KR20150063728A

KR20150063728A - 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체

Info

Publication number: KR20150063728A
Application number: KR1020130148437A
Authority: KR
Inventors: 이정준; 김석균; 김경은; 김수진; 김형찬; 이광훈; 이윤숙; 한상열
Original assignee: 삼성전자주식회사
Priority date: 2013-12-02
Filing date: 2013-12-02
Publication date: 2015-06-10
Also published as: WO2015083978A1

Abstract

항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체, 및 이를 포함하는 Ang2 및/또는 VEGF-C 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 약학적 조성물이 제공된다.

Description

항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체{Anti-VEGF-C/anti-Ang2 bispecific antibody}

혈관 신생(angiogenesis)은 기존 혈관으로부터 새로운 혈관이 생성되는 기작을 의미한다. 정상적인 혈관 신생은 기관의 형성, 정상적인 생리학적 성장, 상처 치유 등에 중요한 역할을 하는 반면, 비정상적인 혈관 신생은 종양의 성장과 전이, 및/또는 연령 관련 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 건선, 류마티스성 관절염, 만성 염증과 같은 질병의 발생 또는 악화에 결정적인 역할을 한다.

따라서, 혈관 신생에 관여하는 인자들이 암 등의 질병의 새로운 치료제의 개발을 위한 중요한 타겟이 되고 있다. 이와 같이 혈관 신생에 관여하는 것으로 알려진 인자들에는 혈관 발달 및 출생 후 혈관 신생에 관여하는 것으로 알려져 있는 Ang1, Ang2, Ang3, Ang4 등의 앤지오포이에틴류, VEGF-A, VEGF-B, VEGF-C, VEGF-D 등의 혈관내피세포성장인자 등이 있다.

　이 중에서, Ang2와 관련한 암 조직의 신생 혈관 형성 과정은 다음과 같다. 먼저, 암 조직에서 신생 혈관 형성을 위해 암세포가 기존의 혈관을 선택하는 혈관공용(cooption)이 발생한다. 이후, Ang2 경로에 의해 기존의 혈관의 기능을 파괴시키는 혈관 퇴화가 일어난다. 기존 혈관의 퇴화로 인해 암 조직 내의 환경은 저산소(hypoxia) 환경이 되어 신생 혈관이 형성될 수 있는 조건을 제공하게 된다. 상기 조건 하에서 혈관 내피 세포 성장 인자(vascular endothelial cell growth factor, VEGF)의 발현이 증가되어 새로운 혈관이 생성된다.

또한, 혈관 내피세포 성장인자 (Vascular endothelial growth factor; VEGF) 패밀리 중 하나인 VEGF-C가 수용체인 VEGFR3와의 결합시 림프관 신생, 림프 내피세포 성장 및 이동을 촉진시킨다. 또한, VEGF-C는 다수의 고형암, 예컨대 위암, 전립선암, 인간 결장 직장암, 침윤성 자궁경부암 등에 있어서의 종양 관련 림프관 신생 유도를 통한 림프관 매개 (lymphatic-mediated) 전이, 유방암 전이 및 인간 흑색종 전이를 촉진시킨다. 뿐만 아니라 암세포에서의 VEGF-C 과잉 발현은 종양 관련 림프관 신생을 증가시킴으로써 국소 림프절에로의 전이를 증가시킨다.

따라서, 상기 2종 단백질을 동시에 저해함으로써 암 등의 관련 질병의 치료 효과를 보다 증진 시킬 수 있을 것으로 예측되며, 이러한 활성을 갖는 이중 저해제의 개발이 요구된다.

일 예는 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는, 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체를 제공한다.

다른 예는 상기 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체를 유효성분으로 포함하는 Ang2 및/또는 VEGF-C 관련 질병의 예방 및/또는 치료용 조성물을 제공한다.

본 발명은 혈관신생 유도인자인 VEGF-C의 Ang2의 기능을 동시에 저해하는 항체 및 그의 용도에 관한 것이며, 더욱 구체적으로는 암조직내 암세포 성장에 필수적인 신생혈관형성을 유도하는 인자인 VEGF-C가 그의 세포내 수용체(receptor)인 VEGF-R3와 결합하는 것을 방해함과 동시에, Ang2가 그의 세포내 수용체인 Tie2와 결합하는 것을 방해함으로써, 병변 조직 (예컨대, 암조직) 내의 신생혈관 형성 및 전이를 억제하고 Ang2 및/또는 VEGF-C의 활성 및/또는 과생성과 연관된 질병의 진단 및/또는 치료에 유용한 항체를 제공한다.

일 예는 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체를 제공한다. 상기 항원결합 단편은 scFv, (scFv)2, scFvFc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 이중 특이 항체의 표적 중 하나인 VEGF-C는 VEGFR-3의 리간드로서, 혈관 신생, 림프관 신생, 종양 생성, 종양 전이 등과 관련 있다. 상기 VEGF-C는 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류를 포함하는 포유류 유래의 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 유래의 Human VEGF-C (예컨대, NCBI Accession No. P49767), 원숭이 유래의 원숭이 VEGF-C (예컨대, NCBI Accession No. B6EBK4), 마우스 유래의 Mouse VEGF-C (NCBI Accession No. P97953), 래트 유래의 래트 VEGF-C (예컨대, NCBI Accession No. O35757) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 이중 특이 항체의 표적 중 다른 하나인 Ang2는 혈액 내에 존재하는 가용성 리간드로서, 혈관 신생(angiogenesis), 암전이(metastasis), 암세포 침투(invasion), 비정상적 혈관 형성을 수반하는 안구 질환 및 류마티스성 관절염 등의 다양한 병적 증상에 광범위하게 작용한다. 상기 Ang2는 인간, 원숭이 등의 영장류, 래트, 마우스 등의 설치류를 포함하는 포유류 유래의 것일 수 있으며, 예컨대, 인간 유래의 Human Ang2 (Accession # O15123), 원숭이 유래의 원숭이 Ang2 (예컨대, NCBI Accession No. Q8MIK6 등), 마우스 유래의 Mouse Ang2 (Accession # NP_031452, Accession # O35608 등), 래트 유래의 래트 Ang2 (예컨대, NCBI Accession No. O35462 등) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

상기 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체는 완전한 면역글로불린 (예컨대, IgG) 형태의 항 VEGF-C 항체와 항 Ang2 항체를 포함하는 것일 수 있으며, 이 때 상기 항 VEGF-C 항체와 항 Ang2 항체는 N 말단 또는 C 말단에서 서로 연결된 형태일 수 있다. 다른 예에서, 상기 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체는 완전한 면역글로불린 (예컨대, IgG) 형태의 항 VEGF-C 항체와 상기 항체의 N 말단 또는 C 말단에 연결된 Ang2에 대한 결합력을 보유하는 항 Ang2 항체의 항원 결합 단편 (예컨대, scFv)을 포함하는 것일 수 있다. 다른 예에서 상기 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체는 완전한 면역글로불린 (예컨대, IgG) 형태의 항 Ang2 항체와 상기 항체의 N 말단 또는 C 말단에 연결된 VEGF-C에 대한 결합력을 보유하는 항 VEGF-C 항체의 항원 결합 단편 (예컨대, scFv)을 포함하는 것일 수 있다.

보다 구체적으로, 상기 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체는 완전한 면역글로불린 (예컨대, IgG) 형태의 항체와 상기 면역글로불린 형태의 항체의 N 말단 또는 C 말단, 구체적으로 각 모노머의 중쇄의 C 말단에 각각 결합된 항원 결합 단편 (예컨대, scFv 형태의 단편)을 포함하는 상하 비대칭형 이중 특이 항체일 수 있다. 이 때, 상기 면역글로불린 형태의 항체는 VEGF-C에 대한 결합 부위를 갖는 것이고 상기 항원 결합 단편 (예컨대, scFv 형태의 단편)은 Ang2에 대한 결합 부위를 갖는 것이거나 (도 1 참조), 상기 면역글로불린 형태의 항체는 Ang2에 대한 결합 부위를 갖는 것이고 상기 항원 결합 단편 (예컨대, scFv 형태의 단편)은 VEGF-C에 대한 결합 부위를 갖는 것일 수 있다.

상기 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체에 있어서, 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 링커, 예컨대, 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 또한 항원 결합 단편 내의 중쇄 부분과 경쇄 부분, 예컨대 scFv 단편 내의 중쇄 가변 부위와 경쇄 가변 부위도 펩타이드 링커를 통하거나 통하지 않고 연결될 수 있다. 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편과 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 연결하는 펩타이드 링커와 항원 결합 단편 내의 중쇄 부분과 경쇄 부분을 연결하는 펩타이드 링커는 동일하거나 상이할 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 폴리펩타이드일 수 있으며, 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다. 상기 펩타이드 링커는, 예컨대, Gly, Asn 및/또는 Ser 잔기를 포함할 수 있으며, Thr 및/또는 Ala과 같은 중성 아미노산들도 포함될 수 있다. 펩타이드 링커에 적합한 아미노산 서열은 당 업계에 공지되어 있다. 한편, 상기 링커는 상기 이중 특이 항체의 기능에 영향을 미치지 않는 한도 내에서, 그 길이를 다양하게 결정할 수 있다. 예컨대, 상기 펩타이드 링커는 Gly, Asn, Ser, Thr 및 Ala로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 총 1 내지 100개, 2 내지 50개, 또는 5 내지 25개를 포함하여 이루어진 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 펩타이드 링커는 (G4S)n (n은 (G4S)의 반복수)로서, 1 내지 10의 정수, 예컨대 2 내지 5의 정수)로 표현되는 것일 수 있다.

구체적으로, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2와의 결합에 있어서 Tie2 수용체와 경쟁함으로써, Ang2와 Tie2 수용체와의 결합을 저해하는 것일 수 있으며, 예컨대, Ang2의 Tie2 수용체와의 결합 부위를 인식 및/또는 결합함으로써 Ang2와 Tie2 수용체와의 결합을 저해하는 것일 수 있다.

또한, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 활성을 추가로 가질 수 있다. 상기 인테그린(integrin)은 세포 부착을 매개하는 대표적인 단백질로서, 알파(α) 서브유닛과 베타(β) 서브유닛을 포함하는 헤테로다이머 구조이다. 포유류에서는 18 종류의 알파 서브유닛과 8종류의 베타 서브유닛이 동정되어 있다. 상기 인테그린은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등과 같은 포유류로부터 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대 인간 인테그린, 원숭이 인테그린, 마우스 인테그린, 래트 인테그린 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 각 종(species) 마다 24종의 인테그린이 알려져 있으며, 이들의 아미노산 서열은 잘 동정되어 있어서 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확한 사항이다. 예컨대, 상기 인테그린은 인간 인테그린일 수 있고, 대표적인 인테그린 종류로서 alpha5beta1(α5β1)(α5: NCBI Accession No. P08648, β1: NCBI Accession No. P05556), alphaVbeta1(αVβ1)(αV: NCBI Accession No. P06756, β1: NCBI Accession No. P05556), 및 alphaVbeta3(αVβ3)(αV: NCBI Accession No. P06756, β3: NCBI Accession No. P05106) 등을 들 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

일 예에 있어서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 Ang2 (hAng2; 서열번호 70; Accession # O15123)의 루프 1 (서열번호 70 중 417번째 아미노산부터 434번째 아미노산까지의 부위), 루프 2(서열번호 70 중 447번째 아미노산부터 454번째 아미노산까지의 부위), 및 루프 3(서열번호 70 중 460번째 아미노산부터 468번째 아미노산까지의 부위)으로 이루어진 부위의 전부 또는 일부(예컨대, 각 루프 중 외부에 노출된 아미노산 잔기 부위로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상), 또는 서열번호 70 중에서 루프 1, 루프 2, 또는 루프 3의 외부에 노출된 아미노산 잔기를 하나 이상 포함하는 인접하는 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 2개 내지 10개, 또는 2개 내지 5개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열 부위를 에피토프로서 인식하거나, 이 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.

예컨대, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 Ang2의 루프 1에 위치하는 I434, 루프 2에 위치하는 A449 및 P452, 및 루프 3에 위치하는 N467 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기, 또는 상기 하나 이상의 아미노산 잔기를 포함하는 인접하는 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 2개 내지 10개, 또는 2개 내지 5개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열 부위를 에피토프로 인식 및/또는 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 일 예에서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 인간 Ang2의 루프 1에 위치하는 I434, 루프 2에 위치하는 A449 및 P452, 및 루프 3에 위치하는 N467 로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기를 에피토프로 인식하거나 또는 이 부분에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.

[Ang2 (서열번호 70; 루프 1, 루프 2 및 루프 3을 각각 순서대로 밑줄로 표시하였으며, 각 에피토프를 굵은 글씨로 표시함)]

MWQIVFFTLS CDLVLAAAYN NFRKSMDSIG KKQYQVQHGS CSYTFLLPEM

DNCRSSSSPY VSNAVQRDAP LEYDDSVQRL QVLENIMENN TQWLMKLENY

IQDNMKKEMV EIQQNAVQNQ TAVMIEIGTN LLNQTAEQTR KLTDVEAQVL

NQTTRLELQL LEHSLSTNKL EKQILDQTSE INKLQDKNSF LEKKVLAMED

KHIIQLQSIK EEKDQLQVLV SKQNSIIEEL EKKIVTATVN NSVLQKQQHD

LMETVNNLLT MMSTSNSAKD PTVAKEEQIS FRDCAEVFKS GHTTNGIYTL

TFPNSTEEIK AYCDMEAGGG GWTIIQRRED GSVDFQRTWK EYKVGFGNPS

GEYWLGNEFV SQLTNQQRYV LKIHLKDWEG NEAYSLYEHF YLSSEELNYR

IHLKGLTGTA GKISSI SQPG NDFSTKDGDN DKC I CKCSQM LTGGWWFD A C

G P SNLNGMYY PQRQNT N KFN GIKWYYWKGS GYSLKATTMM IRPADF

상기 에피토프 부위는 Ang2의 3차원 구조의 루프 1, 2, 또는 3에 위치하는 노출된 아미노산 잔기로서, Tie2 수용체와의 결합에 직접 참여하거나, Tie2 수용체와의 결합 부위에 포함되거나 인접하여 위치한다. 따라서, 상기 에피토프들 중 하나 이상을 인식하고 결합하는 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang2와의 결합에 있어서 Tie2 수용체와 경쟁하게 되므로, Ang2와 Tie2 수용체의 결합을 저해하게 된다.

상기 "인접하는 아미노산"은 단백질의 1차구조 뿐 아니라, 2차 또는 3차 구조상에서는 서로 인접하여 위치하는 아미노산을 의미하는 것일 수 있다. 따라서, 본 명세서에서 "인접하는 아미노산"은 단백질의 1차, 2차 또는 3차 구조 상에서 연속하는 아미노산 잔기를 의미하는 것일 수 있다.

또한, 상기 에피토프 부위를 인식 및/또는 특이적으로 결합하는 항 Ang2 항체뿐 아니라, 상기 항 Ang2 항체와 경쟁적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 역시 Ang2와의 결합에 있어서 Tie2 수용체와 경쟁 가능하므로, Ang2와 Tie2 수용체의 결합을 저해할 수 있다. 이와 같이 경쟁적으로 결합하는 항체는 앞서 기술한 에피토프와 3차원 구조상의 인접한 부위를 에피토프로 인식하는 항체일 수 있다. 상기 경쟁적으로 결합하는 항체는 Ang2와의 결합 친화도(Kd)가 0.001 내지 10nM, 구체적으로 0.01 내지 1 nM, 보다 구체적으로 0.1 내지 0.8 nM인 것일 수 있다

따라서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 앞서 설명한 에피토프를 인식 및/또는 특이적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 이와 경쟁적으로 Ang2에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.

구체예에서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄(Heavy chain)의 상보성 결정 부위(complementarity determining region, CDR)로서 다음의 서열번호 49의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 50의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 17 내지 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 17 내지 22로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (CDR-H3)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다:

X₁-Y-X₂-M-S (서열번호 49)

X₃-I-X₄-X₅-X₆-X₇-X₈-X₉-X₁₀-Y-Y-A-D-S-V-K-G(서열번호 50)

상기 서열번호 49에서,

X₁은 아스파르트산 (D), 세린(S), 또는 아스파라진(N), 예컨대, 아스파르트산 (D) 또는 아스파라진(N)이고,

X₂는 알라닌(A), 아스파르트산(D), 또는 타이로신(Y)이며,

상기 서열번호 50에서,

X₃은 알라닌(A), 글라이신(G), 류신(L), 또는 세린(S)이고, 예컨대, 알라닌(A), 글라이신(G), 또는 세린(S)이고,

X₄는 타이로신(Y) 또는 세린(S)이며,

X₅는 프롤린(P), 히스티딘(H), 또는 세린(S)이고,

X₆는 아스파르트산 (D), 글라이신(G), 또는 세린(S)이며,

X₇는 세린(S), 글라이신(G), 또는 아스파르트산(D)이며,

X₈은 글라이신(G) 또는 세린(S)이고,

X₉는 아스파라진(N) 또는 세린(S)이며,

X₁₀은 라이신(K), 이소류신(I), 또는 트레오닌(T)이다.

또한, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄(Light chain)의 상보성 결정 부위로서, 다음의 서열번호 51의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L2) 및 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 포함하는 것일 수 있다:

X₁₁-G-S-S-S-N-I-G-X₁₂-N-X₁₃-V-X₁₄ (서열번호 51)

X₁₅-X₁₆-X₁₇-X₁₈-R-P-S (서열번호 52)

X₁₉-X₂₀-W-D-X₂₁-S-L-X₂₂-X₂₃ (서열번호 53)

상기 서열번호 51에서,

X₁₁은 세린(S) 또는 트레오닌(T)이고,

X₁₂는 아스파라진(N) 또는 세린(S)이며,

X₁₃은 알라닌(A), 타이로신(Y), 또는 아스파르트산(D)이고,

X₁₄는 아스파라진(N), 세린(S), 트레오닌(T), 또는 타이로신(Y)이며,

상기 서열번호 52에서,

X₁₅는 알라닌(A) 또는 세린(S)이고,

X₁₆은 아스파르트산(D) 또는 아스파라진(N)이며,

X₁₇은 세린(S) 또는 아스파라진(N), 예컨대 세린(S)이고,

X₁₈은 아스파라진(N), 라이신(K), 히스티딘(H), 또는 글루타민(Q)이며,

상기 서열번호 53에서,

X₁₉는 글라이신(G) 또는 알라닌(A)이고,

X₂₀은 세린(S), 알라닌(A), 또는 트레오닌(T), 예컨대 세린(S) 또는 트레오닌(T)이며,

X₂₁은 타이로신(Y), 또는 아스파르트산(D), 예컨대 타이로신(Y)이고,

X₂₂는 세린(S) 또는 아스파라진(N), 예컨대 세린(S)이며,

X₂₃은 글라이신(G) 또는 알라닌(A)이다.

구체예에서, 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 앞서 설명한 중쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 상보성 결정 부위, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.

보다 구체적으로, 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은

서열번호 49의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 50의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H2) 및 서열번호 17 내지 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 17 내지 22로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 중쇄 가변 부위;

서열번호 51의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L2) 및 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 경쇄 가변 부위;

상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위 및 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위의 조합; 또는

상기 중쇄 가변 부위와 경쇄 가변 부위의 조합

을 포함하는 것일 수 있다.

구체적으로, 항 Ang2 항체의 중쇄 CDR은 예컨대 다음의 표 1의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

중쇄 CDR 아미노산 서열
CDRH1-KABAT	CDRH2-KABAT	CDRH3-KABAT
DYAMS(서열번호1)	AIYPDSGNKYYADSVKG(서열번호9)	ARHSSDPKVKSGYYDDGMDV(서열번호17)
DYYMS(서열번호2)	GIYPSGGSTYYADSVKG(서열번호10)	ARDPSTLTYAGFDY(서열번호18)
NYAMS(서열번호3)	AISSGGGNIYYADSVKG(서열번호11)	AKSGIQPSPPSMSSAYAMDV(서열번호19)
DYAMS(서열번호4)	SIYPDDGNTYYADSVKG(서열번호12)	ARHTSHHTSIDGYYYYGMDG(서열번호20)
DYDMS(서열번호5)	SISHGDSNKYYADSVKG(서열번호13)	AKSSGIQESPPTYYYYGMDV(서열번호21)
DYAMS(서열번호6)	SIYPDDGNTYYADSVKG(서열번호14)	AKHPVRLNLHPMYYYYGMDV(서열번호22)
SYDMS(서열번호7)	LISPDSSSIYYADSVKG(서열번호15)	AKDLISFWRGGFDY(서열번호23)
DYDMS(서열번호8)	GISSDDGNTYYADSVKG(서열번호16)	ARPTIDKYTLRGYYSYGMDV(서열번호24)

또한 항 Ang2 항체의 경쇄 CDR은 예컨대 다음의 표 2의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.

경쇄 CDR 아미노산 서열
CDRL1-KABAT	CDRL2-KABAT	CDRL3-KABAT
SGSSSNIGNNAVN(서열번호25)	ADSNRPS(서열번호33)	GSWDYSLSG(서열번호41)
SGSSSNIGNNYVT(서열번호26)	ADSHRPS(서열번호34)	ATWDYSLSG(서열번호42)
SGSSSNIGNNDVY(서열번호27)	ANSHRPS(서열번호35)	GTWDYSLSG(서열번호43)
TGSSSNIGNNDVS(서열번호28)	SDSKRPS(서열번호36)	GSWDYSLSG(서열번호44)
SGSSSNIGSNAVN(서열번호29)	ADSNRPS(서열번호37)	GSWDYSLSG(서열번호45)
TGSSSNIGNNAVS(서열번호30)	SDSQRPS(서열번호38)	ATWDYSLSA(서열번호46)
SGSSSNIGSNYVN(서열번호31)	SDSHRPS(서열번호39)	GAWDDSLSG(서열번호47)
TGSSSNIGSNYVS(서열번호32)	SDNKRPS(서열번호40)	GTWDDSLNG(서열번호48)

구체적으로, 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,

서열번호 1 내지 8 중에서 선택된 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 1 내지 6 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 9 내지 16 중에서 선택된 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 9 내지 14 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 17 내지 24 중에서 선택된 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 17 내지 22 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H3)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위 또는 이를 포함하는 중쇄 가변 부위;

서열번호 25 내지 32 중에서 선택된 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 25 내지 30 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 33 내지 40 중에서 선택된 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 33 내지 38 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 41 내지 48 중에서 선택된 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 41 내지 46 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L3)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위 또는 이를 포함하는 경쇄 가변 부위;

상기 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위의 조합

을 포함하는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 54 내지 61로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 54 내지 59로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 부위는 서열번호 62 내지 69로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 62 내지 67로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것이 수 있다.

따라서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 54 내지 61로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 54 내지 59로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위; 서열번호 62 내지 69로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 62 내지 67로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위; 또는 상기 중쇄 가변 부위와 경쇄 가변 부위의 조합을 포함하는 것일 수 있다.

또 다른 예에서, 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,

서열번호 7 또는 8의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 15 또는 16의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 23 또는 24의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H3)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위 또는 이를 포함하는 중쇄 가변 부위;

서열번호 31 또는 32의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 39 또는 40의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 47 또는 48의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L3)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위 또는 이를 포함하는 경쇄 가변 부위;

상기 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위의 조합

을 포함하는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 중쇄 가변 부위는 서열번호 60 또는 61의 아미노산 서열을 포함하고, 상기 경쇄 가변 부위는 서열번호 68 또는 69의 아미노산 서열을 포함하는 것이 수 있다.

따라서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 60 또는 61의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위; 서열번호 68 또는 69의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위; 또는 상기 중쇄 가변 부위와 경쇄 가변 부위의 조합을 포함하는 것일 수 있다.

일 예에서, 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,

서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 부위;

서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위;

상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는

상기 중쇄 가변 부위 및 상기 경쇄 가변 부위의 조합

을 포함하는 것일 수 있다.

상기 항 VEGF-C의 각각의 CDR의 아미노산 서열을 아래의 표 3에 정리하였다.

	중쇄 CDR		경쇄 CDR
CDR-H1	SYDMS(서열번호 89)	CDR-L1	SGSSSNIGSNNVS(서열번호 92)
CDR-H2	AISYDNGSTYYADSVKG(서열번호 90)	CDR-L2	YNSHRPS(서열번호 93)
CDR-H3	ARDPYLARLNTFDY(서열번호 91)	CDR-L3	ATWDSSLNG(서열번호 94)

예컨대, 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위, 서열번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.

<서열번호 95: 항 VEGF-C 항체의 중쇄 가변 부위>

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSAISYDNGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPYLARLNTFDYWGQGTLVTVSS

　　(상기 서열에서 굵은 글씨로 표시한 부분이 CDR 부위이며, 순서대로 CDR-H1, CDR-H2, 및 CDR-H3이다)

<서열번호 96: 항 VEGF-C 항체의 경쇄 가변 부위>

QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNNVSWYQQLPGTAPKLLIYYNSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDSSLNGYVFGGGTKLT

(상기 서열에서 굵은 글씨로 표시한 부분이 CDR 부위이며, 순서대로 CDR-L1, CDR-L2, 및 CDR-L3이다)

본 발명에서 "항체"라 함은, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 또한 본 발명에서 항체란 항원 결합능을 보유한 항체의 항원 결합 단편도 포함한다. 　한편, "상보성　결정 영역 (Complementarity-determining regions, CDR)"라 함은, 항체의 가변 영역 중에서 항원과의 결합 특이성을 부여하는 부위를 의미한다. 앞서 설명한 항체의 항원 결합 단편은 상기 상보성 결정 영역을 하나 이상 포함하는 항체 단편, 예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편 및 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편에서 앞서 정의한 중쇄 CDR 및 경쇄 CDR 부위, 또는 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위를 제외한 나머지 부위는 모든 서브타입의 면역글로불린(예컨대, IgA, IgD, IgE, IgG (IgG1, IgG2, IgG3, IgG4), IgM, 등)으로부터 유래한 것일 수 있고, 예컨대, 상기 모든 서브타입의 면역글로불린의 경쇄 불변 부위 및/또는 중쇄 불변 부위로부터 유래한 것일 수 있다.

원하는 항원을 피면역 동물에게 면역시켜 생산하는 동물 유래 항체는 일반적으로 치료 목적으로 인간에 투여 시 면역거부반응이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반응을 억제하고자 키메릭 항체(chimeric antibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항-아이소타입(anti-isotype) 반응의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물 유래 항체에 비하여 항-아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나, 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변 영역에 존재하고 있어 잠재적인 항-이디오타입(anti-idiotypic) 반응에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체(humanized antibody)이다. 이는 키메릭 항체의 가변 영역 중 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR(complementaritiy determining regions) 부위를 인간 항체 골격(framework)에 이식하여 제작된다.

인간화 항체를 제작하기 위한 CDR 이식(grafting) 기술에 있어서 가장 중요한 것은 동물 유래 항체의 CDR 부위를 가장 잘 받아들일 수 있는 최적화된 인간 항체를 선정하는 것이며, 이를 위하여 항체 데이터베이스의 활용, 결정구조(crystal structure)의 분석, 분자모델링 기술 등이 활용된다. 그러나, 최적화된 인간 항체 골격에 동물 유래 항체의 CDR 부위를 이식할지라도 동물 유래 항체의 골격에 위치하면서 항원 결합에 영향을 미치는 아미노산이 존재하는 경우가 있기 때문에, 항원 결합력이 보존되지 못하는 경우가 상당수 존재하므로, 항원 결합력을 복원하기 위한 추가적인 항체 공학 기술의 적용은 필수적이라고 할 수 있다.

본 발명에서 항체는 동물 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체를 모두 포함한다. 구체적으로, 상기 항체는 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다. 완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.

용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_H 및 3개의 불변 영역 도메인 C_H1, C_H2 및 C_H3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 V_L 및 불변 영역 도메인 C_L을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.

용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.

상기 "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv)₂, scFv-Fc, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂일 수 있으나, 이에 한정하지 않는다.

본 발명에서의 항체의 항원 결합 단편은 상기 상보성 결정 영역을 하나 이상 포함하는 항체 단편, 예컨대, scFv, (scFv)2, scFv-Fc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것일 수 있다.

상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변 부위와 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(C_H1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다.

Fab'는 중쇄 C_H1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')₂ 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다.

Fv는 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변 부위와 경쇄 가변 부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 부위와 단쇄의 가변 부위가 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 펩타이드 링커는 앞서 설명한 바와 같을 수 있으며, 예컨대, 1 내지 100개, 예컨대 2 내지 50개 또는 5 내지 25개 아미노산 길이의 것일 수 있으며, 그 포함된 아미노산 종류는 제한이 없다.

상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')₂단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.

용어 "힌지 영역(hunge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며, 항체 내 항원 결합 부위의 유연성(flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다.

동물 유래 항체가 키메릭화(chimerization) 과정을 거치게 되면, 동물 유래의 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지로 치환되지만, 동물 유래 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지에 비하여 그 길이가 짧고, 두 개의 중쇄 사이의 이황화결합(disulfide bond)이 3개에서 2개로 감소하여 힌지의 경직성(rigidity)이 서로 상이한 효과를 보이게 된다. 따라서, 힌지 영역의 변형(modification)은 인간화 항체의 항원 결합 효율성을 증가시킬 수 있다. 상기 힌지 영역의 아미노산 서열을 변형시키기 위한 아미노산의 결실, 부가 또는 치환 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.

상기 항 Ang2　항체 및/또는 항 VEGF-C 항체는 단클론항체일 수 있다. 단클론항체는 당 업계에 널리 알려진 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대, phage display 기법을　이용해서 제조될 수 있다

한편, 전형적인 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 포맷을 이용하여 Ang2와의 결합능에 기초하여 개별 단클론항체들을 스크리닝할 수 있다. 결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적　ELISA(Competitive ELISA)와 같은 기능성 분석　또는 세포-기반 분석(cell-based assay)과 같은 기능성 분석을 통해 저해 활성에 대해 검정할 수 있다. 그런 다음 강한 저해 활성에 기초하여 선택된 단클론항체 멤버들에 대해 Ang2에 대한 각각의 친화도(Kd values)를 검정한다.

구체예에서, 상기 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체는 항 VEGF-C 항체, 및 상기 항 VEGF-C 항체의 C 말단에 연결된 항 Ang2 항체의 항원 결합 단편, 즉, scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂, 예컨대 scFv를 포함하는 것일 수 있다. 상기 항 Ang2 항체의 항원 결합 단편은 Ang2에 대한 결합력을 유지하는 한, 상기 제시된 Ang2에 대한 CDR 중 하나 이상을 포함하는 모든 단편이 사용될 수 있다. 예컨대, 상기 항 Ang2 항체의 scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂는 서열번호 54 내지 서열번호 61로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위와 서열번호 62 내지 서열번호 69로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위를 포함하는 것일 수 있다.

따라서, 한 구체예에서, 상기 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체는 항 VEGF-C항체, 및 상기 항 VEGF-C 항체의 C 말단에 연결된 서열번호 54 내지 서열번호 61로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄가변 부위와 서열번호 62 내지 서열번호 69로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄가변 부위를 포함하는 항 Ang2 항체의 scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂를 포함하는 것일 수 있다.

다른 구체예에서, 상기 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체는 항 Ang2 항체, 및 상기 항 Ang2 항체의 C 말단에 연결된 항 VEGF-C 항체의 scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂, 예컨대 scFv를 포함하는 것일 수 있다. 예컨대, 상기 항 VEGF-C 항체의 scFv, (scFv)₂, Fab, Fab' 또는 F(ab')₂는 VEGF-C에 대한 결합력을 유지하는 한, 상기 제시된 VEGF-C에 대한 CDR 중 하나 이상을 포함하는 모든 단편이 사용될 수 있다.

상기 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체는 Ang2 또는 VEGF-C를 단독으로 저해하는 항체와 비교하여 종양 세포 이동 (migration) 억제, 종양 세포 증식 억제 등의 항암 효과가 우수할 뿐 아니라, Ang2 또는 VEGF-C를 각각 단독으로 저해하는 항체를 병용 투여한 경우와 비교해서도 현저한 상승 효과를 갖는다. 또한, 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체는 Ang2 또는 VEGF-C를 단독으로 저해하는 항체의 단독 투여 또는 병용 투여와 비교하여 투여 용량 및/또는 투여 간격을 줄일 수 있으므로, 상기 약제에 의한 부작용을 감소시킬 수 있다는 이점이 있다. 또한 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체는 기존의 Ang2 억제제 (예컨대, 항 Ang2 항체) 또는 VEGF-C 억제제 (예컨대, 항 VEGF-C 항체)에 대하여 내성을 갖는 암 종류 또는 개별 환자에도 소망하는 효과를 나타낼 수 있다.

다른 예는 상기 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체를 포함하는 약학 조성물을 제공한다.

구체적으로, 일 예는 상기 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체를 유효성분으로 포함하는 Ang2 및/또는 VEGF-C와 관련된 질병의 예방 및/또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.

다른 예는 상기 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체의 약학적 유효량을 환자에게 투여하는 단계를 포함하는 Ang2 및/또는 VEGF-C와 관련된 질병의 예방 및/또는 치료 방법을 제공한다. 상기 환자는 Ang2 및/또는 VEGF-C와 관련된 질병의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자일 수 있다. 상기 암의 예방 및/또는 치료 방법은 상기 투여하는 단계 이전에 암의 예방 및/또는 치료를 필요로 하는 환자를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.

또 다른 예는 상기 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체의 암의 예방 및/또는 치료를 위한 용도가 제공된다.

상기 Ang2 및/또는 VEGF-C와 관련된 질병은 Ang2/Tie2 신호전달체계와 VEGF-C/VEGFR 신호전달체계가 관여하는 질병으로, Ang2 및/또는 VEGF-C의 과다 활성화 또는 과생성(과발현) 또는 작용 이상에 의하여 유발되는 질병을 의미할 수 있다. 예컨대, 상기 Ang2 및/또는 VEGF-C와 관련된 질병은 암; 암 전이; 암침윤/침습; 황반변성 (예컨대, 연령 관련 황반변성), 당뇨병성 망막병증 등의 안구질환; 건선, 류마티스성 관절염, 만성 염증, 패혈증 등의 염증성 질환; 말라리아 등이 있다.

상기 암은 고형암 또는 혈액암일 수 있고, Ang2 및/또는 VEGF-C를 분비하는 암일 수 있다. 상기 암은, 예컨대, 이에 제한되지 않지만, 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암, 골육종 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 상기 암은 원발성 암뿐 아니라 전이성 암도 포함한다.

상기 약학적 조성물 또는 방법에 있어서, 상기 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체의 약학적 유효량은, 약학적으로 허용되는 담체, 희석제, 및 부형제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상의 첨가제와 함께 제공될 수 있다.

상기 약학적으로 허용되는 담체는, 항체의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학적 조성물은 상기 성분들 이외에 약학적 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.

상기 약학적 조성물, 상기 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체는 경구 또는 비경구로 투여될 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화 되어야 한다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.

상기 약학적 조성물 또는 상기 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체의 적절한 투여량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 상기 조성물의 바람직한 투여량은 성인 기준으로 0.001 내지 100mg/kg 범위 내이다. 예컨대, 상기 약학적 조성물 또는 상기 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체의 1일 투여량은 0.001 내지 1000mg/kg, 구체적으로 0.01 내지 100mg/kg, 보다 구체적으로 0.1 내지 50mg/kg범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.

용어 "약학적 유효량"은 상기 유효성분(즉, 상기 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체)이 소망하는 효과, 즉 암을 예방 및/또는 치료하는 효과를 나타낼 수 있는 양을 의미하며, 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다.

상기 약학적 조성물은 당해 당업자가 용이하게 실시할 수 있는 방법에 따라, 약학적으로 허용되는 담체 및/또는 부형제를 이용하여 제제화함으로써 단위 용량 형태로 제조되거나 또는 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다. 이때 제형은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 형태일 수도 있으며, 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.

또한, 상기 약학적 조성물은 개별 치료제로 투여되거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고, 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있다.

한편, 상기 약학적 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다. 독소루비신과 같은 화학치료제가 추가로 리포좀 내에 포함될 수 있다.

상기 약학적 조성물 또는 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체의 투여 대상 또는 상기 예방 및/또는 치료 방법의 대상 환자는 인간, 원숭이 등의 영장류, 또는 래트, 마우스 등의 설치류 등을 포함하는 포유류 또는 이들로부터 유래하는 세포, 조직 등으로 이루어진 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

또 다른 예는 상기 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체를 포함하는 Ang2 및/또는 VEGF-C 검출용 조성물 및 Ang2 및/또는 VEGF-C 관련 질병의 진단용 약학 조성물을 제공한다. 또 다른 예에서, 생물 시료에 상기 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체를 처리하는 단계; 및 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계를 포함하는 Ang2 및/또는 VEGF-C 검출 방법, 및 Ang2 및/또는 VEGF-C 관련 질병의 진단 방법 또는 진단에 정보를 제공하는 방법을 제공한다. 상기 검출 방법, 진단 방법 또는 진단에 정보를 제공하는 방법은, 상기 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계 이후에, 항원-항체 반응이 탐지되는 경우, 상기 생물 시료에 Ang2 및/또는 VEGF-C가 존재하는 것으로 판단하는 단계 또는 상기 생물 시료가 유래하는 환자가 Ang2 및/또는 VEGF-C 관련 질병을 갖는 것으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 상기 생물 시료는 환자로부터 얻어진(분리된) 세포, 조직, 체액(예컨대, 혈청), 또는 이들의 배양물 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다. 상기 검출 또는 진단 대상 환자는 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등을 포함하는 포유류일 수 있다.

상기 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 수행할 수 있다. 예컨대, 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 검출을 통하여 하여 측정될 수 있으며, 구체적으로, 면역크로마토그래피(Immunochromatography), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry), 효소결합 면역흡착 분석(enzyme linked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA), 웨스턴블라팅(Western blotting) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.

본 발명의 항 VEGF-C/항 Ang2 이중항체는 Ang2/Tie2 신호전달의 저해제와 VEGF-C/HGF 신호전달의 저해제의 두 가지 특성을 모두 갖춘 치료제로써, 다음과 같은 효과를 갖는다:　

1. Ang2/Tie2 저해제와 HGF/VEGF-C 저해제 단독 투여 시보다 효능 증진, 투여 농도 감소.

2. Ang2/Tie2 저해제와 HGF/VEGF-C 저해제 병용 투여 시보다 투여 농도 감소.

3. 원발성 암뿐 아니라 전이성 암의 치료제로 사용

4. 암 이외의 Ang2/Tie2 신호전달체계와 VEGF-C/VEGFR 신호전달체계가 관여하는 다른 질병에의 응용

도 1은 일 실시예에 따른 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체의 구조를 보여주는 모식도이다.
도 2는 일 실시예에 따른 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체 처리시의 세포 증식 정도를 보여주는 그래프이다.
도 3은 일 실시예에 따른 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체 처리시의 세포 이동 정도를 보여주는 그래프이다.

이하 하기의 실시예를 본 발명을 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 하나 이상의 구체예를 예시적으로 설명하기 위한 것일 뿐이며, 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 항- Ang2 항체의 제조

1.1. Ang2 -결합 scFv 클론의 제조

인간 Ang2 폴리펩타이드(R&D systems; Human Ang2; Accession # O15123(hAng2); 서열번호 70)에 대하여 파지 디스플레이 scFv 라이브러리(이화여대 산학협력단으로부터 입수)를 사용하여 완전 인간 Ang2 항체를 제작하였다. 구체적 프로토콜은 다음과 같다.

상기 Ang2 폴리펩타이드를 맥시소프 이뮤노튜브에 각각 약 10 ug(microgram)/ml, 1 ug/ml 및 0.1 ug/ml의 양으로 평판하여 1차, 2차, 3차 패닝을 통하여 ANG2 에 반응하는 항체를 enrich 시키는 과정을 수행하였다. PBS 에 용해된 약 3%(v/v)의 우유를 사용하여 이뮤노튜브의 표면을 차단시킨 후, 약 0.5ml의 3%(v/v) 우유에 상기 기재된 동일한 파지 디스플레이 scFv 라이브러리로부터 유래하는 약 1x10¹²개의 파지 입자를 넣고 함께 37℃로 1시간 동안 항온 처리하여 blocking 하였다. 그 후 Ang2 로 평판된 이뮤노튜브에 우유로 blocking 한 파지를 넣고 실온에서 1 시간 동안 항온 처리 하여 Ang2 와 파지를 결합시켰다.

파지의 항온 처리 후, 파지 표면을 PBS 와 약 0.1%(v/v) 트윈 20으로 3 내지 5 회 세척한 후,　100 mM 트리에탄올아민을 사용하여 결합된 파지를 용출시켰다. 용출된 파지를 E. coli ER2537 세포(New England Biolabs,. USA) 내로 감염시키고 증폭시킨 뒤 수득하여 다음 단계인 스크리닝에 사용하기 위하여 준비하였다. 이러한 과정을 상기 Ang2 폴리펩타이드를 맥시소프 이뮤노튜브에 각각 약 10 ug/ml, 1 ug/ml 및 0.1 ug/ml의 양으로 평판하여 3회 반복 실시 후에, 하기 기재한 바와 같이 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 친화 검정(실시예 1.2 참조) 을 사용하여 측정한 인간 Ang2(Accession # O15123), 마우스 Ang2(Accession # NP_031452Ang2Ang2)를 인식하는 약 600개의 특정한 Ang2-결합 scFv 클론을 확인하였다.

1.2. 항- Ang2 항체 생산 클론　선별 및 항체 정제

ELISA 포맷을 이용하여 Ang2와의 결합능에 기초하여, 상기 실시예 1.1에서 얻어진 약 600개의 Ang2-결합 scFv 클론들로부터 항-Ang2 항체를 생산하는 70 개의 클론들을　선별하였다. 구체적으로, Ang2에 결합하고 Tie2 결합을 억제할 수 있는 클론 중에서 ELISA OD 가 높은 클론들을 선별하였다. 그런 다음, 각각의 클론들을 OD 600=1.0 수준까지 ampicillin 이 첨가된 SB Media 에서 배양하여 1 mM IPTG(Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside) 주입 후 주변 세포질(periplasm) 분획을 모아 NI-NTA 칼럼(QIAGEN)을 이용하여 항-Ang2 단클론항체를 부분 정제하였다.

1.3. Ang2 : Tie -2 중화( neutralization ) ELISA (경쟁적 ELISA ; Competitive ELISA )

결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적 ELISA를 수행하였다. 96-웰의 MaxiSorp™ flat-bottom 플레이트 (Nunc)를 4　ug/ul의　인간 IgG1의 Fc를 결합시킨 단백질인 hTie2-Fc(R&D Systems)로 코팅하였다. 그런 다음, 0.05%(v/v) Tween-20이 포함된 PBS(Phosphate Buffer Saline)로 상기 플레이트를 5회 씻은 후, 1%(v/v) BSA(Bovine serum albumin; Sigma)가 함유된 PBS로 상온에서 2시간 동안 블로킹시켰다.

Ang2:Tie-2 neutralization ELISA를 수행하기 위하여, 상기 실시예 2에서 정제된 각각의 scfv 형태의 항-Ang2 항체(1, 10, 100, 1000 nM)를 1%(v/v)의 BSA와 400 ng/ml 의 FLAG-Tagging 된 hAng2와 함께 상기 hTie2-Fc가 코팅된 플레이트의 각각의 웰에 넣어 준 후,　상기 플레이트를 상온에서 2시간 반응시켰다. 그런 다음, 상기 플레이트를 0.05 %의Tween-20이 포함된 PBS로 5회 씻어준 후, HRP 가 Conjugation 된 항-FLAG　항체(SIGMA)를 1%(v/v)의 BSA가 함유된 PBS로 1:5,000 비율(v/v)로 희석하여 각 웰에 100 ul(microliter)의 양으로 넣어주고 상온에서　1시간 반응시킨 후, 0.1%(v/v)의 Tween-20이 함유된 PBS로 5회 씻어 주었다. 마지막으로 상기 플레이트의 각 웰에 100 ul(microliter)의 TMB 기질 (cell signal)을 첨가하여 실온 ℃에서 3분 동안 발색반응을 유도시켰다. 이후, 5N H₂SO₄ 용액 50 ul로 반응을 중지시키고, OD450 값을 플레이트 리더(Molecular Devices) 상에서 측정하였다. 이를 통하여 Ang2:Tie-2의 결합력의 50% 저해 농도(50% inhibition concentration, IC50)를 구하여, 아래의 표 4에 나타내었다.

항체 명칭	Ang2:Tie-2 결합에 대한 50% 저해 농도 (IC50, nM)
SAIT-ANG2-AB-2-E6	18.9
SAIT-ANG2-AB-4-H10	24.3
SAIT-ANG2-AB-8-A5	36.3
SAIT-ANG2-AB-7-C9	39.7
SAIT-ANG2-AB-3-D3	9.9
SAIT-ANG2-AB-4-C11	6.5
SAIT-ANG2-AB-4-F5	10
SAIT-ANG2-AB-4-F11	6.6

상기 표 4에서와 같이,　항-Ang2 항체가 Ang2와 Tie-2수용체 간의 결합력을 중화(neutralization)시킬 수 있음을 확인하였다.

1.4. hAng2 , mAng2 , 의 결합 ELISA

상기 제작된 항체의 각각의 항원들에 대한 결합력을 측정하기 위한 ELISA를 수행하였다. 96-웰의 MaxiSorp™ flat-bottom 플레이트 (Nunc)를 5~20　ug/ml의　인간 Ang2, 마우스 Ang2(Mouse Ang2; Accession # NP_031452) (이상, R&D Systems)로 코팅하였다. 그런 다음, 0.05%(v/v) Tween-20이 포함된 PBS로 플레이트를 5회 씻은 후, 1%(v/v) BSA가 함유된 PBS로 상온에서 2시간 동안 블로킹시켰다. 상기 제작된 각각의 scFv 형태의 항-Ang2 항체를 상기 플레이트의 각각의 웰에 넣어 준 후,　플레이트를 상온에서 2시간 반응시켰다.

그런 다음, 0.05%(v/v)의Tween-20이 포함된 PBS로 5회 씻어준 후, HRP 가 Conjugation 된 항-HA(HA-probe Antibody (F-7) HRP conjugated)　항체 (Santacruz)를 1%(v/v)의 BSA가 함유된 PBS로 1:1,000 비율(v/v)로 희석하여 상기 플레이트의 각 웰에 50 ul의 양으로 넣어주고, 상온에서　1시간 반응시킨 후, 0.1%(v/v)의 Tween-20이 함유된 PBS로 5회 씻어 주었다. 마지막으로 상기 플레이트의 각 웰에 100 ul TMB 기질 (cell signal)을 첨가하여 실온에서 3분 동안 발색반응을 유도시켰으며, 이후, 이후, 5N H₂SO₄ 용액 50ul로 반응을 중지시키고, OD450 값을 플레이트 리더(Molecular Devices) 상에서 측정하였다. 이를 통하여 인간 Ang2 및 마우스 Ang2 단백질에 대한 50% 결합　농도(Kd)를 구함으로써 항-Ang2 항체가 각각의 단백질에 대한 결합력 정도를 측정하였다. 상기 얻어진 결과를 하기 표 5에 나타내었다:

항체 명칭	인간 Ang2 (Kd, nM)	마우스 Ang2 (Kd, nM)
SAIT-ANG2-AB-2-E6	9.3	5.1
SAIT-ANG2-AB-4-H10	5.3	15.8
SAIT-ANG2-AB-8-A5	5.3	11.7
SAIT-ANG2-AB-7-C9	3.8	8.7
SAIT-ANG2-AB-3-D3	4.3	37.8
SAIT-ANG2-AB-4-C11	4.9	28.6
SAIT-ANG2-AB-4-F5	12.1	23.8
SAIT-ANG2-AB-4-F11	3	20.7

1.6. 항- Ang2 인간　항체 유전자 클로닝

상기 상체 선별 결과물로부터 얻어진 각각의 항체 생산 E. coli glycerol stock으로부터　써모사이클러(GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystem)를 사용하여 각 클론들에서 생산되는 단클론항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역(variable region) 유전자 서열을　증폭시켰다:

PCR 조건

94℃에서 5분간;

[94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분]x 30　사이클;

72℃에서 6분간;

4℃로 냉각

프라이머: pC3X-f: 3'- GCACGACAGGTTTCCCGAC-5' (서열번호 87), pC3X-b: 3'-AACCATCGATAGCAGCACCG-5'(서열번호 88).

각 반응으로부터 얻어진 PCR 산물을 제조업자의 프로토콜에 따라 QIAquick Multiwell PCR Purification kit(Qiagen)으로 세정하였다.

상기 확보된 PCR 결과물들을 클로닝한 후 공시된 방법으로 DNA 염기서열분석(Sequencing)을 수행하였다. 그 결과 아래의 표 6내지 표 8에 나타난 CDR 서열 및 가변부위들을 확보할 수 있었다.

	중쇄 CDR 아미노산 서열
항체명칭	CDRH1-KABAT	CDRH2-KABAT	CDRH3-KABAT
SAIT-ANG2-AB-2-E6	DYAMS (서열번호1)	AIYPDSGNKYYADSVKG (서열번호9)	ARHSSDPKVKSGYYDDGMDV (서열번호17)
SAIT-ANG2-AB-8-A5	DYYMS (서열번호2)	GIYPSGGSTYYADSVKG (서열번호10)	ARDPSTLTYAGFDY (서열번호18)
SAIT-ANG2-AB-7-C9	NYAMS (서열번호3)	AISSGGGNIYYADSVKG (서열번호11)	AKSGIQPSPPSMSSAYAMDV (서열번호19)
SAIT-ANG2-AB-4-C11	DYAMS (서열번호4)	SIYPDDGNTYYADSVKG (서열번호12)	ARHTSHHTSIDGYYYYGMDG (서열번호20)
SAIT-ANG2-AB-4-F5	DYDMS (서열번호5)	SISHGDSNKYYADSVKG (서열번호13)	AKSSGIQESPPTYYYYGMDV (서열번호21)
SAIT-ANG2-AB-4-F11	DYAMS (서열번호6)	SIYPDDGNTYYADSVKG (서열번호14)	AKHPVRLNLHPMYYYYGMDV (서열번호22)
SAIT-ANG2-AB-4-H10	SYDMS (서열번호7)	LISPDSSSIYYADSVKG (서열번호15)	AKDLISFWRGGFDY (서열번호23)
SAIT-ANG2-AB-3-D3	DYDMS (서열번호8)	GISSDDGNTYYADSVKG (서열번호16)	ARPTIDKYTLRGYYSYGMDV (서열번호24)

	경쇄 CDR 아미노산 서열
항체명칭	CDRL1-KABAT	CDRL2-KABAT	CDRL3-KABAT
SAIT-ANG2-AB-2-E6	SGSSSNIGNNAVN (서열번호25)	ADSNRPS (서열번호33)	GSWDYSLSG (서열번호41)
SAIT-ANG2-AB-8-A5	SGSSSNIGNNYVT (서열번호26)	ADSHRPS (서열번호34)	ATWDYSLSG (서열번호42)
SAIT-ANG2-AB-7-C9	SGSSSNIGNNDVY (서열번호27)	ANSHRPS (서열번호35)	GTWDYSLSG (서열번호43)
SAIT-ANG2-AB-4-C11	TGSSSNIGNNDVS (서열번호28)	SDSKRPS (서열번호36)	GSWDYSLSG (서열번호44)
SAIT-ANG2-AB-4-F5	SGSSSNIGSNAVN (서열번호29)	ADSNRPS (서열번호37)	GSWDYSLSG (서열번호45)
SAIT-ANG2-AB-4-F11	TGSSSNIGNNAVS (서열번호30)	SDSQRPS (서열번호38)	ATWDYSLSA (서열번호46)
SAIT-ANG2-AB-4-H10	SGSSSNIGSNYVN (서열번호31)	SDSHRPS (서열번호39)	GAWDDSLSG (서열번호47)
SAIT-ANG2-AB-3-D3	TGSSSNIGSNYVS (서열번호32)	SDNKRPS (서열번호40)	GTWDDSLNG (서열번호48)

항체 명칭	중쇄가변영역 아미노산 서열	경쇄가변영역 아미노산 서열
SAIT-ANG-2-AB-2-E6	EVQLLESGGGLVQTGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSAIYPDSGNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHSSDPKVKSGYYDDGMDVWGQGTLVAVSS (서열번호 54)	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNAVNWYQQLPGTAPKLLIYADSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG (서열번호 62)
SAIT-ANG-2-AB-8-A5	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYYMSWVRQAPGKGLEWVSGIYPSGGSTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARDPSTLTYAGFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 55)	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNYVTWYQQLPGTAPKLLIYADSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG (서열번호 63)
SAIT-ANG-2-AB-7-C9	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSNYAMSWVRQAPGKGLEWVSAISSGGGNIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSGIQPSPPSMSSAYAMDVWGQGTLVTVSS (서열번호 56)	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGNNDVYWYQQLPGTAPKLLIYANSHRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG (서열번호 64)
SAIT-ANG-2-AB-4-C11	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIYPDDGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARHTSHHTSIDGYYYYGMDGWGQGTLVTVSS (서열번호 57)	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGNNDVSWYQQLPGTAPKLLIYSDSKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG (서열번호 65)
SAIT-ANG-2-AB-4-F5	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDMSWVRQAPGKGLEWVSSISHGDSNKYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKSSGIQESPPTYYYYGMDVWGQGTLVTVSS (서열번호 58)	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNAVNWYQQLPGTAPKLLIYADSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG (서열번호 66)
SAIT-ANG-2-AB-4-F11	EVQLLESGGGLVQTGGSLRLSCAASGFTFSDYAMSWVRQAPGKGLEWVSSIYPDDGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKHPVRLNLHPMYYYYGMDVWGQGTLVTVSS (서열번호 59)	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGNNAVSWYQQLPGTAPKLLIYSDSQRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCATWDYSLSAYVFGGGTKLTVLG (서열번호 67)
SAIT-ANG-2-AB-4-H10	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSSYDMSWVRQAPGKGLEWVSLISPDSSSIYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCAKDLISFWRGGFDYWGQGTLVTVSS (서열번호 60)	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCSGSSSNIGSNYVNWYQQLPGTAPKLLIYADSNRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGSWDYSLSGYVFGGGTKLTVLG (서열번호 68)
SAIT-ANG-2-AB-3-D3	EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFSDYDMSWVRQAPGKGLEWVSGISSDDGNTYYADSVKGRFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYCARPTIDKYTLRGYYSYGMDVWGQGTLVTVSS (서열번호 61)	QSVLTQPPSASGTPGQRVTISCTGSSSNIGSNYVSWYQQLPGTAPKLLIYSDNKRPSGVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYCGTWDDSLNGYVFGGGTKLTVLG (서열번호 69)

1.6. 항 Ang2 scFv 의 제조

상기 실시예 1.5에서 얻어진 CDR 서열 중 4-H10의 CDR을 이용하여 항 Ang2 scFv를 제작하였다. 즉, 서열번호 7의 아미노산 서열 (CDR-H1), 서열번호 15의 아미노산 서열 (CDR-H2), 및 서열번호 23의 아미노산 서열 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄가변영역 (서열번호 60), 서열번호 31 (CDR-L1), 서열번호 39 (CDR-L2), 및 서열번호 47의 아미노산 서열 (CDR-L3)를 포함하는 경쇄가변영역 (서열번호 68), 및 펩타이드 링커 (GGGGSGGGGSGSGGS)를 포함하는 항 Ang2 scFv(서열번호 99)를 합성하였다 (Bioneer).

<서열번호 99; 항 Ang2 scFv>

EVQLLESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTFS SYDMS WVRLAPGKGLEWVS LISPDSSSIYYADSVKG RFTISRDNSKNTLYLQMNSLRAEDTAVYYC AKDLISFWRGGFDY WGQGTLVTVSSGGGGSGGGGSGSGGSQSVLTQPPSASGTPGQRVTISC SGSSSNIGSNYVN WYQQLPGTAPKLLIY SDSHRPS GVPDRFSGSKSGTSASLAISGLRSEDEADYYC GAWDDSLSG YVFGGGTKLTVLGQ

실시예 2. 항 VEGF -C 항체 제조

2.2 VEGF -C-결합 scFv 클론

인간 VEGF-C 폴리펩타이드(R&D systems; Human VEGF-C; Accession # P49767(hVEGF-C))에 대하여 파지 디스플레이 scFv 라이브러리(이화여대 산학협력단으로부터 입수)를 사용하여 완전 인간 VEGF-C 항체를 제작하였다. 구체적 프로토콜은 다음과 같다.

상기 VEGF-C 폴리펩타이드를 맥시소프 이뮤노튜브에 각각 약 10 ug(microgram)/ml, 1 ug/ml 및 0.1 ug/ml의 양으로 평판하여 1차, 2차, 3차 패닝을 통하여 VEGF-C 에 반응하는 항체를 enrich 시키는 과정을 수행하였다. PBS((Phosphate Buffer Saline)에 용해된 약 3%(v/v)의 우유를 사용하여 이뮤노튜브의 표면을 차단시킨 후, 약 0.5 ㎖ 의 3%(v/v) 우유에 상기 기재된 동일한 파지 디스플레이 scFv 라이브러리로부터 유래하는 약 1x10¹²개의 파지 입자를 넣고 함께 37℃로 1시간 동안 항온 처리하여 blocking 하였다. 그 후 VEGF-C 로 평판된 이뮤노튜브에 우유로 blocking 한 파지를 넣고 실온에서 1 시간 동안 항온 처리 하여 VEGF-C 와 파지를 결합시켰다.

파지의 항온 처리 후, 파지 표면을 PBS 와 약 0.1%(v/v) 트윈 20으로 3 내지 5 회 세척한 후,　100 mM 트리에탄올아민을 사용하여 결합된 파지를 용출시켰다. 용출된 파지를 E. coli ER2537 세포(New England Biolabs., USA) 내로 감염시키고 증폭시킨 뒤 수득하여 다음 단계인 스크리닝에 사용하기 위하여 준비하였다. 이러한 과정을 상기 VEGF-C 폴리펩타이드를 맥시소프 이뮤노튜브에 각각 약 10 ug/ml, 1 ug/ml 및 0.1 ug/ml의 양으로 평판하여 3회 반복 실시 후에, 하기 기재한 바와 같이 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 친화 검정(하기 실시예 2.2 참조)을 사용하여 측정한 인간 VEGF-C(Accession # P49767)를 인식하는 약 600개의 특정한 VEGF-C-결합 scFv 클론을 확인하였다.

2.2. 항- VEGF -C 항체 생산 클론　선별 및 항체 정제

ELISA 포맷을 이용하여 VEGF-C와의 결합능에 기초하여, 상기 실시예 1에서 얻어진 약 600개의 VEGF-C-결합 scFv 클론들로부터 항-VEGF-C 항체를 생산하는 20 개의 클론들을　선별하였다. 구체적으로, VEGF-C에 결합하고 VEGF-C와 VEGR-R3와의 결합을 억제할 수 있는 클론 중에서 ELISA OD 가 높은 클론들을 선별하였다. 그런 다음, 각각의 클론들을 OD 600=1.0 수준까지 ampicillin 이 첨가된 SB Media(BD Bioscience)에서 배양하여 1 mM IPTG(Isopropyl-β-D-Thiogalactopyranoside) 주입 후 주변 세포질(periplasm) 분획을 모아 NI-NTA 칼럼(QIAGEN)을 이용하여 scFv 형태의 항-VEGF-C 단클론항체를 부분 정제하였다.

2.3. scFv 형태의 항 VEGF -C 항체를 이용한 VEGF -C: VEGR - R3 중화( neutralization ) ELISA (경쟁적 ELISA ; Competitive ELISA )

상기 실시예 2.2에서 정제된 scFv 형태의 항-VEGF-C 항체의 VEGF-C:VEGR-R3결합 저해 효능을 알아보기 위하여, 결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적 ELISA를 수행하였다. 96-웰의 MaxiSorp™ flat-bottom 플레이트 (Nunc)를 2　ug/ul의　인간 IgG1의 Fc를 결합시킨 단백질인 hVEGR-R3-Fc(R&D Systems. Accession No.P35916)로 코팅하였다. 그런 다음, 0.05%(v/v) Tween-20이 포함된 PBS(Phosphate Buffer Saline)로 상기 플레이트를 5회 씻은 후, 1%(v/v) BSA(Bovine serum albumin; Sigma)가 함유된 PBS로 상온에서 2시간 동안 블로킹시켰다.

VEGF-C:VEGR-R3 neutralization ELISA를 수행하기 위하여, 상기 실시예 2에서 정제된 scFv 형태의 항-VEGF-C 항체(1, 10, 100, 1000 nM)를 1%(v/v)의 BSA와 200 ng/ml 의 FLAG-Tagging 된 hVEGF-C(Accession # P49767)와 함께 상기 hVEGR-R3-Fc가 코팅된 플레이트의 각각의 웰에 넣어 준 후,　상기 플레이트를 상온에서 2시간 반응시켰다. 그런 다음, 상기 플레이트를 0.05 %의Tween-20이 포함된 PBS로 5회 씻어준 후, HRP 가 Conjugation 된 항-FLAG　항체(SIGMA)를 1%(v/v)의 BSA가 함유된 PBS로 1:5,000 비율(v/v)로 희석하여 각 웰에 100 ul(microliter)의 양으로 넣어주고 상온에서　1시간 반응시킨 후, 0.1%(v/v)의 Tween-20이 함유된 PBS로 5회 씻어 주었다. 마지막으로 상기 플레이트의 각 웰에 100 ul(microliter)의 TMB 기질 (cell signal)을 첨가하여 실온 ℃에서 3분 동안 발색반응을 유도시켰다. 이후, 5N H₂SO₄ 용액 50 ul로 반응을 중지시키고, OD450 값을 플레이트 리더(Molecular Devices) 상에서 측정하였다. 이를 통하여 VEGF-C:VEGR-R3의 결합력의 50% 저해 농도(50% inhibition concentration, IC50)를 구하여, 아래의 표 9에 나타내었다.

항체 명칭	VEGF-C:VEGR-R3 결합에 대한 50% 저해 농도 (IC50, nM)
SAIT-VEGFC-AB-4A2	33.36

상기 표 9에서와 같이,　항-VEGF-C 항체가 VEGF-C와 VEGR-R3 간의 결합력을 중화(neutralization)시킬 수 있음을 확인하였다.

2.4. hVEGF -C와의 결합 ELISA

상기 실시예 2에서 정제된 항체의 항원에 대한 결합력을 측정하기 위한 ELISA를 수행하였다. 96-웰의 MaxiSorp™ flat-bottom 플레이트 (Nunc)를 1　ug/ml의　인간 VEGF-C (R&D Systems)로 코팅하였다. 그런 다음, 0.05%(v/v) Tween-20이 포함된 PBS로 플레이트를 5회 씻은 후, 1%(v/v) BSA(Bovine Serum Albumin)가 함유된 PBS로 상온에서 2시간 동안 블로킹시켰다. 상기 실시예 2에서 정제된 scFv 형태의 항-VEGF-C 항체를 상기 플레이트의 각각의 웰에 넣어 준 후,　플레이트를 상온에서 2시간 반응시켰다.

그런 다음, 0.05%(v/v)의Tween-20이 포함된 PBS로 5회 씻어준 후, HRP 가 Conjugation 된 항-HA(HA-probe Antibody (F-7) HRP conjugated)　항체 (Santacruz)를 1%(v/v)의 BSA가 함유된 PBS로 1:1,000 비율(v/v)로 희석하여 상기 플레이트의 각 웰에 50 ul의 양으로 넣어주고, 상온에서　1시간 반응시킨 후, 0.1%(v/v)의 Tween-20이 함유된 PBS로 5회 씻어 주었다. 마지막으로 상기 플레이트의 각 웰에 100 ul TMB 기질 (cell signal)을 첨가하여 실온에서 3분 동안 발색반응을 유도시켰으며, 이후, 5N H₂SO₄ 용액 50ul로 반응을 중지시키고, OD450 값을 플레이트 리더(Molecular Devices) 상에서 측정하였다. 이를 통하여 인간 VEGF-C 단백질에 대한 50% 결합　농도(Kd)를 구함으로써 항-VEGF-C 항체의 상기 단백질에 대한 결합력 정도를 측정하였다. 상기 얻어진 결과를 하기 표 9에 나타내었다:

항체 명칭	인간 VEGF-C (Kd, nM)
SAIT-VEGFC-AB-4A2	26.2

2.　5. 항- VEGF -C 인간　항체 유전자 클로닝

상기 실시예 2.2의 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역(variable region) 유전자 서열을　증폭시켰다 (PC3X Reverse primer: 5'-AAC CAT CGA TAG CAG CAC CG-3', PC3X Forward primer: 5'-GCA CGA CAG GTT TCC CGA C-3'):

PCR 조건

94℃에서 5분간;

[94℃에서 1분, 55℃에서 1분, 72℃에서 2분]x 30　사이클;

72℃에서 6분간;

4℃로 냉각.

상기 확보된 PCR 결과물들을 클로닝한 후 공시된 방법으로 DNA 염기서열분석(Sequencing)을 수행하였다. 그 결과 표 11에 나타난 CDR 및 서열번호 95 (중쇄 가변 영역) 및 서열번호 96 (경쇄 가변 영역)의 아미노산 서열들을 확보할 수 있었다.

2.6. 완전　항체의 발현 및 정제

상기 실시예 2.5에서 얻어진 중쇄 가변 영역 (서열번호 95)을 암호화 하는 염기서열 (서열번호 97)와 경쇄 가변 영역(서열번호 96)을 암호화하는 염기서열 (서열번호 98)을 각각 서로 다른 벡터에 클로닝시켰다.

중쇄 가변 영역은 CMV 프로모터(cytomegalovirus promoter)를 가지고 있으며 인간 IgG1의 불변 영역(constant region)과 Fc 영역을 포함하는 벡터 pOPTI-VAC (Invitrogen)에 클로닝하였다. 경쇄 가변 영역은 CMV 프로모터를 가지고 있으며, 인간 IgG1의 불변 영역을 포함하는 벡터 pFUSE2-CLIg-hl2 (Invivogen)에 클로닝을 하였다.

구체적으로, 상기 중쇄 가변 영역과 그를 포함하는 벡터는 ecorI(neb)와 NheI(neb)의 제한효소(restriction enzyme)를 처리하고, 경쇄 가변 영역과 그를 포함하는 벡터는 ecorI(neb)과 avrII(neb)의 제한 효소를 처리한 후, T4 DNA Ligase(New England Biolab)로 라이게이션(ligation)을 시켜 원하는 가변영역이 포함된 항체 발현용 중쇄 벡터와 경쇄 벡터를 제조하였다.

이렇게 하여 얻어진 중쇄 벡터 및 경쇄 벡터를 293-F　세포(invitrogen)에 같이 트랜스펙션(transfection)시켰다. 상기 세포를 혈청(serum)을 넣지 않은 293-f expression medium (Invitrogen)배지에서 배양시키면서 5 일째 되는 날 배양액을 회수 하였다. 상기　배양을 통해 얻어진 배양액은 서열번호 55 또는 서열번호 56의 가변영역을 갖는 중쇄와 경쇄로 구성된 항체를 포함하였다. 상기 발현된 항체가 함유된 배양액을 1000xg 속도로 10 분간 원심분리하여 잔류 하는 세포 및 불순물을 제거한 후, 항체 Fc 영역과 강한 친화력을 갖는 Protein A(GE-Healthcare)를　이용한 친화도 크로마토그래피(affinity chromatography) 방법으로 low PH elution을 통해 IgG 형태의 항 VEGF-C 항체를 정제하였다.

<서열번호 95: 항 VEGF-C 항체의 중쇄 가변 부위>

<서열번호 96: 항 VEGF-C 항체의 경쇄 가변 부위>

2.7. IgG 형태의 항 VEGF -C 항체를 이용한 VEGF -C: Tie -2 중화( neutralization ) ELISA (경쟁적 ELISA ; Competitive ELISA )

상기 실시예 2.6에서 정제된 IgG 형태의 항-VEGF-C 항체의 VEGF-C:VEGR-R3결합 저해 효능을 알아보기 위하여, 결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적 ELISA를 수행하였다.

96-웰의 MaxiSorp^TM flat-bottom 플레이트 (Nunc)를 2 ug/ul의 인간 IgG1의 Fc를 결합시킨 단백질인 hVEGFR3-Fc(R&D Systems)로 코팅하였다. 그런 다음, 0.05%(v/v) Tween-20이 포함된 PBS(Phosphate Buffer Saline)로 상기 플레이트를 5회 씻은 후, 1%(v/v) BSA(Bovine serum albumin; Sigma)가 함유된 PBS로 상온에서 2시간 동안 블로킹시켰다.

VEGF-R3:VEGF-C neutralization ELISA를 수행하기 위하여, 상기 실시예 6에서 정제된 IgG 형태의 항-VEGF-C 항체(1, 10, 100, 1000 nM)를 1%(v/v)의 BSA와 200 ng/ml 의 FLAG-Tagging 된 VEGF-C와 함께 상기 hVEGFR3-Fc가 코팅된 플레이트의 각각의 웰에 넣어 준 후, 상기 플레이트를 상온에서 2시간 반응시켰다. 　그런 다음, 상기 플레이트를 0.05 %(v/v)의Tween-20이 포함된 PBS로 5회 씻어준 후, HRP 가 Conjugation 된 항-FLAG 항체(SIGMA)를 1%(v/v)의 BSA가 함유된 PBS로 1:5,000 비율(v/v)로 희석하여 각 웰에 100 ul의 양으로 넣어주고 상온에서 1시간 반응시킨 후, 0.1%(v/v)의 Tween-20이 함유된 PBS로 5회 씻어 주었다. 　 마지막으로 상기 플레이트의 각 웰에 100 μl의 TMB 기질 (cell signal)을 첨가하여 실온에서 3분 동안 발색반응을 유도시켰다. 이후, 5N H₂SO₄ 용액 50ul로 반응을 중지시키고, OD450 값을 플레이트 리더(Molecular Devices) 상에서 측정하였다. 이를 통하여 VEGF-C:VEGF-R3의 결합력의 50% 저해 농도(50% inhibition concentration, IC50)를 구하여, 아래의 표 12에 나타내었다.

항체 명칭	VEGF-C:VEGF-R3 결합에 대한 50% 저해 농도 (IC50, nM)
SAIT-VEGFC-AB-4A2	9.2

상기 표 12에서와 같이,　항-VEGF-C 항체가 VEGF-C와 VEGF-R3 간의 결합력을 중화(neutralization)시킬 수 있음을 확인하였다.

실시예 3. 항 VEGF -C/항 Ang2 이중 특이 항체의 제작

상기 실시예 1.6에서 제작된 항 Ang2 scFv (서열번호 99)을 상기 실시예 2.6에서 얻어진 항 VEGF-C 항체 (서열번호 95 및 서열번호 96 포함)의 각 모노머의 C 말단에 각각 연결하여 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체 (tetra complex: 항 Ang2 항체의 중쇄 가변부위 + 항 Ang2 항체의 경쇄 가변부위 + 항 VEGF-C 항체의 중쇄 (서열번호 95의 중쇄 가변 부위 포함) + 항 VEGF-C 항체의 경쇄 (서열번호 96의 경쇄 가변 부위 포함)로 이루어짐)를 제작하였다 (도 1 참조).

이를 위하여, 상기 이중 특이 항체의 중쇄 (항 VEGF-C 항체의 중쇄 + 항 Ang2 scFv로 이루어짐)을 코딩하기 위한 중쇄 코딩 DNA 단편 (서열번호 97)과 경쇄 (항 VEGF-C 항체의 경쇄로 이루어짐)을 코딩하기 위한 DNA 단편 (서열번호 98)을 human embryonic kidney 293F 세포 (invitrogen)에서 2:2의 비율로 발현시키고 Protein A(GE-Healthcare)를　이용한 친화도 크로마토그래피(affinity chromatography) 방법으로 low PH elution을 통해 상기 이중 특이 항체를 정제하였다.

이를 위하여 다음의 과정을 수행하였다.

VEGF-C 인식부위의 아미노산 서열은 앞서 설명한 바와 같이 서열번호 95 및 서열번호 96의 아미노산 서열을 사용하였다. 중쇄 가변부위 (서열번호 95)의 코딩 DNA 단편의 염기서열(서열번호 100)과 경쇄 가변부위 (서열번호 96)의 코딩 DNA 단편의 염기서열(서열번호 101)은 다음과 같다:

<서열번호 100: 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체 중 항 VEGF-C 중쇄 가변 부위 코딩 염기서열>

GACGCCATCCACGCTGTTTTGACCTCCATAGAAGACACCGGGACCGATCCAGCCTCCGGACTCTAGAGGATCGAACCCTTGAATTCGCCGCCACCATGGAATGGAGCTGGGTTTTTCTCGTAACACTTTTAAATGGTATCCAGTGTGAAGTCCAGCTGCTAGAATCTGGGGGGGGCCTGGTCCAGCCTGGTGGATCTCTCAGATTATCCTGTGCCGCAAGCGGATTCACCTTCTCATCTTACGACATGAGTTGGGTGAGGCAAGCCCCAGGCAAGGGCTTGGAGTGGGTGAGCGCGATCTCCTACGACAATGGTAGTACTTACTATGCCGATTCCGTTAAAGGCCGCTTTACGATTAGTAGAGATAACAGCAAGAATACACTGTATTTGCAGATGAACTCCCTGAGAGCAGAGGATACTGCTGTGTACTATTGCGCCAGAGACCCCTATCTGGCTCGGCTGAATACCTTTGACTACTGGGGACAGGGGACACTTGTGACCGTATCAAGCGCTAGCACCAAGGGCCCATCGGTCTTCCCCCTGGCGCCCTGCTCCAGGAGCACCTCCGAGAGCACAGCGGCCCTGGGCTGCCTGGTCAAGGACTACTTCCCCGAACCGGTGACGGTGTCGTGGAACTCAGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACCTTTCCCAGCTGTCCTACAGTCCTCAGGACTCTACTCCCCTCAGCAGCGTGGTGACCGTGCCCTCCAG

<서열번호 101: 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체 중 항 VEGF-C 경쇄 가변 부위 코딩 염기서열>　

GAATTCACTAGTGATTAATTCGCCGCCACCATGGATTCACAGGCCCAGGTCCTCATGTTGCTGCTGCTATCGGTATCTGGTACCTGTGGACAGAGTGTCCTTACCCAGCCCCCATCAGCCTCCGGTACCTGGCCAGAGAGTGACTATAAGCTGCTCTGGATCCTCCTCCAATATCGGAAGCAACAACGTTTCTTGGTACCAGCAACTGCCTGGCACAGCACCTAAGCTGCTCATTTACTATAATTCTCACAGACAGCGGGGTGCCAGACAGATTTTCTGGCTCAAAGTCGGGTACCTCAGCCAGTCTGGCAATCAGCGGGCTGAGATCAGAGGATGAAGCTGATTATTATTGTGCTACCTGGGACAGCAGTCTGAATGGTAGTGTTCGGCGGGGGAACAAAATTGACTGTCCTAGGC

상기 중쇄 가변부위 코딩 DNA 단편은 EcoRI/NheI 제한효소 (NEB)를 이용하고, 경쇄 가변부위 코딩 DNA 단편은 EcoRI/BsiWI 제한효소 (NEB)를 이용하여, pCDNA3.3 vector (Invitrogen)에 들어있는 IgG2 backbone과 kappa light chain에 각각 서브클로닝 하여, 항 VEGF-C항체를 제작하였다.

Ang2 인식부위(4H10으로 표시)는 상기 실시예 1.6에서 제작한 항 Ang2 scFv (서열번호 99)를 사용하였다. 이를 코딩하는 DNA 단편의 염기서열(서열번호 102)은 다음과 같다:

<서열번호 102: 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체 중 항 Ang2 scFv 코딩 염기서열>

GAGGTACAACTGCTGGAGAGTGGAGGAGGTCTCGTCCAGCCGGGAGGGAGCCTAAGATTAAGTTGTGCCGCATCAGGTTTTACATTCAGCAGCTACGATATGAGCTGGGTGAGACTTGCTCCAGGAAAAGGGCTAGAATGGGTTAGCCTGATTTCCCCCGACTCAAGCTCAATCTATTACGCAGATTCTGTGAAGGGCAGATTCACAATAAGCAGGGATAACTCAAAGAATACTCTGTATCTGCAGATGAACAGTCTGAGAGCCGAGGACACAGCCGTGTACTACTGTGCAAAGGACCTGATTTCTTTTTGGCGAGGCGGATTCGACTACTGGGGCCAAGGAACGCTGGTGACCGTTAGCAGCGGGGGAGGCGGAAGTGGAGGCGGCGGTTCAGGCAGCGGCGGGAGCCAGTCTGTGTTGACACAGCCACCTTCGGCCTCCGGTACCCCAGGTCAGCGCGTTACCATCTCATGCTCAGGATCGTCTAGTAATATCGGCAGCAACTACGTCAATTGGTATCAGCAATTGCCCGGGACTGCGCCTAAGCTTTTAATTTATTCCGACAGCCATAGACCTAGCGGCGTCCCCGATAGATTTTCTGGGAGCAAATCTGGGACTAGTGCCTCTCTGGCTATCTCTGGACTGAGAAGCGAAGATGAAGCTGACTATTACTGCGGCGCTTGGGACGACAGCCTTAGCGGATATGTATTCGGTGGGGGTACCAAACTGACCGTGCTGGGACAGGCAGGGCAGCACCACCACCATCATCACGGCGCCTACCCTTATGATGTGCCCGATTATGCCTCT

상기 항 Ang2 scFv 코딩 DNA 단편은 인간 세포에서 생산하도록 최적화하여 합성하였다 (Bioneer).

이렇게 만들어진 항 Ang2 scFv 코딩 DNA 단편은 BamHI/XhoI 제한효소 (NEB)를 이용하여 앞서 제작한 항 VEGF-C 항체의 중쇄 코딩 DNA 단편의 3' 말단에 서브클로닝 하였다. 이 때, 펩타이드 링커 (GGGGSGGGGS)의 코딩 DNA 단편을 사용하여 이들 사이를 연결하였다.

상기 제작된 DNA 단편을 Expi293 cell (Invitrogen)에 트랜스펙션하여 이중항체 단백질을 발현시켰다. MabSelectSuRe column (GE Healthcare)을 이용하여 배양액으로부터 이중항체를 선택적으로 분리하였고, IgG elution buffer (Thermo Scientific) 용액으로 elution 후, 1 M Tris (pH 8.0) 용액 1/20 (v/v)로 중화시킨 후, PBS 용액으로 교체해 주었다.

실시예 4. 항 VEGF -C/항 Ang2 이중 특이 항체의 VEGF -C 및 Ang2 에 대한 친화도

상기 실시예 3에서 제작된 이중 특이 항체의 VEGF-C에 대한 각 친화도를 Biacore T100(GE)을 사용하여 확인하였다. 인간 Fab 결합체(#28-9583-25,GE Healthcare)를 CM5 칩(#BR-1005-30, GE)의 표면에 제조사 설명서에 따라서 고정화시켰다. 약 90~120 RU의 이중 특이 항체를 포획하고, 다양한 농도의 VEGF-C-Fc(#358-MT/CF, R&D Systems)를 상기 포획된 항체에 주입하였다. 그 후, 여기에 10mM Glycine-HCl(pH 1.5) 용액을 주입하여 상기 표면을 재생시켰다(regenerated). 친화도를 측정하기 위하여, 상기 실험에서 얻어진 데이터를 BIAevaluation software(GE Healthcare,Biacore T100 evaluation software)를 사용하여 fitting하였다.

또한, 상기 실시예 3에서 제작된 이중 특이 항체의 Ang2에 대한 결합력을 측정하기 위한 ELISA를 수행하였다. 96-웰의 MaxiSorp^TM flat-bottom 플레이트 (Nunc)를 50ul/well에 1 ug/ul의 인간 Ang2 (R&D Systems)로 코팅하였다. 그런 다음, 0.05% Tween-20이 포함된 PBS (Phosphate Buffer Saline)로 플레이트를 5회 씻은 후, 1% BSA가 함유된 PBS로 상온에서 2시간 동안 블로킹시켰다. 상기 제작된 이중 특이 항체를 각각의 웰에 넣어 준 후, 플레이트를 상온에서 1시간 반응시켰다. 그런 다음, 0.05 %의Tween-20이 포함된 PBS로 5회 씻어준 후, HRP 가 Conjugation 된 항-Human Fc 항체 (Sigma)를 1%의 BSA가 함유된 PBS로 1:5,000 비율로 희석하여 상온에서 1시간 반응시킨 후, 0.1%의 Tween-20이 함유된 PBS로 5회 씻어 주었다. 마지막으로 플레이트 각 웰에 100ul의 TMB 기질 (SIGMA)을 첨가하여 발색반응을 유도시켰으며, 이후, 5N H2SO4용액 50ul로 반응을 중지시키고, OD450 값을 플레이트 리더(Molecular Devices) 상에서 측정하였다. 이를 통해 인간 Ang2 단백질에 대한 50% 결합 농도 (Kd)를 구함으로써 결합력 정도를 측정할 수 있었다.

상기 얻어진 결과를 아래의 표 13에 나타내었다:

	ka(1/Ms)	kd(1/s)	K_D(M)	Chi²(RU²)	U-value	T(ka)	T(kd)
Ang2	1.354x10⁶	5.412x10^-6	3.996x10^-12	1.23	43	2.6x10²	14
VEGF-C	3.923x10⁶	0.001404	3.579x10^-10	0.874	5	1.6x10²	2.4x10²

실시예 5. 항 VEGF -C/항 Ang2 이중 특이 항체의 세포 증식 억제 효과

상기 제작된 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체의 세포 증식 억제 효과를 시험하기 위하여, Cell Counting Kit-8 (CCK-8, supplied by Dojinho Molecular Technologies, Inc. Cat. # CK04-01)를 사용하여 세포 증식 정도를 측정하였다.

림프관내피세포 (LEC; Lonza, CC-2811)를 EGM-2MV 배지 (Lonza)에서 5% CO₂ 및 37℃의 조건 하에서 배양하였다. 세포 증식 분석(Cell proliferation assay)을 위하여, 상기 배양된 세포를 5000cells/well(1% FBS in EBM2)의 농도로 96 웰 플레이트에서 계대배양하면서 실시예 3에서 제작된 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체 60nM를 처리하여 72시간 동안 배양하였다. 이 때, 인간 Ang2 (R&D systems; Accession # O15123(hAng2)) 2ug(microgram)/ml(40nM)와 VEGF-C(P49767) 1ug/ml(30nM)를 함께 처리하였다. 음성 대조군(control)으로 항체를 첨가하지 않은 배지를 사용하고, 양성 대조군으로 항 Ang2 항체 4H10 60nM 단독 처리군, 항 VEGF-C 항체 4A2 (실시예 2.6) 60nM 단독 처리군, 및 항 Ang2 항체 4H10 60nM와 항 VEGF-C 항체 60nM의 병용 처리군을 사용하였다.

상기 항 Ang2 항체 4H10는 상기 실시예 1.6의 표 8에 나타난 중쇄 가변부위(서열번호 60)를 CMV 프로모터(cytomegalovirus promoter) 및 인간 IgG1의 불변영역(constant region)과 및 Fc 영역을 포함하는 벡터 pOPTI-VAC (Invitrogen)에 클로닝하고 (ecorI(neb)와 NheI(neb)의 제한효소 및 T4 DNA Ligase(New England Biolab) 사용), 표 8의 경쇄 가변부위(서열번호 68)를 CMV 프로모터 및 인간 IgG1의 불변 영역을 포함하는 벡터 pFUSE2-CLIg-hl2 (Invivogen)에 클로닝 (ecorI(neb)과 avrII(neb)의 제한 효소 및 T4 DNA Ligase(New England Biolab) 사용)한 후, 상기 얻어진 중쇄 벡터 및 경쇄 벡터를 293-F　세포 (invitrogen)에 같이 트랜스펙션(transfection)시키고, 혈청(serum)을 넣지 않은 293-f expression medium (Invitrogen)배지에서 37℃에서 배양 시키면서 5 일째 되는 날 배양액을 회수 하고, 1000 xg 속도로 10 분간 원심분리하여 잔류 하는 세포 및 불순물을 제거한 후, Protein A(GE-Healthcare)를　이용한 친화도 크로마토그래피(affinity chromatography) 방법으로 low PH elution을 통해 정제하여 제작하였다.

배양 후 Cell Counting Kit-8 assay (Dojindo Molecular Technologies, Gaithersburg, MD)를 이용하여 제조사의 지시에 따라 세포 증식 정도를 분석하였다. 간략하게 설명하면, 48시간 및 72시간 배양 후 CCK8 solution을 10 ul(microliter)씩 각 well에 첨가하여 2.5시간을 추가 배양한 후, microplate reader로 450 nm에서의 흡광도를 읽었다.

상기 얻어진 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에서 보여지는 바와 같이, 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체 처리시, 항 Ang2항체 또는 항 VEGF-C 항체의 단독처리보다, 현저한 세포 증식 억제 효과가 나타남을 확인할 수 있으며, 항 Ang2항체 또는 항 VEGF-C 항체의 병용 처리시와 비교하여도 증진된 세포 성장 저해 효과를 보여줌을 확인할 수 있다.

실시예 6. 항 VEGF -C/항 Ang2 이중 특이 항체의 세포 이동 억제 효과

상기 실시예 3에서 얻어진 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체의 세포 이동 억제 효과를 확인하기 위하여, 상기 이중 특이 항체가 Ang2와 VEGF-C에 의해 유도되는 LEC 이동 (migration)에 미치는 효과를 시험하였다.

혈관내피세포의 이동성의 측정은 GE Healthcare의 xCelligence RTCA (Realtime cell analyzer)를 이용하여 측정하였다. RTCA는 real time으로 impedance를 측정함으로써 세포의 변화를 확인할 수 있는 non-invasive한 cell monitoring system이다. Cell migration assay 수행을 위해 lower chamber와 upper chamber로 구성된 CIM-plate16 (GE Healthcare)을 사용하였다. 상기 upper chamber에 impedance를 측정하는 미세전극이 배열되어 있으며, chamber에 seeding된 세포가 미세구멍을 통해 이동하면 상기 미세전극에 부착되므로, 이를 이용하여 세포의 이동 정도를 확인하고, 이를 migration index로 나타내었다.

EGM2-MV 배지에서 배양한 림프관내피세포 (Lonza, CC-2811; P5-7)를 1% FBS가 첨가된 EBM 배지에서 6시간 동안 키웠다. 상기 CIM-plate16의 lower chamber 각 well에 1% FBS가 첨가된 EBM 배지에 1 ug/ml VEGF-C 와 1 ug/ml Ang2 (R&D systems)와 100nM 이중특이항체를 넣은 뒤 fibronectin coating된 upper chamber와 assembly 하였다. Upper chamber에 serum free EBM 배지를 30 ul 씩 넣어준 뒤, plate와 배지간의 equilibration을 위해 1시간 동안 incubator에 두고 CIM-plate를 incubator내의 device station에 장착한 후 background value 측정하였다. Serum-free media로 재현탁된 혈관 내피세포를 40,000/well에 seeding하고, 15분간 settle down하도록 방치한 뒤, device에 장착하여 세포 이동을 실시간으로 측정하였다. 세포 이동 정도는 cell index 값으로 나타내었다.

상기 얻어진 결과를 도 3에 나타내었다. 도 3에서 보여지는 바와 같이, 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체 처리시, 항 Ang2항체 또는 항 VEGF-C 항체의 단독처리보다, 현저한 세포 이동 억제 효과가 나타남을 확인할 수 있으며, 항 Ang2항체 또는 항 VEGF-C 항체의 병용 처리시와 비교하여도 증진된 세포 이동 저해 효과를 보여줌을 확인할 수 있다.

<110> SAMSUNG ELECTRONICS CO., LTD. <120> Anti-VEGF-C/anti-Ang2 bispecific antibody <130> DPP20134641KR <160> 102 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 of anti-Ang2 antibody <400> 1 Asp Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 2 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 of anti-Ang2 antibody <400> 2 Asp Tyr Tyr Met Ser 1 5 <210> 3 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 of anti-Ang2 antibody <400> 3 Asn Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 4 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 of anti-Ang2 antibody <400> 4 Asp Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 5 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 of anti-Ang2 antibody <400> 5 Asp Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 6 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 of anti-Ang2 antibody <400> 6 Asp Tyr Ala Met Ser 1 5 <210> 7 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 of anti-Ang2 antibody <400> 7 Ser Tyr Asp 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variable region of anti-Ang2 antibody 7-C9 <400> 64 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Asp Val Tyr Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ala Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Gly Thr Trp Asp Tyr Ser Leu 85 90 95 Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly 100 105 110 <210> 65 <211> 111 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region of anti-Ang2 antibody 4-C11 <400> 65 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Thr Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Asn Asn 20 25 30 Asp Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Ser Asp Ser Lys Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser 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ttagttggta ccagcagctt 120 cccggcacag ctccaaagct cttgatttac agcgattcac aaagacctag tggtgtcccc 180 gatagatttt ctgggagtaa gagcgggacc agtgcctccc tggctatatc aggactgaga 240 tctgaagatg aggctgacta ttactgtgcc acttgggact attcactctc tgcctatgtg 300 ttcgggggcg gaaccaaact gacagtccta ggc 333 <210> 83 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polyucleotide encoding heavy chain variable region of anti-Ang2 antibody 4-H10 <400> 83 gaggttcagt tgctggagag tggcggcggc ttagtgcagc caggtggcag cctgcgcctt 60 tcttgtgccg ccagtgggtt taccttctcc tcctacgaca tgagctgggt gcggcaggct 120 cccggcaaag gtcttgaatg ggtgtcactg atcagccctg acagttcctc aatctattat 180 gcagattcag tcaagggaag atttaccata agcagagata attccaagaa tactctgtac 240 ctacagatga actcgctcag agccgaagat accgcagtct actactgcgc taaagacctg 300 atttctttct ggaggggggg attcgactat tgggggcaag gaacactcgt aacagtgtct 360 agc 363 <210> 84 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polyucleotide encoding light chain variable region of anti-Ang2 antibody 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c 381 <210> 86 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Polyucleotide encoding light chain variable region of anti-Ang2 antibody 3-D3 <400> 86 cagtcagtgc tgacacagcc tccaagcgct tccgggacac ctggacaaag agttaccatt 60 tcgtgcaccg gatcctcctc aaacatcggt agcaattatg tgtcttggta ccagcagctc 120 cccgggactg cccccaaact cttgatctac agcgacaaca agagaccatc tggtgtgcct 180 gatagattca gtgggagtaa gtcaggaacg agtgcctctc tggctatttc tggcctgaga 240 agcgaagatg aggcagacta ttattgtggc acctgggatg actccctgaa tggctacgtc 300 tttggcggcg gaacaaaact tactgtccta ggc 333 <210> 87 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pC3X-f primer <400> 87 gcacgacagg tttcccgac 19 <210> 88 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pC3X-b primer <400> 88 aaccatcgat agcagcaccg 20 <210> 89 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a polypetide capable of being used as a CDR-H1 of an anti-Ang2 antibody <400> 89 Ser Tyr Asp Met Ser 1 5 <210> 90 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a polypetide capable of being used as a CDR-H2 of an anti-Ang2 antibody <400> 90 Ala Ile Ser Tyr Asp Asn Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 91 <211> 14 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a polypetide capable of being used as a CDR-H3 of an anti-Ang2 antibody <400> 91 Ala Arg Asp Pro Tyr Leu Ala Arg Leu Asn Thr Phe Asp Tyr 1 5 10 <210> 92 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a polypetide capable of being used as a CDR-L1 of an anti-Ang2 antibody <400> 92 Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Asn Val Ser 1 5 10 <210> 93 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a polypetide capable of being used as a CDR-L2 of an anti-Ang2 antibody <400> 93 Tyr Asn Ser His Arg Pro Ser 1 5 <210> 94 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a polypetide capable of being used as a CDR-L3 of an anti-Ang2 antibody <400> 94 Ala Thr Trp Asp Ser Ser Leu Asn Gly 1 5 <210> 95 <211> 121 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a polypetide capable of being used as a heavy chain variable region of an anti-Ang2 antibody <400> 95 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Ala Ile Ser Tyr Asp Asn Gly Ser Thr Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Asp Pro Tyr Leu Ala Arg Leu Asn Thr Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser 115 120 <210> 96 <211> 108 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> a polypetide capable of being used as a light chain variable region of an anti-Ang2 antibody <400> 96 Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln 1 5 10 15 Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn 20 25 30 Asn Val Ser Trp Tyr Gln Gln Leu Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu 35 40 45 Ile Tyr Tyr Asn Ser His Arg Pro Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser 50 55 60 Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg 65 70 75 80 Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr Cys Ala Thr Trp Asp Ser Ser Leu 85 90 95 Asn Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Thr 100 105 <210> 97 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding the pokypeptide of SEQ ID NO: 95 <400> 97 gaagtccagc tgctagaatc tggggggggc ctggtccagc ctggtggatc tctcagatta 60 tcctgtgccg caagcggatt caccttctca tcttacgaca tgagttgggt gaggcaagcc 120 ccaggcaagg gcttggagtg ggtgagcgcg atctcctacg acaatggtag tacttactat 180 gccgattccg ttaaaggccg ctttacgatt agtagagata acagcaagaa tacactgtat 240 ttgcagatga actccctgag agcagaggat actgctgtgt actattgcgc cagagacccc 300 tatctggctc ggctgaatac ctttgactac tggggacagg ggacacttgt gaccgtatca 360 agc 363 <210> 98 <211> 333 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> polynucleotide encoding the pokypeptide of SEQ ID NO: 96 <400> 98 cagagtgtcc ttacccagcc cccatcagcc tccggtacgc ctggccagag agtgactata 60 agctgctctg gatcctcctc caatatcgga agcaacaacg tttcttggta ccagcaactg 120 cctggcacag cacctaagct gctcatttac tataattctc acagacccag cggggtgcca 180 gacagatttt ctggctcaaa gtcgggtacc tcagccagtc tggcaatcag cgggctgaga 240 tcagaggatg aagctgatta ttattgtgct acctgggaca gcagtctgaa tggctacgtg 300 ttcggcgggg gaacaaaatt gactgtccta ggc 333 <210> 99 <211> 248 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> anti-Ang2 scFv <400> 99 Glu Val Gln Leu Leu Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Gly 1 5 10 15 Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr 20 25 30 Asp Met Ser Trp Val Arg Leu Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val 35 40 45 Ser Leu Ile Ser Pro Asp Ser Ser Ser Ile Tyr Tyr Ala Asp Ser Val 50 55 60 Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr 65 70 75 80 Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Lys Asp Leu Ile Ser Phe Trp Arg Gly Gly Phe Asp Tyr Trp Gly 100 105 110 Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly 115 120 125 Gly Gly Ser Gly Ser Gly Gly Ser Gln Ser Val Leu Thr Gln Pro Pro 130 135 140 Ser Ala Ser Gly Thr Pro Gly Gln Arg Val Thr Ile Ser Cys Ser Gly 145 150 155 160 Ser Ser Ser Asn Ile Gly Ser Asn Tyr Val Asn Trp Tyr Gln Gln Leu 165 170 175 Pro Gly Thr Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Ser Asp Ser His Arg Pro 180 185 190 Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Lys Ser Gly Thr Ser Ala 195 200 205 Ser Leu Ala Ile Ser Gly Leu Arg Ser Glu Asp Glu Ala Asp Tyr Tyr 210 215 220 Cys Gly Ala Trp Asp Asp Ser Leu Ser Gly Tyr Val Phe Gly Gly Gly 225 230 235 240 Thr Lys Leu Thr Val Leu Gly Gln 245 <210> 100 <211> 732 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding anti-VEGF-C heavy chain variable region within anti-VEGF-C/anti-Ang2 bispecific antibody <400> 100 gacgccatcc acgctgtttt gacctccata gaagacaccg ggaccgatcc agcctccgga 60 ctctagagga tcgaaccctt gaattcgccg ccaccatgga atggagctgg gtttttctcg 120 taacactttt aaatggtatc cagtgtgaag tccagctgct agaatctggg gggggcctgg 180 tccagcctgg tggatctctc agattatcct gtgccgcaag cggattcacc ttctcatctt 240 acgacatgag ttgggtgagg caagccccag gcaagggctt ggagtgggtg agcgcgatct 300 cctacgacaa tggtagtact tactatgccg attccgttaa aggccgcttt acgattagta 360 gagataacag caagaataca ctgtatttgc agatgaactc cctgagagca gaggatactg 420 ctgtgtacta ttgcgccaga gacccctatc tggctcggct gaataccttt gactactggg 480 gacaggggac acttgtgacc gtatcaagcg ctagcaccaa gggcccatcg gtcttccccc 540 tggcgccctg ctccaggagc acctccgaga gcacagcggc cctgggctgc ctggtcaagg 600 actacttccc cgaaccggtg acggtgtcgt ggaactcagg cgctctgacc agcggcgtgc 660 acacctttcc cagctgtcct acagtcctca ggactctact cccctcagca gcgtggtgac 720 cgtgccctcc ag 732 <210> 101 <211> 417 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nucleotide sequence encoding anti-VEGF-C light chain variable region within anti-VEGF-C/anti-Ang2 bispecific antibody <400> 101 gaattcacta gtgattaatt cgccgccacc atggattcac aggcccaggt cctcatgttg 60 ctgctgctat cggtatctgg tacctgtgga cagagtgtcc ttacccagcc cccatcagcc 120 tccggtacct ggccagagag tgactataag ctgctctgga tcctcctcca atatcggaag 180 caacaacgtt tcttggtacc agcaactgcc tggcacagca cctaagctgc tcatttacta 240 taattctcac agacagcggg gtgccagaca gattttctgg ctcaaagtcg ggtacctcag 300 ccagtctggc aatcagcggg ctgagatcag aggatgaagc tgattattat tgtgctacct 360 gggacagcag tctgaatggt agtgttcggc gggggaacaa aattgactgt cctaggc 417 <210> 102 <211> 807 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> nuleotide sequence encoding anti-Ang2 scFv within anti-VEGF-C/anti-Ang2 bispecific antibody <400> 102 gaggtacaac tgctggagag tggaggaggt ctcgtccagc cgggagggag cctaagatta 60 agttgtgccg catcaggttt tacattcagc agctacgata tgagctgggt gagacttgct 120 ccaggaaaag ggctagaatg ggttagcctg atttcccccg actcaagctc aatctattac 180 gcagattctg tgaagggcag attcacaata agcagggata actcaaagaa tactctgtat 240 ctgcagatga acagtctgag agccgaggac acagccgtgt actactgtgc aaaggacctg 300 atttcttttt ggcgaggcgg attcgactac tggggccaag gaacgctggt gaccgttagc 360 agcgggggag gcggaagtgg aggcggcggt tcaggcagcg gcgggagcca gtctgtgttg 420 acacagccac cttcggcctc cggtacccca ggtcagcgcg ttaccatctc atgctcagga 480 tcgtctagta atatcggcag caactacgtc aattggtatc agcaattgcc cgggactgcg 540 cctaagcttt taatttattc cgacagccat agacctagcg gcgtccccga tagattttct 600 gggagcaaat ctgggactag tgcctctctg gctatctctg gactgagaag cgaagatgaa 660 gctgactatt actgcggcgc ttgggacgac agccttagcg gatatgtatt cggtgggggt 720 accaaactga ccgtgctggg acaggcaggg cagcaccacc accatcatca cggcgcctac 780 ccttatgatg tgcccgatta tgcctct 807

Claims

항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편, 및 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하고,
상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
서열번호 89의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H1, 서열번호 90의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H2, 및 서열번호 91의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-H3로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 중쇄 가변 부위;
서열번호 92의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L1, 서열번호 93의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L2, 및 서열번호 94의 아미노산 서열을 포함하는 CDR-L3으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역, 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역을 포함하는 경쇄 가변 부위;
상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 영역 및 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 영역의 조합; 또는
상기 중쇄 가변 부위 및 상기 경쇄 가변 부위의 조합
을 포함하는 것이고,
상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
서열번호 49의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 50의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H2) 및 서열번호 17 내지 24로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열, 예컨대 서열번호 17 내지 22로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위, 또는 상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 중쇄 가변 부위;
서열번호 51의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 52의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L2) 및 서열번호 53의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위 또는 상기 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 경쇄 가변 부위;
상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위 및 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위의 조합; 또는
상기 중쇄 가변 부위와 경쇄 가변 부위의 조합
을 포함하는 것인,
항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체.
제1항에 있어서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 1 내지 8 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 9 내지 16 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 17 내지 24 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H3)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위 또는 이를 포함하는 중쇄 가변 부위;
서열번호 25 내지 32 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 33 내지 40 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 41 내지 48 중에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L3)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위 또는 이를 포함하는 경쇄 가변 부위;
상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위 및 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위의 조합; 또는
상기 중쇄 가변 부위 및 경쇄 가변 부위의 조합
을 포함하는 것인,
항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체.
제1항에 있어서, 상기 항 Ang2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 54 내지 61로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위; 서열번호 62 내지 69로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위; 또는 상기 중쇄 가변 부위와 경쇄 가변 부위의 조합을 포함하는 것인,
항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체.
제1항에 있어서, 상기 항 VEGF-C 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
서열번호 95의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 부위,
서열번호 96의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 부위, 또는
이들의 조합
을 포함하는 것인, 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체.
제1항에 있어서, 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체는
항 VEGF-C 항체, 및 상기 항 VEGF-C 항체의 C 말단에 연결된 항 Ang2 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 형태, 또는
항 Ang2 항체, 및 상기 항 Ang2 항체의 C 말단에 연결된 항 VEGF-C 항체의 항원 결합 단편을 포함하는 형태인,
항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 scFv, (scFv)2, scFvFc, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것인,
항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체를 유효성분으로 포함하는 Ang2 또는 VEGF-C와 관련된 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제7항에 있어서, 상기 Ang2 또는 VEGF-C와 관련된 질병은 암, 암 전이, 암침윤 또는 침습, 안구질환, 염증성 질환, 및 말라리아로 이루어진 군에서 선택된 것인, Ang2 또는 VEGF-C와 관련된 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체를 포함하는 Ang2 또는 VEGF-C의 검출용 조성물.
제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체를 포함하는 Ang2 또는 VEGF-C와 관련된 질병의 진단용 조성물.
제10항에 있어서, 상기 Ang2 또는 VEGF-C와 관련된 질병은 암, 암 전이, 암침윤 또는 침습, 안구질환, 염증성 질환, 및 말라리아로 이루어진 군에서 선택된 것인, 진단용 조성물.