ES2906795T3

ES2906795T3 - Receptores de células T anti-KK-LC-1

Info

Publication number: ES2906795T3
Application number: ES17733120T
Authority: ES
Inventors: Sanja Stevanovic; Christian S Hinrichs
Original assignee: US Department of Health and Human Services
Current assignee: US Department of Health and Human Services
Priority date: 2016-04-26
Filing date: 2017-04-17
Publication date: 2022-04-20
Anticipated expiration: 2037-04-17
Also published as: AU2017258745A1; US20190135891A1; EP3448882A1; AU2017258745B2; US11352410B2; EP3448882B1; WO2017189254A1; DK3448882T3; CA3021898A1

Abstract

Un receptor de células T (TCR) aislado o purificado que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3-8 y que tiene especificidad antigénica por el antígeno de cáncer de pulmón de Kita-Kyushu 152-60 (KK-LC-152-60).

Description

DESCRIPCIÓN

Receptores de células T anti-KK-LC-1

Referencia cruzada a la solicitud relacionada

Esta solicitud de patente reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional de EE. UU. N° 62/327 529, presentada el 26 de abril de 2016. Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo el número de proyecto ZIA BC 011478 por los Institutos Nacionales de la Salud, Instituto Nacional del Cáncer. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.

Incorporación por referencia del material presentado electrónicamente

Se incorpora por referencia en su totalidad en el presente documento una lista de secuencias de nucleótidos/aminoácidos legible por ordenador presentada junto con la presente e identificada de la siguiente manera: Un archivo ASCII (texto) de 39566 bytes denominado "728073_ST25.txt", con fecha del 14 de marzo de 2017.

Antecedentes de la invención

La terapia celular adoptiva (ACT) implica la transferencia de células T reactivas a pacientes, incluida la transferencia de células T reactivas frente al cáncer a pacientes con cáncer. La ACT ha tenido éxito en la mediación de resultados clínicos positivos en algunos pacientes con cáncer. Sin embargo, siguen existiendo obstáculos para la aplicación generalizada de la ACT. Por ejemplo, un obstáculo incluye la dificultad de generar células T humanas con potencial antitumoral. Otro obstáculo es que las células T transferidas también pueden ser tóxicas para los tejidos normales, es decir, no cancerosos. Por consiguiente, existe la necesidad de composiciones y métodos inmunológicos mejorados para tratar el cáncer.

Breve resumen de la invención

Una realización de la invención proporciona un receptor de células T (TCR) aislado o purificado que tiene especificidad antigénica para el antígeno del cáncer de pulmón de Kita-Kyushu 1^52-60(KK-LC-1^52-60).

Otras realizaciones de la invención proporcionan polipéptidos relacionados, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedantes, poblaciones de células y composiciones farmacéuticas relacionadas con los TCR de la invención.

Otras realizaciones de la invención proporcionan métodos para detectar la presencia de cáncer en un mamífero y métodos para tratar o prevenir el cáncer en un mamífero utilizando los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedantes, poblaciones de células o composiciones farmacéuticas de la invención. Las referencias a los métodos de tratamiento de esta descripción deben interpretarse como referencias a los compuestos, composiciones farmacéuticas y medicamentos de la presente invención para su uso en un método para el tratamiento del cuerpo humano (o animal) mediante terapia (o para diagnóstico)."

Breve descripción de las varias vistas de los dibujos

La Figura 1A es un gráfico que muestra la concentración de IFN-y (pg/ml) secretado por células efectoras no transducidas (UT) (barras sin sombrear y barras con rayas horizontales), células T transducidas con un TCR dirigido a un epítopo restringido por HLA-A*01:01 de MAGE-A3^168-176(barras grises), o células T transducidas con el vector del ejemplo 2 que codifica un TCR anti-KK-LC-1 (barras negras) tras el cocultivo con células COS7 (células diana) transfectadas con ADN que codifica (i) ninguna molécula HLA o una de las seis moléculas HLA de clase I del paciente 3853 (A*01:01, A*25:01, B*08:01, B*18:01, C*07:01 o C*12:03) y (ii) el antígeno KK-LC-1, antígeno de control MAGE-A3, antígeno de control GFP o ningún antígeno.

La figura 1B es un gráfico que muestra el número de puntos positivos para IFN-y por 20000 células T observadas tras el cocultivo de APC autólogas (células diana) pulsadas con uno de los números de péptido 1-26 (SEQ ID NO: 20-45, respectivamente), sin péptido, o péptido irrelevante con células T no transducidas (UT) (barras rayadas) o células T transducidas con el vector del ejemplo 2 que codifica un TCR anti-KK-LC-1 (barras negras). Las células T UT, las células T transducidas con TCR anti-KK-LC-1 y las APC autólogas (células diana EBV-LCL) cultivadas solas sirvieron como controles negativos. Las células T UT y las células T transducidas con TCR anti-KK-LC-1 estimuladas de forma no específica con PMA/ionomicina sirvieron como controles positivos.

La figura 1C es un gráfico que muestra el número de puntos positivos para IFN-y por 20000 células T observadas tras el cocultivo de APC autólogas (células diana) pulsadas con 0, 0.0001, 0.001,0.01, 0.1, 1 o 10 pM de péptido 8-mero (SEQ ID NO: 46), 9-mero (SeQ ID NO: 2), 10-mero (SEQ ID NO: 52), u 11-mero (SEQ ID NO: 48) tras cocultivo con células T transducidas con el vector del ejemplo 2 que codifica un TCR anti-KK-LC-1 (barras negras) o células T no transducidas (UT) (barras rayadas). Las células T UT, las células T transducidas con TCR anti-KK-LC-1 y las APC autólogas (células diana EBV-LCL) cultivadas solas sirvieron como controles negativos. Las células T UT y las células T transducidas con TCR anti-KK-LC-1 estimuladas de forma no específica con PMA/ionomicina sirvieron como controles positivos.

La Figura 2A es un gráfico que muestra la concentración de IFN-y (pg/ml) secretado por células efectoras no transducidas (UT) (barras sin sombrear y barras rayadas), células T transducidas con un TCR restringido por HLA-A*0101 dirigido a MAGE-A3168-176 (barras grises), o células T transducidas con el vector del ejemplo 2 que codifica un TCR anti-KK-LC-1 (barras negras) tras el cocultivo con la línea de células tumorales diana EKVX transfectadas con (i) HLA-A*0101 y KK-LC-1, (ii) KK-LC-1, (iii) HLA-A*0101 y MAGE-A3, (iv) MAGE-A3, (v) HLA-A*0101, o (vi) ninguno de (i)-(v). Las células T cultivadas solas sirvieron como control.

La Figura 2B es un gráfico que muestra la concentración de IFN-y (pg/ml) secretado por células efectoras no transducidas (UT) (barras sin sombrear y barras rayadas), células T transducidas con un TCR restringido por HLA-A*0101 dirigido a MAGE-A3168-176 (barras grises), o células T transducidas con el vector del ejemplo 2 que codifica un TCR anti-KK-LC-1 (barras negras) tras el cocultivo con la línea de células tumorales diana HCT-116 transfectadas con (i) HLA-A*0101 y KK-LC-1, (ii) KK-LC-1, (iii) HLA-A*0101 y MAGE-A3, (iv) MAGE-A3, (v) HLA-A*0101, o (vi) ninguno de (i)-(v). Las células T cultivadas solas sirvieron como control.

La Figura 2C es un gráfico que muestra la concentración de IFN-y (pg/ml) secretado por células efectoras no transducidas (UT) (barras sin sombrear y barras rayadas), células T transducidas con un TCR restringido por HLA-A*0101 dirigido a MAGE-A3168-176 (barras grises), o células T transducidas con el vector del ejemplo 2 que codifica un TCR anti-KK-LC-1 (barras negras) tras el cocultivo con la línea de células tumorales diana HeLa transfectadas con (i) HLA-A*0101 y KK-LC-1, (ii) KK-LC-1, (iii) HLA-A*0101 y MAGE-A3, (iv) MAGE-A3, (v) HLA-A*0101, o (vi) ninguno de (i)-(v). Las células T cultivadas solas sirvieron como control.

La Figura 2D es un gráfico que muestra la concentración de IFN-y (pg/ml) secretado por células efectoras no transducidas (UT) (barras sin sombrear y barras rayadas), células T transducidas con un TCR restringido por HLA-A*0101 dirigido a MAGE-A3168-176 (barras grises), o células T transducidas con el vector del ejemplo 2 que codifica un TCR anti-KK-LC-1 (barras negras) tras el cocultivo con la línea de células tumorales diana DU145 transfectadas con (i) HLA-A*0101 y KK-LC-1, (ii) KK-LC-1, (iii) HLA-A*0101 y MAGE-A3, (iv) MAGE-A3, (v) HLA-A*0101, o (vi) ninguno de (i)-(v). Las células T cultivadas solas sirvieron como control.

La figura 3 es un gráfico que muestra la cantidad de expresión de ARNm de KK-LC-1 (CT83/105 p-actina (copias)) por líneas de células cancerosas de diferentes histologías.

La figura 4A incluye gráficos de citometría de flujo. Los valores en los cuadrantes de los paneles centrales muestran los porcentajes de células que expresan (o no expresan) CD107a y TNF-a tras el cocultivo de células efectoras (células T transducidas con TCR KK-LC-1 (Td) o no transducidas (UT)) con células diana (las líneas de células tumorales no manipuladas indicadas). La presencia (+) o ausencia (-) de HLA-A*0101 y/o KK-LC-1 expresados endógenamente por las líneas de células tumorales se indica en la parte superior de la figura. Los valores en los cuadrantes de los paneles a la derecha de la línea de puntos muestran los porcentajes de células que expresan (o no expresan) CD107a y TNF-a tras el cocultivo de las mismas células efectoras con líneas de células tumorales diana PC-3 o HeLa preincubadas con 0.1 pg/ml de péptido afín KK-LC-1^52-60. Los paneles del extremo izquierdo muestran que los datos para las células T Td TCR KK-LC-1 se delimitaron en células T KK-LC-1^52-60tetrámero⁺(extremo izquierdo, flecha) y los datos para las células T UT se delimitaron en todas las células T CD3⁺(extremo izquierdo, flecha).

La Figura 4B incluye gráficos que muestran el porcentaje (%) de lisis específica de las células diana (las líneas de células tumorales no manipuladas de la Figura 4A) por células efectoras (las células T transducidas con TCR KK-LC-1 (cuadrados) o células T UT (círculos)) en las proporciones indicadas de efector a diana. Se indica la presencia (+) o ausencia (-) de KK-LC-1 y/o HLA-A*0101 expresados endógenamente por las líneas de células tumorales. Las barras de error representan la desviación estándar de pocillos por triplicado.

Descripción detallada de la invención

Una realización de la invención proporciona un receptor de células T (TCR) aislado o purificado que tiene especificidad antigénica por el antígeno 1 de cáncer de pulmón de Kita-Kyushu (KK-LC-1) (también denominado "CXorf61", "CT83" o "KKLC1"). KK-LC-1 pertenece a una familia de antígenos de cáncer denominados "antígenos de cáncer de testículo" (CTA) o antígenos de línea germinal de cáncer (CGA), que se expresan solo en células cancerosas y células germinales de los testículos que no expresan MHC. KK-LC-1 se expresa en una variedad de cánceres humanos que incluyen, pero no se limitan a carcinomas de vejiga, cuello uterino, estómago, mama, pulmón, colon, recto y páncreas. La proteína KK-LC-1 de longitud completa puede comprender, consistir o consistir esencialmente en la SEQ ID NO: 1.

El TCR de la invención puede tener especificidad antigénica por cualquier proteína, polipéptido o péptido KK-LC-1. En una realización de la invención, el TCR tiene especificidad antigénica por una proteína KK-LC-1 que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en la SEQ ID NO: 1. En una realización preferida de la invención, el TCR tiene especificidad antigénica por un péptido KK-LC-1^52-60que comprende, consiste en, o consiste esencialmente en NTDNNLAVY (SEQ ID NO: 2).

En una realización de la invención, los TCR de la invención son capaces de reconocer KK-LC-1 de una manera dependiente del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I. "Modo dependiente de MHC de clase I", como se usa en el presente documento, significa que el TCR provoca una respuesta inmunitaria al unirse a KK-LC-1 en el contexto de una molécula de MHC de clase I. La molécula de MHC de clase I puede ser cualquier molécula de MHC de clase I conocida en la técnica, p. ej., moléculas HLA-A. En una realización preferida de la invención, la molécula MHC de clase I es una molécula HLA-A1.

Los TCR de la invención pueden proporcionar muchas ventajas, incluso cuando son expresados por células utilizadas para la transferencia celular adoptiva. Sin estar ligado a una teoría o mecanismo en particular, se cree que debido a que KK-LC-1 se expresa en células de múltiples tipos de cáncer, los TCR de la invención proporcionan ventajosamente la capacidad de destruir células de múltiples tipos de cáncer y, en consecuencia, tratar o prevenir múltiples tipos de cáncer. Además, sin estar ligado a una teoría o mecanismo en particular, se cree que debido a que KK-LC-1 es un CTA que se expresa solo en células tumorales y células germinales del testículo que no expresan MHC (con expresión baja en la glándula salival y epidídimo), los TCR de la invención se dirigen ventajosamente a la destrucción de células cancerosas a la vez que minimizan o eliminan la destrucción de células normales no cancerosas, minimizando o eliminando así la toxicidad. Debido a que la glándula salival y el epidídimo no son esenciales para la vida, también se cree que la terapia con los TCR de la invención puede reducir o evitar el daño a los tejidos que son esenciales para la vida. Además, los TCR de la invención pueden, ventajosamente, tratar o prevenir con éxito los cánceres positivos para KK-LC-1 que no responden a otros tipos de tratamiento como, por ejemplo, quimioterapia sola, cirugía o radiación. Además, se cree que los TCR inventivos pueden proporcionar un reconocimiento muy ávido de KK-LC-1, lo que puede, ventajosamente, proporcionar la capacidad de reconocer células tumorales no manipuladas (p. ej., células tumorales que no han sido tratadas con interferón (IFN)-y , transfectadas con un vector que codifica uno o ambos de KK-LC-1 y HLA-A1, pulsadas con péptido KK-LC-1^52-60, o una combinación de los mismos).

La frase "especificidad antigénica", como se usa en el presente documento, significa que el TCR puede unirse específicamente y reconocer inmunológicamente al KK-LC-1. Por ejemplo, se puede considerar que un TCR tiene "especificidad antigénica" por el KK-LC-1 si las células T que expresan el TCR secretan al menos aproximadamente 100 pg/ml o más (p. ej., 200 pg/ml o más, 300 pg/ml o más, 400 pg/ml o más, 500 pg/ml o más, 600 pg/ml o más, 700 pg/ml o más, 1000 pg/ml o más, 5000 pg/ml o más, 7000 pg/ml o más, 10000 pg/ml o más, o 20000 pg/ml o más) de IFN-y tras el cocultivo con células diana negativas para el antígeno HLA-A1⁺pulsadas con una concentración baja de péptido KK-LC-1 (p. ej., de aproximadamente 0.05 ng/ml a aproximadamente 5 ng/ml, 0.05 ng/ml, 0.1 ng/ml, 0.5 ng/ml, 1 ng/ml, o 5 ng/ml). Alternativa o adicionalmente, se puede considerar que un TCR tiene "especificidad antigénica" por KK-LC-1 si las células T que expresan el TCR secretan al menos el doble de IFN-y que el nivel base de IFN-y de las células T no transducidas tras el cocultivo con células diana negativas para el antígeno HLA-A1⁺pulsadas con una baja concentración de péptido KK-LC-1. Las células que expresan los TCR de la invención también pueden secretar IFN-y tras el cocultivo con células diana negativas para el antígeno HLA-A1⁺pulsadas con concentraciones más altas de péptido KK-LC-1.

Una realización de la invención proporciona un TCR que comprende dos polipéptidos (es decir, cadenas polipeptídicas), tales como una cadena alfa (a) de un TCR, una cadena beta (p) de un TCR, una cadena gamma (y ) de un TCR, una cadena delta (5) de un TCR, o una combinación de las mismas. Los polipéptidos del TCR de la invención pueden comprender cualquier secuencia de aminoácidos, con la condición de que el TCR tenga especificidad antigénica por KK-LC-1.

En una realización de la invención, el TCR comprende dos cadenas polipeptídicas, cada una de las cuales comprende una región variable que comprende una región determinante de la complementariedad (CDR)1, una CDR2 y una CDR3 de un TCR. En una realización de la invención, el TCR comprende una primera cadena polipeptídica que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (CDR1 de cadena a), una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (CDR2 de cadena a), y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (CDR3 de cadena a), y una segunda cadena polipeptídica que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (CDR1 de cadena p ), una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (CDR2 de cadena p), y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (CDR3 de cadena p). A este respecto, el TCR de la invención puede comprender una cualquiera o más de las secuencias de aminoácidos seleccionadas del grupo que consiste en las SEQ ID NO: 3-8. Preferiblemente, el TCR comprende las SEQ ID NO: 3-5 o SEQ ID NO: 6-8. En una realización especialmente preferida, el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3-8.

En una realización de la invención, el TCR puede comprender una secuencia de aminoácidos de una región variable de un TCR que comprende las CDR expuestas anteriormente. A este respecto, el TCR puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (la región variable de una cadena a humana); SEQ ID NO: 10, en donde X en la posición 2 de la SEQ ID NO: 10 es Ala o Gly (la región variable de una cadena p); ambas SEQ ID NO: 9 y 10, en donde X en la posición 2 de la SEQ ID NO: 10 es Ala o Gly; SEQ ID NO: 11 (la región variable de una cadena p humana); o ambas SEQ ID NO: 9 y 11. La SEQ ID NO: 10 corresponde a la SeQ ID NO: 11 cuando X en la posición 2 de la SEQ ID NO: 10 es Gly. Preferiblemente, el TCR de la invención comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 9 y 10, en donde X en la posición 2 de la SEQ ID NO: 10 es Ala.

Los TCR de la invención pueden comprender además una región constante derivada de cualquier especie adecuada tal como, p. ej., ser humano o ratón. Como se usa en el presente documento, el término "murino" o "humano", cuando se refiere a un TCR o cualquier componente de un TCR descrito en el presente documento (p. ej., región determinante de la complementariedad (CDR), región variable, región constante, cadena alfa y/o beta cadena), significa un TCR (o componente del mismo) que deriva de un ratón o un ser humano, respectivamente, es decir, un TCR (o componente del mismo) procedente de o que, en un momento dado, fue expresado por una célula T de ratón o un célula T humana, respectivamente.

En una realización de la invención, los TCR comprenden además una región constante humana. En este sentido, el TCR puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59, en donde X en la posición 1 es cualquier resto de aminoácido natural (la región constante de una cadena a humana), SEQ ID NO: 60 (la región constante de una cadena p humana), SEQ ID NO: 62 (la región constante de una cadena p humana), tanto de SEQ ID NO: 59 como 62, o tanto de SEQ ID NO: 59 como 60.

En una realización de la invención, el TCR comprende una región constante murina. Por ejemplo, el TCR puede ser un TCR quimérico que comprende una región variable humana y una región constante murina. A este respecto, el TCR puede comprender la SEQ ID NO: 55 (región constante de una cadena a murina); SEQ ID NO: 56 (región constante de una cadena p murina); o tanto la SEQ ID NO: 55 como la SEQ ID NO: 56. El TCR quimérico puede comprender cualquiera de las regiones CDR como se describen en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. En otra realización de la invención, el TCR quimérico puede comprender cualquiera de las regiones variables descritas en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. En una realización de la invención, el TCR comprende una región constante murina, opcionalmente con una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos en la región constante de una de o tanto de la cadena alfa como beta, como se describe en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. En una realización de la invención, el TCR comprende una región constante murina, opcionalmente con una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos en la región constante murina de la cadena alfa y una sustitución de aminoácido en la región constante murina de la cadena beta, como se describe en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención.

En una realización de la invención, el TCR inventivo puede comprender una combinación de una región variable y una región constante. En este sentido, el TCR puede comprender una cadena alfa que comprende las secuencias de aminoácidos tanto de SEQ ID NO: 9 (la región variable de una cadena a humana) como de SEQ ID NO: 59 (la región constante de una cadena a humana); una cadena beta que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 11 (la región variable de una cadena p humana) y SEQ ID NO: 60 (la región constante de una cadena p humana); una cadena beta que comprende las secuencias de aminoácidos tanto de SEQ ID NO: 11 (la región variable de una cadena p humana) como de SEQ ID NO: 62 (la región constante de una cadena p humana); una cadena beta que comprende las secuencias de aminoácidos tanto de SEQ ID NO: 10, en donde X en la posición 2 de la SEQ ID NO: 2 es Ala o Gly (la región variable de una cadena p) como de SEQ ID NO: 60 (la constante región de una cadena p humana); una cadena beta que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 10 (la región variable de una cadena p humana) y SEQ ID NO: 62 (la región constante de una cadena p humana); las secuencias de aminoácidos de todas las SEQ ID NO: 9, 11,59 y 60; las secuencias de aminoácidos de todas las SEQ ID NO: 9, 10, 59 y 60; las secuencias de aminoácidos de todas las SEQ ID NO: 9, 11,59 y 62; o las secuencias de aminoácidos de todas las SEQ ID NO: 9, 10, 59 y 62.

En una realización de la invención, el TCR inventivo puede comprender una cadena alfa que comprende las secuencias de aminoácidos tanto de SEQ ID NO: 9 (la región variable de una cadena a humana) como de SEQ ID NO: 55 (la región constante de un cadena a murina); una cadena beta que comprende las secuencias de aminoácidos tanto de SEQ ID NO: 11 (la región variable de una cadena p humana) como de SEQ ID NO: 56 (la región constante de una cadena p murina); una cadena beta que comprende las secuencias de aminoácidos tanto de SEQ ID NO: 10, en donde X en la posición 2 de la SEQ ID NO: 2 es Ala o Gly (la región variable de una cadena p) como de SEQ ID NO: 56 (la constante región de una cadena p murina); las secuencias de aminoácidos de todas las SEQ ID NO: 9, 11, 55 y 56; o las secuencias de aminoácidos de todas las SEQ ID NO: 9, 10, 55 y 56.

En una realización de la invención, el TCR comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los TCR descritos en el presente documento con una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos en la región constante de una de o tanto de la cadena alfa como beta. Preferiblemente, el TCR comprende una región constante murina con una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos en la región constante murina de una de o tanto de la cadena alfa como beta. En una realización especialmente preferida, el TCR comprende una región constante murina con una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos en la región constante murina de la cadena alfa y una sustitución de aminoácidos en la región constante murina de la cadena beta. En algunas realizaciones, los TCR que comprenden la(s) secuencia(s) de aminoácidos sustituidos proporcionan ventajosamente uno o más de mayor reconocimiento de dianas KK-LC-1+, mayor expresión por una célula hospedante y mayor actividad antitumoral en comparación con el TCR original que comprende una secuencia de aminoácidos no sustituidos. En general, las secuencias de aminoácidos sustituidos de las regiones constantes murinas de las cadenas a y p del TCR, SEQ ID NO: 13 y 14, respectivamente, se corresponden con todas o partes de las secuencias de aminoácidos de la región constante murina no sustituida SEQ ID NO: 55 y 56, respectivamente, teniendo la SEQ ID NO: 13 una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácidos en comparación con la SEQ ID NO: 55 y SEQ ID NO: 14 que tiene una sustitución de aminoácido en comparación con la SEQ ID NO: 56. A este respecto, una realización de la invención proporciona un TCR que comprende las secuencias de aminoácidos de una de o tanto de (a) SEQ ID NO: 13 (región constante de la cadena alfa), en donde (i) X en la posición 48 es Thr o Cys; (ii) X en la posición 112 es Ser, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; (iii) X en la posición 114 es Met, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; y (iv) X en la posición 115 es Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; como de (b) SEQ ID NO: 14 (región constante de la cadena beta), en donde X en la posición 57 es Ser o Cys. En una realización de la invención, el TCR que comprende la SEQ ID NO: 13 no comprende la SEQ ID NO: 55 (región constante murina no sustituida de la cadena alfa). En una realización de la invención, el TCR que comprende la SEQ ID NO: 14 no comprende la SEQ ID NO: 56 (región constante murina no sustituida de la cadena beta).

En una realización de la invención, la secuencia de aminoácidos sustituidos incluye sustituciones de cisteína en la región constante de una de o tanto de la cadena a como p para proporcionar un TCR sustituido con cisteína. Las cisteínas opuestas en las cadenas a y p proporcionan un enlace disulfuro que une entre sí las regiones constantes de las cadenas a y p del TCR sustituido y que no está presente en un TCR que comprende la región constante humana no sustituida o la región constante murina no sustituida. A este respecto, el TCR es un TCR sustituido con cisteína en el que uno de o tanto la Thr48 nativa de la SEQ ID NO: 55 como la Ser57 nativa de la SEQ ID NO: 56 pueden estar sustituidas por Cys. Preferiblemente, tanto la Thr48 nativa de la SEQ ID NO: 55 como la Ser57 nativa de la SEQ ID NO: 56 están sustituidas por Cys. En una realización, el TCR sustituido con cisteína comprende una región constante de la cadena alfa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, en donde X en la posición 48 es Cys, X en la posición 112 es la Ser nativa, X en la posición 114 es la Met nativa, y X en la posición 115 es la Gly nativa, y una región constante de la cadena beta que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, en donde X en la posición 57 es Cys. Los TCR sustituidos con cisteína de la invención pueden incluir la región constante sustituida además de cualquiera de las CDR o regiones variables descritas en el presente documento.

En una realización de la invención, la secuencia de aminoácidos sustituidos incluye sustituciones de uno, dos o tres aminoácidos en el dominio transmembrana (TM) de la región constante de una de o tanto de la cadena a como p por un aminoácido hidrófobo para proporcionar un TCR sustituido con aminoácido hidrófobo. La(s) sustitución(es) por aminoácidos hidrófobos en el dominio TM del TCR pueden aumentar la hidrofobicidad del dominio TM del TCR en comparación con un TCR que carece de la(s) sustitución(es) de aminoácidos hidrófobos en el dominio TM. A este respecto, el TCR puede ser un TCR sustituido con aminoácidos hidrófobos en el que uno, dos o tres de las Ser112, Met114 y Gly115 nativas de la SEQ ID NO: 55 pueden, independientemente, estar sustituidas por Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; preferiblemente por Leu, Ile o Val. Preferiblemente, las tres Ser112, Met114 y Gly115 nativas de la SEQ ID NO: 55 están, independientemente, sustituidas por Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; preferiblemente por Leu, Ile o Val. En una realización, el TCR sustituido con aminoácidos hidrófobos comprende una región constante de la cadena alfa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, en donde X en la posición 48 es la Thr nativa, X en la posición 112 es Ser, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp, X en la posición 114 es Met, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp, y X en la posición 115 es Gly, Ala , Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp, y una región constante de cadena beta que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, en donde X en la posición 57 es la Ser nativa, en donde el TCR sustituido con aminoácidos hidrófobos que comprende la SEQ ID NO: 13 no comprende la SEQ ID NO: 55 (región constante murina no sustituida de la cadena alfa). Preferiblemente, el TCR sustituido con aminoácidos hidrófobos comprende una región constante de la cadena alfa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, en donde X en la posición 48 es la Thr nativa, X en la posición 112 es Leu, X en la posición 114 es Ile, y X en la posición 115 es Val, y una región constante de la cadena beta que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, en donde X en la posición 57 es la Ser nativa. Los TCR sustituidos con aminoácidos hidrófobos de la invención pueden incluir la región constante sustituida además de cualquiera de las CDR o regiones variables descritas en el presente documento.

En una realización de la invención, la secuencia de aminoácidos sustituidos incluye sustituciones de cisteína en la región constante de una de o tanto de la cadena a como p en combinación con la(s) sustitución(es) de uno, dos o tres aminoácidos en el dominio transmembrana (TM) de la región constante de una de o tanto de la cadena a como p por un aminoácido hidrófobo (también denominado en el presente documento como "TCR sustituido con aminoácido hidrófobo, sustituido con cisteína"). A este respecto, el TCR es un TCR sustituido con aminoácido hidrófobo, sustituido con cisteína en el que la Thr48 nativa de la SEQ ID NO: 55 está sustituida por Cys; uno, dos o tres de las Ser112, Met114 y Gly115 nativas de la SEQ ID NO: 55 están, independientemente, sustituidas por Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; preferiblemente por Leu, Ile o Val; y la Ser57 nativa de la SEQ ID NO: 56 está sustituida por Cys. Preferiblemente, las tres de las Ser112, Met114 y Gly115 nativas de la SEQ ID NO: 55 están, independientemente, sustituidas por Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; preferiblemente por Leu, Ile o Val. En una realización, el TCR sustituido con aminoácido hidrófobo, sustituido con cisteína comprende una región constante de la cadena alfa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13, en donde X en la posición 48 es Cys, X en la posición 112 es Ser, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp, X en la posición 114 es Met, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp, y X en la posición 115 es Gly , Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp, y una región constante de la cadena beta que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14, en donde X en la posición 56 es Cys, en donde el TCR sustituido con cisteína, sustituido con aminoácido hidrófobo que comprende la SEQ ID NO: 13 no comprende la SEQ ID NO: 55 (región constante murina no sustituida de la cadena alfa). Preferiblemente, el TCR sustituido con aminoácido hidrófobo, sustituido con cisteína comprende una región constante de la cadena alfa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 57 y una región constante de la cadena beta que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 58. Los TCR sustituidos con aminoácidos hidrófobos, sustituidos con cisteína de la invención pueden incluir la región constante sustituida además de cualquiera de las CDR o regiones variables descritas en el presente documento. A este respecto, el TCR sustituido con aminoácido hidrófobo, sustituido con cisteína puede comprender (i) SEQ ID NO: 3-5 y 57; (ii) SEQ ID NO: 9 y 57; (iii) SEQ ID NO: 6-8 y 58; (iv) SEQ ID NO: 10 y 58, en donde X en la posición 2 de la SEQ ID NO: 10 es Ala o Gly; o (v) SEQ ID NO: 11 y 58. Preferiblemente, el TCR sustituido con aminoácido hidrófobo, sustituido con cisteína comprende las secuencias de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 3-8 y 57 y 58; (ii) SEQ ID NO: 9-10 y 57 y 58; o (iii) SEQ ID NO: 9, 11 y 57 y 58. En una realización especialmente preferida, el TCR sustituido con aminoácido hidrófobo, sustituido con cisteína comprende una cadena alfa de longitud completa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO : 15 y una cadena beta de longitud completa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. En este sentido, el TCR sustituido con aminoácido hidrófobo, sustituido con Cys puede comprender la SEQ ID NO: 15, SEQ ID NO: 16, o tanto la SEQ ID NO: 15 como 16.

La invención también proporciona un polipéptido que comprende una parte funcional de cualquiera de los TCR descritos en el presente documento. El término "polipéptido", como se usa en el presente documento, incluye oligopéptidos y se refiere a una sola cadena de aminoácidos conectados por uno o más enlaces peptídicos.

Con respecto a los polipéptidos de la invención, la parte funcional puede ser cualquier parte que comprenda aminoácidos contiguos del TCR del cual es una parte, con la condición de que la parte funcional se una específicamente a KK-LC-1. La expresión "parte funcional", cuando se usa en referencia a un TCR, se refiere a cualquier parte o fragmento del TCR de la invención, cuya parte o fragmento retiene la actividad biológica del TCR del cual es una parte (el TCR original). Las partes funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas partes de un TCR que conservan la capacidad de unirse específicamente a KK-LC-1 (p. ej., de manera dependiente de HLA-A1), o detectar, tratar o prevenir el cáncer, de una manera similar, la misma medida, o en mayor medida, que el TCR original. Con referencia al TCR original, la parte funcional puede comprender, por ejemplo, aproximadamente 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95% o más del TCR original.

La parte funcional puede comprender aminoácidos adicionales en el extremo amino o carboxi de la parte, o en ambos extremos, cuyos aminoácidos adicionales no se encuentran en la secuencia de aminoácidos del TCR original. Deseablemente, los aminoácidos adicionales no interfieren con la función biológica de la parte funcional, p. ej., unión específica a KK-LC-1; y/o tienen la capacidad de detectar el cáncer, tratar o prevenir el cáncer, etc. Más deseablemente, los aminoácidos adicionales potencian la actividad biológica, en comparación con la actividad biológica del TCR original.

El polipéptido puede comprender una parte funcional de cualquiera de o tanto de la cadena a como p de los TCR de la invención, tal como una parte funcional que comprende una o más de CDR1, CDR2 y CDR3 de la(s) región(es) variable(s) de la cadena a y/o cadena p de un TCR de la invención. En una realización de la invención, el polipéptido puede comprender una parte funcional que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (CDR1 de cadena a), 4 (CDR2 de cadena a), 5 (CDR3 de cadena a), 6 (CDR1 de cadena p), 7 (CDR2 de cadena p), 8 (CDR3 de cadena p), o una combinación de los mismos. Preferiblemente, el polipéptido inventivo comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3-5; 6-8; o todas las SEQ ID NO: 3-8. Más preferiblemente, el polipéptido comprende las secuencias de aminoácidos de todas las de SEQ ID NO: 3-8.

En una realización de la invención, el polipéptido inventivo puede comprender, por ejemplo, la región variable del TCR inventivo que comprende una combinación de las regiones CDR expuestas anteriormente. A este respecto, el polipéptido puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (la región variable de una cadena a), SEQ ID NO: 10, en donde X en la posición 2 de la SEQ ID NO: 10 es Ala o Gly (la región variable de una cadena p), SEQ ID NO: 11 (la región variable de una cadena p), tanto de SEQ ID NO: 9 como 10, o tanto de SEQ ID NO: 9 como 11. Preferiblemente, el polipéptido comprende las secuencias de aminoácidos tanto de SEQ ID NO: 9 como 10, en donde X en la posición 2 de la SEQ ID NO: 10 es Ala.

El polipéptido inventivo puede comprender además una región constante derivada de cualquier especie adecuada tal como, p. ej., humana o de ratón, descrita en el presente documento o cualquiera de las regiones constantes sustituidas descritas en el presente documento. A este respecto, el polipéptido puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 59 (la región constante de una cadena a humana), SEQ ID NO: 60 (la región constante de una cadena p humana), SEQ ID NO: 62 (la región constante de una cadena p humana), SEQ ID NO: 13 (región constante de la cadena a, sustituida como se describe en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención), SEQ ID NO: 55 (la región constante no sustituida de una cadena a murina), SEQ ID NO: 14 (región constante de la cadena p, sustituida como se describe en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención), SEQ ID NO: 56 (la región constante no sustituida de una cadena p murina), SEQ ID NO : 57 (región constante de una cadena a sustituida con cisteína, sustituida con aminoácidos hidrófobos), SEQ ID NO: 58 (región constante de una cadena p sustituida con cisteína, sustituida con aminoácidos hidrófobo), tanto de SEQ ID NO: 13 como 14, tanto de SEQ ID NO: 55 como 56, o tanto de SEQ ID NO: 57 como 58.

En una realización de la invención, el polipéptido inventivo puede comprender una combinación de una región variable y una región constante. A este respecto, el polipéptido puede comprender tanto la SEQ ID NO: 9 como 13, tanto la SEQ ID NO: 9 como 55, tanto la SEQ ID nO: 9 como 57, tanto la SEQ ID NO: 10 como 14, tanto la SEQ iD NO: 10 como 56, tanto la SEQ ID NO: 10 como 58, tanto la SEQ ID NO: 11 como 14, tanto la SEQ ID NO: 11 como 56, tanto la SEQ ID NO: 11 como 58, todas de SEQ ID NO: 3-5 y 13 , todas de SEQ ID NO: 3-5 y 55, todas de SEQ ID NO: 3-5 y 57, todas de SEQ ID NO: 6-8 y 14, todas de SEQ ID NO: 6-8 y 56, todas de SEQ ID NO: 6-8 y 58, todas de SEQ ID NO: 3-8 y 13-14, todas de SEQ ID NO: 3-8 y 55 y 56, o todas de SEQ ID NO: 3-8 y 57 y 58. Las SEQ ID NO: 13 y 14 pueden tener sustituciones como se describe en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención.

En una realización de la invención, el polipéptido inventivo puede comprender la longitud completa de una cadena a o p de uno de los TCR descritos en el presente documento. A este respecto, el polipéptido inventivo puede comprender una secuencia de aminoácidos de una de o tanto de SEQ ID NO: 15 como 16. Preferiblemente, el polipéptido comprende la SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16.

La invención proporciona además una proteína que comprende al menos uno de los polipéptidos descritos en el presente documento. Por "proteína" se entiende una molécula que comprende una o más cadenas polipeptídicas.

En una realización, la proteína de la invención puede comprender una primera cadena polipeptídica que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3-5 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6-8. Alternativa o adicionalmente, la proteína de la invención puede comprender (i) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, en donde (i) X en la posición 2 de SEQ ID NO: 10 es Ala o Gly; (ii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11; o (iii) una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14. Las SEQ ID NO: 13 y 14 pueden estar sustituidas como se describe en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. La proteína puede, por ejemplo, comprender una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16. En este caso, la proteína de la invención puede ser un TCR. Alternativamente, si, por ejemplo, la proteína comprende una sola cadena polipeptídica que comprende la SEQ ID NO: 15 y 16, todas las SEQ ID NO: 3-8 y 13 y 14; todas las SEQ ID NO: 3-8 y 55 y 56, todas las SEQ ID NO: 3-8 y 57 y 58; todas las SEQ ID NO: 9, 10, 13 y 14; todas las SEQ ID NO: 9, 11, 13 y 14; todas las SEQ ID NO: 9, 10, 55 y 56; todas las SEQ ID NO: 9, 10, 57 y 58; o todas las SEQ ID NO: 9, 11,57 y 58, o si la primera y/o segunda cadena(s) polipeptídica(s) de la proteína comprende(n) además otras secuencias de aminoácidos, p. ej., una secuencia de aminoácidos que codifica un inmunoglobulina o una parte de la misma, entonces la proteína inventiva puede ser una proteína de fusión. A este respecto, la invención también proporciona una proteína de fusión que comprende al menos uno de los polipéptidos inventivos descritos en el presente documento junto con al menos otro polipéptido. El otro polipéptido puede existir como un polipéptido separado de la proteína de fusión, o puede existir como un polipéptido, que se expresa en el marco (en tándem) con uno de los polipéptidos inventivos descritos en el presente documento. El otro polipéptido puede codificar cualquier molécula peptídica o proteica, o una parte de la misma, incluyendo, pero no limitado a una inmunoglobulina, CD3, CD4, CD8, una molécula MHC, una molécula CD1, p. ej., CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, etc.

La proteína de fusión puede comprender una o más copias del polipéptido inventivo y/o una o más copias del otro polipéptido. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o más copias del polipéptido inventivo y/o del otro polipéptido. Los métodos adecuados para producir proteínas de fusión son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, métodos recombinantes.

En algunas realizaciones de la invención, los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención pueden ser expresados como una sola proteína que comprende un péptido conector que une la cadena a y la cadena p. A este respecto, los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención pueden comprender además un péptido conector. El péptido conector puede facilitar ventajosamente la expresión de un TCR, polipéptido y/o proteína recombinante en una célula hospedante. El péptido conector puede comprender cualquier secuencia de aminoácidos adecuada. En una realización de la invención, el conector es un conector de furina/Ser/Gly/P2A. Por ejemplo, el péptido conector puede comprender la SEQ ID NO: 17. En una realización de la invención, la proteína que comprende una cadena alfa, cadena beta y un conector puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (cadenas alfa y beta de longitud completa de TCR con aminoácido hidrófobo sustituido, con cisteína sustituida unidas por un conector). Tras la expresión de la construcción que incluye el péptido conector por una célula hospedante, el péptido conector puede escindirse, dando como resultado cadenas a y p separadas.

La proteína de la invención puede ser un anticuerpo recombinante que comprende al menos uno de los polipéptidos inventivos descritos en el presente documento. Como se usa en el presente documento, "anticuerpo recombinante" se refiere a una proteína recombinante (p. ej., modificada genéticamente) que comprende al menos uno de los polipéptidos de la invención y una cadena polipeptídica de un anticuerpo, o una parte de la misma. El polipéptido de un anticuerpo, o parte del mismo, puede ser una cadena pesada, una cadena ligera, una región variable o constante de una cadena pesada o ligera, un fragmento variable monocatenario (scFv) o un fragmento Fc, Fab o F(ab)2' de un anticuerpo, etc. La cadena polipeptídica de un anticuerpo, o parte de la misma, puede existir como un polipéptido separado del anticuerpo recombinante. Alternativamente, la cadena polipeptídica de un anticuerpo, o parte de la misma, puede existir como un polipéptido, que se expresa en el marco (en tándem) con el polipéptido de la invención. El polipéptido de un anticuerpo, o parte del mismo, puede ser un polipéptido de cualquier anticuerpo o cualquier fragmento de anticuerpo.

Los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención pueden tener cualquier longitud, es decir, pueden comprender cualquier número de aminoácidos, con la condición de que los TCR, polipéptidos o proteínas conserven su actividad biológica, p. ej., la capacidad de unirse específicamente a KK-LC-1; detectar el cáncer; o tratar o prevenir el cáncer en un mamífero, etc. Por ejemplo, el polipéptido puede tener una longitud de aproximadamente 50 a aproximadamente 5000 aminoácidos, tal como 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más aminoácidos de longitud. A este respecto, los polipéptidos de la invención también incluyen oligopéptidos.

Los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención pueden comprender aminoácidos sintéticos en lugar de uno o más aminoácidos de origen natural. Dichos aminoácidos sintéticos son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ácido aminociclohexanocarboxílico, norleucina, ácido a-amino-n-decanoico, homoserina, S-acetilaminometil-cisteína, trans-3- y trans-4-hidroxiprolina, 4-aminofenilalanina, 4-nitrofenilalanina, 4-clorofenilalanina, 4-carboxifenilalanina, pfenilserina p-hidroxifenilalanina, fenilglicina, a-naftilalanina, ciclohexilalanina, ciclohexilglicina, ácido indolina-2-carboxílico, ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolina-3-carboxílico, ácido aminomalónico, monoamida del ácido aminomalónico, N'-bencil-N'-metil-lisina, N',N'-dibencil-lisina, 6-hidroxilisina, ornitina, ácido a-aminociclopentanocarboxílico, ácido a-aminociclohexano-carboxílico, ácido a-aminocicloheptano-carboxílico, ácido a-(2-amino-2-norbornano)-carboxílico, ácido a,Y-diaminobutírico, ácido a,p-diaminopropiónico, homofenilalanina y a-terc-butilglicina.

Los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención se pueden glicosilar, amidar, carboxilar, fosforilar, esterificar, N-acilar, ciclar mediante, p. ej., un puente disulfuro, o convertir en una sal de adición de ácido y/u opcionalmente dimerizar o polimerizar, o conjugar.

Están incluidas en el alcance de la invención las variantes funcionales de los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención descritos en el presente documento. La expresión "variante funcional", como se usa en el presente documento, se refiere a un TCR, polipéptido o proteína que tiene una identidad o similitud de secuencia sustancial o significativa con un TCR, polipéptido o proteína original, cuya variante funcional retiene la actividad biológica del TCR, polipéptido, o proteína de la que es una variante. Las variantes funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas variantes del TCR, polipéptido o proteína descritos en el presente documento (el TCR, polipéptido o proteína original) que retienen la capacidad de unirse específicamente al KK-LC-1 por el cual el TCR original tiene especificidad antigénica o al que el polipéptido o proteína original se une específicamente, en un grado similar, en el mismo grado, o en un grado mayor, que el TCR, polipéptido o proteína original. En referencia al TCR, polipéptido o proteína original, la variante funcional puede, por ejemplo, ser al menos aproximadamente 30%, 50%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% o más idéntica en la secuencia de aminoácidos al TCR, polipéptido o proteína original.

La variante funcional puede, por ejemplo, comprender la secuencia de aminoácidos del TCR, polipéptido o proteína original con al menos una sustitución conservadora de aminoácidos. Las sustituciones conservadoras de aminoácidos son conocidas en la técnica e incluyen sustituciones de aminoácidos en las que un aminoácido que tiene ciertas propiedades físicas y/o químicas se intercambia por otro aminoácido que tiene las mismas propiedades químicas o físicas. Por ejemplo, la sustitución conservadora de aminoácidos puede ser un aminoácido ácido sustituido por otro aminoácido ácido (p. ej., Asp o Glu), un aminoácido con una cadena lateral no polar sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral no polar (p. ej., Ala , Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, etc.), un aminoácido básico sustituido por otro aminoácido básico (Lys, Arg, etc.), un aminoácido con cadena lateral polar sustituido por otro aminoácido con cadena lateral polar (Asn, Cys, Gln, Ser, Thr, Tyr, etc.), etc.

Alternativa o adicionalmente, las variantes funcionales pueden comprender la secuencia de aminoácidos del TCR, polipéptido o proteína original con al menos una sustitución de aminoácido no conservadora. En este caso, es preferible que la sustitución de aminoácidos no conservadora no interfiera ni inhiba la actividad biológica de la variante funcional. Preferiblemente, la sustitución de aminoácido no conservadora mejora la actividad biológica de la variante funcional, de modo que la actividad biológica de la variante funcional aumenta en comparación con el TCR, polipéptido o proteína original.

El TCR, polipéptido o proteína puede consistir esencialmente en la secuencia o secuencias de aminoácidos especificadas descritas en el presente documento, de modo que otros componentes del TCR, polipéptido o proteína, p. ej., otros aminoácidos, no cambien materialmente la actividad biológica del TCR, polipéptido o proteína. A este respecto, el TCR, polipéptido o proteína de la invención pueden, por ejemplo, consistir esencialmente en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de o tanto de SEQ ID NO: 15 como 16. Además, por ejemplo, los TCR, polipéptidos o proteínas inventivos pueden consistir esencialmente en la(s) secuencia(s) de aminoácidos de SEQ ID NO: 9, 10, 11, tanto de SEQ ID NO: 9 como 10, o tanto de SEQ ID NO: 9 como 11. Además, los TCR, polipéptidos o proteínas inventivos pueden consistir esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (CDR1 de cadena a), SEQ ID n O: 4 (CDR2 de cadena a), SEQ ID NO: 5 (CDR3 de cadena a), SEQ ID NO: 6 (CDR1 de cadena p), SEQ ID NO: 7 (CDR2 de cadena p), SEQ ID NO: 8 (CDR3 de cadena p), o cualquier combinación de los mismos, por ejemplo, SEQ ID NO: 3-5; 6-8; o 3-8.

El TCR, polipéptido y/o proteína de la invención se pueden obtener mediante métodos conocidos en la técnica. Los métodos adecuados de síntesis de polipéptidos y proteínas nuevos es conocida en la técnica. Además, los polipéptidos y proteínas se pueden producir de forma recombinante usando los ácidos nucleicos descritos en el presente documento usando métodos recombinantes convencionales. Véase, por ejemplo, Green y Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4.a ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2012. Además, algunos de los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención se pueden aislar y/o purificar de una fuente, tal como una planta, una bacteria, un insecto, un mamífero, p. ej., una rata, un ser humano, etc. Los métodos de aislamiento y purificación son bien conocidos en la técnica. Alternativamente, los TCR, polipéptidos y/o proteínas descritos en el presente documento pueden ser sintetizados comercialmente por empresas tales como Synpep (Dublin, CA), Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD) y Múltiple Peptide Systems (San Diego, CA). A este respecto, los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención pueden ser sintéticos, recombinantes, aislados y/o purificados.

Están incluidos en el alcance de la invención los conjugados, p. ej., bioconjugados, que comprenden cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas inventivos, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedantes o poblaciones de células hospedantes. Los conjugados, así como los métodos para sintetizar conjugados en general, son conocidos en la técnica.

Una realización de la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas descritos en el presente documento. "Ácido nucleico", como se usa en el presente documento, incluye "polinucleótido", "oligonucleótido" y "molécula de ácido nucleico", y generalmente significa un polímero de ADN o ARN, que puede ser monocatenario o bicatenario, sintetizado u obtenido (p. ej., aislado y/o purificado) de fuentes naturales, que pueden contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados, y que pueden contener un enlace internucleotídico natural, no natural o alterado, tal como un enlace fosforoamidato o un enlace fosforotioato, en lugar del fosfodiéster que se encuentra entre los nucleótidos de un oligonucleótido no modificado. En una realización, el ácido nucleico comprende ADN complementario (ADNc). Generalmente se prefiere que el ácido nucleico no comprenda ninguna inserción, deleción, inversión y/o sustitución. Sin embargo, puede ser adecuado en algunos casos, como se describe en el presente documento, que el ácido nucleico comprenda una o más inserciones, deleciones, inversiones y/o sustituciones.

Preferiblemente, los ácidos nucleicos de la invención son recombinantes. Como se usa en el presente documento, el término "recombinante" se refiere a (i) moléculas que se construyen fuera de las células vivas uniendo segmentos de ácidos nucleicos naturales o sintéticos con moléculas de ácidos nucleicos que pueden replicarse en una célula viva, o (ii) moléculas que resultan de la replicación de las descritas en (i) antes. Para los propósitos del presente documento, la replicación puede ser replicación in vitro o replicación in vivo.

Los ácidos nucleicos se pueden construir basándose en síntesis química y/o reacciones de ligado enzimático utilizando procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Green y Sambrook et al., véase antes. Por ejemplo, un ácido nucleico se puede sintetizar químicamente utilizando nucleótidos de origen natural o nucleótidos modificados de diversas formas diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado tras la hibridación (p. ej., derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina). Los ejemplos de nucleótidos modificados que se pueden usar para generar los ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, N6-adenina sustituida, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracilo-5-oxiacético (v), wybutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2- tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracilo-5-oxiacético, 3- (3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo y 2,6-diaminopurina. Alternativamente, uno o más de los ácidos nucleicos de la invención se pueden adquirir de empresas, tales como Macromolecular Resources (Fort Collins, CO) y Synthegen (Houston, TX).

El ácido nucleico puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos que codifique cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas descritos en el presente documento. En una realización de la invención, la secuencia de nucleótidos puede comprender, consistir o consistir esencialmente en la SEQ ID NO: 61. La secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 61 codifica la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12 (cadenas alfa y beta de longitud completa de TCR con cisteína sustituida, con aminoácido hidrófobo sustituido unidas por un conector).

En una realización de la invención, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos con codones optimizados. Sin estar ligados a una teoría o mecanismo particular, se cree que la optimización de codones de la secuencia de nucleótidos aumenta la eficiencia de traducción de los transcritos de ARNm. La optimización de codones de la secuencia de nucleótidos puede implicar la sustitución de un codón nativo por otro codón que codifique el mismo aminoácido, pero puede ser traducido por el ARNt que está más fácilmente disponible dentro de una célula, lo que aumenta la eficiencia de la traducción. La optimización de la secuencia de nucleótidos también puede reducir las estructuras de ARNm secundarias que interferirían con la traducción, aumentando así la eficiencia de la traducción. Por ejemplo, la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 61 tiene los codones optimizados para la expresión en una célula humana.

La invención también proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento o una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento.

La secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas se hibrida preferiblemente en condiciones de alta rigurosidad. Por "condiciones de alta rigurosidad" se entiende que la secuencia de nucleótidos se hibrida específicamente con una secuencia diana (la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento) en una cantidad que es detectablemente más fuerte que la hibridación no específica. Las condiciones de alta rigurosidad incluyen condiciones que distinguirían un polinucleótido con una secuencia complementaria exacta, o uno que contenga solo unas pocas discordancias dispersas de una secuencia aleatoria que resulta tener algunas regiones pequeñas (p. ej., 3-10 bases) que coincidían con la secuencia de nucleótidos. Estas pequeñas regiones de complementariedad se funden más fácilmente que un complemento de longitud completa de 14-17 o más bases, y la hibridación de alta rigurosidad las hace fácilmente distinguibles. Las condiciones de rigurosidad relativamente alta incluirían, por ejemplo, condiciones de baja salinidad y/o alta temperatura, tales como las proporcionadas por NaCl aproximadamente 0.02-0.1 M o el equivalente, a temperaturas de aproximadamente 50-70°C. Dichas condiciones de alta rigurosidad toleran pocas, si es que hay alguna, discordancias entre la secuencia de nucleótidos y el molde o cadena diana, y son particularmente adecuadas para detectar la expresión de cualquiera de los TCR de la invención. En general, se aprecia que las condiciones pueden hacerse más rigurosas mediante la adición de cantidades crecientes de formamida.

La invención también proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente 70% o más, p. ej., aproximadamente 80%, aproximadamente 90%, aproximadamente 91%, aproximadamente 92%, aproximadamente 93%, aproximadamente 94%, aproximadamente 95%, aproximadamente 96%, aproximadamente 97%, aproximadamente 98% o aproximadamente 99% idéntica a cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento.

Los ácidos nucleicos de la invención se pueden incorporar en un vector de expresión recombinante. En este sentido, la invención proporciona vectores de expresión recombinantes que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención. En una realización de la invención, el vector de expresión recombinante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica la cadena a, la cadena p y el péptido conector. Por ejemplo, en una realización, el vector de expresión recombinante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica las cadenas alfa y beta de longitud completa del TCR inventivo con un conector colocado entre ellas, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena beta está situada 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena alfa. En una realización de la invención, la secuencia de nucleótidos codifica las cadenas alfa y beta de longitud completa del TCR inventivo con un conector colocado entre ellas, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena beta está situada 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena alfa.

Para los fines del presente documento, la expresión "vector de expresión recombinante" significa una construcción de oligonucleótido o polinucleótido modificada genéticamente que permite la expresión de un ARNm, proteína, polipéptido o péptido por una célula hospedante, cuando la construcción comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARNm, proteína, polipéptido o péptido, y el vector se pone en contacto con la célula en condiciones suficientes para que el ARNm, proteína, polipéptido o péptido se expresen dentro de la célula. Los vectores de la invención no se dan de forma natural en su conjunto. Sin embargo, partes de los vectores pueden ser de origen natural. Los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden comprender cualquier tipo de nucleótidos, incluyendo, pero no limitados a ADN y ARN, que pueden ser monocatenarios o bicatenarios, sintetizados u obtenidos en parte de fuentes naturales, y que pueden contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados. Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender enlaces internucleotídicos de origen natural, de origen no natural, o ambos tipos de enlaces. Preferiblemente, los nucleótidos o enlaces internucleotídicos de origen no natural o alterados no impiden la transcripción o replicación del vector.

El vector de expresión recombinante de la invención puede ser cualquier vector de expresión recombinante adecuado y puede usarse para transformar o transfectar cualquier célula hospedante adecuada. Los vectores adecuados incluyen aquellos diseñados para propagación y expansión o para expresión o ambos, tales como plásmidos y virus. El vector puede seleccionarse del grupo que consiste en la serie pUC (Fermentas Life Sciences), la serie pBluescript (Stratagene, LaJolla, CA), la serie pET (Novagen, Madison, WI), la serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y la serie pEX (Clontech, Palo Alto, CA). También se pueden usar vectores de bacteriófagos, tales como AGT10 AGT11, AZapII (Stratagene), AEMBL4 y ANM1149. Los ejemplos de vectores de expresión de plantas incluyen pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 y pBIN19 (Clontech). Los ejemplos de vectores de expresión animal incluyen pEUK-Cl, pMAM y pMAMneo (Clontech). Preferiblemente, el vector de expresión recombinante es un vector viral, p. ej., un vector retroviral. En una realización especialmente preferida, el vector de expresión recombinante es un vector MSGV1.

En una realización preferida, el vector de expresión recombinante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena alfa y una cadena beta de cualquiera de los TCR descritos en el presente documento, en donde la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena beta está situada en 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena alfa. En este sentido, la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena alfa puede estar situada en 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena beta. Sin estar ligado a una teoría o mecanismo en particular, se cree que una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena beta que está situada en 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena alfa puede proporcionar uno o más de mayor reconocimiento de dianas KK-LC-1+, mayor expresión por una célula hospedante y mayor actividad antitumoral en comparación con una secuencia de nucleótidos que codifica una cadena beta que está situada en 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena alfa. En una realización menos preferida, la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena beta está situada en 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena alfa. En este sentido, la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena alfa puede estar situada en 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena beta.

Los vectores de expresión recombinantes de la invención se pueden preparar usando técnicas convencionales de ADN recombinante descritas, por ejemplo, en Green y Sambrook et al. Pueden prepararse construcciones de vectores de expresión, que son circulares o lineales, para contener un sistema de replicación funcional en una célula hospedante procariota o eucariota. Los sistemas de replicación se pueden obtener, p. ej., de ColEl, plásmido 2 p, A, SV40, virus del papiloma bovino y similares.

Deseablemente, el vector de expresión recombinante comprende secuencias reguladoras, tales como codones de inicio y terminación de la transcripción y traducción, que son específicos para el tipo de célula hospedante (p. ej., bacteria, hongo, planta o animal) en la que se va a introducir el vector, según corresponda y teniendo en cuenta si el vector está basado en ADN o ARN.

El vector de expresión recombinante puede incluir uno o más genes marcadores, que permiten la selección de células hospedantes transformadas o transfectadas. Los genes marcadores incluyen resistencia a biocidas, p. ej., resistencia a antibióticos, metales pesados, etc., complementación en una célula hospedante auxótrofa para proporcionar prototrofia y similares. Los genes marcadores adecuados para los vectores de expresión de la invención incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a neomicina/G418, genes de resistencia a higromicina, genes de resistencia a histidinol, genes de resistencia a tetraciclina y genes de resistencia a ampicilina.

El vector de expresión recombinante puede comprender un promotor nativo o no nativo unido operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica el TCR, polipéptido o proteína, o a la secuencia de nucleótidos que es complementaria o que se hibrida con la secuencia de nucleótidos que codifica el TCR, polipéptido o proteína. La selección de promotores, p. ej., fuerte, débil, inducible, específico de tejido y específico de desarrollo, forma parte de la experiencia habitual del experto en la técnica. De manera similar, la combinación de una secuencia de nucleótidos con un promotor también forma parte de la experiencia del experto en la técnica. El promotor puede ser un promotor no viral o un promotor viral, p. ej., un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de SV40, un promotor de RSV y un promotor que se encuentra en la repetición terminal larga del virus de células madre murinas.

Los vectores de expresión recombinantes inventivos pueden diseñarse para expresión transitoria, para expresión estable o para ambas. Además, los vectores de expresión recombinantes se pueden preparar para expresión constitutiva o para expresión inducible. Además, los vectores de expresión recombinantes se pueden hacer para que incluyan un gen suicida.

Como se usa en el presente documento, la expresión "gen suicida" se refiere a un gen que hace que la célula que expresa el gen suicida muera. El gen suicida puede ser un gen que confiere sensibilidad a un agente, p. ej., un fármaco, en la célula en la que se expresa el gen, y hace que la célula muera cuando la célula entra en contacto o se expone al agente. Los genes suicidas son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, el gen de la timidina quinasa (TK) del virus del herpes simple (HSV), la citosina daminasa, la purina nucleósido fosforilasa y la nitroreductasa.

Otra realización de la invención proporciona además una célula hospedante que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinantes descritos en el presente documento. Como se usa en el presente documento, la expresión "célula hospedante" se refiere a cualquier tipo de célula que pueda contener el vector de expresión recombinante de la invención. La célula hospedante puede ser una célula eucariota, p. ej., de planta, animal, hongo o alga, o puede ser una célula procariota, p. ej., bacteria o protozoo. La célula hospedante puede ser una célula cultivada o una célula primaria, es decir, aislada directamente de un organismo, p. ej., un ser humano. La célula hospedante puede ser una célula adherente o una célula suspendida, es decir, una célula que crece en suspensión. Las células hospedantes adecuadas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, células DH5a de E. coli, células de ovario de hámster chino, células VERO de mono, células COS, células HEK293 y similares. Con el fin de amplificar o replicar el vector de expresión recombinante, la célula hospedante es preferiblemente una célula procariota, p. ej., una célula DH5a. Con el fin de producir un TCR, polipéptido o proteína recombinantes, la célula hospedante es preferiblemente una célula de mamífero. Lo más preferiblemente, la célula hospedante es una célula humana. Aunque la célula hospedante puede ser de cualquier tipo de célula, puede originarse a partir de cualquier tipo de tejido y puede estar en cualquier etapa de desarrollo, la célula hospedante es preferiblemente un linfocito de sangre periférica (PBL) o una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC). Más preferiblemente, la célula hospedante es una célula T.

Para los fines del presente documento, la célula T puede ser cualquier célula T, tal como una célula T cultivada, p. ej., una célula T primaria, o una célula T de una línea de células T cultivadas, p. ej., Jurkat, SupTI, etc., o una célula T obtenida de un mamífero. Si se obtiene de un mamífero, la célula T se puede obtener de numerosas fuentes, incluyendo, pero no limitado a la sangre, médula ósea, ganglios linfáticos, timo u otros tejidos o fluidos. Las células T también se pueden enriquecer o purificar. Preferiblemente, la célula T es una célula T humana. Más preferiblemente, la célula T es una célula T aislada de un ser humano. La célula T puede ser cualquier tipo de célula T y puede estar en cualquier etapa de desarrollo, incluyendo, pero no limitadas a células T doble positivas CD4+/CD8+, células T auxiliares CD4+, p. ej., células Thi y Th2 , células T CD4+, células T CD8+ (p. ej., células T citotóxicas), linfocitos infiltrantes de tumores (TIL), células T de memoria (p. ej., células T de memoria central y células T de memoria efectoras), células T na'íve y similares.

La invención también proporciona una población de células que comprende al menos una célula hospedante descrita en el presente documento. La población de células puede ser una población heterogénea que comprende la célula hospedante que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinantes descritos, además de al menos otra célula, p. ej., una célula hospedante (p. ej., una célula T), que no comprende ninguno de los vectores de expresión recombinantes, o una célula distinta de una célula T, p. ej., una célula B, un macrófago, un neutrófilo, un eritrocito, un hepatocito, una célula endotelial, una célula epitelial, una célula muscular, una célula cerebral, etc. Alternativamente, la población de células puede ser una población sustancialmente homogénea, en la que la población comprende principalmente células hospedantes (p. ej., que consisten esencialmente en) que comprenden el vector de expresión recombinante. La población también puede ser una población clonal de células, en la que todas las células de la población son clones de una única célula hospedante que comprende un vector de expresión recombinante, de manera que todas las células de la población comprenden el vector de expresión recombinante. En una realización de la invención, la población de células es una población clonal que comprende células hospedantes que comprenden un vector de expresión recombinante como se describe en el presente documento.

En una realización de la invención, el número de células en la población puede expandirse rápidamente. La expansión del número de células T se puede lograr mediante cualquiera de una serie de métodos conocidos en la técnica como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. 8034334; patente de EE. UU. 8383099; publicación de solicitud de patente de EE. UU. N° 2012/0244133; Dudley et al., J. Immunother., 26:332-42 (2003); y Riddell et al., J. Immunol. Methods, 128:189-201 (1990). Por ejemplo, la expansión del número de células T puede llevarse a cabo cultivando las células T con anticuerpo OKT3, lL-2 y PBMC alimentadoras (p. ej., PBMC alogénicas irradiadas).

Los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes y células hospedantes (incluidas las poblaciones de los mismos) de la invención pueden aislarse y/o purificarse. El término "aislado", tal como se usa en el presente documento, significa que se ha retirado de su entorno natural. El término "purificado", tal como se usa en el presente documento, significa que se ha aumentado la pureza, en donde "pureza" es un término relativo y no debe interpretarse necesariamente como pureza absoluta. Por ejemplo, la pureza puede ser de al menos aproximadamente 50 %, puede ser superior al 60%, 70%, 80%, 90%, 95% o puede ser de 100%.

Los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes y células hospedantes (incluidas las poblaciones de los mismos) de la invención, todos los cuales se denominan colectivamente "materiales de TCR inventivos" en lo sucesivo, pueden formularse en una composición, tal como una composición farmacéutica. A este respecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión y células hospedantes (incluidas las poblaciones de los mismos) descritos en el presente documento y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas inventivas que contienen cualquiera de los materiales de TCR inventivos pueden comprender más de un material de TCR inventivo, p. ej., un polipéptido y un ácido nucleico, o dos o más TCR diferentes. Alternativamente, la composición farmacéutica puede comprender un material de TCR de la invención en combinación con otro(s) agente(s) farmacéuticamente activo(s) o fármaco(s), tales como agentes quimioterapéuticos, p. ej., asparaginasa, busulfano, carboplatino, cisplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina, vincristina, etc.

Preferiblemente, el vehículo es un vehículo farmacéuticamente aceptable. Con respecto a las composiciones farmacéuticas, el vehículo puede ser cualquiera de los utilizados convencionalmente para el material de TCR inventivo particular que se está considerando. Dichos vehículos farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por los expertos en la técnica y están fácilmente disponibles para el público. Se prefiere que el vehículo farmacéuticamente aceptable sea uno que no tenga efectos secundarios perjudiciales o toxicidad en las condiciones de uso.

La elección del vehículo estará determinada en parte por el material de TCR inventivo particular, así como por el método particular usado para administrar el material de TCR inventivo. Por consiguiente, existe una variedad de formulaciones adecuadas de la composición farmacéutica de la invención. Las formulaciones adecuadas pueden incluir cualquiera de aquellas para administración oral, parenteral, subcutánea, intratumoral, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal o interperitoneal. Se puede usar más de una ruta para administrar los materiales de TCR inventivos y, en ciertos casos, una ruta particular puede proporcionar una respuesta más inmediata y más efectiva que otra ruta.

Preferiblemente, el material de TCR inventivo se administra por inyección, p. ej., por vía intravenosa. Cuando el material de TCR inventivo es una célula hospedante que expresa el TCR inventivo, el vehículo farmacéuticamente aceptable para las células para inyección puede incluir cualquier vehículo isotónico tal como, por ejemplo, solución salina normal (NaCl en agua aproximadamente al 0.90% p/v, NaCl en agua aproximadamente 300 mOsm/l, o aproximadamente 9.0 g de NaCl por litro de agua), solución electrolítica NORMOSOL R (Abbott, Chicago, IL), PLASMA-LYTE A (Baxter, Deerfield, IL), dextrosa en agua aproximadamente al 5%, o lactato de Ringer. En una realización, el vehículo farmacéuticamente aceptable se complementa con albúmina de suero humano.

Para los fines de la invención, la cantidad o dosis (p. ej., el número de células cuando el material de TCR inventivo es una o más células) del material de TCR inventivo administrado debe ser suficiente para efectuar, p. ej., una respuesta terapéutica o profiláctica en el sujeto o animal a lo largo de un período de tiempo razonable. Por ejemplo, la dosis del material de TCR inventivo debe ser suficiente para unirse a un antígeno canceroso, o detectar, tratar o prevenir el cáncer en un período de aproximadamente 2 horas o más, p. ej., 12 a 24 horas o más, desde el momento de la administración. En ciertas realizaciones, el período de tiempo podría ser incluso mayor. La dosis estará determinada por la eficacia del material de TCR inventivo particular y la afección del animal (p. ej., ser humano), así como el peso corporal del animal (p. ej., ser humano) para tratar.

En la técnica se conocen muchos ensayos para determinar una dosis administrada. Para los fines de la invención, un ensayo, que comprende comparar el grado en que las células diana son lisadas o el IFN-y es secretado por las células T que expresan el TCR, polipéptido o proteína de la invención tras la administración de una dosis dada de tales células T a un mamífero entre un conjunto de mamíferos a cada uno de los cuales se le administra una dosis diferente de las células T, podría usarse para determinar una dosis inicial que se administrará a un mamífero. El grado en que son lisadas las células diana o secretado el IFN-y tras la administración de una determinada dosis puede ensayarse mediante métodos conocidos en la técnica.

La dosis del material de TCR inventivo también estará determinada por la existencia, la naturaleza y grado de cualquier efecto secundario adverso que pueda acompañar a la administración de un material de TCR inventivo en particular. Normalmente, el médico tratante decidirá la dosis del material de TCR inventivo con el que tratar a cada paciente individual, teniendo en cuenta una variedad de factores, tales como la edad, peso corporal, salud general, dieta, sexo, material de TCR inventivo que se va a administrar, vía de administración y la gravedad de la afección que se está tratando. En una realización en la que el material de TCR inventivo es una población de células, el número de células administradas por infusión puede variar, p. ej., desde aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1012 células o más. En ciertas realizaciones, se pueden administrar menos de 1 x 106 células.

Está contemplado que las composiciones farmacéuticas, TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedantes o poblaciones de células de la invención pueden usarse en métodos para tratar o prevenir el cáncer. Sin vincularse a una teoría o mecanismo en particular, se cree que los TCR inventivos se unen específicamente a KK-LC-1, de modo que el TCR (o el polipéptido o proteína inventivos relacionados), cuando se expresa en una célula, es capaz de mediar en una respuesta inmunitaria contra una célula diana que expresa KK-LC-1. En este sentido, la invención proporciona un método para tratar o prevenir el cáncer en un mamífero, que comprende administrar al mamífero cualquiera de las composiciones farmacéuticas, TCR, polipéptidos o proteínas descritas en el presente documento, cualquier ácido nucleico o vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los TCR, polipéptidos, proteínas descritos en el presente documento, o cualquier célula hospedante o población de células que comprende un vector recombinante que codifica cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas descritos en el presente documento, en una cantidad eficaz para tratar o prevenir el cáncer en el mamífero.

Los términos "tratar" y "prevenir", así como las palabras derivadas de los mismos, tal como se utilizan en el presente documento, no implican necesariamente un tratamiento o prevención de 100% o completos. Más bien, existen diversos grados de tratamiento o prevención de los cuales un experto en la técnica reconoce que tienen un beneficio potencial o efecto terapéutico. A este respecto, los métodos inventivos pueden proporcionar cualquier cantidad de cualquier nivel de tratamiento o prevención del cáncer en un mamífero. Además, el tratamiento o la prevención proporcionados por el método inventivo pueden incluir el tratamiento o la prevención de una o más afecciones o síntomas del cáncer que se está tratando o previniendo. Por ejemplo, el tratamiento o la prevención pueden incluir promover la regresión de un tumor. Además, para los fines del presente documento, "prevención" puede abarcar retrasar la aparición de la afección, o un síntoma o afección de la misma, o prevenir la recurrencia del cáncer.

También se proporciona un método para detectar la presencia de cáncer en un mamífero. El método comprende poner en contacto una muestra que comprende una o más células del mamífero con cualquiera de los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedantes, poblaciones de células o composiciones farmacéuticas de la invención descritos en el presente documento, formando así un complejo, y detectar el complejo, en donde la detección del complejo es indicativa de la presencia de cáncer en el mamífero, en donde la afección es cáncer.

Con respecto al método inventivo para detectar cáncer en un mamífero, la muestra de células puede ser una muestra que comprende células enteras, lisados de las mismas, o una fracción de los lisados de células enteras, p ej., una fracción nuclear o citoplasmática, una fracción de proteínas enteras, o una fracción de ácidos nucleicos.

Para los fines del método de detección inventivo, el contacto puede tener lugar in vitro o in vivo con respecto al mamífero. Preferiblemente, el contacto es in vitro.

Además, la detección del complejo puede ocurrir mediante varias formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los TCR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedantes o poblaciones de células de la invención descritos en el presente documento pueden marcarse con un marcador detectable tal como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (p. ej., isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (p. ej., fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante) y partículas de elementos (p. ej., partículas de oro).

Para los fines de los métodos inventivos, en donde se administran células hospedantes o poblaciones de células, las células pueden ser células que son alogénicas o autólogas del mamífero. Preferiblemente, las células son autólogas del mamífero.

Con respecto a los métodos inventivos, el cáncer puede ser cualquier tipo de cáncer, incluido cualquiera de cáncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiosarcoma alveolar, cáncer de huesos, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer del ano, canal anal o anorrectal, cáncer del ojo, cáncer del conducto biliar intrahepático, cáncer de las articulaciones, cáncer de cuello, vesícula biliar o pleura, cáncer de nariz, cavidad nasal u oído medio, cáncer de la cavidad oral, cáncer de vagina, cáncer de vulva, leucemia linfocítica crónica, cáncer mieloide crónico, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer de cuello uterino, tumor carcinoide gastrointestinal, glioma, linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, cáncer de riñón, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, mesotelioma maligno, melanoma, mieloma múltiple, cáncer de nasofaringe, linfoma no Hodgkin, cáncer de orofaringe, cáncer de ovario, cáncer de pene, cáncer de páncreas, cáncer de peritoneo, epiplón y mesenterio, cáncer de faringe, cáncer de próstata, cáncer rectal cáncer, cáncer renal, cáncer de piel, cáncer de intestino delgado, cáncer de tejidos blandos, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de tiroides, cáncer de útero, cáncer de uréter y cáncer de vejiga urinaria. Un cáncer preferido es el cáncer de vejiga, cuello uterino, estómago, mama, pulmón, colon, recto o páncreas. Un cáncer particularmente preferido es el carcinoma de vejiga, cuello uterino, estómago, mama, pulmón, colon, recto o páncreas. Mientras que los cánceres más comúnmente asociados con la expresión de KK-LC-1 incluyen cáncer de vejiga, cuello uterino, estómago, mama, pulmón, colon, recto y páncreas, los métodos inventivos pueden usarse para tratar cualquier cáncer positivo para KK-LC-1, incluidos los que se producen en otras áreas anatómicas.

El mamífero al que se hace referencia en los métodos inventivos puede ser cualquier mamífero. Como se usa en el presente documento, el término "mamífero" se refiere a cualquier mamífero, incluyendo, pero no limitados a mamíferos del orden Rodentia, tales como ratones y hámsteres, y mamíferos del orden Logomorpha, tales como conejos. Se prefiere que los mamíferos sean del orden Carnivora, incluyendo Felinos (gatos) y Caninos (perros). Se prefiere más que los mamíferos sean del orden Artiodactyla, que incluye bovinos (vacas) y cerdos (cerdos) o del orden Perssodactyla, que incluye equinos (caballos). Lo más preferido es que los mamíferos sean del orden Primates, Ceboidea o Simoidea (monos) o del orden Antropoide (seres humanos y simios). Un mamífero especialmente preferido es el ser humano.

Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención pero, por supuesto, no deben interpretarse como limitantes de ningún modo de su alcance.

Ejemplo 1

Este ejemplo demuestra el aislamiento de un TCR anti-KK-LC-1.

Una paciente con adenocarcinoma de cuello uterino experimentó la regresión completa de su enfermedad metastásica después de la administración de linfocitos infiltrantes de tumores (TIL) (TIL-3853). Los TIL-3853 se sometieron a análisis IMMUNOSEQ (Adaptive Biotechnologies) para identificar las secuencias de las cadenas de TCRa y TCRp en el repertorio de células T administradas. Las células T administradas estaban compuestas principalmente por un clonotipo con una frecuencia aproximada de 67% (TCRBV07-03/TCRAV35-01). El TCR comprendía una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena alfa de SEQ ID NO: 9 y una secuencia de aminoácidos de región variable de cadena beta de SEQ ID NO: 11. La región de unión (CDR3 flanqueada por un resto de aminoácido en cada lado) de la cadena alfa comprendía la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18. La región de unión de la cadena beta comprendía la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19.

Ejemplo 2

Este ejemplo demuestra la construcción de un vector retroviral que codifica el TCR anti-KK-LC-1.

Se construyó un vector retroviral MSGV1 que codificaba las regiones variables de la cadena alfa y beta del TCR que eran idénticas a las del TCR del ejemplo 1 con la excepción de que el resto de aminoácido en la posición 2 de la cadena beta se cambió de una glicina a una alanina con el fin de facilitar la clonación en el vector. Se hicieron modificaciones adicionales al TCR de tipo natural, como se describe con más detalle a continuación.

Las regiones VDJ de TCRp se fusionaron con una cadena constante de TCRp de ratón, y las regiones VJ de TCRa se fusionaron con la cadena constante de TCRa de ratón. Sin estar ligado a una teoría o mecanismo en particular, se cree que reemplazar las regiones constantes de las cadenas de TCRa y TCRp humanas con regiones constantes murinas mejora la expresión y la funcionalidad del TCR. Cohen et al., Cáncer Res., 66(17): 8878-86 (2006)).

Además, las cadenas constantes de TCRa y TCRp murinos se modificaron con cisteína y se introdujeron mutaciones hidrófobas transmembrana en la cadena constante de TCRa murino. Sin estar ligado a una teoría o mecanismo en particular, se cree que estas modificaciones dan como resultado un emparejamiento preferencial de las cadenas de TCR introducidas y una mayor expresión y funcionalidad de la superficie del TCR. Cohen et al., Cáncer Res., 67(8):3898-903 (2007); Haga-Friedman et al., J. Immu, 188: 5538-5546 (2012)).

Después de hacer las modificaciones descritas en este ejemplo, la cadena alfa del TCR de longitud completa comprendía la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y la cadena beta del TCR de longitud completa comprendía la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16.

Las cadenas TCRp y TCRa se separaron mediante un conector de Furina Ser/Gly P2A (SEQ ID NO: 17) para asegurar una eficiencia de expresión comparable de las dos cadenas (Szymczak et al., Nat. Biotechnol., 22(5):589-94 (2004)). El vector MSGV1 final comprendía un casete de expresión que comprendía la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 61 que codificaba la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. El casete de expresión codificaba, desde el extremo 5' al 3', la cadena beta del TCR de longitud completa de SEQ ID NO: 16, el conector de Furina Ser/Gly P2A de SEQ ID NO: 17 y la cadena alfa del TCR de longitud completa de SEQ ID NO: 15. El casete de expresión tenía la siguiente configuración: 5'NotI-VDJp-mCp-Furina/SGSG/P2A-VJa-mCa-EcoRI3'.

Ejemplo 3

Este ejemplo demuestra la expresión del TCR por células T de sangre periférica transducidas con el vector del ejemplo 2.

Se produjo un retrovirus que codificaba el TCR y se usó para transducir células T autólogas de sangre periférica con el vector MSGV1 del ejemplo 2. La expresión del TCR introducido se evaluó por citometría de flujo usando un anticuerpo específico para la región constante de la cadena TCRp de ratón. La Tabla 1 muestra el porcentaje de células T no transducidas (UT) y transducidas con TCR que expresan CD8 y la región constante de la cadena beta del TCR murino (mTCRbeta).

Tabla 1

Ejemplo 4

Este ejemplo demuestra la especificidad del TCR del ejemplo 2.

Se analizó la reactividad de las células T transducidas con TCR del ejemplo 3 frente a una serie de antígenos tumorales. Las células presentadoras de antígeno autólogas (APC) del paciente se sometieron a electroporación con ARN que codifica el antígeno tumoral KK-LC-1, GP100 o MAGEA3 (células diana). Las APC de las células diana de control se sometieron a electroporación con ARN que codifica la proteína fluorescente verde (GFP). Las células diana de APC se cocultivaron con las células T transducidas con TCR del ejemplo 3 (células efectoras). Como controles, las células T transducidas con TCR se cultivaron solas o se estimularon de forma no específica con acetato miristato de forbol (PMA)/ionomicina. La reactividad se evaluó contando el número de puntos positivos de interferón (IFN)-y por 20 000 células T (ELISPOT). Los resultados se muestran en la Tabla 2.

Tabla 2

Como se muestra en la Tabla 2, las células T transducidas con TCR eran reactivas frente al antígeno KK-LC-1, pero no frente a otros antígenos ensayados. Estos resultados indicaban que el TCR introducido reconocía un epítopo de KK-LC-1 presentado en el contexto de una molécula de HLA del paciente.

Ejemplo 5

Este ejemplo demuestra que la respuesta de KK-LC-1 en TIL-3853 está mediada por células T CD8+.

También se analizó la reactividad de los TIL-3853 del ejemplo 1 contra el antígeno KK-LC-1 midiendo la regulación por aumento de CD137 por citometría de flujo. Las tablas 3 y 4 muestran el porcentaje de células T de sangre periférica antes del tratamiento de la paciente 3853 (tabla 3) y de TIL-3853 (tabla 4) (células delimitadas en células T CD3+) que expresan CD8 y CD137 después del tratamiento con el estimulador no específico PMA/ionomicina o después del cocultivo con APC que expresa KK-LC-1 o GFP.

Tabla 3

Tabla 4

Los resultados indicaban que la respuesta de KK-LC-1 en TIL-3853 era mediada por células T CD8+ (% de células T CD137+CD8+ indicado en negrita) (Tablas 3 y 4). Este hallazgo sugería que era probable que el TCR de KK-LC-1 estuviera restringido por HLA de clase I.

Ejemplo 6

Este ejemplo demuestra que el TCR del ejemplo 2 tiene especificidad antigénica por KK-LC-1 presentado en el contexto de un molécula HLA-A*0101.

Para identificar el elemento de restricción HLA del TCR reactivo con KK-LC-1 del ejemplo 2, se transfectaron células COS7 (células diana) con ADN que codifica (i) ninguna molécula HLA o una de las seis moléculas HLA clase I de la paciente 3853 (A*01:01, A*25:01, B*08:01, B*18:01, C*07:01 o C*12:03) y (ii) el antígeno KK-LC-1, antígeno de control MAGE-A3, antígeno de control GFP o ningún antígeno (Figura 1A). Se usaron células T transducidas con TCR restringido por HLA-A*0101 dirigido a MAGE-A3168-176 y células T no transducidas (UT) como células efectoras de control. Las células diana se cocultivaron con las células efectoras de control o las células T efectoras transducidas con el TCR del ejemplo 2. Como controles, las células COS7 se cultivaron solas, las células T UT y transducidas con TCR se cultivaron solas y las células T UT y transducidas con TCR se estimularon de forma no específica con PMA/ionomicina. Se midió el IFN-y liberado en los líquidos sobrenadantes. Los resultados se muestran en la Figura 1A.

Como se muestra en la Figura 1A, el TCR anti-KK-LC-1 del ejemplo 2 reconocía específicamente el antígeno KK-LC-1 en el contexto de la molécula HLA-A*0101.

Ejemplo 7

Este ejemplo demuestra que el epítopo mínimo de KK-LC-1 al que se dirige el TCR anti-KK-LC-1 restringido por HLA-A*0101 del ejemplo 2 está situado entre los restos 49 y 67 de la proteína KK-LC-1.

Para identificar el epítopo al que se dirige el TCR reactivo con KK-LC-1, se sintetizaron péptidos 15-meros que solapan en 11 aminoácidos, que abarcan toda la proteína KK-LC-1 (Tabla 5). Cada péptido se pulsó individualmente en APC autólogas (células diana) y se analizó el reconocimiento por células T de sangre periférica autólogas transducidas con el TCR del ejemplo 2 (células efectoras) por ELISPOT de IFN-y . Las APC autólogas pulsadas sin péptido o con péptido irrelevante sirvieron como células diana de control. Células T UT, células T transducidas con TCR anti-KK-LC-1 y APC autólogas (células diana EBV-LCL) cultivadas solas, y las células T UT y células T transducidas con TCR anti-KK-LC-1 estimuladas de forma no específica con PMA/ionomicina, sirvieron como controles. Se usaron células T no transducidas como células efectoras de control, y estas células efectoras de control no mostraron reconocimiento de ninguno de los péptidos (Figura 1B). Los péptidos brutos en la Tabla 5 fueron sintetizados por Genscript.

Tabla 5

Como se muestra en la Figura 1B, las células T transducidas con el TCR del ejemplo 2 reconocían dos péptidos 15-meros correspondientes a las posiciones de restos de aminoácidos 49-63 (INSNTDNNLAVYDLS) (SEQ Id NO: 32) y 53-67 (TDNNLAVYDLSRDIL) (SEQ ID NO: 33) de la proteína KK-LC-1 (Figura 1B). Este resultado indicaba que el epítopo mínimo de KK-LC-1 al que se dirige el TCR anti-KK-LC-1 restringido por HLA-A*0101 del ejemplo 2 se situaba entre los restos 49 y 67 de la proteína KK-LC-1.

Ejemplo 8

Este ejemplo demuestra que KK-LC-152-60 (NTDNNLAVY) (SEQ ID NO: 2) es el epítopo mínimo probable al que se dirigen las células T transducidas con TCR anti-KK-LC-1 restringido por HLA-A*0101 del ejemplo 2.

Para definir aún más el epítopo mínimo de KK-LC-1 al que se dirige el TCR reactivo con KK-LC-1 restringido por HLA-A*0101, se usaron algoritmos de predicción de péptidos (iedb.org) para predecir los mejores péptidos de unión de KK-LC-1 en HLA-A*0101. El algoritmo de predicción indicó que un péptido 9-mero 52-60 (NTDNn La VY) (SEQ ID NO: 2) presentaba la mayor afinidad entre todos los péptidos 8-, 9-, 10- y 11-mero predichos de KK-LC-1 en HLA-A*0101 (Tabla 6). Además del péptido 9-mero mejor previsto, se sintetizaron una versión de péptido 8-mero más corto (NTDNNLAV) (SEQ ID NO: 46), una 10-mero más larga (NTDNNLAVYD) (SEQ ID NO: 52) y una 11 -mero más larga (NTDNNLAVYDL) (SEQ ID NO: 48) de este péptido 9-mero (Tabla 7).

Tabla 6

Tabla 6: Las predicciones de MHC-clase I se hicieron utilizando la herramienta ANN de análisis de recursos de IEDB (Nielsen et al., Protein Sci., 12: 1007-1017 (2003); Lundegaard et al., Nucleic Acids Res., 36: W509-512 (2008)). La afinidad <50 nM se considera alta. El péptido 9-mero NTDNNLAVY (SEQ ID NO: 2) mostró la afinidad más alta y el rango de percentil más bajo entre todos los péptidos 8-mero, 9-mero, 10-mero y 11-mero de las posiciones de restos de aminoácidos 49-67 de KK-LC-1, así como de la secuencia de aminoácidos de KK-LC-1 de longitud completa propuesta para unirse en HLA-A*0101. Solo se muestran los 10 epítopos mínimos superiores mejor predichos.

Tabla 7

Tabla 7: Las predicciones de MHC-clase I se hicieron utilizando la herramienta ANN de análisis de recursos de IEDB (Nielsen et al., Protein Sci., 12: 1007-1017 (2003); Lundegaard et al., Nucleic Acids Res., 36: W509-512 (2008)). La afinidad <50 nM se considera alta. El péptido 9-mero NTDNNLAVY (SEQ ID NO: 2) mostró la afinidad más alta y el rango de percentil más bajo entre todos los péptidos 8-mero, 9-mero, 10-mero y 11-mero de las posiciones de restos de aminoácidos 49-67 de KK-LC-1, así como de la secuencia de aminoácidos de KK-LC-1 de longitud completa propuesta para unirse en HLA-A*0101. Las variaciones de longitud de este péptido 9-mero (8-, 10- y 11-mero) se incluyeron en el análisis. Los péptidos fueron sintetizados por Genscript con >90% de pureza.

Se analizó el reconocimiento de los péptidos de la Tabla 7 por células T transducidas con TCR anti-KK-LC-1 restringido por HLA-A*0101 del ejemplo 2 por ELISPOT de IFN-y. Las APC autólogas (células diana) se pulsaron con 0, 0.0001, 0.001, 0.01, 0.1, 1 o 10 pM de 8-mero, 9-mero, 10-mero u 11-mero. Las células diana se cocultivaron con células T transducidas con TCR anti-KK-LC-1 restringido por HLA-A*0101 del ejemplo 2 (células efectoras). Las células T no transducidas se utilizaron como una célula efectora de control. Las células T UT, células T transducidas con TCR anti-KK-LC-1 y APC autólogas (células diana EBV-LCL) cultivadas solas, y células T UT y células T transducidas con TCR anti-KK-LC-1 estimuladas de forma no específica con PMA/ionomicina, sirvieron como controles.

Los resultados se muestran en la Figura 1C. Las células T transducidas con el TCR anti-KK-LC-1 restringido por HLA-A*0101 del ejemplo 2 no mostraron reconocimiento de las APC pulsadas con péptido 8-mero, pero reconocieron la APC pulsada con péptido 9-, 10- y 11 -mero. La reactividad más fuerte se observó contra las APC pulsadas con péptido 9-mero (Figura 1C). La avidez funcional de las células T transducidas con TCR de KK-LC-152-60 parecía estar en el intervalo de péptido KK-LC-152-6010-9- 10-10 M, lo que sugiere una alta avidez funcional de este TCR. Estos resultados identificaron el epítopo de KK-LC-152-60 NTDNNLAVY (SEQ ID NO: 2) como el epítopo mínimo probable al que se dirigen las células T transducidas con el TCR anti-KK-LC-1 restringido por HLA-A*0101 del ejemplo 2, e indicaban que este TCR presentaba una alta avidez funcional.

Ejemplo 9

Este ejemplo demuestra que el TCR anti-KK-LC-152-60 del ejemplo 2 puede reconocer el antígeno KK-LC-1 procesado naturalmente y presentado por líneas de células tumorales en el contexto de HLA-A*0101.

Para evaluar si las células T transducidas con el TCR anti-KK-LC-1 del ejemplo 2 (células efectoras) podrían reconocer líneas de células tumorales que expresan naturalmente el antígeno KK-LC-1 en el contexto de HLA-A*0101 (células diana), se ensayó el reconocimiento de una variedad de líneas de células tumorales derivadas de diferentes histologías de cáncer. Células T no transducidas y células T de donantes no relacionadas transducidas con un TCR dirigido a MAGE-A3168-176 en el contexto de HLA-A*0101 se usaron como células efectoras de control. El nivel de expresión de ARNm de KK-LC-1 y MAGE-A3 en las líneas de células tumorales se derivó de la base de datos GENEVESTIGATOR (indicado como alto o bajo), y la tipificación HLA de las líneas celulares se describe en Adams et al., J. Transí. Med, 3(1 ):11 (2005) (Cuadro 8).

Tabla 8

Las líneas de células tumorales diana de la Tabla 8 se transfectaron con (i) HLA-A*0101 y KK-LC-1, (ii) KK-LC-1, (iii) HLA-A*0101 y MAGE-A3, (iv) MAGE-A3, (v) HLA-A*0101, o (vi) ninguno de (i)-(v) para investigar si la sobreexpresión de HLA y/o KK-LC-1 puede estar limitando el reconocimiento de la línea celular tumoral por las células T transducidas con el TCR anti-KK-LC-1 del ejemplo 2. Las células diana se cocultivaron con células efectoras y se midió el IFN-y. Las células T efectoras cultivadas solas sirvieron como control. Los resultados se muestran en las Figuras 2A-2D.

Las células T transducidas con TCR reactivo con KK-LC-I^52-60eran capaces de reconocer líneas de células tumorales con alta expresión de ARNm de KK-LC-1 (Figura 2A, 2C, 2D; EKVX, HeLa y DU145), pero no una línea de células tumorales con baja expresión de ARNm de KK-LC -1 (Figura 2B; HCT-116). Mientras que EKVX es HLA-A*0101+ y era reconocido por las células T transducidas con TCR reactivo con KK-LC-1^52-60, HeLa y DU145 son negativas para HLA-A*0101, y estas líneas de células tumorales solo eran reconocidas por el TCR reactivo con KK-LC-1^52-60después de la transfección con HLA-A*0101, confirmando el reconocimiento restringido por HLA-A*0101 de este TCR. Además, se demostró que la expresión baja de KK-LC-1, en lugar de HLA, es el factor limitante en el reconocimiento de la línea celular tumoral HCT-116, ya que la sobreexpresión de KK-LC-1, pero no de HLA-A*0101, por transfección, confirió reconocimiento de esta línea celular tumoral por las células T transducidas con TCR reactivo con KK-LC-1^52-60. Estos resultados indican que el TCR para KK-LC-1^52-60puede reconocer el antígeno KK-LC-1 procesado naturalmente y presentado por líneas de células tumorales en el contexto de HLA-A*0101.

Ejemplo 10

Este ejemplo demuestra la expresión de KK-LC-1 en una variedad de líneas de células tumorales.

Para permitir la caracterización del TCR anti-KK-LC-1 con respecto al reconocimiento de tumores no manipulados, se determinó el nivel de expresión del gen CT83 que codifica el antígeno KK-LC-1 en una variedad de líneas de células tumorales por reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR).

El ARN se extrajo de las líneas de células tumorales utilizando el kit de micropreparación RNEASY PLUS MICRO (Qiagen, Venlo, Países Bajos). El ADNc se hizo utilizando el kit QSCRIPT CDNA Su PERMIX (Quanta Bio, Beverly, MA). Posteriormente, la expresión del gen CT83 (que codifica el antígeno KK-LC-1) en las líneas de células tumorales se determinó por la reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa cuantitativa en tiempo real (qRT-PCR) con conjuntos de cebador/sonda TAQMAN específicos para el gen CT83 (Hs02386421_g1, Thermo Fischer Scientific, Waltham, MA) y el gen de mantenimiento ACTB (Hs99999903_m1, Thermo Fischer Scientific) utilizando el sistema QUANTSTUDIO 3 RT-PCR (Applied Biosystems, Grand Island, NY) y siguiendo las instrucciones estándar del fabricante y las condiciones de los ciclos térmicos. Se usaron plásmidos de ADN diluidos en serie de CT83 y ACTB para generar curvas de calibración para la cuantificación del número de copias usando procedimientos convencionales.

Los resultados se muestran en la Figura 3. Se identificaron numerosas líneas de células tumorales (25 de 47) de varias histologías de cáncer que expresaban niveles variables de ARNm de KK-LC-1. Tres líneas de células tumorales expresaban KK-LC-1 así como el elemento de restricción HLA-A*01:01 pertinente, lo que permite el ensayo del TCR de KK-LC-1^52-60restringido por HLA-A*01:01 para el reconocimiento de tumores.

Ejemplo 11

Este ejemplo demuestra que el TCR de KK-LC-1 del ejemplo 2 reconoce y lisa líneas de células tumorales.

Para caracterizar aún más el TCR específico de KK-LC-1, se evaluó la producción de citoquinas, así como la actividad citolítica de las células T transducidas con el TCR específico de KK-LC-1 del ejemplo 2 tras cocultivo con líneas de células tumorales no manipuladas.

Se cocultivaron células T transducidas con TCR de KK-LC-1 (Td) y no transducidas (UT) de sangre periférica durante 6 horas con las líneas de células tumorales no manipuladas indicadas (Figura 4A), y se usó citometría de flujo para evaluar la expresión del marcador de desgranulación citotóxico CD107a (LAMP-1) y la producción de TNF-a mediante tinción intracelular. La presencia (+) o ausencia (-) de HLA-A*0101 y/o KK-LC-1 expresado endógenamente se indica en la fila superior de la Figura 4A. También se usaron líneas de células tumorales PC-3 y HeLa preincubadas con péptido cognado de KK-LC-1^52-600.1 |ug/ml (Figura 4A, derecha) como células diana. Los datos para las células T Td con TCR de KK-LC-1 se delimitaron en células T tetrámero⁺para KK-LC-1^52-60(Figura 4A, extremo izquierdo, flecha. Los datos de las células T UT se delimitaron en todas las células T CD3⁺(Figura 4A, extremo izquierdo, flecha). Las histologías de las líneas celulares tumorales incluían 4156 TC y HeLa: carcinoma de cuello uterino, EKVX: carcinoma de pulmón; A375: melanoma; PC-3: carcinoma de próstata.

Los resultados se muestran en la Figura 4A. Las células T transducidas con TCR específico de KK-LC-1 producían la citoquina efectora inflamatoria TNF-a y movilizaban el marcador de desgranulación citotóxico CD107a (LAMP-1) cuando se cocultivaron con células tumorales que expresan KK-LC-1 y HLA-A*01:01 pero no cuando se cocultivan con células tumorales que carecen del antígeno diana o del elemento de restricción (Figura 4A).

Además, la citolisis específica de las líneas de células tumorales no manipuladas descritas en este Ejemplo por las células T Td TCR KK-LC-1 y las células T UT se midió mediante un ensayo de citotoxicidad después de un cocultivo de 6 horas.

Los resultados se muestran en la Figura 4B. Las células T transducidas con TCR específico de KK-LC-1 presentaban citolisis específica de líneas de células tumorales de una manera dependiente de antígeno y HLA en el ensayo de citotoxicidad (Figura 4B). Estos resultados indicaban que el TCR específico de KK-LC-1 del ejemplo 2 presenta reconocimiento y destrucción dependientes de antígeno y HLA de líneas de células tumorales no manipuladas.

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un receptor de células T (TCR) aislado o purificado que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3-8 y que tiene especificidad antigénica por el antígeno de cáncer de pulmón de Kita-Kyushu 152-60 (KK-LC-152-60).

2. El TCR según la reivindicación 1 que comprende una región constante murina.

3. El TCR según la reivindicación 1 o 2, que comprende las secuencias de aminoácidos de:

(a) SEQ ID NO: 9 y

(b) SEQ ID NO: 10, en donde X en la posición 2 es Ala o Gly.

4. El TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -3, que comprende las secuencias de aminoácidos de (a) SEQ ID NO: 13, en donde

(i) X en la posición 48 es Thr o Cys;

(ii) X en la posición 112 es Ser, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp;

(iii) X en la posición 114 es Met, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; y

(iv) X en la posición 115 es Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; y

(b) SEQ ID NO: 14, en donde X en la posición 57 es Ser o Cys.

5. El TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 15 y SEQ ID NO: 16.

6. Un polipéptido aislado o purificado que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 5, la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena beta de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena beta de SEQ ID NO: 7, y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena beta de SEQ ID NO: 8,

opcionalmente en donde:

(I) el polipéptido comprende:

(a) la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena alfa de SEQ ID NO: 9 y

(b) la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena beta de SEQ ID NO: 10, en donde X en la posición 2 es Ala o Gly; (II) el polipéptido comprende además las secuencias de aminoácidos de:

(a) la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena alfa de SEQ ID NO: 13, en donde:

(i) X en la posición 48 es Thr o Cys;

(iv) X en la posición 115 es Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; y

(b) la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena beta de SEQ ID NO: 14, en donde X en la posición 57 es Ser o Cys; y/o (III) el polipéptido comprende la secuencia de aminoácidos de cadena alfa de SEQ ID NO: 15 y la secuencia de aminoácidos de cadena beta de SEQ ID NO: 16.

7. Una proteína aislada o purificada que comprende una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena alfa de SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena alfa de SEQ ID NO : 5 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de CDR1 de la cadena beta de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de CDR2 de la cadena beta de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de CDR3 de la cadena beta de SEQ ID NO: 8;

opcionalmente en donde:

(I) la proteína comprende:

una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena alfa de SEQ ID NO: 9 y

una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de la región variable de la cadena beta de SEQ ID NO: 10, en donde X en la posición 2 de la SEQ ID NO: 10 es Ala o Gly; (II)

(a) la primera cadena polipeptídica comprende además la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena alfa de SEQ ID NO: 13, en donde

(i) X en la posición 48 es Thr o Cys;

(iv) X en la posición 115 es Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; y

(b) la segunda cadena polipeptídica comprende además la secuencia de aminoácidos de la región constante de la cadena beta de SEQ ID NO: 14, en donde X en la posición 57 es Ser o Cys; y/o (III) la proteína comprende una primera cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena alfa de SEQ ID NO: 15 y una segunda cadena polipeptídica que comprende la secuencia de aminoácidos de la cadena beta de SEQ ID NO: 16.

8. El TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1 -5, el polipéptido según la reivindicación 6 o la proteína según la reivindicación 7, que comprende además un conector que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17.

9. Un ácido nucleico aislado o purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y 8, el polipéptido según la reivindicación 6 u 8, o la proteína según la reivindicación 7 u 8.

10. Un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 9, en donde opcionalmente la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena beta está situada en 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica la cadena alfa.

11. Una célula hospedante que comprende el vector de expresión recombinante de la reivindicación 10.

12. Una población de células que comprende al menos una célula hospedante de la reivindicación 11.

13. Una composición farmacéutica que comprende el TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y 8, el polipéptido según la reivindicación 6 u 8, la proteína según la reivindicación 7 u 8, el ácido nucleico según la reivindicación 9, el vector de expresión recombinante según la reivindicación 10, la célula hospedante de la reivindicación 11, o la población de células según la reivindicación 12, y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

14. Un método para detectar la presencia de cáncer en un mamífero, que comprende:

(a) poner en contacto una muestra que comprende una o más células del mamífero con el TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y 8, el polipéptido según la reivindicación 6 u 8, la proteína según la reivindicación 7 u 8, el ácido nucleico según la reivindicación 9, el vector de expresión recombinante según la reivindicación 10, la célula hospedante según la reivindicación 11, la población de células según la reivindicación 12, o la composición farmacéutica según la reivindicación 13, formando así un complejo, y

(b) detectar el complejo, en donde la detección del complejo es indicativa de la presencia de cáncer en el mamífero, opcionalmente

en donde el cáncer es carcinoma de vejiga, cuello uterino, estómago, mama, pulmón, colon, recto o páncreas.

15. El TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5 y 8, el polipéptido según la reivindicación 6 u 8, la proteína según la reivindicación 7 u 8, el ácido nucleico según la reivindicación 9, el vector de expresión recombinante según la reivindicación 10, la célula hospedante de la reivindicación 11, la población de células según la reivindicación 12, o la composición farmacéutica de la reivindicación 13, para usar en el tratamiento o prevención del cáncer en un mamífero, en donde opcionalmente el cáncer es carcinoma de vejiga, cuello uterino, estómago , mama, pulmón, colon, recto o páncreas.