ES2784237T3 - Receptores de células T anti-papilomavirus 16 E7 humano - Google Patents

Receptores de células T anti-papilomavirus 16 E7 humano Download PDF

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Abstract

Receptor de células T (TCR) que comprende una región variable humana y una región constante murina, o una variante funcional del TCR, en el que el TCR y la variante funcional comprenden la secuencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad (CDR) 1 de cadena alfa de SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena alfa de SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena alfa de SEQ ID NO: 5, la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena beta de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena beta de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena beta de SEQ ID NO: 8, y tienen especificidad antigénica para el papilomavirus humano (HPV) 16 E711-19 SEQ ID NO: 2, en el que opcionalmente el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de (a) SEQ ID NO: 9 y (b) SEQ ID NO: 10, en la que X en la posición 2 es Ala o Gly.

Description

DESCRIPCIÓN
Receptores de células T anti-papilomavirus 16 E7 humano
Referencia cruzada a solicitud relacionada
Esta solicitud de patente reivindica el beneficio de la solicitud de patente provisional estadounidense n.° 62/004.335, presentada el 29 de mayo de 2014.
Incorporación por referencia del material presentado electrónicamente
Se incorpora por referencia en su totalidad en el presente documento un listado de secuencias de nucleótidos/aminoácidos legible por ordenador presentado de manera simultánea con el presente documento e identificado de la siguiente manera: un archivo ASCII (texto) de 78.607 Bytes titulado “720940_ST25.TXT”, con fecha de 28 de mayo de 2015.
Antecedentes de la invención
El motivo principal de algunos tipos de cáncer tal como, por ejemplo, cáncer de cuello uterino, es la infección por papilomavirus humano (HPV). A pesar de los avances en los tratamientos tal como quimioterapia, puede ser malo el pronóstico para muchos cánceres, incluyendo cánceres asociados a HPV. Por consiguiente, existe la necesidad insatisfecha de tratamientos adicionales para cáncer, particularmente cánceres asociados a HPV.
Breve sumario de la invención
La presente invención se refiere a receptores de células T, polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión, células huésped, población de células, anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos, composiciones farmacéuticas y métodos in vitro de detección de la presencia de un estado en un mamífero tal como se definen por el contenido de las reivindicaciones.
Una realización de la invención proporciona un receptor de células T (TCR) que comprende una región variable humana y una región constante murina, o una variante funcional del TCR, en el que el TCR y la variante funcional comprenden la secuencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad (CDR) 1 de cadena alfa de SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena alfa de SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena alfa de SEQ ID NO: 5, la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena beta de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena beta de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena beta de SEQ ID NO: 8, y tienen especificidad antigénica para el papilomavirus humano (HPV) 16 E7n-19 SEQ ID NO: 2.
Una realización adicional de la invención proporciona un receptor de células T (TCR) aislado o purificado que comprende la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena alfa de SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena alfa de SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena alfa de SEQ ID NO: 5, la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena beta de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena beta de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena beta de SEQ ID NO: 8, y que tiene especificidad antigénica para el papilomavirus humano (HPV) 16 E7n-19 SEQ ID NO: 2, en el que opcionalmente el TCR:
1. (i) comprende una región constante humana; y/o
2. (ii) comprende las secuencias de aminoácidos de (a) SEQ ID NO: 9 y (b) SEQ ID NO: 10, en la que X en la posición 2 es Ala o Gly.
La invención proporciona adicionalmente polipéptidos y proteínas relacionados, así como ácidos nucleicos relacionados, vectores de expresión recombinante relacionados, células huésped relacionadas y poblaciones de células relacionadas. Adicionalmente se proporcionan por la invención anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos, y composiciones farmacéuticas que se refieren a los TCR (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos) de la invención.
Adicionalmente se proporciona por la invención un método in vitro de detección de la presencia de un estado en un mamífero, en el que el estado es cáncer, infección por HPV 16 o tumor maligno previo positivo a HPV. El método de la invención de detección de la presencia de un estado en un mamífero comprende (i) poner en contacto una muestra que comprende células del estado con cualquiera de los TCR de la invención (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos), polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células huésped, poblaciones de células huésped, anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos, o composiciones farmacéuticas descritas en el presente documento, formando de este modo un complejo, y (ii) detectar el complejo, en el que la detección del complejo es indicativa de la presencia del estado en el mamífero, en el que el estado es cáncer, infección por HPV 16 o tumor maligno previo positivo a HPV.
La invención proporciona adicionalmente cualquiera de los TCR (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos), polipéptidos o proteínas definidos por el contenido de las reivindicaciones, cualquier ácido nucleico o vector de expresión recombinante que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para cualquiera de los TCR (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos), polipéptidos, proteínas definidos por el contenido de las reivindicaciones, o cualquier célula huésped o población de células huésped que comprenden un vector recombinante que codifica para cualquiera de los TCR (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos), polipéptidos o proteínas definidos por el contenido de las reivindicaciones, eficaz para su uso para tratar o prevenir el estado en un mamífero, en el que el estado es cáncer, infección por HPV 16 o tumor maligno previo positivo a HPV.
Breve descripción de las varias vistas de los dibujos
La figura 1 es un gráfico de barras que muestra el interferón (IFN)-y (pg/ml) secretado por linfocitos de sangre periférica (PBL) que se transdujeron con una secuencia de nucleótidos que codifica para un TCR quimérico anti-HPV 16 E7 (barras sombreadas) en el cocultivo con células 293-A2 diana sometidas a impulso con péptido de HPV 16 E629-38, células 293-A sometidas a impulso con péptido de HPV 16 E7n-1g, células 624 transducidas con un plásmido que codifica para HPV 16 E6, células 624 transducidas con un plásmido que codifica para HPV 16 E7, células SCC152, células SCC90, células CaSki, células Alb, células Panc1 o células SiHa. La expresión de HLA-A2 y HPV-16 E7 por cada célula diana se indica en el fondo de la figura 1 (“+” indica positivo para la expresión y “-” indica negativo para la expresión). Se usaron células no transducidas (barras no sombreadas) como control negativo.
Las figuras 2A-2R son gráficos de puntos que muestran el porcentaje de células de un primer donante (A-I) o un segundo donante (J-R) que se transdujeron (B-I y K-R) con uno de los vectores de expresión recombinante expuestos en la tabla 1 que expresaron lo siguiente: HLA-A2/E7n-19 tetrámero+/m TRBC- (cuadrante izquierdo superior), HLA-A2/E7n-19 tetrámero+/m TRBC+ (cuadrante derecho superior), HLA-A2/E7n-19 tetrámeroVm TRBC' (cuadrante izquierdo inferior) y HLA-A2/E7n-19 tetrámeroVm TRBC+ (cuadrante derecho inferior). Los porcentajes numéricos para cada cuadrante se proporcionan encima de cada gráfico de puntos. Se usaron células no transducidas (A y J) como control negativo.
Las figuras 3A y 3B son gráficos que muestran la secreción de IFN-y por células efectoras de donante 1 (A) o donante 2 (B) que se transdujeron con uno de los vectores de expresión recombinante expuestos en la tabla 1 en el cocultivo con células 624, CaSki, SCC90 o SCC152 diana. Para cada línea de células diana, las barras sombreadas (de izquierda a derecha) corresponden a células efectoras transducidas con el siguiente vector: TCR quimérico anti-HPV 16 E7 (a /p), TCR modificado con Cys (a /p), TCR modificado con LVL (a /p), TCR modificado con LVL-Cys (a /p), TCR quimérico anti-HPV 16 E7 (p/a ), TCR modificado con Cys (p/a ), TCR modificado con LVL (p/a ) o TCR modificado con LVL-Cys (p/a ). Se usaron células no transducidas (barras no sombreadas) como control negativo.
La figura 4 es un gráfico que muestra IFN-y (pg/ml) secretado por PBL que se transdujeron con un vector retroviral que codifica para el TCR modificado con LVL (p/a ) (SEQ ID NO: 37) (barras sombreadas) en el cocultivo con células 293-A2 diana sometidas a impulso con péptido de HPV 16 E629-38, células 293-A2 sometidas a impulso con péptido de HPV 16 E711-19, células 624 transducidas con un plásmido que codifica para HPV 16 E6, células 624 transducidas con un plásmido que codifica para HPV 16 E7, células SCC152, células SCC90, células CaSki, células Ane, células Alb, células Panc1 o células SiHa. La expresión de HLA-A2 y HPV-16 E7 por cada célula diana se indica en el fondo de la figura 4 (“+” indica positivo para la expresión y “-” indica negativo para la expresión). Se usaron células no transducidas (barras no sombreadas) como control negativo.
La figura 5 es un gráfico que muestra IFN-y (pg/ml) secretado por PBL que se transdujeron con un vector retroviral que codifica para el TCR modificado con LVL-Cys (p/a ) (SEQ ID NO: 38) en el cocultivo con células 624 diana, células SCC90 o células CaSki sin anticuerpos (barras negras) o en presencia de anticuerpos anti-MHC de clase I (barras grises) o anti-MHC de clase II (barras no sombreadas). Como controles, se transdujeron PBL con TCR de DMF5 y se cocultivaron con células 624 o se transdujeron con TCR anti-MAGE A3 y se cocultivaron con células 526-CIITA sin anticuerpos o en presencia de anticuerpos anti-MHC de clase I o anti-MHC de clase II.
Las figuras 6A-6D son gráficos que muestran la lisis específica (%) de las células diana CaSki (A), SCC90 (B), SCC152 (C) o células 624 (D) cocultivadas con células efectoras transducidas con un vector retroviral que codifica para el TCR modificado con LVL-Cys (p/a ) (SEQ ID NO: 38) (cuadrados) a diversas razones de efector:diana. Se usaron células no transducidas (círculos) como control negativo.
Las figuras 7A y 7B son gráficos que muestran IFN-y (pg/ml) secretado por PBL que se transdujeron con un vector retroviral que codifica para el TCR modificado con LVL-Cys (p/a ) (SEQ ID NO: 38) (barras sombreadas) o el TCR DCA2E6 anti-HPV 16 E6 (barras no sombreadas) en el cocultivo con células diana sometidas a impulso con diversas concentraciones de péptido de HPV 16 E711-19 (A) o péptido de HPV 16 E629-38 (B).
La figura 8A es un gráfico que muestra IFN-y (pg/ml) secretado por PBL que se transdujeron con un vector retroviral que codifica para el TCR modificado con LVL-Cys (p/a) (SEQ ID NO: 38) (barras negras) o el TCR DCA2E6 (barras grises) en el cocultivo con células 624, células CaSki, células SCC90 o células SCC152 diana. Se usaron células no transducidas (barras no sombreadas) como control negativo.
La figura 8B es un gráfico que muestra IFN-y (pg/ml) secretado por PBL que se transdujeron con un vector retroviral que codifica para el TCR modificado con Cys (p/a) (barras negras) o el TCR DCA2E6 (barras grises) en el cocultivo con células 293-A2 diana sometidas a impulso con péptido de HPV 16 E629-38, células 293-A2 sometidas a impulso con péptido de HPV 16 E711-19, células SCC152, células SCC90, células CaSki, células Ane, células Alb, células Panc1 o células SiHa. Se usaron células no transducidas (barras no sombreadas) como control negativo.
Descripción detallada de la invención
Una realización de la invención proporciona un receptor de células T (TCR) aislado o purificado que tiene especificidad antigénica para el papilomavirus humano (HPV) 16 E711-19.
HPV 16 es el subtipo de HPV que está más comúnmente asociado con tumor maligno. Sin que se una a ninguna teoría o mecanismo particular, se cree que el HPV 16 provoca cáncer al menos parcialmente a través de las acciones de la oncoproteína E7, que mantiene a las células cancerosas activas en el ciclo de división celular a través de la inactivación de Rb. El HPV 16 E7 se expresa de manera constitutiva en células cancerosas y no se expresa por tejidos humanos normales no infectados. El HPV 16 E7 se expresa en una variedad de cánceres humanos incluyendo, pero sin limitarse a, cáncer del cuello uterino, orofaringe, ano, conducto anal, anorrecto, vagina, vulva y pene.
El TCR de la invención (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales del mismo) tiene especificidad antigénica para un péptido de HPV 16 E711-19 que comprende, que consiste en, o que consiste esencialmente en, YMLDLQPET (SEQ ID NO: 2).
En una realización de la invención, los TCR de la invención (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos) son capaces de reconocer HPV 16 E711-19 de una manera dependiente del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I. “De manera dependiente de MHC de clase I”, tal como se usa en el presente documento, significa que el TCR (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales del mismo) produce una respuesta inmunitaria tras la unión a HPV 16 E711-19 dentro del contexto de la molécula de MHC de clase I. la molécula de MHC de clase I puede ser cualquier molécula de MHC de clase I conocida en la técnica, por ejemplo, moléculas de HLA-A. En una realización preferida de la invención, la molécula de MHC de clase I es una molécula de HLA-A2.
Los TCR (incluyendo las porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos) de la invención proporcionan muchas ventajas, incluyendo cuando se expresan por células usadas para la transferencia celular adoptiva. Sin que se una por ninguna teoría o mecanismo particular, se cree que debido a que HPV 16 E7 se expresa por células infectadas por HPV 16 de múltiples tipos de cáncer, los TCR de la invención (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos) proporcionan de manera ventajosa la capacidad de destruir células de múltiples tipos de cánceres asociados a HPV 16, y por consiguiente, para tratar o prevenir múltiples tipos de cánceres asociados a HPV 16. De manera adicional, sin que se una a ninguna teoría o mecanismo particular, se cree que debido a que la proteína de HPV 16 E7 se expresa sólo en células cancerosas, los TCR de la invención (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos) seleccionan como diana de manera ventajosa la destrucción de células cancerosas a la vez que reducen al mínimo o eliminan la destrucción de células normales no cancerosas, reduciendo de este modo, por ejemplo, al reducir al mínimo o eliminar, la toxicidad. Además, los TCR de la invención (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos) pueden, de manera ventajosa, tratar o prevenir con éxito cánceres positivos a HPV que no responden a otros tipos de tratamiento, tal como, por ejemplo, quimioterapia sola, cirugía o irradiación. De manera adicional, los TCR de la invención (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos) proporcionan reconocimiento de alta avidez de HPV 16 E711-19, que puede proporcionar de manera ventajosa la capacidad de reconocer células tumorales no manipuladas (por ejemplo, células tumorales que no se han tratado con interferón (IFN)-y, transfectadas con un vector que codifica para uno o ambos de HPV 16 E7 y HLA-A2, sometidas a impulso con el péptido E711-19, o una combinación de los mismos).
La frase “especificidad antigénica”, tal como se usa en el presente documento, significa que el TCR (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales del mismo) puede unirse específicamente a y reconocer de manera inmunológica HPV 16 E711-19 con alta avidez. Por ejemplo, un TCR (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales del mismo) puede considerarse que tiene “especificidad antigénica” para HPV 16 E711-19 si las células T que expresan el TCR (o porción funcional o variante funcional del mismo) secretan al menos aproximadamente 200 pg/ml o más (por ejemplo, 200 pg/ml o más, 300 pg/ml o más, 400 pg/ml o más, 500 pg/ml o más, 600 pg/ml o más, 700 pg/ml o más, 1000 pg/ml o más, 5.000 pg/ml o más, 7.000 pg/ml o más, 10.000 pg/ml o más, o 20.000 pg/ml o más) de IFN-y en cocultivo con células diana HLA-A2+ negativas para el antígeno sometidas a impulso con una baja concentración de péptido de HPV 16 E7ii-ig (por ejemplo, de aproximadamente 0,05 ng/ml a aproximadamente 5 ng/ml, 0,05 ng/ml, 0,1 ng/ml, 0,5 ng/ml, 1 ng/ml o 5 ng/ml). De manera alternativa o adicional, un TCR (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales del mismo) puede considerarse que tiene “especificidad antigénica” para HPV 16 E7n-1g si las células T que expresan el TCR (o porción funcional o variante funcional del mismo) secretan al menos dos veces tanto IFN-y como el nivel de fondo de linfocitos de sangre periférica (PBL) no transducidos de IFN-y en cocultivo con células diana HLA-A2+ negativas para el antígeno sometidas a impulso con una baja concentración de péptido de HPV 16 E7n-m Las células que expresan los TCR de la invención (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos) también pueden secretar IFN-y en cocultivo con células diana HLA-A2+ negativas para el antígeno sometidas a impulso con altas concentraciones de péptido de HPV 16 E7n-19.
La invención proporciona un TCR que comprende dos polipéptidos (es decir, cadenas de polipéptido), tal como una cadena alfa (a) de un TCR, una cadena beta (P) de un TCR, una cadena gamma (y) de un TCR, una cadena delta (8) de un TCR, o una combinación de las mismas.
El TCR de la invención comprende dos cadenas de polipéptido, cada una de las cuales comprende una región variable humana que comprende una región determinante de complementariedad (CDR) 1, una CDR2 y una CDR3 de un TCR. El TCR comprende una primera cadena de polipéptido que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (CDR1 de cadena a), una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 4 (CDR2 de cadena a) y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 5 (CDR3 de cadena a), y una segunda cadena de polipéptido que comprende una CDR1 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 (CDR1 de cadena P), una CDR2 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 7 (CDR2 de cadena P) y una CDR3 que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 8 (CDR3 de cadena P). El TCR comprende las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 3-8.
El TCR de la invención comprende una secuencia de aminoácidos de una región variable de un TCR que comprende las CDR expuestas anteriormente. A este respecto, el TCR puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 (la región variable de una cadena a humana); SEQ ID NO: 10, en la que X en la posición 2 de SEQ ID NO: 10 es Ala o Gly (la región variable de una cadena P); ambas SEQ ID NO: 9 y 10, en la que X en la posición 2 de SEQ ID NO: 10 es Ala o Gly; SEQ ID NO: 11 (la región variable de una cadena p humana); o ambas SeQ ID NO: 9 y 11. SEQ ID NO: 10 corresponde a SEQ ID NO: 11 cuando X en la posición 2 de SEQ ID No : 10 es Gly. Preferiblemente, el TCR de la invención comprende las secuencias de aminoácidos de ambas SEQ ID NO: 9 y 10, en la que X en la posición 2 de SEQ ID NO: 10 es Ala.
Los TCR de la invención pueden comprender adicionalmente una región constante derivada de cualquier especie adecuada tal como, por ejemplo, ser humano o ratón. En una realización de la invención, los TCR comprenden además una región constante humana. A este respecto, el TCR puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 (la región constante de una cadena a humana), SEQ ID NO: 15 (la región constante de una cadena P humana), o ambas SEQ ID NO: 14 y 15.
En una realización de la invención, el TCR de la invención puede comprender una combinación de una región variable y una región constante. A este respecto, el TCR puede comprender una cadena alfa que comprende las secuencias de aminoácidos de ambas de SEQ ID NO: 9 (la región variable de una cadena a humana) y SEQ ID NO: 14 (la región constante de una cadena a humana); una cadena beta que comprende las secuencias de aminoácidos de ambas de SEQ ID NO: 11 (la región variable de una cadena P humana) y SEQ ID NO: 15 (la región constante de una cadena P humana); una cadena beta que comprende las secuencias de aminoácidos tanto de ambas de SEQ ID NO: 10, en la que X en la posición 2 de SEQ ID NO: 2 es Ala o Gly (la región variable de una cadena P) y SEQ ID NO: 15 (la región constante de una cadena P humana); las secuencias de aminoácidos de todas de SEQ ID NO: 9, 11, 14 y 15; o las secuencias de aminoácidos de todas de SEQ ID NO: 9, 10, 14 y 15.
En una realización de la invención, el TCR de la invención puede comprender una cadena a de un TCR y una cadena P de un TCR. A este respecto, la cadena a del TCR de la invención puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 12. A este respecto, la cadena P del TCR de la invención puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 13. El TCR de la invención, por lo tanto, puede comprender la secuencia de aminoácidos de ambas de SEQ ID NO: 12 y 13.
Otra realización de la invención proporciona un TCR quimérico que comprende una región variable humana y una región constante murina, o una variante funcional del TCR, en el que el TCR y la variante funcional comprenden la secuencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad (CDR) 1 de cadena alfa de SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena alfa de SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena alfa de SEQ ID NO: 5, la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena beta de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena beta de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena beta de SEQ ID NO: 8, y tienen especificidad antigénica para el papilomavirus humano (HPV) 16 E7ii-i9 SEQ ID NO: 2.
Tal como se usa en el presente documento, el término “murino” o “humano”, cuando se refiere a un TCR o cualquier componente de un TCR descrito en el presente documento (por ejemplo, región determinante de complementariedad (CDR), región variable, región constante, cadena alfa y/o cadena beta), significa un TCR (o componente del mismo) que se deriva de un ratón o un ser humano, respectivamente, es decir, un TCR (o componente del mismo) que se origina de o se expresó, en un momento, por una célula T de ratón o una célula T humana, respectivamente.
En una realización de la invención, los TCR quiméricos de la invención comprenden una región constante murina. A este respecto, el TCR puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 17 (la región constante de una cadena a murina), SEQ ID NO: 19 (la región constante de una cadena p murina), o ambas SEQ ID NO: 17 y 19. En una realización preferida, los TCR de la invención son TCR quiméricos que comprenden tanto una región variable humana como una región constante murina.
En una realización de la divulgación, el TCR quimérico de la invención puede comprender una combinación de una región variable y una región constante. A este respecto, el TCR puede comprender una cadena alfa que comprende las secuencias de aminoácidos de ambas de SEQ ID NO: 9 (la región variable de una cadena a humana) y SEQ ID NO: 17 (la región constante de una cadena a murina); una cadena beta que comprende las secuencias de aminoácidos de ambas de SEQ ID NO: 11 (la región variable de una cadena p humana) y SEQ ID NO: 19 (la región constante de una cadena p murina); una cadena beta que comprende las secuencias de aminoácidos de ambas de SEQ ID NO: 10, en la que X en la posición 2 de SEQ ID NO: 10 es Ala o Gly (la región variable de una cadena p) y SEQ ID NO: 19 (la región constante de una cadena p murina); las secuencias de aminoácidos de todas de SEQ ID NO: 9, 11, 17 y 19; o las secuencias de aminoácidos de todas de SEQ ID NO: 9, 10, 17 y 19. En una realización, el TCR quimérico de la invención comprende una cadena beta de longitud completa que comprende SEQ ID NO: 20. A este respecto, el TCR puede comprender todas de SEQ ID NO: 9, 17 y 20.
Se incluyen en el alcance de la invención las variantes funcionales de los TCR de la invención descritos en el presente documento. El término “variante funcional”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a un TCR, polipéptido o proteína que tiene similitud o identidad de secuencia sustancial o significativa a un TCR, polipéptido o proteína original, con las variantes funcionales que mantienen la actividad biológica del TCR, polipéptido o proteína del cual es una variante. Las variantes funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas variantes del TCR, polipéptido o proteína descritas en el presente documento (el TCR, polipéptido o proteína original) que mantienen la capacidad de unirse específicamente a HPV 16 E7n-1g SEQ ID NO: 2 para el cual el TCR original tiene especificidad antigénica o al cual se une específicamente el polipéptido o proteína original, a un grado similar, al mismo grado o a un mayor grado que el TCR, polipéptido o proteína original. Con referencia al TCR, polipéptido o proteína original, la variante funcional puede ser, por ejemplo, al menos aproximadamente el 30%, el 50%, el 75%, el 80%, el 90%, el 95%, el 96%, el 97%, el 98%, el 99% o más idéntica en la secuencia de aminoácidos al TCR, polipéptido o proteína original. La variante funcional puede comprender, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos del TCR, polipéptido o proteína original con al menos una sustitución conservadora de aminoácido. Las sustituciones conservadoras de aminoácido se conocen en la técnica, e incluyen sustituciones de aminoácido en las cuales un aminoácido que tiene determinadas propiedades físicas y/o químicas se intercambia por otro aminoácido que tiene las mismas propiedades químicas o físicas. Por ejemplo, la sustitución conservadora de aminoácido puede ser un aminoácido ácido sustituido por otro aminoácido ácido (por ejemplo, Asp o Glu), un aminoácido con una cadena lateral apolar sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral apolar (por ejemplo, Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val, etc.), un aminoácido básico sustituido por otro aminoácido básico (Lys, Arg, etc.), un aminoácido con una cadena lateral polar sustituido por otro aminoácido con una cadena lateral polar (Asn, Cys, Gln, Ser, Thr, Tyr, etc.), etc.
De manera alternativa o adicional, las variantes funcionales pueden comprender la secuencia de aminoácidos del TCR, polipéptido o proteína original, con al menos una sustitución no conservadora de aminoácido. En este caso, se prefiere que la sustitución no conservadora de aminoácido no interfiera con ni inhiba la actividad biológica de la variante funcional. Preferiblemente, la sustitución no conservadora de aminoácido mejora la actividad biológica de la variante funcional, tal que la actividad biológica de la variante funcional se incrementa en comparación al TCR, polipéptido o proteína original.
En una realización de la invención, la variante funcional comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de los TCR descritos en el presente documento con una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácido en la región constante de la cadena alfa o beta. Preferiblemente, la variante funcional comprende la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las regiones constantes murinas descritas en el presente documento con una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácido en la región constante murina. En algunas realizaciones, los TCR (o porciones funcionales de los mismos) que comprenden la(s) secuencia(s) de aminoácidos sustituida(s) proporcionan de manera ventajosa uno o más de reconocimiento aumentado de dianas positivas a HPV 16 E7, expresión aumentada por una célula huésped y actividad antitumoral aumentada en comparación con el TCR original que comprende una secuencia de aminoácidos no sustituida. En general, las secuencias de aminoácidos sustituidas de las regiones constantes murinas de las cadenas a y p del TCR, SEQ ID NO: 16 y 18, respectivamente, corresponden con todas o con porciones de las secuencias de aminoácidos no sustituidas de región constante murina s Eq ID NO: 17 y 19, respectivamente, con SEQ ID NO: 16 que tiene una, dos, tres o cuatro sustituciones de aminoácido en comparación con SEQ ID NO: 17 y SEQ ID NO: 18 que tiene una sustitución de aminoácido en comparación con SEQ ID NO: 19. A este respecto, una realización de la invención proporciona una variante funcional de un TCR que comprende las secuencias de aminoácidos de (a) SEQ ID NO: 16 (región constante de cadena alfa), en la que (i) X en la posición 48 es Thr o Cys; (ii) X en la posición 112 es Ser, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp;; (iii) X en la posición 114 es Met, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; y (iv) X en la posición 115 es Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met, o Trp; y (b) SEQ ID NO: 18 (región constante de cadena beta), en la que X en la posición 56 es Ser o Cys. En una realización de la invención, la variante funcional del TCR que comprende SEQ ID NO: 16 no comprende SEQ ID NO: 17 (región constante murina no sustituida de cadena alfa). En una realización de la invención, la variante funcional del TCR que comprende SEQ ID NO: 18 no comprende SEQ ID NO: 19 (región constante murina no sustituida de cadena beta).
En una realización de la invención, la secuencia de aminoácidos sustituida incluye sustituciones de cisteína en la región constante de una o ambas de las cadenas a y p para proporcionar un TCR sustituido con cisteína. Las cisteínas opuestas en las cadenas a y p proporcionan un enlace de disulfuro que enlaza las regiones constantes de las cadenas a y p del TCR sustituido entre sí y que no está presente en un TCR que comprende la región constante humana no sustituida o la región constante murina no sustituida. A este respecto, la variante funcional del TCR es un TCR quimérico sustituido con cisteína en el que una o ambas de la Thr48 nativa de SEQ ID NO: 17 y la Ser56 nativa de SEQ ID NO: 19 pueden sustituirse con Cys. Preferiblemente, tanto la Thr48 nativa de SEQ ID NO 17: como la Ser56 nativa de SEQ ID NO: 19 se sustituyen con Cys. En una realización, el TCR quimérico sustituido con cisteína comprende una región constante de cadena alfa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, en la que X en la posición 48 es Cys, X en la posición 112 es la Ser nativa, X en la posición 114 es la Met nativa y X en la posición 115 es la Gly nativa, y una región constante de cadena beta que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, en la que X en la posición 56 es Cys. Preferiblemente, el TCR quimérico sustituido con cisteína comprende una región constante de cadena alfa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 24 y una región constante de cadena beta que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23. Los TCR quiméricos sustituidos con cisteína de la invención pueden incluir la región constante sustituida además de cualquiera de las CDR y/o regiones variables descritas en el presente documento. A este respecto, el TCR quimérico sustituido con cisteína comprende las secuencias de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 3-8 y 23-24; (ii) SEQ ID NO: 9­ 10 y 23-24; (iii) SEQ ID NO: 9, 11 y 23-24; (iv) SEQ ID NO: 3-8, 16 y 18; (v) SEQ ID NO: 9-10, 16 y 18; o (vi) SEQ ID NO: 9, 11, 16 y 18. En una realización, el TCR quimérico sustituido con Cys comprende una cadena beta de longitud completa que comprende SEQ ID NO: 27. A este respecto, el TCR quimérico sustituido con Cys puede comprender SEQ ID NO: 9 y 24; SEQ ID NO: 27; o todas de SEQ ID NO: 9, 24 y 27.
En una realización de la invención, la secuencia de aminoácidos sustituida incluye sustituciones de uno, dos o tres aminoácidos en el dominio transmembrana (TM) de la región constante de una o ambas de las cadenas a y p con un aminoácido hidrófobo para proporcionar un TCR sustituido con aminoácido hidrófobo (también denominado en el presente documento “TCR modificado con LVL”). La(s) sustitución/sustituciones de aminoácidos hidrófobos en el dominio TM del TCR puede(n) aumentar la hidrofobicidad del dominio TM del TCR en comparación con un TCR que carece de la(s) sustitución/sustituciones de aminoácidos hidrófobos en el dominio TM. A este respecto, la variante funcional del TCR es un TCR quimérico modificado con LVL en el que una, dos o tres de la Ser112, Met114 y Gly115 nativas de SEQ ID NO: 17 pueden sustituirse independientemente con Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; preferiblemente con Leu, Ile o Val. Preferiblemente, las tres de la Ser112, Met114 y Gly115 nativas de SEQ ID NO: 17 pueden sustituirse independientemente con Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; preferiblemente con Leu, Ile o Val. En una realización, el TCR quimérico modificado con LVL comprende una región constante de cadena alfa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, en la que X en la posición 48 es la Thr nativa, X en la posición 112 es Ser, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp, X en la posición 114 es Met, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp, y X en la posición 115 es Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp, y una región constante de cadena beta que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19, en la que el TCR quimérico modificado con lVl que comprende SEQ ID NO: 16 no comprende SEQ ID NO: 17 (región constante murina no sustituida de cadena alfa). Preferiblemente, el TCR quimérico modificado con LVL comprende una región constante de cadena alfa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 21 y una región constante de cadena beta que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 19. Los TCR quiméricos modificados con LVL de la invención pueden incluir la región constante sustituida además de cualquiera de las CDR y/o regiones variables descritas en el presente documento. A este respecto, el TCR quimérico modificado con LVL comprende las secuencias de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 3-8 y 19 y 21; (ii) SEQ ID NO: 9-10 y 19 y 21; (iii) SEQ ID NO: 9, 11 y 19 y 21; (iv) SEQ ID NO: 3-8, 16 y 18; (v) SEQ ID NO: 9-10, 16 y 18; o (vi) SEQ ID NO: 9, 11, 16 y 18. En una realización, el TCR quimérico modificado con LVL comprende una cadena alfa de longitud completa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 22 y una cadena beta de longitud completa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 20. A este respecto, el TCR quimérico modificado con LVL puede comprender SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 29, o ambas SEQ ID NO: 20 y 22.
En una realización de la invención, la secuencia de aminoácidos sustituida incluye las sustituciones de cisteína en la región constante de una o ambas de las cadenas a y p en combinación con la(s) sustitución/sustituciones de uno, dos o tres aminoácidos en el dominio transmembrana (TM) de la región constante de una o ambas de las cadenas a y p con un aminoácido hidrófobo (también denominado en el presente documento “TCR modificado con LVL sustituido con cisteína”). A este respecto, la variante funcional del TCR es un TCR quimérico, modificado con LVL, sustituido con cisteína en el que la Thr48 nativa de SEQ ID NO: 17 se sustituye con Cys; una, dos o tres de las Ser112, Met114 y Gly115 nativas de SEQ ID NO: 17 se sustituyen independientemente con Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; preferiblemente con Leu, Ile o Val; y la Ser56 nativa de SEQ ID NO: 19 se sustituye con Cys. Preferiblemente, las tres de la Ser112, Met114 y Gly115 nativas de SEQ ID NO: 17 pueden sustituirse independientemente con Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; preferiblemente con Leu, Ile o Val. En una realización, el TCR quimérico, modificado con LVL, sustituido con cisteína comprende una región constante de cadena alfa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 16, en la que X en la posición 48 es Cys, X en la posición 112 es Ser, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp, X en la posición 114 es Met, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp, y X en la posición 115 es Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp, y una región constante de cadena beta que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 18, en la que X en la posición 56 es Cys, en la que el TCR quimérico, modificado con LVL, sustituido con cisteína que comprende SEQ ID NO: 16 no comprende SEQ ID NO: 17 (región constante murina no sustituida de cadena alfa). Preferiblemente, el TCR quimérico, modificado con LVL, sustituido con cisteína comprende una región constante de cadena alfa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 25 y una región constante de cadena beta que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 23. Los TCR quiméricos, modificados con LVL, sustituidos con cisteína de la invención pueden comprender la región constante sustituida además de cualquiera de las CDR y/o regiones variables descritas en el presente documento. A este respecto, el TCR quimérico, modificado con LVL, sustituido con cisteína comprende las secuencias de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 3-8 y 23 y 25; (ii) SEQ ID NO: 9-10 y 23 y 25; (iii) SEQ ID NO: 9, 11 y 23 y 25; (iv) SEQ ID NO: 3-8, 16 y 18; (v) SEQ ID NO: 9, 10, 16 y 18; o SEQ ID NO: 9, 11, 16 y 18. En una realización especialmente preferida, el t Cr quimérico, modificado con LVL, sustituido con cisteína comprende una cadena alfa de longitud completa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 26 y una cadena beta de longitud completa que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 27. A este respecto, el TCR quimérico, modificado con LVL, sustituido con Cys puede comprender SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 30, o ambas SEQ ID NO: 26 como 27.
El TCR (o variante funcional del mismo), polipéptido o proteína puede consistir esencialmente en la secuencia o secuencias de aminoácidos especificadas descritas en el presente documento, tal que otros componentes del TCR (o variante funcional del mismo), polipéptido o proteína, por ejemplo, otros aminoácidos, no cambien de manera material la actividad biológica del Tc R (o variante funcional del mismo), polipéptido o proteína. A este respecto, el TCR (o variante funcional del mismo), polipéptido o proteína dado a conocer puede consistir, por ejemplo, esencialmente en la secuencia de aminoácidos de una cualquiera de SEQ ID NO: 12, 13, 20, 22, 26, 27, 29 y 30. Además, por ejemplo, los TCR (incluyendo variantes funcionales de los mismos), polipéptidos o proteínas dados a conocer pueden consistir esencialmente en la(s) secuencia(s) de aminoácidos de SEQ iD NO: 9, 10, 11 , 14-19, 21 , 23-25, ambas SEQ ID NO: 9 y 10, ambas SEQ ID NO: 9 y 11, ambas SEQ ID NO: 14 y 15, ambas SEQ ID NO: 16 y 18, ambas SEQ ID NO: 17 y 19, ambas SEQ ID NO: 23 y 24, ambas SEQ ID NO: 19 y 21, o ambas SEQ ID NO: 23 y 25. Además, los TCR (incluyendo variantes funcionales de los mismos) polipéptidos o proteínas dados a conocer pueden consistir esencialmente en la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3 (CDR1 de cadena a ), SEQ ID NO: 4 (CDR2 de cadena a ), SEQ ID NO: 5 (CDR3 de cadena a ), SEQ ID NO: 6 (CDR1 de cadena p), SEQ ID NO: 7 (CDR2 de cadena p), SEQ ID NO: 8 (CDR3 de cadena p), o cualquier combinación de las mismas, por ejemplo, SEQ ID NO: 3-5; 6-8; ó 3-8.
También se proporciona por la presente invención un polipéptido que comprende una porción funcional de cualquiera de los TCR (o variantes funcionales de los mismos) de la invención descritos en el presente documento. El término “polipéptido” tal como se usa en el presente documento incluye oligopéptidos y se refiere a una cadena individual de aminoácidos conectados por uno o más enlaces peptídícos.
Con respecto a los polipéptidos de la invención, la porción funcional puede ser cualquier porción que comprenda aminoácidos contiguos del TCR (o variante funcional del mismo) del cual es una parte, con la condición de que la porción funcional se una específicamente a HPV 16 E711-19 y comprenda la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena alfa de SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena alfa de SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena alfa de SEQ ID NO: 5, la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena beta de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena beta de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena beta de SEQ ID NO: 8. El término “porción funcional” cuando se usa con referencia a un TCR (o variante funcional del mismo) se refiere a cualquier parte o fragmento del TCR (o variante funcional del mismo) de la invención, parte o fragmento que mantiene la actividad biológica del TCR (o variante funcional del mismo) del cual es una parte (el TCR original o variante funcional original del mismo). Las porciones funcionales abarcan, por ejemplo, aquellas partes de un TCR (o variante funcional del mismo) que mantienen la capacidad para unirse específicamente a HPV 16 E711-19 (por ejemplo, de una manera dependiente de HLA-A2), o para detectar, tratar o prevenir cáncer, a un grado similar, el mismo grado o un mayor grado, como el TCR original (o variante funcional del mismo) y comprende la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena alfa de SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena alfa de SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena alfa de SEQ ID NO: 5, la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena beta de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena beta de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena beta de SEQ ID NO: 8. Con referencia al TCR original (o variante funcional del mismo), la porción funcional puede comprender, por ejemplo, aproximadamente el 10%, el 25%, el 30%, el 50%, el 68%, el 80%, el 90%, el 95% o más del TCR original (o variante funcional del mismo).
La porción funcional puede comprender aminoácidos adicionales en el extremo amino o carboxilo terminal de la porción, o en ambos extremos terminales, aminoácidos adicionales que no se encuentran en la secuencia de aminoácidos del TCR original o variante funcional del mismo. De manera deseable, los aminoácidos adicionales no interfieren con la función biológica de la porción funcional, por ejemplo, que se unan específicamente a HPV 16 E7n-19; y/o que tengan la capacidad de detectar cáncer, tratar o impedir cáncer, etc. De manera más deseable, los aminoácidos adicionales mejoran la actividad biológica, en comparación con la actividad biológica del TCR original o variante funcional del mismo.
El polipéptido comprende las secuencias de aminoácidos de todas de SEQ ID NO: 3-8.
En una realización de la invención, el polipéptido de la invención puede comprender, por ejemplo, la región variable del TCR de la invención o variante funcional del mismo que comprende una combinación de las regiones CDR expuestas anteriormente. A este respecto, el polipéptido puede comprender la secuencia de aminoácidos ambas SEQ ID NO: 9 y 10, o ambas SEQ ID NO: 9 y 11. Preferiblemente, el polipéptido comprende las secuencias de aminoácidos de ambas de SEQ ID NO: 9 y 10, en la que X en la posición 2 de s Eq ID NO: 10 es Ala.
El polipéptido de la invención puede comprender además una región constante derivada de cualquier especie adecuada tal como, por ejemplo, ser humano o ratón, descrita en el presente documento o cualquiera de las regiones constantes sustituidas descritas en el presente documento. A este respecto, el polipéptido puede comprender la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 14 (la región constante de una cadena a humana), SEQ ID NO: 15 (la región constante de una cadena p humana), SEQ ID NO: 16 (región constante de cadena a , sustituida tal como se describe en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención), SEQ ID NO 17 (la región constante de una cadena a murina), SEQ ID NO: 18 (región constante de cadena p, sustituida tal como se describe en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención), SEQ ID NO: 19 (la región constante de una cadena p murina), SEQ ID NO: 21 (región constante de una cadena a modificada con LVL), SEQ ID NO: 23 (región constante de una cadena p sustituida con Cys), SEQ ID NO: 24 (región constante de una cadena a sustituida con Cys), SEQ ID NO: 25 (región constante de una cadena a modificada con LVL, sustituida con Cys), ambas SEQ ID NO: 14 y 15, ambas SEQ ID NO: 16 y 18, ambas SEQ ID NO: 17 y 19, ambas SEQ ID NO: 19 y 21, ambas SEQ ID NO: 23 y 24, o ambas SEQ ID NO: 23 y 25. Preferiblemente, el polipéptido comprende ambas SEQ ID NO: 14 y 15, ambas SEQ ID NO: 16 y 18, ambas SEQ ID NO: 17 y 19, ambas SEQ ID NO: 19 y 21, ambas SEQ ID NO: 23 y 24, o ambas SEQ ID NO: 23 y 25. En una realización, el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de una o ambas de SEQ ID NO: 9 y 11 se aísla o purifica.
En una realización de la invención, el polipéptido de la invención puede comprender una combinación de una región variable y una región constante. A este respecto, el polipéptido puede comprender todas de SEQ ID NO: 3-8 y 14­ 15, todas de SEQ ID NO: 3-8 y 16 y 18, todas de SEQ ID NO: 3-8 y 17 y 19, todas de SEQ ID NO: 3-8 y 19 y 21, todas de SEQ ID NO: 3-8 y 23 y 24, todas de SEQ ID NO: 3-8 y 23 y 25, todas de SEQ ID NO: 9-10 y 14-15, todas de SEQ ID NO: 9-10 y 16 y 18, todas de SEQ ID NO: 9-10 y 17 y 19, todas de SEQ ID NO: 9-10 y 19 y 21, todas de SEQ ID NO: 9-10 y 23 y 24, todas de SEQ ID NO: 9-10 y 23 y 25, todas de SEQ ID NO: 9, 11 y 14-15, todas de SEQ ID NO: 9, 11 y 16 y 18, todas de SEQ ID NO: 9, 11 y 17 y 19, todas de SEQ ID NO: 9, 11 y 19 y 21, todas de SEQ ID NO: 9, 11 y 23 y 24, o todas de SEQ ID NO: 9, 11 y 23 y 25. Las SEQ ID NO: 16 y 18 pueden sustituirse tal como se describe en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. En una realización, el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de una o ambas de (i) SEQ ID NO: 9 y 14 y (ii) SEQ ID NO: 11 y 15 se aísla o purifica.
En una realización de la divulgación, el polipéptido dado a conocer puede comprender la longitud completa de una cadena a o p de uno de los TCR o variante funcional de los mismos descritos en el presente documento. A este respecto, el polipéptido dado a conocer puede comprender una secuencia de aminoácidos de (i) una cualquiera de SEQ ID NO: 12, 13, 20, 22, 26, 27, 29, 30; (ii) SEQ ID NO: 9, 24 y 27; (iii) SEQ ID NO: 9, 17 y 20; o (iv) SEQ ID NO: 9, 10, 16 y 18. Las SEQ ID NO: 16 y 18 pueden sustituirse tal como se describe en el presente documento con respecto a otros aspectos de la divulgación.
De manera alternativa, el polipéptido de la invención puede comprender cadenas a y p de los TCR o variantes funcionales de los mismos descritos en el presente documento. Por ejemplo, el polipéptido de la invención puede comprender las secuencias de aminoácidos de ambas SEQ ID NO: 12 y 13; ambas SEQ ID NO: 20 y 22; ambas SEQ ID NO: 26 y 27; todas de SEQ ID NO: 9, 24 y 27; todas de SEQ ID NO: 9, 17 y 20; o todas de SEQ ID NO: 9, 10, 16 y 18. Preferiblemente, el polipéptido comprende las secuencias de aminoácidos de ambas SEQ ID NO: 12 y 13; ambas SEQ ID NO: 20 y 22; ambas SEQ ID NO: 26 y 27; todas de SEQ ID NO: 9, 24 y 27; todas de SEQ ID NO: 9, 17 y 20; o todas de SEQ ID NO: 9, 10, 16 y 18. Las SEQ ID NO: 16 y 18 pueden sustituirse tal como se describe en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. En una realización, el polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de una o ambas de SEQ ID NO: 12 y 13 se aísla o purifica.
La invención proporciona además una proteína que comprende al menos uno de los polipéptidos descritos en el presente documento. Por “proteína” quiere decirse una molécula que comprende una o más cadenas de polipéptido. En una realización, la proteína que comprende (a) ambas de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y SEQ ID NO: 10, en la que X en la posición 2 de SeQ ID NO: 10 es Gly o (b) ambas de SEQ ID NO: 12 y 13 se aísla o purifica.
En una realización, la proteína de la invención puede comprender una primera cadena de polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 3-5 y una segunda cadena de polipéptido que comprende las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NO: 6-8. De manera alternativa o adicional, la proteína de la invención puede comprender una primera cadena de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y una segunda cadena de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, en la que (i) X en la posición 2 de SEQ ID nO: 10 es Ala o Gly, y (ii) la proteína que comprende SEQ ID NO: 9 y 10, en la que X en la posición 2 de SEQ ID NO: 10 es Gly, se aísla o purifica. La proteína puede comprender, por ejemplo, una primera cadena de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 12, (ii) SEQ ID NO: 22, (iii) SEQ ID NO: 26, (iv) SEQ ID NO: 9 y 16, (v) SEQ ID NO: 9 y 17, o (vi) SEQ ID NO: 9 y 24, y una segunda cadena de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 10 y 18, o (ii) una cualquiera de SEQ ID NO: 13, 20 y 27, en la que la proteína que comprende SEQ ID NO: 12 y 13 se aísla o purifica, y las SEQ ID NO: 16 y 18 se sustituyen tal como se describe en el presente documento con respecto a otros aspectos de la invención. En este caso, la proteína de la invención puede ser un TCR. De manera alternativa, si, por ejemplo, la proteína comprende una cadena de polipéptido individual que comprende ambas SEQ ID NO: 12 y 13, ambas SEQ ID NO: 20 y 22, SEQ ID NO: 26 y 27, todas de SEQ ID NO: 9, 10, 16 y 18, todas de SEQ ID NO: 9, 17 y 20, todas de SEQ ID NO: 9, 24 y 27, o si la primera y/o segunda cadena(s) de polipéptido de la proteína comprende(n) además otras secuencias de aminoácidos, por ejemplo, una secuencia de aminoácidos que codifica para una inmunoglobulina o una porción de la misma, entonces la proteína de la invención puede ser una proteína de fusión. A este respecto, la invención también proporciona una proteína de fusión que comprende al menos uno de los polipéptidos de la invención descritos en el presente documento junto con al menos otro polipéptido. El otro polipéptido puede existir como un polipéptido separado de la proteína de fusión, o puede existir como un polipéptido que se expresa en marco (en tándem) con uno de los polipéptidos de la invención descritos en el presente documento. El otro polipéptido puede codificar para cualquier molécula peptídica o proteínica, o una porción de la misma, incluyendo, pero sin limitarse a, una inmunoglobulina, CD3, CD4, CD8, una molécula de MHC, una molécula de CD1, por ejemplo, CD1a, CD1b, CD1c, CD1d, etc.
La proteína de fusión puede comprender una o más copias del polipéptido de la invención y/o una o más copias del otro polipéptido. Por ejemplo, la proteína de fusión puede comprender 1, 2, 3, 4, 5 o más copias del polipéptido de la invención y/o del otro polipéptido. Los métodos adecuados para producir proteínas de fusión se conocen en la técnica, e incluyen, por ejemplo, métodos recombinantes. Véase, por ejemplo, Choi et al., Mol. Biotechnol. 31: 193­ 202 (2005).
En algunas realizaciones de la invención, los TCR (y porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos), polipéptidos y proteínas de la invención pueden expresarse como una proteína individual que comprende un péptido ligador que enlaza la cadena a y la cadena p. A este respecto, los TCR (y variantes funcionales y porciones funcionales de los mismos), polipéptidos y proteínas de la invención que comprenden ambas SEQ ID NO: 12 y 13, ambas SEQ ID NO: 20 y 22, SEQ ID NO: 26 y 27, todas de SEQ ID NO: 9, 10, 16 y 18, todas de SEQ ID NO: 9, 17 y 20, todas de SEQ ID NO: 9, 24 y 27 pueden comprender además un péptido ligador. El péptido ligador puede facilitar de manera ventajosa la expresión de un TCR recombinante (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales del mismo), polipéptido y/o proteína en una célula huésped. El péptido ligador puede comprender cualquier secuencia de aminoácidos adecuada. Por ejemplo, el péptido ligador puede comprender SEQ ID NO: 28. En una realización de la invención, la proteína que comprende una cadena alfa, una cadena beta y un ligador puede comprender SEQ ID NO: 29 (TCR quimérico modificado con LVL) o SEQ ID NO: 30 (TCR quimérico, modificado con LVL, sustituido con Cys). En la expresión del constructo que incluye el péptido ligador por una célula huésped, el péptido ligador puede escindirse, dando como resultado cadenas a y p separadas.
La proteína de la invención puede ser un anticuerpo recombinante que comprende al menos uno de los polipéptidos de la invención descritos en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, “anticuerpo recombinante” se refiere a una proteína recombinante (por ejemplo, modificada genéticamente) que comprende al menos uno de los polipéptidos de la invención y una cadena de polipéptido de un anticuerpo, o una porción del mismo. El polipéptido de un anticuerpo, o porción del mismo, puede ser una cadena pesada, una cadena ligera, una región variable o constante de una cadena pesada o ligera, un fragmento variable de cadena individual (scFv), o un fragmento Fc, Fab o F(ab2') de un anticuerpo, etc. La cadena de polipéptido de un anticuerpo, o porción del mismo, puede existir como un polipéptido separado del anticuerpo recombinante. De manera alternativa, la cadena de polipéptido de un anticuerpo, o porción del mismo, puede existir como un polipéptido que se expresa en marco (en tándem) con el polipéptido de la invención. El polipéptido de un anticuerpo, o porción del mismo, puede ser un polipéptido de cualquier anticuerpo o cualquier fragmento de anticuerpo, incluyendo cualquiera de los anticuerpos y fragmentos de anticuerpo descritos en el presente documento.
Los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención (incluyendo variantes funcionales de los mismos) pueden ser de cualquier longitud, es decir, pueden comprender cualquier número de aminoácidos, con la condición de que los TCR, polipéptidos o proteínas (o variantes funcionales de los mismos) mantengan su actividad funcional, por ejemplo, la capacidad de unirse específicamente a HPV 16 E711-19; detectar cáncer, infección por HPV 16, o tumor maligno previo positivo a HPV en un mamífero; o tratar o prevenir cáncer, infección por HPV 16, o tumor maligno previo positivo a HPV en un mamífero, etc. Por ejemplo, el polipéptido puede estar en el intervalo de desde aproximadamente 50 hasta aproximadamente 5000 aminoácidos de longitud, tal como 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1000 o más aminoácidos de longitud. A este respecto, los polipéptidos de la invención también incluyen oligopéptidos.
Los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención (incluyendo variantes funcionales de los mismos) de la invención pueden comprender aminoácidos sintéticos en lugar de uno o más aminoácidos que se presentan de manera natural. Tales aminoácidos sintéticos se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, ácido aminociclohexanocarboxílico, norleucina, ácido a -amino-n-decanoico, homoserina, S-acetilaminometil-cisteína, trans-3 y trans-4-hidroxiprolina, 4-aminofenilalanina, 4-nitrofenilalanina, 4-clorofenilalanina, 4-carboxifenilalanina, p-fenilserina phidroxifenilalanina, fenilglicina, a -naftilalanina, ciclohexilalanina, ciclohexilglicina, ácido indolin-2-carboxílico, ácido 1,2,3,4-tetrahidroisoquinolin-3-carboxílico, ácido aminomalónico, monoamida de ácido aminomalónico, N'-bencil-N'-metil-lisina, N',N'-dibencil-lisina, 6-hidroxilisina, ornitina, ácido a -aminociclopentanocarboxílico, ácido aaminociclohexanocarboxílico, ácido a -aminocicloheptanocarboxílico, ácido a -(2-amino-2-norbornano)-carboxílico, ácido a,y-diaminobutírico, ácido a ,p-diaminopropiónico, homofenilalanina y a -terc-butilglicina.
Los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención (incluyendo variantes funcionales de los mismos) pueden glicosilarse, amidarse, carboxilarse, forsforilarse, esterificarse, N-acilarse, ciclarse mediante, por ejemplo, un puente de disulfuro, o convertirse en una sal de adición de ácido y/u opcionalmente dimerizarse o polimerizarse, o conjugarse.
El TCR, polipéptido y/o proteína de la invención (incluyendo variantes funcionales del mismo) puede obtenerse por métodos conocidos en la técnica. Los métodos adecuados de síntesis de novo de polipéptidos y proteínas se describen en referencias tales como Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2005; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, Reino Unido, 2000; y la patente estadounidense n.° 5.449.752. Además, los polipéptidos y proteínas pueden producirse de manera recombinante usando los ácidos nucleicos descritos en el presente documento usando métodos recombinantes convencionales. Véanse, por ejemplo, Green y Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4‘ ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2012; y Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, nY, 1994. De manera adicional, algunos de los TCR, polipéptidos y proteínas de la invención (incluyendo variantes funcionales de los mismos) pueden aislarse y/o purificarse de una fuente, tal como una planta, una bacteria, un insecto, un mamífero, por ejemplo, una rata, un ser humano, etc. Los métodos de aislamiento y purificación se conocen bien en la técnica. De manera alternativa, los TCR, polipéptidos y/o proteínas descritos en el presente documento (incluyendo variantes funcionales de los mismos) pueden sintetizarse de manera comercial por empresas, tales como Synpep (Dublin, CA), Peptide Technologies Corp. (Gaithersburg, MD) y Multiple Peptide Systems (San Diego, CA). A este respecto, los TCR de la invención (incluyendo variantes funcionales de los mismos), polipéptidos y proteínas pueden ser sintéticos, recombinantes, aislados y/o purificados.
Se incluyen en el alcance de la invención conjugados, por ejemplo, bioconjugados, que comprenden cualquiera de los TCR, polipéptidos o proteínas de la invención (incluyendo cualquiera de las variantes funcionales de los mismos), ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células huésped, poblaciones de células huésped o anticuerpos, o porciones de unión a antígeno de los mismos. Los conjugados, así como los métodos de síntesis de conjugados en general se conocen en la técnica (véanse, por ejemplo, Hudecz, F., Methods Mol. Biol. 298: 209-223 (2005) y Kirin et al., Inorg Chem. 44(15): 5405-5415 (2005)).
Una realización de la invención proporciona una secuencia de ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para cualquiera de los TCR (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos), polipéptidos o proteínas descritos en el presente documento. Por “ácido nucleico”, tal como se usa en el presente documento, se incluye “polinucleótido”, “oligonucleótido” y “molécula de ácido nucleico”, y significa en general un polímero de ADN o ARN, que puede ser monocatenario o bicatenario, sintetizado u obtenido (por ejemplo aislado y/o purificado) de fuentes naturales, que puede contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados, y que puede contener un enlace internucleótido natural, no natural o alterado, tal como un enlace de fosforoamidato o un enlace de fosforotioato, en lugar del fosfotiéster encontrado entre los nucleótidos de un oligonucleótido no modificado. En una realización, el ácido nucleico comprende ADN complementario (ADNc). En general, se prefiere que el ácido nucleico no comprenda ninguna inserción, deleción, inversión y/o sustitución. Sin embargo, puede ser adecuado en algunos casos, tal como se analiza en el presente documento, que el ácido nucleico comprenda una o más inserciones, deleciones, inversiones y/o sustituciones.
Preferiblemente, los ácidos nucleicos de la invención son recombinantes. Tal como se usa en el presente documento, el término “recombinante” se refiere a (i) moléculas que se construyen fuera de células vivas al unir segmentos de ácidos nucleicos naturales o sintéticos a moléculas de ácidos nucleicos que pueden replicarse en una célula viva, o (ii) moléculas que resultan de la replicación de aquellas descritas en (i) anterior. Para los propósitos del presente documento, la replicación puede ser replicación in vitro o replicación in vivo.
Los ácidos nucleicos pueden construirse basándose en síntesis química y/o reacciones de ligación enzimática usando procedimientos conocidos en la técnica. Véanse, por ejemplo, Green y Sambrook et al., citado anteriormente, y Ausubel et al., citado anteriormente. Por ejemplo, un ácido nucleico puede sintetizarse químicamente usando nucleótidos que se presentan de manera natural o nucleótidos diversamente modificados diseñados para aumentar la estabilidad biológica de las moléculas o para aumentar la estabilidad física del dúplex formado en la hibridación (por ejemplo, derivados de fosforotioato y nucleótidos sustituidos con acridina). Los ejemplos de nucleótidos modificados que pueden usarse para generar los ácidos nucleicos incluyen, pero no se limitan a, 5-fluorouracilo, 5-bromouracilo, 5-clorouracilo, 5-yodouracilo, hipoxantina, xantina, 4-acetilcitosina, 5-(carboxihidroximetil)uracilo, 5-carboximetilaminometil-2-tiouridina, 5-carboximetilaminometiluracilo, dihidrouracilo, beta-D-galactosilqueosina, inosina, N6-isopenteniladenina, 1-metilguanina, 1-metilinosina, 2 ,2-dimetilguanina, 2-metiladenina, 2-metilguanina, 3-metilcitosina, 5-metilcitosina, adenina N6-sustituida, 7-metilguanina, 5-metilaminometiluracilo, 5-metoxiaminometil-2-tiouracilo, beta-D-manosilqueosina, 5'-metoxicarboximetiluracilo, 5-metoxiuracilo, 2-metiltio-N6-isopenteniladenina, ácido uracil-5-oxiacético (v), wibutoxosina, pseudouracilo, queosina, 2- tiocitosina, 5-metil-2-tiouracilo, 2-tiouracilo, 4-tiouracilo, 5-metiluracilo, éster metílico del ácido uracil-5-oxiacético, 3- (3-amino-3-N-2-carboxipropil)uracilo y 2,6-diaminopurina. De manera alternativa, uno o más de los ácidos nucleicos de la invención pueden comprarse de empresas, tales como Macromolecular Resources (Fort Collins, CO) y Synthegen (Houston, tX).
El ácido nucleico puede comprender cualquier secuencia de nucleótidos que codifique para cualquiera de los TCR, polipéptidos, proteínas o variantes funcionales de los mismos descritos en el presente documento. En una realización de la invención, la secuencia de nucleótidos puede comprender, consistir o consistir esencialmente en cualquiera de ambas SEQ ID NO: 31 y 32, ambas SEQ ID NO: 33 y 34, o ambas SEQ ID NO: 35 y 36.
En una realización de la invención, el ácido nucleico comprende una secuencia de nucleótidos no natural. Una secuencia de nucleótidos puede considerarse como que es “no natural” si la secuencia de nucleótidos no se encuentra en la naturaleza. En algunas realizaciones, la secuencia de nucleótidos puede optimizarse por codón. Sin que se una a ninguna teoría o mecanismo particular, se cree que la optimización por codón de la secuencia de nucleótidos aumenta la eficacia de traducción de los transcriptos de ARNm. La optimización por codón de la secuencia de nucleótidos puede implicar sustituir un codón nativo por otro codón que codifica para el mismo aminoácido, pero puede traducirse por ARNt que está más fácilmente disponible dentro de una célula, aumentando de este modo la eficacia de traducción. La optimización de la secuencia de nucleótidos también puede reducir las estructuras secundarias de ARNm que pueden interferir con la traducción, aumentando de este modo la eficacia de traducción. En una realización de la invención, la secuencia de nucleótidos optimizada por codón puede comprender, consistir o consistir esencialmente en ambas de SEQ ID NO: 33 y 34 o ambas de SEQ ID NO: 35 y 36.
La invención también proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es complementaria a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento o una secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas a la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento.
La secuencia de nucleótidos que se hibrida en condiciones rigurosas se hibrida preferiblemente en condiciones de alta rigurosidad. Por “condiciones de alta rigurosidad” quiere decirse que la secuencia de nucleótidos se hibrida específicamente a una secuencia diana (la secuencia de nucleótidos de cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento) en una cantidad que es detectablemente más fuerte que la hibridación no específica. Las condiciones de alta rigurosidad incluyen condiciones que distinguirían a un polinucleótido con una secuencia complementaria exacta o una que sólo contenga pocos apareamientos erróneos dispersos de una secuencia aleatoria que puede tener unas pocas regiones pequeñas (por ejemplo, 3-10 bases) que correspondan a la secuencia de nucleótidos. Estas pequeñas regiones de complementariedad se fusionan más fácilmente que un complemento de longitud completa de 14-17 o más bases, y la hibridación de alta rigurosidad las hace más fácilmente distinguibles. Las condiciones de rigurosidad relativamente alta incluirán, por ejemplo, condiciones de poca sal y/o alta temperatura, tales como las proporcionadas por aproximadamente NaCl 0,02-0,1 M o el equivalente, a temperaturas de aproximadamente 50-70°C. Estas condiciones de alta rigurosidad toleran poco, si lo hay, apareamiento erróneo entre la secuencia de nucleótidos y el molde o la cadena diana, y son particularmente adecuadas para detectar la expresión de cualquiera de los TCR de la invención (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos). En general, se aprecia que las condiciones pueden volverse más rigurosas mediante la adición de cantidades crecientes de formamida.
La invención también proporciona un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que es al menos aproximadamente el 70% o más, por ejemplo, aproximadamente el 80%, aproximadamente el 90%, aproximadamente el 91%, aproximadamente el 92%, aproximadamente el 93%, aproximadamente el 94%, aproximadamente el 95%, aproximadamente el 96%, aproximadamente el 97%, aproximadamente el 98% o aproximadamente el 99% idéntica a cualquiera de los ácidos nucleicos descritos en el presente documento.
Los ácidos nucleicos de la invención pueden incorporarse en un vector de expresión recombinante. A este respecto, la invención proporciona vectores de expresión recombinante que comprenden cualquiera de los ácidos nucleicos de la invención. En una realización de la invención, el vector de expresión recombinante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena a , la cadena p y el péptido ligador. Por ejemplo, en una realización, el vector de expresión recombinante comprende una secuencia de nucleótidos optimizada por codón que comprende SEQ ID NO: 39 (que codifica para las cadenas a y p quiméricas SEQ ID NO: 20 y 22 con un ligador colocado entre ellas, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena beta está colocada 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena alfa).
Para los propósitos del presente documento, el término “vector de expresión recombinante” significa un constructo de oligonucleótido o polinucleótido modificado genéticamente que permite la expresión de un ARNm, proteína, polipéptido o péptido por una célula huésped, cuando el constructo comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el ARNm, proteína, polipéptido o péptido, y el vector se pone en contacto con la célula en condiciones suficientes para tener al ARNm, proteína, polipéptido o péptido expresado dentro de la célula. Los vectores de la invención no se presentan de manera natural como una totalidad. No obstante, las partes de los vectores pueden presentarse de manera natural. Los vectores de expresión recombinante de la invención pueden comprender cualquier tipo de nucleótidos, incluyendo, pero sin limitarse a, ADN y ARN, que pueden ser monocatenarios o bicatenarios, sintetizados u obtenidos en parte de fuentes naturales y que pueden contener nucleótidos naturales, no naturales o alterados. Los vectores de expresión recombinante pueden comprender enlaces internucleótido que se presentan de manera natural o que no se presentan de manera natural, o ambos tipos de enlaces. Preferiblemente, los enlaces internucleótido o nucleótidos que no se presentan de manera natural o alterados no impedirán la transcripción o replicación del vector.
El vector de expresión recombinante de la invención puede ser cualquier vector de expresión recombinante adecuado y puede usarse para transformar o transfectar cualquier célula huésped adecuada. Los vectores adecuados incluyen aquellos diseñados para la propagación y expansión o para la expresión, o ambos, tales como plásmidos y virus. El vector puede seleccionarse del grupo que consiste en la serie pUC (Fermentas Life Sciences), la serie pBluescript (Stratagene, La Jolla, CA), la serie pET (Novagen, Madison, WI), la serie pGEX (Pharmacia Biotech, Uppsala, Suecia) y la serie pEX (Clontech, Palo Alto, CA). También pueden usarse vectores de bacteriófago, tales como XGPT10, XGPT11, XZapII (Stratagene), XEMBL4 y XNM1149. Los ejemplos de vectores de expresión de origen vegetal incluyen pBI01, pBh0l2 , pBI101.3, pBI121 y pBIN19 (Clontech). Los ejemplos de vectores de expresión de origen animal incluyen pEUK-Cl, pMAM y pMAMneo (Clontech). Preferiblemente, el vector de expresión recombinante es un vector viral, por ejemplo, un vector retroviral. En una realización especialmente preferida, el vector de expresión recombinante es un vector MSGV1.
En una realización preferida, el vector de expresión recombinante comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para una cadena alfa y una cadena beta de cualquiera de los TCR (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos) descritos en el presente documento, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena beta está colocada 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena alfa. A este respecto, la secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena alfa puede estar colocada 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena beta. Sin que se una por ninguna teoría o mecanismo particular, se cree que una secuencia de nucleótidos que codifica para una cadena beta que está colocada 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena alfa puede proporcionar cualquiera de uno o más de reconocimiento aumentado de las dianas positivas a HPV 16 E7, expresión aumentada por una célula huésped y actividad antitumoral aumentada en comparación con una secuencia de nucleótidos que codifica para una cadena beta que está colocada 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena alfa. En una realización menos preferida, la secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena beta está colocada 3' de la secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena alfa. A este respecto, la secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena alfa puede estar colocada 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena beta. En una realización, un vector MSGV1 que comprende una secuencia de nucleótidos optimizada por codón que codifica para un TCR quimérico modificado con LVL que comprende las SEQ ID NO: 20 y 22 de la invención, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena beta está colocada 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena alfa, comprende SEQ ID NO: 37. En otra realización, un vector MSGV1 que comprende una secuencia de nucleótidos optimizada por codón que codifica para un TCR quimérico, modificado con LVL, sustituido con Cys que comprende las SEQ ID NO: 26 y 27 de la invención, en el que la secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena beta está colocada 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena alfa, comprende SEQ ID NO: 38.
Los vectores de expresión recombinante de la invención pueden prepararse usando técnicas normales de ADN recombinante descritas en, por ejemplo, Green y Sambrook et al., citado anteriormente, y Ausubel et al., citado anteriormente. Los constructos de los vectores de expresión, que son circulares o lineales, pueden prepararse para contener un sistema de replicación funcional en una célula huésped procariota o eucariota. Los sistemas de replicación pueden derivarse, por ejemplo, de ColEI, plásmido 2m, X, VS40, papilomavirus bovino y similares.
De manera deseable, el vector de expresión recombinante comprende secuencias reguladoras, tal como codones de inicio y terminación de trascripción y traducción que son específicos al tipo de célula huésped (por ejemplo, bacteria, hongo, planta o animal) en la que va a introducirse el vector, tal como sea apropiado y tomando en consideración si el vector es a base de ADN o ARN.
El vector de expresión recombinante puede incluir uno o más genes marcadores, que permiten la selección de células huésped transformadas o transfectadas. Los genes marcadores incluyen resistencia a biocidas, por ejemplo, resistencia a antibióticos, metales pesados, etc., complementación en una célula huésped auxotrófica para proporcionar fototrofía, y similares. Los genes marcadores adecuados para los vectores de expresión de la invención incluyen, por ejemplo, genes de resistencia a neomicina/G418, genes de resistencia a hidromicina, genes de resistencia a histidinol, genes de resistencia a tetraciclina y genes de resistencia a ampicilina.
El vector de expresión recombinante puede comprender un promotor nativo o no nativo operativamente enlazado a la secuencia de nucleótidos que codifica para el TCR, polipéptido o proteína (incluyendo variantes funcionales de los mismos) o a la secuencia de nucleótidos que es complementaria o que se hibrida a la secuencia de nucleótidos que codifica para el TCR, polipéptido o proteína (incluyendo variantes funcionales del mismo). La selección de promotores, por ejemplo, fuertes, débiles, inducibles, específicos de tejido y específicos de desarrollo, está dentro de la habilidad de un experto en la técnica. De manera similar, la combinación de una secuencia de nucleótidos con un promotor también está dentro de la habilidad de un experto en la técnica. El promotor puede ser un promotor no viral o un promotor viral, por ejemplo, un promotor de citomegalovirus (CMV), un promotor de SV40, un promotor de VRS y un promotor encontrado en la repetición terminal larga del virus de células madre murinas.
Los vectores de expresión recombinante de la invención pueden diseñarse ya sea para la expresión transitoria, para la expresión estable o para ambas. Además, los vectores de expresión recombinante pueden producirse para la expresión constitutiva o para la expresión inducible. De manera adicional, los vectores de expresión recombinante pueden producirse para incluir un gen suicida.
Tal como se usa en el presente documento, el término “gen suicida” se refiere a un gen que provoca que la célula que expresa al gen suicida muera. El gen suicida puede ser un gen que confiere sensibilidad a un agente, por ejemplo, un fármaco, en la célula en la que se expresa el gen, y provoca que la célula muera cuando la célula se pone en contacto con o se expone al agente. Los genes suicidas se conocen en la técnica (véase, por ejemplo, Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, Springer, Caroline J. (Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, RU, Humana Press, 2004) e incluyen, por ejemplo, gen de timidina-cinasa (TK) del virus del herpes simple (VHS), citosina-daminasa, purina-nucleósido-fosforilasa y nitro-reductasa.
Otra realización de la invención proporciona adicionalmente una célula huésped que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinante descritos en el presente documento. Tal como se usa en el presente documento, el término “célula huésped” se refiere a cualquier tipo de célula que pueda contener el vector de expresión recombinante de la invención. La célula huésped puede ser una célula eucariota, por ejemplo, planta, animal o alga, o puede ser una célula procariota, por ejemplo, bacteria o protozoo. La célula huésped puede ser una célula cultivada o una célula primaria, es decir, aislada directamente de un organismo, por ejemplo, un ser humano. Una célula huésped puede ser una célula adherente o una célula suspendida, es decir, una célula que crece en suspensión. Las células huésped adecuadas se conocen en la técnica e incluyen, por ejemplo, células DH5a de E. coli, células de ovario de hámster chino, células VERO de mono, células COS, células HEK293, y similares. Para los propósitos de amplificar o replicar el vector de expresión recombinante, la célula huésped es preferiblemente una célula procariota, por ejemplo, una célula DH5a . Para los propósitos de producir un TCR, polipéptido o proteína recombinante, la célula huésped es preferiblemente una célula de mamífero. De manera más preferible, la célula huésped es una célula humana. Mientras que la célula huésped puede ser de cualquier tipo de célula, y puede originarse de cualquier tipo de tejido, y puede ser de cualquier fase de desarrollo, la célula huésped es preferiblemente un linfocito de sangre periférica (PBL) o una célula mononuclear de sangre periférica (PBMC). De manera más preferible, la célula huésped es una célula T.
Para los propósitos del presente documento, la célula T puede ser cualquier célula T, tal como una célula T cultivada, por ejemplo, una célula T primaria, o una célula T de una línea de células T cultivadas, por ejemplo, Jurkat, SupT1, etc., o una célula T obtenida de un mamífero. Si se obtiene de un mamífero, la célula T puede obtenerse de numerosas fuentes, incluyendo, pero sin limitarse a, sangre, médula ósea, ganglio linfático, el timo u otros tejidos o fluidos. Las células T también pueden enriquecerse o purificarse. Preferiblemente, la célula T es una célula T humana. De manera más preferible, la célula T es una célula T aislada de un ser humano. La célula T puede ser cualquier tipo de célula T y puede ser de cualquier fase de desarrollo, incluyendo, pero sin limitarse a, células T doble positivas a CD4+/CD8+, células T auxiliares CD4+, por ejemplo, células Th1 y Th2, células T CD4+, células T CD8+ (por ejemplo, células T citotóxicas), linfocitos infiltrantes de tumor (TIL), células T de memoria (por ejemplo, células T de memoria central y células T de memoria efectora), células T vírgenes, y similares.
También se proporciona por la invención una población de células que comprende al menos una célula huésped descrita en el presente documento. La población de células puede ser una población heterogénea que comprende la célula huésped que comprende cualquiera de los vectores de expresión recombinante descritos, además de al menos otra célula, por ejemplo, una célula huésped (por ejemplo, una célula T), que no comprende ninguno de los vectores de expresión recombinante, o una célula diferente de una célula T, por ejemplo, una célula B, un macrófago, un neutrófilo, un eritrocito, un hepatocito, o una célula endotelial, una célula epitelial, una célula muscular, una célula cerebral, etc. De manera alternativa, la población de células puede ser una población sustancialmente homogénea, en la que la población comprende principalmente células huésped (por ejemplo, que consisten esencialmente en) que comprenden el vector de expresión recombinante. La población también puede ser una población clonal de células, en la que todas las células de la población son clones de una célula huésped individual que comprenden un vector de expresión recombinante, tal que todas las células de la población comprendan el vector de expresión recombinante. En una realización de la invención, la población de células es una población clonal que comprende células huésped que comprenden un vector de expresión recombinante tal como se describe en el presente documento.
En una realización de la invención, el número de células en la población puede expandirse rápidamente. La expansión de los números de células T puede lograrse por cualquiera de varios métodos tal como se conoce en la técnica, tal como se describe, por ejemplo, en la patente estadounidense n.° 8.034.334; patente estadounidense 8.383.099; publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2012/0244133; Dudley et al., J. Immunother., 26:332-42 (2003); y Riddell et al., J. Immunol. Methods, 128:189-201 (1990).
La invención proporciona adicionalmente un anticuerpo, o una porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un epítopo que se forma por las 6 CDR (CDR1-3 de la cadena alfa y CDR1-3 de la cadena beta). El anticuerpo puede ser cualquier tipo de inmunoglobulina que se conoce en la técnica. Por ejemplo, el anticuerpo puede ser de cualquier isotipo, por ejemplo, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM, etc. El anticuerpo puede ser monoclonal o policlonal. El anticuerpo puede ser un anticuerpo que se presenta de manera natural, por ejemplo, un anticuerpo aislado y/o purificado de un mamífero, por ejemplo, ratón, conejo, cabra, caballo, gallina, hámster, ser humano, etc. De manera alternativa, el anticuerpo puede ser un anticuerpo modificado genéticamente, por ejemplo, un anticuerpo humanizado o un anticuerpo quimérico. El anticuerpo puede estar en forma monomérica o polimérica. Además, el anticuerpo puede tener cualquier nivel de afinidad o avidez para la porción funcional del TCR de la invención (o variante funcional del mismo). De manera deseable, el anticuerpo es específico para la porción funcional del TCR de la invención (o variantes funcionales del mismo), tal que hay una mínima reacción cruzada con otros péptidos o proteínas.
Los métodos para someter a prueba anticuerpos para determinar la capacidad de unirse a cualquier porción funcional o variante funcional del TCR de la invención se conocen en la técnica e incluyen cualquier ensayo de unión anticuerpo-antígeno, tal como, por ejemplo, radioinmunoensayo (RIA), ELISA, inmunotransferencia de tipo Western, inmunoprecipitación y ensayos de inhibición competitiva (véanse, por ejemplo, Janeway et al., citado más adelante, y la publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2002/0197266 A1).
Los métodos adecuados de elaboración de anticuerpos se conocen en la técnica. Por ejemplo, se describen métodos de hibridoma convencionales en, por ejemplo, Kohler y Milstein, Eur. J. Immunol., 5, 511-519 (1976), Harlow y Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), y C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 8' ed., Garland Publishing, Nueva York, NY (2011)). De manera alternativa, en la técnica se conocen otros métodos, tal como métodos de EBV-hibridoma (Haskard y Archer, J. Immunol. Methods, 74(2), 361­ 67 (1984), y Roder et al., Methods Enzymol., 121, 140-67 (1986)), y sistemas de expresión en vector de bacteriófago (véase, por ejemplo, Huse et al., Science, 246, 1275-81 (1989)). De manera adicional, los métodos para producir anticuerpos en animales no humanos se describen en, por ejemplo, las patentes estadounidenses 5.545.806, 5.569.825 y 5.714.352, y publicación de solicitud de patente estadounidense n.° 2002/0197266 A1.
De manera adicional, puede usarse visualización en fagos para generar el anticuerpo de la invención. A este respecto, las bibliotecas de fagos que codifican para dominios variables (V) de unión a antígeno de los anticuerpos pueden generarse usando técnicas de biología molecular y ADN recombinante convencionales (véase, por ejemplo, Green y Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 4a edición, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Nueva York (2012)). El fago que codifica para una región variable con la especificidad deseada se selecciona para la unión específica al antígeno deseado, y se reconstituye un anticuerpo completo o parcial que comprende el dominio variable seleccionado. Las secuencias de ácido nucleico que codifican para el anticuerpo reconstituido se introducen en una línea de células adecuadas, tal como una célula de mieloma usada para la producción de hibridoma, tal que las células secreten anticuerpos que tienen las características de anticuerpos monoclonales (véase, por ejemplo, Janeway et al., citado anteriormente, Huse et al., citado anteriormente, y patente estadounidense 6.265.150).
Pueden producirse anticuerpos por ratones transgénicos que son transgénicos para genes de inmunoglobulina de cadena pesada y ligera específicos. Estos métodos se conocen en la técnica y se describen en, por ejemplo, las patentes estadounidenses 5.545.806 y 5.569.825, y Janeway et al., citado anteriormente.
En la técnica se conocen bien los métodos para generar anticuerpos humanizados y se describen en detalle en, por ejemplo, Janeway et al., citado anteriormente, las patentes estadounidenses 5.225.539, 5.585.089 y 5.693.761, la patente europea n.° 0239400 B1 y la patente del Reino Unido n.° 2188638. Los anticuerpos humanizados también pueden generarse usando la tecnología de resuperficialización de anticuerpos descrita en, por ejemplo, la patente estadounidense 5.639.641 y Pedersen et al., J. Mol. Biol., 235, 959973 (1994).
La invención también proporciona porciones de unión a antígeno de cualquiera de los anticuerpos descritos en el presente documento. La porción de unión a antígeno puede ser cualquier porción que tenga al menos un sitio de unión a antígeno, tal como Fab, F(ab')2, dsFv, sFv, diacuerpos y triacuerpos.
Un fragmento de anticuerpo de fragmento de región variable de cadena individual (sFv), que consiste en un fragmento Fab truncado que comprende el dominio variable (V) de una cadena pesada de anticuerpo enlazada a un dominio V de una cadena ligera de anticuerpo mediante un péptido sintético, puede generarse usando técnicas de tecnología de ADN recombinante de rutina (véase, por ejemplo, Janeway et al., citado anteriormente). De manera similar, pueden prepararse fragmentos de región variable estabilizados con disulfuro (dsFv) por tecnología de ADN recombinante (véase, por ejemplo, Reiter et al., Protein Engineering, 7, 697-704 (1994)). Los fragmentos de anticuerpo de la invención, no obstante, no se limitan a estos tipos de fragmentos de anticuerpo a modo de ejemplo. Además, el anticuerpo, o porción de unión antígeno del mismo, puede modificarse para comprender una etiqueta detectable, tal como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano), y partículas elementales (por ejemplo, partículas de oro).
Los TCR, polipéptidos, proteínas (incluyendo variantes funcionales de los mismos), ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células huésped (incluyendo poblaciones de las mismas) y anticuerpos (incluyendo porciones de unión a antígeno de los mismos) de la invención, pueden aislarse y/o purificarse. El término “aislado”, tal como se usa en el presente documento, significa que se ha retirado de su ambiente natural. El término “purificado”, tal como se usa en el presente documento, significa que se ha aumentado en pureza, en el que “pureza” es un término relativo y no se considera necesariamente como pureza absoluta. Por ejemplo, la pureza puede ser de al menos aproximadamente el 50%, puede ser mayor del 60%, el 70%, el 80%, el 90%, el 95%, o puede ser del 100%.
Los TCR, polipéptidos, proteínas (incluyendo variantes funcionales de los mismos), ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células huésped (incluyendo poblaciones de las mismas) y anticuerpos (incluyendo porciones de unión a antígeno de los mismos) de la invención, todos ellos denominados colectivamente “materiales de TCR de la invención” a continuación en el presente documento, pueden formularse en una composición, tal como una composición farmacéutica. A este respecto, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende cualquiera de los TCR, polipéptidos, proteínas, porciones funcionales, variantes funcionales, ácidos nucleicos, vectores de expresión, células huésped (incluyendo poblaciones de las mismas) y anticuerpos (incluyendo porciones de unión a antígeno de los mismos) descritos en el presente documento, y un portador farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas de la invención que contienen cualquiera de los materiales de TCR de la invención pueden comprender más de un material de TCR de la invención, por ejemplo, un polipéptido y un ácido nucleico, o dos o más TCR diferentes (incluyendo porciones funcionales y variantes funcionales de los mismos). De manera alternativa, la composición farmacéutica puede comprender un material de TCR de la invención en combinación con otro(s) agente(s) farmacéuticamente activo(s), o fármaco(s), tales como agentes quimioterápicos, por ejemplo, asparaginasa, busulfano, carboplatino, cisplatino, daunorrubicina, doxorrubicina, fluorouracilo, gemcitabina, hidroxiurea, metotrexato, paclitaxel, rituximab, vinblastina, vincristina, etc.
Preferiblemente, el portador es un portador farmacéuticamente aceptable. Con respecto a las composiciones farmacéuticas, el portador puede ser cualquiera de aquellos usados convencionalmente para el material de TCR de la invención particular en consideración. Tales portadores farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por aquellos expertos en la técnica y están fácilmente disponibles al público. Se prefiere que el portador farmacéuticamente aceptable sea uno que no tenga efectos secundarios perjudiciales ni toxicidad en las condiciones de uso.
La elección del portador se determinará en parte por el material de TCR de la invención particular, así como por el método particular usado para administrar el material de TCR de la invención. Por consiguiente, hay una variedad de formulaciones adecuadas de la composición farmacéutica de la invención. Las formulaciones adecuadas pueden incluir cualquiera de aquellas para administración oral, parenteral, subcutánea, intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal o intraperitoneal. Puede usarse más de una vía para administrar los materiales de TCR de la invención, y en determinados casos, una vía particular puede proporcionar una respuesta más inmediata y más eficaz que otra vía.
Preferiblemente, el material de TCR de la invención se administra por inyección, por ejemplo, por vía intravenosa. Cuando el material de TCR de la invención es una célula huésped que expresa el TCR de la invención (o variante funcional del mismo), el portador farmacéuticamente aceptable para las células para inyección puede incluir cualquier portador isotónico tal como, por ejemplo, solución salina normal (aproximadamente el 0,90% p/v de NaCl en agua, aproximadamente 300 mOsm/l de NaCl en agua o aproximadamente 9,0 g de NaCl por litro de agua), disolución de electrolitos NORMOSOL R (Abbott, Chicago, IL), PLASMA-LYTE A (Baxter, Deerfield, Il ), aproximadamente el 5% de dextrosa en agua o lactato de Ringer. En una realización, el portador farmacéuticamente aceptable se complementa con albúmina sérica humana.
Para los propósitos de la invención, la cantidad o dosis (por ejemplo, números de células cuando el material de TCR de la invención es una o más células) del material de TCR de la invención administrado debe ser suficiente para efectuar, por ejemplo, una respuesta terapéutica o profiláctica, en el sujeto o animal a lo largo de un marco de tiempo razonable. Por ejemplo, la dosis del material de TCR de la invención debe ser suficiente para unirse a un antígeno de cáncer, o detectar, tratar o impedir cáncer en un periodo de desde aproximadamente 2 horas o más tiempo, por ejemplo, de 12 a 24 o más horas, desde el momento de administración. En determinadas realizaciones, el periodo de tiempo puede ser aún más largo. La dosis se determinará por la eficacia del material de TCR de la invención particular y el estado del animal (por ejemplo, ser humano), así como el peso corporal del animal (por ejemplo, ser humano) que va a tratarse.
En la técnica se conocen muchos ensayos para determinar una dosis administrada. Para los propósitos de la invención, puede usarse un ensayo, que comprende comparar el grado al cual las células diana se lisan o se secreta IFN-y por las células T que expresan el TCR de la invención (o variante funcional o porción funcional del mismo), polipéptido o proteína en la administración de una dosis dada de estas células T a un mamífero entre un conjunto de mamíferos de los cuales a cada uno se le da una dosis diferente de las células T, para determinar una dosis de inicio que va a administrarse a un mamífero. El grado al cual se lisan las células diana o se secreta IFN-y en la administración de una determinada dosis puede evaluarse mediante métodos conocidos en la técnica.
La dosis del material de TCR de la invención también se determinará por la existencia, naturaleza y grado de cualquier efecto secundario adverso que pueda acompañar a la administración de un material de TCR de la invención particular. Típicamente, el médico tratante decidirá la dosificación del material de TCR de la invención con la que tratar a cada paciente individual, tomando en consideración una variedad de factores, tal como edad, peso corporal, salud general, dieta, sexo, material de TCR de la invención que va a administrarse, vía de administración y la gravedad del estado que va a tratarse. En una realización en la que el material de TCR de la invención es una población de células, el número de células administradas por infusión puede variar, por ejemplo, desde aproximadamente 1 x 106 hasta aproximadamente 1 x 1012 células o más. En determinadas realizaciones, pueden administrarse menos de 1 x 106 células.
Un experto en la técnica apreciará fácilmente que los materiales de TCR de la invención pueden modificarse de cualquier número de maneras, tal que la eficacia terapéutica o profiláctica de los materiales de TCR de la invención se aumenta a través de la modificación. Por ejemplo, los materiales de TCR de la invención pueden conjugarse ya sea directa o indirectamente a través de un puente a un resto de direccionamiento. La práctica de conjugar compuestos, por ejemplo, materiales de TCR de la invención, a restos de direccionamiento se conoce en la técnica. Véanse, por ejemplo, Wadwa et al., J. Drug Targeting 3:111 (1995) y la patente estadounidense 5.087.616. El término “resto de direccionamiento”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier molécula o agente que reconoce y se une específicamente a un receptor de superficie celular, tal que el resto de direccionamiento dirige el suministro de los materiales de TCR de la invención a una población de células, en cuya superficie se expresa el receptor. Los restos de direccionamiento incluyen, pero no se limitan a, anticuerpos o fragmentos de los mismos, péptidos, hormonas, factores de crecimiento, citocinas, y cualquier otro ligando natural o no natural, que se una a los receptores de superficie celular (por ejemplo, receptor del factor de crecimiento epitelial (EGFR), receptor de células T (TCR), receptor de células B (BCR), CD28, receptor del factor de crecimiento derivado de plaquetas (PDGF), receptor de acetilcolina de tipo nicotínico (nAChR), etc.). El término “puente”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a cualquier agente o molécula que enlace los materiales de TCR de la invención al resto de direccionamiento. Un experto en la técnica reconoce que los sitios en los materiales de TCR de la invención, que no son necesarios para la función de los materiales de TCR de la invención, son sitios ideales para unir un puente y/o un resto de direccionamiento, siempre que el puente y/o resto de direccionamiento, una vez unidos a los materiales de TCR de la invención, no interfiera(n) con la función de los materiales de TCR de la invención, es decir, la capacidad de unirse a HPV 16 E7n-1g; o detectar, tratar o impedir cáncer, infección por HPV 16 o tumor maligno previo positivo a HPV.
Se contempla que las composiciones farmacéuticas, TCR (incluyendo variantes funcionales de los mismos), polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células huésped o poblaciones de células de la invención, pueden usarse en los métodos de tratamiento o prevención de cáncer, infección por HPV 16 o tumor maligno previo positivo a HPV. Sin que se una a ninguna teoría particular, se cree que los TCR de la invención (y variantes funcionales de los mismos) se unen específicamente a HPV 16 E7n-1g, tal que el TCR (o polipéptido o proteína de la invención relacionado y variantes funcionales de los mismos), cuando se exprese por una célula, es capaz de mediar una respuesta inmunitaria contra una célula diana que expresa HPV 16 E7. A este respecto, la divulgación proporciona un método de tratamiento o prevención de un estado en un mamífero que comprende administrar al mamífero cualquiera de las composiciones farmacéuticas, TCR (y variantes funcionales de los mismos), polipéptidos o proteínas descritos en el presente documento, cualquier ácido nucleico o vector de expresión recombinante que comprenda una secuencia de nucleótidos que codifique para cualquiera de los TCR (y variantes funcionales de los mismos), polipéptidos, proteínas descritos en el presente documento, o cualquier célula huésped o población de células que comprendan un vector recombinante que codifique para cualquiera de los TCR (y variantes funcionales de los mismos), polipéptidos o proteínas descritos en el presente documento, en una cantidad eficaz para tratar o prevenir el estado en el mamífero, en el que el estado es cáncer, infección por HPV 16 o tumor maligno previo positivo a HPV.
Los términos “tratar” y “prevenir”, así como palabras derivadas de los mismos, tal como se usan en el presente documento, no implican necesariamente tratamiento o prevención al 100% o completo. Más bien, hay grados variables de tratamiento o prevención de los que un experto en la técnica reconoce como que tienen un posible beneficio o efecto terapéutico. A este respecto, los métodos dados a conocer pueden proporcionar cualquier cantidad de cualquier nivel de tratamiento o prevención de un estado en un mamífero. Además, el tratamiento o la prevención proporcionados por el método dado a conocer pueden incluir tratamiento o prevención de uno o más estados o síntomas del estado, por ejemplo, cáncer, que va a tratarse o prevenirse. Por ejemplo, el tratamiento o la prevención pueden incluir fomentar la regresión de un tumor. Además, para los propósitos del presente documento, “prevención” puede abarcar el retraso de la aparición del estado, o un síntoma o estado del mismo.
Además, en el presente documento se proporciona un método de detección de la presencia de un estado en un mamífero. El método comprende (i) poner en contacto una muestra que comprende una o más células del mamífero con cualquiera de los t Cr (y variantes funcionales de los mismos), polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células huésped, poblaciones de células, anticuerpos o porciones de un antígeno de los mismos, o composiciones farmacéuticas de la invención descritos en el presente documento, formando de este modo un complejo, y detectar el complejo, en el que la detección del complejo es indicativa de la presencia del estado en el mamífero, en el que el estado es cáncer, infección por HPV 16 o tumor maligno previo positivo a HPV.
Con respecto al método in vitro de la invención de detección de un estado en un mamífero, la muestra de células puede ser una muestra que comprenda células completas, lisados de las mismas, o una fracción de los lisados de células completas, por ejemplo, una fracción nuclear o citoplásmica, una fracción de proteína completa o una fracción de ácido nucleico.
Para los propósitos del método de detección de la invención, la puesta en contacto es in vitro.
Además, la detección del complejo puede presentarse a través de cualquiera de varias maneras conocidas en la técnica, por ejemplo, los TCR (y variantes funcionales de los mismos), polipéptidos, proteínas, ácidos nucleicos, vectores de expresión recombinante, células huésped, poblaciones de células o anticuerpos o porciones de unión a antígeno de los mismos de la invención descritos en el presente documento, pueden etiquetarse con una etiqueta detectable tal como, por ejemplo, un radioisótopo, un fluoróforo (por ejemplo, isotiocianato de fluoresceína (FITC), ficoeritrina (PE)), una enzima (por ejemplo, fosfatasa alcalina, peroxidasa de rábano), y partículas elementales (por ejemplo, partículas de oro).
Para los propósitos de los métodos dados a conocer, en los que se administren células huésped o poblaciones de células, las células pueden ser células que son alogénicas o autólogas al mamífero. Preferiblemente, las células son autólogas al mamífero.
Con respecto a los métodos de la invención, el cáncer puede ser cualquier cáncer, incluyendo cualquiera de cáncer linfocítico agudo, leucemia mieloide aguda, rabdomiosarcoma alveolar, cáncer de huesos, cáncer de cerebro, cáncer de mama, cáncer del ano, conducto anal o anorrecto, cáncer del ojo, cáncer del conducto biliar intrahepático, cáncer de las articulaciones, cáncer del cuello, vesícula biliar o pleura, cáncer de la nariz, cavidad nasal u oído medio, cáncer de la cavidad oral, cáncer de la vagina, cáncer de la vulva, leucemia linfocítica crónica, cáncer mieloide crónico, cáncer de colon, cáncer de esófago, cáncer de cuello uterino, tumor carcinoide gastrointestinal, glioma, linfoma de Hodgkin, cáncer de hipofaringe, cáncer de riñón, cáncer de laringe, cáncer de hígado, cáncer de pulmón, mesotelioma maligno, melanoma, mieloma múltiple, cáncer de nasofaringe, linfoma no Hodgkin, cáncer de la orofaringe, cáncer de ovario, cáncer del pene, cáncer de páncreas, cáncer del peritoneo, epiplón y mesenterio, cáncer de faringe, cáncer de próstata, cáncer rectal, cáncer renal, cáncer de piel, cáncer de intestino delgado, cáncer de tejidos blandos, cáncer de estómago, cáncer de testículo, cáncer de tiroides, cáncer del útero, cáncer de uretra y cáncer de vejiga urinaria. Un cáncer preferido es cáncer de cuello uterino, orofaringe, ano, conducto anal, anorrecto, vagina, vulva o pene. Un cáncer particularmente preferido es cáncer positivo a HPV 16. Si bien los cánceres más comúnmente asociados con infección por HPV 16 incluyen cáncer de cuello uterino, orofaringe, ano, conducto anal, anorrecto, vagina, vulva y pene, los métodos de la invención pueden usarse para tratar cualquier cáncer positivo a HPV 16, incluyendo aquellos que se presentan en otras áreas anatómicas.
El mamífero referido en los métodos de la invención puede ser cualquier mamífero. Tal como se usa en el presente documento, el término “mamífero” se refiere a cualquier mamífero, incluyendo, pero sin limitarse a, mamíferos del orden Rodentia, tales como ratones y hámsteres, y mamíferos del orden Logomorpha, tales como conejos. Se prefiere que los mamíferos sean del orden Carnívora, incluyendo felinos (gatos) y caninos (perros). Es más preferido que los mamíferos sean del orden Artíodactyla, incluyendo bovinos (vacas) y porcinos (cerdos), o del orden Perssodactyla, incluyendo equinos (caballos). Lo más preferido es que el mamífero sea del orden de primates, ceboides o simoides (monos) o del orden de antropoides (humanos y simios). Un mamífero especialmente preferido es el ser humano.
Los siguientes ejemplos ilustran adicionalmente la invención pero, por supuesto, no deben considerarse que limitan su alcance de ninguna manera.
Ejemplo 1
Este ejemplo demuestra el aislamiento de un TCR anti-HPV 16 E7 humano de neoplasia.
Las muestras de linfocitos de neoplasia intraepitelial cervical (CIN) II/IN positiva a HPV 16 se obtuvieron de catorce pacientes. Los pacientes habían recibido previamente diversas vacunas que seleccionaban como diana a HPV 16 E7. Los números de los linfocitos infiltrantes en el cuello uterino (CIL) se expandieron usando el protocolo de expansión rápida (REP) tal como se describió previamente (Dudley et al. J. Immunother. 26:332-42 (2003) y Riddell et al. J. Immunol. Methods 128:189-201 (1990)). En resumen, se cultivaron TIL con células “alimentadoras” mononucleares de sangre periférica alogénicas irradiadas (40 Gy) en medio completo (CM) con 30 ng/ml de anticuerpo anti-CD3 y 6000 UI/ml de IL-2. Los números expandidos de CIL se examinaron para determinar la reactividad de HPV 16 E7 al medir la secreción de interferón (IFN)-y después del cocultivo con células dendríticas (DC) autólogas sometidas a impulso con péptido gp100, una mezcla de péptidos E6 de 15 meros que se superponen por 11 residuos de aminoácido y que abarcan la longitud completa de HPV 16 E6, una mezcla de péptidos E7 de 15 meros que se superponen por 11 residuos de aminoácido y que abarcan la longitud completa de HPV 16 E7, u OKT3. Los CIL CD8+ de un paciente (5048) se identificaron como que tenían reactividad a HPV 16 E7. También se encontró que el paciente 5048 expresaba HLA-A*02:01.
Un tetrámero de HLA-A*02:01/E7n-19 se usó para determinar la presencia de células T del paciente 5048 que seleccionaba como diana el epítopo HPV 16 E7n-19. Las células que se unen al tetrámero se aislaron usando separación por cuentas magnéticas usando anticuerpos anti-PE y se realizó la clonación por dilución limitante. Los clones de células T se examinaron para la unión al tetrámero y se identificó un clon de alta unión.
Las regiones variables de las cadenas alfa y beta del TCR del clon que se unieron al tetrámero HLA-A2/E7n-19 se aislaron y secuenciaron usando amplificación 5' rápida de la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) de extremos de ADNc (RACE). Una secuencia de nucleótidos que comprende el ADNc que codifica para la región variable de una cadena a humana de tipo natural que comprende SEQ ID NO: 9 se obtuvo de TRAV1-2*01/TRAJ7*01. Una secuencia de nucleótidos que comprende ADNc que codifica para la región variable de una cadena p humana de tipo natural que comprende SEQ ID NO: 11 se obtuvo de TRBV5-6*01/TRBJ2-1/TRBD2.
Ejemplo 2
Este ejemplo demuestra que las células T de sangre periférica transducidas para expresar un TCR anti-HPV 16 E7 quimérico que comprende una región variable humana y una región constante de ratón mostraron unión independiente a CD8 al tetrámero HLA-A2/E7n-19 y reconocieron líneas tumorales HLA-A2+ HPV-16+.
Un vector de expresión recombinante MSGV1 que comprende secuencias de nucleótidos que codifican para un TCR anti-HPV 16 E7 quimérico que comprende una región variable humana derivada del TCR humano de tipo natural del ejemplo 1 y una región constante de ratón se preparó de la siguiente manera. Las secuencias de nucleótidos en el vector de expresión recombinante codificaron para la región variable de la cadena a y la región variable de la cadena p del TCR del ejemplo 1, con la excepción que una alanina se sustituyó por la glicina nativa en la segunda posición de la región variable de la cadena p (la secuencia guía) a fin de proporcionar un sitio de restricción NcoI y una secuencia Kozak en el vector de expresión recombinante. Las secuencias de nucleótidos que codifican para una región constante murina de las cadenas a y p (SEQ ID NO: 17 y 19, respectivamente) se insertaron en el vector en lugar de las respectivas regiones constantes humanas para proporcionar una secuencia de nucleótidos que codifica para un TCR quimérico. Una secuencia de nucleótidos optimizada por codón que codifica para un péptido 2A de picornavirus (SEQ ID NO: 28) se colocó entre las cadenas a y p. La secuencia de nucleótidos que codifica para las cadenas a y p quiméricas y el ligador se optimizaron por codón para la expresión en tejidos humanos.
Se transdujeron células de sangre periférica con retrovirus del vector de expresión recombinante MSGV1 que codifica para el TCR quimérico o un vector que codifica para un TCR anti-HPV 16 E7 completamente murino. Se usaron células no transducidas como control negativo. Las células transducidas se marcaron con anticuerpos anti-CD8 y anti-TRBC (región constante de ratón) y se sometieron a prueba para determinar la unión al tetrámero HLA-A2/e7h -19 mediante citometría de flujo. Las células no transducidas (tanto CD8+ como CD8‘) y células transducidas para expresar un TCR anti-HPV 16 E7 de ratón de control que se identificó en experimentos anteriores (tanto CD8+ como CD‘) no se unen al tetrámero. Las células tanto CD8+ como CD‘ transducidas con el TCR de HPV-16 E7 quimérico se unieron al tetrámero. Por consiguiente, los PBL transducidos con el TCR quimérico se unieron al tetrámero HLA-A2/E7n-19 de una manera independiente a CD8. También se observó que aproximadamente el 50% de las células T transducidas que expresan la cadena p del TCR quimérico no se unen al tetrámetro.
En un experimento separado, se transdujeron linfocitos de sangre periférica (PBL) con el vector de expresión recombinante MSGV1 que codifica para el TCR quimérico con una eficacia de transducción de aproximadamente el 50%. Se midió la unión al tetrámero HLA-A2/E7n-19 mediante clasificación celular activada por fluorescencia (FACS), y se encontró que el 25% de las células se unen al tetrámetro en el día 8 después de la estimulación. Las células transducidas se cocultivaron con células 293-A2 diana sometidas a impulso con el péptido de HPV 16 E629-38 (control), células 293-A2 sometidas a impulso con el péptido de HPV 16 E711-19, células 624 transducidas con un plásmido que codifica para HPV 16 E6, células 624 transducidas con un plásmido que codifica para HPV 16 E7, células SCC152, células SCC90, células CaSki, células Alb, células Panc1 o células SiHa 10 días después de la estimulación. Se usaron células no transducidas como control. Se midió IFN-y. Los resultados se muestran en la figura 1. Tal como se muestra en la figura 1, los PBL transducidos con el vector de expresión recombinante MSGV1 que codifica para el TCR quimérico reconocieron específicamente líneas de células tumorales positivas a HPV 16 E7 y otras dianas HLA-A2+HPV16 E7+ de una manera restringida a HLA-A2. Los resultados obtenidos con las células de un segundo donante fueron similares.
Ejemplo 3
Este ejemplo demuestra un método para producir un TCR anti-HPV 16 E7 quimérico que comprende una región variable humana y una región constante de ratón, en el que tres residuos de aminoácidos nativos en la región transmembrana (TM) de la región constante de la cadena a del TCR se sustituyen cada uno con un residuo de aminoácido hidrófobo.
Una secuencia de nucleótidos que codifica para un TCR quimérico que comprende una región variable humana y una región constante de ratón, en la que tres residuos de aminoácido nativos en la región transmembrana (TM) de la región constante de la cadena a del TCR se sustituyen cada uno con un residuo de aminoácido hidrófobo, se preparó de la siguiente manera. Las secuencias de nucleótidos que codifican para las cadenas a y p del TCR quimérico del ejemplo 2 se clonaron en una secuencia de nucleótidos individual con la secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena p colocada 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena alfa y una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido 2A de picornavirus (SEQ ID NO: 28) colocado entre las cadenas a y p. Con referencia a la región constante de ratón de cadena a de tipo natural, SEQ ID NO: 17, tres residuos de aminoácido nativos en la región TM de la cadena a (específicamente, la Ser, Met y Gly en las posiciones 112, 114 y 115, respectivamente, se sustituyeron con Leu, Ile y Val, respectivamente). La secuencia de nucleótidos combinada se optimizó por codón para la expresión en tejidos humanos para proporcionar un inserto de vector (SEQ ID NO: 39). El inserto de vector se clonó en un vector de expresión MSGV1 dando como resultado SEQ ID NO: 37. El TCR codificado por el vector comprendía una cadena a que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 22 y una cadena p que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 20 (“TCR modificado con LVL” o “LVL TCR”).
Ejemplo 4
Este ejemplo demuestra un método de elaboración de TCR anti-HPV 16 E7 quiméricos que comprenden una región variable humana y una región constante de ratón, en el que un residuo de aminoácido nativo en las cadenas p y a se sustituye cada uno con un residuo de serina.
El TCR del ejemplo 2 se modificó para incluir una sustitución de Cys en la región constante de cada una de las cadenas a y p de la siguiente manera. La secuencia de nucleótidos que codifica para la región constante de la cadena a del TCR del ejemplo 2 (aminoácidos de SEQ ID NO: 17) se modificó para sustituir la Thr nativa en la posición 48 con Cys. La secuencia de nucleótidos que codifica para la región constante de la cadena p del TCR del ejemplo 2 (SEQ ID NO: 19) se modificó para sustituir la Ser nativa en la posición 56 con Cys. Las secuencias de nucleótidos que codifican para las cadenas a y p se clonaron en una secuencia de nucleótidos individual con la secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena p colocada 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena a y una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido 2A de picornavirus (SEQ ID NO: 28) colocado entre las cadenas a y p. La secuencia de nucleótidos combinada se optimizó por codón para la expresión en tejidos humanos para proporcionar un inserto de vector. El inserto de vector se clonó en un vector de expresión MSGV1. El TCR codificado por el vector comprendía una cadena a que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 9 y 24 y una cadena p que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SeQ ID No : 27 (“TCR modificado con Cys” o “Cys TCR”).
El TCR del ejemplo 3 (TCR modificado con LVL) se modificó adicionalmente para incluir una sustitución Cys en la región constante de cada una de las cadenas a y p de la siguiente manera. La secuencia de nucleótidos que codifica para la región constante de la cadena a del TCR modificado con LVL del ejemplo 3 (aminoácidos de SEQ ID NO: 21) se modificó para sustituir la Thr nativa en la posición 48 con Cys. La secuencia de nucleótidos que codifica para la región constante de la cadena p del TCR modificado con LVL del ejemplo 3 (SEQ ID NO: 19) se modificó para sustituir la Ser nativa en la posición 56 con Cys. Las secuencias de nucleótidos que codifican para las cadenas a y p se clonaron en una secuencia de nucleótidos individual con la secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena p colocada 5' de la secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena a y una secuencia de nucleótidos que codifica para un péptido 2A de picornavirus (SEQ ID NO: 28) colocado entre las cadenas a y p. La secuencia de nucleótidos combinada se optimizó por codón para la expresión en tejidos humanos para proporcionar un inserto de vector (SEQ ID NO: 40). El inserto de vector se clonó en un vector de expresión MSGV1 dando como resultado SEQ ID NO: 38. El TCR codificado por el vector comprendía una cadena a que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende SEQ ID NO: 26 y una cadena p que comprende una secuencia de aminoácidos que comprende s Eq ID nO: 27 (“TCR modificado con LVL-Cys” o “LVL-Cys Tc R”).
Ejemplo 5
Este ejemplo demuestra que la modificación del vector de expresión recombinante que codifica para el TCR anti-HPV 16 E7 quimérico del ejemplo 2 mejoró la unión al tetrámero HPV 16 E7n-1g y mejoró el reconocimiento de las líneas de células tumorales HPV 16+.
Los PBL de dos donantes se transdujeron con uno de los vectores de expresión recombinante expuestos en la tabla 1.
Tabla 1
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Los PBL transducidos de dos donantes normales se sometieron a prueba para determinar la unión al tetrámero HPV 16 E7n-19 mediante citometría de flujo usando anticuerpos anti-tetrámero HPV 16 E7n-1g y anti-TRBC de ratón (m) en el día 8 después de la estimulación. Se usaron células no transducidas como control negativo. Los resultados se muestran en las figuras 2A-2R. El porcentaje de células teñidas detectadas en cada cuadrante se proporciona encima de cada gráfico. Tal como se muestra en las figuras 2A-2R, las células transducidas con un vector de expresión recombinante en el que la cadena p se colocó 5' de la cadena a, demostró unión mejorada al tetrámero en comparación con células transducidas con un vector de expresión recombinante en el que la cadena a se colocó 5' de la cadena p. Además, tal como se muestra en las figuras 2A-2R, las células transducidas con un TCR modificado con Cys, un TCR modificado con LVL o un TCR modificado con LVL-Cys demostraron cada una unión mejorada al tetrámero en comparación con células transducidas con el TCR del ejemplo 2.
En un experimento separado, las células transducidas se cocultivaron con células 624, células CaSki, células SCC90 o células SCC152 11 días después de la estimulación, y se midió la secreción de IFN-y. Se usaron células no transducidas como control negativo. Los resultados se muestran en las figuras 3A y 3B. Tal como se muestra en las figuras 3A y 3B, las células transducidas con un TCR modificado con Cys, un TCR modificado con LVL o un TCR modificado con LVL-Cys demostraron cada una reconocimiento mejorado en líneas tumorales HPV 16+ en comparación con células transducidas con el TCR del ejemplo 2. Además, tal como se muestra en las figuras 3A-3B, las células transducidas con un vector de expresión recombinante en las que la cadena p se colocó 5' de la cadena a demostraron, en general, reconocimiento mejorado de las líneas tumorales HPV 16+ en comparación con células transducidas con un vector de expresión recombinante en el que la cadena a se colocó 5' de la cadena p.
Las células transducidas con un vector de expresión recombinante en las que la cadena p se colocó 5' de la cadena a también demostraron expresión mejorada en comparación con células transducidas con un vector de expresión recombinante en las que la cadena a se colocó 5' de la cadena p, tal como se mide mediante citometría de flujo.
Ejemplo 6
Este ejemplo demuestra que las células T transducidas con un vector de expresión recombinante que codifica para el TCR modificado con LVL-Cys (p/a) demostraron unión independiente a CD8 del tetrámero HPV-16 E711-19.
Se transdujeron células de sangre periférica con el vector de expresión recombinante MSGV1 que codifica para el TCR modificado con LVL-Cys (p/a) del ejemplo 4. Las células transducidas se marcaron con anticuerpos anti-CD8, anti-TRBC (región constante de ratón) y tetrámero HLA-A2/E7n-19, y se analizaron mediante citometría de flujo. Las células CD8+ transducidas y las células CD8' transducidas de ambos donantes se unieron ambas al tetrámetro, lo que demostró unión independiente a CD8.
Ejemplo 7
Este ejemplo demuestra que las células T de sangre periférica transducidas para expresar el TCR modificado con LVL (p/a) reconocen específicamente el péptido HPV 16 E7n-19 y líneas de células tumorales HPV 16+.
Se transdujeron PBL con un vector de expresión recombinante que codifica para TCR modificado con LVL (p/a) (SEQ ID NO: 37) del ejemplo 3. Se realizó la expansión rápida de los números de células usando el protocolo de expansión rápida (REP) tal como se describió previamente (Dudley et al. J Immunother. 26:332-42 (2003) y Riddell et al. J Immunol. Methods 128:189-201 (1990)). En resumen, se cultivaron TIL con células “alimentadoras” mononucleares de sangre periférica alogénicas irradiadas (40 Gy) en medio completo (CM) con 30 ng/ml de anticuerpo anti-CD3 y 6000 UI/ml de IL-2. Las células transducidas expandidas se cocultivaron con células 293-A2 diana sometidas a impulso con el péptido de HPV 16 E729-38 (control), células 293-A2 sometidas a impulso con el péptido de HPV 16 E711-19, células 624 transducidas con un plásmido que codifica para HPV 16 E6, células 624 transducidas con un plásmido que codifica para HPV 16 E7, células SCC152, células SCC90, células CaSki, células Alb, células Panc1, células Ane o células SiHa. Se midió IFN-y. Los resultados se muestran en la figura 4. Tal como se muestra en la figura 4, los PBL transducidos con un vector de expresión recombinante que codifica para el TCR modificado con LVL (p/a) reconocieron específicamente líneas de células tumorales positivas a HPV 16 E7 y otras dianas HLA-A2+HPV16 E7+ de una manera restringida a HLA-A2. Los resultados obtenidos con las células de un segundo donante fueron similares.
Ejemplo 8
Este ejemplo demuestra que las células T de sangre periférica transducidas para expresar el TCR modificado con LVL-Cys (p/a) reconocen específicamente líneas de células tumorales HPV 16+ y que este reconocimiento se bloquea por anticuerpos anti-MHC de clase I. Este ejemplo también demuestra que estas células T transducidas destruyen específicamente líneas de células tumorales HPV 16+ HLA-A2+.
Se transdujeron PBL con un vector de expresión recombinante que codifica para TCR modificado con LVL-Cys (p/a) (SEQ ID NO: 38). Se realizó la expansión rápida de los números de células usando REP tal como se describe en el ejemplo 7. Las células transducidas se cocultivaron con células 624, células SCC90 o células CaSki diana sin anticuerpos (barras negras) o en presencia de anticuerpos anti-MHC de clase I (barras grises) o anti-MHC de clase II (barras no sombreadas). Como controles, se transdujeron PBL con TCR de DMF5 y se cocultivaron con células 624 o se transdujeron con TCR anti-MAGE A3 y se cocultivaron con células 526-CIITA sin anticuerpos o en presencia de anticuerpos anti-MHC de clase I o anti-MHC de clase II. Se midió IFN-y. Los resultados se muestran en la figura 5. Tal como se muestra en la figura 5, las células T de sangre periférica transducidas para expresar el TCR modificado con LVL-Cys (p/a) reconocieron específicamente líneas de células tumorales HPV 16+ y este reconocimiento se bloqueó por anticuerpos anti-MHC de clase I.
En un experimento separado, se cocultivaron células efectoras transducidas con células CaSki, células SCC90, células SCC152 o células 624 diana a varias razones de efector:diana. Se usaron células efectoras no transducidas como control negativo. Los resultados se muestran en las figuras 6A-6D. Tal como se muestra en las figuras 6A-6D, los PBL transducidos con un vector de expresión recombinante que codifica para el TCR modificado con LVL-Cys (p/a) (SEQ ID NO: 38) demostraron destrucción específica de líneas tumorales HPV 16+ HLA-A2+.
Ejemplo 9
Este ejemplo demuestra que las células T de sangre periférica transducidas para expresar el TCR modificado con LVL-Cys (p/a) tienen una avidez funcional similar al TCR DCA2E6 anti-HPV 16 E6. Este ejemplo también demuestra que las células T de sangre periférica transducidas para expresar el TCR modificado con LVL-Cys (p/a) demostraron mayor producción de IFN-y en el cocultivo con células CaSki y SCC152 pero no con células SCC90 en comparación con células transducidas con el TCR DCA2E6.
Se transdujeron PBL con un vector de expresión recombinante que codifica para TCR modificado con LVL-Cys (p/a) (SEQ ID NO: 38) o DCA2E6. Las células transducidas se cocultivaron con células T2 sometidas a impulso sin péptido o con concentraciones de péptido HPV 16 E7n-1g o péptido HPV 16 E629-38 que oscilan entre 1 pM y 1 pM.

Claims (1)

  1. REIVINDICACIONES
    i. Receptor de células T (TCR) que comprende una región variable humana y una región constante murina, o una variante funcional del TCR, en el que el TCR y la variante funcional comprenden la secuencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad (CDR) 1 de cadena alfa de SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena alfa de SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena alfa de SEQ ID NO: 5, la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena beta de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena beta de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena beta de SEQ ID NO: 8, y tienen especificidad antigénica para el papilomavirus humano (HPV) 16 E7n-19 SEQ ID NO: 2, en el que opcionalmente el TCR comprende las secuencias de aminoácidos de (a) SEQ ID NO: 9 y (b) SEQ ID NO: 10, en la que X en la posición 2 es Ala o Gly.
    2. Receptor de células T (TCR) aislado o purificado que comprende la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena alfa de SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena alfa de SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena alfa de SEQ ID NO: 5, la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena beta de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena beta de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena beta de SEQ ID NO: 8, y que tiene especificidad antigénica para el papilomavirus humano (HPV) 16 E7n-19 SEQ ID NO: 2, en el que opcionalmente el TCR:
    (i) comprende una región constante humana; y/o
    (ii) comprende las secuencias de aminoácidos de (a) SEQ ID NO: 9 y (b) SEQ ID NO: 10, en la que X en la posición 2 es Ala o Gly.
    3. TCR o variante funcional según la reivindicación 1 o TCR aislado o purificado según la reivindicación 2, que comprende las secuencias de aminoácidos de
    (a) SEQ ID NO: 16, en la que
    (i) X en la posición 48 es Thr o Cys;
    (ii) X en la posición 112 es Ser, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp;
    (iii) X en la posición 114 es Met, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; y
    (iv) X en la posición 115 es Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met o Trp; y
    (b) SEQ ID NO: 18, en la que X en la posición 56 es Ser o Cys.
    4. TCR o variante funcional según la reivindicación 1 ó 3 o TCR aislado o purificado según la reivindicación 2 ó 3, que comprende las secuencias de aminoácidos de:
    (I)
    (a) una cualquiera de las SEQ ID NO: 14, 17, 21,24 y 25; y
    (b) una cualquiera de las SEQ ID NO: 15, 19 y 23
    (II)
    (a) (i) SEQ ID NO: 12, (ii) SEQ ID NO: 22, (iii) SEQ ID NO: 26, (iv) SEQ ID NO: 9 y 24, (v) SEQ ID NO: 9 y 16, o (vi) SEQ ID NO: 9 y 17; y
    (b) (i) SEQ ID NO: 10 y 18, o (ii) una cualquiera de las SEQ ID NO: 13, 20 y 27; o
    (III) SEQ ID NO: 29 ó 30.
    5. Polipéptido aislado o purificado que comprende una porción funcional de (i) TCR o variante funcional según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-4 o (ii) TCR aislado o purificado según una cualquiera de las reivindicaciones 2-4, en el que la porción funcional se une específicamente a HPV 16 E7n-19 y comprende la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena alfa de SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena alfa de SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena alfa de SEQ ID NO: 5, la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena beta de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena beta de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena beta de SEQ ID NO: 8, en el que opcionalmente la porción funcional comprende la(s) secuencia(s) de aminoácidos de:
    (I) (a) SEQ ID NO: 9, (b) SEQ ID NO: 10 o (c) SEQ ID NO: 9 y 10, en la que X en la posición 2 de SEQ ID NO: 10 es Ala o Gly, y cuando X en la posición 2 de SEQ ID NO: 10 es Gly, el polipéptido se aísla o purifica; o
    (II)
    (a) (i) SEQ ID NO: 9 y 24; (ii) SEQ ID NO: 9 y 17; (iii) SEQ ID NO: 9 y 16; (iv) SEQ ID NO: 10 y 18; o (v) una cualquiera de las SEQ ID NO: 12, 13, 20, 22, 26, 27, 29 y 30;
    (b) SEQ ID NO: 12 y 13;
    (c) SEQ ID NO: 20 y 22;
    (d) SEQ ID NO: 26 y 27;
    (e) SEQ ID NO: 9, 24 y 27;
    (f) SEQ ID NO: 9, 17 y 20; o
    (g) SEQ ID NO: 9, 10, 16 y 18,
    en el que polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de una o ambas de SEQ ID NO: 12 y 13 se aísla o purifica.
    Proteína aislada o purificada que se une específicamente a HPV 16 E7n-1g y que comprende una primera cadena de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena alfa de SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena alfa de SEQ ID NO: 4 y la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena alfa de SEQ ID NO: 5, y una segunda cadena de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena beta de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena beta de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena beta de SEQ ID NO: 8, en la que opcionalmente la proteína:
    (i) es una proteína de fusión o un anticuerpo recombinante;
    (ii) comprende una primera cadena de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 9 y una segunda cadena de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 10, en la que (A) X en la posición 2 de SEQ ID NO: 10 es Ala o Gly, y (B) comprendiendo la proteína SEQ ID NO: 9 y 10, en la que X en la posición 2 de SEQ ID NO: 10 es Gly, se aísla o purifica; o
    (iii) comprende una primera cadena de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 12, (ii) SEQ ID NO: 22, (iii) SEQ ID NO: 26, (iv) SEQ ID NO: 9 y 16, (v) SEQ ID NO: 9 y 17, o (vi) SEQ ID NO: 9 y 24, y una segunda cadena de polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos de (i) SEQ ID NO: 10 y 18, o (ii) una cualquiera de las SEQ ID No : 13, 20 y 27,
    en la que la proteína que comprende SEQ ID NO: 12 y 13 se aísla o purifica.
    Proteína que comprende SEQ ID NO: 29 ó 30.
    (a) Ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el TCR o la variante funcional según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-4, polipéptido según la reivindicación 5 o proteína según la reivindicación 6 ó 7, o
    (b) ácido nucleico aislado o purificado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica para el TCR según una cualquiera de las reivindicaciones 2-4, polipéptido según la reivindicación 5 o proteína según la reivindicación 6 ó 7, en los que opcionalmente:
    (i) el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO: 31, SEQ ID NO: 32, o ambas SEQ ID NO: 31 y 32; o
    (ii) el ácido nucleico comprende la secuencia de nucleótidos de (1) una cualquiera de las de 33-36, (2) ambas SEQ ID NO: 33 y 34, o (3) ambas SEQ ID NO: 35 y 36.
    9. Vector de expresión recombinante que comprende el ácido nucleico según la reivindicación 8, en el que opcionalmente:
    (i) la secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena beta se coloca 5' en la secuencia de nucleótidos que codifica para la cadena alfa; o
    (ii) el vector de expresión recombinante comprende SEQ ID NO: 37, 38, 39 ó 40.
    10. Célula huésped que comprende el vector de expresión recombinante según la reivindicación 9, en la que opcionalmente la célula es humana.
    11. Población de células que comprende al menos una célula huésped según la reivindicación 10.
    12. Anticuerpo, o porción de unión a antígeno del mismo, que se une específicamente a un epítopo de un TCR, en el que el epítopo se forma por la secuencia de aminoácidos de la región determinante de complementariedad (CDR) 1 de cadena alfa de SEQ ID NO: 3, la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena alfa de SEQ ID NO: 4, la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena alfa de SEQ ID NO: 5, la secuencia de aminoácidos de la CDR1 de cadena beta de SEQ ID NO: 6, la secuencia de aminoácidos de la CDR2 de cadena beta de SEQ ID NO: 7 y la secuencia de aminoácidos de la CDR3 de cadena beta de SEQ ID NO: 8.
    13. Composición farmacéutica que comprende el TCR o la variante funcional según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-4, TCR aislado o purificado según una cualquiera de las reivindicaciones 2-4, polipéptido según la reivindicación 5, proteína según la reivindicación 6 ó 7, ácido nucleico según la reivindicación 8, vector de expresión recombinante según la reivindicación 9, célula huésped según la reivindicación 10 o población de células según la reivindicación 11, y un portador farmacéuticamente aceptable.
    14. Método in vitro de detección de la presencia de un estado en un mamífero, que comprende:
    (a) poner en contacto una muestra que comprende una o más células del mamífero con el TCR o la variante funcional según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-4, el TCR aislado o purificado según una cualquiera de las reivindicaciones 2-4, el polipéptido según la reivindicación 5, la proteína según la reivindicación 6 ó 7, la célula huésped según la reivindicación 10 o la población de células según la reivindicación 11, en el que la célula huésped y la población de células expresan el TCR o la variante funcional, formando de este modo un complejo, y
    (b) detectar el complejo, en el que la detección del complejo es indicativa de la presencia del estado en el mamífero, en el que el estado es cáncer, infección por HPV 16 o tumor maligno previo positivo a HPV. 15. TCR o variante funcional según una cualquiera de las reivindicaciones 1 y 3-4, TCR aislado o purificado según una cualquiera de las reivindicaciones 2-4, polipéptido según la reivindicación 5, proteína según la reivindicación 6 ó 7, ácido nucleico según la reivindicación 8, vector de expresión recombinante según la reivindicación 9, célula huésped según la reivindicación 10, población de células según la reivindicación 11 o composición farmacéutica según la reivindicación 13, para su uso en el tratamiento o la prevención de un estado en un mamífero, en el que el estado es cáncer, infección por HPV 16 o tumor maligno previo positivo a HPV, en el que opcionalmente el estado es:
    (i) cáncer del cuello uterino, orofaringe, ano, conducto anal, anorrecto, vagina, vulva o pene; o
    (ii) cáncer positivo a HPV 16.
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