KR101078202B1 - 재조합 루브리신 분자 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본원에서는 신규한 재조합 루브리신 분자 및 윤활제, 항유착제 및/또는 예를 들어, 활막성 관절, 반월연골, 건, 복막, 심장막 및 흉막에 대한 관절내 보충물로서의 이의 용도가 제공된다.

루브리신 분자, 윤활제, 항유착제, 관절내 보충물, PRG4 유전자의 엑손 6, KEPAPTT-유사 서열 반복부

Description

재조합 루브리신 분자 및 이의 용도{Recombinant lubricin molecules and uses thereof}

본 발명은 신규한 재조합 루브리신(lubricin) 분자 및 윤활제, 항유착제 및/또는 예를 들어, 활막성 관절, 반월연골, 건, 복막, 심장막 및 흉막에 대한 관절내 보충물로서의 이의 용도에 관한 것이다.

활막성 관절의 최적의 기능성은 관절을 이루는 조직들 간의 극히 낮은 마찰계수에 의존한다. 정상적으로는, 인접한 잘 윤활된 표면은 관절 연골에서 유지된다. 그러나, 골관절염(OA) 동안에 감소된 윤활성은 연골 매트릭스 분해 및 세동에 기여하고; 이는 다시 관절 기능부전 및 통증에 기여한다. 감소된 윤활성은 또한 류마티스 관절염(RA)을 포함하는 관절염의 다른 형태인 관절 기능부전 및 통증을 유도한다.

다른 조직(예: 건)의 경우, 윤활된 표면은 최적의 기능성에도 기여한다. 윤활된 표면을 요구하는 것 이외에, 정상적인 건 기능을 위해서는 건 표면에의 세포 유착의 방지가 요구된다. 예를 들어, 굴근 건 손상 및 복구에 있어서, 건 유착의 형성은 가장 통상적인 합병증이다.

천연 루브리신 단백질은 거대핵세포 자극 인자(MSF) 전구체 단백질과 관련된다. PRG4(프로테오글리칸 4)는 UCL/HGNC/HUGO 사람 유전자 명명법 데이타베이스에서 채택된 MSF의 명칭이다. PRG4 단백질(즉, MSF 전구체 단백질)은 US6433142 및 US20020137894(본원에서 인용된 모든 특허 및 특허원은 이의 전문이 참조로 인용된다)에 기재되어 있다. PRG4 유전자의 엑손 6에 의해 암호화되는 폴리펩타이드는 상당히 글리코실화되어 있으며 예를 들어, PRG4-관련 단백질의 관절 연골의 표면들 간에 윤활제로서 작용하는데 필수적인 것으로 보인다.

연구에 의해 PRG4 당단백질은 또한 건초(tendon sheath)를 구성하는 내막 윤활막세포에 의해 합성되고, 이 당단백질은 건 세포(tenocyte)로부터도 유래될 가능성이 매우 크다는 것이 밝혀졌다[참조: Rees et al., 2002]. 상기 당단백질은 건의 섬유연골성 영역에 주로 존재한다. 활액 기능과 보완되는 방식으로, 상기 당단백질은 건 표면에의 세포 유착을 방지할 뿐만 아니라 정상적 건 기능 동안 윤활성을 제공함으로써 중요한 세포보호 역할을 할 수 있다.

PRG4("루브리신"으로도 지칭됨) 유전자의 엑손 6은 대략 76 내지 78개의KEPAPTT-유사 서열 반복부 및 6개의 XXTTTX-유사 서열 반복부를 암호화한다. 본 발명에 따른 재조합 루브리신 단백질내의 유사한 반복 서열의 수를 변화시킴으로써 관절내 윤활을 증진시키고 조직들간의 목적하지 않는 유착을 상쇄시키기 위한 개선된 생물요법을 개발할 수 있다.

발명의 개요

본 발명은 신규 재조합 루브리신 분자 및 윤활제, 항유착제 및/또는 관절내 보충물로서의 이의 용도에 관한 것이다.

발현 파라미터를 최적화하고 모든 약 76 내지 78개의 KEPAPTT-유사 서열의 기능적 필요성을 조사하기 위해, 다양한 O-연결된 올리고사카라이드 치환도를 갖는 재조합 루브리신 단백질을 합성할 수 있도록 하는 루브리신 발현 작제물을 고안하였다. 이는 가변적 수의 KEPAPTT-유사 서열을 엑손 1 내지 5, 엑손 6의 5'- 및 3'-플랭킹(flanking) 영역 및 엑손 7 내지 12로 구성된 "코어" cDNA 작제물내로 혼입시킴으로써 달성된다. 다중 KEPAPTT-유사 서열을 암호화하는 "합성 cDNA 카셋트"를 반복적으로 삽입시킴으로써 상이한 크기의 재조합 루브리신 작제물의 제조가 용이해진다. 이들 연구의 초기 주안점은 PRG4-Lub:1(4개의 KEPAPTT 서열을 암호화하는 "합성 cDNA 카셋트-1"의 DNA(서열번호 1)를 함유함)를 작제하는데 있었다.

본 발명의 재조합 루브리신 단백질은 천연 사람 루브리신의 몇몇 동종형과 1차 구조를 공유한다[참조: US6743774, US20040072741 및 WO0064930]. 특성화된 동종형들 중에서, 각각의 동종형은 해당 동종형의 1차 구조를 암호화하는 PRG4 유전자 엑손의 조성이 서로 상이하다. 예를 들어, PRG4 유전자의 엑손 1 내지 12는 전체길이 동종형을 나타내는 V0 동종형을 암호화하는 반면에, 엑손 1 내지 4 및 6 내지 12는 엑손 5에 의해 암호화되는 절편만이 결여된 V1 동종형을 암호화한다. 엑손 1 내지 3 및 6 내지 12는 엑손 4 및 5에 의해 암호화하는 절편만이 결여된 V2 동종형을 암호화한다. 마지막으로, 엑손 1, 3 및 6 내지 12는 엑손 2, 4 및 5에 의해 암호화되는 절편이 결여된 V3 동종형을 암호화한다. 다른 동종형도 또한 존 재하며, 몇가지 관련 돌연변이 단백질의 일부가 기술된 바 있다[참조: US20020086824].

특히, 본 발명은 반복적 KEPAPTT-유사 서열을 포함하는 재조합 루브리신 단백질을 제공한다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 서열번호 9, 13, 17, 21 또는 25를 포함하는 분리된 단백질을 제공한다. 관련 양태에서, 본 발명은 서열번호 7, 11, 15, 19 또는 23을 포함하는 분리된 단백질을 제공한다. 추가의 관련 양태에서, 본 발명은 재조합 루브리신 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 바람직한 양태에서, 본 발명은 당해 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다. 추가의 관련 양태에서, 본 발명은 당해 서열의 전체 길이에 걸쳐서 서열번호 6, 10, 14, 18 또는 22와 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖는 분리된 폴리뉴클레오타이드를 제공한다.

관련 측면에서, 본 발명은 서열번호 27의 (N - 2)개 반복부(들)(여기서, N은 3 내지 200의 정수이다)에 연결된 서열번호 26을 포함하는 분리된 단백질을 또한 제공한다. 추가의 관련 양태에서, 본 발명은 서열번호 26 + 서열번호 28 + [서열번호 27의 (N - 2)개 반복부(들)(여기서, N은 3 내지 200의 정수이다)] + 서열번호 29를 포함하는 분리된 단백질을 제공한다. 본 단락에서 주지된 본 발명의 관련 측면의 양태에 있어서, 보다 바람직하게는 N은 5 내지 50의 정수, 보다 더욱 바람직하게는 10 내지 30의 정수이다.

서열 식별 번호를 갖는 서열의 확인

서열 번호	확인
1	합성 cDNA 카셋트-1의 뉴클레오타이드 서열:155개 염기
2	서열번호 1의 해독물: 51개 아미노산
3	합성 cDNA 카셋트-2의 뉴클레오타이드 서열: 125개 염기
4	서열번호 3의 해독물: 41개 아미노산
5	재조합 PRG4-Lub:1 cDNA 작제물을 함유하는 pTmed2 벡터: 8049개 염기
6	재조합 PRG4-Lub:1 cDNA 작제물: 2946개 염기
7	전체 PRG4-LUB:1 단백질의 아미노산 서열: 981개 아미노산
8	합성 cDNA 카셋트-1로부터의 Lub:1 DNA 삽입체: 157개 염기
9	Lub:1 DNA 삽입체에 의해 암호화되는 51개 아미노산 (서열번호 7의 S373과 E425 간의 4개의 KEPAPTT 서열)
10	재조합 PRG4-Lub:2 cDNA 작제물: 3024개 염기
11	전체 PRG4-LUB:2 단백질의 아미노산 서열: 1007개 아미노산
12	합성 cDNA 카셋트-1과 1개의 합성 cDNA 카셋트-2 서열로부터의 Lub:2 DNA 삽입체: 235개 염기
13	Lub:2 DNA 삽입체에 의해 암호화되는 77개 아미노산(서열번호 11의 S373과 E451 사이의 6개 KEPAPTT)
14	재조합 PRG4-Lub:3 cDNA 작제물: 3117개 염기
15	전체 PRG4-LUB:3 단백질의 아미노산 서열: 1038개 아미노산
16	합성 cDNA 카셋트-1과 2개의 합성 cDNA 카셋트-2 서열로부터의 Lub:3 DNA 삽입체: 328개 염기
17	Lub:3 DNA 삽입체에 의해 암호화되는 108개 아미노산(서열번호 15의 S373과 E482 사이의 9개 KEPAPTT 서열)
18	재조합 PRG4-Lub:4 cDNA 작제물: 3210개 염기
19	전체 PRG4-LUB:4 단백질의 아미노산 서열: 1069개 아미노산
20	cDNA 카셋트-1과 3개의 합성 cDNA 카셋트-2 서열로부터의 Lub:4 DNA 삽입체: 421개 염기
21	Lub:4 DNA 삽입체에 의해 암호화되는 139개 아미노산(서열 19 의 S373과 E513 사이의 12개 KEPAPTT 서열)
22	재조합 PRG4-Lub:5 cDNA 작제물: 3303개 염기
23	전체 PRG4-LUB:5 단백질의 아미노산 서열: 1100개 아미노산
24	cDNA 카셋트-1과 4개의 합성 cDNA 카셋트-2 서열로부터의 Lub:5 DNA 삽입체: 514개 염기
25	Lub:5 DNA 삽입체에 의해 암호화되는 170개 아미노산(서열번호 23의 S373과 E544 사이의 15개 KEPAPTT 서열)
26	바람직한 PRG4-LUB:N 단백질내 아미노산 서열 "APTTPKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTT KEPAPTTPKEPAPTTTK"(45개 아미노산)
27	바람직한 PRG4-LUB:N 단백질내 N-1회 반복된 아미노산 서열 "KEPAPTTTKEPAPTTTKSAPTTP KEPAPTTP"(31개 아미노산)
28	바람직한 PRG4-LUB:N 단백질(여기서, N ≥3)에서 서열번호 26을 서열번호 27의 (N-2)개 반복부에 연결시키는 아미노산 서열 "EPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP" (22개 아미노산)
29	바람직한 PRG4-LUB:N 단백질(여기서, N≥2)내 아미노산 서열 "KEPKPAPTTP" (10개 아미노산)

본 발명은, 관련 양태에서, 약제학적으로 허용되는 담체 중에 치료학적 유효량의 재조합 루브리신 단백질을 포함하는 조성물을 또한 제공한다. 일부 양태에서, 당해 조성물은 하이알루로난 또는 하일란(hylan)을 추가로 포함한다.

본 발명은 재조합 루브리신 단백질 조성물을 수득하는 단계 및 상기 조성물을 피험체의 조직에 투여하는 단계를 포함하는, 피험체의 치료 방법을 제공한다. 본 발명의 관련 양태에서, 조직은 연골, 활막, 반월연골, 건, 복막, 심장막 및 흉막으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 본 발명의 방법의 추가의 관련 양태에서, 당해 방법은 피험체에게 마취제를 제공하는 단계; 소염 약물을 피험체에게 제공하는 단계; 항생제를 피험체에게 제공하는 단계; 피험체로부터 체액을 흡인하는 단계; 피험체의 조직을 세척하는 단계; 피험체의 조직을 영상화하는 단계로 이루어진 그룹으로부터 선택된 단계를 추가로 포함한다. 다른 관련 양태에서, 피험체는 마우스, 랫트, 고양이, 개, 말 및 사람으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다.

다른 양태에서, 본 발명은 또한 재조합 루브리신 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터를 제공하며, 이때 당해 폴리뉴클레오타이드는 발현 조절 서열에 작동적으로 연결되어 있다. 관련 양태에서, 본 발명은 당해 발현 벡터로 형질전환된 세포를 액체 배양 배지 중에서 성장시키는 단계 및 상기 배지로부터 재조합 루브리신 단백질을 수집하는 단계를 포함하는, 재조합 루브리신 단백질의 제조 방법을 제공한다. 단백질을 수집하는 단계는, 배지를 막을 통해 여과하여 단백질을 농축시키고; 보유된 단백질을 상기 막으로부터 수집하고; 수집된 단백질을 0.1 내지 2.0M 농도 범위의 L-아르기닌 하이드로클로라이드를 함유하는 완충된 염 용액에서 가용화시킴을 추가로 포함할 수 있다.

다른 관련 양태에서, 본 발명은 재조합 루브리신 단백질에 특이적인 분리된 항체를 제공한다.

본 발명의 다른 특징 및 이점은 다음의 바람직한 양태의 설명 및 청구의 범위로부터 명백할 것이다.

재조합 루브리신 단백질을 제조하는데 사용되는 기본적 DNA 작제물은 PRG4 유전자의 엑손 6의 5' 및 3'에 서열의 가변적 배열을 포함할 수 있다. 예를 들어, 기본적 DNA 작제물은 소마토메딘 B-유사 도메인을 암호화하는 서열(엑손 2 내지 4) 또는 헤모펙신-유사 도메인을 암호화하는 서열(엑손 7 내지 9)의 가변적 배열을 포함할 수 있다.

엑손 6의 3'에 다양한 엑손 배열을 갖는 기본적 DNA 작제물의 양태는 오직 엑손 7, 8, 9, 10, 11 또는 12만을 개별적으로 포함할 수 있거나, 엑손 쌍(7 및 8), (7 및 9), (7 및 10), (7 및 11), (7 및 12), (8 및 9), (8 및 10), (8 및 11), (8 및 12), (9 및 10), (9 및 11), (9 및 12), (10 및 11), (10 및 12) 또는 (11 및 12), 또는 엑손 3개쌍(7, 8 및 9), (7, 8 및 10), (7, 8, 및 11), (7, 8, 및 12), (7, 9 및 10), (7, 9 및 11), (7, 9 및 12), (7, 10 및 11), (7, 10 및 12), (7, 11 및 12), (8, 9 및 10), (8, 9 및 11), (8, 9 및 12), (8, 10 및 11), (8, 10 및 12), (8, 11 및 12), (9, 10 및 11), (9, 10 및 12), (9, 11 및 12) 또는 (10, 11 및 12), 또는 엑손 4개쌍(7, 8, 9 및 10), (7, 8, 9 및 11), (7, 8, 9 및 12), (7, 8, 10 및 11), (7, 8, 10 및 12), (7, 8, 11 및 12), (7, 9, 10 및 11), (7, 9, 10 및 12), (7, 9, 11 및 12), (7, 10, 11 및 12), (8, 9, 10 및 11), (8, 9, 10 및 12), (8, 9, 11 및 12), (8, 10, 11 및 12) 또는 (9, 10, 11 및 12), 또는 엑손 5개쌍(7, 8, 9, 10 및 11), (7, 8, 9, 10 및 12), (7, 8, 9, 11 및 12), (7, 8, 10, 11 및 12), (7, 9, 10, 11 및 12) 또는 (8, 9, 10, 11 및 12), 또는 엑손 6개쌍(7, 8, 9, 10, 11 및 12)을 포함하는 기본적 DNA 작제물을 포함할 수 있다.

또한, 엑손 6의 5'에 다양한 엑손 배열을 갖는 기본적 DNA 작제물의 양태는 오직 엑손 1, 2, 3, 4 또는 5만을 개별적으로 포함하거나, 엑손 쌍(1 및 2), (1 및 3), (1 및 4), (1 및 5), (2 및 3), (2 및 4), (2 및 5), (3 및 4), (3 및 5) 또는 (4 및 5), 또는 엑손 3개쌍(1, 2 및 3), (1, 2 및 4), (1, 2 및 5), (1, 3 및 4), (1, 3 및 5), (1, 4 및 5), (2, 3 및 4), (2, 3 및 5), (2, 4 및 5) 또는 (3, 4 및 5), 또는 엑손 4개쌍(1, 2, 3 및 4), (1, 2, 3 및 5), (1, 2, 4 및 5), (1, 3, 4 및 5) 또는 (2, 3, 4 및 5), 또는 엑손 5개쌍(1, 2, 3, 4 및 5)을 포함하는 기본적 DNA 작제물을 포함할 수 있다.

본 발명은 또한 기본적 DNA 작제물에 의해 암호화되는 단백질, 즉 엑손 6 서열-암호화된 폴리펩타이드의 일부분 또는 모두가 결실되어 있고 합성 cDNA 카셋트로부터의 삽입체에 의해 암호화된 아미노산이 부가되지 않은 단백질을 포함한다.

본 발명은 또한 본원에서 개요된 구체적 양태에 상동성인, 예를 들어, 구체화된 DNA 서열과 80%, 85%, 90%, 95%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 서열 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명은 추가로 높은 엄격성 조건하에 구체화된 DNA 서열의 상보체에 기능적 도메인의 길이에 걸쳐서 하이브리드화할 수 있는 핵산 서열을 갖는 폴리뉴클레오타이드를 포함한다. 본 발명은 또한 이러한 상동성 또는 하이브리드화 폴리뉴클레오타이드에 의해 암호화되는 단백질을 포함한다.

본 발명의 양태를 보다 명확히 기술하기 위해 다음 정의들이 제공된다.

정의. "반복적 KEPAPTT-유사 서열"이란 어구는 (a) 서열 "APTTPKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTTKEPAPTTPKEPAPTTTK"(서열번호 26; 45개 아미노산), (b) 서열 "KEPAPTTTKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP"(서열번호 27; 31개 아미노산) 또는 (c) 서열 "EPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP" (서열번호 28; 22개 아미노산)와 90%, 93%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 이상의 동일성을 갖고 1개 이상의 O-연결된 치환을 갖는 아미노산 서열을 의미한다. 반복적 KEPAPTT-유사 서열은 바람직하게는 2개, 3개 또는 4개 이상의 O-연결된 치환을 가질 수 있다.

두 폴리뉴클레오타이드 또는 폴리펩타이드 서열 간의 동일성을 측정하기 위한 다수의 방법이 존재하며, "동일성"이란 용어는 당해 분야의 숙련가에게 익히 공지되어 있으며 소정의 구체화된 방법과 관련하여 명확한 의미를 갖는다. 본원에서 기술하는 서열 동일성은 NCBI(http://ncbi.nlm.nih.gov/blast: 또한 Tatusova and Madden (1999)를 참조)를 통해 입수가능한 BLAST 2 SEQUENCES 툴을 사용하여 측정한다. 아미노산 서열의 경우, 사용되는 파라미터는 다음과 같다: 예상치 = 1000; 워드 크기 = 2; 필터= 오프. 다른 파라미터는 데폴트 값으로 설정한다. 이러한 동일한 파라미터는 워드 크기가 8인 것을 제외하고는 핵산 서열의 경우에도 사용된다. 아미노산 서열 비교를 위한 데폴트 값은 행렬 = BLOSUM62; 개방갭 = 11; 연장 갭 = 1 페널티; 및 갭 x_드롭오프 = 50이다. 핵산 서열 비교를 위한 데폴트 값은 다음을 포함한다: 매치에 대한 보상 = 1; 미스매치에 대한 패널티 = 2; 스트랜드 옵션 = 두 스트랜드 모두; 개방 갭 = 5; 연장 갭 = 2 페널티; 및 갭 x_드롭오프 = 50.

재조합 루브리신의 O-연결된 치환은 윤활성 올리고사카라이드 β-(1-3)-Gal-GalNac, 또는 인공 또는 천연 탄수화물 잔기(예: 케라틴 설페이트 또는 콘드로이틴 설페이트)를 포함하는 다른 잔기로의 치환일 수 있다. 일부 양태에서, O-연결된 치환은 표면활성 인지질(SAPL) 또는 표면활성제의 운반체로서 작용하는 재조합 루브리신의 능력에 기여하는 잔기로의 치환일 수 있다. 글리코실화율(%) 또는 치환율(%)은 중량(건식 중량)에 의해 결정된다.

높은 엄격성 조건은, DNA:DNA 하이브리드화와 관련하여 사용되어, 약 500개 뉴클레오타이드 길이의 프로브가 사용되는 경우 5X SSPE(43.8 g/l NaCl, 6.9 g/l NaH₂PO₄H₂O 및 1.85 g/l EDTA, NaOH를 사용하여 7.4로 조정된 pH), 0.5% SDS, 5X 덴하르트 시약 및 100㎍/ml 변성된 연어 정액 DNA로 이루어진 용액 속에서 42℃에서의 결합 또는 하이브리드화에 이어서 42℃에서 0.1X SSPE, 1.0% SDS를 포함하는 용액 속에서의 세척에 동등한 조건을 포함한다.

본원에서 기술되는 폴리펩타이드 또는 다른 화합물은 이들이 관심대상의 화합물 50중량%(건식 중량) 이상인 제제내에 있는 경우에 "분리된" 것으로 언급된다. 본원에서 기술되는 폴리펩타이드 또는 다른 화합물은 이들이 관심대상의 화합물 80중량%(건식 중량) 이상인 제제내에 있는 경우에 "실질적으로 순수한" 것으로 언급된다. 본원에서 기술되는 폴리펩타이드 또는 다른 화합물은 이들이 관심대상의 화합물 95중량%(건식 중량) 이상, 바람직하게는 99중량%(건식 중량)인 제제내에 있는 경우에 "균질한" 것으로 언급된다. 순도는 환원 폴리아크릴아미드 겔 전기영동 및 증강된 쿠마시 블루 염색에 이어서 밴드의 광학 밀도 추적에 의해 측정한다(즉, 단백질 순도는 광학 밀도측정계를 통해서 측정한다).

"피로겐 비함유"는 내독소를 포함하여 열을 유발하는 오염원을 함유하지 않음을 의미한다. 오염원의 측정은 미국 식품의약청에 의해 설정된 적용가능한 표준 시험법으로 수행될 것이다.

본원에서 사용되는 바와 같이, "치료학적 유효량"이란 용어는 의미있는 환자 이익, 즉 관련 의학적 상태의 치료, 치유, 예방 또는 경감 또는 이러한 상태의 치료, 치유, 예방 또는 경감 속도의 증가를 나타내기에 충분한 관련 약제학적 조성물 또는 방법의 각 활성 성분의 총량을 의미한다. 단독으로 투여되는 개개의 활성 성분에 적용되는 경우, 상기 용어는 단독의 성분만을 의미한다. 배합물에 적용되는 경우, 상기 용어는 연속적으로 또는 동시에 투여되든지 간에 배합되어 치료학적 효과를 야기하는 활성 성분의 배합된 양을 의미한다.

본 발명의 양태는 관절내 보충물로서 사용될 수 있다. 루브리신으로부터 유래되지 않은 화합물로의 관절내 보충이 관절 요법으로서 실시되어 왔다. 예를 들어, 중합체성 하이알루로난(HA) 및 고분자량 하일란(예: SYNVISC^R 점탄성액 "하일란 G-F 20"; 배급원: WYETH^R Pharmaceuticals)으로의 "점성보충(viscosupplementation)"이 OA-관련 슬개 통증을 치료하는데 임상적으로 사용되고 있다. 이러한 점성보충은 특히 환자의 체중-부하 통증을 감소시키는데 있어서 현저한 치료학적 유용성을 보여주었다[참조: Wobig et al., 1998].

하일란 G-F 20은 수탉 또는 병아리 볏으로부터 수득된 몇몇 HA 분자를 가교결합시켜 제조된다. 하일란 G-F 20으로의 점성보충은 저분자량 HA로의 점성보충에 비해서 통증을 감소시키는데 있어 실질적으로 보다 효과적일 수 있다[참조: Wobig et al., 1999]. 또한, 하일란 G-F 20으로의 점성보충에 의한 통증 경감은 NSAID를 허용하지 않는 환자(예를 들어, 위장관 합병증의 위험이 높은 환자; 참조: Espallargues and Pons, 2003)의 경우에 NSAID를 투여하는 것보다 특히 바람직할 수 있다. 하일란 G-F 20 점성보충은 통증 증상의 단기간(즉, 치료후 3 내지 6개월 후까지) 감소를 제공하면서 관절 기능을 개선시키는 안전하고 잘 허용되는 요법이지만, 이 요법은 OA 환자에서 슬관절 대치술의 궁극적 필요성을 현저하게 감소시키지 못한다[참조: Espallargues and Pons, 2003].

실시예 1: 재조합 루브리신의 클로닝

작제. 일부 양태에서, 재조합 루브리신 분자를 제조하기 위한 기본적 DNA 작제물은 서열번호 6의 Met 코돈(ATG) 내지 BssHII 제한 부위(G^CGCGC)(즉, 염기 번호 1번 내지 1123번) 및 서열번호 6의 BspEI 제한 부위 (T^CCGGA) 내지 종결 코돈(TAA)(즉, 염기 번호 1269번 내지 2946번)으로 이루어진다. 이들 서열, 즉, 서열번호 6의 염기 번호 1번 내지 1123번 및 1269번 내지 2946번은 천연 전체길이 루브리신(즉, PRG4)의 아미노산 M1 내지 S373(엑손 1 내지 5, 및 엑손 6의 약 174개 플랭킹 5'-코돈에 의해 암호화됨) 및 E848 내지 P1404(엑손 6의 약 293개 플랭킹 3'-코돈 및 엑손 7 내지 14에 의해 암호화됨)을 암호화한다. 당해 기본적 DNA 작제물에 존재하지 않는 엑손 6의 부분은 천연 PRG4의 아미노산 A374 내지 P847을 암호화하는 DNA 서열에 상응한다(엑손 6에 의해 암호화되는 940개 아미노산 중 474개 아미노산이 부재이다). 이러한 부재 아미노산 서열은 KEPAPTT-유사 서열에 풍부하다.

합성 cDNA 카셋트-1의 DNA 서열(서열번호 1)은 재조합 PRG4-Lub:1 cDNA 작제물(서열번호 6)을 제조하기 위해 당해 기본적 작제물에 부가되는 BssHII/BspEI이다. 서열번호 6은 천연 PRG4의 아미노산 M1 내지 S373를 암호화하는 DNA와 E848 내지 P1404를 암호화하는 DNA 사이에 있는 Lub:1 DNA 삽입체(서열번호 8; 서열번호 9의 51개 아미노산과 함께 이의 4개의 KEPAPTT 서열을 암호화함)로 이루어진다. 즉, 천연 PRG4의 A374 내지 P847(474개 아미노산) 대신에 당해 재조합 루브리신 PRG4-LUB:1은 4개의 완전한 KEPAPTT 서열과 약 3개의 불완전한 KEPAPTT 서열을 포함한다.

합성 cDNA 카셋트-2의 DNA 서열(서열번호 3)은 PRG4-Lub:2 cDNA 작제물(서열번호 10)을 제조하기 위해 PRG4-Lub:1 작제물에 부가되는 Bsu36I/BspEI 이다. PRG4-Lub:1 cDNA 작제물은 1개의 Bsu36I 제한 부위(CC^TNAGG, 즉, CC^TAAGG; 서열번호 6의 염기 번호 1225 내지 1231번)를 갖는다. 합성 cDNA 카셋트-2가 PRG4- Lub:1 cDNA 작제물에 첨가되는 경우, 당해 Bsu36I 부위는 파괴되지만, 합성 카셋트-2는 또 다른 내부 Bsu36I 제한 부위(CC^TNAGG, 즉, CC^TAAGG; 서열번호 3의 염기 번호 92 내지 98번)를 함유한다. 따라서, PRG4-Lub:N+1 작제물은, 합성 cDNA 카셋트-2 Bsu36I/BspEI를 기존의 PRG4-Lub:N 작제물에 합성 cDNA 카셋트-2에 의해 제공된 상기 내부 Bsu36I 제한 부위에서 첨가함으로써 제조할 수 있다.

cDNA 카셋트를 일본쇄 올리고뉴클레오타이드로서 합성하고 함께 하이브리드화시켜 점착성 말단을 갖는 이본쇄 DNA 단편을 제조한다. 이것이 말단 BssHII, Bsu36I 및 BspEI 부위가 불완전한 것으로 보이는 이유이다. 합성 cDNA 카셋트-1(서열번호 1)에서, 잔여 플랭킹 BssHII(G^CGCGC) 및 BspEI(T^CCGGA) 제한 부위에 의해 결합된 서열은 내부 Bsu36I 제한 부위(CC^TNAGG, 즉, CC^TAAGG)를 포함하며, 이 제한 부위는 하기에 밑줄로 표시한다:

서열번호 1의 해독물인 서열번호 2는 완벽하게 매치되는 부분인 4개의 KEPAPTT 서열(강조된 부분)을 포함한다:

합성 cDNA 카셋트-2(서열번호 3)도 마찬가지로 잔여 5'-말단 Bsu36I 제한 부위(즉, CC^TNAGG, TAA 서열에 의해서만 명백해짐), 3'-말단 잔여 BspEI 제한 부위 (T^CCGGA) 및 내부 Bsu36I 제한 부위(CC^TNAGG)를 가지며, 이 제한 부위는 하기에 밑줄로 표시한다:

서열번호 3의 해독물인 서열번호 4는 완벽하게 매치되는 부분인 3개의 KEPAPTT 서열(강조된 부분)을 포함한다:

pTmed2 벡터(작제물에 벡터를 부가하면 서열번호 5가 된다)내 재조합 PRG4-Lub:1 cDNA 작제물(서열번호 6)은 SalI(G^TCGAC; 서열번호 5의 염기번호 1027번 내지 1032번) 및 NotI(GC^GGCCGC; 서열번호 5의 염기번호 3984번 내지 3991번) 제한 부위에 의해 플랭킹되어 있다. SalI 부위에는 해독 개시 코돈 ATG(서열번호 5의 염기번호 1038번 내지 1040번) 전에 변형된 코작(Kozak) 해독 개시 서열(CCCACC; 서열번호 5의 염기번호 1032번 내지 1037번)이 혼입되어져 있다. BssHII(G^CGCGC; 서열번호 5의 염기번호 2155 내지 2160번)와 BspEI(T^CCGGA; 서열번호 5의 염기번호 2306 내지 2311) 제한 부위 사이에서 내부 Bsu36I 클로닝 부위(CC^TNAGG, 즉, CC^TAAGG; 서열번호 5의 염기번호 2262번 내지 2268번)가 발견된다.

당해 PRG4-Lub:1 cDNA 작제물(서열번호 6)은 PRG4-LUB:1 부분(서열번호 7)으로 해독된다. 전체 PRG4-LUB:1 단백질(서열번호 7)의 S373과 E425(즉, 천연 PRG4 의 E848) 사이의 삽입체는 서열번호 9의 51개 아미노산이다. 이들은 Lub:1 DNA 삽입체(서열번호 8)로부터 해독되며 4개의 완전한 KEPAPTT 서열을 포함한다. BssHII 제한 부위(G^CGCGC; 서열번호 6의 염기번호 1118 내지 1123번)과 BspEI 제한 부위 (T^CCGGA; 서열번호 6의 염기번호 1269 내지 1274) 사이에서 내부 Bsu36I 클로닝 부위(CC^TNAGG, 즉, CC^TAAGG; 서열번호 6의 염기번호 1225 내지 1231번)이 발견된다.

pTmed2 벡터내 재조합 PRG4-Lub:1 작제물에서와 같이, pTmed2 벡터내 재조합 PRG4-Lub:2 cDNA 작제물(서열번호 10)도 SalI(G^TCGAC) 및 NotI(GC^GGCCGC) 제한 부위에 의해 플랭킹되어 있으며, 상기 SalI 부위에는 해독 개시 코돈 ATG(서열번호 10의 염기번호 1 내지 3번) 전에 변형된 코작 해독 개시 서열(CCCACC)이 혼입되어 있다. 마찬가지로, pTmed2 벡터내 재조합 PRG4-Lub:3 cDNA 작제물(서열번호 14), 재조합 PRG4-Lub:4 cDNA 작제물 (서열번호 18) 및 재조합 PRG4-Lub:5 cDNA 작제물(서열번호 22)은 각각 SalI (G^TCGAC) 및 NotI (GC^GGCCGC) 제한 부위에 의해 플랭킹되어 있으며, 상기 SalI 부위에는 해독 개시 코돈 ATG(각각 서열번호 14, 18 및 22의 염기번호 1 내지 3번) 전에 변형된 코작 해독 개시 서열(CCCACC)이 혼입되어 있다.

PRG4-Lub:2 cDNA 작제물내에서, 내부 Bsu36I 클로닝 부위(CC^TNAGG, 즉, CC^TAAGG; 서열번호 10의 염기번호 1318 내지 1324번)는 BssHII(G^CGCGC; 염기번호 1118 내지 1123)과 BspEI(T^CCGGA; 염기번호 1347 내지 1352) 제한 부위 사이에서 발견된다. PRG4-Lub:2 작제물(서열번호 10)은 PRG4-LUB:2 단백질(서열번호 11)로 해독된다. 전체 PRG4-LUB:2 단백질(서열번호 11)의 S373과 E451(즉 천연 PRG4의 E848)의 삽입체는 서열번호 13의 77개 아미노산이다. 이들은 Lub:2 DNA 삽입체(서열번호 12)로부터 해독된다. 천연 PRG4의 A374 내지 P847(474개 아미노산) 대신에, 재조합 루브리신 PRG4-LUB:2의 77개 아미노산이 6개의 완전한 KEPAPTT 서열과 약 4개의 불완전한 KEPAPTT 서열을 형성한다.

PRG4-Lub:3 cDNA 작제물내에서, 내부 Bsu36I 클로닝 부위(CC^TNAGG, 즉, CC^TAAGG; 서열번호 14의 염기번호 1411 내지 1417번)는 BssHII(G^CGCGC; 염기번호 1118 내지 1123번)과 BspEI(T^CCGGA; 염기번호 1440 내지 1445) 제한 부위 사이에서 발견된다. PRG4-Lub:3 작제물(서열번호 14)은 PRG4-LUB:3 단백질(서열번호 15)로 해독된다. 전체 PRG4-LUB:3 단백질(서열번호 15)의 S373과 E482(즉, 천연 PRG4의 E848) 사이의 삽입체는 서열번호 17의 108개 아미노산이다. 이들은 Lub:3 DNA 삽입체(서열번호 16)로부터 해독된다. 천연 PRG4의 A374 내지 P847(474개 아미노산) 대신에, 재조합 루브리신 PRG4-LUB:3의 108개 아미노산이 9개의 완전한 KEPAPTT 서열 및 약 5개의 불완전한 KEPAPTT 서열을 형성한다.

PRG4-Lub:4 cDNA 작제물내에서, 내부 Bsu36I 클로닝 부위(CC^TNAGG, 즉, CC^TAAGG; 서열번호 18의 염기번호 1504 내지 1510번)는 BssHII(G^CGCGC; 염기번호 1118 내지 1123번)와 BspEI(T^CCGGA; 염기번호 1533 내지 1538번) 제한 부위 사이에서 발견된다. PRG4-Lub:4 작제물(서열번호 18)은 PRG4-LUB:4 단백질(서열번호 19)로 해독된다. 전체 PRG4-LUB:4 단백질(서열번호 19)의 S373과 E513(즉, 천연 PRG4의 E848) 사이의 삽입체는 서열번호 21의 139개 아미노산이다. 이들은 Lub:4 DNA 삽입체(서열번호 20)로부터 해독된다. 천연 PRG4의 A374 내지 P847(474개 아미노산) 대신에, 재조합 루브리신 PRG4-LUB:4의 139개 아미노산이 12개의 완전한 KEPAPTT 서열 및 약 6개의 불완전한 KEPAPTT 서열을 형성한다.

PRG4-Lub:5 cDNA 작제물내에서, 내부 Bsu36I 클로닝 부위(CC^TNAGG, 즉, CC^TAAGG; 서열번호 22의 염기번호 1597 내지 1603번)는 BssHII(G^CGCGC; 염기번호 1118 내지 1123)와 BspEI(T^CCGGA; 염기번호 1626 내지 1631번) 제한 부위 사이에서 발견된다. PRG4-Lub:5 작제물(서열번호 22)은 PRG4-LUB:5 단백질(서열번호 23)로 해독된다. 전체 PRG4-LUB:5 단백질(서열번호 23)의 S373과 E544(즉, 천연 PRG4의 E848) 사이의 삽입체는 서열번호 25의 170개 아미노산이다. 이들은 Lub:5 DNA 삽입체(서열번호 24)로부터 해독된다. 천연 PRG4의 A374 내지 P847(474개 아미노산) 대신에, 재조합 루브리신 PRG4-LUB:5의 170개 아미노산이 15개의 완전한 KEPAPTT 서열 및 약 7개의 불완전한 KEPAPTT 서열을 형성한다.

중요한 점은, 합성 cDNA 카셋트-2를 삽입하는 과정이 무한정 반복될 수 있다는 점이다. 각각의 반복으로 3개의 완전한 KEPAPTT 서열이 부가된다. 재조합 루브리신 PRG4-LUB:2 내지 PRG4-LUB:5가 삽입 서열의 사용을 통해서 이러한 방식으로 작제되는 것과 같이 재조합 루브리신 PRG4-LUB:6 내지 PRG4-LUB:N이 작제된다. 표 2는 BssHII/BspE1 삽입체 서열의 개요를 제공한다.

본원에서 모든 12개의 엑손을 함유한 전체길이 PRG4를 갖는 기본적 DNA 작제물(엑손 6의 중심 부분이 결여됨)이 예시되었지만, 각종 활성 및 목적하는 길이에 따라서 PRG4의 스플라이스 변이체가 사용될 수도 있다. 또한, 상이한 제한 효소가 유사한 전략에서 사용될 수 있는데, 단 이의 위치는 편의상 PRG4 단백질을 암호화하는 핵산 서열내에 위치한다. 다른 양태에서, 기본적 DNA 작제물은 천연 엑손 6 서열이 결여되어 있지만, 천연 PRG4 유전자의 엑손 1 내지 엑손 5 서열 또는 엑손 7 내지 12 서열 중 하나 이상을 포함한다. 다른 양태에서, 기본적 DNA 작제물은 엑손 6의 서열의 부분 또는 모두가 부재라는 점을 제외하고는 US6433142 또는 US20020137894에 기술된 재조합 MSF 서열과 동일하다.

본 발명은 바람직한 양태로서(예를 들어, pTmed2 발현 벡터내 재조합 PRG4-Lub:1 cDNA 작제물은 서열번호 5에서 염기번호 1038 내지 3983번에 위치한다) 진핵성 발현 벡터 pTmed2내의 SalI(G^TCGAC; 서열번호 5의 염기번호 1027 내지 1032번) 및 NotI (GC^GGCCGC; 서열번호 5의 염기번호 3984 내지 3991번) 제한 부위로 클로닝되는 재조합 루브리신을 암호화하는 cDNA 작제물을 제공한다. SalI 부위에는 메티오닌 개시 코돈 (ATG; 서열번호 5의 염기번호 1038 내지 1040번) 전에 변형된 코작 해독 개시 서열의 첫번째 염기(CCCACC; 서열번호 5의 염기번호 1032번)가 혼입되어 있다. 본 발명의 다른 양태는 다른 제한 부위 조합 및 다른 발현 벡터를 포함한다.

바람직한 양태에서, 반복 과정은 BssHII (G^CGCGC) 및 BspEI (T^CCGGA)에 대한 제한 부위에 의해 플랭킹되어 있는 발현 벡터 pTmed2내의 합성 cDNA 카셋트-1(서열번호 1) 및 내부 Bsu36I 제한 부위(CC^TNAGG, 즉 CC^TAAGG; 서열번호 1의 염기번호 107 내지 113번)를 포함하는 합성 cDNA 카셋트-1을 사용한다. 이러한 바람직한 양태에서, KEPAPTT-유사 서열을 함유하는 재조합 루브리신 작제물의 반복적 생성을 위해서, 합성 cDNA 카셋트-2(서열번호 3)를 당해 재조합 작제물의 Bsu36I과 BspEI 부위 사이에 삽입시킨다. 합성 cDNA 카셋트-2(서열번호 3)는 변형된 잔여 Bsu36I 부위(TAAAG) 및 잔여 BspEI (ACTCCGG) 부위에 의해 플랭킹된다. 이는 또한 내부 Bsu36I 부위(CC^TNAGG, 즉, CC^TAAGG; 서열번호 3의 염기번호 92 내지 98번)를 포함한다. 합성 cDNA 카셋트-2를 재조합 루브리신 작제물의 Bsu36I 및 BspEI 부위로 클로닝시, 본래 작제물의 Bsu36I 클로닝 부위가 파괴되어 새로운 작제물에 1개의 고유한 Bsu36I 클로닝 부위가 남게된다.

이러한 바람직한 양태에서, 아미노산 서열 "APTTP KEPAPTT TKSAPTTP KEPAPTT T KEPAPTT P KEPAPTT TK"(서열번호 26; 45개 아미노산)은 각각의 PRG4-LUB:N 단백질(여기서, N은 1 이상의 정수이다)의 일부분을 보유한다. 또한, 아미노산 서열 " KEPAPTT T KEPAPTT TKSAPTTP KEPAPTT P"(서열번호 27; 31개 아미노산)은 합성 cDNA 카셋트-2 Bsu36I/BspEI를 PRG4-Lub:N cDNA 작제물에 첨가함을 통해서 각각의 PRG4-Lub:N+1 cDNA 작제물의 일부분이 되는 DNA 삽입체에 의해 암호화된다. PRG4-LUB:N 단백질(여기서, N은 3 이상의 정수이다)의 경우, 아미노산 서열 " EPAPTT TKSAPTTP KEPAPTT P"(서열번호 28; 22개 아미노산)은 바람직한 양태에서 서열번호 26을 서열번호 27의 (N-2)개 반복부에 연결시킨다. 게다가, 아미노산 서열 "KEPKPAPTTP"(서열번호 29; 10개 아미노산)은 PRG4-LUB:N 단백질의 바람직한 양태(여기서, N은 2 이상의 정수이다)에서 서열번호 27의 마지막 삽입 반복부 바로 다음에 위치한다.

서열번호 26, 서열번호 27 및 서열번호 28은, 이들이 2개 이상의 KEPAPTT 서열을 형성하기 때문에, 각각 본원에서 "반복적 KEPAPTT-유사 서열"로서 명명된다(서열번호 28의 N-말단이 K 잔기에 연결됨으로써 서열번호 28은 PRG4-LUB:N 단백질내 2개의 KEPAPTT 서열을 형성한다)

따라서, 재조합 루브리신 단백질 PRG4-LUB:N(여기서, N은 1 이상의 정수이다)의 경우, PRG4-LUB:N 단백질은 바람직한 양태에서 서열번호 26을 포함한다. 게다가, 재조합 루브리신 단백질 PRG4-LUB:N(여기서, N은 2 이상의 정수이다.)의 경우, PRG4-LUB:N 단백질은 바람직한 양태에서 서열번호 27을 또한 포함한다. 이들 바람직한 양태에서 서열번호 27은 각각의 PRG4-LUB:N 단백질내에서 (N-1)회 반복된다. PRG4-LUB:2에서, 서열번호 26 및 서열번호 27은 중복된다(즉, 이들 서열은 KEPAPTT 서열을 공유한다).

N이 3 이상의 정수인 다른 바람직한 양태(예를 들어, N이 3 내지 200의 정수인 양태, 또는 N이 5 내지 50의 정수인 보다 바람직한 양태, 또는 N이 10 내지 30의 정수인 보다 더욱 바람직한 양태)에서, 재조합 루브리신 단백질은 서열번호 27의 31개 아미노산의 (N-2)개 반복부(들)에 서열번호 26의 N-말단-배향된 45개 아미노산을 연결시키는 서열번호 28의 22개 아미노산 서열을 포함하며, 여기서 서열번호 29의 10개 아미노산은 서열번호 27의 마지막 31개 아미노산 반복부에 대해 C-말단에 있다.

일반적으로 PRG4-LUB:N 단백질은 N이 반복적 KEPAPTT-유사 서열의 개수와 동일한 바람직한 양태에서 (3×N)개의 KEPAPTT-유사 서열 반복부를 갖는다. 재조합 루브리신 PRG4-LUB:5(바람직한 양태에서 3×N = 3×5 = KEPAPTT 서열의 15개 카피)는 이의 서열이 본원에서 상세히 기술되는 가장 큰 재조합 루브리신 PRG4-LUB:N이다. 그러나, 본 발명의 재조합 루브리신의 경우, N 값은 5 초과, 예를 들어, 7, 10, 12, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 100, 150 또는 200 이상일 수 있다.

특히, 각각 4, 6, 9, 12 및 15개의 완전한 KEPAPTT 서열을 갖는 단백질 PRG4-LUB:1, PRG4-LUB:2, PRG4-LUB:3, PRG4-LUB:4 및 PRG4-LUB:5은 본원에서 상세히 기술된다. 그러나, 본원에서 기술되는 반복적 Lub:N 삽입 과정을 지속함으로써 KEPAPTT 서열 수를 증가시키면서 부가할 수 있다. 본원에서는 보다 작은 단백질이 합성하고 조작하기가 용이하기 때문에 천연 PRG4/루브리신 단백질에 비해서 비교적 적은 수의 KEPAPTT 또는 KEPAPTT-유사 서열을 갖는 PRG4-LUB:N 재조합 루브리신에 대한 상세한 설명이 제공되었다.

KEPAPTT-유사 서열의 개수를 천연 PRG4 단백질에서 보여진 개수 이상으로 증가시키는 것이 또한 바람직할 수 있다. 이는 본원에서 기술하는 반복적 Lub:N 삽입 과정을 지속하여 재조합 루브리신 PRG4-LUB:N 단백질내에 78개 초과의 KEPAPTT-유사 서열이 존재하도록 하거나, 엑손 6-결실된 또는 엑손 6-축소된 형태의 PRG4 cDNA가 아니라 온전한 PRG4 cDNA로 시작함으로써 달성할 수 있다. 따라서, 어떠한 부가된 KEPAPTT-유사 서열이라도 천연의 PRG4 단백질에서 발견되는 개수보다 과량으로 존재할 수 있다. 온전한 PRG4 cDNA로부터 보다 큰 재조합 루브리신 단백질의 제조를 위해 사용되는 삽입 과정 뿐만 아니라 엑손 6-결실된 또는 엑손 6-축소된 형태의 PRG4 cDNA를 사용하는 삽입 과정은 본 발명의 범주에 포함된다.

실시예 2: 'LUB' 단백질의 발현 및 정제

PRG4-Lub:1 cDNA 작제물(서열번호 6; 합성 cDNA 카셋트-1 서열을 함유함)을 다음과 같이 안정하게 형질감염된 전적응 CHO DUKX 세포주에서 발현시키고, 조건화된 배지로부터 정제하고, 500mM L-아르기닌 하이드로클로라이드를 함유하는 PBS에 가용화시켰다.

PRG4-Lub:1 cDNA 작제물을 안정하게 형질감염된 CHO DUKX 세포주에서 발현시키고, 조건화된 배지를 수집하였다. 상기 조건화된 배지 2ℓ 용적을 압축된 질소 가스(40psi)하에 10kDa 명목 분자량 한계치(NMWL), 30kDa NMWL 또는 100kDa NMWL PALL FILTRON^R OMEGA^TM 디스크 막이 장착된 AMICON M2000^TM 여과 단위를 사용하여 필터 농축시켰다. 배지를 약 100ml 용적으로 농축시키고, 이를 디스크 막으로부터 흡인시켰다. 이어서, 상기 디스크 막을 AMICON M2000^TM 여과 단위로부터 제거하였다. 디스크 막의 표면에 축적된 "점액" 보유물을 세포 스크래퍼를 사용하여 수거하고 마이크로원심관으로 옮겼다. 상기 마이크로원심관내의 샘플을 10분 동안 약 12,000xg로 원심분리하고, 수성 상청액을 제거하였다. 잔류하는 "루브리신-풍부한" 펠렛을 500mM L-아르기닌 하이드로클로라이드를 함유하는 포스페이트 완충된 염수(PBS)에 용해시켰다. L-아르기닌 하이드로클로라이드의 농도는 100mM 내지 2.0M의 범위일 수 있다.

상기한 과정을 사용하여, PRG4-LUB:2 내지 PRG4-LUB:5 당단백질(및 PRG4-LUB:N 단백질(여기서, N은 6 이상의 양의 정수이다) 뿐만 아니라 KEPAPTT-유사 서열을 함유하는 다른 당단백질)를 디스크 막으로부터 직접, 즉 디스크 막 위에 잔류하는 농축물을 정제하지 않고 수거하였다. 즉, 이들 재조합 루브리신 당단백질을 10kDa NMWL, 30kDa NMWL 또는 100kDa NMWL PALL FILTRON^R OMEGA^TM 여과 단위의 디스크 막으로부터 직접 분리시킨다. 일부 경우에, 이들 당단백질은 크로마토그래피 기법 또는 전기영동 기법 또는 이들 둘다를 통해서 디스크 막 위에 잔류하는 농축물로부터 정제될 수도 있다. 재조합 루브리신 단백질 및 당단백질은 또한 크로마토그래피 및 당해 분야에 공지된 다른 기법(예를 들어, MSF 단백질에 대해 US6433142에 기재되어 있는 바와 같은 기법; 또한 Deutscher, 1990; and Scopes, 1994 참조)를 사용하여 정제될 수도 있다.

실시예 3: 면역조직화학

정상 관절 및 골관절염 관절내 루브리신의 세포 공급원을 면역조직화학 기법을 사용하여 추가로 조사하였다. 또한, 흉막, 심장막, 복막 및 수막을 포함하는 다른 세포 표면상의 루브리신의 존재를 하기 방법에 따라서 검사하였다.

골관절염 연골 및 활막은 슬관절 대치 수술 중에 있는 환자로부터 숙지 동의서에 의해 수득되었다. 검사된 다른 조직은 정상 사람 활막 및 정상 비-사람 영장류(NHP) 활막, 연골, 흉막, 심장막, 복막 및 수막, 뇌, 건 및 인대, 및 개의 정상 및 골관절염 반월연골, 연골, 활막, 인대 및 건이었다. 조직을 수거 후 또는 모넨신 보충물(5μM)의 존재 및 부재하에 배지에서 24시간 항온처리한 후에 4% 파라포름알데히드 속에 고정시켰다. 면역조직화학 연구를 위해 조직을 24시간동안 4% 파라포름알데히드 속에 고정시키고 6 내지 8㎛ 파라핀 절편을 수득하였다. 조직의 서브세트를 광학응집 단층촬영(OCT) 동결 화합물 속에 동결시키고 아세톤 고정 후에 5 내지 10㎛ 간격으로 절단하였다.

면역조직화학 및 면역형광 분석은 절두된(truncated) 형태의 재조합 루브리신으로의 면역화 및 단백질 A 컬럼에서의 정제에 의해 생성된 정제된 폴리클로날 래빗 항-사람 루브리신 항체(Ab 06A10)을 사용하였다. CD16 항체(NEOMARKERS^R, Fremont CA)를 대식세포(Fcy 수용체 III)를 확인하는데 사용하였다. CD106/VCAM-1 항체(NEOMARKERS^R)를 극저온냉동 절편 내에서 섬유모세포를 표지하는데 사용하였다. 대조 절편의 경우, 등가 농도의 RIgG(VECTOR LABS ^TM, CA), MIgG₁ (DAKO) 및 MIgG_2a (DAKO^R)를 연속적으로 사용하였다. 덱스트란 기법 시스템(ENVISION+^TM; DAKO^R)을 사용하여 항체 결합을 가시화하고, 절편을 메이어 알룸-헤마톡실린(Mayer's alum-hematoxylin)으로 대조염색하였다. 면역형광을 상기한 1차 항체를 사용하여 수행하고 2차 항체(알렉사 염료 - MOLECULAR PROBES^TM, Oregon) 546nm에서 염소 항-래빗트 알렉사 염료 및 488nm에서 염소 항-마우스 알렉사 염료로 프로빙하였다. 항체의 형광 결합을 NIKON^R 형광 현미경으로 검출하였다.

루브리신은 정상 및 골관절염 사람 인공 관절 및 활막의 표면에서 함께 검출되었다. 두꺼운 루브리신 층은 세동된 골관절염 표면을 완전히 덮었다. CD106 면역형광은 활막의 내막 섬유모세포의 강력한 세포 막 염색을 나타냈으며; 루브리신 단백질은 또한 활막세포내에서 염색으로서 가시화되었다. CD106+루브리신에 대한 이중 면역염색은 활막의 내막 섬유모세포내에서 공동국재화를 명백하게 나타냈다. 활막 대식세포의 CD16 염색은 활막 층 전체에 걸친 이들 세포의 존재를 입증하였으나, 루브리신과의 공동국재화는 없었다.

루브리신 항체를 이용한 NHP 및 개의 관절 조직(정상 및 OA)의 염색은 루브리신이 활막, 연골, 반월연골 및 건의 표면 층을 덮고 있었음을 나타냈다. NHP 연골은 또한 당단백질의 세포내 저장량을 증가시키기 위해 모넨신을 첨가하지 않아도 표재 영역 세포에서뿐만 아니라 이행 영역 세포에서도 강력한 면역반응성을 나타냈다. 복막, 심장막 및 흉막을 구성하는 세포는 루브리신 발현을 나타냈으나, 면역반응성은 수막 또는 뇌에서 관찰되지 않았다.

요약하면, 정상 및 골관절염 활막, 건, 반월연골 및 연골은 모두 상당한 루브리신 층으로 덮여있었다. 당단백질은 OA 관절내 조직에 명백히 존재한다. 사람 OA 활막의 이중-면역형광 염색은 내막 섬유모세포성 활막세포가 루브리신을 합성하는 역할을 하였음을 입증하였다.

관절 조직 외부의 루브리신 단백질의 국재화는 이전에는 기술되지 않았다. 루브리신의 표면 층은 폐 흉막, 심장막 및 복막에서 명백히 나타났다. 루브리신은 활막성 관절내에서 윤활 기능을 갖지만, 다른 조직에서는 윤활 및 항-유착 기능을 포함하나 이에 제한되지 않은 다수의 역할을 할 수 있는 것으로 사료된다. 이들 다른 조직에 루브리신을 보충시키는 것은 본 발명에 포함되는 생물요법이다.

실시예 4: 기전적 윤활제로서의 재조합 루브리신

재조합 루브리신은 일반적으로, 예를 들어, 씰 및 베어링 등과 함께 윤활제로서 사용될 수 있다. 예를 들어, "Self-lubricating seal"를 발명의 명칭으로 하는 US3973781, "Grooved mechanical face seal"를 발명의 명칭으로 하는 US4491331, "Multi lip seal"를 발명의 명칭으로 하는 US4560174 및 "Differential surface roughness dynamic seals and bearings"를 발명의 명칭으로 하는 US4973068에는 각각 다양한 디자인의 씰(seal)이 기술되어 있다. 재조합 루브리신은 이러한 씰과 함께 윤활제로서 사용될 수 있다.

특히, 재조합 루브리신은 특히 생적합성 윤활제가 요구되는 경우에 의료 장치, 보형물 및 이식물용 윤활제로서 사용될 수 있다. 또한, 그 적용이 의료용일 필요는 없으나, 생적합성 윤활제가 바람직할 수 있는 환경적으로 민감한 상황에서의 적용을 포함할 수 있다.

실시예 5: 재조합 루브리신 조성물

본 발명의 재조합 루브리신은 약제학적으로 허용되는 담체와 배합되는 경우에 약제학적 조성물에서 사용될 수 있다. 이러한 조성물은 (단백질 및 담체 이외에도) 희석제, 충전제, 염, 완충제, 안정화제, 가용화제 및 당해 분야에 익히 공지된 기타 물질들을 또한 함유할 수 있다. "약제학적으로 허용되는"이란 용어는 활성 성분(들)의 생물학적 활성의 유효성을 방해하지 않는 비독성 물질을 의미한다. 담체의 특징은 투여 경로에 따라 좌우될 것이다. 본 발명의 약제학적 조성물은 또한 사이토킨, 림포킨 또는 다른 조혈 인자, 예를 들어, M-CSF, GM-CSF, TNF, IL-1, IL-2, IL-3, IL4, IL-5, IL-6, IL-7, IL-8, IL-9, IL-10, IL-11, IL-12, IL-13, IL-14, IL-15, TNF1, TNF2, G-CSF, Meg-CSF, 트롬보포이에틴, 줄기세포 인자 및 에리트로포이에틴을 함유할 수 있다. 약제학적 조성물은 단백질의 활성을 증진시키거나 치료시 이의 활성 또는 용도를 보완할 수 있는 다른 제제를 추가로 함유할 수 있다. 이러한 추가의 인자 및/또는 제제는 약제학적 조성물에 포함되어 본 발명의 단백질과의 상승 효과를 유발하거나 부작용을 최소화시킬 수 있다. 환언하면, 본 발명의 단백질은 특정한 사이토킨, 림포킨, 다른 조혈 인자, 혈전용해 또는 항혈전 용해 인자 또는 소염제의 제형에 포함되어 부작용을 최소화시킬 수 있다.

관절내 보충을 위해서 재조합 루브리신 단백질을 중합체성 하이알루로난(HA) 및 고분자량 하일란과 배합하여 사용하는 것이 특히 바람직하다. 관절내 보충시 사용하기 위한 다른 바람직한 배합은 재조합 루브리신 단백질과 마취제(예: 리도카인), 스테로이드(예: 트리암시놀론 헥사세토나이드) 또는 방사성동위원소(예: 이트륨)과의 배합 사용이 포함된다. 관절내 보충시 사용하기 위한 다른 바람직한 배합은 자가 또는 이종 세포 제제(예: 자가 유래되었는지 이종적으로 유래되었는지 관계없이, 배양된 연골세포, 활막세포 또는 줄기세포의 제제)를 포함할 수 있다.

본 발명의 재조합 루브리신은 다량체(예: 이종이량체 또는 동종이량체) 또는 서로간의 또는 다른 단백질과의 복합체에서 활성일 수 있다. 그 결과, 본 발명의 약제학적 조성물은 이러한 다량체 또는 복합체화된 형태의 본 발명의 단백질을 포함할 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은 본 발명의 재조합 루브리신 단백질(들)과 단백질 또는 펩타이드 항원과의 복합체 형태일 수 있다. 상기 단백질 및/또는 펩타이드 항원은 B 및 T 림프구 둘다에게 자극 시그날을 전달할 수 있다. B 림프구는 이의 표면 면역글로불린 수용체를 통해서 항원에 반응할 수 있다. T 림프구는 MHC 단백질에 의해 항원이 제시된 후에 T 세포 수용체(TCR)를 통해서 항원에 반응할 수 있다. MHC와, 숙주 세포상의 I형 및 II형 MHC 유전자에 의해 암호화되는 단백질을 포함하는 구조적으로 관련된 단백질은 T 림프구에 대한 펩타이드 항원(들)을 제시하는 작용을 할 수 있다. 항원 성분은 정제된 MHC-펩타이드 복합체 단독으로서 또는 T 세포에 시그날을 직접 전달할 수 있는 공자극 분자와 함께 공급될 수도 있다. 또는, B 세포상의 표면 면역글로불린 및 기타 분자에 결합할 수 있는 항체 뿐만 아니라 T 세포상의 TCR 및 기타 분자에 결합할 수 있는 항체는 본 발명의 약제학적 조성물과 함께 배합될 수 있다.

본 발명의 약제학적 조성물은, 본 발명의 단백질이 다른 약제학적으로 허용되는 담체 이외에 양쪽성 제제, 예를 들어, 수용액 중에서 미셀, 불용성 단층, 액체 결정 또는 라멜라 층과 같은 응집된 형태로 존재하는 지질과 함께 배합되어져 있는 리포좀의 형태일 수 있다. 리포좀 제형에 적합한 지질로는 모노글리세라이드, 디글리세라이드, 설파타이드, 리소레시틴, 인지질, 사포닌, 담즙산 등이 포함되나 이에 제한되지 않는다. 이러한 리포좀 제형의 제조는 당해 분야의 숙련가의 수준 범위내에 있으며 예를 들어, US4235871, US4501728, US4837028 및 US4737323에 개시되어 있다.

본 발명의 치료 방법 또는 사용 방법을 실시하는데 있어서, 치료학적 유효량의 본 발명의 단백질은 치료되어야 할 상태를 앓는 환자(예: 포유동물)에게 투여된다. 본 발명의 단백질은 본 발명의 방법에 따라서 단독으로 또는 사이토킨, 림포킨, 다른 조혈 인자 또는 세포계 보충제를 사용하는 치료법과 같은 다른 요법과 병용하여 투여될 수 있다. 하나 이상의 사이토킨, 림포킨, 다른 조혈 인자 또는 세포계 보충제과 함께 공동 투여는 경우, 본 발명의 단백질은 사이토킨(들), 림포킨(들), 다른 조혈 인자(들), 혈전용해 또는 항혈전 인자 또는 세포계 보충제와 동시에 투여되거나 연속하여 투여될 수 있다. 연속하여 투여되는 경우, 담당 주치의는 사이토킨(들), 림포킨(들), 다른 조혈 인자(들), 혈전용해 또는 항혈전 인자 또는 세포계 보충제와 함께 본 발명의 단백질의 적절한 투여 순서를 결정할 수 있다.

약제학적 조성물에서 사용되거나 본 발명의 방법을 실시하기 위해 사용되는 본 발명의 단백질의 투여는 피부, 피하, 복강내, 비경구 또는 정맥내 주사 또는 일부 경우에 경구 섭취, 흡입, 국소 투여와 같은 다양한 통상적 방식으로 수행할 수 있다. 관절 조직으로 주사하여 환자에게 투여하는 것이 일반적으로 바람직하다[참조: Schumacher, 2003].

치료학적 유효량의 본 발명의 단백질이 경구 투여되는 경우, 본 발명의 단백질은 정제, 캡슐제, 산제, 액제 또는 엘릭서제의 형태로 존재할 수 있다. 정제 형태로 투여되는 경우, 본 발명의 약제학적 조성물은 젤라틴과 같은 고체 담체 또는 보조제를 추가로 함유할 수 있다. 정제, 캡슐제 및 산제는 본 발명의 단백질 약 5 내지 95%, 바람직하게는 약 25 내지 90%를 함유한다. 액제 형태로 투여되는 경우에, 물, 석유, 동물 또는 식물 기원의 오일, 예를 들어, 땅콩유, 광유, 대두유 또는 참기름 또는 합성 오일과 같은 액체 담체가 첨가될 수 있다. 액제 형태의 약제학적 조성물은 생리식염수, 덱스트로즈 또는 기타 사카라이드 용액 또는 글리콜, 예를 들어, 에틸렌 글리콜, 프로필렌 글리콜 또는 폴리에틸렌 글리콜을 추가로 함유할 수 있다. 액제 형태로 투여되는 경우, 약제학적 조성물은 본 발명의 단백질 약 0.5중량% 내지 90중량%, 바람직하게는 약 1중량% 내지 50중량%를 함유한다.

치료학적 유효량의 본 발명의 단백질이 정맥내, 피부 또는 피하 주사로 투여되는 경우, 본 발명의 단백질은 피로겐 비함유, 비경구적으로 허용되는 수용액의 형태일 수 있다. pH, 등장성, 안정성 등을 충분히 고려한 이러한 비경구적으로 허용되는 단백질 용액의 제조법은 당해 분야의 기술의 범주내에 있다. 정맥내, 피부 또는 피하 주사에 바람직한 약제학적 조성물은 본 발명의 단백질 이외에도, 염화나트륨 주사액, 링거 주사액, 덱스트로즈 주사액, 덱스트로즈 및 염화나트륨 주사액, 락테이트 처리된 링거 주사액 또는 당해 분야에 공지된 다른 비히클과 같은 등장성 비히클을 함유해야 한다. 본 발명의 약제학적 조성물은 안정화제, 보존제, 완충제, 항산화제 또는 당해 분야의 숙련가에게 공지된 다른 첨가제를 또한 함유할 수 있다. 예를 들어, 리도카인 또는 기타 국소 마취제, 스테로이드 또는 아드레노코르티코이드, HA 및/또는 하일란 또는 방사성동위원소와 함께 또는 이들과 병용한 주사는 모두 본 발명의 범주내에 포함된다.

본 발명의 약제학적 조성물 중의 본 발명의 단백질의 양은 치료될 상태의 성질 및 중증도와 환자가 받았던 사전 치료법의 성질에 따라 좌우될 것이다. 궁극적으로, 담당 주치의 각각의 개별적 환자를 치료하기 위한 본 발명의 단백질의 양을 결정할 수 있다. 초기에, 담당 주치의는 저 투여량의 본 발명의 단백질을 투여하고 환자의 반응을 관찰할 수 있다. 보다 큰 투여량의 본 발명의 단백질을 환자에 대한 최적의 치료 효과가 수득될 때까지 투여될 수 있으며, 이 시점에서는 투여량을 추가로 증가시키지 않는다. 본 발명의 방법을 실시하기 위해 사용되는 각종 약제학적 조성물은 수행되는 투여 방법 및 정확한 치료 과정에 따라서 체중 kg당 본 발명의 단백질 약 0.01㎍ 내지 약 100mg (바람직하게는 약 0.1㎍ 내지 약 10mg, 보다 바람직하게는 약 0.1㎍ 내지 약 1mg)을 함유해야 하는 것으로 의도된다.

정맥내 투여되는 경우, 본 발명의 재조합 루브리신을 포함하는 약제학적 조성물을 사용한 정맥내 요법의 지속기간은 치료되는 질환의 중증도 및 각각의 환자의 상태 및 특이체질 반응에 따라서 다양하다. 본 발명의 단백질의 각 적용 지속기간은 12시간 내지 24시간의 연속적 정맥 투여의 범위일 수 있다. 궁극적으로, 담당 주치의는 본 발명의 약제학적 조성물을 사용한 정맥내 요법의 적절한 지속기간을 결정할 수 있다.

골, 연골, 건 또는 인대 요법에 유용한 본 발명의 조성물의 경우, 치료 방법은 당해 조성물을 이식물 또는 장치로서 국소, 전신계적으로 또는 국부 투여함을 포함한다. 투여되는 경우, 본 발명에서 사용하기 위한 치료학적 조성물은 물론 피로겐 비함유 생리학적으로 허용되는 형태로 존재해야 한다. 또한, 당해 조성물은 바람직하게는 골, 연골 또는 조직 손상 부위로 전달하기 위한 점성 형태로 캡슐화되거나 주사될 수 있다. 국소 투여가 일부 상처 치유 및 조직 복구 상황에 적합할 수 있다. 대안으로서 또는 추가로, 상기한 바와 같은 조성물에 임의로 포함될 수 있는 치료학적으로 유용한 제제는 본 발명의 방법에서 본 발명의 재조합 루브리신 단백질을 포함하는 조성물과 동시에 또는 연속하여 투여될 수 있다. 바람직하게는, 당해 조성물은 단백질 함유 조성물을 골 및/또는 연골 손상 부위로 전달할 수 있고, 아마도 발달성 골 및 연골에 대한 구조를 제공하고 최적으로는 체내로 재흡수될 수 있는 매트릭스를 포함할 수 있다. 이러한 매트릭스는 본원에서 이식된 의료 장치에서 사용되는 물질로 구성될 수 있다.

매트릭스가 사용되는 경우, 매트릭스 물질의 선택은 생적합성, 생분해성, 기전적 특성, 미용적 외관 및 계면 특성에 기초한다. 조성물의 특정한 적용이 적절한 제형을 결정할 것이다. 당해 조성물에 가능한 매트릭스는 생분해성이고 화학적으로 규정된 황산칼슘, 트리칼슘포스페이트, 하이드록시아파타이트, 폴리락트산, 폴리글리콜산 및 폴리무수물일 수 있다. 다른 가능한 물질은 골 또는 피부 콜라겐과 같은 생분해성이고 생물학적으로 익히 규정된 것일 수 있다. 또한 매트릭스는 순수한 단백질 또는 세포외 매트릭스 성분으로 이루어질 수 있다. 다른 가능한 매트릭스는 소결 하이드록시아파타이트, 생체유리, 알루미네이트 또는 기타 세라믹과 같이 비생분해성이고 화학적으로 규정된 것일 수 있다. 매트릭스는 상기한 유형의 물질들의 배합물, 예를 들어, 폴리락트산과 하이드록시아파타이트의 배합물 또는 콜라겐과 트리칼슘포스페이트의 배합물로 이루어질 수 있다. 바이오세라믹은 그 조성, 예를 들어, 칼슘-알루미네이트-포스페이트가 변경될 수 있으며 기공 크기, 입자 크기, 입자 모양 및 생분해성이 변경되도록 가공될 수 있다.

추가의 조성물에서, 본 발명의 단백질은 해당 골 및/또는 연골 결손, 상처 또는 조직의 치료에 유익한 다른 제제와 배합될 수 있다. 이러한 제제들은 상피 성장 인자(EGF), 혈소판 유래의 성장 인자(PDGF), 형질전환 성장 인자(TGF-α 및 β) 및 인슐린-유사 성장 인자(IGF)와 같은 각종 성장 인자를 포함한다.

당해 치료학적 조성물은 또한 수의학적 적용에 유용하다. 사람 이외에, 특히 고양 및 개와 같은 애완동물, 마우스 및 랫트와 같은 실험실 동물 뿐만 아니라 말은 본 발명의 재조합 루브리신 단백질을 이용한 이러한 치료에 특히 바람직한 피험체 또는 환자이다.

조직 재생에서 사용될 단백질 함유 약제학적 조성물의 투여 섭생은 단백질의 작용을 변경하는 각종 인자들, 예를 들어, 형성이 요망되는 조직 중량, 손상 부위, 손상된 조직의 상태, 상처의 크기, 손상된 조직(예: 연골 또는 건)의 유형, 환자의 연령, 성별 및 식이, 임의의 감염의 중증도, 투여 시간 및 다른 임상적 인자들을 고려하여 담당 주치의에 의해 결정될 것이다. 투여량은 재구성시 사용되는 매트릭스의 유형 및 약제학적 조성물내에 포함되는 기타 단백질에 따라서 달라질 것이다. 예를 들어, IGF I(인슐린 유사 성장 인자 I)와 같은 다른 공지된 성장 인자를 최종 조성물에 첨가하는 것도 투여량에 영향을 줄 수 있다. 진행은 조직/골 성장 및/또는 복구의 주기적 평가, 예를 들어, X-선, 조직형태계측 결정 및 테트라사이클린 표지화에 의해 모니터링할 수 있다.

본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 또한 유전자 요법을 위해서도 사용될 수 있다. 이러한 폴리뉴클레오타이드는 피험체(예: 포유동물)에서의 발현을 위해 생체내 또는 생체외에서 세포로 도입될 수 있다. 본 발명의 폴리뉴클레오타이드는 또한 핵산을 세포 또는 유기체로 도입시키는 다른 공지된 방법으로 (바이러스성 벡터 또는 나출(naked) DNA의 형태를 포함하는 이에 제한되지 않는 형태로) 투여될 수 있다.

세포에서의 목적하는 효과 또는 활성을 증대시키거나 생성시키기 위해 당해 세포를 본 발명의 핵산 또는 단백질의 존재하에 생체외에서 배양할 수도 있다. 이어서, 처리된 세포를 치료학적 목적으로 생체내 도입시킬 수 있다.

실시예 6: 항-루브리신 항체

본 발명의 재조합 루브리신 단백질은 당해 단백질 또는 일부 양태에서 이의 천연 대응물과 특이적으로 반응하는 폴리클로날 및 모노클로날 항체를 수득하기 위해 동물을 면역화시키는데 사용될 수 있다. 이러한 항체는 면역원으로서 완전한 재조합 루브리신 단백질 또는 이의 단편을 사용하여 수득할 수 있다. 펩타이드 면역원은 카복실 말단에 시스테인 잔기를 추가로 함유할 수 있으며 키홀 림펫 헤모시아닌(KLH)과 같은 합텐에 접합된다. 이러한 펩타이드를 접합시키는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다[참조: Merrifield, 1963; and Krstenansky et al., 1987]. 본 발명의 재조합 루브리신 단백질에 결합하는 모노클로날 항체는 관련 단백질의 면역검출을 위해 유용한 진단제일 수 있다. 이러한 관련 단백질에 결합하는 중화 모노클로날 항체도 또한 루브리신과 연관된 상태 또는 일부 경우에 루브리신의 비정상적 발현이 관련될 수 있는 일부 형태의 암(예: 활막종)의 치료시에 유용한 치료제일 수 있다.

재조합 루브리신 단백질의 폴리펩타이드 코어로 지시되는 항체 이외에, 재조합 루브리신 단백질의 당 부분 또는 당단백질 복합체로 지시되는 항체가 바람직하다. 글리코실화된 재조합 루브리신에 결합하지만 탈글리코실화 형태에는 결합하지 않는 항체를 생성하기 위해, 면역원은 바람직하게는 아미노산 서열이 재조합 루브리신의 고도로 글리코실화된 부분에 걸쳐있는, 예를 들어, 반복적 KEPAPTT-유사 서열인 당펩타이드이다. 동일한 고도로 글리코실화된 영역내에서 예를 들어, 길이가 8 내지 15개 아미노산인 보다 짧은 당펩타이드도 또한 면역원으로서 사용된다. 고도로 글리코실화된 생체분자에 대한 항체를 제조하는 방법은 당해 분야에 공지되어 있다(예를 들어, 문헌[Schneerson et al., 1980]에 기술되어 있다).

실시예 7: 재조합 루브리신 전달

재조합 루브리신의 표준 전달 방법이 사용된다. 관절내 투여를 위해, 재조합 루브리신은 주사당 약 0.1 내지 2ml의 용적 중에 20 내지 500㎍/ml 범위의 농도로 활막강으로 전달된다. 예를 들어, 200 내지 300㎍/ml 농도의 재조합 루브리신 1ml을 미세한(예를 들어, 14 내지 30게이지, 바람직하게는 18 내지 26게이지) 바늘을 사용하여 슬관절로 주사된다. 본 발명의 조성물은 비경구 투여, 예를 들어, 정맥내, 피하, 근육내 또는 복강내 투여, 및 바람직한 양태에서 복막, 심장막 또는 흉막의 표면으로의 투여에도 유용하다.

적절한 바늘 배치는 관절 요법에서 주사로 전달되는 재조합 루브리신 단백질의 효능에 결정적이다[참조: Schumacher, 2003]. 적절한 바늘 배치는 초음파 기법의 사용을 통해서 촉진될 수 있다. 체액의 성공적 흡인이 수득된 후에 성공적 주사가 보다 흔히 나타난다. 슬개상낭으로의 측면상부 접근은 슬개 관절 공간으로 가장 확실한 접근을 제공하는 것으로 제안된 바 있다. 관절내 주사로 재조합 루브리신을 투여하는 것 이외에, 재조합 루브리신을 암호화하는 핵산을 (예를 들어, 유전자 요법 적용시에) 관절내 주사로 활막 강으로 투여할 수 있다.

수술적 유착의 방지를 위해, 본원에서 기술하는 재조합 루브리신은 겔, 발포체, 섬유 또는 패브릭(fabric)의 형태로 투여된다. 병치된 표면들 간의 유착 형성을 방지하기 위해, 이러한 방식으로 제형화된 재조합 루브리신은 손상된 또는 노출된 조직 접촉면 위에 또는 이러한 접촉면들 간에 배치된다. 보다 효과적이기 위해서, 겔 또는 필름은 겔이 최종적으로 분산되고 조직이 접촉되지 않는 경우에 이들이 더이상 유착하는 경향이 없도록 충분히 긴 시간 동안 적소에서 유지되어야 하며 조직 접촉을 방지해야 한다. 유착 형성의 억제 또는 방지용으로 제형화되는 재조합 루브리신(예를 들어, 막, 패브릭, 발포체 또는 겔의 형태)은 랫트 맹장 마멸 모델에서 수술후 유착의 방지에 대해 평가한다[참조: Goldberg et al., 1993]. 조성물을 수술에 의해 마멸된 랫트 맹장 주변에 위치시키고 비처리된 대조군(맹장이 마멸되었지만 어떠한 처리도 하지 않은 동물)과 비교하였다. 재조합 루브리신 제형의 부재하에 랫트 모델에서 유착 형성 양과 비교하여 재조합 루브리신 제형의 존재하에 유착 형성 양이 감소되었음은 당해 제형이 조직 유착 형성을 감소시키는데 있어 임상적으로 효과적임을 나타낸다. 그러나, 조직 유착이 요망되는 상황(예를 들어, 연골 균열의 치유가 요망되는 경우)에서, 재조합 루브리신의 사용을 피하는 것이 좋을 수 있다. 연골 표면에 윤활을 제공하는 것은 연골-연골 통합을 손상시킨다[참조: Schaefer et al., 2004].

재조합 루브리신은 또한 포유동물에게 이식하기 전에 의지(義肢) 및 인공 관절을 피복시키는데 사용된다. 예를 들어, 이러한 장치를, 예를 들어 US5709020 또는 US5702456에 기술된 방법 후에 재조합 루브리신의 용액에 액침시키거나 침지시킬 수 있다. 그러나, 보형물 주위로 윤활을 제공하는데 있어서 재조합 루브리신의 생체내 사용시에는 주의를 기울여야 한다. PRG4 유전자 발현(즉, MSF 유전자 발현)의 현저한 상향조절은 보형물 해리와 관련되는 것으로 보고된 바 있으며; 루브리신은 골과 보형물 간의 단단한 상호작용을 방해하고 이로써 보형물 해리에 기여할 수 있다[참조: Morawietz et al., 2003].

실시예 8: OA 모델

루브리신 제제의 관절내 투여의 효능을 평가하기 위해서, 쥐의 골관절염/연골 미란 모델을 제조한다. 골관절염의 수술적 도입을 위해, 마우스를 250mg/kg 복강내 트리브로모에탄올(SIGMA^R Chemical)로 마취시키고, 슬개를 무균 수술용으로 준비한다. 슬개 인대의 중간에 종방향 절개부를 만들고, 관절포를 개방시키고, 반월 인대(내측반월을 경골 고평부(tibial plateau)에 고정시킴)를 확인한다. 동물의 서브세트에서, 추가의 조작을 수행하지 않고, 이 그룹은 모의 조작한다. 실험군에서, 내측 반월판 인대를 횡으로 절단하여 내측 반월의 탈안정화(DMM)를 야기한다. 모의 및 DMM 동물 둘다에서, 관절포 및 피하 층을 별도로 봉합 폐쇄시키고, 피부를 NEXABAND^R S/C 조직 접착제(제조원: Abbott, North Chicago, IL)를 적용하여 폐쇄시킨다. 부프레노르핀(BUPRENEX^R; Reckitt & Coleman, Kingston-upon-Hull, UK)를 수술전과 수술후에 투여하다.

재조합 루브리신 제제를 30게이지 바늘을 사용하여 관절내 주사로 투여한다. 슬개 관절당 5 내지 10㎕의 주사액을 수술 후 1주째에 투여한다. 추가의 주사액을 매주 임의로 투여한다. 동물을 수술후 4주째 및 수술후 8주째에 이산화탄소로 희생시킨다.

골관절의 진행 및 중증도를 평가하기 위해, 온전한 슬개 관절을 24시간 동안 4% 포름알데히드 속에 놓아둔 다음, EDTA/폴리비닐피롤리돈 속에서 5일 동안 탈회시킨다. 관절을 파라핀 속에 포매시키고 전체 관절 전반에 걸쳐서 6㎛ 전두단을 수득한다. 슬라이드를 사프라닌 O-패스트 그린(Safranin O-fast green)으로 염색하고, 변형시킨 반정량적 스코어화 시스템[참조: Chambers et al., 2001](여기서, "0" = 정상 연골; "0.5" = 구조적 변화없이 사프라닌 O의 손실; "1" = 조면 관절 표면 및 적은 세동; "2" = 표재 층 바로 밑에 있는 층 아래로의 세동; "3" =비석회화 연골의 경미한 손실(<20%); "5" = 비석회화 연골의 중간 정도 손실(20 내지 80%); 및 "6" = 비석회화 연골의 심각한(>80%) 손실)을 사용하여 관절 전반에 걸쳐서 70㎛ 간격으로 등급화한다. "4"의 스코어(골까지의 미란)는 당해 모델의 특징이 아니다. 관절의 모든 사분역(내측 경골 고평부, 대퇴골내측과, 외측 경골 고평부 및 대퇴골외측과)를 개별적으로 스코어화한다. 본 실험을 알지 못하는 관찰자에 의해서 각 슬개 관절에 대해 최소 12개 수준을 스코어화한다. 스코어는 각 관절에서 발견되는 최대 조직학적 스코어 또는 합산된 조직학적 스코어로서 표현한다. 합산된 스코어는 관절 전반에 걸친 각각의 조직학적 절편상에서 관절의 각 사분역에 대한 부가된 스코어를 나타낸다. 본 분석 방법으로 병변의 중증도 뿐만 아니라 OA-유사 병변이 발생한 연골의 표면적을 평가할 수 있다[참조: Glasson et al., 2004].

<110> WYETH <120> Recombinant lubricin molecules and uses thereof <130> 50657-01404WOPT <150> US 60/495,741 <151> 2003-08-14 <160> 29 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 155 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of synthetic cDNA cassette-1. <400> 1 cgcgcccaca actccaaaag agcccgcacc taccacgaca aagtcagctc ctactacgcc 60 caaagagcca gcgccgacga ctactaaaga accggcaccc accacgccta aggagccagc 120 tcctactaca acgaaaccgg caccaaccac tccgg 155 <210> 2 <211> 51 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Translation of SEQ ID NO: 1. <400> 2 Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala 1 5 10 15 Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala 20 25 30 Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Pro Ala Pro 35 40 45 Thr Thr Pro 50 <210> 3 <211> 125 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Nucleotide sequence of synthetic cDNA cassette-2. <400> 3 taaagaacca gcccctacta cgacaaagga gcctgcaccc acaaccacga agagcgcacc 60 cacaacacca aaggagccgg cccctacgac 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acagctacaa ccacacaagt aacatctacc 1620 acaactcaag ataccacacc attcaaaatt actactctta aaacaactac tcttgcaccc 1680 aaagtaacta caacaaaaaa gacaattact accactgaga ttatgaacaa acctgaagaa 1740 acagctaaac caaaagacag agctactaat tctaaagcga caactcctaa acctcaaaag 1800 ccaaccaaag cacccaaaaa acccacttct accaaaaagc caaaaacaat gcctagagtg 1860 agaaaaccaa agacgacacc aactccccgc aagatgacat caacaatgcc agaattgaac 1920 cctacctcaa gaatagcaga agccatgctc caaaccacca ccagacctaa ccaaactcca 1980 aactccaaac tagttgaagt aaatccaaag agtgaagatg caggtggtgc tgaaggagaa 2040 acacctcata tgcttctcag gccccatgtg ttcatgcctg aagttactcc cgacatggat 2100 tacttaccga gagtacccaa tcaaggcatt atcatcaatc ccatgctttc cgatgagacc 2160 aatatatgca atggtaagcc agtagatgga ctgactactt tgcgcaatgg gacattagtt 2220 gcattccgag gtcattattt ctggatgcta agtccattca gtccaccatc tccagctcgc 2280 agaattactg aagtttgggg tattccttcc cccattgata ctgtttttac taggtgcaac 2340 tgtgaaggaa aaactttctt ctttaaggat tctcagtact ggcgttttac caatgatata 2400 aaagatgcag ggtaccccaa accaattttc aaaggatttg gaggactaac tggacaaata 2460 gtggcagcgc tttcaacagc taaatataag aactggcctg aatctgtgta ttttttcaag 2520 agaggtggca gcattcagca gtatatttat aaacaggaac ctgtacagaa gtgccctgga 2580 agaaggcctg ctctaaatta tccagtgtat ggagaaatga cacaggttag gagacgtcgc 2640 tttgaacgtg ctataggacc ttctcaaaca cacaccatca gaattcaata ttcacctgcc 2700 agactggctt atcaagacaa aggtgtcctt cataatgaag ttaaagtgag tatactgtgg 2760 agaggacttc caaatgtggt tacctcagct atatcactgc ccaacatcag aaaacctgac 2820 ggctatgatt actatgcctt ttctaaagat caatactata acattgatgt gcctagtaga 2880 acagcaagag caattactac tcgttctggg cagaccttat ccaaagtctg gtacaactgt 2940 ccttaa 2946 <210> 7 <211> 981 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of entire PRG4-LUB:1 protein. <400> 7 Met Ala Trp Lys Thr Leu Pro Ile Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Val 1 5 10 15 Phe Val Ile Gln Gln Val Ser Ser Gln Asp Leu Ser Ser Cys Ala Gly 20 25 30 Arg Cys Gly Glu Gly Tyr Ser Arg Asp Ala Thr Cys Asn Cys Asp Tyr 35 40 45 Asn Cys Gln His Tyr Met Glu Cys Cys Pro Asp Phe 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Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala 20 25 30 Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Pro Ala Pro 35 40 45 Thr Thr Pro 50 <210> 10 <211> 3024 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant PRG4-Lub:2 cDNA construct. <400> 10 atggcatgga aaacacttcc catttacctg ttgttgctgc tgtctgtttt cgtgattcag 60 caagtttcat ctcaagattt atcaagctgt gcagggagat gtggggaagg gtattctaga 120 gatgccacct gcaactgtga ttataactgt caacactaca tggagtgctg ccctgatttc 180 aagagagtct gcactgcgga gctttcctgt aaaggccgct gctttgagtc cttcgagaga 240 gggagggagt gtgactgcga cgcccaatgt aagaagtatg acaagtgctg tcccgattat 300 gagagtttct gtgcagaagt gcataatccc acatcaccac catcttcaaa gaaagcacct 360 ccaccttcag gagcatctca aaccatcaaa tcaacaacca aacgttcacc caaaccacca 420 aacaagaaga agactaagaa agttatagaa tcagaggaaa taacagaaga acattctgtt 480 tctgaaaatc aagagtcctc ctccagtagc agttcaagta gttcgtcgtc gacaatttgg 540 aaaatcaagt cttccaaaaa ttcagctgct aatagagaat tacagaagaa actcaaagta 600 aaagataaca agaagaacag aactaaaaag aaacctaccc ccaaaccacc agttgtagat 660 gaagctggaa gtggattgga caatggtgac ttcaaggtca caactcctga cacgtctacc 720 acccaacaca ataaagtcag cacatctccc aagatcacaa cagcaaaacc aataaatccc 780 agacccagtc ttccacctaa ttctgataca tctaaagaga cgtctttgac agtgaataaa 840 gagacaacag ttgaaactaa agaaactact acaacaaata aacagacttc aactgatgga 900 aaagagaaga ctacttccgc taaagagaca caaagtatag agaaaacatc tgctaaagat 960 ttagcaccca catctaaagt gctggctaaa cctacaccca aagctgaaac tacaaccaaa 1020 ggccctgctc tcaccactcc caaggagccc acgcccacca ctcccaagga gcctgcatct 1080 accacaccca aagagcccac acctaccacc atcaagagcg cgcccacaac tccaaaagag 1140 cccgcaccta ccacgacaaa gtcagctcct actacgccca aagagccagc gccgacgact 1200 actaaagaac cggcacccac cacgcctaaa gaaccagccc ctactacgac aaaggagcct 1260 gcacccacaa ccacgaagag cgcacccaca acaccaaagg agccggcccc tacgactcct 1320 aaggaaccca aaccggcacc aaccactccg gaaacacctc ctccaaccac ttcagaggtc 1380 tctactccaa ctaccaccaa ggagcctacc actatccaca aaagccctga tgaatcaact 1440 cctgagcttt ctgcagaacc cacaccaaaa gctcttgaaa acagtcccaa ggaacctggt 1500 gtacctacaa ctaagacgcc ggcggcgact aaacctgaaa tgactacaac agctaaagac 1560 aagacaacag aaagagactt acgtactaca cctgaaacta caactgctgc acctaagatg 1620 acaaaagaga cagcaactac aacagaaaaa actaccgaat ccaaaataac agctacaacc 1680 acacaagtaa catctaccac aactcaagat accacaccat tcaaaattac tactcttaaa 1740 acaactactc ttgcacccaa agtaactaca acaaaaaaga caattactac cactgagatt 1800 atgaacaaac ctgaagaaac agctaaacca aaagacagag ctactaattc taaagcgaca 1860 actcctaaac ctcaaaagcc aaccaaagca cccaaaaaac ccacttctac caaaaagcca 1920 aaaacaatgc ctagagtgag aaaaccaaag acgacaccaa ctccccgcaa gatgacatca 1980 acaatgccag aattgaaccc tacctcaaga atagcagaag ccatgctcca aaccaccacc 2040 agacctaacc aaactccaaa ctccaaacta gttgaagtaa atccaaagag tgaagatgca 2100 ggtggtgctg aaggagaaac acctcatatg cttctcaggc cccatgtgtt catgcctgaa 2160 gttactcccg acatggatta cttaccgaga gtacccaatc aaggcattat catcaatccc 2220 atgctttccg atgagaccaa tatatgcaat ggtaagccag tagatggact gactactttg 2280 cgcaatggga cattagttgc attccgaggt cattatttct ggatgctaag tccattcagt 2340 ccaccatctc cagctcgcag aattactgaa gtttggggta ttccttcccc cattgatact 2400 gtttttacta ggtgcaactg tgaaggaaaa actttcttct ttaaggattc tcagtactgg 2460 cgttttacca atgatataaa agatgcaggg taccccaaac caattttcaa aggatttgga 2520 ggactaactg gacaaatagt ggcagcgctt tcaacagcta aatataagaa ctggcctgaa 2580 tctgtgtatt ttttcaagag aggtggcagc attcagcagt atatttataa acaggaacct 2640 gtacagaagt gccctggaag aaggcctgct ctaaattatc cagtgtatgg agaaatgaca 2700 caggttagga gacgtcgctt tgaacgtgct ataggacctt ctcaaacaca caccatcaga 2760 attcaatatt cacctgccag actggcttat caagacaaag gtgtccttca taatgaagtt 2820 aaagtgagta tactgtggag aggacttcca aatgtggtta cctcagctat atcactgccc 2880 aacatcagaa aacctgacgg ctatgattac tatgcctttt ctaaagatca atactataac 2940 attgatgtgc ctagtagaac agcaagagca attactactc gttctgggca gaccttatcc 3000 aaagtctggt acaactgtcc ttaa 3024 <210> 11 <211> 1007 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of entire PRG4-LUB:2 protein. <400> 11 Met Ala Trp Lys Thr Leu Pro Ile Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Val 1 5 10 15 Phe Val Ile Gln Gln Val Ser Ser Gln Asp Leu Ser Ser Cys Ala Gly 20 25 30 Arg Cys Gly Glu Gly Tyr Ser Arg Asp Ala Thr Cys Asn Cys Asp Tyr 35 40 45 Asn Cys Gln His Tyr Met Glu Cys Cys Pro Asp Phe Lys Arg Val Cys 50 55 60 Thr Ala Glu Leu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Ser Phe Glu Arg 65 70 75 80 Gly Arg Glu Cys Asp Cys Asp Ala Gln Cys Lys Lys Tyr Asp Lys Cys 85 90 95 Cys Pro Asp Tyr Glu Ser Phe Cys Ala Glu Val His Asn Pro Thr Ser 100 105 110 Pro Pro Ser Ser Lys Lys Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala Ser Gln Thr 115 120 125 Ile Lys Ser Thr Thr Lys Arg Ser Pro Lys Pro Pro Asn Lys Lys Lys 130 135 140 Thr Lys Lys Val Ile Glu Ser Glu Glu Ile Thr Glu Glu His Ser Val 145 150 155 160 Ser Glu Asn Gln Glu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser 165 170 175 Ser Thr Ile Trp Lys Ile Lys Ser Ser Lys Asn Ser Ala Ala Asn Arg 180 185 190 Glu Leu Gln Lys Lys Leu Lys Val Lys Asp Asn Lys Lys Asn Arg Thr 195 200 205 Lys Lys Lys Pro Thr Pro Lys Pro Pro Val Val Asp Glu Ala Gly Ser 210 215 220 Gly Leu Asp Asn Gly Asp 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aaccggcacc caccacgcct aaagaaccag 120 cccctactac gacaaaggag cctgcaccca caaccacgaa gagcgcaccc acaacaccaa 180 aggagccggc ccctacgact cctaaggaac ccaaaccggc accaaccact ccgga 235 <210> 13 <211> 77 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 77 amino acids encoded by Lub:2 DNA insert (6 KEPAPTT sequences between S373 and E451 in SEQ ID NO: 11). <400> 13 Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala 1 5 10 15 Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala 20 25 30 Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala 35 40 45 Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro 50 55 60 Thr Thr Pro Lys Glu Pro Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro 65 70 75 <210> 14 <211> 3117 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant PRG4-Lub:3 cDNA construct. <400> 14 atggcatgga aaacacttcc catttacctg ttgttgctgc tgtctgtttt cgtgattcag 60 caagtttcat ctcaagattt atcaagctgt gcagggagat gtggggaagg gtattctaga 120 gatgccacct gcaactgtga ttataactgt caacactaca tggagtgctg ccctgatttc 180 aagagagtct gcactgcgga gctttcctgt aaaggccgct gctttgagtc cttcgagaga 240 gggagggagt gtgactgcga cgcccaatgt aagaagtatg acaagtgctg tcccgattat 300 gagagtttct gtgcagaagt gcataatccc acatcaccac catcttcaaa gaaagcacct 360 ccaccttcag gagcatctca aaccatcaaa tcaacaacca aacgttcacc caaaccacca 420 aacaagaaga agactaagaa agttatagaa tcagaggaaa taacagaaga acattctgtt 480 tctgaaaatc aagagtcctc ctccagtagc agttcaagta gttcgtcgtc gacaatttgg 540 aaaatcaagt cttccaaaaa ttcagctgct aatagagaat tacagaagaa actcaaagta 600 aaagataaca agaagaacag aactaaaaag aaacctaccc ccaaaccacc agttgtagat 660 gaagctggaa gtggattgga caatggtgac ttcaaggtca caactcctga cacgtctacc 720 acccaacaca ataaagtcag cacatctccc aagatcacaa cagcaaaacc aataaatccc 780 agacccagtc ttccacctaa ttctgataca tctaaagaga cgtctttgac agtgaataaa 840 gagacaacag ttgaaactaa agaaactact acaacaaata aacagacttc aactgatgga 900 aaagagaaga ctacttccgc taaagagaca caaagtatag agaaaacatc tgctaaagat 960 ttagcaccca catctaaagt gctggctaaa cctacaccca aagctgaaac tacaaccaaa 1020 ggccctgctc tcaccactcc caaggagccc acgcccacca ctcccaagga gcctgcatct 1080 accacaccca aagagcccac acctaccacc atcaagagcg cgcccacaac tccaaaagag 1140 cccgcaccta ccacgacaaa gtcagctcct actacgccca aagagccagc gccgacgact 1200 actaaagaac cggcacccac cacgcctaaa gaaccagccc ctactacgac aaaggagcct 1260 gcacccacaa ccacgaagag cgcacccaca acaccaaagg agccggcccc tacgactcct 1320 aaagaaccag cccctactac gacaaaggag cctgcaccca caaccacgaa gagcgcaccc 1380 acaacaccaa aggagccggc ccctacgact cctaaggaac ccaaaccggc accaaccact 1440 ccggaaacac ctcctccaac cacttcagag gtctctactc caactaccac caaggagcct 1500 accactatcc acaaaagccc tgatgaatca actcctgagc tttctgcaga acccacacca 1560 aaagctcttg aaaacagtcc caaggaacct ggtgtaccta caactaagac gccggcggcg 1620 actaaacctg aaatgactac aacagctaaa gacaagacaa cagaaagaga cttacgtact 1680 acacctgaaa ctacaactgc tgcacctaag atgacaaaag agacagcaac tacaacagaa 1740 aaaactaccg aatccaaaat aacagctaca accacacaag taacatctac cacaactcaa 1800 gataccacac cattcaaaat tactactctt aaaacaacta ctcttgcacc caaagtaact 1860 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40 45 Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro 50 55 60 Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro 65 70 75 80 Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr 85 90 95 Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr 100 105 110 Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr 115 120 125 Pro Lys Glu Pro Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro 130 135 <210> 22 <211> 3303 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Recombinant PRG4-Lub:5 cDNA construct <400> 22 atggcatgga aaacacttcc catttacctg ttgttgctgc tgtctgtttt cgtgattcag 60 caagtttcat ctcaagattt atcaagctgt gcagggagat gtggggaagg gtattctaga 120 gatgccacct gcaactgtga ttataactgt caacactaca tggagtgctg ccctgatttc 180 aagagagtct gcactgcgga gctttcctgt aaaggccgct gctttgagtc cttcgagaga 240 gggagggagt gtgactgcga cgcccaatgt aagaagtatg acaagtgctg tcccgattat 300 gagagtttct gtgcagaagt gcataatccc acatcaccac catcttcaaa gaaagcacct 360 ccaccttcag gagcatctca aaccatcaaa tcaacaacca aacgttcacc caaaccacca 420 aacaagaaga agactaagaa agttatagaa tcagaggaaa taacagaaga acattctgtt 480 tctgaaaatc aagagtcctc ctccagtagc agttcaagta gttcgtcgtc gacaatttgg 540 aaaatcaagt cttccaaaaa ttcagctgct aatagagaat tacagaagaa actcaaagta 600 aaagataaca agaagaacag aactaaaaag aaacctaccc ccaaaccacc agttgtagat 660 gaagctggaa gtggattgga caatggtgac ttcaaggtca caactcctga cacgtctacc 720 acccaacaca ataaagtcag cacatctccc aagatcacaa cagcaaaacc aataaatccc 780 agacccagtc ttccacctaa ttctgataca tctaaagaga cgtctttgac agtgaataaa 840 gagacaacag ttgaaactaa agaaactact acaacaaata aacagacttc aactgatgga 900 aaagagaaga ctacttccgc taaagagaca caaagtatag agaaaacatc tgctaaagat 960 ttagcaccca catctaaagt gctggctaaa cctacaccca aagctgaaac tacaaccaaa 1020 ggccctgctc tcaccactcc caaggagccc acgcccacca ctcccaagga gcctgcatct 1080 accacaccca aagagcccac acctaccacc atcaagagcg cgcccacaac tccaaaagag 1140 cccgcaccta ccacgacaaa gtcagctcct actacgccca aagagccagc gccgacgact 1200 actaaagaac cggcacccac cacgcctaaa gaaccagccc ctactacgac aaaggagcct 1260 gcacccacaa ccacgaagag cgcacccaca acaccaaagg agccggcccc tacgactcct 1320 aaagaaccag cccctactac gacaaaggag cctgcaccca caaccacgaa gagcgcaccc 1380 acaacaccaa aggagccggc ccctacgact cctaaagaac cagcccctac tacgacaaag 1440 gagcctgcac ccacaaccac gaagagcgca cccacaacac caaaggagcc ggcccctacg 1500 actcctaaag aaccagcccc tactacgaca aaggagcctg cacccacaac cacgaagagc 1560 gcacccacaa caccaaagga gccggcccct acgactccta aggaacccaa accggcacca 1620 accactccgg aaacacctcc tccaaccact tcagaggtct ctactccaac taccaccaag 1680 gagcctacca ctatccacaa aagccctgat gaatcaactc ctgagctttc tgcagaaccc 1740 acaccaaaag ctcttgaaaa cagtcccaag gaacctggtg tacctacaac taagacgccg 1800 gcggcgacta aacctgaaat gactacaaca gctaaagaca agacaacaga aagagactta 1860 cgtactacac ctgaaactac aactgctgca cctaagatga caaaagagac agcaactaca 1920 acagaaaaaa ctaccgaatc caaaataaca gctacaacca cacaagtaac atctaccaca 1980 actcaagata ccacaccatt caaaattact actcttaaaa caactactct tgcacccaaa 2040 gtaactacaa caaaaaagac aattactacc actgagatta tgaacaaacc tgaagaaaca 2100 gctaaaccaa aagacagagc tactaattct aaagcgacaa ctcctaaacc tcaaaagcca 2160 accaaagcac ccaaaaaacc cacttctacc aaaaagccaa aaacaatgcc tagagtgaga 2220 aaaccaaaga cgacaccaac tccccgcaag atgacatcaa caatgccaga attgaaccct 2280 acctcaagaa tagcagaagc catgctccaa accaccacca gacctaacca aactccaaac 2340 tccaaactag ttgaagtaaa tccaaagagt gaagatgcag gtggtgctga aggagaaaca 2400 cctcatatgc ttctcaggcc ccatgtgttc atgcctgaag ttactcccga catggattac 2460 ttaccgagag tacccaatca aggcattatc atcaatccca tgctttccga tgagaccaat 2520 atatgcaatg gtaagccagt agatggactg actactttgc gcaatgggac attagttgca 2580 ttccgaggtc attatttctg gatgctaagt ccattcagtc caccatctcc agctcgcaga 2640 attactgaag tttggggtat tccttccccc attgatactg tttttactag gtgcaactgt 2700 gaaggaaaaa ctttcttctt taaggattct cagtactggc gttttaccaa tgatataaaa 2760 gatgcagggt accccaaacc aattttcaaa ggatttggag gactaactgg acaaatagtg 2820 gcagcgcttt caacagctaa atataagaac tggcctgaat ctgtgtattt tttcaagaga 2880 ggtggcagca ttcagcagta tatttataaa caggaacctg tacagaagtg ccctggaaga 2940 aggcctgctc taaattatcc agtgtatgga gaaatgacac aggttaggag acgtcgcttt 3000 gaacgtgcta taggaccttc tcaaacacac accatcagaa ttcaatattc acctgccaga 3060 ctggcttatc aagacaaagg tgtccttcat aatgaagtta aagtgagtat actgtggaga 3120 ggacttccaa atgtggttac ctcagctata tcactgccca acatcagaaa acctgacggc 3180 tatgattact atgccttttc taaagatcaa tactataaca ttgatgtgcc tagtagaaca 3240 gcaagagcaa ttactactcg ttctgggcag accttatcca aagtctggta caactgtcct 3300 taa 3303 <210> 23 <211> 1100 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence of entire PRG4-LUB:5 protein. <400> 23 Met Ala Trp Lys Thr Leu Pro Ile Tyr Leu Leu Leu Leu Leu Ser Val 1 5 10 15 Phe Val Ile Gln Gln Val Ser Ser Gln Asp Leu Ser Ser Cys Ala Gly 20 25 30 Arg Cys Gly Glu Gly Tyr Ser Arg Asp Ala Thr Cys Asn Cys Asp Tyr 35 40 45 Asn Cys Gln His Tyr Met Glu Cys Cys Pro Asp Phe Lys Arg Val Cys 50 55 60 Thr Ala Glu Leu Ser Cys Lys Gly Arg Cys Phe Glu Ser Phe Glu Arg 65 70 75 80 Gly Arg Glu Cys Asp Cys Asp Ala Gln Cys Lys Lys Tyr Asp Lys Cys 85 90 95 Cys Pro Asp Tyr Glu Ser Phe Cys Ala Glu Val His Asn Pro Thr Ser 100 105 110 Pro Pro Ser Ser Lys Lys Ala Pro Pro Pro Ser Gly Ala Ser Gln Thr 115 120 125 Ile Lys Ser Thr Thr Lys Arg Ser Pro Lys Pro Pro Asn Lys Lys Lys 130 135 140 Thr Lys Lys Val Ile Glu Ser Glu Glu Ile Thr Glu Glu His Ser Val 145 150 155 160 Ser Glu Asn Gln Glu Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser 165 170 175 Ser Thr Ile Trp Lys Ile Lys Ser Ser Lys Asn Ser Ala Ala Asn Arg 180 185 190 Glu Leu Gln Lys Lys Leu Lys Val Lys Asp Asn Lys Lys Asn Arg Thr 195 200 205 Lys Lys Lys Pro Thr Pro Lys Pro Pro Val Val Asp Glu Ala Gly Ser 210 215 220 Gly Leu Asp Asn Gly Asp Phe Lys Val Thr Thr Pro Asp Thr Ser Thr 225 230 235 240 Thr Gln His Asn Lys Val Ser Thr Ser Pro Lys Ile Thr Thr Ala Lys 245 250 255 Pro Ile Asn Pro Arg Pro Ser Leu Pro Pro Asn Ser Asp Thr Ser Lys 260 265 270 Glu Thr Ser Leu Thr Val Asn Lys Glu Thr Thr Val Glu Thr Lys Glu 275 280 285 Thr Thr Thr Thr Asn Lys Gln Thr Ser Thr Asp Gly Lys Glu Lys Thr 290 295 300 Thr Ser Ala Lys Glu Thr Gln Ser Ile Glu Lys Thr Ser Ala Lys Asp 305 310 315 320 Leu Ala Pro Thr Ser Lys Val Leu Ala Lys Pro Thr Pro Lys Ala Glu 325 330 335 Thr Thr Thr Lys Gly Pro Ala Leu Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro 340 345 350 Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Ser Thr Thr Pro Lys Glu Pro Thr Pro 355 360 365 Thr Thr Ile Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr 370 375 380 Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr 385 390 395 400 Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr 405 410 415 Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro 420 425 430 Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr 435 440 445 Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys 450 455 460 Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys 465 470 475 480 Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu 485 490 495 Pro Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu 500 505 510 Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro 515 520 525 Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro Glu 530 535 540 Thr Pro Pro Pro Thr Thr Ser Glu Val Ser Thr Pro Thr Thr Thr Lys 545 550 555 560 Glu Pro Thr Thr Ile His Lys Ser Pro Asp Glu Ser Thr Pro Glu Leu 565 570 575 Ser Ala Glu Pro Thr Pro Lys Ala Leu Glu Asn Ser Pro Lys Glu Pro 580 585 590 Gly Val Pro Thr Thr Lys Thr Pro Ala Ala Thr Lys Pro Glu Met Thr 595 600 605 Thr Thr Ala Lys Asp Lys Thr Thr Glu Arg Asp Leu Arg Thr Thr Pro 610 615 620 Glu Thr Thr Thr Ala Ala Pro Lys Met Thr Lys Glu Thr Ala Thr Thr 625 630 635 640 Thr Glu Lys Thr Thr Glu Ser Lys Ile Thr Ala Thr Thr Thr Gln Val 645 650 655 Thr Ser Thr Thr Thr Gln Asp Thr Thr Pro Phe Lys Ile Thr Thr Leu 660 665 670 Lys Thr Thr Thr Leu Ala Pro Lys Val Thr Thr Thr Lys Lys Thr Ile 675 680 685 Thr Thr Thr Glu Ile Met Asn Lys Pro Glu Glu Thr Ala Lys Pro Lys 690 695 700 Asp Arg Ala Thr Asn Ser Lys Ala Thr Thr Pro Lys Pro Gln Lys Pro 705 710 715 720 Thr Lys Ala Pro Lys Lys Pro Thr Ser Thr Lys Lys Pro Lys Thr Met 725 730 735 Pro Arg Val Arg Lys Pro Lys Thr Thr Pro Thr Pro Arg Lys Met Thr 740 745 750 Ser Thr Met Pro Glu Leu Asn Pro Thr Ser Arg Ile Ala Glu Ala Met 755 760 765 Leu Gln Thr Thr Thr Arg Pro Asn Gln Thr Pro Asn Ser Lys Leu Val 770 775 780 Glu Val Asn Pro Lys Ser Glu Asp Ala Gly Gly Ala Glu Gly Glu Thr 785 790 795 800 Pro His Met Leu Leu Arg Pro His Val Phe Met Pro Glu Val Thr Pro 805 810 815 Asp Met Asp Tyr Leu Pro Arg Val Pro Asn Gln Gly Ile Ile Ile Asn 820 825 830 Pro Met Leu Ser Asp Glu Thr Asn Ile Cys Asn Gly Lys Pro Val Asp 835 840 845 Gly Leu Thr Thr Leu Arg Asn Gly Thr Leu Val Ala Phe Arg Gly His 850 855 860 Tyr Phe Trp Met Leu Ser Pro Phe Ser Pro Pro Ser Pro Ala Arg Arg 865 870 875 880 Ile Thr Glu Val Trp Gly Ile Pro Ser Pro Ile Asp Thr Val Phe Thr 885 890 895 Arg Cys Asn Cys Glu Gly Lys Thr Phe Phe Phe Lys Asp Ser Gln Tyr 900 905 910 Trp Arg Phe Thr Asn Asp Ile Lys Asp Ala Gly Tyr Pro Lys Pro Ile 915 920 925 Phe Lys Gly Phe Gly Gly Leu Thr Gly Gln Ile Val Ala Ala Leu Ser 930 935 940 Thr Ala Lys Tyr Lys Asn Trp Pro Glu Ser Val Tyr Phe Phe Lys Arg 945 950 955 960 Gly Gly Ser Ile Gln Gln Tyr Ile Tyr Lys Gln Glu Pro Val Gln Lys 965 970 975 Cys Pro Gly Arg Arg Pro Ala Leu Asn Tyr Pro Val Tyr Gly Glu Met 980 985 990 Thr Gln Val Arg Arg Arg Arg Phe Glu Arg Ala Ile Gly Pro Ser Gln 995 1000 1005 Thr His Thr Ile Arg Ile Gln Tyr Ser Pro Ala Arg Leu Ala Tyr 1010 1015 1020 Gln Asp Lys Gly Val Leu His Asn Glu Val Lys Val Ser Ile Leu 1025 1030 1035 Trp Arg Gly Leu Pro Asn Val Val Thr Ser Ala Ile Ser Leu Pro 1040 1045 1050 Asn Ile Arg Lys Pro Asp Gly Tyr Asp Tyr Tyr Ala Phe Ser Lys 1055 1060 1065 Asp Gln Tyr Tyr Asn Ile Asp Val Pro Ser Arg Thr Ala Arg Ala 1070 1075 1080 Ile Thr Thr Arg Ser Gly Gln Thr Leu Ser Lys Val Trp Tyr Asn 1085 1090 1095 Cys Pro 1100 <210> 24 <211> 514 <212> DNA <213> Artificial <220> <223> Lub:5 DNA insert from cDNA cassette-1 and four synthetic cDNA cassette-2 sequences <400> 24 gcgcgcccac aactccaaaa gagcccgcac ctaccacgac aaagtcagct cctactacgc 60 ccaaagagcc agcgccgacg actactaaag aaccggcacc caccacgcct aaagaaccag 120 cccctactac gacaaaggag cctgcaccca caaccacgaa gagcgcaccc acaacaccaa 180 aggagccggc ccctacgact cctaaagaac cagcccctac tacgacaaag gagcctgcac 240 ccacaaccac gaagagcgca cccacaacac caaaggagcc ggcccctacg actcctaaag 300 aaccagcccc tactacgaca aaggagcctg cacccacaac cacgaagagc gcacccacaa 360 caccaaagga gccggcccct acgactccta aagaaccagc ccctactacg acaaaggagc 420 ctgcacccac aaccacgaag agcgcaccca caacaccaaa ggagccggcc cctacgactc 480 ctaaggaacc caaaccggca ccaaccactc cgga 514 <210> 25 <211> 170 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> 170 amino acids encoded by Lub:5 DNA insert (15 KEPAPTT sequences between S373 and E544 in SEQ ID NO: 23) <400> 25 Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala 1 5 10 15 Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala 20 25 30 Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala 35 40 45 Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro 50 55 60 Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro 65 70 75 80 Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr 85 90 95 Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr 100 105 110 Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr 115 120 125 Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr 130 135 140 Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro 145 150 155 160 Lys Glu Pro Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro 165 170 <210> 26 <211> 45 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequence "APTTPKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTT KEPAPTTPKEPAPTTTK" (45 amino acids) in preferred PRG4-LUB:N protein <400> 26 Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala 1 5 10 15 Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala 20 25 30 Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys 35 40 45 <210> 27 <211> 31 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> amino acid sequence "KEPAPTTTKEPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP" (31 amino acids) repeated N-1 times in preferred PRG4-LUB:N protein <400> 27 Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr 1 5 10 15 Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu Pro Ala Pro Thr Thr Pro 20 25 30 <210> 28 <211> 22 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence "EPAPTTTKSAPTTPKEPAPTTP" (22 amino acids) joining SEQ ID NO: 26 to (N-2) repeats of SEQ ID NO: 27 in preferred PRG4-LUB:N protein where N = 3 or more. <400> 28 Glu Pro Ala Pro Thr Thr Thr Lys Ser Ala Pro Thr Thr Pro Lys Glu 1 5 10 15 Pro Ala Pro Thr Thr Pro 20 <210> 29 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> Amino acid sequence "KEPKPAPTTP" (10 amino acids) in preferred PRG4-LUB:N protein where N = 2 or more. <400> 29 Lys Glu Pro Lys Pro Ala Pro Thr Thr Pro 1 5 10

Claims (32)

1. 엑손 6에 의해 암호화된 아미노산 서열의 전부 또는 일부가, 서열번호 9; 서열번호 13; 서열번호 17; 서열번호 21; 서열번호 25; 서열번호 27의 N-2개의 반복부(들)(여기서, N은 3 내지 200의 정수이다)에 연결된 서열번호 26; 및 서열번호 26 + 서열번호 28 + [서열번호 27의 N-2개의 반복부(들)(여기서, N은 10 내지 30의 정수이다)] + 서열번호 29로 이루어진 그룹으로부터 선택된 아미노산 서열을 포함하는 폴리펩타이드로 치환된 사람 프로테오글리칸-4(PRG-4) 단백질을 포함하는, 윤활 활성 및/또는 항유착 활성을 갖는 분리된 재조합 루브리신 단백질.
2. 제1항에 있어서, PRG-4 단백질이 V0 동종형(isoform), V1 동종형, V2 동종형 및 V3 동종형으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 단백질.
3. 제2항에 있어서, PRG-4 단백질이 V0 동종형인 단백질.
4. 제1항에 있어서, 서열번호 7, 11, 15, 19 또는 23에 제시된 아미노산 서열을 포함하는 단백질.
5. 제1항에 있어서, β-(1-3)-Gal-GalNac, 케라틴 설페이트 또는 콘드로이틴 설페이트에 O-연결된 단백질.
6. 약제학적으로 허용되는 담체중에 제1항의 치료학적 유효량의 단백질을 포함하는,

   조직의 윤활 기능을 개선/증진시키거나;

   관절 기능부전을 치료하거나;

   최적의 활막성 관절 기능을 유지하거나;

   활막 손상을 치료하거나;

   골 손상을 치료하거나;

   연골 손상/미란을 치료하거나;

   관절염을 치료하거나;

   상처 및/또는 조직 손상을 치료하거나;

   2개의 마주보는 조직 표면간의 유착을 억제하거나;

   관절통을 감소시키거나;

   체중-부하 통증을 감소시키거나;

   조직간의 목적하지 않은 유착을 억제하거나;

   건 표면으로의 세포 유착을 억제하거나;

   점성보충(viscosupplementation)을 위한 약제학적 조성물
7. 제6항에 있어서, 하이알루로난 또는 하일란을 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
8. 제6항 또는 제7항에 있어서, 주사용으로 제형화된 약제학적 조성물.
9. 제6항 또는 제7항에 있어서, 캅셀화된 약제학적 조성물.
10. 제9항에 있어서, 이식가능한 약물 전달 매트릭스내에 캅셀화된 약제학적 조성물.
11. 제6항 또는 제7항에 있어서, 국소 마취제, 사이토킨, 림포킨, 혈전용해 인자, 항혈전용해 인자, 소염제, 항생제 및 성장 인자중 하나 이상을 추가로 포함하는 약제학적 조성물.
12. 제1항의 재조합 루브리신 단백질의 아미노산 서열을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는, 재조합 루브리신 단백질을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
13. 전체 서열 길이에 걸쳐 서열번호 6, 10, 14, 18 또는 22와 80% 이상의 동일성을 갖고 윤활 및/또는 항유착 활성을 갖는 재조합 루브리신 단백질을 암호화하는 핵산 서열을 포함하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
14. 제13항에 있어서, 90% 이상의 동일성을 갖는 폴리뉴클레오타이드.
15. 높은 엄격성 조건하에서 서열번호 6, 10, 14, 18 또는 22에 제시된 핵산 서열과 하이브리드화하고 윤활 및/또는 항유착 활성을 갖는 재조합 루브리신 단백질을 암호화하는 분리된 폴리뉴클레오타이드.
16. 발현 조절 서열에 작동적으로 연결된 제12항 내지 제15항 중 어느 한 항에 따른 폴리뉴클레오타이드를 포함하는 발현 벡터.
17. 제16항의 적절한 발현 벡터로 형질전환된 세포를 액체 배양 배지에서 성장시키는 단계; 및

    상기 배지로부터 재조합 단백질을 수집하는 단계를 포함하는, 재조합 루브리신 단백질의 제조 방법.
18. 제17항에 있어서, 단백질을 수집하는 단계가, 배지를 막을 통해 여과하여 단백질을 농축시키고; 보유된 단백질을 상기 막으로부터 수집하고; 수집된 단백질을 0.1 내지 2.0M 농도 범위의 L-아르기닌 하이드로클로라이드를 함유하는 완충된 염 용액에서 가용화시킴을 포함하는 방법.
19. 제17항에 있어서, 세포가 중국 햄스터 난소 세포인 방법.
20. 제19항에 있어서, 중국 햄스터 난소 세포가 CHO DUKX 세포인 방법.
21. 제18항에 있어서, L-아르기닌 하이드로클로라이드 농도가 0.5M인 방법.
22. 제6항 또는 제7항의 조성물을 피험체의 관절 또는 조직에 투여함을 포함하는, 사람을 제외한 피험체에서 관절 또는 조직의 윤활을 개선시키는 방법.
23. 제22항에 있어서, 피험체가 마우스, 랫트, 고양이, 개 및 말로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 방법.
24. 제6항 또는 제7항에 있어서, 관절내 윤활 감소로 인해 활막성 관절의 비-최적 기능을 갖는 피험체를 치료하기 위한 약제학적 조성물.
25. 제6항 또는 제7항에 있어서, 피험체를 치료하여 체중-부하 통증을 감소시키기 위한 약제학적 조성물.
26. 제6항 또는 제7항에 있어서, 피험체의 관절염을 치료하기 위한 약제학적 조성물.
27. 제26항에 있어서, 관절염이 골관절염 또는 류마티스 관절염인 약제학적 조성물.
28. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 단백질에 특이적으로 결합하는 분리된 항체.
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