KR102131371B1 - Ang-2 특이적 항체 및 그의 용도 - Google Patents

Ang-2 특이적 항체 및 그의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR102131371B1
KR102131371B1 KR1020130077228A KR20130077228A KR102131371B1 KR 102131371 B1 KR102131371 B1 KR 102131371B1 KR 1020130077228 A KR1020130077228 A KR 1020130077228A KR 20130077228 A KR20130077228 A KR 20130077228A KR 102131371 B1 KR102131371 B1 KR 102131371B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
cancer
seq
ang
antibody
amino acid
Prior art date
Application number
KR1020130077228A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20150004444A (ko
Inventor
이윤숙
김충호
김경은
김형찬
이광훈
이효선
한상열
Original Assignee
삼성전자주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 삼성전자주식회사 filed Critical 삼성전자주식회사
Priority to KR1020130077228A priority Critical patent/KR102131371B1/ko
Priority to US14/322,343 priority patent/US9527910B2/en
Publication of KR20150004444A publication Critical patent/KR20150004444A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR102131371B1 publication Critical patent/KR102131371B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/22—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against growth factors ; against growth regulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/74—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving hormones or other non-cytokine intercellular protein regulatory factors such as growth factors, including receptors to hormones and growth factors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/30—Immunoglobulins specific features characterized by aspects of specificity or valency
    • C07K2317/34—Identification of a linear epitope shorter than 20 amino acid residues or of a conformational epitope defined by amino acid residues
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
    • C07K2317/76—Antagonist effect on antigen, e.g. neutralization or inhibition of binding
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/475—Assays involving growth factors
    • G01N2333/515—Angiogenesic factors; Angiogenin
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2800/00—Detection or diagnosis of diseases
    • G01N2800/70—Mechanisms involved in disease identification
    • G01N2800/7014—(Neo)vascularisation - Angiogenesis

Abstract

신생혈관형성 유도인자인 안지오포이에틴-2(Angiopoietin-2; Ang-2)에 특이적으로 결합하는 항 Ang-2 항체, 상기 항 Ang-2 항체의 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주, 상기 항 Ang-2 항체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물이 제공된다.

Description

Ang-2 특이적 항체 및 그의 용도{Ang-2 specific antibodies and uses thereof}
신생혈관형성 유도인자인 안지오포이에틴-2(Angiopoietin-2; Ang-2)에 특이적으로 결합하는 항 Ang-2 항체, 상기 항 Ang-2 항체의 단클론항체를 생산하는 하이브리도마 세포주, 상기 항 Ang-2 항체를 유효성분으로 포함하는 약학 조성물이 제공된다.
안지오포이에틴-2 (Angiopoietin-2; Ang-2)는 혈관내피세포에 존재하는 수용체 Tie2의 길항적인 리간드 (antagonistic ligand)로서, Tie2의 작용물질 (agonist)인 안지오포이에틴-1(Angiopoietin-1; Ang1)과 Tie2 결합에 대해 경쟁함으로써 Tie2에 의한 신호전달을 억제하는 작용을 한다. 따라서 Ang-2는 혈관내피세포의 안정성을 유지하는 Ang1-Tie2 결합과 이를 통한 신호전달을 저해하여, 결과적으로 혈관의 역동적인 재배열 (dynamic rearrangement)을 통한 신생혈관형성을 촉진한다.
신생혈관형성과정은 암의 성장에 필수적인 요소이므로, 위와 같은 Tie2 의존적인 Ang-2의 기능을 저해하여 신생혈관형성을 억제함으로써 암의 추가적인 성장을 막을 수 있음은 여러 전임상 모델의 연구에 의해 알려져 있고, 실제로 Ang-2 특이적 항체를 이용하여 암의 진행을 막으려는 시도가 다양하게 이루어지고 있다.
　최근, Ang-2는 Tie2 의존적인 (Tie2-dependent) 신생혈관형성을 통한 암의 성장을 유발할 수 있을 뿐 아니라 Tie2 독립적인 (Tie2-independent) 기작을 통해 암의 전이를 촉진할 수 있음을 보이는 현상들이 관찰되고 있지만, 그 구체적인 메커니즘에 대한 연구 결과는 아직 미미한 실정이다.
　Ang-2에 의한 암의 진행을 효과적으로 저해하는 방법으로 앞서 언급한 Ang-2에 의한 Tie2 시그널링을 억제하는 것도 중요하지만, 이와 더불어 Ang-2의 Tie2 독립적인 기작을 차단함으로써, 더욱 탁월한 성능의 암치료제 확보가 가능할 수 있을 것으로 기대된다.
따라서, Ang-2의 Tie2 독립적인 기작을 밝히고 이를 억제하는 물질의 개발이 요구된다.
본 발명의 일 예는 신생혈관형성 유도인자인 Ang-2(Angiopoietin-2)에 특이적으로 결합하는 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
다른 예는 상기 항 Ang-2 항체의 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다.
다른 예는 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 신생혈관 형성 저해용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 Ang-2 의존적 세포부착 억제용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는 신생혈관 형성 및/또는 Ang-2 의존적 세포부착과 관련된 질병의 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 신생혈관 형성 및/또는 Ang-2 의존적 세포부착과 관련된 질병의 진단용 조성물을 제공한다.
Ang-2는 Tie2 의존적인 (Tie2-dependent) 신생혈관형성을 통한 암의 성장을 유발할 수 있을 뿐 아니라 Tie2 독립적 (Tie2-independent) 기작을 통해 암의 전이를 촉진한다. 일례로 Ang-2를 인위적으로 과발현시킨 암세포주는 세포의 이동 (migration), 침투 (invasion) 및 이종이식(xenograft) 모델에서의 암 전이가 증가하였다. 이와 관련하여, 본 발명자들은 Tie2를 발현하지 않는 교모세포종(Glioblastoma) 암세포주인 U87MG가 Ang-2이 코팅된 표면에 부착(adhesion)할 수 있는지 여부를 측정하여, Tie2 독립적이고 Ang-2 의존적인 세포부착을 확인하였다.
본 발명자들은 또한 Ang-2가 인테그린(integrin)이라는 세포결합단백질에 결합함을 확인하고, Ang-2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 항체가 Tie2 독립적이고 Ang-2 의존적인 세포부착을 억제함을 확인하여 본 발명을 완성하였다. 본 발명에서 제공되는 항체는 신생혈관 형성뿐 아니라 암의 전이도 효과적으로 억제한다.
이에, 본 발명의 일 예는 신생혈관형성 유도인자인 Ang-2(Angiopoietin-2)에 특이적으로 결합하는 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 제공한다.
상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang-2의 활성 억제뿐 아니라 Ang-2와 인테그린 간의 결합을 저해하는 활성을 갖는다.
암 조직의 신생혈관형성 과정을 보면, 먼저, 암 조직에서 신생혈관형성을 위해 암세포가 기존의 혈관을 선택하는 혈관공용(cooption)이 발생한다. 그런 다음, Ang-2(Angiopoietin-2, Ang-2) 경로에 의해 상기 공용된 기존의 혈관의 기능을 파괴시키는 혈관퇴화(vessel regression)가 일어난다. 기존 혈관의 퇴화로 인해 암 조직 내의 환경은 저산소(hypoxia) 환경이 되어 신생혈관이 형성될 수 있는 조건을 제공하게 된다. 이 조건 하에서 혈관내피세포성장인자(Vascular Endothelial Cell Growth Factor, VEGF)의 발현이 증가되어 새로운 혈관이 생성된다.　안지오포이에틴 단백질에는 Ang-1, Ang-2, Ang-3 및 Ang-4 등이 알려져 있는데 그 중 Ang-2는 ANGPT2로도 알려져 있으며,　혈관 리모델링 부위에서 발현된다.
본 발명에서 제공되는 항체의 항원으로 작용하는 Ang-2 단백질은 신생혈관 형성과 밀접한 관련이 있으며 혈액 내에 존재하는 가용성 리간드로서, 신생혈관 생성(angiogenesis), 암전이(metastasis), 암세포 침투(invasion) 에 광범위하게 작용한다. 상기 Ang-2는 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등과 같은 포유류로부터 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대 인간 Ang-2 (예컨대, NCBI Accession No. O15123 등), 원숭이 Ang-2 (예컨대, NCBI Accession No. Q8MIK6 등), 마우스 Ang-2 (예컨대, NCBI Accession No. O35608 등), 래트 Ang-2 (예컨대, NCBI Accession No. O35462 등) 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 인테그린(integrin)은 세포 부착을 매개하는 대표적인 단백질로서, 알파(α) 서브유닛과 베타(β) 서브유닛을 포함하는 헤테로다이머 구조이다. 포유류에서는 18 종류의 알파 서브유닛과 8종류의 베타 서브유닛이 동정되어 있다. 상기 인테그린은 인간, 원숭이 등의 영장류, 마우스, 래트 등의 설치류 등과 같은 포유류로부터 유래하는 것일 수 있으며, 예컨대 인간 인테그린, 원숭이 인테그린, 마우스 인테그린, 래트 인테그린 등일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 각 종(species) 마다 24종의 인테그린이 알려져 있으며, 이들의 아미노산 서열은 잘 동정되어 있어서 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확한 사항이다. 예컨대, 인간 인테그린의 대표적인 종류로서 alpha5beta1(α5β1)(α5: NCBI Accession No. P08648, β1: NCBI Accession No. P05556), alphaVbeta1(αVβ1)(αV: NCBI Accession No. P06756, β1: NCBI Accession No. P05556), 및 alphaVbeta3(αVβ3)(αV: NCBI Accession No. P06756, β3: NCBI Accession No. P05106) 등을 들 수 있다.
일 예에 있어서, 상기 항 Ang-2 항체에 의하여 Ang-2와의 결합이 저해되는 인테그린은 인간 인테그린일 수 있고, 구체적으로, alpha5beta1(α5β1)(α5: NCBI Accession No. P08648, β1: NCBI Accession No. P05556), alphaVbeta1(αVβ1)(αV: NCBI Accession No. P06756, β1: NCBI Accession No. P05556), 및 alphaVbeta3(αVβ3)(αV: NCBI Accession No. P06756, β3: NCBI Accession No. P05106)로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있으며, 예컨대, alpha5beta1(α5β1)(α5: NCBI Accession No. P08648, β1: NCBI Accession No. P05556), 또는 alphaVbeta3(αVβ3)(αV: NCBI Accession No. P06756, β3: NCBI Accession No. P05106)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 항체는 Ang-2에 대한 결합 활성과 함께　Ang-2와 인테그린 간의 결합을 방해함으로써, 암조직내 신생혈관형성의 억제는 물론이고 세포 부착 억제 효과를 갖는다. 따라서, 상기 항체는 암과 같은 신생혈관형성과 관련된 질병의 치료 효과뿐 아니라 암의 전이 억제 효과를 갖는다.
상기 항 Ang-2 항체는 인간 Ang-2 (hAng-2; 서열번호 22; Accession # O15123) 의 루프 1 (서열번호 28 중 417번째 아미노산부터 434번째 아미노산까지의 부위)의 전부 또는 일부(예컨대, 루프 중 외부에 노출된 아미노산 잔기 부위로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 잔기) 또는 서열번호 28 중에서 루프 1의 외부에 노출된 아미노산 잔기를 하나 이상 포함하는 1차, 2차 또는 3차 구조상 인접하는 연속하거나 연속하지 않는 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 2개 내지 10개, 또는 2개 내지 5개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열 부위를 에피토프로서 인식하거나, 이 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
Ang-2 (서열번호 28)
MWQIVFFTLS CDLVLAAAYN NFRKSMDSIG KKQYQVQHGS CSYTFLLPEM DNCRSSSSPY
VSNAVQRDAP LEYDDSVQRL QVLENIMENN TQWLMKLENY IQDNMKKEMV EIQQNAVQNQ
TAVMIEIGTN LLNQTAEQTR KLTDVEAQVL NQTTRLELQL LEHSLSTNKL EKQILDQTSE
INKLQDKNSF LEKKVLAMED KHIIQLQSIK EEKDQLQVLV SKQNSIIEEL EKKIVTATVN
NSVLQKQQHD LMETVNNLLT MMSTSNSAKD PTVAKEEQIS FRDCAEVFKS GHTTNGIYTL
TFPNSTEEIK AYCDMEAGGG GWTIIQRRED GSVDFQRTWK EYKVGFGNPS GEYWLGNEFV
SQLTNQQRYV LKIHLKDWEG NEAYSLYEHF YLSSEELNYR IHLKGLTGTA GKISSISQPG
NDFSTKDGDN DKCICKCSQM LTGGWWFDAC GPSNLNGMYY PQRQNTNKFN GIKWYYWKGS
GYSLKATTMM IRPADF
예컨대, 상기 항 Ang-2 항체는 서열번호 28의 루프 1에 위치하는 Q418 또는 서열번호 28 중에서 Q418의 아미노산 잔기를 포함하는 1차, 2차 또는 3차 구조상 인접하는 연속하거나 연속하지 않는 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 2개 내지 10개, 또는 2개 내지 5개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열 부위를 에피토프로 인식하거나 또는 이 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 다른 예에서, 상기 항 Ang-2 항체는, 상기 Q418 또는 이를 포함하는 아미노산 서열 부위에 더하여, 서열번호 28의 루프 1에 위치하는 P419 또는 서열번호 28 중에서 P419의 아미노산 잔기를 포함하는 1차, 2차 또는 3차 구조상 인접하는 연속하거나 연속하지 않는 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 2개 내지 10개, 또는 2개 내지 5개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열 부위를 추가로 에피토프로 인식하거나 또는 이 부위에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다. 일 예에서 상기 항 Ang-2 항체는 서열번호 28의 Q418 및 P419의 아미노산 잔기를 에피토프로 인식하거나 또는 이 부분에 특이적으로 결합하는 것일 수 있다.
상기 항 Ang-2 항체가 특이적으로 결합하는 부위인 Q418, P419, 또는 이를 포함하는 아미노산 부위는 Ang-2의 3차원 구조의 루프 1에 위치하는 노출된 아미노산 잔기로서, Ang-2와 인테그린 간의 결합에 직접 참여하거나, 인테그린과의 결합 부위에 포함되거나 인접하여 위치하는 것으로 여겨진다. 따라서, 상기 항 Ang-2 항체가 특이적으로 결합하는 부위들 중 하나 이상을 인식하고 결합하는 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang-2와의 결합에 있어서 인테그린과 경쟁하게 되므로, Ang-2과 인테그린 간의 결합을 저해하게 된다.
또한, 상기 부위를 인식 및/또는 특이적으로 결합하는 항 Ang-2 항체뿐 아니라, 상기 항 Ang-2 항체와 경쟁적으로 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편 역시 Ang-2와의 결합에 있어서 인테그린과 경쟁 가능하므로, Ang-2와 인테그린 간의 결합을 저해할 수 있다. 이와 같이 경쟁적으로 결합하는 항체는 앞서 기술한 부위와 3차원 구조상의 인접한 부위를 에피토프 및/또는 특이적 결합 부위로 인식하는 항체일 수 있다. 상기 경쟁적으로 결합하는 항체는 Ang-2와의 결합 친화도가 0.1pM 내지 50nM, 구체적으로 0.5pM 내지 35nM, 보다 구체적으로 1pM 내지 10nM인 것일 수 있다.
따라서, 본 발명의 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 앞서 설명한 부위를 에피토프로서 인식하거나 여기에 특이적으로 결합하는 항체 또는 항원 결합 단편, 및 이와 경쟁적으로 Ang-2에 결합하는 항체 또는 이의 항원 결합 단편으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
구체예에서, 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 중쇄(Heavy chain)의 상보성 결정 부위(complementarity determining region, CDR)로서,
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H1),
일반식 1 (서열번호 14)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및
서열번호 4 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (CDR-H3)
로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 상보성 결정 부위를 포함하는 것일 수 있다:
[일반식 1]
Y-I-X1-Y-X2-G-X3-T-X4-Y-N-P-S-L-K-S (서열번호 14)
상기 일반식 1에서
X1은 세린(S) 또는 아스파라진(N)이고,
X2는 세린(S) 또는 아르기닌(R)이며,
X3은 세린(S) 또는 아스파라진(N)이고,
X4는 세린(S) 또는 아스파르트산(D)이다.
상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 경쇄(Light chain)의 상보성 결정 부위로서,
서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L1),
서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및
일반식 2 (서열번호 15)의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L3)
로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 상보성 결정 부위를 포함하는 것일 수 있다:
[일반식 2]
Q-Q-D-Y-X5-S-P-X6-T (서열번호 15)
상기 일반식 2에서,
X5는 세린(S), 또는 트레오닌(T) 이고,
X6는 프롤린(P), 류신(L), 또는 트립토판(W)이다.
구체예에서, 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 상기한 중쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 상보성 결정 부위, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
보다 구체적으로, 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 4 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (CDR-H3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위;
서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 11 내지 서열번호 13으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위; 또는
상기 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위와 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위의 조합
을 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 항 Ang-2 항체의 중쇄 상보성 결정 부위는 예컨대 다음의 표 1의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
중쇄 CDR 아미노산 서열
CDRH1-KABAT CDRH2-KABAT CDRH3-KABAT
DYAWN
(서열번호1)		 YISYSGSTSYNPSLKS
(서열번호 2)		 STFGHYVSSMDY
(서열번호4)
DYAWN
(서열번호1)		 YINYRGNTDYNPSLKS
(서열번호 3)		 GNFEGAMDY
(서열번호5)
　DYAWN
(서열번호1)		 YISYSGSTSYNPSLKS
(서열번호 2)		 　GDYGNYVGPMDY
(서열번호6)
또한 항 Ang-2 항체의 경쇄 상보성 결정 부위는 예컨대 다음의 표 2의 아미노산 서열을 갖는 것일 수 있다.
경쇄 CDR 아미노산 서열
CDRL1-KABAT CDRL2-KABAT CDRL3-KABAT
KASQSASNDVA
(서열번호7)		 YASNRYT
(서열번호 9)		 QQDYSSPPT
(서열번호 11)
KASQSVSNDVA
(서열번호8)		 YASNRYP
(서열번호 10)		 QQDYTSPWT
(서열번호 12)
KASQSVSNDVA
(서열번호8)		 YASNRYT
(서열번호 9)		 QQDYSSPLT
(서열번호 13)
일 구체예에서, 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2 또는 서열번호 3의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 4 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드 (CDR-H3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 중쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 중쇄 가변 영역;
서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 11 내지 서열번호 13으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드(CDR-L3)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 경쇄 상보성 결정 부위를 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
상기 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합
을 포함하는 것일 수 있다.
일 구체예에 따른 항체의 중쇄 가변 영역은 서열번호 16 내지 서열번호 18로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다:
(서열번호 16)
VQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITS DYAWN WIRQFPGNKLEWMG YISYSGSTSYNPSLKS RISITRDTSKNQFFLQLNSVTPEDTATYYCAR STFGHYVSSMDY WGQ
(서열번호 17)
VQLQESGPGLVKPSQSLSLSCTVTGYSIAS DYAWN WIRQFPGNKVEWMG YINYRGNTDYNPSLKS RSSINRDTSKNQFFLQLNSVTTGDTATYYCAR GNFEGAMDY WGQ
(서열번호 18)
LQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITS DYAWN WIRQFPGNKLEWMG YISYSGSTSYNPSLKS RISITRDTSKNQFFLQLNSLTTEDTATYYCAR GDYGNYVGPMDY WGQ
(상기 서열번호 16 내지 서열번호 18에서, 밑줄 표시된 굵은 글씨는 순서대로 CDRH1, CDRH2, CDRH3 임)
일 구체예에 따른 항체의 경쇄는 서열번호 19 내지 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
(서열번호 19)
SIVMTQTPKLLLVSAGDRVTITC KASQSASNDVA WYQQKPGQSPKLLIY YASNRYT GVPDRFTGSGYGTDFTFAISTVQAEDLAIYFC QQDYSSPPT FGGGTKLEIK
(서열번호 20)
TIVMTQTPKFLLVSAGDRITITC KASQSVSNDVA WYQQKPGQSPKLLIY YASNRYP GVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFC QQDYTSPWT FGGGTELEIK
(서열번호 21)
SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITC KASQSVSNDVA WYRQKPGQSPKLLIY YASNRYT GVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFC QQDYSSPLT FGARTKLELK
(상기 서열번호 19 내지 서열번호 21에서, 밑줄 표시된 굵은 글씨는 순서대로 CDRL1, CDRL2, CDRL3 임)
따라서, 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 16 내지 서열번호 18로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역, 서열번호 19 내지 서열번호 21로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역, 또는 상기 중쇄 가변 영역과 경쇄 가변 영역의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
예컨대, 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은
서열번호 16의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 19의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역;
서열번호 17의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 20의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역; 또는
서열번호 18의 아미노산 서열을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 서열번호 21의 아미노산 서열을 포함하는 경쇄 가변 영역
을 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 서열번호 서열번호 8, 서열번호 10, 및 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열로만 이루어진 것이 아니거나, 서열번호 20의 아미노산 서열로만 이루어진 것이 아닐 수 있다.
또 다른 예에서, 상기한 에피토프를 이용하여 앤지오포이에틴-2 활성화 및/또는 과생성(과발현)과 관련된 질병의 진단, 예방 및/또는 치료를 위한 후보 물질을 스크리닝하는 방법이 제공된다. 상기 스크리닝 방법은,
(a) 상술한 앤지오포이에틴-2의 3차 구조의 에피토프에 후보 화합물을 접촉시키는 단계; 및
(b) 상기 에피토프와 후보 화합물과의 결합력을 측정하는 단계
를 포함할 수 있다. 상기 스크리닝 방법에 있어서. 상기 에피토프와 후보 화합물이 10nM 이하, 예컨대, 1 pM 내지 10 nM 범위, 또는 10 pM 내지 10 nM, 또는 100 pM 내지 10 nM 범위의 결합력을 보이는 경우에는, 상기 후보 화합물을 앤지오포이에틴-2 활성화 및/또는 과생성(과발현)과 관련된 질병의 진단, 예방, 및/또는 치료를 위한 후보 물질로 판단할 수 있다.
상기 에피토프는 인간 Ang-2 (hAng-2; 서열번호 28; Accession # O15123) 의 루프 1 (서열번호 27 중 417번째 아미노산부터 434번째 아미노산까지의 부위)의 전부, 일부(예컨대, 루프 1 중 외부에 노출된 아미노산 잔기 부위로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상), 또는 서열번호 28 중에서 루프 1의 외부에 노출된 아미노산 잔기를 하나 이상 포함하는 연속하거나 연속하지 않는 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 또는 2개 내지 10개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열 부위 일 수 있으며, 예컨대, 서열번호 28의 루프 1에 위치하는 Q418, Q418과 P419와의 조합, 또는 이들을 포함하는 연속하거나 연속하지 않는 2개 내지 20개, 2개 내지 15개, 2개 내지 10개, 또는 2개 내지 5개의 아미노산을 포함하는 아미노산 서열 부위로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
상기 후보 화합물은 인공적으로 합성되거나 천연의 각종 화합물, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드, 폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드, 안티센스-RNA, shRNA(short hairpin RNA), siRNA(small interference RNA), 압타머, 천연물 추출물 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
상기 에피토프와 후보 화합물과의 결합력을 측정하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통해 실시될 수 있다. 예를 들어, 상기 결합력은 Biacore 장치를 사용하여 측정할 수 있다. 일반적으로, 치료용 약품으로서 상기 결합력이 인정되는 범위는 결합 상수인 KD값이 10 nM 이하로 정의될 수 있다. 즉, 예를 들어, 상술한 앤지오포이에틴-2의 에피토프와 분석하고자 하는 후보 화합물(예를 들어, 항체)의 결합력은 Biacore 장치와 같은 표면 플라스몬 공명(Surface Plasmon Resonance) 방법으로 측정하였을 때, 0.1pM 내지 50nM, 구체적으로 0.5pM 내지 35nM, 보다 구체적으로 1pM 내지 10nM인 경우, 상기 후보 화합물(예를 들어, 항체)을 앤지오포이에틴-2 활성화 및/또는 과생성과 관련된 질병의 진단, 예방 및/또는 치료용 후보 물질로 판단할 수 있다.
다른 예에서, 앞서 설명한 항 Ang-2 항체의 중쇄 상보성 결정 부위, 경쇄 상보성 결정 부위, 또는 이들의 조합; 또는 중쇄 가변 영역, 경쇄 가변 영역, 또는 이들의 조합을 포함하는 폴리펩타이드 분자가 제공된다. 상기 폴리펩타이드 분자는 항체의 제작뿐 아니라 항체와 유사한 구조를 갖는 단백질 골격체 (protein scaffold; 예컨대 펩티바디), 이중 특이 항체, 다중 특이 항체의 구성 성분으로 포함될 수 있다. 상기 폴리펩타이드 분자는 서열번호 1 내지 21로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 포함하는 것일 수 있다.
구체적으로, 상기 폴리펩타이드 분자는
서열번호 1의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 일반식 1 (서열번호 14)의 아미노산 서열 (예컨대, 서열번호 2, 또는 서열번호 3의 아미노산 서열)을 갖는 폴리펩타이드, 및 서열번호 4 내지 서열번호 6으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상;
서열번호 7 또는 서열번호 8의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 서열번호 9 또는 서열번호 10의 아미노산 서열을 갖는 폴리펩타이드, 및 일반식 2 (서열번호 15)의 아미노산 서열 (예컨대, 서열번호 11 내지 서열번호 13으로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열)을 갖는 폴리펩타이드로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상; 또는
이들의 조합
을 포함하는 것일 수 있다.
구체예에서, 상기 폴리펩타이드 분자는 서열번호 16 내지 18로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열, 서열번호 19 내지 서열번호 21로 이루어진 군에서 선택된 아미노산 서열, 또는 이들의 조합을 포함하는 것일 수 있다.
일 예에서, 상기 폴리펩타이드 분자는 서열번호 8, 서열번호 10, 및 서열번호 12로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상의 아미노산 서열로만 이루어진 것이 아니거나, 서열번호 20의 아미노산 서열로만 이루어진 것이 아닐 수 있다.
상기 이중 특이 항체 또는 다중 특이 항체는, 서로 다른 2종 또는 그 이상의 항원에 대한 각각의 항원 결합 부위를 포함하여, 2종 이상 또는 그 이상의 항원을 동시에 인식하는 항체로서, 상기 항원 결합 부위 중 하나는 앞서 설명한 폴리펩타이드 분자를 포함하는 것일 수 있다. 구체적으로, Ang-2 항원 결합 부위 역할을 하는 상기 폴리펩타이드 분자는 다른 항원에 대한 항원 결합 부위와 이합체 또는 다합체를 형성하여 이중 특이 항체 또는 다중 특이 항체를 구성할 수 있다. 따라서, 일 구체에서, Ang-2 항원 결합 부위로서 상기 폴리펩타이드 분자를 포함하는 이중 특이 항체 또는 다중 특이 항체가 제공된다.
또 다른 예에서, 앞서 설명한 폴리펩타이드 분자 하나 이상 또는 상기 폴리펩타이드 분자가 링커에 의하여 반복하여 연결된 반복체 (이하, '제1 펩타이드')와 구조적 기능을 하는 폴리펩타이드 (이하, '제2 펩타이드'; 예컨대, 항체의 중쇄 또는 경쇄의 불변부위, 또는 항체의 Fc 단편)를 포함하는 펩타이드 복합체를 하나 이상 (예컨대 1 내지 5개, 구체적으로 2 내지 4개) 포함하고, 상기 하나 이상의 펩타이드 복합체가 제2 펩타이드 (예컨대 Fc 단편)에서 결합되어 다합체 구조를 갖는 단백질 골격체가 제공된다.
본 발명에서 항체는 동물 유래 항체, 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 완전 인간 항체를 모두 포함한다. 원하는 항원을 피면역 동물에게 면역시켜 생산하는 동물 유래 항체는 일반적으로 치료 목적으로 인간에 투여 시 면역거부반응이 일어날 수 있으며, 이러한 면역거부반응을 억제하고자 키메릭 항체(chimeric antibody)가 개발되었다. 키메릭 항체는 유전공학적 방법을 이용하여 항-아이소타입(anti-isotype) 반응의 원인이 되는 동물 유래 항체의 불변 영역을 인간 항체의 불변 영역으로 치환한 것이다. 키메릭 항체는 동물 유래 항체에 비하여 항-아이소타입 반응에 있어서 상당 부분 개선되었으나, 여전히 동물 유래 아미노산들이 가변 영역에 존재하고 있어 잠재적인 항-이디오타입(anti-idiotypic) 반응에 대한 부작용을 내포하고 있다. 이러한 부작용을 개선하고자 개발된 것이 인간화 항체(humanized antibody)이다. 이는 키메릭 항체의 가변 영역 중 항원의 결합에 중요한 역할을 하는 CDR(complementaritiy determining regions) 부위를 인간 항체 골격(framework)에 이식하여 제작된다.
인간화 항체를 제작하기 위한 CDR 이식(grafting) 기술에 있어서 가장 중요한 것은 동물 유래 항체의 CDR 부위를 가장 잘 받아들일 수 있는 최적화된 인간 항체를 선정하는 것이며, 이를 위하여 항체 데이터베이스의 활용, 결정구조(crystal structure)의 분석, 분자모델링 기술 등이 활용된다. 그러나, 최적화된 인간 항체 골격에 동물 유래 항체의 CDR 부위를 이식할지라도 동물 유래 항체의 골격에 위치하면서 항원 결합에 영향을 미치는 아미노산이 존재하는 경우가 있기 때문에, 항원 결합력이 보존되지 못하는 경우가 상당수 존재하므로, 항원 결합력을 복원하기 위한 추가적인 항체 공학 기술의 적용은 필수적이라고 할 수 있다.
일 구체예에 따르면, 상기 항체는 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체, 인간화 항체 또는 인간 항체일 수 있다.
본 발명에서 "항체"라 함은, 면역계 내에서 항원의 자극에 의하여 만들어지는 물질을 의미하는 것으로서 그 종류는 특별히 제한되지 않는다. 항체는 최근에 질병 치료제의 용도로 많이 사용되고 있다. 항체는 생체 외뿐 아니라 생체 내에서도 매우 안정하고 반감기가 길기 때문에 대량 발현 및 생산에 유리하다. 또한, 항체는 본질적으로 다이머(dimer) 구조를 가지므로 접착능(avidity)이 매우 높다.　
완전한 항체는 2개의 전장(full length) 경쇄 및 2개의 전장 중쇄를 가지는 구조이며 각각의 경쇄는 중쇄와 이황화 결합으로 연결되어 있다. 항체의 불변 영역은 중쇄 불변 영역과 경쇄 불변 영역으로 나뉘어지며, 중쇄 불변 영역은 감마(γ), 뮤(μ), 알파(α), 델타(δ) 및 엡실론(ε) 타입을 가지고, 서브클래스로 감마1(γ1), 감마2(γ2), 감마3(γ3), 감마4(γ4), 알파1(α1) 및 알파2(α2)를 가진다. 경쇄의 불변 영역은 카파(κ) 및 람다(λ) 타입을 가진다.
용어, "중쇄(heavy chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위해 충분한 가변 영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VH 및 3개의 불변 영역 도메인 CH1, CH2 및 CH3과 힌지(hinge)를 포함하는 전장 중쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다. 또한, 용어 "경쇄(light chain)"는 항원에 특이성을 부여하기 위한 충분한 가변영역 서열을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 가변 영역 도메인 VL 및 불변 영역 도메인 CL을 포함하는 전장 경쇄 및 이의 단편을 모두 포함하는 의미로 해석된다.
용어, "CDR(complementarity determining region)"은 면역글로불린의 중쇄 및 경쇄의 고가변 영역(hypervariable region)의 아미노산 서열을 의미한다. 중쇄 및 경쇄는 각각 3개의 CDR을 포함할 수 있다(CDRH1, CDRH2, CDRH3 및 CDRL1, CDRL2, CDRL3). 상기 CDR은 항체가 항원 또는 에피토프에 결합하는 데 있어서 주요한 접촉 잔기를 제공할 수 있다. 한편, 본 명세서에 있어서, 용어, "특이적으로 결합" 또는 "특이적으로 인식"은 당업자에게 통상적으로 공지되어 있는 의미와 동일한 것으로서, 항원 및 항체가 특이적으로 상호작용하여 면역학적 반응을 하는 것을 의미한다.
본 발명에서 제공되는 항체의 항원 결합 단편은 상기 상보성 결정부위를 하나 이상 포함하는 단편일 수 있다.
용어, "항원 결합 단편"은 면역글로불린 전체 구조에 대한 그의 단편으로, 항원이 결합할 수 있는 부분을 포함하는 폴리펩타이드의 일부를 의미한다. 예를 들어, scFv, (scFv)2, Fab, Fab' 또는 F(ab')2일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 항원 결합 단편 중 Fab는 경쇄 및 중쇄의 가변영역과 경쇄의 불변 영역 및 중쇄의 첫 번째 불변 영역(CH1)을 가지는 구조로 1개의 항원 결합 부위를 가진다. Fab'는 중쇄 CH1 도메인의 C-말단에 하나 이상의 시스테인 잔기를 포함하는 힌지 영역(hinge region)을 가진다는 점에서 Fab와 차이가 있다. F(ab')2 항체는 Fab'의 힌지 영역의 시스테인 잔기가 디설파이드 결합을 이루면서 생성된다. Fv는 중쇄 가변부위 및 경쇄 가변부위만을 가지고 있는 최소의 항체조각으로 Fv 단편을 생성하는 재조합 기술은 당업계에 널리 공지되어 있다. 이중쇄 Fv(two-chain Fv)는 비공유 결합으로 중쇄 가변부위와 경쇄 가변부위가 연결되어 있고 단쇄 Fv(single-chain Fv)는 일반적으로 펩타이드 링커를 통하여 중쇄의 가변 영역과 단쇄의 가변 영역이 공유 결합으로 연결되거나 또는 C-말단에서 바로 연결되어 있어서 이중쇄 Fv와 같이 다이머와 같은 구조를 이룰 수 있다. 상기 링커는 1 내지 100개 또는 2 내지 50개의 임의의 아미노산으로 이루어진 펩타이드 링커일 수 있으며, 당업계에 적절한 서열이 알려져 있다. 상기 항원 결합 단편은 단백질 가수분해 효소를 이용해서 얻을 수 있고(예를 들어, 전체 항체를 파파인으로 제한 절단하면 Fab를 얻을 수 있고 펩신으로 절단하면 F(ab')2 단편을 얻을 수 있다), 유전자 재조합 기술을 통하여 제작할 수 있다.
용어 "힌지 영역(hunge region)"은 항체의 중쇄에 포함되어 있는 영역으로서, CH1 및 CH2 영역 사이에 존재하며, 항체 내 항원 결합 부위의 유연성(flexibility)를 제공하는 기능을 하는 영역을 의미한다. 예컨대, 상기 힌지는 인간 항체로부터 유래한 것일 수 있으며, 구체적으로, IgA, IgE, 또는 IgG, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG 3, 또는 IgG4로부터 유래한 것일 수 있다.
동물 유래 항체가 키메릭화(chimerization) 과정을 거치게 되면, 동물 유래의 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지로 치환되지만, 동물 유래 IgG1 힌지는 인간 IgG1 힌지에 비하여 그 길이가 짧고, 두 개의 중쇄 사이의 이황화결합(disulfide bond)이 3개에서 2개로 감소하여 힌지의 경직성(rigidity)이 서로 상이한 효과를 보이게 된다. 따라서, 힌지 영역의 변형(modification)은 인간화 항체의 항원 결합 효율성을 증가시킬 수 있다. 상기 힌지 영역의 아미노산 서열을 변형시키기 위한 아미노산의 결실, 부가 또는 치환 방법은 당업자에게 잘 알려져 있다.
항 Ang-2　항체의 가변 부위를 제외한 부분은 인간 항체로부터 유래한 불변부위일 수 있으며, 구체적으로, IgA, IgE, 또는 IgG, 예컨대, IgG1, IgG2, IgG 3, 또는 IgG4로부터 유래한 불변부위일 수 있다.
항 Ang-2　항체는 단클론 항체일 수 있다. 단클론 항체는 당 업계에 널리 알려진 방법대로 제조될 수 있다. 예컨대, phage display 기법을　이용해서 제조될 수 있다. 또는, 항 Ang-2 항체는 마우스 단클론항체를 이용하여 Schwaber 등의 논문에 기재된 방법에 의하여 마우스 유래의 단클론 항체로 제조될 수 있다(Schwaber, J and Cohen, E. P., "Human x Mouse Somatic Cell Hybrid Clones Secreting Immunoglobulins of Both Parental Types," Nature, 244 (1973), 444-447).
한편, 전형적인 ELISA(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) 포맷을 이용하여 Ang-2와의 결합능에 기초하여 개별 단클론항체들을 스크리닝할 수 있다. 결합체들에 대해 분자적 상호작용을 검정하기 위한 경쟁적　ELISA(Competitive ELISA)와 같은 기능성 분석　또는 세포-기반 분석(cell-based assay)과 같은 기능성 분석을 통해 저해 활성에 대해 검정할 수 있다. 그런 다음 강한 저해 활성에 기초하여 선택된 단클론항체 멤버들에 대해 Ang-2에 대한 각각의 친화도(Kd values)를 검정한다.
최종 선택된 항체들은 항원결합부를 제외한 나머지 부분이 인간의 면역글로블린 항체화된 항체뿐만 아니라, 인간화 항체로서 제조하여 사용할 수 있다. 인간화 항체의 제조방법은 당 업계에 잘 알려져 있다 (Almagro, J. C. and Fransson, J., "Humanization of antibodies," Frontiers in Bioscience, 13(2008), 1619-1633).
다른 예는 상기 항 Ang-2 항체의 단클론 항체를 생산하는 하이브리도마 세포주를 제공한다. 상기 하이브리도마 세포주는 수탁번호 KCLRF-BP-00292, KCLRF-BP-00293, 또는 KCLRF-BP-00294인 세포주일 수 있다.
다른 예는 상기 Ang-2 특이적 항체를 유효성분으로 포함하는 신생혈관 형성 저해용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 Ang-2 특이적 항체를 유효성분으로 포함하는 세포부착 억제용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 Ang-2 특이적 항체를 유효성분으로 포함하는 신생혈관 형성 및/또는 세포부착과 관련된 질병의 치료용 약학 조성물을 제공한다.
다른 예는 상기 항체를 포함하는 신생혈관 형성 및/또는 세포부착과 관련된 질병의 진단용 조성물을 제공한다.
상기 세포부착은 암전이의 주요 기작으로, 구체적으로 암세포의 세포 부착일 수 있으며, Ang-2 의존적 세포부착일 수 있다.
상기 약학 조성물은 약학적으로 허용 가능한 담체를 추가로 포함할 수 있으며, 상기 담체는 약물의 제제화에 통상적으로 이용되는 것으로서, 락토스, 덱스트로스, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 전분, 아카시아 고무, 인산 칼슘, 알기네이트, 젤라틴, 규산 칼슘, 미세결정성 셀룰로스, 폴리비닐피롤리돈, 셀룰로스, 물, 시럽, 메틸 셀룰로스, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 활석, 스테아르산 마그네슘, 미네랄 오일 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 약학 조성물은 또한 약학 조성물 제조에 통상적으로 사용되는 희석제, 부형제, 윤활제, 습윤제, 감미제, 향미제, 유화제, 현탁제, 보존제 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상을 추가로 포함할 수 있다.
상기 약학 조성물, 또는 상기 항체 또는 이의 항원결합단편의 유효량은 경구 또는 비경구로 투여할 수 있다. 비경구 투여인 경우에는 정맥내 주입, 피하 주입, 근육 주입, 복강 주입, 내피 투여, 국소 투여, 비내 투여, 폐내 투여 및 직장내 투여 등으로 투여할 수 있다. 경구 투여시, 단백질 또는 펩타이드는 소화가 되기 때문에 경구용 조성물은 활성 약제를 코팅하거나 위에서의 분해로부터 보호되도록 제형화될 수 있다. 또한, 상기 조성물은 활성 물질이 표적 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다.
상기 약학 조성물 내의 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 함유량은 제제화 방법, 투여 방식, 환자의 연령, 체중, 성, 병적 상태, 음식, 투여 시간, 투여 간격, 투여 경로, 배설 속도 및 반응 감응성과 같은 요인들에 의해 다양하게 처방될 수 있다. 예컨대, 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편의 1일 투여량은 0.001 내지 1000㎎/kg, 구체적으로 0.01 내지 100㎎/kg, 보다 구체적으로 0.1 내지 50 ㎎/kg범위일 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 1일 투여량은 단위 용량 형태로 하나의 제제로 제제화되거나, 적절하게 분량하여 제제화되거나, 다용량 용기 내에 내입시켜 제조될 수 있다.
상기 약학적 조성물은 오일 또는 수성 매질중의 용액, 현탁액, 시럽제 또는 유화액 형태이거나 엑스제, 산제, 분말제, 과립제, 정제 또는 캅셀제 등의 형태로 제형화될 수 있으며, 제형화를 위하여 분산제 또는 안정화제를 추가적으로 포함할 수 있다.
특히, 상기 항 Ang-2 항체 또는 그 항원 결합 단편을 포함하는 약학 조성물은 항체 또는 항원 결합 단편을 포함하므로, 면역 리포좀으로 제형화될 수 있다. 항체를 포함하는 리포좀은 당업계에 널리 알려진 방법에 따라 제조될 수 있다. 상기 면역 리포좀은 포스파티딜콜린, 콜레스테롤 및 폴리에틸렌글리콜-유도체화된 포스파티딜에탄올아민을 포함하는 지질 조성물로서 역상 증발법에 의해 제조될 수 있다. 예를 들어, 항체의 Fab' 단편은 디설파이드-교체 반응을 통해 리포좀에 접합될 수 있다.
한편, 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은 Ang-2에 특이적으로 결합하므로, 이를 이용하여 Ang-2를 검출할 수 있으며, 이를 통하여 Ang-2의 과발현 여부를 확인할 수 있다. 따라서, 본 발명의 또 다른 예는 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 포함하는 Ang-2 검출용 조성물 및 Ang-2 과발현과 관련된 질병의 진단용 조성물을 제공한다.
또 다른 예에서, 환자로부터 얻어진(분리된) 생물 시료에 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계; 및 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계를 포함하는 Ang-2 검출 방법이 제공된다. 또한, 환자로부터 얻어진 생물 시료에 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 처리하는 단계; 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계; 및 항원-항체 반응이 탐지되는 경우 상기 환자를 Ang-2 과발현 증상이 존재하거나, Ang-2 과발현 관련 질병을 갖는 것으로 판단하는 단계를 포함하는, 진단 방법이 제공된다. 상기 생물 시료는 환자로부터 얻어진 (분리된) 세포, 조직, 체액 등으로 이루어진 군에서 선택된 것일 수 있다.
상기 항원-항체 반응 여부를 확인하는 단계는 당업계에 공지된 다양한 방법을 통하여 수행할 수 있다. 예컨대, 통상적인 효소 반응, 형광, 발광 및/또는 방사선 검출을 통하여 하여 측정될 수 있으며, 구체적으로, 면역크로마토그래피(Immunochromatography), 면역조직화학염색(Immunohistochemistry), 효소결합 면역흡착 분석(enzyme liked immunosorbent assay: ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA), 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA), 웨스턴블라팅(Western blotting) 등으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법에 의하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 약학 조성물의 투여 또는 진단 대상 환자는 인간, 원숭이 등을 포함하는 영장류, 마우스, 래트 등을 포함하는 설치류 등을 포함하는 포유류일 수 있다.
상기 신생혈관 형성 및/또는 세포부착 및/또는 Ang-2 과발현과 관련된 질병은 암, 암전이, 미숙아 망막병증, 황반변성 (예컨대, 연령 관련 황반변성), 당뇨병성 망막병증, 혈관신생성 녹내장 등의 안질환, 건선, 천식, 류마티스성 관절염, 폐렴, 만성 염증 등의 염증 질환, 감염성질환, 고혈압, 동맥경화, 신장관련 질환, 패혈증 등일 수 있다. 상기 암은 Ang-2를 과발현하는 것으로, 고형암 또는 혈액암일 수 있으며, 이에 제한되지 않지만, 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암, 골육종 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다.
기존에는 Ang-2와 그 수용체인 Tie2와의 결합을 저해함으로써 Ang-2에 의한 신생혈관형성을 저해하려는 시도가 있어왔으나, 암세포의 이동, 침투, 및 전이뿐 아니라 혈관내피세포의 이동 및 침투에도 중요한 역할을 하는 것으로 보고되고 있는 Ang-2와 인테그린(integrin)간의 결합에 대한 저해제는 현재까지 알려져 있지 않다. 이러한 상황에서, 본 발명은 Ang-2 의존적인 세포 부착 및 Ang-2와 integrin간의 결합을 효과적으로 차단할 수 있는 항체를 제안함으로써, Ang-2에 의한 암세포의 전이 및 신생혈관형성을 저해할 수 있는 새로운 방법을 제시한다. 또한 본 발명에서 제안되는 항체는 암 이외의 비정상적 혈관 형성관련 질환의 진단 및 치료에의 응용 가능성이 기대된다. 상기 항체는 화학 의약품 및 기타 다른 항암 치료제와 병용 치료 요법 등에 활용 가능하며, Ang-2 특이적인 인지작용을 이용하여 antibody fragment, bi- 또는 multi-specific antibody, protein scaffold 등에 사용 가능할 것으로 기대된다.
도 1은 U87MG 세포주에서의 Tie2이 발현 여부를 측정한 겔 전기영동 결과이다.
도 2는 Ang-2 코팅된 웰에서의 U87MG 부착 정도를 보여주는 그래프이다 (ALU: arbitrary light unit).
도 3은 일 실시예에 따른 항 Ang-2 항체의 처리에 따른 Ang-2-의존적 세포 부착의 저해 정도를 보여주는 그래프이다.
도 4는 일 실시예에 따른 항 Ang-2 항체 처리 후의 Ang-2:Tie2 결합력을 HRP를 이용한 발색반응으로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 5은 Ang-2 단백질과 인테그린 단백질 간 결합 여부를 HRP를 이용한 발색반응으로 측정하여 나타낸 그래프이다.
도 6은 일 실시예에 따른 항 Ang-2 항체 처리 후의 Ang-2와 인테그린(alphaVbeta3) 간의 결합 정도를 효소면역분석법으로 정량화하여 나타낸 그래프이다.
도 7는 인테그린과 FLAG-Ang-2의 세포막 상에서의 결합 정도를 cell flow cytometry data로 분석한 결과이고, 도 8은 상기 도7의 결과를 linear-log scale의 그래프로 보여주는 것이다
도 9는 일 실시예에 따른 항 Ang-2 항체의 Ang-2 단백질과의 결합력을 야생형 Ang-2 단백질과 Q418A 변이를 갖는 Ang-2 단백질에서 각각 측정하여 나타낸 그래프이다.
이하에서는 실시예를 들어 본 발명을 더욱 구체적으로 설명하고자 하나, 이는 예시적인 것에 불과할 뿐 본 발명의 범위를 제한하고자 함이 아니다. 아래 기재된 실시예들은 발명의 본질적인 요지를 벗어나지 않는 범위에서 변형될 수 있음은 당 업자들에게 있어 자명하다.
실시예 1. 항 Ang-2 항체의 제조
　항 Ang-2 항체는 5주령의 BALB/c 마우스에 인간 Ang-2 단백질 (R&D systems; 623-AN-025/CF)를 adjuvant와 함께 투여하여 면역반응을 유도한 후 Schwaber 등의 논문에 기재된 공지된 방법에 의해 개별 항체를 생산하는 하이브리도마들을 제조하였다(Schwaber, J and Cohen, E. P., "Human x Mouse Somatic Cell Hybrid Clones Secreting Immunoglobulins of Both Parental Types," Nature, 244 (1973), 444-447).
보다 구체적으로, 하이브리도마 세포주의 개발에 필요한 면역화 된 마우스를 얻기 위하여, 5마리의 5주령의 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)에 한 마리당 100 ug 의 인간의 Ang-2 단백질(R&D Systems)과 동량의 완전 프로인드 어주번트(Freund's adjuvant)를 혼합하여 4-6 주된 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하였다. 2주 후에 상기와 동일한 방법으로 항원(먼저 주사한 양의 절반)을 불완전 프로인드 어주번트(incomplete Freund's adjuvant)와 혼합하여 마우스의 복강 내에 주사하였다. 일주일 후 마지막 부스팅(boosting)이 수행되고 3일 후에 상기 마우스의 꼬리에서 채혈하여 혈청을 얻은 뒤 1/1000로 PBS에 희석하여 ELISA로 Ang-2을 인지하는 항체의 역가가 증가됨을 확인하였다. 상기의 결과로 항체의 양이 충분하게 얻어지는 마우스를 선별하여 세포융합과정을 수행하였다.
세포융합 실험 3일 전에 50 ug의 PBS에 인간 Ang-2 단백질 (R&D systems) 100 ug을 혼합한 혼합물을 BALB/c 마우스(Japan SLC, Inc.)의 복강 내에 주사하고, 면역화 된 마우스를 마취한 후 몸통의 좌측에 위치한 비장(spleen)을 적출하였다. 적출한 비장을 메쉬로 갈아서 세포를 분리하고, 배양배지(DMEM, Hyclon)와 혼합하여 비장세포 현탁액을 만들었다. 상기 현탁액을 원심분리하여 세포층을 회수하였다. 상기 얻어진 비장세포 1x108 개와 골수종세포(Sp2/0) 1x107 개를 혼합한 다음 원심분리하여 세포를 침전시켰다. 원심분리된 침전물을 천천히 분산시키고, 배양배지(DMEM)에 들어있는 45 % 폴리에틸렌 글리콜(PEG 1500) 1 ㎖을 처리하고, 37 ℃에서 1분 동안 유지시킨 후, 배양배지(DMEM) 1 ㎖을 첨가하였다. 이후 배양배지(DMEM) 10 ㎖을 1분 동안 첨가하고, 37℃의 물에서 5분 동안 방치한 후 50 ㎖로 맞추어 다시 원심분리하였다. 세포 침전물을 분리배지(HAT 배지)에 1~2×105/㎖ 정도로 재현탁시키고, 96-웰(well) 플레이트에 0.1 ㎖씩 분주한 후 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하여 하이브리도마 세포군을 제작하였다. 상기 제작된 하이브리도마는 대한민국 서울 종로구 연건동에 소재하는 한국세포주연구재단에 2013년 4월 23일자로 기탁하여 수탁번호 KCLRF-BP-00292(7F8), KCLRF-BP-00293(8B3), KCLRF-BP-00294(2E7)를 각각 부여받았다.
실시예 2. 항-Ang-2 항체의 제작
2.1. 항-Ang-2 항체의 생산 클론　선별 및 항체 정제
상기 얻어진 개별 항체 생산 하이브리도마들로부터 전형적인 ELISA 포맷을 이용하여 Ang-2와의 결합능에 기초하여 모　하이브리도마로부터 분화시킨 하이브리도마 중 95개의 항 Ang-2 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마를 선별하였다.
보다 구체적으로, 상기 실시예 1에서 제조된 하이브리도마 세포군 중에서 Ang-2 단백질에만 특이적으로 반응하는 하이브리도마 세포를 선별하기 위하여 인간의 Ang-2 단백질을 항원으로 이용한 ELISA 분석 방법을 통하여 스크리닝하였다.
마이크로타이터 플레이트에 인간의 Ang-2 단백질을 한 웰당 각각 100 ng씩 가하여 플레이트 표면에 부착시키고, 반응하지 않은 항원은 세척하여 제거하였다. 상기 실시예 1에서 얻어진 하이브리도마 세포의 배양액을 각각 웰에 50 ㎕씩을 가하여 1 시간 동안 반응시킨 후 인산 완충용액-트윈 20(TBST) 용액으로 충분히 세척하여 반응하지 않은 배양액을 제거하였다. 여기에 염소 항-마우스 IgG-호스래디쉬 퍼옥시다제(goat anti-mouse IgG-HRP)를 가하여 1 시간 동안 실온에서 반응시킨 다음, TBST 용액으로 충분히 세척하였다. 이어서 퍼옥시다제의 기질용액(OPD)을 가하여 반응시키고, 그 반응정도는 엘리자 해독기(ELISA Reader)로 450 nm에서 흡광도를 측정하여 인간의 Ang-2 단백질에만 특이적으로 높은 결합력을 갖는 항체를 분비하는 하이브리도마 세포주들을 반복하여 선별하였다. 반복 선별을 통해 얻은 하이브리도마 세포주를 제한 희석(limiting dilution)하여 단일클론 항체를 생성하는 하이브리도마 세포주 58개의 클론을 최종적으로 얻었다.
상기 얻어진 각각의 하이브리도마를 DMEM (Dulbeco's Modified Eagle's Medium)에서 배양한 후 배양액을 모아 프로테인 G-친화성 크로마토그래피법으로 각각의 하이브리도마에서 생산되는 항 Ang-2 단클론 항체를 정제하였다.
먼저 10% (v/v) FBS이 포함된 배양배지(DMEM) 배지 50 ㎖에서 배양된 상기 하이브리도마 세포를 원심분리하여 세포 침전물을 20 ㎖ PBS로 2회 이상 세척하여 FBS가 제거된 상태에서 배양배지(DMEM) 배지 50 ㎖을 세포 침전물에 재현탁시킨 후 3일 동안 37℃ 이산화탄소 배양기에서 배양하였다. 이후 원심분리를 통해 항체를 생산하는 세포를 제거하고 항체들이 분비된 배양액을 분리하여 4℃에 보관하거나 바로 모아서 50 ㎖ 내지 300 ㎖의 배양액으로부터 친화성 칼럼(Protein G agarose column; Pharmacia, USA)을 장착한 AKTA 정제 기기(GE Healthcare)를 이용하여 항체를 순수 정제한 후 단백질 응집용 필터(Amicon)를 사용하여 PBS로 상층액을 치환하여 정제된 항체를 보관하고, 이후의 실험에 사용하였다. 상기 각각의 하이브리도마로부터 얻어진 항체를 각각 7F8 (KCLRF-BP-00292), 8B3 (KCLRF-BP-00293), 2E7 (KCLRF-BP-00294)로 명명하였다.
상기 5종의 항체의 인간 Ang-2 단백질에 대한 결합 친화도를BIAcore T100 (GE Healthcare)을 이용한SPR 방식으로 측정하였다. SPR 방식은 센서칩에 코팅된 물질의 상태에 따라 칩을 지나는 빛의 굴절률이 변화하는 원리를 이용한 것으로, 칩에 항원 또는 항체가 코팅된 상태에서 항체 또는 항원을 흘리면 이들간 결합으로 인한 굴절률의 변화가 발생하고, 이를 측정한 수치로부터 Kd 값을 계산한다.
먼저 pH 5.0 아세테이트 용액과 아민 커플링 키트(amine coupling kit; GE Healthcare)를 이용하여 anti-His 항체를 8,000 RU 레벨까지 CM5 센서칩(GE Healthcare)에 고정화시켰다. 여기에 6 ug/ml 농도의 재조합 hAng-2 (C-His, R&D Systems) 단백질을 흘려 보내 100 ~ 200 RU 레벨로 capture시켰다. 여기에 상기 실시예 2에서 얻어진 항체를 100 nM 농도로부터 순차적으로 2배씩 희석시킨 후, 각각 흘려 보내는 방법으로 센서칩에 capture된 항원과 결합 (on), 분리 (off), 해리 (regeneration, 10 mM NaOH 용액 사용)시키며 항원-항체간 친화도를 측정하였다. hAng1에 대하여 위와 같은 방법으로 실험하였으며, 그 결과는 하기 표 3와 같다.　　　
항체 명칭 hAng-2 (Kd)
SAIT-Ang-2-AB-m7F8 4.2 pM
SAIT-Ang-2-AB-m8B3 8.6 pM
SAIT-Ang-2-AB-m2E7 30.6 nM
2.2. 항 Ang-2 항체의 유전자 클로닝
상기 실시예 2.1에서 얻어진 각각의 항체생산 하이브리도마(2x106 세포)로부터 RNeasy mini kit (Qiagen)를 이용하여 전체 RNA를 얻었다. 그런 다음, 이를 주형(template)으로 하여, OneStep RT-PCR kit (Qiagen)과 Mouse Ig-Primer Set (Novagen)과 써모사이클러(GeneAmp PCR System 9700, Applied Biosystem)를 사용하여 하기 조건으로 각 하이브리도마에서 생산되는 모노클로날 항체의 중쇄 및 경쇄의 가변영역(variable region) 유전자 서열만 증폭시켰다: 94℃에서 5분간; [50℃에서 30분, 95℃에서 15분], [94℃에서 1분, 50℃에서 1분, 72℃에서 2분]x 35 사이클; 72℃에서 6분간; 4℃로 냉각.
각 반응으로부터 얻어진 PCR 산물을 직접 DNA 염기서열분석(Sequencing)을 수행하여, 각 항체의 CDR, 중쇄 가변부 및 경쇄 가변부 및 이들을 암호화하는 염기서열을 얻었으며, 상기 얻어진 결과를 아래의 표 4 내지 7에 정리하였다:
항체 명칭 중쇄 CDR 서열
CDRH1-KABAT CDRH2-KABAT CDRH3-KABAT
SAIT-Ang-2-AB-m7F8 DYAWN
(서열번호1)		 YISYSGSTSYNPSLKS
(서열번호 2)		 STFGHYVSSMDY
(서열번호4)
SAIT-Ang-2-AB-m8B3 DYAWN
(서열번호1)		 YINYRGNTDYNPSLKS
(서열번호 3)		 GNFEGAMDY
(서열번호5)
SAIT-Ang-2-AB-m2E7 　DYAWN
(서열번호1)		 YISYSGSTSYNPSLKS
(서열번호 2)		 　GDYGNYVGPMDY
(서열번호6)
항체 명칭 경쇄 CDR 아미노산 서열
CDRL1-KABAT CDRL2-KABAT CDRL3-KABAT
SAIT-Ang-2-AB-m7F8 KASQSASNDVA
(서열번호7)		 YASNRYT
(서열번호 9) 		QQDYSSPPT
(서열번호 11)
SAIT-Ang-2-AB-m8B3 KASQSVSNDVA
(서열번호8)		 YASNRYP
(서열번호 10)		 QQDYTSPWT
(서열번호 12)
SAIT-Ang-2-AB-m2E7 KASQSVSNDVA
(서열번호8)		 YASNRYT
(서열번호 9) 		QQDYSSPLT
(서열번호 13)
항체 명칭 중쇄 가변부 서열
SAIT-Ang-2-AB-m7F8 VQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITS DYAWN WIRQFPGNKLEWMG YISYSGSTSYNPSLKS RISITRDTSKNQFFLQLNSVTPEDTATYYCAR STFGHYVSSMDY WGQ (서열번호 16)
gatgtgcagcttcaggagtcgggacctggcctggtgaaaccttctcagtctctgtccctcacctgcactgtcactggctactcaatcaccagtgattatgcctggaactggatccggcagtttccaggaaacaaactggagtggatgggttacataagctacagtggtagcactagctacaacccatctctcaaaagtcgaatctctatcactcgagacacatccaagaatcagttcttcctgcagctgaattctgtgacacctgaggacacagccacatattactgtgcaagatcaacttttggtcactacgtcagttctatggactactggGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (서열번호 22)
SAIT-Ang-2-AB-m8B3 VQLQESGPGLVKPSQSLSLSCTVTGYSIAS DYAWN WIRQFPGNKVEWMG YINYRGNTDYNPSLKS RSSINRDTSKNQFFLQLNSVTTGDTATYYCAR GNFEGAMDY WGQ (서열번호 17)
gatgtgcagcttcaggagtcgggacctggcctggtgaaaccttctcagtctctgtccctctcctgcactgtcactggctactcaatcgccagtgattatgcctggaactggatccggcagtttccaggaaacaaagtggagtggatgggctacataaactaccgtggaaacactgactacaacccatctctcaaaagtcgaagctctatcaatcgagacacatccaagaaccagttcttcctgcaattgaattctgtgactactggggacacagccacatattactgtgcaagaggtaacttcgaaggagctatggactactggGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (서열번호 23)
SAIT-Ang-2-AB-m2E7 LQLQESGPGLVKPSQSLSLTCTVTGYSITS DYAWN WIRQFPGNKLEWMG YISYSGSTSYNPSLKS RISITRDTSKNQFFLQLNSLTTEDTATYYCAR GDYGNYVGPMDY WGQ (서열번호 18)
gatgtgcagcttcaggagtcgggacctggcctggtgaaaccttctcagtctctgtccctcacctgcactgtcactggctactcaatcaccagtgattatgcctggaactggatccggcagtttccaggaaacaaactggagtggatgggctacataagctacagtggtagtactagctacaacccatctctcaaaagtcgaatctctatcactcgagacacatccaagaaccagttcttcctacagttgaattctttgactactgaggacacagccacatattactgtgcaagaggggactatggtaactacgtgggacctatggactactggGGTCAAGGAACCTCAGTCACCGTCTCCTCA (서열번호 24)
항체 명칭 경쇄 가변부 서열
SAIT-Ang-2-AB-m7F8 SIVMTQTPKLLLVSAGDRVTITC KASQSASNDVA WYQQKPGQSPKLLIY YASNRYT GVPDRFTGSGYGTDFTFAISTVQAEDLAIYFC QQDYSSPPT FGGGTKLEIK (서열번호 19)
agtattgtgatgacccagactcccaaactcctgcttgtttcagcaggagacagggttaccataacctgcaaggccagtcagagtgcgagcaatgatgttgcttggtaccaacagaagccagggcagtctcctaaactgctgatatactatgcatccaatcgctacactggagtccctgatcgcttcactggcagtggatatgggacggatttcactttcgccatcagcactgtgcaggctgaagacctggcaatttatttctgtcagcaggattatagctctccaccgacgttcggtggaggcaccaagctggaaatcaaa (서열번호 25)
SAIT-Ang-2-AB-m8B3 TIVMTQTPKFLLVSAGDRITITC KASQSVSNDVA WYQQKPGQSPKLLIY YASNRYP GVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFC QQDYTSPWT FGGGTELEIK (서열번호 20)
actattgtgatgacccagactcccaaattcctgcttgtatcagcaggagacaggattaccataacctgcaaggccagtcagagtgtgagtaatgatgtagcctggtaccaacagaagccagggcagtctcctaaactgctgatatactatgcatccaatcgctaccctggagtccctgatcgcttcactggcagtggatatgggacggatttcactttcaccatcagcactgtgcaggctgaagacctggcagtttatttctgtcagcaggattatacctctccgtggacgttcggtggaggcaccgagctggaaatcaaa (서열번호 26)
SAIT-Ang-2-AB-m2E7 SIVMTQTPKFLLVSAGDRVTITC KASQSVSNDVA WYRQKPGQSPKLLIY YASNRYT GVPDRFTGSGYGTDFTFTISTVQAEDLAVYFC QQDYSSPLT FGARTKLELK (서열번호 21)
agtattgtgatgacccagactcccaaattcctgcttgtgtcagcaggagacagggttaccataacctgcaaggccagtcagagtgtgagtaatgatgtagcttggtaccgacagaagccagggcagtctcctaaactgctgatatactatgcatccaatcgctacactggagtccctgatcgcttcactggcagtggatatgggacggatttcactttcaccatcagcactgtgcaggctgaagacctggcagtttatttctgtcagcaggattatagctctccgctcacgttcggtgctaggaccaagctggagctgaaa (서열번호 27)
(상기 표 6 및 7에서, 밑줄 표시된 굵은 글씨는 순서대로 CDR1, CDR2, CDR3 임)
실시예 3. Ang-2 의존적 세포 부착 (Ang-2- dependent cell adhesion ) 억제 시험
Tie2를 발현하지 않는 것으로 알려진 U87MG 세포주의 Ang-2 의존적 세포 부착을 시험하여, Ang-2가 Tie2 이외에 다른 수용체와 결합함을 확인하였다.
구체적으로, Ang-2(R&D systems; 623-AN-025/CF)를 인산완충용액(Phosphate buffered saline; PBS)에 10 ug/ml의 농도로 희석시킨 용액 100 ul 를 96 웰플레이트에 처리하고 4℃에서 18시간동안 인큐베이션하여 웰을 Ang-2로 코팅하였다. 이후 Ang-2 코팅된 96 웰을 37℃에서 2% BSA (bovine serum albumin)로 1시간 동안 처리하여, Ang-2로 코팅되지 않은 표면을 차단(blocking)하였다.
T75 플라스크에서 약 70~80% 정도의 confluency를 보이는 뇌암세포주 U87MG(ATCC, HTB-14TM)을 트립신처리(trypsinize)하여 떼어낸 후, 무혈청 배지(serum-free media; IMDM(Iscove's Modified Dulbecco's Medium), invitrogen)로 2회 세척하고, 10 ml 의 IMDM에 약 3 x 105 cells/ml의 농도로 재현탁하였다. 상기 얻어진 세포 현탁액 150 ul를 앞서 준비된 코팅 및 블라킹 과정이 끝난 96 웰플레이트의 각각의 웰에 첨가하고 37℃의 CO2 인큐베이터에서 2시간동안 인큐베이션하여 세포 부착을 유도하였다.
이후 37℃로 데워진 IMDM로 4회 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거하였다. 세포의 부착 정도는 CellTiter-Glo reagent (Promega 사)를 이용하여 ATP의 양을 측정함으로써 정량화하였다.
한편, 상기 세포 부착 동안, 상기 실시예 2에서 얻어진 항 Ang-2 항체를 각각의 웰에 50nM 농도로 처리하여 Ang-2-의존적 세포 부착의 저해 정도를 측정하였다. 항체를 넣지 않은 군을 대조군으로 하였다.
상기 측정된 세포 부착 정도를 대조군(부착정도 100%)과 비교하여 다음의 표 8 및 도 3에 나타내었다.
항체 명칭 Ang-2 의존적 세포부착 정도(%)
대조군 (항체 무처리) 100
SAIT-Ang-2-AB-m7F8 35.1
SAIT-Ang-2-AB-m8B3 23.6
SAIT-Ang-2-AB-m2E7 28.1
상기 표 8 및 도 3에서 확인되는 바와 같이, 5종의 항 Ang-2 항체는 모두, 항체무처리 대조군과 비교하여, 적어도 60% 이상의 Ang-2 의존적 세포 부착 저해 효과를 나타내었다.
또한, 상기에서 사용된 U87MG 세포주에서 실제 Tie2이 발현되지 않는지를 확인하였다. 이를 위하여, U87MG 세포주(ATCC, HTB-14TM)의 단백질을 sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis (SDS-PAGE) 실험법으로 전개하고 nitrocellulose paper에 transfer 한 후, Tie2에 대한 항체(santa cruz biotechnology, SC-324)를 처리하여 western blot 방법을 수행하였다. Tie2를 발현하는 것으로 잘 알려진 혈관내피세포주 Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC; ATCC, CRL-1730TM)을 양성 대조군으로 사용하였다. GAPDH는 gel에 loading된 총 단백질 양에 대한 control로 사용하였다.
상기 얻어진 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에 나타난 바와 같이, U87MG 세포주는 Tie2를 발현하지 않음을 알 수 있다.
이와 같이 Tie2를 발현하지 않는 것으로 확인된 U87MG 세포주의 Angiopoietin-2 (이하 Ang-2) 의존적 세포 부착을 시험하여, Ang-2가 Tie2 이외에 다른 수용체와 결합함을 확인하였다.
구체적으로, Ang-2(R&D systems; 623-AN-025/CF)를 인산완충용액(Phosphate buffered saline; PBS)에 10 ug/ml의 농도로 희석시킨 용액 100 ul 를 96 웰플레이트에 처리하고 4℃에서 16시간동안 인큐베이션하여 웰을 Ang-2로 코팅하였다. 이후 Ang-2 코팅된 96 웰을 PBS로 2회 세척하고, 2%(v/v) 우혈청알부민(bovine serum albumin; BSA)을 포함하는 PBS 200 ul를 처리하여 실온에서 2시간동안 인큐베이션하여 블라킹하였다. 음성대조군으로 Ang-2 코팅 없이 블라킹만 된 웰(BSA만 처리)을 준비하였다.
블라킹 과정 중, T75 플라스크에서 약 70~80% 정도의 confluency를 보이는 뇌암세포주 U87MG(ATCC, HTB-14TM)을 트립신처리(trypsinize)하여 떼어낸 후, 무혈청 배지(serum-free media; IMDM, invitrogen)로 2회 세척하고, 10 ml 의 무혈청 배지에 약 3 x 105 cells/ml의 농도로 재현탁하였다. 상기 얻어진 세포 현탁액 150 ul를 앞서 준비된 코팅 및 블라킹 과정이 끝난 96 웰플레이트의 각각의 웰에 첨가하고 37℃의 CO2 인큐베이터에서 2시간동안 인큐베이션하여 세포 부착을 유도하였다.
이후 37℃로 데워진 무혈청 배지로 4회 세척하여 부착되지 않은 세포를 제거하였다. 세포의 부착정도는, IMDM에 1:1로 희석된 CellTiter-Glo reagent (Promega) 200ul를 첨가한 후 10분 후에 EnVision
Figure 112013059521213-pat00001
Multilabel Reader (PerkinElmer)에서 발광 정도(luminescence)를 측정하여 정량화하였다.
상기 결과를 도 2에 나타내었다. 도 2에 나타난 바와 같이, 음성 대조군으로 준비된 BSA만을 처리한 웰에서 U87MG 세포 부착이 거의 일어나지 않은 반면, Ang-2가 부착된 웰에서는 현저하게 높은 수준으로 U87MG 세포 부착이 일어남을 확인할 수 있다.
실시예 4: Ang-2- Tie2 결합에 대한 영향 시험
상기 실시예 2에서 얻어진 Ang-2 의존적인 세포 부착을 저해하는 항체들이 Ang-2와 Tie2의 결합 또한 저해하는지 여부를 확인하기 위하여 Ang-2-Tie2 binding competition ELISA를 수행하였다.
구체적으로, 96-well의 MaxiSorp™ flat-bottom plate (Nunc)를 4ug/ml의 인간 IgG1의 Fc를 결합시킨 단백질인 hTie2-Fc(R&D Systems) 로 코팅하였다. 그런 다음, 0.05% PBST (0.05%(v/v) Tween-20 포함된 Phosphate Buffer Saline)로 상기 플레이트를 5회 씻은 후, 1%(v/v) BSA(Bovine serum albumin; Sigma)가 함유된 PBS로 상온에서 1시간 동안 블로킹시켰다.
Ang-2:Tie2 competition ELISA를 수행하기 위하여, 상기 실시예 2에서 얻어진 각각의 항체를 50~0.0000005nM의 다양한 농도로 1% (v/v)의 BSA와 200 ng/ml 의 FLAG-Tagging 된 hAng-2과 함께　상기 hTie2/Fc 융합 단백질이 코팅된 각각의 웰에 넣어 준 후,　플레이트를 상온에서 2시간 반응시킨 후,　상기 플레이트를 PBST로 5회 세척하였다. 그 후, 호스래디쉬 퍼옥시다제(HRP)가 컨쥬게이션된 항-FLAG 항체 (Sigma)를 1% (v/v)의 BSA가 함유된 PBS로 1:5,000 (v/v) 비율로 희석하여 100 ul 의 양으로 각각의 웰에 넣어주고 상온에서 1시간 반응시킨 후, PBST로 5회 씻어 주었다. 마지막으로 상기 플레이트의 각 웰에 100 ul의 TMB 기질 (Cell Signaling)을 첨가하여 3분간 발색반응을 유도시켰으며, 이후, 5N H2SO4용액 100μl로 반응을 중지시키고, OD450 값을 plate 리더(Molecular Devices) 상에서 측정하였다. 항체를 넣지 않은 대조군에서 측정된 수치(Ang-2:Tie2 결합력)를 100%로 하여 이에 대한 상대값으로 각 항체를 넣은 시험군의 Ang-2:Tie2 결합력을 측정하였다.
상기 얻어진 결과를 도 4에 나타내었다. 도 4에서와 같이, 항체 처리군의 상대적 Ang-2:Tie2 결합력이 항체를 넣지 않은 대조군과 큰 차이가 없는 것을 확인하였다. 이러한 결과는 상기 실시예 2에서 얻어진 Ang-2 의존적 세포 부착을 저해하는 항체가 Ang-2와 Tie2간의 결합력을 중화(neutralization)시키지는 않는 선택적 활성을 보임을 입증하는 것이다.
실시예 5: 항 Ang-2 항체에 의한 Ang-2와 인테그린 간 결합 저해
5.1. Ang-2와 인테그린 간 결합 확인
3종의 인테그린(integrin; alpha5beta1(α5β1; α5: NCBI Accession No. P08648, β1: NCBI Accession No. P05556), alphaVbeta1(αVβ1; αV: NCBI Accession No. P06756, β1: NCBI Accession No. P05556), 및 alphaVbeta3(αVβ3; αV: NCBI Accession No. P06756, β3: NCBI Accession No. P05106); R&D systems) 단백질을 5 ug/ml의 농도로 PBS에 희석한 희석액을 ELISA 플레이트에 코팅한 후 (18시간, 4℃), 1%(v/v) BSA로 상온에서 1시간동안 블라킹하였다. 이후, FLAG 서열 (DYKDDDDK, Sigma)이 N-terminal에 태깅되어 있는 Ang-2 단백질 (FLAG-Ang-2, PBS에 10 ug/ml의 농도로 희석된 Ang-2 단백질 용액 0.1 ml)을 처리하여 상온에서 2시간 동안 인큐베이션하고, 0.05% PBST (0.05%(v/v) Tween-20 포함된 Phosphate Buffer Saline)로 5회 세척하였다. 그 후, horse radish peroxidase (HRP)가 접합(conjugation)되어 있는 항-FLAG 항체(Sigma)를 첨가하여 반응시키고, 다시 PBST로 5회 세척하였다. TMB(3,3,5,5-tetramethylbenzidine)를 HRP의 기질로 사용한 발색반응을 통해 ELISA 플레이트 내 남아있는 항-FLAG 항체의 양을 측정함으로써 간접적으로 Ang-2와 상기 3종의 인테그린 간의 결합을 확인하였다. 음성 대조군으로 Ang-2 단백질 처리 없이 블라킹(BSA 처리)만 된 것을 사용하였다.
상기 결과를 도 5에 나타내었다. 도 5에 나타낸 바와 같이, Ang-2 단백질이 상기 3종의 인테그린과 모두 결합함을 확인할 수 있다.
5.2. 항 Ang-2 항체에 의한 Ang-2와 인테그린 간 결합 저해 확인
Ang-2-의존적 세포부착은 여러 종류의 인테그린 단백질이 관여할 것으로 예상되므로, 항 Ang-2 항체가 Ang-2와 인테그린 단백질 integrin aVb3 결합에 미치는 영향을 살펴 보았다.
정제된 alphaVbeta3 단백질(αVβ3; αV: NCBI Accession No. P06756, β3: NCBI Accession No. P05106; R&D systems)을 5 ug/ml의 농도로 PBS에 희석한 희석액을 ELISA 플레이트에 코팅하였다 (18시간, 4℃). 그 후, FLAG 서열 (DYKDDDDK, Sigma)이 N-terminal에 태깅되어 있는 Ang-2 단백질 10 ug/ml과 함께 상기 실시예 2에서 제작된 항 Ang-2 항체를 각각 20nM의 농도로 넣고 상온에서 2시간 인큐베이션 하였다. horse radish peroxidase (HRP)가 접합(conjugation)되어 있는 항-FLAG 항체(Sigma)를 첨가하여 반응시키고, TMB(3,3,5,5-tetramethylbenzidine)를 HRP의 기질로 사용한 발색반응을 통해 ELISA 플레이트 내 남아있는 항-FLAG 항체의 양을 측정함으로써 Ang-2와 인테그린 간의 결합과 항체에 의한 저해 정도를 정량화하였다. 상기 얻어진 결과를 도 6에 나타내었다.
도 6 에서와 같이, 항 Ang-2 항체는 항체가 포함되지 않은 대조군과 비교하여 Ang-2와 인테그린 alphaVbeta3 의 결합을 효과적으로 저해함을 알 수 있다(<50%).
5.3. Ang-2와 인테그린 간 세포막에서의 결합 저해 확인
Chinese Hamster Ovary (CHO) 세포주(한국생명공학연구원 생명자원센터)에 트랜스펙선 마커로서 녹색 형광 단백질(Green fluorescent protein; GFP)을 encoding하는 cDNA(pTRACERTM-CMV2, Invitrogen)와 인테그린 α5β1의 cDNA 쌍을 lipofectamine 2000 reagent (Invitrogen)을 사용하여 제조사의 추천 실험 방법을 따라 트랜스펙션하였다. Transfection에 사용된 각 cDNA (integrin α5, αV, β1, β3 4종)는 Origene에서 구입하여 polymerase chain reaction 해당 open reading frame을 증폭하고 pcDNA3.1(+)/myc-His A (invitrogen)에 cloning 하였다.
트랜스팩션을 한 세포는 24시간 동안 정상 세포 배양 조건 (IMDM에 10%의 10% Fetal Bovine Serum과 Penicillin/streptomycin이 포함되어 있는 배지, 37?의 CO2 인큐베이터)에서 배양하였다.
그 이후 세포들을 떼어내어 무혈청배지(IMDM)에 약 2x107 cells/ml 로 재현탁하고, 이 세포 용액 45 ul에 PBS에 희석된 FLAG-Ang-2 20ug/ml 및 상기 실시예 2에서 제작된 각각의 항 Ang-2 항체 20ug/ml을 혼합한 후 4℃에서 1시간 동안 인큐베이션하였다. 이 세포들은 3%(v/v) 포름알데히드로 고정시키고 IMDM으로 세척한 후, 다시 R-Phycoerythrin을 접합시킨 항-FLAG 항체(Sigma)로 염색하여, flow cytometry로 분석하였다.
상기 결과를 도 7 및 8에 나타내었다. 도 7의 dot plot에서 y축은 트랜스펙션 마커인 GFP 발현 여부를, x축은 Ang-2 결합 정도를 보여준다. 빨간점은 각 y축 구간에 해당하는 여러 세포들에서의 인테그린과 Ang-2과의 결합 정도에 대한 평균을 나타낸다. 각 그래프의 윗부분의 빨간점이 이루는 선의 기울기가 낮을수록 Ang-2와의 결합 정도가 높음을 나타낸다. 상기 도 7에 나타난 Ang-2 결합 정도를 보다 명확하게 나타내기 위하여, 도 7 중의 빨간점을 linear-log scale의 그래프로 다시 작성하여 도 8에 나타내었다. 도 8에서, 세포막에서 Ang-2가 인테그린 α5β1에 잘 결합함을 확인할 수 있다. 반면, 음성 대조군으로 사용한 인테그린 없는 vector만 트랜스팩션한 세포의 경우는 인테그린과의 결합이 GFP 발현 여부와 무관하였으므로, Ang-2는 발현시킨 인테그린에 특이적으로 결합함을 나타낸다.
실시예 6. Ang-2 항체의 항원인지부위 ( epitope ) 확인
상기 실시예 2에서 제작된 각각의 항 Ang-2 항체들에 대해 각각의 에피토프(또는 특이적 결합 부위)를 확인하기 위하여 Flag이 tagging된 형태의 Ang-2 단백질의 수용체 결합 부위(receptor binding domain, RBD)를 인위적으로 돌연변이를 일으킨 재조합 단백질을 이용하여 ELISA를 수행하였다.
96-웰의 MaxiSorp™ flat-bottom 플레이트 (Nunc)의 각 웰을 1000nM의 항체 (실시예 2) 50 ul(microliter)로 코팅하였다.　그 후, 0.05%(v/v) Tween-20이 포함된 PBS (PBST)로 플레이트를 5회 씻은 후, 1%(v/v) BSA가 함유된 PBS로 상온에서 2시간 동안 블로킹시켰다.　 FLAG 서열 (DYKDDDDK, Sigma)이 N-terminal에 태깅되어 있는 Ang-2 단백질의 S417, Q418, P419, N421, I434, D448, A449, P452, Y460, N467, K468, 또는 F469 잔기를 알라닌으로 치환(mutation)시켜 얻어진 각각의 변이단백질(Mutant Ang-2)을 상기 플레이트의 각각의 웰에 각각 250ng씩 넣어준 후, 상기 플레이트를 상온에서 2시간 동안 반응시켰다.
0.05%(v/v)의Tween-20이 포함된 PBS로 5회 씻어준 후, HRP 가 Conjugation 된 항-FLAG　항체 (SIGMA)를 1%(v/v)의 BSA가 함유된 PBS로 1:5,000 (v/v) 비율로 희석하여 상온에서　1시간 반응시킨 후, 0.1%(v/v)의 Tween-20이 함유된 PBS로 5회 씻어 주었다.
마지막으로, 상기 플레이트의 각 웰에 50 ul의 TMB 기질 (Cell signaling)을 첨가하여 상온에서 3분동안 발색반응을 유도시켰으며, 이후, 50 ul의 Stop 용액 (Cell signaling) 첨가하여 반응을 중지시키고, OD450 값을 플레이트 리더(Molecular Devices) 상에서 측정하였다. Mutation 을 시킨 Ang-2와의 결합력을 mutation 을 시키지 않은 Ang-2와 비교함으로 Ang-2 항체들에 대한　각각의 에피토프를 확인하였다. 상기 얻어진 native Ang-2와의 결합력에 대한 Mutant Ang-2 와의 결합력(%) 측정 결과를 하기 표 9에 나타내었다:　
Figure 112013059521213-pat00002
상기 표 9에서 변이에 의한 결합력 저하가 가장 뚜렷한 Q418A 변이 단백질을 이용하여 ELISA 시험을 수행하였으며, 그 결과를 도 9에 나타내었다.
도 9에서도 Ang-2 단백질의 Q418A 변이에 의하여 항 Ang-2 항체의 Ang-2 단백질 결합력이 현저하게 감소함을 확인할 수 있다.
한국세포주연구재단 KCLRFBP00292 20130423 한국세포주연구재단 KCLRFBP00293 20130423 한국세포주연구재단 KCLRFBP00294 20130423
<110> SAMSUNG ELECTRONICS CO., LTD. <120> Ang2 specific antibodies and uses thereof <130> DPP20126855KR <160> 28 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 5 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H1 of anti-Ang2 antibody <400> 1 Asp Tyr Ala Trp Asn 1 5 <210> 2 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 of anti-Ang2 antibody <400> 2 Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 3 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 of anti-Ang2 antibody <400> 3 Tyr Ile Asn Tyr Arg Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 of anti-Ang2 antibody <400> 4 Ser Thr Phe Gly His Tyr Val Ser Ser Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 of anti-Ang2 antibody <400> 5 Gly Asn Phe Glu Gly Ala Met Asp Tyr 1 5 <210> 6 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H3 of anti-Ang2 antibody <400> 6 Gly Asp Tyr Gly Asn Tyr Val Gly Pro Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 7 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 of anti-Ang2 antibody <400> 7 Lys Ala Ser Gln Ser Ala Ser Asn Asp Val Ala 1 5 10 <210> 8 <211> 11 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L1 of anti-Ang2 antibody <400> 8 Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp Val Ala 1 5 10 <210> 9 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 of anti-Ang2 antibody <400> 9 Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr 1 5 <210> 10 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L2 of anti-Ang2 antibody <400> 10 Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Pro 1 5 <210> 11 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 of anti-Ang2 antibody <400> 11 Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Pro Thr 1 5 <210> 12 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 of anti-Ang2 antibody <400> 12 Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Trp Thr 1 5 <210> 13 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 of anti-Ang2 antibody <400> 13 Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Leu Thr 1 5 <210> 14 <211> 16 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-H2 of anti-Ang2 antibody <220> <221> UNSURE <222> (3) <223> Ser(S) or Asn(N) <220> <221> UNSURE <222> (5) <223> Ser(S) or Arg(R) <220> <221> UNSURE <222> (7) <223> Ser(S) or Asn(N) <220> <221> UNSURE <222> (9) <223> Ser(S) or Asp(D) <400> 14 Tyr Ile Xaa Tyr Xaa Gly Xaa Thr Xaa Tyr Asn Pro Ser Leu Lys Ser 1 5 10 15 <210> 15 <211> 9 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> CDR-L3 of anti-Ang2 antibody <220> <221> UNSURE <222> (5) <223> Ser(S) or Thr(T) <220> <221> UNSURE <222> (8) <223> Pro(P), Leu(L), or Trp(W) <400> 15 Gln Gln Asp Tyr Xaa Ser Pro Xaa Thr 1 5 <210> 16 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region of anti-Ang2 antibody <400> 16 Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser 1 5 10 15 Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Val Thr Pro Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Ser Thr Phe Gly His Tyr Val Ser Ser Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 <210> 17 <211> 109 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region of anti-Ang2 antibody <400> 17 Val Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser 1 5 10 15 Leu Ser Leu Ser Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Ala Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Val Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Asn Tyr Arg Gly Asn Thr Asp Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ser Ser Ile Asn Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Val Thr Thr Gly Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Asn Phe Glu Gly Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 <210> 18 <211> 112 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain variable region of anti-Ang2 antibody <400> 18 Leu Gln Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Gln Ser 1 5 10 15 Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Thr Gly Tyr Ser Ile Thr Ser Asp Tyr 20 25 30 Ala Trp Asn Trp Ile Arg Gln Phe Pro Gly Asn Lys Leu Glu Trp Met 35 40 45 Gly Tyr Ile Ser Tyr Ser Gly Ser Thr Ser Tyr Asn Pro Ser Leu Lys 50 55 60 Ser Arg Ile Ser Ile Thr Arg Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Phe Leu 65 70 75 80 Gln Leu Asn Ser Leu Thr Thr Glu Asp Thr Ala Thr Tyr Tyr Cys Ala 85 90 95 Arg Gly Asp Tyr Gly Asn Tyr Val Gly Pro Met Asp Tyr Trp Gly Gln 100 105 110 <210> 19 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region of anti-Ang2 antibody <400> 19 Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Leu Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Ala Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Ala Ile Ser Thr Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Ile Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Pro 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 20 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region of anti-Ang2 antibody <400> 20 Thr Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Ile Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Pro Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Thr Ser Pro Trp 85 90 95 Thr Phe Gly Gly Gly Thr Glu Leu Glu Ile Lys 100 105 <210> 21 <211> 107 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain variable region of anti-Ang2 antibody <400> 21 Ser Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Lys Phe Leu Leu Val Ser Ala Gly 1 5 10 15 Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Arg Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile 35 40 45 Tyr Tyr Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Thr Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Thr Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Leu Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Arg Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 22 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding heavy chain variable region of anti-Ang2 antibody of SEQ ID NO: 16 <400> 22 gatgtgcagc ttcaggagtc gggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60 acctgcactg tcactggcta ctcaatcacc agtgattatg cctggaactg gatccggcag 120 tttccaggaa acaaactgga gtggatgggt tacataagct acagtggtag cactagctac 180 aacccatctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgagaca catccaagaa tcagttcttc 240 ctgcagctga attctgtgac acctgaggac acagccacat attactgtgc aagatcaact 300 tttggtcact acgtcagttc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 23 <211> 354 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding heavy chain variable region of anti-Ang2 antibody of SEQ ID NO: 17 <400> 23 gatgtgcagc ttcaggagtc gggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60 tcctgcactg tcactggcta ctcaatcgcc agtgattatg cctggaactg gatccggcag 120 tttccaggaa acaaagtgga gtggatgggc tacataaact accgtggaaa cactgactac 180 aacccatctc tcaaaagtcg aagctctatc aatcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240 ctgcaattga attctgtgac tactggggac acagccacat attactgtgc aagaggtaac 300 ttcgaaggag ctatggacta ctggggtcaa ggaacctcag tcaccgtctc ctca 354 <210> 24 <211> 363 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding heavy chain variable region of anti-Ang2 antibody of SEQ ID NO: 18 <400> 24 gatgtgcagc ttcaggagtc gggacctggc ctggtgaaac cttctcagtc tctgtccctc 60 acctgcactg tcactggcta ctcaatcacc agtgattatg cctggaactg gatccggcag 120 tttccaggaa acaaactgga gtggatgggc tacataagct acagtggtag tactagctac 180 aacccatctc tcaaaagtcg aatctctatc actcgagaca catccaagaa ccagttcttc 240 ctacagttga attctttgac tactgaggac acagccacat attactgtgc aagaggggac 300 tatggtaact acgtgggacc tatggactac tggggtcaag gaacctcagt caccgtctcc 360 tca 363 <210> 25 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding Light chain variable region of anti-Ang2 antibody of SEQ ID NO: 19 <400> 25 agtattgtga tgacccagac tcccaaactc ctgcttgttt cagcaggaga cagggttacc 60 ataacctgca aggccagtca gagtgcgagc aatgatgttg cttggtacca acagaagcca 120 gggcagtctc ctaaactgct gatatactat gcatccaatc gctacactgg agtccctgat 180 cgcttcactg gcagtggata tgggacggat ttcactttcg ccatcagcac tgtgcaggct 240 gaagacctgg caatttattt ctgtcagcag gattatagct ctccaccgac gttcggtgga 300 ggcaccaagc tggaaatcaa a 321 <210> 26 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding Light chain variable region of anti-Ang2 antibody of SEQ ID NO: 20 <400> 26 actattgtga tgacccagac tcccaaattc ctgcttgtat cagcaggaga caggattacc 60 ataacctgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtag cctggtacca acagaagcca 120 gggcagtctc ctaaactgct gatatactat gcatccaatc gctaccctgg agtccctgat 180 cgcttcactg gcagtggata tgggacggat ttcactttca ccatcagcac tgtgcaggct 240 gaagacctgg cagtttattt ctgtcagcag gattatacct ctccgtggac gttcggtgga 300 ggcaccgagc tggaaatcaa a 321 <210> 27 <211> 321 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Nucleotide sequence encoding Light chain variable region of anti-Ang2 antibody of SEQ ID NO: 21 <400> 27 agtattgtga tgacccagac tcccaaattc ctgcttgtgt cagcaggaga cagggttacc 60 ataacctgca aggccagtca gagtgtgagt aatgatgtag cttggtaccg acagaagcca 120 gggcagtctc ctaaactgct gatatactat gcatccaatc gctacactgg agtccctgat 180 cgcttcactg gcagtggata tgggacggat ttcactttca ccatcagcac tgtgcaggct 240 gaagacctgg cagtttattt ctgtcagcag gattatagct ctccgctcac gttcggtgct 300 aggaccaagc tggagctgaa a 321 <210> 28 <211> 496 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Human Ang2 <400> 28 Met Trp Gln Ile Val Phe Phe Thr Leu Ser Cys Asp Leu Val Leu Ala 1 5 10 15 Ala Ala Tyr Asn Asn Phe Arg Lys Ser Met Asp Ser Ile Gly Lys Lys 20 25 30 Gln Tyr Gln Val Gln His Gly Ser Cys Ser Tyr Thr Phe Leu Leu Pro 35 40 45 Glu Met Asp Asn Cys Arg Ser Ser Ser Ser Pro Tyr Val Ser Asn Ala 50 55 60 Val Gln Arg Asp Ala Pro Leu Glu Tyr Asp Asp Ser Val Gln Arg Leu 65 70 75 80 Gln Val Leu Glu Asn Ile Met Glu Asn Asn Thr Gln Trp Leu Met Lys 85 90 95 Leu Glu Asn Tyr Ile Gln Asp Asn Met Lys Lys Glu Met Val Glu Ile 100 105 110 Gln Gln Asn Ala Val Gln Asn Gln Thr Ala Val Met Ile Glu Ile Gly 115 120 125 Thr Asn Leu Leu Asn Gln Thr Ala Glu Gln Thr Arg Lys Leu Thr Asp 130 135 140 Val Glu Ala Gln Val Leu Asn Gln Thr Thr Arg Leu Glu Leu Gln Leu 145 150 155 160 Leu Glu His Ser Leu Ser Thr Asn Lys Leu Glu Lys Gln Ile Leu Asp 165 170 175 Gln Thr Ser Glu Ile Asn Lys Leu Gln Asp Lys Asn Ser Phe Leu Glu 180 185 190 Lys Lys Val Leu Ala Met Glu Asp Lys His Ile Ile Gln Leu Gln Ser 195 200 205 Ile Lys Glu Glu Lys Asp Gln Leu Gln Val Leu Val Ser Lys Gln Asn 210 215 220 Ser Ile Ile Glu Glu Leu Glu Lys Lys Ile Val Thr Ala Thr Val Asn 225 230 235 240 Asn Ser Val Leu Gln Lys Gln Gln His Asp Leu Met Glu Thr Val Asn 245 250 255 Asn Leu Leu Thr Met Met Ser Thr Ser Asn Ser Ala Lys Asp Pro Thr 260 265 270 Val Ala Lys Glu Glu Gln Ile Ser Phe Arg Asp Cys Ala Glu Val Phe 275 280 285 Lys Ser Gly His Thr Thr Asn Gly Ile Tyr Thr Leu Thr Phe Pro Asn 290 295 300 Ser Thr Glu Glu Ile Lys Ala Tyr Cys Asp Met Glu Ala Gly Gly Gly 305 310 315 320 Gly Trp Thr Ile Ile Gln Arg Arg Glu Asp Gly Ser Val Asp Phe Gln 325 330 335 Arg Thr Trp Lys Glu Tyr Lys Val Gly Phe Gly Asn Pro Ser Gly Glu 340 345 350 Tyr Trp Leu Gly Asn Glu Phe Val Ser Gln Leu Thr Asn Gln Gln Arg 355 360 365 Tyr Val Leu Lys Ile His Leu Lys Asp Trp Glu Gly Asn Glu Ala Tyr 370 375 380 Ser Leu Tyr Glu His Phe Tyr Leu Ser Ser Glu Glu Leu Asn Tyr Arg 385 390 395 400 Ile His Leu Lys Gly Leu Thr Gly Thr Ala Gly Lys Ile Ser Ser Ile 405 410 415 Ser Gln Pro Gly Asn Asp Phe Ser Thr Lys Asp Gly Asp Asn Asp Lys 420 425 430 Cys Ile Cys Lys Cys Ser Gln Met Leu Thr Gly Gly Trp Trp Phe Asp 435 440 445 Ala Cys Gly Pro Ser Asn Leu Asn Gly Met Tyr Tyr Pro Gln Arg Gln 450 455 460 Asn Thr Asn Lys Phe Asn Gly Ile Lys Trp Tyr Tyr Trp Lys Gly Ser 465 470 475 480 Gly Tyr Ser Leu Lys Ala Thr Thr Met Met Ile Arg Pro Ala Asp Phe 485 490 495

Claims (18)

  1. (1) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위 또는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 상보성 결정 부위 경쇄 가변 영역,
    (2) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위 또는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 상보성 결정 부위 경쇄 가변 영역, 또는
    (3) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위 또는 중쇄 가변 영역; 및 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 상보성 결정 부위 경쇄 가변 영역
    을 포함하는, 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  2. 삭제
  3. 제1항에 있어서, 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    (a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 4의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위 또는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 7의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 11의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 상보성 결정 부위 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인, 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  4. 제1항에 있어서, 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    (a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 3의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 5의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위 또는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 10의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 12의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 상보성 결정 부위 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인, 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  5. 제1항에 있어서, 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    (a) 서열번호 1의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-H1), 서열번호 2의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-H2), 및 서열번호 6의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드 (CDR-H3)를 포함하는 중쇄 상보성 결정 부위 또는 중쇄 가변 영역; 및
    (b) 서열번호 8의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-L1), 서열번호 9의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-L2), 및 서열번호 13의 아미노산 서열로 이루어진 폴리펩타이드(CDR-L3)를 포함하는 경쇄 상보성 결정 부위 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인, 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  6. 제1항에 있어서, 상기 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편은,
    서열번호 16의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 서열번호 19의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역;
    서열번호 17의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 서열번호 20의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역; 또는
    서열번호 18의 아미노산 서열로 이루어진 중쇄 가변 영역 및 서열번호 21의 아미노산 서열로 이루어진 경쇄 가변 영역
    을 포함하는 것인, 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  7. 제1항, 및 제3 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항 Ang-2 항체는 단클론항체인, 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  8. 제7항에 있어서, 상기 항 Ang-2 항체는 수탁번호 KCLRF-BP-00292, KCLRF-BP-00293, 또는 KCLRF-BP-00294의 하이브리도마로부터 얻어진 것인, 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  9. 제1항, 및 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항 Ang-2 항체는 마우스 유래 항체, 마우스-인간 키메릭 항체, 인간화 항체, 또는 인간 항체인, 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  10. 제1항, 및 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항원 결합 단편은 상기 항 Ang-2 항체의 scFv, (scFv)2, Fab, Fab' 및 F(ab')2로 이루어진 군에서 선택되는 것인, 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편.
  11. 항 Ang-2 항체를 생산하는 수탁번호 KCLRF-BP-00292, KCLRF-BP-00293, 또는 KCLRF-BP-00294 의 하이브리도마 세포주.
  12. 제1항, 및 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는, 암, 암전이, 미숙아 망막병증, 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 혈관신생성녹내장, 건선, 류마티스성 관절염, 천식, 폐렴, 만성 염증, 감염, 고혈압, 동맥경화, 신장 질환, 및 패혈증으로 이루어진 군에서 선택되는 신생혈관 형성 또는 세포부착(cell adhesion)과 관련된 질병의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  13. 제12항에 있어서, 상기 신생혈관 형성 또는 암세포의 세포부착과 관련된 질병은 암 또는 암전이인, 약학 조성물.
  14. 제12항에 있어서, 상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암, 또는 골육종인, 약학 조성물.
  15. 제1항, 및 제3항 내지 제6항 중 어느 한 항의 항 Ang-2 항체 또는 이의 항원 결합 단편을 유효성분으로 포함하는, 암, 암전이, 미숙아 망막병증, 황반변성, 당뇨병성 망막병증, 혈관신생성녹내장, 건선, 류마티스성 관절염, 천식, 폐렴, 만성 염증, 감염, 고혈압, 동맥경화, 신장 질환, 및 패혈증으로 이루어진 군에서 선택되는 Ang-2 과발현과 관련된 질병의 진단용 조성물.
  16. 제15항에 있어서, 상기 암은 편평상피세포암, 소세포폐암, 비소세포폐암, 폐의 선암, 폐의 편평상피암, 복막암, 피부암, 피부 또는 안구내 흑색종, 직장암, 항문부근암, 식도암, 소장암, 내분비선암, 부갑상선암, 부신암, 연조직 육종, 요도암, 만성 또는 급성 백혈병, 림프구 림프종, 간세포암, 위장암, 췌장암, 교아종, 경부암, 난소암, 간암, 방광암, 간종양, 유방암, 결장암, 대장암, 자궁내막 또는 자궁암, 침샘암, 신장암, 전립선암, 음문암, 갑상선암, 두경부암, 뇌암, 또는 골육종인, 진단용 조성물.
  17. 삭제
  18. 삭제
KR1020130077228A 2013-07-02 2013-07-02 Ang-2 특이적 항체 및 그의 용도 KR102131371B1 (ko)

Priority Applications (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130077228A KR102131371B1 (ko) 2013-07-02 2013-07-02 Ang-2 특이적 항체 및 그의 용도
US14/322,343 US9527910B2 (en) 2013-07-02 2014-07-02 Ang-2 specific antibodies and uses thereof

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020130077228A KR102131371B1 (ko) 2013-07-02 2013-07-02 Ang-2 특이적 항체 및 그의 용도

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20150004444A KR20150004444A (ko) 2015-01-12
KR102131371B1 true KR102131371B1 (ko) 2020-07-08

Family

ID=52132956

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020130077228A KR102131371B1 (ko) 2013-07-02 2013-07-02 Ang-2 특이적 항체 및 그의 용도

Country Status (2)

Country Link
US (1) US9527910B2 (ko)
KR (1) KR102131371B1 (ko)

Families Citing this family (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3381940B1 (en) 2013-07-29 2022-09-07 Samsung Electronics Co., Ltd. Anti-ang2 antibody
CN116003591B (zh) * 2022-12-12 2023-09-19 三门峡市眼科医院 Ang-2抗体及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009097325A1 (en) 2008-01-28 2009-08-06 Medimmune Limited Stabilized angiopoietin-2 antibodies and uses thereof

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5859205A (en) * 1989-12-21 1999-01-12 Celltech Limited Humanised antibodies
US5462990A (en) * 1990-10-15 1995-10-31 Board Of Regents, The University Of Texas System Multifunctional organic polymers
ES2619313T3 (es) * 2001-03-15 2017-06-26 Precision Biologics, Inc. Terapia de anticuerpos monoclonales para el cáncer de páncreas
US7658924B2 (en) 2001-10-11 2010-02-09 Amgen Inc. Angiopoietin-2 specific binding agents
US7138370B2 (en) 2001-10-11 2006-11-21 Amgen Inc. Specific binding agents of human angiopoietin-2
ES2371083T3 (es) 2004-12-21 2011-12-27 Medimmune Limited Anticuerpos dirigidos contra la angiopoyetina-2 y usos de los mismos.
AR059066A1 (es) 2006-01-27 2008-03-12 Amgen Inc Combinaciones del inhibidor de la angiopoyetina -2 (ang2) y el inhibidor del factor de crecimiento endotelial vascular (vegf)
EP2245066A2 (en) * 2008-01-22 2010-11-03 Biogen Idec MA Inc. Ron antibodies and uses thereof
KR20110013409A (ko) * 2008-05-23 2011-02-09 삼성전자주식회사 항체-펩티드 융합 상승체
US8268314B2 (en) 2008-10-08 2012-09-18 Hoffmann-La Roche Inc. Bispecific anti-VEGF/anti-ANG-2 antibodies
WO2010066836A2 (en) 2008-12-10 2010-06-17 Ablynx Nv Amino acid sequences directed against the angiopoietin/tie system and polypeptides comprising the same for the treatment of diseases and disorders related to angiogenesis
US8133979B2 (en) 2008-12-16 2012-03-13 Hoffmann-La Roche Inc. Antibodies against human angiopoietin 2
KR101688522B1 (ko) * 2009-12-15 2016-12-21 삼성전자주식회사 안지오포이에틴-2에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
EP3381940B1 (en) * 2013-07-29 2022-09-07 Samsung Electronics Co., Ltd. Anti-ang2 antibody

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2009097325A1 (en) 2008-01-28 2009-08-06 Medimmune Limited Stabilized angiopoietin-2 antibodies and uses thereof

Also Published As

Publication number Publication date
US9527910B2 (en) 2016-12-27
US20150010572A1 (en) 2015-01-08
KR20150004444A (ko) 2015-01-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
EP3381940B1 (en) Anti-ang2 antibody
US9808507B2 (en) Anti-c-Met/anti-Ang2 bispecific antibody
US11155627B2 (en) Anti-c-Met/anti-Ang2 bispecific antibody
US9556275B2 (en) Combination therapy using anti-C-met antibody and anti-ang-2 antibody
KR102349370B1 (ko) 인간화 또는 친화도 성숙된 항 앤지오포이에틴-2 항체 및 그의 용도
KR102196450B1 (ko) Tie2와 결합을 유도하는 항 Ang2 항체를 포함하는 항암제
US10047154B2 (en) Angiopoietin-2 specific antibodies and uses thereof
EP2787008B1 (en) Anti-idiotype antibody against anti-C-met antibody
WO2015083978A1 (ko) 항 VEGF-C/항 Ang2 이중 특이 항체
KR102106160B1 (ko) 항 Ang2 항체
KR102131371B1 (ko) Ang-2 특이적 항체 및 그의 용도
KR102312922B1 (ko) Tie2와 결합을 유도하는 항 Ang2 항체
CN114667296B (zh) 一种双特异性抗体及其用途
KR102206029B1 (ko) Ang-2에 특이적으로 결합하는 항체 및 그의 용도
KR102118691B1 (ko) 항 Ang2 항체를 포함하는 혈관누수 차단제
US9562093B2 (en) Antibodies or antigen-binding fragments thereof specifically binding to VEGF-C and use thereof
KR20150063847A (ko) 항 VEGF-A/항 Ang2 이중 특이 항체
US20170183401A1 (en) Hypoglycemic agent containing anti-ang2 antibody
KR102195957B1 (ko) Tie2와 결합을 유도하는 항 Ang2 항체

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant