JP5564268B2 - 成長因子と結合する融合タンパク質 - Google Patents

Description

本発明は、抗血管新生組成物の分野に関する。本発明は、２つの異なる成長因子又はサイトカインと同時に結合する組成物にも関する。

ヒトにおいて３つの既知のＶＥＧＦ受容体、ＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２及びＶＥＧＦＲ３が存在する。ヒトＶＥＧＦＲ１は、７つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインから成る細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内チロシンキナーゼドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔエントリーＰ１７９４８）との３つの主な領域によって分けられた１３３８個のアミノ酸から成る（図１）。ＶＥＧＦＲ２及びＶＥＧＦＲ３は、同様に組織化し、チロシンキナーゼドメインにおいてＶＥＧＦＲ１に対して約８０％の同一性を示す。

ＶＥＧＦ−Ａの結合によるＶＥＧＦＲ１及びＶＥＧＦＲ２の活性化は、血液内皮細胞の成長、移動及び生存にとって極めて重要な役割を果たし、これは血管新生及び脈管形成に必須のプロセスである一方で、ＶＥＧＦ−Ｃ及びＶＥＧＦ−Ｄの結合によるＶＥＧＦＲ３の活性化は、リンパ内皮細胞の成長、移動及び生存にとって極めて重要な役割を果たし、これは特に指示がない限り、リンパ管形成に必須のプロセスである（非特許文献１、非特許文献２）。

ＶＥＧＦ−ＡとＶＥＧＦＲ１との親和性は、ＶＥＧＦＲ２に対するものよりおよそ１０倍高い。ＶＥＧＲ１の７つのＩｇ様ドメインでは、Ｉｇ様ドメイン２は、ＶＥＧＦ−Ａ結合に必須である（図２）。しかしながら、ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメイン２は、多くの塩基性アミノ酸を含有し、その理論等電点（ｐＩ）は９．１９である（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬエントリーに対するｐＩ／Ｍｗ計算ツール、http://kr.expasy.org/tools/pi_tool.html）。したがって、ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメイン２自体は、薬物動態特性が低いので、デコイ受容体の特性を有する治療タンパク質として使用することはできない。

免疫グロブリン及び表皮成長因子相同ドメイン−２（Ｔｉｅ２）を有するチロシンキナーゼは、内皮細胞及び造血細胞で主に発現する受容体チロシンキナーゼ（ＲＴＫ）である（非特許文献３）。Ｔｉｅ２は、脈管形成、血管新生及び造血に必須である（非特許文献４）。４つのＴｉｅ２リガンドが同定されている：アンジオポエチン１（Ａｎｇ１）、アンジオポエチン２（Ａｎｇ２）、アンジオポエチン３（Ａｎｇ３）、及びアンジオポエチン４（Ａｎｇ４）（非特許文献４）。Ａｎｇ１は、Ｔｉｅ２の必須の活性化因子であると考えられるが、Ａｎｇ２は、幾つかの細胞でこの受容体を活性化するが、他の細胞又は異なる条件下ではＴｉｅ２活性化を遮断する環境に特異的な（context-specific：状況に特異的な）効果があると考えられる（非特許文献４）。

ヒトＴｉｅ２は、２つのＩｇ様ドメイン、３つのＥＧＦ様ドメイン、１つのＩｇ様ドメイン、３つのＩＩＩ型フィブロネクチンから成る細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内チロシンキナーゼドメイン（ＵｎｉＰｒｏｔＫＢ／Ｓｗｉｓｓ−ＰｒｏｔエントリーＱ０２７６３）との３つの主な領域に分けられる１１２４個のアミノ酸から成る（図１）。

Ｔｉｅ２の細胞外サブドメイン中で、Ｉｇ様ドメイン２は、アンジオポエチン結合に必須であるが、Ｉｇ様ドメイン１及び３つのＥＧＦ様ドメインは、アンジオポエチンの安定結合に必要であると思われる（図２）。重要なことに、これらのサブドメインは、多くの酸性アミノ酸を含有し、その理論等電点（ｐＩ）は６．５５である（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ／ＴｒＥＭＢＬエントリーに対するｐＩ／Ｍｗ計算ツール、http://kr.expasy.org/tools/pi_tool.html）。したがって、これらのドメイン自体は、薬物動態値が高くなり得るので、治療タンパク質として使用することができる。

ＶＥＧＦ及びアンジオポエチンファミリータンパク質のうち、ＶＥＧＦ−Ａ及びアンジオポエチン２（Ａｎｇ２）は、腫瘍の血管新生（非特許文献５、非特許文献６）及び転移（非特許文献７）、加齢性黄斑変性症（非特許文献８）、糖尿病性網膜症（非特許文献９）、関節リウマチ（非特許文献１０、非特許文献１１）、乾癬（非特許文献１２）、急性及び慢性炎症（非特許文献１３、非特許文献１４）、アテローム性動脈硬化症（非特許文献１５）及び腫瘍リンパ管形成等のリンパ増殖性疾患（非特許文献１６）並びにリンパ行性転移（非特許文献１７）に必須の分子である。したがって、本発明は、ＶＥＧＦ−Ａ及び／又はＡｎｇ２関連疾患を治療するために、好ましくはデコイ受容体、二重特異性抗体内（intradiabody）（二重抗体）又はＲＮＡの干渉によるＶＥＧＦ−Ａ及びＡｎｇ２の同時阻止を提供する。

Shibuya M and Claessson-Welsh L, Exp. Cell Research 312:549-560,2006 Alitalo K, et al., Nature 438:946-953 Dumont DJ, et al., Oncogene 8: 1293-1301, 1993 Yancopoulos GD, et al., Nature 407:242-248, 2000 Holash, J. et al., Science 1999;284:1994-1998 Holash, J. et al., Oncogene 1999;18:5356-5362 Saaristo, A. et al., Oncogene 2000;19:6122-6129 Otani, A. et al., Invest Ophthalmol. Vis. Sci., 1999;40:1912-1920 Watanabe, D. et al., Am. J. Ophthalmol. 2005;139:476-481 Fearon, U. et al., J. Rheumatol. 2003;30:260-268 Paleolog, E.M. et al., Arthritis Res. 2002;4:S81-S90 Kuroda, K. et al., J. Invest Dermatol. 2001;116:713-720 McDonald, D.M. et al., Am. J. Respi. Cri. Care Med. 2001;164:S39-S45 Roviezzo, F. et al., J. Pharmacol. Exp. Ther. 2005; 314: 738-744 Lim HS, et al., Atherosclerosis, 2005;180:113-118 Scavelli, C. et al., Leukemia 2004;18:1054-1058 Sfiligoi, C. et al., Int. J. Cancer 2003;103:466-474

本発明は、２つの異なる成長因子又はサイトカインと結合する組成物も提供する。好ましくは、このような組成物は、同時に２つのタンパク質と結合することが可能な融合タンパク質である。一態様では、このような融合ポリペプチドは抗体ではない。好ましい態様では、このような融合ポリペプチドは、成長因子若しくはサイトカインの天然結合パートナーの全長形態又は断片を含む。最も好ましくは、融合ポリペプチド、即ち「二重抗血管新生タンパク質（ＤＡＡＰ）」は、血管内皮成長因子（ＶＥＧＦ）及びアンジオポエチンと同時に結合することが可能である。ＶＥＧＦ及びアンジオポエチン関連の症状、並びに癌、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、乾癬、急性及び慢性炎症、アテローム性動脈硬化症並びにリンパ増殖性疾患等の疾患を治療するのに治療的に有用であるＤＡＡＰを開示する。

特定の一態様において、本発明は、ＶＥＧＦポリペプチド及びアンジオポエチンポリペプチドと同時に結合することが可能であるポリペプチドをコードする単離核酸分子であって、Ｔｉｅ２構成要素及びＶＥＧＦＲ構成要素をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子に関する。Ｔｉｅ２構成要素及びＶＥＧＦＲ構成要素が、多量体形成構成要素をコードするヌクレオチド配列と操作可能に連結し得る。ＶＥＧＦＲは、ＶＥＧＦＲ１又はＶＥＧＦＲ３であり得るが、これに限定されない。また、多量体形成構成要素は、免疫グロブリンドメインであり得る。一態様では、免疫グロブリンドメインは、ＩｇＧのＦｃドメイン、ＩｇＧの重鎖、又はＩｇＧの軽鎖であり得る。さらにＴｉｅ２構成要素は、ＶＥＧＦＲ構成要素の上流又は下流に位置し得る。

別の態様において、核酸分子では、Ｔｉｅ２構成要素は、Ｔｉｅ２の細胞外ドメインのＩｇ様ドメイン１、Ｉｇ様ドメイン２及び３つのＥＧＦ様ドメインのアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含み得る。別の態様では、ＶＥＧＦＲ１構成要素が、本質的にＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメインのＩｇ様ドメイン２のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列から成り、ＶＥＧＦＲ３構成要素が、本質的にＶＥＧＦＲ３の細胞外ドメインのＩｇ様ドメイン１、Ｉｇ様ドメイン２及びＩｇ様ドメイン３のアミノ酸配列から成り得る。

別の態様において、本発明は、単離核酸分子であって、
（ａ）ＤＡＡＰ＃１と称される表１に記載のヌクレオチド配列；
（ｂ）ＤＡＡＰ＃２と称される表１に記載のヌクレオチド配列；
（ｃ）ＤＡＡＰ＃３と称される表１に記載のヌクレオチド配列；
（ｄ）ＤＡＡＰ＃４と称される表１に記載のヌクレオチド配列；
（ｅ）ＤＡＡＰ＃１１と称される表１に記載のヌクレオチド配列；
（ｆ）ＤＡＡＰ＃１２と称される表１に記載のヌクレオチド配列；
（ｇ）ＤＡＡＰ＃１３と称される表１に記載のヌクレオチド配列；
（ｈ）ＤＡＡＰ＃１４と称される表１に記載のヌクレオチド配列；
（ｉ）ＤＡＡＰ＃１５と称される表１に記載のヌクレオチド配列；
（ｊ）ＤＡＡＰ＃１６と称される表１に記載のヌクレオチド配列；
（ｋ）ＤＡＡＰ＃１７と称される表１に記載のヌクレオチド配列；又は
（ｌ）遺伝子コードの縮退の結果、（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）、（ｈ）、（ｉ）、（ｊ）又は（ｋ）のヌクレオチド配列とは異なるが、それから発現されるものと同一のアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列、
をコードするヌクレオチド配列を含む、単離核酸分子に関する。

本発明は、上記の核酸分子を全て含むベクターにも関する。このベクターは発現ベクターであり得る。

本発明は、好適な宿主細胞において、上記の発現ベクターを含む融合ポリペプチドの産生のための宿主ベクター系にも関する。このような好適な宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞を含み得る。

本発明は、これらに限定されないが、ＤＡＡＰ＃１〜ＤＡＡＰ＃４及びＤＡＡＰ＃１１〜ＤＡＡＰ＃１７に対するアミノ酸配列を含む、上記の単離核酸分子のいずれかによってコードされる融合ポリペプチドにも関する。

本発明は、これらに限定されないが、ＶＥＧＦＲ１構成要素又はＶＥＧＦＲ３構成要素を使用するこれらの融合構築物を含む、ＶＥＧＦ及びアンジオポエチン分子と同時に結合し、上記の融合ポリペプチドの多量体を含む非機能的複合体を形成することが可能な組成物にも関する。この多量体は二量体であり得る。

別の態様において、本発明は、融合ポリペプチドを産生する方法であって、融合ポリペプチドの産生を可能にし、このようにして産生した融合ポリペプチドを回収する条件下で、上記の宿主ベクター系の細胞を成長させることを含む、方法に関する。このような融合ポリペプチドは、アセチル化又はペグ化によって修飾され得る。少なくとも約１０倍モル過剰から約１００倍モル過剰の範囲のモル過剰のアセチル化試薬でアセチル化を達成し得る。ペグ化は、１０Ｋ又は２０ＫのＰＥＧによるものであり得る。

さらに別の態様において、本発明は、哺乳動物において血漿漏出を低減又は阻害する方法であって、有効量の本明細書中に記載の融合ポリペプチドを、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、方法に関する。好ましい実施の形態では、漏出は網膜で起こり得る。

さらに別の態様において、本発明は、哺乳動物において血管成長を遮断する方法であって、有効量の本明細書中に記載の融合ポリペプチドを、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、方法に関する。或る特定の態様では、血管成長遮断活性は、特に癌、加齢性黄斑変性症、糖尿病性網膜症、関節リウマチ、乾癬、急性及び慢性炎症、アテローム性動脈硬化症並びにリンパ増殖性疾患を治療するのに有用であり得る。

さらに別の態様において、本発明は、哺乳動物において腫瘍成長を軽減又は予防する方法であって、有効量の本明細書中に記載の融合ポリペプチドを、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、方法に関する。

さらに別の態様において、本発明は、哺乳動物において浮腫を軽減又は予防する方法であって、有効量の本明細書中に記載の融合ポリペプチドを、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、方法に関する。浮腫は、網膜浮腫及び脳浮腫であり得る。

さらに別の態様において、本発明は、哺乳動物において腹水形成を軽減又は予防する方法であって、有効量の本明細書中に記載の融合ポリペプチドを、それを必要とする哺乳動物に投与することを含む、方法に関する。腹水は、卵巣癌に関連し得る。本発明は、哺乳動物においてＶＥＧＦ受容体リガンド及びＴｉｅ２リガンドの活性を阻害する方法であって、有効量の本明細書中に記載の融合ポリペプチドを哺乳動物に投与することを含む、方法にも関する。

さらに別の態様において、本発明は、哺乳動物において炎症性血管新生を軽減又は予防する方法であって、有効量の本明細書中に記載の融合ポリペプチドをそれを必要とする哺乳動物に投与することを含む、方法に関する。炎症性血管新生によって引き起こされる障害の例は、関節リウマチである。炎症性血管新生によって引き起こされる障害の他の例は、脊椎関節症、乾癬、糖尿病性網膜症、アテローム性動脈硬化症を含むが、これらに限定されない。

本発明は、本明細書中の以下で与える詳細な説明、及び添付の図面からより完全に理解され、これらは、単に例示として与えられ、したがって本発明を限定するものではない。

７つの免疫グロブリン（Ｉｇ）様ドメインから成る細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内チロシンキナーゼドメインとの３つの主な領域に分けられるヒトＶＥＧＦＲ１の概略図である。図１は、２つのＩｇ様ドメイン、３つのＥＧＦ様ドメイン、１つのＩｇ様ドメイン、３つのＩＩＩ型フィブロネクチンから成る細胞外ドメインと、膜貫通ドメインと、細胞内チロシンキナーゼドメインとの３つの主な領域に分けられるヒトＴｉｅ２の概略図も示す。 Ａｎｇ２とＴｉｅ２との間、及びＶＥＧＦとＶＥＧＦＲ１との間の結合に対する構造的な相互作用を示す図である。Ｔｉｅ２のＩｇ様ドメイン２は、アンジオポエチン結合に必須であり、Ｉｇ様ドメイン１及び３つのＥＧＦ様ドメインは、アンジオポエチンの安定結合に必要であると考えられるが、ＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメイン２はＶＥＧＦ−Ａ結合に必須である。 ＤＡＡＰ（＃１、＃２、＃３及び＃４）構築物の概略図である。図３Ａは、Ｔｉｅ２及びＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメイン由来のサブドメインアセンブリを示し、図３Ｂは、Ｔｉｅ２及びＶＥＧＦＲ１由来の対応するアミノ酸を示す。ＥｃｏＲ１及びＸｈｏ１は制限酵素部位である。 ｐＣＭＶ−ｄｈｆｒベクター及びｐＣＭＶ−ＤＡＡＰ−ｄｈｆｒベクターに関する遺伝子構築物の概略図である。 Ｔｉｅ２及びＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメイン由来のサブドメインアセンブリに対するＤＡＡＰ（＃１、＃１１、＃１２、＃１３、＃１４、＃１５、＃１６及び＃１７）構築物の概略図、並びにＴｉｅ２及びＶＥＧＦＲ１由来の対応するアミノ酸を示す。 Ｔｉｅ２及びＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメイン由来のサブドメインアセンブリに対するＤＡＡＰ（＃１１、＃１２、＃１３、＃１４、＃１５、＃１６及び＃１７）構築物の概略図、並びにＴｉｅ２及びＶＥＧＦＲ１由来の対応するアミノ酸を示す。 ＤＡＡＰ（＃１、＃２、＃３、＃４、＃１１、＃１２、＃１３、＃１４、＃１５、＃１６及び＃１７）、ＶＥＧＦ−トラップ、Ｔｉｅ２−Ｆｃ及びＦｃのタンパク質に対するウェスタンブロット解析を示す図である。 ＤＡＡＰとＶＥＧＦ−ＡとのＥＬＩＳＡ結合アッセイの概略図である。 ＤＡＡＰとＡｎｇ２とのＥＬＩＳＡ結合アッセイの概略図である。 ＤＡＡＰとＶＥＧＦ−Ａ及びＡｎｇ２とのＥＬＩＳＡ結合アッセイの結果を示す図である。 ＤＡＡＰとＶＥＧＦ−Ａ及びＡｎｇ２との競合結合に対する結合アッセイを示す図である。 ＤＡＡＰとＶＥＧＦ−Ａ及びＡｎｇ２とのｉｎ ｖｉｔｒｏ結合後のウェスタンブロット解析を示す図である。 ＶＥＧＦ及びアンジオポエチンとＤＡＡＰとの同時結合の概略図である。 ＩｇＦｃ、ＤＡＡＰ＃１、ＶＥＧＦ−トラップ及びＴｉｅ２−Ｆｃのサイズ及び二量体状態を示す図である。タンパク質をＣＨＯ細胞で産生し、プロテイン−Ａセファロースアフィニティクロマトグラフィで精製して、約２μｇを還元及び非還元条件下で充填してＳＤＳ−ＰＡＧＥを行い、クマシーブルーで染色した。 ＤＡＡＰ＃１、ＶＥＧＦ−トラップ及びＴｉｅ２−Ｆｃと（Ａ）ＶＥＧＦ−Ａ及び（Ｂ）Ａｎｇ２との親和性定数のＥＬＩＳＡ解析を示す図である。 ＤＡＡＰ＃１を（Ａ）Ａｎｇ２又は（Ｂ）ＶＥＧＦ−Ａで予め占有させるとさらに高まるＤＡＡＰ＃１とＶＥＧＦ−Ａ又はＡｎｇ２との結合のＥＬＩＳＡ解析を示す図である。 ＤＡＡＰ＃１、ＶＥＧＦ−トラップ又はＴｉｅ２−Ｆｃと、幾つかの表示された型のＶＥＧＦ及びアンジオポエチンとの間の物理的相互作用を検出するｉｎ ｖｉｔｒｏプルダウンアッセイを示す図である。 様々なＤＡＡＰの等電点の理論値を示す図である。 細胞外基質結合アッセイの概略図である。 様々なＤＡＡＰとの細胞外基質結合に対するＥＬＩＳＡアッセイを示す図である。 より高濃度のＤＡＡＰ＃１、ＶＥＧＦ−トラップ及びＴｉｅ２−Ｆｃとの細胞外基質結合に対するＥＬＩＳＡアッセイを示す図である。 マウスを使用する薬物動態解析の概略図である。 Ｆｃ、ＤＡＡＰ＃１、ＶＥＧＦ−トラップ及びＴｉｅ−Ｆｃの薬物動態プロファイルを示す図である。 ＧＦＰ−ＬＬＣ移植腫瘍モデルの作製、並びにＰＢＳ、Ｆｃ、ＤＡＡＰ＃１、ＶＥＧＦ−トラップ及びＴｉｅ２−Ｆｃの処理計画の概略図である。 図２４に記載のＧＦＰ−ＬＬＣ腫瘍成長に対するＰＢＳ、Ｆｃ、ＤＡＡＰ＃１、ＶＥＧＦ−トラップ及びＴｉｅ２−Ｆｃの効果を示す図である。図２５Ａは、腫瘍移植後２９日目、及び処理後２４日目の腫瘍サイズの写真図を示す。図２５Ｂは、各群（ｎ＝４）の腫瘍容積（平均±ＳＥ）の変化を示す。 Ｆｃ、ＶＥＧＦ−トラップ又はＤＡＡＰ＃１で処理したマウスの腫瘍における血管の代表的な画像を示す図である。 ＲＯＰモデルの作製、並びにＰＢＳ、Ｆｃ、ＤＡＡＰ＃１、ＶＥＧＦ−トラップ及びＴｉｅ２−Ｆｃの治療計画の概略図である。 ＲＯＰマウスモデルの網膜血管系に対するＰＢＳ、Ｆｃ、ＤＡＡＰ＃１、ＶＥＧＦ−トラップ及びＴｉｅ２−Ｆｃの効果を示す図である。図２８Ａ、図２８Ｂ、図２８Ｃ及び図２８Ｄは、全網膜、視神経乳頭、中央部及び周縁部の網膜血管系を示す。 ＲＯＰマウスモデルの網膜血管系に対するＰＢＳ、Ｆｃ、ＤＡＡＰ＃１、ＶＥＧＦ−トラップ及びＴｉｅ２−Ｆｃの効果を示す図である。図２８Ｅ及び図２８Ｆは、ＲＯＰモデルにおける新生血管網（tufts）の面積及び周縁血管密度に対するＰＢＳ、Ｆｃ、ＤＡＡＰ＃１、ＶＥＧＦ−トラップ及びＴｉｅ２−Ｆｃの効果を示す。 関節リウマチモデル動物の作出を示す図である。図２９Ａは、ＩＩ型コラーゲンで誘導された関節リウマチ（ＣＩＡ）の実験マウスモデルの作製及び処理時間に対する概略図を示す。図２９Ｂは、表示された時間での膨潤、紅斑及び関節の強直の重症度に基づき決定及び定量した足（paws）における平均臨床関節炎スコアを示す。 関節リウマチの治療を示す図である。図３０Ａは、表示された作用物質で処理したＲＡマウスの膝及び足首の関節の代表的なＸ線写真所見を示す。図３０Ｂは、表示された作用物質で処理したＣＩＡマウスの膝、足首及び足根中足の関節における骨破壊のＸ線写真スコアを示す。値は平均±ＳＤである。 関節リウマチの治療を示す図である。図３１Ａは、１８日間、表示された作用物質で処理したＣＩＡマウスの膝及び足首の関節の代表的な病理組織学的所見を示す。図３１Ｂは、１８日間、表示された作用物質で処理したＣＩＡマウスの膝及び足首の関節における骨異常の病理組織学的スコアを示す。値は平均±ＳＤである。

表１は、ＤＡＡＰ＃１、ＤＡＡＰ＃２、ＤＡＡＰ＃３、ＤＡＡＰ＃４、ＤＡＡＰ＃１１、ＤＡＡＰ＃１２、ＤＡＡＰ＃１３、ＤＡＡＰ＃１４、ＤＡＡＰ＃１５、ＤＡＡＰ＃１６、ＤＡＡＰ＃１７の核酸及びアミノ酸配列を示す。特に、配列番号１は、ＤＡＡＰ＃１で表す核酸のセンス鎖を示す。配列番号２は、ＤＡＡＰ＃１で表すアミノ酸配列を示す。

配列番号３は、ＤＡＡＰ＃２で表す核酸のセンス鎖を示す。配列番号４は、ＤＡＡＰ＃２で表すアミノ酸配列を示す。

配列番号５は、ＤＡＡＰ＃３で表す核酸のセンス鎖を示す。配列番号６は、ＤＡＡＰ＃３で表すアミノ酸配列を示す。

配列番号７は、ＤＡＡＰ＃４で表す核酸のセンス鎖を示す。配列番号８は、ＤＡＡＰ＃４で表すアミノ酸配列を示す。

配列番号９は、ＤＡＡＰ＃１１で表す核酸のセンス鎖を示す。配列番号１０は、ＤＡＡＰ＃１１で表すアミノ酸配列を示す。

配列番号１１は、ＤＡＡＰ＃１２で表す核酸のセンス鎖を示す。配列番号１２は、ＤＡＡＰ＃１２で表すアミノ酸配列を示す。

配列番号１３は、ＤＡＡＰ＃１３で表す核酸のセンス鎖を示す。配列番号１４は、ＤＡＡＰ＃１３で表すアミノ酸配列を示す。

配列番号１５は、ＤＡＡＰ＃１４で表す核酸のセンス鎖を示す。配列番号１６は、ＤＡＡＰ＃１４で表すアミノ酸配列を示す。

配列番号１７は、ＤＡＡＰ＃１５で表す核酸のセンス鎖を示す。配列番号１８は、ＤＡＡＰ＃１５で表すアミノ酸配列を示す。

配列番号１９は、ＤＡＡＰ＃１６で表す核酸のセンス鎖を示す。配列番号２０は、ＤＡＡＰ＃１６で表すアミノ酸配列を示す。

配列番号２１は、ＤＡＡＰ＃１７で表す核酸のセンス鎖を示す。配列番号２２は、ＤＡＡＰ＃１７で表すアミノ酸配列を示す。

本願において、「ａ」及び「ａｎ」は単数及び複数の対象物の両方を表すのに使用する。

本明細書中で使用される場合、「約」又は「実質的に」には概して、正確な数に限定しない余地が与えられる。例えば、ポリペプチド配列の長さに関して使用される場合、「約」又は「実質的に」は、ポリペプチドが言及数のアミノ酸に限定されないことを示す。その結合活性等の機能的活性が存在する限り、幾つかのアミノ酸をＮ末端又はＣ末端に加えるか、又は差し引くことを含み得る。

本明細書中で使用される場合、１つ又は複数のさらなる治療剤「を併用した」投与は、任意の順番での同時（並行）及び連続投与を含む。

本明細書中で使用される場合、「アミノ酸（"amino acid" and "amino acids"）」は、全ての天然Ｌ−α−アミノ酸を表す。この定義は、ノルロイシン、オルニチン、及びホモシステインを含むことを意味する。

本明細書中で使用される場合、概して用語「アミノ酸配列変異型」は、参照（例えば天然配列）ポリペプチドに比べて、アミノ酸配列に幾つかの違いがある分子を表す。アミノ酸変化は、天然アミノ酸配列における置換、挿入、欠失、又はこのような変化の任意の所望の組合せであり得る。

置換変異型は、天然配列で少なくとも１つのアミノ酸残基が除去され、同じ位置のその場所に異なるアミノ酸が挿入されたものである。分子において１つだけのアミノ酸が置換されている場合、置換は単一であり得るか、又は２つ以上のアミノ酸が同じ分子において置換されている場合、置換は複数であり得る。

配列内のアミノ酸置換基は、アミノ酸が属する群の他の成員から選択され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられる。負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。また、同じ又は同様の生体活性を示すタンパク質若しくはそれらの断片又は誘導体、及び例えばグリコシル化、タンパク質分解切断、抗体分子又は他の細胞リガンドとの連結等による翻訳中又は翻訳後に特異的に修飾される誘導体が本発明の範囲内に含まれる。

挿入変異型は、天然アミノ酸配列における特定の位置で１つ又は複数のアミノ酸が、或るアミノ酸と直接隣接して挿入されたものである。アミノ酸と直接隣接するとは、アミノ酸のα−カルボキシ官能基又はα−アミノ官能基のいずれかと連結することを意味する。

欠失変異型は、天然アミノ酸配列で１つ又は複数のアミノ酸が除去されたものである。元来、欠失変異型は、分子の特定領域で１つ又は２つのアミノ酸が欠失している。

本明細書中で使用される場合、「アンタゴニスト」は、生物学的反応を誘起することなく、細胞受容体と結合するリガンドとして、別のリガンドの作用を打ち消す傾向があるリガンドを表す。

本発明のリガンドの好ましい生体活性には、血管透過性の阻害能が含まれる。血管透過性の阻害能は、糖尿病性網膜症、浮腫及び腹水等の医学的状態及び疾患の治療に有用である。本発明のリガンドの好ましい生体活性には、内皮細胞完全性の維持能（アポトーシスの防止を含む）が含まれる。内皮細胞完全性の維持能は、マンニトール処理、放射線及び敗血症等の医学的状態及び疾患の治療に有用である。

ＤＡＡＰ融合タンパク質を、放射性同位体、蛍光タグ、酵素タグ、又は化学発光タグ等の検出可能なラベルで標識して、リガンド−受容体結合相互作用を決定することも考慮する。また、キメラ分子を利用するアッセイシステムも考慮する。

本明細書中で使用される場合、「担体」は、用いる用量及び濃度でそれに曝される細胞又は哺乳動物に対して非毒性である、薬学的に許容可能な担体、賦形剤又は安定剤を含む。薬学的に許容可能な担体は、ｐＨ緩衝水溶液であることが多い。薬学的に許容可能な担体の例としては、リン酸塩、クエン酸塩及び他の有機酸等のバッファー；アスコルビン酸を含む抗酸化剤；低分子量（約１０残基未満の）ポリペプチド；血清アルブミン、ゼラチン又は免疫グロブリン等のタンパク質；ポリビニルピロリドン等の親水性ポリマー；グリシン、グルタミン、アスパラギン、アルギニン又はリシン等のアミノ酸；単糖類、二糖類及びグルコース、マンノース又はデキストリンを含む他の炭水化物；ＥＤＴＡ等のキレート剤；マンニトール又はソルビトール等の糖アルコール；ナトリウム等の塩形成対イオン；及び／又はＴＷＥＥＮ（登録商標）、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）及びＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）等の非イオン性界面活性剤が挙げられるが、これらに限定されない。

本明細書中で使用される場合、核酸配列又はアミノ酸配列に関して使用する場合、「から本質的に成る」は、核酸によってコードされるアミノ酸の意図する機能を実行するのに必須である配列を表す。

本明細書中で使用される場合、「有効量」は、有益な又は所望の臨床結果又は生化学的結果を得るのに十分な量である。有効量は、１回又は複数回で投与することができる。本発明のために、阻害化合物の有効量は、疾患状態の進行を緩和、改善、安定化、反転、減速又は遅延させるのに十分な量である。

本明細書中で使用される場合、「断片」又は「機能的誘導体」は、本発明の天然リガンド又は受容体の生物学的に活性のあるアミノ酸配列変異型及び断片、並びに有機誘導体化剤との反応によって得られた誘導体、翻訳後修飾体、非タンパク質ポリマーを有する誘導体、及び免疫アドヘシンを含む、共有結合修飾体を表す。

本明細書中で使用される場合、「宿主細胞」には、本発明のベクターのレシピエントになり得るか、又はレシピエントである個々の細胞又は細胞培養物が含まれる。宿主細胞は単一の宿主細胞の子孫を含み、天然、偶発又は意図的な突然変異及び／又は変化のために、子孫は元の親細胞と（形態的に又はＤＮＡ相補体全体において）必ずしも完全に同一でなくてもよい。

本明細書中で使用される場合、「リガンド」は、共有的に又は一時的にポリペプチド等の分子と特異的に結合する、分子若しくは作用物質、又は化合物のいずれかを表す。或る特定の内容に関して使用される場合、リガンドは抗体を含み得る。他の内容において、「リガンド」は、リガンドトラップ等において高い親和性で別の分子と結合しようとする分子を表し得る。

本明細書中で使用される場合、処理のための「哺乳動物」は、ヒト、家畜動物（domestic and farm animals）及び動物園動物、競技動物、又は飼育動物（zoo, sports, or pet animals）を含む哺乳動物として分類された任意の動物を表す。例えば、イヌ、ネコ、ウシ、ウマ、ヒツジ、ブタ等である。好ましくは、哺乳動物はヒトである。

本明細書中で使用される場合、「薬学的に許容可能な担体及び／又は希釈剤」には、任意の全ての溶媒、分散媒、コーティング剤、抗菌剤及び抗真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等が含まれる。薬学的に活性がある物質に対してこのような媒体及び作用物質を使用することは、当該技術分野で既知である。任意の従来の媒体又は作用物質が活性成分と不適合である場合を除いて、治療組成物におけるそれらの使用が考慮される。補助的な活性成分を組成物に組み込むこともできる。

調剤の投与及び均一化を容易にするために、調剤単位形態で非経口組成物を配合することは特に有益である。本明細書中で使用される場合、調剤単位形態は、治療する哺乳動物被験体用に単一調剤として適合した物理的に不連続な単位を表し、各単位は、所要の薬学的担体に関連して所望の治療効果を生むように計算された所定量の活性材料を含有する。本発明の調剤単位形態に対する詳述は、（ａ）活性材料の特有の特徴及び達成される特定の治療効果、並びに（ｂ）身体健康を損う疾患状態にある生被験体における疾患の治療のためにこのような活性材料を混ぜ合わせるという当該技術分野に固有の制限によって決定され、且つ直接的に依存する。

主要な活性成分は、調剤単位形態で好適な薬学的に許容可能な担体と共に、有効量で便利で且つ効果的に投与するために混ぜ合わせる。例えば単位調剤形態は、０．５μｇ〜約２０００ｍｇの範囲の量で主要な活性化合物を含有することができる。割合で表すと、活性化合物は概して、約０．５μｇ／ｍｌで担体中に存在する。補助的な活性成分を含有する組成物の場合、該成分の通常の投与用量及び投与形態を参照して、調剤を確定する。

本明細書中で使用される場合、「試料」又は「生体試料」は、その最も広範な意味で解釈され、実施するアッセイの種類に応じて、キメラＡｎｇ１結合因子を含有し得る個体、体液、細胞株、組織培養液、又は他の供給源から得られた任意の生体試料を含む。示されるように、生体サンプルとしては、精液、リンパ液、血清、血漿、尿、滑液、髄液等の体液が挙げられる。哺乳動物から組織生検及び体液を得る方法は、当該技術分野で既知である。

本明細書中で使用される場合、「被験体」は脊椎動物、好ましくは哺乳動物、より好ましくはヒトである。

本明細書中で使用される場合、「同時（"synchronous" or "synchronously"）」結合は、タンパク質が結合に利用可能である場合、ＤＡＡＰタンパク質と２つ以上の指定タンパク質との同時の結合を表す。

本明細書中で使用される場合、「治療」は有益な又は所望の臨床結果を得るためのアプローチである。本発明のために、有益な又は所望の臨床結果としては、検出可能又は検出不可能のいずれかである、症状の緩和、疾患の程度の退縮、疾患の安定（即ち、悪化ではない）状態、疾患進行の遅延又は減速、疾患状態の改善又は緩和、及び寛解（部分又は全体のいずれか）が挙げられるが、これらに限定されない。「治療」は、治療を受けない場合の期待生存と比べて、生存が延長することも意味し得る。「治療」は、治療的処置及び予防的（prophylactic or preventative）手段の両方を表す。治療が必要なものとしては、既に障害にあるもの、及び傷害を予防すべきものが挙げられる。疾患を「緩和すること」は、治療をしない状態に比べて、疾患状態の程度及び／又は不要の臨床兆候を軽減すること、及び／又は進行の時間経過を減速又は延長させることである。

本明細書中で使用される場合、「ベクター」、「ポリヌクレオチドベクター」、「構築物」及び「ポリヌクレオチド構築物」は本明細書中で区別なく使用する。本発明のポリヌクレオチドベクターは、これらに限定されないが、ＲＮＡ、ＤＮＡ、レトロウイルス外被に封入されるＲＮＡ、アデノウイルス外被に封入されるＤＮＡ、別のウイルス又はウイルス様形態（単純ヘルペス、及びポリアミド等のアデノ構造等）に詰められたＤＮＡを含む幾つかの形態のいずれかの中にあり得る。

炎症性血管新生
血管新生は、既存の血管からの新規の血管形成として定義され、健康及び疾患における重要なプロセスである。関節リウマチ、脊椎関節症、乾癬、糖尿病性網膜症、アテローム性動脈硬化症等の炎症疾患における血管新生の永続化によって、炎症性細胞の病的領域への侵入が容易に起こり得る。永続的な血管新生に関連するこれらの障害は、「炎症性血管新生」疾患であると考えられる。成長因子、サイトカイン、基質メタロプロテイナーゼ、基質高分子、細胞接着受容体、ケモカイン及びケモカイン受容体を含む幾つかの血管新生媒介因子は、炎症性血管新生に関与している。血管新生の上方調節又は下方調節に関与する炎症組織における調節ネットワークが存在する（Lainer-Carr and Brahn Nature Clinical Practice Rheumatology 3,434-442, 2007）。

炎症性血管新生の発症及び進行は、以下の流れに従って起こり得る。（１）様々な刺激（自己免疫反応、急性及び慢性炎症、急性及び慢性低酸素症、腫瘍細胞増殖、壊死、及びアポトーシス）によって、炎症促進性媒介因子を放出させる内在マクロファージ及び他の食細胞の活性化が引き起こされる。（２）これらの食細胞由来因子が内皮細胞を活性化し、接着分子、ケモカイン及びサイトカインを産生する。（３）活性化内皮由来の接着分子及び可溶性因子は、循環食細胞を補充及び刺激し、このようにして反応性細胞の質量を増大させる。（４）次に、組織再構築活性化食細胞は、内皮細胞の伸長及び移動を促進する可溶性因子を放出し、新規の血管を形成する。食細胞由来の血管新生刺激が有効になるには、「臨界質量」に達しなければならず、そのためさらなる食細胞補充後にのみ工程（４）が実施可能になる。

成長因子及びサイトカイン
同時に結合するのが望ましい任意の成長因子及びサイトカインを作製してもよく、これには、疾患進行に対して同様の効果を有するものが含まれる。本発明に包含される成長因子及びサイトカインとしては、ＶＥＧＦ−Ａ、ＶＥＧＦ−Ｂ、ＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｄ、ＰｌＧＦ、ＰＤＧＦ、アンジオポエチン１、アンジオポエチン２、アンジオポエチン３、アンジオポエチン４、ＨＧＦ、ＥＧＦ、ＦＧＦ、ＴＮＦ−α、インターロイキン−１β、インターロイキン−６、インターロイキン−１２、ＴＧＦ−β、ＲＡＮＫＬ等が挙げられるが、これらに限定されない。

成長因子及びサイトカインとの結合に対する融合ポリペプチド候補物
本発明を実施する際に、融合ポリペプチドを選択的に作製するための以下の基準を含む、融合ポリペプチドを作製する一方法を使用してもよい。疾患進行に対して同様の効果を有する２つ以上の成長因子に対する様々な受容体の結合領域は連結して、同時に成長因子の二重、三重又は多重の作用を遮断し得る。新規の融合ポリペプチド候補物は、その同時結合の親和性に関してスクリーニングし、成長因子とサイトカインとの任意の組合せの結合のために成長因子及びサイトカインに対する中和活性に関して調べることができる。例えば、ＶＥＧＦ−Ａ及びＴＮＦ−α；ＶＥＧＦ−Ａ及びインターロイキン−１β；ＶＥＧＦ−Ａ及びＶＥＧＦ−Ｃ；ＶＥＧＦ−Ｃ及びアンジオポエチン；ＶＥＧＦ−Ｃ及びＴＮＦ−α；ＴＮＦ−α及びアンジオポエチン；並びにＶＥＧＦ−Ｃ及びＨＧＦである。本発明に従って、任意の成長因子の任意の組合せを作製及び使用することができる。３つ以上の成長因子との三重又は多重結合に組合せを適用してもよく、本明細書中に挙げられる二重遮断に限定されない。

核酸構築物
本明細書中に記載のように、本発明の核酸分子を含む発現ベクターも提供され、この核酸分子は、発現制御配列に操作可能に連結される。融合ポリペプチドの発現に好適な宿主細胞に導入されている本発明の発現ベクターを含む融合ポリペプチドの産生のために宿主ベクター系も提供される。好適な宿主細胞は、大腸菌等の細菌細胞、ピキア・パストリス（Pichia pastoris）等の酵母細胞、スポドプテラ・フルギペルダ（Spodopterafrugiperda）等の昆虫細胞、又はＣＯＳ若しくはＣＨＯ細胞等の哺乳動物細胞であり得る。

本発明は、融合ポリペプチドの産生を可能にし、このようにして産生した融合ポリペプチドを回収する条件下で、本明細書中に記載の宿主ベクター系の細胞を成長させることによって、本発明の融合ポリペプチドを産生する方法も提供する。本発明を実施するのに有用な融合ポリペプチドは、原核又は真核の発現系での発現によって調製し得る。

任意数の方法を用いて、組換え遺伝子を発現し、ポリペプチドを精製してもよい。この遺伝子を、例えばこれに限定されないが、ｐＺＥｒＯ等の細菌発現ベクターにサブクローニングしてもよい。

安定で生物学的に活性があるタンパク質のその後の形成を可能にする任意の技法によって、融合ポリペプチドを精製してもよい。例えば、これらに限定されないが、可溶性タンパク質又は封入体としてのいずれかで細胞からこれらの因子を回収してもよく、細胞から８Ｍのグアニジン塩酸塩及び透析によって定量的に抽出してもよい。これらの因子をさらに精製するために、これらに限定されないが、従来のイオン交換クロマトグラフィ、アフィニティクロマトグラフィ、様々な糖クロマトグラフィ、疎水性相互作用クロマトグラフィ、逆相クロマトグラフィ又はゲル濾過を含む任意数の精製法を使用してもよい。

本明細書中で使用される場合、融合ポリペプチドは、配列内の残基がアミノ酸残基に置換されており静的変化又は保存的変化を生ずる機能的に同等の分子を含む。例えば、配列内の１つ又は複数のアミノ酸残基を、機能的同等物として作用する同様の極性を有する別のアミノ酸に置換することができ、これにより静的変化又は保存的変化がもたらされる。配列内のアミノ酸の置換は、アミノ酸が属する群の他の成員から選択され得る。例えば、非極性（疎水性）アミノ酸としては、アラニン、ロイシン、イソロイシン、バリン、プロリン、フェニルアラニン、トリプトファン及びメチオニンが挙げられる。極性中性アミノ酸としては、グリシン、セリン、スレオニン、システイン、チロシン、アスパラギン及びグルタミンが挙げられる。正に荷電した（塩基性）アミノ酸としては、アルギニン、リシン及びヒスチジンが挙げられる。負に荷電した（酸性）アミノ酸としては、アスパラギン酸及びグルタミン酸が挙げられる。また、例えばグリコシル化、タンパク質分解切断、抗体分子又は他の細胞リガンドとの連結等による翻訳中又は翻訳後に特異的に修飾される、同じ又は同様の生体活性を示すタンパク質若しくはそれらの断片又は誘導体が本発明の範囲内に含まれる。

本発明の融合ポリペプチドを発現する細胞を遺伝子操作して、例えばトランスフェクション法、形質導入法、電気穿孔法又は顕微注射法によってそれらを産生する。

また、本発明は、タグを付した形態での本明細書中に記載の融合ポリペプチドの使用を考慮する。

ＤＮＡ断片をベクターに挿入する、当業者に既知の方法のいずれかを用いて、適切な転写／翻訳制御シグナル及びタンパク質コード配列を使用して、本発明の融合ポリペプチドをコードする発現ベクターを構築してもよい。これらの方法には、ｉｎ ｖｉｔｒｏでのＤＮＡの組換え及び合成法並びにｉｎ ｖｉｖｏでの組換え（遺伝子組換え）が含まれ得る。組換えＤＮＡ分子で形質転換した宿主で融合ポリペプチドを発現するように、本発明の融合ポリペプチドをコードする核酸配列の発現が、二次核酸配列によって調節され得る。例えば、本明細書中に記載の融合ポリペプチドの発現が、当該技術分野で既知の任意のプロモータ／エンハンサ因子によって制御され得る。融合ポリペプチドの発現を制御するのに使用し得るプロモータとしては、Squinto et al.,（1991, Cell 65:1-20）に記載の長末端反復配列；ＳＶ４０初期プロモータ領域（Bernoist and Chambon, 1981, Nature 290:304-310）、ＣＭＶプロモータ、Ｍ−ＭｕＬＶ ５’末端反復配列、ラウス肉腫（Rous sarcoma）ウイルスの３’長末端反復配列中に含有したプロモータ（Yamamoto, et al., 1980, Cell 22:787-797）、ヘルペスチミジンキナーゼプロモータ（Wagner et al., 1981, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 78:144-1445）、メタロチオネイン遺伝子の調節配列（Brinster et al., 1982, Nature 296:39-42）；β−ラクタマーゼプロモータ等の原核生物発現ベクター（Villa-Kamaroff, et al., 1978, Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.75:3727-3731）、又はｔａｃプロモータ（DeBoer, et al., 1983, Proc.Natl. Acad. Sci. U.S.A. 80:21-25）、またScientificAmerican, 1980, 242:74-94における"Useful proteins fromrecombinant bacteria"を参照する；Ｇａｌ４プロモータ等の酵母又は他の真菌由来のプロモータ因子、ＡＤＨ（アルコールデヒドロゲナーゼ）プロモータ、ＰＧＫ（ホスホグリセロールキナーゼ）プロモータ、アルカリホスファターゼプロモータ、及び以下の動物の転写制御領域（これらは組織特異性を示し、トランスジェニック動物に用いられている）：膵腺房細胞で活性があるエラスターゼＩ遺伝子制御領域（Swift et al., 1984, Cell 38:639-646、Ornitzet al., 1986, Cold Spring Harbor Symp. Quant. Biol. 50:399-409、MacDonald, 1987, Hepatology 7:425-515）；膵臓β細胞で活性があるインスリン遺伝子制御領域（Hanahan, 1985, Nature 315:115-122）、リンパ細胞で活性がある免疫グロブリン遺伝子制御領域（Grosschedl et al., 1984, Cell 38:647-658、Adameset al., 1985, Nature 318:533-538、Alexander et al.,1987, Mol. Cell. Biol. 7:1436-1444）、精巣、乳房、リンパ及びマスト細胞で活性があるマウス乳癌ウイルス制御領域（Leder et al., 1986, Cell 45:485-495）、肝臓で活性があるアルブミン遺伝子制御領域（Pinkert et al., 1987, Genes and Devel. 1:268-276）、肝臓で活性があるα−フェトプロテイン遺伝子制御領域（Krumlauf et al., 1985, Mol. Cell. Biol. 5:1639-1648、Hammer et al., 1987, Science 235:53-58）；肝臓で活性があるα１−抗トリプシン遺伝子制御領域（Kelsey et al., 1987, Genes and Devel. 1:161-171）、骨髄細胞で活性があるβ−グロビン遺伝子制御領域（Mogram et al., 1985, Nature 315:338-340、Kolliaset al., 1986, Cell 46:89-94）；脳における乏突起膠細胞で活性があるミエリン塩基性タンパク質遺伝子制御領域（Readhead et al., 1987, Cell 48:703-712）；骨格筋で活性があるミオシン軽鎖−２遺伝子制御領域（Shani, 1985, Nature 314:283-286）、及び視床下部で活性がある性腺刺激放出ホルモン遺伝子制御領域（Mason et al., 1986, Science 234:1372-1378）が挙げられるが、これらに限定されない。

したがって、本発明によれば、本明細書中に記載の融合ポリペプチド、特に修飾ＤＡＡＰをコードする核酸を含む、細菌又は真核の宿主で複製することが可能な発現ベクターを使用して、宿主をトランスフェクトし、それによってこのような核酸を直接発現して、生物学的活性形態で回収することができる融合ポリペプチドを産生する。本明細書中で使用される場合、生物学的活性形態は、関連の受容体と結合し、分化機能をもたらし、及び／又は受容体を発現する細胞の表現型に影響を与えることが可能な形態を含む。このような生物学的活性形態は、例えばＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＲＦ３及びＴｉｅ２の受容体のリン酸化、又は細胞ＤＮＡの合成阻害を遮断する。

これらに限定されないが、少なくとも３つの一般的なアプローチ：（ａ）ＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーション、（ｂ）「マーカー」遺伝子機能の有無、及び（ｃ）挿入配列の発現によって、挿入核酸を含有する発現ベクターを同定することができる。第１のアプローチでは、挿入核酸配列と相同的な配列を含むプローブを使用したＤＮＡ−ＤＮＡハイブリダイゼーションによって、発現ベクターに挿入される外来核酸の存在を検出することができる。第２のアプローチでは、組換えベクター／宿主系は、ベクターにおける外来核酸配列の挿入によって引き起こされる或る特定の「マーカー」遺伝子機能（例えば、チミジンキナーゼ活性、抗生物質に対する耐性、形質転換表現型、バキュロウイルスにおける封入体形成等）の有無に基づき同定及び選択することができる。例えば、ｅｆｌ核酸配列が、ベクターのマーカー遺伝子配列内に挿入される場合、マーカー遺伝子機能の非存在によって、挿入を含有する組換え体を同定することができる。第３のアプローチでは、組換え構築物によって発現される外来核酸産物を分析することによって、組換え発現ベクターを同定することができる。このようなアッセイは、例えば、リガンドと、例えば検出可能な抗体若しくはその一部でタグを付し得る受容体若しくはその一部との結合、又は対象のタンパク質若しくはその一部に対して産生された抗体との結合によって、例えば対象の核酸産物の物理的若しくは機能的特性に基づき得る。

融合ポリペプチド、特に本発明の修飾ＤＡＡＰは、一時的に、連続して、又は永久に宿主細胞で発現し得る。

本発明は、本明細書中でＶＥＧＦＲ１、ＶＥＧＦＲ２、ＶＥＧＦＲ３、又はＴｉｅ２の受容体を発現する、細胞、組織又は器官を伴う障害に罹患した患者の治療のために、治療剤としての融合ポリペプチドの開発をさらに提供する。ヒト若しくは動物の身体の治療法で、又は診断法で、このような分子を使用してもよい。

当業者に既知の方法を用いて、これらの又は他の疾患又は障害を治療するのに有用な有効用量を決定してもよい（例えば、Fingl, et al., The Pharmacological Basis of Therapeutics, Goodmanand Gilman, eds. Macmillan Publishing Co, New York, pp. 1-46（1975）を参照されたい）。本発明に記載の使用のための薬学的組成物は、担体又は標的化分子（例えば抗体、ホルモン、成長因子等）と連結するか、及び／又はリポソーム、マイクロカプセルに組み込まれ、ｉｎ ｖｉｖｏでの投与の前に製剤を制御放出する、薬学的に許容可能な液体、固体又は半固体の担体中に上記の融合ポリペプチドを含む。例えば、薬学的組成物は、滅菌水、生理食塩水、リン酸バッファー又はデキストロース溶液等の水溶液中で融合ポリペプチドを含み得る。代替的に、活性剤は、このような治療が必要な患者に注入し得る固体（例えばワックス）又は半固体（例えばゲル状）剤形中に含まれ得る。投与経路は、これらに限定されないが、静脈内、髄腔内、皮下、子宮内、病変組織への注射、動脈内、鼻内、経口、又は移植装置を介するものを含む、当該技術分野で既知の投与様式のいずれかであり得る。

投与によって、身体を通して、又は局所部位において本発明の活性剤が分配され得る。例えば、神経系の遠位領域を含む幾つかの状態において、作用物質の静脈内投与又は髄腔内投与が望まれ得る。状況によっては、活性剤を含有するインプラントは、障害部位中、又は障害部位の近くに位置し得る。好適なインプラントとしては、ゲルフォーム、ワックス、スプレー、又は微粒子状のインプラントが挙げられるが、これらに限定されない。

本発明は、薬学的に許容可能なビヒクル中に本明細書に記載の融合ポリペプチドを含む薬学的組成物も提供する。全身又は局所的に組成物を投与してもよい。これらに限定されないが、静脈内、髄腔内、動脈内、鼻内、経口、皮下、腹腔内、又は局所の注射若しくは外科的移植を含む、当該技術分野で既知の任意の適切な投与様式を使用してもよい。持続放出製剤も提供される。

遺伝子療法
特定の実施形態において、遺伝子療法によって、血管漏出を防ぐのに、及び治療的脈管形成のために、キメラＡｎｇ１ポリペプチドをコードする核酸を投与する。遺伝子療法は、発現した、又は発現可能な核酸を被験体に投与することで実施される療法を表す。本発明のこの実施形態では、核酸は、治療的効果を媒介する核酸によってコードされるタンパク質を産生する。

当該技術分野で利用可能な遺伝子療法の方法のいずれかを本発明に従って使用することができる。例示的な方法は以下に記載する。

遺伝子療法の方法の一般的な総説に関しては、Goldspiel et al., Clinical Pharmacy 12:488-505（1993）、Wu and Wu, Biotherapy 3:87-95（1991）、Tolstoshev, Ann. Rev. Pharmacol.Toxicol. 32:573-596（1993）、Mulligan,Science 260:926-932（1993）、及びMorganand Anderson, Ann. Rev. Biochem. 62:191-217（1993）; May, TIBTECH 11（5）:155-215（1993）を参照されたい。使用することができる組換えＤＮＡ技法の技術分野で一般的に既知の方法は、Ausubel et al.（eds.）,Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons, NY（1993）、及びKriegler, Gene Transfer andExpression, A Laboratory Manual, Stockton Press, NY（1990）に記載されている。

好ましい態様において、核酸配列は、キメラのＡｎｇ１又はＴｉｅ２ポリペプチドをコードし得る。この核酸配列は、好適な宿主でポリペプチドを発現する発現ベクターの一部である。特に、このような核酸配列は、ポリペプチドコード化領域と操作可能に連結するプロモータを有し、該プロモータが誘導性又は構成性及び任意で、組織特異的である。別の特定の実施形態では、ポリペプチドをコードする配列及び任意の他の所望の配列がゲノム中の所望の部位で相同性組換えを促進する領域に隣接する核酸分子を使用し、これによって抗体をコードする核酸の染色体内発現が与えられる（Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935（1989）、Zijlstra et al., Nature 342:435-438（1989））。

核酸の患者への送達は、患者が核酸又は核酸担持ベクターに直接曝露される場合、直接的、又は初めにｉｎ ｖｉｔｒｏで細胞を核酸で形質転換した後、患者に移植する場合、間接的であり得る。これらの２つのアプローチはそれぞれ、ｉｎ ｖｉｖｏ又はｅｘ ｖｉｖｏ遺伝子療法として知られている。

特定の実施形態において、該コードされた遺伝子産物を産生させるために発現を行う場合、核酸配列をｉｎ ｖｉｖｏで直接投与する。当該技術分野で既知の多くの方法のいずれか、例えば核酸配列を適切な核酸発現ベクターの一部として構築し、例えば欠損若しくは弱毒化レトロウイルスベクター若しくは他のウイルスベクターによって、又は裸の（naked）ＤＮＡの直接注射、又は脂質若しくは細胞表面受容体若しくはトランスフェクト剤によるコーティング、リポソーム、微粒子、若しくはマイクロカプセル、又は核に侵入することが既知であるペプチドに連結して核酸配列を投与すること、リガンド被験体に連結して核酸配列を投与し、受容体媒介エンドサイトーシス（例えばWu and Wu, J. Biol. Chem. 262:4429-4432（1987）を参照されたい）（これは、受容体を特異的に発現する細胞型を標的化するのに使用することができる）等によって、核酸配列が細胞内性になるようにベクターを投与することによってこれを達成することができる。別の実施形態では、核酸−リガンド複合体を形成することができ、このリガンドは、エンドソームを破壊させる融合ウイルスペプチドを含み、核酸がリソソーム分解するのを避ける。さらに別の実施形態では、特異的な受容体を標的化することによって、細胞特異的な取り込み及び発現に関して、ｉｎ ｖｉｖｏで核酸を標的化することができる。代替的に、核酸を細胞内に導入し、相同組換えによって、発現用の宿主細胞ＤＮＡ内に組み込むことができる（Koller and Smithies, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:8932-8935（1989）、Zijlstra et al., Nature 342:435-438（1989））。

特定の実施形態において、ポリペプチドをコードする核酸配列を含有するウイルスベクターを使用する。遺伝子療法で使用するポリペプチドをコードする核酸配列を１つ又は複数のベクターにクローン化し、遺伝子の患者への送達を容易にする。レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター及びアデノ関連ウイルスが、使用し得るウイルスベクターの例である。レトロウイルスベクターは、ウイルスゲノムの正しいパッケージング及び宿主細胞ＤＮＡへの統合に必要な構成要素を含有する。

アデノウイルスは、中度の疾患を引き起こす場合、自然状態で呼吸上皮に感染させるため、呼吸上皮に遺伝子を送達するのに特に魅力的なビヒクルである。アデノウイルスベースの送達系に関する他の標的は、肝臓、中枢神経系、内皮細胞及び筋肉である。アデノウイルスには、非分裂細胞を感染させることが可能であるという利点がある。さらに、アデノ関連ウイルス（ＡＡＶ）は、遺伝子療法での使用も提案されている。

遺伝子療法に対する別のアプローチは、電子穿孔、リポフェクション、リン酸カルシウム媒介トランスフェクション、又はウイルス感染等の方法による組織培養における遺伝子の細胞への導入を伴う。通常導入法は、選択可能なマーカーの細胞への移動を含む。それから、導入遺伝子を取り出し、また発現する細胞を単離する選択下に、これらの細胞を置く。その後、これらの細胞を患者に送達する。

この実施形態において、得られた組換え細胞をｉｎ ｖｉｖｏで投与する前に、核酸を細胞に導入する。これらに限定されないが、トランスフェクション、電気穿孔、顕微注射、核酸配列を含有するウイルス又はバクテリオファージベクターによる感染、細胞融合、染色体媒介遺伝子導入、ミクロセル媒介遺伝子導入、スフェロプラスト融合等を含む当該技術分野で既知の方法のいずれかによって、このような導入を実施することができる。外来遺伝子を細胞に導入するのに当該技術分野で多くの技法が知られており、レシピエント細胞の必要な発生的且つ生理的な機能が破壊されなければ、本発明に従って使用することができる。核酸が、細胞によって発現可能、好ましくはその子孫細胞によって遺伝可能及び発現可能であるように、この技法は、核酸の細胞への安定な導入を与える必要がある。

遺伝子療法のために核酸を導入することができる細胞は、任意の所望の利用可能な細胞型を包含し、上皮細胞、内皮細胞、角化細胞、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞；Ｔ−リンパ球、Ｂ−リンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球等の血液細胞；様々な幹細胞又は前駆細胞、特に例えば骨髄、臍帯血、末梢血、胎児肝臓から得られる造血幹細胞又は前駆細胞等が挙げられるが、これらに限定されない。

好ましい実施形態において、遺伝子療法に使用する細胞は、患者に対して自家性である。

組換え細胞を遺伝子療法に使用する実施形態において、ポリペプチドをコードする核酸配列は、細胞又はその子孫細胞によって発現可能になるように、細胞に導入した後、治療効果のためにｉｎ ｖｉｖｏで組換え細胞を投与する。特定の実施形態では、幹細胞又は前駆細胞を使用する。本発明のこの実施形態に従って、ｉｎ ｖｉｔｒｏで単離及び維持することができる任意の幹細胞及び／又は前駆細胞を潜在的に使用することができる。

特定の実施形態において、転写の適切な誘導因子の有無を制御することによって核酸の発現が制御可能になるように、遺伝子療法のために導入する核酸は、コード領域と操作可能に連結する誘導性プロモータを含む。

治療組成物
一実施形態において、本発明は、血管漏出又は血管新生の喪失を特徴とする様々な疾患の治療に関する。このようにして、本発明の治療化合物を、Ｔｉｅ２を活性化する化合物を準備することによって疾患を患うか、又は疾患を患いやすいヒト患者に投与してもよい。

治療化合物製剤は一般的に、当該技術分野で既知であり、便宜的にRemington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., Mack Publishing Co.,Easton, Pa., USAを参照することができる。例えば、１日当たり、体重１ｋｇ当たり約０．０５μｇ〜約２０ｍｇを投与し得る。最適治療反応を得るために、投与計画を調整し得る。例えば、幾つかに分かれた用量を毎日投与してもよく、又は治療状況の要求によって示されるように用量を比例的に低減してもよい。（例えば腹腔内経路によって、又は例えばｉｎ ｖｉｔｒｏで感作し、レシピエントに養子導入した細胞（例えば単球又は樹状細胞）を使用することによって徐放分子を使用して）経口、静脈（水溶性の場合）、筋肉内、皮下、鼻内、皮内又は坐剤経路若しくは移植のような便利な様式で活性化合物を投与してもよい。投与経路に応じて、該成分を不活性化し得る、酵素の作用、酸及び他の自然状態からペプチドを保護するために、材料でペプチドをコーディングする必要があり得る。

例えば、ペプチドの低親油性によって、ペプチド結合を切断することが可能な酵素、及び胃での酸加水分解によって、胃腸管でペプチドが破壊される。非経口投与以外でペプチドを投与するには、その不活性化を防ぐために、材料でペプチドをコーティングするか、又は材料と共にペプチドを投与する。例えば、ペプチドは、アジュバント中で投与するか、酵素阻害剤と同時に投与するか、又はリポソーム中で同時に投与してもよい。本明細書中で考慮するアジュバントとしては、レゾルシノール、ポリオキシエチレンオレイルエーテル及びｎ−ヘキサデシルポリエチレンエーテル等の非イオン性界面活性剤が挙げられる。酵素阻害剤としては、膵臓トリプシン阻害剤、ジイソプロピルフルオロホスフェート（ＤＥＰ）及びトラジロールが挙げられる。リポソームとしては、水中油中水型ＣＧＦエマルジョン及び従来のリポソームが挙げられる。

活性化合物は、非経口又は腹腔内で投与してもよい。分散剤は、グリセロール、液体ポリエチレングリコール、並びにその及び油中の混合物で調製することもできる。通常の保存及び使用条件下で、これらの製剤は、微生物の増殖を妨げる保存剤を含有する。

注射に使用するのに適した医薬品形態としては、滅菌水溶液（水溶性の場合）又は分散剤、及び滅菌注射溶液又は分散剤の即時調製のための滅菌粉末が挙げられる。全ての場合で、剤形は滅菌性でなければならず、シリンジ装填が容易である範囲で流動性でなければならない。剤形は、製造及び保存条件下で安定でなければならず、細菌及び真菌等の微生物の汚染作用に対して保護されなければならない。担体は、例えば水、エタノール、ポリオール（例えばグリセロール、プロピレングリコール及び液体ポリエチレングリコール等）、その好適な混合物、及び植物油を含有する溶媒又は分散媒体であり得る。例えば、レシチン等のコーティングの使用、分散液の場合に要求される粒径の維持、及び界面活性剤の使用によって、適切な流動性を維持することができる。様々な抗菌剤抗真菌剤、例えばクロロブタノール、フェノール、ソルビン酸、チオメルサール等によって微生物の作用の防止をもたらし得る。多くの場合で、等張剤、例えば糖類又は塩化ナトリウムを含むのが好ましい。吸収を遅延させる作用物質、例えばモノステアリン酸アルミニウム及びゼラチンの組成物における使用によって、注射組成物の吸収延長がもたらされ得る。

上記で列挙した様々な他の成分と共に適切な溶媒中で所要量の活性化合物を組み込んだ後、滅菌濾過することによって、滅菌注射組成物を調製する。一般的に様々な滅菌活性成分を、塩基性分散媒体、及び上記で言及したもの由来の要求される他の成分を含有する滅菌ビヒクルに組み込むことによって分散液を調製する。滅菌注射溶液の調製用の滅菌粉末の場合、好ましい調製方法は、活性成分の粉末に加えて、これまでに滅菌濾過したそれらの溶液由来の任意の付加的な所望の成分が得られる真空乾燥法及び凍結乾燥法である。

上記のようにペプチドを好適に保存する場合、例えば不活性希釈剤又は吸収可能な食用担体と共に活性化合物を経口投与してもよく、又は硬殻ゼラチンカプセル又は軟殻ゼラチンカプセルに封入してもよく、又は錠剤に圧縮してもよく、又は食餌の食べ物に直接組み込んでもよい。経口治療投与のために、活性化合物を賦形剤に組み込み、摂取可能な錠剤、バッカル錠、トローチ、カプセル、エリキシル錠、懸濁液、シロップ、ウエハー等の形態で使用してもよい。このような組成物及び製剤は、少なくとも活性化合物の１重量％含有されている必要がある。当然のことながら、組成物及び製剤の割合は、様々である可能性があり、従来単位重量の約５％〜約８０％の範囲であり得る。このような治療に有用な組成物における活性化合物の量は、好適な調剤が得られるようなものである。口腔調剤単位形が、０．１μｇ〜２０００ｍｇの活性化合物を含有するように、本発明の好ましい組成物又は調剤を調製する。

錠剤、ピル、カプセル等は以下のものも含有し得る：トラガカントガム、アカシア、コーンスターチ又はゼラチン等の結合剤；リン酸二カルシウム等の賦形剤；コーンスターチ、ポテトスターチ（potato starch：片栗粉）、アルギン酸等の崩壊剤；ステアリン酸マグネシウム等の滑剤；並びに添加し得るスクロース、ラクトース若しくはサッカリン等の甘味剤、又はペパーミント、冬緑油若しくはサクランボ香料等の香料剤。調剤単位形がカプセルである場合、上記の種類の材料に加えて、液体担体を含有し得る。様々な他の材料は、コーティング剤として、そうでなければ調剤単位の物理的形態を変更するために、存在してもよい。例えば、錠剤、ピル、又はカプセルをセラックニス、糖又はその両方でコーティングしてもよい。シロップ又はエリキシルは、活性化合物と、甘味剤としてスクロースと、保存剤としてメチル及びプロピルパラベンと、染料及びサクランボ香料又はオレンジ香料等の香料とを含有し得る。当然のことながら、任意の調剤単位形を調製する際に使用する任意の材料は、薬学的に純粋であり、且つ利用する量で実質的に非毒性である必要がある。さらに、活性化合物を持続放出製剤及び剤形に組み込んでもよい。

送達系
様々な送達系、例えばリポソーム、微粒子、マイクロカプセル、化合物を発現することが可能な組換え細胞中での封入、受容体媒介エンドサイトーシス、レトロウイルス又は他のベクターの一部としての核酸の構築等が知られており、本発明の化合物を投与するのに使用することができる。導入方法としては、皮内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻内、硬膜外及び経口の経路が挙げられるが、これらに限定されない。任意の都合の良い経路、例えば注入又はボーラス注射、上皮又は皮膚粘膜の内膜（例えば口腔粘膜、直腸及び腸の粘膜等）を介した吸収によって、化合物又は組成物を投与してもよく、他の生物学的に活性がある作用物質と共に投与してもよい。全身に又は局所に投与することができる。さらに、脳室内注射及び髄腔内注射を含む任意の好適な経路によって、本発明の薬学的な化合物又は組成物を中枢神経系に導入するのが望ましく；例えばオマヤ槽等のリザーバと接着する脳室内カテーテルによって、脳室内注射が容易になり得る。例えば、吸入器又はネブライザ、及びエアロゾル化剤との剤形の使用によって肺投与を利用することもできる。

特定の実施形態において、本発明の薬学的化合物又は組成物を治療が必要な領域に局所で投与することが望まれ得る。例えば、これらに限定されないが、術中の局所注入、例えば術後の創傷包帯と併用した局所適用、注射、カテーテル、坐薬、又はインプラントによってこれを達成してもよく、該インプラントは、多孔性、非多孔性、又はゲル状の材料であり、シアラスティック（sialastic）膜又は繊維等の膜を含む。好ましくは、本発明の抗体又はペプチドを含むタンパク質を投与する場合、タンパク質を吸収しない材料を使用することに注意しなければいけない。別の実施形態では、小胞、特にリポソーム中で化合物又は組成物を送達することができる。さらに別の実施形態では、制御放出系で化合物又は組成物を送達することができる。一実施形態では、ポンプを使用してもよい。別の実施形態では、ポリマー材料を使用することができる。さらに別の実施形態では、制御放出系を治療標的付近に配置することができ、このためにほんのわずかの全身用量しか必要にならない。

ラベル
好適な酵素ラベルとしては、例えばオキシダーゼ群由来のものが挙げられ、これは基質と反応することによる過酸化水素の生成を触媒する。良好な安定性を有すると共にその基質（グルコース）が容易に利用可能であるために、グルコースオキシダーゼが特に好ましい。酵素標識抗体／基質反応で形成された過酸化水素の濃度を測定することによって、オキシダーゼラベルの活性を検査してもよい。酵素以外の他の好適なラベルとしては、ヨウ素（^１２５1、^１２１1）、炭素（^１４Ｃ）、硫黄（^３５Ｓ）、トリチウム（^３Ｈ）、インジウム（^１１２Ｉｎ）、及びテクネチウム（^９９ｍＴｃ）等の放射性同位体、フルオレセイン及びローダミン等の蛍光ラベル、並びにビオチンが挙げられる。

本発明のキメラＡｎｇ１、Ｔｉｅ２又はキメラＡｎｇ１／Ｔｉｅ２複合体に特異的な抗体にさらに適したラベルを以下で与える。好適な酵素ラベルの例としては、リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、δ−５−ステロイドイソメラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α−グリセロールホスフェートデヒドロゲナーゼ、トリオースホスフェートイソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β−ガラクトシダーゼ、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース−６−ホスフェートデヒドロゲナーゼ、グルコアミラーゼ、及びアセチルコリンエステラーゼが挙げられる。

好適な放射性同位体ラベルの例としては、^３Ｈ、^１１１Ｉｎ、^１２５1、^１３１1、^３２Ｐ、^３５Ｓ、^１４Ｃ、^５１Ｃｒ、^５７Ｔｏ、^５８Ｃｏ、^５９Ｆｅ、^７５Ｓｅ、^１５２Ｅｕ、^９０Ｙ、^６７Ｃｕ、^２１７Ｃｉ、^２１１Ａｔ、^２１２Ｐｂ、^４７Ｓｃ、^１０９Ｐｄ等が挙げられる。ｉｎ ｖｉｖｏで画像化する場合、肝臓によって、^１２５Ｉ又は^１３１Ｉ標識ポリペプチドの脱ハロゲン化の問題が回避されるので、^１１１Ｉｎが好ましい同位体である。さらに、この放射性ヌクレオチドには、画像化により有益なγ放射エネルギーがある。例えば、１−（Ｐ−イソチオシアナトベンジル）−ＤＰＴＡを有するモノクローナル抗体と連結する^１１１Ｉｎは、非腫瘍組織、特に肝臓ではわずかな取り込みしか見られず、したがって腫瘍局在診断の特異性を高める。

好適な非放射性同位体ラベルの例としては、^１５７Ｇｄ、^５５Ｍｎ、^１６２Ｄｙ、^５２Ｔｒ、及び^５６Ｆｅが挙げられる。

好適な蛍光ラベルの例としては、^１５２Ｅｕラベル、フルオレセインラベル、イソチオシアネートラベル、ローダミンラベル、フィコエリトリンラベル、フィコシアニンラベル、アロフィコシアニンラベル、ｏ−フタルデヒドラベル、及びフルオレスカミンラベルが挙げられる。

好適な毒素ラベルの例としては、シュードモナス毒素、ジフテリア毒素、リシン、及びコレラ毒素が挙げられる。

化学発光ラベルの例としては、ルミナール（luminal）ラベル、イソルミナールラベル、芳香族アクリジニウムエステルラベル、イミダゾールラベル、アクリジニウム塩ラベル、シュウ酸エステルラベル、ルシフェリンラベル、ルシフェラーゼラベル、及びエクオリンラベルが挙げられる。

核磁気共鳴造影剤の例としては、Ｇｄ、Ｍｎ及び鉄等の重金属核が挙げられる。重水素も使用してもよい。また、ＥＰＲ、ＰＥＴ又は他の画像化機構にも他の造影剤が存在し、当業者にとって既知である。

上記のラベルとポリペプチドとの結合に典型的な技法は、Kennedy et al.（1976）Clin. Chim. Acta 70: 1-31、及びSchurs et al.（1977） Clin. Chim. Acta 81: 1-40で与えられる。連結技法としては、グルタルアルデヒド法、過ヨード酸法、ジマレイミド法、ｍ−マレイミドベンジル−Ｎ−ヒドロキシ−スクシンイミドエステル法が挙げられ、これらの方法は全て本明細書中に参照により援用される。

実施例１
実験プロトコル
ヒトＴｉｅ２のＩｇ様ドメイン１、ヒトＴｉｅ２のＩｇ様ドメイン２、ヒトＴｉｅ２の３つのＥＧＦ様ドメイン、ヒトＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメイン及びヒトＩｇＧのＦｃドメインから成る４つの異なる集合化融合タンパク質（ＤＡＡＰ＃１、ＤＡＡＰ＃２、ＤＡＡＰ＃３及びＤＡＡＰ＃４）をコードする遺伝子構築物（図３Ａ及び図３Ｂ）を、ｐＣＭＶ−ｄｈｆｒベクターにクローン化した（Hwang SJ, et al., Protein Express Purif. 2005;39: 175-183）（図４）。

ＤＡＡＰ＃１だけがＶＥＧＦ−Ａ及びＡｎｇ２との同時結合を示すため、ＶＥＧＦ−Ａ及びＡｎｇ２との結合が可能な融合タンパク質をコードするＤＡＡＰ＃１遺伝子構築物の７つの変形（ＤＡＡＰ＃１１、ＤＡＡＰ＃１２、ＤＡＡＰ＃１３、ＤＡＡＰ＃１３、ＤＡＡＰ＃１４、ＤＡＡＰ＃１５、ＤＡＡＰ＃１６及びＤＡＡＰ＃１７）をさらに作製した（図５及び図６）。

製造業者の取扱説明書（Qiagen, Inc., Hilden, Germany）に従ってＥｆｆｅｃｔｅｎｅリポソームトランスフェクションを用いた、ＨＥＫ２９３細胞（Ａｍｅｒｉｃａｎタイプカルチャーコレクション、Manassas, VA）における一時的発現によって、全てのＤＡＡＰ組換えタンパク質を得た。４８時間〜９６時間後、上澄みをトランスフェクトした細胞から回収した。プロテイン−Ａセファロースアフィニティクロマトグラフィを用いて、組換えタンパク質を精製し、その後酸溶離及び中和した。精製後、ブラッドフォードアッセイを用いて、タンパク質を定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシーブルー染色で確認した。ウェスタンブロッティング解析のために、それぞれの試料１００ｎｇを試料バッファーと混合し、１０分間熱変性させ、１０％ＳＤＳ−ＰＡＧＥ上を泳動させて、ニトロセルロース膜上にエレクトロブロッティングした。０．０５％トリトンＸ−１００を含有するトリスバッファー溶液（５０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中の５％脱脂乳で膜を遮断し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（希釈率１：１００００、Sigma-Aldrich Ａ０１７０）でウェスタンブロッティングし、Ｆｃ融合タンパク質を検出した。化学発光スキャナ（ＬＡＳ−１０００、富士フイルム株式会社、東京）を使用して、製造業者のプロトコル（Amersham Pharmacia Biotech）に従って、化学発光検出によってシグナルを視覚化した（図７）。

酵素免疫測定法（ＥＬＩＳＡ）によって、ＤＡＡＰ組換えタンパク質とＶＥＧＦ−Ａ又はＡｎｇ２との結合能を測定した（図８及び図９）。リン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）１００μｌ中、ＶＥＧＦ−Ａ_１６５（ＣＨＯ細胞から産生）（以下ＶＥＧＦ−Ａと呼ぶ）又はＡｎｇ２（ＣＨＯ細胞から産生）２００ｎｇを９６ウェルプレートに等分し、４℃で一晩インキュベートした。それぞれＰＢＳ ４００μｌで３回プレートを洗浄した後、３７℃で２時間、遮断溶液（ＰＢＳ １００μｌ中、１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ））で遮断を実施した。遮断溶液１００μｌ中、それぞれＤＡＡＰタンパク質１００ｎｇをプレートに加え、３７℃で２時間、インキュベートした。同量のＶＥＧＦ−トラップ（Holash, J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 99:11393-11398）、Ｔｉｅ２−Ｆｃ又はＦｃ組換えタンパク質を添加し、陽性対照及び陰性対照と同じようにインキュベートした。それぞれＰＢＳ ４００μｌで３回プレートを洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（希釈率１：１００００、Sigma-Aldrich Ａ０１７０）５０μｌをプレートに加え、３７℃で２時間インキュベートした。それぞれＰＢＳ ４００μｌで３回プレートを洗浄した後、３，３’，５，５’−テトラメチルベンジジン（ＴＭＢ）溶液（Sigma-Aldrich Ｔ０４４０）５０μｌをプレートに加え、室温で１０分間インキュベートした。１ＭのＨＣｌ ５０μｌを加えることで反応を停止させ、ＥＬＩＳＡリーダー（BioRad Ｍ６８０）によって光学密度４１５ｎｍで反応物の色を解析した。

これまでに記載の方法（Hwang SJ, et al., Protein Express Purif. 2005;39: 175-183）に従って、ＶＥＧＦ−トラップ（ＣＨＯ−ＶＴ１）を発現する組換えチャイニーズハムスター卵巣（ｒＣＨＯ）細胞を樹立した。要するに、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞（ＣＲＬ−９０９６、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Manassas, Virginia, USA）に、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）と、ＶＥＧＦ−トラップ（Holash J. et al., PNAS 99:11393-11398, 2002）遺伝子とを含有するベクターのトランスフェクションによって、ＣＨＯ−ＶＴ１細胞を樹立した。この後に、ｄｈｆｒ／メトトレキサート（ＭＴＸ）媒介遺伝子を増幅した。ＭＴＸ（０．０２μＭ〜１．０μＭ、Sigma-Aldrich）の濃度を漸増幅しながら、ＶＥＧＦ−トラップを分泌する３つの安定ｒＣＨＯ細胞を選択した。これらのうち、最も多量のＶＥＧＦ−トラップを発現する１つの細胞株を選択し、「ＣＨＯ−ＶＴ１」と呼んだ。ＣＨＯ−ＶＴ１細胞を成長させ、５％透析ウシ胎児血清（Invitrogen, Carlsbad, California, USA）と１μＭのＭＴＸ（Sigma-Aldrich）とを補充したイスコフ改変ダルベッコ培地中で維持した。組換えＶＥＧＦ−トラップタンパク質産生のために、３７℃加湿５％ＣＯ_２インキュベータ内で１１０ｒｐｍでオービタルシェーカー（Vision, Bucheon, Korea）上で培地１００ｍｌが入った２５０ｍｌ容のエルレンマイアーフラスコ中でＣＨＯ−ＶＴ１細胞を２×１０^５細胞／ｍＬ接種した。指定日の後、プロテイン−Ａセファロースアフィニティクロマトグラフィを用いることによって、ＶＥＧＦ−トラップ組換えタンパク質を含有する培養培地を精製し、酸溶離した後、中和した。精製後、ブラッドフォードアッセイを用いて、タンパク質を定量し、ＳＤＳ−ＰＡＧＥゲルのクマシーブルー染色で確認した。この解析によって、およそ１０ｍｇ／ＬのＶＥＧＦ−トラップを回収したことが示された。

実施例２
ＥＬＩＳＡ解析によって、ＤＡＡＰ＃１、ＤＡＡＰ＃１４、ＤＡＡＰ＃１６及びＤＡＡＰ＃１７がＶＥＧＦ−Ａ及びＡｎｇ２と結合することが可能であることが示された（図１０）。ＤＡＡＰ＃２、ＤＡＡＰ＃３、ＤＡＡＰ＃４、ＤＡＡＰ＃１１及びＦｃは、ＶＥＧＦ−Ａ及びＡｎｇ２と結合することが不可能であった（図１０）。ＤＡＡＰ＃１２及びＶＥＧＦ−トラップが、ＶＥＧＦ−Ａと優先的且つ選択的に結合することが可能であり、ＤＡＡＰ＃１３及びＴｉｅ２−Ｆｃが、ＶＥＧＦ−Ａと優先的且つ選択的に結合することが可能であった（図１０）。ＤＡＡＰ＃１及びＤＡＡＰ＃１４とＶＥＧＦ−Ａ及び／又はＡｎｇ２との結合能が、ＶＥＧＦ−トラップ又はＴｉｅ２−Ｆｃの結合能と同程度であったので、ＤＡＡＰ＃１及びＤＡＡＰ＃１４が治療タンパク質としてさらに発展するための最も強力な候補物であると考えられる。

ＤＡＡＰ組換えタンパク質が、ＶＥＧＦ及びＡｎｇ２と同時に結合することが可能であるか否かを調べるために、遮断溶液１００μｌ中、３７℃で２時間、それぞれのＤＡＡＰ組換えタンパク質（ＤＡＡＰ＃１、ＤＡＡＰ＃１２、ＤＡＡＰ＃１３、ＤＡＡＰ＃１４、ＤＡＡＰ＃１５、ＤＡＡＰ＃１６及びＤＡＡＰ＃１７）１００ｎｇを、連続量（０ｎｇ、１０ｎｇ、１００ｎｇ、１０００ｎｇ）のＡｎｇ２又はＶＥＧＦ−Ａとプレインキュベートした後、上記のようにＥＬＩＳＡのためにＶＥＧＦ−Ａ又はＡｎｇ２でコートしたプレートに加えた。陽性対照及び陰性対照と同じように、同量のＶＥＧＦ−トラップ、Ｔｉｅ２−Ｆｃ又はＦｃ組換えタンパク質を、連続量のＡｎｇ２又はＶＥＧＦ−Ａとプレインキュベートした。Ａｎｇ２又はＶＥＧＦ−Ａのプレインキュベーションによって、ＤＡＡＰタンパク質とＡｎｇ２又はＶＥＧＦ−Ａとの結合部位が占有された。Ａｎｇ２プレインキュベーションでは、ＤＡＡＰ＃１、ＤＡＡＰ＃１２、ＤＡＡＰ＃１４、ＤＡＡＰ＃１６、ＤＡＡＰ＃１７及びＶＥＧＦ−トラップが、ＶＥＧＦと結合することが可能であった（図１１Ａ）。比較して、ＶＥＧＦプレインキュベーションでは、ＤＡＡＰ＃１、ＤＡＡＰ＃１３、ＤＡＡＰ＃１４、ＤＡＡＰ＃１６、ＤＡＡＰ＃１７及びＴｉｅ２−Ｆｃが、Ａｎｇ２と結合可能であった（図１１Ｂ）。したがって、ＤＡＡＰ＃１、ＤＡＡＰ＃１４、ＤＡＡＰ＃１６及びＤＡＡＰ＃１７が、ＶＥＧＦ−Ａ及びＡｎｇ２と同時に結合することが可能である（図１２）。

ＤＡＡＰ＃１、ＤＡＡＰ＃１４、ＶＥＧＦ−トラップ、及びＴｉｅ２−Ｆｃと、ＶＥＧＦ−Ａ及びＡｎｇ２との結合能のさらなる解析のために、ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合アッセイを実施した（図１３）。１．０％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０を含有するトリスバッファー溶液（５０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）５００μｌ中、４℃で２時間、それぞれ５００ｎｇのＤＡＡＰ＃１、ＤＡＡＰ＃１４、ＶＥＧＦ−トラップ又はＴｉｅ２−Ｆｃを、１００ｎｇのＦＬＡＧタグ付与ＶＥＧＦ−Ａ、ＦＬＡＧタグ付与Ａｎｇ２、又はＶＥＧＦ−Ａ及びＡｎｇ２とインキュベートした。それから、プロテイン−Ａアガロースビース（Oncogene）２０μｌを添加し、４℃でさらに２時間インキュベートした。プロテイン−Ａ結合試料を、１．０％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０を含有するトリスバッファー溶液１ｍｌで３回洗浄した。試料を試料バッファーで溶離し、熱変性させた。１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥで試料を分離し、ニトロセルロース膜上にエレクトロブロッティングした。０．０５％トリトンＸ−１００を含有するトリスバッファー溶液（５０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）中の５％脱脂乳で膜を遮断し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合マウス抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（希釈率１：１００００、Sigma-Aldrich Ａ８５９２）でウェスタンブロッティングし、結合ＦＬＡＧタグ付与ＶＥＧＦ−Ａ及びＦＬＡＧタグ付与Ａｎｇ２を検出した。化学発光スキャナ（ＬＡＳ−１０００、富士フイルム株式会社、東京）を使用して、製造業者のプロトコル（Amersham Pharmacia Biotech）に従って、化学発光検出によってシグナルを視覚化した。ｉｎ ｖｉｔｒｏ結合は、ＤＡＡＰ＃１及びＤＡＡＰ＃１４がＶＥＧＦ−Ａ及びＡｎｇ２と同時に結合することが可能であることを示した（図１２、図１３Ａ及び図１３Ｂ）。ＶＥＧＦ−トラップは、Ａｎｇ２ではなく、ＶＥＧＦ−Ａと結合することが可能であったが（図１３Ｃ）、Ｔｉｅ２−Ｆｃは、ＶＥＧＦ−Ａではなく、Ａｎｇ２との結合を示していた（図１３Ｄ）。

実施例３
上記の所見に基づき、治療タンパク質として使用するために、ＤＡＡＰ＃１をさらに研究した。これまでに記載の方法（Hwang SJ, et al., Protein Express Purif. 2005;39: 175-183）に従って、ＤＡＡＰ＃１（ＣＨＯ−ＤＡＡＰ＃１）を発現する組換えチャイニーズハムスター卵巣（ｒＣＨＯ）細胞を樹立した。要するに、ｄｈｆｒ欠損ＣＨＯ細胞（ＣＲＬ−９０９６、アメリカンタイプカルチャーコレクション、Manassas, Virginia, USA）に、ジヒドロ葉酸還元酵素（ｄｈｆｒ）と、ＤＡＡＰ＃１遺伝子構築物とを含有するベクターのトランスフェクションによって、ＣＨＯ−ＤＡＡＰ＃１細胞を樹立した。この後に、ｄｈｆｒ／メトトレキサート（ＭＴＸ）媒介遺伝子を増幅した。ＭＴＸ（０．０２μＭ〜１．０μＭ、Sigma-Aldrich）の濃度を漸増幅しながら、ＤＡＡＰ＃１を分泌する安定なｒＣＨＯ細胞を選択した。組換えＤＡＡＰ＃１タンパク質産生のために、３７℃加湿５％ＣＯ_２インキュベータ内で１１０ｒｐｍでオービタルシェーカー（Vision, Bucheon, Korea）上で培地１００ｍｌが入った２５０ｍｌ容のエルレンマイアーフラスコ中でＣＨＯ−ＤＡＡＰ＃１細胞を２×１０^５細胞／ｍＬ接種した。指定日の後、プロテイン−Ａセファロースアフィニティクロマトグラフィを用いることによって、ＤＡＡＰ＃１組換えタンパク質を含有する培養培地を精製し、酸溶離した後、中和した。精製後、ＳＤＳ−ＰＡＧＥ及びクマシーブルー染色によって、還元条件及び非還元条件下で、ＤＡＡＰ＃１のサイズ及び二量体状態を調べた（図１４）。この解析によって、ＤＡＡＰ＃１が二量体タンパク質（約１５０ｋＤａ）であることが示される（図１４）。

実施例４
ＥＬＩＳＡ法を用いて、Ｆｃ、ＤＡＡＰ＃１、ＶＥＧＦ−トラップ、及びＦｃタンパク質とＶＥＧＦ−Ａ及びＡｎｇ２との結合能を測定した。ＶＥＧＦ−Ａ結合のために、一晩、各ウェル当たり１００μｌのＰＢＳ中のＶＥＧＦ−Ａ ２００ｎｇで９６ウェルプレートをコーティングした。それぞれ、プレートをＰＢＳ ４００μｌで３回洗浄した後、３７℃で２時間、ＰＢＳ １００μｌ中の１％ウシ血清アルブミンで遮断した。３回のＰＢＳ洗浄の後、遮断溶液中の各種量（０ｎＭ、０．００１ｎＭ、０．００３ｎＭ、０．０１ｎＭ、０．０３ｎＭ、０．１ｎＭ、０．３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ）のＤＡＡＰ＃１、Ｆｃ、ＶＥＧＦ−トラップ又はＴｉｅ２−Ｆｃタンパク質を３７℃で２時間インキュベートした。３回のＰＢＳ洗浄の後、遮断溶液中のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（希釈率１：１００００、Sigma-Aldrich Ａ０１７０）５０μｌを３７℃で２時間インキュベートした。３回のＰＢＳ洗浄の後、ＴＭＢ溶液（Sigma-Aldrich Ｔ０４４０）５０μｌを各ウェルに加え、プレートを室温で１０分間インキュベートした。１ＭのＨＣｌ ５０μｌを添加することで反応を停止させ、ＥＬＩＳＡリーダー（BioRad Ｍ６８０）によって光学密度４１５ｎｍで反応物の色を解析した。Ａｎｇ２結合のために、上記と同じようにＡｎｇ２を９６ウェルプレートにコーティングし、また上記と同じように、Ｆｃ、ＤＡＡＰ＃１、ＶＥＧＦ−トラップ、及びＦｃタンパク質と、Ａｎｇ２との結合能を測定した。

結合能に関するこれらのアッセイによって、ＤＡＡＰ＃１とＶＥＧＦ−ＡとのＫｄは約５ｐＭであり、ＶＥＧＦ−トラップとＶＥＧＦ−ＡとのＫｄは約１ｐＭであり、その一方でＤＡＡＰ＃１とＡｎｇ２とのＫｄが約１０ｎＭであり、Ｔｉｅ２−ＦｃとＡｎｇ２とのＫｄが約５０ｎＭであることが明らかになった（図１５）。ＶＥＧＦ−トラップは、Ａｎｇ２と結合せず、Ｔｉｅ２−Ｆｃは、ＶＥＧＦ−Ａと結合しなかった（図１５）。

実施例５
ＤＡＡＰ＃１がＶＥＧＦ−Ａ及びＡｎｇ２の両方に対する結合部位を包含しているため、初めにＤＡＡＰ＃１の部位の１つをＡｎｇ２又はＶＥＧＦ−Ａのいずれかで占有又は予め占有する場合、その構造変化によって、ＶＥＧＦ−Ａ又はＡｎｇ２との結合活性が影響を受ける可能性がある。

ＤＡＡＰ＃１のＶＥＧＦ−Ａ結合部位をＶＥＧＦ−Ａで予め占有することがＡｎｇ２結合能に影響を与えるか否かを調べるために、組換えＤＡＡＰ＃１タンパク質を、漸増量（０ｎｇ／μｌ、１０ｎｇ／μｌ、３０ｎｇ／μｌ、１００ｎｇ／μｌ、３００ｎｇ／μｌ、１０００ｎｇ／μｌ）のＶＥＧＦ−Ａとプレインキュベートした後、上述のＡｎｇ２結合ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。反対に、ＤＡＡＰ＃１のＡｎｇ２結合部位をＡｎｇ２で予め占有することがＶＥＧＦ−Ａ結合能に影響を与えるか否かを調べるために、組換えＤＡＡＰ＃１タンパク質を、漸増量（０ｎｇ／μｌ、１０ｎｇ／μｌ、３０ｎｇ／μｌ、１００ｎｇ／μｌ、３００ｎｇ／μｌ、１０００ｎｇ／μｌ）のＡｎｇ２とプレインキュベートした後、上述のＶＥＧＦ結合ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。対照として、組換えＶＥＧＦ−トラップタンパク質を、漸増量（０ｎｇ／μｌ、１０ｎｇ／μｌ、３０ｎｇ／μｌ、１００ｎｇ／μｌ、３００ｎｇ／μｌ、１０００ｎｇ／μｌ）のＡｎｇ２とプレインキュベートした後、上述のＶＥＧＦ結合ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。対照として、組換えＴｉｅ２−Ｆｃタンパク質を、漸増量（０ｎｇ／μｌ、１０ｎｇ／μｌ、３０ｎｇ／μｌ、１００ｎｇ／μｌ、３００ｎｇ／μｌ、１０００ｎｇ／μｌ）のＶＥＧＦ−Ａとプレインキュベートした後、上述のＡｎｇ２結合ＥＬＩＳＡアッセイを実施した。

興味深いことに、Ａｎｇ２とＤＡＡＰ＃１との結合が予め占有することが、ＤＡＡＰ＃１とＶＥＧＦ−Ａとの結合活性を高めた（図１６Ａ）。さらに、ＶＥＧＦ−ＡとＤＡＡＰ＃１との結合が予め占有することが、ＤＡＡＰ＃１とＡｎｇ２との結合活性を高めた（図１６Ｂ）。これに対して、ＶＥＧＦ−ＡとＤＡＡＰ＃１との結合が予め占有することは、ＶＥＧＦ−ＡとＤＡＡＰ＃１とのさらなる結合を阻害し、Ａｎｇ２とＤＡＡＰ＃１との結合が予め占有することは、Ａｎｇ２とＤＡＡＰ＃１とのさらなる結合を阻害した（図１６）。３回の反復実験が同様の所見を示した。これらのデータによってＤＡＡＰ＃１が、ＶＥＧＦ−Ａ及びＡｎｇ２の両方と同時に結合することが可能であることが示される。

実施例６
ＤＡＡＰ＃１の結合能をさらに解析するために、幾つかの種類のＶＥＧＦ及びアンジオポエチンタンパク質の存在下で、プルダウンアッセイによるｉｎ ｖｉｔｒｏ結合を実施した（ｎ＝３）（図１７）。１．０％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０を含有するトリスバッファー溶液（５０ｍＭのトリス、１００ｍＭのＮａＣｌ、ｐＨ７．５）５００μｌ中、４℃で２時間、それぞれ２００ｎｇのＦＬＡＧタグ付与タンパク質（ヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５、マウスＶＥＧＦ−Ａ１６４、ヒトＶＥＧＦ−Ａ１８９、ヒトＶＥＧＦ−Ａ１２１、ヒトＶＥＧＦ−Ｃ、ＶＥＧＦ−Ｅ、ヒトＡｎｇ２、マウスＡｎｇ２、ヒトＡｎｇ１、ヒトＡｎｇ４、及びマウスＡｎｇｐｔｌ４）を、５００ｎｇのＤＡＡＰ＃１、ＶＥＧＦ−トラップ、及びＴｉｅ２−Ｆｃとインキュベートした。それから、プロテイン−Ａアガロースビース（Oncogene）２０μｌを添加し、４℃でさらに２時間インキュベートした。プロテイン−Ａ結合試料を、１．０％ Ｎｏｎｉｄｅｔ Ｐ−４０を含有するトリスバッファー溶液１ｍｌで３回洗浄した。試料を試料バッファーで溶離し、熱変性させた。１０％ ＳＤＳ−ＰＡＧＥで試料を分離し、ニトロセルロース膜上にエレクトロブロッティングした。０．０５％トリトンＸ−１００を含有するトリスバッファー溶液中の５％脱脂乳で膜を遮断し、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合マウス抗ＦＬＡＧ Ｍ２抗体（希釈率１：１００００、Sigma-Aldrich Ａ８５９２）でウェスタンブロッティングした。化学発光スキャナ（ＬＡＳ−１０００、富士フイルム株式会社、東京）を使用して、製造業者のプロトコル（Amersham Pharmacia Biotech）に従って、化学発光検出によってシグナルを視覚化した。剥離した後、ＤＡＡＰ、ＶＥＧＦ−トラップ、及びＴｉｅ２−Ｆｃに対して、膜を抗Ｆｃホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（希釈率１：１００００、Sigma-Aldrich Ａ０１７０）で再プローブ化した。ＤＡＡＰ＃１は、ヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５、マウスＶＥＧＦ−Ａ１６４、ヒトＶＥＧＦ−Ａ１８９、ヒトＶＥＧＦ−Ａ１２１、ヒトＡｎｇ２、マウスＡｎｇ２、ヒトＡｎｇ１及びヒトＡｎｇ４と結合可能であり、その一方でＶＥＧＦ−トラップは、ヒトＶＥＧＦ−Ａ１６５、マウスＶＥＧＦ−Ａ１６４、ヒトＶＥＧＦ−Ａ１８９及びヒトＶＥＧＦ−Ａ１２１と結合可能であり、Ｔｉｅ２−Ｆｃは、ヒトＡｎｇ２、マウスＡｎｇ２、ヒトＡｎｇ１及びヒトＡｎｇ４と結合可能である（図１７）。

組換えＤＡＡＰタンパク質、Ｆｃタンパク質を含有するＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメイン２［ＶＥＧＦＲ１（２）−Ｆｃ］、Ｆｃタンパク質を含有するＶＥＧＦＲ１のＩｇ様ドメイン２及び３［ＶＥＧＦＲ１（２−３）−Ｆｃ］、ＶＥＧＦ−トラップ及びＴｉｅ２−Ｆｃに対するｐＩ理論値を図１８に示す。

実施例７
一般的に、タンパク質のｐＩ値の増大は、細胞外基質（ＥＣＭ）結合の増大に相関する。またタンパク質のＥＣＭ結合の増大は、薬物動態特性の低減に相関する。３７℃で２時間、ＥＣＭコーティング９６ウェルプレート（Becton Dickinson、カタログ番号３５４６０７）を遮断バッファー（ＰＢＳ中、１％ＢＳＡ）でインキュベートし、それぞれＰＢＳ ４００μｌで３回洗浄した。それから、遮断バッファー中の各種量（０ｎｇ、０．１ｎｇ、０．３ｎｇ、１．０ｎｇ、３．３ｎｇ、１０ｎｇ、３３ｎｇ、１００ｎｇ）のそれぞれのＤＡＡＰ組換えタンパク質をプレートに加え、３７℃で２時間インキュベートした（図１９）。プレートをそれぞれＰＢＳ ４００μｌで３回洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（希釈率１：１００００、Sigma-Aldrich Ａ０１７０）５０μｌをプレートに加え、３７℃で２時間インキュベートした。プレートをそれぞれＰＢＳ ４００μｌで３回洗浄した後、ＴＭＢ溶液（Sigma-Aldrich Ｔ０４４０）５０μｌをプレートに加え、プレートを室温で１０分間インキュベートした。１ＭのＨＣｌ ５０μｌを加えることで反応を停止させ、ＥＬＩＳＡリーダー（BioRad Ｍ６８０）によって光学密度４１５ｎｍで反応物の色を解析した（図１９）。

ＥＣＭ結合アッセイによって、ＥＣＭ結合に対してそれぞれ、ＤＡＡＰ＃１、ＤＡＡＰ＃１４、ＤＡＡＰ＃１５及びＴｉｅ２−Ｆｃは非常に低く、ＤＡＡＰ＃１７及びＶＥＧＦ−トラップは比較的低く、ＤＡＡＰ＃１６は中程度であり、ＶＥＧＦＲ１（２−３）−Ｆｃは非常に高かったことが明らかになった（図２０）。したがって、ＤＡＡＰ＃１、ＤＡＡＰ＃１４、ＤＡＡＰ＃１５及びＴｉｅ２−Ｆｃは、比較的高い薬物動態特性を有し得る。

ＤＡＡＰ＃１、ＶＥＧＦ−トラップ及びＴｉｅ２−Ｆｃタンパク質の濃度を高くしながら、さらにＥＣＭ結合アッセイを実施した。ＥＣＭコーティング９６ウェルプレート（Becton Dickinson、カタログ番号３５４６０７）を遮断バッファー（ＰＢＳ中、２％ＢＳＡ）１００μｌで３７℃で２時間インキュベートした。プレートをそれぞれＰＢＳ ４００μｌで３回洗浄した。それから、遮断バッファー中の各種量（０．１ｎＭ、０．３ｎＭ、１ｎＭ、３ｎＭ、１０ｎＭ、３０ｎＭ）のそれぞれのＤＡＡＰ＃１、ＶＥＧＦ−トラップ、Ｔｉｅ２−Ｆｃ組換えタンパク質をプレートに加え、３７℃で２時間インキュベートした。３回ＰＢＳ洗浄した後、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（希釈率１：１００００、Sigma-Aldrich Ａ０１７０）５０μｌをプレートに加え、３７℃で２時間インキュベートした。３回ＰＢＳ洗浄した後、遮断溶液中のホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（希釈率１：１００００、Sigma-Aldrich Ａ０１７０）５０μｌを３７℃で２時間インキュベートした。３回ＰＢＳ洗浄した後、ＴＭＢ溶液（Sigma-Aldrich Ｔ０４４０）５０μｌをそれぞれのウェルに加え、プレートを室温で１０分間インキュベートした。１ＭのＨＣｌ ５０μｌを加えることで反応を停止させ、ＥＬＩＳＡリーダー（BioRad Ｍ６８０）によって光学密度４１５ｎｍで反応物の色を解析した。このＥＣＭ結合アッセイ（ｎ＝４）によって、ＥＣＭ結合に対して、ＤＡＡＰ＃１は低く、Ｔｉｅ２−Ｆｃは非常に低く、ＶＥＧＦ−トラップは比較的高かったことが明らかになった（図２１）。

実施例８
標準的な薬物動態解析を実施した（ｎ＝３）。１００μｇのＦｃ、ＤＡＡＰ＃１、ＶＥＧＦ−トラップ又はＴｉｅ２−Ｆｃ組換えタンパク質を８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウス（体重約２５ｇ）に皮下注射した後、１時間、２時間、４時間、８時間、１２時間、２４時間、４８時間、９６時間及び１４４時間で、尾静脈から血液試料を採取した（図２２）。ＶＥＧＦ−Ａ結合ＥＬＩＳＡ法によって、ＤＡＡＰ＃１及びＶＥＧＦ−トラップタンパク質の血清レベルを測定し、Ａｎｇ２結合ＥＬＩＳＡ法によって、Ｔｉｅ２−Ｆｃの血清レベルを測定した。捕捉抗体として、ヒトＩｇＧ１に対するマウスモノクローナル抗体（クローン番号２Ｃ１１、Abcam ＡＢ１９２７）と、検出抗体として、ホースラディッシュペルオキシダーゼ（ＨＲＰ）結合ヤギ抗ヒトＦｃ抗体（希釈率１：１００００、Sigma-Aldrich Ａ０１７０）とを使用するサンドウィッチＥＬＩＳＡ法によって、Ｆｃタンパク質の血清レベルを測定した。Ｆｃ、ＤＡＡＰ＃１、ＶＥＧＦ−トラップ及びＴｉｅ２−Ｆｃの半減期（Ｔ１／２）は、約２００時間、約４８時間、約２４時間及び約１２時間であった（図２３）。そのため、皮下投与後の血中のＤＡＡＰ＃１の消失が、血中のＶＥＧＦ−トラップの消失よりも遅かった（図２３）。

実施例９
腫瘍成長に対するＤＡＡＰ＃１の効果を調べるために、１×１０^６個の緑色蛍光タンパク質タグ付与ルイス肺癌（ＧＦＰ−ＬＬＣ）細胞を、８週齢の雄Ｃ５７ＢＬ／６マウスの剪毛した右脇腹域に皮下移植した。移植の５日後、処理のためにマウスを５つの群に分けた：群１（ｎ＝４）、ＰＢＳ（１００μｌ）；群２（ｎ＝４）、Ｆｃ（２５ｍｇ／ｋｇ）；群３（ｎ＝４）、ＤＡＡＰ＃１（２５ｍｇ／ｋｇ）；群４（ｎ＝４）、ＶＥＧＦ−トラップ（２５ｍｇ／ｋｇ）；群５（ｎ＝４）、Ｔｉｅ２−Ｆｃ（２５ｍｇ／ｋｇ）。これらの作用物質を隔日ごとに皮下注射した（図２４）。幅×長さ×深さ×０．５の式を用いて、キャリパーで６日ごとに成長腫瘍のサイズを測定した。

対照ＰＢＳ処理に比べて、ＤＡＡＰ＃１及びＶＥＧＦ−トラップでは、ＬＬＣ腫瘍成長の顕著な阻害が生じたが、Ｆｃ及びＴｉｅ２−Ｆｃでは、ＬＬＣ腫瘍成長の有意な阻害は生じなかった（図２５）。ＤＡＡＰ＃１による腫瘍成長阻害は、ＶＥＧＦ−トラップによる阻害よりも顕著であった（図２５）。このため、腫瘍成長阻害の潜在力は、ＤＡＡＰ＃１＞ＶＥＧＦ−トラップ＞Ｔｉｅ２−Ｆｃ＞Ｆｃ＞ＰＢＳである。

実施例１０
指定日での腫瘍血管の変化を調べるために、組み合せた麻酔薬（８０ｍｇ／ｋｇのケタミン及び１２ｍｇ／ｋｇのキシラジン）の筋肉内注射によって、ＧＦＰ−ＬＬＣ細胞を移植したマウスを麻酔し、ＰＢＳ中の１％パラホルムアルデヒドの全身血管潅流によって腫瘍を固定し、取り出して、組織凍結培地（Leica, Nussioch, Germany）に埋め込み、１０μｍの厚さで低温切開した。室温で１時間、ＰＢＳＴ（ＰＢＳ中、０．３％トリトンＸ−１００）中の５％ロバ血清で遮断した後、組織切片を抗マウスＰＥＣＡＭ−１抗体、ハムスタークローン２Ｈ８、１：１０００（Chemicon International, Temecula, CA）とインキュベートした。ＰＢＳＴ中で何回か洗浄した後、室温で２時間、試料をＣｙ３結合抗ハムスターＩｇＧ抗体、１：１０００（Jackson ImmunoResearch）とインキュベートした。蛍光シグナルを視覚化し、Zeissの倒立顕微鏡、ZeissのＡｐｏＴｏｍｅ顕微鏡又はアルゴン及びヘリウムネオンレーザーを備えたZeissのＬＳＭ５１０共焦点顕微鏡（Carl Zeiss）を使用して、デジタル画像を撮った。ＩｍａｇｅＪソフトウェア（http://rsb.info.nih.gov/ij）での写真解析を用いて、又はモノクロ電荷結合素子（ＣＣＤ）カメラと接続されたZeissのＡｐｏＴｏｍｅ顕微鏡及び画像解析ソフトウェア（ＡｘｉｏＶｉｓｉｏｎ、Zeiss）を用いてＰＥＣＡＭ−１免疫染色によって、腫瘍組織切片における血管の形態及び密度の測定を行った。

ＧＦＰ−ＬＬＣ細胞移植の２９日後、ＰＢＳで処理したＬＬＣ腫瘍で、密度が高くなり、十分に結び付いた血管が形成された（図２６）。ＶＥＧＦ−トラップの処理によって、腫瘍血管の剪定（Pruning）が観察され（図２６）、その一方でＤＡＡＰ＃１の処理によって、腫瘍血管の剪定及び狭窄が観察された（図２６）。

実施例１１
網膜での血管漏出及び浮腫を伴う異常な眼の血管新生は、糖尿病性網膜症及び加齢性黄斑変性症の主な原因である。新生児のマウスを過酸素雰囲気に曝すことで、異常な眼の血管新生を有するマウスモデルを作製することができ、これは「未熟児網膜症（ＲＯＰ）又は酸素誘導性網膜症」である（図２７）。Ｃ５７／ＢＬ６野生型マウスで、酸素誘導性網膜症を誘導した。生後７日目（Ｐ７）〜中心網膜の毛細血管床での血管閉塞及び血管発生の停止が起こるＰ１２で、新生児のマウス及びその乳母を７５％酸素に曝した（ＰＲＯ−ＯＸ１１０チャンバー酸素制御装置を使用した）（図２７）。Ｐ１２に動物を正常酸素室の空気条件に戻し、中心網膜を虚血状態及び低酸素状態にさせ、前網膜の血管新生を引き起こす（図２７）。それぞれの群｛ＰＢＳ対照（ｎ＝４）、Ｆｃ（ｎ＝４）、Ｔｉｅ２−Ｆｃ（ｎ＝４）、ＶＥＧＦ−トラップ（ｎ＝４）、ＤＡＡＰ（ｎ＝４）｝で、Ｐ１２動物に、Ｐ１６まで１日おきにそれぞれのタンパク質（２５ｍｇ／ｋｇ）を皮下注射し、Ｐ１７に屠殺した（図２７）。

それから、網膜の全載及び血管での免疫組織学的染色を以下のように実施した。即座にマウスから眼球を摘出し、４℃で２時間、４％パラホルムアルデヒド（ＰＦＡ）で固定した。ＰＢＳ中で網膜を単離し、２５℃で１時間、５％ロバ血清（Jackson Immuno Research）を含有するＴＢＳ（ＴＢＳ−Ｔ）中の０．３％トリトンＸ−１００で遮断して、４℃で一晩、ＰＥＣＡＭ−１抗体、ハムスタークローン２Ｈ８、１：１０００希釈（Chemicon International, Temecula, CA）で染色した。ＴＢＳ−Ｔ中で６回洗浄した後、２５℃で４時間、試料を１０００倍希釈したＣｙ３結合抗ハムスターＩｇＧ抗体とインキュベートした。ＴＢＳ−Ｔ中でさらに６回洗浄した後、光受容体が下にあり、ＶＥＣＴＡＳＨＩＥＬＤ（Vector）試薬中に埋め込まれたＳｕｐｅｒｆｒｏｓｔ／Ｐｌｕｓ顕微鏡スライド（１２−５５０−１５、Fisher）上に網膜を全載した。

ＰＥＣＡＭ−１で染色したＰ１７網膜血管系は、それぞれの群で網膜の全血管パターンを示した（図２８Ａ）。大きく拡大された視神経乳頭域では、ＰＢＳ処理群、Ｆｃ処理群及びＴｉｅ２−Ｆｃ処理群で、発芽した網膜小静脈の数の増加が検出されたのに対し、ＤＡＡＰ＃１処理群及びＶＥＧＦ−トラップ処理群では、発芽した網膜小静脈の数が顕著に減少した（図２８Ｂ）。ＰＢＳ処理群、Ｆｃ処理群及びＴｉｅ２−Ｆｃ処理群で、網膜症の典型的な特徴である、網膜血管における血管微小網の数が大きく増加したのに対して、ＤＡＡＰ＃１処理群及びＶＥＧＦ−トラップ処理群では、網膜小静脈における血管微小網の数が顕著に減少した（図２８Ｃ）。ＰＢＳ処理群、Ｆｃ処理群及びＴｉｅ２−Ｆｃ処理群で、網膜縁の血管の密度及び蛇行性が大きく増大したのに対し、ＤＡＡＰ＃１処理群及びＶＥＧＦ−トラップ処理群では、これらが顕著に低減した（図２８Ｄ）。定量解析によって、ＤＡＡＰ＃１及びＶＥＧＦ−トラップの処理によって、網膜血管における血管微小網のＲＯＰ誘導性形成及び周辺網膜血管密度の増大が潜在的に阻害されたことが明らかになった（図２８Ｅ及び図２８Ｆ）。これらのうち、ＤＡＡＰ＃１の潜在力は、ＶＥＧＦ−トラップよりも高かった。これらのデータは、糖尿病性網膜症及び加齢性黄斑変性症の患者を治療するためには、ＤＡＡＰ＃１がＶＥＧＦ−トラップよりも有効であることを示している。

炎症性血管新生は、関節リウマチの進行における特徴及び重大な要因である（Lainer-Carr and Brahn, 2007, Nature Clinical Practice Rhuematology3:434-442）。したがって、本発明者らが炎症性血管新生を阻害すれば、ＲＡの進行及び関節破壊を低減することができる。ＲＡの実験マウスモデルとしてコラーゲン誘導関節炎（ＣＩＡ）を導入するために、等容量の完全フロイントアジュバント中で乳化したウシＩＩ型コラーゲンを、雄ＤＢＡ／１Ｊマウスの尾の付け根に皮内免疫付与した（図２９Ａ）。３週間後、同じようにマウスを追加免疫付与した（boosted）（図２９Ａ）。１８日間、１週間に２回、対照バッファー（ｎ＝５）、Ｆｃ−タンパク質（２５ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝５）、ＶＥＧＦ−トラップ（２５ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝６）又はＤＡＡＰ＃１（２５ｍｇ／ｋｇ）（ｎ＝６）の皮下注射でＣＩＡのマウスを処理した（図２９Ａ）。以下のシステムを用いて、それぞれの足で疾患重症度を臨床的に採点した：悪性度０、浸潤なし；悪性度１、わずかな浸潤及び紅斑；２、顕著な浮腫；３、間接の剛直（図２９Ｂ）。処理マンモグラフィ画像化を用いて、Ｘ線写真解析を実施し、膝、踵及び足根中足関節でスコアを決定した（図３０）。また処理開始から１８日目で、病理組織学的解析を実施し、スコアを決定した（図３１）。概して、ＶＥＧＦ−トラップ及びＤＡＡＰ＃１は、臨床スコア及び放射学及び組織学的な異常を緩和したのに対し、対照バッファー及びＦｃ−タンパク質は、ＲＡの疾患重症度及び関節破壊における緩和効果を全く示さなかった。しかしながら、特に、ＤＡＡＰ＃１の効果が、臨床スコア並びにＲＡの放射学及び組織学的な異常の進行の低減において、ＶＥＧＦ−トラップの効果よりも優れている。したがって、ＤＡＡＰ＃１は、ＲＡ患者を治療する潜在的な治療剤であり得る。

本発明は、本明細書中に記載の特定の実施形態による範囲に限定されない。実際、本明細書中に記載のものに加えて、本発明の様々な修正が、上記の記載及び添付の図面から、当業者にとって明らかになる。このような修正は、添付の特許請求の範囲内にあるとされる。本実施例は、本発明を例示するものであり、これに限定されるものではない。

Claims (22)

1. Ｔｉｅ２ポリペプチドの機能的部分及びＶＥＧＦＲ１ポリペプチドの機能的部分を含むポリペプチドをコードする単離核酸分子であって、
   ＶＥＧＦポリペプチド及びアンジオポエチンポリペプチドと同時に結合することが可能であるポリペプチドをコードするものであり、
   前記Ｔｉｅ２ポリペプチドの機能的部分が、Ｉｇ様ドメイン１、Ｉｇ様ドメイン２及びＴｉｅ２の細胞外ドメインの３つのＥＧＦ様ドメインのアミノ酸配列から成り、
   前記ＶＥＧＦＲ１ポリペプチドの機能的部分が、ＶＥＧＦＲ１の細胞外ドメインのＩｇ様ドメイン２のアミノ酸配列から成り、
   前記Ｔｉｅ２ポリペプチドの機能的部分をコードするヌクレオチド配列が、前記ＶＥＧＦＲ１ポリペプチドの機能的部分をコードするヌクレオチド配列の上流に位置し、
   前記Ｔｉｅ２及びＶＥＧＦＲ１ポリペプチドの機能的部分を含むポリペプチドをコードするヌクレオチド配列が、多量体を形成するポリペプチドの機能的部分をコードするヌクレオチド配列と作動可能に連結する、核酸分子。
2. 多量体を形成するポリペプチドの機能的部分が免疫グロブリンドメインである、請求項１に記載の核酸分子。
3. 免疫グロブリンドメインが、ＩｇＧのＦｃドメイン、ＩｇＧの重鎖、及びＩｇＧの軽鎖から成る群から選択される、請求項２に記載の核酸分子。
4. ＤＡＡＰ＃１と称される配列番号２に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含む、請求項１に記載の核酸分子。
5. 請求項１に記載の核酸分子からなるヌクレオチド配列が発現制御配列と作動可能に連結したヌクレオチド配列を含む発現ベクター。
6. 請求項５に記載の発現ベクターを含む融合ポリペプチドを好適な宿主細胞において産生する、宿主ベクター系。
7. 好適な宿主細胞が、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞又は哺乳動物細胞である、請求項６に記載の宿主ベクター系。
8. 請求項１に記載の単離核酸分子がコードする融合ポリペプチド。
9. 融合ポリペプチドを産生する方法であって、該融合ポリペプチドの産生を可能にし、産生された該融合ポリペプチドを回収できる条件下で、請求項６に記載の宿主ベクター系の細胞を成長させることを含む、方法。
10. 請求項１に記載の核酸分子がコードする融合ポリペプチドであって、アセチル化又はペグ化によって修飾されている、融合ポリペプチド。
11. 請求項８に記載の融合ポリペプチドを有効成分として含む、哺乳動物における血漿漏出を低減又は阻害するための薬剤。
12. 哺乳動物がヒトである、請求項１１に記載の薬剤。
13. 請求項８に記載の融合ポリペプチドを有効成分として含む、哺乳動物における血管成長を遮断するための薬剤。
14. 請求項８に記載の融合ポリペプチドを有効成分として含む、哺乳動物におけるＶＥＧＦ受容体リガンド及びＴｉｅ２リガンドの活性を阻害するための薬剤。
15. 請求項８に記載の融合ポリペプチドを有効成分として含む、哺乳動物における腫瘍成長を軽減又は予防するための薬剤。
16. 請求項８に記載の融合ポリペプチドを有効成分として含む、ヒトにおける浮腫を軽減又は予防するための薬剤。
17. 浮腫が脳浮腫である、請求項１６に記載の薬剤。
18. 請求項８に記載の融合ポリペプチドを有効成分として含む、ヒトにおける腹水形成を軽減又は予防するための薬剤。
19. 腹水が卵巣癌に関連する、請求項１８に記載の薬剤。
20. ポリペプチドが抗体ではない、請求項１に記載の核酸分子。
21. 請求項８に記載の融合ポリペプチドを有効成分として含む、被験体における炎症性血管新生によって引き起こされる症状を治療するための薬剤。
22. 症状が関節リウマチである、請求項２１に記載の薬剤。