JP2004537976A - 膵癌のモノクローナル抗体治療 - Google Patents
膵癌のモノクローナル抗体治療 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2004537976A JP2004537976A JP2002572962A JP2002572962A JP2004537976A JP 2004537976 A JP2004537976 A JP 2004537976A JP 2002572962 A JP2002572962 A JP 2002572962A JP 2002572962 A JP2002572962 A JP 2002572962A JP 2004537976 A JP2004537976 A JP 2004537976A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- antibody
- pancreatic cancer
- amino acid
- monoclonal antibody
- acid sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
- 206010061902 Pancreatic neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 32
- 201000002528 pancreatic cancer Diseases 0.000 title claims abstract description 30
- 208000015486 malignant pancreatic neoplasm Diseases 0.000 title claims abstract description 29
- 208000008443 pancreatic carcinoma Diseases 0.000 title claims abstract description 29
- 238000002625 monoclonal antibody therapy Methods 0.000 title 1
- 238000009739 binding Methods 0.000 claims abstract description 17
- 239000013598 vector Substances 0.000 claims description 35
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 32
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 22
- 239000000427 antigen Substances 0.000 claims description 19
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 claims description 19
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 claims description 19
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 19
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 18
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 18
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 15
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 10
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 10
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 10
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 9
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 9
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims description 8
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 7
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 7
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 claims description 6
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 6
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 claims description 6
- 102000009786 Immunoglobulin Constant Regions Human genes 0.000 claims description 4
- 108010009817 Immunoglobulin Constant Regions Proteins 0.000 claims description 4
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 claims description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 claims description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 claims description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 claims description 4
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 3
- 238000005406 washing Methods 0.000 claims description 3
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims description 2
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims 8
- 238000003384 imaging method Methods 0.000 claims 1
- 238000011532 immunohistochemical staining Methods 0.000 claims 1
- 238000010186 staining Methods 0.000 claims 1
- 238000011282 treatment Methods 0.000 abstract description 37
- 102000008394 Immunoglobulin Fragments Human genes 0.000 abstract description 4
- 108010021625 Immunoglobulin Fragments Proteins 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 41
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 20
- 241000701022 Cytomegalovirus Species 0.000 description 19
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 18
- 150000001413 amino acids Chemical group 0.000 description 13
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 12
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 11
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 11
- 206010028980 Neoplasm Diseases 0.000 description 10
- 210000004408 hybridoma Anatomy 0.000 description 10
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 10
- 230000010056 antibody-dependent cellular cytotoxicity Effects 0.000 description 9
- 230000000670 limiting effect Effects 0.000 description 9
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 8
- 206010009944 Colon cancer Diseases 0.000 description 8
- 238000003556 assay Methods 0.000 description 8
- 208000029742 colonic neoplasm Diseases 0.000 description 8
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 7
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 7
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 7
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 7
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 7
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 7
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 7
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 7
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 5
- 201000011510 cancer Diseases 0.000 description 5
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 5
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 5
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 5
- 239000013615 primer Substances 0.000 description 5
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 5
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 5
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 5
- BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N Bilirubin Chemical compound N1C(=O)C(C)=C(C=C)\C1=C\C1=C(C)C(CCC(O)=O)=C(CC2=C(C(C)=C(\C=C/3C(=C(C=C)C(=O)N\3)C)N2)CCC(O)=O)N1 BPYKTIZUTYGOLE-IFADSCNNSA-N 0.000 description 4
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 4
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 4
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 4
- 230000000172 allergic effect Effects 0.000 description 4
- 208000010668 atopic eczema Diseases 0.000 description 4
- 230000006037 cell lysis Effects 0.000 description 4
- DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N creatinine Chemical compound CN1CC(=O)NC1=N DDRJAANPRJIHGJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 4
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 4
- 239000012636 effector Substances 0.000 description 4
- 230000003211 malignant effect Effects 0.000 description 4
- YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N phenylmethanesulfonyl fluoride Chemical compound FS(=O)(=O)CC1=CC=CC=C1 YBYRMVIVWMBXKQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 4
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 4
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 101150074155 DHFR gene Proteins 0.000 description 3
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 3
- 241000204031 Mycoplasma Species 0.000 description 3
- 108010022394 Threonine synthase Proteins 0.000 description 3
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 3
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 3
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 3
- 210000001072 colon Anatomy 0.000 description 3
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 3
- 230000001419 dependent effect Effects 0.000 description 3
- ZZVUWRFHKOJYTH-UHFFFAOYSA-N diphenhydramine Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(OCCN(C)C)C1=CC=CC=C1 ZZVUWRFHKOJYTH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 3
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 230000003902 lesion Effects 0.000 description 3
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 3
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 2,3-bis(butanoylsulfanyl)propyl butanoate Chemical compound CCCC(=O)OCC(SC(=O)CCC)CSC(=O)CCC NHBKXEKEPDILRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 3,3',5,5'-tetramethylbenzidine Chemical compound CC1=C(N)C(C)=CC(C=2C=C(C)C(N)=C(C)C=2)=C1 UAIUNKRWKOVEES-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N Acetaminophen Chemical compound CC(=O)NC1=CC=C(O)C=C1 RZVAJINKPMORJF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 206010067484 Adverse reaction Diseases 0.000 description 2
- 102100036475 Alanine aminotransferase 1 Human genes 0.000 description 2
- 108010082126 Alanine transaminase Proteins 0.000 description 2
- 102000002260 Alkaline Phosphatase Human genes 0.000 description 2
- 108020004774 Alkaline Phosphatase Proteins 0.000 description 2
- 108010003415 Aspartate Aminotransferases Proteins 0.000 description 2
- 102000004625 Aspartate Aminotransferases Human genes 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 206010011703 Cyanosis Diseases 0.000 description 2
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 description 2
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 2
- 206010020751 Hypersensitivity Diseases 0.000 description 2
- NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N Mytomycin Chemical compound C1N2C(C(C(C)=C(N)C3=O)=O)=C3[C@@H](COC(N)=O)[C@@]2(OC)[C@@H]2[C@H]1N2 NWIBSHFKIJFRCO-WUDYKRTCSA-N 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 240000004808 Saccharomyces cerevisiae Species 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 230000006838 adverse reaction Effects 0.000 description 2
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 2
- 239000012472 biological sample Substances 0.000 description 2
- 238000004820 blood count Methods 0.000 description 2
- 230000036772 blood pressure Effects 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 238000002512 chemotherapy Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 2
- 238000002591 computed tomography Methods 0.000 description 2
- 229940109239 creatinine Drugs 0.000 description 2
- 230000003013 cytotoxicity Effects 0.000 description 2
- 231100000135 cytotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000002950 deficient Effects 0.000 description 2
- 238000002405 diagnostic procedure Methods 0.000 description 2
- 102000004419 dihydrofolate reductase Human genes 0.000 description 2
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 2
- 229960000520 diphenhydramine Drugs 0.000 description 2
- 239000003623 enhancer Substances 0.000 description 2
- 230000001747 exhibiting effect Effects 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 2
- BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N geneticin Chemical compound O1C[C@@](O)(C)[C@H](NC)[C@@H](O)[C@H]1O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](C(C)O)O2)N)[C@@H](N)C[C@H]1N BRZYSWJRSDMWLG-CAXSIQPQSA-N 0.000 description 2
- 230000012010 growth Effects 0.000 description 2
- 230000003053 immunization Effects 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 2
- 238000009533 lab test Methods 0.000 description 2
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 2
- 230000036210 malignancy Effects 0.000 description 2
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 2
- 230000001394 metastastic effect Effects 0.000 description 2
- 206010061289 metastatic neoplasm Diseases 0.000 description 2
- 210000000496 pancreas Anatomy 0.000 description 2
- 210000004923 pancreatic tissue Anatomy 0.000 description 2
- 229960005489 paracetamol Drugs 0.000 description 2
- 238000009101 premedication Methods 0.000 description 2
- 230000035485 pulse pressure Effects 0.000 description 2
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 2
- 238000001959 radiotherapy Methods 0.000 description 2
- 230000009257 reactivity Effects 0.000 description 2
- 230000004044 response Effects 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- 210000004988 splenocyte Anatomy 0.000 description 2
- 238000010561 standard procedure Methods 0.000 description 2
- 238000007920 subcutaneous administration Methods 0.000 description 2
- 230000004083 survival effect Effects 0.000 description 2
- 230000003442 weekly effect Effects 0.000 description 2
- DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N β‐Mercaptoethanol Chemical compound OCCS DGVVWUTYPXICAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 1
- 206010052747 Adenocarcinoma pancreas Diseases 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 108010088751 Albumins Proteins 0.000 description 1
- 102000009027 Albumins Human genes 0.000 description 1
- IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N Atomic nitrogen Chemical compound N#N IJGRMHOSHXDMSA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000008035 Back Pain Diseases 0.000 description 1
- BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M Bicarbonate Chemical compound OC([O-])=O BVKZGUZCCUSVTD-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 208000009079 Bronchial Spasm Diseases 0.000 description 1
- 208000014181 Bronchial disease Diseases 0.000 description 1
- 206010006482 Bronchospasm Diseases 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 241000283707 Capra Species 0.000 description 1
- 206010008342 Cervix carcinoma Diseases 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N Chromium Chemical compound [Cr] VYZAMTAEIAYCRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000001333 Colorectal Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 102000003915 DNA Topoisomerases Human genes 0.000 description 1
- 108090000323 DNA Topoisomerases Proteins 0.000 description 1
- 239000003155 DNA primer Substances 0.000 description 1
- 239000004803 Di-2ethylhexylphthalate Substances 0.000 description 1
- 208000000059 Dyspnea Diseases 0.000 description 1
- 206010013975 Dyspnoeas Diseases 0.000 description 1
- 208000010201 Exanthema Diseases 0.000 description 1
- 241000233866 Fungi Species 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 244000068988 Glycine max Species 0.000 description 1
- 235000010469 Glycine max Nutrition 0.000 description 1
- 102000003886 Glycoproteins Human genes 0.000 description 1
- 108090000288 Glycoproteins Proteins 0.000 description 1
- 108010017213 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Proteins 0.000 description 1
- 102000004457 Granulocyte-Macrophage Colony-Stimulating Factor Human genes 0.000 description 1
- 208000001953 Hypotension Diseases 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 102000003855 L-lactate dehydrogenase Human genes 0.000 description 1
- 108700023483 L-lactate dehydrogenases Proteins 0.000 description 1
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 1
- 241001529936 Murinae Species 0.000 description 1
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 1
- 206010052904 Musculoskeletal stiffness Diseases 0.000 description 1
- 206010028813 Nausea Diseases 0.000 description 1
- 229930193140 Neomycin Natural products 0.000 description 1
- 108020004711 Nucleic Acid Probes Proteins 0.000 description 1
- 206010033557 Palpitations Diseases 0.000 description 1
- 102000007079 Peptide Fragments Human genes 0.000 description 1
- 108010033276 Peptide Fragments Proteins 0.000 description 1
- 102000003992 Peroxidases Human genes 0.000 description 1
- 206010035226 Plasma cell myeloma Diseases 0.000 description 1
- ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N Potassium Chemical compound [K] ZLMJMSJWJFRBEC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 102000007056 Recombinant Fusion Proteins Human genes 0.000 description 1
- 108010008281 Recombinant Fusion Proteins Proteins 0.000 description 1
- 229920005654 Sephadex Polymers 0.000 description 1
- 239000012507 Sephadex™ Substances 0.000 description 1
- XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N Urea Chemical compound NC(N)=O XSQUKJJJFZCRTK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N Uric Acid Chemical compound N1C(=O)NC(=O)C2=C1NC(=O)N2 LEHOTFFKMJEONL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N Uric acid Natural products N1C(=O)NC(=O)C2NC(=O)NC21 TVWHNULVHGKJHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000006105 Uterine Cervical Neoplasms Diseases 0.000 description 1
- 206010047700 Vomiting Diseases 0.000 description 1
- PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N [N].NC(N)=O Chemical compound [N].NC(N)=O PNNCWTXUWKENPE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000002159 abnormal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001154 acute effect Effects 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000007818 agglutination assay Methods 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 208000030961 allergic reaction Diseases 0.000 description 1
- 230000000735 allogeneic effect Effects 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- 229940035676 analgesics Drugs 0.000 description 1
- 239000000730 antalgic agent Substances 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 230000001760 anti-analgesic effect Effects 0.000 description 1
- 230000002494 anti-cea effect Effects 0.000 description 1
- 230000003474 anti-emetic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000692 anti-sense effect Effects 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 229940125683 antiemetic agent Drugs 0.000 description 1
- 239000002111 antiemetic agent Substances 0.000 description 1
- 229940045719 antineoplastic alkylating agent nitrosoureas Drugs 0.000 description 1
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000012867 bioactive agent Substances 0.000 description 1
- 230000003115 biocidal effect Effects 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- BJQHLKABXJIVAM-UHFFFAOYSA-N bis(2-ethylhexyl) phthalate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)C1=CC=CC=C1C(=O)OCC(CC)CCCC BJQHLKABXJIVAM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000006161 blood agar Substances 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 210000001185 bone marrow Anatomy 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 229960005069 calcium Drugs 0.000 description 1
- 239000004202 carbamide Substances 0.000 description 1
- TWFZGCMQGLPBSX-UHFFFAOYSA-N carbendazim Chemical compound C1=CC=C2NC(NC(=O)OC)=NC2=C1 TWFZGCMQGLPBSX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 231100000504 carcinogenesis Toxicity 0.000 description 1
- 239000008004 cell lysis buffer Substances 0.000 description 1
- 210000000170 cell membrane Anatomy 0.000 description 1
- 230000030570 cellular localization Effects 0.000 description 1
- 210000003169 central nervous system Anatomy 0.000 description 1
- 201000010881 cervical cancer Diseases 0.000 description 1
- 210000004978 chinese hamster ovary cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 229910052804 chromium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011651 chromium Substances 0.000 description 1
- 238000009535 clinical urine test Methods 0.000 description 1
- 238000004440 column chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 1
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 1
- 238000012136 culture method Methods 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 230000001086 cytosolic effect Effects 0.000 description 1
- 230000001472 cytotoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 230000034994 death Effects 0.000 description 1
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 1
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003111 delayed effect Effects 0.000 description 1
- 230000002939 deleterious effect Effects 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000003745 diagnosis Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 229910001873 dinitrogen Inorganic materials 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 210000001198 duodenum Anatomy 0.000 description 1
- 239000003792 electrolyte Substances 0.000 description 1
- 238000001493 electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 201000005884 exanthem Diseases 0.000 description 1
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 1
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000012817 gel-diffusion technique Methods 0.000 description 1
- SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N gemcitabine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1C(F)(F)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 SDUQYLNIPVEERB-QPPQHZFASA-N 0.000 description 1
- 229960005277 gemcitabine Drugs 0.000 description 1
- 229940020967 gemzar Drugs 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 231100001156 grade 3 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 231100000171 higher toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000009610 hypersensitivity Effects 0.000 description 1
- 230000036543 hypotension Effects 0.000 description 1
- 238000002649 immunization Methods 0.000 description 1
- 230000000951 immunodiffusion Effects 0.000 description 1
- 230000016784 immunoglobulin production Effects 0.000 description 1
- 239000000367 immunologic factor Substances 0.000 description 1
- 238000001114 immunoprecipitation Methods 0.000 description 1
- 230000003308 immunostimulating effect Effects 0.000 description 1
- 238000009169 immunotherapy Methods 0.000 description 1
- 230000006872 improvement Effects 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 238000011065 in-situ storage Methods 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 229910052816 inorganic phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000001990 intravenous administration Methods 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 230000004807 localization Effects 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 210000003141 lower extremity Anatomy 0.000 description 1
- 238000002595 magnetic resonance imaging Methods 0.000 description 1
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 1
- 239000000463 material Substances 0.000 description 1
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 229960004857 mitomycin Drugs 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 229940126619 mouse monoclonal antibody Drugs 0.000 description 1
- 201000000050 myeloid neoplasm Diseases 0.000 description 1
- 230000008693 nausea Effects 0.000 description 1
- 229960004927 neomycin Drugs 0.000 description 1
- 239000002853 nucleic acid probe Substances 0.000 description 1
- 238000011580 nude mouse model Methods 0.000 description 1
- 235000015097 nutrients Nutrition 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 229960003540 oxyquinoline Drugs 0.000 description 1
- 201000002094 pancreatic adenocarcinoma Diseases 0.000 description 1
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 1
- 230000002093 peripheral effect Effects 0.000 description 1
- 108040007629 peroxidase activity proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 238000003752 polymerase chain reaction Methods 0.000 description 1
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 1
- 239000011591 potassium Substances 0.000 description 1
- 229910052700 potassium Inorganic materials 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 208000037821 progressive disease Diseases 0.000 description 1
- 239000013014 purified material Substances 0.000 description 1
- 238000002601 radiography Methods 0.000 description 1
- 238000003127 radioimmunoassay Methods 0.000 description 1
- 206010037844 rash Diseases 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 1
- 230000000306 recurrent effect Effects 0.000 description 1
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 1
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 238000002271 resection Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 238000010839 reverse transcription Methods 0.000 description 1
- 230000002441 reversible effect Effects 0.000 description 1
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 1
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 description 1
- 238000004062 sedimentation Methods 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 208000013220 shortness of breath Diseases 0.000 description 1
- 201000008261 skin carcinoma Diseases 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- 230000003381 solubilizing effect Effects 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 230000000087 stabilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000010473 stable expression Effects 0.000 description 1
- 238000011272 standard treatment Methods 0.000 description 1
- 150000003431 steroids Chemical class 0.000 description 1
- 239000012089 stop solution Substances 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 239000004094 surface-active agent Substances 0.000 description 1
- 208000024891 symptom Diseases 0.000 description 1
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 description 1
- 230000001225 therapeutic effect Effects 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 231100000331 toxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000002588 toxic effect Effects 0.000 description 1
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 1
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 1
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 1
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 1
- 230000004614 tumor growth Effects 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 241001430294 unidentified retrovirus Species 0.000 description 1
- 229940116269 uric acid Drugs 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000008673 vomiting Effects 0.000 description 1
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
- C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
- C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
- C07K16/30—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants from tumour cells
- C07K16/303—Liver or Pancreas
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K39/395—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum
- A61K39/39533—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals
- A61K39/39558—Antibodies; Immunoglobulins; Immune serum, e.g. antilymphocytic serum against materials from animals against tumor tissues, cells, antigens
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
- A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
- A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
- A61K47/6835—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site
- A61K47/6851—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell
- A61K47/6859—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment the modifying agent being an antibody or an immunoglobulin bearing at least one antigen-binding site the antibody targeting a determinant of a tumour cell the tumour determinant being from liver or pancreas cancer cell
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/04—X-ray contrast preparations
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/06—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations
- A61K49/08—Nuclear magnetic resonance [NMR] contrast preparations; Magnetic resonance imaging [MRI] contrast preparations characterised by the carrier
- A61K49/10—Organic compounds
- A61K49/14—Peptides, e.g. proteins
- A61K49/16—Antibodies; Immunoglobulins; Fragments thereof
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K49/00—Preparations for testing in vivo
- A61K49/22—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations
- A61K49/221—Echographic preparations; Ultrasound imaging preparations ; Optoacoustic imaging preparations characterised by the targeting agent or modifying agent linked to the acoustically-active agent
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P1/00—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system
- A61P1/18—Drugs for disorders of the alimentary tract or the digestive system for pancreatic disorders, e.g. pancreatic enzymes
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P35/00—Antineoplastic agents
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
- G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
- G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
- G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
- G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
- G01N33/57407—Specifically defined cancers
- G01N33/57438—Specifically defined cancers of liver, pancreas or kidney
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
- A61K2039/505—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising antibodies
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/10—Immunoglobulins specific features characterized by their source of isolation or production
- C07K2317/14—Specific host cells or culture conditions, e.g. components, pH or temperature
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/20—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin
- C07K2317/24—Immunoglobulins specific features characterized by taxonomic origin containing regions, domains or residues from different species, e.g. chimeric, humanized or veneered
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
- C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
- C07K2317/70—Immunoglobulins specific features characterized by effect upon binding to a cell or to an antigen
- C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
- C07K2317/732—Antibody-dependent cellular cytotoxicity [ADCC]
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K2319/00—Fusion polypeptide
-
- G—PHYSICS
- G01—MEASURING; TESTING
- G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
- G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
- G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
- G01N2333/705—Assays involving receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
Abstract
本発明は、モノクローナル抗体31.1のキメラ化および／またはヒト化抗体、抗体フラグメント、ならびに競合的に結合し共通の特異性を示す抗体および抗体フラグメントを包含する、前記抗体の結合同等物を膵癌治療に使用することに関する。
Description
【技術分野】
【０００１】
1. 序論
本発明は、膵癌の治療におけるモノクローナル抗体31.1およびその同等物、ならびに共通の特異性を有する(co-specific)抗体の使用に関する。本発明は、少なくとも一部には、モノクローナル抗体31.1が悪性の膵細胞と反応するが、悪性でない膵細胞とは反応しないという発見に基づくものである。本発明はさらに、それぞれ図2および図4に示す、Mu-31.1の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含んでなるポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供する。こうしたポリヌクレオチド配列を使用して、本発明の方法で用いる31.1と同等の抗体を組換えにより発現させることができる。
【背景技術】
【０００２】
2. 発明の背景
2.1. 膵癌
膵癌は米国において癌による死因の第5位であり、今年、膵癌が原因で約28,000人の米国人が死亡すると予想される（Pancreas Cancer Web, The Johns Hopkins Medical Institutions, http://162.129.103.69:80/PANCREAS_INTRO）。現在、唯一の治癒可能性のある治療法は、膵頭、頚部、膵鈎状突起だけでなく十二指腸の大部分も切除する、広範囲にわたる複雑な手術（いわゆる「Whipple手術」）による、癌の外科的切除である。手術をしない場合、全体の5年生存率は、わずか3パーセントにすぎない（同上）。
【０００３】
切除不能な腫瘍を有する患者に提示される主な治療法は、化学療法（ゲムシタビン（Gemzar（登録商標））を使用することが多い）および放射線療法である（同上）。実験的な免疫療法が現在研究中であって、この免疫療法では、患者自身の細胞が免疫賦活性タンパク質である顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子を発現するように遺伝子操作され、腫瘍増殖を防ぐために放射線を照射され、その後患者にもどされる。この場合、これらの細胞がうまくいけば免疫応答を活性化すると期待される（1997, Cancer Res. 57:1537-1546; Pancreas Cancer Web, The Johns Hopkins Medical Institutions, http://162.129.103.69:80/PANCREAS_MEDICAL_TX）。
【０００４】
2.2. モノクローナル抗体 31.1
抗体31.1は、BALB(c)マウスを、プールした（ヒト）同種異系大腸癌検体から得られた膜調製物で免疫することによって誘導されたタンパク質指向モノクローナル抗体に相当する。抗原の調製に使用される細胞を、窒素ガス（Parr）細胞破砕器によって細分化した後、超遠心にかけた。最初に、バッチごとの一貫性を保証するために、膜材料を電子顕微鏡で検査し、細胞質および核成分を除外した。次にこれを超音波処理してセファデックスG200で分画した。最初の部分精製には不連続ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用し（約80％）、30μgを遅延型皮膚過敏症（DHR）について試験した(3)。50μgの大腸癌関連抗原の腹腔内注射によってBALBマウスを免疫した。10日後に2回目の注射を行った後、マウスを犠牲にして融合用の脾細胞を取得した。5×107個のマウス脾細胞を40% PEG中で107個のsp2/0-AG14骨髄腫細胞とともにインキュベートすることによって融合を行った。モノクローナル抗体31.1によって規定される抗原は、分子量が72,000であることが判明した。免疫ペルオキシダーゼを用いた研究から、31.1により認識される抗原は、大腸癌の進行度が高いほど高頻度に見られることが示唆された。この抗体の特異性は高く、したがってMayo Clinicにおける脱落した結腸細胞に関する研究では、抗CEA、抗MUC1およびB72.3と比較して感度および特異性が優れていた。
【０００５】
第1世代TAAから、いくつかの候補となる抗体を分離して試験した。すべてがタンパク質由来であり、大腸癌に比較的特異的であることが判明した。抗体31.1は、ゲル電気泳動で近接して移動することが明らかになった2つの抗原のうちの1つに相当し、DHRを引き起こす免疫原性糖タンパク質に関連していた。マウスの抗体はIgG2aアイソタイプであるが、これはキメラ化の際にIgG1アイソタイプに変わる。31.1は強い局在化指数をもつことが見出された。こうして、この抗体はキメラ化される最初のものであった。
【０００６】
モノクローナル抗体31.1をキメラ化するために、31.1重鎖可変領域遺伝子のタンパク質コード化エキソンを、ヒトガンマ1鎖定常領域のタンパク質コード化エキソンにスプライスした。PCRを使用した。第１のフレームワーク領域（FR1）のコンセンサスDNA配列に基づいて合成された逆方向縮重プライマー、およびJ-C結合領域のコンセンサスDNA配列にしたがって合成された順方向プライマーを用いたPCR法によって、31.1 VH cDNAを増幅した。増幅された31.1 VH DNAをpBluescriptベクターにクローニングして配列決定した。SP2/0 AG14細胞にこのベクターをトランスフェクトすることによって、キメラ31.1が産生された。
【０００７】
モノクローナル抗体31.1およびそのキメラ型（ヒト化）抗体は、1997年11月18日発行の米国特許第5,688,657号に記載され、現在では再発行出願の主題であるが、その内容を全体として参考のために本明細書に含めるものとする。さらに、モノクローナル抗体31.1はAmerican Type Culture Collection(ATCC)（所在地10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110-2209）に寄託されて受託番号ATCC PTA-2497を指定され、また、キメラ型もATCCに寄託されて受託番号12316を指定された。
【発明の開示】
【０００８】
3. 発明の概要
本発明は、膵癌の治療におけるモノクローナル抗体31.1の結合同等物の使用に関するが、これらには、そのキメラおよび／またはヒト化抗体、抗体フラグメント、ならびに競合的に結合する抗体および抗体フラグメント、さらに共通の特異性を示す抗体、誘導体およびフラグメントも含めるものとする。
【０００９】
本発明は、少なくとも一部には、マウス型31.1とキメラ型31.1の両方を用いて、31.1抗体のADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) 活性をD6-12および17.1a（Panorex）と比較したin vitro研究に基づいている。マウス型31.1抗体は35%のADCC応答を誘発することができるが、一方、キメラ型は、クロム遊離試験によって、3時間ごとに腫瘍細胞の80%が破壊されるという結果を示した。これはD6-12に関する破壊率30%およびPanorexに関する破壊率15%と比較される。ヒト大腸癌細胞系LC-174TおよびColo205を用いた異種移植モデルを用いて、2百万個の腫瘍細胞をヌードマウスの後肢に植え付けて、10日後にヒトエフェクター細胞とともに腹腔内に抗体を投与した後では、キメラ31.1が樹立された腫瘍細胞系（十分に確定された分子）の後退を引き起こすことが明らかとなった。30日後には、この処理動物の腫瘍の体積は、対照と比較して、95%以上減少した。この抗体が膵癌細胞に向けられるならば、31.1抗体は膵癌細胞に存在する抗原に結合するが悪性でない膵臓組織には結合しないことが明らかとなっているので、同様の効果を期待することができる。
【００１０】
本発明は、キメラ31.1抗体を発現させるために使用することができる、Mu-31.1の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含んでなるポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供する。本発明のヌクレオチド配列は、(a)図2もしくは図4に示されるヌクレオチド配列；(b) 図2もしくは図4に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；ならびに(c)(i)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、例えば0.5M NaHPO4、7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1mM EDTA中65℃でのフィルター結合DNAとのハイブリダイゼーション、および0.1xSSC/0.1% SDS中68℃での洗浄の条件下で、図2もしくは図4のヌクレオチド配列と結合し、かつ(ii)キメラ31.1モノクローナル抗体と同じ免疫特異性で結合することが可能な軽鎖および重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列；を含むものである。
【００１１】
本発明はさらに、pRc/CMV 31.1と命名したキメラ化31.1抗体の新規発現構築物を提供する。これはすでにATCCに寄託され、受託番号ATCC[ ]を指定されている。このプラスミドは、エンハンサー欠損SV40初期プロモーターによって駆動されるジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhfr）発現ユニットを有し、これによってジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞において200 mg/Lを超える発現が可能になる。
【００１２】
4. 図面の説明
図1A〜F． Chi31.1-1軽鎖および重鎖遺伝子をプラスミドpDCM-dhfr(図1F)に挿入することによってpRc/CMV 31.1ベクターを構築するために使用した一連のプラスミド。
【００１３】
図2． 制限酵素切断部位を示す、31.1軽鎖可変領域の核酸配列（二本鎖）および可能なアミノ酸配列（読み枠による）。
【００１４】
図3． 図2に示す軽鎖可変領域核酸配列を切断しない酵素の一覧表。
【００１５】
図4． 制限酵素切断部位を示す、31.1重鎖可変領域の核酸配列（二本鎖）および可能なアミノ酸配列（読み枠による）。
【００１６】
図5． 図4に示す重鎖可変領域核酸配列を切断しない酵素の一覧表。
【００１７】
図6A〜B． 抗体依存性細胞傷害活性（ADCC）アッセイを行って、CHO chi31.1抗体の標的細胞SW1643およびPANC-1に対するエフェクター機能を調べた。31.1抗体の存在下では細胞溶解が起こる（図6A）が、対照抗体の存在下では起こらない（図6B）。
【００１８】
5. 発明の詳細な説明
限定するためではなく、説明を明確にする目的で、詳細な説明を次の2項に分けて説明する：
i)モノクローナル抗体31.1およびその同等物；ならびに
ii)治療プロトコル。
【００１９】
5.1. モノクローナル抗体 31.1 およびその同等物
モノクローナル抗体31.1はマウスのモノクローナル抗体であって（以後Mu-31.1と称する）、もともと、大腸癌細胞膜由来の精製材料で免疫することによって生成されたものである。この抗体を分泌するハイブリドーマ細胞はAmerican Type Culture Collection(ATCC)に寄託され、受託番号ATCC PTA 2497を指定されている。
【００２０】
本発明は、Mu-31.1の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含んでなる核酸分子およびポリペプチドを提供する。本発明のヌクレオチド配列は、(a)図2もしくは図4に示すDNA配列；(b)図2もしくは図4に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；(c) (i)ストリンジェントな条件下、例えば0.5M NaHPO4、7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1mM EDTA中65℃でのフィルター結合DNAとのハイブリダイゼーション、および0.1xSSC/0.1% SDS中68℃での洗浄の条件下で（Ausubel F. M.ら編、1989, Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、Green Publishing Associates, Inc., およびJohn Wiley & sons, Inc., New York, p.2.10.3参照）、(a)もしくは(b)に示すヌクレオチド配列とハイブリダイズし、かつ(ii)機能的に同等な遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列；を包含する。機能的に同等な遺伝子産物には、標的抗原との結合に関して31.1と競合するポリペプチドが含まれる。本発明はまた、重鎖および軽鎖可変領域のペプチド断片、およびそれらの融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する。
【００２１】
当業者に公知の種々様々な方法を用いて、本発明のヌクレオチドを単離することができる。例えば、31.1モノクローナル抗体もしくはその同等物を発現することが明らかな細胞または組織に由来するRNAを用いて構築されたcDNAライブラリーを、図2もしくは図4に示す配列から誘導された、標識された核酸プローブを用いてスクリーニングすることができる。さらに、本明細書に開示したヌクレオチド配列に基づいてデザインされた2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCRを行うことによって、重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸配列を得ることができる。この反応のための鋳型は、31.1モノクローナル抗体を発現することが明らかな細胞系または組織から調製されたmRNAの逆転写によって得られるcDNAとすることができる。
【００２２】
本発明はまた、(a)前記重鎖および軽鎖可変領域配列および／またはその相補配列（すなわち、アンチセンス）のいずれかを含有するDNAベクター；(b)重鎖および軽鎖可変領域コード配列の発現を指令する調節エレメントに機能的に結合された前記重鎖および軽鎖可変領域配列のいずれかを含有するDNA発現ベクター；および(c)宿主細胞において該コード配列の発現を指令する調節エレメントに機能的に結合された前記重鎖および軽鎖可変領域配列のいずれかを含有する遺伝子操作された宿主細胞；を包含する。ここで用いる調節エレメントとしては、限定するものではないが、誘導および非誘導プロモーター、エンハンサー、オペレーター、および発現を駆動し調節する当業者に公知の他のエレメントがある。
【００２３】
図2は31.1軽鎖可変領域の推定アミノ酸配列を示し、図4は31.1重鎖可変領域の推定アミノ酸配列を示す。したがって、本発明のアミノ酸配列は、図2および図4に示すアミノ酸配列を包含する。
【００２４】
本発明はまた、上記ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と機能的に同等であるタンパク質を包含するが、かかるタンパク質は、31.1モノクローナル抗体によって認識されるエピトープと結合する能力を含むがこれに限定されない、いくつかの判断基準によって判定することができる。
【００２５】
また、重鎖および軽鎖可変領域の1以上のドメインに相当するペプチド、ならびに融合タンパク質（重鎖および軽鎖可変領域の全長もしくは一部分が無関係のタンパク質に融合されている）も本発明の範囲に含まれ、本明細書に開示したヌクレオチドおよびアミノ酸配列に基づいてこれらをデザインすることができる（図2および図4を参照されたい）。
【００２６】
重鎖および軽鎖可変領域は化学合成が可能である（例えば、Creighton, 1983, Proteins: Structure and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co., N. Y.を参照されたい）が、一方、これらの領域を、重鎖および軽鎖可変領域遺伝子配列および／またはコード配列を含む核酸を発現させるための当業界で公知の技法を用いた組換えDNA技術によって、有利に製造することができる。このような方法を用いて、上記ヌクレオチド配列および適当な転写・翻訳調節シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。こうした方法として、例えば、in vitro組換えDNA法、合成法およびin vivo遺伝的組換えが挙げられる（例えば、Sambrookら、1989、前掲、およびAusubelら、1989、前掲、に記載の方法を参照されたい）。
【００２７】
様々な宿主-発現ベクター系を用いて、本発明のヌクレオチド配列を発現させることができる。重鎖および軽鎖可変領域が可溶性誘導体として発現され、分泌されない場合は、そのペプチドもしくはポリペプチドを宿主細胞から回収することができる。これとは別に、重鎖および軽鎖可変領域が分泌される場合には、ペプチドもしくはポリペプチドを培地から回収することができる。
【００２８】
本発明の目的で使用することができる発現系には、31.1重鎖および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含有する組換えバクテリオファージ、プラスミドもしくはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌、31.1重鎖および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母、といった微生物、または哺乳類細胞のゲノムもしくは哺乳類ウイルスに由来するプロモーターを含有する組換え発現構築物を保有する哺乳類細胞系があるが、それらに限定されない。
【００２９】
適当な発現系を選択することにより、重鎖および軽鎖可変領域タンパク質の正確な修飾、プロセシングおよび細胞内局在が確実に生じるようにすることができる。そのためには、抗体を分泌させるべく抗体を適切に修飾してプロセシングする能力を保持する宿主細胞を選択することが好ましい。キメラ抗体生産用の細胞系の開発に求められるように、長期間、高収率で組換えタンパク質を生産するためには、安定した発現が好適である。複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞を、適当な発現制御エレメントによって制御されるDNAおよび選択マーカー遺伝子（すなわち、2〜3の名を挙げると、tk、hgprt、neoおよびhygro遺伝子）で形質転換する。外来DNAを導入した後、遺伝子操作した細胞を栄養培地で1〜2日増殖させたのち、選択培地に移し替えることができる。
【００３０】
キメラ型のマウス31.1は、以下Chi-31.1-1と称するが、ヒト定常領域免疫グロブリン配列とともにMu-31.1由来の可変領域を含んでなり、ATCCに寄託されて受託番号ATCC CRL-12316を指定されたハイブリドーマ細胞によって産生される。
【００３１】
本発明の特定の実施形態において、もう一つのキメラ型マウス31.1（以後Chi-31.1-2と称する）は、Mu-31.1由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有し、Chi31.1-1重鎖および軽鎖遺伝子から誘導されるもので、本明細書に記載した、また図1に示したベクターpRc/CMV31.1の発現によって生産することができる。このベクターは、キメラ抗体を高収率で産生するという利点を有する。このベクターの作製方法は、下記の実施例の項に記載される。
【００３２】
本発明の特定の非限定的な実施形態において、Mu-31.1の可変領域を含んでなる、さらに別のキメラ抗体を作製することができる。例えば、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を作製するには、図2（軽鎖可変領域）および図4（重鎖可変領域）に示す可変領域配列、または選択したベクターにおいてスプライシングを促進するように末端を変化させたその変異体に基づいてデザインされたPCRプライマーを使用し、さらに、鋳型DNA源として31.1-Ab同等物を産生するハイブリドーマ（例えばATCCに寄託された上記のハイブリドーマの１つ）から集められたDNAを使用することができる。その後、この可変領域コード配列をヒト定常領域コード配列と連結して「ヒト化」抗体を作製することができる。
【００３３】
あるいはまた、発現しやすくするために、Chi31.1-1重鎖および軽鎖（ヒト定常領域を含む）をコードする核酸を様々な発現ベクターに挿入することができる。こうしたPCRプライマーの具体的な限定的でない例は次の通りである：
a) Chi31.1-1軽鎖コード配列をBamH1/XbaI挿入部位に挿入する場合：
i) Chi31.1-LcBamH1(S):
5’-ATA GGA TCC ATG AAG TCA CAG ACC CAG GTC TTC G-3’
ii) Chi31.1-LcXBaI(A):
5’-TTT CTA GAC TAA CAC TCT CCC CTG TTG AAG C-3’
b) Chi31.1-1重鎖コード領域をEcoRI/NotI挿入部位に挿入する場合：
i) Chi31.1-HcEciRI(S):
5’-ATA GAA TTC ATG GCT TGG GTG TGG ACC TTG CT-3’
ii) Chi31.1-HcNotI(A):
5’-TGG CGG CCG CTC ATT TAC CCG GAG-3’。
上記プライマーは、ATCCに寄託され、受託番号ATCC CRL-12316を指定されたハイブリドーマ細胞から調製されたDNAを鋳型として用いるポリメラーゼ連鎖反応に使用することができる。
【００３４】
Mu-31.1の「同等物」は、本明細書では、標準的な方法によって評価して、その標的抗原との結合についてMu-31.1と競合する免疫グロブリン分子またはそのフラグメントもしくは誘導体として定義される。こうした同等物として、完全な抗体分子（すなわち、2本の重鎖および2本の軽鎖を有する）、一本鎖抗体分子（例えば、Leeら、1999, Molec. Immunol. 36:61-71参照；参考として本明細書に含める）、Mu-31.1、Chi-31.1-1、Chi-31.1-2もしくは同等な完全抗体分子のF(ab)およびF(ab)2フラグメントのような抗体フラグメント、および生理活性物質とコンジュゲートされた、またはヒト免疫グロブリン分子に一層近似するように修飾された1以上の前記免疫グロブリン分子もしくはフラグメントを含むがそれに限定されない誘導体分子（例えば、Ryuら、1996, Human Antibod. Hybridomas 7:113-122を参照されたい）を挙げることができる。Mu-31.1、Chi-31.1-1、Chi-31.1-2を含めて、このような同等物はまとめて「31.1-Ab同等物」と呼ぶことにする。
【００３５】
共通の特異性を示す抗体およびその同等物（同等物は31.1抗体に適用される範囲と同一の範囲を有する）の使用も本発明にしたがって想定される。Mu-31.1と共通の特異性を有する抗体（「31.1共通特異性抗体」と称する）は、Mu-31.1の結合と競合しても、しなくてもよいが、同一の標的抗原（本明細書では「31.1-Ag」と称する）を認識する（すなわち、それと結合する）。この31.1と共通する特異性を示す抗体およびその同等物を、本明細書では「31.1共通特異性抗体同等物」と称する。
【００３６】
ヒトに使用されるどのような31.1抗体同等物または共通特異性抗体同等物も、それ自体がヒトにおいて有害な免疫反応を惹起しない構造を有することが望ましい。例えば、上記31.1抗体同等物または31.1共通特異性抗体同等物は、もともとそうした免疫原性の構造を欠いているか、または対象者から非自己と認識される構造を最小限にとどめるかもしくは排除する標準技法により「ヒト化」処理を施された産物でありうる（例えば、キメラ化および／または部位ごとの遺伝子工学的操作）。31.1-Agは大腸癌および膵癌の膜に局在すると思われる。その存在は、採取後直ちに凍結された正常なヒト組織には検出されていない（表A）。
【００３７】
【００３８】
しかしながら、外科手術時に得られ、新鮮凍結された大腸癌および膵癌の表面には31.1-Agが見いだされた（表B）。
【００３９】
【００４０】
留意すべきは、この結果が、米国特許第5,688,657号の表2（第24欄、1-26行）に示された、Mu-31.1抗体は調べた2つの膵臓腫瘍試料のいずれとも結合しなかったという結果と異なることである。米国特許第5,688,657号の表1（第23欄、1-38行）は、Mu-31.1が3つの膵癌由来細胞系のうち2つと反応したことを示す。米国特許第5,688,657号に含まれる情報に基づくと、31.1-Agは培養下で細胞を継代した後にのみ出現し、新鮮な膵癌組織には存在しないと結論づけられる。したがって、本明細書の表Bに記載のように31.1-Agが3つの膵臓腫瘍試料の全部に存在するであろうとは、米国特許第5,688,657号の開示からは予想されないことである。
【００４１】
Mu-31.1は、マウスSP2細胞系との融合によって創出されたハイブリドーマ細胞系から分泌される。Mu-31.1、Chi-31.1-1およびChi-31.1-2、31.1-Ab同等物、ならびに31.1共通特異性抗体は、例えば、限定するものではないが、臨床用途のために標準的なin vitro細胞培養法および後続の精製法によって製造することができる。例えば、ハイブリドーマ細胞をジェネテシン(Geneticin)（0.2 mg/ml）中で増殖させることができるが、これはこの抗生物質の存在によってハイブリドーマ細胞のより良い増殖が可能になることが観察されたためである。
【００４２】
前記31.1-Ab同等物および31.1共通特異性抗体を含有する組成物は、ヒト添加剤を加えることなく調製することが望ましい。例えば、調製物をMillipore 0.2ミクロン細菌濾過器に通して濾過して混入物を除去し、血液寒天プレートおよび培地を陽性対照とともに14日間画線培養(streak)することによって細菌および真菌について無菌であることを検証する。調製物がマイコプラズマを含まないことは、例えばPCRマイコプラズマアッセイにより、また、マイコプラズマ寒天プレート（Life Technology カタログ#18042-010）およびMyco Test Kit（Life Technology カタログ#15672-017）により3T6対照細胞を使用して判定することができる。
【００４３】
1以上の上記31.1-Ab同等物もしくは31.1共通特異性抗体を含有する培地は、Pallエンドトキシンフィルターに通して濾過し、ガラス器具は乾熱滅菌してエンドトキシンを除去することができる。適当なエンドトキシンレベルはBio Whittaker Pyrogent 03,250テストキットにより測定して0.125ユニット/ml以下とすることが望ましいが、それに限らない。
【００４４】
本発明の好ましい非限定的な実施形態において、前記調製物の1つはウイルスを不活化するように処理することができる。例えば、レトロウイルスは、カラムクロマトグラフィーおよび10〜40 nmのPall Ultipor Grade DV50ウイルス除去フィルターによる濾過の間、pH3での酢酸処理を1時間行うことによって不活化することができる。
【００４５】
本発明の特定の非限定的な実施形態においては、50 mgのChi-31.1-1を、リン酸緩衝食塩水（PBS）中2 mg/mlの濃度でバイアルに入れる。
【００４６】
5.2. 治療プロトコル
本発明は、単独でまたは組合せで使用される、31.1-Ab同等物および／または31.1共通特異性抗体同等物の、治療を必要とする患者の膵癌治療への使用を提供する。その方法は、治療上有効な投与量の、1以上の31.1-Ab同等物および／または31.1共通特異性抗体同等物を患者に投与することを包含する。治療上有効な投与量は、本明細書では、患者において次のうち1以上を達成する用量、すなわち、患者において検出可能な膵癌細胞の溶解をもたらす；膵臓腫瘍の増殖もしくは侵襲性もしくは大きさの低下を引き起こす；臨床症状の改善をもたらす；および／または生存期間の増加をもたらす用量として定義される。31.1-Ab同等物および／または31.1共通特異性抗体同等物の単回投与量は、約25mgから約1000mgまでの範囲とすることができ、約100mgから250mgまでとすることが好ましいが、限定を意図するものではない。投与量は、患者ごとの基準に基づいて、望ましくない副作用および／または毒性を避けるように調整しうる。31.1-Ab同等物および／または31.1共通特異性抗体同等物は、1〜4週間の間隔で（望ましくは2週間毎に）投与される一連（複数）の単回投与量として投与し、副作用が有害なレベルに達するまで、または、病気が望ましくないレベルに進行するまで、投与することが好適である。31.1-Ab同等物および／または31.1共通特異性抗体同等物は、どのような標準的な投与経路でも投与することができる。望ましくは、患者がその製剤を許容する（すなわち、患者が好ましくないアレルギー反応および／または他の毒性反応を示さない）かどうか調べるために、最初に皮下投与して、ひとたび十分な許容度が示されたならば、静脈内投与することができる。
【００４７】
ある特定の非限定的な例において、本発明に従うプロトコルは下記の通りとすることができる。
無菌手順によって、標準的なバイオテクノロジー技法で作製された「ヒト化」31.1-Ab同等物または31.1共通特異性抗体同等物を、0.22ミクロン低タンパク質フィルターを通して、0.9%塩化ナトリウムを含むガラス製輸液ビンもしくはDEHPを含まない輸液バッグの中に濾過して入れ、最終濃度を0.4mg/mlとする。この輸液を軽く混合する。輸液に濁りが認められたら、投与してはならない。
【００４８】
患者が「ヒト化」31.1-Ab同等物および／または31.1共通特異性抗体同等物による治療に耐えられるかどうかを判定するために、ジフェンヒドラミン25mg（静脈内）、およびパラセタモール650mg（経口）を予め投薬してから、30マイクログラムの31.1-Ab同等物および／または31.1共通特異性抗体同等物を皮下注射する。もしアレルギー毒性がまったく生じないか、グレード1のアレルギー毒性が生じるならば、静脈内処置を行うことにする。もしグレード１のアレルギー毒性が生じたならば、静脈注射に進む前に、その毒性の分解が必要となろう。
【００４９】
上記段落に記載した皮下投与試験に患者が耐えられたならば、2時間かけて25mgの31.1-Ab同等物または31.1共通特異性抗体同等物の第1回注入による治療を行うことができる。ジフェンヒドラミン25mg(静脈内)およびパラセタモール650mg（経口）という形で前投薬を行ってもよい。それから、注射後6時間にわたり、何らかの起こりうる副作用について患者を観察する。患者は注射前に、そして治療後最初の1時間は15分ごと、次の2時間は30分ごと、さらに、その後は注入完了の6時間後まで1時間ごとに、バイタルサイン（生存徴候）でモニターすることができる。
【００５０】
最初の注入に耐えられることが判明したならば、2週間後、この患者は、PBSもしくは他の適当な希釈剤で100ccとした50mgの31.1-Ab同等物または31.1共通特異性抗体同等物の注入を4時間にわたって、上記段落に示したのと同じ臨床プロトコルに従って受けることができる。この第2回の注入も耐えられることが判明したならば、患者はさらに希釈剤100 cc中の100mgの31.1-Ab同等物または31.1共通特異性抗体同等物の注入を4時間にわたり、上記プロトコルを用いて、2週間ごとに受けることができる。その後患者は、不耐性が現れるかまたは病気が悪化するまで、こうした治療を続けることができるが、最長4ヶ月間が望ましい。何らかのグレード3以上の毒性が治療に起因して生じるならば、患者は治療を永久に中止することになる。毒性が治療に関係しないと認められる場合には、患者はその毒性から回復したとき治療を再開することができる。治療中もしくは治療後にグレード2の毒性が生じた場合、注入をやめることが望ましい。グレード0に回復したならば、その時、注入を再開することができる。次回に計画された治療時までに回復が見られなかった場合には、グレード0への回復が生じるまで治療を延期することができる。4週間以内にグレード0への回復が起こらない場合には、治療は永久に中止されることになる。グレード2以上の何らかのアレルギー反応が生じた場合には、治療を中止し、それ以上の注入を行わないことが望ましい。
【００５１】
本発明の特定の非限定的な実施形態において、下記は治療に適した患者を判定する基準として役立つと考えられる：
a)患者は、組織学的に確認された再発性もしくは転移性の膵臓腺癌に罹患している可能性があり、その腫瘍が、使用する予定の31.1-Ab同等物または31.1共通特異性抗体同等物と反応する；
b)転移性膵癌のための標準的な治療計画による患者の治療が失敗したと考えられる；
c)患者の病気が下記のうち1以上によって測定可能である：
i) 理学的検査；
ii) コンピューター断層撮影法または他の放射線造影法；
iii) CEAレベル；および／または
iv) Ca 19-9レベル；
d)患者が18歳以上である；
e)患者が0、1または2のWHO機能状態(WHO performance status)を示す；
f)患者の予後の見通しから、推定余命が少なくとも12週間と考えられる；
g)患者の血液学的検査が次の値を示す：
i) WBC＞3,000 ;
ii) HGB＞10 ;および
iii) 血小板＞100,000 ;
h)臨床化学検査値が以下の通りである：
クレアチニン、ビリルビン、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アラニントランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼ、およびビリルビンがすべて正常値の上限の2倍以下である；および／または
i)患者に、度重なる採血に適した末梢静脈アクセスが確保されている。
【００５２】
本発明の特定の非限定的な実施形態において、下記は治療に適さない患者を除外するための判断基準となると考えられる：
a)前の化学療法から（あるいは、ニトロソ尿素またはマイトマイシンCの場合は6週間）、生物学的応答調節物質による治療から、または放射線療法から4週間以上経過していない；
b)患者が現在ステロイド療法を受けている；
c)患者が妊娠している（この研究に関わる男女には、妊娠可能な場合、有効な避妊の実施を勧める）；
d)患者が授乳中の女性である；
e)患者が、悪性ではないが衰弱させるような合併症、例えば活動性感染症または悪性腫瘍の急性介入性合併症に罹っている；
f)中枢神経系の関与がある；
g)患者が以前に骨髄移植もしくは他の臓器移植を受けたことがある；
h)患者に別の悪性腫瘍の既往症がある、ただし適切に治療された黒色腫以外の皮膚癌またはin situ子宮頸癌を除く；
i)患者が以前にマウスモノクローナルまたはポリクローナル抗体の投与を受けたことがある；および／または
j)患者がHIV陽性であると判明している。
【００５３】
この研究過程において、有害反応の非限定的な例として、息切れ、低血圧、チアノーゼ、発疹、気管支痙攣、悪寒、硬直、背痛、発熱、チアノーゼ、悪心、嘔吐、動悸またはなんらかの他の有害反応を挙げることができる。
【００５４】
本発明の非限定的な実施形態においては、下記の臨床検査を行って、上記のプロトコルで治療を受けることになっている患者を評価することが望ましい。血液学的検査に関しては、全血球数、白血球数および血小板数を各注入の前、および治療中と、最後の注入から4週間まで毎週入手する。臨床生化学検査に関しては、ブドウ糖、ナトリウム、カリウム、炭酸水素イオン、塩素、血液尿素窒素、クレアチニン、尿酸、カルシウム、無機リン酸、総タンパク量、アルブミン、乳酸脱水素酵素、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アラニントランスアミナーゼおよびアルカリホスファターゼを測定する完全な生化学パネルを治療期間中および最後の注入から4週間まで毎週入手する。特別な臨床検査に関しては、10ccの血液から得られた血清試料を、各回の注入の前および2分以内に、最初の注入終了後15分、30分、60分、2，4，24および72時間の時点で、その後各回の注入前に、さらに、最後の治療後4週間経過するまで2週間ごとに採取し、投与された31.1-Ab同等物および／または31.1共通特異性抗体同等物を検出するために処理することができる。この血清試料を用いて、次に、ADCC、抗体濃度、および投与された抗体同等物に対するヒト抗体の存在を調べることができる。登録時および各回の注入の前に、さらに最後の注入の4週間後に、尿検査を実施することができ、何らかの異常のある検体については顕微鏡検査を実施する。
【００５５】
本発明の様々な実施形態において、次のような安全性評価を行うことが望ましい。各回の注入では、患者の体温、脈拍、および血圧を含めたバイタルサインを各注入の前後に入手する。脈拍および血圧は、注入の最初の1時間は15分ごとに、その後2時間は30分ごとに、続いて注入完了後6時間までは1時間ごとに記録する。注入終了の6時間後まで、もしくはバイタルサインが基底値に戻るまで、患者を観察し、バイタルサインをモニターすることができる。
【００５６】
治療に対する患者の応答の初期評価および後続の評価は下記のように行うことができる。腫瘍の計測は、理学的検査および／または標準もしくは特別の放射線医学検査（例えば胸部X線）、コンピューター断層撮影、磁気共鳴画像診断、または超音波によって実施することができる。2以上の病変が存在する場合、代表的な病変を測定すべきである。その主要な病変の最長の垂直方向測定値を治療前および8週間ごとに記録することができる。Ca 19.9のレベルを定期的に、例えば毎月モニターしてもよい。
【００５７】
治療を受ける患者それぞれについて、書面によるインフォームドコンセントを得ることが望ましい。それぞれの患者は、書面での同意にサインする前に、その治療、その治療の潜在的危険性および利点、ならびに受けることのできる代替の治療法に関する口頭での説明を受けるべきである。
【００５８】
治療の過程で、必要に応じて、血液製剤、抗生物質、制吐剤、鎮痛剤、もしくは同時に現れる病状の安定のための他の薬剤を投与することができる。
【００５９】
患者において、進行性疾患の徴候がある場合、重大なまたは予想外の副作用が生じた場合、または他の医学上妥当な理由がある場合、治療を中止することができる。
【００６０】
本明細書に記載した治療用途に加えて、31.1抗体およびその機能的同等物を、被験者において膵癌の診断に用いることができる。本発明の診断法は、31.1抗体が膵癌細胞には発現するが正常細胞には発現しない抗原と選択的に結合するという発見に基づいている。
【００６１】
本発明にしたがって、被験者から得られた試料中のモノクローナル抗体31.1の反応性レベルの測定値を、膵癌のような疾病の診断に利用することができる。被験者由来の試料中のモノクローナル抗体31.1の反応性の検出は、多数の方法のいずれによっても行うことができる。好ましい診断方法には、例えば、31.1反応性抗原を31.1モノクローナル抗体との相互作用によって検出するイムノアッセイが含まれる。本発明の実施に有用なイムノアッセイとしては、ほんの数例を挙げると、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA（酵素免疫測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降法、沈降素(precipitin)反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散法、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定法、蛍光免疫測定法、プロテインAイムノアッセイのような技法によるアッセイ系を包含するが、それらに限定されない。
【００６２】
膵臓組織もしくは他の生体組織のような生物学的試料を、特定の癌またはその危険性が疑われる被験者から採取する。全組織の一部または細胞を、当業者に公知の様々な可溶化カクテルのうちいずれかを用いて可溶化する。例えば、（リッター当たり）8M尿素、20mlのNonidet P-40界面活性剤、20mlの両性電解質（pH3.5〜10）、20mlの2-メルカプトエタノール、および0.2mMのフッ化フェニルメチルスルホニル（PMSF）を蒸留脱イオン水に溶解した細胞溶解バッファーの添加によって、組織を可溶化することができる。
【００６３】
31.1反応性抗原の発現を検出するためのイムノアッセイは、典型的には、被験者から得られた組織試料のような生体試料と31.1モノクローナル抗体とを、免疫特異的な抗原-抗体結合反応が起こりうる条件下で接触させること、および抗体による免疫特異的結合の量を検出もしくは測定することを含んでなる。特定の態様においては、このような抗体の結合を用いて、例えば、31.1反応性抗原の存在および生産増加を検出することができ、この場合、該抗原の検出が疾病状態の指標となる。
【実施例】
【００６４】
6. 実施例： pRc/CMV ベクターの調製
pRc/CMVベクターは、図1A〜Fに示した一連のプラスミドを用いて作製した。Chi31.1の重鎖および軽鎖を、TOPO(トポイソメラーゼI)クローニングによって、pCRベクター(図1A)にクローニングした。PCRによって軽鎖および重鎖配列をpCRベクターに挿入するために用いた配列は次の通りである：
a)Chi31.1-1軽鎖をコードする領域をBamH1/XbaI挿入部位に挿入する場合：
i) Chi31.1-LcBamH1(S):
5’-ATA GGA TCC ATG AAG TCA CAG ACC CAG GTC TTC G-3’
ii) Chi31.1-LcXbaI(A):
5’-TTT CTA GAC TAA CAC TCT CCC CTG TTG AAG C-3’
b)Chi31.1-1重鎖をコードする領域をEcoRI/NotI挿入部位に挿入する場合：
i) Chi31.1-HcEcoRI(S):
5’-ATA GAA TTC ATG GCT TGG GTG TGG ACC TTG CT-3’
ii) Chi31.1-HcNotI(A):
5’-TTG CGG CCG CTC ATT TAC CCG GAG-3’
【００６５】
次に、これらをpCRベクターからpDCM-dhfrベクターにクローニングした結果、前記軽鎖コード領域はサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターの制御下でBamHi/XbaI部位に挿入され、前記重鎖コード領域はもう一つのCMVプロモーターエレメントの制御下でEcoRI/NotI部位に挿入された（図1F）。
【００６６】
pDCM-dhfrベクターは、図1B〜Eに示した一連のステップを用いて作製した。いくつかの関連成分を用いた一連のベクター構築は、Ryuら、1996, Hum. Antibod. Hybridomas 7:113-122 (pRc/CMVベクター（Invitrogen）に基づく；例えば、Ryuらの115頁および図4を参照); Jinら、1995, Virus Res. 38: 269; およびLeeら、1999, Molec. Immunol. 36:61-71 (例えば、この文献の図2を参照) に記載されている。
【００６７】
基本的には、pcDNA3ベクター（Invitrogen）（図1B）をpDCMベクター（図1C）の基礎として使用し、制限酵素の対で消化した後再連結することを並行して用いて、特定の切断部位を破壊しかつベクター内のCMVプロモーター配列の下流にある他の部位を保持させた。具体的には、図1Cに示すように、pcDNA3を最初にHindIIIおよびBamHIで消化し、続いて再連結し、その後XhoIおよびApaIで消化してから再連結し、結果的にプロモーターの下流のBstXI、EcoRI、EcoRV、BstXIおよびNotI部位が保存された。その後、BsmIによる切断によってアンピシリンおよびネオマイシン耐性遺伝子間でこの分子を直線化した（成分1）。並行して、pcDNA3をBstXIおよびNotIで消化後、小断片を分離して再連結し、BstXI、EcoRI、EcoRV、BstXIおよびNotI部位を除去し、HindIII、KpnI、BamHI、XhoI、XbaIおよびApaI部位をそのまま残した。PvuIIおよびNruIによる切断によって、CMVプロモーター、保存された部位、およびBGHpAを含む断片が生じた（成分2）。成分2を成分1の末端間に挿入すると、結果的にpDCMが得られたが、これは、2つのそれぞれのCMVプロモーターエレメントの下流に遺伝子のための2つの異なる挿入部位を有している。図1Eに示すように、KC-dhfr由来のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（dhfr）を次に、pDCMに挿入して（Leeら、1999, Molec. Immunol. 36:61-71を参照）、pDCM-dhfrを作製することができる。あるいはまた、図1Dに示すように、KC-dhfrに由来するdhfr遺伝子をpcDNA3に組み込んで、pCdhfrを作製することができるが、これをさらに図1Cに示す方法と同様の方法によって操作して、2つのCMVプロモーター／挿入部位カセットを作製することができる。
【００６８】
Chi31.1-1重鎖および軽鎖をコードする配列を、次に、pCRベクターからpDCM-dhfrにクローニングしてpRc/CMVを作製した。これをCHO dhfr-細胞にトランスフェクションし、その後発現されたキメラ免疫グロブリン分子を標準的な技法によって回収する。
【００６９】
7. 実施例： Chi31.1-1 に対するヒトの免疫応答
31.1キメラ抗体が免疫応答を惹起できるかどうか判定するために、Chi31.1-1キメラモノクローナル抗体の投与を受けたヒト被験者から血漿を採取した。この患者において、キメラ抗体に対する免疫応答の存在を、次のようなアッセイによって検査した。
【００７０】
96ウェルマイクロタイタープレートにChi31.1-1抗体を、ミリリッター当たり10マイクログラムとした溶液を使用して、ウェル当たり100マイクロリッターでコーティングした。Chi31.1-1の調製物をビオチン化した。次に、対照血漿または患者の血漿（50マイクロリッター）のいずれかをウェルに入れ、50マイクロリッターのビオチン化Chi31.1-1を添加した。さらに、そのプレートを90分間37℃でインキュベートした後、ウェルを洗浄し、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを添加した。次にウェルを3回洗浄した。TMB基質（3,3’,5,5’テトラメチルベンジジン）を加えて、プレートを20分間インキュベートした。停止溶液を添加し、反応した基質の量を測定した。
【００７１】
その結果を表Cに示すが、血漿ミリリッター当たりの結合Chi31.1-1をナノグラムで示す。処理前の基底値の2倍を超える結果が陽性とみなされる。健康で正常な3試料から得られた非特異的な基底結合値は、ミリリッター当たり4プラス・マイナス2ナノグラムであることがわかった。標準は、ヤギ抗ヒトIgG1をコーティングしたウェルを様々な濃度のビオチン化Chi31.1-1モノクローナル抗体とともに使用することによって測定した。
【００７２】
表 C.
【００７３】
8. 実施例： CHO Chi31.1 抗体の ADCC 活性
以下の節では、CHO Chi31.1モノクローナル抗体が腫瘍の破壊と関連した生物活性を有することを実証する実験について記載する。具体的には、この抗体が抗体依存性細胞傷害活性(ADCC)を有することを明らかにした。
【００７４】
4時間111In放出アッセイを用いてADCC活性を測定した。標的細胞は大腸腫瘍細胞系SW1643および膵癌細胞系PANC-1とした。対照抗体としてUPC-10を使用した。標的細胞を50μCiの111In-オキシキノリンで室温にて15分間標識した。50μl中の標的細胞（1×104）を96ウェルプレートに添加した。エフェクターと標的細胞の比は100:1、50:1および25:1としてCHO 31.1(1mg/ウェル)の存在下でアッセイした。プレートを37℃にて4時間、5%CO2含有加湿環境でインキュベートした。Skatron Harvesterフレームを用いるガンマ線計数のために上清を採取した。実験は3回反復して行った。特異的な細胞溶解は下記の式を用いて算出された：
【００７５】
図6Aおよび6Bに示すように、CHO31.1抗体は標的細胞に対する抗体依存性細胞傷害活性を媒介することができるが、対照UPC-10抗体はできなかった。
【００７６】
様々な文献が本明細書に引用されているが、その内容はその全体を参考として本明細書に含めるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１Ａ】Chi31.1-1軽鎖および重鎖遺伝子をプラスミドpDCM-dhfr(図1F)に挿入することによってpRc/CMV 31.1ベクターを構築するために使用したpCRベクターを示す。
【図１Ｂ】Chi31.1-1軽鎖および重鎖遺伝子をプラスミドpDCM-dhfr(図1F)に挿入することによってpRc/CMV 31.1ベクターを構築するために使用したpcDNA3ベクターを示す。
【図１Ｃ】Chi31.1-1軽鎖および重鎖遺伝子をプラスミドpDCM-dhfr(図1F)に挿入することによってpRc/CMV 31.1ベクターを構築するために使用したpDCMベクターを示す。
【図１Ｄ】Chi31.1-1軽鎖および重鎖遺伝子をプラスミドpDCM-dhfr(図1F)に挿入することによってpRc/CMV 31.1ベクターを構築するために使用したpCdhfrベクターを示す。
【図１Ｅ】Chi31.1-1軽鎖および重鎖遺伝子をプラスミドpDCM-dhfr(図1F)に挿入することによってpRc/CMV 31.1ベクターを構築するために使用したpDCM-dhfrベクターを示す。
【図１Ｆ】Chi31.1-1軽鎖および重鎖遺伝子をプラスミドpDCM-dhfr(図1F)に挿入することによってpRc/CMV 31.1ベクターを構築するために使用したpDCM-dhfrベクターを示す。
【図２】31.1軽鎖可変領域の核酸配列（二本鎖）および推定アミノ酸配列を示す。
【図３】図2に示した軽鎖可変領域の核酸配列を切断しない酵素の一覧表である。
【図４】31.1重鎖可変領域の核酸配列（二本鎖）および推定アミノ酸配列を示す。
【図５】図4に示した重鎖可変領域の核酸配列を切断しない酵素の一覧表である。
【図６Ａ】抗体依存性細胞傷害活性（ADCC）アッセイを行って、CHO chi31.1抗体の標的細胞SW1643およびPANC-1に対するエフェクター機能を調べた。31.1抗体の存在下では細胞溶解が起こることを示したグラフである。
【図６Ｂ】細胞溶解が対照抗体の存在下では起こらないことを示したグラフである。
【０００１】
1. 序論
本発明は、膵癌の治療におけるモノクローナル抗体31.1およびその同等物、ならびに共通の特異性を有する(co-specific)抗体の使用に関する。本発明は、少なくとも一部には、モノクローナル抗体31.1が悪性の膵細胞と反応するが、悪性でない膵細胞とは反応しないという発見に基づくものである。本発明はさらに、それぞれ図2および図4に示す、Mu-31.1の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含んでなるポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供する。こうしたポリヌクレオチド配列を使用して、本発明の方法で用いる31.1と同等の抗体を組換えにより発現させることができる。
【背景技術】
【０００２】
2. 発明の背景
2.1. 膵癌
膵癌は米国において癌による死因の第5位であり、今年、膵癌が原因で約28,000人の米国人が死亡すると予想される（Pancreas Cancer Web, The Johns Hopkins Medical Institutions, http://162.129.103.69:80/PANCREAS_INTRO）。現在、唯一の治癒可能性のある治療法は、膵頭、頚部、膵鈎状突起だけでなく十二指腸の大部分も切除する、広範囲にわたる複雑な手術（いわゆる「Whipple手術」）による、癌の外科的切除である。手術をしない場合、全体の5年生存率は、わずか3パーセントにすぎない（同上）。
【０００３】
切除不能な腫瘍を有する患者に提示される主な治療法は、化学療法（ゲムシタビン（Gemzar（登録商標））を使用することが多い）および放射線療法である（同上）。実験的な免疫療法が現在研究中であって、この免疫療法では、患者自身の細胞が免疫賦活性タンパク質である顆粒球-マクロファージコロニー刺激因子を発現するように遺伝子操作され、腫瘍増殖を防ぐために放射線を照射され、その後患者にもどされる。この場合、これらの細胞がうまくいけば免疫応答を活性化すると期待される（1997, Cancer Res. 57:1537-1546; Pancreas Cancer Web, The Johns Hopkins Medical Institutions, http://162.129.103.69:80/PANCREAS_MEDICAL_TX）。
【０００４】
2.2. モノクローナル抗体 31.1
抗体31.1は、BALB(c)マウスを、プールした（ヒト）同種異系大腸癌検体から得られた膜調製物で免疫することによって誘導されたタンパク質指向モノクローナル抗体に相当する。抗原の調製に使用される細胞を、窒素ガス（Parr）細胞破砕器によって細分化した後、超遠心にかけた。最初に、バッチごとの一貫性を保証するために、膜材料を電子顕微鏡で検査し、細胞質および核成分を除外した。次にこれを超音波処理してセファデックスG200で分画した。最初の部分精製には不連続ポリアクリルアミドゲル電気泳動を使用し（約80％）、30μgを遅延型皮膚過敏症（DHR）について試験した(3)。50μgの大腸癌関連抗原の腹腔内注射によってBALBマウスを免疫した。10日後に2回目の注射を行った後、マウスを犠牲にして融合用の脾細胞を取得した。5×107個のマウス脾細胞を40% PEG中で107個のsp2/0-AG14骨髄腫細胞とともにインキュベートすることによって融合を行った。モノクローナル抗体31.1によって規定される抗原は、分子量が72,000であることが判明した。免疫ペルオキシダーゼを用いた研究から、31.1により認識される抗原は、大腸癌の進行度が高いほど高頻度に見られることが示唆された。この抗体の特異性は高く、したがってMayo Clinicにおける脱落した結腸細胞に関する研究では、抗CEA、抗MUC1およびB72.3と比較して感度および特異性が優れていた。
【０００５】
第1世代TAAから、いくつかの候補となる抗体を分離して試験した。すべてがタンパク質由来であり、大腸癌に比較的特異的であることが判明した。抗体31.1は、ゲル電気泳動で近接して移動することが明らかになった2つの抗原のうちの1つに相当し、DHRを引き起こす免疫原性糖タンパク質に関連していた。マウスの抗体はIgG2aアイソタイプであるが、これはキメラ化の際にIgG1アイソタイプに変わる。31.1は強い局在化指数をもつことが見出された。こうして、この抗体はキメラ化される最初のものであった。
【０００６】
モノクローナル抗体31.1をキメラ化するために、31.1重鎖可変領域遺伝子のタンパク質コード化エキソンを、ヒトガンマ1鎖定常領域のタンパク質コード化エキソンにスプライスした。PCRを使用した。第１のフレームワーク領域（FR1）のコンセンサスDNA配列に基づいて合成された逆方向縮重プライマー、およびJ-C結合領域のコンセンサスDNA配列にしたがって合成された順方向プライマーを用いたPCR法によって、31.1 VH cDNAを増幅した。増幅された31.1 VH DNAをpBluescriptベクターにクローニングして配列決定した。SP2/0 AG14細胞にこのベクターをトランスフェクトすることによって、キメラ31.1が産生された。
【０００７】
モノクローナル抗体31.1およびそのキメラ型（ヒト化）抗体は、1997年11月18日発行の米国特許第5,688,657号に記載され、現在では再発行出願の主題であるが、その内容を全体として参考のために本明細書に含めるものとする。さらに、モノクローナル抗体31.1はAmerican Type Culture Collection(ATCC)（所在地10801 University Blvd., Manassas, VA, 20110-2209）に寄託されて受託番号ATCC PTA-2497を指定され、また、キメラ型もATCCに寄託されて受託番号12316を指定された。
【発明の開示】
【０００８】
3. 発明の概要
本発明は、膵癌の治療におけるモノクローナル抗体31.1の結合同等物の使用に関するが、これらには、そのキメラおよび／またはヒト化抗体、抗体フラグメント、ならびに競合的に結合する抗体および抗体フラグメント、さらに共通の特異性を示す抗体、誘導体およびフラグメントも含めるものとする。
【０００９】
本発明は、少なくとも一部には、マウス型31.1とキメラ型31.1の両方を用いて、31.1抗体のADCC (antibody-dependent cellular cytotoxicity) 活性をD6-12および17.1a（Panorex）と比較したin vitro研究に基づいている。マウス型31.1抗体は35%のADCC応答を誘発することができるが、一方、キメラ型は、クロム遊離試験によって、3時間ごとに腫瘍細胞の80%が破壊されるという結果を示した。これはD6-12に関する破壊率30%およびPanorexに関する破壊率15%と比較される。ヒト大腸癌細胞系LC-174TおよびColo205を用いた異種移植モデルを用いて、2百万個の腫瘍細胞をヌードマウスの後肢に植え付けて、10日後にヒトエフェクター細胞とともに腹腔内に抗体を投与した後では、キメラ31.1が樹立された腫瘍細胞系（十分に確定された分子）の後退を引き起こすことが明らかとなった。30日後には、この処理動物の腫瘍の体積は、対照と比較して、95%以上減少した。この抗体が膵癌細胞に向けられるならば、31.1抗体は膵癌細胞に存在する抗原に結合するが悪性でない膵臓組織には結合しないことが明らかとなっているので、同様の効果を期待することができる。
【００１０】
本発明は、キメラ31.1抗体を発現させるために使用することができる、Mu-31.1の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含んでなるポリヌクレオチドおよびアミノ酸配列を提供する。本発明のヌクレオチド配列は、(a)図2もしくは図4に示されるヌクレオチド配列；(b) 図2もしくは図4に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；ならびに(c)(i)ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件下、例えば0.5M NaHPO4、7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1mM EDTA中65℃でのフィルター結合DNAとのハイブリダイゼーション、および0.1xSSC/0.1% SDS中68℃での洗浄の条件下で、図2もしくは図4のヌクレオチド配列と結合し、かつ(ii)キメラ31.1モノクローナル抗体と同じ免疫特異性で結合することが可能な軽鎖および重鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列；を含むものである。
【００１１】
本発明はさらに、pRc/CMV 31.1と命名したキメラ化31.1抗体の新規発現構築物を提供する。これはすでにATCCに寄託され、受託番号ATCC[ ]を指定されている。このプラスミドは、エンハンサー欠損SV40初期プロモーターによって駆動されるジヒドロ葉酸レダクターゼ（dhfr）発現ユニットを有し、これによってジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損チャイニーズハムスター卵巣細胞において200 mg/Lを超える発現が可能になる。
【００１２】
4. 図面の説明
図1A〜F． Chi31.1-1軽鎖および重鎖遺伝子をプラスミドpDCM-dhfr(図1F)に挿入することによってpRc/CMV 31.1ベクターを構築するために使用した一連のプラスミド。
【００１３】
図2． 制限酵素切断部位を示す、31.1軽鎖可変領域の核酸配列（二本鎖）および可能なアミノ酸配列（読み枠による）。
【００１４】
図3． 図2に示す軽鎖可変領域核酸配列を切断しない酵素の一覧表。
【００１５】
図4． 制限酵素切断部位を示す、31.1重鎖可変領域の核酸配列（二本鎖）および可能なアミノ酸配列（読み枠による）。
【００１６】
図5． 図4に示す重鎖可変領域核酸配列を切断しない酵素の一覧表。
【００１７】
図6A〜B． 抗体依存性細胞傷害活性（ADCC）アッセイを行って、CHO chi31.1抗体の標的細胞SW1643およびPANC-1に対するエフェクター機能を調べた。31.1抗体の存在下では細胞溶解が起こる（図6A）が、対照抗体の存在下では起こらない（図6B）。
【００１８】
5. 発明の詳細な説明
限定するためではなく、説明を明確にする目的で、詳細な説明を次の2項に分けて説明する：
i)モノクローナル抗体31.1およびその同等物；ならびに
ii)治療プロトコル。
【００１９】
5.1. モノクローナル抗体 31.1 およびその同等物
モノクローナル抗体31.1はマウスのモノクローナル抗体であって（以後Mu-31.1と称する）、もともと、大腸癌細胞膜由来の精製材料で免疫することによって生成されたものである。この抗体を分泌するハイブリドーマ細胞はAmerican Type Culture Collection(ATCC)に寄託され、受託番号ATCC PTA 2497を指定されている。
【００２０】
本発明は、Mu-31.1の軽鎖可変領域および重鎖可変領域を含んでなる核酸分子およびポリペプチドを提供する。本発明のヌクレオチド配列は、(a)図2もしくは図4に示すDNA配列；(b)図2もしくは図4に示すアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列；(c) (i)ストリンジェントな条件下、例えば0.5M NaHPO4、7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1mM EDTA中65℃でのフィルター結合DNAとのハイブリダイゼーション、および0.1xSSC/0.1% SDS中68℃での洗浄の条件下で（Ausubel F. M.ら編、1989, Current Protocols in Molecular Biology、第1巻、Green Publishing Associates, Inc., およびJohn Wiley & sons, Inc., New York, p.2.10.3参照）、(a)もしくは(b)に示すヌクレオチド配列とハイブリダイズし、かつ(ii)機能的に同等な遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列；を包含する。機能的に同等な遺伝子産物には、標的抗原との結合に関して31.1と競合するポリペプチドが含まれる。本発明はまた、重鎖および軽鎖可変領域のペプチド断片、およびそれらの融合タンパク質をコードするヌクレオチド配列を包含する。
【００２１】
当業者に公知の種々様々な方法を用いて、本発明のヌクレオチドを単離することができる。例えば、31.1モノクローナル抗体もしくはその同等物を発現することが明らかな細胞または組織に由来するRNAを用いて構築されたcDNAライブラリーを、図2もしくは図4に示す配列から誘導された、標識された核酸プローブを用いてスクリーニングすることができる。さらに、本明細書に開示したヌクレオチド配列に基づいてデザインされた2つのオリゴヌクレオチドプライマーを用いてPCRを行うことによって、重鎖および軽鎖可変領域をコードする核酸配列を得ることができる。この反応のための鋳型は、31.1モノクローナル抗体を発現することが明らかな細胞系または組織から調製されたmRNAの逆転写によって得られるcDNAとすることができる。
【００２２】
本発明はまた、(a)前記重鎖および軽鎖可変領域配列および／またはその相補配列（すなわち、アンチセンス）のいずれかを含有するDNAベクター；(b)重鎖および軽鎖可変領域コード配列の発現を指令する調節エレメントに機能的に結合された前記重鎖および軽鎖可変領域配列のいずれかを含有するDNA発現ベクター；および(c)宿主細胞において該コード配列の発現を指令する調節エレメントに機能的に結合された前記重鎖および軽鎖可変領域配列のいずれかを含有する遺伝子操作された宿主細胞；を包含する。ここで用いる調節エレメントとしては、限定するものではないが、誘導および非誘導プロモーター、エンハンサー、オペレーター、および発現を駆動し調節する当業者に公知の他のエレメントがある。
【００２３】
図2は31.1軽鎖可変領域の推定アミノ酸配列を示し、図4は31.1重鎖可変領域の推定アミノ酸配列を示す。したがって、本発明のアミノ酸配列は、図2および図4に示すアミノ酸配列を包含する。
【００２４】
本発明はまた、上記ヌクレオチド配列によってコードされるタンパク質と機能的に同等であるタンパク質を包含するが、かかるタンパク質は、31.1モノクローナル抗体によって認識されるエピトープと結合する能力を含むがこれに限定されない、いくつかの判断基準によって判定することができる。
【００２５】
また、重鎖および軽鎖可変領域の1以上のドメインに相当するペプチド、ならびに融合タンパク質（重鎖および軽鎖可変領域の全長もしくは一部分が無関係のタンパク質に融合されている）も本発明の範囲に含まれ、本明細書に開示したヌクレオチドおよびアミノ酸配列に基づいてこれらをデザインすることができる（図2および図4を参照されたい）。
【００２６】
重鎖および軽鎖可変領域は化学合成が可能である（例えば、Creighton, 1983, Proteins: Structure and Molecular Principles, W. H. Freeman & Co., N. Y.を参照されたい）が、一方、これらの領域を、重鎖および軽鎖可変領域遺伝子配列および／またはコード配列を含む核酸を発現させるための当業界で公知の技法を用いた組換えDNA技術によって、有利に製造することができる。このような方法を用いて、上記ヌクレオチド配列および適当な転写・翻訳調節シグナルを含有する発現ベクターを構築することができる。こうした方法として、例えば、in vitro組換えDNA法、合成法およびin vivo遺伝的組換えが挙げられる（例えば、Sambrookら、1989、前掲、およびAusubelら、1989、前掲、に記載の方法を参照されたい）。
【００２７】
様々な宿主-発現ベクター系を用いて、本発明のヌクレオチド配列を発現させることができる。重鎖および軽鎖可変領域が可溶性誘導体として発現され、分泌されない場合は、そのペプチドもしくはポリペプチドを宿主細胞から回収することができる。これとは別に、重鎖および軽鎖可変領域が分泌される場合には、ペプチドもしくはポリペプチドを培地から回収することができる。
【００２８】
本発明の目的で使用することができる発現系には、31.1重鎖および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含有する組換えバクテリオファージ、プラスミドもしくはコスミドDNA発現ベクターで形質転換された細菌、31.1重鎖および軽鎖可変領域をコードするヌクレオチド配列を含有する組換え酵母発現ベクターで形質転換された酵母、といった微生物、または哺乳類細胞のゲノムもしくは哺乳類ウイルスに由来するプロモーターを含有する組換え発現構築物を保有する哺乳類細胞系があるが、それらに限定されない。
【００２９】
適当な発現系を選択することにより、重鎖および軽鎖可変領域タンパク質の正確な修飾、プロセシングおよび細胞内局在が確実に生じるようにすることができる。そのためには、抗体を分泌させるべく抗体を適切に修飾してプロセシングする能力を保持する宿主細胞を選択することが好ましい。キメラ抗体生産用の細胞系の開発に求められるように、長期間、高収率で組換えタンパク質を生産するためには、安定した発現が好適である。複製起点を含む発現ベクターを使用するのではなく、宿主細胞を、適当な発現制御エレメントによって制御されるDNAおよび選択マーカー遺伝子（すなわち、2〜3の名を挙げると、tk、hgprt、neoおよびhygro遺伝子）で形質転換する。外来DNAを導入した後、遺伝子操作した細胞を栄養培地で1〜2日増殖させたのち、選択培地に移し替えることができる。
【００３０】
キメラ型のマウス31.1は、以下Chi-31.1-1と称するが、ヒト定常領域免疫グロブリン配列とともにMu-31.1由来の可変領域を含んでなり、ATCCに寄託されて受託番号ATCC CRL-12316を指定されたハイブリドーマ細胞によって産生される。
【００３１】
本発明の特定の実施形態において、もう一つのキメラ型マウス31.1（以後Chi-31.1-2と称する）は、Mu-31.1由来の可変領域およびヒト免疫グロブリン定常領域を有し、Chi31.1-1重鎖および軽鎖遺伝子から誘導されるもので、本明細書に記載した、また図1に示したベクターpRc/CMV31.1の発現によって生産することができる。このベクターは、キメラ抗体を高収率で産生するという利点を有する。このベクターの作製方法は、下記の実施例の項に記載される。
【００３２】
本発明の特定の非限定的な実施形態において、Mu-31.1の可変領域を含んでなる、さらに別のキメラ抗体を作製することができる。例えば、重鎖可変領域および軽鎖可変領域を作製するには、図2（軽鎖可変領域）および図4（重鎖可変領域）に示す可変領域配列、または選択したベクターにおいてスプライシングを促進するように末端を変化させたその変異体に基づいてデザインされたPCRプライマーを使用し、さらに、鋳型DNA源として31.1-Ab同等物を産生するハイブリドーマ（例えばATCCに寄託された上記のハイブリドーマの１つ）から集められたDNAを使用することができる。その後、この可変領域コード配列をヒト定常領域コード配列と連結して「ヒト化」抗体を作製することができる。
【００３３】
あるいはまた、発現しやすくするために、Chi31.1-1重鎖および軽鎖（ヒト定常領域を含む）をコードする核酸を様々な発現ベクターに挿入することができる。こうしたPCRプライマーの具体的な限定的でない例は次の通りである：
a) Chi31.1-1軽鎖コード配列をBamH1/XbaI挿入部位に挿入する場合：
i) Chi31.1-LcBamH1(S):
5’-ATA GGA TCC ATG AAG TCA CAG ACC CAG GTC TTC G-3’
ii) Chi31.1-LcXBaI(A):
5’-TTT CTA GAC TAA CAC TCT CCC CTG TTG AAG C-3’
b) Chi31.1-1重鎖コード領域をEcoRI/NotI挿入部位に挿入する場合：
i) Chi31.1-HcEciRI(S):
5’-ATA GAA TTC ATG GCT TGG GTG TGG ACC TTG CT-3’
ii) Chi31.1-HcNotI(A):
5’-TGG CGG CCG CTC ATT TAC CCG GAG-3’。
上記プライマーは、ATCCに寄託され、受託番号ATCC CRL-12316を指定されたハイブリドーマ細胞から調製されたDNAを鋳型として用いるポリメラーゼ連鎖反応に使用することができる。
【００３４】
Mu-31.1の「同等物」は、本明細書では、標準的な方法によって評価して、その標的抗原との結合についてMu-31.1と競合する免疫グロブリン分子またはそのフラグメントもしくは誘導体として定義される。こうした同等物として、完全な抗体分子（すなわち、2本の重鎖および2本の軽鎖を有する）、一本鎖抗体分子（例えば、Leeら、1999, Molec. Immunol. 36:61-71参照；参考として本明細書に含める）、Mu-31.1、Chi-31.1-1、Chi-31.1-2もしくは同等な完全抗体分子のF(ab)およびF(ab)2フラグメントのような抗体フラグメント、および生理活性物質とコンジュゲートされた、またはヒト免疫グロブリン分子に一層近似するように修飾された1以上の前記免疫グロブリン分子もしくはフラグメントを含むがそれに限定されない誘導体分子（例えば、Ryuら、1996, Human Antibod. Hybridomas 7:113-122を参照されたい）を挙げることができる。Mu-31.1、Chi-31.1-1、Chi-31.1-2を含めて、このような同等物はまとめて「31.1-Ab同等物」と呼ぶことにする。
【００３５】
共通の特異性を示す抗体およびその同等物（同等物は31.1抗体に適用される範囲と同一の範囲を有する）の使用も本発明にしたがって想定される。Mu-31.1と共通の特異性を有する抗体（「31.1共通特異性抗体」と称する）は、Mu-31.1の結合と競合しても、しなくてもよいが、同一の標的抗原（本明細書では「31.1-Ag」と称する）を認識する（すなわち、それと結合する）。この31.1と共通する特異性を示す抗体およびその同等物を、本明細書では「31.1共通特異性抗体同等物」と称する。
【００３６】
ヒトに使用されるどのような31.1抗体同等物または共通特異性抗体同等物も、それ自体がヒトにおいて有害な免疫反応を惹起しない構造を有することが望ましい。例えば、上記31.1抗体同等物または31.1共通特異性抗体同等物は、もともとそうした免疫原性の構造を欠いているか、または対象者から非自己と認識される構造を最小限にとどめるかもしくは排除する標準技法により「ヒト化」処理を施された産物でありうる（例えば、キメラ化および／または部位ごとの遺伝子工学的操作）。31.1-Agは大腸癌および膵癌の膜に局在すると思われる。その存在は、採取後直ちに凍結された正常なヒト組織には検出されていない（表A）。
【００３７】
しかしながら、外科手術時に得られ、新鮮凍結された大腸癌および膵癌の表面には31.1-Agが見いだされた（表B）。
【００３９】
留意すべきは、この結果が、米国特許第5,688,657号の表2（第24欄、1-26行）に示された、Mu-31.1抗体は調べた2つの膵臓腫瘍試料のいずれとも結合しなかったという結果と異なることである。米国特許第5,688,657号の表1（第23欄、1-38行）は、Mu-31.1が3つの膵癌由来細胞系のうち2つと反応したことを示す。米国特許第5,688,657号に含まれる情報に基づくと、31.1-Agは培養下で細胞を継代した後にのみ出現し、新鮮な膵癌組織には存在しないと結論づけられる。したがって、本明細書の表Bに記載のように31.1-Agが3つの膵臓腫瘍試料の全部に存在するであろうとは、米国特許第5,688,657号の開示からは予想されないことである。
【００４１】
Mu-31.1は、マウスSP2細胞系との融合によって創出されたハイブリドーマ細胞系から分泌される。Mu-31.1、Chi-31.1-1およびChi-31.1-2、31.1-Ab同等物、ならびに31.1共通特異性抗体は、例えば、限定するものではないが、臨床用途のために標準的なin vitro細胞培養法および後続の精製法によって製造することができる。例えば、ハイブリドーマ細胞をジェネテシン(Geneticin)（0.2 mg/ml）中で増殖させることができるが、これはこの抗生物質の存在によってハイブリドーマ細胞のより良い増殖が可能になることが観察されたためである。
【００４２】
前記31.1-Ab同等物および31.1共通特異性抗体を含有する組成物は、ヒト添加剤を加えることなく調製することが望ましい。例えば、調製物をMillipore 0.2ミクロン細菌濾過器に通して濾過して混入物を除去し、血液寒天プレートおよび培地を陽性対照とともに14日間画線培養(streak)することによって細菌および真菌について無菌であることを検証する。調製物がマイコプラズマを含まないことは、例えばPCRマイコプラズマアッセイにより、また、マイコプラズマ寒天プレート（Life Technology カタログ#18042-010）およびMyco Test Kit（Life Technology カタログ#15672-017）により3T6対照細胞を使用して判定することができる。
【００４３】
1以上の上記31.1-Ab同等物もしくは31.1共通特異性抗体を含有する培地は、Pallエンドトキシンフィルターに通して濾過し、ガラス器具は乾熱滅菌してエンドトキシンを除去することができる。適当なエンドトキシンレベルはBio Whittaker Pyrogent 03,250テストキットにより測定して0.125ユニット/ml以下とすることが望ましいが、それに限らない。
【００４４】
本発明の好ましい非限定的な実施形態において、前記調製物の1つはウイルスを不活化するように処理することができる。例えば、レトロウイルスは、カラムクロマトグラフィーおよび10〜40 nmのPall Ultipor Grade DV50ウイルス除去フィルターによる濾過の間、pH3での酢酸処理を1時間行うことによって不活化することができる。
【００４５】
本発明の特定の非限定的な実施形態においては、50 mgのChi-31.1-1を、リン酸緩衝食塩水（PBS）中2 mg/mlの濃度でバイアルに入れる。
【００４６】
5.2. 治療プロトコル
本発明は、単独でまたは組合せで使用される、31.1-Ab同等物および／または31.1共通特異性抗体同等物の、治療を必要とする患者の膵癌治療への使用を提供する。その方法は、治療上有効な投与量の、1以上の31.1-Ab同等物および／または31.1共通特異性抗体同等物を患者に投与することを包含する。治療上有効な投与量は、本明細書では、患者において次のうち1以上を達成する用量、すなわち、患者において検出可能な膵癌細胞の溶解をもたらす；膵臓腫瘍の増殖もしくは侵襲性もしくは大きさの低下を引き起こす；臨床症状の改善をもたらす；および／または生存期間の増加をもたらす用量として定義される。31.1-Ab同等物および／または31.1共通特異性抗体同等物の単回投与量は、約25mgから約1000mgまでの範囲とすることができ、約100mgから250mgまでとすることが好ましいが、限定を意図するものではない。投与量は、患者ごとの基準に基づいて、望ましくない副作用および／または毒性を避けるように調整しうる。31.1-Ab同等物および／または31.1共通特異性抗体同等物は、1〜4週間の間隔で（望ましくは2週間毎に）投与される一連（複数）の単回投与量として投与し、副作用が有害なレベルに達するまで、または、病気が望ましくないレベルに進行するまで、投与することが好適である。31.1-Ab同等物および／または31.1共通特異性抗体同等物は、どのような標準的な投与経路でも投与することができる。望ましくは、患者がその製剤を許容する（すなわち、患者が好ましくないアレルギー反応および／または他の毒性反応を示さない）かどうか調べるために、最初に皮下投与して、ひとたび十分な許容度が示されたならば、静脈内投与することができる。
【００４７】
ある特定の非限定的な例において、本発明に従うプロトコルは下記の通りとすることができる。
無菌手順によって、標準的なバイオテクノロジー技法で作製された「ヒト化」31.1-Ab同等物または31.1共通特異性抗体同等物を、0.22ミクロン低タンパク質フィルターを通して、0.9%塩化ナトリウムを含むガラス製輸液ビンもしくはDEHPを含まない輸液バッグの中に濾過して入れ、最終濃度を0.4mg/mlとする。この輸液を軽く混合する。輸液に濁りが認められたら、投与してはならない。
【００４８】
患者が「ヒト化」31.1-Ab同等物および／または31.1共通特異性抗体同等物による治療に耐えられるかどうかを判定するために、ジフェンヒドラミン25mg（静脈内）、およびパラセタモール650mg（経口）を予め投薬してから、30マイクログラムの31.1-Ab同等物および／または31.1共通特異性抗体同等物を皮下注射する。もしアレルギー毒性がまったく生じないか、グレード1のアレルギー毒性が生じるならば、静脈内処置を行うことにする。もしグレード１のアレルギー毒性が生じたならば、静脈注射に進む前に、その毒性の分解が必要となろう。
【００４９】
上記段落に記載した皮下投与試験に患者が耐えられたならば、2時間かけて25mgの31.1-Ab同等物または31.1共通特異性抗体同等物の第1回注入による治療を行うことができる。ジフェンヒドラミン25mg(静脈内)およびパラセタモール650mg（経口）という形で前投薬を行ってもよい。それから、注射後6時間にわたり、何らかの起こりうる副作用について患者を観察する。患者は注射前に、そして治療後最初の1時間は15分ごと、次の2時間は30分ごと、さらに、その後は注入完了の6時間後まで1時間ごとに、バイタルサイン（生存徴候）でモニターすることができる。
【００５０】
最初の注入に耐えられることが判明したならば、2週間後、この患者は、PBSもしくは他の適当な希釈剤で100ccとした50mgの31.1-Ab同等物または31.1共通特異性抗体同等物の注入を4時間にわたって、上記段落に示したのと同じ臨床プロトコルに従って受けることができる。この第2回の注入も耐えられることが判明したならば、患者はさらに希釈剤100 cc中の100mgの31.1-Ab同等物または31.1共通特異性抗体同等物の注入を4時間にわたり、上記プロトコルを用いて、2週間ごとに受けることができる。その後患者は、不耐性が現れるかまたは病気が悪化するまで、こうした治療を続けることができるが、最長4ヶ月間が望ましい。何らかのグレード3以上の毒性が治療に起因して生じるならば、患者は治療を永久に中止することになる。毒性が治療に関係しないと認められる場合には、患者はその毒性から回復したとき治療を再開することができる。治療中もしくは治療後にグレード2の毒性が生じた場合、注入をやめることが望ましい。グレード0に回復したならば、その時、注入を再開することができる。次回に計画された治療時までに回復が見られなかった場合には、グレード0への回復が生じるまで治療を延期することができる。4週間以内にグレード0への回復が起こらない場合には、治療は永久に中止されることになる。グレード2以上の何らかのアレルギー反応が生じた場合には、治療を中止し、それ以上の注入を行わないことが望ましい。
【００５１】
本発明の特定の非限定的な実施形態において、下記は治療に適した患者を判定する基準として役立つと考えられる：
a)患者は、組織学的に確認された再発性もしくは転移性の膵臓腺癌に罹患している可能性があり、その腫瘍が、使用する予定の31.1-Ab同等物または31.1共通特異性抗体同等物と反応する；
b)転移性膵癌のための標準的な治療計画による患者の治療が失敗したと考えられる；
c)患者の病気が下記のうち1以上によって測定可能である：
i) 理学的検査；
ii) コンピューター断層撮影法または他の放射線造影法；
iii) CEAレベル；および／または
iv) Ca 19-9レベル；
d)患者が18歳以上である；
e)患者が0、1または2のWHO機能状態(WHO performance status)を示す；
f)患者の予後の見通しから、推定余命が少なくとも12週間と考えられる；
g)患者の血液学的検査が次の値を示す：
i) WBC＞3,000 ;
ii) HGB＞10 ;および
iii) 血小板＞100,000 ;
h)臨床化学検査値が以下の通りである：
クレアチニン、ビリルビン、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アラニントランスアミナーゼ、アルカリホスファターゼ、およびビリルビンがすべて正常値の上限の2倍以下である；および／または
i)患者に、度重なる採血に適した末梢静脈アクセスが確保されている。
【００５２】
本発明の特定の非限定的な実施形態において、下記は治療に適さない患者を除外するための判断基準となると考えられる：
a)前の化学療法から（あるいは、ニトロソ尿素またはマイトマイシンCの場合は6週間）、生物学的応答調節物質による治療から、または放射線療法から4週間以上経過していない；
b)患者が現在ステロイド療法を受けている；
c)患者が妊娠している（この研究に関わる男女には、妊娠可能な場合、有効な避妊の実施を勧める）；
d)患者が授乳中の女性である；
e)患者が、悪性ではないが衰弱させるような合併症、例えば活動性感染症または悪性腫瘍の急性介入性合併症に罹っている；
f)中枢神経系の関与がある；
g)患者が以前に骨髄移植もしくは他の臓器移植を受けたことがある；
h)患者に別の悪性腫瘍の既往症がある、ただし適切に治療された黒色腫以外の皮膚癌またはin situ子宮頸癌を除く；
i)患者が以前にマウスモノクローナルまたはポリクローナル抗体の投与を受けたことがある；および／または
j)患者がHIV陽性であると判明している。
【００５３】
この研究過程において、有害反応の非限定的な例として、息切れ、低血圧、チアノーゼ、発疹、気管支痙攣、悪寒、硬直、背痛、発熱、チアノーゼ、悪心、嘔吐、動悸またはなんらかの他の有害反応を挙げることができる。
【００５４】
本発明の非限定的な実施形態においては、下記の臨床検査を行って、上記のプロトコルで治療を受けることになっている患者を評価することが望ましい。血液学的検査に関しては、全血球数、白血球数および血小板数を各注入の前、および治療中と、最後の注入から4週間まで毎週入手する。臨床生化学検査に関しては、ブドウ糖、ナトリウム、カリウム、炭酸水素イオン、塩素、血液尿素窒素、クレアチニン、尿酸、カルシウム、無機リン酸、総タンパク量、アルブミン、乳酸脱水素酵素、アスパラギン酸トランスアミナーゼ、アラニントランスアミナーゼおよびアルカリホスファターゼを測定する完全な生化学パネルを治療期間中および最後の注入から4週間まで毎週入手する。特別な臨床検査に関しては、10ccの血液から得られた血清試料を、各回の注入の前および2分以内に、最初の注入終了後15分、30分、60分、2，4，24および72時間の時点で、その後各回の注入前に、さらに、最後の治療後4週間経過するまで2週間ごとに採取し、投与された31.1-Ab同等物および／または31.1共通特異性抗体同等物を検出するために処理することができる。この血清試料を用いて、次に、ADCC、抗体濃度、および投与された抗体同等物に対するヒト抗体の存在を調べることができる。登録時および各回の注入の前に、さらに最後の注入の4週間後に、尿検査を実施することができ、何らかの異常のある検体については顕微鏡検査を実施する。
【００５５】
本発明の様々な実施形態において、次のような安全性評価を行うことが望ましい。各回の注入では、患者の体温、脈拍、および血圧を含めたバイタルサインを各注入の前後に入手する。脈拍および血圧は、注入の最初の1時間は15分ごとに、その後2時間は30分ごとに、続いて注入完了後6時間までは1時間ごとに記録する。注入終了の6時間後まで、もしくはバイタルサインが基底値に戻るまで、患者を観察し、バイタルサインをモニターすることができる。
【００５６】
治療に対する患者の応答の初期評価および後続の評価は下記のように行うことができる。腫瘍の計測は、理学的検査および／または標準もしくは特別の放射線医学検査（例えば胸部X線）、コンピューター断層撮影、磁気共鳴画像診断、または超音波によって実施することができる。2以上の病変が存在する場合、代表的な病変を測定すべきである。その主要な病変の最長の垂直方向測定値を治療前および8週間ごとに記録することができる。Ca 19.9のレベルを定期的に、例えば毎月モニターしてもよい。
【００５７】
治療を受ける患者それぞれについて、書面によるインフォームドコンセントを得ることが望ましい。それぞれの患者は、書面での同意にサインする前に、その治療、その治療の潜在的危険性および利点、ならびに受けることのできる代替の治療法に関する口頭での説明を受けるべきである。
【００５８】
治療の過程で、必要に応じて、血液製剤、抗生物質、制吐剤、鎮痛剤、もしくは同時に現れる病状の安定のための他の薬剤を投与することができる。
【００５９】
患者において、進行性疾患の徴候がある場合、重大なまたは予想外の副作用が生じた場合、または他の医学上妥当な理由がある場合、治療を中止することができる。
【００６０】
本明細書に記載した治療用途に加えて、31.1抗体およびその機能的同等物を、被験者において膵癌の診断に用いることができる。本発明の診断法は、31.1抗体が膵癌細胞には発現するが正常細胞には発現しない抗原と選択的に結合するという発見に基づいている。
【００６１】
本発明にしたがって、被験者から得られた試料中のモノクローナル抗体31.1の反応性レベルの測定値を、膵癌のような疾病の診断に利用することができる。被験者由来の試料中のモノクローナル抗体31.1の反応性の検出は、多数の方法のいずれによっても行うことができる。好ましい診断方法には、例えば、31.1反応性抗原を31.1モノクローナル抗体との相互作用によって検出するイムノアッセイが含まれる。本発明の実施に有用なイムノアッセイとしては、ほんの数例を挙げると、ウェスタンブロット、ラジオイムノアッセイ、ELISA（酵素免疫測定法）、「サンドイッチ」イムノアッセイ、免疫沈降法、沈降素(precipitin)反応、ゲル拡散沈降反応、免疫拡散法、凝集アッセイ、補体結合アッセイ、免疫放射定量測定法、蛍光免疫測定法、プロテインAイムノアッセイのような技法によるアッセイ系を包含するが、それらに限定されない。
【００６２】
膵臓組織もしくは他の生体組織のような生物学的試料を、特定の癌またはその危険性が疑われる被験者から採取する。全組織の一部または細胞を、当業者に公知の様々な可溶化カクテルのうちいずれかを用いて可溶化する。例えば、（リッター当たり）8M尿素、20mlのNonidet P-40界面活性剤、20mlの両性電解質（pH3.5〜10）、20mlの2-メルカプトエタノール、および0.2mMのフッ化フェニルメチルスルホニル（PMSF）を蒸留脱イオン水に溶解した細胞溶解バッファーの添加によって、組織を可溶化することができる。
【００６３】
31.1反応性抗原の発現を検出するためのイムノアッセイは、典型的には、被験者から得られた組織試料のような生体試料と31.1モノクローナル抗体とを、免疫特異的な抗原-抗体結合反応が起こりうる条件下で接触させること、および抗体による免疫特異的結合の量を検出もしくは測定することを含んでなる。特定の態様においては、このような抗体の結合を用いて、例えば、31.1反応性抗原の存在および生産増加を検出することができ、この場合、該抗原の検出が疾病状態の指標となる。
【実施例】
【００６４】
6. 実施例： pRc/CMV ベクターの調製
pRc/CMVベクターは、図1A〜Fに示した一連のプラスミドを用いて作製した。Chi31.1の重鎖および軽鎖を、TOPO(トポイソメラーゼI)クローニングによって、pCRベクター(図1A)にクローニングした。PCRによって軽鎖および重鎖配列をpCRベクターに挿入するために用いた配列は次の通りである：
a)Chi31.1-1軽鎖をコードする領域をBamH1/XbaI挿入部位に挿入する場合：
i) Chi31.1-LcBamH1(S):
5’-ATA GGA TCC ATG AAG TCA CAG ACC CAG GTC TTC G-3’
ii) Chi31.1-LcXbaI(A):
5’-TTT CTA GAC TAA CAC TCT CCC CTG TTG AAG C-3’
b)Chi31.1-1重鎖をコードする領域をEcoRI/NotI挿入部位に挿入する場合：
i) Chi31.1-HcEcoRI(S):
5’-ATA GAA TTC ATG GCT TGG GTG TGG ACC TTG CT-3’
ii) Chi31.1-HcNotI(A):
5’-TTG CGG CCG CTC ATT TAC CCG GAG-3’
【００６５】
次に、これらをpCRベクターからpDCM-dhfrベクターにクローニングした結果、前記軽鎖コード領域はサイトメガロウイルス（CMV）プロモーターの制御下でBamHi/XbaI部位に挿入され、前記重鎖コード領域はもう一つのCMVプロモーターエレメントの制御下でEcoRI/NotI部位に挿入された（図1F）。
【００６６】
pDCM-dhfrベクターは、図1B〜Eに示した一連のステップを用いて作製した。いくつかの関連成分を用いた一連のベクター構築は、Ryuら、1996, Hum. Antibod. Hybridomas 7:113-122 (pRc/CMVベクター（Invitrogen）に基づく；例えば、Ryuらの115頁および図4を参照); Jinら、1995, Virus Res. 38: 269; およびLeeら、1999, Molec. Immunol. 36:61-71 (例えば、この文献の図2を参照) に記載されている。
【００６７】
基本的には、pcDNA3ベクター（Invitrogen）（図1B）をpDCMベクター（図1C）の基礎として使用し、制限酵素の対で消化した後再連結することを並行して用いて、特定の切断部位を破壊しかつベクター内のCMVプロモーター配列の下流にある他の部位を保持させた。具体的には、図1Cに示すように、pcDNA3を最初にHindIIIおよびBamHIで消化し、続いて再連結し、その後XhoIおよびApaIで消化してから再連結し、結果的にプロモーターの下流のBstXI、EcoRI、EcoRV、BstXIおよびNotI部位が保存された。その後、BsmIによる切断によってアンピシリンおよびネオマイシン耐性遺伝子間でこの分子を直線化した（成分1）。並行して、pcDNA3をBstXIおよびNotIで消化後、小断片を分離して再連結し、BstXI、EcoRI、EcoRV、BstXIおよびNotI部位を除去し、HindIII、KpnI、BamHI、XhoI、XbaIおよびApaI部位をそのまま残した。PvuIIおよびNruIによる切断によって、CMVプロモーター、保存された部位、およびBGHpAを含む断片が生じた（成分2）。成分2を成分1の末端間に挿入すると、結果的にpDCMが得られたが、これは、2つのそれぞれのCMVプロモーターエレメントの下流に遺伝子のための2つの異なる挿入部位を有している。図1Eに示すように、KC-dhfr由来のジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子（dhfr）を次に、pDCMに挿入して（Leeら、1999, Molec. Immunol. 36:61-71を参照）、pDCM-dhfrを作製することができる。あるいはまた、図1Dに示すように、KC-dhfrに由来するdhfr遺伝子をpcDNA3に組み込んで、pCdhfrを作製することができるが、これをさらに図1Cに示す方法と同様の方法によって操作して、2つのCMVプロモーター／挿入部位カセットを作製することができる。
【００６８】
Chi31.1-1重鎖および軽鎖をコードする配列を、次に、pCRベクターからpDCM-dhfrにクローニングしてpRc/CMVを作製した。これをCHO dhfr-細胞にトランスフェクションし、その後発現されたキメラ免疫グロブリン分子を標準的な技法によって回収する。
【００６９】
7. 実施例： Chi31.1-1 に対するヒトの免疫応答
31.1キメラ抗体が免疫応答を惹起できるかどうか判定するために、Chi31.1-1キメラモノクローナル抗体の投与を受けたヒト被験者から血漿を採取した。この患者において、キメラ抗体に対する免疫応答の存在を、次のようなアッセイによって検査した。
【００７０】
96ウェルマイクロタイタープレートにChi31.1-1抗体を、ミリリッター当たり10マイクログラムとした溶液を使用して、ウェル当たり100マイクロリッターでコーティングした。Chi31.1-1の調製物をビオチン化した。次に、対照血漿または患者の血漿（50マイクロリッター）のいずれかをウェルに入れ、50マイクロリッターのビオチン化Chi31.1-1を添加した。さらに、そのプレートを90分間37℃でインキュベートした後、ウェルを洗浄し、ストレプトアビジン-西洋ワサビペルオキシダーゼコンジュゲートを添加した。次にウェルを3回洗浄した。TMB基質（3,3’,5,5’テトラメチルベンジジン）を加えて、プレートを20分間インキュベートした。停止溶液を添加し、反応した基質の量を測定した。
【００７１】
その結果を表Cに示すが、血漿ミリリッター当たりの結合Chi31.1-1をナノグラムで示す。処理前の基底値の2倍を超える結果が陽性とみなされる。健康で正常な3試料から得られた非特異的な基底結合値は、ミリリッター当たり4プラス・マイナス2ナノグラムであることがわかった。標準は、ヤギ抗ヒトIgG1をコーティングしたウェルを様々な濃度のビオチン化Chi31.1-1モノクローナル抗体とともに使用することによって測定した。
【００７２】
表 C.
8. 実施例： CHO Chi31.1 抗体の ADCC 活性
以下の節では、CHO Chi31.1モノクローナル抗体が腫瘍の破壊と関連した生物活性を有することを実証する実験について記載する。具体的には、この抗体が抗体依存性細胞傷害活性(ADCC)を有することを明らかにした。
【００７４】
4時間111In放出アッセイを用いてADCC活性を測定した。標的細胞は大腸腫瘍細胞系SW1643および膵癌細胞系PANC-1とした。対照抗体としてUPC-10を使用した。標的細胞を50μCiの111In-オキシキノリンで室温にて15分間標識した。50μl中の標的細胞（1×104）を96ウェルプレートに添加した。エフェクターと標的細胞の比は100:1、50:1および25:1としてCHO 31.1(1mg/ウェル)の存在下でアッセイした。プレートを37℃にて4時間、5%CO2含有加湿環境でインキュベートした。Skatron Harvesterフレームを用いるガンマ線計数のために上清を採取した。実験は3回反復して行った。特異的な細胞溶解は下記の式を用いて算出された：
図6Aおよび6Bに示すように、CHO31.1抗体は標的細胞に対する抗体依存性細胞傷害活性を媒介することができるが、対照UPC-10抗体はできなかった。
【００７６】
様々な文献が本明細書に引用されているが、その内容はその全体を参考として本明細書に含めるものとする。
【図面の簡単な説明】
【００７７】
【図１Ａ】Chi31.1-1軽鎖および重鎖遺伝子をプラスミドpDCM-dhfr(図1F)に挿入することによってpRc/CMV 31.1ベクターを構築するために使用したpCRベクターを示す。
【図１Ｂ】Chi31.1-1軽鎖および重鎖遺伝子をプラスミドpDCM-dhfr(図1F)に挿入することによってpRc/CMV 31.1ベクターを構築するために使用したpcDNA3ベクターを示す。
【図１Ｃ】Chi31.1-1軽鎖および重鎖遺伝子をプラスミドpDCM-dhfr(図1F)に挿入することによってpRc/CMV 31.1ベクターを構築するために使用したpDCMベクターを示す。
【図１Ｄ】Chi31.1-1軽鎖および重鎖遺伝子をプラスミドpDCM-dhfr(図1F)に挿入することによってpRc/CMV 31.1ベクターを構築するために使用したpCdhfrベクターを示す。
【図１Ｅ】Chi31.1-1軽鎖および重鎖遺伝子をプラスミドpDCM-dhfr(図1F)に挿入することによってpRc/CMV 31.1ベクターを構築するために使用したpDCM-dhfrベクターを示す。
【図１Ｆ】Chi31.1-1軽鎖および重鎖遺伝子をプラスミドpDCM-dhfr(図1F)に挿入することによってpRc/CMV 31.1ベクターを構築するために使用したpDCM-dhfrベクターを示す。
【図２】31.1軽鎖可変領域の核酸配列（二本鎖）および推定アミノ酸配列を示す。
【図３】図2に示した軽鎖可変領域の核酸配列を切断しない酵素の一覧表である。
【図４】31.1重鎖可変領域の核酸配列（二本鎖）および推定アミノ酸配列を示す。
【図５】図4に示した重鎖可変領域の核酸配列を切断しない酵素の一覧表である。
【図６Ａ】抗体依存性細胞傷害活性（ADCC）アッセイを行って、CHO chi31.1抗体の標的細胞SW1643およびPANC-1に対するエフェクター機能を調べた。31.1抗体の存在下では細胞溶解が起こることを示したグラフである。
【図６Ｂ】細胞溶解が対照抗体の存在下では起こらないことを示したグラフである。
Claims (19)
- 図2もしくは図4のヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸分子。
- 図2もしくは図4に示されるアミノ酸配列をコードするヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸分子。
- (i)下記のストリンジェントなハイブリダイゼーション条件、すなわち、65℃にて0.5M NaHPO4、7%ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)、1mM EDTA、および68℃にて0.1xSSC/0.1% SDSでの洗浄の条件下で、図2もしくは図4のヌクレオチド配列と結合し、かつ(ii)キメラ31.1モノクローナル抗体と同じ免疫特異性でもって結合することが可能な軽鎖および重鎖可変領域をコードする、ヌクレオチド配列を含んでなる、単離された核酸分子。
- 図2のアミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
- 図4のアミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
- 請求項1または２に記載のヌクレオチド配列とストリンジェントな条件下でハイブリダイズし、かつ機能的に同等な遺伝子産物をコードするヌクレオチド配列によってコードされるアミノ酸配列を含んでなる、単離されたポリペプチド。
- 軽鎖可変領域タンパク質ではない第2のタンパク質のアミノ酸配列に融合された、図2に示すアミノ酸配列もしくはその断片を含んでなるキメラタンパク質。
- 重鎖可変領域タンパク質ではない第2のタンパク質のアミノ酸配列に融合された、図4に示すアミノ酸配列もしくはその断片を含んでなるキメラタンパク質。
- 第2のタンパク質が免疫グロブリン定常領域を含んでなる、請求項7または8に記載のキメラタンパク質。
- 免疫グロブリン定常領域がヒト免疫グロブリン定常領域である、請求項9に記載のキメラタンパク質。
- 請求項1〜3のいずれか１つに記載の核酸を含有する組換えベクター。
- 請求項1〜3のいずれか１つに記載の核酸を含有する組換え発現ベクター。
- 請求項1〜3のいずれか１つに記載の核酸を含有する組換え細胞。
- 請求項11または12に記載のベクターを含有する組換え細胞。
- 請求項１、２または３に記載の核酸を含有する組換え細胞を、コードされた軽鎖および重鎖可変領域が該細胞によって発現されるように、増殖させること、および発現された抗体を回収すること、を含んでなる、31.1モノクローナル抗体と同一の免疫反応性を有するキメラ抗体を作製する方法。
- 試料中の、モノクローナル抗体31.1またはその機能的同等物と結合することが可能な膵癌関連抗原を検出するためのイムノアッセイ法であって、
(a)前記試料をモノクローナル抗体31.1もしくはその同等物と接触させること、および
(b)抗体の結合を検出することによって前記抗原を検出すること、
を含んでなる方法。 - 被験者において膵癌抗原を検出するためのイメージング法であって、
(a)標識された31.1抗体もしくはその機能的同等物を接触させること、および
(b)標識された抗体を検出すること、
を含んでなり、ここで前記標識抗体の検出が膵癌抗原の存在を示す、上記方法。 - 被験者において膵癌を診断する方法であって、
(a)膵癌であることが疑われる患者から検体を切除すること、
(b)その検体を31.1モノクローナル抗体もしくはその機能的同等物と接触させること、
(c)その検体を免疫組織化学的染色によって染色すること、および
(d)抗原-抗体複合体の存在を検出すること、
を含んでなり、ここで抗原-抗体複合体の存在が膵癌の存在を示す、上記方法。 - 膵癌関連抗原を有する細胞を死滅させる方法であって、前記細胞に有効量の31.1モノクローナル抗体もしくはその機能的同等物を送達することを含んでなる方法。
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US27628401P | 2001-03-15 | 2001-03-15 | |
| PCT/US2002/009193 WO2002074251A2 (en) | 2001-03-15 | 2002-03-15 | Monoclonal antibody therapy for pancreas cancer |
Publications (1)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JP2004537976A true JP2004537976A (ja) | 2004-12-24 |
Family
ID=23056011
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP2002572962A Pending JP2004537976A (ja) | 2001-03-15 | 2002-03-15 | 膵癌のモノクローナル抗体治療 |
Country Status (9)
| Country | Link |
|---|---|
| US (6) | US20060228363A1 (ja) |
| EP (3) | EP1411962B1 (ja) |
| JP (1) | JP2004537976A (ja) |
| AT (1) | ATE495751T1 (ja) |
| CA (1) | CA2441042A1 (ja) |
| DE (1) | DE60238987D1 (ja) |
| DK (1) | DK1411962T3 (ja) |
| ES (2) | ES2619313T3 (ja) |
| WO (1) | WO2002074251A2 (ja) |
Families Citing this family (16)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CA2421070A1 (en) | 2000-09-01 | 2002-03-14 | International Bioimmune Systems, Inc. | The identification and development of specific monoclonal antibodies to squamous cell carcinoma |
| EP1411962B1 (en) | 2001-03-15 | 2011-01-19 | Neogenix Oncology, Inc. | Monoclonal antibody therapy for pancreas cancer |
| CA2571743A1 (en) * | 2004-06-30 | 2006-01-12 | International Bioimmune Systems, Inc. | Humanized monoclonal antibody 31.1 as an anticancer agent |
| KR101188117B1 (ko) | 2005-03-31 | 2012-10-09 | 바이오메딕스 인코포레이티드 | 항ｃｄ20 모노클로날 항체 |
| AU2009291882A1 (en) * | 2008-09-09 | 2010-03-18 | Oregon Health & Science University | Monoclonal antibodies specific for pancreatic neoplasia cells |
| US20130189268A1 (en) | 2010-06-22 | 2013-07-25 | Precision Biologics, Inc. | Colon and pancreas cancer specific antigens and antibodies |
| CA2896723C (en) | 2012-12-28 | 2024-02-13 | Precision Biologics, Inc. | Humanized monoclonal antibodies and methods of use for the diagnosis and treatment of colon and pancreas cancer |
| US10035009B2 (en) | 2013-04-15 | 2018-07-31 | The Board Of Trustees Of The Leland Stanford Junior University | Systems and methods for treating pancreatic cancer |
| KR102131371B1 (ko) * | 2013-07-02 | 2020-07-08 | 삼성전자주식회사 | Ang-2 특이적 항체 및 그의 용도 |
| CA3189270A1 (en) * | 2013-10-01 | 2015-04-09 | Toray Industries, Inc. | Method for detecting pancreatic tumor, antibodies, and kit for the detection of pancreatic tumor |
| US11279768B1 (en) | 2015-04-03 | 2022-03-22 | Precision Biologics, Inc. | Anti-cancer antibodies, combination therapies, and uses thereof |
| US10617262B2 (en) | 2016-09-28 | 2020-04-14 | San Jamar, Inc. | Cutting board systems |
| US10617261B2 (en) | 2016-09-28 | 2020-04-14 | San Jamar, Inc. | Cutting board systems |
| US10856699B2 (en) | 2017-05-10 | 2020-12-08 | Scott Jackson Collins | Cutting board |
| USD858224S1 (en) | 2018-05-02 | 2019-09-03 | Scott Jackson Collins | Cutting board |
| USD857468S1 (en) | 2018-05-02 | 2019-08-27 | San Jamar, Inc. | Cutting board |
Family Cites Families (28)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US4376110A (en) * | 1980-08-04 | 1983-03-08 | Hybritech, Incorporated | Immunometric assays using monoclonal antibodies |
| US4713352A (en) * | 1981-08-31 | 1987-12-15 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Reseach | Monoclonal antibody panel for early diagnosis and therapy of renal carcinoma |
| US4404350A (en) | 1982-07-07 | 1983-09-13 | General Electric Company | Silicone-imide copolymers and method for making |
| WO1984000375A1 (fr) | 1982-07-14 | 1984-02-02 | Battelle Development Corp | Procede de production de revetements de resines reticulees sur des substrats |
| US4579827A (en) * | 1983-03-11 | 1986-04-01 | Sloan-Kettering Institute For Cancer Research | Monoclonal antibodies to human gastrointestinal cancers and hybridoma method of production of the monoclonal antibodies |
| US4816567A (en) * | 1983-04-08 | 1989-03-28 | Genentech, Inc. | Recombinant immunoglobin preparations |
| US4753894A (en) * | 1984-02-08 | 1988-06-28 | Cetus Corporation | Monoclonal anti-human breast cancer antibodies |
| ZA858371B (en) * | 1984-11-02 | 1987-03-25 | Oncogen | Monoclonal antibodies for human non-small cell lung carcinomas |
| US5618920A (en) * | 1985-11-01 | 1997-04-08 | Xoma Corporation | Modular assembly of antibody genes, antibodies prepared thereby and use |
| HU196394B (en) | 1986-06-27 | 1988-11-28 | Richter Gedeon Vegyeszet | Process for preparing 2-halogenated ergoline derivatives |
| US4946778A (en) * | 1987-09-21 | 1990-08-07 | Genex Corporation | Single polypeptide chain binding molecules |
| DE3854821T2 (de) * | 1987-02-19 | 1996-05-23 | Scripps Clinic Res | Zellenoberflachenmarker für humanen Pankreaskrebszellen |
| US5212085A (en) * | 1987-12-09 | 1993-05-18 | The General Hospital Corporation | Sf-25 colon adenocarcinoma antigen, and antibodies with recognize this antigen |
| US5688657A (en) * | 1988-03-31 | 1997-11-18 | International Bio-Immune Systems, Inc. | Monoclonal antibodies against human colon carcinoma-associated antigens and uses therefor |
| US5530101A (en) * | 1988-12-28 | 1996-06-25 | Protein Design Labs, Inc. | Humanized immunoglobulins |
| GB8928874D0 (en) * | 1989-12-21 | 1990-02-28 | Celltech Ltd | Humanised antibodies |
| AU639059B2 (en) | 1989-12-22 | 1993-07-15 | E.I. Du Pont De Nemours And Company | Site-specific recombination of dna in plant cells |
| CA2110799A1 (en) * | 1991-06-14 | 1992-12-23 | Arnold H. Horwitz | Microbially-produced antibody fragments and their conjugates |
| SE9102074D0 (sv) * | 1991-07-03 | 1991-07-03 | Kabi Pharmacia Ab | Tomour antigen specific antibody |
| JPH05317082A (ja) * | 1991-08-06 | 1993-12-03 | Toray Ind Inc | モノクローナル抗体およびその用途 |
| WO1995003828A1 (en) * | 1993-08-02 | 1995-02-09 | Houston Biotechnology Incorporated | Single-chain immunotoxin compositions and methods for preventing secondary cataracts |
| US5665848A (en) * | 1996-05-20 | 1997-09-09 | Dow Corning Corporation | Crosslinkers for silazane polymers |
| US6541212B2 (en) * | 1997-03-10 | 2003-04-01 | The Regents Of The University Of California | Methods for detecting prostate stem cell antigen protein |
| US6884879B1 (en) * | 1997-04-07 | 2005-04-26 | Genentech, Inc. | Anti-VEGF antibodies |
| FR2813427B1 (fr) | 2000-08-25 | 2002-11-29 | St Microelectronics Sa | Circuit de commande d'une memoire dram |
| EP1411962B1 (en) * | 2001-03-15 | 2011-01-19 | Neogenix Oncology, Inc. | Monoclonal antibody therapy for pancreas cancer |
| ATE429233T1 (de) | 2001-06-29 | 2009-05-15 | Glykos Finland Oy | Verwendung mindestens einer glycoinhibitor- substanz gegen infektionskrankheiten |
| KR100466197B1 (ko) | 2002-07-18 | 2005-01-13 | 주식회사 하이닉스반도체 | 플래시 메모리 셀 및 그 제조방법 |
-
2002
- 2002-03-15 EP EP20020726672 patent/EP1411962B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-15 WO PCT/US2002/009193 patent/WO2002074251A2/en active Application Filing
- 2002-03-15 EP EP10177880.1A patent/EP2295064B1/en not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-15 ES ES10177880.1T patent/ES2619313T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-15 AT AT02726672T patent/ATE495751T1/de not_active IP Right Cessation
- 2002-03-15 ES ES02726672T patent/ES2358977T3/es not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-15 EP EP16204333.5A patent/EP3202790A1/en not_active Withdrawn
- 2002-03-15 DK DK02726672T patent/DK1411962T3/da active
- 2002-03-15 CA CA002441042A patent/CA2441042A1/en not_active Abandoned
- 2002-03-15 DE DE60238987T patent/DE60238987D1/de not_active Expired - Lifetime
- 2002-03-15 JP JP2002572962A patent/JP2004537976A/ja active Pending
-
2005
- 2005-09-22 US US11/234,645 patent/US20060228363A1/en not_active Abandoned
-
2011
- 2011-01-21 US US13/011,485 patent/US8470326B2/en not_active Expired - Lifetime
- 2011-01-21 US US13/011,631 patent/US9034588B2/en active Active
-
2014
- 2014-10-08 US US14/509,428 patent/US9592290B2/en not_active Expired - Lifetime
-
2017
- 2017-01-27 US US15/417,326 patent/US20170210816A1/en not_active Abandoned
-
2018
- 2018-10-17 US US16/162,731 patent/US11001641B2/en not_active Expired - Lifetime
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| DK1411962T3 (da) | 2011-04-04 |
| US9592290B2 (en) | 2017-03-14 |
| EP2295064A1 (en) | 2011-03-16 |
| EP1411962B1 (en) | 2011-01-19 |
| EP1411962A4 (en) | 2005-02-02 |
| US20060228363A1 (en) | 2006-10-12 |
| EP1411962A2 (en) | 2004-04-28 |
| EP3202790A1 (en) | 2017-08-09 |
| WO2002074251A3 (en) | 2004-02-19 |
| ES2619313T3 (es) | 2017-06-26 |
| WO2002074251A2 (en) | 2002-09-26 |
| DE60238987D1 (de) | 2011-03-03 |
| US9034588B2 (en) | 2015-05-19 |
| WO2002074251A9 (en) | 2004-05-06 |
| US20120034227A1 (en) | 2012-02-09 |
| EP2295064B1 (en) | 2017-02-22 |
| US20110165599A1 (en) | 2011-07-07 |
| US20190100601A1 (en) | 2019-04-04 |
| CA2441042A1 (en) | 2002-09-26 |
| ES2358977T3 (es) | 2011-05-17 |
| ATE495751T1 (de) | 2011-02-15 |
| US8470326B2 (en) | 2013-06-25 |
| US20170210816A1 (en) | 2017-07-27 |
| US11001641B2 (en) | 2021-05-11 |
| US20150104464A1 (en) | 2015-04-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US11001641B2 (en) | Monoclonal antibody therapy for pancreas cancer | |
| KR101386376B1 (ko) | 인간 ｃｄ22 특이성 항체 및 이들의 치료학적, 진단학적 사용 | |
| EP0753065B1 (en) | Antibodies against e-selectin | |
| JP4773097B2 (ja) | ヒトインスリン受容体を介する医薬品の送達 | |
| EP0842948B1 (en) | ANTIFas LIGAND ANTIBODIES AND ASSAY METHOD BY USING THE SAME | |
| JPH02503867A (ja) | Ｉｌ‐２レセプター特異的キメラ抗体 | |
| KR20010043470A (ko) | Ｃｄ23에 대한 항체, 이의 유도체 및 이들의 치료적 용도 | |
| NZ329145A (en) | Chimeric superantigens; a method of treating cancers, viral infections, parasitic infestations and autoimmune diseases | |
| EP2567982A1 (en) | Antibody against carcinoembryonic antigen and uses thereof | |
| CN116178547A (zh) | Cd3抗原结合片段及其应用 | |
| OA10149A (en) | Vascular endothelial cell growth factor antagonists | |
| CN112794911B (zh) | 人源化抗叶酸受体1抗体及其应用 | |
| AU2002257089A1 (en) | Monoclonal antibody therapy for pancreas cancer | |
| WO2024007129A1 (zh) | 人源化的b7h3抗体或其抗原结合片段 | |
| WO2022142272A1 (zh) | Cldn18.2抗体及其应用 | |
| JPH06503956A (ja) | 腫瘍細胞に対する標的決定ＩｇＥエフェクター細胞 | |
| WO2023148707A1 (en) | Humanized anti quiescin suefhydrye oxidase 1 (qsox1) antibodies and uses thereof | |
| CN117430711A (zh) | 用于治疗肝细胞性肝癌的双特异性融合蛋白及其应用 | |
| CN115925967A (zh) | 双特异性多功能融合多肽 | |
| WO2014142356A1 (ja) | 強皮症治療剤 | |
| BRPI0309730B1 (pt) | Molécula de anticorpo possuindo especificidade para cd22 humana, sequência de dna, vetor de expressão ou clonagem, célula hospedeira, uso da molécula de anticorpo ou da sequência de dna, composição diagnóstica ou terapêutica, processo para a produção de uma molécula de anticorpo, processo para a preparação de uma composição diagnóstica ou terapêutica |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050314 |
|
| A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20050314 |
|
| A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20071127 |
|
| A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20080221 |
|
| A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20080228 |
|
| A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20080715 |