BRPI0609543A2

BRPI0609543A2 - anticorpo monoclonal anti-cd20, hibridoma, célula de mamìfero, agente de diagnóstico, e, agente terapêutico

Info

Publication number: BRPI0609543A2
Application number: BRPI0609543-7A
Authority: BR
Inventors: Masanori Numazaki; Tetsuo Nakamura; Sadakazu Usuda; Eduardo A Padlan
Original assignee: Biomedics Inc
Priority date: 2005-03-31
Filing date: 2006-03-31
Publication date: 2011-10-18
Also published as: IL186387A0; CA2603414A1; RU2007140257A; AU2010214745A1; DE602006019565D1; EP2143795A3; US8101179B2; DK2143795T3; PL2143795T3; EP1865058A4; EP1865058B1; HK1111728A1; EP2143795A2; IL206783A; KR20070116175A; ATE495248T1; TWI381050B; CA2603414C; AU2010214745B2; WO2006106959A1

Abstract

ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CD2O, HIBRIDOMA, CéLULA DE MAMìFERO, AGENTE DE DIAGNóSTICO, E, AGENTE TERAPêUTICO. Divulga-se um anticorpo monoclonal capaz de induzir uma reação biológica específica através da ligação do anticorpo monoclonal a um antígeno CD2O na superficie de uma célula. Clona-se um anticorpo monoclonal apresentando uma alta afinidade de ligação a um epitopo extracelular de um antígeno CD2O e também apresentando atividades biológicas incluindo uma atividade inibidora de crescimento celular. O anticorpo monoclonal é quimerizado ou humanizado para desenvolver um agente terapêutico para uma doença em que células B estão envolvidas.

Description

ANTICORPO MONOCLONAL ANTI-CD20, HIBRIDOMA, CÉLULA DE MAMÍFERO, AGENTE DE DIAGNÓSTICO, E, AGENTE TERAPÊUTICO" Campo técnico

A presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal dirigido a um antígeno CD20 humano. A presente invenção refere-se adicionalmente a um anticorpo monoclonal anti-CD20 quimérico e um anticorpo monoclonal anti-CD20 humanizado produzido por meio de recombinação gênica, e também como um agente terapêutico para um tumor mediado com células B ou uma doença imunológica contendo qualquer um destes anticorpos como um ingrediente ativo.

Técnica anterior

Como anticorpos monoclonais que reconhecem o antígeno CD20, conhece-se BI, 2B8 (nome do anticorpo quimérico é rituximab), 1F5, 2H7 e outros. Acima de tudo, rituximab, um anticorpo monoclonal anti-CD20 quimérico desenvolvido pela IDEC Pharmaceuticals Corporation, U.S., foi estabelecido como um agente terapêutico padrão para linfoma não-Hodgkin (NHL, non-Hodkirís lymphoma) de baixa malignidade, e verificou-se que apresenta um efeito terapêutico sobre muitas doença imunológicas mediadas com células B. Por exemplo, afirma-se que é efetivo para, adicionalmente a tumores malignos, como leucemia linfática crônica, doenças auto-imunes em que um auto-anticorpo patogênico parece estar envolvido, como anemia hemolítica auto-imune e trombocitopenia púrpura idiopática, e doenças inflamatórias, como artrite reumatóide crônica e esclerose múltipla (documentos não-patente de 14 a 17).

CD20 é uma molécula presente na superfície de células linfáticas B e- sua expressão é observada em células B normais no sangue periférico, baço, amídala e medula óssea etc, e também células B na maior parte dos tumores malignos. Esta molécula compreende 297 radicais de aminoácidos, penetra uma membrana celular quatro vezes, e apresenta ambas as pontas C e N no interior da célula, e apresenta a única alça exposta extracelularmente sem cadeia açúcar que consiste de 43 radicais de aminoácidos entre os terceiro e quarto domínios de transmembrana (documentos não-patente 1 e 9). Ensina-se que a molécula CD20 existe usualmente como um tetrâmero, e formam adicionalmente um heterocomplexo com outros componentes menores (documento não patente 18). Como a proteína de CD20 não é secretada da célula ou clivada, e, adicionalmente, dificilmente é absorvida na célula por meio de ligação de anticorpo, pode-se esperar que um mecanismo citotóxico baseado em um anticorpo dirigido para o mesmo atue efetivamente contra uma célula-alvo (documentos não-patente de 1 a 3).

Apesar do seu pequeno tamanho molecular, CD20 mostra diversidade de epitopo parcialmente devido ao efeito da sua forma de expressão como um complexo fora da célula, e anticorpos que o ligam mediam respostas biológicas diversamente diferentes. Por exemplo, atividades, como regulagem negativa de receptores de células B, aumento de expressões de moléculas de adesão e antígenos de classe II MHC, ativação da liberação de Ca2+ na presença de hiper-reticulação, inibição de adesão homotípica não-dependente de antígeno 1 associado com função de linfócitos, indução de apoptose e a atividade oposta, promoção de crescimento celular, variam significamente (documentos não-patente de 4 a 13). Os exemplos típicos de anticorpo anti-CD20, rituximab, BI, 1F5 e 2H7, também apresentam diferentes características e funções biológicas, e uma referência a um "anticorpo monoclonal que se liga a CD20" sozinha não pode especificar suas propriedades biológicas.

A molécula que constitui o domínio extracelular de CD20 é insolúvel. Embora a molécula de CD20 derivada de um lisado de células ou como uma proteína recombinante de gene pode ser solubilizada por meio do uso de um tensoativo ou álcali forte, é difícil manter a estrutura tridimensional natural sob uma condição de tratamento do tipo referido. Portanto, usa-se uma cepa de células B positivas para CD20 como um imunogene para obter anticorpos. No entanto, sua propriedade imunoestimuladora é fraca, e não é fácil obter clones de células maduras produtoras de anticorpos.

Desde 2005, rituximab, um anticorpo quimérico de camundongo/humano, é o único anticorpo monoclonal anti-CD20 aprovado como um agente terapêutico. Como moléculas quiméricas com moléculas heterólogas apresentam antigenicidade, elas não são geralmente preferidas como agentes terapêuticos. No entanto, anticorpos anti-CD20 apresentam a propriedade de objetivar e eliminar todas as células B incluindo células normais, e, portanto, afirma-se que apresentam substancialmente nenhuma antigenicidade. No entanto, reportou-se exemplos em que um anticorpo neutralizador é induzido durante o período de tratamento, embora eles possam contribuir apenas para diversos percentuais, e poderia tornar-se mais provável de ser induzido dependendo da dose e do período de dosagem. Portanto, deseja-se o desenvolvimento de um anticorpo humanizado apresentando uma seqüência mais próxima daquela de humano ou de um anticorpo humano. Outra desvantagem de anticorpos quiméricos é a curta meia-vida no sangue, e a meia-vida β é de apenas 3 ou 4 dias. A taxa efetiva do rituximab apenas contra a recorrência de NHL de baixa malignidade foi um pouco menor do que 50% em um estudo clínico nos Estados Unidos, indicando que 50% ou mais pacientes não respondem ou respondem fracamente ao rituximab. A taxa de resposta em pacientes com NHL de malignidade moderada é ainda mais baixa, sendo de apenas 30% (documento não patente 14). Portanto, é necessário investigar os fatores e o fundo das diferentes respostas em pacientes, e deseja-se ao mesmo tempo o desenvolvimento de um anticorpo apresentando um efeito superior.

Documento não patente 1: Leukocyte Fact Book 2a edição, Academic Press Documento não patente 2: Stashenko P et al., J. Immunol., 1980, 125: 1678- 85

Documento não patente 3: Anderson KC et al., Blood, 1984, 63: 1424-33

Documento não patente 4: Shan D et al., Blood, 1998, 91: 1644-52

Documento não patente 5: Flieger D et al., Cell Immunol., 2000,204: 55-63

Documento não patente 6: Mathas S et al., Câncer Res., 2000, 60: 7170-6

Documento não patente 7: Cardarelli PM et al., Câncer Immunol. Immunother., 2002, 51: 15-24;

Documento não patente 8: Pedersen IM et al., Blood, 2002, 99: 1314-9;

Documento não patente 9: Deans JP et al., Imminol., 2002, 107: 176-82

Documento não patente 10: Golay JT et al., J. Immunol., 1992, 149: 300-8

Documento não patente 11: Bourger I et al., Eur. J. Immunol., 1993, 23: 768- 71

Documento não patente 12: White MW et al., J. Immunol., 1991, 146: 846-53

Documento não patente 13: Shan D et al., Câncer Immunol. Immnother., 2000,48:673-83

Documento não patente 14: Coiffier B et al., Blood, 1998, 92: 1927-32

Documento não patente 15: Edward JC et al., Rheumatology (Oxford), 2001, 40: 205-11

Documento não patente 16: Zaja F et al., Heamatologica, 2002, 87: 189-95

Documento não patente 17: Perrotta S et al., Br. J. Haematol., 2002, 116: 465- 7

Documento não patente 18: Polyak MJ et al., Blood, 2002, 99: 3256-62

Descrição da invenção

Um objeto da presente invenção consiste em proporcionar um anticorpo monoclonal apresentando funções biológicas superiores àquelas de agentes terapêuticos convencionais de anticorpos monoclonais anti-CD20.

Da presente invenção obtiveram anticorpos monoclonais anti- CD20 de murino que se ligam especificamente ao antígeno CD20 humano por meio do uso de duas ou mais cepas de células B positivas para antígeno CD20, células de mamífero preparadas biotecnologicamente para expressar o antígeno CD20 humano sobre suas membranas celulares, e a proteína CD20 humana fundida com proteína glutationa S-transferase (GST) em uma combinação arbitrária como um imunogene. Alguns apresentaram atividades inibidoras de crescimento celular direto incluindo apoptose em uma cultura de células expressando CD20 in vitro sem células efetoras. Adicionalmente, independente da presença ou da ausência das atividades inibidoras de crescimento celular, como apoptose, estes anticorpos, incluindo outros anticorpos monoclonais anti-CD20 de murino selecionados, foram dotados com efetiva citotoxicidade mediada com células dependente de complemento ou anticorpo, por meio de quimerização. Por meio da humanização das seqüências de aminoácidos dos anticorpos determinados como apresentando as atividades biológicas mais desejáveis entre os mesmos, preparou-se anticorpos monoclonais anti-CD20 que poderiam ser usados como um agente terapêutico. Assim, realizou-se a presente invenção.

A presente invenção proporciona o seguinte.

(1) Um anticorpo monoclonal anti-CD20 de murino apresentando atividades inibidoras de crescimento celular incluindo apoptose contra células que expressam antígeno CD20 humano em cultura das células que expressam antígeno CD20 sem células efetoras.

(2) O anticorpo monoclonal anti-CD20 de acordo com (1), sendo que as seqüências de aminoácidos da região variável de cadeia H e da região variável de cadeia L são SEQ ID NOS: 1 e 7, SEQ ID NOS: 2 e 8, ou SEQ ID NOS: 15 e 17.

(3) Um hibridoma produzindo o anticorpo monoclonal anti- CD20 de acordo com (1) ou (2). (4) Um anticorpo monoclonal anti-CD20 quimérico, em que a seqüência de aminoácidos da região variável do anticorpo monoclonal anti- CD20 de acordo com (2) e a seqüência de aminoácidos da região constante de imunoglobulina humana são fundidas.

(5) Um anticorpo monoclonal anti-CD20 humanizado por meio do uso da seqüência de aminoácidos da região determinadora de complementaridade (CDR) da região variável do anticorpo monoclonal anti- CD20 de acordo com (2) e uma seqüência de aminoácidos de imunoglobulina humana.

(6) O anticorpo monoclonal anti-CD20 humanizado de acordo com

(5), sendo que a combinação das seqüências de aminoácidos da região variável de cadeia H e da região variável de cadeia L é uma combinação das SEQ ID NOS: 19 e 23, SEQ ID NOS: 19 e 24, SEQ ID NOS: 19 e 25, SEQ ID NOS: 19 e 26, SEQ ID NOS: 20 e 23, SEQ ID NOS: 20 e 24, SEQ ID NOS: 20 e 25, SEQ ID NOS: 20 e 26, SEQ ID NOS: 21 e 23, SEQ ID NOS: 21 e 24, SEQ ID NOS: 21 e 25, SEQ ID NOS: 21 e 26, SEQ ID NOS: 22 e 23, SEQ ID NOS: 22 e 24, SEQ ID NOS: 22 e 25, ou SEQ ID NOS: 22 e 26.

(7) O anticorpo monoclonal anti-CD20 de acordo com qualquer um de (4) a (6), que apresenta citotoxicidade contra células que expressam antígeno CD20 na presença de um complemento humano.

(8) Célula de mamífero incorporada com uma seqüência de nucleotídeos apresentando a seqüência de aminoácidos do anticorpo monoclonal anti-CD20 de acordo com qualquer um de (4) a (7).

(9) A célula de mamífero de acordo com (8), que é uma célula de ovário de hâmster chinês (CHO, Chinese Hamster Ovary).

(10) Um anticorpo monoclonal anti-CD20 de murino, sendo que a combinação das seqüências de aminoácidos da região variável de cadeia H e da região variável de cadeia L é uma combinação das SEQ ID NOS: 3 e 9, SEQ ID NOS: 4 e 10, SEQ ID NOS: 5 e 11, SEQ ID NOS: 6 e 12, ou SEQ ID NOS: 16 e 18.

(11) Um hibridoma que produz o anticorpo monoclonal anti- CD20 de acordo com (10).

(12) Um anticorpo monoclonal anti-CD20 quimérico, sendo que a seqüência de aminoácidos da região variável do anticorpo monoclonal anti-CD20 de acordo com (10) e a seqüência de aminoácidos da região constante de imunoglobulina humana são fundidas.

(13) Um anticorpo monoclonal anti-CD20 humanizado por meio do uso da seqüência de aminoácidos da região variável CDR do anticorpo monoclonal anti-CD20 de acordo com (10) e uma seqüência de aminoácidos de imunoglobulina humana.

(14) O anticorpo monoclonal anti-CD20 de acordo com (12) ou (13), que apresenta citotoxicidade contra células que expressam antígeno CD20 na presença de um complemento humano.

(15) Uma célula de mamífero incorporada com uma seqüência de nucleotídeos codificando a seqüência de aminoácidos do anticorpo monoclonal anti-CD20 de acordo com qualquer um de (12) a (14).

(16) A célula de mamífero de acordo com (15), que é uma célula de CHO.

(17) Um agente de diagnóstico compreendendo o anticorpo monoclonal anti-CD20 de acordo com qualquer um de (2), de (4) a (7), (10) e de (12) a (14) como um ingrediente ativo.

(18) Um agente terapêutico compreendendo o anticorpo monoclonal anti-CD20 de acordo com qualquer um de (4) a (7) e de (12) a (14) como um ingrediente ativo.

Radicais de aminoácidos nas seqüências de aminoácidos dos anticorpos monoclonais definidos acima podem ser substituídos por outros radicais de aminoácidos desde que as estruturas secundárias e suas propriedades biológicas não sejam alteradas significativamente, e referidos anticorpos monoclonais cujas seqüências de aminoácidos são alteradas como mencionado acima também se enquadram no escopo da presente invenção.

Breve descrição dos desenhos

[Fig. 1] Estrutura de um vetor para expressar um anticorpo recombinante, pNOW-Ab.

[Fig. 2] Estrutura de um vetor para expressar uma proteína, pNOW-Ag.

[Fig. 3] Seqüências de iniciadores para clonagem de gene de CD20 humano.

[Fig. 4] Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis de cadeia H e de cadeia L de anticorpos monoclonais anti-CD20 de murino.

[Fig. 5] Resultados de teste de apoptose usando anticorpos monoclonais anti-CD20 de murino.

[Fig. 6] Resultados de teste de inibição de crescimento celular usando anticorpos monoclonais anti-CD20 de murino.

[Fig. 7] Resultados de teste de citotoxicidade dependente de complemento usando anticorpos monoclonais anti-CD20 quiméricos.

[Fig. 8A] Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis de cadeia H e de cadeia L de anticorpos monoclonais anti-CD20 humanizados e seqüências de nucleotídeos correspondendo aos mesmos.

[Fig. 8B] Seqüências de aminoácidos de regiões variáveis de cadeia H e de cadeia L de anticorpos monoclonais anti-CD20 humanizados e seqüências de nucleotídeos correspondendo aos mesmos.

[Fig. 9] Resultados de teste de inibição de crescimento celular usando anticorpos monoclonais anti-CD20 humanizados. Melhor modo de realizar a invenção

Na presente invenção, o termo "anticorpo" é usado em um significado que compreende anticorpo no sentido geral, cadeia H e cadeia L constituindo o mesmo, e fragmentos do mesmo.

A presente invenção refere-se a um anticorpo monoclonal anti- CD20 que se liga ao antígeno de CD20 humano em uma membrana celular e apresenta atividades biológicas desejáveis para induzir um efeito terapêutico.

O anticorpo de acordo com uma primeira concretização da presente invenção é um anticorpo monoclonal que se liga especificamente ao antígeno CD20 humano em uma membrana celular e apresenta atividades inibidoras de crescimento celular incluindo apoptose contra células que expressam antígeno CD20 humano em cultura das células que expressam antígeno CD20 sem o auxílio de células efetoras. Isto é originalmente um anticorpo monoclonal anti-CD20 de murino, e inclui adicionalmente um anticorpo monoclonal anti-CD20 obtido por meio de quimerização ou humanização daquele anticorpo. Estes anticorpos apresentam atividades inibidoras de crescimento celular diretas incluindo apoptose contra células que expressam antígeno CD20 humano em cultura in vitro das células que expressam antígeno CD20 sem o auxílio de células efetoras. Estes anticorpos monoclonais anti-CD20 quimerizados ou humanizados apresentam uma citotoxicidade mediada com célula dependente de complemento e/ou anticorpo.

A propriedade de ligação a um antígeno de CD20 em uma membrana de célula pode ser examinada por meio de ELISA de células, em que células que expressam CD20, como células SB e células Raj i, são aderidas a uma placa e reagidas com um anticorpo monoclonal a ser testado. No entanto, como níveis de expressão do antígeno de CD20 destas células são insuficientes, a reatividade não é alta. Portanto, na presente invenção, desenvolveu-se um método de ELISA de células, em que células de CHO em que CD20 é expresso numa grande quantidade por meio de recombinação gênica (células CD20/CHO) são aderidas a uma placa e reagidas com um anticorpo monoclonal a ser testado. Em um teste preliminar da presente invenção confirmou-se que ELISA de células usando as células CD20/CHO apresentou um padrão similar àquele observado em ELISA de células usando as células SB ou células Raji em um teste de reatividade de um anticorpo monoclonal, e mostrou alta sensibilidade (ver o exemplo, Determinação do Método de Seleção de ELISA de células CD20/CHO, Tabela 1).

As atividades inibidoras de crescimento celular diretas em uma cultura in vitro de células que expressam antígeno CD20 humano sem células efetoras podem ser determinadas por meio de um método usual (Miyamoto T et al., Avian Dis., vol. 46(1), 10-16). Adicionalmente, a capacidade de indução de apoptose pode ser determinada por meio de um teste que emprega citometria de fluxo (manchamento com iodeto de propídio (PI)/ anexina V).

Exemplos do anticorpo de acordo com a primeira concretização incluem anticorpos monoclonais anti-CD20 de camundongo apresentando uma combinação das seqüências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 1 e 7, SEQ ED NOS: 2 e 8, ou SEQ ID NOS: 15 e 17 para a região variável de cadeia Hea região variável de cadeia L, e também anticorpos monoclonais anti-CD20 obtidos por meio dentre quimerização ou humanização daqueles anticorpos. Estes anticorpos apresentam atividades inibidoras de crescimento celular diretas incluindo apoptose contra células que expressam antígeno CD20 humano em cultura in vitro das células que expressam antígeno CD20 sem o auxílio de células efetoras. Estes anticorpos também apresentam citotoxicidade mediada com célula dependente de complemento e/ou anticorpo. A presente invenção também inclui um hibridoma que produz um anticorpo de murino, e uma célula de mamífero (célula de CHO nos exemplos) incorporada com uma seqüência de nucleotídeos correspondente a qualquer uma das seqüências de aminoácidos dos anticorpos quiméricos ou humanizados.

A quimerização é realizada por meio de fusão da seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia H de um anticorpo monoclonal de murino e a seqüência de aminoácidos da região constante de cadeia H de imunoglobulina humana, e a seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia Lea seqüência de aminoácidos da região constante de cadeia L de imunoglobulina humana (Ishida T et al., Nippon Rinsho, vol. 60, n° 3, 439- 444). Anticorpos humanizados são projetados usando-se seqüências de aminoácidos da região variável CDR de um anticorpo monoclonal de murino e uma seqüência de aminoácidos de imunoglobulina humana. Anticorpos monoclonais anti-CD20 humanizados preferidos como agentes terapêuticos são selecionados comparando-se características de diversos anticorpos projetados (Padlan EA, Mol. Immunol., Vol. 28, No 4/5, 489-498; Wu TT e Kabat EA, Mol. Immunol., Vol. 29, No 9, 1141-1146; Padlan EA et al., FASEB J., Vol. 9, 133-139).

Anticorpos monoclonais anti-CD20 humanizados ou quimerizados apresentam adicionalmente citotoxicidade dependente de complemento (CDC, complement-dependent cytotoxicity), e citotoxicidade mediada com célula dependente de anticorpo (ADCC, antibody-dependent cell-mediated cytotoxicity) na presença de células efetoras. Quanto a métodos de teste para estas CDC e ADCC, métodos comumente usados podem ser referidos (Manches O et al., Blood, 2003, 101(3), 949-54; Idusogie EE et al., J. Immunol., 2000, 164, 4178-4184).

Exemplos específicos dos anticorpos monoclonais anti-CD20 humanizados incluem aqueles apresentando uma combinação das seqüências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 19 e 23, SEQ ID NOS: 19 e 24, SEQ ID NOS: 19 e 25, SEQ ID NOS: 19 e 26, SEQ ID NOS: 20 e 23, SEQ ID NOS: e 24, SEQ ID NOS: 20 e 25, SEQID NOS: 20 e 26, SEQID NOS: 21 e 23, SEQ ID NOS: 21 e 24, SEQ ID NOS: 21 e 25, SEQ ID NOS: 21 e 26, SEQ ID NOS: 22 e 23, SEQ ID NOS: 22 e 24, SEQ ID NOS: 22 e 25, ou SEQ ID NOS: 22 e 26 para a região variável de cadeia Hea região variável de cadeia L.

O anticorpo de acordo com uma segundo concretização da presente invenção é um anticorpo monoclonal de murino que se liga especificamente ao antígeno de CD20 humano em uma membrana de célula, e não apresenta atividades inibidoras de crescimento celular incluindo apoptose ou apresenta referidas atividades em um nível não tão alto. No entanto, estes anticorpos de murino podem ser dotados com atividade de CDC ou ADCC por meio de quimerização ou humanização. Estas atividades citotóxicas também são atividades biológicas importantes, e, portanto, o anticorpo monoclonal anti-CD20 da segunda concretização também pode ser um candidato promissor para agente terapêutico.

Exemplos do anticorpo de acordo com a segunda concretização incluem anticorpos monoclonais anti-CD20 de murino apresentando uma combinação das seqüências de aminoácidos das SEQ ID NOS: 3 e 9, SEQ ID NOS: 4 e 10, SEQ ID NOS: 5 e 11, SEQ ID NOS: 6 e 12, ou SEQ ID NOS: 16 e 18 para a região variável de cadeia Hea região variável de cadeia L, e também anticorpos monoclonais anti-CD20 obtidos por meio de quimerização ou humanização daqueles anticorpos. A presente invenção também inclui um hibridoma que produz o anticorpo de murino, e uma célula de mamífero (células de CHO no exemplo) incorporada com uma seqüência de nucleotídeos correspondente a qualquer uma das seqüências de aminoácidos dos anticorpos quiméricos ou humanizados.

O método para determinar a propriedade de ligação ao antígeno de CD20 em uma membrana de célula, vários métodos de teste para determinar inibição do crescimento de células, apoptose, ADCC, CDC, etc, e o método de preparação para anticorpos quiméricos ou humanizados são similares àqueles mencionados para o anticorpo da primeira concretização.

Pode-se esperar que tanto o anticorpo monoclonal anti-CD20 quimérico como também o anticorpo monoclonal anti-CD20 humanizado descritos como os anticorpos da primeira concretização e a segunda concretização podem apresentar efeito superior como um agente terapêutico para tumores malignos mediados com células B e doenças imunológicas em que células B ou anticorpos produzidos por meio de células B estão envolvidas, e um objeto da presente invenção consiste em usar os mesmos no desenvolvimento de um agente terapêutico contendo um anticorpo monoclonal anti-CD20 quimérico ou humanizado, desejavelmente um anticorpo monoclonal anti-CD20 humanizado, como um ingrediente ativo. Exemplos das doenças objetivas incluem linfoma não-Hodgkin, linfoma de Hodgkin5 leucemia linfática crônica, leucemia linfática aguda, artrite reumatóide crônica, anemia hemolítica auto-imune, trombocitopenia púrpura idiopática, lúpus eritematoso sistêmico, síndrome do anticorpo anti- fosfolipídeo, síndrome de Sjogren, doença de Crohn, escleroderma, esclerose múltipla, diabetes de tipo I, etc.

O anticorpo monoclonal de murino da presente invenção pode ser preparado por meio do método a seguir.

Como um imunogene para sensibilização, a célula SB ou célula Raji como uma cepa de células que expressa o antígeno de CD20 humano, e célula de CHO preparada para expressar o antígeno de CD20 humano podem ser usadas em combinação. Adicionalmente, é possível usar uma proteína de CD20 humana fundida com GST (GST-CD20) como um antígeno sensibilizador complementar.

É possível preparar um hibridoma que produz um anticorpo monoclonal por meio de uma série de procedimentos que incluem (1) imunização de um animal a ser imunizado (murino), (2) preparação de linfócitos do animal imunizado, (3) preparação de células originárias, (4) fusão celular dos linfócitos e das células originárias, (5) seleção e (6) clonagem (Biochemistry Experiment Method: Monoclonal Antibody, escrito por Ailsa M. Campbell, traduzido por Toshiaki Osawa, Tokyo Kagaku Dozin Co., Ltd., 1989). Um anticorpo monoclonal anti-CD20 que se liga especificamente ao antígeno de CD20 em uma superfície celular pode ser clonado por meio de reação de um anticorpo monoclonal a ser testado com um sistema de ELISA de células em que células CD20/CHC) são imobilizadas sobre uma placa. Também é possível usar vetores de expressão comercialmente obteníveis. No entanto, como o antígeno de CD20 precisa ser expresso na célula de CHO com alta densidade, é possível usar um vetor de expressão elevada de célula de mamífero, pNOW (Patente Japonesa n° 3582965). Um critério de seleção do anticorpo monoclonal é a apresentação de reatividade comparável ou superior àquela de um controle positivo.

Um anticorpo quimerizado ou humanizado pode ser preparado de acordo com um método usual de recombinação genética. Por exemplo, pNOW-Ab, que contém 2 conjuntos de sítios de clonagem múltipla posicionados em tandem para produção de anticorpo, e é incorporado previamente com os genes que codificam regiões constantes de cadeia H e de cadeia L humanas, pode ser usado como um vetor de expressão (Fig. 1).

Exemplo 1

Preparação, quimerização e humanização de anticorpos monoclonais dirigidos ao antígeno de CD20 e também teste de características dos anticorpos obtidos serão explicados abaixo com referência aos exemplos. (1) Preparação de imunogene para sensibilizar camundongo

O gene de CD20 humano foi obtido de uma biblioteca de cDNA por meio do uso de um iniciador a 5' da SEQ ID NO: 13 e um iniciador a 3' da SEQ ID NO: 14, que são específicos para o gene que codifica a molécula total do CD20 humano (Multiple Choice cDNA human spleen [n.t.: cDNA de baço humano], Origene Technologies, Inc., 6 Tafl Court, Suite 100, Rockville, MD 20850). Especificamente, usou-se os iniciadores mostrados na Fig. 3. O gene de CD20 foi incorporado em pNOW-Ag (Fig. 2) como um vetor de expressão elevado para células de mamífero, e transfectado para células de CHO como as células hospedeiras. Células de CHO recombinantes (células CD20/CHO) expressando moléculas de CD20 em um nível mais elevado em suas superfícies celulares foram estabelecidos por meio de análise de FACS. Células apresentando 5 ou mais vezes mais intensidade de fluorescência, em comparação com a célula SB no manchamento com anticorpos monoclonais anti-CD20 marcados com FITC foram definidos como aqueles que apresentam elevada expressão. GST-CD20, o imunogene complementar, foi preparado fundindo-se GST na ponta N de 43 radicais de aminoácidos do domínio extracelular de CD20 por meio do uso do vetor pGEX-4T2 (G et ai. AM, Electrophoresis, vol. 20(2): 344-348). (2) Preparação de imunogene

As células SB ou células Raji foram cultivadas em meio RPMI 1640 que recebeu a adição de FCS a 10%. As células CD20/CHO foram cultivadas em meio CHO-S-SFM II (GIBCO, N0 de catálogo 12052-098) adicionadas com 800 μg/ml de G418. Estas culturas foram centrifugadas (1100 rpm, 5 minutos), depois as células foram adicionadas com PBS (-) Dulbecco e suspensas, e a suspensão foi novamente centrifugada. Este procedimento de lavagem foi repetido mais uma vez, e usou-se uma suspensão por meio de adição de solução salina fisiológica às células (contagem de células: 1 to 3 χ 10 /ml) para imunização. pGEX-4T2 incorporado com GST-CD20 foi introduzida em células de E. coli competentes. As células competentes foram lisadas após a cultura, e GST- CD20 foi purificado grosseiramente das células lisadas, e, então, solubilizado por meio de adição de hidróxido de sódio 0,1 N. (3) Imunização e fusão de células

Os animais a serem imunizados, camundongos BALB/c fêmeas com de 7 a 11 semanas de vida foram usados. As células SB, células Raji ou células CD20/CHO foram repetidamente administradas duas ou três vezes em intervalos de vários dias, depois selecionou-se um antígeno de célula diferente (células SB, células Raji ou células CD20/CHC)) e usado para imunização final. A contagem de células administradas foi de 1 a 3 χ 10 por camundongo independentemente do tipo de célula. Adicionalmente, realizou-se imunização complementar usando GST-CD20 para uma parte dos camundongos. Três dias após a imunização final, células de baço foram extraídas dos camundongos, e suspensas no meio RPMI, e realizou-se uma reação de fusão com mieloma de camundongo (NS-I) na presença de PEG-1500 (Oi, VT et. Herzenberg, 1980, em: Selected Methods in Cellular Immunology; Mishell B et ai. (Freeman e Co., São Francisco, CA) p.351).

(4) Determinação do método de seleção de ELISA de células CD20/CHO

Vários anticorpos monoclonais anti-CD20 de murino e 2B8 foram reagidos usando-se placas de 96 poços em que se aderiu as células SB, células Raji, células CD20/CHO e linhagem de célula originária CD20 CHO. Confirmou-se que nestes testes de ELISA de células foi possível observar tendências similares para as concentrações de anticorpo, e verificou-se que também foram possíveis comparações relativas entre os anticorpos e com um controle. Em virtude da alta densidade dos antígenos de células de superfície aderidos à placa no ELISA de células CD20/CHO, observou-se uma absorbância em um nível que permite suficientemente a detecção mesmo com uma concentração relativamente baixa da amostra de anticorpo de teste, e verificou-se que é um sistema de medição sensível. Os resultados de medição específicos são mostrados na Tabela 1. <table>table see original document page 18</column></row><table> (5) Seleção por meio de ELISA de células

ELISA de células foi realizada empregando-se uma placa de 96 poços em que se aderiu as células CD20/CHO ou células de CHO (linhagem de célula originária CD20), e selecionou-se poços em que se produziu anticorpos especificamente reativos a CD20. Usou-se 2B8 como um controle positivo, e usou-se como um controle negativo um anticorpo monoclonal de camundongo dirigido ao antígeno de CD3 humano (BD PharMingen). Especificamente, as células CD20/CHC) ou células de CHO (linhagem de célula originária) que aderiram a uma placa de 96 poços revestida com poli-L-lisina (Asahi Techno Glass Corporation, n° de catálogo 11-023-018) foram usadas para ELISA de células. Adicionou-se uma solução de bloqueio (0,2% de gelatina e 0,5% de solução BSA em PBS) a um volume de 150 μl em cada poço e isto foi deixado descansar a 37°C durante 1 hora. Em seguida, a placa foi lavada 5 vezes com 150 mM de NaCl e 0,05% de solução aquosa de Tween 20, e 100 μΐ de cada amostra (solução diluída de sobrenadante de cultura) em cada poço para realizar a reação primária a 37°C durante 1 hora. Após a lavagem, adicionou-se em cada poço 100 μl de uma solução diluída de um anticorpo marcado [anticorpo de coelho IgG anti-camundongo marcada com HRP (H+L) (Jackson Lab., código n° 315-035-003) ou anticorpo de coelho IgG(Fcy) anti-camundongo marcado com HRP (Jackson Lab., código n° 315-035- 008)] para realizar a reação secundária a 37°C durante 1 hora. Para a preparação das misturas de reação para as reações primárias e secundárias, usou-se uma solução igual à solução de bloqueio. Após a lavagem adicionou-se 100 μl de uma solução de desenvolvimento de cor (OPD) em cada poço, 30 minutos mais tarde adicionou-se 50 μl de H2SO4 4 N para terminar a reação, e mediu-se a absorbância a 492 nm (A492). Em seguida, selecionou-se poços apresentando reatividade comparável ou significativamente superior àquela de 2-B8. (6) Clonagem

A clonagem foi realizada com o método de diluição limitada.

Células foram semeadas em uma placa de 96 poços e cultivadas, depois realizou-se ELISA de células para células CD20/CHO para sobrenadante de cultura de um poço contendo 1 colônia para selecionar um clone que produz um anticorpo específico.

(7) Preparação de anticorpo purificado

O clone que produz um anticorpo específico foi cultivado em meio RPMI 1640 com adição de FCS a 10%. Quando toda a densidade de células se tornou cerca de 5 x 105/ml, o meio foi substituído por um meio isento de soro, ASF-104N (Ajinomoto Co. Inc.), e continuou-se com a cultura. Em seguida, de 2 a 4 dias mais tarde, o meio de cultura foi centrifugado, e o sobrenadante de cultura foi recolhido e submetido a purificação usando uma coluna de proteína G. A solução eluída de anticorpo monoclonal foi dialisada contra 150 mM de NaCl. A solução foi submetida a esterilização com filtração usando-se um filtro apresentando um tamanho de poros de 0,2 μm e empregada como um anticorpo de teste (anticorpo monoclonal de mouse CD20 anti-humano).

Clones de anticorpo monoclonal apresentando afinidade de ligação comparável com aquela do controle positivo foram selecionados com ELISA de células CD20/CHO. As seqüências de genes de regiões variáveis destes anticorpos foram determinadas, e, como um resultado, determinou-se as suas seqüências de aminoácidos. As seqüências da região variável de cadeia H e da região variável de cadeia L de anticorpos típicos são mostradas nas SEQ ID NOS: 1 e 7, SEQ ID NOS: 2 e 8, SEQ ID NOS: 3 e 9, SEQ ID NOS: 4 e 10, SEQ ID NOS: 5 e 11, SEQ ID NOS: 6 e 12, SEQ ID NOS: 15 e 17, e SEQ ID NOS: 16 e 18 (Fig. 4). Adicionalmente, investigou-se características biológicas destes clones. Teste de característica biológica Cl): Teste de indução de apoptose

A capacidade de indução de apoptose dos anticorpos de teste foi determinada por meio de citometria de fluxo (manchamento com PI/anexina V). Usou-se 2B8 como um controle positivo, e usou-se anticorpo monoclonal de camundongo dirigido para o CD3 humano (BD PharMingen) como um controle negativo. Os procedimentos foram como a seguir.

Usou-se o kit de apoptose MEBCYTO (MBL, n° de catálogo 4700, Lot. 20).

As células Raji foram centrifugadas, e então suspensas em um meio RPMI 1640 fresco (Sigma, n° de catálogo R8758, lote 44K2416) contendo FCS a 10% (inativado) (ICN, n° de catálogo 2916754, lote 8005C), e adicionou-se 1 ml da suspensão a uma densidade de 5 χ 105 células/ml em cada poço de uma placa de 12 poços. Usou-se vinte poços para cada anticorpo, e cada anticorpo foi adicionado a uma concentração final de 2 μg/ml ou 4 μg/ml (3 poços χ 2 concentrações diferentes χ 2 momentos no tempo, 12 poços ao todo).

Um dia e dois dias após o início da cultura, o meio de cultura contendo cerca de 2 χ 105 células foi recolhido e centrifugado, e então as células foram lavadas uma vez com PBS. Subseqüentemente, adicionou-se 85 μL de um tamponador de ligação às células para suspender as células no tamponador. Adicionalmente, adicionou-se à suspensão 10 μL de FITC- anexina V e 5 μΐ de PI, misturando-se suficientemente, e isto foi deixado reagir à temperatura ambiente durante 15 minutos com proteção contra luz. A medição foi realizada por meio de citometria de fluxo (FACS Calibur, Becton Dickinson), e os resultados foram analisados com CellQuest (Becton Dickinson).

Os resultados de medição de 8 tipos dos anticorpos monoclonais anti-CD20 de murino típicos, controle positivo (2B8), e controle negativo (anticorpo anti-CD3) são mostrados na Fig. 5. De uma forma geral, afirma-se que a capacidade de 2B8 de induzir apoptose é elevada. Mesmo comparado com isto, o clone cujas seqüências de aminoácidos da região variável de cadeia H e da região variável de cadeia L foram aquelas das SEQ ID NOS: 2 e 8 (1K1791) apresentou uma atividade indutora de apoptose marcantemente maior. Observou-se também morte celular devida a apoptose no caso dos clones cuja seqüência de aminoácidos da região variável de cadeia H e da região variável de cadeia L foram aquelas das SEQ ID NOS: 1 e 7 (1K1422) e SEQ ID NOS: 15 e 17 (1K0924). Teste de característica biológica (2): Teste de inibição de crescimento celular

Preparou-se uma suspensão de 5 χ IO4 células/ml de células Raji com meio RPMI 1640 que recebeu a adição de FCS a 10%, e isto foi adicionado em uma placa de 96 poços em um volume de 100 μΐ/poço, e realizou-se a cultura. Após 24 horas, adicionou-se 50 μΐ/poço de cada solução de anticorpo a uma concentração de anticorpo de 0,01 μg/ml, 0,1 μg/ml ou 1 μg/ml, e a cultura foi continuada. Setenta e duas horas após a adição do anticorpo, adicionou-se 10 μΐ/poço de uma solução de desenvolvimento de cor, Cell Counting Kit-8 [n.t.: kit de contagem de células] (Dojindo Laboratories, n° de catálogo 343-07623, lote SG076), as células foram cultivadas durante mais 4 horas, e então mediu-se a absorbância a 492 nm. As contagens de células vivas dos 8 tipos típicos de anticorpos monoclonais anti-CD20 de murino e do controle positivo (2B8) são mostradas na Fig. 6 como percentuais baseados no controle negativo (100%). O efeito inibidor de crescimento celular pode ser estimado com base na taxa da contagem diminuída de células vivas, em comparação com aquele do controle negativo. Observou-se clara inibição de crescimento celular com 1K0924, 1K1422, 1K1791 e 2B8 como o controle positivo, e a inibição foi particularmente marcante com IKl 791. Esta tendência foi consistente com os resultados do teste de indução de apoptose. Preparação de anticorpos quiméricos

Os genes que codificam as regiões variáveis de cadeia H e de cadeia L de cada anticorpo de murino foram incorporados em pNOW-Ab, um vetor de expressão elevado para célula de CHO já contendo os genes que codificam regiões constantes (K) de cadeia H e de cadeia L de imunoglobulina humana como uma cassete. Cada vetor de expressão foi transfectado em células de CHO, e selecionou-se clones apresentando elevada produtividade para cada anticorpo.

Teste de propriedade de ligação a antígeno de CD20 de anticorpos quiméricos Os 8 tipos preparados de anticorpos monoclonais anti-CD20 quiméricos foram examinados quanto à reatividade com relação ao antígeno de CD20 humano por meio de ELISA de células CD20/CHO. Usou-se rituximab (c2B8) como um controle positivo. Os resultados de teste são mostrados na Tabela 2. Os valores medidos na ELISA de células (A492) refletem a intensidade da propriedade de ligação. Estes anticorpos apresentaram afinidade substancialmente comparável ou superior àquela do controle, exceto que clK0924 e clK1422 tenderam a mostrar afinidade ligeiramente inferior à do controle. Tabela 2 - Teste com ELISA de células CD20/CHQ de anticorpos anti-CD20 quiméricos

<table>table see original document page 23</column></row><table> Teste de CDC de anticorpos quiméricos

Os 8 tipos preparados de anticorpos monoclonais anti-CD20 quiméricos foram examinados quanto à atividade de CDC. Usou-se rituximab (c2B8) como um controle positivo. RC-K8 (obtido da Kochi Medicai School) foi usado como as células-alvo. Como um meio de consumo, preparou-se e usou-se RHB (meio basal: RPMI-1640, aditivos: 0,1% de BSA, 20 mM de HEPES (pH 7,2), 2 mM de glutamina, 100 unidades/ml de penicilina G, 100 μg/ml de estreptomicina). As células-alvo foram lavadas com RHB e ressuspensas a 106 células/ml. Em um volume de 50 μΐ de cada uma das soluções dos anticorpos quiméricos de teste e rituximab apresentando concentrações diferentes, adicionou- se 50 μl de solução diluída 4 vezes de um complemento humano comercialmente obtenível (Quidel, São Diego, CA, cat. Al 13), e 50 μl de uma suspensão de células contendo 106 células/ml em cada poço de uma placa de cultura de tecidos de 96 poços com fundo plano (preta). A concentração de anticorpo na mistura de 150 μl/poço foi ajustada a 0,1, 1 e 10 μg/ml. Para promover Iise de células mediada com complemento, a mistura foi incubada nas condições de 37°C e 5% de CO2 para 2 horas. Adicionou-se à mistura 50 μl de azul alamar (não diluído, prescrição da AccuMed International, Biosource, Cat. DAL 1100), e a reação foi deixada adicionalmente de um dia para o outro nas mesmas condições. A placa foi deixada à temperatura ambiente durante 10 minutos para esfriar, e mediu-se a fluorescência a 590 nm quanto à emissão com excitação a 530 nm por meio do uso de uma leitora de microplacas com fluorescência. Os resultados foram representados em termos de intensidade de fluorescência (RFU). A taxa de atividade de CDC foi calculada de acordo com a seguinte equação: % de atividade de CDC = 100 x {RFU (anticorpo não adicionado) - RFU (anticorpo adicionado)}/{RFU (anticorpo não adicionado) - RFU (Triton Χ- 100 adicionado)}

Os resultados são mostrados na Fig. 7. Exceto no que se refere a c1K1712, os anticorpos apresentaram atividades de CDC substancialmente comparáveis ou superiores às de C2B2 como um controle positivo.

Preparação de anticorpos humanizados

Anticorpos humanizados foram projetados com base na região variável CDR do anticorpo monoclonal anti-CD20 de murino IKl791. Realizando-se análise estrutural com base nas seqüências de aminoácidos e alterando-se adicionalmente o método de projeto, preparou-se 4 tipos de seqüências humanizadas para cada uma das cadeias HeL (Padlan EA5 Mol.

Immunol., Vol. 28, No 4/5, 489-498; Wu TT e Kabat EA, Mol. Immunol., Vol. 29, No 9, 1141-1146; Padlan EA et ai., FASEB J., Vol. 9, 133-139). Anticorpos foram preparados com todas as combinações possíveis dos quatro tipos para cada uma das cadeias HeL. Estas seqüências de aminoácidos são mostradas nas SEQ ID NOS: 19 e 23, SEQ ID NOS: 19 e 24, SEQ ID NOS: 19 e 25, SEQ ID NOS: 19 e 26, SEQ ID NOS: 20 e 23, SEQ ID NOS: 20 e 24, SEQ ID NOS: 20 e 25, SEQ ID NOS: 20 e 26, SEQ ID NOS: 21 e 23, SEQ ID NOS: 21 e 24, SEQ ID NOS: 21 e 25, SEQ ID NOS: 21 e 26, SEQ ID NOS: 22 e 23, SEQ ID NOS: 22 e 24, SEQ ID NOS: 22 e 25, e SEQ ID NOS: 22 e 26 (Figs. 8A e 8B).

As seqüências de aminoácidos destes 4 tipos de regiões variáveis de cadeia H e 4 tipos de regiões variáveis de cadeia L foram convertidas em seqüências de DNA (nucleotídeo) com códons que são mais freqüentemente usados em seqüências de genes humanos, e alguns destes nucleotídeos foram alterados considerando-se a adequabilidade nas células hospedeiras de CHO sem modificar os radicais de aminoácidos originais (Kim CH et al., Gene, 1997, 15; 199 (1-2): 293-301). Especificamente, usou-se as seqüências de nucleotídeos correspondentes às seqüências de aminoácidos da SEQ ID NO: 27 correspondendo à SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 28 correspondendo à SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 29 correspondendo à SEQ ID NO: 21, SEQ ID NO: 30 correspondendo à SEQ ID NO: 22, SEQ ID NO: 31 correspondendo à SEQ ID NO: 23, SEQ ID NO: 32 correspondendo à SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 33 correspondendo à SEQID NO: 25, e SEQ ID NO: 34 correspondendo à SEQID NO: 26 (Fig. 8A e Fig. 8B). Nestas seqüências de nucleotídeos, nucleotídeos podem ser substituídos por outros nucleotídeos desde que as seqüências de aminoácidos correspondentes não sejam alteradas.

No total, 8 tipos das seqüências de nucleotídeos de regiões variáveis de cadeia H (SEQ ID NOS: 27 a 30) e regiões variáveis de cadeia L (SEQ ID NOS: 31 a 34) foram sintetizados (Takara Shuzo Co., Ltd.) e incorporados em pNOW-Ab, um vetor de expressão para células de mamífero contendo um sítio de clonagem múltipla. Os vetores de expressão incorporados com cada um destes genes de anticorpo humanizado foram transfectados para células de CHO5 e selecionou-se para cada anticorpo clones apresentando elevada produtividade.

Característica biológica e testes de inibição de crescimento de células para anticorpos humanizados

Uma suspensão contendo 5 χ 104/ml das células Raji foi preparada com meio RPMI 16340 com adição de FCS a 10%, e adicionada em uma placa de 96 poços em um volume de 100 μl/poço, e realizou-se a cultura. Após 24 horas, adicionou-se 50 μ25 Ct-089/poço de cada solução de anticorpo, a uma concentração de anticorpo de 0,5 μg/ml, e continuou-se a cultura. Setenta e duas horas após a adição do anticorpo, adicionou-se 10 μl/poço de uma solução de desenvolvimento de cor, Cell Counting Kit-8 (Dojindo Laboratories, n° de catálogo 343-07623, lote SG076), cultivou-se durante mais 4 horas, e então mediu-se a absorbância a 492 nm. As contagens de células vivas de 15 tipos (27 clones) de um total de 16 tipos de anticorpos humanizados derivados de IKl791 e c2B8 (outro nome do rituximab) como o controle positivo são mostradas na Fig. 9 como taxas baseadas no controle negativo (100%). O efeito inibidor de crescimento de células pode ser estimado com base na taxa de contagem de células vivas, em comparação com aquele do controle negativo, e observou-se o efeito inibidor de crescimento em todos os clones neste teste. Os nomes dos anticorpos monoclonais e os números de seqüências descritos nesta descrição e nos desenhos anexos encontram-se compilados a seguir. Tabela 3

<table>table see original document page 27</column></row><table> Os hibridomas que produzem estes anticorpos monoclonais foram denominados com base nos nomes dos anticorpos produzidos, e internacionalmente depositados no National Institute of Advanced Industrial Science and Technology, International Patent Organism Depositary (Tsukuba Central 6, 1-1, Higashi 1-Chome, Tsukuba-shi, Ibaraki-ken, 305-8566, Japão) em 28 de março 2006 sob as condições do Tratado de Budapeste, e receberam números de acesso FERM BP-10587 (1K1422), FERM BP-10591 (1K1791), FERM BP-10588 (1K1712), FERM BP-10586 (1K1402), FERM BP-10589 (1K1736), FERM BP-10590 (1K1782), FERM BP-10584 (1K0924), e FERM 10 BP-10585 (1K1228).

Aplicabilidade industrial

A presente invenção proporciona um anticorpo monoclonal apresentando atividades biológicas vantajosas para uso como um agente terapêutico. LISTAGEM DAS SEQÜÊNCIAS

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Claims

1. Anticorpo monoclonal anti-CD20 de murino, caracterizado pelo fato de que apresenta atividades inibidoras de crescimento celular incluindo apoptose contra células que expressam antígeno CD20 humano em cultura das células que expressam antígeno CD20 sem células efetoras.

2. Anticorpo monoclonal anti-CD20 de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo fato de que as seqüências de aminoácidos da região variável de cadeia H e da região variável de cadeia L são SEQ ID NOS: 1 e 7, SEQ ID NOS: 2 e 8, ou SEQ ID NOS: 15 e 17.

3. Hibridoma, caracterizado pelo fato de que produz o anticorpo monoclonal anti-CD20 como definido na reivindicação 1 ou 2.

4. Anticorpo monoclonal anti-CD20 quimérico, caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos da região variável do anticorpo monoclonal anti-CD20 como definido na reivindicação 2 e a seqüência de aminoácidos da região constante da imunoglobulina humano são fundidas.

5. Anticorpo monoclonal anti-CD20, caracterizado pelo fato de ser humanizado por meio do uso da seqüência de aminoácidos da região variável CDR do anticorpo monoclonal anti-CD20 como definido na reivindicação 2 e uma seqüência de aminoácidos de imunoglobulina humana.

6. Anticorpo monoclonal anti-CD20 humanizado de acordo com a reivindicação 5, caracterizado pelo fato de que a combinação das seqüências de aminoácidos da região variável de cadeia H e da região variável de cadeia L é uma combinação das SEQ ID NOS: 19 e 23, SEQ ID NOS: 19 e -24, SEQ ID NOS: 19 e 25, SEQ ID NOS: 19 e 26, SEQ ID NOS: 20 e 23, SEQ ID NOS: 20 e 24, SEQ ID NOS: 20 e 25, SEQ ID NOS: 20 e 26, SEQ ID NOS: 21 e 23, SEQ ID NOS: 21 e 24, SEQ ID NOS: 21 e 25, SEQ ID NOS: 21 e 26, SEQ ID NOS: 22 e 23, SEQ ID NOS: 22 e 24, SEQ ID NOS: -22 e 25, ou SEQ ID NOS: 22 e 26.

7. Anticorpo monoclonal anti-CD20 de acordo com qualquer uma das reivindicações de 4 a 6, caracterizado pelo fato de que apresenta citotoxicidade contra células que expressam antígeno CD20 na presença de um complemento humano.

8. Célula de mamífero, caracterizada pelo fato de que é incorporada com uma seqüência de nucleotídeos apresentando a seqüência de aminoácidos do anticorpo monoclonal anti-CD20 como definida em qualquer uma das reivindicações de 4 a 7.

9. Célula de mamífero de acordo com a reivindicação 8, caracterizada pelo fato de que é uma célula de CHO.

10. Anticorpo monoclonal anti-CD20 de murino, caracterizado pelo fato de que a combinação das seqüências de aminoácidos da região variável de cadeia H e da região variável de cadeia L é uma combinação das SEQ ID NOS: 3 e 9, SEQ ID NOS: 4 e 10, SEQ ID NOS: 5 e 11, SEQ ID NOS: 6 e 12 ou SEQ ID NOS: 16 e 18.

11. Hibridoma, caracterizado pelo fato de que produz o anticorpo monoclonal anti-CD20 como definido na reivindicação 10.

12. Anticorpo monoclonal anti-CD20 quimérico, caracterizado pelo fato de que a seqüência de aminoácidos da região variável do anticorpo monoclonal anti-CD20 como definido na reivindicação 10 e da seqüência de aminoácidos da região constante de imunoglobulina humana são fundidas.

13. Anticorpo monoclonal anti-CD20, caracterizado pelo fato de ser humanizado que é por meio do uso da seqüência de aminoácidos da região variável CDR do anticorpo monoclonal anti-CD20 como definido na reivindicação 10 e uma seqüência de aminoácidos de imunoglobulina humana.

14. Anticorpo monoclonal anti-CD20 de acordo com a reivindicação 12 ou 13, caracterizado pelo fato de que apresenta citotoxicidade contra células que expressam antígeno CD20 na presença de um complemento humano.

15. Célula de mamífero, caracterizada pelo fato de que é incorporada com uma seqüência de nucleotídeos apresentando a seqüência de aminoácidos do anticorpo monoclonal anti-CD20 como definida em qualquer uma das reivindicações de 12 a 14.

16. Célula de mamífero de acordo com a reivindicação 15, caracterizada pelo fato de que é uma célula de CHO.

17. Agente de diagnóstico, caracterizado pelo fato de que compreende o anticorpo monoclonal anti-CD20 como definido em qualquer uma das reivindicações 2, de 4 a 7, 10 e de 12 a 14 como um ingrediente ativo.

18. Agente terapêutico, caracterizado pelo fato de compreender o anticorpo monoclonal anti-CD20 como definido em qualquer uma das reivindicações de4a7ede 12al4 como um ingrediente ativo.