ES2619313T3 - Terapia de anticuerpos monoclonales para el cáncer de páncreas - Google Patents

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Abstract

Un anticuerpo recombinante aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo que es un anticuerpo monocatenario, un fragmento F(ab) o un fragmento F(ab)2, para su uso en el tratamiento o diagnóstico in vivo del cáncer de páncreas en un sujeto, donde el anticuerpo recombinante aislado o un fragmento de unión a antígeno del mismo comprende (1) una región variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 3; y (2) una región variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO: 6 o una variante humanizada de dicho anticuerpo recombinante o fragmento de unión a antígeno del mismo.

Description

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DESCRIPCION
Terapia de anticuerpos monoclonales para el cancer de pancreas Solicitud de patente
1. Introduccion
La presente invencion se refiere al uso del anticuerpo monoclonal 31.1 y de sus fragmentos de union al antigeno en el tratamiento del cancer de pancreas. Se basa, al menos en parte, en el descubrimiento de que el anticuerpo monoclonal 31.1 es reactivo con celulas de pancreas malignas, pero no con las no malignas. La presente divulgacion se refiere ademas secuencias de polinucleotidos y aminoacidos que comprenden la region variable de cadena ligera y la region variable de cadena pesada de Mu-31.1 tal como se expone en la figura 2 y la figura 4, respectivamente. Tales secuencias de polinucleotidos pueden usarse para expresar de manera recombinante anticuerpos equivalentes a 31.1 para su uso en los procedimientos de la invencion.
2. Antecedentes de la invencion
2.1. CANCER DE PANCREAS
El cancer de pancreas es la quinta causa principal de muerte por cancer en los Estados Unidos, esperandose que este ano mueran aproximadamente 28000 estadounidenses por la enfermedad (sitio web sobre el cancer de pancreas, The Johns Hopkins Medical Institutions,
http://162.129.03.69:80/PANCREAS_INTRO). En la actualidad, el unico tratamiento potencialmente curativo es la extraccion quirurgica del cancer, en el contexto de un procedimiento extenso y complejo que extrae la cabeza, el cuello y el proceso unciforme del pancreas, asf como la mayor parte del duodeno (la “operacion Whipple”). Sin el tratamiento, la tasa de supervivencia global a 5 anos es solo del 3 por ciento (Id.).
La quimioterapia (que usa a menudo gemcitabina (Gemzar®)) y terapia con radiacion son los tratamientos principales ofrecidos a los pacientes con tumores no resecables (Id.). Actualmente esta estudiandose una inmunoterapia experimental en la que se modifican geneticamente las propias celulas de un paciente para expresar la protema inmunoestimuladora, factor estimulante de colonias de granulocitos-macrofagos, se irradian para evitar el crecimiento tumoral, y entonces se introducen de nuevo al paciente, en el que se espera que estas estimulen una respuesta inmunitaria (1997, Cancer Res. 57:1537-1546; sitio web sobre el cancer de pancreas, The Johns Hopkins Medical Institutions,
http://162.129.103.69:80/PANCREAS_MEDICAL_TX)).
2.2. ANTICUERPO MONOCLONAL 31.1
El anticuerpo 31.1 representa un anticuerpo monoclonal dirigido a protemas derivado mediante la inmunizacion de ratones BALB(c) con una preparacion de membrana obtenida de muestras de carcinoma de colon alogenicas (humanas) combinadas. Se fragmentaron las celulas usadas para preparar el antfgeno usando una bomba de nitrogeno (Parr) y entonces se sometieron a ultracentrifugacion. Inicialmente se sometio a prueba el material de membrana mediante microscopfa electronica para garantizar la compatibilidad entre lotes, descartando los componentes citoplasmaticos y nucleares. Despues, se sonico y fracciono con sephadex G200. Se uso electroforesis en gel de poliacrilamida discontinua para la purificacion parcial inicial (aproximadamente el 80 %) y se sometieron a prueba 30 |ig para detectar hipersensibilidad cutanea retrasada (DHR), (3). Se inmunizaron los ratones BALB mediante inyeccion intraperitoneal de 50 microgramos de antfgeno asociado a carcinoma de colon. Se proporciono una segunda inyeccion 10 dfas despues y luego se sacrificaron los ratones para obtener celulas del bazo para la fusion. Se realizo la fusion incubando 5x107 celulas de bazo de raton con 107 celulas de mieloma sp2/0AG 14 en PEG al 40 %. Se ha demostrado que el antfgeno definido por el anticuerpo monoclonal 31.1 tiene un PM de 72.000. Estudios que usan la inmunoperoxidasa han sugerido que se observa con mayor frecuencia el antfgeno reconocido por 31.1 en los tumores de colon de grado superior. La especificidad para el anticuerpo es alta, de modo que en un estudio de colonocitos eliminados en la clmica Mayo, la sensibilidad y especificidad fueron superiores cuando se compararon con anticuerpos anti-CEA, anti-MUC1 y B72.3.
Se aislaron varios anticuerpos candidatos y se sometieron a prueba a partir de la primera generacion de TAA. Todos demostraron ser derivados proteicos y relativamente espedficos para el carcinoma de colon. El anticuerpo 31.1 correspondio a uno de los dos antfgenos que se ha demostrado que migran estrechamente en la electroforesis en gel y se relacionan con la glicoprotema inmunogenica que induce DHR. La version murina es de isotipo IgG2a que se convierte a un isotipo IgG1 en la quimerizacion. Se encontro que 31.1 tiene fuertes indices de localizacion. Como tal, este anticuerpo fue el primero que se quimerizo.
Para la quimerizacion del anticuerpo monoclonal 31.1, el exon codificante de la protema del gen de la region variable de la cadena pesada 31.1 se corto y empalmo a los exones codificantes de la protema de la region constante de la cadena gamma 1 humana. Se empleo PCR. El ADNc de 31.1 VH se amplifico mediante la PCR utilizando los cebadores inversos degenerados sintetizados basados en las secuencias de ADN de la primera region marco
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conservada (FR1) de consenso y un cebador directo sintetizado de acuerdo con las secuencias de ADN de la region de union J-C de consenso. El ADN de Vh 31.1 amplificado se clono en el vector pBluescript y se secuencio. Se produjo 31.1 quimerico transfectando celulas SP2/0 AG14 con el vector.
El anticuerpo monoclonal 31.1 y una version quimerica (humanizada) de ese anticuerpo se describen en la patente estadounidense n.° 5.688.657 expedida el 18 de noviembre de 1997, en la actualidad objeto de una solicitud de reexpedicion. Ademas, el anticuerpo monoclonal 31.1 se ha depositado en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (“ATCC”), que tiene una direccion en 10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110-2209 y se le asigno el numero de registro ATCC PTA-2497 y se ha depositado la version quimerizada en la ATCC y se le asigno el numero de registro 12316.
La patente US 5.688.657 muestra la expresion del antigeno 31.1 detectado por el anticuerpo monoclonal 31.1 en diferentes lmeas celulares de cancer, incluyendo dos de tres lmeas celulares de carcinoma de pancreas ensayadas, pero no muestra una expresion del antfgeno 31.1 en tejido pancreatico humano.
3. Sumario de la invencion
La presente invencion se refiere al uso de equivalentes de union del anticuerpo monoclonal 31.1, incluyendo versiones quimerizadas y/o humanizadas de los mismos, y fragmentos de union a antigeno de los mismos en el tratamiento de cancer de pancreas.
Se basa, al menos en parte, en estudios in vitro usando tanto versiones murinas como quimericas de 31.1 que compararon las actividades ADCC de los anticuerpos 31.1 con D6-12 y 17.1a (Panorex). Mientras que la version murina de 31.1 puede inducir una respuesta de ADCC del 35 %, se ha mostrado que la version quimerica da como resultado la destruccion del 80 % de celulas tumorales cada tres horas, usando un ensayo de liberacion de cromo. Esto se compara con la tasa del 30 % de destruccion asociada con D6-12 y una tasa del 15 % para Panorex. Usando modelos de xenoinjerto con lmeas celulares de cancer de colon humanas LC-174T y Colo205, se encontro que 31.1 quimerico provocaba la regresion de lmeas tumorales establecidas (moleculas bien definidas) tras inocular dos millones de celulas tumorales en las patas traseras de ratones desnudos y administrar anticuerpo intraperitoneal a los 10 dfas junto con celulas efectoras humanas. A los 30 dfas, el volumen del tumor en los animales tratados en comparacion con los controles se redujo en mas del 95 %. Pueden esperarse resultados similares cuando se dirige el anticuerpo hacia celulas cancerosas de pancreas, ya que se ha demostrado que el anticuerpo 31.1 se une al antfgeno presente en celulas cancerosas de pancreas, pero no a tejidos de pancreas no malignos.
La presente divulgacion se refiere a secuencias de polinucleotidos y aminoacidos que comprenden la region variable de cadena ligera y la region variable de cadena pesada de Mu-31.1 que pueden usarse para expresar anticuerpos
31.1 quimerizados. Estas secuencias de nucleotidos incluyen: (a) las secuencias de nucleotidos mostradas en la figura 2 o la figura 4; (b) una secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de aminoacidos mostrada en la figura 2 o la figura 4; y (c) cualquier secuencia de nucleotidos que (i) se une a la secuencia de nucleotidos de la figura 2 o la figura 4 en condiciones de hibridacion rigurosas, por ejemplo, hibridacion a ADN unido a filtro en NaHPO4 0,5 M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7 %, EDTA 1 mM a 65°, y lavado en 0,1xSSC/SDS al 0,1 % a 68° y (ii) codifica una region variable de cadena ligera y pesada que puede unirse con la misma inmunoespecificidad que el anticuerpo monoclonal 31.1 quimerico.
La divulgacion se refiere ademas a una nueva construccion de expresion de anticuerpo 31.1 quimerizado, denominado pRc/CMV 31.1 que se ha depositado en la ATCC y se le ha asignado el n.° de registro de ATCC [ ]. Este plasmido lleva una unidad de expresion de dihidrofolato reductasa (“dhfr”) activada mediante un promotor temprano de SV40 que carece de promotor que permite la expresion a mas de 200 mg/litro en celulas de ovario de hamster chino que carecen de dihidrofolato reductasa.
4. Breve descripcion de los dibujos
Figuras 1A-F. Serie de plasmidos usados para construir el vector pRc/CMV 31.1 insertando los genes de cadena ligera y de cadena pesada de Chi31.1-1 en el plasmido pDCM-dhfr (figura 1F).
Figura 2. Secuencia de acido nucleico (bicatenario) y secuencias de aminoacidos posibles (dependiendo del marco de lectura) de la region variable de cadena ligera de 31.1, que muestran los sitios de escision de enzimas de restriccion.
Figura 3. Lista de enzimas que no cortan de la secuencia de acido nucleico de region variable de cadena ligera mostrada en la figura 2.
Figura 4. Secuencia de acido nucleico (bicatenario) y secuencias de aminoacidos posibles (dependiendo de la fase de lectura) de la region variable de cadena pesada de 31.1, que muestran los sitios de escision de enzimas de restriccion.
Figura 5. Lista de enzimas que no cortan de la secuencia de acido nucleico de region variable de cadena pesada mostrada en la figura 4.
Figuras 6A-B. Se realizo un ensayo de citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) para someter a prueba la funcion efectora del anticuerpo chi 31.1 de CHO contra celulas diana SW1643 y PANC-1. Se produce
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lisis celular en presencia de anticuerpo 31.1 (figura 6A) pero no en presencia de anticuerpo de control (figura 6B).
5. Descripcion detallada de los dibujos
Para fines de claridad de la presentacion y no a modo de limitacion, la descripcion detallada se divide en las dos subsecciones siguientes:
i) anticuerpo monoclonal 31.1 y sus equivalentes; y
ii) protocolo de tratamiento.
5.1. ANTICUERPO MONOCLONAL 31.1 Y SUS EQUIVALENTES
El anticuerpo monoclonal 31.1 es un anticuerpo monoclonal murino (denominado en lo sucesivo en el presente documento Mu-31.1), originariamente generado mediante inmunizacion con material purificado a partir de membranas celulares de carcinoma de colon. Las celulas del hibridoma que secretan este anticuerpo se han depositado en la Coleccion Americana de Cultivos Tipo (“ATCC”) y se les asigno el n.° de registro de ATCC PTA 2497.
La presente invencion proporciona anticuerpos y fragmentos de union a antfgeno de los mismos que comprenden la region variable de cadena ligera y la region variable de cadena pesada de Mu-31.1. Se divulgan tambien las secuencias de nucleotidos que incluyen; (a) las secuencias de ADN mostradas en la figura 2 o la figura 4; (b) una secuencia de nucleotidos que codifica la secuencia de aminoacidos mostrada en la figura 2 o la figura 4; (c) cualquier secuencia de nucleotidos que (i) se hibrida con la secuencia de nucleotidos expuesta en (a) o (b) en condiciones rigurosas, por ejemplo, hibridacion a ADN unido a filtro en NaHPO4 0,5 M, dodecilsulfato de sodio (SDS) al 7 %, EDTA 1 mM a 65 °C, y lavado en 0,1xSSC/SDS al 0,1 % a 68 °C (Ausubel F. M. et al., eds., 1989, Current Protocols in Molecular Biology, Vol. I, Green Publishing Associates, Inc., y John Wiley & sons, Inc., Nueva York, en p.2, 10, 3) y (ii) codifica un producto genico funcionalmente equivalente. Los productos genicos funcionalmente equivalentes incluyen aquellos polipeptidos que compiten con 31.1 para unirse a su antfgeno diana. La divulgacion tambien se refiere a secuencias de nucleotidos que codifican fragmentos de peptidos de las regiones variables de cadena pesada y ligera, y protemas de fusion de las mismas.
Los nucleotidos pueden aislarse usando una diversidad de diferentes procedimientos conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, puede examinarse una biblioteca de ADNc construida usando ARN de celulas o tejido que se sabe que expresan el anticuerpo monoclonal 31.1 o su equivalente, usando una sonda de acido nucleico marcada derivada de las secuencias representadas en la figura 2 o la figura 4. Ademas, pueden derivarse secuencias de acidos nucleicos que codifican las regiones variables de cadena pesada y ligera realizando PCR que usa dos cebadores oligonucleotfdicos disenados basandose en las secuencias de nucleotidos desveladas en el presente documento. El molde para la reaccion puede ser ADNc obtenido mediante transcripcion inversa de ARNm preparado a partir de lmeas celulares o tejido que se sabe que expresan el anticuerpo monoclonal 31.1.
La divulgacion tambien abarca (a) vectores de ADN que contienen cualquiera de las secuencias de region variable de cadena pesada y ligera anteriores y/o sus complementos (es decir, antisentido); (b) vectores de expresion de ADN que contienen cualquiera de las secuencias de region variable de cadena pesada y ligera anteriores asociada operativamente a un elemento regulador que dirige la expresion de las secuencias codificantes de la region variable de cadena pesada y ligera; y (c) celulas hospedadoras modificadas por ingeniena genetica que contienen cualquiera de las secuencias de region variable de cadena pesada y ligera anteriores asociada operativamente a un elemento regulador que dirige la expresion de las secuencias codificantes en la celula hospedadora. Tal como se usa en el presente documento, los elementos reguladores incluyen, pero no se limitan a, promotores inducibles y no inducibles, potenciadores, operadores y otros elementos que los expertos en la tecnica saben que activan y regulan la expresion.
La figura 2 muestra la secuencia de aminoacidos deducida de la region variable de cadena ligera de 31.1 y la figura 4 muestra la secuencia de aminoacidos deducida de la region variable de cadena pesada de 31.1. Por tanto, las secuencias de aminoacidos de la invencion incluyen la secuencia de aminoacidos mostrada en la figura 2 y la figura 4.
La divulgacion tambien abarca protemas que son funcionalmente equivalentes a protemas codificadas por las secuencias de nucleotidos descritas anteriormente, tal como se evalua mediante cualquiera de varios criterios, incluyendo, pero sin limitarse a, la capacidad de unirse al epttopo reconocido por el anticuerpo monoclonal 31.1.
Los peptidos que corresponden a uno o mas dominios de las regiones variables de cadena pesada y ligera, asf como las protemas de fusion en las que se fusiona la longitud completa o una parte de la region variable de cadena pesada y ligera con una protema no relacionada pueden disenarse basandose en las secuencias de nucleotidos y de aminoacidos divulgadas en el presente documento (veanse la figura 2 y la figura 4).
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Mientras que las regiones variables de cadena pesada y ligera pueden sintetizarse qmmicamente (por ejemplo, vease Creighton, 1983, Proteins: Structures and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co., N. Y.), las regiones pueden producirse ventajosamente mediante tecnolog^a de ADN recombinante usando tecnicas bien conocidas en la tecnica para expresar un acido nucleico que contiene secuencias genicas y/o secuencias codificantes de region variable de cadena pesada y ligera. Tales procedimientos pueden usarse para construir vectores de expresion que contienen las secuencias de nucleotidos descritas anteriormente y senales de control de la transcripcion y la traduccion apropiadas. Estos procedimientos incluyen, por ejemplo, tecnicas de ADN recombinante in vitro, tecnicas sinteticas y recombinacion genetica in vivo. (Veanse, por ejemplo, las tecnicas descritas en Sambrook et al., 1989, citado anteriormente, y Ausubel et al., 1989, citado anteriormente).
Puede utilizarse una diversidad de sistemas de hospedador-vector de expresion para expresar las secuencias de nucleotidos.
Cuando se expresan las regiones variables de cadena pesada y ligera como un derivado soluble y no se secretan, puede recuperarse el peptido o polipeptido de la celula hospedadora. Alternativamente, cuando se secretan las regiones variables de cadena pesada y ligera, pueden recuperarse el peptido o los polipeptidos de los medios de cultivo.
Los sistemas de expresion que pueden usarse incluyen, pero no se limitan a, microorganismos tales como bacterias transformadas con bacteriofago recombinante, vectores de expresion de ADN de plasmido o de cosmido que contienen secuencias de nucleotidos que codifican las regiones variables de cadena pesada y ligera de 31.1; levadura transformada con vectores de expresion de levadura recombinantes que contienen secuencias de nucleotidos que codifican las regiones variables de cadena pesada y ligera de 31.1 o sistemas de celulas de mairnferos que albergan construcciones de expresion recombinantes que contienen promotores derivados del genoma de celulas de mai^eras o de virus de mai^eras.
Pueden elegirse sistemas de expresion apropiados para asegurar que se produzca la correcta modificacion, procesamiento y ubicacion subcelular de la protema de region variable de cadena pesada y ligera. Para este fin, se prefieren celulas hospedadoras que poseen la capacidad de modificar y procesar apropiadamente anticuerpos para su secrecion. Para la produccion de alto rendimiento, a largo plazo de protemas recombinantes, tal como la deseada para el desarrollo de lmeas celulares para la produccion de anticuerpos quimericos, se prefiere la expresion estable. En vez de usar vectores de expresion que contienen ongenes de replicacion, pueden transformarse las celulas hospedadoras con ADN controlado por elementos de control de la expresion apropiados y un gen marcador seleccionable, es decir, gen tk, hgprt, dhfr, neo e hygro, por mencionar unos pocos. Tras la introduccion del ADN foraneo, puede permitirse que las celulas modificadas por ingeniena genetica crezcan durante 1-2 dfas en medios enriquecidos, y entonces se cambian a un medio selectivo.
Una version quimerica de 31.1 murino, denominada en lo sucesivo en el presente documento Chi-31.1-1, que comprende la region variable de Mu-31.1 junto con secuencias de inmunoglobulina de region constante humanas, se produce mediante celulas de hibridoma depositadas en la ATCC y a las que se les asigna el n.° de registro de ATCC CRL-12316.
En una realizacion espedfica de la invencion, puede producirse una segunda version quimerica de 31.1 murino, denominada en lo sucesivo en el presente documento Chi-31.1-2, que tiene regiones variables de Mu-31.1 y regiones de inmunoglobulina constantes humanas y derivadas de los genes de cadena pesada y ligera de Chi31.1-1, mediante expresion del vector pRc/CMV 31.1, descrito en el presente documento, y tal como se muestra en la figura 1. Este vector tiene la ventaja de producir altos rendimientos de anticuerpo quimerico. Una descripcion de la preparacion de este vector se proporciona en la seccion de ejemplos, a continuacion.
En realizaciones no limitativas espedficas de la invencion, pueden producirse versiones quimericas adicionales que comprenden las regiones variables de Mu-31.1. Por ejemplo, pueden generarse la region variable de cadena pesada y la region variable de cadena ligera usando cebadores de PCR disenados basandose en las secuencias de region variable expuestas en la figura 2 (region variable de cadena ligera) y la figura 4 (region variable de cadena pesada) o variantes de las mismas para alterar los extremos terminales para facilitar el corte y empalme en un vector de eleccion y usar, como fuente de ADN molde, ADN recogido de un hibridoma que produce un equivalente de Ab 31.1, tal como uno de los hibridomas expuestos anteriormente que se han depositado en la ATCC. Entonces pueden combinarse las secuencias que codifican regiones variables con secuencias que codifican regiones constantes humanas para producir un anticuerpo “humanizado”.
Como alternativa, el acido nucleico que codifica las cadenas pesada y ligera de Chi31.1-1 (incluyendo las regiones constantes humanas) puede insertarse en diversos vectores de expresion para facilitar la expresion. Ejemplos no limitativos espedficos de tales cebadores de PCR son:
a) para la insercion de secuencias que codifican la cadena ligera de Chi31.1-1 en un sitio de insercion
BamH1/XbaI:
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i) Chi31.1-LcBamH1(S):
5'- ATA GGA TCC ATG AAG TCA CAG ACC CAG GTC TTC G-3'
ii) Chi31.1-LcXBaI (A):
5'-TTT CTA GAC TAA CAC TCT CCC CTG TTG AAG C-3'
b) para la insercion de secuencias que codifican la cadena pesada de Chi31.1-1 en un sitio de insercion EcoRI/Notl:
i) Chi31.1-HcEcoRI(S):
5'-ATA GAA TTC ATG GCT TGG GTG TGG ACC TTG CT-3'
ii) Chi31.1-HcNotI(A):
5'-TTG CGG CCG CTC ATT TAC CCG GAG-3'. Tales cebadores pueden usarse en reacciones en cadena de la polimerasa usando, como molde, ADN preparado de celulas de hibridoma depositadas en la ATCC y a las que se les asigna el n.° de registro de ATCC CRL-12316.
En la presente divulgacion se definen “equivalentes” de Mu-31.1 como moleculas o fragmentos de inmunoglobulina o derivados de los mismos que compiten con Mu-31.1 para la union a su antigeno diana, tal como se evalua usando tecnicas convencionales. Tales equivalentes pueden incluir moleculas de anticuerpo completas (es decir, que tienen dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras), moleculas de anticuerpo monocatenarias (vease, por ejemplo, Lee et al., 1999, Molec. Immmunol. 36: 61-71), fragmentos tales como fragmentos F(ab) y F(ab)2 de Mu-31.1, Chi-31.1-1, Chi-31.1-2, o moleculas de anticuerpos completos equivalentes, y moleculas derivadas incluyendo, pero sin limitarse a, una o mas de las moleculas de inmunoglobulina anteriores o fragmentos conjugados a un agente bioactivo, o modificadas para asemejarse mas estrechamente a una molecula de inmunoglobulina humana (vease, por ejemplo; Ryu et al., 1996, Human Antibod. Hybridomas 7:113-122). Tales equivalentes, que incluyen Mu-31.1, Chi-31.1-1, Chi-31.1-2, se denominan de manera colectiva “equivalentes de Ab 31.1”.
Segun la divulgacion, tambien se preve el uso de anticuerpos coespedficos y sus equivalentes (teniendo los equivalentes el mismo alcance que el aplicado al anticuerpo 31.1).
Un anticuerpo coespedfico frente a Mu-31.1 (denominado “anticuerpos coespedficos para 31.1”) puede, o como alternativa puede no, competir con la union de Mu-31.1, pero reconoce (es decir, se une a) el mismo antfgeno diana, denominado en el presente documento “Ag 31.1”. Los anticuerpos coespedficos para 31.1 y sus equivalentes se denominan en la presente divulgacion “equivalentes de anticuerpos coespedficos para 31.1".
Cualquier equivalente de anticuerpo 31.1 o equivalente de anticuerpo coespedfico para 31.1 que va a usarse en seres humanos tiene preferiblemente una estructura que por sf misma no provoca una reaccion inmunitaria perjudicial en seres humanos. Por ejemplo, dicho equivalente de anticuerpo de 31.1 o equivalente de anticuerpo coespedfico para 31.1 puede carecer inherentemente de tales estructuras inmunogenicas o puede ser el producto de un proceso de “humanizacion” mediante tecnicas convencionales que minimizan o eliminan estructuras que se reconocenan como no propias por un sujeto (por ejemplo, la quimerizacion y/o la modificacion mediante ingeniena sitio por sitio). Parece que el Ag 31.1 se ubica en la membrana de canceres de colon y de pancreas. Su presencia aun no se ha detectado en tejido humano normal recien obtenido e inmediatamente congelado (tabla A).
Tabla A. Reactividad cruzada frente a tejidos humanos recien congelados normales.
Tejido (numero)
Tincion con parafina Tincion de muestras congeladas
Colon (3)
Negativo (3) Negativo (2) Traza Positiva (1)
Intestino delgado (3)
Negativo (3) Negativo (3)
Esofago (3)
Negativo (3) Negativo (3)
Mucosa ora (2)
Negativo (2) Negativo (2)
Yeyuno (1)
Negativo (1) Negativo (1)
Estomago (1)
Negativo (1) Negativo (1)
Hfgado (3)
Negativo (3) Negativo (3)
Pancreas (3)
Negativo (3) Negativo (3)
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Tejido (numero)
Tincion con parafina Tincion de muestras congeladas
Timo (3)
Negativo (3) Negativo (3)
Corazon (2)
Negativo (2) Negativo (2)
Prostata (2)
Negativo (2) Negativo (2)
Mama (3)
Negativo (3) Negativo (3)
Testmulo (1)
Negativo (1) Negativo (1)
Ovario (2)
Negativo (2) Negativo (2)
Glandulas salivales (3)
Negativo (3) Negativo (3)
Bazo (2)
Negativo (2) Negativo (2)
Cerebro (3)
Negativo (3) Negativo (3)
Ganglios linfaticos (2)
Negativo (2) Negativo (2)
Glandula suprarrenal (1)
Negativo (1) Negativo (1)
Vagina (1)
Negativo (1) Negativo (1)
Leucocitos (1)
Negativo (1) Negativo (1)
Sin embargo, Ag 31.1 se encuentra en la superficie de canceres de colon y pancreas recien obtenidos en el momento de la cirugfa y congelamiento (tabla B).
Tabla B. Ubicacion de antigeno 31.1 en canceres de colon y pancreas
Cancer (numero)
Tincion con parafina Tincion de muestras congeladas
Adenocarcinoma de colon (3)
Positivo (3) Positivo (3)
Adenocarcinoma de pancreas (3)
Positivo (3) Positivo (3)
Debe observarse que estos resultados difieren de los presentados en la tabla 2 de la patente estadounidense n.° 5.688.657 (en la columna 24, lmeas 1-26), que indican que el anticuerpo Mu-31.1 no se unio a ninguna de las dos muestras de tumores de pancreas sometidas a prueba. La tabla 1 de la patente estadounidense n.° 5.688.657 (en la columna 23, lmeas 1-38) muestra que Mu-31.1 reacciono con dos de tres lmeas celulares derivadas de cancer de pancreas. Basandose en la informacion contenida en la patente estadounidense n.° 5.688.657, puede concluirse que Ag 31.1 solo aparecio tras el pase de las celulas en cultivo, y no estaba presente en el tejido de cancer de pancreas reciente. Por tanto, no se espera, basandose en la descripcion de la patente estadounidense n.° 5.688.657, que el Ag 31.1 estuviera presente en 3/3 muestras de tumor de pancreas, tal como se expone en la tabla B en el presente documento.
Mu-31.1 se secreta a partir de una lmea celular de hibridoma desarrollada mediante fusion con la lmea celular SP2 murina. Mu-31.1, Chi-31.1-1 y Chi-31.1-2, equivalentes de Ab 31.1, y anticuerpos coespedficos para 31.1 pueden prepararse, por ejemplo y no a modo de limitacion, para su uso clmico mediante cultivo celular in vitro convencional y procedimientos de purificacion aguas abajo. Por ejemplo, pueden hacerse crecer celulas de hibridoma en geneticina (0,2 mg/ml) dado que se ha observado que la presencia del antibiotico permite que las celulas de hibridoma crezcan mejor.
Preferiblemente, las composiciones que comprenden los equivalentes de Ab 31.1 y anticuerpos coespedficos para
31.1 anteriores pueden prepararse sin la adicion de aditivos humanos. Por ejemplo, las preparaciones pueden filtrarse a traves de un filtro de 0,2 micrometros Millipore para bacterias para eliminar contaminantes y verificarse que son esteriles para bacterias y hongos sembrando en estnas controles positivos en placas de agar sangre y medios de cultivo durante 14 dfas. Puede determinarse que la preparacion esta libre de micoplasma mediante, por ejemplo, ensayos de PCR para micoplasma y mediante placas de agar para micoplasma (Life Technology n.° de cat. 18042010) y kit Myco Test (Life Technology n.° de cat. 15672-017) usando celulas de control 3T6.
Los medios que contienen uno o mas de los equivalentes de Ab 31-1 o anticuerpos coespedficos para 31.1 anteriores pueden filtrarse a traves de un filtro para endotoxina Pall y puede esterilizarse por calor el material de vidrio para eliminar endotoxinas. Convenientemente, pero no a modo de limitacion, un nivel de endotoxina apropiado puede ser de 0,125 unidades/ml o menos, tal como se mide mediante el kit de prueba BioWhittaker Pyrogent 03,250.
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Puede tratarse una de las preparaciones anteriores de modo que inactiven virus. Por ejemplo, puede inactivarse retrovirus mediante el tratamiento con acido acetico a pH3 durante una hora durante una cromatograffa en columna y filtracion a traves de un filtro de eliminacion de virus DV50 de calidad Pall Ultipor de 10-40 nm.
En una realizacion no limitativa, espedfica de la invencion, se usan 50 mg de Chi31.1-1 contenido en un vial a una concentracion de 2 mg/ml en solucion salina tamponada con fosfato (“PBS”).
5.2. PROTOCOLOS DE TRATAMIENTO
La presente invencion proporciona el uso de anticuerpos o fragmentos de union a antigeno de los mismos, que se usan individualmente o en combinacion como se definen en las reivindicaciones adjuntas, en el tratamiento del cancer de pancreas en un sujeto que necesite dicho tratamiento. El procedimiento implica administrar, al sujeto, una dosis terapeuticamente eficaz de uno o mas equivalentes de Ab 31.1 y/o equivalentes de anticuerpos coespedficos para 31.1. En el presente documento, se define una dosis terapeuticamente eficaz como una dosis que logra uno o mas de lo siguiente en el sujeto: produce lisis de celulas de carcinoma de pancreas detectable en el sujeto; provoca una disminucion del crecimiento, o capacidad de invasion, o tamano de un tumor de pancreas; provoca una mejora de los smtomas clmicos; y/o provoca un aumento en el tiempo de supervivencia. Preferiblemente, pero no a modo de limitacion, una dosis individual de equivalente de Ab 31.1 y/o equivalente de anticuerpo coespedfico para 31.1 puede oscilar desde aproximadamente 25 mg hasta aproximadamente 1000 mg, y preferiblemente desde aproximadamente 100 mg hasta 250 mg. La magnitud de la dosis puede ajustarse en cada paciente para evitar efectos secundarios no deseados y/o toxicidad. Se prefiere que se administre el equivalente de Ab 31.1 y/o equivalente de anticuerpo coespedfico para 31.1 como una serie (pluralidad) de dosis individuales, administradas a intervalos de entre aproximadamente 1 y 4 semanas, preferiblemente cada dos semanas, hasta que los efectos secundarios se eleven hasta un nivel no deseable o la enfermedad evolucione hasta un nivel no deseable. El equivalente de Ab 31.1 y/o equivalente de anticuerpo coespedfico para 31.1 pueden administrarse mediante cualquier via convencional; preferiblemente, para someter a prueba si un paciente tolera la formulacion (es decir, el paciente no manifiesta una reaccion alergica y/u otra reaccion toxica no deseable), en primer lugar, puede administrase por via subcutanea, y una vez que se muestra su tolerancia adecuada, puede administrarse por via intravenosa.
En un ejemplo no limitativo, espedfico, un protocolo segun la invencion puede ser tal como sigue.
Usando procedimientos asepticos, puede filtrarse un equivalente de Ab 31.1 “humanizado” y/o equivalente de anticuerpo coespedfico para 31.1, producido usando tecnicas de biotecnologfa convencionales, a traves de un filtro de protemas de bajo peso molecular de 0,22 micrometros en una botella de infusion de vidrio o una bolsa de infusion que no contiene DEHP que contienen cloruro de sodio al 0,9 % hasta una concentracion final de 0,4 mg/ml. Puede mezclarse suavemente lo infundido. Si se observa que la infusion esta turbia, esta no debe administrarse.
Para determinar si un paciente tolera el tratamiento con el equivalente de Ab 31.1 “humanizado” o equivalente de anticuerpo coespedfico para 31.1, puede medicarse previamente al paciente con difenhidramina 25 mg i.v. y paracetamol 650 mg v.o., y entonces pueden inyectarse por via subcutanea 30 microgramos de equivalente de Ab
31.1 o equivalente de anticuerpo coespedfico para 31.1. Si no se produce toxicidad alergica o se produce una toxicidad alergica de grado 1, se realizara el tratamiento intravenoso. Si se produce una toxicidad alergica de grado 1, sera necesaria la resolucion de la toxicidad antes de continuar con la inyeccion intravenosa.
Si el paciente tolera la dosis de prueba subcutanea descrita en el parrafo anterior, el paciente puede tratarse con una primera infusion de 25 mg del equivalente de Ab 31.1 o equivalente de anticuerpo coespedfico para 31.1 durante 2 horas. Puede proporcionarse medicacion previa en forma de difenhidramina 25 mg i.v. y paracetamol 650 mg v.o. Entonces, puede observarse al paciente para detectar cualquier posible efecto secundario durante 6 horas tras la inyeccion. Pueden monitorizarse los signos vitales del paciente antes de la inyeccion, y cada 15 minutos durante la primera hora de tratamiento, cada 30 minutos durante dos horas a continuacion, y cada hora a continuacion hasta 6 horas tras la finalizacion de la infusion.
Si se encuentra que se tolera la primera infusion, tras 2 semanas, entonces el paciente puede recibir una infusion de
50 mg del equivalente de Ab 31.1 o equivalente de anticuerpo coespedfico para 31.1, en un volumen de 100 cm3 de PBS u otro diluyente adecuado, durante 4 horas usando el mismo protocolo clmico tal como se expone en el parrafo anterior. Si tambien se encuentra que se tolera esta segunda infusion, entonces el paciente puede recibir infusiones de 100 mg del equivalente de Ab 31.1 o equivalente de anticuerpo coespedfico para 31.1 en 100 cm3de diluyente durante 4 horas cada dos semanas, usando el protocolo descrito anteriormente. Entonces el paciente puede continuar tal tratamiento hasta que se desarrolle intolerancia o se produzca evolucion de la enfermedad, y preferiblemente durante un maximo de 4 meses. Si se produce alguna toxicidad de grado 3 o superior debido al tratamiento, el paciente puede interrumpir el tratamiento de manera permanente. Si se considera que la toxicidad no esta relacionada con el tratamiento, el paciente puede reanudar el tratamiento tras la recuperacion de la toxicidad. Si se produce alguna toxicidad de grado 2 durante o tras el tratamiento, la infusion puede detenerse convenientemente.
51 se produce recuperacion hasta grado 0, entonces puede reanudarse la infusion. Si no se ha producido la recuperacion en el momento del siguiente tratamiento planeado, puede retrasarse el tratamiento hasta que se haya
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producido recuperacion hasta grado 0. Si no se produce la recuperacion hasta grado 0 en el plazo de 4 semanas, el tratamiento puede interrumpirse de manera permanente. Si se produce alguna reaccion alergica de grado 2 o superior, puede detenerse el tratamiento y preferiblemente no puede proporcionarse ninguna infusion adicional.
En realizaciones no limitativas, espedficas de la invencion, lo siguiente puede servir como criterios para seleccionar pacientes adecuados para el tratamiento:
a) el paciente puede padecer un adenocarcinoma del pancreas recurrente o metastasico confirmado de manera histologica, en el que el tumor reacciona con un anticuerpo de la invencion que se pretende usar;
b) puede haber fracasado el tratamiento del paciente mediante un regimen convencional para cancer de pancreas metastasico;
c) la enfermedad en el paciente puede ser medible por uno o mas de los siguientes:
i) exploracion ffsica;
ii) tomograffa computarizada u otro estudio radiologico;
iii) niveles de CEA; y/o
iv) niveles de Ca 19-9;
d) el paciente puede tener 18 anos o mas;
e) el paciente puede presentar un estado general segun la OMS de 0, 1 o 2;
f) el pronostico del paciente puede indicar una esperanza de vida de al menos 12 semanas;
g) las pruebas hematologicas del paciente pueden indicar los siguientes valores:
i) leucocitos > 3.000;
ii) hemoglobina > 10; y
iii) plaquetas > 100.000;
h) los valores de qrnmica clmica pueden ser tal como sigue:
Creatinina, bilirrubina, aspartato transaminasa, alanina transaminasa, fosfatasa alcalina y bilirrubina son todos inferiores o iguales a 2 veces el lfmite superior de lo normal; y/o
i) el paciente tiene acceso venoso periferico adecuado para la toma de muestras de sangre repetida.
En realizaciones no limitativas espedficas de la invencion, lo siguiente puede servir como criterios para excluir a pacientes que pueden ser inadecuados para el tratamiento:
a) pueden haber transcurrido menos de 4 semanas desde la quimioterapia anterior (o 6 semanas para nitrosoureas o mitomicina C), desde el tratamiento con modificadores de la respuesta biologica o desde la radioterapia;
b) actualmente el paciente recibe terapia con esteroides
c) la paciente esta embarazada (se aconseja a los hombres y las mujeres en el estudio, si son fertiles, que practiquen anticoncepcion eficaz);
d) el paciente es una mujer en periodo de lactancia;
e) el paciente padece un estado comorbido no maligno debilitante, tal como infeccion activa o una complicacion intercurrente aguda de cancer;
f) existe una implicacion del sistema nervioso central;
g) el paciente ha recibido previamente un trasplante de medula osea u otro organo;
h) el paciente tiene una historia de otro cancer, excepto cancer de la piel distinto de melanoma tratado adecuadamente o cancer de cuello uterino in situ;
i) se ha expuesto previamente al paciente a anticuerpos monoclonales o policlonales murinos; y/o
j) se sabe que el paciente es positivo para el VIH.
Durante el transcurso del estudio, ejemplos no limitativos de reacciones adversas incluyen disnea, hipotension, cianosis, exantema, broncoespasmo, escalofnos, rigidez, dolor de espalda, fiebre, cianosis, nauseas, vomitos, palpitaciones o cualquier otra reaccion adversa.
En realizaciones no limitativas de la invencion, pueden realizarse de manera deseable las siguientes pruebas de laboratorio para evaluar a pacientes que van a tratarse mediante el protocolo. Con respecto a las pruebas de hematologfa, pueden obtenerse un hemograma completo, formula leucocitaria y recuento de plaquetas antes de cada infusion y semanalmente durante el tratamiento hasta cuatro semanas tras la ultima inyeccion. Con respecto a las pruebas de qrnmica clmica, puede obtenerse semanalmente un panel qrnmico completo que mide glucosa, sodio, potasio, bicarbonato, cloruro, nitrogeno ureico, creatinina, acido urico, calcio, fosfato inorganico, protema total, albumina, lactato deshidrogenasa, aspartato transaminasa, alanina transaminasa y fosfatasa alcalina durante el tratamiento y hasta cuatro semanas tras la ultima inyeccion. Con respecto a pruebas de laboratorio especiales, pueden recogerse muestras de suero obtenidas de 10 cm3 de sangre antes de y en el plazo de dos minutos tras
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cada inyeccion, en tiempos de 15 min., 30 min., 60 min., 2, 4, 24 y 72 horas tras la finalizacion de la primera inyeccion y cada dos semanas despues de eso antes de cada inyeccion y hasta cuatro semanas tras el ultimo tratamiento y procesarse para la deteccion de equivalente de Ab 31-1 y/o equivalente de anticuerpo coespedfico para 31.1 administrado. Entonces pueden usarse estas muestras de suero para determinar ADCC, concentracion de anticuerpos y la presencia de anticuerpos humanos dirigidos contra el equivalente de anticuerpo administrado. Puede realizarse un analisis de orina en la inclusion y antes de cada inyeccion, asf como cuatro semanas despues de la ultima inyeccion, realizandose un examen microscopico en cualquier muestra anomala.
En diversas realizaciones de la invencion, pueden realizarse de manera deseable las siguientes evaluaciones de seguridad. Para cada infusion, pueden obtenerse los signos vitales incluyendo la temperatura, el pulso y la tension arterial del paciente antes y despues de cada infusion. Puede registrarse el pulso y la tension arterial cada quince minutos durante la primera hora de infusion y luego cada media hora durante dos horas, seguido por cada hora hasta 6 horas tras la finalizacion de la infusion. Puede observarse a los pacientes y monitorizarse los signos vitales hasta seis horas tras la finalizacion de la infusion o hasta el regreso al nivel inicial de los signos vitales.
Pueden realizarse una evaluacion inicial y evaluaciones posteriores de la respuesta del paciente al tratamiento tal como sigue. Puede realizarse la medicion del tumor mediante exploracion ffsica y/o estudios radiologicos especiales o convencionales tales como radiograffa de torax, tomograffa computarizada, obtencion de imagenes por resonancia magnetica o ecograffa. Si existe mas de una lesion medible, deben medirse las lesiones representativas. Pueden registrarse las mediciones perpendiculares mas largas de las lesiones representativas antes del tratamiento y cada ocho semanas. Pueden monitorizarse regularmente los niveles de Ca 19.9, por ejemplo, mensualmente.
Preferiblemente se obtiene el consentimiento informado por escrito para cada paciente que va a tratarse. Debe proporcionarsele a cada paciente una descripcion verbal del tratamiento, sus riesgos y beneficios potenciales, asf como tratamientos alternativos disponibles, antes de firmar el consentimiento por escrito.
Durante el transcurso del tratamiento, pueden administrarse hemoderivados, antibioticos, antiemeticos, analgesicos u otras medicaciones para afecciones medicas coexistentes estables segun sea apropiado.
El tratamiento puede interrumpirse en un paciente si existen pruebas de enfermedad progresiva, si se produce una reaccion adversa grave o inesperada, o por otras razones apropiadas desde el punto de vista medico.
Ademas de los usos terapeuticos descritos en el presente documento, los anticuerpos 31.1 y equivalentes funcionales de los mismos pueden usarse para diagnosticar carcinoma de pancreas en un sujeto. Los procedimientos de diagnostico de la invencion se basan en el descubrimiento de que el anticuerpo 31.1 se une selectivamente a un antfgeno expresado en celulas de carcinoma de pancreas, pero no en celulas normales.
Segun la invencion, puede usarse la medicion de los niveles de reactividad de anticuerpo monoclonal 31.1 en muestras derivadas de un sujeto para el diagnostico de enfermedades tales como carcinoma de pancreas. La deteccion de la reactividad del anticuerpo monoclonal 31.1 en una muestra de un sujeto puede llevarse a cabo mediante cualquiera de varios procedimientos. Los procedimientos de diagnostico preferidos pueden implicar, por ejemplo, inmunoensayos en los que se detecta el antfgeno reactivo para 31.1 mediante su interaccion con un anticuerpo monoclonal 31.1. Los inmunoensayos utiles en la practica de la invencion incluyen, pero no se limitan a, sistemas de ensayo que usan tecnicas tales como transferencias de tipo Western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo de inmunoabsorcion ligado a enzima), inmunoensayos de tipo “sandwich”, ensayos de inmunoprecipitacion, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina de difusion en gel, ensayos de inmunodifusion, ensayos de aglutinacion, ensayos de fijacion de complemento, ensayos inmunorradiometricos, inmunoensayos fluorescentes, inmunoensayos con protema A, por mencionar unos pocos.
Se obtiene una muestra biologica, tal como tejido pancreatico u otro tejido biologico, a partir de un sujeto que se sospecha que tiene un cancer particular o riesgo para el cancer. Se solubilizan alfcuotas de tejidos completos, o celulas, usando uno cualquiera de una diversidad de cocteles de solubilizacion conocidos por los expertos en la tecnica. Por ejemplo, puede solubilizarse tejido mediante la adicion de tampon de lisis que comprende (por litro) urea 8 M, 20 ml de tensioactivo Nonidet P-40, 2o ml de anfolitos (pH 3,5-10), 20 ml de 2-mercaptoetanol, y fluoruro de fenilmetilsulfonilo (PMSF) 0,2 mM en agua desionizada destilada.
Los inmunoensayos para detectar la expresion del antfgeno reactivo para 31.1 comprenden normalmente poner en contacto la muestra biologica, tal como una muestra de tejido derivada de un sujeto, con el anticuerpo monoclonal
31.1 en condiciones tales que puede producirse una reaccion de union antfgeno-anticuerpo inmunoespedfica, y detectar o medir la cantidad de cualquier union inmunoespedfica mediante el anticuerpo. En un aspecto espedfico, puede usarse tal union de anticuerpo, por ejemplo, para detectar la presencia y aumento de la produccion del antfgeno reactivo para 31.1, en el que la deteccion del antfgeno es una indicacion de un estado de enfermedad.
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65
6. EJEMPLO: PREPARACION DE VECTOR pRc/CMV
Se preparo el vector pRc/CMV usando una serie de plasmidos, tal como se representa en la figura 1A-F. Se clonaron las cadenas pesada y ligera de Chi 31.1-1 en el vector pCR (figura 1A) mediante clonacion con TOPO (topoisomerasa I). Las secuencias usadas para insertar las secuencias de cadena pesada y ligera en el vector pCR mediante PCR son tal como sigue:
a) para la insercion de la region que codifica cadena ligera de Chi31.1-1 en un sitio de insercion BamH1/XbaI:
i) Chi31.1-LcBamH1(S):
5'- ATA GGA TCC ATG AAG TCA CAG ACC CAG GTC TTC G-3'
ii) Chi31.1-LcXBaI (A):
5'-TTT CTA GAC TAA CAC TCT CCC CTG TTG AAG C-3'
b) para la insercion de la region que codifica cadena pesada de Chi31.1-1 en un sitio de insercion EcoRI/NotI:
i) Chi31.1-HcEcoRI(S):
5'-ATA GAA TTC ATG GCT TGG GTG TGG ACC TTG CT-3'
ii) Chi31.1-HcNotI(A):
5'-TTG CGG CCG CTC ATT TAC CCG GAG-3'
Entonces, estos se clonaron del vector pCR en el vector pDCM-dhfr, de tal manera que se inserto la region que codifica la cadena ligera en el sitio BamHI/XbaI (bajo el control del promotor de citomegalovirus (“CMV”)), y se inserto la region que codifica la cadena pesada en el sitio EcoRI/NotI, bajo el control de un segundo elemento promotor de CMV (figura 1F).
Se preparo el vector pDCM-dhfr usando la serie de etapas expuesta en las figuras 1B-E. Una serie de construcciones de vector usando algunos componentes relacionados se describe en Ryu et al., 1996, Hum. Antibod. Hybridomas 7:113-122 (basado en el vector pRc/CMV (Invitrogen); veanse, por ejemplo, pagina 115 y figura 4 de Ryu et al.); Jin et al., 1995, Virus Res. 38:269; y Lee et al., 1999, Molec. Immunol. 36:61-71 (vease, por ejemplo, la figura 2 de esta publicacion).
Basicamente, se uso el vector pcDNA3 (Invitrogen) (figura 1B) como la base para el vector pDCM (figura 1C), en el que se uso digestion con pares de enzimas de restriccion seguido por nuevo ligamiento, en preparaciones paralelas, para destruir determinados sitios de escision y mantener otros en vector cadena abajo de las secuencias promotoras de CMV. Espedficamente, tal como se muestra en la figura 1C, la digestion de pcDNA3 en primer lugar con HindIII y BamHI, seguido por nuevo ligamiento y luego digestion con XhoI y ApaI, seguido por nuevo ligamiento, dio como resultado la conservacion de los sitios BstXI, EcoRI, EcoRV, BstXI y NotI cadena abajo del promotor; la posterior escision con BsmI linealizo la molecula entre los genes de resistencia a ampicilina y neomicina (componente 1). En paralelo, la digestion de pcDNA3 con BstxI y NotI, seguido por la eliminacion del fragmento pequeno y nuevo ligamiento, elimino los sitios BstXI, EcoRI, EcoRV, BstXI y NotI y dejo los sitios HindIII, KpnI, BamHI, XhoI, XbaI y ApaI intactos; la escision con PvuII y NruI dio lugar a un fragmento que contema el promotor CMV, los sitios conservados y BGHpA (componente 2). Se inserto el componente 2 entre los extremos del componente 1, lo que dio como resultado pDCM, que tema dos sitios de insercion diferentes para los genes cadena abajo de dos elementos promotores de CMV respectivos. Tal como se muestra en la figura 1E, entonces puede insertarse un gen de dihidrofolato reductasa (“dhfr’) de KC-dhfr en pDCM (vease Lee et al., 1999, Molec. Immunol. 36:61-71) para producir pDCM-dhfr. Como alternativa, tal como se muestra en la figura 1D, puede incorporarse el gen dhfr de KC- dhfr en pcDNA3, para producir pCdhfr, que entonces puede modificarse por ingeniena genetica mediante procedimientos analogos a los mostrados en la figura 1C para producir el casete de promotor CMV/sitio de insercion doble.
Entonces, se clonaron las secuencias que codifican la cadena pesada y ligera de Chi31.1-1 del vector pCR en pDCM-dhfr, formando pRc/CMV, que puede transferirse en las celulas CHO dhfr-, despues de lo cual pueden recogerse moleculas de inmunoglobulina quimericas expresadas segun tecnicas convencionales.
7. EJEMPLO: RESPUESTA INMUNITARIA HUMANA A Chi31.1-1
Para determinar si los anticuerpos quimericos de 31.1 pueden inducir una respuesta inmunitaria, se recogio plasma de un sujeto humano a quien se le habfa administrado anticuerpo monoclonal quimerico Chi31.1-1. Se sometio a prueba la presencia de una reaccion inmunitaria en el paciente frente al anticuerpo quimerico usando el siguiente
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ensayo.
Se recubrieron placas de microtitulacion de 96 pocillos con anticuerpo Chi31.1-1, usando una solucion que tema 10 microgramos por mililitro, con 100 microlitros por pocillo. Se biotinilo una preparacion de Chi31.1-1. Entonces, se introdujo o bien el plasma de control o bien el plasma del paciente (50 microlitros) en los pocillos, y se anadieron 50 microlitros del Chi31.1-1 biotinilado. Entonces, se incubaron las placas durante noventa minutos a 37 grados centigrados y luego se lavaron los pocillos y se anadio conjugado de estreptavidina-peroxidasa del rabano rusticano. Entonces, se lavaron tres veces los pocillos. Luego, se anadio sustrato TMB (3,3',5,5'-tetrametil-bencidina), y se incubaron las placas durante 20 minutos. Se anadio disolucion de parada y se determino la cantidad del sustrato que reacciono.
Los resultados se presentan en la tabla C, y se expresan en nanogramos de Chi31.1-1 unidos por mililitro de plasma. Se consideran positivos los resultados mayores de 2 veces por encima del nivel inicial previo al tratamiento. Se encontro que los valores de union de nivel inicial no espedficos de 3 muestras normales sanas eran de 4 mas o menos 2 nanogramos por mililitro. Se determino el patron usando pocillos recubiertos con IgG1 anti-humano de cabra con diversas concentraciones de anticuerpo monoclonal Chi31.1-1 biotinilado.
TABLA C.
Respuesta inmunitaria humana frente a anticuerpo monoclonal Chi31.1-1 (HAMA)
Tiempo ng/ml unido
0 hora (previo al tratamiento) 2

1 hora 3

2 horas 2

3 horas 3

4 horas 3

5 horas 2

6 horas 3

Dfa siguiente 4

1 semana 3

2 semanas 5
8. EJEMPLO: ACTIVIDAD ADCC DE ANTICUERPO CHI 31.1 DE CHO
La siguiente seccion describe experimentos que demuestran que el anticuerpo monoclonal Chi 31.1 de CHO tiene actividad biologica asociada con la destruccion de tumores. Espedficamente, se demostro que el anticuerpo tiene citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC).
Se uso un ensayo de liberacion de 111In de cuatro horas para medir la actividad de ADCC. Las celulas diana fueron la lmea celular de tumor de colon SW1643 y la lmea celular de cancer de pancreas PANC-1. Se uso UPC-10 como un anticuerpo de control. Se marcaron las celulas diana con 50 |iCi de In-oxiquinolina durante 15 minutos a temperatura ambiente. Se anadieron celulas diana (1 x 104) en 50 |il a placas de 96 pocillos. Se sometieron a ensayo proporciones de celulas efectoras con respecto a celulas diana de 100:1, 50:1 y 25:1 en presencia de 31.1 de CHO (1 mg/pocillo). Se incubaron las placas durante cuatro horas a 37° en atmosfera humidificada que contema CO2 al 5 %. Se recogio el sobrenadante para el recuento gamma con el uso de marcos de colector de celulas Skatron. Se llevaron a cabo experimentos por triplicado. Se calculo la lisis espedfica con el uso de la siguiente formula:
% lisis = 100 X ^E mX“hberaaonesjicatania(cpm)
libe-raotn trt J r rpnfi - lib;i a:irii r^jDCitir e a./cpmfi
Tal como se presenta en la figura 6A y 6B, el anticuerpo 31.1 de CHO, pero no el anticuerpo UPC-10 de control, pudo mediar la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos contra las celulas diana.
LISTADO DE SECUENCIAS
<110> Arlen, Myron Tsang, Kwong Y.
<120> TERAPIA DE ANTICUERPOS MONOCLONALES PARA EL CANCER DE PANCREAS <130> 34133-PCT 072771.0111 <140> PCT/US02/09193
5
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20
25
30
35
<141>
<150> US 60/276.284 <151>
<160> 10
<170> FastSEQ para Windows version 4.0
<210> 1 <211> 384 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 1
atgaagtcac agacccaggt cttcgtattt agtattgtga tgacccagac tcccaaattc ataacctgca aggccagtca gagtgtgagt gggcagtctc ctaaactgct gatatactat cgcttcactg gcagtggata tgggacggat gaagacctgg cagtttattt ctgtcagcag gggaccaagc tggagctgaa acgt
ctactgctct
ctgcttgtat
aatgatgtag
gcatccaatc
ttcactttca
gattatagct
gtgtgtctgg
cagcaggaga
cttggtacca
gctacactgg
ccatcagcac
ctccgctcac
tgctcatggg 60 cagggttacc 120 acagaaacca 180 agtccctgat 240 tgtgcaggct 300 gttcggtgct 360 384
<210> 2 <211> 384 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 2
acgtttcagc tccagcttgg tcccagcacc acagaaataa actgccaggt cttcagcctg cccatatcca ctgccagtga agcgatcagg tatcagcagt ttaggagact gccctggttt actctgactg gccttgcagg ttatggtaac gggagtctgg gtcatcacaa tactcccatg gaagacctgg gtctgtgact teat
gaacgtgagc
cacagtgctg
gactccagtg
ctgttggtac
cctgtctcct
agcaccagac
ggagagetat
atggtgaaag
tagegattgg
caagctacat
gctgatacaa
acacagagca
aatcctgctg 60 tgaaatccgt 120 atgeatagta 180 cattactcac 240 gcaggaattt 300 gtagaaatac 360 384
<210> 3 <211> 128 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 3
Met
Lys Ser Gin Thr Gin val Phe Val Phe Leu Leu Leu Cys val Ser
1
5 10 15
Gly
Al a Hi s Gly Ser lie val Met Thr Gl n Thr Pro Lys Phe Leu Leu
20 25 30
Val
Ser Al a Gly Asp Arg Val Thr lie Thr Cys Lys Al a Ser Gl n Ser
35 40 45
val
Ser Asn Asp val Al a Trp Tyr Gl n Gl n Lys Pro Gly Gl n Ser Pro
50 55 60
Lys
Leu Leu lie Tyr Tyr Al a Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp
65
70 75 80
Arg
Phe Thr Gly Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr lie Ser
85 90 95
Thr
val Gin Al a Glu Asp Leu Al a Val Tyr Phe Cys Gl n Gl n Asp Tyr
100 105 110
Ser
Ser
Pro Leu Thr Phe Gly Al a Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg
115 120 125
<210> 4 <211> 411
5
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15
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<212> ADN <213> Homo sapiens
<400>4
atggcttggg tgtggacctt atccagttgg tgcagtctgg tgcaaggctt ctgggtatac ggaaagggtt taaagtggat gatgacttca agggacggtt cagatcaaca acctcaaaaa ggtaaatact ttgactactg
gctattcctg
acctgagctg
cttcacaaac
gggctggata
tgccttctct
tgaggacacg
gggccaaggc
atggcagctg
aagaagcctg
tatggaatga
aacacctaca
ttggaaacct
gatacatatt
accactctca
cccaaagtgc
gagagacagt
actgggtgaa
ctggagagcc
ctgccagcac
tctgtgcaag
cagtctcctc
ccaagcacag 60 caagatctcc 120 gcaggctcca 180 aacatatgct 240 tgcctatttg BOO agcctactat 360 a 411
<210>5 <211> 411 <212> ADN <213> Homo sapiens
<400> 5
tgaggagact gtgagagtgg tcttgcacag aaatatgtag agtgctggca gaggtttcca tggctctcca gtgtaggtgt cttcacccag ttcattccat gactgtctct ccaggcttct ggcactttgg gcagctgcca
tgccttggcc ccagtagtca ccgtgtcctc atttttgagg aagagaaggc aaaccgtccc ttatccagcc catccacttt agtttgtgaa ggtataccca tcagctcagg tccagactgc tcaggaatag caaggtccac
aagtatttac catagtaggc 60 ttgttgatct gcaaataggc 120 ttgaagtcat cagcatatgt 180 aaaccctttc ctggagcctg 240 gaagccttgc aggagatctt 300 accaactgga tctgtgcttg 360 acccaagcca t 411
<210>6 <211> 137 <212> PRT <213> Homo sapiens
<400> 6
Met
Al a Trp Val Trp Thr Leu Leu Phe Leu Met Al a Al a Al a Gin Ser
1
5 10 15
Al a
Gl n Al a Gl n lie Gl n Leu val Gin Ser Gly Pro Gl U Leu Lys Lys
20 25 30
Pro
Gly Gl U Thr Val Lys lie Ser Cys Lys Al a Ser Gly Tyr Thr Phe
35 40 45
Thr
Asn Ty r Gly Met Asn Trp Val Lys Gin Al a Pro Gly Lys Gly Leu
50 55 60
Lys
Trp Met Gly Trp lie Asn Thr Tyr Thr Gly Gl U Pro Thr Tyr Al a
65
70 75 80
Asp
Asp
Phe Lys Gly Arg Phe Al a Phe Ser Leu Gl U Thr Ser Al a Ser
85 90 95
Thr
Al a Tyr Leu Gl n lie Asn Asn Leu Lys Asn Gl U Asp Thr Al a
Thr
100 105 110
Ty r
Phe Cys Al a Arg Al a Tyr Tyr Gly Lys Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly
115 120 125
Gl n
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser
130 135
<210> 7 <211> 34 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial
<220>
<223> cebador oligonucleotdico <400> 7
ataggatcca tgaagtcaca gacccaggtc ttcg 34
<210>8 <211>31
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30
<212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> cebador oligonudeotfdico <400>8
tttctagact aacactctcc cctgttgaag c 31
<210>9 <211> 32 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> cebador oligonudeotfdico <400> 9
atagaattca tggcttgggt gtggaccttg ct 32
<210> 10 <211> 24 <212> ADN
<213> Secuencia Artificial <220>
<223> cebador oligonudeotfdico <400> 10
ttgcggccgc tcatttaccc ggag 24

Claims (17)

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    15
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    REIVINDICACIONES
    1. Un anticuerpo recombinante aislado o un fragmento de union a antigeno del mismo que es un anticuerpo monocatenario, un fragmento F(ab) o un fragmento F(ab)2, para su uso en el tratamiento o diagnostico in vivo del cancer de pancreas en un sujeto, donde el anticuerpo recombinante aislado o un fragmento de union a antfgeno del mismo comprende (1) una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 3; y (2) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 6 o una variante humanizada de dicho anticuerpo recombinante o fragmento de union a antfgeno del mismo.
  2. 2. El anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, donde la cadena ligera de dicho anticuerpo esta codificada por acido nucleico de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 1.
  3. 3. El anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, donde la cadena pesada de dicho anticuerpo esta codificada por acido nucleico de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 4.
  4. 4. El anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, donde dicho anticuerpo o su fragmento de union al antfgeno es un anticuerpo quimerico o un anticuerpo humanizado.
  5. 5. El anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicacion 4, donde dicho anticuerpo quimerizado se expresa mediante una lmea celular depositada bajo el n.° de registro de ATCC CRL-12316.
  6. 6. El anticuerpo para uso de acuerdo con la reivindicacion 1, dicho anticuerpo o el fragmento de union a antfgeno del mismo esta unido a un agente bioactivo.
  7. 7. Una composicion terapeutica para uso en el tratamiento de cancer pancreatico que comprende el anticuerpo o el fragmento de union a antfgeno del mismo para uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones de 1 a 6.
  8. 8. Un procedimiento para detectar si un sujeto tiene un carcinoma pancreatico que comprende,
    (a) poner en contacto una muestra del sujeto con un anticuerpo recombinante o fragmento de union a antfgeno del mismo que sea un anticuerpo monocatenario, un fragmento F(ab) o un fragmento F(ab)2, donde el anticuerpo recombinante aislado o un fragmento de union al antfgeno del mismo comprende (1) una region variable de cadena ligera que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 3; y (2) una region variable de cadena pesada que comprende la secuencia de aminoacidos de SEQ ID NO: 6 o una variante humanizada de dicho anticuerpo recombinante o fragmento de union a antfgeno del mismo, y
    (b) detectar la presencia del complejo antfgeno-anticuerpo,
    donde la presencia de un complejo antfgeno-anticuerpo indica la presencia de cancer pancreatico.
  9. 9. El procedimiento de la reivindicacion 8, donde dicha muestra es un tejido.
  10. 10. El procedimiento de la reivindicacion 8, donde la muestra del sujeto se obtiene despues de la cirugfa de un sujeto que se sospecha que tiene cancer de pancreas.
  11. 11. El procedimiento de la reivindicacion 8, donde dicho anticuerpo o su fragmento de union al antfgeno es un anticuerpo quimerico o un anticuerpo humanizado.
  12. 12. El procedimiento de la reivindicacion 11, donde dicho anticuerpo quimerico se expresa mediante una lmea celular depositada bajo el n.° de registro de ATCC CRL-12316.
  13. 13. El procedimiento de la reivindicacion 8, donde la cadena ligera de dicho anticuerpo esta codificada por el acido nucleico de la secuencia de nucleotidos de SEQ ID NO: 1.
  14. 14. El procedimiento de la reivindicacion 8, donde la cadena pesada de dicho anticuerpo esta codificada por el acido nucleico de la secuencia de nucleotidos de la SEQ ID NO: 4.
  15. 15. El procedimiento de la reivindicacion 8, donde dicha deteccion del carcinoma de pancreas en dicho sujeto se lleva a cabo mediante un procedimiento de inmunoensayo seleccionado del grupo que consiste en transferencias de Western, radioinmunoensayos, ELISA (ensayo inmunoabsorbente ligado a enzimas), inmunoensayos de tipo “sandwich”, ensayos de inmunoprecipitacion, reacciones de precipitina, reacciones de precipitina de difusion en gel, ensayos de inmunodifusion, ensayos de aglutinacion, ensayos de fijacion de complemento, ensayos inmunorradiometricos, inmunoensayos fluorescentes e inmunoensayos con protema A.
  16. 16. El procedimiento de la reivindicacion 15, donde dicho procedimiento de inmunoensayo detecta o mide la cantidad de union inmunoespedfica de dicho anticuerpo o fragmento de union a antfgeno del mismo con dicho epttopo reconocido por el anticuerpo monoclonal 31.1, donde la presencia o aumento de la cantidad de dicho epftopo indica
    la presencia de cancer de pancreas en dicho sujeto.
  17. 17. El procedimiento de la reivindicacion 8, donde el sujeto tiene cancer o esta en riesgo de cancer.
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