KR20170003939A - 항-인유두종바이러스 16 e7 t 세포 수용체 - Google Patents

항-인유두종바이러스 16 e7 t 세포 수용체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인유두종바이러스(HPV) 16 E7의 HLA-A2-제한 에피토프, E711-19에 대한 항원 특이성을 갖는 합성 T 세포 수용체(TCR)에 관한 것이다. 관련 폴리펩티드 및 단백질뿐 아니라, 관련 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포 및 세포 집단도 또한 제공된다. 본 발명의 TCR에 관한 항체 또는 그의 항원 결합 부분 및 약학 조성물도 또한 제공된다. 포유동물에서 질병의 존재를 검출하는 방법 및 포유동물에서 질병을 치료 또는 예방하는 방법도 또한 개시되어 있고, 상기 질병은 암, HPV 16 감염 또는 HPV-양성 전암이다.

Description

항-인유두종바이러스 16 E7 T 세포 수용체{ANTI-HUMAN PAPILLOMAVIRUS 16 E7 T CELL RECEPTORS}
관련 출원에 대한 상호참조
본원은 2014년 5월 29일자로 출원된 미국 가출원 제 62/004,335 호(본원에 전체로 참고로 인용됨)를 우선권 주장한다.
전자 제출된 자료에 대한 참조 인용
본원과 함께 제출되고 다음과 같이 확인되는 컴퓨터-판독가능한 뉴클레오티드/아미노산 서열 목록은 본원에 전체로 참고로 인용된다: 2015년 5월 28일자, "720940_ST25.TXT" 명칭의 1개의 78,607 바이트 ASCII(텍스트) 파일.
예를 들어, 자궁경부암과 같은 일부 암 유형의 주 원인은 인유두종바이러스(human papillomavirus, HPV) 감염이다. 화학치료와 같은 치료법의 진전에도 불구하고, HPV-연관 암을 포함한 많은 암들에 대한 예후는 불량할 수 있다. 따라서, 암, 특히 HPV-연관 암에 대한 또 다른 치료법에 대한 충족되지 못한 요구가 존재한다.
본 발명의 한 태양은 인유두종바이러스(HPV) 16 E7에 대한 항원 특이성을 갖는 단리되거나 정제된 T 세포 수용체(TCR)를 제공한다.
본 발명의 또 다른 태양은 인간 가변 영역 및 뮤린 불변 영역을 포함하는 TCR, 또는 상기 TCR의 기능성 변이체를 제공하며, 이때 상기 TCR 및 기능성 변이체는 인유두종바이러스(HPV) 16 E7에 대한 항원 특이성을 갖는다.
본 발명은 또한 관련된 폴리펩티드 및 단백질뿐 아니라, 관련 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 및 세포 집단을 제공한다. 또한, 본 발명에 의해 본 발명의 TCR(그의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함)에 관한 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 및 약학 조성물이 제공된다.
포유동물에서 질병의 존재를 검출하는 방법, 및 포유동물에서 질병을 치료 또는 예방하는 방법(이때, 상기 질병은 암, HPV 16 감염 또는 HPV-양성 전암(premalignancy)이다)도 또한 본 발명에 의해 제공된다. 포유동물에서 질병의 존재를 검출하는 본 발명의 방법은, (i) 상기 질병의 세포를 포함하는 샘플을, 임의의 본 발명의 TCR(그의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함), 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 숙주 세포 집단, 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 또는 본원에 기술된 약학 조성물과 접촉시켜 복합체를 생성하는 단계; 및 (ii) 복합체를 검출하는 단계로서, 상기 복합체의 검출이 포유동물에서 질병의 존재를 나타내고, 이때 상기 질병이 암, HPV 16 감염 또는 HPV-양성 전암인, 단계를 포함한다.
포유동물에서 질병을 치료 또는 예방하는 본 발명의 방법은, 본원에 기술된 임의의 TCR(그의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함), 폴리펩티드 또는 단백질; 본원에 기술된 임의의 TCR(그의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함), 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 핵산 또는 재조합 발현 벡터; 또는 본원에 기술된 임의의 TCR(그의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함), 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 재조합 벡터를 포함하는 임의의 숙주 세포 또는 숙주 세포 집단을, 포유동물에서 상기 질병을 치료 또는 예방하기에 효과적인 양으로 포유동물에게 투여하는 것을 포함하며, 이때 상기 질병은 암, HPV 16 감염 또는 HPV-양성 전암이다.
도 1은 HPV 16 E629-38 펩티드로 펄스된 표적 293-A2 세포, HPV 16 E711-19 펩티드로 펄스된 293-A2 세포, HPV 16 E6을 암호화하는 플라스미드로 형질도입된 624 세포, HPV 16 E7을 암호화하는 플라스미드로 형질도입된 624 세포, SCC152 세포, SCC90 세포, CaSki 세포, Alb 세포, Panc1 세포, 또는 SiHa 세포와 공-배양시 키메라 항-HPV 16 E7 TCR(음영처리된 막대)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열로 형질도입된 말초혈 림프구(PBL)에 의해 분비된 인터페론(IFN)-γ(pg/mL)을 나타내는 막대 그래프이다. 각각의 표적 세포에 의한 HLA-A2 및 HPV-16 E7 발현은 도 1의 하단에 나타나 있다("+"는 발현에 양성임을 나타내고, "-"는 발현에 음성임을 나타낸다). 비형질도입 세포(음영처리되지 않은 막대)를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 2A 내지 2R은 다음을 발현한, 표 1에 나타낸 재조합 발현 벡터들 중의 하나로 형질도입된(B 내지 I 및 K 내지 R) 제 1 공여체(A 내지 I) 또는 제 2 공여체(J 내지 R)로부터의 세포들의 퍼센트를 나타내는 점도표이다: HLA-A2/E711-19 사량체+/m TRBC-(위 왼쪽 사분면), HLA-A2/E711-19 사량체+/m TRBC+(위 오른쪽 사분면), HLA-A2/E711-19 사량체-/m TRBC-(아래 왼쪽 사분면), 및 HLA-A2/E711-19 사량체-/m TRBC+(아래 오른쪽 사분면). 각각의 사분면에 대한 퍼센트 수치가 각각의 점도표 위에 제공되어 있다. 비형질도입 세포(A 및 J)를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 3A 및 3B는 표적 624, CaSki, SCC90, 또는 SCC152 세포와 공-배양시 표 1에 나타낸 재조합 발현 벡터들 중 하나로 형질도입된 공여체 1(A) 또는 공여체 2(B)로부터의 효과기(effector) 세포에 의한 IFN-γ 분비를 나타내는 그래프이다. 각각의 표적 세포주에 대해, 음영처리된 막대(왼쪽으로부터 오른쪽으로)는 다음 벡터로 형질도입된 효과기 세포에 상응한다: 키메라 항-HPV 16 E7 TCR(α/β), Cys-변형된 TCR(α/β), LVL-변형된 TCR(α/β), LVL-Cys-변형된 TCR(α/β), 키메라 항-HPV 16 E7 TCR(β/α), Cys-변형된 TCR(β/α), LVL-변형된 TCR(β/α) 또는 LVL-Cys-변형된 TCR(β/α). 비형질도입 세포(음영처리되지 않은 막대)를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 4는 HPV 16 E629-38 펩티드로 펄스된 표적 293-A2 세포, HPV 16 E711-19 펩티드로 펄스된 293-A2 세포, HPV 16 E6을 암호화하는 플라스미드로 형질도입된 624 세포, HPV 16 E7을 암호화하는 플라스미드로 형질도입된 624 세포, SCC152 세포, SCC90 세포, CaSki 세포, Ane 세포, Alb 세포, Panc1 세포, 또는 SiHa 세포와 공-배양시 LVL-변형된 TCR(β/α)(서열번호 37)(음영처리된 막대)을 암호화하는 레트로바이러스 벡터로 형질도입된 PBL에 의해 분비된 인터페론(IFN)-γ(pg/mL)를 나타내는 그래프이다. 각각의 표적 세포에 의한 HLA-A2 및 HPV-16 E7 발현은 도 4의 하단에 나타나 있다("+"는 발현에 양성임을 나타내고, "-"는 발현에 음성임을 나타낸다). 비형질도입 세포(음영처리되지 않은 막대)를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 5는 항체 없이(검정색 막대) 또는 항-MHC 클래스 I(회색 막대) 또는 항-MHC 클래스 II 항체(음영처리되지 않은 막대)의 존재하에서 표적 624 세포, SCC90 세포 또는 CaSki 세포와 공-배양시 LVL-Cys-변형된 TCR(β/α)(서열번호 38)을 암호화하는 레트로바이러스 벡터로 형질도입된 PBL에 의해 분비된 인터페론(IFN)-γ(pg/mL)를 나타내는 그래프이다. 대조군으로서, PBL을 DMF5 TCR로 형질도입시키고 624 세포와 공-배양하거나, 항-MAGE A3 TCR로 형질도입시키고 항체 없이 또는 항-MHC 클래스 I 또는 항-MHC 클래스 II 항체의 존재하에서 526-CIITA 세포와 공-배양하였다.
도 6A 내지 6D는 다양한 효과기:표적 비에서 LVL-Cys-변형된 TCR(β/α)(서열번호 38)(사각형)을 암호화하는 레트로바이러스 벡터로 형질도입된 효과기 세포와 공-배양된 표적 세포 CaSki(A), SCC90(B), SCC152(C), 또는 624 세포(D)의 특이적 용해율(%)을 나타내는 그래프이다. 비형질도입 세포(원)를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 7A 및 7B는 다양한 농도의 HPV 16 E711-19 펩티드(A) 또는 HPV 16 E629-38 펩티드(B)로 펄스된 표적 세포들과 공-배양시 LVL-Cys-변형된 TCR(β/α)(서열번호 38)(음영처리된 막대) 또는 항-HPV 16 E6 TCR DCA2E6(음영처리되지 않은 막대)을 암호화하는 레트로바이러스 벡터로 형질도입된 PBL에 의해 분비된 IFN-γ(pg/mL)를 나타내는 그래프이다.
도 8A는 표적 624 세포, Caski 세포, SCC90 세포, 또는 SCC152 세포와 공-배양시 LVL-Cys-변형된 TCR(β/α)(서열번호 38)(검정색 막대) 또는 DCA2E6 TCR(회색 막대)을 암호화하는 레트로바이러스 벡터로 형질도입된 PBL에 의해 분비된 IFN-γ(pg/mL)를 나타내는 그래프이다. 비형질도입 세포(음영처리되지 않는 막대)를 음성 대조군으로 사용하였다.
도 8B는 HPV 16 E629-38 펩티드로 펄스된 표적 293-A2 세포, HPV 16 E711-19 펩티드로 펄스된 293-A2 세포, SCC152 세포, SCC90 세포, CaSki 세포, Ane 세포, Alb 세포, Panc1 세포, 또는 SiHa 세포와 공-배양시 Cys-변형된 TCR(β/α)(검정색 막대) 또는 DCA2E6 TCR(회색 막대)을 암호화하는 레트로바이러스 벡터로 형질도입된 PBL에 의해 분비된 IFN-γ(pg/mL)를 나타내는 그래프이다. 비형질도입 세포(음영처리되지 않은 막대)를 음성 대조군으로 사용하였다.
본 발명의 한 태양은 인유두종바이러스(HPV) 16 E7에 대한 항원 특이성을 갖는 단리되거나 정제된 T 세포 수용체(TCR)를 제공한다.
HPV 16은 악성종양과 가장 흔하게 연관되는 HPV의 아형이다. 특정 이론 또는 메카니즘에 결부되지 않고, HPV 16은, Rb 불활성화를 통해 세포 분열 주기에서 암세포를 활성으로 유지시키는 발암단백질 E7의 작용을 통해 적어도 부분적으로 암을 야기하는 것으로 생각된다. HPV 16 E7은 암세포에서 구성적으로 발현되며, 정상적인 비감염된 인간 조직에 의해서는 발현되지 않는다. HPV 16 E7은 자궁경부, 구강인두, 항문, 항문관, 항문직장, 질, 외음부 및 음경의 암을 포함한(이로 한정되지는 않는다) 다양한 인간 암에서 발현된다.
본 발명의 TCR(그의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함)은 임의의 HPV 16 E7 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드에 대한 항원 특이성을 가질 수 있다. 본 발명의 한 태양에서, TCR(그의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함)은 서열번호 1을 포함하거나, 그로 이루어지거나, 필수적으로 그로 이루어진 HPV 16 E7 단백질에 대한 항원 특이성을 갖는다. 본 발명의 바람직한 태양에서, TCR(그의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함)은 YMLDLQPET(서열번호 2)를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 필수적으로 그로 이루어진 HPV 16 E711-19 펩티드에 대한 항원 특이성을 갖는다.
본 발명의 한 태양에서, 본 발명의 TCR(그의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함)은 주조직적합성 복합체(major histocompatibility complex, MHC) 클래스 I-의존성 방식으로 HPV 16 E7을 인식할 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이 "MHC 클래스 I-의존성 방식"은 TCR(그의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함)이 MHC 클래스 I 분자의 배경 내에서 HPV 16 E7에 결합시 면역 반응을 유도하는 것을 의미한다. MHC 클래스 I 분자는 당해 분야에 공지된 임의의 MHC 클래스 I 분자, 예를 들면, HLA-A 분자일 수 있다. 본 발명의 바람직한 태양에서, MHC 클래스 I 분자는 HLA-A2 분자이다.
본 발명의 TCR(그의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함)은 입양 세포 이식에 사용된 세포에 의해 발현되는 경우를 포함하여 많은 이점을 제공한다. 특정 이론 또는 메카니즘에 결부되지 않고, HPV 16 E7은 여러 암 유형의 HPV 16-감염된 세포에 의해 발현되기 때문에, 본 발명의 TCR(그의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함)은 유리하게 여러 유형의 HPV 16-연관 암의 세포들을 파괴하는 능력을 제공하며, 따라서 여러 유형의 HPV 16-연관 암을 치료 또는 예방하는 것으로 생각된다. 또한, 특정 이론 또는 메카니즘에 결부되지 않고, HPV 16 E7 단백질은 암 세포에서만 발현되기 때문에, 본 발명의 TCR(그의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함)은 유리하게, 정상적인 비암성 세포의 파괴를 최소화하거나 배제시키면서 암 세포의 파괴를 표적화함으로써, 예를 들면, 독성을 최소화하거나 배제시켜 독성을 감소시키는 것으로 생각된다. 또한, 본 발명의 TCR(그의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함)은 유리하게, 예를 들면, 화학치료 단독, 수술 또는 방사선과 같은 다른 유형의 치료에 반응하지 않는 HPV-양성 암을 성공적으로 치료하거나 예방할 수 있다. 또한, 본 발명의 TCR(그의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함)은 HPV 16 E7의 매우 민감한 인식을 제공하며, 이것은 유리하게, 비처리 종양 세포(예를 들면, E711-19 펩티드로 펄스된, HPV 16 E7 및 HLA-A2 중 하나 또는 둘 다, 또는 그의 조합을 암호화하는 벡터로 형질감염된, 인터페론(IFN)-γ로 치료받은 적이 없는 종양 세포)를 인식하는 능력을 제공할 수 있다.
본원에서 사용된 바와 같이, 어구 "항원 특이성"은 TCR(그의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함)이 높은 결합활성하에 HPV 16 E7에 특이적으로 결합하고 면역학적으로 인식할 수 있음을 의미한다. 예를 들면, TCR(또는 그의 기능성 부분 및 기능성 변이체)을 발현하는 T 세포가 저농도의 HPV 16 E7 펩티드(예를 들면, 약 0.05 내지 약 5 ng/mL, 0.05 ng/mL, 0.1 ng/mL, 0.5 ng/mL, 1 ng/mL, 또는 5 ng/mL)로 펄스된 항원-음성 HLA-A2+ 표적 세포와 공-배양시 적어도 약 200 pg/mL 이상(예를 들면, 200 pg/mL 이상, 300 pg/mL 이상, 400 pg/mL 이상, 500 pg/mL 이상, 600 pg/mL 이상, 700 pg/mL 이상, 1,000 pg/mL 이상, 5,000 pg/mL 이상, 7,000 pg/mL 이상, 10,000 pg/mL 이상, 또는 20,000 pg/mL 이상)의 IFN-γ를 분비하는 경우, TCR(그의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함)은 HPV 16 E7에 대한 "항원 특이성"을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 다르게는 또는 추가적으로, TCR(또는 그의 기능성 부분 및 기능성 변이체)이 저농도의 HPV 16 E7 펩티드로 펄스된 항원-음성 HLA-A2+ 표적 세포와 공-배양시 IFN-γ의 비형질도입 말초혈 림프구(PBL) 배경 수준보다 적어도 2배의 IFN-γ를 분비하는 경우, TCR(그의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함)은 HPV 16 E7에 대한 "항원 특이성"을 갖는 것으로 간주될 수 있다. 본 발명의 TCR(그의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함)을 발현하는 세포는 또한 보다 고농도의 HPV 16 E7 펩티드로 펄스된 항원-음성 HLA-A2+ 표적 세포와 공-배양시 IFN-γ를 분비할 수 있다.
본 발명은 2개의 폴리펩티드(즉, 폴리펩티드쇄들), 예를 들면, TCR의 알파(α)쇄, TCR의 베타(β)쇄, TCR의 감마(γ)쇄, TCR의 델타(δ)쇄, 또는 그의 조합을 포함하는 TCR을 제공한다. 본 발명의 TCR의 폴리펩티드는 임의의 아미노산 서열을 포함할 수 있지만, TCR은 HPV 16 E7에 대한 항원 특이성을 가져야 한다.
본 발명의 한 태양에서, TCR은 2개의 폴리펩티드쇄를 포함하며, 이들 각각은 TCR의 상보성 결정 영역(CDR)1, CDR2 및 CDR3을 포함하는 인간 가변 영역을 포함한다. 본 발명의 한 태양에서, TCR은, 서열번호 3의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1(α쇄의 CDR1), 서열번호 4의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2(α쇄의 CDR2) 및 서열번호 5의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3(α쇄의 CDR3)을 포함하는 제 1 폴리펩티드쇄, 및 서열번호 6의 아미노산 서열을 포함하는 CDR1(β쇄의 CDR1), 서열번호 7의 아미노산 서열을 포함하는 CDR2(β쇄의 CDR2) 및 서열번호 8의 아미노산 서열을 포함하는 CDR3(β쇄의 CDR3)을 포함하는 제 2 폴리펩티드쇄를 포함한다. 이와 관련하여, 본 발명의 TCR은 서열번호 3 내지 8로 이루어진 군으로부터 선택된 아미노산 서열들 중 임의의 하나 이상을 포함할 수 있다. 바람직하게, TCR은 서열번호 3 내지 5 또는 서열번호 6 내지 8을 포함한다. 특히 바람직한 태양에서, TCR은 서열번호 3 내지 8의 아미노산 서열을 포함한다.
본 발명의 한 태양에서, TCR은 상기에 나타낸 CDR을 포함하는 TCR의 가변 영역의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, TCR은 서열번호 9(인간 α쇄의 가변 영역); 서열번호 10(이때, 서열번호 10의 위치 2에서의 X는 Ala 또는 Gly이다)(β쇄의 가변 영역); 서열번호 9 및 10(이때, 서열번호 10의 위치 2에서의 X는 Ala 또는 Gly이다) 둘 다; 서열번호 11(인간 β쇄의 가변 영역); 또는 서열번호 9 및 11 둘 다의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 10의 위치 2에서의 X가 Gly인 경우 서열번호 10은 서열번호 11에 상응한다. 바람직하게, 본 발명의 TCR은 서열번호 9 및 10 둘 다의 아미노산 서열을 포함하며, 이때 서열번호 10의 위치 2에서의 X는 Ala이다.
본 발명의 TCR은 또한, 예를 들면, 인간 또는 마우스와 같은 임의의 적절한 종으로부터 유도된 불변 영역을 포함할 수 있다. 본 발명의 한 태양에서, TCR은 또한 인간 불변 영역을 포함한다. 이와 관련하여, TCR은 서열번호 14(인간 α쇄의 불변 영역), 서열번호 15(인간 β쇄의 불변 영역), 또는 서열번호 14 및 15 둘 다의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 태양에서, 본 발명의 TCR은 가변 영역 및 불변 영역의 조합을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, TCR은, 서열번호 9(인간 α쇄의 가변 영역) 및 서열번호 14(인간 α쇄의 불변 영역) 둘 다의 아미노산 서열을 포함하는 알파쇄; 서열번호 11(인간 β쇄의 가변 영역) 및 서열번호 15(인간 β쇄의 불변 영역) 둘 다의 아미노산 서열을 포함하는 베타쇄; 서열번호 10(이때, 서열번호 2의 위치 2에서의 X는 Ala 또는 Gly이다)(인간 β쇄의 가변 영역) 및 서열번호 15(인간 β쇄의 불변 영역) 둘 다의 아미노산 서열을 포함하는 베타쇄; 서열번호 9, 11, 14 및 15 모두의 아미노산 서열; 또는 서열번호 9, 10, 14 및 15 모두의 아미노산 서열을 포함할 수 있다.
본 발명의 한 태양에서, 본 발명의 TCR은 TCR의 α쇄 및 TCR의 β쇄를 포함할 수 있다. 본 발명 TCR의 α쇄 및 β쇄 각각은 독립적으로 임의의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명 TCR의 α쇄는 서열번호 12의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 상기 유형의 α쇄는 TCR의 임의의 β쇄와 쌍을 이룰 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명 TCR의 β쇄는 서열번호 13의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 그러므로, 본 발명의 TCR은 서열번호 12, 서열번호 13, 또는 서열번호 12 및 13 둘 다의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 TCR은 서열번호 12 및 13 둘 다의 아미노산 서열을 포함하는 인간 TCR이다.
본 발명의 또 다른 태양은 인간 가변 영역 및 뮤린 불변 영역을 포함하는 키메라 TCR, 또는 TCR의 기능성 변이체를 제공하며, 이때 상기 TCR 및 기능성 변이체는 인유두종바이러스(HPV) 16 E7에 대한 항원 특이성을 갖는다. 키메라 TCR 또는 그의 기능성 변이체는 본 발명의 다른 양태들에 관해 본원에 기술된 바와 같은 임의의 CDR 영역들을 포함할 수 있다. 본 발명의 또 다른 태양에서, 키메라 TCR 또는 그의 기능성 변이체는 본 발명의 다른 양태들에 관해 본원에 기술된 임의의 가변 영역들을 포함할 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "뮤린" 또는 "인간"은, TCR 또는 본원에 기술된 TCR의 임의의 성분(예를 들면, 상보성 결정 영역(CDR), 가변 영역, 불변 영역, 알파쇄 및/또는 베타쇄)을 언급할 때, 마우스 또는 인간 각각으로부터 유도된 TCR(또는 그의 성분), 즉, 마우스 T 세포 또는 인간 T 세포 각각으로부터 유래되었거나 이들 각각에 의해 동시에 발현된 TCR(또는 그의 성분)을 의미한다.
본 발명의 한 태양에서, 본 발명의 키메라 TCR은 뮤린 불변 영역을 포함한다. 이와 관련하여, TCR은 서열번호 17(뮤린 α쇄의 불변 영역), 서열번호 19(뮤린 β쇄의 불변 영역), 또는 서열번호 17 및 19 둘 다의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바람직한 태양에서, 본 발명의 TCR은 인간 가변 영역 및 뮤린 불변 영역 둘 다를 포함하는 키메라 TCR이다.
본 발명의 한 태양에서, 본 발명의 키메라 TCR은 가변 영역 및 불변 영역의 조합을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, TCR은, 서열번호 9(인간 α쇄의 가변 영역) 및 서열번호 17(뮤린 α쇄의 불변 영역) 둘 다의 아미노산 서열을 포함하는 알파쇄; 서열번호 11(인간 β쇄의 가변 영역) 및 서열번호 19(뮤린 β쇄의 불변 영역) 둘 다의 아미노산 서열을 포함하는 베타쇄; 서열번호 10(이때, 서열번호 10의 위치 2에서의 X는 Ala 또는 Gly이다)(β쇄의 가변 영역) 및 서열번호 19(뮤린 β쇄의 불변 영역) 둘 다의 아미노산 서열을 포함하는 베타쇄; 서열번호 9, 11, 17 및 19 모두의 아미노산 서열; 또는 서열번호 9, 10, 17 및 19 모두의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 한 태양에서, 본 발명의 키메라 TCR은 서열번호 20을 포함하는 전장 베타쇄를 포함한다. 이와 관련하여, TCR은 서열번호 9, 17 및 20 모두를 포함할 수 있다.
본 발명의 범위에는 본원에 기술된 본 발명 TCR의 기능성 변이체가 포함된다. 본원에서 사용된 용어 "기능성 변이체"는 모 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질과 실질적이거나 상당한 서열 동일성 또는 유사성을 갖는 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질을 말하며, 상기 기능성 변이체는 변이체인 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질의 생물 활성을 보유한다. 기능성 변이체는, 예를 들면, 모 TCR이 그에 대한 항원 특이성을 가지거나 모 폴리펩티드 또는 단백질이 그에 모 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질과 유사한 정도로, 동일한 정도로 또는 더 높은 정도로 특이적으로 결합하는 HPV 16 E7에 특이적으로 결합하는 능력을 보유하는 본원에 기술된 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질(모 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질)의 변이체를 포함한다. 모 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질과 관련하여, 기능성 변이체는, 예를 들면, 모 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질에 대해 아미노산 서열에 있어서 적어도 약 30%, 50%, 75%, 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% 이상 동일할 수 있다.
기능성 변이체는, 예를 들면, 1개 이상의 보존적 아미노산 치환을 갖는 모 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 보존적 아미노산 치환은 당해 분야에 공지되어 있으며, 특정한 물리적 및/또는 화학적 성질을 갖는 1개의 아미노산이 동일한 화학적 또는 물리적 성질을 갖는 또 다른 아미노산으로 교환되는 아미노산 치환을 포함한다. 예를 들면, 보존적 아미노산 치환은, 또 다른 산성 아미노산 대신 치환된 산성 아미노산(예를 들면, Asp 또는 Glu), 비극성 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 대신 치환된 비극성 측쇄를 갖는 아미노산(예를 들면, Ala, Gly, Val, Ile, Leu, Met, Phe, Pro, Trp, Val 등), 또 다른 염기성 아미노산 대신 치환된 염기성 아미노산(Lys, Arg 등), 극성 측쇄를 갖는 또 다른 아미노산 대신 치환된 극성 측쇄를 갖는 아미노산(Asn, Cys, Gln, Ser, Thr, Tyr 등) 등일 수 있다.
다르게는 또는 추가적으로, 기능성 변이체는 1개 이상의 비-보존적 아미노산 치환을 갖는 모 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 이 경우에, 비-보존적 아미노산 치환은 기능성 변이체의 생물 활성을 저해하거나 억제하지 않는 것이 바람직하다. 바람직하게, 비-보존적 아미노산 치환은, 기능성 변이체의 생물 활성이 모 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질에 비해 증가되도록, 기능성 변이체의 생물 활성을 증대시킨다.
본 발명의 한 태양에서, 기능성 변이체는 알파 또는 베타쇄의 불변 영역에 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환(들)을 갖는 본원에 기술된 임의의 TCR의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직하게, 기능성 변이체는 뮤린 불변 영역에 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환(들)을 갖는 본원에 기술된 임의의 뮤린 불변 영역의 아미노산 서열을 포함한다. 일부 태양에서, 치환된 아미노산 서열(들)을 포함하는 TCR(또는 그의 기능성 부분)은 유리하게, 비치환된 아미노산 서열을 포함하는 모 TCR에 비해, HPV 16 E7+ 표적의 증가된 인식, 숙주 세포에 의한 증가된 발현, 및 증가된 항-종양 활성 중 하나 이상을 제공한다. 일반적으로, TCR α 및 β쇄의 뮤린 불변 영역의 치환된 아미노산 서열, 서열번호 16 및 18은 각각 비치환된 뮤린 불변 영역 아미노산 서열 서열번호 17 및 19 각각의 모두 또는 부분들과 상응하며, 이때 서열번호 16은 서열번호 17과 비교할 때 1, 2, 3 또는 4개의 아미노산 치환(들)을 가지고, 서열번호 18은 서열번호 19와 비교할 때 1개의 아미노산 치환을 갖는다. 이와 관련하여, 본 발명의 한 태양은, (a) (i) 위치 48에서의 X가 Thr 또는 Cys이고; (ii) 위치 112에서의 X가 Ser, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met 또는 Trp이고; (iii) 위치 114에서의 X가 Met, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met 또는 Trp이고; (iv) 위치 115에서의 X가 Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met 또는 Trp인 서열번호 16(알파쇄의 불변 영역); 및 (b) 위치 56에서의 X가 Ser 또는 Cys인 서열번호 18(베타쇄의 불변 영역)의 아미노산 서열을 포함하는 TCR의 기능성 변이체를 제공한다. 본 발명의 한 태양에서, 서열번호 16을 포함하는 TCR의 기능성 변이체는 서열번호 17(알파쇄의 비치환된 뮤린 불변 영역)을 포함하지 않는다. 본 발명의 한 태양에서, 서열번호 18을 포함하는 TCR의 기능성 변이체는 서열번호 19(베타쇄의 비치환된 뮤린 불변 영역)를 포함하지 않는다.
본 발명의 한 태양에서, 치환된 아미노산 서열은 α 및 β쇄 중 하나 또는 둘 다의 불변 영역에 시스테인 치환을 포함하여 시스테인-치환된 TCR을 제공한다. α 및 β쇄에서 대향 시스테인들은, 치환된 TCR의 α 및 β쇄의 불변 영역들을 서로에게 연결시키고 비치환된 인간 불변 영역 또는 비치환된 뮤린 불변 영역을 포함하는 TCR에는 존재하지 않는 다이설파이드 결합을 제공한다. 이와 관련하여, TCR의 기능성 변이체는 서열번호 17의 천연 Thr48 및 서열번호 19의 천연 Ser56 중 하나 또는 둘 다가 Cys로 치환될 수 있는 시스테인-치환된 키메라 TCR이다. 바람직하게, 서열번호 17의 천연 Thr48 및 서열번호 19의 천연 Ser56은 둘 다 Cys로 치환된다. 한 태양에서, 시스테인-치환된 키메라 TCR은, 위치 48에서의 X가 Cys이고, 위치 112에서의 X가 천연 Ser이고, 위치 114에서의 X가 천연 Met이고, 위치 115에서의 X가 천연 Gly인 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 알파쇄 불변 영역, 및 위치 56에서의 X가 Cys인 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 베타쇄 불변 영역을 포함한다. 바람직하게, 시스테인-치환된 키메라 TCR은 서열번호 24의 아미노산 서열을 포함하는 알파쇄 불변 영역 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 베타쇄 불변 영역을 포함한다. 본 발명의 시스테인-치환된 키메라 TCR은 본원에 기술된 임의의 CDR 및/또는 가변 영역 이외에 치환된 불변 영역을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 시스테인-치환된 키메라 TCR은 (i) 서열번호 3 내지 5 및 24; (ii) 서열번호 9 및 24; (iii) 서열번호 6 내지 8 및 23; (iv) 서열번호 10 및 23(이때, 서열번호 10의 위치 2에서의 X는 Ala 또는 Gly이다); (v) 서열번호 11 및 23; (vi) 서열번호 9 및 16; (vii) 서열번호 10 및 18; (viii) 서열번호 11 및 18; (ix) 서열번호 3 내지 5 및 16; 또는 (x) 서열번호 6 내지 8 및 18의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게, 시스테인-치환된 키메라 TCR은 (i) 서열번호 3 내지 8 및 23 및 24; (ii) 서열번호 9 및 10 및 23 및 24; (iii) 서열번호 9, 11 및 23 및 24; (iv) 서열번호 3 내지 8, 16 및 18; (v) 서열번호 9 및 10, 16 및 18; 또는 (vi) 서열번호 9, 11, 16 및 18의 아미노산 서열을 포함한다. 한 태양에서, Cys-치환된 키메라 TCR은 서열번호 27의 전장 베타쇄를 포함한다. 이와 관련하여, Cys-치환된 키메라 TCR은 서열번호 9 및 24; 서열번호 27; 또는 서열번호 9, 24 및 27 모두를 포함할 수 있다.
본 발명의 한 태양에서, 치환된 아미노산 서열은, 소수성 아미노산-치환된 TCR(본원에서 "LVL-변형된 TCR"로도 지칭됨)을 제공하기 위해 소수성 아미노산을 갖는 α 및 β쇄의 하나 또는 둘 다의 불변 영역의 막관통(transmembrane, TM) 도메인에 1, 2 또는 3개의 아미노산의 치환을 포함한다. TCR의 TM 도메인내 소수성 아미노산 치환(들)은 TM 도메인에 소수성 아미노산 치환(들)이 결여된 TCR에 비해 TCR의 TM 도메인의 소수성을 증가시킬 수 있다. 이와 관련하여, TCR의 기능성 변이체는, 서열번호 17의 천연 Ser112, Met114 및 Gly115 중 1, 2 또는 3개가 독립적으로 Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met 또는 Trp로; 바람직하게는 Leu, Ile 또는 Val로 치환될 수 있는 LVL-변형된 키메라 TCR이다. 바람직하게, 서열번호 17의 천연 Ser112, Met114 및 Gly115의 3개 모두는 독립적으로 Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met 또는 Trp로; 바람직하게는 Leu, Ile 또는 Val로 치환될 수 있다. 한 태양에서, LVL-변형된 키메라 TCR은, 위치 48에서의 X가 천연 Thr이고, 위치 112에서의 X가 Ser, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met 또는 Trp이고, 위치 114에서의 X가 Met, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met 또는 Trp이고, 위치 115에서의 X가 Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met 또는 Trp인 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 알파쇄 불변 영역, 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 베타쇄 불변 영역을 포함하며, 이때 서열번호 16을 포함하는 LVL-변형된 키메라 TCR은 서열번호 17(알파쇄의 비치환된 뮤린 불변 영역)을 포함하지 않는다. 바람직하게, LVL-변형된 키메라 TCR은 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 알파쇄 불변 영역 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 베타쇄 불변 영역을 포함한다. 본 발명의 LVL-변형된 키메라 TCR은 본원에 기술된 임의의 CDR 및/또는 가변 영역 이외에 치환된 불변 영역을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, LVL-변형된 키메라 TCR은 (i) 서열번호 3 내지 5 및 21; (ii) 서열번호 9 및 21; (iii) 서열번호 6 내지 8 및 19; (iv) 서열번호 10 및 19(이때, 서열번호 10의 위치 2에서의 X는 Ala 또는 Gly이다); (v) 서열번호 11 및 19; (vi) 서열번호 9 및 16; (vii) 서열번호 3 내지 5 및 16; (x) 서열번호 6 내지 8 및 18; (viii) 서열번호 10 및 18; 또는 (ix) 서열번호 11 및 18을 포함할 수 있다. 바람직하게, 시스테인-치환된 키메라 TCR은 (i) 서열번호 3 내지 8 및 19 및 21; (ii) 서열번호 9 및 10 및 19 및 21; (iii) 서열번호 9, 11, 및 19 및 21; (iv) 서열번호 3 내지 8, 16 및 18; (v) 서열번호 9 및 10, 16 및 18; 또는 (vi) 서열번호 9, 11, 16 및 18의 아미노산 서열을 포함한다. 한 태양에서, LVL-변형된 키메라 TCR은 서열번호 22의 아미노산 서열을 포함하는 전장 알파쇄 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 전장 베타쇄를 포함한다. 이와 관련하여, LVL-변형된 키메라 TCR은 서열번호 20, 서열번호 22, 서열번호 29, 또는 서열번호 20 및 22 둘 다를 포함할 수 있다.
본 발명의 한 태양에서, 치환된 아미노산 서열은, 소수성 아미노산을 갖는 α 및 β쇄의 하나 또는 둘 다의 불변 영역의 막관통(TM) 도메인에 1, 2 또는 3개 아미노산의 치환(들)과 함께 α 및 β쇄 중 하나 또는 둘 다의 불변 영역에 시스테인 치환을 포함한다(본원에서 "시스테인-치환된, LVL-변형된 TCR"로도 지칭됨). 이와 관련하여, TCR의 기능성 변이체는, 서열번호 17의 천연 Thr48이 Cys로 치환되고; 서열번호 17의 천연 Ser112, Met114 및 Gly115 중 1, 2 또는 3개가 독립적으로 Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met 또는 Trp로; 바람직하게는 Leu, Ile 또는 Val로 치환되고; 서열번호 19의 천연 Ser56이 Cys로 치환되는 시스테인-치환된, LVL-변형된 키메라 TCR이다. 바람직하게, 서열번호 17의 천연 Ser112, Met114 및 Gly115의 3개 모두는 독립적으로 Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met 또는 Trp로; 바람직하게는 Leu, Ile 또는 Val로 치환될 수 있다. 한 태양에서, 시스테인-치환된, LVL-변형된 키메라 TCR은, 위치 48에서의 X가 Cys이고, 위치 112에서의 X가 Ser, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met 또는 Trp이고, 위치 114에서의 X가 Met, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met 또는 Trp이고, 위치 115에서의 X가 Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met 또는 Trp인 서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 알파쇄 불변 영역, 및 위치 56에서의 X가 Cys인 서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 베타쇄 불변 영역을 포함하며, 이때 서열번호 16을 포함하는 시스테인-치환된, LVL-변형된 키메라 TCR은 서열번호 17(알파쇄의 비치환된 뮤린 불변 영역)을 포함하지 않는다. 바람직하게, 시스테인-치환된, LVL-변형된 키메라 TCR은 서열번호 25의 아미노산 서열을 포함하는 알파쇄 불변 영역 및 서열번호 23의 아미노산 서열을 포함하는 베타쇄 불변 영역을 포함한다. 본 발명의 시스테인-치환된, LVL-변형된 키메라 TCR은 본원에 기술된 임의의 CDR 및/또는 가변 영역 이외에 치환된 불변 영역을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 시스테인-치환된, LVL-변형된 키메라 TCR은 (i) 서열번호 3 내지 5 및 25; (ii) 서열번호 9 및 25; (iii) 서열번호 6 내지 8 및 23; (iv) 서열번호 10 및 23(이때, 서열번호 10의 위치 2에서의 X는 Ala 또는 Gly이다); (v) 서열번호 11 및 23; (vi) 서열번호 3 내지 5 및 16; (vii) 서열번호 9 및 16; (viii) 서열번호 6 내지 8 및 18; (ix) 서열번호 10 및 18; 또는 (x) 서열번호 11 및 18을 포함할 수 있다. 바람직하게, 시스테인-치환된, LVL-변형된 키메라 TCR은 (i) 서열번호 3 내지 8 및 23 및 25; (ii) 서열번호 9 및 10 및 23 및 25; (iii) 서열번호 9, 11 및 23 및 25; (iv) 서열번호 3 내지 8, 16 및 18; (v) 서열번호 9, 10, 16 및 18; 또는 서열번호 9, 11, 16 및 18의 아미노산 서열을 포함한다. 특히 바람직한 태양에서, 시스테인-치환된, LVL-변형된 키메라 TCR은 서열번호 26의 아미노산 서열을 포함하는 전장 알파쇄 및 서열번호 27의 아미노산 서열을 포함하는 전장 베타쇄를 포함한다. 이와 관련하여, Cys-치환된, LVL-변형된 키메라 TCR은 서열번호 26, 서열번호 27, 서열번호 30, 또는 서열번호 26 및 27 둘 다를 포함할 수 있다.
TCR(또는 그의 기능성 변이체), 폴리펩티드 또는 단백질의 다른 성분들, 예를 들면, 다른 아미노산이 TCR(또는 그의 기능성 변이체), 폴리펩티드 또는 단백질의 생물 활성을 실질적으로 변화시키지 않도록, TCR(또는 그의 기능성 변이체), 폴리펩티드 또는 단백질은 필수적으로 본원에 기술된 특정 아미노산 서열 또는 서열들로 이루어질 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 TCR(또는 그의 기능성 변이체), 폴리펩티드 또는 단백질은, 예를 들면, 필수적으로 서열번호 12, 13, 20, 22, 26, 27, 29 및 30 중 어느 하나의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다. 또한, 예를 들면, 본 발명의 TCR(또는 그의 기능성 변이체), 폴리펩티드 또는 단백질은 필수적으로 서열번호 9, 10, 11, 14 내지 19, 21, 23 내지 25, 서열번호 9 및 10 둘 다, 서열번호 9 및 11 둘 다, 서열번호 14 및 15 둘 다, 서열번호 16 및 18 둘 다, 서열번호 17 및 19 둘 다, 서열번호 23 및 24 둘 다, 서열번호 19 및 21 둘 다, 또는 서열번호 23 및 25 둘 다의 아미노산 서열(들)로 이루어질 수 있다. 또한, 본 발명의 TCR(그의 기능성 변이체 포함), 폴리펩티드 또는 단백질은 필수적으로, 서열번호 3(α쇄의 CDR1), 서열번호 4(α쇄의 CDR2), 서열번호 5(α쇄의 CDR3), 서열번호 6(β쇄의 CDR1), 서열번호 7(β쇄의 CDR2), 서열번호 8(β쇄의 CDR3), 또는 그의 임의의 조합, 예를 들면, 서열번호 3 내지 5; 6 내지 8; 또는 3 내지 8의 아미노산 서열로 이루어질 수 있다.
또한, 본 발명에 의해 본원에 기술된 임의의 TCR(또는 그의 기능성 변이체)의 기능성 부분을 포함하는 폴리펩티드가 제공된다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "폴리펩티드"는 올리고펩티드를 포함하며, 하나 이상의 펩티드 결합에 의해 연결된 아미노산들의 단일쇄를 말한다.
본 발명의 폴리펩티드와 관련하여, 기능성 부분은, 그의 일부분인 TCR(또는 그의 기능성 변이체)의 연속 아미노산들을 포함하는 임의의 부분일 수 있지만, 상기 기능성 부분은 HPV 16 E7에 특이적으로 결합해야 한다. 용어 "기능성 부분"은 TCR(또는 그의 기능성 변이체)과 관련하여 사용될 때, 그 일부분 또는 단편이, 그의 일부분인 TCR(또는 그의 기능성 변이체)(모 TCR 또는 그의 모 기능성 변이체)의 생물 활성을 보유하는 본 발명의 TCR(또는 그의 기능성 변이체)의 임의의 일부분 또는 단편을 말한다. 기능성 부분은, 예를 들면, HPV 16 E7에 특이적으로 결합하거나(예를 들면, HLA-A2-의존성 방식으로), 모 TCR(또는 그의 기능성 변이체)과 유사한 정도로, 동일한 정도로, 또는 더 높은 정도로 암을 검출하거나 치료하거나 예방하는 능력을 보유하는 TCR(또는 그의 기능성 변이체)의 상기 일부분을 포함한다. 모 TCR(또는 그의 기능성 변이체)과 관련하여, 기능성 부분은, 예를 들면, 모 TCR(또는 그의 기능성 변이체)의 약 10%, 25%, 30%, 50%, 68%, 80%, 90%, 95% 이상을 차지할 수 있다.
기능성 부분은 상기 부분의 아미노 또는 카복시 말단에, 또는 양쪽 말단 둘 다에, 모 TCR 또는 그의 기능성 변이체의 아미노산 서열에서는 발견되지 않는 추가의 아미노산을 포함할 수 있다. 바람직하게, 추가의 아미노산은 기능성 부분의 생물학적 기능, 예를 들면, HPV 16 E7에 특이적으로 결합하는 것; 및/또는 암을 검출하거나, 암을 치료하거나, 예방하는 능력을 갖는 것 등을 저해하지 않는다. 보다 바람직하게, 상기 추가의 아미노산은 모 TCR 또는 그의 기능성 변이체의 생물 활성에 비해 생물 활성을 증대시킨다.
폴리펩티드는 본 발명의 TCR 또는 그의 기능성 변이체의 α 및 β쇄 중 어느 하나 또는 둘 다의 기능성 부분, 예를 들면, 본 발명의 TCR 또는 그의 기능성 변이체의 α쇄 및/또는 β쇄의 가변 영역(들)의 CDR1, CDR2 및 CDR3 중 하나 이상을 포함하는 기능성 부분을 포함할 수 있다. 본 발명의 한 태양에서, 폴리펩티드는 서열번호 3(α쇄의 CDR1), 4(α쇄의 CDR2), 5(α쇄의 CDR3), 6(β쇄의 CDR1), 7(β쇄의 CDR2), 8(β쇄의 CDR3), 또는 그의 조합의 아미노산 서열을 포함하는 기능성 부분을 포함할 수 있다. 바람직하게, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 3 내지 5; 6 내지 8; 또는 서열번호 3 내지 8 모두를 포함하는 기능성 부분을 포함한다. 보다 바람직하게, 폴리펩티드는 서열번호 3 내지 8 모두의 아미노산 서열을 포함하는 기능성 부분을 포함한다.
본 발명의 한 태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는, 예를 들면, 상기에 나타낸 CDR 영역들의 조합을 포함하는 본 발명의 TCR 또는 그의 기능성 변이체의 가변 영역을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 폴리펩티드는 서열번호 9(α쇄의 가변 영역), 서열번호 10(이때, 서열번호 10의 위치 2에서의 X는 Ala 또는 Gly이다)(β쇄의 가변 영역), 서열번호 11(β쇄의 가변 영역), 서열번호 9 및 10 둘 다, 또는 서열번호 9 및 11 둘 다의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 폴리펩티드는 서열번호 9 및 10 둘 다의 아미노산 서열을 포함하며, 이때 서열번호 10의 위치 2에서의 X는 Ala이다.
본 발명의 폴리펩티드는 본원에 기술된, 예를 들면, 인간 또는 마우스와 같은 임의의 적절한 종으로부터 유도된 불변 영역, 또는 본원에 기술된 임의의 치환된 불변 영역을 또한 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 상기 폴리펩티드는 서열번호 14(인간 α쇄의 불변 영역), 서열번호 15(인간 β쇄의 불변 영역), 서열번호 16(α쇄의 불변 영역, 본 발명의 다른 양태들과 관련하여 본원에 기술된 바와 같이 치환), 서열번호 17(뮤린 α쇄의 불변 영역), 서열번호 18(β쇄의 불변 영역, 본 발명의 다른 양태와 관련하여 본원에 기술된 바와 같이 치환), 서열번호 19(뮤린 β쇄의 불변 영역), 서열번호 21(LVL-변형된 α쇄의 불변 영역), 서열번호 23(Cys-치환된 β쇄의 불변 영역), 서열번호 24(Cys-치환된 α쇄의 불변 영역), 서열번호 25(Cys-치환된, LVL-변형된 α쇄의 불변 영역), 서열번호 14 및 15 둘 다, 서열번호 16 및 18 둘 다, 서열번호 17 및 19 둘 다, 서열번호 19 및 21 둘 다, 서열번호 23 및 24 둘 다, 또는 서열번호 23 및 25 둘 다의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 폴리펩티드는 서열번호 14 및 15 둘 다, 서열번호 16 및 18 둘 다, 서열번호 17 및 19 둘 다, 서열번호 19 및 21 둘 다, 서열번호 23 및 24 둘 다, 또는 서열번호 23 및 25 둘 다를 포함한다. 한 태양에서, 서열번호 9 및 11 중 하나 또는 둘 다의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 단리되거나 정제된다.
본 발명의 한 태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 가변 영역 및 불변 영역의 조합을 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 상기 폴리펩티드는 서열번호 9 및 14 둘 다, 서열번호 9 및 16 둘 다, 서열번호 9 및 17 둘 다, 서열번호 9 및 21 둘 다, 서열번호 9 및 24 둘 다, 서열번호 9 및 25 둘 다, 서열번호 10 및 15 둘 다, 서열번호 10 및 18 둘 다, 서열번호 10 및 19 둘 다, 서열번호 10 및 23 둘 다, 서열번호 11 및 15 둘 다, 서열번호 11 및 18 둘 다, 서열번호 11 및 19 둘 다, 서열번호 11 및 23 둘 다, 서열번호 3 내지 5 및 14 모두, 서열번호 3 내지 5 및 16 모두, 서열번호 3 내지 5 및 17 모두, 서열번호 3 내지 5 및 21 모두, 서열번호 3 내지 5 및 24 모두, 서열번호 3 내지 5 및 25 모두, 서열번호 6 내지 8 및 15 모두, 서열번호 6 내지 8 및 18 모두, 서열번호 6 내지 8 및 19 모두, 서열번호 6 내지 8 및 23 모두, 서열번호 3 내지 8 및 14 및 15 모두, 서열번호 3 내지 8 및 16 및 18 모두, 서열번호 3 내지 8 및 17 및 19 모두, 서열번호 3 내지 8 및 19 및 21 모두, 서열번호 3 내지 8 및 23 및 24 모두, 서열번호 3 내지 8 및 23 및 25 모두, 서열번호 9 및 10 및 14 및 15 모두, 서열번호 9 및 10 및 16 및 18 모두, 서열번호 9 및 10 및 17 및 19 모두, 서열번호 9 및 10 및 19 및 21 모두, 서열번호 9 및 10 및 23 및 24 모두, 서열번호 9 및 10 및 23 및 25 모두, 서열번호 9, 11, 및 14 및 15 모두, 서열번호 9, 11, 및 16 및 18 모두, 서열번호 9, 11, 및 17 및 19 모두, 서열번호 9, 11, 및 19 및 21 모두, 서열번호 9, 11, 및 23 및 24 모두, 또는 서열번호 9, 11, 및 23 및 25 모두를 포함할 수 있다. 서열번호 16 및 18은 본 발명의 다른 양태와 관련하여 본원에 기술된 바와 같이 치환될 수 있다. 한 태양에서, (i) 서열번호 9 및 14, 및 (ii) 서열번호 11 및 15 중 하나 또는 둘 다의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 단리되거나 정제된다.
본 발명의 한 태양에서, 본 발명의 폴리펩티드는 본원에 기술된 TCR 또는 그의 기능성 변이체 중 하나의 전체 길이의 α 또는 β쇄를 포함할 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 폴리펩티드는 (i) 서열번호 12, 13, 20, 22, 26, 27, 29, 30 중 어느 하나; (ii) 서열번호 9, 24 및 27; (iii) 서열번호 9, 17 및 20; 또는 (iv) 서열번호 9, 10, 16 및 18의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 서열번호 16 및 18은 본 발명의 다른 양태와 관련하여 본원에 기술된 바와 같이 치환될 수 있다.
또는, 본 발명의 폴리펩티드는 본원에 기술된 TCR 또는 그의 기능성 변이체의 α 또는 β쇄를 포함할 수 있다. 예를 들면, 본 발명의 폴리펩티드는 서열번호 12 및 13 둘 다; 서열번호 20 및 22 둘 다; 서열번호 26 및 27 둘 다; 서열번호 9, 24, 및 27 모두; 서열번호 9, 17, 및 20 모두; 또는 서열번호 9, 10, 16, 및 18 모두의 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 바람직하게, 상기 폴리펩티드는 서열번호 12 및 13 둘 다; 서열번호 20 및 22 둘 다; 서열번호 26 및 27 둘 다; 서열번호 9, 24, 및 27 모두; 서열번호 9, 17, 및 20 모두; 또는 서열번호 9, 10, 16, 및 18 모두의 아미노산 서열을 포함한다. 서열번호 16 및 18은 본 발명의 다른 양태와 관련하여 본원에 기술된 바와 같이 치환될 수 있다. 한 태양에서, 서열번호 12 및 13 중 하나 또는 둘 다의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드는 단리되거나 정제된다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 폴리펩티드들중 하나 이상을 포함하는 단백질을 제공한다. "단백질"은 하나 이상의 폴리펩티드쇄를 포함하는 분자를 의미한다. 한 태양에서, (a) 서열번호 9 및 서열번호 10(이때, 서열번호 10의 위치 2에서의 X는 Gly이다)의 아미노산 서열 중 하나 또는 둘 다, 또는 (b) 서열번호 12 및 13 중 하나 또는 둘 다를 포함하는 단백질은 단리되거나 정제된다.
한 태양에서, 본 발명의 단백질은 서열번호 3 내지 5의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드쇄, 및 서열번호 6 내지 8의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드쇄를 포함할 수 있다. 다르게는 또는 추가적으로, 본 발명의 단백질은 서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드쇄 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드쇄를 포함할 수 있으며, 이때, (i) 서열번호 10의 위치 2에서의 X는 Ala 또는 Gly이고, (ii) 서열번호 9 및 10(이때 서열번호 10의 위치 2에서의 X는 Gly이다)을 포함하는 단백질은 단리되거나 정제된다. 단백질은, 예를 들면, (i) 서열번호 12, (ii) 서열번호 22, (iii) 서열번호 26, (iv) 서열번호 9 및 16, (v) 서열번호 9 및 17, 또는 (vi) 서열번호 9 및 24의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드쇄, 및 (i) 서열번호 10 및 18, 또는 (ii) 서열번호 13, 20 및 27 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드쇄를 포함할 수 있으며, 이때 서열번호 12 및 13을 포함하는 단백질은 단리되거나 정제되고, 서열번호 16 및 18은 본 발명의 다른 양태들과 관련하여 본원에 기술된 바와 같이 치환된다. 이 경우, 본 발명의 단백질은 TCR일 수 있다. 또는, 예를 들면, 단백질이 서열번호 12 및 13 둘 다, 서열번호 20 및 22 둘 다, 서열번호 26 및 27, 서열번호 9, 10, 16 및 18 모두, 서열번호 9, 17 및 20 모두, 서열번호 9, 24 및 27 모두를 포함하는 단일 폴리펩티드쇄를 포함하는 경우, 또는 상기 단백질의 제 1 및/또는 제 2 폴리펩티드쇄(들)가 다른 아미노산 서열, 예를 들면, 면역글로불린 또는 그의 일부를 암호화하는 아미노산 서열을 포함하는 경우, 본 발명의 단백질은 융합 단백질일 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명은 또한 1개 이상의 다른 폴리펩티드와 함께 본원에 기술된 본 발명의 폴리펩티드를 1개 이상 포함하는 융합 단백질을 제공한다. 상기 다른 폴리펩티드는 융합 단백질의 별개의 폴리펩티드로서 존재할 수 있거나, 본원에 기술된 본 발명의 폴리펩티드 중 하나와 동시에(나란히) 발현되는 폴리펩티드로서 존재할 수 있다. 상기 다른 폴리펩티드는, 면역글로불린, CD3, CD4, CD8, MHC 분자, CD1 분자, 예를 들면, CD1a, CD1b, CD1c, CD1d 등을 포함한(이로 한정되지는 않는다) 임의의 펩티드 또는 단백질성 분자 또는 그의 일부를 암호화할 수 있다.
융합 단백질은 본 발명 폴리펩티드의 하나 이상의 복제물 및/또는 다른 폴리펩티드의 하나 이상의 복제물을 포함할 수 있다. 예를 들면, 융합 단백질은 1, 2, 3, 4, 5개 이상의 본 발명 폴리펩티드의 복제물 및/또는 다른 폴리펩티드의 복제물을 포함할 수 있다. 융합 단백질을 제조하는 적합한 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 재조합 방법을 포함한다(예를 들면, 문헌 [Choi et al., Mol . Biotechnol. 31: 193-202 (2005)] 참조).
본 발명의 일부 태양에서, 본 발명의 TCR(및 그의 기능성 부분 및 기능성 변이체), 폴리펩티드 및 단백질은 α쇄 및 β쇄를 연결하는 링커 펩티드를 포함하는 단일 단백질로서 발현될 수 있다. 이와 관련하여, 서열번호 12 및 13 둘 다, 서열번호 20 및 22 둘 다, 서열번호 26 및 27, 서열번호 9, 10, 16 및 18 모두, 서열번호 9, 17 및 20 모두, 서열번호 9, 24 및 27 모두를 포함하는 본 발명의 TCR(및 그의 기능성 부분 및 기능성 변이체), 폴리펩티드 및 단백질은 또한 링커 펩티드를 포함할 수 있다. 링커 펩티드는 유리하게 숙주 세포에서 재조합 TCR(그의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함), 폴리펩티드 및/또는 단백질의 발현을 촉진할 수 있다. 링커 펩티드는 임의의 적합한 아미노산 서열을 포함할 수 있다. 예를 들면, 링커 펩티드는 서열번호 28을 포함할 수 있다. 본 발명의 한 태양에서, 알파쇄, 베타쇄 및 링커를 포함하는 단백질은 서열번호 29(LVL-변형된 키메라 TCR) 또는 서열번호 30(Cys-치환된, LVL-변형된 키메라 TCR)을 포함할 수 있다. 숙주 세포에 의한, 링커 펩티드를 포함하는 구조물의 발현시, 링커 펩티드는 절단되어, 분리된 α 및 β쇄를 제공할 수 있다.
본 발명의 단백질은 본원에 기술된 본 발명의 폴리펩티드를 1개 이상 포함하는 재조합 항체일 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같이, "재조합 항체"는 1개 이상의 본 발명의 폴리펩티드 및 항체의 폴리펩티드쇄 또는 그의 일부를 포함하는 재조합(예를 들면, 유전자 조작된) 단백질을 말한다. 항체의 폴리펩티드 또는 그의 일부는 항체의 중쇄, 경쇄, 중쇄 또는 경쇄의 가변 또는 불변 영역, 단일쇄 가변 단편(scFv), 또는 Fc, Fab 또는 F(ab)2' 단편 등일 수 있다. 항체의 폴리펩티드쇄 또는 그의 일부는 재조합 항체의 별개의 폴리펩티드로서 존재할 수 있다. 또는, 항체의 폴리펩티드쇄 또는 그의 일부는 본 발명의 폴리펩티드와 동시에(나란히) 발현되는 폴리펩티드로서 존재할 수 있다. 항체의 폴리펩티드 또는 그의 일부는 본원에 기술된 임의의 항체 및 항체 단편을 포함하여 임의의 항체 또는 임의의 항체 단편의 폴리펩티드일 수 있다.
본 발명의 TCR, 폴리펩티드 및 단백질(그의 기능성 변이체 포함)은 임의의 길이를 가질 수 있다. 즉, 임의의 수의 아미노산을 포함할 수 있으나, TCR, 폴리펩티드 또는 단백질(또는 그의 기능성 변이체)은 그의 생물 활성, 예를 들면, HPV 16 E7에 특이적으로 결합하거나; 포유동물에서 암, HPV 16 감염 또는 HPV-양성 전암을 검출하거나; 포유동물에서 암, HPV 16 감염 또는 HPV-양성 전암을 치료하거나 예방하는 등의 능력을 보유하여야 한다. 예를 들면, 상기 폴리펩티드는 길이가 약 50 내지 약 5,000개 아미노산 범위의 길이, 예를 들면, 50, 70, 75, 100, 125, 150, 175, 200, 300, 400, 500, 600, 700, 800, 900, 1,000 개 이상의 아미노산일 수 있다.
본 발명의 TCR, 폴리펩티드 및 단백질(그의 기능성 변이체 포함)은 하나 이상의 천연 아미노산 대신 합성 아미노산을 포함할 수 있다. 상기 합성 아미노산은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 아미노사이클로헥산 카복실산, 노르류신, α-아미노 n-데카노산, 호모세린, S-아세틸아미노메틸-시스테인, 트랜스-3- 및 트랜스-4-하이드록시프롤린, 4-아미노페닐알라닌, 4-니트로페닐알라닌, 4-클로로페닐알라닌, 4-카복시페닐알라닌, β-페닐세린 β-하이드록시페닐알라닌, 페닐글리신, α-나프틸알라닌, 사이클로헥실알라닌, 사이클로헥실글리신, 인돌린-2-카복실산, 1,2,3,4-테트라하이드로이소퀴놀린-3-카복실산, 아미노말론산, 아미노말론산 모노아미드, N'-벤질-N'-메틸-라이신, N',N'-다이메틸-라이신, 6-하이드록시라이신, 오르니틴, α-아미노사이클로펜탄 카복실산, α-아미노사이클로헥산 카복실산, α-아미노사이클로헵탄 카복실산, α-(2-아미노-2-노르보난)-카복실산, α,γ-다이아미노부티르산, α,β-다이아미노프로피온산, 호모페닐알라닌 및 α-3급-부틸글리신을 포함한다.
본 발명의 TCR, 폴리펩티드 및 단백질(그의 기능성 변이체 포함)은 글리코실화되거나, 아미드화되거나, 카복실화되거나, 포스포릴화되거나, 에스터화되거나, N-아실화되거나, 예를 들면, 다이설파이드 가교를 통해 환화되거나, 산 부가염으로 전환되고/되거나, 선택적으로 이량체화 또는 중합되거나, 공액화될 수 있다.
본 발명의 TCR, 폴리펩티드 및/또는 단백질(그의 기능성 변이체 포함)은 당해 분야에 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다. 폴리펩티드 및 단백질을 데노보(de novo) 합성하는 적합한 방법은 문헌 [Chan et al., Fmoc Solid Phase Peptide Synthesis, Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2005; Peptide and Protein Drug Analysis, ed. Reid, R., Marcel Dekker, Inc., 2000; Epitope Mapping, ed. Westwood et al., Oxford University Press, Oxford, United Kingdom, 2000]; 및 미국 특허 제 5,449,752 호와 같은 참조문헌에 기술되어 있다. 또한, 폴리펩티드 및 단백질은 표준 재조합 방법을 이용하여 본원에 기술된 핵산을 사용하여 재조합적으로 생성될 수 있다(예를 들면, 문헌 [Green and Sambrook, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 4th ed., Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, NY 2012; and Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons, NY, 1994] 참조). 또한, 본 발명의 TCR, 폴리펩티드 및 단백질(그의 기능성 변이체 포함)의 일부는 식물, 세균, 곤충, 포유동물, 예를 들면, 래트, 인간 등과 같은 공급원으로부터 단리되고/되거나 정제될 수 있다. 단리 및 정제 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 또한, 본원에 기술된 TCR, 폴리펩티드 및/또는 단백질(그의 기능성 변이체 포함)은 신펩(Synpep)(미국 캘리포니아주 더블린), 펩티드 테크놀로지스 코포레이션(Peptide Technologies Corp.)(미국 메릴랜드주 게이터스버그), 및 멀티플 펩티드 시스템즈(Multiple Peptide Systems)(미국 캘리포니아주 샌디에이고)와 같은 회사들에서 상업적으로 합성될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명의 TCR(그의 기능성 변이체 포함), 폴리펩티드 및 단백질은 합성되거나, 재조합체이거나, 단리되고/되거나 정제될 수 있다.
본 발명의 범위에는 임의의 본 발명의 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질(그의 임의의 기능성 변이체 포함)을 포함하는 접합체, 예를 들면, 생물접합체, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 숙주 세포 집단, 또는 항체 또는 그의 항원 결합 부분이 포함된다. 접합체뿐 아니라 일반적으로 접합체를 합성하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 문헌 [Hudecz, F., Methods Mol . Biol . 298: 209-223 (2005) and Kirin et al., Inorg Chem. 44(15): 5405-5415 (2005)] 참조).
본 발명의 한 태양은 본원에 기술된 임의의 TCR(그의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함), 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열을 제공한다. 본원에서 사용된 바와 같은 "핵산"은 "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드" 및 "핵산 분자"를 포함하며, 일반적으로, 단일-가닥 또는 이중-가닥의, 합성되거나 천연 공급원으로부터 수득(예를 들면, 단리 및/또는 정제)될 수 있고 천연, 비-천연 또는 변이된 뉴클레오티드를 함유할 수 있고 비변형된 올리고뉴클레오티드의 뉴클레오티드들 사이에서 발견되는 포스포다이에스터 대신에 천연, 비-천연 또는 변이된 뉴클레오티드간 결합, 예를 들면, 포스포로아미데이트 결합 또는 포스포로티오에이트 결합을 함유할 수 있는 DNA 또는 RNA의 중합체를 의미한다. 한 태양에서, 핵산은 상보성 DNA(cDNA)를 포함한다. 일반적으로, 핵산은 임의의 삽입, 결실, 역위 및/또는 치환을 포함하지 않는 것이 바람직하다. 그러나, 일부 경우에서, 본원에서 논의된 바와 같이, 핵산이 하나 이상의 삽입, 결실, 역위 및/또는 치환을 포함하는 것이 적절할 수도 있다.
바람직하게, 본 발명의 핵산은 재조합체이다. 본원에서 사용된 용어 "재조합체"는 (i) 천연 또는 합성 핵산 절편들을 살아있는 세포에서 복제될 수 있는 핵산 분자에 결합시킴으로써 살아있는 세포 밖에서 구성되는 분자, 또는 (ii) 상기 (i)에서 기술된 분자들의 복제로부터 생성되는 분자를 말한다. 본원에 있어서, 복제는 시험관내 복제 또는 생체내 복제일 수 있다.
핵산은 당해 분야에 공지된 절차를 이용하여 화학적 합성 및/또는 효소적 접합 반응에 기초하여 구성될 수 있다(예를 들면, 그린 및 샘브룩(Green and Sambrook) 등의 상기 문헌 및 오스벨(Ausubel) 등의 상기 문헌 참조). 예를 들면, 핵산은, 천연 뉴클레오티드, 또는 분자의 생물학적 안정성을 증가시키거나 하이브리드화시 생성되는 이중체의 물리적 안정성을 증가시키도록 설계된 다양하게 변형된 뉴클레오티드(예를 들면, 포스포로티오에이트 유도체 및 아크리딘 치환된 뉴클레오티드)를 사용하여 화학적으로 합성될 수 있다. 핵산을 생성하기 위해 사용될 수 있는 변형된 뉴클레오티드의 예로는 5-플루오로우라실, 5-브로모우라실, 5-클로로우라실, 5-요오도우라실, 하이포잔틴, 잔틴, 4-아세틸시토신, 5-(카복시하이드록시메틸) 우라실, 5-카복시메틸아미노메틸-2-티오우리딘, 5-카복시메틸아미노메틸우라실, 다이하이드로우라실, 베타-D-갈락토실쿼신, 이노신, N6-이소펜테닐아데닌, 1-메틸구아닌, 1-메틸이노신, 2,2-다이메틸구아닌, 2-메틸아데닌, 2-메틸구아닌, 3-메틸시토신, 5-메틸시토신, N6-치환된 아데닌, 7-메틸구아닌, 5-메틸아미노메틸우라실, 5-메톡시아미노메틸-2-티오우라실, 베타-D-만노실쿼신, 5'-메톡시카복시메틸우라실, 5-메톡시우라실, 2-메틸티오-N6-이소펜테닐아데닌, 우라실-5-옥시아세트산(v), 위부톡소신, 슈도우라실, 쿼신(queosine), 2-티오시토신, 5-메틸-2-티오우라실, 2-티오우라실, 4-티오우라실, 5-메틸우라실, 우라실-5-옥시아세트산 메틸에스터, 3-(3-아미노-3-N-2-카복시프로필) 우라실 및 2,6-다이아미노퓨린이 포함되나, 이로 한정되지는 않는다. 또는, 본 발명의 핵산들 중 하나 이상은 마크로몰레큘라 리소시즈(Macromolecular Resources)(미국 콜로라도주 포트 콜린스) 및 신테겐(Synthegen)(미국 텍사스주 휴스턴)과 같은 회사로부터 구입할 수 있다.
핵산은 본원에 기술된 임의의 TCR, 폴리펩티드, 단백질 또는 그의 기능성 변이체를 암호화하는 임의의 뉴클레오티드 서열을 포함할 수 있다. 본 발명의 한 태양에서, 상기 뉴클레오티드 서열은 서열번호 31(인간, 야생형 TCR의 알파쇄), 서열번호 32(인간, 야생형 TCR의 베타쇄), 서열번호 33(LVL-변형된 키메라 TCR의 알파쇄), 서열번호 34(키메라 TCR의 베타쇄), 서열번호 35(Cys-치환된, LVL-변형된 키메라 TCR의 알파쇄), 서열번호 36(Cys-치환된 키메라 TCR의 베타쇄), 서열번호 31 및 32 둘 다, 서열번호 33 및 34 둘 다, 또는 서열번호 35 및 36 둘 다 중 어느 하나를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 필수적으로 그로 이루어질 수 있다.
본 발명의 한 태양에서, 핵산은 비-천연 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 뉴클레오티드 서열이 자연에서 발견되지 않는 경우, 상기 뉴클레오티드 서열은 "비-천연"인 것으로 간주될 수 있다. 일부 태양에서, 뉴클레오티드 서열은 코돈-최적화될 수 있다. 특정 이론 또는 메카니즘에 결부되지 않고, 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화는 mRNA 전사체의 번역 효율을 증가시키는 것으로 생각된다. 뉴클레오티드 서열의 코돈 최적화는, 천연 코돈을 동일한 아미노산을 암호화하지만 세포내에서 보다 용이하게 이용가능한 tRNA에 의해 번역될 수 있는 또 다른 코돈으로 치환시키는 것을 수반함으로써, 번역 효율을 증가시킬 수 있다. 뉴클레오티드 서열의 최적화는 또한 번역을 저해하는 2차 mRNA 구조물을 감소시킴으로써, 번역 효율을 증가시킬 수 있다. 본 발명의 한 태양에서, 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열은 서열번호 33 내지 36 중 어느 하나, 서열번호 33 및 34 둘 다, 또는 서열번호 35 및 36 둘 다를 포함하거나, 그로 이루어지거나, 필수적으로 그로 이루어질 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 상보적인 뉴클레오티드 서열, 또는 엄격한 조건하에서 본원에 기술된 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열에 하이브리드화되는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
엄격한 조건하에서 하이브리드화되는 뉴클레오티드 서열은 바람직하게는 고엄격성 조건하에서 하이브리드화된다. "고엄격성 조건"은 뉴클레오티드 서열이 비-특이적 하이브리드화보다 검출가능하게 더 강한 양으로 표적 서열(본원에 기술된 임의의 핵산의 뉴클레오티드 서열)에 특이적으로 하이브리드화되는 것을 의미한다. 고엄격성 조건은, 정확한 상보성 서열을 갖는 폴리뉴클레오티드 또는 소수의 산재해 있는 미스매치만을 함유하는 폴리뉴클레오티드를, 뉴클레오티드 서열과 매치된 소수의 소영역(예를 들면, 3 내지 10개 염기)을 갖게 된 랜덤 서열과 구별하는 조건을 포함한다. 상보성을 갖는 상기 소영역들은 14 내지 17개 이상의 염기를 갖는 전장 보체보다 더 용이하게 용융되며, 고엄격성 하이브리드화는 이들을 용이하게 구별할 수 있게 한다. 비교적 고엄격성 조건은, 예를 들면, 약 50 내지 70 ℃의 온도에서 약 0.02 내지 0.1 M NaCl 또는 등가물에 의해 제공되는 바와 같은 저염 및/또는 고온 조건을 포함한다. 상기 고엄격성 조건은, 뉴클레오티드 서열과 주형 또는 표적 가닥 사이의, 있다 해도 소수의 미스매치를 용인하며, 임의의 본 발명의 TCR(그의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함)의 발현을 검출하기에 특히 적합하다. 일반적으로 조건은 증가하는 양의 포름아미드의 첨가에 의해 더 엄격해질 수 있는 것으로 이해된다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 임의의 핵산과 적어도 약 70% 이상, 예를 들면, 약 80%, 약 90%, 약 91%, 약 92%, 약 93%, 약 94%, 약 95%, 약 96%, 약 97%, 약 98%, 또는 약 99% 동일한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산을 제공한다.
본 발명의 핵산은 재조합 발현 벡터내에 혼입될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명은 본 발명의 임의의 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다. 본 발명의 한 태양에서, 재조합 발현 벡터는 α쇄, β쇄 및 링커 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함한다. 예를 들면, 한 태양에서, 재조합 발현 벡터는 서열번호 39(그 사이에 위치한 링커와 함께 서열번호 20 및 22의 키메라 α 및 β쇄를 암호화, 이때 베타쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 알파쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치한다) 또는 서열번호 40(그 사이에 위치한 링커와 함께 서열번호 26 및 27의 키메라 α 및 β쇄를 암호화, 이때 베타쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 알파쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치한다)을 포함하는 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열을 포함한다.
본원에 있어서, 용어 "재조합 발현 벡터"는, 구조물이 mRNA, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하고 벡터가 세포내에서 발현된 mRNA, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드를 갖기에 충분한 조건하에서 세포와 접촉될 때, 숙주 세포에 의한 mRNA, 단백질, 폴리펩티드 또는 펩티드의 발현을 허용하는 유전자-변형된 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드 구조물을 의미한다. 본 발명의 벡터는 전체로서는 천연이 아니다. 그러나, 벡터의 일부는 천연일 수 있다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는, 단일-가닥 또는 이중-가닥의, 합성되거나 부분적으로 천연 공급원으로부터 수득될 수 있고 천연, 비-천연 또는 변이된 뉴클레오티드를 함유할 수 있는 DNA 및 RNA를 포함하여(이로 한정되지는 않는다) 임의 유형의 뉴클레오티드를 포함할 수 있다. 재조합 발현 벡터는 천연, 비-천연 뉴클레오티드간 결합, 또는 두 유형의 결합 모두를 포함할 수 있다. 바람직하게, 비-천연 또는 변이된 뉴클레오티드 또는 뉴클레오티드간 결합은 벡터의 전사 또는 복제를 저해하지 않는다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 임의의 적합한 재조합 발현 벡터일 수 있으며, 임의의 적절한 숙주 세포를 형질전환시키거나 형질감염시키기 위해 사용될 수 있다. 적절한 벡터는 증식 및 증폭을 위해 또는 발현을 위해 또는 둘 다를 위해 설계된 벡터들, 예를 들면, 플라스미드 및 바이러스를 포함한다. 벡터는 pUC 시리즈(퍼멘타스 라이프 사이언시즈(Fermentas Life Sciences)), pBluescript 시리즈(스트라테이진(Swtratagene), 미국 캘리포니아주 라졸라), pET 시리즈(노바겐(Novagen), 미국 위스콘신주 매디슨), pGEX 시리즈(파마시아 바이오테크(Pharmacia Biotech), 스웨덴 웁살라), 및 pEX 시리즈(클론테크(Clontech), 미국 캘리포니아주 팔로 알토)로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 박테리오파지 벡터, 예를 들면, λGT10, λGT11, λZapII(스트라테이진), λEMBL4, 및 λNM1149도 또한 사용될 수 있다. 식물 발현 벡터의 예로는 pBI01, pBI101.2, pBI101.3, pBI121 및 pBIN19(클론테크)가 포함된다. 동물 발현 벡터의 예로는 pEUK-Cl, pMAM 및 pMAMneo(클론테크)가 포함된다. 바람직하게, 재조합 발현 벡터는 바이러스 벡터, 예를 들면, 레트로바이러스 벡터이다. 특히 바람직한 태양에서, 재조합 발현 벡터는 MSGV1 벡터이다.
바람직한 태양에서, 재조합 발현 벡터는 본원에 기술된 임의의 TCR(그의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함)의 알파쇄 및 베타쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하며, 이때 베타쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 알파쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치한다. 이와 관련하여, 알파쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 베타쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치할 수 있다. 특정 이론 또는 메카니즘에 결부되지 않고, 알파쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치한 베타쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은, 알파쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한 베타쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 비해, HPV 16 E7+ 표적의 증가된 인식, 숙주 세포에 의한 증가된 발현, 및 증가된 항-종양 활성 중 임의의 하나 이상을 제공할 수 있는 것으로 생각된다. 덜 바람직한 태양에서, 베타쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 알파쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 3'에 위치한다. 이와 관련하여, 알파쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 베타쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치할 수 있다. 한 태양에서, 본 발명의 서열번호 20 및 22를 포함하는 LVL-변형된 키메라 TCR을 암호화하는 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 MSGV1 벡터(이때, 베타쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 알파쇄를 암호화하는 뉴클레오티드의 5'에 위치한다)는 서열번호 37을 포함한다. 또 다른 태양에서, 본 발명의 서열번호 26 및 27을 포함하는 Cys-치환된, LVL-변형된 키메라 TCR을 암호화하는 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열을 포함하는 MSGV1 벡터(이때, 베타쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열은 알파쇄를 암호화하는 뉴클레오티드의 5'에 위치한다)는 서열번호 38을 포함한다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는, 예를 들면, 그린 및 샘브룩(Green and Sambrook) 등의 상기 문헌 및 오스벨(Ausubel) 등의 상기 문헌에 기술된 표준 재조합 DNA 기술을 이용하여 제조할 수 있다. 원형 또는 선형인 발현 벡터의 구조물은 원핵 또는 진핵 숙주 세포에서 기능성인 복제 시스템을 함유하도록 제조될 수 있다. 복제 시스템은, 예를 들면, ColE1, 2 μ 플라스미드, λ, SV40, 소 유두종바이러스 등으로부터 유도될 수 있다.
바람직하게, 재조합 발현 벡터는, 적절한 대로 및 벡터가 DNA- 또는 RNA-기반인지를 고려하여, 그중에 벡터가 도입될 숙주 세포의 유형(예를 들면, 세균, 진균, 식물 또는 동물)에 특이적인 조절 서열, 예를 들면, 전사 및 번역 개시 및 종료 코돈을 포함한다.
재조합 발현 벡터는, 형질전환되거나 형질감염된 숙주 세포의 선택을 가능하게 하는 마커 유전자를 하나 이상 포함할 수 있다. 마커 유전자는 살생물제 내성, 예를 들면, 항생물질, 중금속 등에 대한 내성, 원영양성을 제공하기 위한 영양요구성 숙주 세포에서의 상보성 등을 포함한다. 본 발명의 발현 벡터에 적절한 마커 유전자는, 예를 들면, 네오마이신/G418 내성 유전자, 하이그로마이신 내성 유전자, 히스티디놀 내성 유전자, 테트라사이클린 내성 유전자 및 암피실린 내성 유전자를 포함한다.
재조합 발현 벡터는, TCR, 폴리펩티드 또는 단백질(그의 기능성 변이체 포함)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에, 또는 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질(그의 기능성 변이체 포함)을 암호화하는 뉴클레오티드 서열에 상보성이거나 그에 하이브리드화되는 뉴클레오티드 서열에 작동가능하게 연결된 천연 또는 비천연 프로모터를 포함할 수 있다. 예를 들면, 강한, 약한, 유도성, 조직-특이성 및 발달-특이적인 프로모터의 선택은 전문가의 통상의 기술내에 속한다. 유사하게, 뉴클레오티드 서열과 프로모터의 결합도 또한 전문가의 기술내에 속한다. 프로모터는 비-바이러스 프로모터 또는 바이러스 프로모터, 예를 들면, 사이토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, SV40 프로모터, RSV 프로모터, 및 뮤린 줄기세포 바이러스의 긴-말단 반복서열에서 발견되는 프로모터일 수 있다.
본 발명의 재조합 발현 벡터는 일시적 발현을 위해, 안정한 발현을 위해, 또는 둘 다를 위해 설계될 수 있다. 또한, 재조합 발현 벡터는 구성적 발현을 위해 또는 유도성 발현을 위해 제조될 수 있다. 또한, 재조합 발현 벡터는 자살 유전자를 포함하도록 제조될 수 있다.
본원에서 사용된 용어 "자살 유전자"는 자살 유전자를 발현하는 세포가 사멸하도록 야기하는 유전자를 말한다. 자살 유전자는, 유전자가 발현되는 세포에 약제, 예를 들면, 약물에 대한 민감성을 제공하고, 세포가 약제와 접촉하거나 약제에 노출시 세포가 사멸하도록 야기하는 유전자일 수 있다. 자살 유전자는 당해 분야에 공지되어 있으며(예를 들면, 문헌 [Suicide Gene Therapy: Methods and Reviews, Springer, Caroline J. (Cancer Research UK Centre for Cancer Therapeutics at the Institute of Cancer Research, Sutton, Surrey, UK), Humana Press, 2004] 참조), 예를 들면, 단순 포진 바이러스(Herpes Simplex Virus, HSV) 티미딘 키나제(TK) 유전자, 시토신 디아미나제, 퓨린 뉴클레오시드 포스포릴라제 및 니트로리덕타제를 포함한다.
본 발명의 또 다른 태양은 또한 본원에 기술된 임의의 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 제공한다. 본원에서 사용된 용어 "숙주 세포"는 본 발명의 재조합 발현 벡터를 함유할 수 있는 임의 유형의 세포를 말한다. 숙주 세포는 진핵 세포, 예를 들면, 식물, 동물, 진균 또는 조류(algae)일 수 있거나, 원핵 세포, 예를 들면, 세균 또는 원생동물일 수 있다. 숙주 세포는 배양된 세포 또는 1차 세포, 즉 유기체, 예를 들면, 인간으로부터 직접 단리된 세포일 수 있다. 숙주 세포는 부착 세포 또는 현탁 세포, 즉, 현탁 상태로 성장하는 세포일 수 있다. 적절한 숙주 세포는 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, DH5α 에스케리치아 콜라이(Escherichia coli) 세포, 차이니즈 햄스터 난소 세포, 원숭이 VERO 세포, COS 세포, HEK293 세포 등을 포함한다. 재조합 발현 벡터를 증폭시키거나 복제하기 위해, 숙주 세포는 바람직하게는 원핵 세포, 예를 들면, DH5α 세포이다. 재조합 TCR, 폴리펩티드 또는 단백질을 생성하기 위해, 숙주 세포는 바람직하게는 포유동물 세포이다. 가장 바람직하게, 숙주 세포는 인간 세포이다. 숙주 세포는 임의의 세포 유형일 수 있고, 임의 유형의 조직으로부터 기원할 수 있고, 임의의 발달 상태의 세포일 수 있지만, 숙주 세포는 바람직하게는 말초혈 림프구(PBL) 또는 말초혈 단핵세포(PBMC)이다. 보다 바람직하게, 숙주 세포는 T 세포이다.
본원에 있어서, T 세포는 임의의 T 세포, 예를 들면, 배양된 T 세포, 예를 들어, 1차 T 세포 또는 배양된 T 세포주, 예를 들어, Jurkat, SupT1 등으로부터의 T 세포, 또는 포유동물로부터 수득된 T 세포일 수 있다. 포유동물로부터 수득되는 경우, T 세포는 혈액, 골수, 림프절, 흉선 또는 다른 조직 또는 유체를 포함한(이로 한정되지는 않는다) 수많은 공급원으로부터 수득될 수 있다. T 세포는 또한 농축되거나 정제될 수 있다. 바람직하게, T 세포는 인간 T 세포이다. 보다 바람직하게, T 세포는 인간으로부터 단리된 T 세포이다. T 세포는 임의 유형의 T 세포일 수 있으며, CD4+/CD8+ 이중 양성 T 세포, CD4+ 헬퍼 T 세포, 예를 들면, Th1 및 Th2 세포, CD4+ T 세포, CD8+ T 세포(예를 들면, 세포독성 T 세포), 종양 침윤 림프구(TIL), 메모리 T 세포(예를 들면, 중추 메모리 T 세포 및 효과기 메모리 T 세포), 미접촉(naive) T 세포 등을 포함하여(이로 한정되지는 않는다) 임의의 발달 단계의 세포일 수 있다.
또한, 본 발명에 의해 본원에 기술된 하나 이상의 숙주 세포를 포함하는 세포 집단이 제공된다. 세포 집단은, 임의의 재조합 발현 벡터를 포함하지 않는 1개 이상의 다른 세포, 예를 들면, 숙주 세포(예, T 세포), 또는 T 세포 이외의 다른 세포, 예를 들면, B 세포, 대식세포, 호중구, 적혈구, 간세포, 내피세포, 상피세포, 근세포, 뇌세포 등 이외에, 임의의 기술된 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함하는 이종 집단일 수 있다. 또는, 세포 집단은 실질적으로, 집단이 재조합 발현 벡터를 포함하는(예를 들면, 필수적으로 그로 이루어지는) 숙주 세포를 주로 포함하는 동종 집단일 수 있다. 상기 집단은 또한, 집단의 모든 세포가 재조합 발현 벡터를 포함하도록, 집단의 모든 세포가 재조합 발현 벡터를 포함하는 단일 숙주 세포의 클론인, 세포들의 클론성 집단일 수 있다. 본 발명의 한 태양에서, 세포들의 집단은 본원에 기술된 바와 같은 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포를 포함하는 클론성 집단이다.
본 발명의 한 태양에서, 집단내 세포들의 수는 급속하게 증폭될 수 있다. T 세포의 수의 증폭은, 예를 들면, 미국 특허 제 8,034,334 호; 미국 특허 제 8,383,099 호; 미국 특허출원공개 제 2012/0244133 호; 문헌 [Dudley et al., J. Immunother., 26:332-42 (2003); and Riddell et al., J. Immunol . Methods, 128:189-201 (1990)]에 기술된 바와 같이 당해 분야에 공지된 바와 같은 임의의 많은 방법에 의해 달성될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 임의의 TCR(또는 그의 기능성 변이체)의 기능성 부분에 특이적으로 결합하는 항체, 또는 그의 항원 결합 부분을 제공한다. 바람직하게, 기능성 부분, 예를 들면, 아미노산 서열 서열번호 3(α쇄의 CDR1), 4(α쇄의 CDR2), 5(α쇄의 CDR3), 6(β쇄의 CDR1), 7(β쇄의 CDR2), 8(β쇄의 CDR3), 서열번호 9(α쇄의 가변 영역), 서열번호 10(β쇄의 가변 영역), 서열번호 11(β쇄의 가변 영역), 또는 그의 조합, 예를 들면, 3 내지 5; 6 내지 8; 3 내지 8; 9; 10; 11; 9 및 10; 또는 9 및 11을 포함하는 기능성 부분은 암 항원에 특이적으로 결합한다. 보다 바람직하게, 기능성 부분은 서열번호 3 내지 8; 서열번호 9 및 10; 또는 서열번호 9 및 11의 아미노산 서열을 포함한다. 바람직한 태양에서, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은, 6개 CDR 모두(알파쇄의 CDR1-3 및 베타쇄의 CDR1-3)에 의해 생성된 에피토프에 결합한다. 항체는 당해 분야에 공지된 임의 유형의 면역글로불린일 수 있다. 예를 들면, 항체는 임의의 이소타입, 예를 들면, IgA, IgD, IgE, IgG, IgM 등을 가질 수 있다. 항체는 단클론성 또는 다클론성일 수 있다. 항체는 천연 항체, 예를 들면, 포유동물, 예를 들어, 마우스, 토끼, 염소, 말, 닭, 햄스터, 인간 등으로부터 단리 및/또는 정제된 항체일 수 있다. 또는, 항체는 유전자-조작된 항체, 예를 들면, 인간화 항체 또는 키메라 항체일 수 있다. 항체는 단량체 또는 중합체 형태일 수 있다. 또한, 항체는 본 발명의 TCR(또는 그의 기능성 변이체)의 기능성 부분에 대해 임의 수준의 친화도 또는 결합활성을 가질 수 있다. 바람직하게, 항체는, 다른 펩티드 또는 단백질과 최소 교차-반응이 존재하도록, 본 발명의 TCR(또는 그의 기능성 변이체)의 기능성 부분에 대해 특이적이다.
본 발명의 TCR의 임의의 기능성 부분 또는 기능성 변이체에 결합하는 능력에 대해 항체를 시험하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 임의의 항체-항원 결합 분석법, 예를 들면, 방사성면역분석법(RIA), ELISA, 웨스턴 블롯(Western blot), 면역침전법 및 경쟁성 억제 분석법을 포함한다(예를 들면, 하기의 제인웨이(Janeway) 등의 문헌 및 미국 특허출원공개 제 2002/0197266 A1 호 참조).
항체를 제조하는 적절한 방법은 당해 분야에 공지되어 있다. 예를 들면, 표준 하이브리드화 방법은, 예를 들면, 문헌 [Kohler and Milstein, Eur . J. Immunol., 5, 511-519 (1976), Harlow and Lane (eds.), Antibodies: A Laboratory Manual, CSH Press (1988), and C.A. Janeway et al. (eds.), Immunobiology, 8th Ed., Garland Publishing, New York, NY (2011)]에 기술되어 있다. 또한, EBV-하이브리도마 방법[Haskard and Archer, J. Immunol . Methods, 74(2), 361-67 (1984), and Roder et al., Methods Enzymol., 121, 140-67 (1986)], 및 박테리오파지 벡터 발현 시스템(예를 들면, 문헌 [Science, 246, 1275-81 (1989)] 참조)이 당해 분야에 공지되어 있다. 또한, 비-인간 동물에서 항체를 생성하는 방법은, 예를 들면, 미국 특허 제 5,545,806 호, 제 5,569,825 호 및 제 5,714,352 호, 및 미국 특허출원공개 제 2002/0197266 A1 호에 기술되어 있다.
본 발명의 항체를 생성하기 위해 파지 디스플레이도 또한 사용될 수 있다. 이와 관련하여, 표준 분자 생물학 및 재조합 DNA 기술(예를 들면, 문헌 [Green and Sambrook et al. (eds.), Molecular Cloning, A Laboratory Manual, 4th Edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (2012)] 참조)을 이용하여 항체의 항원-결합 가변(V) 도메인을 암호화하는 파지 라이브러리를 생성할 수 있다. 목적하는 특이성을 갖는 가변 영역을 암호화하는 파지를 목적 항원에 대한 특이적 결합을 위해 선택하고, 선택된 가변 도메인을 포함하는 완전 또는 부분 항체를 재구성시킨다. 단클론성 항체의 특징을 갖는 항체들이 세포에 의해 분비되도록, 재구성된 항체를 암호화하는 핵산 서열을 적절한 세포주, 예를 들면, 하이브리도마 생성에 사용된 골수종 세포 내에 도입한다(예를 들면, 제인웨이 등의 상기 문헌, 휴스(Huse) 등의 상기 문헌 및 미국 특허 제 6,265,150 호 참조).
항체들은 특정 중쇄 및 경쇄 면역글로불린 유전자에 대해 유전자전이된 유전자전이 마우스에 의해 생성될 수 있다. 상기 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 미국 특허 제 5,545,806 호 및 제 5,569,825 호, 및 상기 제인웨이 등의 문헌에 기술되어 있다.
인간화 항체를 생성하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있으며, 예를 들면, 제인웨이 등의 상기 문헌 및 미국 특허 제 5,225,539 호, 제 5,585,089 호 및 제 5,693,761 호, 유럽 특허 제 0239400 B1 호 및 영국 특허 제 2188638 호에 상세하게 기술되어 있다. 인간화 항체는 또한, 예를 들면, 미국 특허 제 5,639,641 호 및 문헌 [Pedersen et al., J. Mol . Biol ., 235, 959-973 (1994)]에 기술된 항체 재표면처리(resurfacing) 기술을 이용하여 생성될 수 있다.
본 발명은 또한 본원에 기술된 임의의 항체의 항원 결합 부분을 제공한다. 항원 결합 부분은 1개 이상의 항원 결합 부위를 갖는 임의의 부분, 예를 들면, Fab, F(ab')2, dsFv, sFv, 디아바디(diabody) 및 트리아바디(triabody)일 수 있다.
합성 펩티드를 통해 항체 경쇄의 V 도메인에 연결된 항체 중쇄의 가변(V) 도메인을 포함하는 절두된 Fab 단편으로 이루어진 단일-쇄 가변 영역 단편(sFv) 항체 단편은 통상적인 재조합 DNA 기술(예를 들면, 제인웨이 등의 상기 문헌 참조)을 이용하여 생성될 수 있다. 유사하게, 다이설파이드-안정화된 가변 영역 단편(dsFv)은 재조합 DNA 기술에 의해 제조될 수 있다(예를 들면, 문헌 [Reiter et al., Protein Engineering, 7, 697-704 (1994)] 참조). 그러나, 본 발명의 항체 단편은 항체 단편들의 상기 대표적인 유형들로 한정되지 않는다.
또한, 항체 또는 그의 항원 결합 부분은, 검출가능한 표지, 예를 들면, 방사성동위원소, 형광단(예를 들면, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 피코에리트린(PE)), 효소(예를 들면, 알칼리성 포스파타제, 양고추냉이 퍼옥시다제), 및 원소 입자들(예를 들면, 금 입자)을 포함하도록 변형될 수 있다.
본 발명의 TCR, 폴리펩티드, 단백질(그의 기능성 변이체 포함), 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포(그의 집단 포함), 및 항체(그의 항원 결합 부분 포함)는 단리되고/되거나 정제될 수 있다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "단리된"은 그의 천연 환경으로부터 제거된 것을 의미한다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "정제된"은 순도가 증가된 것을 의미하며, 이때 "순도"는 상대적 용어이며 반드시 절대 순도로 해석될 필요는 없다. 예를 들면, 순도는 약 50% 이상일 수 있으며, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%보다 클 수 있거나, 100%일 수 있다.
본 발명의 TCR, 폴리펩티드, 단백질(그의 기능성 변이체 포함), 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포(그의 집단 포함), 및 항체(그의 항원 결합 부분 포함) (이하에서 이들 모두는 총칭하여 "본 발명의 TCR 물질들"로 지칭된다)는 약학 조성물과 같은 조성물로 제형화될 수 있다. 이와 관련하여, 본 발명은 본원에 기술된 임의의 TCR, 폴리펩티드, 단백질, 기능성 부분, 기능성 변이체, 핵산, 발현 벡터, 숙주 세포(그의 집단 포함) 및 항체(그의 항원 결합 부분 포함), 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다. 임의의 본 발명의 TCR 물질들을 함유하는 본 발명의 약학 조성물은 하나보다 많은 본 발명의 TCR 물질, 예를 들면, 폴리펩티드 및 핵산, 또는 2개 이상의 상이한 TCR들(그의 기능성 부분 및 기능성 변이체 포함)을 포함할 수 있다. 또는, 약학 조성물은 또 다른 약학 활성 약제(들) 또는 약물(들), 예를 들면, 화학치료제, 예를 들어, 아스파라기나제, 부설판, 카보플라틴, 시스플라틴, 다우노루비신, 독소루비신, 플루오로우라실, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 메토트렉세이트, 파클리탁셀, 리툭시맙, 빈블라스틴, 빈크리스틴 등과 함께 본 발명의 TCR 물질을 포함할 수 있다.
바람직하게, 담체는 약학적으로 허용되는 담체이다. 약학 조성물과 관련하여, 담체는 고려중인 특정한 본 발명의 TCR 물질에 통상적으로 사용되는 임의의 담체일 수 있다. 상기 약학적으로 허용되는 담체는 당해 분야에 숙련된 자에게 공지되어 있으며 대중에게 쉽게 이용가능하다. 약학적으로 허용되는 담체는 사용 조건하에서 해로운 부작용 또는 독성을 갖지 않는 담체인 것이 바람직하다.
담체의 선택은 부분적으로, 특정한 본 발명의 TCR 물질뿐 아니라, 본 발명의 TCR 물질을 투여하기 위해 사용되는 특정 방법에 의해 결정될 것이다. 따라서, 본 발명의 약학 조성물의 다양한 적합한 제형들이 존재한다. 적절한 제형들로는 경구, 비경구, 피하, 정맥내, 근육내, 동맥내, 척추강내 또는 복강내 투여를 위한 임의의 제형이 포함될 수 있다. 본 발명의 TCR 물질을 투여하기 위해 하나보다 많은 경로가 이용될 수 있으며, 특정한 경우에, 특정 경로가 또 다른 경로보다 더 즉각적이고 더 효과적인 반응을 제공할 수 있다.
바람직하게, 본 발명의 TCR 물질은 주사에 의해, 예를 들면, 정맥내로 투여된다. 본 발명의 TCR 물질이 본 발명의 TCR(또는 그의 기능성 변이체)을 발현하는 숙주 세포인 경우, 주사용의 세포를 위한 약학적으로 허용되는 담체는 임의의 등장성 담체, 예를 들면, 생리식염수(물 중 약 0.90% w/v의 NaCl, 물 중 약 300 mOsm/L NaCl, 또는 물 1 리터당 약 9.0 g NaCl), 노르모솔(NORMOSOL) R 전해질 용액(애보트(Abbott), 미국 일리노이주 시카고), 플라스마-라이트(PLASMA-LYTE) A(박스터(Baxter), 미국 일리노이주 디어필드), 물 중 약 5% 덱스트로스 또는 링거(Ringer)의 락테이트를 포함할 수 있다. 한 태양에서, 약학적으로 허용되는 담체는 인간 혈청 알부민으로 보충된다.
본 발명에 있어서, 투여되는 본 발명의 TCR 물질의 양 또는 용량(예를 들면, 본 발명의 TCR 물질이 하나 이상의 세포인 경우 세포의 수)은 대상 또는 동물에서 적정한 기간에 걸쳐, 예를 들면, 치료 또는 예방적 반응을 수행하기에 충분하여야 한다. 예를 들면, 본 발명의 TCR 물질의 용량은, 투여로부터 약 2 시간 이상, 예를 들면, 12 내지 24 시간 이상의 기간에 암 항원에 결합하거나, 암을 검출하거나, 치료하거나, 예방하기에 충분하여야 한다. 특정 태양에서, 상기 기간은 훨씬 더 길 수 있다. 용량은 특정한 본 발명의 TCR 물질의 효능 및 동물(예, 인간)의 상태, 및 치료될 동물(예, 인간)의 체중에 의해 결정될 것이다.
투여되는 용량을 결정하기 위한 많은 분석법들이 당해 분야에 공지되어 있다. 본 발명에 있어서, 각각 상이한 용량의 T 세포가 제공되는 일련의 포유동물들 중에서 한 포유동물에게 해당 용량의 상기 T 세포의 투여시, 표적 세포가 용해되거나, 본 발명의 TCR(또는 그의 기능성 변이체 또는 기능성 부분), 폴리펩티드 또는 단백질을 발현하는 T 세포에 의해 IFN-γ가 분비되는 정도를 비교하는 것을 포함하는 분석법을 이용하여 포유동물에게 투여될 출발 용량을 결정할 수 있다. 특정 용량의 투여시 표적 세포가 용해되거나 IFN-γ가 분비되는 정도는 당해 분야에 공지된 방법에 의해 분석될 수 있다.
본 발명의 TCR 물질의 용량은 또한 특정한 본 발명의 TCR 물질의 투여에 동반될 수 있는 임의의 불리한 부작용의 존재, 특성 및 정도에 의해 결정될 것이다. 전형적으로, 주치의는, 연령, 체중, 일반적인 건강상태, 식이, 성별, 투여될 본 발명의 TCR 물질, 투여 경로 및 치료되는 질병의 중증도와 같은 다양한 요인들을 고려하여 각각의 개개 환자들을 치료하는 본 발명 TCR 물질의 투여량을 결정할 것이다. 본 발명의 TCR 물질이 세포 집단인 태양에서, 주입 당 투여되는 세포의 수는, 예를 들면, 약 1 x 106 내지 약 1 x 1012 세포 이상으로 변할 수 있다. 특정 태양에서, 1 x 106보다 적은 세포가 투여될 수 있다.
당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면, 본 발명 TCR 물질의 치료 또는 예방 효능이 변형을 통해 증가되도록 본 발명의 TCR 물질이 여러 방법으로 변형될 수 있음을 용이하게 인지할 것이다. 예를 들면, 본 발명의 TCR 물질은 가교를 통해 표적화 잔기에 직접 또는 간접적으로 접합될 수 있다. 화합물, 예를 들면, 본 발명의 TCR 물질을 표적화 잔기에 접합시키는 것의 실시는 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들면, 문헌 [Wadwa et al., J. Drug Targeting 3: 111 (1995)] 및 미국 특허 제 5,087,616 호 참조). 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "표적화 잔기"는, 상기 표적화 잔기가 그 표면 상에서 수용체가 발현되는 세포의 집단에 본 발명의 TCR 물질의 전달을 유도하도록 세포-표면 수용체를 특이적으로 인식하고 그에 결합하는 임의의 분자 또는 약제를 말한다. 표적화 잔기는, 세포 표면 수용체(예를 들면, 상피 성장 인자 수용체(Epithelial Growth Factor Receptor, EGFR), T 세포 수용체(TCR), B-세포 수용체(BCR), CD28, 혈소판-유래 성장 인자 수용체(Platelet-derived Growth Factor Receptor, PDGF), 니코틴성 아세틸콜린 수용체(nAChR) 등)에 결합하는, 항체 또는 그의 단편, 펩티드, 호르몬, 성장 인자, 사이토카인, 및 임의의 다른 천연 또는 비-천연 리간드를 포함하나, 이로 한정되지는 않는다. 본원에서 사용된 바와 같은 용어 "가교"는 본 발명의 TCR 물질을 표적화 잔기에 연결하는 임의의 약제 또는 분자를 말한다. 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자라면, 본 발명 TCR 물질의 기능에 필수적이지 않은 본 발명 TCR 물질 상의 부위가 가교 및/또는 표적화 잔기를 결합시키기에 이상적인 부위이지만, 상기 가교 및/또는 표적화 잔기는 본 발명의 TCR 물질에 일단 결합되면 본 발명 TCR 물질의 기능, 즉, HPV 16 E7에 결합하거나; 암, HPV 16 감염 또는 HPV-양성 전암을 검출하거나, 치료하거나, 예방하는 능력을 저해하지 않아야 함을 인지할 것이다.
본 발명의 약학 조성물, TCR(그의 기능성 변이체 포함), 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포 또는 세포 집단은 암, HPV 16 감염 또는 HPV-양성 전암을 치료하거나 예방하는 방법에 사용될 수 있는 것으로 생각된다. 특정 이론에 결부되지 않고, 본 발명의 TCR(및 그의 기능성 변이체)는, TCR(또는 그의 관련된 본 발명의 폴리펩티드 또는 단백질 및 기능성 변이체)이 세포에 의해 발현시 HPV 16 E7을 발현하는 표적 세포에 대한 면역 반응을 매개할 수 있도록 HPV 16 E7에 특이적으로 결합하는 것으로 생각된다. 이와 관련하여, 본 발명은, 본원에 기술된 임의의 약학 조성물, TCR(및 그의 기능성 변이체), 폴리펩티드 또는 단백질; 본원에 기술된 임의의 TCR(및 그의 기능성 변이체), 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 임의의 핵산 또는 재조합 발현 벡터; 또는 본원에 기술된 임의의 TCR(및 그의 기능성 변이체), 폴리펩티드 또는 단백질을 암호화하는 재조합 벡터를 포함하는 임의의 숙주 세포 또는 세포 집단을, 포유동물에서 질병을 치료 또는 예방하기에 효과적인 양으로 포유동물에게 투여하는 것을 포함하는, 포유동물에서 질병을 치료 또는 예방하는 방법을 제공하며, 이때 상기 질병은 암, HPV 16 감염 또는 HPV-양성 전암이다.
용어 "치료하다" 및 "예방하다"뿐 아니라 그로부터 유래하는 단어들은, 본원에서 사용되는 바와 같이, 반드시 100% 또는 완전한 치료 또는 예방을 의미하지 않는다. 오히려, 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자가 잠재적 이점 또는 치료 효과를 갖는 것으로 인지하는 치료 또는 예방의 다양한 정도가 존재한다. 이와 관련하여, 본 발명의 방법은 포유동물에서 질병의 치료 또는 예방의 임의 수준의 임의의 양을 제공할 수 있다. 또한, 본 발명의 방법에 의해 제공되는 치료 또는 예방은 치료 또는 예방되는 하나 이상의 질병 또는 질병의 증상들, 예를 들면, 암의 치료 또는 예방을 포함할 수 있다. 예를 들면, 치료 또는 예방은 종양의 관해를 촉진하는 것을 포함할 수 있다. 또한, 본원에 있어서, "예방"은 상기 질병의 개시, 또는 그의 증상 또는 상태를 지연시키는 것을 포함할 수 있다.
포유동물에서 질병의 존재를 검출하는 방법도 또한 제공된다. 상기 방법은 (i) 포유동물로부터의 하나 이상의 세포를 포함하는 샘플을 본원에 기술된 임의의 본 발명의 TCR(및 그의 기능성 변이체), 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포 집단, 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 또는 약학 조성물과 접촉시켜 복합체를 형성하는 단계, 및 상기 복합체를 검출하는 단계로서, 상기 복합체의 검출이 포유동물에서 질병의 존재를 나타내고, 상기 질병이 암, HPV 16 감염 또는 HPV-양성 전암인, 단계를 포함한다.
포유동물에서 질병을 검출하는 본 발명의 방법과 관련하여, 세포들의 샘플은 전세포, 그의 용해물, 또는 전세포 용해물의 분획, 예를 들면, 핵 또는 세포질 분획, 전(全)단백질 분획 또는 핵산 분획을 포함하는 샘플일 수 있다.
본 발명의 검출 방법에 있어서, 접촉은 포유동물과 관련하여 시험관내 또는 생체내에서 일어날 수 있다. 바람직하게, 접촉은 시험관내 접촉이다.
또한, 복합체의 검출은 당해 분야에 공지된 여러 방법을 통해 일어날 수 있다. 예를 들면, 본원에 기술된 본 발명의 TCR(및 그의 기능성 변이체), 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포 집단, 또는 항체 또는 그의 항원 결합 부분은, 예를 들면, 방사성동위원소, 형광단(예를 들면, 플루오레세인 이소티오시아네이트(FITC), 피코에리트린(PE)), 효소(예를 들면, 알칼리성 포스파타제, 양고추냉이 퍼옥시다제), 및 원소 입자들(예를 들면, 금 입자)과 같은 검출가능한 표지로 표지화될 수 있다.
본 발명의 방법에 있어서, 숙주 세포 또는 세포 집단이 투여되는 경우, 세포는 포유동물에 대해 동종이계 또는 자가유래인 세포일 수 있다. 바람직하게, 세포는 포유동물에 대해 자가유래성이다.
본 발명의 방법과 관련하여, 암은, 임의의 급성 림프구성 암, 급성 골수성 백혈병, 포상 횡문근육종, 뼈암, 뇌암, 유방암, 항문, 항문관 또는 항문직장의 암, 눈 암, 간내 담관암, 관절암, 목, 담낭 또는 흉막의 암, 코, 비강 또는 중이의 암, 구강암, 질암, 외음부암, 만성 림프구성 백혈병, 만성 골수성 암, 결장암, 식도암, 자궁경부암, 위장 유암종, 신경교종, 호지킨(Hodgkin) 림프종, 하인두암, 신장암, 후두암, 간암, 폐암, 악성 중피종, 흑색종, 다발성 골수종, 비인두암, 비-호지킨 림프종, 구강인두암, 난소암, 음경암, 췌장암, 복막, 장망막 및 장간막 암, 인두암, 전립선암, 직장암, 신암, 피부암, 소장암, 연조직암, 위암, 고환암, 갑상선암, 자궁암, 요관암 및 방광암을 포함한 임의의 암일 수 있다. 바람직한 암은 자궁경부, 구강인두, 항문, 항문관, 항문직장, 질, 외음부 또는 음경의 암이다. 특히 바람직한 암은 HPV 16-양성 암이다. HPV 16 감염과 가장 흔히 연관되는 암은 자궁경부, 구강인두, 항문, 항문관, 항문직장, 질, 외음부 또는 음경의 암을 포함하지만, 본 발명의 방법은 다른 해부학적 부위에서 발생하는 암을 포함한 임의의 HPV 16-양성 암을 치료하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 방법에 언급된 포유동물은 임의의 포유동물일 수 있다. 본원에서 사용된 용어 "포유동물"은 마우스 및 햄스터와 같은 설치류(Rodentia) 목의 포유동물 및 토끼와 같은 중치류(Logomorpha) 목의 포유동물을 포함한(이로 한정되지는 않는다) 임의의 포유동물을 말한다. 포유동물은 고양이과(Feline)(고양이) 및 개과(Canine)(개)를 포함한 육식류(Carnivora) 목인 것이 바람직하다. 포유동물은 소과(Bovine)(소) 및 돼지과(Swine)(돼지)를 포함한 우제류(Artiodactyla) 목, 또는 말과(Equine)(말)을 포함한 기제류(Perissodactyla) 목의 포유동물인 것이 더 바람직하다. 포유동물은 영장류(Primate), 세보이드(Ceboid) 또는 시모이드(Simoid) 목(원숭이), 또는 유인원류(Anthropoid) 목(인간 및 유인원)의 포유동물인 것이 가장 바람직하다. 특히 바람직한 포유동물은 인간이다.
하기의 실시예는 본 발명을 더 예시하지만, 어떤 식으로든 그 범위를 제한하는 것으로 이해하지 않아야 함은 물론이다.
실시예 1
본 실시예는 신생물로부터 인간 항-HPV 16 E7 TCR의 단리를 설명한다.
HPV 16-양성 자궁경부 상피내 종양(CIN) II/III으로부터의 림프구 샘플을 14명의 환자로부터 수득하였다. 환자들은 이전에 HPV 16 E7을 표적화하는 다양한 백신을 투여받았다. 자궁경부 침윤 림프구(CIL)의 수를 전술한 바와 같이[Dudley et al. J. Immunother . 26:332-42 (2003) and Riddell et al. J. Immunol . Methods 128:189-201 (1990)] 급속 증폭 프로토콜(Rapid Expansion Protocol, REP)을 사용하여 증폭시켰다. 간략하게, TIL을, 30 ng/mL 항-CD3 항체 및 6,000 IU/mL IL-2를 함유한 완전 배지(CM)중에서 방사선조사된(40 Gy) 동종이계 말초혈 단핵 "피더(feeder)" 세포와 함께 배양하였다. 인터페론(IFN)-γ 분비를 측정한 후, gp 100개 펩티드, 11개 아미노산 잔기들이 중복되고 HPV 16 E6의 전체 길이에 이르는 15-량체 E6 펩티드의 풀, 11개 아미노산 잔기들이 중복되고 HPV 16 E7의 전체 길이에 이르는 15-량체 E7 펩티드의 풀, 또는 OKT3으로 펄스된 자가유래 수지상 세포(DC)와 공-배양시킴으로써 증폭된 수의 CIL을 HPV 16 E7 반응성에 대해 스크리닝하였다. 1명의 환자(5048)의 CD8+ CIL이 HPV 16 E7 반응성을 갖는 것으로 확인되었다. 환자 5048은 또한 HLA-A*02:01을 발현하는 것으로 확인되었다.
HLA-A*02:01/E711-19의 사량체를 사용하여 에피토프 HPV 16 E711-19를 표적화하는 환자 5048로부터의 T 세포의 존재를 측정하였다. 항-PE 항체를 사용하여 자기 비드 분리법을 이용하여 사량체-결합 세포를 단리하고, 제한 희석 클로닝을 수행하였다. T 세포 클론을 사량체 결합에 대해 스크리닝하고, 고-결합 클론을 확인하였다.
HLA-A2/E711-19 사량체에 결합된 클론의 TCR의 알파 및 베타쇄의 가변 영역을 단리하고, cDNA 말단의 5' 급속 증폭(RACE) 중합효소 연쇄 반응(PCR)을 이용하여 서열분석하였다. 서열번호 9를 포함하는 야생형 인간 α쇄의 가변 영역을 암호화하는 cDNA를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 TRAV1-2*01/TRAJ7*01로부터 수득하였다. 서열번호 11을 포함하는 야생형 인간 β쇄의 가변 영역을 암호화하는 cDNA를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 TRBV5-6*01/TRBJ2-1/TRBD2로부터 수득하였다.
실시예 2
본 실시예는, 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 포함하는 키메라 항-HPV 16 E7 TCR을 발현하도록 형질도입된 말초혈 T 세포가 HLA-A2/E711-19 사량체에 대해 CD8-비의존성 결합을 나타내고, HLA-A2+ HPV-16+ 종양 세포주를 인식하였음을 보여준다.
실시예 1의 야생형 인간 TCR로부터 유래된 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 포함하는 키메라 항-HPV 16 E7 TCR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 MSGV1 재조합 발현 벡터를 다음과 같이 제조하였다. 재조합 발현 벡터 중의 뉴클레오티드 서열은, 재조합 발현 벡터에 NcoI 제한효소 부위 및 코작(Kozak) 서열을 제공하기 위해 β쇄(리더 서열)의 가변 영역의 두번째 위치에서 알라닌이 천연 글리신 대신 치환된 것을 제외하고, 실시예 1의 TCR의 α쇄의 가변 영역 및 β쇄의 가변 영역을 암호화하였다. α 및 β쇄의 뮤린 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열들(각각 서열번호 17 및 19)을 각각의 인간 불변 영역 대신에 벡터내에 삽입시켜 키메라 TCR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 제공하였다. 피코르나바이러스 2A 펩티드를 암호화하는 코돈-최적화된 뉴클레오티드 서열(서열번호 28)을 α 및 β쇄 사이에 위치시켰다. 키메라 α 및 β쇄 및 링커를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 인간 조직에서의 발현을 위해 코돈-최적화시켰다.
말초혈 세포를 키메라 TCR을 암호화하는 MSGV1 재조합 발현 벡터 또는 완전 뮤린 항-HPV 16 E7 TCR을 암호화하는 벡터로부터 레트로바이러스로 형질도입하였다. 비형질도입 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 형질도입된 세포를 항-CD8 및 항-TRBC(마우스 불변 영역) 항체로 표지화하고 유세포분석에 의해 HLA-A2/E711-19 사량체에 대한 결합에 대해 검사하였다. 비형질도입 세포(CD8+ 및 CD8- 둘 다), 및 선행 실험에서 확인된 대조군 마우스 항-HPV 16 E7 TCR을 발현하도록 형질도입된 세포(CD8+ 및 CD8- 둘 다)는 사량체에 결합하지 않았다. 키메라 HPV-16 E7 TCR로 형질도입된 CD8+ 및 CD8- 세포는 둘 다 사량체에 결합하였다. 따라서, 키메라 TCR로 형질도입된 PBL은 HLA-A2/E711-19 사량체에 CD8-비의존성 방식으로 결합하였다. 키메라 TCR의 β쇄를 발현하는 형질도입된 T 세포의 약 50%는 사량체에 결합하지 않은 것도 또한 관찰되었다.
별개의 실험으로, 말초혈 림프구(PBL)를 약 50% 형질도입 효율하에 키메라 TCR을 암호화하는 MSGV1 재조합 발현 벡터로 형질도입시켰다. HLA-A2/E711-19 사량체 결합을 형광-활성화 세포 분류(FACS)에 의해 측정하였으며, 세포의 25%가 자극후 제 8일에 사량체에 결합하는 것으로 확인되었다. 형질도입된 세포를, 자극 10일후에, HPV 16 E629-38 펩티드로 펄스된 표적 293-A2 세포(대조군), HPV 16 E711-19 펩티드로 펄스된 293-A2 세포, HPV 16 E6을 암호화하는 플라스미드로 형질도입된 624 세포, HPV 16 E7을 암호화하는 플라스미드로 형질도입된 624 세포, SCC152 세포, SCC90 세포, CaSki 세포, Alb 세포, Panc1 세포, 또는 SiHa 세포와 공-배양하였다. 비형질도입 세포를 대조군으로 사용하였다. IFN-γ를 측정하였다. 결과는 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타낸 바와 같이, 키메라 TCR을 암호화하는 MSGV1 재조합 발현 벡터로 형질도입된 PBL은 HPV 16 E7-양성 종양 세포주 및 다른 HLA-A2+HPV16 E7+ 표적을 HLA-A2-제한 방식으로 특이적으로 인식하였다. 제 2의 공여체의 세포를 사용하여 수득된 결과도 유사하였다.
실시예 3
본 실시예는, TCR의 α 쇄의 불변 영역의 막관통(TM) 영역 중 3개의 천연 아미노산 잔기가 각각 소수성 아미노산 잔기로 치환된, 인간 가변 영역 및 뮤린 불변 영역을 포함하는 키메라 항-HPV 16 E7 TCR을 제조하는 방법을 설명한다.
TCR의 α 쇄의 불변 영역의 막관통(TM) 영역 중 3개의 천연 아미노산 잔기가 각각 소수성 아미노산 잔기로 치환된, 인간 가변 영역 및 뮤린 불변 영역을 포함하는 키메라 TCR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 다음과 같이 제조하였다. 실시예 2의 키메라 TCR의 α 및 β쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을, 알파쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치한 β쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 단일 뉴클레오티드 서열, 및 α 및 β쇄 사이에 위치한 피코르나바이러스 2A 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 28) 내에 클로닝하였다. 야생형 α쇄 마우스 불변 영역 서열번호 17과 관련하여, α쇄의 TM 영역내의 3개의 천연 아미노산 잔기, 즉, 위치 112, 114 및 115 각각의 Ser, Met 및 Gly를 각각 Leu, Ile 및 Val로 치환시켰다. 결합된 뉴클레오티드 서열을 인간 조직에서의 발현을 위해 코돈-최적화시켜 벡터 삽입물(서열번호 39)을 수득하였다. 상기 벡터 삽입물을 MSGV1 발현 벡터 내에 클로닝시켜 서열번호 37을 수득하였다. 상기 벡터에 의해 암호화된 TCR은 서열번호 22를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 α쇄 및 서열번호 20을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 β쇄를 포함하였다("LVL-변형된 TCR" 또는 "LVL TCR").
실시예 4
본 실시예는, β 및 α쇄 중의 천연 아미노산 잔기가 각각 시스테인 잔기로 치환된, 인간 가변 영역 및 마우스 불변 영역을 포함하는 키메라 항-HPV 16 E7 TCR을 제조하는 방법을 설명한다.
실시예 2의 TCR을 다음과 같이 α 및 β쇄 각각의 불변 영역에 Cys 치환을 포함하도록 변형시켰다. 실시예 2의 TCR의 α쇄의 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(아미노산 서열번호 17)을 위치 48에서의 천연 Thr을 Cys로 치환시키도록 변형시켰다. 실시예 2의 TCR의 β쇄의 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 19)을 위치 56에서의 천연 Ser을 Cys로 치환시키도록 변형시켰다. α 및 β쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을, α쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치한 β쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 단일 뉴클레오티드 서열, 및 α 및 β쇄 사이에 위치한 피코르나바이러스 2A 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 28) 내에 클로닝하였다. 결합된 뉴클레오티드 서열을 인간 조직에서의 발현을 위해 코돈-최적화시켜 벡터 삽입물을 수득하였다. 벡터 삽입물을 MSGV1 발현 벡터 내에 클로닝시켰다. 상기 벡터에 의해 암호화된 TCR은 서열번호 9 및 24를 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 α쇄 및 서열번호 27을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 β쇄를 포함하였다("Cys-변형된 TCR" 또는 "Cys TCR").
실시예 3의 TCR(LVL-변형된 TCR)을 다음과 같이 α 및 β쇄 각각의 불변 영역에 Cys 치환을 포함하도록 더 변형시켰다. 실시예 3의 LVL-변형된 TCR의 α쇄의 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(아미노산 서열번호 21)을 위치 48에서의 천연 Thr을 Cys로 치환시키도록 변형시켰다. 실시예 3의 LVL-변형된 TCR의 β쇄의 불변 영역을 암호화하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 19)을 위치 56에서의 천연 Ser을 Cys로 치환시키도록 변형시켰다. α 및 β쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을, α쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치한 β쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 갖는 단일 뉴클레오티드 서열, 및 α 및 β쇄 사이에 위치한 피코르나바이러스 2A 펩티드를 암호화하는 뉴클레오티드 서열(서열번호 28) 내에 클로닝하였다. 결합된 뉴클레오티드 서열을 인간 조직에서의 발현을 위해 코돈-최적화시켜 벡터 삽입물(서열번호 40)을 수득하였다. 상기 벡터 삽입물을 MSGV1 발현 벡터 내에 클로닝시켜 서열번호 38을 수득하였다. 상기 벡터에 의해 암호화된 TCR은 서열번호 26을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 α쇄 및 서열번호 27을 포함하는 아미노산 서열을 포함하는 β쇄를 포함하였다("LVL-Cys-변형된 TCR" 또는 "LVL-Cys TCR").
실시예 5
본 실시예는 실시예 2의 키메라 항-HPV 16 E7 TCR을 암호화하는 재조합 발현 벡터의 변형이 HPV 16 E711-19 사량체 결합을 개선하였으며 HPV 16+ 종양 세포주의 인식을 개선하였음을 보여준다.
두 공여체로부터의 PBL을 표 1에 나타낸 재조합 발현 벡터 중 하나로 형질도입시켰다.
TCR TCR의 아미노산 서열번호 벡터내 α 및 β쇄의 위치
키메라 항-HPV 16 E7 TCR
(실시예 2)		 9, 10, 17 및 19
(이때 서열번호 10의 위치 2에서의 X는 Ala이다)		 알파쇄는 베타쇄의 5'에
위치한다 ("α/β")
Cys-변형된 TCR 9, 24, 27 α/β
LVL-변형된 TCR 20, 22 α/β
LVL-Cys-변형된 TCR 26, 27 α/β
키메라 항-HPV 16 E7 TCR
(실시예 2)		 9, 10, 17 및 19
(이때 서열번호 10의 위치 2에서의 X는 Ala이다)		 베타쇄는 알파쇄의 5'에
위치한다("β/α")
Cys-변형된 TCR 9, 24, 27 β/α
LVL-변형된 TCR 20, 22 β/α
LVL-Cys-변형된 TCR 26, 27 β/α
2명의 정상 공여체로부터의 형질도입된 PBL을 자극후 제 8일에 항-HPV 16 E711-19 사량체 및 항-마우스(m)TRBC 항체를 사용하여 유세포분석에 의해 HPV 16 E711-19 사량체 결합에 대해 검사하였다. 비형질도입 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 결과는 도 2A 내지 2R에 나타내었다. 각각의 그래프 위에 각 사분면에 검출된 염색된 세포의 퍼센트를 나타내었다. 도 2A 내지 2R에 나타낸 바와 같이, β쇄가 α쇄의 5'에 위치한 재조합 발현 벡터로 형질도입된 세포가, α쇄가 β쇄의 5'에 위치한 재조합 발현 벡터로 형질도입된 세포에 비해 개선된 사량체 결합을 나타내었다. 또한, 도 2A 내지 2R에 나타낸 바와 같이, Cys-변형된 TCR, LVL-변형된 TCR, 또는 LVL-Cys-변형된 TCR로 형질도입된 세포는 각각 실시예 2의 TCR로 형질도입된 세포에 비해 개선된 사량체 결합을 나타내었다.
별개의 실험으로, 자극 11일 후에, 형질도입된 세포를 624 세포, CaSki 세포, Scc90 세포 또는 Scc152 세포와 공-배양시키고, IFN-γ 분비를 측정하였다. 비형질도입 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 결과는 도 3A 및 3B에 나타내었다. 도 3A 및 3B에 나타낸 바와 같이, Cys-변형된 TCR, LVL-변형된 TCR, 또는 LVL-Cys-변형된 TCR로 형질도입된 세포는 각각 실시예 2의 TCR로 형질도입된 세포에 비해 HPV 16+ 종양 세포주의 개선된 인식을 나타내었다. 도 3A 및 3B에 또한 나타낸 바와 같이, β쇄가 α쇄의 5'에 위치한 재조합 발현 벡터로 형질도입된 세포가, α쇄가 β쇄의 5'에 위치한 재조합 발현 벡터로 형질도입된 세포에 비해 HPV 16+ 종양 세포주의 개선된 인식을 나타내었다.
β쇄가 α쇄의 5'에 위치한 재조합 발현 벡터로 형질도입된 세포가, 유세포분석에 의해 측정시, α쇄가 β쇄의 5'에 위치한 재조합 발현 벡터로 형질도입된 세포에 비해 또한 개선된 발현을 나타내었다.
실시예 6
본 실시예는 LVL-Cys-변형된 TCR(β/α)을 암호화하는 재조합 발현 벡터로 형질도입된 T 세포가 HPV-16 E711-19 사량체의 CD8-비의존성 결합을 나타내었음을 보여준다.
말초혈 세포를 실시예 4의 LVL-Cys-변형된 TCR(β/α)을 암호화하는 MSGV1 재조합 발현 벡터로 형질도입시켰다. 형질도입된 세포를 항-CD8, 항-TRBC(마우스 불변 영역) 항체, 및 HLA-A2/E711-19 사량체로 표지화하고 유세포분석에 의해 분석하였다. 두 공여체 모두로부터의 CD8+ 형질도입된 세포 및 CD8- 형질도입된 세포 둘 다 사량체에 결합하여, CD8-비의존성 결합을 입증하였다.
실시예 7
본 실시예는 LVL-변형된 TCR(β/α)을 발현하도록 형질도입된 말초혈 T 세포가 HPV 16 E711-19 펩티드 및 HPV 16+ 종양 세포주를 특이적으로 인식함을 보여준다.
PBL을 실시예 3의 LVL-변형된 TCR(β/α)(서열번호 37)을 암호화하는 재조합 발현 벡터로 형질도입시켰다. 세포 수의 급속한 증폭을 전술한 바와 같이[Dudley et al. J. Immunother . 26:332-42 (2003) and Riddell et al. J. Immunol. Methods 128:189-201 (1990)] 급속 증폭 프로토콜(REP)을 사용하여 수행하였다. 간략하게, TIL을, 30 ng/mL 항-CD3 항체 및 6,000 IU/mL IL-2를 함유한 완전 배지(CM)중에서 방사선조사된(40 Gy) 동종이계 말초혈 단핵 "피더" 세포와 함께 배양하였다. 증폭된, 형질도입된 세포를, HPV 16 E629-38 펩티드로 펄스된 표적 293-A2 세포(대조군), HPV 16 E711-19 펩티드로 펄스된 293-A2 세포, HPV 16 E6을 암호화하는 플라스미드로 형질도입된 624 세포, HPV 16 E7을 암호화하는 플라스미드로 형질도입된 624 세포, SCC152 세포, SCC90 세포, CaSki 세포, Alb 세포, Panc1 세포, Ane 세포 또는 SiHa 세포와 공-배양하였다. IFN-γ를 측정하였다. 결과는 도 4에 나타내었다. 도 4에 나타낸 바와 같이, LVL-변형된 TCR(β/α)을 암호화하는 재조합 발현 벡터로 형질도입된 PBL은 HPV 16 E7-양성 종양 세포주 및 다른 HLA-A2+HPV16 E7+ 표적을 HLA-A2-제한 방식으로 특이적으로 인식하였다. 제 2의 공여체의 세포를 사용하여 수득된 결과도 유사하였다.
실시예 8
본 실시예는 LVL-Cys-변형된 TCR(β/α)을 발현하도록 형질도입된 말초혈 T 세포가 HPV 16+ 종양 세포주를 특이적으로 인식하고, 상기 인식이 항-MHC 클래스 I 항체에 의해 차단됨을 보여준다. 본 실시예는 또한 상기 형질도입된 T 세포들이 HPV 16+ HLA-A2+ 종양 세포주를 특이적으로 사멸시킴을 보여준다.
PBL을 LVL-Cys-변형된 TCR(β/α)(서열번호 38)을 암호화하는 재조합 발현 벡터로 형질도입시켰다. 세포 수의 급속 증폭을 실시예 7에 기술된 바와 같이 REP를 이용하여 수행하였다. 형질도입된 세포를, 항체 없이(검정색 막대) 또는 항-MHC 클래스 I(회색 막대) 또는 항-MHC 클래스 II 항체(음영처리되지 않은 막대)의 존재하에서 표적 624 세포, SCC90 세포 또는 CaSki 세포와 공-배양하였다. 대조군으로서, PBL을 DMF5 TCR로 형질도입시키고, 항체없이 또는 항-MHC 클래스 I 또는 항-MHC 클래스 II 항체의 존재하에서 526-CIITA 세포와 공-배양하였다. IFN-γ를 측정하였다. 결과는 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, LVL-Cys-변형된 TCR(β/α)을 발현하도록 형질도입된 말초혈 T 세포는 HPV 16+ 종양 세포주를 특이적으로 인식하였으며, 상기 인식은 항-MHC 클래스 I 항체에 의해 차단되었다.
별개의 실험으로, 형질도입된 효과기 세포를 다양한 효과기:표적 비에서 표적 CaSki 세포, SCC90 세포, SCC152 세포, 또는 624 세포와 공-배양하였다. 비형질도입 효과기 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 결과는 도 6A 내지 6D에 나타내었다. 도 6A 내지 6D에 나타낸 바와 같이, LVL-Cys-변형된 TCR(β/α)(서열번호 38)을 암호화하는 발현 벡터로 형질도입된 PBL은 HPV 16+ HLA-A2+ 종양 세포주의 특이적 사멸을 나타내었다.
실시예 9
본 실시예는 LVL-Cys-변형된 TCR(β/α)을 발현하도록 형질도입된 말초혈 T 세포가 항-HPV 16 E6 TCR DCA2E6과 유사한 기능적 결합활성을 가짐을 보여준다. 본 실시예는 또한, LVL-Cys-변형된 TCR(β/α)을 발현하도록 형질도입된 말초혈 T 세포가 CaSki 및 SCC152 세포와 공-배양시 DCA2E6 TCR로 형질도입된 세포에 비해 더 큰 IFN-γ 생성을 나타내었으나, SCC90 세포와 공-배양시에는 그렇지 않음을 보여준다.
PBL을 LVL-Cys-변형된 TCR(β/α)(서열번호 38)을 암호화하는 재조합 발현 벡터 또는 DCA2E6으로 형질도입시켰다. 형질도입된 세포를, 펩티드로 펄스되지 않거나 1 μM 내지 1 pM 범위 농도의 HPV 16 E711-19 펩티드 또는 HPV 16 E629-38 펩티드로 펄스된 T2 세포들과 공-배양하였다. IFN-γ를 측정하였다. 결과는 도 7A 및 7B에 나타내었다. 도 7A 및 7B에 나타낸 바와 같이, LVL-Cys-변형된 TCR(β/α)을 발현하도록 형질도입된 PBL은 항-HPV 16 E6 TCR DCA2E6과 유사한 기능적 결합활성을 가졌다. 제 2 공여체로부터의 세포를 사용하여 수득된 결과도 유사하였다.
별개의 실험으로, PBL을 LVL-Cys-변형된 TCR(β/α)(서열번호 38)을 암호화하는 재조합 발현 벡터 또는 DCA2E6으로 형질도입시켰다. 비형질도입 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 세포를 표적 624 세포, CaSki 세포, SCC90 세포 또는 SCC152 세포와 공-배양하였다. IFN-γ를 측정하였다. 결과는 도 8A에 나타내었다. 도 8A에 나타낸 바와 같이, LVL-Cys-변형된 TCR(β/α)을 발현하도록 형질도입된 말초혈 T 세포는 CaSki 및 SCC152 세포와 공-배양시 DCA2E6 TCR로 형질도입된 세포에 비해 더 큰 IFN-γ 생성을 나타내었으나, SCC90 세포와 공-배양시에는 그렇지 않았다.
별개의 실험으로, PBL을 Cys-변형된 TCR(β/α)(서열번호 9, 24 및 27) 또는 DCA2E6을 발현하도록 형질도입시켰다. 비형질도입 세포를 음성 대조군으로 사용하였다. 세포를, HPV 16 E629-38 펩티드로 펄스된 표적 293-A2 세포(대조군), HPV 16 E711-19 펩티드로 펄스된 293-A2 세포, SCC152 세포, SCC90 세포, CaSki 세포, Alb 세포, Ane 세포, Panc1 세포, 또는 SiHa 세포와 공-배양하였다. IFN-γ를 측정하였다. 결과는 도 8B에 나타내었다. 도 8B에 나타낸 바와 같이, Cys-변형된 TCR(β/α)을 발현하도록 형질도입된 말초혈 T 세포는 CaSki 및 SCC152 세포와 공-배양시 DCA2E6 TCR로 형질도입된 세포에 비해 더 큰 IFN-γ 생성을 나타내었으나, SCC90 세포와 공-배양시에는 그렇지 않았다.
본원에 인용된 특허출원공개, 특허출원 및 특허를 포함한 모든 참조문헌들은, 각각의 참조문헌들이 참고로 인용되는 것으로 개별적으로 및 명확하게 지적되고 본원에 전체로 나타낸 경우와 동일한 정도로 본원에 참고로 인용된다.
본 발명을 설명하는 맥락에서(특히 하기 특허청구범위의 맥락에서) 단수형 용어, "하나 이상" 및 유사한 언급대상들의 사용은, 본원에 달리 나타내거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 단수형 및 복수형 둘 다를 포함하는 것으로 이해해야 한다. 용어 "하나 이상" 다음에 하나 이상의 항목들의 목록(예를 들면, "A 및 B 중 하나 이상")의 사용은, 본원에 달리 나타내거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한, 열거된 항목들로부터 선택된 1개의 항목(A 또는 B) 또는 열거된 항목들의 2개 이상의 임의의 조합(A 및 B)을 의미하는 것으로 이해해야 한다. 용어 "이루어지는", "갖는", "포함하는" 및 "함유하는"은 달리 언급되지 않는 한, 제한이 없는(open-ended) 용어(즉, "포함하지만 그로 한정되지는 않는"을 의미)로 이해해야 한다. 본원에서 값들의 범위의 인용은, 본원에 달리 나타내지 않는 한, 단지 그 범위내에 속하는 각각의 별개의 값을 개별적으로 언급하는 간단한 방법으로 사용하기 위한 것이며, 각각의 별개의 값은 본원에 개별적으로 인용된 것처럼 명세서에 인용된다. 본원에 기술된 모든 방법들은 본원에 달리 나타내거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한 임의의 적절한 순서로 수행될 수 있다. 본원에 제공된 임의의 및 모든 예, 또는 예시적 용어(예를 들면, "와 같은")의 사용은 단지 본 발명을 더 잘 예시하기 위한 것일 뿐이며, 달리 청구되지 않는 한 본 발명의 범위에 제한을 제기하는 것이 아니다. 명세서의 어떤 용어도 임의의 비-청구된 요소를 본 발명의 실시에 필수적인 것으로 지시하는 것으로 이해되어서는 안된다.
본 발명을 수행하기 위해 본 발명자들에게 알려진 가장 최적의 방식을 포함하여 본 발명의 바람직한 태양들이 본원에 기술되어 있다. 상기 바람직한 태양들의 변형은 상기 설명을 숙지할 때 당해 분야에 통상의 기술을 가진 자에게 명백해질 수 있다. 본 발명자들은 숙련된 전문가들이 상기 변형들을 적절하게 사용할 것을 기대하며, 본 발명자들은 본 발명이 본원에 구체적으로 기술된 바와 달리 실행될 것을 의도한다. 따라서, 본 발명은 준거법에 의해 허용되는 바와 같이 본원에 첨부된 특허청구범위에 인용된 주제의 모든 수정 및 등가물을 포함한다. 또한, 그의 모든 가능한 변형들에서 전술한 요소들의 임의의 조합은 본원에 달리 나타내거나 문맥상 명백하게 모순되지 않는 한 본 발명에 포함된다.
SEQUENCE LISTING <110> THE UNITED STATES OF AMERICA, AS REPRESENTED BY THE SECRETARY, DEPARTMENT OF HEALTH AND HUMAN SERVICES <120> ANTI-HUMAN PAPILLOMAVIRUS 16 E7 T CELL RECEPTORS <130> 720940 <140> PCT/US2015/033129 <141> 2015-05-29 <150> US 62/004335 <151> 2014-05-29 <160> 40 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 98 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 1 Met His Gly Asp Thr Pro Thr Leu His Glu Tyr Met Leu Asp Leu Gln 1 5 10 15 Pro Glu Thr Thr Asp Leu Tyr Cys Tyr Glu Gln Leu Asn Asp Ser Ser 20 25 30 Glu Glu Glu Asp Glu Ile Asp Gly Pro Ala Gly Gln Ala Glu Pro Asp 35 40 45 Arg Ala His Tyr Asn Ile Val Thr Phe Cys Cys Lys Cys Asp Ser Thr 50 55 60 Leu Arg Leu Cys Val Gln Ser Thr His Val Asp Ile Arg Thr Leu Glu 65 70 75 80 Asp Leu Leu Met Gly Thr Leu Gly Ile Val Cys Pro Ile Cys Ser Gln 85 90 95 Lys Pro <210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 2 Tyr Met Leu Asp Leu Gln Pro Glu Thr 1 5 <210> 3 <211> 6 <212> PRT <213> 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aatcctcctc ctgaaagtgg ccgggtttaa tctgctcatg 780 acgctgcggc tgtggtccag ctga 804 <210> 32 <211> 945 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 32 atgggccccg ggctcctctg ctgggcactg ctttgtctcc tgggagcagg cttagtggac 60 gctggagtca cccaaagtcc cacacacctg atcaaaacga gaggacagca agtgactctg 120 agatgctctc ctaagtctgg gcatgacact gtgtcctggt accaacaggc cctgggtcag 180 gggccccagt ttatctttca gtattatgag gaggaagaga gacagagagg caacttccct 240 gatcgattct caggtcacca gttccctaac tatagctctg agctgaatgt gaacgccttg 300 ttgctggggg actcggccct ctatctctgt gccagcagct tgggatggcg ggggggccgt 360 tacaatgagc agttcttcgg gccagggaca cggctcaccg tgctagagga cctgaaaaac 420 gtgttcccac ccgaggtcgc tgtgtttgag ccatcagaag cagagatctc ccacacccaa 480 aaggccacac tggtgtgcct ggccacaggc ttctaccccg accacgtgga gctgagctgg 540 tgggtgaatg ggaaggaggt gcacagtggg gtcagcacag acccgcagcc cctcaaggag 600 cagcccgccc tcaatgactc cagatactgc ctgagcagcc gcctgagggt ctcggccacc 660 ttctggcaga acccccgcaa ccacttccgc tgtcaagtcc agttctacgg gctctcggag 720 aatgacgagt ggacccagga tagggccaaa cctgtcaccc agatcgtcag cgccgaggcc 780 tggggtagag cagactgtgg cttcacctcc gagtcttacc agcaaggggt cctgtctgcc 840 accatcctct atgagatctt gctagggaag gccaccttgt atgccgtgct ggtcagtgcc 900 ctcgtgctga tggccatggt caagagaaag gattccagag gctag 945 <210> 33 <211> 795 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 33 atgtggggtg tcttcctttt gtacgtcagc atgaagatgg gaggcactac tgggcaaaac 60 atagatcagc ctaccgaaat gactgctacc gagggagcca ttgtccaaat caactgcacc 120 tatcagacta gcggcttcaa tggactcttc tggtaccaac agcatgcggg cgaagcacct 180 accttcttgt cctataatgt cttggatggt ctcgaagaga aaggcagatt ctccagtttc 240 ctcagccgga gcaagggata ctcatatctt ctcctgaaag agcttcagat gaaggattct 300 gcatcctatc tctgtgcttc agtcgatggc aataaccgac tcgcctttgg aaaagggaat 360 caagtggtcg tcataccgaa tattcagaac cccgaaccag ccgtatatca gttgaaggac 420 ccaagatctc aggatagtac actctgtttg tttacggact ttgactcaca aatcaacgtc 480 ccgaagacta tggaaagtgg tacgttcatc acagataaga cggttctgga catgaaggct 540 atggactcaa 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ccgaaatgac tgctaccgag ggagccattg tccaaatcaa ctgcacctat cagactagcg 1140 gcttcaatgg actcttctgg taccaacagc atgcgggcga agcacctacc ttcttgtcct 1200 ataatgtctt ggatggtctc gaagagaaag gcagattctc cagtttcctc agccggagca 1260 agggatactc atatcttctc ctgaaagagc ttcagatgaa ggattctgca tcctatctct 1320 gtgcttcagt cgatggcaat aaccgactcg cctttggaaa agggaatcaa gtggtcgtca 1380 taccgaatat tcagaacccc gaaccagccg tatatcagtt gaaggaccca agatctcagg 1440 atagtacact ctgtttgttt acggactttg actcacaaat caacgtcccg aagactatgg 1500 aaagtggtac gttcatcaca gataagacgg ttctggacat gaaggctatg gactcaaaga 1560 gcaacggggc aattgcttgg tccaaccaga caagctttac ctgtcaggac atttttaagg 1620 agactaatgc tacttatccc tccagcgacg ttccgtgtga tgcgactctt accgagaagt 1680 cttttgagac cgatatgaat ctcaacttcc agaatctgct ggtgatcgtt ctgcggatcc 1740 tgcttctgaa ggttgcagga ttcaatcttc ttatgactct ccggctctgg tcttcatgat 1800 aagaattctg cagtcgacgg taccgcgggc ccgggatccg ataaaataaa agattttatt 1860 tagtctccag aaaaaggggg gaatgaaaga ccccacctgt aggtttggca agctagctta 1920 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ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 3660 gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 3720 tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 3780 ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 3840 taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 3900 gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 3960 gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 4020 ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 4080 aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 4140 gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 4200 cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 4260 actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 4320 caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 4380 gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 4440 ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 4500 caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 4560 tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 4620 gcggatacat atttgaatgt atttagaaaa ataaacaaat aggggttccg cgcacatttc 4680 cccgaaaagt gccacctgac gtctaagaaa ccattattat catgacatta acctataaaa 4740 ataggcgtat cacgaggccc tttcgtctcg cgcgtttcgg tgatgacggt gaaaacctct 4800 gacacatgca gctcccggag acggtcacag cttgtctgta agcggatgcc gggagcagac 4860 aagcccgtca gggcgcgtca gcgggtgttg gcgggtgtcg gggctggctt aactatgcgg 4920 catcagagca gattgtactg agagtgcacc atatgcggtg tgaaataccg cacagatgcg 4980 taaggagaaa ataccgcatc aggcgccatt cgccattcag gctgcgcaac tgttgggaag 5040 ggcgatcggt gcgggcctct tcgctattac gccagctggc gaaaggggga tgtgctgcaa 5100 ggcgattaag ttgggtaacg ccagggtttt cccagtcacg acgttgtaaa acgacggcgc 5160 aaggaatggt gcatgcaagg agatggcgcc caacagtccc ccggccacgg ggcctgccac 5220 catacccacg ccgaaacaag cgctcatgag cccgaagtgg cgagcccgat cttccccatc 5280 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ccccgcccct tgtaaacttc cctgaccctg acatgacaag agttactaac agcccctctc 7020 tccaagctca cttacaggct ctctacttag tccagcacga agtctggaga cctctggcgg 7080 cagcctacca agaacaactg gaccgaccgg tggtacctca cccttaccga gtcggcgaca 7140 cagtgtgggt ccgccgacac cagactaaga acctagaacc tcgctggaaa ggaccttaca 7200 cagtcctgct gaccaccccc accgccctca aagtagacgg catcgcagct tggatacacg 7260 ccgcccacgt gaaggctgcc gaccccgggg gtggaccatc ctctagaccg 7310 <210> 38 <211> 7310 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 38 ccatggcccc ggggcttttg tgttgggcct tgctttgttt gcttggggca ggcttggtgg 60 atgctggagt cacacagtca cccacacacc tcattaaaac caggggacaa caagtcactc 120 tgcgctgcag tcctaagtca ggccatgaca cagtttcctg gtatcaacag gctctggggc 180 agggccctca gttcattttc caatattacg aggaagagga acgccaacgc ggtaatttcc 240 ccgatcggtt ctctgggcac cagttcccaa actactcaag tgagttgaac gtaaatgctc 300 tcctcctcgg agactccgcc ctctacttgt gtgccagttc tcttggttgg cggggcggcc 360 gatacaatga acaatttttt ggacctggta ctcggctgac cgtgctagag gacctgcgca 420 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atatcttctc ctgaaagagc ttcagatgaa ggattctgca tcctatctct 1320 gtgcttcagt cgatggcaat aaccgactcg cctttggaaa agggaatcaa gtggtcgtca 1380 taccgaatat tcagaacccc gaaccagccg tatatcagtt gaaggaccca agatctcagg 1440 atagtacact ctgtttgttt acggactttg actcacaaat caacgtcccg aagactatgg 1500 aaagtggtac gttcatcaca gataagtgcg ttctggacat gaaggctatg gactcaaaga 1560 gcaacggggc aattgcttgg tccaaccaga caagctttac ctgtcaggac atttttaagg 1620 agactaatgc tacttatccc tccagcgacg ttccgtgtga tgcgactctt accgagaagt 1680 cttttgagac cgatatgaat ctcaacttcc agaatctgct ggtgatcgtt ctgcggatcc 1740 tgcttctgaa ggttgcagga ttcaatcttc ttatgactct ccggctctgg tcttcatgat 1800 aagaattctg cagtcgacgg taccgcgggc ccgggatccg ataaaataaa agattttatt 1860 tagtctccag aaaaaggggg gaatgaaaga ccccacctgt aggtttggca agctagctta 1920 agtaacgcca ttttgcaagg catggaaaat acataactga gaatagagaa gttcagatca 1980 aggttaggaa cagagagaca gcagaatatg ggccaaacag gatatctgtg gtaagcagtt 2040 cctgccccgg ctcagggcca agaacagatg gtccccagat gcggtcccgc cctcagcagt 2100 ttctagagaa ccatcagatg tttccagggt gccccaagga cctgaaaatg accctgtgcc 2160 ttatttgaac taaccaatca gttcgcttct cgcttctgtt cgcgcgcttc tgctccccga 2220 gctcaataaa agagcccaca acccctcact cggcgcgcca gtcctccgat agactgcgtc 2280 gcccgggtac ccgtgtatcc aataaaccct cttgcagttg catccgactt gtggtctcgc 2340 tgttccttgg gagggtctcc tctgagtgat tgactacccg tcagcggggg tctttcatgg 2400 gtaacagttt cttgaagttg gagaacaaca ttctgagggt aggagtcgaa tattaagtaa 2460 tcctgactca attagccact gttttgaatc cacatactcc aatactcctg aaatccatcg 2520 atggagttca ttatggacag cgcagaaaga gctggggaga attgtgaaat tgttatccgc 2580 tcacaattcc acacaacata cgagccggaa gcataaagtg taaagcctgg ggtgcctaat 2640 gagtgagcta actcacatta attgcgttgc gctcactgcc cgctttccag tcgggaaacc 2700 tgtcgtgcca gctgcattaa tgaatcggcc aacgcgcggg gagaggcggt ttgcgtattg 2760 ggcgctcttc cgcttcctcg ctcactgact cgctgcgctc ggtcgttcgg ctgcggcgag 2820 cggtatcagc tcactcaaag gcggtaatac ggttatccac agaatcaggg gataacgcag 2880 gaaagaacat gtgagcaaaa ggccagcaaa aggccaggaa ccgtaaaaag gccgcgttgc 2940 tggcgttttt ccataggctc cgcccccctg acgagcatca caaaaatcga cgctcaagtc 3000 agaggtggcg aaacccgaca ggactataaa gataccaggc gtttccccct ggaagctccc 3060 tcgtgcgctc tcctgttccg accctgccgc ttaccggata cctgtccgcc tttctccctt 3120 cgggaagcgt ggcgctttct catagctcac gctgtaggta tctcagttcg gtgtaggtcg 3180 ttcgctccaa gctgggctgt gtgcacgaac cccccgttca gcccgaccgc tgcgccttat 3240 ccggtaacta tcgtcttgag tccaacccgg taagacacga cttatcgcca ctggcagcag 3300 ccactggtaa caggattagc agagcgaggt atgtaggcgg tgctacagag ttcttgaagt 3360 ggtggcctaa ctacggctac actagaagaa cagtatttgg tatctgcgct ctgctgaagc 3420 cagttacctt cggaaaaaga gttggtagct cttgatccgg caaacaaacc accgctggta 3480 gcggtggttt ttttgtttgc aagcagcaga ttacgcgcag aaaaaaagga tctcaagaag 3540 atcctttgat cttttctacg gggtctgacg ctcagtggaa cgaaaactca cgttaaggga 3600 ttttggtcat gagattatca aaaaggatct tcacctagat ccttttaaat taaaaatgaa 3660 gttttaaatc aatctaaagt atatatgagt aaacttggtc tgacagttac caatgcttaa 3720 tcagtgaggc acctatctca gcgatctgtc tatttcgttc atccatagtt gcctgactcc 3780 ccgtcgtgta gataactacg atacgggagg gcttaccatc tggccccagt gctgcaatga 3840 taccgcgaga cccacgctca ccggctccag atttatcagc aataaaccag ccagccggaa 3900 gggccgagcg cagaagtggt cctgcaactt tatccgcctc catccagtct attaattgtt 3960 gccgggaagc tagagtaagt agttcgccag ttaatagttt gcgcaacgtt gttgccattg 4020 ctacaggcat cgtggtgtca cgctcgtcgt ttggtatggc ttcattcagc tccggttccc 4080 aacgatcaag gcgagttaca tgatccccca tgttgtgcaa aaaagcggtt agctccttcg 4140 gtcctccgat cgttgtcaga agtaagttgg ccgcagtgtt atcactcatg gttatggcag 4200 cactgcataa ttctcttact gtcatgccat ccgtaagatg cttttctgtg actggtgagt 4260 actcaaccaa gtcattctga gaatagtgta tgcggcgacc gagttgctct tgcccggcgt 4320 caatacggga taataccgcg ccacatagca gaactttaaa agtgctcatc attggaaaac 4380 gttcttcggg gcgaaaactc tcaaggatct taccgctgtt gagatccagt tcgatgtaac 4440 ccactcgtgc acccaactga tcttcagcat cttttacttt caccagcgtt tctgggtgag 4500 caaaaacagg aaggcaaaat gccgcaaaaa agggaataag ggcgacacgg aaatgttgaa 4560 tactcatact cttccttttt caatattatt gaagcattta tcagggttat tgtctcatga 4620 gcggatacat 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actctttggt gcacccccct tagaggaggg atatgtggtt ctggtaggag 6360 acgagaacct aaaacagttc ccgcctccgt ctgaattttt gctttcggtt tgggaccgaa 6420 gccgcgccgc gcgtcttgtc tgctgcagca tcgttctgtg ttgtctctgt ctgactgtgt 6480 ttctgtattt gtctgaaaat atgggcccgg gctagcctgt taccactccc ttaagtttga 6540 ccttaggtca ctggaaagat gtcgagcgga tcgctcacaa ccagtcggta gatgtcaaga 6600 agagacgttg ggttaccttc tgctctgcag aatggccaac ctttaacgtc ggatggccgc 6660 gagacggcac ctttaaccga gacctcatca cccaggttaa gatcaaggtc ttttcacctg 6720 gcccgcatgg acacccagac caggtcccct acatcgtgac ctgggaagcc ttggcttttg 6780 acccccctcc ctgggtcaag ccctttgtac accctaagcc tccgcctcct cttcctccat 6840 ccgccccgtc tctccccctt gaacctcctc gttcgacccc gcctcgatcc tccctttatc 6900 cagccctcac tccttctcta ggcgccccca tatggccata tgagatctta tatggggcac 6960 ccccgcccct tgtaaacttc cctgaccctg acatgacaag agttactaac agcccctctc 7020 tccaagctca cttacaggct ctctacttag tccagcacga agtctggaga cctctggcgg 7080 cagcctacca agaacaactg gaccgaccgg tggtacctca cccttaccga gtcggcgaca 7140 cagtgtgggt ccgccgacac cagactaaga acctagaacc tcgctggaaa ggaccttaca 7200 cagtcctgct gaccaccccc accgccctca aagtagacgg catcgcagct tggatacacg 7260 ccgcccacgt gaaggctgcc gaccccgggg gtggaccatc ctctagaccg 7310 <210> 39 <211> 1800 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 39 atggccccgg ggcttttgtg ttgggccttg ctttgtttgc ttggggcagg cttggtggat 60 gctggagtca cacagtcacc cacacacctc attaaaacca ggggacaaca agtcactctg 120 cgctgcagtc ctaagtcagg ccatgacaca gtttcctggt atcaacaggc tctggggcag 180 ggccctcagt tcattttcca atattacgag gaagaggaac gccaacgcgg taatttcccc 240 gatcggttct ctgggcacca gttcccaaac tactcaagtg agttgaacgt aaatgctctc 300 ctcctcggag actccgccct ctacttgtgt gccagttctc ttggttggcg gggcggccga 360 tacaatgaac aattttttgg acctggtact cggctgaccg tgctagagga cctgcgcaac 420 gtcaccccac caaaggtcag tttgtttgag ccatcaaagg cggagatcgc caacaaacag 480 aaagctacgc tcgtgtgttt ggctcggggc ttcttcccag accacgtaga actttcctgg 540 tgggtcaatg gaaaggaggt tcattccgga gtgtccactg atccccaagc gtacaaggaa 600 tccaactata gctactgtct ctcatctcgg ctccgggtga gtgcgacatt ctggcataat 660 cctcggaacc actttcgatg ccaagtgcag tttcatgggt tgagcgagga agacaagtgg 720 cccgagggca gtcctaaacc agtcactcaa aacataagcg ccgaggcatg gggtagagcc 780 gattgtggga ttactagcgc ttcataccaa caaggggtat tgagcgctac aattctttac 840 gaaattctcc tcggcaaggc gacgctctac gccgtactgg tgtctactct cgtggttatg 900 gcaatggtga aacggaaaaa cagcagagcc aaaagaagtg gttctggcgc gacgaatttt 960 agtttgctta agcaagccgg agatgtggag gaaaatcctg gaccgatgtg gggtgtcttc 1020 cttttgtacg tcagcatgaa gatgggaggc actactgggc aaaacataga tcagcctacc 1080 gaaatgactg ctaccgaggg agccattgtc caaatcaact gcacctatca gactagcggc 1140 ttcaatggac tcttctggta ccaacagcat gcgggcgaag cacctacctt cttgtcctat 1200 aatgtcttgg atggtctcga agagaaaggc agattctcca gtttcctcag ccggagcaag 1260 ggatactcat atcttctcct gaaagagctt cagatgaagg attctgcatc ctatctctgt 1320 gcttcagtcg atggcaataa ccgactcgcc tttggaaaag ggaatcaagt ggtcgtcata 1380 ccgaatattc agaaccccga accagccgta tatcagttga aggacccaag atctcaggat 1440 agtacactct gtttgtttac ggactttgac tcacaaatca acgtcccgaa gactatggaa 1500 agtggtacgt tcatcacaga taagacggtt ctggacatga aggctatgga ctcaaagagc 1560 aacggggcaa ttgcttggtc caaccagaca agctttacct gtcaggacat ttttaaggag 1620 actaatgcta cttatccctc cagcgacgtt ccgtgtgatg cgactcttac cgagaagtct 1680 tttgagaccg atatgaatct caacttccag aatctgctgg tgatcgttct gcggatcctg 1740 cttctgaagg ttgcaggatt caatcttctt atgactctcc ggctctggtc ttcatgataa 1800 <210> 40 <211> 1800 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Synthetic <400> 40 atggccccgg ggcttttgtg ttgggccttg ctttgtttgc ttggggcagg cttggtggat 60 gctggagtca cacagtcacc cacacacctc attaaaacca ggggacaaca agtcactctg 120 cgctgcagtc ctaagtcagg ccatgacaca gtttcctggt atcaacaggc tctggggcag 180 ggccctcagt tcattttcca atattacgag gaagaggaac gccaacgcgg taatttcccc 240 gatcggttct ctgggcacca gttcccaaac tactcaagtg agttgaacgt aaatgctctc 300 ctcctcggag actccgccct ctacttgtgt gccagttctc ttggttggcg gggcggccga 360 tacaatgaac aattttttgg acctggtact cggctgaccg tgctagagga cctgcgcaac 420 gtcaccccac caaaggtcag 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cagatgaagg attctgcatc ctatctctgt 1320 gcttcagtcg atggcaataa ccgactcgcc tttggaaaag ggaatcaagt ggtcgtcata 1380 ccgaatattc agaaccccga accagccgta tatcagttga aggacccaag atctcaggat 1440 agtacactct gtttgtttac ggactttgac tcacaaatca acgtcccgaa gactatggaa 1500 agtggtacgt tcatcacaga taagtgcgtt ctggacatga aggctatgga ctcaaagagc 1560 aacggggcaa ttgcttggtc caaccagaca agctttacct gtcaggacat ttttaaggag 1620 actaatgcta cttatccctc cagcgacgtt ccgtgtgatg cgactcttac cgagaagtct 1680 tttgagaccg atatgaatct caacttccag aatctgctgg tgatcgttct gcggatcctg 1740 cttctgaagg ttgcaggatt caatcttctt atgactctcc ggctctggtc ttcatgataa 1800

Claims (35)

  1. 인유두종바이러스(HPV) 16 E7에 대한 항원 특이성을 갖는, 인간 가변 영역 및 뮤린 불변 영역을 포함하는 T 세포 수용체(TCR) 또는 상기 TCR의 기능성 변이체.
  2. 인유두종바이러스(HPV) 16 E7에 대한 항원 특이성을 갖는, 단리되거나 정제된 T 세포 수용체(TCR).
  3. 제 2 항에 있어서,
    인간 불변 영역을 포함하는, 단리되거나 정제된 TCR.
  4. 제 1 항 내지 제 3 항 중 어느 한 항에 있어서,
    TCR이 HPV 16 E711-19 서열번호 2에 대한 항원 특이성을 갖는, TCR 또는 기능성 변이체, 또는 단리되거나 정제된 TCR.
  5. 제 1 항 내지 제 4 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 3 내지 8의 아미노산 서열을 포함하는, TCR 또는 기능성 변이체, 또는 단리되거나 정제된 TCR.
  6. 제 1 항 내지 제 5 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 서열번호 9; 및
    (b) 위치 2에서의 X가 Ala 또는 Gly인 서열번호 10
    의 아미노산 서열을 포함하는, TCR 또는 기능성 변이체, 또는 단리되거나 정제된 TCR.
  7. 제 1 항 내지 제 6 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) (i) 위치 48에서의 X가 Thr 또는 Cys이고; (ii) 위치 112에서의 X가 Ser, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met 또는 Trp이고; (iii) 위치 114에서의 X가 Met, Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met 또는 Trp이고; (iv) 위치 115에서의 X가 Gly, Ala, Val, Leu, Ile, Pro, Phe, Met 또는 Trp인 서열번호 16; 및
    (b) 위치 56에서의 X가 Ser 또는 Cys인 서열번호 18
    의 아미노산 서열을 포함하는, TCR 또는 기능성 변이체, 또는 단리되거나 정제된 TCR.
  8. 제 1 항 내지 제 7 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) 서열번호 14, 17, 21, 24 및 25 중 어느 하나; 및
    (b) 서열번호 15, 19 및 23 중 어느 하나
    의 아미노산 서열을 포함하는, TCR 또는 기능성 변이체, 또는 단리되거나 정제된 TCR.
  9. 제 1 항 내지 제 8 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (a) (i) 서열번호 12, (ii) 서열번호 22, (iii) 서열번호 26, (iv) 서열번호 9 및 24, (v) 서열번호 9 및 16, 또는 (vi) 서열번호 9 및 17; 및
    (b) (i) 서열번호 10 및 18, 또는 (ii) 서열번호 13, 20 및 27중 어느 하나
    의 아미노산 서열을 포함하는, TCR 또는 기능성 변이체, 또는 단리되거나 정제된 TCR.
  10. 제 1 항 내지 제 9 항 중 어느 한 항에 있어서,
    서열번호 29 또는 30의 아미노산 서열을 포함하는, TCR 또는 기능성 변이체, 또는 단리되거나 정제된 TCR.
  11. (i) 제 1 항 및 제 4 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 TCR 또는 기능성 변이체, 또는 (ii) 제 2 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 단리되거나 정제된 TCR의 기능성 부분을 포함하는, 단리되거나 정제된 폴리펩티드로서,
    상기 기능성 부분이 (a) 서열번호 3 내지 5, (b) 서열번호 6 내지 8, 또는 (c) 서열번호 3 내지 8의 아미노산 서열을 포함하는, 단리되거나 정제된 폴리펩티드.
  12. (i) 제 1 항 및 제 4 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 TCR 또는 기능성 변이체, 또는 (ii) 제 2 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 단리되거나 정제된 TCR의 기능성 부분을 포함하는 폴리펩티드로서,
    상기 기능성 부분이 (a) 서열번호 9, (b) 서열번호 10, 또는 (c) 서열번호 9 및 10의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 10의 위치 2에서의 X가 Ala 또는 Gly이고, 서열번호 10의 위치 2에서의 X가 Gly일때, 폴리펩티드가 단리되거나 정제되는, 폴리펩티드.
  13. (i) 제 1 항 및 제 4 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 TCR 또는 기능성 변이체, 또는 (ii) 제 2 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 단리되거나 정제된 TCR의 기능성 부분을 포함하는 폴리펩티드로서,
    상기 기능성 부분이 (a) (i) 서열번호 9 및 24, (ii) 서열번호 9 및 17, (iii) 서열번호 9 및 16, (iv) 서열번호 10 및 18, 또는 (v) 서열번호 12, 13, 20, 22, 26, 27, 29 및 30 중 어느 하나; (b) 서열번호 12 및 13; (c) 서열번호 20 및 22; (d) 서열번호 26 및 27; (e) 서열번호 9, 24 및 27; (f) 서열번호 9, 17 및 20; 또는 (f) 서열번호 9, 10, 16 및 18의 아미노산 서열을 포함하고, 서열번호 12 및 13 중 하나 또는 둘 다의 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩티드가 단리되거나 정제되는, 폴리펩티드.
  14. 하나 이상의 제 11 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 단리되거나 정제된 단백질, 또는 하나 이상의 제 12 항 또는 제 13 항에 따른 폴리펩티드를 포함하는 단백질.
  15. 제 14 항에 있어서,
    서열번호 3 내지 5의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드쇄, 및 서열번호 6 내지 8의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드쇄를 포함하는, 단리되거나 정제된 단백질.
  16. 제 14 항 또는 제 15 항에 있어서,
    서열번호 9의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드쇄, 및 서열번호 10의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드쇄를 포함하는 단백질로서,
    (i) 서열번호 10의 위치 2에서의 X가 Ala 또는 Gly이고;
    (ii) 서열번호 10의 위치 2에서의 X가 Gly인 서열번호 9 및 10을 포함하는 단백질이 단리되거나 정제되는,
    단백질.
  17. 제 14 항 내지 제 16 항 중 어느 한 항에 있어서,
    (i) 서열번호 12, (ii) 서열번호 22, (iii) 서열번호 26, (iv) 서열번호 9 및 16, (v) 서열번호 9 및 17, 또는 (vi) 서열번호 9 및 24의 아미노산 서열을 포함하는 제 1 폴리펩티드쇄; 및
    (i) 서열번호 10 및 18, 또는 (ii) 서열번호 13, 20 및 27 중 어느 하나의 아미노산 서열을 포함하는 제 2 폴리펩티드쇄
    를 포함하는 단백질로서,
    서열번호 12 및 13을 포함하는 단백질이 단리되거나 정제되는, 단백질.
  18. 서열번호 29 또는 30을 포함하는 단백질.
  19. 제 14 항 내지 제 18 항 중 어느 한 항에 있어서,
    융합 단백질인, 단백질.
  20. 제 14 항 내지 제 19 항 중 어느 한 항에 있어서,
    재조합 항체인, 단백질.
  21. (a) 제 1 항 및 제 4 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 TCR 또는 기능성 변이체, 제 12 항 또는 제 13 항에 따른 폴리펩티드, 또는 제 14 항 및 제 16 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 서열; 또는
    (b) 제 2 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 TCR, 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 또는 제 14 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 따른 단백질을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단리되거나 정제된 핵산 서열.
  22. 제 21 항에 있어서,
    서열번호 31, 서열번호 32, 또는 서열번호 31 및 32 둘 다의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 단리되거나 정제된 핵산.
  23. 제 21 항에 있어서,
    (a) 서열번호 33 내지 36 중 어느 하나, (b) 서열번호 33 및 34 둘 다, 또는 (c) 서열번호 35 및 36 둘 다의 뉴클레오티드 서열을 포함하는, 핵산.
  24. 제 21 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 핵산을 포함하는 재조합 발현 벡터.
  25. 제 24 항에 있어서,
    베타쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열이 알파쇄를 암호화하는 뉴클레오티드 서열의 5'에 위치하는, 재조합 발현 벡터.
  26. 제 24 항 또는 제 25 항에 있어서,
    서열번호 37, 38, 39 또는 40을 포함하는, 재조합 발현 벡터.
  27. 제 24 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 발현 벡터를 포함하는 숙주 세포.
  28. 제 27 항에 있어서,
    세포가 인간 세포인, 숙주 세포.
  29. 하나 이상의 제 27 항 또는 제 28 항에 따른 숙주 세포를 포함하는 세포 집단.
  30. (i) 제 1 항 및 제 4 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 TCR 또는 기능성 변이체, 또는 (ii) 제 2 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 단리되거나 정제된 TCR의 기능성 부분에 특이적으로 결합하는 항체 또는 그의 항원 결합 부분으로서,
    상기 기능성 부분이 서열번호 3 내지 8의 아미노산 서열을 포함하는, 항체 또는 그의 항원 결합 부분.
  31. 제 1 항 및 제 4 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 TCR 또는 기능성 변이체, 제 2 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 단리되거나 정제된 TCR, 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제 14 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 따른 단백질, 제 21 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 핵산, 제 24 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 발현 벡터, 제 27 항 또는 제 28 항에 따른 숙주 세포, 제 29 항에 따른 세포 집단, 또는 제 30 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 및 약학적으로 허용되는 담체를 포함하는 약학 조성물.
  32. (a) 포유동물로부터의 하나 이상의 세포를 포함하는 샘플을, 제 1 항 및 제 4 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 TCR 또는 기능성 변이체, 제 2 항 내지 제 10 항 중 어느 한 항에 따른 단리되거나 정제된 TCR, 제 11 항 내지 제 13 항 중 어느 한 항에 따른 폴리펩티드, 제 14 항 내지 제 20 항 중 어느 한 항에 따른 단백질, 제 21 항 내지 제 23 항 중 어느 한 항에 따른 핵산, 제 24 항 내지 제 26 항 중 어느 한 항에 따른 재조합 발현 벡터, 제 27 항 또는 제 28 항에 따른 숙주 세포, 제 29 항에 따른 세포 집단, 제 30 항에 따른 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 또는 제 31 항에 따른 약학 조성물과 접촉시켜 복합체를 생성하는 단계; 및
    (b) 상기 복합체를 검출하는 단계로서, 상기 복합체의 검출이 포유동물에서 질병의 존재를 나타내고, 상기 질병이 암, HPV 16 감염 또는 HPV-양성 전암인, 단계
    를 포함하는, 포유동물에서 상기 질병의 존재를 검출하는 방법.
  33. 제 1 항 내지 제 31 항 중 어느 한 항에 있어서,
    포유동물에서, 암, HPV 16 감염 또는 HPV-양성 전암인 질병의 치료 또는 예방에 사용하기 위한, TCR 또는 기능성 변이체, 단리되거나 정제된 TCR, 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포 집단, 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 또는 약학 조성물.
  34. 제 33 항에 있어서,
    질병이 자궁경부, 구강인두, 항문, 항문관, 항문직장, 질, 외음부 또는 음경의 암인, TCR, 기능성 변이체, 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포 집단, 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 또는 약학 조성물.
  35. 제 33 항 또는 제 34 항에 있어서,
    질병이 HPV 16-양성 암인, TCR, 기능성 변이체, 폴리펩티드, 단백질, 핵산, 재조합 발현 벡터, 숙주 세포, 세포 집단, 항체 또는 그의 항원 결합 부분, 또는 약학 조성물.
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