CN110291107B - 靶向cd43的独特唾液酸糖基化的癌症相关表位的单克隆抗体 - Google Patents

靶向cd43的独特唾液酸糖基化的癌症相关表位的单克隆抗体 Download PDF

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Abstract

本发明涉及由以ICLC登录号ICLC PD n°16001保藏的杂交瘤细胞产生的靶向CD43独特唾液酸糖基化的癌症相关表位的单克隆小鼠抗体。此外，本发明涉及抗体，其包含含有互补决定区CDRH1，CDRH2和CDRH3的重链可变区，和含有互补决定区CDRL1，CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中CDRH1，CDRH2，CDRH3，CDRL1，CDRL2和CDRL3分别包含氨基酸序列GFTFSSFGMH，YISSGSGNFYYVDTVKG，STYYHGSRGAMDY，SASSSVSSMYWY，DTSKMAS和QQWSSYPPIT。另外，本发明涉及识别相同表位的抗体。

Description

靶向CD43的独特唾液酸糖基化的癌症相关表位的单克隆抗体
本发明涉及由以ICLC登录号ICLC PD n°16001保藏的杂交瘤细胞产生的单克隆小鼠抗体，相关抗体和结合分子及其用途。
发明背景
CD43是跨膜蛋白和限于造血谱系细胞的特异性白细胞标志物。然而，在这些细胞中，CD43在大多数外周和骨髓来源的细胞成分中广泛表达。CD43的前体形式迁移，表观分子量为54kD。在其成熟形式中，CD43是高度糖基化的，具有115至200kD的分子量。总体而言，CD4+胸腺细胞和单核细胞表达115kD形式，而活化的CD4+和CD8+-T细胞，B细胞，嗜中性粒细胞和血小板表达130kD形式。CD43参与多种功能，例如细胞粘附，细胞凋亡和迁移(OstbergJR等，Immunology today.1998；19:546–50)。
糖蛋白，例如糖基化的CD43，在细胞信号传导，免疫识别和细胞-细胞相互作用中起主要作用，因为它们的聚糖分支赋予结构可变性和对凝集素配体的结合特异性(OhtsuboK.等，Cell 2006；126,855–867)。粘蛋白型糖蛋白的特征在于高含量的O-连接的碳水化合物链(O-聚糖)，并且在造血细胞和上皮细胞的膜上分泌或表达。O-聚糖生物合成在高尔基体中起始，N-乙酰基-半乳糖胺(GalNAc)通过UDP-N-乙酰基-D-半乳糖胺：多肽N-乙酰半乳糖胺基转移酶(GalNAc-转移酶)与丝氨酸或苏氨酸残基连接，产生O-聚糖的Tn抗原结构。通过添加其他碳水化合物(例如半乳糖，岩藻糖和唾液酸)由组织特异性糖基转移酶催化O-连接的聚糖分支的后续延伸，这导致O-聚糖结构的复杂阵列的合成，该结构不同于O-连接的碳水化合物链的性质和长度(Wopereis S.等，Clin.Chem 2006；52,574–600)。另外，寡糖可以通过唾液酸化，岩藻糖基化，硫酸化，甲基化或乙酰化来修饰。O-聚糖结构的截短以及特定O-聚糖的异常表达发生在癌细胞中，表明异常糖基化可通过改变细胞信号传导，粘附和抗原性而促进癌症进展(Hakomori S.等，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.2002；99,10231–10233,Brockhausen I.EMBO Rep.7 2006；599–604)。
癌胚抗原(OA)主要是糖蛋白和一种或多种基因的产物，其通常仅在胎儿发育期间高度表达，在分化过程中逐渐被抑制，并因此不在成体组织中表达。它们在成人中的重新表达是癌症中发生的受控基因异常激活的结果。癌胚表位(OE)是抗体识别的OA的一部分。鉴定OA或特定的癌胚表位(OE)，其表达仅限于癌症组织，可能不仅用于检测早期致癌过程，而且最重要的是，在开发新的人类癌症免疫治疗方法中可能是至关重要的。
本发明的目的是提供一种允许检测OE和开发新型免疫治疗方法的抗体。
该问题由根据本发明的抗体解决。实施例中显示的数据表明，由于胎儿组织中限制性表达和恶性肿瘤中再表达的特定模式，由根据本发明保藏的杂交瘤细胞产生的抗体识别的表位可以被认为是OE。因此，后者代表了用于治疗人类癌症的创新性免疫治疗策略的潜在合适靶标。
此外，开发了嵌合抗原受体(CAR)，其包含基于本发明抗体的结合分子的scFv，其与包含CD3ζ链，T细胞受体的信号传导区和两个共刺激结构域CD28和41BB的细胞内区域连接。表达根据本发明的CAR的CD3+淋巴细胞诱导针对表达由根据本发明保藏的杂交瘤细胞产生的抗体识别的表位的细胞的显著细胞毒性。
尽管已经部分地描述了本发明的鼠抗体的作用(Tassone等，Tissue Antigens，1994；De Laurentiis等，Mol Cel Proteomics 2011；Cecco等，Tissue Antigens，1998；DeLaurentiis等，Int J Biol Macromol，2006；Tassone等，Int J Oncol，2002；Tassone等，Anticancer Res，2002)，公众从未知晓抗体本身或其序列以及其结合的表位。
发明内容
提供了由以ICLC PD n°16001保藏的杂交瘤细胞产生的小鼠抗体。另外，提供了一种抗体，其与由以ICLC PD n°16001保藏的杂交瘤细胞产生的抗体识别相同的表位。
本发明进一步涉及抗体，其包含含有互补决定区CDRH1，CDRH2和CDRH3的重链可变区，和含有互补决定区CDRL1，CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中CDRH1，CDRH2，CDRH3，CDRL1，CDRL2和CDRL3分别包含氨基酸序列GFTFSSFGMH，YISSGSGNFYYVDTVKG，STYYHGSRGAMDY，SASSSVSSMYWY，DTSKMAS和QQWSSYPPIT。
优选地，所述抗体是单克隆抗体。
此外，提供了衍生自由以ICLC PD n°16001保藏的杂交瘤细胞产生的抗体或本发明的上述抗体的结合分子。
此外，提供了嵌合抗原受体，其包含与包含CD3ζ链的细胞内区域，T细胞受体的信号传导区域和两个共刺激结构域CD28和41BB连接的本发明的scFv结合分子。
此外，提供了表达载体，其包含核酸序列，其编码根据本发明的嵌合抗原受体，根据本发明的抗体或根据本发明的结合分子。
本发明进一步提供CD3+淋巴细胞，NK淋巴细胞，细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞，γ-δ淋巴细胞或NKT细胞，其包含根据本发明的嵌合抗原受体或根据本发明的表达载体。
提供药物组合物，其包含根据本发明的抗体或根据本发明的结合分子或本发明的CD3+淋巴细胞，NK淋巴细胞，细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞，γ-δ淋巴细胞或NKT细胞。
提供核酸，其编码根据本发明的抗体或根据本发明的结合分子。
提供了产生根据本发明的抗体的杂交瘤细胞。
提供了产生根据本发明的抗体的方法，其包括从以ICLC PD n°16001保藏的杂交瘤细胞中分离所述抗体。
提供了鉴定或分离T细胞急性淋巴细胞白血病细胞，T淋巴瘤细胞，瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症细胞或肿瘤相关巨噬细胞的方法，其包括使包含所述细胞的细胞样品与根据本发明的抗体或根据本发明的结合分子接触。
本发明提供了产生表达本发明的嵌合抗原受体的CD3+淋巴细胞，NK淋巴细胞，细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞，γ-δ淋巴细胞或NKT细胞的方法，包括将本发明的表达载体导入所述CD3+淋巴细胞，NK淋巴细胞，细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，γ-δ淋巴细胞或NKT细胞。
具体实施方式
在第一方面，本发明涉及由以ICLC PD n°16001保藏的杂交瘤细胞产生的单克隆小鼠抗体。
杂交瘤细胞于2016年8月4日以登录号ICLC PD n°16001保藏于高级生物技术中心(ABC)(Centro Biotecnologie Avanzate)，中间细胞系收集(Interlay Cell LineCollection)(ICLC)，Largo Rosanna，10，16132热那亚，意大利。以下给出的实施例中测试了抗体。如实施例中所示，抗体结合CD43上的特定唾液酸糖基化表位。
在该第一方面，本发明进一步涉及抗体，其包含含有互补决定区CDRH1，CDRH2和CDRH3的重链可变区，和含有互补决定区CDRL1，CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中CDRH1，CDRH2，CDRH3，CDRL1，CDRL2和CDRL3分别包含氨基酸序列GFTFSSFGMH，YISSGSGNFYYVDTVKG，STYYHGSRGAMDY，SASSSVSSMYWY，DTSKMAS和QQWSSYPPIT。
这些序列也在SEQ ID NO：1-6中给出。
上述CDR序列是由以ICLC PD n°16001保藏的杂交瘤细胞产生的单克隆小鼠抗体的CDR序列，通过测序确定。
如本文所用，术语“CDR”或“互补决定区”是指在重链和轻链多肽的可变区内发现的非连续抗原结合位点。这些特定区域已由Kabat等，J.Biol.Chem.252,6609-6616(1977)和Kabat等，Sequences of protein of immunological interest.(1991)，并且由Chothia等，J.Mol.Biol.196:901-917(1987)并且由MacCallum等，J.Mol.Biol.262:732-745(1996)描述，其中定义包括当彼此比较时氨基酸残基的重叠或子集。列出了包含由上述每篇参考文献所定义的CDR的氨基酸残基用于比较。优选地，基于序列比较，术语“CDR”是由Kabat定义的CDR。CDRH1，CDRH2和CDRH3表示重链CDR，并且CDRL1，CDRL2和CDRL3表示轻链CDR。
该单克隆抗体可具有来自任何物种的框架序列。优选地，它可以具有小鼠或人框架。
如本文所用，术语“框架(FR)氨基酸残基”是指免疫球蛋白链的框架区中的那些氨基酸。如本文所用的术语“框架区”或“FR区”包括作为可变区的一部分但不是CDR的一部分的氨基酸残基(例如，使用CDR的Kabat定义)。
用于产生具有如上所述CDR序列的单克隆抗体的方法是本领域已知的，并且包括将编码CDR的核酸序列引入编码所需框架序列的合适表达载体中。其他方法如下所述。
在第二方面，本发明涉及与根据第一方面的抗体识别相同表位的抗体。
通常，并且如本领域通常已知的，抗体是属于免疫球蛋白的蛋白质家族的蛋白质，并且其可变区包含如上定义的框架区和互补决定区。抗体天然由浆细胞响应某种抗原产生。通常，每种抗体具有两个相同的重链免疫球蛋白和两个相同的轻链免疫球蛋白。每条重链和每条轻链可具有可变区和恒定区。重链的恒定区可以是五种类型的哺乳动物Ig重链之一：α，δ，ε，γ和μ。存在的重链类型通常分别定义抗体的类别(同种型)：IgA，IgD，IgE，IgG和IgM抗体。类似地，轻链的恒定区可以是两种类型的哺乳动物Ig轻链中的一种：κ和λ。重链和轻链的可变区通常由许多蛋白质序列的独特组合构成，允许与特定抗原结合。
根据本发明，术语“抗体”还包括分离的抗体。
通常，每条重链与轻链中的一条连接，由此重链和轻链的可变区组合形成两个相同的抗原结合位点之一，并且它们的恒定区组合形成抗体的恒定区。此外，一条重链和一条轻链的构建体可以通过其重链的恒定区连接，形成“Y”形分子，其中两条臂描绘抗原结合可变区，并且茎描绘恒定区。
根据第二方面的抗体可以是完整抗体，这意味着它通常包含三个或四个恒定结构域的重链和一个恒定结构域的轻链以及各自的可变结构域，由此每个结构域可以包含其他修饰，例如突变，缺失或插入，它们不会改变整个结构域的结构。
此外，根据本发明第二方面的抗体可以形成同二聚体或异二聚体或同源或异源多聚体，其中“二聚体”和“多聚体”分别表示两种和至少三种抗体可以组合形成复合物。前缀“同源”是指复合物可以由相同的抗体分子形成，其中前缀“异源”是指复合物可以由不同的抗体分子形成。
通常，术语“抗体”旨在包括所有上述免疫球蛋白同种型，即抗体可以是IgA，IgD，IgE，IgG或IgM抗体，包括这些同种型的任何亚类。优选地，抗体是IgG抗体，更优选地，抗体是IgG1抗体。由于抗体可以重组表达和产生，因此抗体也可以包含两个不同的重链恒定区，例如一个IgG1重链和一个IgG2重链，或来自不同物种的重链。然而，重链优选来自相同物种。此外，抗体可包含λ或κ轻链。
与本发明第一方面的抗体之一识别相同表位的抗体还可以是以下抗体，其包含含有互补决定区CDRH1，CDRH2和CDRH3的重链可变区，和含有互补决定区CDRL1，CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中CDRH1，CDRH2，CDRH3，CDRL1，CDRL2和CDRL3分别具有氨基酸序列GFTFSSFGMH，YISSGSGNFYYVDTVKG，STYYHGSRGAMDY，SASSSVSSMYWY，DTSKMAS和QQWSSYPPIT。
此外，与本发明第一方面的抗体之一识别相同表位的抗体可以是以下抗体，其中CDR与上述序列相比具有至少一个保守氨基酸交换，例如，具有与原始氨基酸相似的化学结构和性质和/或功能的相似氨基酸。
与本发明第一方面的抗体之一识别相同表位的抗体也可以是与本发明第一方面的抗体之一相比具有增加或降低的亲和力或特异性的抗体。此类抗体易于通过本领域已知的方法获得并在下文中进一步描述。
通常，根据本发明第二方面的抗体可具有序列，尤其是在其可变区中，其与由以ICLC PD n°16001保藏的杂交瘤细胞产生的单克隆小鼠抗体至少75％，80％，85％，90％，95％或100％(例如，至少86，87，88，89，90，91，92，93，94，95，96，97，98或99％)相同。
通常，根据本发明的抗体可以是单克隆抗体，双特异性抗体或多特异性抗体。这类抗体是本领域已知的。如在本发明的上下文中所使用的，术语“单克隆”可以在最广义上理解，描述由B淋巴细胞的单克隆产生的抗体或具有相同或相似氨基酸序列的抗体。如本文所用，术语“双特异性”可以在最广义上理解，描述与两种不同表位相互作用的抗体。双特异性抗体可以衍生自两种单克隆抗体。任选地，这两种不同的表位可以位于相同的抗原上，但它们也可以位于两种不同的抗原上。如本文所用，术语“多特异性”可以在最广义上理解，描述与三种或更多种不同类型的表位相互作用的抗体。任选地，这些表位可以位于相同的抗原上或两个或更多个抗原上。
优选地，根据本发明的方面2的抗体是单克隆抗体。此外，根据本发明方面2的抗体优选是双特异性或多特异性抗体。
产生抗体的方法是本领域技术人员熟知的。优选地，通过制备杂交瘤细胞产生抗体。用于产生杂交瘤细胞的方法以及借助杂交瘤细胞产生抗体的方法是本领域技术人员公知的。通常，给小鼠注射所需抗原并在几天后杀死，以分离针对所需抗原分泌抗体的脾细胞。通常，这些分泌抗体的脾细胞与永生的非分泌性骨髓瘤细胞的融合产生杂交瘤细胞。然后通常筛选这些杂交瘤细胞，并选择产生所需抗体的杂交瘤。然后可以在体内或体外培养选择的杂交瘤，并可以分离所需的抗体。
双功能或双特异性抗体可具有不同特异性的抗原结合位点。各种形式的双特异性抗体及其产生是本领域技术人员已知的。例如，这些包括BSIgG，其是包含两条不同的重链和两条不同的轻链的IgG分子，其由所谓的“杂交杂交瘤”分泌，和通过不同特异性的抗体或抗体片段的化学偶联产生的异源抗体偶联物(Segal DM等，Current Opin.Immunol.1999,11:558-562；Van Spriel AB等，Immunology Today 2000,21:391-397)。
可以产生双特异性抗体以将细胞，细胞毒素或药物递送至特定位点。重要的用途可以是将宿主细胞毒性细胞(例如NK或细胞毒性T细胞)递送至特定细胞靶标(P.J.Lachmann,Clin.Exp.Immunol.1990,79:315)。另一个重要用途可以是将细胞毒性蛋白质递送至特定细胞靶标(V.Raso,T.Griffin,Cancer Res.1981,41:2073；S.Honda等，Cytotechnology,1990,4:59)。另一个重要用途可以是将抗癌非蛋白质药物递送至特定细胞靶标(J.Corvalan等，Intl.J.Cancer Suppl.1988,2:22；M.Pimm等，British J.ofCancer 1990,61:508)。这种双特异性抗体可以通过化学交联(M.Brennan等，1985,Science229:81)，二硫键交换或杂交-杂交瘤(四源杂交瘤(quadromas))的产生来制备。可以通过融合针对两种不同抗原分泌两种不同类型抗体的杂交瘤来构建四源杂交瘤(Milstein和Cuello，Nature,1983,305:537-539)。
在本发明的上下文中使用的术语“表位”可以在最广义上理解为能够被由以ICLCPD n°16001保藏的杂交瘤细胞产生的抗体在一个或多个抗体的抗原结合区处识别并结合的CD43分子的一部分。与表位结合的抗体部分称为互补位。在许多情况下，表位具有特异性产生互补位结合位点的构象特性。
表位通常由分子的化学活性表面基团(如氨基酸或糖侧链)组成且通常有特定的三维结构性质以及特定的电荷性质。
此外，本领域技术人员知晓并理解，表位和抗体之间的相互作用通常可以基于抗原的一级结构，即氨基酸的连续序列。通常，相互作用还可以基于表位的二级结构，三级结构或四级结构以及翻译后修饰，例如糖基化。表位和抗体之间的相互作用可以进一步基于抗原的三维结构和所得的表面特征，其可以包括氨基酸序列的不连续区段，其包含在远处位置的氨基酸与抗体的相互作用。
当两种抗体识别相同或空间上重叠的表位时，抗体识别与第一方面的抗体“相同的表位”。通常，确定两种表位是否识别相同或空间重叠表位的最常用且迅速的方法是竞争性测试，其可用标记的抗原或标记的抗体以各种不同形式配置。例如，抗原被固定在96孔板上，采用放射性标记或酶标记来测定未标记抗体阻断标记抗体结合的能力。
与根据第一方面的抗体识别“相同表位”的抗体通常是指在竞争测定中阻断参照抗体与其抗原结合的50％或更多的抗体，相反，参照抗体通常在竞争测定中阻断抗体与其抗原的结合的50％或更多。
通常，由以ICLC PD n°16001保藏的杂交瘤细胞产生的抗体识别并结合的表位可以通过本领域已知的任何合适的表位作图方法与由以ICLC PD n°16001保藏的杂交瘤细胞产生的抗体组合鉴定。
这种方法的实例包括针对结合由以ICLC PD n°16001保藏的杂交瘤细胞产生的抗体对衍生自CD43的不同长度的肽进行筛选，其中可以特异性结合抗体的最小片段通常含有被抗体识别的表位序列。通常，CD43肽可以通过合成产生或通过蛋白水解消化CD43产生。用于鉴定与抗体结合的肽的方法是本领域技术人员公知的，例如质谱分析。在另一个实例中，NMR光谱法可用于鉴定与本发明的抗体相互作用的残基。例如，已经用15N和2H均匀标记的CD43肽可以与未标记的抗体混合，并且标记的肽中与未标记的抗体相互作用的那些氨基酸可以被检测为它们在NMR光谱变化内的位置。通常，两个光谱之间的差异使得能够鉴定CD43中参与抗体相互作用的氨基酸。优选地，质谱分析用于鉴定与抗体结合的肽。
示例性地，由以ICLC PD n°16001保藏的杂交瘤细胞产生的抗体识别并结合的表位也可以通过包括以下的方法鉴定：聚合酶链式反应(PCR)扩增CD43 DNA的各种DNA片段，整合这些片段形成包括它们与组氨酸融合蛋白的连接的表达载体，并且在蛋白质表达后，检测表位，例如通过Western印迹。
在一个优选的实施方式中，根据方面1或2的抗体识别包含与人CD43发生O-连接的GalNAc的表位。
在另一个实例中，为了确定由以ICLC PD n°16001保藏的杂交瘤细胞产生的抗体识别并结合的CD43上的位点，可以通过PCR方法引入具有缺失突变的CD43克隆的表达载体以制备突变系列，如大肠杆菌(E.coli)突变体系列，其表达在CD43中具有各种缺失位点的蛋白质。可培养这些大肠杆菌突变体并诱导其表达。可以使用细胞裂解物作为抗原进行Western印迹分析。
用于鉴定由以ICLC PD n°16001保藏的杂交瘤细胞产生的抗体识别和结合的表位的其他方法可包括通过免疫测定法检测，例如酶联免疫吸附测定法(ELISA)。
在本发明的上下文中使用的术语“亲和力”可以在最广义上理解为表位和抗体的表位结合位点之间的相互作用的强度。确定抗体亲和力的绝对值,即亲和常数的方法是本领域技术人员熟知的。然而，通常也可以确定抗体亲和力的相对值，即比较两种抗体的亲和力而不确定它们的绝对值。比较抗体亲和力的方法是本领域技术人员熟知的。例如，可以使用流式细胞术，其中具有所需表位的细胞可以独立地与不同的抗体接触，随后用免疫荧光二抗标记。通常，在用流式细胞术检测后，可以比较抗体信号的强度。
鉴定根据第二方面的抗体的方法是本领域技术人员熟知的，该抗体与根据第一方面的抗体识别相同的表位。例如，可以通过基于抗体文库的噬菌体展示鉴定根据第二方面的抗体。
因此，识别相同表位的本发明的抗体也可以是人抗体。
在另一个优选的实施方式中，根据第二方面的抗体是嵌合抗体。在更优选的实施方式中，根据第二方面的抗体是根据第一方面的嵌合抗体。
嵌合抗体是这样的抗体，其中通过基因工程将一个物种的免疫球蛋白的至少一个区域与另一物种的免疫球蛋白的另一区域融合以降低其免疫原性(参见，例如，美国专利号4,816,567和美国专利号4,816,397)。
在另一个优选的实施方式中，根据第二方面的抗体是人源化抗体。在更优选的实施方式中，根据第二方面的抗体是根据第一方面的抗体的嵌合或人源化抗体。
通常，人源化抗体是特定类型的嵌合抗体。例如，可以通过将人抗体的DNA移植到编码小鼠抗体框架的DNA中或通过将小鼠抗体的DNA移植到编码人抗体框架的DNA中来产生人源化抗体。优选地，将人抗体的DNA移植到编码小鼠抗体框架的DNA中。通常，DNA的移植包括将一个或多个DNA序列移植到编码靶抗体框架的DNA中。任选地，可变区和恒定区以及重链和轻链可以部分或完全人源化。优选地，小鼠抗体的重链可变区和轻链可变区是人源化的。更优选地，通过改变编码1至50，优选1至30，更优选1至20个氨基酸的DNA序列，使小鼠抗体的重链可变区和轻链可变区人源化。在移植的DNA中通常可以包含确定抗原特异性的六个高变环的DNA区域，也称为互补决定区(CDR)，或不包含CDR的DNA区域，或两者。优选地，人源化包括移植不包含CDR的DNA。
通常，所得DNA构建体然后可用于表达和产生与非人类亲本抗体相比通常较低或不具有免疫原性的抗体。这包括产生修饰的抗体，例如非糖基化抗体或非岩藻糖基化抗体。这些方法为本领域熟知。
因此，识别相同表位的本发明抗体也可以是非糖基化抗体或非岩藻糖基化抗体。
在另一个优选的实施方式中，根据方面2的抗体的单克隆抗体能够诱导针对以下细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)：T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)的EGIL T3亚组，T细胞淋巴母细胞淋巴瘤细胞和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(WM)细胞。
淋巴细胞属于白细胞群，是体液和细胞介导免疫的介质。有两组淋巴细胞，B细胞和T细胞。
就像许多其他细胞类型一样，B细胞和T细胞可以异常发育成B细胞和T细胞肿瘤。由于发展B细胞和T细胞的许多发育阶段，存在各种类型的肿瘤。B细胞和T细胞均来自淋巴祖细胞。
在B细胞的情况下，这种淋巴祖细胞发育经历许多B细胞发育阶段，每个阶段都包含某种可定义的细胞类型，直到形成浆细胞。这些阶段之一包括所谓的“分泌IgM的B细胞”，其最终发展成产生抗体的浆细胞。源自“分泌IgM的B细胞”的肿瘤称为“瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症”(WM)。WM是一种罕见，无痛和无法治愈的疾病。其特征在于分泌克隆IgM的淋巴浆细胞的骨髓积累。
T细胞仅在少数发育阶段从淋巴祖细胞发育成成熟T细胞。肿瘤可以特别地从成熟T细胞或淋巴祖细胞进化，后者分别导致B细胞或T细胞急性淋巴细胞白血病(B-ALL)和(T-ALL)。T细胞表型T-ALL占所有急性淋巴细胞白血病病例的约20％，并且在成人中比在儿童中更常发生。T-ALL与T细胞淋巴母细胞淋巴瘤(T-LBL)密切相关，两种疾病之间的鉴别诊断基于特定部位的普遍定位，例如T-ALL中的骨髓或T-LBL中的二级淋巴器官。欧洲白血病免疫学表征组(EGIL)根据其免疫表型将T-ALL分为四个亚组(Bene MC,Leukemia 1995；9:1783)：
1)EGIL T1(pro-)，其特征在于CD3(cCD3)的细胞质阳性和CD7的表面表达；
2)EGIL T2(pre-)，其特征在于cCD3，CD7阳性和CD2或CD5阳性；
3)EGIL T3(皮质)，其特征在于cCD3，CD1a阳性和表面CD3(sCD3)的存在或不存在，和
4)EGIL T4(成熟白血病)，其特征在于cCD3和sCD3阳性和CD1a阴性。
如本文所用，术语“抗体依赖性细胞毒性(ADCC)”是通过细胞毒性效应细胞(例如天然杀伤(NK)细胞)杀死由抗体结合并标记的细胞。。
为了检查抗体是否能够诱导ADCC，可以使用以下测定。通过在不同抗体浓度存在下共培养来自健康供体的外周血单核细胞(PBMC)(包括效应细胞)与表达表位的靶细胞进行脱粒测定。将4×104个靶细胞接种于96孔圆底板中，并在不同浓度的抗体(0，10，50，100和200ug/ml)或对照IgG1存在下，在37℃，5％CO2下培养30分钟。随后，将来自相同供体的0.4×106个PBMC(固定效应细胞(E)：靶细胞(T)＝10：1)与20μl/ml的藻红蛋白(PE)偶联的抗CD107a单克隆抗体(mAb)(BD)一起加入到每个孔中，然后将细胞在37℃，5％CO2下孵育3小时。1小时后，向每个孔(GolgiStop，BD)中加入6μg/ml莫能菌素。在孵育期结束时，用别藻蓝蛋白(APC)偶联的抗CD56和多甲藻素叶绿素蛋白复合物(PerCp)偶联的抗CD3对细胞进行染色，并在ATTUNE NxT流式细胞仪(热科学公司(THERMO Scientific))上分析。通过检测CD3-/CD56+/CD107a+细胞，测量诱导靶细胞裂解的NK细胞(CD3-/CD56+)(CD107a+)。因此，根据抗体浓度的增加，CD3-/CD56+/CD107a+细胞的增加证实了抗体诱导ADCC的潜力。得到的数据允许设计免疫靶向方法，这是，例如T细胞急性淋巴细胞白血病/淋巴母细胞淋巴瘤的迫切和未满足的临床需求。还可以使用其他方法以检查抗体是否能够诱导ADCC，这些方法是本领域技术人员熟知的。
在第三方面，本发明涉及衍生自根据方面1或方面2的抗体的结合分子。
根据本发明，结合分子是衍生自由以ICLC PD n°16001保藏的杂交瘤细胞产生的单克隆小鼠抗体的分子。优选地，结合分子是包含免疫球蛋白的分子，即其包含至少一个免疫球蛋白(Ig)结构域。
在优选的实施方式中，本发明的结合分子选自单链抗体。在更优选的实施方式中，结合分子选自单链可变片段(scFv)，scFv的多聚体，例如双抗体，三抗体或四抗体，抗体片段，优选Fab，Tandab和柔性体(flexibody)。
抗体的结构，尤其是其CDR的功能通常是本领域熟知的(Carter PJ.设计的有效抗体疗法(Potent antibody therapeutics by design).Nature Rev.Immunol.6:343-357,2006)。单链Fv(scFv)及其多聚体，Tandab，双抗体和柔性体通常是本领域已知的标准抗体形式，例如，来自WO1988/001649A1，WO1993/011161A1，WO1999/057150A2和EP1293514B1。
在scFv中，抗体的轻链和重链(VH Fv和VL Fv)的两个抗原结合可变区通常通过接头肽人工连接，称为单链可变片段或单链抗体(Bird等，(1988)Science 242:423-426；Orlandi等，(1989)Proc Natl Acad Sci USA 86:3833-3837；Clarkson等，Nature 352:624-628(1991))。抗原结合位点可以由单克隆抗体的轻链和重链的可变结构域组成。一些研究表明，scFv片段确实可能具有完整抗体的一个结合位点的完整内在抗原结合亲和力。
在本发明的上下文中，双抗体是具有两种结合特异性的scFv，并且可以是单特异性的和二价的或双特异性的和二价的。
Tandab和柔性体是其他抗体形式，例如，其分别在US2007031436和EP1293514B1中定义。
含有蛋白质独特型的抗体片段可以通过本领域已知的技术产生。例如，这些片段包括但不限于，可以通过胃蛋白酶消化抗体分子产生的F(ab')2片段；可以通过还原F(ab')2片段的二硫桥产生的Fab'片段；可以通过用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子而产生的Fab片段；和Fv片段。
本发明的抗体或结合分子可以进一步与活性物质连接，优选毒素，纳米颗粒，细胞因子或放射性核苷酸。此类抗体偶联物是本领域已知的(Wu AM,Senter PD.NatureBiotechnol.23:1137-1146,2005,Pastan等，Annu.Rev.Med.58:221-237,2007，WO 1990/012592 A1，WO 2007/030642 A2，WO 2004/067038 A1，WO 2004/003183 A1，US 2005/0074426 A1，WO 1994/004189 A1)。
本发明的另一方面还涉及嵌合抗原受体(CAR)，其包含与细胞内结构域连接的方面3的结合分子，优选包含一个或多个信号传导结构域。
优选地，本发明涉及嵌合抗原受体(CAR)，其包含与包含CD3ζ链，T细胞受体的信号传导区域和两个共刺激结构域CD28和4-1BB的细胞内区域连接的方面3的结合分子的优选实施方式的scFv。
当在T细胞或NK细胞中表达时，根据本发明的CAR是用于靶向具有被方面1或方面2的单克隆抗体识别并结合的表位的恶性细胞的相关工具。如本文所用，术语“嵌合抗原受体”(CAR)是指包含与单个融合分子中的一个或多个信号传导结构域相关的靶向部分的合成受体。通常，CAR的结合部分包含scFv，但它也可包含其他结合实体。基于受体或配体结构域的结合部分也已成功使用。CAR的信号传导结构域可以源自Fc受体γ链或CD3ζ的细胞质区域，但也可以源自其他细胞质区域。已证明第一代CAR成功地重定向T细胞的细胞毒性。已经添加来自共刺激分子以及跨膜和铰链结构域的信号传导结构域以形成第二代和第三代的CAR，导致一些成功的人类治疗试验，其中T细胞可以针对表达CD19的恶性细胞重定向(Porter DL等，N Eng J Med,2011)。
在第五方面，本发明涉及包含核酸序列的表达载体，所述核酸序列编码根据方面4的嵌合抗原受体，根据方面1和2的抗体或根据方面3的结合分子的结合分子。
通常，表达载体是质粒，其用于将所需的核酸序列(例如基因)引入靶细胞，导致由核酸序列编码的蛋白质(即嵌合抗原受体、抗体或结合分子)的转录和翻译。因此，表达载体通常包含调节序列，例如启动子和增强子区，以及多腺苷酸化位点，以指导核酸序列在表达载体上的高效转录。表达载体可以进一步包含其他必需或有用的区域，例如用于在真核或原核细胞中选择的可选择标志物，用于纯化所得蛋白质的纯化标签，多克隆位点或复制起点。
通常，表达载体可以是病毒载体或非病毒载体。通常，可以使用各种病毒载体，例如逆转录病毒载体，例如慢病毒或腺病毒载体或质粒。在优选的实施方式中，根据方面5的表达载体是病毒载体。在更优选的实施方式中，表达载体是慢病毒载体。
在第六方面，本发明涉及CD3+淋巴细胞，NK淋巴细胞，细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，γ-δ淋巴细胞，NKT细胞或另一种免疫效应细胞，其包含根据方面4的嵌合抗原或根据方面5的表达载体。
通常，CD3是与功能性T细胞受体复合物中的T细胞受体的α:β异二聚体相关的四个信号链的复合物。CD3复合物通常是T细胞受体信号传导所必需的。通常，CD3+淋巴细胞组仅包含胸腺细胞和T细胞。CD3+细胞的检测可以通过，例如流式细胞术实现。
在第七方面，本发明涉及药物组合物，其包含根据方面1或2的单克隆抗体或根据方面3的结合分子或根据方面6的CD3+淋巴细胞，NK淋巴细胞，细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，γ-δ淋巴细胞，NKT细胞或其他免疫效应细胞。
如本文所用，术语“药物组合物”可与术语“药物”互换使用。
药物组合物中抗体，结合分子或CD3+淋巴细胞的含量不受限制，只要它可用于治疗或预防，但优选含有0.0000001-10％重量/总组合物。此外，本文所述的抗体，结合分子或CD3+淋巴细胞优选用于运载体中。运载体的选择可取决于给药途径和活性剂的浓度，并且运载体可以是冻干组合物或水溶液的形式。通常，在运载体中使用适量的药学上可接受的盐以使组合物等渗。运载体的实例包括但不限于盐水，林格氏溶液和右旋糖溶液。优选地，可接受的赋形剂，运载体或稳定剂在所用的剂量和浓度下是无毒的，包括缓冲剂如柠檬酸盐，磷酸盐和其它有机酸；成盐抗衡离子，例如，钠和钾；低分子量(>10个氨基酸残基)多肽；蛋白质，例如血清白蛋白或明胶；亲水聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如组氨酸，谷氨酰胺，赖氨酸，天冬酰胺，精氨酸或甘氨酸；碳水化合物，包括葡萄糖，甘露糖或糊精；单糖；双糖；其他糖，例如蔗糖，甘露醇，海藻糖或山梨糖醇；螯合剂，例如EDTA；非离子表面活性剂，例如吐温，普流罗尼克或聚乙二醇；抗氧化剂，包括蛋氨酸，抗坏血酸和生育酚；和/或防腐剂，例如十八烷基二甲基苄基氯化铵；六甲基氯化铵；苯扎氯铵，苄索氯铵；苯酚，丁基或苄醇；对羟基苯甲酸烷基酯，例如对羟基苯甲酸甲酯或丙酯；邻苯二酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；和间甲酚)。合适的运载体及其制剂在《雷明顿药物科学》(Remington'sPharmaceutical Sciences)，第17版，马克出版公司(Mack Publishing Co.)中有更详细的描述。该组合物还可含有至少一种其他活性化合物，例如化学治疗剂。
优选地，以有效量包含抗体，结合分子，CD3+淋巴细胞和/或活性化合物。术语“有效量”是指足以在待给予药物组合物的对象中诱导可检测的治疗反应的量。
在第八方面，本发明涉及编码根据方面1或方面2的抗体或根据方面3的结合分子的核酸或多核苷酸。
本文还提供了编码抗体的多核苷酸，所述抗体通过例如密码子/RNA优化，用异源信号序列替换，和消除mRNA不稳定性元件进行优化。通过引入密码子改变和/或消除mRNA中的抑制区域来产生编码抗体或其片段(例如，轻链，重链，VH结构域或VL结构域)的优化核酸用于重组表达的方法可以通过以下方法进行：使其适应例如美国专利号5,965,726；6,174,666；6,291,664；6,414,132和6,794,498中描述的优化方法。例如，可以突变RNA内的潜在剪接位点和不稳定性元件(例如，富含A/T或A/U元件)而不改变由核酸序列编码的氨基酸，以增加RNA的重组表达的稳定性。这些改变利用遗传密码的简并性，例如，针对相同的氨基酸使用替代密码子。在一些实施方式中，可能需要改变一个或多个密码子以编码保守突变，例如，具有与原始氨基酸相似的化学结构和性质和/或功能的相似氨基酸。此类方法可使抗体或其片段的表达相对于未被优化的多核苷酸编码的抗体的表达增加至少1倍，2倍，3倍，4倍，5倍，10倍，20倍，30倍，40倍，50倍，60倍，70倍，80倍，90倍或100倍或更多。
在某些实施方式中，编码本文所述抗体或其片段(例如，VL结构域和/或VH结构域)的优化多核苷酸序列可与编码本文所述抗体或其片段(例如，VL结构域和/或VH结构域)的未优化多核苷酸序列的反义(例如，互补)多核苷酸杂交。在具体的实施方式中，编码本文所述抗体或片段的优化核苷酸序列在高度严格条件下与编码本文所述抗体或其片段的未优化多核苷酸序列的反义多核苷酸杂交。在一个具体实施方式中，编码本文所述抗体或其片段的优化核苷酸序列在高度严格，中等或较低严格杂交条件下与编码本文所述抗体或其片段的未优化核苷酸序列的反义多核苷酸杂交。已经描述了关于杂交条件的信息，参见例如美国专利申请公开号US 2005/0048549(例如，第72-73段)。
可以通过本领域已知的任何方法获得本发明的多核苷酸，并确定多核苷酸的核苷酸序列。编码本文所述抗体的核苷酸序列和这些抗体的修饰形式可以使用本领域熟知的方法确定，即，已知编码特定氨基酸的核苷酸密码子以产生编码抗体的核酸的方式组装。编码抗体的这种多核苷酸可以由化学合成的寡核苷酸组装(例如，如Kutmeier G等，(1994),BioTechniques 17:242-6中所述)，其简要地涉及含有编码抗体的序列的部分的重叠寡核苷酸的合成，退火和连接那些寡核苷酸，然后通过PCR扩增连接的寡核苷酸。
或者，可以使用本领域熟知的方法(例如，PCR和其他分子克隆方法)从合适来源(例如杂交瘤)的核酸产生编码本文所述抗体的多核苷酸。例如，使用可与已知序列的3'和5'末端杂交的合成引物的PCR扩增可以使用从产生感兴趣抗体的杂交瘤细胞获得的基因组DNA来进行。此类PCR扩增方法可用于获得包含编码抗体轻链和/或重链的序列的核酸。此类PCR扩增方法可用于获得包含编码抗体的可变轻链区和/或可变重链区的序列的核酸。可以将扩增的核酸克隆到载体中以在宿主细胞中表达并进一步克隆，例如，以产生嵌合和人源化抗体。
如果无法获得含有编码特定抗体的核酸的克隆，但该抗体分子的序列已知，则可通过以下方法由合适来源(如抗体cDNA文库，或由表达该抗体的任何组织或细胞如选择表达本文所述抗体的杂交瘤细胞产生的cDNA文库，或从中分离的核酸，优选聚A+RNA)获得编码该免疫球蛋白的核酸：化学合成或利用可与该序列3'和5'端杂交的合成引物进行PCR扩增、或利用具体基因序列的特异性寡核苷酸探针进行克隆以鉴定例如cDNA文库中编码该抗体的cDNA克隆。然后，可利用本领域熟知的任何方法将PCR产生的扩增核酸克隆到可复制克隆载体中。
不难用常规方法(例如，使用能够特异性结合编码抗体的重链和轻链的基因的寡核苷酸探针)对编码本文所述的本发明的抗体的DNA进行分离和测序。杂交瘤细胞可以作为这种DNA的来源。一旦分离，可将DNA置于表达载体中，然后将其转染入宿主细胞，例如大肠杆菌(E.coli)细胞、猿COS细胞、中国仓鼠卵巢(CHO)细胞(例如，来自CHO GS SystemTM的CHO细胞(隆萨公司(Lonza)))或否则不会产生免疫球蛋白的骨髓瘤细胞，以实现重组宿主细胞中的抗体合成。
为了产生完整抗体，可以使用包括VH或VL核苷酸序列，限制性位点和侧翼序列来保护限制性位点的PCR引物来扩增scFv克隆或其他克隆中的VH或VL序列。利用本领域技术人员已知的克隆技术，可以将PCR扩增的VH结构域克隆到表达重链恒定区(例如人γ4恒定区)的载体中，并且可以将PCR扩增的VL结构域克隆到表达轻链恒定区(例如人κ或λ恒定区)的载体中。在某些实施方式中，用于表达VH或VL结构域的载体包含启动子，分泌信号，可变区的克隆位点，恒定结构域和选择标志物如新霉素。还可以将VH和VL结构域克隆到表达必需恒定区的一个载体中。然后将重链转化载体和轻链转化载体共转染到细胞系中，以使用本领域技术人员已知的技术产生表达全长抗体(例如IgG)的稳定或瞬时细胞系。
DNA也可以被修饰，例如，通过用编码人重链和轻链恒定结构域的序列代替鼠序列，或通过将非免疫球蛋白多肽的编码序列的全部或部分与免疫球蛋白编码序列共价连接。
可以使用可变区的定点或高密度诱变或其他诱变方法以优化单克隆抗体的特异性、亲和力等。特别地，亲和力成熟策略和链改组策略(Marks等，1992,Bio/Technology 10:779-783)是本领域已知的，并且可用于产生高亲和力人抗体。
在第九方面，本发明涉及根据方面1或2的抗体产生单克隆抗体的杂交瘤细胞。
在第十方面，本发明涉及以ICLC PD n°16001保藏的杂交瘤。
在第十一方面，本发明涉及产生根据方面1或2的单克隆抗体的方法，所述方法包括从由以ICLC PD n°16001保藏的杂交瘤细胞中分离所述抗体。
在第十二方面，本发明涉及鉴定或分离T细胞急性淋巴细胞白血病细胞，T淋巴瘤细胞，瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症细胞或肿瘤相关巨噬细胞的方法，其包括使包含所述细胞的细胞样品与根据方面1或2的单克隆抗体或根据方面3的结合分子接触。
通常，巨噬细胞是肿瘤微环境中最有代表性的非恶性细胞。这些肿瘤相关巨噬细胞(TAM)被认为获得了肿瘤前的炎症和免疫抑制表型，并且有利于化学抗性，血管生成，细胞运动和内/外渗。因此，靶向TAM可代表一种新的治疗性且尚未开发的临床选择，以改善目前抗癌治疗的功效。
基于抗体或结合分子鉴定或分离特定细胞，例如T细胞急性淋巴细胞白血病细胞，T淋巴瘤细胞，瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症细胞或肿瘤相关巨噬细胞的方法一般是本领域技术人员所熟知的，例如基于通过流式细胞术，磁性细胞分离或单细胞分选，例如，通过细胞分选器的荧光细胞分选的方法。
在第十三方面，本发明涉及产生表达根据方面4的嵌合抗原受体的CD3+淋巴细胞，NK淋巴细胞，细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，γ-δ淋巴细胞，NKT细胞或其他免疫效应细胞的方法，包括将根据方面5的表达载体的表达载体引入所述CD3+淋巴细胞，NK淋巴细胞，细胞因子诱导的杀伤细胞(CIK)，γ-δ淋巴细胞，NKT细胞或其他免疫效应细胞中。
这还包括产生单个细胞或将表达载体引入单个细胞的可能性。
在第十四方面，本发明涉及鉴定或分离CD45+，CD3+，CD8-，CD127+，CCR7+ T淋巴细胞的方法，包括使包含所述T淋巴细胞的细胞样品与根据方面1或2的抗体或与根据方面3的结合分子接触。
优选的实施方式是根据方面1或2的抗体的抗体，根据方面3的结合分子，根据方面5的表达载体，根据方面6的CD3+淋巴细胞，NK淋巴细胞，细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞，γ-δ淋巴细胞，NKT细胞或其他免疫效应细胞，或根据方面7的药物组合物，其用于治疗T细胞急性淋巴细胞白血病或瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症的方法。
此外，还可以治疗其他恶性肿瘤，其中细胞表达由本发明方面1和2的抗体识别的表位。
另一个优选的实施方式是根据方面1或2的抗体或根据方面3的结合分子，其用于鉴定或分离CD45+，CD3+，CD8-，CD127+，CCR7+ T淋巴细胞的方法。
另一个优选的实施方式是根据方面1或2的抗体或根据方面3的结合分子，其用于分离或鉴定T细胞急性淋巴细胞白血病细胞，T淋巴瘤细胞，瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血细胞或肿瘤相关巨噬细胞的方法。
另一个优选的实施方式是根据方面1或2的抗体或根据方面3的结合分子，其用于诊断T细胞急性淋巴细胞白血病或瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症的方法。
此外，还可以诊断其他恶性肿瘤，其中细胞表达由本发明方面1和2的抗体识别的表位。
在下文中，通过附图和实施例进一步描述本发明，这些附图和实施例旨在解释而不是限制本发明。
序列表
<110> P·塔松（Tassone, Pierfrancesco）
<120> 靶向CD43的独特唾液酸糖基化的癌症相关表位的单克隆抗体
<130> U70414PC
<150> DE 102016015379.2
<151> 2016-12-22
<160> 6
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链CDR1
<400> 1
Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His
1               5                   10
<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链CDR2
<400> 2
Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Gly Asn Phe Tyr Tyr Val Asp Thr Val Lys
1               5                   10                  15
Gly
<210> 3
<211> 13
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 重链CDR3
<400> 3
Ser Thr Tyr Tyr His Gly Ser Arg Gly Ala Met Asp Tyr
1               5                   10
<210> 4
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链CDR1
<400> 4
Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Met Tyr Trp Tyr
1               5                   10
<210> 5
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链CDR2
<400> 5
Asp Thr Ser Lys Met Ala Ser
1               5
<210> 6
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 轻链CDR3
<400> 6
Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile Thr
1               5                   10
附图说明
图1：根据本发明保藏的杂交瘤细胞在一组健康供体的外周血单核细胞上产生的抗体表位的表达，并与现有技术的CD43检测抗体进行比较。
顶部散点图显示通过流式细胞术获得的数据。x轴表示检测到的前向散射(FSC)，y轴表示侧向散射(SSC)。每个点对应一个细胞。
下面的直方图在x轴上描绘了藻红蛋白信号强度。y轴将信号强度与100％的未染色样品的最大信号强度相关联。未填充的曲线代表未染色的对照，用水平条纹填充的曲线代表序列打乱的(scramble)IgG1染色的细胞(即阴性对照)，填充有交叉条纹的曲线代表mAb UN1染色的细胞，并且填充有斜条纹的曲线代表CD43染色的细胞)。
图2：由根据本发明保藏的杂交瘤细胞产生的抗体识别的细胞群。
图2显示了四个散点图。左侧的两个散点图属于淋巴细胞。右侧的两个散点图来自由根据本发明保藏的杂交瘤细胞产生的抗体检测的淋巴细胞。
在顶部的两个散点图中，x轴表示CD4信号强度，而y轴表示CD8信号强度。在底部的两个散点图中，x轴表示CD45ro信号强度，y轴表示CCR7信号强度。
图3显示了两个直方图。顶部的直方图表示由BCWM.1细胞系上根据本发明保藏的杂交瘤细胞产生的抗体(mAb UN1)检测到的表位UN1的表达。底部的直方图显示MWCL.1细胞系上的UN1表达。未填充的曲线代表未染色的对照，用水平条纹填充的曲线代表二级mAb染色的细胞，填充有垂直条纹的曲线表示序列打乱的IgG加上二级染色的细胞，并且填充有斜条纹的曲线表示由mAb UN1染色的细胞。
图4：由根据本发明保藏的杂交瘤细胞产生的抗体识别的肿瘤相关巨噬细胞(TAM)。白色箭头表示TAM浸润结肠直肠癌标本。
图5：THP1衍生的巨噬细胞用以下染色：对照IgG1，不存在肿瘤细胞(第一行)，UMG1-CH(根据本发明方面2的嵌合抗体，其中原始鼠Fc区被完全人IgG1Fc替换)，不存在肿瘤细胞(第二行)，和UMG1-CH，存在PANC1胰腺癌细胞系(第三行，具体是左侧)。第一列代表DAPI染色，第二列代表抗体加alexa-fluor 488标记的二抗，第三列代表叠加图像。
图6：用于评估HPB-ALL(左图)和H9细胞系(右图)中的ADCC的脱粒测定的结果。x轴上的数字代表不同的样品，意思是：无靶标(1)，E+T(2)，阴性对照(NC)200μg/ml(3)，UMG1-CH 10μg/ml(4)，UMG1-CH 50μg/ml(5)，UMG1-CH 100μg/ml(6)，UMG1-CH 200μg/ml(7)，阳性对照(PC)200μg/ml(8)。y轴表示受ADCC影响的CD107a+NK细胞相对于测试的CD107a+NK细胞总数/样品的百分比。
图7：用于评估BCWM.1细胞系中ADCC的脱粒测定的结果。x轴上的数字代表不同的样品。根据图6编号。y轴表示受ADCC影响的CD107a+NK细胞相对于测试的CD107a+NK细胞总数/样品的百分比。
图8：表达CD3+的淋巴细胞(CAR-T)能够在H9细胞存在下释放显著更高量的干扰素γ(IFNγ)。y轴报告以ng/ml表示的IFNγ浓度。x轴报告：未转导的T细胞(1)，用对照CAR转导的T细胞(2)和用UMG-1CAR转导的T细胞(3)。
图9：在H9细胞存在下，CAR-T能够释放显著更高量的白细胞介素2(IL-2)。y轴表示以ng/ml表示的IL2浓度。x轴报告：未转导的T细胞(1)，用对照CAR转导的T细胞(2)和用UMG-1CAR转导的T细胞(3)。
图10：CAR-T能够诱导H9细胞的选择性杀伤。y轴报告死/活细胞比率。x轴报告：单独的H9(1)，存在非转导的T细胞时的H9(2)，存在用对照CAR转导的T细胞时的H9(3)和存在用UMG-1CAR转导的T细胞的H9(4)。
图11：该图显示了体内实验的肿瘤体积曲线，其比较了对照IgG1与UN1-mAb的人源化形式(h-UN1)和UN1-mAb的非岩藻糖化形式(a-h-UN1)。
Figure GDA0002172277550000221
对照lgGl
Figure GDA0002172277550000222
h-UN1
Figure GDA0002172277550000223
a-h-UN1
实施例
提供以下实施例是为了说明本发明，但不应解释为限制本发明。这些实施例包括技术特征，并且应当理解，本发明还涉及该示例部分中呈现的技术特征的任何组合。
实施例1
根据本发明保藏的杂交瘤细胞在一组健康供体的外周血单核细胞上产生的抗体表位的表达，并与现有技术的CD43检测抗体进行比较。
首先，通过Ficoll梯度分离获得来自不同健康供体的外周血单核细胞(PBMC)。随后，将细胞接种在5ml管中，并用由以ICLC登录号ICLC PD n°16001保藏的杂交瘤细胞产生的1μg/ml mAb(mAb UN1)或1μg/ml序列打乱的鼠IgG1抗体在100μl结合溶液(磷酸盐缓冲盐水(PBS)+0.5％胎牛血清(FBS))中染色，并在4℃下孵育30分钟。然后将细胞在结合溶液中洗涤2次，并用异硫氰酸荧光素(FITC)-偶联的二抗在4℃在黑暗中染色30分钟。随后，将细胞在结合溶液中洗涤2次，并在ATTUNE NxT流式细胞仪(热科学公司)上获得。每个供体的一个管未染色，并且每个供体的一个管仅用FITC-偶联的二抗染色。总之，由根据本发明保藏的杂交瘤细胞产生的抗体能够识别不同供体的可变淋巴细胞亚群(范围：0-15％)。此外，它没有显示出与PBMC内的所有其他细胞群体的任何反应性，包括骨髓衍生细胞，因此对于相应抗原的表达是阴性的(参见图1，顶部)。
相反，当我们通过使用商业克隆(来自BD公司(Beckton Dickinson)的S7)测定相同PBMC的CD43表达时，发现所有淋巴细胞和骨髓细胞都是阳性的(参见图1，底部)。
因此，由根据本发明保藏的杂交瘤细胞产生的抗体表现出已经存在的针对CD43的抗体所不具有的特异性限制的反应性模式和特性。
实施例2
由根据本发明保藏的杂交瘤细胞产生的抗体识别的细胞群。
为了表征由根据本发明保藏的杂交瘤细胞产生的抗体检测的淋巴细胞亚群，我们对各淋巴细胞进行免疫磁性分选(Easysep do-it-yourself，干细胞技术公司(Stemcelltechnologies))。简而言之，将15μg抗体与制造商提供的组分混合以获得准备用于免疫磁性分离的溶液。在FcR阻断后，将该溶液加入来自3个不同供体的PBMC中，所述供体具有至少10％的抗体检测的淋巴细胞，并将细胞在室温下(r.t.)孵育15分钟。随后，将
Figure GDA0002172277550000231
磁性纳米颗粒加入溶液中，并将细胞在室温下再孵育10分钟。然后将溶液置于磁体中并除去未结合的细胞。由根据本发明的抗体检测到的细胞几乎都是CD45+CD3+CD4+CD8-CD127+CCR7+T淋巴细胞，其中大多数是CD45ro-(参见图2和表1)。
表1：UN1抗原阳性细胞的标志物
标志物 +/-
CD45 +
CD3 +
CD4 +
CD8 -
CD127 +
CCR7 +
CD45ra +
CD56 -
实施例3
由根据本发明保藏的杂交瘤细胞产生的抗体(mAb UN1)识别T-ALL和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症细胞系。
评估各种癌细胞系(表2)的UN1表达(MM：多发性骨髓瘤)。简而言之，将细胞接种在5ml管中，并在100μl结合溶液(磷酸盐缓冲盐水(PBS)+0.5％胎牛血清(FBS))中用1μg/mlmAb UN1或1μg/ml序列打乱的鼠IgG1抗体染色并在4℃下孵育30分钟。然后将细胞在结合溶液中洗涤2次，并用异硫氰酸荧光素(FITC)-偶联的二抗在4℃在黑暗中染色30分钟。随后，将细胞在结合溶液中洗涤2次，并在ATTUNE NxT流式细胞仪(热科学公司)上获得。每种细胞系的一个管未染色，并且每种细胞系的一个管仅用FITC-偶联的二抗染色。观察到属于EGILT3分类的T-ALL细胞系和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(图3)均对UN1表达呈阳性。
表2：癌症细胞系的UN1表达
Figure GDA0002172277550000241
Figure GDA0002172277550000251
实施例4
由根据本发明保藏的杂交瘤细胞产生的抗体(mAb UN1)识别肿瘤相关巨噬细胞。
如已经描述的，CD43是特异性白细胞标志物，通常限于造血谱系的不同细胞。发现由mAb UN1结合并在CD43同种型上的特异性表位由肿瘤相关巨噬细胞(TAM)高度表达。
通过免疫组织化学评估来自不同类型癌症的标本(表3，图4)，观察到UN1+巨噬细胞是大多数肿瘤的高渗透成分，在胰腺癌和卵巢癌中具有特异性和特别高的浸润程度。
此外，在巨噬细胞分化模型中评估UN1表达是否在共培养的癌细胞存在或不存在时发生变化。
为此目的，使用THP1单核细胞白血病细胞，如前所示，其不表达UN1。为了获得分化的人非极化M0巨噬细胞(THP1-M)，在50ng/ml佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯(PMA)存在下，将这些细胞在完全合适的培养基中培养48小时。然后用不含PMA的新鲜培养基替换上述培养基。在该步骤中，在选定的孔中加入PANC1胰腺癌细胞系，比例为1:1，持续48小时。然后制备所有细胞用于免疫荧光分析。简而言之，固定后，用UMG1-CH或人IgG1对照染色THP1-M，并在4℃孵育过夜。然后将FITC抗人二级mAb加入细胞中2小时。洗涤后，将含有DAPI(Vectashield，载体实验室公司(Vectorlabs))的抗褪色固定介质加入到细胞中并盖上盖玻片用于读数。
如右图5所示，用对照IgG1染色的THP1衍生的巨噬细胞是完全阴性的，而用UMG1-CH染色的那些是弱阳性的。有趣的是，在PANC1存在下，THP1衍生的巨噬细胞对于UN1表达变得明亮。显示了THP1衍生的巨噬细胞(白色箭头)和PANC1(红色箭头)之间的特定相互作用(图5，左侧)。这些发现表明，当巨噬细胞共培养并与重建的肿瘤微环境内的癌细胞相互作用时，UN1特异性表位显著上调。这种上调本身是相关的，也是与聚焦肿瘤相关的巨噬细胞清除的治疗方法的代表性靶标。除了作为治疗工具的相关潜力之外，mAb UN1还可以为检测，分析预后作用和预测性研究提供有用性。
表3：各种肿瘤中的UN1+ TAM浸润
Figure GDA0002172277550000261
Figure GDA0002172277550000271
实施例5
嵌合mAb UMG1-CH(根据本发明的方面2)是用于T细胞急性淋巴细胞白血病/淋巴母细胞淋巴瘤的主动免疫治疗工具。
为了确定mAb UMG1-CH作为免疫治疗工具的潜在活性，首先评估其诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的能力。为此，在不同浓度的mAb UMG1-CH存在下，通过共培养来自健康供体的PBMC(效应细胞)与HPB-ALL或H9T-ALL细胞系(靶细胞)进行脱粒测定，具体如下：
将4×104个靶细胞接种于96孔圆底板中，并在不同浓度的mAb UMG1-CH(0，10，50，100，200μg/ml)或最高剂量(200μg/ml)的嵌合阴性或阳性对照(分别为NC和PC，每种200μg/ml)IgG1存在下，在37℃，5％CO2下培养30分钟。随后，将来自相同供体的0.4×106个PBMC(固定E:T＝10:1)与20μl/ml的PE偶联的抗CD107a mAb(BD)一起加入到每个孔中，然后将细胞在37℃，5％CO2下孵育3小时。1小时后，向每个孔(GolgiStop，BD)中加入6μg/ml莫能菌素。在孵育期结束时，用APC偶联的抗CD56和PerCp偶联的抗CD3对细胞进行染色，并在ATTUNENxT流式细胞仪(热科学公司)上分析。发现CD3-/CD56+/CD107a+细胞根据mAb UMG1-CH浓度显著增加，因此证实了mAb UMG1-CH作为ADCC诱导剂的潜力(图6)。
这些数据允许设计免疫靶向方法，这是T细胞急性淋巴细胞白血病/淋巴母细胞淋巴瘤的迫切和未满足的临床需求。
实施例6
嵌合mAb UMG1-CH(本发明的方面2)是瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症的主动免疫治疗工具。
为了研究mAb UMG1-CH的免疫治疗潜力，我们评估了其诱导抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)的能力。为此，我们通过在不同浓度的mAb UMG1-CH或阴性/阳性对照存在下共培养来自健康供体的纯化NK细胞(效应细胞)和BCWM.1细胞系(靶细胞)进行脱粒测定。我们选择mAb西妥昔单抗作为阴性对照，mAb利妥昔单抗作为阳性对照。具体而言，将105个靶细胞接种于96孔圆底板中，并在不同浓度的mAb UMG1-CH(0，10，50，100，200μg/ml)、200μg/ml西妥昔单抗或200μg/ml利妥昔单抗存在下，在37℃，5％CO2下培养30分钟。随后，将来自相同供体的105个NK细胞(固定E:T＝10:1)与20μl/ml的PE偶联的抗CD107a mAb(BD)一起加入到每个孔中，然后将细胞在37℃，5％CO2下孵育2小时。1小时后，向每个孔(GolgiStop，BD)中加入6μg/ml莫能菌素。在孵育期结束时，用APC偶联的抗CD56和PerCp偶联的抗CD3对细胞进行染色，并在ATTUNE NxT流式细胞仪(热科学公司)上分析。发现CD3-/CD56+/CD107a+细胞根据mAb UMG1-CH浓度显著增加，达到与利妥昔单抗获得的完全相同的效果，因此证实了该mAb作为ADCC诱导剂的潜力(图7)。
实施例7
嵌合抗原受体(CAR)-UMG1诱导针对表达由根据本发明保藏的杂交瘤细胞产生的抗体表位的细胞的显著细胞毒性。
为了进一步改善由根据本发明保藏的杂交瘤细胞产生的抗体作为免疫治疗工具的免疫治疗潜力，开发了第三代CAR。具体地，通过将由来自抗体序列的scFv组成的细胞外结构域与由CD3ζ链，TCR的信号传导区，和2个共刺激结构域CD28和4-1BB组成的细胞内区域偶联来设计CAR-T，因此模拟生理T细胞活化。为此，将抗体scFv与3个选择的共刺激结构域一起克隆到CAR盒中以产生慢病毒载体。随后，病毒颗粒用于以5的感染复数(MOI)转导来自健康供体的CD3+淋巴细胞，并通过流式细胞术评估转导效率(约38％)。最后测定针对抗体表位的CAR-T在靶细胞存在下释放IFNγ和IL-2的能力及该CAR-T的选择性细胞毒性能力。如图8和图9所示，CAR-UMG1仅在H9细胞存在下能够释放明显更高量的干扰素γ(IFNγ)和白细胞介素2(IL-2)。另外，仅CAR-UMG1能够诱导H9细胞的选择性杀伤(参见图10)，因此证明了所得CAR识别H9细胞和诱导T细胞活化的能力。
实施例8
该实施例报告了体内实验的肿瘤体积曲线，其比较了对照IgG1与UN1-mAb的人源化形式(h-UN1)和UN1-mAb的非岩藻糖化形式(a-h-UN1)。在该实验中，15只NOD-SCID-g-链不存在(NSG)小鼠皮下移植了5×106个HPB-ALL细胞。然后将小鼠随机接受每周腹膜内给予15mg/kg的对照IgG1，h-UN1或a-h-UN1，从第1天开始直至死亡，肿瘤体积>2000mm3或不可接受的毒性。每隔一天评估肿瘤体积，并且在图11中报告每个时间点的每组的平均体积。从第29天开始，h-UN1和a-h-UN1均显示出显著降低的疾病负担，证实了两种抗体的体内强烈活性。

Claims (28)

1.一种由以ICLC登录号ICLC PD n°16001保藏的杂交瘤细胞产生的单克隆小鼠抗体。
2.一种抗体，其包含含有互补决定区CDRH1，CDRH2和CDRH3的重链可变区，和含有互补决定区CDRL1，CDRL2和CDRL3的轻链可变区，其中CDRH1的氨基酸序列是GFTFSSFGMH，CDRH2的氨基酸序列是YISSGSGNFYYVDTVK，CDRH3的氨基酸序列是STYYHGSRGAMDY，CDRL1的氨基酸序列是SASSSVSSMYW，CDRL2的氨基酸序列是DTSKMAS和CDRL3的氨基酸序列是QQWSSYPPIT。
3.权利要求1或2所述的抗体，其中所述抗体是单克隆抗体或双特异性抗体，或其中所述抗体是权利要求1所述抗体的人、嵌合或人源化抗体。
4.如权利要求3所述的抗体，其中所述抗体能够诱导针对以下细胞的抗体依赖性细胞毒性(ADCC)：T细胞急性淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞的EGIL T3亚组，T细胞淋巴母细胞淋巴瘤细胞和瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症(WM)细胞。
5.如权利要求1-4中任一项所述的抗体，其中所述抗体识别包含与人CD43发生O-连接的GalNAc的表位。
6.一种结合分子，其衍生自如权利要求1-5任一所述的抗体。
7.如权利要求6所述的结合分子，其为单链抗体。
8.如权利要求6所述的结合分子，其选自scFv，scFv的多聚体和抗体片段。
9.如权利要求8所述的结合分子，所述scFv的多聚体选自双抗体，三抗体或四抗体。
10.如权利要求8所述的结合分子，其中所述抗体片段选自Fab，Tandab和柔性体。
11.一种嵌合抗原受体，其包含与细胞内结构域连接的如权利要求6所述的结合分子。
12.如权利要求11所述的嵌合抗原受体，其包含一个或多个信号传导结构域。
13.一种表达载体，其包含编码如权利要求11所述的嵌合抗原受体，如权利要求1-5中任一项所述的抗体或如权利要求6所述的结合分子的核酸序列。
14.如权利要求13所述的表达载体，其中所述载体是病毒载体或非病毒载体。
15.如权利要求13所述的表达载体，其中所述载体是慢病毒载体。
16.一种CD3+淋巴细胞，NK淋巴细胞，细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞，γ-δ淋巴细胞或NKT细胞，包含如权利要求11所述的嵌合抗原受体或如权利要求13所述的表达载体。
17.一种药物组合物，其包含如权利要求1-5中任一项所述的抗体或如权利要求6所述的结合分子或如权利要求16所述的CD3+淋巴细胞，NK淋巴细胞，细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞，γ-δ淋巴细胞或NKT细胞。
18.一种核酸，其编码如权利要求1-5中任一项所述的抗体或如权利要求6所述的结合分子。
19.一种杂交瘤细胞，其产生如权利要求1-5中任一项所述的单克隆抗体。
20.以ICLC登录号ICLC PD n°16001保藏的杂交瘤。
21.一种产生如权利要求1-5中任一项所述的单克隆抗体的方法，所述方法包括由以ICLC登录号ICLC PD n°16001保藏的杂交瘤细胞分离所述抗体。
22.一种鉴定或分离CD45+，CD3+，CD8-，CD127+，CCR7+T淋巴细胞的非诊断性方法，包括将包含所述T淋巴细胞的细胞样品与如权利要求1-5中任一项所述的抗体或与如权利要求6所述的结合分子接触。
23.一种鉴定或分离T细胞急性淋巴细胞白血病细胞，T淋巴瘤细胞，瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症细胞或肿瘤相关巨噬细胞的非诊断性方法，包括使包含所述细胞的细胞样品与如权利要求1-5中任一项所述的单克隆抗体或如权利要求6所述的结合分子接触。
24.一种产生表达如权利要求11所述的嵌合抗原受体的CD3+淋巴细胞，NK淋巴细胞，细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞，γ-δ淋巴细胞或NKT细胞的方法，包括将如权利要求13所述的表达载体导入所述CD3+淋巴细胞，NK淋巴细胞，细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞，γ-δ淋巴细胞或NKT细胞。
25.如权利要求1-5中任一项所述的抗体，如权利要求6所述的结合分子，如权利要求13所述的表达载体，如权利要求16所述的CD3+淋巴细胞，NK淋巴细胞，细胞因子诱导的杀伤(CIK)细胞，γ-δ淋巴细胞或NKT细胞，或如权利要求17所述的药物组合物的用途，用于制备治疗T细胞急性淋巴细胞白血病或瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症的药物。
26.如权利要求1-5中任一项所述的抗体或如权利要求6所述的结合分子的用途，用于制备鉴定或分离CD45+，CD3+，CD8-，CD127+，CCR7+T淋巴细胞的试剂盒。
27.如权利要求1-5中任一项所述的抗体或如权利要求6所述的结合分子的用途，用于制备分离或鉴定T细胞急性淋巴细胞白血病细胞，T淋巴瘤细胞，瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症细胞或肿瘤相关巨噬细胞的试剂盒。
28.如权利要求1-5中任一项所述的抗体或如权利要求6所述的结合分子的用途，用于制备诊断T细胞急性淋巴细胞白血病或瓦尔登斯特伦氏巨球蛋白血症的试剂盒。
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