ES2745153T3 - Receptores de antígeno quimérico anti-cd70 - Google Patents

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Abstract

Un receptor de antígeno quimérico (CAR) que tiene especificidad antigénica por CD70, comprendiendo el CAR: un dominio transmembrana de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos de CD27 que carece de todo el dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD27; un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de 4-1BB; un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3ζ; y opcionalmente, un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD28.

Description

DESCRIPCIÓN
Receptores de antígeno quimérico anti-cd70
REFERENCIA CRUZADA A SOLICITUDES RELACIONADAS
Esta solicitud de patente reclama el beneficio de la solicitud de patente provisional de EE. UU. n.° 62/088.882, presentada el 8 de diciembre de 2014. La presente invención fue realizada con la financiación del gobierno con el número de proyecto Z01BC011227-04 por los Institutos Nacionales de la Salud, Instituto Nacional del Cáncer. El gobierno tiene determinados derechos sobre la invención.
MATERIAL REMITIDO ELECTRÓNICAMENTE
En el presente documento se incluye un listado de secuencias de nucleótidos/aminoácidos en soporte informático que se remite al mismo tiempo que el mismo y se identifica de la siguiente manera: un archivo ASCII (texto) de 55.121 bytes denominado "719062sT25.TXT", con fecha del 3 de diciembre de 2014.
ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN
El cáncer es un problema de salud pública. A pesar de los avances en tratamientos tales como la quimioterapia, el pronóstico para muchos cánceres, incluidos el carcinoma de células renales (CCR), el glioblastoma, el linfoma no Hodgkin (LNH), la leucemia linfocítica crónica (LLC), el linfoma difuso de células B grandes y el linfoma folicular, puede ser malo. Por consiguiente, existe una necesidad insatisfecha de tratamientos adicionales para el cáncer, particularmente CCR, glioblastoma, LNH, LLC, linfoma difuso de células B grandes y linfoma folicular.
BREVE SUMARIO DE LA INVENCIÓN
Una realización de la invención proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR) que tiene especificidad antigénica por CD70, comprendiendo el CAR: un dominio transmembrana de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos de CD27 que carece de todo el dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD27; un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de 4-1BB; un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3Z; y opcionalmente, un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD28.
Otra realización de la invención proporciona un CAR que tiene especificidad antigénica por CD70 que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 90 % idéntica a una cualquiera de las SEQ Id NO: 11-13.
Otras realizaciones de la invención proporcionan ácidos nucleicos relacionados, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras, poblaciones de células y composiciones farmacéuticas relacionadas con los CAR de la invención.
Realizaciones adicionales de la invención proporcionan procedimientos para detectar la presencia de cáncer en un mamífero y procedimientos para tratar o prevenir el cáncer en un mamífero.
BREVE DESCRIPCIÓN DE LAS VARIAS VISTAS DE LOS DIBUJOS
Las Figuras 1A y 1B son gráficos que muestran el tamaño tumoral (mm2) de ratones portadores de tumor B16/mCD70 (A) o B16 (B) durante un período de tiempo (días) después de la administración de las células transducidas con CAR mCD27-CD3Z (círculos negros), células no transducidas (círculos blancos), solución salina tamponada con fosfato (PBS) (x), o pmel VI (cuadrados) e irradiación (500 Rad).
Las Figuras 1C y 1D son gráficos que muestran el tamaño tumoral (mm2) de ratones portadores de tumor B16/mCD70 durante un período de tiempo (días) después de la administración de células transducidas con CAR mCD27-CD3Z a una dosis de 1 x 104 (▼), 1 x 105 (cuadrados negros), 1 x 106 (A ) o 1 x 107 (círculos negros) células por ratón; p Bs (cuadrados blancos); células transducidas con un vector vacío (círculos blancos); o pmel VI (rombos) con (C) o sin (D) irradiación (500 Rad).
La Figura 1E es un gráfico que muestra la supervivencia (%) de ratones portadores de tumores B16/mCD70 durante un período de tiempo (días) después de la administración de células transducidas con CAR mCD27-CD3Z a una dosis de 1 x 104 (rombos), 1 x 105 (▼), 1 x 106 (A ) o 1 x 107 (círculos negros) células por ratón; PBS (cuadrados blancos); células transducidas con un vector vacío (círculos blancos); o pmel VI (A), seguido de irradiación (500 Rad).
La Figura 1F es un gráfico que muestra el tamaño tumoral (mm2) de ratones portadores de tumor B16/mCD70 durante un período de tiempo (días) después de la administración de células transducidas con CAR mCD27-CD3Z (cuadrados), células no transducidas (A), células transducidas con un vector vacío (V), o pmel VI (círculos), seguido de irradiación y administración de IL-2.
Las Figuras 2A-2D son gráficos que muestran el peso promedio (g) de ratones portadores de tumor B16/mCD70 (A y B) o B16 (C y D) durante un período de tiempo (días) después de la administración de células transducidas con CAR mCD27-CD3Z (círculos negros), células no transducidas (cuadrados blancos), solución salina tamponada con fosfato (PBS) (V), o pmel VI (A) con (a y C) o sin (B y D) irradiación (500 Rad).
Las Figuras 2E-2H son gráficos que muestran el recuento absoluto de glóbulos blancos (K/pl) (E y F) o el recuento de esplenocitos (x 107 por bazo) (G y H) de ratones portadores de tumores B16/mCD70 durante un período de tiempo (días) después de la administración de células transducidas con CAR mCD27-CD3Z (barras sombreadas), células no transducidas (barras sin sombrear) o células transducidas con un vector que codifica proteína fluorescente verde (GFP) (barras con rayas diagonales) con (E y G) o sin (F y H) irradiación (500 Rad).
La Figura 2I es un gráfico que muestra los niveles de interferón sérico (IFN) gamma (pg/ml) de ratones portadores de tumor B16/mCD70 durante un período de tiempo (días) después de la administración de células transducidas con CAR mCD27-CD3Z con (barras negras) o sin (barras rayadas horizontalmente) irradiación o células transducidas con un vector que codifica GFP con (barras cuadriculadas) o sin (barras sin sombrear) irradiación (500 Rad).
La Figura 3 es un gráfico que muestra el IFN-y (pg/ml) secretado tras el cultivo de linfocitos T humanos transducidos con un vector retrovírico vacío (control) (MSGV1) o uno de fCD27-CD3Z (SEQ ID NO: 7), ACD27-CD28 - CD3Z (SEQ ID NO: 8), ACD27-4-1BB - CD3Z (SEQ ID NO: 9), ACD27-CD28 -4-1BB - CD3Z (SEQ ID NO: 10), fCD27-CD28 -CD3Z (SEQ ID NO: 11), fCD27-4-1BB - CD3Z (SEQ ID NO: 12) o fCD27-CD28- 4-1BB - CD3Z (SEQ ID NO: 13) solo (medio) (barras con rayas verticales) o tras cocultivo con células diana de control 624mel (barras cuadriculadas), 624/CD70 (barras negras), 938mel (barras punteadas) o 938/CD70 (barras blancas) o células diana RCC Rc C 2245R (barras diagonales), RCC 2246R (barras diagonales invertidas), RCC 2361R (barras en caja) o RCC 1764 (barras en espiga).
La Figura 4 es un gráfico que muestra el IFN-y (pg/ml) secretado tras el cultivo de células no transducidas (UT) o clones de empaquetamiento retrovíricos A2, A10, B3, C1, E3 o G2 transducidos con ACD27-4-1BB - CD3Z (SEQ ID NO: 9) solo (medio, barras con rayas verticales) o tras cocultivo con células diana de control SNU1079 (barras punteadas), SNU1196 (barras blancas), 938mel (barras a cuadros), o 938/CD70 (barras negras) o células diana RCC RCC 2245R (barras diagonales), RCC 2246R (barras diagonales invertidas), RCC 2361R (barras en caja) o RCC 1764 (barras en espiga).
La Figura 5 es un gráfico que muestra el IFN-y (pg/ml) secretado tras el cultivo de células no transducidas (UT) o clones de empaquetamiento retrovíricos A2, B11, C5 o D2 transducidos con ACD27-4-1BB - CD3Z (SEQ ID No : 9) solo (medio, barras rayadas verticalmente) o tras cocultivo con células diana de control SNU1079 (barras punteadas), SNU1196 (barras blancas), 938mel (barras a cuadros) o 938/CD70 (barras negras) o células diana RCC RCC 2245R (barras diagonales), Rc C 2246R (barras diagonales invertidas), RCC 2361R (barras en caja) o RCC 1764 (barras en espiga).
DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN
Una realización de la invención proporciona un receptor de antígeno quimérico (CAR) que tiene especificidad antigénica por CD70, comprendiendo el CAR: un dominio transmembrana de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos de CD27 que carece de todo el dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD27; un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de 4-1BB; un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3Z; y opcionalmente, un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD28. En lo sucesivo, las referencias a un "CAR" también hacen referencia a porciones funcionales y variantes funcionales del CAR, a menos que se especifique lo contrario.
Un CAR es una proteína o polipéptido híbrido construido artificialmente que contiene los dominios de unión a antígeno de un receptor (por ejemplo, un receptor del factor de necrosis tumoral (TNF)) ligados a dominios de señalización de linfocitos T. Las características de los CAR incluyen su capacidad para redirigir la especificidad y reactividad de linfocitos T hacia una diana seleccionada de manera no restringida por el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), explotando las propiedades de unión a antígeno de los receptores. El reconocimiento de antígeno no restringido por MHC da a los linfocitos T que expresan CAR la capacidad de reconocer el antígeno independientemente del procesamiento del antígeno, eludiendo así un mecanismo principal de escape tumoral. Además, cuando se expresan en linfocitos T, los CAR ventajosamente no se dimerizan con las cadenas alfa y beta del receptor de linfocitos T (TCR) endógeno.
Las frases "tienen especificidad de antígeno (antigénica)" y "provocan una respuesta específica de antígeno", como se usan en el presente documento, significan que el CAR puede unirse específicamente a un antígeno y reconocerlo inmunológicamente, de tal modo que la unión del CAR al antígeno provoca una respuesta inmunitaria.
Los CAR de la invención tienen especificidad de antígeno por CD70. CD70 pertenece a la superfamilia de TNF y tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 1. CD70 es una molécula coestimuladora que participa en la proliferación y supervivencia de las células derivadas de linfoides cuando interactúa con su receptor, CD27. La expresión normal y no cancerosa de CD70 está restringida a los tejidos linfoides, tales como los linfocitos T activados, los linfocitos B, los linfocitos citolíticos naturales (NK), los monocitos y las células dendríticas. CD70 se expresa en una variedad de cánceres humanos tales como, por ejemplo, CCR (Diegmann et al., Eur. J. Cancer, 41: 1794-801 (2005)) (por ejemplo, CCR de células claras (CCRcc)), glioblastoma (Held-Feindt et al., Int. J. Cancer, 98: 352-56 (2002); Wischhusen et al., Cancer Res., 62: 2592-99 (2002)), LNH y LLC (Lens et al., Br. J. Haematol., 106: 491-503 (1999)), linfoma difuso de células B grandes y linfoma folicular.
Sin limitarse a una teoría o mecanismo particular, se cree que al provocar una respuesta específica de antígeno contra CD70, los CAR inventivos proporcionan uno o más de cualquiera de los siguientes: atacar y destruir células cancerosas que expresan CD70, reducir o eliminar células cancerosas, facilitar la infiltración de células inmunitarias en el sitio o sitios del tumor, y potenciar/extender las respuestas contra el cáncer. Debido a que la expresión normal de CD70 se limita a los tejidos linfoides, tales como los linfocitos T activados, los linfocitos B, los linfocitos NK, los monocitos y las células dendríticas, se contempla que los CAR inventivos eviten ventajosamente atacar/destruir muchos tejidos normales.
Una realización de la invención proporciona un CAR que comprende un dominio transmembrana de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos de CD27. A este respecto, el CAR puede comprender tanto un dominio de unión a antígeno de CD27 como un dominio transmembrana de CD27. El CD27 puede comprender o consistir en cualquier secuencia de aminoácidos del dominio transmembrana de CD27 de unión a antígeno humano adecuada. En una realización de la invención, el CD27 de longitud completa, que incluye el dominio de unión a antígeno, el dominio transmembrana y el dominio de señalización intracelular de linfocitos T, tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 2. En una realización de la invención, el dominio de unión a antígeno de CD27 está compuesto por los residuos de aminoácidos 1-188 de la SEQ ID NO: 2 y tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 21, el dominio transmembrana de CD27 está compuesto por los residuos de aminoácidos 189-211 de la SEQ ID NO: 2 y tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 22, y el dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD27 está compuesto por los residuos de aminoácidos 212-260 de la SEQ ID NO: 2 y tiene la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23. Por consiguiente, en una realización de la invención, el CAR comprende un dominio transmembrana de unión a antígeno que comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 21 y 22. El dominio de unión a antígeno de CD27 se une específicamente a CD70.
Una realización de la invención proporciona un CAR que comprende un dominio transmembrana de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos de CD27 que carece de todo el dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD27. Una secuencia de aminoácidos de CD27 que carece de todo el dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD27 también se denomina en el presente documento "secuencia de aminoácidos de CD27 truncado" o "CD27 truncado".
En una realización, el dominio transmembrana de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de CD27 que carece de todo el dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD27. A este respecto, el dominio transmembrana de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de CD27 que carece de los residuos de aminoácidos contiguos 212 a 260 como se define por la SEQ ID NO: 2 o una secuencia de aminoácidos de CD27 que carece de los residuos de aminoácidos contiguos 212 a 260 de la SEQ ID NO: 2. En una realización de la invención, el dominio transmembrana de unión a antígeno comprende una secuencia de aminoácidos de CD27 que carece de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 23. En una realización de la invención, el dominio transmembrana de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos de CD27 que carece de todo el dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD27 comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 3 o que comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 3.
El CAR puede comprender además un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de 4-1BB; un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3 zeta (Z); y opcionalmente, un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD28. En una realización de la invención, el CAR comprende comprender un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de 4-1BB, un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3Z y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD28. En otra realización de la invención, el CAR comprende un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de 4-1BB y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3Z. En una realización preferida, los dominios de señalización intracelular de linfocitos T de 4-1BB, CD3Z y CD28 son humanos. CD28 es un marcador de linfocitos T importante en la coestimulación de linfocitos T. 4-1BB, también conocido como CD137, transmite una potente señal coestimuladora a los linfocitos T, promoviendo la diferenciación y potenciando la supervivencia a largo plazo de los linfocitos T. CD3Z se asocia con TCR para producir una señal y contiene motivos de activación basados en tirosina inmunorreceptores (ITAM).
El dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3Z puede comprender o consistir en cualquier secuencia de aminoácidos del dominio de señalización intracelular de linfocitos T humanos de CD3Z adecuada. En una realización de la invención, el dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3Z comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92%, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, o aproximadamente 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 4. Preferiblemente, el dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3Z comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 4.
El dominio de señalización intracelular de linfocitos T de 4-1BB puede comprender o consistir en cualquier secuencia de aminoácidos del dominio de señalización intracelular de linfocitos T de 4-1BB humanos adecuada. En una realización de la invención, el dominio de señalización intracelular de linfocitos T de 4-1BB comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 5. Preferiblemente, el dominio de señalización intracelular de linfocitos T de 4-1BB comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 5.
El dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD28 puede comprender o consistir en cualquier secuencia de aminoácidos del dominio de señalización intracelular de linfocitos T humanos de CD28 adecuada. En una realización de la invención, el dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD28 comprende o consiste en una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, o aproximadamente 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 6. Preferiblemente, el dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD28 comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID NO: 6.
En una realización de la invención, el CAR comprende una secuencia de aminoácidos de CD27 de longitud completa, que incluye un dominio de unión a antígeno de CD27, un dominio transmembrana de CD27 y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD27, en combinación con un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3Z ((f) CAR CD27-CD3Z de longitud completa). A este respecto, el CAR puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos de CD27 de longitud completa al menos aproximadamente un 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 2 y cualquiera de las secuencias de aminoácidos de CD3Z descritas en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. Por ejemplo, el CAR fCD27-CD3Z puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos de CD27 de longitud completa de SEQ ID NO: 2 y la secuencia de aminoácidos de CD3Z de SEQ ID NO: 4. En una realización de la invención, el CAR fCD27 -CD3Z puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente el 98% o aproximadamente 99 idéntica a la SEQ ID NO: 7. Preferiblemente, el CAR fCD27-CD3Z comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. En una realización de la invención, el CAR fCD27-CD3Z carece de uno o ambos CD19 y DsRed truncados.
En una realización de la invención, el CAR comprende una secuencia de aminoácidos de CD27 de longitud completa, que incluye un dominio de unión a antígeno de CD27, un dominio transmembrana de CD27 y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD27, en combinación con un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3Z y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD28 (fCD27-CD28-CD3Z). A este respecto, el CAR puede comprender o consistir en cualquiera de las secuencias de aminoácidos de CD27 de longitud completa, cualquiera de las secuencias de aminoácidos de CD3Z y cualquiera de las secuencias de aminoácidos de CD28 descritas en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. Por ejemplo, el CAR fCD27-CD28-CD3Z puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos de CD27 de longitud completa de SEQ ID NO: 2, la secuencia de aminoácidos de CD3Z de SEQ ID NO: 4 y la secuencia de aminoácidos de CD28 de SEQ ID NO: 6. En una realización de la invención, el CAR fCD27-CD28-CD3Z puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 11. Preferiblemente, el CAR fCD27-CD28-CD3Z comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 11.
En una realización de la invención, el CAR comprende una secuencia de aminoácidos de CD27 de longitud completa, que incluye un dominio de unión a antígeno de CD27, un dominio transmembrana de CD27 y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD27, en combinación con un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3Z y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de 4-1BB (fCD27-4-1BB-CD3Z). A este respecto, el CAR puede comprender o consistir en cualquiera de las secuencias de aminoácidos de CD27 de longitud completa, cualquiera de las secuencias de aminoácidos de CD3Z y cualquiera de las secuencias de aminoácidos de 4-1BB descritas en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. Por ejemplo, el CAR fCD27-4-1BB-CD3Z puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos de CD27 de longitud completa de SEQ ID NO: 2, la secuencia de aminoácidos de CD3Z de SEQ ID NO: 4 y la secuencia de aminoácidos de 4-1BB de SEQ ID NO: 5. En una realización de la invención, el CAR fCD27-4-1BB-CD3Z puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 12. Preferiblemente, el CAR fCD27-4-1BB-CD3Z comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12.
En una realización de la invención, el CAR comprende una secuencia de aminoácidos de CD27 de longitud completa, que incluye un dominio de unión a antígeno de CD27, un dominio transmembrana de CD27 y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD27, en combinación con un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3Z, un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de 4-1BB y un dominio de señalización intracelular de Cd28 (fCD27-CD28-4-1BB-CD3Z). A este respecto, el CAR puede comprender o consistir en cualquiera de las secuencias de aminoácidos de CD27 de longitud completa, cualquiera de las secuencias de aminoácidos de CD3Z, cualquiera de las secuencias de aminoácidos de 4-1BB y cualquiera de las secuencias de aminoácidos de CD28 descritas en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. Por ejemplo, el CAR fCD27-CD28-4-1BB-CD3Z puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos de CD27 de longitud completa de SEQ ID NO: 2, la secuencia de aminoácidos de CD3Z de SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de 4-1BB de SEQ ID NO: 5 y la secuencia de aminoácidos de CD28 de SEQ ID NO: 6. En una realización de la invención, el CAR fCD27-CD28-4-1BB-CD3Z puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 13. Preferiblemente, el CAR fcD27-CD28-4-1BB-CD3Z comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13.
En una realización de la invención, el CAR comprende una secuencia de aminoácidos de CD27 de ratón de longitud completa, que incluye un dominio de unión a antígeno de CD27, un dominio transmembrana de CD27 y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD27, en combinación con dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3Z de ratón (mCD27-CD3Z). A este respecto, el CAR puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos de CD27 de ratón de longitud completa al menos aproximadamente un 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 26 en combinación con una secuencia de aminoácidos de CD3Z de ratón al menos aproximadamente un 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 % aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 27. Por ejemplo, el CAR mCD27-CD3Z puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos de CD27 de ratón de longitud completa de SEQ ID NO: 26 y la secuencia de aminoácidos de CD3Z de ratón de SEQ ID NO: 27. En una realización de la invención, el CAR mCD27-CD3Z puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente el 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 25. Preferiblemente, el CAR mCD27-CD3Z comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25.
En una realización de la invención, el CAR comprende un dominio transmembrana de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos de c D27 truncado que carece de todo el dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD27, en combinación con un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3Z y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD28 (CD27-CD28 - CD3Z truncado (A)). A este respecto, el CAR puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos del dominio transmembrana de unión a antígeno de CD27 truncado al menos aproximadamente un 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, o aproximadamente 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 3 en combinación con cualquiera de las secuencias de aminoácidos del dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3Z y cualquiera de las secuencias de aminoácidos del dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD28 descritas en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. Por ejemplo, el CAR ACD27-CD28 - CD3Z puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos del dominio transmembrana de unión a antígeno de CD27 truncado de SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de CD3C de SEQ ID NO: 4 y la secuencia de aminoácidos de CD28 de SEQ ID NO: 6. En una realización de la invención, el CAR ACD27-CD28 - CD3Z puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 8. Preferiblemente, el CAR ACD27-CD28-CD3Z comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8.
En una realización de la invención, el CAR comprende un dominio transmembrana de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos de c D27 truncado que carece de todo el dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD27, en combinación con un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3Z y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de 4-1BB (ACD27-4-1BB - CD3Z). A este respecto, el CAR puede comprender o consistir en cualquiera de las secuencias de aminoácidos del dominio transmembrana de unión a antígeno de CD27 truncado, cualquiera de las secuencias de aminoácidos del dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3Z y cualquiera de las secuencias de aminoácidos del dominio de señalización intracelular de linfocitos T de 4-1BB descritas en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. Por ejemplo, el CAR ACD27-4-1BB - CD3Z puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos del dominio transmembrana de unión a antígeno CD27 truncado de SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de CD3Z de SEQ ID NO: 4 y la secuencia de aminoácidos de 4-1BB de SEQ ID NO: 5. En una realización de la invención, el CAR ACD27-4-1BB - CD3Z puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 9. Preferiblemente, el CAR ACD27-4-1BB - CD3Z comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9.
En una realización de la invención, el CAR comprende un dominio transmembrana de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos de CD27 truncado que carece de todo el dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD27, en combinación con un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3Z, un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD28 y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de 4-1BB (ACD27-CD28 - 4-1BB - CD3Z). A este respecto, el CAR puede comprender o consistir en cualquiera de las secuencias de aminoácidos del dominio transmembrana de unión al antígeno de CD27 truncado, cualquiera de las secuencias de aminoácidos del dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3Z, cualquiera de las secuencias de aminoácidos del dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD28, y cualquiera de las secuencias de aminoácidos del dominio de señalización intracelular de linfocitos T de 4-1BB descritas en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. Por ejemplo, el CAR ACD27-CD28 - 4-1 BB - CD3Z puede comprender o consistir en la secuencia de aminoácidos del dominio transmembrana de unión a antígeno de CD27 truncado de SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de CD3Z de SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de CD28 de SEQ ID NO: 6 y la secuencia de aminoácidos de 4-1BB de SEQ ID NO: 5. En una realización de la invención, el CAR ACD27-CD28 - 4-1BB - CD3Z puede comprender o consistir en una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 % o aproximadamente 99 % idéntica a la SEQ ID NO: 10. Preferiblemente, el CAR ACD27-CD28 - 4-1BB - CD3Z comprende o consiste en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10.
En una realización de la invención, el CAR comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 90 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 8-10. En una realización de la invención, el CAR comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 90% idéntica a la SEQ ID NO: 9 o 10. En otra realización de la invención, el CAR comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 90 % idéntica a cualquiera de las SEQ ID NO: 11-13. En otra realización de la invención, el CAR comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 12 o 13. Preferiblemente, el CAR comprende, consiste o consiste esencialmente en cualquiera de las secuencias de aminoácidos expuestas en la Tabla 1A. En una realización preferida de la invención, el CAR comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 7-13. Preferiblemente, el CAR comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 9, 10, 12 y 13.
TABLA 1A
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Se incluyen en el alcance de la invención porciones funcionales de los CAR inventivos descritos en el presente documento. El término "porción funcional" cuando se usa en referencia a un CAR hace referencia a cualquier parte o fragmento del CAR de la invención, cuya parte o fragmento retiene la actividad biológica del CAR del cual es parte (el CAR original). Las porciones funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas partes de un CAR que retienen la capacidad de reconocer células diana, o detectar, tratar o prevenir el cáncer, en una medida, la misma medida, o en mayor medida, que el CAR original. En referencia al cAr original, la porción funcional puede comprender, por ejemplo, aproximadamente un 10 %, aproximadamente 25 %, aproximadamente 30 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 68 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 95 % o más, del CAR original.
La porción funcional puede comprender aminoácidos adicionales en el extremo amino o carboxilo de la porción, o en ambos extremos, cuyos aminoácidos adicionales no se encuentran en la secuencia de aminoácidos del CAR original. Deseablemente, los aminoácidos adicionales no interfieren con la función biológica de la porción funcional, por ejemplo, reconocer células diana, detectar cáncer, tratar o prevenir el cáncer, etc. Más deseablemente, los aminoácidos adicionales potencian la actividad biológica, en comparación con la actividad biológica del CAR original.
Se incluyen en el alcance de la invención las variantes funcionales de los CAR inventivos descritos en el presente documento. El término "variante funcional" como se usa en el presente documento hace referencia a un CAR, polipéptido o proteína que tiene una identidad o similitud de secuencia sustancial o significativa con un CAR original, cuya variante funcional retiene la actividad biológica del CAR del cual es una variante. Las variantes funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas variantes del CAR descritas en el presente documento (el CAR original) que retienen la capacidad de reconocer las células diana en una medida similar, la misma medida o en mayor medida que el CAR original. En referencia al CAR original, la variante funcional puede ser, por ejemplo, al menos aproximadamente un 30 %, aproximadamente 50 %, aproximadamente 75 %, aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente 98 %, aproximadamente 99 % o más idéntica en secuencia de aminoácidos al CAR original.
Una variante funcional puede, por ejemplo, comprender la secuencia de aminoácidos del CAR original con al menos una sustitución conservativa de aminoácidos. Como alternativa o adicionalmente, las variantes funcionales pueden comprender la secuencia de aminoácidos del CAR original con al menos una sustitución de aminoácidos no conservativa. En este caso, es preferible que la sustitución de aminoácidos no conservativa no interfiera o inhiba la actividad biológica de la variante funcional. La sustitución de aminoácidos no conservativa puede potenciar la actividad biológica de la variante funcional, de tal modo que la actividad biológica de la variante funcional aumenta en comparación con el CAR original.
Las sustituciones de aminoácidos de los CAR inventivos son preferiblemente sustituciones de aminoácidos conservativas. Las sustituciones de aminoácidos conservativas son conocidas en la técnica e incluyen sustituciones de aminoácidos en las que un aminoácido que tiene ciertas propiedades físicas y/o químicas se intercambia por otro aminoácido que tenga las mismas o similares propiedades químicas o físicas. Por ejemplo, la sustitución de aminoácidos conservativa puede ser un aminoácido polar ácido/con carga negativa sustituido por otro aminoácido polar ácido/con carga negativa (por ejemplo, Asp o Glu), un aminoácido con una cadena lateral no polar sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral no polar (p. ej., Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Cys, Val, etc.), un aminoácido polar básico/con carga positiva sustituido por otro aminoácido polar básico/con carga positiva (p. ej. Lys, His, Arg, etc.), un aminoácido sin carga con una cadena lateral polar sustituido por otro aminoácido sin carga con una cadena lateral polar (p. ej., Asn, Gln, Ser, Thr, Tyr, etc.), un aminoácido con una cadena lateral ramificada beta sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral ramificada beta (p. ej., Ile, Thr y Val), un aminoácido con una cadena lateral aromática sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral aromática (p. ej., His, Phe, Trp y Tyr), etc.
El CAR puede consistir esencialmente en la secuencia o secuencias de aminoácidos especificadas descritas en el presente documento, de tal modo que otros componentes, p. ej., otros aminoácidos, no cambien materialmente la actividad biológica de la variante funcional.
Los CAR de las realizaciones de la invención pueden ser de cualquier longitud, es decir, pueden comprender cualquier número de aminoácidos, siempre que los CAR retengan su actividad biológica, p. ej., la capacidad de unirse específicamente al antígeno, detectar células cancerosas en un mamífero o tratar o prevenir el cáncer en un mamífero, etc. Por ejemplo, el CAR puede tener una longitud de aproximadamente 50 a aproximadamente 5000 aminoácidos, tal como 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más aminoácidos de longitud.
Los CAR de las realizaciones de la invención pueden comprender aminoácidos sintéticos en lugar de uno o más aminoácidos de origen natural. Tales aminoácidos sintéticos son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, ácido aminociclohexanocarboxílico, norleucina, ácido a-amino-n-decanoico, homoserina, S-acetilaminometilcisteína, trans-3- y trans-4-hidroxiprolina, 4-aminofenilalanina, 4-nitrofenilalanina, 4-clorofenilalanina, 4-carboxifenilalanina, pfenilserina, p-hidroxifenilalanina, fenilglicina, a-naftilalanina, ciclohexilalanina, ciclohexilglicina, ácido indolin-2-carboxílico, ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico, ácido aminomalónico, monoamida del ácido aminomalónico, N'-bencil-N'-metil-lisina, N',N'-dibencil-lisina, 6-hidroxilisina, ornitina, ácido aaminociclopentanocarboxílico, a-aminociclohexanocarboxílico ácido, ácido a-aminocicloheptanocarboxílico, ácido a-(2-amino-2-norbornano)carboxílico, ácido a,Y-diaminobutírico, ácido a,p-diaminopropiónico, homofenilalanina y aterc-butilglicina.
Los CAR de las realizaciones de la invención pueden estar glicosilados, amidados, carboxilados, fosforilados, esterificados, N-acilados, ciclados a través de, p. ej., un puente disulfuro, o convertidos en una sal de adición de ácido y/u opcionalmente dimerizados o polimerizados, o conjugados.
Los CAR de las realizaciones de la invención pueden obtenerse mediante procedimientos conocidos en la técnica tales como, por ejemplo, síntesis de novo. Además, los polipéptidos y las proteínas se pueden producir de forma recombinante utilizando los ácidos nucleicos descritos en el presente documento usando procedimientos recombinantes estándares. Véase, por ejemplo, Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4a ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY (2012). Como alternativa, los CAR descritos en el presente documento pueden sintetizarse comercialmente por compañías, tales como Synpep (Dublin, CA), Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD) y Multiple Peptide Systems (San Diego, CA). A este respecto, los CAR inventivos pueden ser sintéticos, recombinantes, aislados y/o purificados.
Además, una realización de la invención proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los CAR descritos en el presente documento. Los ácidos nucleicos de la invención pueden comprender una secuencia de nucleótidos que codifica cualquiera de los dominios de unión a antígeno, dominios transmembrana y/o dominios de señalización intracelular de linfocitos T descritos en el presente documento. En una realización de la invención, el ácido nucleico comprende, consiste o consiste esencialmente en cualquiera de las secuencias de nucleótidos expuestas en la Tabla 1B. Preferiblemente, el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 14-20. Preferiblemente, el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 16, 17, 19 y 20. En una realización de la invención, la secuencia de nucleótidos que codifica el CAR fCD27-CD3Z no codifica uno o ambos de CD19 y DsRed truncados.
TABLA 1B
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"Ácido nucleico" como se usa en el presente documento incluye "polinucleótido", "oligonucleótido" y "molécula de ácido nucleico", y generalmente significa un polímero de ADN o a Rn , que puede ser monocatenario o bicatenario, sintetizado u obtenido (p. ej., aislado y/o purificado) de fuentes naturales, que puede contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados, y que puede contener un grupo de enlace internucleotídico natural, no natural o alterado, tal como un grupo de enlace fosforoamidato o un grupo de enlace fosforotioato, en lugar del fosfodiéster encontrado entre los nucleótidos de un oligonucleótido no modificado. En algunas realizaciones, el ácido nucleico no comprende inserciones, deleciones, inversiones y/o sustituciones. Sin embargo, puede ser adecuado en algunos casos, como se discute en el presente documento, que el ácido nucleico comprenda una o más inserciones, deleciones, inversiones y/o sustituciones. En algunas realizaciones, el ácido nucleico puede codificar secuencias de aminoácidos adicionales que no afectan la función del CAR y que pueden o no traducirse tras la expresión del ácido nucleico por una célula hospedadora.
Los ácidos nucleicos de una realización de la invención pueden ser recombinantes. Como se usa en el presente documento, el término "recombinante" hace referencia a (i) moléculas que se construyen fuera de las células vivas uniendo segmentos de ácido nucleico naturales o sintéticos a moléculas de ácido nucleico que pueden replicarse en una célula viva, o (ii) moléculas que son el resultado de la replicación de las descritas en (i) anteriormente. Con los fines de el presente documento, la replicación puede ser replicación in vitro o replicación in vivo.
Un ácido nucleico recombinante puede ser uno que tiene una secuencia que no es de origen natural o que tiene una secuencia que está elaborada por una combinación artificial de dos segmentos de secuencia separados de otra manera. Esta combinación artificial a menudo se logra mediante síntesis química o, más comúnmente, mediante la manipulación artificial de segmentos aislados de ácidos nucleicos, p. ej., mediante técnicas de ingeniería genética, tales como las descritas en Green y Sambrook, supra. Los ácidos nucleicos pueden construirse en base a síntesis química y/o reacciones de ligadura enzimática usando procedimientos conocidos en la técnica. Véase, por ejemplo, Green y Sambrook, supra. Por ejemplo, un ácido nucleico puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos de origen natural o nucleótidos modificados diversamente diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado tras la hibridación (p. ej., derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina). Los ejemplos de nucleótidos modificados que pueden usarse para generar los ácidos nucleicos incluyen, pero sin limitación, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5- (carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, adenina N6-sustituida, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2-tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, 3-(3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo y 2,6-diaminopurina. Como alternativa, uno o más de los ácidos nucleicos de la invención se pueden adquirir en compañías tales como Macromolecular Resources (Fort Collins, CO) y Synthegen (Houston, TX).
El ácido nucleico puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos aislada o purificada que codifique cualquiera de los CAR descritos en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. Como alternativa, la secuencia de nucleótidos puede comprender una secuencia de nucleótidos que está degenerada en cualquiera de las secuencias o una combinación de secuencias degeneradas.
Una realización de la invención también proporciona un ácido nucleico aislado o purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria de la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento o una secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas con la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los nucleicos. ácidos descritos en el presente documento.
La secuencia de nucleótidos que hibrida en condiciones rigurosas puede hibridar en condiciones de alto rigor. Por "condiciones de alto rigor" se entiende que la secuencia de nucleótidos hibrida específicamente con una secuencia diana (la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento) en una cantidad que es detectablemente mayor que la hibridación no específica. Las condiciones de alto rigor incluyen condiciones que distinguirían un polinucleótido con una secuencia complementaria exacta, o una que contenga solo unos pocos desapareamientos dispersos de una secuencia aleatoria que tenga algunas regiones pequeñas (p. ej., 3­ 10 bases) que coincidan con la secuencia de nucleótidos. Tales regiones pequeñas de complementariedad se funden más fácilmente que un complemento de longitud completa de 14-17 o más bases, y la hibridación de alto rigor las hace fácilmente distinguibles. Las condiciones de rigor relativamente alto incluirían, por ejemplo, condiciones bajas en sal y/o de alta temperatura, tales como las proporcionadas por aproximadamente NaCl 0,02­ 0,1 M o su equivalente, a temperaturas de aproximadamente 50-70 °C. Dichas condiciones de alto rigor toleran poco, o ningún, desapareamiento entre la secuencia de nucleótidos y la hebra molde o diana, y son particularmente adecuadas para detectar la expresión de cualquiera de los CAR inventivos. Generalmente, se aprecia que las condiciones pueden volverse más rigurosas mediante la adición de cantidades crecientes de formamida.
La invención también proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente un 70 % o más, p. ej., aproximadamente 80 %, aproximadamente 90 %, aproximadamente 91 %, aproximadamente 92 %, aproximadamente 93 %, aproximadamente 94 %, aproximadamente 95 %, aproximadamente el 96 %, aproximadamente 97 %, aproximadamente el 98 % o aproximadamente 99 % idéntica a cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento.
En una realización, los ácidos nucleicos de la invención pueden incorporarse en un vector de expresión recombinante. A este respecto, una realización de la invención proporciona vectores de expresión recombinantes que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención. Con los fines de el presente documento, el término "vector de expresión recombinante" significa un constructo de oligonucleótidos o polinucleótidos genéticamente modificados que permite la expresión de un ARNm, proteína, polipéptido o péptido por una célula hospedadora, cuando el constructo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el ARNm, proteína, polipéptido o péptido, y el vector se pone en contacto con la célula en condiciones suficientes para expresar el ARNm, proteína, polipéptido o péptido dentro de la célula. Los vectores de la invención no son de origen natural en su conjunto. Sin embargo, partes de los vectores pueden ser de origen natural. Los vectores de expresión recombinantes inventivos pueden comprender cualquier tipo de nucleótidos, incluidos, pero sin limitación, ADN y ARN, que pueden ser monocatenarios o bicatenarios, sintetizados u obtenidos en parte de fuentes naturales, y que pueden contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados. Los vectores de expresión recombinantes pueden comprender grupos de enlace internucleotídicos de origen natural o no natural, o ambos tipos de grupos de enlace. Preferiblemente, los nucleótidos o grupos de enlace internucleotídicos de origen no natural o alterados no obstaculizan la transcripción o replicación del vector. En una realización de la invención, el vector de expresión recombinante que comprende la secuencia de nucleótidos que codifica el CAR fCD27-CD3Z no codifica uno o ambos de CD19 y DsRed truncados.
En una realización, el vector de expresión recombinante de la invención puede ser cualquier vector de expresión recombinante adecuado, y puede usarse para transformar o transfectar cualquier célula hospedadora adecuada. Los vectores adecuados incluyen aquellos diseñados para propagación y expansión o para expresión o ambas, tales como plásmidos y virus. El vector se puede seleccionar del grupo que consiste en la serie pUC (Fermentas Life Sciences, Glen Burnie, MD), la serie pBluescript (Stratagene, LaJolla, CA), la serie pET (Novagen, Madison, WI), la serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y la serie pEX (Clontech, Palo Alto, CA). También se pueden usar vectores de bacteriófagos, tales como AGT10, áGt 11, AZapII (Stratagene), AEMBL4 y ANM1149. Los ejemplos de vectores de expresión de plantas incluyen pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 y pBIN19 (Clontech). Los ejemplos de vectores de expresión de animales incluyen pEUK-Cl, pMAM y pMAMneo (Clontech). El vector de expresión recombinante puede ser un vector vírico, p. ej., un vector retrovírico o un vector lentivírico. En algunas realizaciones, el vector puede ser un transposón.
En una realización, los vectores de expresión recombinantes de la invención pueden prepararse usando técnicas de ADN recombinante estándares descritas, por ejemplo, en Green y Sambrook, supra. Los constructos de vectores de expresión, que son circulares o lineales, pueden prepararse para contener un sistema de replicación funcional en una célula hospedadora procariótica o eucariótica. Los sistemas de replicación pueden derivar, p. ej., de ColEl, plásmido de 2 p, A, SV40, virus del papiloma bovino y similares.
El vector de expresión recombinante puede comprender secuencias reguladoras, tales como los codones de iniciación y terminación de la transcripción y traducción, que son específicos del tipo de célula hospedadora (p. ej., bacteria, hongo, planta o animal) en el que se va a introducir el vector, según sea apropiado, y teniendo en cuenta si el vector está basado en ADN o ARN. El vector de expresión recombinante puede comprender sitios de restricción para facilitar la clonación.
El vector de expresión recombinante puede incluir uno o más genes marcadores, que permiten la selección de células hospedadoras transformadas o transfectadas. Los genes marcadores incluyen resistencia a biocidas, p. ej., resistencia a antibióticos, metales pesados, etc., complementación en un hospedador auxotrófico para proporcionar prototrofia, y similares. Los genes marcadores adecuados para los vectores de expresión inventivos incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a neomicina/G418, genes de resistencia a higromicina, genes de resistencia a histidinol, genes de resistencia a tetraciclina y genes de resistencia a ampicilina.
El vector de expresión recombinante puede comprender un promotor nativo o no nativo ligado operativamente a la secuencia de nucleótidos que codifica el CAR, o a la secuencia de nucleótidos que es complementaria o que hibrida con la secuencia de nucleótidos que codifica el CAR. La selección de promotores, p. ej., fuertes, débiles, inducibles, específicos de tejido y específicos de desarrollo, está dentro de las habilidades comunes del experto. De manera similar, la combinación de una secuencia de nucleótidos con un promotor también está dentro de las habilidades del experto. El promotor puede ser un promotor no vírico o un promotor vírico, p. ej., un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de SV40, un promotor de RSV o un promotor que se encuentra en la repetición terminal larga del virus de citoblastos murinos.
Los vectores de expresión recombinantes inventivos pueden diseñarse para expresión transitoria, para expresión estable o para ambas. Además, los vectores de expresión recombinantes pueden elaborarse para expresión constitutiva o para expresión inducible.
Además, se puede hacer que los vectores de expresión recombinantes incluyan un gen suicida. Como se usa en el presente documento, el término "gen suicida" hace referencia a un gen que causa que la célula que expresa el gen suicida muera. El gen suicida puede ser un gen que confiere sensibilidad a un agente, p. ej., un fármaco, a la célula en la que se expresa el gen, y causa que la célula muera cuando la célula se pone en contacto con el agente o se expone a él. Los genes suicidas son conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, el gen de timidina cinasa (TK) del herpesvirus simple (HSV), citosina daminasa, nucleósido de purina fosforilasa y nitrorreductasa.
Una realización de la invención proporciona además una célula hospedadora que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinantes descritos en el presente documento. Como se usa en el presente documento, el término "célula hospedadora" hace referencia a cualquier tipo de célula que pueda contener el vector de expresión recombinante inventivo. La célula hospedadora puede ser una célula eucariótica, p. ej., plantas, animales, hongos o algas, o puede ser una célula procariótica, p. ej., bacterias o protozoos. La célula hospedadora puede ser una célula cultivada o una célula primaria, es decir, aislada directamente de un organismo, p. ej., un ser humano. La célula hospedadora puede ser una célula adherente o una célula suspendida, es decir, una célula que crece en suspensión. Las células hospedadoras adecuadas son conocidas en la técnica e incluyen, por ejemplo, células DH5a de E. coli, células ováricas de hámster chino, células VERO de mono, células COS, células HEK293 y similares. Con fines de amplificar o replicar el vector de expresión recombinante, la célula hospedadora puede ser una célula procariótica, p. ej., una célula DH5a. Con fines de producir un CAR recombinante, la célula hospedado ra puede ser una célula de mamífero. La célula hospedadora puede ser una célula humana. Si bien la célula hospedadora puede ser de cualquier tipo celular, puede originarse de cualquier tipo de tejido y puede ser de cualquier estado de desarrollo, la célula hospedadora puede ser un linfocito de sangre periférica (PBL) o una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC). La célula hospedadora puede ser un linfocito T.
Con los fines del presente documento, el linfocito T puede ser cualquier linfocito T, tal como un linfocito T cultivado, p. ej., un linfocito T primario, o un linfocito T de una línea de linfocitos T cultivados, p. ej., Jurkat, SupTl, etc., o un linfocito T obtenido de un mamífero. Si se obtiene de un mamífero, el linfocito T se puede obtener de numerosas fuentes que incluyen, pero sin limitación, sangre, médula ósea, nódulos linfáticos, el timo u otros tejidos o fluidos. Los linfocitos T también pueden enriquecerse o purificarse. El linfocito T puede ser un linfocito T humano. El linfocito T puede ser un linfocito T aislado de un ser humano. El linfocito T puede ser cualquier tipo de linfocito T y puede estar en cualquier estado de desarrollo, incluidos, pero sin limitación, linfocitos T CD4+/CD8+ dobles positivos, linfocitos T auxiliares CD4+, p. ej., linfocitos Th1 y Th2, linfocitos T CD8+ (p. ej., linfocitos T citotóxicos), células infiltrantes de tumores, linfocitos T de memoria, linfocitos T vírgenes y similares. El linfocito T puede ser un linfocito T CD8+ o un linfocito T CD4+.
También se proporciona mediante una realización de la invención una población de células que comprende al menos una célula hospedadora descrita en el presente documento. La población de células puede ser una población heterogénea que comprende la célula hospedadora que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinantes descritos, además de al menos otra célula, p. ej., una célula hospedadora (p. ej., un linfocito T), que no comprende ninguno de los vectores de expresión recombinantes, o una célula que no sea un linfocito T, p. ej., un linfocito B, un macrófago, un neutrófilo, un eritrocito, un hepatocito, una célula endotelial, una célula epitelial, una célula muscular, una célula cerebral, etc. Como alternativa, la población de células puede ser una población sustancialmente homogénea, en la que la población comprende principalmente células hospedadoras que comprenden (p. ej., que consisten esencialmente en) el vector de expresión recombinante. La población también puede ser una población clonal de células, en la que todas las células de la población son clones de una única célula hospedadora que comprende un vector de expresión recombinante, de tal modo que todas las células de la población comprenden el vector de expresión recombinante. En una realización de la invención, la población de células es una población clonal que comprende células hospedadoras que comprenden un vector de expresión recombinante como se describe en el presente documento.
En una realización de la invención, el número de células en la población puede incrementarse rápidamente. El incremento del número de células que expresan el CAR se puede lograr mediante cualquiera de los diversos procedimientos conocidos en la técnica como se describe, por ejemplo, en la patente de EE. UU. 8.034.334; la patente de EE. UU. 8.383.099; la publicación de solicitud de patente de EE. UU. n.° 2012/0244133; Dudley y col., J. Immunother., 26: 332-42 (2003) y Riddell y col., J. Immunol. Methods, 128: 189-201 (1990). En una realización, se lleva a cabo el incremento del número de células cultivando los linfocitos T con anticuerpo OKT3, IL-2 y PBMC de alimentación (p. ej., PBMC alogénicas irradiadas).
Los CAR, los ácidos nucleicos, los vectores de expresión recombinantes y las células hospedadoras (incluidas las poblaciones de las mismas), todos los cuales se denominan colectivamente como "materiales de CAR inventivos" en lo sucesivo, pueden aislarse y/o purificarse. El término "aislado" como se usa en el presente documento significa que se ha retirado de su entorno natural. El término "purificado" o "aislado" no requiere pureza absoluta o aislamiento; más bien, se pretende como un término relativo. Así, por ejemplo, una preparación de célula hospedadora purificada (o aislada) es aquella en la que la célula hospedadora es más pura que las células en su entorno natural dentro del cuerpo. Tales células hospedadoras pueden producirse, por ejemplo, mediante técnicas de purificación estándares. En algunas realizaciones, una preparación de una célula hospedadora se purifica de tal manera que la célula hospedadora representa al menos aproximadamente el 50 %, por ejemplo al menos aproximadamente el 70 %, del contenido celular total de la preparación. Por ejemplo, la pureza puede ser de al menos aproximadamente 50 %, puede ser mayor de aproximadamente 60 %, de aproximadamente 70 % o aproximadamente 80 %, o puede ser de aproximadamente 100 %.
Los materiales de CAR inventivos pueden formularse en una composición, tal como una composición farmacéutica. A este respecto, una realización de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los CAR, ácidos nucleicos, vectores de expresión y células hospedadoras (incluidas las poblaciones de las mismas), y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas inventivas que contienen cualquiera de los materiales de CAR inventivos pueden comprender más de un material de CAR inventivo, p. ej., un CAR y un ácido nucleico, o dos o más CAR diferentes. Como alternativa, la composición farmacéutica puede comprender un material de CAR inventivo en combinación con otros agentes o fármacos farmacéuticamente activos, tales como agentes quimioterapéuticos, p. ej., asparaginasa, busulfano, carboplatino, cisplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina, vincristina, etc. En una realización preferida, la composición farmacéutica comprende la célula hospedadora inventiva o poblaciones de la misma.
Preferiblemente, el portador es un portador farmacéuticamente aceptable. Con respecto a las composiciones farmacéuticas, el portador puede ser cualquiera de los usados convencionalmente para el material de CAR inventivo particular en consideración. Tales portadores farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por los expertos en la materia y están fácilmente disponibles para el público. Se prefiere que el portador farmacéuticamente aceptable sea uno que no tenga efectos secundarios perjudiciales o toxicidad en las condiciones de uso.
La elección del portador estará determinada en parte por el material de CAR inventivo particular, así como por el procedimiento particular usado para administrar el material de CAR inventivo. Por consiguiente, hay una variedad de formulaciones adecuadas de la composición farmacéutica de la invención. Las formulaciones adecuadas pueden incluir cualquiera de aquellas para administración oral, parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal o interperitoneal. Se puede usar más de una vía para administrar los materiales de CAR inventivos, y en ciertos casos, una vía particular puede proporcionar una respuesta más inmediata y más eficaz que otra vía.
Preferiblemente, el material de CAR inventivo se administra por inyección, p. ej., por vía intravenosa. Cuando el material de CAR inventivo es una célula hospedadora que expresa el CAR inventivo, el portador farmacéuticamente aceptable para inyección en las células puede incluir cualquier portador isotónico tal como, por ejemplo, solución salina normal (aproximadamente 0,90 % p/v de NaCl en agua, aproximadamente 300 mOsm/l de NaCl en agua, o aproximadamente 9,0 g de NaCl por litro de agua), solución electrolítica NORMOSOL R (Abbott, Chicago, IL), PLASMA-LYTE A (Baxter, Deerfield, IL), aproximadamente 5 % de dextrosa en agua, o Ringer lactato. En una realización, el portador farmacéuticamente aceptable se complementa con albúmina de suero humano.
La dosis del material de CAR inventivo también estará determinada por la existencia, naturaleza y medida de cualquier efecto secundario adverso que pueda acompañar a la administración de un material de CAR inventivo en particular. Típicamente, el médico tratante decidirá la dosificación del material inventivo de CAR con la que tratar a cada paciente individual, teniendo en cuenta una variedad de factores, tales como la edad, el peso corporal, la salud general, la dieta, el sexo, el material inventivo de CAR que se administrará, la vía de administración y la gravedad del cáncer que se está tratando. En una realización en la que el material de CAR inventivo es una población de células, el número de células administradas por infusión puede variar, p. ej., de aproximadamente 1 x 106 a aproximadamente 1 x 1012 células o más. En ciertas realizaciones, se pueden administrar menos de 1 x 106 células.
Con los fines de la invención, la cantidad o dosis del material de CAR inventivo administrado debería ser suficiente para efectuar una respuesta terapéutica o profiláctica en el sujeto o animal durante un plazo de tiempo razonable. Por ejemplo, la dosis del material de CAR inventivo debería ser suficiente para unirse al antígeno, o detectar, tratar o prevenir el cáncer en un período de aproximadamente 2 horas o más, p. ej., aproximadamente 12 a aproximadamente 24 o más horas, desde el momento de administración. En ciertas realizaciones, el período de tiempo podría ser incluso más largo. La dosis estará determinada por la eficacia del material de CAR particular inventivo y la condición del animal (p. ej., ser humano), así como el peso corporal del animal (p. ej., ser humano) a tratar.
Con los fines de la invención, podría usarse un ensayo que comprende, por ejemplo, comparar la medida en que las células diana se lisan y/o se secreta IFN-y por los linfocitos T que expresan el CAR inventivo tras la administración de una dosis dada de tales linfocitos T a un mamífero, entre un conjunto de mamíferos a los que se les da una dosis diferente de linfocitos T, para determinar la dosis de partida que se administrará a un mamífero. La medida en que las células diana se lisan y/o se secreta IFN-y tras la administración de una dosis determinada puede ensayarse mediante procedimientos conocidos en la técnica.
Un experto en la materia apreciará fácilmente que los materiales de CAR inventivos de la invención pueden modificarse de varias maneras, de tal modo que la eficacia terapéutica o profiláctica de los materiales de CAR inventivos aumente mediante la modificación. Por ejemplo, los materiales de CAR inventivos pueden conjugarse directa o indirectamente a través de un ligador con un resto orientativo. Es conocida en la técnica la práctica de conjugar compuestos, p. ej. materiales de CAR inventivos, con restos orientadores.
Cuando los materiales de CAR inventivos se administran con uno o más agentes terapéuticos adicionales, pueden coadministrase uno o más agentes terapéuticos adicionales al mamífero. Por "coadministración" se entiende administrar uno o más agentes terapéuticos adicionales y los materiales de CAR inventivos suficientemente próximos en el tiempo, de tal manera que los materiales de CAR inventivos puedan potenciar el efecto de uno o más agentes terapéuticos adicionales, o viceversa. A este respecto, los materiales de CAR inventivos pueden administrarse primero y el uno o más agentes terapéuticos adicionales pueden administrarse en segundo lugar, o viceversa. Como alternativa, los materiales de CAR inventivos y el uno o más agentes terapéuticos adicionales se pueden administrar simultáneamente. Un agente terapéutico ejemplar que puede coadministrarse con los materiales de CAR es IL-2. Se cree que IL-2 potencia el efecto terapéutico de los materiales inventivos de CAR.
Se contempla que las composiciones farmacéuticas inventivas, los CAR, los ácidos nucleicos, los vectores de expresión recombinantes, las células hospedadoras o las poblaciones de células puedan usarse en procedimientos para tratar o prevenir el cáncer en un mamífero. Sin limitarse a una teoría o mecanismo particular, los CAR inventivos tienen actividad biológica, p. ej., capacidad de reconocer el antígeno, p. ej., CD70, de tal modo que el CAR cuando se expresa por una célula es capaz de mediar una respuesta inmunitaria contra la célula que expresa el antígeno, p. ej., CD70, para el cual el CAR es específico. A este respecto, una realización de la invención proporciona un procedimiento para tratar o prevenir el cáncer en un mamífero, que comprende administrar al mamífero los CAR, los ácidos nucleicos, los vectores de expresión recombinantes, las células hospedadoras, la población de células y/o las composiciones farmacéuticas de la invención en una cantidad eficaz para tratar o prevenir el cáncer en el mamífero.
Una realización de la invención comprende además terapia linfopenizante en el mamífero antes de administrar los materiales de CAR inventivos. Los ejemplos de terapia linfocitopenizante incluyen, pero sin limitación, quimioterapia linfopenizante no mieloablativa, quimioterapia linfopenizante mieloablativa, irradiación corporal total, etc.
Con los fines de los procedimientos de la invención, en los que se administran células hospedadoras o poblaciones de células, las células pueden ser células alogénicas o autólogas del mamífero. Preferiblemente, las células son autólogas del mamífero.
El mamífero al que se hace referencia en el presente documento puede ser cualquier mamífero. Como se usa en el presente documento, el término "mamífero" hace referencia a cualquier mamífero, incluyendo, pero sin limitación, mamíferos del orden Rodentia, tales como ratones y hámsters, y mamíferos del orden Logomorpha, tales como conejos. Los mamíferos pueden ser del orden Carnivora, incluidos felinos (gatos) y caninos (perros). Los mamíferos pueden ser del orden Artiodactyla, incluidos los bovinos (vacas) y los cerdos (cerdos) o del orden Perssodactyla, incluidos los equinos (caballos). Los mamíferos pueden ser del orden Primates, Ceboidea o Simoides (monos) o del orden Antropoides (seres humanos y simios). Preferiblemente, el mamífero es un ser humano.
Con respecto a los procedimientos de la invención, el cáncer puede ser cualquier cáncer, incluido cualquiera de cáncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiosarcoma alveolar, cáncer de vejiga (p. ej., Carcinoma de vejiga), cáncer de huesos, cáncer de cerebro (p. ej., meduloblastoma), cáncer de mama., cáncer de ano, canal anal o anorecto, cáncer de ojo, cáncer de conducto biliar intrahepático, cáncer de articulaciones, cáncer de cuello, vesícula biliar o pleura, cáncer de nariz, cavidad nasal u oído medio, cáncer de cavidad oral, cáncer de vulva, leucemia linfocítica crónica (LLC), cáncer mieloide crónico, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer cervicouterino, fibrosarcoma, tumor carcinoide gastrointestinal, cáncer de cabeza y cuello (p. ej., carcinoma epidermoide de cabeza y cuello), glioblastoma, linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, cáncer de riñón, cáncer de laringe, leucemia, tumores líquidos, cáncer de hígado, cáncer de pulmón (p. ej., carcinoma pulmonar no microcítico), linfoma, linfoma difuso de células B grandes, linfoma folicular maligno, mesotelioma, mastocitoma, melanoma, mieloma múltiple, cáncer de nasofaringe, linfoma no Hodgkin (LNH), leucemia linfocítica crónica B, tricoleucemia, leucemia linfocítica aguda (LLA) y linfoma de Burkitt, cáncer de ovario, cáncer pancreático, cáncer de peritoneo, epiplón y mesenterio, cáncer de faringe, cáncer de próstata, CCR, CCRcc, cáncer rectal, cáncer renal, cáncer de piel, cáncer de intestino delgado, cáncer de tejidos blandos, tumores sólidos, cáncer de estómago, cáncer testicular, cáncer de tiroides y cáncer de uréter. Preferiblemente, el cáncer se caracteriza por la expresión de CD70.
En una realización preferida, el cáncer es cualquiera de CCR (por ejemplo, CCRcc), glioblastoma, LNH, LLC, linfoma difuso de células B grandes y linfoma folicular.
Los términos "tratar" y "prevenir", así como las palabras derivadas de los mismos, tal como se usan en el presente documento, no necesariamente implican un 100 % de tratamiento o prevención completos. Por el contrario, hay diversos grados de tratamiento o prevención que un experto en la materia reconoce que tienen un beneficio potencial o efecto terapéutico. A este respecto, los procedimientos inventivos pueden proporcionar cualquier cantidad de cualquier nivel de tratamiento o prevención de cáncer en un mamífero. Además, el tratamiento o la prevención proporcionados por el procedimiento inventivo pueden incluir el tratamiento o la prevención de una o más afecciones o síntomas de la enfermedad, p. ej., cáncer, que se está tratando o previniendo. Además, con los fines del presente documento, "prevención" puede abarcar retrasar el inicio de la enfermedad, o un síntoma o afección de la misma.
Otra realización de la invención proporciona un uso de los CAR, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinantes, células hospedadoras, poblaciones de células o composiciones farmacéuticas inventivos, para el tratamiento o la prevención del cáncer en un mamífero.
Otra realización de la invención proporciona un procedimiento para detectar la presencia de cáncer en un mamífero, que comprende: (a) poner en contacto una muestra que comprende una o más células del mamífero con los CAR, los ácidos nucleicos, los vectores de expresión recombinantes, las células hospedadoras o la población de células de la invención, formando así un complejo, (b) y detectar el complejo, en la que la detección del complejo es indicativa de la presencia de cáncer en el mamífero.
La muestra se puede obtener por cualquier procedimiento adecuado, p. ej., biopsia o necropsia. Una biopsia es la retirada de tejido y/o células de un individuo. Tal retirada puede ser para recoger tejido y/o células del individuo con el fin de realizar experimentación en el tejido y/o células retirados. Esta experimentación puede incluir experimentos para determinar si el individuo tiene y/o sufre de una determinada afección o estado patológico. La afección o enfermedad puede ser, p. ej., cáncer.
Con respecto a una realización del procedimiento inventivo para detectar la presencia de cáncer en un mamífero, la muestra que comprende células del mamífero puede ser una muestra que comprende células enteras, lisados de las mismas o una fracción de los lisados de células enteras, p. ej., una fracción nuclear o citoplasmática, una fracción de proteína completa o una fracción de ácido nucleico. Si la muestra comprende células enteras, las células pueden ser cualquier célula del mamífero, p. ej., las células de cualquier órgano o tejido, incluidas las células sanguíneas o las células endoteliales.
Con los fines del procedimiento de detección inventivo, el contacto puede tener lugar in vitro o in vivo con respecto al mamífero. Preferiblemente, el contacto es in vitro.
Además, la detección del complejo puede ocurrir a través de cualquier número de formas conocidas en la técnica. Por ejemplo, los CAR, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células hospedadoras o poblaciones de células inventivos, descritos en el presente documento, pueden marcarse con un marcaje detectable tal como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (p. ej., isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (p. ej., fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano picante) y partículas de elementos (p. ej., partículas de oro).
En la técnica son conocidos procedimientos para ensayar la capacidad de un CAR de reconocer células diana y la especificidad de antígeno. Por ejemplo, Clay et al., J. Immunol., 163: 507-513 (1999), enseñan procedimientos para medir la liberación de citocinas (p. ej., Interferón-Y, factor estimulante de colonias de granulocitos/monocitos (GM-CSF), factor de necrosis tumoral a (TNF-a) o interleucina 2 (IL-2)). Además, la función del CAR se puede evaluar midiendo la citotoxicidad celular, como se describe en Zhao et al., J. Immunol., 174: 4415-4423 (2005).
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención, pero, por supuesto, no se deberían interpretar como limitantes de ningún modo de su alcance.
EJEMPLO 1
Este ejemplo demuestra la eficacia de transducción de un vector retrovírico que codifica un CAR que incluye CD27 de ratón de longitud completa y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3Z de ratón (CAR mCD27-CD3Z) y que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y la reactividad del CAR mCD27 -CD3Z contra células tumorales que expresan mCD70 in vitro.
Se construyó un vector retrovírico que codifica un CAR que incluye CD27 de ratón de longitud completa y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T CD3Z de ratón (CAR mCD27-CD3Z) y que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25. Se transdujeron retrovíricamente los linfocitos T murinos con el vector retrovírico CAR mCD27-CD3Z. Se determinó que la eficacia de transducción era de 62,6 %.
Los linfocitos T de ratón generados a partir de esplenocitos eran no transducidos (UT) o transducidos con un vector que codifica GFP o el CAR mCD27-CD3Z (células efectoras) y cultivados solos (medio) o cocultivados con células de melanoma B16 que no expresan CD70 de ratón (células B16) o células B16 que se transdujeron para expresar células diana CD70 de ratón (B16/mCD70). Las células Pmel, que son linfocitos T de ratón que reconocen el tumor B16, se usaron como células efectoras de control positivo. Se midió la secreción de IFN-y. Los resultados se muestran en la Tabla 2. Como se muestra en la Tabla 2, las células transducidas con el CAR mCD27-CD3Z mostraban alta reactividad contra tumores que expresan CD70 in vitro.
TABLA 2
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EJEMPLO 2
Este ejemplo demuestra que los linfocitos T de ratón generados a partir de esplenocitos transducidos con una secuencia de nucleótidos que codifica un CAR que incluye CD27 de ratón de longitud completa y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3z de ratón (CAR mCD27-CD3Z) y que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 reducen la carga tumoral y aumentan la supervivencia de ratones portadores de tumor que expresan CD70.
Once días antes de transferir células que expresan CAR a ratones, se establecieron tumores en ratones inyectándoles células B16 o células B16/mCD70. Cuatro días después, se retiraron los esplenocitos de los ratones y se estimularon con concanavalina A (ConA) e IL-7 o CD3 anti-ratón (mCD3) y CD28 soluble (sCD28). Dos días después, se transdujeron los linfocitos T de ratón generados a partir de los esplenocitos estimulados con un vector retrovírico MSGV1 que codifica el CAR mCD27-CD3Z que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25. Cinco días después, se administraron las células transducidas con CAR mCD27-CD3Z (1 x 107) a los ratones portadores de tumor, y se irradiaron los ratones (500 rad). A los ratones portadores de tumor de control se les administraron células no transducidas, solución salina tamponada con fosfato (PBS) o una combinación de células pmel (pmel), una vacuna de gp100 (V) e IL-2 (I) ("pmel VI") y se irradiaron. Se midió el tamaño de los tumores durante un período de tiempo de hasta aproximadamente 35 días después del tratamiento. Los resultados se muestran en las Figuras 1A-1B. Como se muestra en las Figuras 1A-1B, las células transducidas con CAR mCD27-CD3Z reducían la carga tumoral en ratones portadores de tumor B16/mCD70, pero no en ratones portadores de tumor B16. Por consiguiente, los ratones portadores de tumores CD70+ podrían tratarse con éxito con células transducidas con CAR mCD27-CD3Z, y el tratamiento era específico de CD70.
El experimento se repitió con ratones portadores de tumores B16/mCD70, excepto que los esplenocitos fueron estimulados con anti-mCD3 y sCD28, y se administró también a los ratones iL-2 después de la irradiación y administración de células transducidas. A los ratones portadores de tumor de control se les administraron células no transducidas, células transducidas con un vector vacío o pmel VI, seguido de irradiación y administración de IL-2. Se midió el tamaño de los tumores durante un período de tiempo de hasta aproximadamente 24 días después del tratamiento. Los resultados se muestran en la Figura 1F. Como se muestra en la Figura 1F, cuando se coadministraron con IL-2, las células transducidas con CAR mCD27-CD3Z reducían la carga tumoral en ratones portadores de tumor B16/mCD70.
Veintiún días después de la transferencia celular, los tumores se retiraron de los ratones tratados y se cultivaron in vitro durante siete días. Se midió la expresión de CD70 de ratón en los tumores mediante FACS. Se observó que la expresión de CD70 se perdía en ratones tratados con células transducidas con CAR mCD27-CD3Z, pero no en ratones tratados con Pmel V o células no transducidas. Sin limitarse a una teoría o mecanismo particular, se cree que la recurrencia del crecimiento tumoral se debía muy probablemente a la pérdida de la expresión de CD70 en los tumores B16/mCD70.
Se repitió de nuevo el experimento correspondiente al de la Figura 1B con ratones portadores de tumor B16/mCD70, con las siguientes excepciones. A los ratones portadores de tumor B16/mCD70 se les administraron células transducidas con CAR mCD27-CD3Z a una dosis de 1 x 104, 1 x 105, 1 x 106 o 1 x 107 células por ratón con o sin irradiación (500 Rad). A los ratones portadores de tumor de control se les administró PBS, pmel VI o linfocitos T de ratón que se transdujeron con un vector vacío con o sin irradiación (500 Rad). Los resultados se muestran en la Figuras 1C-1D. Como se muestra en la Figura 1C, la dosis eficaz mínima para tratar tumores era de 1 x 105 células transducidas con CAR mCD27-CD3Z por ratón cuando se irradiaban ratones. Como se muestra en las Figuras 1C-1D, a una dosis de 1 x 107 células por ratón, la irradiación no parecía afectar la eficacia del tratamiento.
Se evaluó también la supervivencia de los ratones portadores de tumor durante un período de tiempo de hasta aproximadamente 42 días después del tratamiento. Los resultados se muestran en la Figura 1E. Como se muestra en la Figura 1E, los ratones irradiados portadores de tumor tratados con las células transducidas con CAR mCD27-CD3Z sobrevivían más tiempo, particularmente a dosis de 1 x 106 o 1 x 107 células por ratón.
EJEMPLO 3
Este ejemplo demuestra que la administración de células transducidas con CAR mCD27-CD3Z a ratones portadores de tumor da como resultado cierta toxicidad. Este ejemplo también demuestra que los ratones pueden recuperarse de la toxicidad.
A los ratones portadores de tumor B16 o B16/mCD70 se les administraron células no transducidas o células transducidas con CAR mCD27-CD3Z que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, PBS o pmel V, con o sin irradiación (500 Rad). Se midió el peso promedio de los ratones durante un período que comenzaba aproximadamente seis días después de la transferencia celular hasta aproximadamente 17 días después del tratamiento. Los resultados se muestran en la Figuras 2A-2D. Como se muestra en las Figuras 2A-2D, se observaron pesos corporales transitorios menores tanto para ratones portadores de tumor B16/mCD70 como B16 que fueron tratados con CAR mCD27-CD3Z. El menor peso corporal observado en los ratones tratados con CAR mCD27-CD3Z era irrelevante para los tumores implantados. Sin limitarse a una teoría o mecanismo particular, se cree que el peso corporal menor implica que células endógenas eran la diana del CAR mCD27-CD3Z Los ratones recuperaron el peso corporal perdido cuando se les administró un hidrogel que contenía agua, hidrocoloides, ácido alimentario y benzoato de sodio.
A los ratones portadores de tumores B16 o B16/mCD70 se les administraron células no transducidas o células transducidas con CAR mCD27-CD3Z que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25, o células transducidas con un vector que codifica GFP, con o sin irradiación (500 Rad). Se midió el recuento absoluto de glóbulos blancos (WBC) en los ratones durante un período que comenzaba aproximadamente seis días después de la transferencia celular hasta aproximadamente 14 días después del tratamiento. Los resultados se muestran en las Figuras 2E-2H. Como se muestra en las Figuras 2E-2F, se observó un recuento transitorio menor de WBC en los ratones que se trataron con CAR mCD27-CD3Z Como se muestra en las Figuras 2G-2H, también se observó un recuento transitorio de esplenocitos menor en los ratones que se trataron con CAR mCD27-CD3Z
A los ratones portadores de tumor B16/mCD70 se les administraron células transducidas con CAR mCD27-CD3Z que tenía la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 o células transducidas con un vector que codifica GFP, con o sin irradiación (500 Rad). Se midieron los niveles séricos de IFN-y durante un período que comenzaba aproximadamente tres días después de la transferencia celular hasta aproximadamente siete días después del tratamiento. Los resultados se muestran en la Figura 2I. Como se muestra en la Figura 2I, se observó secreción transitoria de IFN-y en los ratones irradiados tratados con CAR mCD27-CD3Z
EJEMPLO 4
Este ejemplo demuestra que la administración de CAR mCD27-CD3Z no tiene un efecto mensurable sobre la función inmunitaria a largo plazo de ratones no portadores de tumor.
A los ratones no portadores de tumor se les administraron células transducidas con CAR mCD27-CD3Z que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 o células transducidas con un vector que codifica GFP (GFP), con o sin irradiación (500 Rad). Se inmunizaron los ratones con ovoalbúmina (OVA) o gp100 humana (h) 32 o 50 días después de la transferencia de células transducidas. Se retiraron linfocitos T del bazo y el nódulo linfático (NL) de los ratones siete días después de la inmunización. Se estimularon las células in vitro con péptido OT-1, OT-II o hgp100. Los resultados se muestran en la Tabla 3 (Día 32 - bazo), la Tabla 4 (Día 32 - NL) y la Tabla 5 (Día 50 - bazo). En la Tabla 5, se usaron ratones C57BL/6 inmunizados (inmunocompetentes) (B6/Im) como control positivo. Se usaron ratones C57BL/6 no tratados (B6/no tratado) como control negativo. Como se muestra en las Tablas 3-5, la administración de CAR mCD27-CD3Z no tiene un efecto mensurable sobre la función inmunitaria a largo plazo de los ratones no portadores de tumor.
Se examinó la histología de diversos órganos, incluidos el cerebro, los pulmones, el hígado, los riñones, el intestino, el corazón, el bazo y los huesos, de 3 a 7 días después de la transferencia celular. Se examinó la química de la sangre, en particular, los niveles sanguíneos de sodio, potasio, cloruro, calcio, magnesio, fósforo, glucosa, nitrógeno ureico en sangre (BUN), creatinina, ácido úrico, albúmina, proteínas, colesterol, triglicéridos, fosfatasa alcalina (ALK P), alanina aminotransferasa (ALT/GPT), aspartato aminotransferasa (AST/GOT), amilasa, creatina cinasa (CK) y lactato deshidrogenasa (LD) de 3 días a 7 días después de la transferencia celular. No se observaron cambios en la histología ni en la química sanguínea.
TABLA 3
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TABLA 4
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TABLA 5
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EJEMPLO 5
Este ejemplo demuestra que los linfocitos T transducidos con una secuencia de nucleótidos que codifica un CAR que incluye CD27 humano de longitud completa y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3Z humano (CAR fCD27-CD3Z) expresan el CAR después del incremento de los números de células transducidas. Se estimularon PBL de forma inespecífica con OKT3 y los linfocitos T generados a partir de PBL (a) no se transdujeron (UT), (b) se transdujeron con una secuencia de nucleótidos que codifica CD27 humano de longitud completa (fCD27), o (c) se transdujeron con una secuencia de nucleótidos que codifica el CAR fCD27-CD3Z que tiene la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7. Se cultivaron las células, se analizó la expresión de cAr mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y se ensayó la reactividad tumoral basándose en la producción de IFN-y. Se incrementaron rápidamente (REP) los números de células reactivas con CD70, en general como se describe en Riddell et al., J. Immunol. Methods, 128: 189-201 (1990). Se hicieron crecer los números de células incrementados y se analizó la expresión de CD27, CD70, CD45RO y CD62L por FACS. La Tabla 6 muestra el porcentaje de células con los fenotipos indicados medidos por FACS. La Tabla 7 muestra el incremento en veces y la viabilidad (%) de las células después de la estimulación (pero antes de REP) y después de REP. Como se muestra en las Tablas 6 y 7, los números incrementados de células transducidas expresan el CAR y son viables y tienen un fenotipo de memoria efectora.
TABLA 6
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TABLA 7
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EJEMPLO 6
Este ejemplo demuestra que los linfocitos T transducidos con una secuencia de nucleótidos que codifica un CAR que incluye CD27 humano de longitud completa y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3Z humano (CAR fCD27-CD3Z) proliferan tras cocultivo con células que expresan CD70 y reconocen específicamente líneas celulares tumorales que expresan CD70 in vitro.
Se generaron linfocitos T a partir de PBL humanos. Se cultivaron linfocitos T no transducidos (UT) o linfocitos T transducidos con una secuencia de nucleótidos que codifica fCD27 o el CAR fCD27-CD3Z (células efectoras) solos o se cocultivaron con la línea de células tumorales que expresan CD70 624mel o células 624mel transducidas con CD70 (624/CD70) (células diana). Se midió la proliferación de las células efectoras usando éster succinimidílico de carboxifluoresceína (CFSE) el día 4 del cocultivo. Los linfocitos T transducidos con el CAR fCD27-CD3Z proliferaban solo cuando se cocultivaban con la línea celular tumoral que expresa CD70 624/CD70. Los linfocitos T UT y linfocitos T transducidos con fCD27 no proliferaban en ningún cultivo.
Se cultivaron linfocitos T UT o linfocitos T transducidos con una secuencia de nucleótidos que codifica fCD27 o el CAR fCD27-CD3Z (SEQ ID NO: 7) (células efectoras) solos (medio) o se cocultivaron con una de las líneas celulares de CCR humanas o líneas celulares de control 624, 624/CD70, SNU245, SNU1079 o SNU1196 (células diana) mostradas en la Tabla 8 a continuación. Todas las líneas celulares de SNU eran negativas de CD70. Se midió la secreción de IFN-y. Los resultados se muestran en la Tabla 8. Como se muestra en la Tabla 8, los linfocitos T transducidos con una secuencia de nucleótidos del CAR fCD27-CD3Z (SEQ ID NO: 7) eran reactivas contra líneas celulares de CCR humanas que expresan CD70.
TABLA 8
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EJEMPLO 7
Este ejemplo demuestra la eficacia de transducción de constructos de CAR humanos anti-CD70.
Se transdujeron los linfocitos T humanos con un vector retrovírico vacío (ficticio) o un vector retrovírico que codifica uno de los constructos expuestos en las Tablas 9A-9C. Los CAR que incluyen un CD27 truncado (A) carecen de todo el dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD27, es decir, el CD27 truncado carece de los residuos de aminoácidos contiguos 212-260 de SEQ ID NO: 2. Se analizó en las células transducidas la expresión de CD3, CD27, CD62L y CD45RO por FACS. Las Tablas 9A-9C muestran el porcentaje de células con los fenotipos indicados medidos por FACS. Como se muestra en la Tabla 9B, las células transducidas con CAR tienen un fenotipo de memoria efectora.
TABLA 9A
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TABLA 9B
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TABLA 9C
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EJEMPLO 8
Este ejemplo demuestra que los linfocitos T humanos transducidos con fCD27-CD3Z (SEQ ID NO: 7), ACD27-4-1BB - CD3Z (SEQ ID NO: 9), ACD27-CD28 - 4-1BB - CD3Z (SEQ ID NO: 10), fCD27-4-1BB - CD3Z (SEQ ID NO: 12) o fCD27-CD28 - 4-1BB - CD3Z (SEQ ID NO: 13) reconocen las células tumorales RCC que expresan CD70 in vitro. Se transdujeron linfocitos T humanos con un vector retrovírico vacío (MSGV1) o un vector retrovírico que codifica uno de los constructos expuestos en la Tabla 9A. Se cultivaron las células transducidas solas (medio) o se cocultivaron con las células diana de control 624mel, 624/CD70, 938mel o células 938mel transducidas para expresar CD70 (938/CD70) o células diana RCC RCC 2245R, RCC 2246R, RCC 2361R, o RCC 1764. Se midió la secreción de IFN-y. Los resultados se muestran en la Figura 3. Como se muestra en la Figura 3, los linfocitos T humanos transducidos con fCD27-CD3Z (SEQ ID NO: 7), ACD27-4-1BB - CD3Z (SEQ ID NO: 9), ACD27-CD28 - 4-1BB - CD3Z (SEQ ID NO: 10), fCD27-4-1BB - CD3Z (SEQ ID NO: 12) o fCD27-CD28 - 4-1BB - CD3Z (SEQ ID NO: 13) reconocen las células tumorales RCC que expresan CD70 in vitro.
EJEMPLO 9
Este ejemplo demuestra la selección de un vector retrovírico ACD27-4-1BB - CD3Z (SEQ ID NO: 9) que produce un clon de empaquetamiento.
Los clones A2, A10, B3, C1, E3, G2 de la línea celular de empaquetamiento retrovírico PG13 no se transdujeron o se transdujeron con un vector retrovírico que codifica ACD27-4-1BB - CD3Z (SEQ ID NO: 9). La Tabla 10 muestra el porcentaje de células con los fenotipos indicados medidos por FACS.
TABLA 10
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Se cultivaron los clones transducidos solos (medio) o se cocultivaron con las células de control diana 938mel, 938/CD70, SNU1079, SNU1196 o las líneas celulares diana RCC RCC 2245R, RCC 2246R, RCC 2361R o RCC 1764. Se midió la secreción de IFN-y. Los resultados se muestran en la Figura 4. Como se muestra en la Figura 4, el clon de empaquetamiento retrovírico E3 demostró reactividad contra líneas celulares tumorales diana que expresan CD70.
Se transdujeron los clones celulares de empaquetamiento retrovírico con un CAR como se expone en la Tabla 11. La Tabla 11 muestra el porcentaje de células con los fenotipos indicados medidos por FACS.
TABLA 11
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Se cultivaron los clones transducidos solos (medio) o se cocultivaron con las células de control diana 938mel, 938/CD70, SNU1079, SNU1196 o las líneas celulares diana RCC RCC 2245R, RCC 2246R, RCC 2361R o RCC 1764. Se midió la secreción de IFN-y. Los resultados se muestran en la Figura 5. Como se muestra en la Figura 5, el clon de empaquetamiento retrovírico E3 demostró reactividad contra líneas celulares tumorales diana que expresan CD70.
En base a su eficacia de transducción y actividad tumoral, se eligió el clon de empaquetamiento retrovírico E3/ACD27-4-1BB - CD3Z (SEQ ID NO: 9) para uso clínico.
El uso de los términos "uno" y "una" y "el/la" y referentes similares en el contexto de la descripción de la invención (especialmente en el contexto de las siguientes reivindicaciones) se debe interpretar de modo que cubra tanto el singular como el plural, a menos que se indique de otro modo en el presente documento o el contexto lo contradiga claramente. Los términos "que comprende", "que tiene", "que incluye" y "que contiene" se deben interpretar como términos abiertos (es decir, que significan "incluyendo, pero sin limitación") a menos que se indique de otro modo. La enumeración de intervalos de valores en el presente documento pretende servir simplemente como un procedimiento abreviado para hacer referencia individualmente a cada valor separado que esté dentro del intervalo, a menos que se indique de otro modo en el presente documento, y cada valor separado se incorpora a la memoria descriptiva como si se hubiera enumerado individualmente en el presente documento. Todos los procedimientos descritos en el presente documento se pueden realizar en cualquier orden adecuado a menos que se indique de otro modo en el presente documento o el contexto lo contradiga claramente. El uso de todos y cada uno de los ejemplos, o del vocabulario ejemplar (por ejemplo, "tal como") proporcionado en el presente documento, pretende simplemente iluminar mejor la invención y no plantea una limitación en el alcance de la invención a menos que se indique de otro modo. Ningún vocabulario en la memoria descriptiva se debe interpretar de forma que indique que cualquier elemento no reivindicado es esencial para la práctica de la invención.
Las realizaciones preferidas de esta invención se describen en el presente documento, incluido el mejor modo conocido por los inventores para llevar a cabo la invención. Las variaciones de esas realizaciones preferidas pueden hacerse evidentes para los expertos en la materia al leer la descripción anterior. Los inventores esperan que los expertos empleen tales variaciones según sea apropiado, y los inventores tienen la intención de que la invención se practique de otra manera que la descrita específicamente en el presente documento. Por consiguiente, esta invención incluye todas las modificaciones y equivalentes de la materia en cuestión enumeradas en las reivindicaciones adjuntas a la misma, según lo permitido por la ley aplicable. Además, cualquier combinación de los elementos descritos anteriormente en todas las variaciones posibles de los mismos está abarcada por la invención a menos que se indique lo contrario en el presente documento o que el contexto lo contradiga claramente.

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Un receptor de antígeno quimérico (CAR) que tiene especificidad antigénica por CD70, comprendiendo el CAR:
un dominio transmembrana de unión a antígeno que comprende una secuencia de aminoácidos de CD27 que carece de todo el dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD27;
un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de 4-1BB;
un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3Z; y
opcionalmente, un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD28.
2. El CAR según la reivindicación 1, que comprende un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de 4-1BB, un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3Z y un dominio de señalización i ntracelular de linfocitos T de CD28.
3. El CAR según la reivindicación 1, que comprende un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de 4-1 BB y un dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3Z.
4. El CAR según la reivindicación 1 o 2, en el que el dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD28 comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 6.
5. El CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, en el que el dominio de señalización intracelular de linfocitos T de 4-1BB comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 5.
6. El CAR según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en el que el dominio de señalización intracelular de linfocitos T de CD3Z comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 4.
7. El CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, en el que el dominio transmembrana de unión a antígeno de CD27 comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 90 % idéntica a la SEQ ID NO: 3.
8. El CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7 que comprende una secuencia de aminoácidos al menos aproximadamente un 90 % idéntica a una cualquiera de las SEQ ID NO: 8-10, opcionalmente en el que el CAR comprende la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 8-10.
9. Un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el CAR según una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, opcionalmente en el que el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de una cualquiera de las SEQ ID NO: 15-17.
10. Un vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico de la reivindicación 9.
11. Una célula hospedadora aislada que comprende el vector de expresión recombinante de la reivindicación 10.
12. Una población de células que comprende al menos una célula hospedadora de la reivindicación 11.
13. Una composición farmacéutica que comprende el CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, el ácido nucleico de la reivindicación 9, el vector de expresión recombinante de la reivindicación 10, la célula hospedadora de la reivindicación 11, o la población de células de la reivindicación 12 y un portador farmacéuticamente aceptable.
14. Un procedimiento para detectar la presencia de cáncer en un mamífero, comprendiendo el procedimiento:
(a) poner en contacto una muestra que comprende una o más células del mamífero con el CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, el ácido nucleico de la reivindicación 9, el vector de expresión recombinante de la reivindicación 10, la célula hospedadora de la reivindicación 11, la población de células de reivindicación 12, o la composición farmacéutica de la reivindicación 13, formando así un complejo, y (b) detectar el complejo, en el que la detección del complejo es indicativa de la presencia de cáncer en el mamífero.
15. El CAR de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, el ácido nucleico de la reivindicación 9, el vector de expresión recombinante de la reivindicación 10, la célula hospedadora de la reivindicación 11, la población de células de la reivindicación 12, o la composición farmacéutica de la reivindicación 13, para uso en el tratamiento o prevención del cáncer.
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