ANTICUERPO MONOCLONAL ANTI-CD20 Campo Técnico La presente invención se relaciona a un anticuerpo monoclonal dirigido al antigeno CD20 humano. La presente invención además se relaciona a un anticuerpo monoclonal anti-CD20 quimérico y a un anticuerpo monoclonal anti-CD20 humanizado producido mediante la recombinación de genes, asi como un agente terapéutico para un tumor mediado por células B o una enfermedad inmunológica que contiene cualquiera de estos anticuerpos como un ingrediente activo. Técnica Antecedente Como anticuerpos monoclonales que reconocen el antigeno CD20 se conocen Bl, 2B8 (nombre del anticuerpo quimérico es rituximab) , 1F5, 2H7 y asi sucesivamente. Ante todo, rituximab, un anticuerpo monoclonal anti-CD20 quimérico desarrollado por IDEC Pharmaceuticals Corporation, U.S., se ha establecido como un agente terapéutico estándar para linfoma no de Hodgkin de baja malignidad (NHL), y se encontró que tiene un efecto terapéutico sobre muchas enfermedades inmunológicas mediadas por célula B. por ejemplo, se dice que es efectivo para, además de tumores malignos tal como leucemia linfática crónica, enfermedades autoinmunes en las cuales un autoanticuerpo patogénico se presenta que esta involucrado tal como la anemia hemolitica autoinmune y la trombocitopenia púrpura idiopática, y enfermedades
inflamatorias tales como artritis reumatoide crónica y esclerosis múltiple (documentos no de patente 14 a 17). CD20 es una molécula presente sobre la superficie de la célula linfática B y la expresión de la misma se observa en las células B normales en la sangre periférica, el bazo, amígdala y medula ósea y asi sucesivamente asi como células B en la mayoría de los tumores malignos. Está molécula comprende 297 residuos de aminoácido, penetra a la membrana celular cuatro veces, y tiene tanto el C-terminal y N-terminal dentro de la célula, y tiene la única vuelta extracelularmente expuesta sin cadena de azúcar que consiste de 43 residuos de aminoácido entre el tercero y el cuarto dominio de transmembrana (documentos no de patente 1 y 9) . La molécula CD20 se piensa que usualmente existe como un tetrámero, y además forma un heterocomplejo con otros componentes menores (documento no de patente 18) . Puesto que la proteina CD20 no es secretada fuera de la célula o segmentada, y además, es difícilmente captada en la célula mediante el enlace de anticuerpo, se puede esperar que un mecanismo citotóxico basado sobre un anticuerpo dirigido a éste contra una célula objetivo trabaja efectivamente (documentos no de patente 1 a 3) . A pesar del tamaño molecular pequeño del mismo, CD20 muestra diversidad de epitope parcialmente debido al efecto de la forma de expresión del mismo como un complejo
fuera de la célula, y los anticuerpos que lo enlazan media respuestas biológicas variadamente diferentes. Por ejemplo, las actividades tal como la regulación hacia abajo de receptores de célula B, incremento de expresiones de antigenos MHC clase II y moléculas de adhesión, la activación de liberación de Ca2+ en la presencia de hiper-reticulación, la inhibición de la adhesión homotipica no dependiente del antigeno 1 asociado con la función de linfocito, la inducción de apoptosis y la actividad opuesta, promoción del crecimiento de la célula, varían significativamente (documentos no de patente 4 a 13) . Los ejemplos típicos del anticuerpo anti-CD20, rituximab, Bl, 1F5 y 2H7, también tienen diferentes características y funciones biológicas, y una referencia a un "anticuerpo monoclonal que enlaza a CD20" sola no puede especificar las propiedades biológicas del mismo . La molécula que constituye el dominio extracelular de CD20 es insoluole. Auque la molécula CD20 derivada de un lisado de célula o como una proteina recombinante de gen puede ser solubilizada al utilizar un surfactante o álcali fuerte, es difícil mantener la estructura tridimensional natural bajo tal condición de tratamiento. Por lo tanto, una cepa de células B positivas de CD20 se utiliza como un inmunógeno para obtener anticuerpos. Sin embargo, la propiedad inmunoestimulante del mismo es débil, y no es fácil
de obtener clones de células que producen anticuerpo maduro. En la fecha del 2005, rituximab, un anticuerpo quimérico de ratón/humano, es el único anticuerpo monoclonal anti-CD20 aprobado como un agente terapéutico. Puesto que las moléculas quiméricas con moléculas heterólogas tienen antigenicidad, ellas no son generalmente preferidas como agentes terapéuticos. Sin embargo, los anticuerpos anti-CD20 tiene una propiedad de dirigirse y eliminar todas las células B incluyendo las células normales, y por lo tanto se dicen que tienen sustancialmente nada de antigenicidad. Sin embargo, ejemplos se han reportado en los cuales un anticuerpo neutralizante es inducido durante el periodo de tratamiento, auque ellos tienen en cuenta solo varios por cientos, y llegarla a ser más probablemente que sea inducido dependiendo de la dosis y el periodo de la dosificación. Por lo tanto, el desarrollo de un anticuerpo humanizado que tiene una secuencia más cercana a aquella del humano o un anticuerpo humano es deseado. Otra desventaja de los anticuerpos quiméricos es la vida media corta en la sangre, y la vida media ß es solamente 3 o 4 dias. La proporción efectiva de rituximab solo contra la recurrencia de NHL de baja malignidad fue un poco menor que 50% en un estudio clínico en los Estados Unidos, indicando que 50% o más pacientes no responden o pobremente responden a rituximab. La proporción de respuesta en pacientes con NHL de malignidad
moderada es aun menor, siendo solo de aproximadamente 30%
(documento no de patente 14) . Por lo tanto, es necesario investigar los factores y el antecedente de las diferentes respuestas en pacientes, y se desea el desarrollo de un anticuerpo que tenga un efecto superior al mismo tiempo. Documento no de patente 1: Leukocyte Fact Book 2nd Edition, Academic Press Documento no de patente 2: Stashenko P y colaboradores, J. Immunol., 1980, 125: 1678-85 Documento no de patente 3: Anderson KC y colaboradores, Blood, 1984, 63: 1424-33 Documento no de patente 4: Shan D y colaboradores, Blood 1998, 91: 1644-52 Documento no de patente 5: Flieger D y colaboradores, Immunol., 2000, 204: 55-63 Documento no de patente 6: Mathas S y colaboradores, Cáncer Res., 2000, 60: 7170-6 Documento no de patente 7: Cardarelli PM y colaboradores, Cáncer Immunol. Immunother., 2002, 51: 15-24 Documento no de patente 8: Pedersen IM y colaboradores, Blood, 2002, 99: 1314-9 Documento no de patente 9: Deans JP y colaboradores, Immunol., 2002, 107: 176-82 Documento no de patente 10: Golay JT y colaboradores, J. Immunol., 1992, 149: 300-8
Documento no de patente 11: Bourger I y colaboradores, Eur. J. Immunol., 1993, 23; 768-71 Documento no de patente 12: White MW y colaboradores, J. Immunol . , 1991, 146: 846-53 Documento no de patente 13: Shan D y colaboradores,
Cáncer Immunol . Immnother., 2000, 48: 673-83 Documento no de patente 14: Coiffier B y colaboradores, Blood, 1998, 92: 1927-32 Documento no de patente 15: Edward JC y colaboradores, Rheumatology (Oxoford) , 2001, 40: 205-11 Documento no de patente 16: Zaja F y colaboradores, Heamatologica, 2002, 87: 189-95 Documento no de patente 17: Perrotta S y colaboradores, Br. J. Haematol., 2002, 116: 465-7 Documento no de patente 18: Polyak MJ y colaboradores, Plood, 2002, 99: 3256-62 Descripción de la Invención Un objetivo de la presente invención es proporcionar un anticuerpo monoclonal que tiene funciones biológicas superiores a aquellas de los agentes terapéuticos de anticuerpo monoclonal anti-CD20 convencionales. Los inventores de la presente invención obtuvieron anticuerpos monoclonales anti-CD20 de murino que específicamente enlazan al antigeno CD20 humano al utilizar dos o más cepas de células B positivas de antigeno CD20,
células mamiferas biotecnológicamente hechas para expresar el antigeno CD20 humano sobre las membranas celulares de las mismas, y la proteina CD20 humana fusionada con la proteina glutationa S-transferasa (GST) en una combinación arbitraria como un inmunógeno. Algunos de estos tienen actividades inhibidoras de crecimiento celular directas incluyendo apoptosis en un cultivo de células que expresan CD20 in vi tro sin células efectoras. Además, sin considerar la presencia o ausencia de las actividades inhibidoras del crecimiento celular tal como apoptosis, estos anticuerpos, incluyendo otros anticuerpos monoclonales anti-CD20 de murino seleccionados, se impartieron con citotoxicidad mediada por célula dependiente de complemento de anticuerpo efectiva mediante quimerización . Al humanizar las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos determinados que tienen las actividades biológicas más deseables entre estos, los anticuerpos monoclonales anti-CD20 que podrían ser utilizados como un agente terapéutico se prepararon. La presente invención de esta manera fue realizada. La presente invención proporciona lo siguiente. (1) Un anticuerpo monoclonal anti-CD20 de murino que tiene actividades inhibidoras de crecimiento celular que incluyen apoptosis contra células que expresan antigeno CD20 humano en cultivo de las células que expresan antigeno CD20 sin células efectoras.
(2) El anticuerpo monoclonal anti-CD20 de acuerdo a (1), en donde las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena H y la región variable de cadena L son SEQ ID NOS: 1 y 7, SEQ ID NOS: 2 y 8, o SEQ ID NOS: 15 y 17. (3) Un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal anti-CD20 de acuerdo a (1) o (2) . (4) Un anticuerpo monoclonal anti-CD20 quimérico, en donde la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo monoclonal anti-CD20 de acuerdo a (2) y la secuencia de aminoácidos de la región constante de inmunoglobulina humana son fusionadas. (5) Un anticuerpo monoclonal anti-CD20 humanizado al utilizar la secuencia de aminoácidos de la región de determinación de complementariedad (CDR) de la región variable del anticuerpo monoclonal anti-CD20 de acuerdo a (2) y una secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina humana. (6) El anticuerpo monoclonal anti-CD20 humanizado de acuerdo a (5), en donde la combinación de las secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena H y la región variable de cadena L es una combinación de SEQ ID NOS: 19 y 23, SEQ ID NOS: 19 y 24, SEQ ID NOS: 19 y 25, SEQ ID NOS: 19 y 26, SEQ ID NOS: 20 y 23, SEQ ID NOS: 20 y 24, SEQ ID NOS: 20 y 25, SEQ ID NOS: 20 y 26, SEQ ID NOS: 21 y 23, SEQ ID NOS: 21 y 24, SEQ ID NOS: 21 y 25, SEQ ID NOS: 21 y 26, SEQ ID NOS: 22 y 23, SEQ ID NOS: 22 y 24, SEQ ID NOS: 22 y 25, o
SEQ ID NOS: 22 y 26. (7) El anticuerpo monoclonal anti-CD20 de acuerdo con cualquiera de (4) a (6), que tiene citotoxicidad contra las células que expresan antigeno CD20 en la presencia de un complemento humano. (8) Una célula mamifera incorporada con una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos del anticuerpo monoclonal anti-CD20 de acuerdo con cualquiera de
(4) a (7) . (9) La célula mamifera de acuerdo con (8), que es una célula de ovario de Hámster Chino (CHO) . (10) Un anticuerpo monoclonal anti-CD20 de murino, en donde la combinación de la secuencias de aminoácidos de la región variable de cadena H y la región variable de cadena L es una combinación de SEQ ID NOS: 3 y 9, SEQ ID NOS: 4 y 10, SEQ ID NOS: 5 y 11, SEQ ID NOS: 6 y 12, o SEQ ID NOS: 16 y 18. (11) Un hibridoma que produce el anticuerpo monoclonal anti-CD20 de acuerdo a (10) . (12) Un anticuerpo monoclonal anti-CD20 quimérico, en donde la secuencia de aminoácidos de la región variable del anticuerpo monoclonal anti-CD20 de acuerdo a (10) y la secuencia de aminoácidos de la región constante de inmunoglobulina humana son fusionadas. (13) Un anticuerpo monoclonal anti-CD20 humanizado al utilizar la secuencia de aminoácidos de la región variable
CDR del anticuerpo monoclonal anti-CD20 de acuerdo a (10) y una secuencia de aminoácidos de inmunoglobulina humana. (14) El anticuerpo monoclonal anti-CD20 de acuerdo a (12) o (13), que tienen citotoxicidad contra células que expresan anti-CD20 en la presencia de un complemento humano. (15) Una célula mamifera incorporada con una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos del anticuerpo monoclonal anti-CD20 de acuerdo con cualquiera de
(12) a (14). (16) La célula mamifera de acuerdo con (15), que es una célula CHO. (17) Un agente de diagnostico que comprende el anticuerpo monoclonal anti-CD20 de acuerdo con cualquiera de (2), (4) a (7), (10) y (12) a (14) como un ingrediente activo. (18) Un agente terapéutico que comprende el anticuerpo monoclonal anti-CD20 de acuerdo con cualquiera de (4) a (7) y (12) a (14) como un ingrediente activo. Los residuos de aminoácidos en las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos monoclonales definidos en lo anterior se pueden remplazar con otros residuos de aminoácidos mientras que las estructuras secundarias y las propiedades biológicas de los mismos no sean significativamente alterados, y tales anticuerpos monoclonales de los cuales se cambian las secuencias de aminoácido como es mencionado en lo anterior también caen en
el alcance de la presente invención. Breve Descripción de los Dibujos [Fig. 1] Estructura de un vector para expresar un anticuerpo recombinante, pNOW-Ab. [Fig. 2] Estructura de un vector para expresar una proteina, pNOW-Ag. [Fig. 3] Secuencias de cebadores para clonar el gen CD20 humano. [Fig. 4] Secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena H y cadena L de los anticuerpos monoclonales anti-CD20 derivado de ratón. [Fig. 5] Resultados de la prueba de apoptosis utilizando los anticuerpos monoclonales anti-CD20 de murino. [Fig. 6] Resultados de la prueba de inhibición de crecimiento celular utilizando los anticuerpos monoclonales de anti-CD20 de murino. [Fig. 7] Resultados de la prueba de citotoxicidad dependiente de complemento utilizando anticuerpo monoclonales anti-CD20 quiméricos. [Fig. 8A] Secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena H y cadena L de anticuerpo monoclonal anti-CD20 humanizados y secuencias de nucleótidos correspondientes a estas. [Fig. 8B] Secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena H y cadena L de anticuerpo monoclonales
ant?-CD20 humanizados y secuencias de nucleótidos correspondientes a estas. [Fig. 9] Resultados de la prueba de inhibición de crecimiento celular utilizando anticuerpos monoclonales anti-CD20 humanizados. Mejor Modo para Llevar a Cabo la Invención En la presente invención, el término "anticuerpo" se utiliza en un significado que comprende anticuerpo en el sentido general, la cadena H y la cadena L que lo constituyen, y fragmentos de los mismos. La presente invención se relaciona a un anticuerpo monoclonal ant?-CD20 que enlaza al antigeno ant?-CD20 humano sobre una membrana celular y tiene actividades biológicas deseables para inducir un efecto terapéutico. El anticuerpo de acuerdo con una primera modalidad de la presente invención es un anticuerpo monoclonal que específicamente enlaza al antigeno CD20 humano sobre una membrana celular y tiene actividades inhibidoras de crecimiento celular incluyendo apoptosis contra células que expresan antigeno CD20 humano en cultivo de las células que expresan antigenos CD20 sin la ayuda de células efectoras. Esto es originalmente un anticuerpo monoclonal ant?-CD20 de murino, y además incluye un anticuerpo monoclonal anti-CD20 obtenido al quimerizar o humanizar ese anticuerpo. Estos anticuerpos tienen actividades inhibidoras de crecimiento
celular directas incluyendo apoptosis contra células que expresan antigeno CD20 humano en el cultivo in vi tro de las células que expresan antigenos CD20 sin la ayuda de células efectoras. Muchos anticuerpos monoclonales anti-CD20 quimerizados o humanizados tienen una citotoxicidad mediada por célula dependiente de complemento y/o de anticuerpo. La propiedad de enlace a un antigeno CD20 sobre una membrana de la célula puede ser examinado mediante ELISA de célula, en la cual células que expresan CD20 tales como células SB y células Raji se adhieren a una placa y se hacen reaccionar a un anticuerpo monoclonal a ser probado. Sin embargo, puesto que los niveles de expresión del antigeno CD20 de estas células son insuficientes, la reactividad no es alta. Por lo tanto, la presente invención, se desarrollo un método de ELISA de célula, en la cual la célula CHO en las cuales CD20 es expresado en una cantidad grande mediante la recombinación de genes (células CD20/CHO) se adhieren a una placa y se hacen reaccionar con un anticuerpo monoclonal a ser probado. En una prueba preliminar de la presente invención, se confirmo que la ELISA de célula utilizando las células CD20/CHO mostró un patrón similar aquel observado en la ELISA de células utilizando la células SB o células Raji en una prueba de reactividad de un anticuerpo monoclonal y mostraron alta sensibilidad (ver el ejemplo, establecimiento del método de clasificación de ELISA de célula CD20/CHO,
Tabla 1) Las actividades inhibidoras del crecimiento celular directas en un cultivo in vi tro de células que expresan antigenos CD20 humano sin células efectoras se pueden determinar por un método usual (Miyamoto T y colaboradores, Avian Dis., Vol. 46(1), 10-16). Además, la habilidad que induce apoptosis se puede determinar mediante una prueba utilizando la citometria de flujo (manchado con annexin V/yoduro de propidio (PI) ) . Ejemplos del anticuerpo de acuerdo con la primera modalidad incluyen anticuerpos monoclonales anti-Cd20 de ratón que tiene una combinación de las secuencias de aminoácidos de la SEQ ID NOS: 1 y 7, SEQ ID NOS: 2 y 8, o SEQ ID NOS: 15 y 17, para la región variable de cadena H y la región variable de cadena L, asi como anticuerpos monoclonales anti-Cd20 obtenidos al quimerizar o humanizar esos anticuerpos. Estos anticuerpos se exhiben actividades inhibidoras de crecimiento celular directas incluyendo la apoptosis contra células que expresan antigenos CD20 humano en cultivo in vi tro de las células que expresan antigenos CD20 sin la ayuda de células efectoras estos anticuerpos también tienen citotoxicidad mediada por células dependiente del complemento y/o de anticuerpo. La presente invención también incluye un hibridoma que produce un anticuerpo de murino y una célula mamifera (células CHO en los ejemplo)
incorporada con una secuencia de nucleótido correspondiente a cualquiera de las secuencia de aminoácido de los anticuerpos quiméricos o humanizados. La quimerización se lleva a cabo al fusionar la secuencia de aminoácidos de la región variable de cadena H de un anticuerpo monoclonal de murino y la secuencia de aminoácido de la región constante de la cadena H de inmunoglobulina humana, y la secuencia de aminoácido de la región variable de la cadena L y la secuencia de aminoácido de la región constante de cadena L de inmunoglobulina humana (Ishida T y colaboradores, Nippon Rinsho, Vol. 60, No 3, 439-444). Los anticuerpos humanizados se diseñan al utilizar una secuencia de aminoácido de la región variable CDR de un anticuerpo monoclonal de murino y una secuencia de aminoácido de inmunoglobulina humana. Los anticuerpos monoclonales anti-Cd20 humanizados preferidos como agentes terapéuticos son seleccionados al compara características de varios anticuerpos variadamente diseñados (Padlan EA, Mol. Immunol., Vol. 28, No 4/5, 489-498; Wu TT y Kabat EA, Mol. Immunol . , Vol. 29, No 9, 1141-1146; Padlan EA y colaboradores, FASEB., Vol. 9, 133-139) . Los anticuerpos monoclonales anti-Cd20 quimerizados o humanizados además tienen citotoxicidad dependiente de complemento (CDC) , y citotoxicidad mediada por célula dependiente de anticuerpo (ADCC) en la presencia de células
efectoras. Como para los métodos de prueba para estos CDC y
ADCC, los métodos comúnmente utilizados puede ser referidos a
(Manches 0 y colaboradores, Blood, 2003, 101(3), 949-54;
Idusogie EE y colaboradores, J. Immunol., 2000, 164, 4178-4184) . Ejemplos específicos de los anticuerpos monoclonales anti-Cd20 humanizados incluyen aquellos que tienen una combinación de las secuencias de aminoácidos de SEQ ID NOS: 19 y 23, SEQ ID NOS: 19 y 24, SEQ ID NOS: 19 y 25, SEQ ID NOS: 19 y 26, SEQ ID NOS: 20 y 23, SEQ ID NOS: 20 y 24, SEQ ID NOS: 20 y 25, SEQ ID NOS: 20 y 26, SEQ ID NOS: 21 y 23, SEQ ID NOS: 21 y 24, SEQ ID NOS: 21 y 25, SEQ ID NOS: 21 y 26, SEQ ID NOS: 22 y 23, SEQ ID NOS: 22 y 24, SEQ ID NOS: 22 y 25, o SEQ ID NOS: 22 y 26 para la región variable de cadena H y la región variable de cadena L. El anticuerpo de cuerdo con una segunda modalidad de la presente invención es un anticuerpo monoclonal de murino que específicamente enlaza al antigeno CD20 humanos o de una membrana celular, y no exhibe actividades inhibidoras del crecimiento celular incluyendo apoptosis o exhiben tales actividades en un nivel no tan alto. Sin embargo, estos anticuerpos de murino pueden ser impartidos con actividad CDC o ADCC mediante la quimerización o humanización. Estas actividades citotóxicas también son actividades biológicas importantes y por lo tanto el anticuerpo monoclonal anti-CD20
de la segunda modalidad también puede ser un candidato prometedor de agente terapéutico. Ejemplos del anticuerpo de acuerdo con la segunda modalidad incluyen anticuerpos monoclonales anti-CD20 de murino que tiene una combinación de la secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NOS: 3 y 4, SEQ ID NOS: 4 y 10, SEQ ID NOS: 5 y 11, SEQ ID NOS: 6 y 11, o SEQ ID NOS: 16 y 18 para la región variable de cadena H y la región variable de cadena L asi como anticuerpos monoclonales anti-CD20 obtenidos al quimerizar o humanizar esos anticuerpos. La presente invención también incluye un hibridoma que produce el anticuerpo de murino, y una célula mamifera (célula CHO en el ejemplo) incorporadas a una secuencia de nucleótido correspondiente a cualquiera de las secuencias de aminoácidos de los anticuerpos quiméricos o humanizados. El método para determinar la propiedad de enlace al antigeno anti-CD20 sobre una membrana celular, varios métodos de prueba para determinar la inhibición del crecimiento celular, apoptosis, ADCC, CDC, y asi sucesivamente, y el método de preparación para anticuerpos quiméricos y humanizados son similares aquellos mencionados para el anticuerpo de la primera modalidad. Tanto el anticuerpo monoclonal anti-CD20 quimérico como el anticuerpo monoclonal anti-CD20 humanizado descritos como los anticuerpos de la primera modalidad y la segunda
modalidad se pueden esperar que exhiban efectos superior como un agente terapéutico para tumores malignos mediados por célula B y enfermedades inmunológicas en las cuales las células B o anticuerpos producidos por la célula B estas involucrados, y un objetivo de la presente invención es utilizar en los desarrollo un agente terapéutico que contiene ya sea un anticuerpo monoclonal anti-CD20 quimérico o humanizado, deseablemente un anticuerpo monoclonal anti-CD20 humanizado, como un ingrediente activo. Ejemplos de las enfermedades objetiva incluyen el linfoma no de Hodgkin, linfoma de Hodgkin, leucemia linfática crónica leucemia linfática aguda, artritis reumatoide crónica, anemia hemolitica anti-inmune, trombocitopenia púrpura idiomática, lupus eritematoso sistémico, síndrome de anticuerpo anti-fosfolipido, síndrome de Sjogren, síndrome de enfermedad de Crohn, escleroderma, esclerosis múltiple, diabetes de tipo I, y asi sucesivamente. El anticuerpo monoclonal de murino de la presente invención se puede preparar mediante el siguiente método. Como un inmunógeno para la sensibilización, la célula SB o célula Raji como una cepa de células que expresa el antigeno CD20 humano, y las células CHO echa para expresar el antigeno CD20 humano pueden ser utilizadas en combinación. Además, una proteina CD20 humana fusionada con GST (GST-CD20) se puede utilizar como un antigeno sensibilizarte
complementario. Un hibridoma que produce un anticuerpo monoclonal puede ser preparado mediante una serie de procedimientos que incluyen (1) la inmunización de un animal a ser inmunizado (ratón), (2) preparación de linfocitos del animal inmunizado, (3) preparación de células parentales, (4) fusión celular de los linfocitos y las células parentales, (5) clasificación y (6) clonación (Biochemistry Experment Method: Monoclonal antibody, griten by Ailsa M. Campbell, translated by Toshiaki osawa, osawa, Tokyo kagaku Dozin Co . , Ltd., 1989). Un anticuerpo monoclonal anti-CD20 que específicamente enlaza al antigeno CD20 sobre una superficie celular puede ser clonado al a ser reaccionar un anticuerpo monoclonal a ser probado con un sistema de ELISA de célula en la cual la célula CD20/CHO son inmovilizadas en una placa. También se pueden utilizar vectores de expresión comercialmente disponibles. Sin embargo, puesto que el antigeno CD20 necesita ser expresado sobre la célula CHO en una alta densidad, un vector de alta expresión de célula mamifera, pong (Patente Japonesa No. 35829659) puede ser utilizado. Un criterio de selección del anticuerpo monoclonal es la exhibición de reactividad comparable con o más alta de aquella de un control positivo. Un anticuerpo quimerizado o humanizado se puede preparar de acuerdo con un método de recombinación de gen usual. Por ejemplo, pNOW-Ab, que contiene dos conjuntos de
sitios de multiclonación posesionados en tándem para producir el anticuerpo, y es incorporado de antemano con los genes que codifican las regiones constante de cadena H y la cadena L humanas, se puede utilizar como un vector de expresión (Fig. 1) . [Ejemplo 1] Preparación, quimerización y humanización de anticuerpos monoclonales dirigidos al antigeno de CD20 asi como la prueba para características de los anticuerpos obtenidos serán explicados enseguida con referencia a los ejemplos . (1) Preparación de inmunógeno para sensibilizar un ratón El gen CD20 humano se obtuvo de una librería de cDNA al utilizar un cebador 5' de la SEQ ID NOS: 13 y un cebador 3' de la SEQ ID NOS: 14, que son específicos al gen que codifica la molécula total del CD20 humano (Múltiple Choice cDNA human apleen, Origene Technologies, Inc., 6 taft Court, Suite 100, Rockville, MD 20850) . Específicamente, los cebadores mostrados en la Fig. 3 se utilizaron. El gen CD20 se incorporó en pNOW-Ag (Fig. 2) como un vector de alta expresión para células mamiferas, y se transfectó en células CHO como las células hospederas. Las células CHO recombinantes (células CD20/CHO) que expresan moléculas CD20 en un alto nivel en sus superficies celulares se establecieron mediante el análisis de FACS. Las células que
muestran 5 o más veces más alta intensidad de fluorescencia comparada con las células SB de inmunomanchado de los anticuerpos monoclonales anti-CD20 marcados con FITC se definieron como aquellos que muestran alta expresión. El GST-CD20, y el inmunógeno complementario, se preparó en fusionar GST en el N-terminal de 43 residuos de aminoácido del dominio extracelular CD20 al utilizar el vector pGEX-4T2 (G y colaboradores, AM; Electrophoresis, Vol. 20(2): 344-348). (2) Preparación del inmunógeno Las células SB o células Raji se cultivaron en el medio RPMI 1640 adicionado con FCS al 10%. Las células CD20/CHO se cultivaron en el medio CHO-S-SFM II (GIBCO, Cat . No. 12052-098) adicionado con 80 µg/ml de G418. Estos cultivos se centrifugaron (1100 rpm, 5 minutos), luego las células se adicionaron con PBS(-) de Dulbecco y se suspendieron, y la suspensión se centrifugó nuevamente. Este procedimiento de lavado se repitió una vez nuevamente, y una suspensión preparada al adicionar solución salina fisiológica a las células (conteo de células: 1 a 3 x 107/ml) se utilizó para inmunización. El pGEX-4T2 incorporado con CD20/CHO se introdujo en las células competentes de E . coli . Las células competentes se Usaron después del cultivo, y CD20/CD20 se purifico de manera cruda a partir de las células Usadas, y luego se solubilizó mediante la adición de hidróxido de sodio 0.1 N.
(3) Inmunización y fusión de la célula Como animales para ser inmunizados, se utilizaron ratones hembras Balb/c de 7 a 11 semanas de edad. Las células SB, las células Raji o células CD20/CHO se administraron repetidamente dos veces o tres veces en intervalos en varios números de dias, luego un antigeno de célula diferente (células SB, células Raji o CD20/CHO) se selecciono y se utilizó para la inmunización final. El conteo de células administradas fue 1 a 3 x 107 por ratón sin considerar el tipo de célula. Además, inmunización complementaria se realizó al utilizar GST-CD20 para una parte de los ratones. Tres dias después de la inmunización final, las células del bazo se extrajeron de los ratones, y se suspendieron en medio RPMI, y una reacción de fusión con mieloma de ratón (NS.l) se llevo a cavo en la presencia de PEG-1500 (Oi, VT colaboradores. Herzenberg, 1980, in: Selected Methods in Cellular Immunology; Mishell B y colaboradores. (Freeman y Co., San Francisco, CA) p. 351). (4) Establecimiento del método de clasificación de ELISA de célula CD20/CHO Varios anticuerpos monoclonales anti-CD20 de murino y 2B8 se hicieron reaccionar al utilizar placas de 96 cavidades a las cuales se adhirieron las células SB, células
Raji, células CD20/CHO y las lineas de células parentales de CD20 CHO. Se confirmó que en estas pruebas de ELISA de
célula, tendencias similares se observaron para las concentraciones de anticuerpo, y se encontró que comparaciones relativas dentro de los anticuerpos y con un control también fueron posibles. Debido a la alta densidad de los antigenos de la célula de superficies adheridas a la placa en la ELISA de células CD20/CHO, se observo una absorbencia en un nivel que permite suficientemente la detención uniforme con una concentración relativamente baja de la muestra de anticuerpo de prueba, y se encontró que es un sistema de medición sensible. Los resultados de la medición específicos se muestran en la Tabla 1.
O
Tabla 1 Comparaci n de ELISA de célula SB, ELISA de célula Rají y ELISA de célula CD20/CHO
ELISA de célula Fa;j? (A492) ELISA de célula SB (A492) Anticuerpo Concentración de anticuerpo ng/ml) Concentración de anticuerpo (ng/ml) 1000 320 100 32 10 3 1000 320 100 32 10 3 1K1228 1.683 1.170 0.678 0.326 0.148 nt 1.265 0.931 0.452 0.192 0.08: nt 1K1257 1.775 1.263 0.782 0.445 0.177 0.096 1.509 1.143 0.570 0.276 0.119 0.055 1K1402 1.228 0.525 0.214 0.102 0.061 0.049 0.763 0.400 0.152 0.095 0.066 0.057 1K1422 0.748 0.277 0.121 0.057 0.046 0.049 0.403 0.147 0.071 0.039 0.036 0.051 1K1428 1.196 0.514 0.222 0.104 0.067 0.057 1.111 0.509 0.252 0.108 0.058 0.061 1K1436A 0.887 0.376 0.191 0.105 0.058 0.058 0.959 0.445 0.264 0.120 0.067 0.065 2B8 0.329 0.121 0.055 0.038 0.034 0.046 0.337 0.091 0.045 0.038 0.037 0.053 t-J
NC 0.035 0.028 4--
ELISA de célula CD20/CHO (A492) ELISA de célula CHO (cepa parental) (A492) Concentración de anticuerpo (ng/ml) Concentración de anticuerpo (ng/ml) Anticuerpo 1000 320 100 32 10 3 1000 320 100 32 10 3 1K1228 3.056 2.704 2.091 1.275 0.572 0.265 0.081 0.040 0.038 0.034 0.038 nt 1K1257 3.184 2.576 1.924 1.223 0.604 0.271 0.095 0.053 0.038 0.039 0.037 0.029 1K1402 1.877 1.574 1.486 0.824 0.389 0.174 0.385 0.170 0.085 0.063 0.070 0.065 1K1422 2.230 1.327 0.842 0.238 0.105 0.068 0.164 0.068 0.046 0.047 0.035 0.067 1K1428 2.544 2.448 2.190 0.967 0.463 0.283 0.564 0.213 0.091 0-056 0.050 0.060 1K1436A 2.432 2.369 2.278 1.101 0.559 0.286 0.375 0.153 0.072 0.043 0.043 0.060 2B8 2.293 1.664 1.090 0.561 0.174 0.089 0.056 0.040 0.045 0.035 0.044 0.060 NC 0.070 0.029
(5) Clasificación mediante ELISA de célula La ELISA de célula se realizó al utilizar una placa de 96 cavidades a la cual se adhirieron las células CD20/CHO células CHO (linea de células parentales CD20) y las cavidades se seleccionaron en las cuales se produjeron anticuerpos específicamente reactivos de CD20. 2B8 se utilizó como un control positivo, y un anticuerpo monoclonal de ratón dirigido al antigeno CD3 humano (BD PharMingen) se utilizó como un control negativo. Específicamente, las células CD20/CHO o células CHO (linea de células parental) adherida a una placa de 96 cavidades recubierta con poli-L-lisina (Asahi Techno Glass Corporation, Cat . No. 11-023-018) se utilizaron para la ELISA de célula. En una solución de bloqueo (gelatina 0.2% y solución al BSA 0.5% en PBS) se adicionó en un volumen de 150 µl a cada cavidad y se dejó reposar bajo 37°C durante 1 hora. Luego, la placa se lavo 5 veces con NaCl 150 mM y solución acuosa de t een 20 al 0.05%, y 100 µl de cada muestra (solución diluida de sobrenadante de cultivo) se adicionó a cada cavidad para realizar la reacción primaria en 37 °C durante 1 hora. Después del lavado, 100 µl en solución diluida y un anticuerpo marcado [anticuerpo de conejo IgG(H+L) anti-ratón marcado con HRP) Jackson Lab., Código No. 315-035-003) o anticuerpo de conejo IgG(Fc?) anti-ratón marcado con HRP (Jackson Lab., Código No. 315-035-008)] se adicionó a cada cavidad para realizar la reacción secundaria
a 37 °C durante 1 hora. Para la preparación de las mezclas de reacción para las reacciones primarias y secundarias, una solución como la misma de la solución de bloqueo se utilizó. Después de lavado, 100 µl de una solución de desarrollo de color (OPD) se adicionó a cada cavidad, 30 minutos después 50 µl de N H2S04 se adicionó para terminar la reacción, y la absorbencia se midió a 492 nm (a492) . Luego, las cavidades que muestran reactividad comparable a significativamente más alta que aquellas de 2B8 se seleccionaron. (6) Clonación La clonación se llevó a cabo mediante el método de dilución limitada. Las células se sembraron sobre una placa de 96 cavidades y se cultivaron, luego la ELISA de célula para la célula CD20/CHO se realizó para el sobrenadante de cultivo de una cavidad que contiene una colonia para seleccionar un clon que produce un anticuerpo especifico. (7) Preparación de anticuerpo purificado El clon que produce un anticuerpo especifico se cultivó en el medio RPMI 1640 adicionado por FCS al 10%. Luego la densidad de la célula llego a ser de aproximadamente 5 x 105/ml, el medio se remplazo con un medio libre de suero, ASF-104N (Ajinomoto Co. Inc.), y el cultivo se continuo. Luego, 2 a 4 dias después, en medio de cultivo se centrifugó, y un sobrenadante de cultivo se recolecto y se sometió a la purificación utilizando una columna de proteina G. La
solución de anticuerpo monoclonales diluidas se dializó contra NaCl 150 mM. La solución se sometió a la esterilización por filtración utilizando un filtro que tiene un tamaño de acuerdo de 0.2 µl y se utilizó como un anticuerpo de prueba (anticuerpo monoclonal de ratón CD20 anti-humano) . Los clones de anticuerpo monoclonales que muestran afinidad de enlace comparable de aquella de control positivo se seleccionaron mediante la ELISA de célula CD20/CHO. Las secuencias de genes de regiones variables de estos anticuerpos se determinaron, y las secuencias de aminoácidos de los mismos se determinaron como un resultado. Las secuencias de la región variable de la cadena H y la región variable de la cadena L de anticuerpos típicos se muestran en SEQ ID NOS: 1 y 7, SEQ ID NOS: 2 y 8, SEQ ID NOS: 3 y 9, SEQ ID NOS: 4 y 10, SEQ ID NOS: 5 y 11, SEQ ID NOS: 6 y 12, SEQ ID NOS: 15 y 17, y SEQ ID NOS: 16 y 18 (Fig. 4). Además, se investigaron adicionalmente las características biológicas de estos clones. Prueba característica biológica (1): prueba de inducción de apoptosis La habilidad para inducir apoptosis de los anticuerpos de prueba se determinó mediante la citometria de flujo (manchado de annexina V/PI). 2B8 se utilizó como un control positivo como el anticuerpo monoclonal de ratón
dirigido al CD3 humano (BD PharMingen) se utilizó como un control negativo. Los procedimientos fueron como siguen. Equipo de Apoptosis MEBCYTO (MBL, Cat . No. 4700, Lote. 20) se utilizó. Las células Raji se centrifugaron, y luego se suspendieron en un medio de RPMI 1640 fresco (Sigma, Cat. No. R8758, Late 44K2416) que contiene FCS10% (inactivado) (ICN, Cat. No. 2916754, Lote 8005C) , y 1 mi de la suspensión a una densidad de de 5 x 105 células/ml se adicionó a cada cavidad de una placa de 12 cavidades. Doce cavidades se utilizaron para cada anticuerpo, y cada anticuerpo se adiciona a una concentración final de 2 µm/ml o 4 µg/ml (3 cavidades x 2 concentraciones diferentes x 2 puntos de tiempo, 12 cavidades en total) . Un dia y dos dias después del inicio del cultivo, el medio de cultivo contiene aproximadamente 2 x 105 células se recolectó y se centrifugó, y luego las células se lavaron con PBS. Subsecuentemente, 85 µl en una solución reguladora de enlace se adicionó a las células para suspender las células en la solución reguladora. Además, a la suspensión se adicionó 10 µl de annexin V-FITC y 5 µl de PI, se mezclaron lo suficiente, y se dejaron reaccionar a temperatura ambiente durante 15 minutos con protección de luz. La medición se realizo mediante la citometria de flujo (FACS Calibur, Becton Dickinson) , y los resultados se analizaron al utilizar
CellQuest (becton Dickinson) . Los resultados de medición de 8 clases de los anticuerpos monoclonales anti-CD20 de murino típicos, control positivo (2B8) y control negativo (anticuerpo anti-CD3) se muestra en la Fig. 5. en general, la habilidad para inducir apoptosis de 2B8 se dice que alta. Han comparado con esto, el clon del cual las secuencias de aminoácido de la región variable de la cadena H y la región variable de cadena L fuero aquellos de la SEQ ID NOS: 2 y 8 (1K1791) mostraron una actividad para inducir apoptosis marcadamente más alta. La muerte celular claramente debido a la apoptosis también se observó con los clones de los cuales la secuencias de aminoácidos de la región variables de cadena H y la región variable de cadena L fueron aquellas de la SEQ ID NOS: 1 y 7 (1K1422) y SEQ ID NOS: 15 y 17 (1K0924). Prueba característica biológica (2): prueba de inhibición del crecimiento celular Una suspensión de células Raji 5 x 104 células/ml se preparó con el medio RPMI 1640 adicionado con FCS el 10%, y se adicionó en una placa de 96 cavidades en un volumen de 100 µl/cavidad, y se realizó el cultivo. Después de 24 horas, 50 µl/cavidad de cada solución de anticuerpo se adicionó a una concentración de anticuerpo de 0.01 µg/ml, 0.1 µg/ml o 1 µg/ml, y el cultivo se continúo. Setenta y dos horas después de la adición del anticuerpo 10 µl/cavidad de una solución de
rebelado de color, equipo de control y células-8 (Dojindo Laboratorios, Cat. No. 343-07623, Lote SG076) se adicionó, las células se cultivaron durante 4 horas adicionales y luego la absorbencia se midió en 492 nm. Los conteos de células vivas de las 8 clases típicas de anticuerpos monoclonales anti-CD20 de murino del control positivo (2B8) se muestra en la Fig. 6 como porcentajes basados en aquel del control negativo (100%). El efecto inhibidor del crecimiento celular se puede estimar sobre la base de la proporción del conteo de células vivas disminuido comparado con aquel del control negativo. La inhibición del crecimiento celular clara se observó con 1K0924, 1K1422, 1K1791 y 2B8 como el control positivo, y la inhibición fue particularmente marcada con 1K1791. Esta tendencia fue consistente con los resultados de la prueba de inducción de apoptosis. Preparación de anticuerpos quiméricos Los genes que codifican las regiones variables de cadena H y cadena L de cada anticuerpo de murino se incorporaron en pNOW-Ab, un vector de alta expresión para las células CHO que ya contienen los genes que codifican las regiones constantes de cadena H y de cadena L (K) de inmunoglobulina humana como un cásete. Cada vector de expresión se transfectó en células CHO, y los clones que muestran alta productividad se seleccionaron para cada anticuerpo.
Prueba para la propiedad de enlace al antigeno CD20 de anticuerpos quiméricos Las 8 clases preparadas de anticuerpos monoclonales anti-CD20 quiméricos se examinaron para la reactividad al antigeno CD20 humano mediante la ELISA de células CD20/CHO. Rituximab (c2B8) se utilizó como un control positivo. Los resultados de la prueba se muestran en la Tabla 2. Los valores medidos en la ELISA de células (A492) refleja la intensidad de la propiedad de enlace. Estos anticuerpos muestran la afinidad sustancialmente comparable a o más alta que aquella del control excepto que clK0924 y clK1422 tendieron a mostrar afinidad ligeramente menor que aquella del control. Tabla 2 prueba de ELISA de célula CD20/CHO de anticuerpo quiméricos anti-CD20 Anticuerpo ELISA de células CD20/CHO (A492) concentración de Anticuerpo (ng/ml) 100 32 10 3 1 0
C1K0924 1.423 0.724 0.391 0.186 0.094 0.032
C1K1228 2.226 1.580 0.701 0.289 0.120 0.032
C1K1402 2.449 1.621 0.737 0.349 0.116 0.032
C1K1422 1.919 0.912 0.357 0.151 0.077 C1K1712 2.292 1.683 0.793 0.359 0.145 C1K1736 2.428 1.548 0.748 0.320 0.122 C1K1782 2.101 1.017 0.505 0.169 0.074
C1K1791 2.231 1.458 0.745 0.276 0.108 c2B8 2.147 1.143 0.536 0.226 0.088 Prueba de CDC de anticuerpos quiméricos Las 8 clases preparadas de anticuerpos monoclonales anti-CD20 quiméricos se examinaron para la actividad de CDC. Rituximab (c2B8) se utilizó como un control positivo. RC-K8 (obtenido de Koci Medical School) se utilizó con las células objetivo. Como un medio para el uso, RHB (medio basal: RPMI-1640, aditivos: BSA al 0.1%, HEPES 20 mM (pH 7.2), glutamina 2 mM, 100 unidades/ml de penicilina G, 100 µg/ml de estreptomicina) se preparó y se utilizó. Las células objetivos se lavaron con RHB y se resuspendieron en 10d células/ml. En un volumen de 50 µl de cada una de la solución de los anticuerpos quiméricos de prueba y rituximab que tienen concentraciones diferentes 50 µl de una solución diluida 4 veces de un complemento humano comercialmente disponible (Quidel, San Diego, CA, Cat. A113), y 50 µl de una suspensión de célula que contiene 106 células/ml se adicionaron a cada cavidad de una placa de cultivo de tejido de 96 cavidades de fondo plano (negras) . La concentración de anticuerpo en la mezcla de 150 µl/cavidad se ajustó en 0.1, 1 y 10 µg/ml. Para promover la lisis de célula mediada por complemento, la mezcla se incubó bajo las condiciones de 37 °C y C02 durante 2 horas. A la mezcla se adicionó 50 µl de azul alamar (no diluido, prescripción de AccuMed Internacional,
Biosource, Cat. DAL1100), y la reacción se permitió adicionalmente durante la noche bajo las mismas condiciones. La placa se dejo a temperatura ambiente durante 10 minutos para enfriarse, en la fluorescencia se midió a 590 nm para la emisión con excitación en 530 nm al utilizar un lector de micro placa de fluorescencia. Los resultados se representaron en términos de la intensidad de fluorescencias (RFU) . La proporción de actividad de CDC se calculó de acuerdo con la siguiente ecuación: % de actividades CDC = 100 x [RFU (anticuerpo no adicionado) RFU (anticuerpo no adicionado) ]/ [RFU (anticuerpo no adicionado] - RFU (Tritón x - 100 adicionado) ] Los resultados se muestran en la Fig. 7. Excepto para clK1712, los anticuerpos mostraron actividades CDC substancialmente comparables a o más altas que aquellas de C2B2 de control positivo. Preparación de anticuerpos humanizados Los anticuerpos humanizados se diseñaron basado en la región variable CDR del anticuerpo monoclonal anti-CD20 de murino 1K1791. Al realizar el análisis estructural basado en las secuencias de aminoácidos y al cambiar adicionalmente el método de diseño, 4 clases de secuencias humanizadas se prepararon para cada una de la cadena H y la cadena L (Parlan EA, Mol. Immunol., Vol. 28, No 4/5, 489-498; Wu TT y Rabat EA, Mol. Immunol., Vol. 29, No 9, 1141-1146; Parlan EA y
colaboradores, FASEB J. , Vol. 9, 133-139). Los anticuerpos se prepararon con todas las combinaciones posibles de los cuatro tipos para cada una de la cadena H y la cadena L. Estas secuencias de aminoácidos se muestran en la SEQ ID NOS: 19 y 23, SEQ ID NOS: 19 y 24, SEQ ID NOS: 19 y 25, SEQ ID NOS: 19 26, SEQ ID NOS: 20 y 23, SEQ ID NOS: 20 y 24, SEQ ID NOS: 20 y 25, SEQ ID NOS: 20 y 26, SEQ ID NOS:21 y 23, SEQ ID NOS: 21 y 24, SEQ ID NOS: 21 y 25, SEQ ID NOS: 21 y 26, SEQ ID NOS: 22 y 23, SEQ ID NOS: 22 y 24, SEQ ID NOS:22 y 25, y SEQ ID NOS: 22 y 26 (Figs. 8A y 8B) . Las secuencias de aminoácidos de estas 4 clases de regiones variables de cadena H y 4 clases de regiones variables de cadena L se convirtieron en secuencias de DNA (nucleótido) con codones más frecuentemente utilizados en la secuencias de genes humanos, y algunos de estos nucleótido se cambiaron considerando la adaptabilidad en las células CHO hospederas sin cambiar los residuos de aminoácidos originales (Kim CH y colaboradores, Gene, 1997, 15; 199 (1-2): 293-301). Específicamente, utilizadas como las secuencias de nucleótidos correspondientes en las secuencias de aminoácido fueron aquellas de SEQ ID NOS: 27 correspondiente a SEQ ID NOS: 19, SEQ ID NOS: 28 correspondiente a SEQ ID NOS: 20, SEQ ID NOS: 29 correspondiente a SEQ ID NOS: 21, SEQ ID NOS: 30 correspondiente a SEQ ID NOS: 22, SEQ ID NOS: 31
correspondiente a SEQ ID NOS:23, SEQ ID NOS: 32 correspondiente a SEQ ID NOS: 24, SEQ ID NOS: 33 correspondiente a SEQ ID NOS: 25 y SEQ ID NOS: 34 correspondiente a SEQ ID NOS: 26 (Fig. 8A y Fig. 8B) . De estas secuencias de nucleótidos, los nucleótidos se pueden remplazar con otros nucleótidos mientras que no se han alteradas las secuencias de aminoácidos correspondientes. Las 8 clases totales de las secuencias de aminoácidos de las regiones variables de cadena H (SEQ ID NOS: 27 a 30) y las regiones variables de cadena L (SEQ ID NOS: 31 a 34) se sintetizaron (Takara Shuzo Co., Ltd.) y se incorporado en pNOW-Ab, como un vector de expresión para células mamiferas que contienen un sitio de multiclonación. Los vectores de expresión incorporados en cada uno de estos genes de anticuerpo humanizados se transfectaron en células CHO, y los clones que muestran alta productividad se seleccionaron para cada anticuerpo. Prueba de característica biológica e inhibición de crecimiento celular para anticuerpos humanizados Una suspensión que contiene 5 x loVml de las células Raji se preparó con el medio RPMI 1640 adicionado con FCS al 10% y se adicionaron a una placa de 96 cavidades en un volumen de 100 µl/cavidad y se realizó el cultivo. Después de 24 horas, 50 µl/cavidad de cada solución de anticuerpo se adicionó una concentración de anticuerpo de 0.5 µg/ml, y se
continúo el cultivo. 72 horas después de la adición del anticuerpo 10 µl cavidad y una solución de regulado de color, equipo de de conteo de células-8 (Dojindo Laboratorios, Cat. No. 343-07623, Lote SG076) se adicionó. El cultivo se realizó durante 4 horas adicionales, y luego la absorbencia se midió en 492nm. Los controles de células vivas de 15 clases (27 clones) de cada 16 clases de anticuerpos humanizados derivados de 1K1791 y c2B8 (otro nombre de rituximab) como el control positivo se muestra en la Fig. 9 como proporciones basadas en aquellas del control negativo (100%). El efecto inhibidor de crecimiento celular se puede estimar en la base de la proporción del control de células vivas disminuidas comparado con aquel del control negativo, y el efecto inhibidor de crecimiento se observó para todos los clones en esta prueba. Los nombres de anticuerpos monoclonales y los números de secuencia descritos en esta especificación y los dibujos adjuntos se resumen como sigue.
o
Tabla 3 Nombre del anticuerpo de Región Región Nombre del Región variable humanizada ratón variable de 1 a variable de la anticuerpo (cadena H/cadena L) cadena H cadena L quimérico
1K1422 SEQ ID NO: 1 SEQ ID NO: 7 C1K1422 1K1791 SEQ ID NO: 2 SEQ ID NO: 8 C1K1791 SEQ ID NOS: 19 y" 23 SEQ ID NOS: 19 y 24 SEQ ID NOS: 19 y 25 SEQ ID NOS: 19 y 26 SEQ ID NOS: 20 y 23 SEQ ID NOS: 20 y 24 SEQ ID NOS: 20 y 25 SEQ ID NOS: 20 y 26 SEQ ID NOS: 21 * 23 -4 SEQ ID NOS: 21 y 24 SEQ ID NOS: 21 25 SEQ ID NOS: 21 y 26 SEQ ID NOS: 22 y 23 SEQ ID NOS: 22 y 24 SEQ ID NOS: 22 y 25 SEQ ID NOS: 22 y 26 1K1712 SEQ ID NO: 3 SEQ ID NO: 9 C1K1712 1K1402 SEQ ID NO: 4 SEQ ID NO: 10 C1K1402 1K1736 SEQ ID NO: 5 SEQ ID NO: 11 C1K1736 1K1782 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 12 C1K1782 1K0924 SEQ ID NO: 15 1 SEQ ID NO: 17 C1K0924 1K1228 SEQ ID NO: 16 SEQ ID NO: 18 C1K1228
Los hibridomas que producen estos anticuerpos monoclonales se nombraron sobre la base de los nombres de los anticuerpos producidos de esta manera, e internacionalmente depositados en el Instituto Nacional de Ciencia y Tecnología Industrial Avanzada, depositario de organismos de patente internacional (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-Ken, 305-8566, Japón) el 28 de Marzo del 2006 bajo las provisiones del tratado de Budapest, y los números de acceso asignados de FERM BP-10587 (1K1422), FERM BP-10591 (1K1791), FERM BP-10588 (1K1712), FERM BP-10586 (1K1402), FERM BP-10589 (1K1736), FERM BP-10590 (1K1782), FERM BP-10584 (1K0924) y FERM BP-10585 (1K1228). Campo de Aplicación Industrial La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal que tiene actividades biológicas adecuadas para el uso como un agente terapéutico.