KR101188117B1 - 항ｃｄ20 모노클로날 항체 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 세포 표면의 CD20 항원에 결합함으로써 특이적인 생물학적 반응을 유도하는 모노클로날 항체에 관한 것이다. CD20 항원의 세포 외부 에피토프에 대하여 강한 결합 친화성을 갖고 또한 세포 증식 저해 활성 등의 생물학적 활성을 갖는 모노클로날 항체를 클로닝한다. 또한 당해 모노클로날 항체를 키메라화 또는 사람화함으로써 B세포가 관여하는 질환에 대한 치료제를 개발한다.
CD20, 모노클로날 항체, 항CD20 항체

Description

항ＣＤ20 모노클로날 항체 {Anti-CD-20 monoclonal antibody}
본 발명은 사람 CD20 항원에 대한 모노클로날 항체에 관한 것이며, 또한 유전자 재조합에 의한 키메라 항CD20 모노클로날 항체 및 사람화 항CD20 모노클로날 항체, 또는 하나 이상의 이들 항체를 유효성분으로 하는 B세포성 종양 또는 면역질환에 대한 치료제에 관한 것이다.
CD20 항원을 인식하는 모노클로날 항체로서는 B1, 2B8 (키메라 항체명은 rituximab), 1F5, 2H7 등이 알려져 있다. 그 중에서도, 제조원 [미국 IDEC Pharmaceuticals Corporation]에 의해 개발된 키메라 항CD20 모노클로날 항체인 리툭시마브(rituximab)는 저악성도(低惡性度) 비-호지킨 림프종(NHL)의 표준 치료제로서 확립되어 있는 것 외에, B세포가 관여하는 많은 면역질환에 대하여 치료 효과가 있다는 것이 분명해졌다. 예를 들면, 만성 림프성 백혈병 등의 악성 종양 외에 자가면역 용혈성 빈혈증, 특발성 혈소판 감소성 자반증 등의 병원성 자가 항체가 관여하고 있다고 생각되는 자가면역질환, 만성 류머티즘성 관절염이나 다발성 경화증과 같은 염증성 질환에 대하여 효과적이다 (비특허문헌 14 내지 17).
CD20은 B림프 세포 표면에 발현하고 있는 분자로, 말초혈, 비장, 편도(扁桃), 골수 중의 정상 B세포 뿐만 아니라 대부분의 악성 종양 B세포에 발현되는 것으로 보인다. 이 분자는 297개의 아미노산으로 이루어지고, 세포막을 4회 관통하여 C말단, N말단의 양쪽을 세포 내에 갖고, 3회째와 4회째 막 관통 도메인 사이에 당쇄를 함유하지 않는 43개의 아미노산 잔기로 이루어지는 세포 외부에 노출된 유일한 루프를 갖는다 (비특허문헌 1, 9). CD20분자는 통상 4량체로서 존재하고, 다른 소수의 성분과 헤테로 복합체를 형성하고 있는 것으로 생각되고 있다 (비특허문헌 18). CD20 단백질은 세포 외부로의 분비나 절단이 없는 것에 추가로, 항체 결합에 의해 세포내로 거의 수용되지 않으므로, 표적 세포에 대한 항체의 세포 독성 메커니즘이 효과적으로 작용할 것으로 기대할 수 있다 (비특허문헌 1 내지 3).
분자 크기가 작음에도 불구하고, CD20은 세포 외부에서의 복합체로서의 발현형태의 영향에 의해 다양한 에피토프를 갖고, 이것에 결합하는 항체는 여러가지 상이한 생물학적 반응을 매개한다. 예를 들면, B세포 수용체의 하향조절, MHC Ⅱ형 항원이나 접착분자의 발현 증가, 과도한-가교-결합하에서의 Ca2 + 방출 활성화, 림프 세포의 기능 관련의 항원 1 비의존성 동형 접착의 저해, 아폽토시스 유도 또는 그 반대의 세포증식 촉진 등의 활성이 크게 다르다 (비특허문헌 4 내지 13). 대표적 항CD20 항체인 리툭시마브, B1, 1F5, 2H7에서도, 그 특성 및 생물학적 기능은 다르므로, CD20에 결합하는 모노클로날 항체만으로는 이의 생물학적 특성을 특정할 수 없다.
CD20의 세포외 도메인을 구성하는 분자는 불용성이다. 세포 용해물 유래 또 는 유전자 재조합 단백으로서의 CD20분자는 계면활성제 또는 강알칼리를 사용하여 가용화시킬 수 있지만, 이러한 처리 조건하에서는 고유 입체 구조를 유지하는 것은 어렵다. 이 때문에, 항체를 수득하기 위한 면역원으로서 CD20 양성 B세포주가 사용되지만, 면역 자극성은 약하여 성숙한 항체 생산 세포 클론을 수득하는 것은 용이하지 않다.
2005년 현재, 치료제로서 인가되어 있는 항CD20 모노클로날 항체는 마우스/사람의 키메라인 리툭시마브뿐이다. 이종 동물과의 키메라 분자는 항원성을 갖기 때문에 치료제로서 일반적으로는 바람직하지 않지만, 항CD20 항체는 정상 세포를 포함하는 모든 B세포를 표적하여 제거하는 성질을 갖기 때문에 항원성이 거의 없다고 되어 있다. 그렇지만, 몇 퍼센트이기는 하지만 치료기간 중에 중화(中和) 항체를 유도하는 사례가 보고되고 있고 투여하는 양이나 기간에 따라서는 더욱 그 가능성이 높아지므로, 더욱 사람과 가까운 서열을 갖는 사람화 항체 또는 사람 항체의 개발이 요구된다. 키메라 항체의 또 하나의 단점은 혈중 반감기(半減期)가 짧은 것으로, β반감기는 3 내지 4일에 불과하다. 저악성도(低惡性度) NHL의 재발에 대한 리툭시마브의 미국에서의 임상 시험의 효율성은 단독 투여로 50% 이하이었던 것이 보고되어 있어, 리툭시마브는 효과가 없거나 또는 효과가 나쁜 환자가 50% 이상 있는 것을 나타내고 있다. 중악성도(中惡性度) NHL의 경우의 반응효율은 더욱 낮아 30% 정도에 불과하다 (비특허문헌 14). 이 때문에, 환자에 따른 반응이 다른 원인?배경의 추적이 필요한 동시에 더욱 우수한 효과를 갖는 항체의 개발이 요구된다.
비특허문헌 1 : Leukocyte Fact Book 2nd Edition, Academic Press
비특허문헌 2 : Stashenko P et al., J Immunol 1980; 125:1678-85
비특허문헌 3 : Anderson KC et al., Blood 1984; 63:1424-33
비특허문헌 4 : Shan D et al., Blood 1998; 91:1644-52
비특허문헌 5 : Flieger D et al., Cell Immunol 2000; 204:55-63
비특허문헌 6 : Mathas S et al., Cancer Res 2000; 60:7170-6
비특허문헌 7 : Cardarelli PM et al., Cancer Immunol Immunother 2002; 51:15-24
비특허문헌 8 : Pedersen IM et al., Blood 2002; 99:1314-9
비특허문헌 9 : Deans JP et al., Immunol 2002; 107:176-82
비특허문헌 10 : Golay JT et al., J Immunol 1992; 149:300-8
비특허문헌 11 : Bourger I et al., Eur J Immunol 1993; 23:768-71
비특허문헌 12 : White MW et al., J Immunol 1991; 146:846-53
비특허문헌 13 : Shan D et al., Cancer Immunol Immnother 2000; 48:673-83
비특허문헌 14 : Coiffer B et al., Blood 1998; 92:1927-32
비특허문헌 15 : Edward JC et al., Rheumatology(Oxford) 2001; 40:205-11
비특허문헌 16 : Zaja F et al., Heamatologica 2002; 87:189-95
비특허문헌 17 : Perrotta S et al., Br J Haematol 2002; 116:465-7
비특허문헌 18 : Polyak MJ et al., Blood 2002; 99:3256-62
본 발명의 목적은 종래의 항CD20 모노클로날 항체 치료제보다도 우수한 생물학적 기능을 갖는 모노클로날 항체를 제공하는 것이다.
본 발명자 등은 복수의 CD20 항원 양성 B세포주, 유전공학적으로 사람 CD20 항원을 세포막상에 발현시킨 포유동물 세포 및 GST (글루타티온 S-트랜스퍼라제) 단백질을 융합시킨 CD20 단백질을 면역원으로서 임의로 조합하여 사용함으로써 사람 CD20 항원에 대하여 특이적으로 결합하는 마우스 유래 항CD20 모노클로날 항체를 수득하였다. 이 중 몇몇은 이펙터 (effector) 세포 비존재하의 생체 외 CD20 발현 세포배양에서 아폽토시스를 포함하는 직접적인 세포증식 저해 활성을 갖는다. 또한, 아폽토시스 등의 세포증식 저해 활성의 유무에 관계없이, 다른 선택된 마우스 유래 항CD20 모노클로날 항체도 포함하여, 키메라화에 의해 효과적인 보체 또는 항체 의존성의 세포 독성을 가졌다. 이들 중으로부터 가장 바람직한 생물학적 활성을 갖는다고 판단된 항체의 아미노산 서열을 사람화함으로써, 치료제로서 사용할 수 있는 항CD20 모노클로날 항체가 제조되었다. 이것에 의해, 본 발명은 완성되었다.
본 발명은 이하의 것을 제공한다.
(1) 이펙터 세포 부재하에서의 사람 CD20 항원 발현 세포배양에 있어서 당해 CD20 항원 발현 세포에 대한 아폽토시스를 포함하는 증식 저해 활성을 갖는 마우스 유래 항CD20 모노클로날 항체.
(2) (1)에 있어서, H쇄 가변영역 아미노산 서열과 L쇄 가변영역 아미노산 서열의 조합이 각각 서열번호 1 및 7, 서열번호 2 및 8, 또는 서열번호 15 및 17인 항CD20 모노클로날 항체.
(3) (1) 또는 (2)에 따른, 항CD20 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마.
(4) (2)에 따른, 항CD20 모노클로날 항체의 가변영역 아미노산 서열과 사람 면역글로불린 불변영역 아미노산 서열을 융합시킨 키메라 항CD20 모노클로날 항체.
(5) (2)에 따른, 항CD20 모노클로날 항체의 가변영역 CDR의 아미노산 서열과 사람 면역글로불린의 아미노산 서열을 사용하여 사람화된 항CD20 모노클로날 항체.
(6) (5)에 있어서, H쇄 가변영역 아미노산 서열 및 L쇄 가변영역 아미노산 서열의 조합이 각각 서열번호 19 및 23, 서열번호 19 및 24, 서열번호 19 및 25, 서열번호 19 및 26, 서열번호 20 및 23, 서열번호 20 및 24, 서열번호 20 및 25, 서열번호 20 및 26, 서열번호 21 및 23, 서열번호 21 및 24, 서열번호 21 및 25, 서열번호 21 및 26, 서열번호 22 및 23, 서열번호 22 및 24, 서열번호 22 및 25 또는 서열번호 22 및 26인 사람화된 항CD20 모노클로날 항체.
(7) (4) 내지 (6) 중 어느 한 항목에 있어서, 사람 보체 존재하에서 CD20 항원 발현 세포에 대하여 세포 독성을 갖는 항CD20 모노클로날 항체.
(8) (4) 내지 (7) 중 어느 한 항목에 따른, 항CD20 모노클로날 항체의 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열이 도입된 포유동물 세포.
(9) (8)에 있어서, CHO 세포인 포유동물 세포.
(10) H쇄 가변영역 아미노산 서열과 L쇄 가변영역 아미노산 서열의 조합이 각각 서열번호 3 및 9, 서열번호 4 및 10, 서열번호 5 및 11, 서열번호 6 및 12, 또는 서열번호 16 및 18인 마우스 유래 항CD20 모노클로날 항체.
(11) (10)에 따른 항CD20 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마.
(12) (10)에 따른 항CD20 모노클로날 항체의 가변영역 아미노산 서열과 사람 면역글로불린의 불변영역 아미노산 서열을 융합시킨 키메라 항CD20 모노클로날 항체.
(13) (10)에 따른 항CD20 모노클로날 항체의 가변영역 CDR의 아미노산 서열과 사람 면역글로불린의 아미노산 서열을 사용하여 사람화된 항CD20 모노클로날 항체.
(14) (12) 또는 (13)에 있어서, 사람 보체 존재하에서 CD20 항원 발현 세포에 대하여 세포 독성을 갖는 항CD20 모노클로날 항체.
(15) (12) 내지 (14) 중 어느 한 항목에 따른 항CD20 모노클로날 항체의 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열이 도입된 포유동물 세포.
(16) (15)에 있어서, CHO 세포인 포유동물 세포.
(17) (2), (4) 내지 (7), (10) 및 (12) 내지 (14) 의 어느 한 항목에 따른 CD20 모노클로날 항체를 유효성분으로 하는 진단제.
(18) (4) 내지 (7) 및 (12) 내지 (14) 중 어느 한 항목에 따른 항CD20 모노클로날 항체를 유효한 성분으로 하는 치료제.
또한, 상기 정의한 모노클로날 항체의 아미노산 서열은 그 2차 구조 및 그 생물학적 성질을 유의적으로 변경하지 않는 한 다른 아미노산으로 치환될 수 있고, 그러한 아미노산 서열이 치환된 모노클로날 항체도 본 출원의 청구의 범위에 포함된다.
도 1은 재조합 항체 발현용 벡터 pNOW-Ab의 구조를 도시한 것이다.
도 2는 단백질 발현용 벡터 pNOW-Ag의 구조를 도시한 것이다.
도 3은 사람 CD20 유전자 클로닝용 프라이머 서열을 도시한 것이다.
도 4는 마우스 유래 항CD20 모노클로날 항체 가변영역 H쇄 및 L쇄의 아미노산 서열을 도시한 것이다.
도 5는 마우스 유래 항CD20 모노클로날 항체의 아폽토시스 시험 결과를 도시한 것이다.
도 6은 마우스 유래 항CD20 모노클로날 항체에 의한 세포증식 저해 시험 결과를 도시한 것이다.
도 7은 키메라 항CD20 모노클로날 항체에 의한 보체 의존성 세포 독성 시험 결과를 도시한 것이다.
도 8A는 사람화된 항CD20 모노클로날 항체 가변영역 H쇄 및 L쇄의 아미노산 서열 및 이에 대응하는 염기 서열을 도시한 것이다.
도 8B는 사람화된 항CD20 모노클로날 항체 가변영역 H쇄 및 L쇄의 아미노산 서열 및 이들에 대응하는 염기 서열을 도시한 것이다.
도 9는 사람화된 항CD20 모노클로날 항체에 의한 세포증식 저해 시험 결과를 도시한 것이다.
본 발명에서, "항체" 라는 용어는 항체 전반 및 이것을 구성하는 H쇄 및 L쇄 및 이들 단편을 포함하는 의미로 사용한다.
본 발명은 세포막상의 사람 CD20 항원에 결합하여, 치료 효과를 유도하는 데 바람직한 생물학적 활성을 갖는 항CD20 모노클로날 항체에 관한 것이다.
본 발명의 제 1 양태의 항체는 세포막상의 사람 CD20 항원에 대하여 특이적으로 결합하는 모노클로날 항체이고, 이펙터 세포의 도움없이 사람 CD20 항원 발현 세포배양에서 당해 사람 CD20 항원 발현 세포에 대하여 아폽토시스를 포함하는 증식 저해 활성을 갖는 항체이다. 이것은 원래 마우스 유래 항CD20 모노클로날 항체이고, 또 이들을 키메라화 또는 사람화한 항CD20 모노클로날 항체도 포함한다. 이 항체는 이펙터 세포의 도움을 빌리지 않고 시험관내 사람 CD20 항원 발현 세포배양에 있어서 당해 CD20 항원 발현 세포에 대하여 아폽토시스를 포함하는 직접적인 증식 저해 활성을 갖는다. 이 키메라화 또는 사람화한 항CD20 모노클로날 항체는 보체 의존성 및/또는 항체 의존성의 세포 독성을 갖는다.
세포막상의 CD20 항원에 대한 결합성은 SB 세포나 Raji 세포 등의 CD20 발현 세포를 플레이트에 부착시켜 피검체인 모노클로날 항체를 반응시키는 세포 ELlSA에 의해 조사할 수 있다. 그렇지만, 이들 세포의 CD20 항원의 발현량이 충분하지 않기 때문에 반응성은 민감하지 않다. 이 때문에, 본 발명에서는 유전자 재조합에 의해 CD20을 다량으로 발현시킨 CHO 세포(CD20/CHO 세포)를 플레이트에 부착시켜, 피검체인 모노클로날 항체를 반응시키는 방식의 세포 ELISA가 개발되었다. 본 발명 중의 예비 시험에서, CD20/CHO 세포를 사용한 세포 ELISA는 모노클로날 항체의 반응성 시험에서 SB 세포 또는 Raji 세포를 사용한 세포 ELISA와 같은 패턴을 나타내고, 또한 민감한 것이 확인되어 있다(실시예 : CD20/CHO 세포 ELISA 스크리닝법의 확립, 표 1을 참조).
이펙터 세포 부재하에서의 시험관내 사람 CD20 항원 발현 세포배양에서의 직접적인 세포증식 저해 활성의 측정은 일반적 방법에 의해 측정할 수 있다(Miyamoto T et al. Avian Dis. Vol 46(1), 10-16). 또한, 아폽토시스 유도능은 유동세포 측정기(Flow cytometry(Annexin V/PI staining))를 사용한 시험에 의해 측정이 가능하다.
제 1 양태의 항체의 예로는 H쇄 가변영역 아미노산 서열과 L쇄 가변영역 아미노산 서열의 조합이 각각 서열번호 1 및 7, 서열번호 2 및 8, 또는 서열번호 15 및 17로 규정되는 마우스 항CD20 모노클로날 항체, 또는 이것을 키메라화 또는 사람화한 항CD20 모노클로날 항체가 포함된다. 이 항체는 이펙터 세포의 도움없이 시험관내 사람 CD20 항원 발현 세포배양에 있어서 당해 CD20 항원 발현 세포에 대하여 아폽토시스를 포함하는 직접적인 증식 저해 활성을 갖는다. 이들은 또 보체 의존성 및/또는 항체 의존성의 세포 독성도 갖는다. 본 발명에는 마우스 유래 항체를 생산하는 하이브리도마 및 키메라 항체 또는 사람화 항체의 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열이 도입된 포유동물 세포(실시예에서는 CHO 세포)도 포함된다.
키메라화는 마우스 유래 모노클로날 항체의 H쇄 가변영역 아미노산 서열과 사람 면역글로불린 H쇄 불변영역 아미노산 서열, L쇄 가변영역 아미노산 서열과 사람 면역글로불린 L쇄 불변영역 아미노산 서열을 융합시킴으로써 수행되고(Ishida T et al.Nippon Rinsho Vol 60, No 3, 439-444), 사람화는 마우스 유래 모노클로날 항체의 가변영역 CDR 아미노산 서열과 사람 면역글로불린의 아미노산 서열을 사용하여 디자인된다. 치료제로서 바람직한 사람화 항CD20 모노클로날 항체는 다양하게 디자인된 항체의 특성을 비교함으로써 선택된다(Padlan EA, Mol Immunol Vol28, No 4/5, 489-498; Wu TT and Kabat EA, Mol Immunol Vol 29, No 9, 1141-1146; Padlan EA et al., FASEB J Vol 9, 133-139).
키메라화 또는 사람화한 항CD20 모노클로날 항체는 또한 보체 의존성 세포 독성(CDC) 및 이펙터 세포 존재하에서 항체 의존성 세포 독성(ADCC)을 갖는다. 이 CDC 및 ADCC에 관한 시험방법에 관해서는 일반적으로 사용되고 있는 방법을 참조할 수 있다(Manches O et al., Blood 2003; 101(3):949-54; Idusogie EE et al.. J Immunol 2000; 164:4178-4184).
구체적인 사람화 항CD20 모노클로날 항체의 예는 H쇄 가변영역 아미노산 서열과 L쇄 가변영역 아미노산 서열의 조합이 각각 서열번호 19 및 23, 서열번호 19 및 24, 서열번호 19 및 25, 서열번호 19 및 26, 서열번호 20 및 23, 서열번호 20 및 24, 서열번호 20 및 25, 서열번호 20 및 26, 서열번호 21 및 23, 서열번호 21 및 24, 서열번호 21 및 25, 서열번호 21 및 26, 서열번호 22 및 23, 서열번호 22 및 24, 서열번호 22 및 25, 또는 서열번호 22 및 26으로 나타낸다.
본 발명의 제 2 양태의 항체는 세포막상의 사람 CD20 항원에 대하여 특이적으로 결합하는 마우스 유래의 모노클로날 항체이지만, 아폽토시스를 포함하는 증식 저해 활성을 나타내지 않거나 또는 그 활성이 그 만큼 높지 않다. 그렇지만, 이 마우스 유래 항체는 키메라화 또는 사람화함으로써 CDC 또는 ADCC 활성을 획득하는 것이 가능하다. 이 세포 독성 활성도 중요한 생물학적 활성이고, 이 때문에 제 2 양태의 항CD20 모노클로날 항체도 치료제로서의 유망한 후보가 될 수 있다.
제 2 양태의 항체의 예로는 H쇄 가변영역 아미노산 서열과 L쇄 가변영역 아미노산 서열의 조합이 각각 서열번호 3 및 9, 서열번호 4 및 10, 서열번호 5 및 11, 서열번호 6 및 12, 또는 서열번호 16 및 18인 마우스 유래 항CD20 모노클로날 항체, 및 이들의 키메라화 또는 사람화한 항CD20 모노클로날 항체가 포함된다. 본 발명에는 당해 마우스 유래 항체를 생산하는 하이브리도마 및 당해 키메라 항체 및 당해 사람화 항체의 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열이 도입된 포유동물 세포(실시예에서는 CHO 세포)도 포함된다.
세포막상의 CD20 항원에 대한 결합성의 판정법, 증식 저해, 아폽토시스, ADCC, CDC 등 각종 시험법 및 키메라 또는 사람화 항체의 제작법은 제 1 양태의 항체의 경우와 같은 방법에 의한다.
제 1 양태 및 제 2 양태의 항체로서 기재하는 키메라 항CD20 모노클로날 항체 또는 사람화 항CD20 모노클로날 항체는 모두 B세포성 악성 종양 및 B세포 또는 B세포가 생산하는 항체가 관여하는 면역질환에 대한 치료제로서 뛰어난 효과를 갖는 것을 기대할 수 있고, 본 발명은 키메라 또는 사람화한 항CD20 모노클로날 항체의 하나 이상, 바람직하게는 사람화 항CD20 모노클로날 항체를 유효성분으로 하는 치료제의 개발에 공급하는 것을 목적으로 한다. 대상질환으로서는 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 만성 림프성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 류머티즘 관절염, 자가면역 용혈성 빈혈증, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 전신성 홍반성 낭창, 항-인지질 항체 증후군, 쇼그렌 증후군, 크론병, 경피증, 다발성 경화증, I형 당뇨병 등을 들 수 있다.
본 발명의 마우스 유래 모노클로날 항체는 이하의 방법으로 제조할 수 있다.
감작 면역 항원으로서, 사람 CD20 항원을 발현하는 세포주인 SB 세포, Raji 세포 또는 사람 CD20 항원을 발현시킨 CHO 세포를 조합하여 사용할 수 있다. 또한, GST를 융합시킨 사람 CD20 단백질(GST-CD20)을 보완적인 감작 항원으로서 사용하는 경우도 있다.
모노클로날 항체 생산 하이브리도마의 제조는 (1) 피면역동물인 동물(마우스)에 대한 면역, (2) 면역된 동물로부터의 림프구의 제조, (3) 모세포의 제조, (4) 림프구와 모세포의 세포 융합, (5) 스크리닝 및 (6) 클로닝과 같은 일련의 과정에 의해 수행할 수 있다(Ailsa M.Campbell(저), 오자와 토시아키(역) 생화학실험법; 모노클로날 항체, 동경화학동인, 1989년). 세포 표면의 CD20 항원에 특이적으로 결합하는 항CD20 모노클로날 항체의 클로닝은 CD20/CHO 세포를 플레이트에 고정한 세포 ELlSA에 피검체인 모노클로날 항체를 반응시킴으로써 수행할 수 있다. 발현 벡터는 시판하는 것이어도 가능하지만, CHO 세포상에 CD20 항원을 고밀도로 발현시킬 필요가 있기 때문에 포유동물 세포 고발현 벡터 pNOW(특허 제3582965호)를 사용할 수 있다. 모노클로날 항체의 선택 기준은 양성 대조군과의 비교에서 같은 정도 이상의 반응성을 나타내는 것으로 한다.
키메라화 및 사람화 항체의 제조는 통상의 유전자 재조합법에 근거하면 양호하다. 예를 들면, 발현 벡터는 항체 생산용으로 2세트의 다클로닝 부위를 탠덤으로 배열하고, 또한 사람의 H쇄 및 L쇄의 불변영역 유전자가 미리 도입된 pNOW-Ab를 사용할 수 있다(도 1).
실시예 1
CD20 항원에 대한 모노클로날 항체의 제작, 키메라화 및 사람화, 또한 수득된 항체의 특성에 관한 시험을 실시예에 기초하여 설명한다.
(1) 마우스 감작용 면역 항원의 제작
사람 CD20 전체 분자를 암호화하는 유전자에 특이적인 서열번호 13에 기재된 5' 프라이머 및 서열번호 14에 기재된 3' 프라이머를 사용하여 cDNA 라이브러리로부터 사람 CD20 유전자를 수득했다 (Multiple Choice cDNA human spleen, Origene Technologies, Inc. 6 Taft Court, Suite 100, Rockville, MD 20850). 구체적으로는 도 3에 도시된 프라이머를 사용하였다. CD20 유전자는 포유동물 세포용 고발현 벡터인 pNOW-Ag(도 2)에 도입된 후, 숙주세포인 CHO 세포에 형질감염되었다. FACS 분석에 의해, 세포 표면에 CD20분자를 고발현하고 있는 재조합 CHO 세포 (CD20/CHO 세포)를 수립하였다. 또, FITC 표식 항CD20 모노클로날 항체로 염색한 경우에 SB 세포와 비교하여 형광 강도가 5배 이상인 세포를 고 발현하는 세포로 정의하였다. 보완적인 면역원인 GST-CD20은 pGEX-4T2 벡터를 사용하여 CD20 세포 외 도메인의 43개 아미노산의 N 말단에 GST를 융합시킴으로써 제조하였다(G et al.AM, Electrophoresis Vol 20(2):344-348).
(2) 면역원의 제조
SB 세포 또는 Raji 세포는 10% FCS 첨가 RPMI1640 배지를 사용하여 배양을 수행하였다. CD20/CHO 세포는 G418을 800㎍/㎖ 첨가한 CHO-S-SFM II 배지(GIBCO, Cat. No.12052-098)를 사용하여 배양을 하였다. 이 배양액을 원심분리(1100rpm, 5분)한 후, 세포에 듈베코 (Dulbecco) PBS(-)를 첨가하여 현탁시켜 다시 원심분리하였다. 이 세척 과정을 또 한번 반복하여, 세포에 생리식염수를 첨가하여 제조한 현탁액(1㎖당 세포수는 1~3×107이다)을 면역에 사용하였다. GST-CD20이 도입된 pGEX-4T2는 이. 콜라이 컴피턴트 세포에 도입되었다. 당해 컴피턴트 세포는 배양 후 용해되고, GST-CD20은 용해 세포물로부터 조악하게 정제한 후 0.1N 가성소다를 첨가하여 가용화되었다.
(3) 면역 및 세포 융합
피면역동물로는 7 내지 11 주령의 Balb/c계 암컷 마우스를 사용하였다. SB 세포, Raji 세포 및 CD20/CHO 세포 중 어떤 세포를 여러가지의 일수 간격으로 2 내지 3회 반복하여 투여한 후, 이것과는 상이한 세포 항원 (SB 세포, Raji 세포 또는 CD20/CHO 세포)을 선택하여 최종 면역에 사용하였다. 투여한 세포수는 모두 마우스 1마리당 1~3×107 개였다. 또한, 일부의 마우스의 예에서는 GST-CD20을 사용하여 보완적인 면역을 수행하였다. 최종 면역의 3일 후에 마우스의 비장 세포를 추 출하여, RPMI 배지 중에서 현탁한 후, PEG-1500의 존재하에서 마우스 골수종 (NS-1)과의 융합 반응을 수행하였다(Oi, V.T.et. Herzenberg, 1980, in : Selected Methods in Cellular Immunology; Mishell B et al(Freeman and Co. San Francisco, CA)p.351.).
(4) CD20/CHO 세포 ELISA 스크리닝법의 확립
SB 세포, Raji 세포, CD20/CHO 세포 및 CD20의 CHO 모주를 각각 부착시킨 96웰 플레이트를 사용하여, 몇몇의 마우스 유래 항CD20 모노클로날 항체와 2B8을 반응시켰다. 이 세포 ELISA는 항체 농도에 대하여 같은 경향을 나타내는 것이 확인되고, 항체간 및 대조군과의 상대비교도 가능한 것으로 판명되었다. CD20 CHO 세포 ELISA는 플레이트에 부착시킨 세포 표면의 항원 밀도가 높기 때문에, 피검 항체 샘플이 비교적 저농도라도 충분히 검출 가능한 수준의 흡광도를 나타내고, 민감한 측정계인 것으로 판명되었다. 구체적인 측정 결과를 표 1에 나타낸다.
Figure 112007077962855-pct00001
(5) 세포 ELISA에 의한 스크리닝
CD20/CHO 세포 또는 CHO 세포(CD20 모주)를 부착시킨 96웰 플레이트를 사용하여 세포 ELISA를 수행하고, CD20에 특이적으로 반응하는 항체를 생산하고 있는 웰을 선택하였다. 양성 대조군에는 2B8을 사용하고, 음성 대조군에는 사람 CD3 항원에 대한 마우스 모노클로날 항체(BD PharMingen사)를 사용하였다. 구체적으로는 폴리-L-리신을 피복한 96웰 플레이트(아사히 테크노 글래스, Cat. No.11-023-018)에 부착시킨 CD20/CHO 세포 또는 CHO 세포(모주)를 세포 ELISA에 사용하였다. 각각의 웰에 블로킹액(0.2%-젤라틴, 0.5%-BSA의 PBS 용액)을 150㎕ 넣어 37℃에서 1시간 정치하였다. 150mM-NaCl, 0.05%-Tween 20 수용액을 사용하여 플레이트를 5회 세척한 후, 샘플(배양 상청액의 희석액)을 각 웰에 100㎕ 넣어 1차 반응을 37℃에서 1시간 수행하였다. 세척 후, 표식 항체의 희석액〔HRP 표식 항마우스 IgG(H+L) 토끼 항체(Jackson Lab. Code No.315-035-003), 또는 HRP 표식 항마우스 IgG(Fcγ) 토끼 항체(Jackson Lab. Code No.315-035-008)〕를 각 웰에 100㎕ 넣어 2차 반응을 37℃에서 1시간 수행하였다. 1차, 2차의 반응액의 제조에는 블로킹액과 같은 것을 사용하였다. 세척 후, 발색액(OPD)을 각 웰에 100㎕ 넣어 30분 후에 4N-H2SO4를 50㎕ 첨가하여 반응을 정지시키고 A492를 측정하였다. 그 결과, 2B8과 같은 정도 내지 유의적으로 높은 반응성을 나타낸 웰을 선택하였다.
(6) 클로닝
한계희석법으로 수행하였다. 세포를 96웰 플레이트에 분주 배양 후, 하나의 콜로니를 함유한 배양 상청액에 관해서 CD20/CHO 세포의 세포 ELISA를 수행하여, 특이 항체의 생산 클론을 선택하였다.
(7) 정제 항체의 제조
특이 항체의 생산 클론을 10% FCS 첨가한 RPMI1640 배지로 배양하여, 세포밀도가 5×105/㎖ 전후가 된 시점에서 무혈청 배지 ASF-104N(아지노모토)로 배지를 교환하여 배양을 수행하였다. 2 내지 4일 후에 배양액을 원심분리하여 배양 상청액을 회수한 후, 단백질 G칼럼을 사용하여 정제를 수행하여, 용출된 모노클로날 항체용액을 150mM-NaCl에 대하여 투석하였다. 0.2㎛의 필터로 여과 멸균을 수행하여, 시험 항체(항사람 CD20 마우스 모노클로날 항체)로 하였다.
CD20/CHO 세포 ELISA법을 사용하여 양성 대조군에 필적하는 결합 친화성을 갖는 모노클로날 항체 클론을 선별하였다. 이들 항체의 가변영역에 관해서 유전자 서열을 결정하고, 그 결과로서 아미노산 서열을 결정하였다. 대표적인 항체의 H쇄 V영역 및 L쇄 V영역의 서열을, 서열번호 1 및 7, 서열번호 2 및 8, 서열번호 3 및 9, 서열번호 4 및 10, 서열번호 5 및 11, 서열번호 6 및 12, 서열번호 15 및 17, 서열번호 16 및 18로 나타낸다(도 4). 또 이들 클론에 관해서 생물학적 특성이 조사되었다.
생물학적 특성 시험 (1) 아폽토시스 유도 시험
유동세포 측정기(Annexin V/PI staining)를 사용하여 시험 항체의 아폽토시스 유도능을 측정하였다. 양성 대조군에는 2B8, 음성 대조군에는 사람 CD3에 대한 마우스 모노클로날 항체(BD PharMingen사)를 사용하였다. 조작 과정은 다음과 같다.
MEBCYTO 아폽토시스 키트(MBL, Cat. No.4700, Lot.20)를 사용하여 수행하였다.
Raji 세포를 원심 후, 10% FCS(비동화제: 非動化濟)(ICN, Cat. No.2916754, Lot.8005C)를 포함하는 신선한 RPMI1640 배지(Sigma, Cat. No.R8758, Lot.44K2416)로 현탁하여, 12웰 플레이트의 각 웰에 5×105세포/㎖의 밀도로 1㎖를 도입하였다. 각 항체당 12웰을 사용하여, 각 항체를 최종농도가 2㎍/㎖ 또는 4㎍/㎖가 되도록 첨가하였다(3웰×2종농도×2시점, 합계 12웰).
배양 개시 1일 후 및 2일 후에, 약 2×105개의 세포를 포함하는 배양액을 회수하여, 원심 후 PBS로 1회 세척하였다. 다음에 85㎕ 결합 완충액을 첨가하여 현탁하였다. 또, Annexin V-FITC 10㎕ 및 PI 5㎕를 첨가하여 잘 혼합한 후, 차광, 실온에서 15분간 반응시켰다. 유동세포 측정기(FACS Calibur, Becton Dickinson)를 사용하여 측정하여, 세포 탐색 (Quest)(Becton Dickinson)으로 해석하였다.
대표적인 8종류의 마우스 유래 항CD20 모노클로날 항체 및 양성 대조군(2B8), 음성 대조군(항CD3 항체)의 측정 결과를 도 5에 도시하였다. 일반적으로, 2B8의 아폽토시스의 유도능은 높지만, 이와 비교에서도 H쇄 가변영역 아미노산 서열과 L쇄 가변영역이 각각 서열번호 2 및 8의 아미노산 서열을 갖는 클론(1K1791)이 눈에 띄게 높은 아폽토시스 유도 활성을 나타내었다. H쇄 가변영역 아미노산 서열 및 L쇄 가변영역이 각각 서열번호 1 및 7(1K1422), 또는 서열번호 15 및 17(1K0924)인 클론에서도 분명한 아폽토시스에 의한 세포사가 관찰되었다.
생물학적 특성 시험 (2) 세포증식 저해 시험
5×104개/㎖의 Raji 세포 현탁액을 10% FCS 첨가된 RPMI1640 배지로 제조하여 96웰 플레이트에 100㎕/웰씩 넣어 배양하였다. 24시간 후, 항체 농도가 각각 0.01㎍/㎖, 0.1㎍/㎖ 및 1㎍/㎖가 되도록 각 항체용액을 50㎕/웰로 첨가하여 배양을 계속하였다. 항체 첨가 72시간 후에 발색색소 세포 계수 키트-8(동인화학 Cat. No.343-07623, Lot.SG076)을 10㎕/웰 첨가하고, 또한 4시간 배양한 후에 파장 492㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 도 6에 대표적인 8개의 마우스 유래 항CD20 모노클로날 항체와 양성 대조군(2B8)의 생세포수 측정치를, 음성 대조군(100%)에 대한 비율로서 나타낸다. 세포증식 저해 효과는 음성 대조군과의 비교에서 감소한 생세포수의 비율에 의해 추정하는 것이 가능하다. 1K0924, 1K1422, 1K1791 및 양성 대조군인 2B8에 있어서 분명한 세포증식 저해가 관찰되고, 특히 1K1791에 있어서 현저하였다. 이 경향은 아폽토시스 유도 시험의 결과와도 일치한다.
키메라 항체의 제조
각각의 마우스 유래 항체의 H쇄 및 L쇄의 가변영역 유전자를, 사람 면역글로불린 H쇄 및 L쇄(κ) 불변영역 유전자를 카세트로서 미리 갖는 CHO 세포용 고발현 벡터 pNOW-Ab에 도입하였다. 당해 발현 벡터를 CHO 세포에 형질감염시켜, 각각 클론에 관해서 생산성이 높은 것을 선별하였다.
키메라 항체의 CD20 항원에 대한 결합성 시험
제조된 8개의 키메라 항CD20 모노클로날 항체에 대해 CD20/CHO 세포 ELISA법을 사용하여 사람 CD20 항원에 대한 반응성을 조사하였다. 양성 대조군에는 리툭시마브 (c2B8)를 사용하였다. 시험 결과를 표 2에 나타낸다. 세포 ELISA 측정치(A492)는 결합성의 강도를 반영한다. c1K0924 및 c1K1422의 친화성이 대조군과 비교하여 약간 낮은 경향이 있는 것 이외에는 거의 동등하거나 그 이상의 친화성을 나타내었다.
Figure 112007077962855-pct00002
키메라 항체의 CDC 시험
제조된 8개의 키메라 항CD20 모노클로날 항체에 관해서 CDC 활성이 조사되었다. 양성 대조군에는 리툭시마브 (c2B8)를 사용하였다. 표적 세포로는 RC-K8(고치다이(高知大) 의학부로부터 입수)을 사용하였다. 사용 배지로서 RHB(기초 배지 : RPMI-1640, 첨가물 : 0.1% BSA, 20mM HEPES(pH7.2), 2mM 글루타민, 페니실린G 100unit/㎖, 스트렙토마이신 100㎍/㎖)를 제조하여 사용하였다. 표적 세포는 RHB로 세척 후, 106세포/㎖가 되도록 재현탁하였다. 피검 키메라 항체 및 리툭시마브의 각각에 대해서 농도가 다른 용액 50㎕, 시판하는 사람 보체(Quidel, San Diego, CA, Cat. A113)의 4배 희석용액 50㎕ 및 106세포/㎖의 세포 현탁액 50㎕를 평평한 바닥의 95 웰 조직 배양용 플레이트(검정)의 각 웰에 첨가하였다. 당해 150㎕/웰 중의 항체 농도의 설정은 0.1㎍/㎖, 1㎍/㎖, 10㎍/㎖로 하였다. 보체 매개성 세포 용해를 촉진하기 위해서 37℃, 5% CO2의 조건으로 2시간 항온처리하였다. 50㎕의 알라머 블루 (Alamer blue) (미희석, Accumed International의 처방, Biosource, Cat. DAL1100)를 첨가하여, 동일 조건으로 하룻밤 반응시켰다. 플레이트를 실온하에서 10분간 두어 냉각시킨 후, 형광 마이크로플레이트 리더를 사용하여, 530㎚ 여기, 590㎚ 측정으로 형광을 판독하고, 결과는 형광 강도(RFU)로 표시하였다. CDC 활성의 비율은 다음의 식으로 계산하였다.
%CDC 활성=100×{RFU(항체 무첨가)-RFU(항체 첨가))/{RFU(항체 무첨가)-RFU(Triton X-100 첨가)}
결과를 도 7에 도시한다. c1K1712 이외에는 양성 대조군인 c2B8와 거의 동등하거나 그 이상의 CDC 활성을 나타내었다.
사람화 항체의 제조
마우스 유래 항CD20 모노클로날 항체 1K1791의 가변영역 CDR을 바탕으로 사람화의 디자인을 수행하였다. 아미노산 서열로부터 구조 해석을 하여 추가로 디자인 방법을 바꿈으로써, H쇄 및 L쇄 각각 4종류의 사람화 서열이 제조되었다(Padlan EA, Mol Immunol Vol 28, No 4/5, 489-498; Wu TT 및 Kabat EA, Mol Immunol Vol 29, No 9, 1141-1146; Padlan EA et al., FASEB J Vol 9, 133-139). H쇄 및 L쇄 각 4종류의 모든 조합으로 항체가 제작되었다. 이 아미노산 서열을 서열번호 19 및 23, 서열번호 19 및 24, 서열번호 19 및 25, 서열번호 19 및 26, 서열번호 20 및 23, 서열번호 20 및 24, 서열번호 20 및 25, 서열번호 20 및 26, 서열번호 21 및 23, 서열번호 21 및 24, 서열번호 21 및 25, 서열번호 21 및 26, 서열번호 22 및 23, 서열번호 22 및 24, 서열번호 22 및 25, 서열번호 22 및 26에 나타낸다(도 8A 및 도 8B).
이들 H쇄 가변영역 4종류 및 L쇄 가변영역 4종류의 아미노산 서열은 사람 유전자 서열에 있어서 가장 사용빈도가 높은 DNA(염기) 서열로 치환되고, 또 이 염기의 몇몇은 숙주 CHO 세포에 대한 적성을 고려하여 원래의 아미노산을 바꾸지 않고 변경되었다(Kim CH et al.. Gene 1997; 15;199(1-2):293-301). 구체적으로 아미노산 서열에 대응하는 염기 서열로서, 각각 서열번호 19에 대응하여 서열번호 27, 서열번호 20에 대응하여 서열번호 28, 서열번호 21에 대응하여 서열번호 29, 서열번호 22에 대응하여 서열번호 30, 서열번호 23에 대응하여 서열번호 31, 서열번호 24에 대응하여 서열번호 32, 서열번호 25에 대응하여 서열번호 33, 서열번호 26에 대응하여 서열번호 34를 사용하였다(도 8A 및 도 8B). 또, 이 염기 서열은 이것에 대응하는 아미노산 서열을 변경하지 않는 한 다른 염기를 사용하여 치환할 수 있다.
H쇄 가변영역(염기 서열번호 27 내지 30) 및 L쇄 가변영역(염기 서열번호 31 내지 34)의 합계 8종류의 염기 서열은 합성된 후(다까라 주조 주식회사), 다클로닝 부위를 갖는 포유동물 세포용 발현 벡터 pNOW-Ab에 도입하였다. 이 사람화된 항체 유전자가 도입된 당해 발현 벡터를 CHO 세포에 형질감염시켜, 각각 클론에 관해서 생산성이 높은 것을 선별하였다.
사람화 항체의 생물학적 특성 시험: 세포증식 저해 시험
5×104개/㎖의 Raji 세포 현탁액을 10% FCS 첨가 RPMI1640 배지로 제조하여 96웰 플레이트에 100㎕/웰씩 넣어 배양하였다. 24시간 후, 항체 농도가 0.5㎍/㎖가 되도록 각 항체용액을 50㎕/웰 첨가하여 배양을 계속하였다. 항체 첨가 72시간 후에 발색색소 세포 계수 키트-8 (동인화학 Cat. No.343-07623, Lot.SG076)을 10㎕/웰 첨가하고, 또 4시간 배양한 후에 파장 492㎚에서의 흡광도를 측정하였다. 도 9에 1K1791 유래의 16종류의 사람화 항체 중의 15종류 (27클론)와 양성 대조군인 c2B8(리툭시마브의 별칭)의 생세포수 측정치를, 음성 대조군(100%)에 대한 비율로서 나타낸다. 세포증식 저해 효과는 음성 대조군과의 비교에서 감소한 생세포수의 비교에 근거하여 추정하는 것이 가능하지만, 본 시험에서는 모든 클론에 관해서 증식 저해 효과가 관찰되었다.
또한, 본 발명의 명세서 및 도표에 기재되는 모노클로날 항체명과 서열번호는 다음과 같이 참조할 수 있다.
Figure 112007077962855-pct00003
이 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마는 생산하는 항체의 명칭에 의해 명명되어, 독립행정법인 산업기술종합연구소 특허생물기탁센터(수신자 : 우편번호 305-8566 일본 이바라기켄 츠쿠바시 히가시 1쵸메 1 쥬오 다이6)에 2006년 3월 28일에 부다페스트 조약에 근거하는 국제기탁이 이루어지고, 수탁번호가 다음과 같이 부여되어 있다. 1K1422 : FERM BP-10587, 1K1791 : FERM BP-10591, 1K1712 : FERM BP-10588, 1K1402 : FERM BP-10586, 1K1736 : FERM BP-10589, 1K1782 : FERM BP-10590, 1K0924 : FERM BP-10584, 1K1228 : FERM BP-10585.
본 발명에 의해 치료제로서 사용하는데 적합한 생물학적 활성을 갖는 모노클로날 항체가 제공된다.
<110> BIOMEDICS INC. <120> Anti-CD-20 monoclonal antibody <130> C6084-PCT <150> JP 2005-103093 <151> 2005-03-31 <150> JP 2005-378466 <151> 2005-12-28 <160> 34 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 123 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 1 Gln Val Gln Leu Gln Gln Pro Gly Ala Glu Leu Val Lys Pro Gly Ala 1 5 10 15 Ser Val Lys Met Ser Cys Arg Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr 20 25 30 Asn Met His Trp Ile Lys Gln Thr Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile 35 40 45 Gly Ala Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Asp Thr Ser Tyr Asn Arg Lys Phe 50 55 60 Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Ala Asp Thr Ser Ser Ser Thr Ala Tyr 65 70 75 80 Met Gln Phe Ser Ser Leu Thr Ser Ala Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys 85 90 95 Ala Arg Phe Thr Tyr Tyr Tyr Gly Gly Thr Tyr Gly Ala Met Asp Tyr 100 105 110 Trp Gly Gln Gly Thr Ser Val Thr Val Ser Leu 115 120 <210> 2 <211> 124 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 2 Gln Ile Gln Leu Val Gln Ser Gly Pro Glu Leu Lys Lys Pro Gly Glu 1 5 10 15 Thr Val Lys Ile Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Phe 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Ser Leu Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 26 <211> 107 <212> PRT <213> Mus musculus <400> 26 Ser Thr Val Met Thr Gln Ser Pro Asp Ser Leu Ala Val Ser Leu Gly 1 5 10 15 Glu Arg Val Thr Ile Asn Cys Lys Ala Ser Gln Ser Val Ser Asn Asp 20 25 30 Val Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Val Leu Ile 35 40 45 Tyr Phe Ala Ser Asn Arg Tyr Thr Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly 50 55 60 Ser Gly Tyr Gly Thr Asp Phe Thr Phe Thr Ile Ser Ser Val Gln Ala 65 70 75 80 Glu Asp Val Ala Val Tyr Phe Cys Gln Gln Asp Tyr Ser Ser Pro Leu 85 90 95 Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys 100 105 <210> 27 <211> 403 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 27 actagttgca gctcctattt gggttctttc tcagatccag ctggtgcaga gcggcagcga 60 gctgaagaag cccggcgcca gcgtgaaggt gagctgcaag gccagcggct acaccttcac 120 caacttcggc gtgaactggg tgcgccaggc ccccggcaag ggcctggagt ggatgggctg 180 gatcaacacc tacaccggcg agcccagcta cgcccagggc ttcaccggcc gcttcgtgtt 240 cagcctggac gccagcgtga gcaccgccta cctgcagatc agcagcctga aggccgagga 300 caccgccacc tacttctgca cccgccgcac caactactac ggcaccagct actactacgc 360 catggactac tggggccagg gcaccaccgt gaccgtctcg agc 403 <210> 28 <211> 403 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 28 actagttgca gctcctattt gggttctttc tcagatccag ctggtgcaga gcggcagcga 60 gctgaagaag cccggcgcca gcgtgaaggt gagctgcaag gccagcggct acaccttcac 120 caacttcggc gtgaactggg tgaagcaggc ccccggcaag ggcctgaagt ggatgggctg 180 gatcaacacc tacaccggcg agcccagcta cgccgacgac ttcaagggcc gcttcgcctt 240 cagcctggac gccagcgcca gcaccgccta cctgcagatc agcagcctga aggccgagga 300 catggccacc tacttctgca cccgccgcac caactactac ggcaccagct actactacgc 360 catggactac tggggccagg gcaccaccgt gaccgtctcg agc 403 <210> 29 <211> 403 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 29 actagttgca gctcctattt gggttctttc tcagatccag ctggtgcaga gcggcagcga 60 gctgaagaag cccggcgcca gcgtgaaggt gagctgcaag gccagcggct acaccttcac 120 caacttcggc gtgaactggg tgcgccaggc ccccggcaag ggcctgaagt ggatgggctg 180 gatcaacacc tacaccggcg agcccagcta cgcccagggc ttcaccggcc gcttcgcctt 240 cagcctggac gccagcgtga gcaccgccta cctgcagatc agcagcctga aggccgagga 300 caccgccacc tacttctgca cccgccgcac caactactac ggcaccagct actactacgc 360 catggactac tggggccagg gcaccaccgt gaccgtctcg agc 403 <210> 30 <211> 403 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 30 actagttgca gctcctattt gggttctttc tcagatccag ctggtgcaga gcggccccga 60 gctgaagaag cccggcgcca gcgtgaagat cagctgcaag gccagcggct acaccttcac 120 caacttcggc gtgaactggg tgaagcaggc ccccggcaag ggcctgaagt ggatgggctg 180 gatcaacacc tacaccggcg agcccagcta cgccgacgac ttcaagggcc gcttcgcctt 240 cagcctggac gccagcgtga gcaccgccta cctgcagatc agcagcctga aggccgagga 300 caccagcacc tacttctgca cccgccgcac caactactac ggcaccagct actactacgc 360 catggactac tggggccagg gcaccaccgt gaccgtctcg agc 403 <210> 31 <211> 340 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 31 ccgcggtgcc agaagcaccg tgatgaccca gagccccgac agcctggccg tgagcctggg 60 cgagcgcgcc accatcaact gcaagagcag ccagagcgtg agcaacgacg tggcctggta 120 ccagcagaag cccggccaga gccccaaggt gctgatctac ttcgccagca accgctacag 180 cggcgtgccc gaccgcttca gcggcagcgg ctacggcacc gacttcaccc tgaccatcag 240 cagcctgcag gccgaggacg tggccgtgta cttctgccag caggactaca gcagccccct 300 gaccttcggc gccggcacca agctggagat caagcgtacg 340 <210> 32 <211> 340 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 32 ccgcggtgcc agaagcaccg tgatgaccca gagccccagc ttcctgagcg ccagcgtggg 60 cgaccgcgtg accatcacct gcaaggccag ccagagcgtg agcaacgacg tggcctggta 120 ccagcagaag cccggccaga gccccaaggt gctgatctac ttcgccagca accgctacac 180 cggcgtgccc gaccgcttca gcggcagcgg ctacggcacc gacttcaccc tgaccatcag 240 cagcctgcag gccgaggacg tggccgtgta cttctgccag caggactaca gcagccccct 300 gaccttcggc gccggcacca agctggagat caagcgtacg 340 <210> 33 <211> 340 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 33 ccgcggtgcc agaagcaccg tgatgaccca gagccccgac agcctggccg tgagcctggg 60 cgagcgcgcc accatcaact gcaagagcag ccagagcaac agcaacgacg tggcctggta 120 ccagcagaag cccggccaga gccccaaggt gctgatctac ttcgccagca accgctacag 180 cggcgtgccc gaccgcttca gcggcagcgg ctacggcacc gacttcaccc tgaccatcag 240 cagcctgcag gccgaggacg tggccgtgta cttctgccag caggactaca gcagccccct 300 gaccttcggc gccggcacca agctggagct gaagcgtacg 340 <210> 34 <211> 340 <212> DNA <213> Mus musculus <400> 34 ccgcggtgcc agaagcaccg tgatgaccca gagccccgac agcctggccg tgagcctggg 60 cgagcgcgtg accatcaact gcaaggccag ccagagcgtg agcaacgacg tggcctggta 120 ccagcagaag cccggccaga gccccaaggt gctgatctac ttcgccagca accgctacac 180 cggcgtgccc gaccgcttca gcggcagcgg ctacggcacc gacttcacct tcaccatcag 240 cagcgtgcag gccgaggacg tggccgtgta cttctgccag caggactaca gcagccccct 300 gaccttcggc gccggcacca agctggagct gaagcgtacg 340

Claims (22)

  1. 이펙터 (effector) 세포 부재하에서의 사람 CD20 항원 발현 세포 배양에서 당해 사람 CD20 항원 발현 세포에 대한 아폽토시스를 포함하는 증식 저해 활성을 가지며, H쇄 가변영역 아미노산 서열과 L쇄 가변영역 아미노산 서열이 서열번호 2 및 8이거나 서열번호 1 및 7인, 마우스 유래 항CD20 모노클로날 항체.
  2. 삭제
  3. 제1항에 따른 항CD20 모노클로날 항체를 생산하는 하이브리도마.
  4. 제1항에 따른 항CD20 모노클로날 항체의 가변영역 아미노산 서열과 사람 면역글로불린 불변영역 아미노산 서열을 융합시킨 키메라 항CD20 모노클로날 항체.
  5. 제1항에 따른 항CD20 모노클로날 항체의 가변영역 CDR의 아미노산 서열과 사람 면역글로불린의 아미노산 서열을 사용하여 사람화된 항CD20 모노클로날 항체.
  6. 제5항에 있어서, H쇄 가변영역 아미노산 서열 및 L쇄 가변영역 아미노산 서열의 조합이 각각 서열번호 19 및 23, 서열번호 19 및 24, 서열번호 19 및 25, 서열번호 19 및 26, 서열번호 20 및 23, 서열번호 20 및 24, 서열번호 20 및 25, 서 열번호 20 및 26, 서열번호 21 및 23, 서열번호 21 및 24, 서열번호 21 및 25, 서열번호 21 및 26, 서열번호 22 및 23, 서열번호 22 및 24, 서열번호 22 및 25 또는 서열번호 22 및 26인 사람화된 항CD20 모노클로날 항체.
  7. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 사람 보체 또는 이펙터 세포 존재하에서 CD20 항원 발현 세포에 대하여 세포 독성을 갖는 항CD20 모노클로날 항체.
  8. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항CD20 모노클로날 항체의 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열이 도입된 포유동물 세포.
  9. 제8항에 있어서, CHO 세포인 포유동물 세포.
  10. 삭제
  11. 삭제
  12. 삭제
  13. 삭제
  14. 삭제
  15. 삭제
  16. 삭제
  17. 삭제
  18. 제4항 내지 제6항 중 어느 한 항에 따른 항CD20 모노클로날 항체를 유효성분으로 하는, 비-호지킨 림프종, 호지킨 림프종, 만성 림프성 백혈병, 급성 림프성 백혈병, 만성 류머티즘 관절염, 자가면역 용혈성 빈혈증, 특발성 혈소판 감소성 자반증, 전신성 홍반성 낭창, 항-인지질 항체 증후군, 쇼그렌 증후군, 크론병, 경피증, 다발성 경화증 및 I형 당뇨병으로 이루어진 그룹으로부터 선택되는 질환을 치료하기 위한 치료제.
  19. 제7항에 따른 항CD20 모노클로날 항체의 아미노산 서열을 암호화하는 염기 서열이 도입된 포유동물 세포.
  20. 제19항에 있어서, CHO 세포인 포유동물 세포.
  21. 삭제
  22. 제18항에 있어서, 항CD20 모노클로날 항체가 사람 보체 또는 이펙터 세포 존재하에서 CD20 항원 발현 세포에 대하여 세포 독성을 갖는, 치료제 .
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Clinical Cancer Research, 2004, Vol. 10, 2868-2878

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