CN116003627A - NKG2D-NKp46细胞接合器分子及其用途 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种靶向NKG2D配体和NKp46的NK细胞接合器分子及其用途。本发明的细胞接合器分子至少包括:第一结合域,所述第一结合域包括可特异性结合NKG2D配体的NKG2D胞外域;第二结合域,所述第二结合域包括NKp46抗原结合片段。本发明的细胞接合器分子可促进自然杀伤细胞对NKG2D配体高表达的靶细胞的杀伤作用,因此可作为表达NKG2D配体的相关疾病的有效治疗剂使用。
Description
技术领域
本发明涉及生物医药领域,具体涉及由可特异性结合NKG2D配体的NKG2D胞外域、连接段和含NKp46抗原结合片段组成的细胞接合器分子及其应用。
背景技术
NKG2D表达于NK细胞、CD8+T细胞、活化的巨噬细胞和肿瘤浸润的γδT细胞表面,通常以自身形成的同源二聚体存在,并依靠转接蛋白DAP10或DAP12直接激活NK细胞发挥杀伤效应,或作为协同刺激信号促进T细胞的活化。它的配体主要有MICA、MICB、ULBP1-6等,一般在正常细胞中不表达或低表达;但当细胞处于异常转化、病毒感染、DNA损伤等应激状态下时,NKG2D配体表达可显著上调,并作为异常细胞的标志被自身免疫系统识别。NKG2D-NKG2D配体信号链是机体免疫系统发挥免疫监视功能的重要机制,针对其开发的免疫治疗方法理应具有更好的安全性和有效性,已逐渐成为当前免疫治疗策略的前沿领域。目前已有10余种以NKG2D-NKG2DL为作用机制设计的CAR-T和CAR-NK进入临床研究,尚未见严重的治疗相关不良事件。基于NKG2D胞外域构建的细胞接合器分子亦在抗肿瘤领域逐渐受到关注。例如T细胞双特异性抗体NKG2D-CD3在体内可通过靶向肿瘤细胞和免疫抑制细胞抑制肿瘤生长并延长模型小鼠生存期。NK细胞双特异性抗体NKG2D-CD16可高效杀伤急性髓细胞性白血病、淋巴瘤和软组织肉瘤等肿瘤细胞;NKG2D-Fc可显著改善肿瘤免疫微环境并抑制肿瘤发生。
目前本领域仍有待开发更多细胞接合器分子。
发明内容
本发明的目的是提供含NKG2D胞外域和NKp46抗原结合片段的细胞接合器分子及其用途。
本发明的第一方面,提供了一种细胞接合器分子,所述细胞接合器分子包括:
(a)第一结合域,所述第一结合域特异性结合NKG2D配体;和
(b)第二结合域,所述第二结合域特异性结合NKp46。
在另一优选例中,所述的第一结合域来源于NKG2D胞外域。
在另一优选例中,所述的第一结合域氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示;或与SEQ IDNO:1所示氨基酸序列具有至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性或序列相同性的并且可结合NKG2D配体的氨基酸序列。
在另一优选例中,所述第二结合域包括特异性抗NKp46的抗原结合片段。
在另一优选例中,所述的抗NKp46的抗原结合片段包括选自下组的结构:Fab、Fab’、F(ab')2、Fd,Fv、dAb、Fc、互补决定区片段、单链抗体、单域抗体、或其组合。
在另一优选例中,所述的抗NKp46的抗原结合片段包括选自下组的结构:人源化抗体、嵌合抗体、或其组合。
在另一优选例中,所述的NKp46抗原结合片段包括:Fab片段、单链抗体(scFv)、单域抗体、或其组合。
在另一优选例中,所述的抗NKp46的Fab片段和/或单链抗体包括重链可变区和轻链可变区,其中所述重链可变区包括以下重链互补决定区(HCDR):
1)氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR1;
2)氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2;
3)氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR3;
并且,所述轻链可变区包括以下轻链互补决定区(LCDR):
1)氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的LCDR1;
2)氨基酸序列为YTS的LCDR2;
3)氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的LCDR3,
所述CDR基于IMGT编号和定义方案。
在另一优选例中,所述抗NKp46的Fab片段重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示、或具有与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性或序列相同性的氨基酸序列。
在另一优选例中,所述抗NKp46的Fab片段轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示、或具有与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性或序列相同性的氨基酸序列。
在另一优选例中,所述的NKp46的Fab片段氨基酸序列如SEQ ID NO:2所示、或具有与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性或序列相同性的氨基酸序列(序列引自文献Gauthier,Morel et al.2019)。
在另一优选例中,所述抗NKp46的scFv片段氨基酸序列如SEQ ID NO:10所示、或具有与SEQ ID NO:10所示的氨基酸序列至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性或序列相同性的氨基酸序列(序列引自文献Gauthier,Morel et al.2019)。
在另一优选例中,所述抗NKp46的scFv片段重链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:8所示、或具有与SEQ ID NO:8所示的氨基酸序列至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性或序列相同性的氨基酸序列。
在另一优选例中,所述抗NKp46的scFv片段轻链可变区氨基酸序列如SEQ ID NO:9所示、或具有与SEQ ID NO:9所示的氨基酸序列至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性或序列相同性的氨基酸序列。
在另一优选例中,所述抗NKp46单域抗体的重链互补决定区包括:
1)氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR1;
2)氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2;
3)氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR3。
在另一优选例中,所述的抗NKp46单域抗体氨基酸序列如SEQ ID NO:11所示、或具有与SEQ ID NO:11所示的氨基酸序列至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性或序列相同性的氨基酸序列。
在另一优选例中,所述的第二结合域进一步包括:来源于抗CD16的抗原结合片段和/或IL15蛋白的多肽。
在另一优选例中,所述的抗CD16的抗原结合片段包括选自下组的结构:Fab、Fab’、F(ab')2、Fd,Fv、dAb、Fc、互补决定区片段、单链抗体、单域抗体、或其组合。
在另一优选例中,所述的抗CD16的抗原结合片段包括选自下组的结构:人源化抗体、嵌合抗体、或其组合。
在另一优选例中,所述抗CD16单域抗体的可变区包括:
1)氨基酸序列如SEQ ID NO:12所示的HCDR1;
2)氨基酸序列如SEQ ID NO:13所示的HCDR2;
3)氨基酸序列如SEQ ID NO:14所示的HCDR3。
在另一优选例中,所述抗CD16单域抗体的氨基酸序列如SEQ ID NO:15所示、或具有与SEQ ID NO:15所示的氨基酸序列至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性或序列相同性的氨基酸序列。
在另一优选例中,所述抗CD16 Fc片段的氨基酸序列如SEQ ID NO:16所示、或具有与SEQ ID NO:16所示的氨基酸序列至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性或序列相同性的氨基酸序列。
在另一优选例中,所述IL15蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO:17所示、或具有与SEQID NO:17所示的氨基酸序列至少有80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%的序列同源性或序列相同性的氨基酸序列。
在另一优选例中,所述细胞接合器分子从N端到C端具有选自下式(I)或(II)的结构:
S-D1-L1-D2-T (I);或
S-D2-L1-D1-T (II),
式中,
各“-”独立地为连接肽或肽键;
S是无或信号肽序列;
D1是第一结合域;
L1是无或连接肽;
D2是第二结合域;
T是无或标记蛋白。
在另一优选例中,所述第二结合域从N端到C端具有选自下式(III)或(IV)的结构:
D3-L2-D4-I (III);或
D4-L2-D3-I (IV),
式中,
各“-”独立地为连接肽或肽键;
D3是NKp46抗原结合片段;
L2是无或连接肽;
D4是无或CD16抗原结合片段;
I是无或IL15蛋白。
在另一优选例中,所述的S是来源于哺乳动物CD8α的信号肽。
在另一优选例中,所述连接肽是甘氨酸-丝氨酸肽接头。
在另一优选例中,所述的连接肽由式(GGGGS)n表示,其中n为1、2、3、4、5或6,优选地所述n为3.
在另一优选例中,所述的标记蛋白T选自:His标签、FLAG标签。
在本发明的第二方面,提供了一种重组蛋白,所述的重组蛋白包括如本发明第一方面所述的细胞接合器分子。
在另一优选例中,所述的重组蛋白(或多肽)包括融合蛋白。
在另一优选例中,所述的重组蛋白特异性结合NKG2D配体和NK细胞表面NKp46抗原。
在另一优选例中,所述的重组蛋白进一步特异性结合CD16。
在本发明的第三方面,提供了一种多核苷酸,所述多核苷酸编码选自下组的多肽:
(1)如本发明第一方面所述的细胞接合器分子;或
(2)如本发明第二方面所述的重组蛋白。
在本发明的第四方面,提供了一种载体,所述载体含有如本发明第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中,所述的载体包括但不限于:细菌质粒、噬菌体、酵母质粒、植物细胞病毒、哺乳动物细胞病毒如腺病毒、逆转录病毒、或其他载体。
在另一优选例中,所述的载体包括但不限于:pCDH、pTOMO、pGEM、pELNS、pMSGV,或其组合。
在本发明的第五方面,提供了一种工程化的宿主细胞,所述宿主细胞含有如本发明第四方面所述的载体或基因组中整合有如本发明第三方面所述的多核苷酸。
在另一优选例中,所述的宿主细胞为体内细胞、以及体外培养的可移植到体内的细胞。
在另一优选例中,所述免疫细胞选自NK细胞。
在另一优选例中,所述免疫细胞来自人或非人哺乳动物(如鼠)。
在本发明的第六方面,提供了一种抗体偶联物,所述抗体偶联物含有:
(a)抗体部分,所述抗体部分选自下组:如本发明第一方面所述的细胞接合器分子;和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分,所述偶联部分选自下组:可检测标记物、药物、或其组合。
在另一优选例中,所述的可检测标记物包括放射性核素。
在另一优选例中,所述的药物包括毒素、细胞因子、酶。
在另一优选例中,所述偶联物选自:荧光或发光标记物、放射性标记物、MRI(磁共振成像)或CT(电子计算机X射线断层扫描技术)造影剂、或能够产生可检测产物的酶、放射性核素、生物毒素、细胞因子(如IL-2等)、抗体、抗体Fc片段、抗体scFv片段、金纳米颗粒/纳米棒、病毒颗粒、脂质体、纳米磁粒、前药激活酶(例如,DT-心肌黄酶(DTD)或联苯基水解酶-样蛋白质(BPHL))、化疗剂(例如,顺铂)或任何形式的纳米颗粒等。
在另一优选例中,所述的抗体部分与所述的偶联部分通过化学键或接头进行偶联。
在另一优选例中,所述免疫偶联物含有:多价(如二价)的如本发明第一方面所述的细胞接合器分子。
在另一优选例中,所述多价是指在所述免疫偶联物的氨基酸序列中包含多个重复的如本发明第一方面所述的细胞接合器分子。
在本发明的第七方面,提供了一种药物组合物,所述药物组合物含有:
(a)活性成分,所述活性成分选自下组:如本发明第一方面所述的细胞接合器分子、如本发明第二方面所述的重组蛋白、如本发明第五方面所述的宿主细胞、如本发明第六方面所述的抗体偶联物、或其组合;以及
(b)一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂、赋形剂,或其组合。
在另一优选例中,所述的药物组合物为液态制剂。
在另一优选例中,所述的药物组合物为注射剂。
在另一优选例中,所述的药物组合物包括0.01~99.99%的如本发明第一方面所述的细胞接合器分子、如本发明第二方面所述的重组蛋白、如本发明第五方面所述的宿主细胞、如本发明第六方面所述的抗体偶联物、或其组合和0.01~99.99%的载体,所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
在另一优选例中,所述的药物组合物用于预防和/或治疗NKG2D配体表达上调的疾病。
在本发明的第八方面,提供了如本发明第一方面所述的细胞接合器分子,或本发明第二方面所述的重组蛋白、或本发明第五方面所述的宿主细胞,或本发明第六方面所述的抗体偶联物、和/或如本发明第七方面所述的药物组合物在治疗NKG2D配体表达上调的相关疾病中的用途。
在另一优选例中,所述的药物用于预防和/或治疗疾病。
在另一优选例中,所述的表达上调指NKG2D配体的表达量(F1)与正常细胞组织表达量(F0)之比(即F1/F0)≥1.5,优选地≥2,更优选地≥2.5。
在另一优选例中,所述的NKG2D配体包括(但不限于)MICA,MICB,ULBP1,ULBP2,ULBP3,ULBP4,ULBP5,ULBP6。
在另一优选例中,所述的疾病包括肿瘤、自身免疫性疾病、移植排斥、炎症,衰老、衰老细胞累积相关疾病
在另一优选例中,所述肿瘤包括血液肿瘤和实体瘤。
在另一优选例中,所述血液肿瘤选自下组:急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL),或其组合。
在另一优选例中,所述的实体瘤选自下组:肺癌、卵巢癌、结直肠癌、肝癌、胆囊癌、胆道癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、鼻咽癌、非小细胞肺癌、神经胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、或其组合。
在另一优选例中,所述的衰老细胞累积相关疾病选自下组:肌肉萎缩症、脂肪肝、心衰、动脉粥样硬化、糖尿病、心肌肥厚、骨质疏松、组织/器官纤维化、阿尔茨海默病、帕金森综合征、关节炎、慢性阻塞性肺病等细胞衰老导致的器官退行性疾病、或其组合。
在另一优选例中,所述的药物用于抑制NKG2D配体表达上调的细胞,优选地包括:人肝癌细胞株MHCC97H,人肝癌细胞株SMMC7721,人胰腺癌细胞株ASPC1,或其组合。
在另一优选例中,所述的衰老细胞的选自下组:肺细胞、脂肪细胞、肾细胞、肌肉细胞,或其组合。
在另一优选例中,所述的衰老细胞为人胚肺细胞株HEL1。
在另一优选例中,所述的衰老细胞是自然的或人工诱导衰老的。
在另一优选例中,所述的人工诱导衰老方法包括:DNA损伤诱导衰老、过表达P16诱导衰老、端粒缩短诱导衰老,或其组合。
在另一优选例中,所述的自身免疫性疾病选自下组:类风湿性关节炎、结肠炎、乳糜泻、多发性硬化症、斑秃、1型糖尿病、慢性阻塞性肺病、动脉粥样硬化或与2型糖尿病相关的代谢综合征。
在另一优选例中,所述的方法进一步包括用另外的疾病治疗方法治疗受试者。
在另一优选例中,所述的另外的疾病治疗方法选自下组:手术、放射疗法、化学疗法、基因疗法、DNA疗法、病毒疗法、RNA疗法、辅助疗法、免疫疗法、或其组合。
在本发明的第九方面,提供了一种治疗与NKG2D配体表达上调相关的疾病的方法,向有需要的对象施用有效量的如本发明第一方面所述的细胞接合器分子、或如本发明第二方面所述的重组蛋白、或如本发明第五方面所述的宿主细胞、或如本发明第六方面所述的抗体偶联物、或如本发明第七方面所述的药物组合物,或其组合。
应理解,在本发明范围内中,本发明的上述各技术特征和在下文(如实施例)中具体描述的各技术特征之间都可以互相组合,从而构成新的或优选的技术方案。限于篇幅,在此不再一一累述。
附图说明
下列附图用于说明本发明的具体实施方案,而不用于限定由权利要求书所界定的本发明范围。
图1显示了NKG2D-NKp46蛋白制备。
(A)NKG2D-NKp46和对照载体结构示意图。(B)NKG2D-NKp46和对照载体转染293T细胞,收集培养液上清并进行纯化后,利用His抗体检测纯化蛋白中NKG2D-NKp46和对照蛋白表达。(C)NKG2D-NKp46与NK92细胞孵育后,流式细胞术检测结合率。
图2显示了NKG2D-NKp46蛋白促进NK92细胞对肿瘤细胞的杀伤。
(A)流式细胞术检测肝癌细胞系MHCC97H中NKG2D配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2和ULBP3表达。(B)NKG2D-NKp46蛋白加入到NK92细胞和MHCC97H细胞共培养体系中6h后,检测MHCC97H细胞死亡率。
图3显示了衰老细胞中NKG2D配体表达上调。
(A)HEL1-P16细胞用四环素(DOX)诱导P16过表达后,细胞β-gal染色。(B)HEL1-P16细胞用四环素诱导P16过表达后,定量PCR检测NKG2D配体表达。(C)HEL1-P16细胞用四环素(DOX)诱导P16过表达后,流式细胞术检测NKG2D配体表达。
图4显示了NKG2D-NKp46蛋白促进NK92细胞对衰老细胞的杀伤。
NKG2D-NKp46蛋白加入到NK92细胞和DOX诱导衰老的HEL1-P16细胞中共培养体系中6h后,检测衰老细胞死亡率。
具体实施方式
本发明人经过广泛而深入的研究,经过大量的筛选,首次开发了一种基于NKG2D胞外域构建的双特异性细胞接合器分子的制备及其应用。实验结果表明,本发明所述的靶向NKG2D配体和NKp46抗原的双特异性抗体对靶细胞杀伤效果显著。在此基础上完成了本发明。
本发明所提供的双特异性细胞接合器分子由三部分组成:可特异性结合NKG2D配体的NKG2D胞外域、连接段和NKp46抗原结合片段。所述的双特异性细胞接合器可桥接自然杀伤细胞到NKG2D配体高表达的靶细胞周围,进而杀死靶细胞,因此可用于治疗表达NKG2D配体的相关疾病。
术语
为了更容易理解本发明,以下具体定义了某些技术和科学术语。除非在本文中另有明确定义,本文使用的所有其它技术和科学术语都具有本发明所属领域的一般技术人员通常理解的含义。在描述本发明之前,应当理解本发明不限于所述的具体方法和实验条件,因为这类方法和条件可以变动。还应当理解本文所用的术语其目的仅在于描述具体实施方案,并且不意图是限制性的,本发明的范围将仅由所附的权利要求书限制。
除非另外定义,否则本文中所用的全部技术与科学术语均具有如本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同含义。如本文所用,在提到具体列举的数值中使用时,术语“约”意指该值可以从列举的值变动不多于1%。例如,如本文所用,表述“约100”包括99和101和之间的全部值(例如,99.1、99.2、99.3、99.4等)。
本发明所用氨基酸三字母代码和单字母代码如J.biol.chem,243,p3558(1968)中所述。
如本文所用,术语“治疗”指给予患者内用或外用治疗剂,包含本发明的针对呼吸道合胞病毒融合蛋白(较佳地融合前F蛋白)的抗体及其组合物,所述患者具有一种或多种疾病症状,而已知所述治疗剂对这些症状具有治疗作用。通常,以有效缓解一种或多种疾病症状的治疗剂的量(治疗有效量)给予患者。
如本文所用,术语“任选”或“任选地”意味着随后所描述的事件或情况可以发生但不是必须发生。例如,“任选包含1-3个抗体重链可变区”是指特定序列的抗体重链可变区可以有但不是必须有,可以是1个、2个或3个。
本发明所述的“序列同一性”表示当具有适当的替换、插入或缺失等突变的情况下最佳比对和比较时,两个核酸或两个氨基酸序列之间的同一性程度。本发明中所述的序列和其具有同一性的序列之间的序列同一性可以至少为85%、90%或95%,优选至少为95%。非限制性实施例包括85%,86%,87%,88%,89%,90%,91%,92%,93%,94%,95%,96%,97%,98%,99%,100%。
NKG2D及NKG2D配体
NKG2D表达于NK细胞、CD8+T细胞、活化的巨噬细胞和肿瘤浸润的γδT细胞表面,能够直接激活NK细胞发挥杀伤效应,或作为协同刺激信号促进T细胞的活化。
本发明基于NKG2D胞外域构建结合NKG2D配体的细胞接合器分子。本发明所述的NKG2D配体包括(但不限于)MICA,MICB,ULBP1,ULBP2,ULBP3,ULBP4,ULBP5,ULBP6。
NKp46
NKp46属于免疫球蛋白超家族,具有两个Ig样结构域。NKp46是体内NK细胞清除靶细胞的主要激活受体,针对NKp46的抗体可有效触发NK细胞的细胞毒活性和细胞因子释放。
本发明以NKG2D胞外域为靶细胞结合域,NKp46为NK细胞结合域构建了NK细胞特异性的接合器分子。
CD16
CD16即FcγRⅢ,为分子量为50000~70000的糖蛋白,属Ig超家族成员,主要表达于单核细胞和自然杀伤细胞表面,参与抗体依赖性的细胞毒性(ADCC)作用。在肿瘤治疗过程中利用CD16抗体激活NK细胞,可促进NK细胞浸润并诱导更强的NK细胞介导的ADCC作用。本发明利用结合CD16的多特异性抗体激活和桥接NK细胞,促进对衰老细胞的杀伤。
IL15
白细胞介素-15(interleukin-15,IL15)是一种T细胞生长因子,通过激活JAK1/JAK3和STAT3/STAT5、Syk激酶和磷脂酶C(PLC)γ、Lck激酶和Shc,进而活化PI3K/Akt和Ras/Raf/MAPK信号级联。文献表明,IL-15参与调节NK、记忆性CD8+T、NKT等免疫细胞的存活、增殖与功能,从而抑制肿瘤发生和发展。
本发明在NKG2D-NKp46基础上还构建了包含IL15激活单元的多特异性细胞接合器,以增强NK细胞对衰老细胞的杀伤作用。
抗体
本发明的细胞接合器分子的第二结合域可以包括特异性结合NKp46的抗原结合片段、和特异性结合CD16的抗原结合片段。
如本文所用,术语“抗体”或“免疫球蛋白”是有相同结构特征的约150000道尔顿的异四聚糖蛋白,其由两个相同的轻链(L)和两个相同的重链(H)组成。每条轻链通过一个共价二硫键与重链相连,而不同免疫球蛋白同种型的重链间的二硫键数目不同。每条重链和轻链也有规则间隔的链内二硫键。每条重链的一端有可变区(VH),其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区(VL),另一端有恒定区;轻链的恒定区与重链的第一个恒定区相对,轻链的可变区与重链的可变区相对。特殊的氨基酸残基在轻链和重链的可变区之间形成界面。
如本文所用,术语“可变”表示抗体中可变区的某些部分在序列上有所不同,它形成了各种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性。然而,可变性并不均匀地分布在整个抗体可变区中。它集中于轻链和重链可变区中称为互补决定区(CDR)或超变区中的三个片段中。可变区中较保守的部分称为构架区(FR)。天然重链和轻链的可变区中各自包含四个FR区,它们大致上呈β-折叠构型,由形成连接环的三个CDR相连,在某些情况下可形成部分β折叠结构。每条链中的CDR通过FR区紧密地靠在一起并与另一链的CDR一起形成了抗体的抗原结合部位(参见Kabat等,NIH Publ.No.91-3242,卷I,647-669页(1991))。恒定区不直接参与抗体与抗原的结合,但是它们表现出不同的效应功能,例如参与抗体的依赖于抗体的细胞毒性。
术语“抗体片段”或“抗原结合片段”用于指抗体的一部分,例如F(ab')2,F(ab)2,Fab',Fab,Fv,单链Fvs(scFv),单链抗体,二硫键连接的Fvs(sdFv),包含VL或VH结构域的片段,Fab表达文库产生的片段以及抗个体遗传型(anti-Id)抗体。不论结构如何,抗体片段都与完整抗体所识别的相同抗原结合。术语“抗体片段”包括DART和双抗体。术语“抗体片段”还包括任何包含免疫球蛋白可变区的合成蛋白或基因工程改造蛋白,其通过与特定抗原结合形成复合物而像抗体一样起作用。“单链片段可变区”或“scFv”是指免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白。在一些方面,所述区结构域与10至约25个氨基酸的短接头肽连接。接头可富含甘氨酸以具有柔韧性和丝氨酸或苏氨酸以具有溶解度,并且可以连接VH的N末端或VL的C末端,反之亦然。尽管去除了恒定区并引入了接头,但是这种蛋白仍保留了原始免疫球蛋白的特异性。关于IgG,标准免疫球蛋白分子包含两个相同的分子量约为23,000道尔顿的轻链多肽和两个相同的分子量为53,000-70,000的重链多肽。四个链通常以“Y”构型通过二硫键连接,其中轻链从“Y”的口连接(bracket)重链并延伸通过可变区。
如上所述,可变区允许抗体选择性地识别并特异性结合抗原上的表位。即,抗体的VL结构域和VH结构域或抗体的互补决定区(CDR)子集(subset)结合以形成限定三维抗原结合位点的可变区。这种四元抗体结构形成了各Y构型的各臂的末端处存在的抗原结合位点。更具体地说,该抗原结合位点由VH和VL链中的每一个上的三个CDR(即HCDR1,HCDR2,HCDR3,LCDR1,LCDR2和LCDR3)限定。在某些情况下,例如某些免疫球蛋白分子衍生自骆驼科动物物种或基于骆驼科动物免疫球蛋白进行工程改造。或者,免疫球蛋白分子可以由仅不具有轻链的重链或仅不具有重链的轻链组成。
如本文所用,抗体、抗体片段或抗体结构域还包括其“变体”,所述的“变体”是指如下,抗体、抗体片段或抗体结构域:(1)与原始抗体、抗体片段或抗体结构域具有至少80%,85%,90%,95%,96%,97%,98%或99%的序列同一性,和(2)特异性结合至与原始抗体,抗体片段或抗体结构域特异性结合的相同靶标。应当理解,在以“至少x%相同”或“至少x%同一性”的形式表示序列同一性的情况下,这样的实施方案包括等于或高于下限的任何和所有数值百分比。此外,应当理解,在本申请中存在氨基酸序列的情况下,应将其解释为另外公开或包含与该氨基酸序列具有至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%或至少99%的同一性。
本发明细胞接合器分子中所包含的抗体可以可以是具有免疫活性的抗体片段,如Fab或(Fab')2片段;抗体重链;抗体轻链。本发明所用的抗体优选地为单链抗体形式,所述单链抗体(scFv)含有抗体重链可变区、轻链可变区,但没有恒定区,并具有全部抗原结合位点的最小抗体片段。一般的,Fv抗体还包含VH和VL结构域之间的多肽接头,且能够形成抗原结合所需的结构。
术语“特异性结合”、“选择性结合”、“选择性地结合”和“特异性地结合”是指抗体对预先确定的抗原上的表位的结合。通常,抗体以大约小于10-7M,例如大约小于10-8M、10-9M或l0-10M或更小的亲和力(KD)结合。
如本文所用,术语“重链可变区”与“VH”可互换使用。
如本文所用,术语“轻链可变区”与“VL”可互换使用。
如本文所用,术语“可变区”与“互补决定区(complementarity determiningregion,CDR)”可互换使用。
术语“CDR”是指抗体的可变结构域内主要促成抗原结合的6个高变区之一。所述6个CDR的最常用的定义之一由Kabat E.A等人,(1991)Sequences of proteins ofimmunological interest.NIH Publication91-3242)提供。
在本发明的一个优选例中,所述的双特异性细胞接合器分子为单链多肽,其包括抗CD3单链抗体段、连接肽和Pep42配体段,其中抗CD3单链抗体为本领域常规的单链抗体,其包括重链可变区、轻链可变区。
同时,本领域技术人员应当理解,虽然本发明BiTE的第一结合域优选为uPAR的配体,但该第一结合域也可以选择为特异性抗uPAR的抗体,只要其能够获得本发明的细胞结合效果。
双特异性细胞接合器分子
如本文所用,术语“双特异性细胞接合器分子”、“双特异性细胞接合器”、“细胞接合器”、“双特异性抗体”、“BiTE”可互换使用,均指本发明第一方面提供的能够同时结合NKG2D配体和NKp46的细胞接合器分子。
双特异性细胞接合器分子由两种结合不同靶蛋白的蛋白或多肽序列(抗体最为常见)连接而成。本发明的双特异性细胞接合器分子的功能是由其中NKG2D受体胞外域和NKp46抗原结合域的特异性基因序列决定的。本发明的抗体可以同时结合NKG2D配体和NKp46,通过NKG2D胞外域连接表达NKG2D配体的靶细胞,通过NKp46结合域连接自然杀伤细胞,从而有效将自然杀伤细胞与靶细胞桥接,促进自然杀伤细胞的杀伤作用。
如本文所用,术语“双特异性”是指包含至少两个具有不同结合特异性的结合域的分子。每个结合域都能够与靶分子特异性结合。在一些实施方式中,双特异性细胞接合器是具有两个或更多个肽的聚合物分子。在一些实施方式中,结合域包含与靶蛋白特异性结合的单域抗体、抗体的抗原结合片段、单链可变片段,或可变区,或CDR、或其组合。在一些实施方式中,结合域包含与靶蛋白特异性结合的配体或其片段。在一些实施方式中,结合域包含上述结构的组合。
本发明的细胞接合器分子的至少两个靶向结构域可选地由连接肽相连。优选的连接肽序列为(GGGGS)3,但不限于此。
在本发明中,本发明的BiTE还包括其保守性变异体,指与本发明BiTE的氨基酸序列相比,有至多10个,较佳地至多8个,更佳地至多5个,最佳地至多3个氨基酸被性质相似或相近的氨基酸所替换而形成多肽。这些保守性变异多肽最好根据表1进行氨基酸替换而产生。
表1
最初的残基 | 代表性的取代 | 优选的取代 |
Ala(A) | Val;Leu;Ile | Val |
Arg(R) | Lys;Gln;Asn | Lys |
Asn(N) | Gln;His;Lys;Arg | Gln |
Asp(D) | Glu | Glu |
Cys(C) | Ser | Ser |
Gln(Q) | Asn | Asn |
Glu(E) | Asp | Asp |
Gly(G) | Pro;Ala | Ala |
His(H) | Asn;Gln;Lys;Arg | Arg |
Ile(I) | Leu;Val;Met;Ala;Phe | Leu |
Leu(L) | Ile;Val;Met;Ala;Phe | Ile |
Lys(K) | Arg;Gln;Asn | Arg |
Met(M) | Leu;Phe;Ile | Leu |
Phe(F) | Leu;Val;Ile;Ala;Tyr | Leu |
Pro(P) | Ala | Ala |
Ser(S) | Thr | Thr |
Thr(T) | Ser | Ser |
Trp(W) | Tyr;Phe | Tyr |
Tyr(Y) | Trp;Phe;Thr;Ser | Phe |
Val(V) | Ile;Leu;Met;Phe;Ala | Leu |
并且,所述的氨基酸序列还包括经过添加、缺失、修饰和/或取代至少一个氨基酸序列所形成的序列,优选为同源性或序列相同性为至少80%,较佳地至少85%,更佳地至少为90%,最佳地至少95%的氨基酸序列。
本领域普通技术人员公知的测定序列同源性或相同性的方法包括但不限于:计算机分子生物学(Computational Molecular Biology),Lesk,A.M.编,牛津大学出版社,纽约,1988;生物计算:信息学和基因组项目(Biocomputing:Informatics and GenomeProjects),Smith,D.W.编,学术出版社,纽约,1993;序列数据的计算机分析(ComputerAnalysis of Sequence Data),第一部分,Griffin,A.M.和Griffin,H.G.编,HumanaPress,新泽西,1994;分子生物学中的序列分析(Sequence Analysis in MolecularBiology),von Heinje,G.,学术出版社,1987和序列分析引物(Sequence AnalysisPrimer),Gribskov,M.与Devereux,J.编M Stockton Press,纽约,1991和Carillo,H.与Lipman,D.,SIAM J.Applied Math.,48:1073(1988)。测定相同性的优选方法要在测试的序列之间得到最大的匹配。测定相同性的方法编译在公众可获得的计算机程序中。优选的测定两条序列之间相同性的计算机程序方法包括但不限于:GCG程序包(Devereux,J.等,1984)、BLASTP、BLASTN和FASTA(Altschul,S,F.等,1990)。公众可从NCBI和其它来源得到BLASTX程序(BLAST手册,Altschul,S.等,NCBI NLM NIH Bethesda,Md.20894;Altschul,S.等,1990)。熟知的Smith Waterman算法也可用于测定相同性。
本发明抗体可以是靶向NKG2D配体和免疫细胞细胞膜蛋白(例如人NKG2D配体和CD3)的单链抗体或双链抗体。
在本发明的一个优选例中,所述的双特异性细胞接合器分子为单链抗体,其包括抗NKP46单链抗体段、连接肽和NKG2D胞外域,其中抗NKP46单链抗体为本领域常规的单链抗体,其包括重链可变区、轻链可变区。
本发明中,所述动物优选为哺乳动物,如鼠和猕猴。
本发明上述内容中,所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量,优选为不超过初始氨基酸序列总氨基酸数量的40%,更优选为不超过35%,更优选为1-33%,更优选为5-30%,更优选为10-25%,更优选为15-20%。
本发明上述内容中,更优选地,所述添加、缺失、修饰和/或取代的氨基酸数量,可以是1-7个,更优选为1-5个,更优选为1-3个,更优选为1-2个。
重组蛋白
本发明还提供一种重组蛋白,其包括本发明的细胞接合器分子。
本发明的重组蛋白可以包括本发明细胞接合器分子的单体、二聚体、或多聚体;或是多特异性(如三特异性)的细胞接合器。
所述重组蛋白的制备方法为本领域常规的制备方法。所述制备方法较佳地为:从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得或者通过人工合成蛋白质序列获得。所述的从重组表达该蛋白质的表达转化体中分离获得优选如下方法:将编码所述蛋白质并且带有点突变的核酸分子克隆到重组载体中,将所得重组载体转化到转化体中,得到重组表达转化体,通过培养所得重组表达转化体,即可分离纯化获得所述重组蛋白。
核酸
本发明还提供了编码上述细胞接合器分子的多核苷酸分子。本发明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因组DNA或人工合成的DNA。DNA可以是单链的或是双链的。DNA可以是编码链或非编码链。编码成熟多肽的编码区序列可以与本发明细胞接合器的编码区序列相同或者是简并的变异体。如本文所用,“简并的变异体”在本发明中是指编码具有与本发明的多肽相同的氨基酸序列,但其编码区序列有差别的核酸序列。
编码本发明的成熟多肽的多核苷酸包括:只编码成熟多肽的编码序列;成熟多肽的编码序列和各种附加编码序列;成熟多肽的编码序列(和任选的附加编码序列)以及非编码序列。
术语“编码多肽的多核苷酸”可以是包括编码此多肽的多核苷酸,也可以是还包括附加编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明还涉及与上述的序列杂交且两个序列之间具有至少50%,较佳地至少70%,更佳地至少80%相同性的多核苷酸。本发明特别涉及在严格条件下与本发明所述多核苷酸可杂交的多核苷酸。在本发明中,“严格条件”是指:(1)在较低离子强度和较高温度下的杂交和洗脱,如0.2×SSC,0.1%SDS,60℃;或(2)杂交时加有变性剂,如50%(v/v)甲酰胺,0.1%小牛血清/0.1%Ficoll,42℃等;或(3)仅在两条序列之间的相同性至少在90%以上,更好是95%以上时才发生杂交。并且,可杂交的多核苷酸编码的多肽与本发明第一方面所述的细胞接合器分子有相同的生物学功能和活性。
本发明的细胞接合器分子的核苷酸全长序列或其片段通常可以用PCR扩增法、重组法或人工合成的方法获得。一种可行的方法是用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。此外,还可将其编码序列和表达标签(如6His)融合在一起,形成融合蛋白。
载体和宿主细胞
本发明还提供一种包含所述核酸的重组表达载体。
其中所述重组表达载体可通过本领域常规方法获得,即:将本发明所述的核酸分子连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体为本领域常规的各种载体,只要其能够容载前述核酸分子即可。所述载体较佳地包括:各种质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等。
本发明还提供一种包含上述重组表达载体的重组表达转化体。
其中,所述重组表达转化体的制备方法为本领域常规的制备方法,较佳地为:将上述重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞为本领域常规的各种宿主细胞,只要能满足使上述重组表达载体稳定地自行复制,且所携带所述的核酸可被有效表达即可。较佳地,所述宿主细胞为E.coli TG1或E.coli BL21细胞,或者HEK-293T或CHO细胞。将前述重组表达质粒转化至宿主细胞中,即可得本发明优选的重组表达转化体。其中所述转化方法为本领域常规转化方法,较佳地为化学转化法,热激法或电转法。
在本发明的优选实施方式中,可选用的载体包括:pCDH、pTOMO、pGEM、pELNS、pMSGV,或其组合。
在本发明的优选实施方式中,可选用的宿主细胞包括:T细胞、NK细胞、或其组合。
细胞接合器分子的制备
本发明细胞接合器分子或其片段的DNA分子的序列制备方法优选为将配体段和抗体段的编码序列融合在一起,形成单链抗体。此外,可以用常规技术,比如利用PCR扩增或基因组文库筛选等方法获得。
一旦获得了有关的序列,就可以用重组法来大批量地获得有关序列。这通常是将其克隆入载体,再转入细胞,然后通过常规方法从增殖后的宿主细胞中分离得到有关序列。
此外,还可用人工合成的方法来合成有关序列,尤其是片段长度较短时。通常,通过先合成多个小片段,然后再进行连接可获得序列很长的片段。
目前,已经可以完全通过化学合成来得到编码所述的本发明的细胞接合器(或其片段,或其衍生物)的DNA序列。然后可将该DNA序列引入本领域中已知的各种现有的DNA分子(或如载体)和细胞中。此外,还可通过化学合成将突变引入本发明蛋白序列中。
本发明还涉及包含上述的适当DNA序列以及适当启动子或者控制序列的载体。这些载体可以用于转化适当的宿主细胞,以使其能够表达蛋白质。
宿主细胞可以是原核细胞,如细菌细胞;或是低等真核细胞,如酵母细胞;或是高等真核细胞,如哺乳动物细胞。优选的细胞包括(但并不限于):T细胞。
通常,在适合本发明抗体表达的条件下,培养转化所得的宿主细胞。然后用常规的免疫球蛋白纯化步骤,如蛋白A-Sepharose、羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析、离子交换层析、疏水层析、分子筛层析或亲和层析等本领域技术人员熟知的常规分离纯化手段纯化得到本发明的抗体。
所得细胞接合器可用常规手段来鉴定。比如,其结合特异性可用免疫沉淀或体外结合试验(如放射性免疫测定(RIA)或酶联免疫吸附测定(ELISA))来测定。其结合亲和力例如可用Munson等,Anal.Biochem.,107:220(1980)的Scatchard分析来测定。
本发明的细胞接合器可在细胞内、或在细胞膜上表达、或分泌到细胞外。如果需要,可利用其物理的、化学的和其它特性通过各种分离方法分离和纯化重组的蛋白。这些方法是本领域技术人员所熟知的。这些方法的例子包括但并不限于:常规的复性处理、用蛋白沉淀剂处理(盐析方法)、离心、渗透破菌、超声处理、超离心、分子筛层析(凝胶过滤)、吸附层析、离子交换层析、高效液相层析(HPLC)和其它各种液相层析技术及这些方法的结合。
本领域常规的双特异性细胞接合器分子制备方法如以下两种;
1.首先利用PCR制备双特异性抗体基因,再将此基因克隆到表达载体pRB199转化到大肠杆菌菌株BL21(λDE3),制备包涵体(Inclusion bodies)。随后,在包涵体中加入6Mguanidine-HCl和DET(dithioerythritol)进行变性,然后使用到复性缓冲液进行100稀释,在4℃快速混合,随后在4℃孵育72h,使蛋白重新折叠。复性后,以1:10的比例加入0.1MTris和0.5M NaCl进行透析,重复三次后进行过滤(0.2μm),随后进行金属离子亲和层析。随后,采用快速蛋白液相色谱仪(BioLogic DuoFlow 10System;Bio-Rad)进行纯化,采用组氨酸标签融合蛋白质纯化柱分离。蛋白质是由咪唑逐步梯度洗脱,流速1毫升/分钟。将该产物进行过柱(Sartorius Stedim Biotech)处理,去掉分子量大于10000的蛋白,用PBS透析,过滤除菌。测定浓度后使用SDS/PAGE进行银染鉴定(参见PNAS,2013,110(1):270-275);
2.将含有双特异性抗体的慢病毒感染CHO细胞,待感染后培养72h,可以观察到CHO细胞有荧光表达。将感染成功的细胞株扩大培养。稳定表达双特异性抗体的CHO细胞能持续分泌表达。收集细胞上清进行蛋白纯化与浓缩。随后,采用快速蛋白液相色谱仪(BioLogicDuoFlow 10System;Bio-Rad)进行纯化,采用组氨酸标签融合蛋白质纯化柱分离。用样本的五倍体积的平衡缓冲液过镍柱,流速0.5-1ml/min。平衡后,将样品流过镍柱,流速0.5ml/min。用五倍体积的平衡缓冲液清洗镍柱,洗去背景蛋白,直到280nm液吸光度的洗出液为0。目的蛋白由咪唑洗脱,流速0.5ml/min。后用超滤管浓缩蛋白并置换盐溶液。测定浓度后使用western blot进行鉴定(参见Oncoimmunology,2015,4(4):e989776。)。
本领域技术人员能够对上述方法进行常规选择或等价改动,以制备或生产本发明的双特异性细胞接合器分子。
抗体-药物偶联物(ADC)
本发明所用的术语“抗体-药物偶联物(antibody-drug conjugate,ADC)”是指本发明细胞接合器分子与效应分子形成的偶联物。
典型地,所述抗体-药物偶联物包括所述细胞接合器分子、以及效应分子,所述细胞接合器分子与所述效应分子偶联,并优选为化学偶联。其中,所述效应分子优选为具有治疗活性的药物。此外,所述效应分子可以是毒蛋白、化疗药物、小分子药物或放射性核素中的一种或多种。
本发明细胞接合器分子与所述效应分子之间可以是通过偶联剂进行偶联。所述偶联剂的例子可以是非选择性偶联剂、利用羧基的偶联剂、肽链、利用二硫键的偶联剂中的任意一种或几种。所述非选择性偶联剂是指使效应分子和细胞接合器分子形成共价键连接的化合物,如戊二醛等。所述利用羧基的偶联剂可以是顺乌头酸酐类偶联剂(如顺乌头酸酐)、酰基腙类偶联剂(偶联位点为酰基腙)中的任意一种或几种。
细胞接合器分子上某些残基(如Cys或Lys等)用于与多种功能基团相连,其中包括成像试剂(例如发色基团和荧光基团),诊断试剂(例如MRI对比剂和放射性同位素),稳定剂(例如乙二醇聚合物)和治疗剂。细胞接合器分子可以被偶联到功能剂以形成细胞接合器分子-功能剂的偶联物。功能剂(例如药物,检测试剂,稳定剂)被偶联(共价连接)至细胞接合器分子上。功能剂可以直接地、或者是通过接头间接地连接于细胞接合器分子。
细胞接合器分子可以偶联药物从而形成抗体药物偶联物(ADCs)。典型地,ADC包含位于药物和细胞接合器分子之间的接头。接头可以是可降解的或者是不可降解的接头。可降解的接头典型地在细胞内环境下容易降解,例如在目标位点处接头发生降解,从而使药物从细胞接合器分子上释放出来。合适的可降解的接头包括,例如酶降解的接头,其中包括可以被细胞内蛋白酶(例如溶酶体蛋白酶或者内体蛋白酶)降解的含有肽基的接头,或者糖接头例如,可以被葡糖苷酸酶降解的含葡糖苷酸的接头。肽基接头可以包括,例如二肽,例如缬氨酸-瓜氨酸,苯丙氨酸-赖氨酸或者缬氨酸-丙氨酸。其它合适的可降解的接头包括,例如,pH敏感接头(例如pH小于5.5时水解的接头,例如腙接头)和在还原条件下会降解的接头(例如二硫键接头)。不可降解的接头典型地在细胞接合器分子被蛋白酶水解的条件下释放药物。
药物可以是任何细胞毒性,抑制细胞生长或者免疫抑制的药物。在实施方式中,接头连接细胞接合器分子和药物,而药物具有可以和接头成键的功能性基团。例如,药物可以具有可以和连接物成键的氨基,羧基,巯基,羟基,或者酮基。在药物直接连接到接头的情况下,药物在连接到细胞接合器分子之前,具有反应的活性基团。
有用的药物类别包括,例如,抗微管蛋白药物、DNA小沟结合试剂、DNA复制抑制剂、烷化试剂、抗生素、叶酸拮抗物、抗代谢药物、化疗增敏剂、拓扑异构酶抑制剂、长春花生物碱等。特别有用的细胞毒性药物类的例子包括,例如,DNA小沟结合试剂、DNA烷基化试剂、和微管蛋白抑制剂、典型的细胞毒性药物包括、例如奥瑞他汀(auristatins)、喜树碱(camptothecins)、多卡霉素/倍癌霉素(duocarmycins)、依托泊甙(etoposides)、美登木素(maytansines)和美登素类化合物(maytansinoids)(例如DM1和DM4)、紫杉烷(taxanes)、苯二氮卓类(benzodiazepines)或者含有苯二氮卓的药物(benzodiazepine containingdrugs)(例如吡咯并[1,4]苯二氮卓类(PBDs),吲哚啉苯并二氮卓类(indolinobenzodiazepines)和噁唑烷并苯并二氮卓类(oxazolidinobenzodiazepines))和长春花生物碱(vinca alkaloids)。
在本发明中,药物-接头可以用于在一个简单步骤中形成ADC。在其它实施方式中,双功能连接物化合物可以用于在两步或多步方法中形成ADC。例如,半胱氨酸残基在第一步骤中与接头的反应活性部分反应,并且在随后的步骤中,接头上的功能性基团与药物反应,从而形成ADC。
通常,选择接头上功能性基团,以利于特异性地与药物部分上的合适的反应活性基团进行反应。作为非限制性的例子,基于叠氮化合物的部分可以用于特异性地与药物部分上的反应性炔基基团反应。药物通过叠氮和炔基之间的1,3-偶极环加成,从而共价结合于接头。其它的有用的功能性基团包括,例如酮类和醛类(适合与酰肼类和烷氧基胺反应),膦(适合与叠氮反应);异氰酸酯和异硫氰酸酯(适合与胺类和醇类反应);和活化的酯类,例如N-羟基琥珀酰亚胺酯(适合与胺类和醇类反应)。这些和其它的连接策略,例如在《生物偶联技术》,第二版(Elsevier)中所描述的,是本领域技术人员所熟知的。本领域技术人员能够理解,对于药物部分和接头的选择性反应,当选择了一个互补对的反应活性功能基团时,该互补对的每一个成员既可以用于接头,也可以用于药物。
检测用途和试剂盒
本发明的双特异性细胞接合器分子或其ADC可用于检测应用,例如用于检测样本,从而提供诊断信息。
本发明中,所采用的样本(样品)包括细胞、组织样本和活检标本。本发明使用的术语“活检”应包括本领域技术人员已知的所有种类的活检。因此本发明中使用的活检可以包括例如肿瘤的切除样本、通过内窥镜方法或器官的穿刺或针刺活检制备的组织样本。
本发明中使用的样本包括固定的或保存的细胞或组织样本。
本发明还提供了一种指含有本发明的细胞接合器(或其片段)的试剂盒,在本发明的一个优选例中,所述的试剂盒还包括容器、使用说明书、缓冲剂等。在优选例中,本发明的细胞接合器可以固定于检测板。
药物组合物
本发明还提供了一种组合物。在优选例中,所述的组合物是药物组合物,它含有上述的细胞接合器或其活性片段或其融合蛋白或其ADC或相应的免疫细胞,以及药学上可接受的载体。通常,可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中,其中pH通常约为5-8,较佳地pH约为6-8,尽管pH值可随被配制物质的性质以及待治疗的病症而有所变化。
配制好的药物组合物可以通过常规途径进行给药,其中包括(但并不限于):瘤内、腹膜内、静脉内、或局部给药。典型地,本发明所述的药物组合物的给药途径较佳地为注射给药或口服给药。所述注射给药较佳地包括静脉注射、动脉注射、肌肉注射、腹腔注射、皮内注射或皮下注射等途径。所述的药物组合物为本领域常规的各种剂型,较佳地为固体、半固体或液体的形式,可以为水溶液、非水溶液或混悬液,更佳地为片剂、胶囊、颗粒剂、注射剂或输注剂等。
本发明所述细胞接合器也可以是由核苷酸序列在细胞内表达用于的细胞治疗。
本发明所述的药物组合物是用于预防和/或治疗与uPAR和/或CD3表达或功能异常相关的疾病的药物组合物。
本发明的药物组合物含有安全有效量(如0.001-99wt%,较佳地0.01-90wt%,更佳地0.1-80wt%)的本发明上述的细胞接合器(或其偶联物)或者安全有效量(1×103-1×108个细胞/ml,更优地1×104-1×107个细胞/ml)的工程化免疫细胞以及药学上可接受的载体或赋形剂。这类载体包括(但并不限于):盐水、缓冲液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其组合。药物制剂应与给药方式相匹配。本发明的药物组合物可以被制成针剂形式,例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。药物组合物如针剂、溶液宜在无菌条件下制造。活性成分的给药量是治疗有效量,例如每天约1微克/千克体重-约5毫克/千克体重。此外,本发明的多肽还可与其他治疗剂一起使用。
在本发明的一个优选例中,本发明的多肽可以与其他治疗和/或预防癌症和/或癌症转移的治疗剂联用。
本发明中,较佳地,本发明所述的药物组合物还包括一种或多种药用载体。所述的药用载体为本领域常规药用载体,所述的药用载体可以为任意合适的生理学或药学上可接受的药物辅料。所述的药物辅料为本领域常规的药物辅料,较佳的包括药学上可接受的赋形剂、填充剂或稀释剂等。更佳地,所述的药物组合物包括0.01~99.99%的上述蛋白质和0.01~99.99%的药用载体,所述百分比为占所述药物组合物的质量百分比。
本发明中,较佳地,所述的药物组合物的施用量为有效量,所述有效量为能够缓解或延迟疾病、退化性或损伤性病症进展的量。所述有效量可以以个体基础来测定,并将部分基于待治疗症状和所寻求结果的考虑。本领域技术人员可以通过使用个体基础等上述因素和使用不超过常规的实验来确定有效量。
使用偶联物时,是将安全有效量的偶联物施用于哺乳动物,其中该安全有效量通常至少约10微克/千克体重,而且在大多数情况下不超过约50毫克/千克体重,较佳地该剂量是约10微克/千克体重-约20毫克/千克体重。当然,具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素,这些都是熟练医师技能范围之内的。
治疗性应用
本发明提供了靶向NKG2D配体细胞接合器分子和本发明的药物组合物的用途,用于预防和/或治疗表达NKG2D配体的疾病。
其中表达NKG2D配体的疾病包括肿瘤、自身免疫性疾病、移植排斥、炎症,衰老、衰老细胞累积相关疾病。
表达NKG2D配体的肿瘤选自下组:肺癌、卵巢癌、结肠癌、肝癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、鼻咽癌、白血病、淋巴癌、神经胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤或其组合。
表达NKG2D配体的衰老细胞累积相关疾病选自下组:肌肉萎缩症、脂肪肝、心衰、动脉粥样硬化、糖尿病、心肌肥厚、骨质疏松、组织/器官纤维化、阿尔茨海默病、帕金森综合征、关节炎、慢性阻塞性肺病等细胞衰老导致的器官退行性疾病,或其组合。
表达NKG2D配体的自身免疫性疾病选自下组:类风湿性关节炎、结肠炎、乳糜泻、多发性硬化症、斑秃、1型糖尿病、慢性阻塞性肺病、动脉粥样硬化或与2型糖尿病相关的代谢综合征。
本发明的通用型细胞接合器分子也可用作对哺乳动物离体免疫和/或体内疗法的疫苗类型。优选地,哺乳动物为人。
除了就离体免疫细胞而言使用基于细胞的疫苗之外,本发明也提供了用于体内以增强针对患者中靶向抗原的免疫应答的组合物和方法。
本发明的药物组合物可以适于待治疗(或预防)的疾病的方式施用。施用的数量和频率将由这样的因素确定,如患者的病症的特征、疾病的类型和严重度——尽管适当的剂量可由临床试验确定。
当指出“免疫学上有效量”、“抗肿瘤有效量”、“抗衰老有效量”或“治疗量”时,待施用的本发明组合物的精确量可由医师确定,其考虑患者(对象)的年龄、重量、衰老组织大小、衰老程度和病症的个体差异。
本发明的主要优点
本发明构建的双特异性细胞接合器分子同时靶向NKG2D配体和NKp46抗原,通过直接输注入体内,或利用体内细胞(如NK细胞、T淋巴细胞、CAR-NK细胞等)携带并在体内持续表达该抗体蛋白,从而使该双特异性细胞接合器分子在体内发挥杀伤作用。其主要优点包括:
1)高靶向性:针对NKG2D配体表达上调的异常细胞的双特异性细胞接合器分子,能够有效地桥接靶细胞和自然杀伤细胞,结合稳定,杀伤力强。
2)高安全性:NKG2D配体是天然免疫细胞清除异常细胞和肿瘤细胞的重要靶点,其在正常细胞表面表达受到严格调控;NKG2D-NKG2D配体信号链经历了长期的自然选择形成,具有高度的安全性。并且目前已有大量针对NKG2D配体的免疫疗法正在进行临床实验,尚未发现严重的治疗相关副作用。
下面结合具体实施例,进一步阐述本发明。应理解,这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法,通常按照常规条件,例如Sambrook等人,分子克隆:实验室手册(New York:Cold Spring HarborLaboratory Press,1989)中所述的条件,或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明,否则百分比和份数是重量百分比和重量份数。
本发明实施例中涉及的序列如下表所示。
表2序列表
实施例1NKG2D-NKp46蛋白制备
1.1载体构建
将如图1A所示结构的目的基因核苷酸序列合成后,通过EcoR I和Swa I酶切位点克隆至慢病毒载体pCDH-CMV-MCS-EF1-Puro(参见Myeloid Leukemia.Mol Ther,2016.24(9):p.1615-26.)。克隆后的载体经过酶切和测序验证正确后,转化感受态大肠杆菌(Stbl3)并扩大培养,然后用QIAGEN公司的无内毒素中抽试剂盒抽提,并用Hind III酶切鉴定。
1.2病毒包装
在15cm培养皿中培养HEK-293T细胞用于病毒包装。待HEK-293T细胞汇合度在90%左右进行转染,准备2ml OPTIMEM溶解的质粒混合物(核心质粒20ug、pCMVΔR8.9 10ug、PMD2.G 4ug);在另一离心管中2ml OPTIMEM以及68ul的lipo8000。室温静置5min后,将质粒复合物加入脂质体复合物中,室温静置20min。将上述混合物滴加入HEK-293T细胞中,37℃孵育6小时后去除培养基。重新加入预热的完全培养基。收集48小时和72小时病毒上清后,于4℃3000rpm离心20分钟。用0.45um滤膜过滤后,于25000rpm 4℃离心2.5小时进行病毒浓缩。浓缩的病毒用30ul病毒溶解液过夜溶解后,病毒滴度用QPCR检测。
1.3蛋白制备和纯化
取上述病毒感染CHO细胞,24h后加入1ug/ml嘌呤霉素筛选48h。筛选后的CHO细胞继续培养至7d后,收集培养液上清并用0.22um滤膜过滤,利用亲和层析柱从表达上清中获得带His标签的抗体。平衡缓冲液为0.5M Nacl、20mM磷酸钠缓冲液900ml,PH=7.4;洗脱缓冲液为0.5M咪唑、0.5M Nacl、20mM磷酸钠缓冲液900ml,PH=7.4。通过阳离子交换柱后获得NKG2D-NKp46双特性抗体,最后用PBS缓冲液进行换液浓缩。纯化后NKG2D-NKp46蛋白SDS-PAGE电泳如图1B所示。Western Blot结果如1B所示,分子量大小与理论一致。
1.4NKG2D-NKp46与NK92细胞结合检测
(1)用200ul 1xPBS(含2%FBS)重悬NK92细胞;
(2)向重悬的细胞中分别加入终浓度为100ug/ml的NKp46蛋白,混匀,放置于冰上孵育120min,期间每隔10min涡旋一次细胞,以500g的速度离心5min,弃上清;
(3)加入1ml 1xPBS(含2%FBS)重悬细胞,500g离心5min;
(4)重复步骤;
(5)加入anti-His抗体并混匀,放置于冰上孵育60min,期间每隔10min涡旋一次细胞,以500g的速度离心5min,弃上清;
(6)加入cy3标记的的羊抗兔二抗,室温孵育30min后,以500g的速度离心5min,弃上清;
(7)加入1ml 1xPBS(含2%FBS)重悬细胞,500g离心5min;
(8)重复步骤7;
(9)流式仪检测结合率,结果如图1C所示。结果表明NKG2D-NKp46可与NK92细胞结合。
实施例2NKG2D-NKp46蛋白促进NK92细胞对肿瘤细胞的杀伤
2.1肿瘤细胞中NKG2D配体表达检测
(1)胰酶消化收集MHCC97H细胞,1xPBS洗三次后,用200ul 1xPBS(含2%FBS)重悬,调整浓度细胞浓度为1x106cell/ml;
(2)向重悬的细胞中加入NKG2D配体抗体,混匀,放置于冰上孵育120min,期间每隔10min涡旋一次细胞,以500g的速度离心5min,弃上清;
(3)加入1ml 1xPBS(含2%FBS)重悬细胞,500g离心5min;
(4)重复步骤;
(5)流式仪检测NKG2D配体表达,结果如图2A所示,MHCC97H细胞中MICA和ULBP2表达显著上升。
2.2NKG2D-NKp46蛋白促进NK92细胞对肿瘤细胞的杀伤
将MHCC97H细胞与NK92细胞按效靶比1:5共孵育(NK92细胞为效应细胞,浓度为1*105/mL,每孔100uL;肿瘤细胞为靶细胞,浓度2*104/mL,每孔100uL),并加入100ug/ml的NKG2D-NKp46蛋白,共孵育6小时。细胞杀伤效果使用promega荧光检测试剂盒检测,首先细胞用30ul 1*PLB裂解液处理细胞20分钟,每孔加入30ul底物后立即用BioTek酶标仪检测。细胞毒性杀伤细胞=1-含效应细胞时靶细胞荧光值/无效应细胞时靶细胞荧光值。结果如图2B所示,加入NKG2D-NKp46蛋白后,NK92细胞对肿瘤细胞的杀伤显著增加。
实施例3衰老细胞中NKG2D配体表达上调
3.1Tet-on系统过表达p16蛋白的细胞衰老模型构建
(1)将3×105个细胞分别铺于10cm皿,第二天贴壁后细胞密度在20%左右;
(2)待细胞贴壁后,将Tet-on系统过表达p16蛋白的慢病毒以50-100的感染复数(multiplicity of infection,MOI)分别感染细胞,并按照1:1000的比例加入原液浓度为8mg/mL的polybrene以提高感染效率;
(3)24h后以相同的病毒量进行二次感染;
(4)感染病毒4天后,加入终浓度为3μg/mL的嘌呤霉素筛选;
(5)将构建好的过表达p16蛋白的细胞传于孔板或培养皿中,24h贴壁后加入1μg/mL的dox诱导p16蛋白的表达;
(6)诱导8天后,用SA-βgal染色试剂盒(CS0030,Sigma)对细胞进行衰老染色,结果如图3A所示,90%以上细胞呈阳性,表明此时细胞已衰老。
3.2NKG2D配体转录水平表达检测
(1)按上述方法准备衰老细胞后,在10cm皿中依据细胞密度加入1~2mL Trizol,冰上放置5min,枪头吹打混匀;
(2)吸取1mL各孔裂解液加入1.5mL EP管中,加入氯仿200μL,用力振摇15s;室温放置5min离心(4℃,12000g,15min);
(3)在新的EP管中加入450μL的异丙醇;
(4)小心吸取离心后的上层无色液体,加入含异丙醇的EP管中,混匀,室温孵育10min,离心(4℃,12000g,10min);
(5)弃上清,加入1mL RNase free水配置的75%乙醇洗RNA,离心(4℃,7500g,5min);
(6)小心去上清,倒扣5min晾干,用枪头吸去管壁的液体;
(7)加入30μL RNase Free水溶解,溶解后立即放在冰上,测定浓度
(8)以提取的RNA为模板,使用Thermo Scientific RevertAidTM First StrandcDNA Synthesis Kit试剂盒将2μg RNA反转录为cDNA。反应体系如下所示:
表3
(9)按以上体系将反应物加入PCR管中,PCR仪内65℃,5min,立即放于冰上,再向管中加入以下成份:
表4
轻轻混匀并瞬时离心,置于PCR仪中进行如下反应:25℃,5min;42℃,1h;70℃,5min;
(10)荧光实时定量PCR检测NKG2D配体表达,具体操作根据Thermo powerupTM SYBRGreen Master Mix(A25742)试剂盒说明书进行,程序:50℃,2min;95℃,2min;95℃,15s(40个循环);60℃,1min(40个循环);12℃,forever;
(11)导出Excel格式的数据,计算NKG2D配体的相对表达量,结果如图3B所示,NKG2D配体MICA和ULBP2均显著上调。
3.2NKG2D配体膜表达水平表达检测
(1)胰酶消化收集HEIP-P16细胞,1xPBS洗三次后,用200ul 1xPBS(含2%FBS)重悬,调整浓度细胞浓度为1x106cell/ml;
(2)向重悬的细胞中加入NKG2D配体抗体,混匀,放置于冰上孵育120min,期间每隔10min涡旋一次细胞,以500g的速度离心5min,弃上清;
(3)加入1ml 1xPBS(含2%FBS)重悬细胞,500g离心5min;
(4)重复步骤;
(5)流式仪检测NKG2D配体表达,结果如图3C所示。
实施例4NKG2D-NKp46蛋白促进NK92细胞对衰老细胞的杀伤
将P16过表达诱导的衰老细胞与NK92细胞按效靶比2:1(衰老细胞为靶细胞,NK92细胞为效应细胞)接种于96孔板中共孵育8小时,实验组中加入NKG2D-NKp46蛋白(1ng/μl),对照组为无关蛋白。显微镜先计算活细胞数目并计算T细胞杀伤率。杀伤效率=(Blank组靶细胞数量-共培养组靶细胞数量)/Blank组靶细胞数量。结果如图4所示,相对于对照组,NKG2D-NKp46显著促进NK92细胞对衰老细胞杀伤作用。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考,就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解,在阅读了本发明的上述讲授内容之后,本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改,这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Claims (20)
1.一种细胞接合器分子,其特征在于,所述细胞接合器分子包括:
(a)第一结合域,所述第一结合域特异性结合NKG2D配体;和
(b)第二结合域,所述第二结合域特异性结合NKp46。
2.如权利要求1所述的细胞接合器分子,其特征在于,所述的第一结合域来源于NKG2D胞外域。
3.如权利要求1所述的细胞接合器分子,其特征在于,所述的第一结合域氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示;或与SEQ ID NO:1所示氨基酸序列具有至少有95%的序列同源性或序列相同性的并且可结合NKG2D配体的氨基酸序列。
4.如权利要求1所述的细胞接合器分子,其特征在于,所述第二结合域包括特异性抗NKp46的抗原结合片段。
5.如权利要求4所述的细胞接合器分子,其特征在于,所述的NKp46抗原结合片段包括:Fab片段、单链抗体(scFv)、单域抗体、或其组合。
6.如权利要求5所述的细胞接合器分子,其特征在于,所述的抗NKp46的Fab片段和/或单链抗体包括重链可变区和轻链可变区,其中所述重链可变区包括以下重链互补决定区(HCDR):
1)氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR1;
2)氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2;
3)氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR3;
并且,所述轻链可变区包括以下轻链互补决定区(LCDR):
1)氨基酸序列如SEQ ID NO:6所示的LCDR1;
2)氨基酸序列为YTS的LCDR2;
3)氨基酸序列如SEQ ID NO:7所示的LCDR3,
所述CDR基于IMGT编号和定义方案。
7.如权利要求5所述的细胞接合器分子,其特征在于,所述抗NKp46单域抗体的重链互补决定区包括:
1)氨基酸序列如SEQ ID NO:3所示的HCDR1;
2)氨基酸序列如SEQ ID NO:4所示的HCDR2;
3)氨基酸序列如SEQ ID NO:5所示的HCDR3。
8.如权利要求1所述的细胞接合器分子,其特征在于,所述的第二结合域进一步包括:来源于抗CD16的抗原结合片段和/或IL15蛋白的多肽。
9.一种重组蛋白,所述的重组蛋白包括如权利要求1-8中任一项所述的细胞接合器分子。
10.一种多核苷酸,所述多核苷酸编码选自下组的多肽:
(1)如权利要求1-8中任一项所述的细胞接合器分子;或
(2)如权利要求9所述的重组蛋白。
11.一种载体,所述载体含有如权利要求3所述的多核苷酸。
12.一种工程化的宿主细胞,所述宿主细胞含有如权利要求11所述的载体或基因组中整合有如权利要求10所述的多核苷酸。
13.一种抗体偶联物,所述抗体偶联物含有:
(a)抗体部分,所述抗体部分选自下组:如权利要求1所述的细胞接合器分子;和
(b)与所述抗体部分偶联的偶联部分,所述偶联部分选自下组:可检测标记物、药物、或其组合。
14.一种药物组合物,所述药物组合物含有:
(a)活性成分,所述活性成分选自下组:如权利要求1所述的细胞接合器分子、如权利要求2所述的重组蛋白、如权利要求12所述的宿主细胞、如权利要求13所述的抗体偶联物、或其组合;以及
(b)一种或多种药学上可接受的载体、稀释剂、填充剂、结合剂、赋形剂,或其组合。
15.如权利要求1所述的细胞接合器分子,或如权利要求9所述的重组蛋白、或如权利要求12所述的宿主细胞,或如权利要求13所述的抗体偶联物、和/或如权利要求14所述的药物组合物在治疗NKG2D配体表达上调的相关疾病中的用途。
16.如权利要求15所述的用途,其特征在于,所述的表达上调指NKG2D配体的表达量(F1)与正常细胞组织表达量(F0)之比(即F1/F0)≥1.5,优选地≥2,更优选地≥2.5。
17.如权利要求15所述的用途,其特征在于,所述的NKG2D配体包括(但不限于)MICA,MICB,ULBP1,ULBP2,ULBP3,ULBP4,ULBP5,ULBP6。
18.如权利要求15所述的用途,其特征在于,所述的疾病包括肿瘤、自身免疫性疾病、移植排斥、炎症,衰老、衰老细胞累积相关疾病。
19.如权利要求18所述的用途,其特征在于,所述肿瘤选自下组:急性髓细胞白血病(AML)、多发性骨髓瘤(MM)、慢性淋巴细胞白血病(CLL)、急性淋巴白血病(ALL)、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、肺癌、卵巢癌、结直肠癌、肝癌、胆囊癌、胆道癌、胃癌、胰腺癌、肾癌、前列腺癌、乳腺癌、膀胱癌、鼻咽癌、非小细胞肺癌、神经胶质细胞瘤、神经母细胞瘤、黑色素瘤、或其组合。
20.如权利要求18所述的用途,其特征在于,所述的衰老细胞累积相关疾病选自下组:肌肉萎缩症、脂肪肝、心衰、动脉粥样硬化、糖尿病、心肌肥厚、骨质疏松、组织/器官纤维化、阿尔茨海默病、帕金森综合征、关节炎、慢性阻塞性肺病等细胞衰老导致的器官退行性疾病、或其组合。
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