KR20190080957A - Ｃｄ43의 독특한 시알로글리코실화된 암-연관 에피토프를 표적으로 하는 모노클로날 항체 - Google Patents

Ｃｄ43의 독특한 시알로글리코실화된 암-연관 에피토프를 표적으로 하는 모노클로날 항체 Download PDF

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Abstract

본 발명은 ICLC 수탁 번호 ICLC PD n° 16001 하에 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된, CD43의 독특한 시알로글리코실화된 암-연관 에피토프를 표적으로 하는 모노클로날 마우스 항체에 관한 것이다. 더욱이, 본 발명은 상보성 결정 영역 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 상보성 결정 영역 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체에 관한 것으로서, 여기서, CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 아미노산 서열 GFTFSSFGMH, YISSGSGNFYYVDTVKG, STYYHGSRGAMDY, SASSSVSSMYWY, DTSKMAS 및 QQWSSYPPIT를 각각 포함한다. 또한, 본 발명은 동일한 에피토프를 인지하는 항체에 관한 것이다.

Description

ＣＤ43의 독특한 시알로글리코실화된 암-연관 에피토프를 표적으로 하는 모노클로날 항체
본 발명은 ICLC 수탁 번호 ICLC PD n° 16001 하에 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 모노클로날 마우스 항체, 이의 관련 항체 및 결합 분자 및 용도에 관한 것이다.
CD43은 조혈 계통(hematopoietic lineage)의 세포로 제한되는 막관통 단백질 및 특이적인 백혈구 마커이다. 그러나, 이들 세포 중에서, CD43은 대부분의 말초 및 골수-유래 세포 구성성분 상에서 광범위하게 발현된다. CD43의 전구체 형태는 54 kD의 겉보기 분자량을 가지며 이동한다. 이의 성숙 형태에서, CD43은 많이 글리코실화되어, 115 내지 200 kD의 분자량을 갖게 된다. 전반적으로, CD4+ 흉선 세포 및 단핵구는 115 kD 형태를 발현하는 한편, 활성화된 CD4+ 및 CD8+ - T 세포, B 세포, 호중구 및 혈소판은 130 kD 형태를 발현한다. CD43은 세포 접착, 세포자멸사 및 이동과 같은 다수의 기능에 관여한다(문헌[Ostberg JR et al. Immunology today. 1998;19:546-50]).
글리코실화된 CD43과 같은 당단백질은, 구조 가변성 및 렉틴 리간드에의 결합 특이성을 부여하는 이들 당단백질의 글리칸 분지때문에 세포 신호전달, 면역 인지, 및 세포-세포 상호작용에 주요한 역할을 한다(문헌[Ohtsubo K. et al.. Cell 2006; 126, 855-867]). 뮤신형 당단백질은 고함량의 O-연결된 탄수화물 사슬(O-글리칸)을 특징으로 하고, 조혈 세포 및 상피 세포의 막 상에서 분비되거나 발현된다. O-글리칸 생합성은 골지체에서 개시하며, N-아세틸-갈락토사민(GalNAc)이 세린 또는 트레오닌 잔기에 O-글리칸의 Tn 항원 구조를 발생시키는 UDP-N-아세틸-D-갈락토사민: 폴리펩타이드 N-아세틸갈락토스아미닐트랜스퍼라제(GalNAc-트랜스퍼라제)에 의해 부착한다. O-연결된 글리칸 분지의 후속 신장은 갈락토스, 푸코스 및 시알산과 같은 다른 탄수화물의 첨가를 통해 조직-특이적인 글리코실트랜스퍼라제에 의해 촉매되고, 이는 O-연결된 탄수화물 사슬의 성질 및 길이에 대해 상이한 O-글리칸 구조의 콤플랙 어레이의 합성을 초래한다(문헌[Wopereis S. et al. Clin. Chem 2006; 52, 574-600]). 또한, 올리고당류는 시알릴화(sialylation), 푸코실화, 설페이트화, 메틸화 또는 아세틸화에 의해 변형될 수 있다. 특이적인 O-글리칸의 비정상적인 발현뿐만 아니라 O-글리칸 구조의 절단이 암세포에서 발생하며, 이는 일탈적인(aberrant) 글리코실화가 세포 신호전달, 접착, 및 항원성을 변형시킴으로써 암 진행에 기여할 수 있음을 시사한다(문헌[Hakomori S. et al. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 2002; 99, 10231-10233, Brockhausen I. EMBO Rep. 7 2006; 599-604]).
종양태아 항원(OA)은 주로, 정상적으로는 태아 발달 동안에만 고도로 발현되며, 분화 동안 점진적으로 억제되고, 따라서 성인 조직에서 발현되지 않는 하나 이상의 유전자의 생성물 및 당단백질이다. 성인에서의 이들의 재발현은, 제어된 유전자의 일탈적인 활성화의 결과이며, 이는 암에서 발생한다. 종양태아 에피토프(OE)는 항체에 의해 인지되는 OA의 부분이다. 발현이 암 조직에 국한되어 있는 OA 또는 특정한 종양태아 에피토프(OE)의 식별은, 조기 종양 형성의 과정을 검출하는 데 역할을 할 수 있을 뿐만 아니라, 가장 중요하게는 인간 암에 대한 새로운 면역치료 접근법을 개발하는 데 있어서 중대할 수 있다.
본 발명의 목적은 OE의 검출 및 신규 면역치료 접근법의 개발을 가능하게 하는 항체를 제공하는 것이다.
과제는 본 발명에 따른 항체에 의해 해결된다. 실시예에 제시된 데이터는, 태아 조직에서의 제약된 발현의 특이적인 패턴 및 악성 종양에서의 재발현으로 인해, 본 발명에 따라 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체에 의해 인지되는 에피토프가 OE인 것으로 생각될 수 있음을 가리킨다. 따라서, 후자는 인간 암의 치료를 위한 혁신적인 면역치료 전략에 잠재적으로 적합한 표적을 나타낸다.
나아가, 본 발명에 따른 항체를 기초로 한 결합 분자의 scFv를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)가 개발되었으며, 상기 항체는 CD3ζ 사슬을 포함하는 세포내 영역, T 세포 수용체의 신호전달 영역, 및 2개의 공동-자극 도메인 CD28 및 41BB에 연결된다. 본 발명에 따른 CAR을 발현하는 CD3+ 림프구는 본 발명에 따라 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체에 의해 인지되는 에피토프를 발현하는 세포에 대해 유의한 세포독성을 유도한다.
본 발명의 뮤린(murine) 항체의 효과가 이미 일부 기재되어 있긴 하더라도(문헌[Tassone et al., Tissue Antigens, 1994; De Laurentiis et al, Mol Cel Proteomics 2011; Cecco et al, Tissue Antigens, 1998; De Laurentiis et al, Int J Biol Macromol, 2006; Tassone et al, Int J Oncol, 2002; Tassone et al, Anticancer Res, 2002]), 이 항제가 결합하는 에피토프뿐만 아니라 이 항체 자체 또는 이의 서열은 대중에게 이용 가능한 적이 전혀 없었다.
ICLC PD n° 16001 하에 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 마우스 항체가 제공된다. 또한, ICLC PD n° 16001 하에 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체가 인지하는 것과 동일한 에피토프를 인지하는 항체가 제공된다.
나아가, 본 발명은 상보성 결정 영역 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 상보성 결정 영역 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체에 관한 것이며, 여기서, CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 아미노산 서열 GFTFSSFGMH, YISSGSGNFYYVDTVKG, STYYHGSRGAMDY, SASSSVSSMYWY, DTSKMAS 및 QQWSSYPPIT를 각각 포함한다.
바람직하게는, 상기 항체는 모노클로날 항체이다.
나아가, ICLC PD n° 16001 하에 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체로부터 유래된 결합 분자, 또는 본 발명의 상기 항체로부터 유래된 결합 분자가 제공된다.
더욱이, 키메라 항원 수용체가 제공되며, 이러한 수용체는 CD3ζ 사슬을 포함하는 세포내 영역, T 세포 수용체의 신호전달 영역, 및 2개의 공동-자극 도메인 CD28 및 41BB에 연결된 본 발명에 따른 scFv 결합 분자를 포함한다.
더욱이, 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체, 본 발명에 따른 항체 또는 본 발명에 따른 결합 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터가 제공된다.
나아가, 본 발명은 본 발명에 따른 키메라 항원 수용체 또는 본 발명에 따른 발현 벡터를 포함하는 CD3+ 림프구, NK 림프구, 사이토카인 유도 살해(CIK; Cytokine induced killer) 세포, 감마-델타 림프구, 또는 NKT 세포를 제공한다.
본 발명에 따른 항체 또는 본 발명에 따른 결합 분자 또는 본 발명에 따른 CD3+ 림프구, NK 림프구, 사이토카인 유도 살해(CIK) 세포, 감마-델타 림프구 또는 NKT 세포를 포함하는 약제학적 조성물이 제공된다.
본 발명에 따른 항체 또는 본 발명에 따른 결합 분자를 인코딩하는 핵산이 제공된다.
본 발명에 따른 항체를 생성하는 하이브리도마 세포가 제공된다.
본 발명에 따른 항체의 생성 방법이 제공되며, 이러한 방법은 ICLC PD n° 16001 하에 기탁된 하이브리도마 세포로부터 상기 항체를 단리하는 단계를 포함한다.
T-세포 급성 림프아구성 백혈병 세포, T 림프종 세포, 발덴스트롬 거대글로불린혈증(Waldenstrom's Macroglobulinemia) 세포 또는 종양-연관 대식세포의 식별 또는 단리 방법이 제공되며, 이러한 방법은 상기 세포를 포함하는 세포 시료를 본 발명에 따른 항체 또는 본 발명에 따른 결합 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다.
본 발명에 따른 키메라 항원 수용체를 발현하는 CD3+ 림프구, NK 림프구, 사이토카인 유도 살해(CIK) 세포, 감마-델타 림프구 또는 NKT 세포의 생성 방법이 제공되며, 이러한 방법은 본 발명에 따른 발현 벡터를 상기 CD3+ 림프구, NK 림프구, 사이토카인 유도 살해(CIK) 세포, 감마-델타 림프구 또는 NKT 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다.
발명의 상세한 설명
제1 양태에서, 본 발명은 ICLC PD n° 16001 하에 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 마우스 항체에 관한 것이다.
하이브리도마 세포는 2016년 8월 4일에 이탈리아 제노아 16132, 10, 라르고 로산나 소재의 Interlay Cell Line Collection(ICLC)의 Centro Biotecnologie Avanzate(CBA)에 수탁 번호 ICLC PD n° 16001 하에 기탁되었다. 이러한 항체는 하기에 주어진 실시예에서 시험되었다. 실시예에 제시된 바와 같이, 항체는 CD43 상의 특이적인 시알로글리코실화된 에피토프에 결합한다.
나아가 이러한 제1 양태에서, 본 발명은 상보성 결정 영역 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 상보성 결정 영역 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체에 관한 것이며, 여기서, CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 아미노산 서열 GFTFSSFGMH, YISSGSGNFYYVDTVKG, STYYHGSRGAMDY, SASSSVSSMYWY, DTSKMAS 및 QQWSSYPPIT를 각각 포함한다.
이들 서열은 또한, SEQ ID NO. 1~6으로 주어진다.
상기 언급된 CDR 서열은 시퀀싱에 의해 결정된 바와 같이, ICLC PD n° 16001 하에 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 마우스 항체로부터의 CDR 서열이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "CDR" 또는 "상보성 결정 영역"은 중쇄 및 경쇄 폴리펩타이드 둘 다의 가변 영역 내에서 확인되는 비접경(noncontiguous) 항원 조합 부위를 의미한다. 이들 특정 영역은 문헌[Kabat et al., J. Biol. Chem. 252, 6609-6616 (1977) 및 Kabat et al., Sequences of protein of immunological interest. (1991), 및 Chothia et al., J. Mol. Biol. 196:901-917 (1987) 및 MacCallum et al., J. Mol. Biol. 262:732-745 (1996)]에 의해 기재되어 있으며, 여기서, 정의는 서로에 비해 비교될 때 아미노산 잔기의 중첩 또는 하위세트를 포함한다. 상기 인용된 참조문헌 각각에 의해 정의된 바와 같은 CDR을 포괄하는 아미노산 잔기는 비교를 위해 주어진다. 바람직하게는, 용어 "CDR"은 서열 비교를 기초로 Kabat에 의해 정의된 바와 같은 CDR이다. CDRH1, CDRH2 및 CDRH3은 중쇄 CDR을 의미하고, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 경쇄 CDR을 의미한다.
이러한 모노클로날 항체는 임의의 종으로부터의 프레임워크 서열을 가질 수 있다. 바람직하게는, 이러한 모노클로날 항체는 마우스 또는 인간 프레임워크를 가질 수 있다.
본원에 사용된 바와 같이 용어 "프레임워크(FR) 아미노산 잔기"는 면역글로불린 사슬의 프레임워크 영역 내의 아미노산을 지칭한다. 본원에 사용된 바와 같이 용어 "프레임워크 영역" 또는 "FR 영역"은 (예를 들어 CDR의 Kabat 정의를 사용하여) 가변 영역의 부분이지만 CDR의 부분은 아닌 아미노산 잔기를 포함한다.
상기 언급된 바와 같은 CDR 서열을 갖는 모노클로날 항체의 생성 방법은 당업계에 공지되어 있고, CDR을 인코딩하는 핵산 서열을 요망되는 프레임워크 서열을 인코딩하는 적합한 발현 벡터 내로 도입하는 단계를 포함한다. 추가의 방법은 하기에 기재된다.
제2 양태에서, 본 발명은 제1 양태에 따른 항체가 인지하는 것과 동일한 에피토프를 인지하는 항체에 관한 것이다.
전형적으로, 당업계에 일반적으로 공지된 바와 같이, 항체는 면역글로불린의 단백질 계통(family)에 속하는 단백질이고, 상기 정의된 바와 같은 항체의 프레임워크 영역 및 상보성 결정 영역의 가변 영역으로 구성된다. 천연적으로, 항체는 소정의 항원에 반응하여 형질 세포에 의해 생성된다. 일반적으로, 각각의 항체는 2개의 동일한 중쇄 면역글로불린 및 2개의 동일한 경쇄 면역글로불린을 가진다. 각각의 중쇄 및 각각의 경쇄는 가변 영역 및 불변 영역을 가질 수 있다. 중쇄의 불변 영역은 5가지 유형의 포유류 Ig 중쇄: α, δ, ε, γ 및 μ 중 하나일 수 있다. 통상 존재하는 중쇄의 유형은 항체의 클래스(class)(이소형): 각각 IgA, IgD, IgE, IgG 및 IgM 항체를 정의한다. 유사하게는, 경쇄의 불변 영역은 2가지 유형의 포유류 Ig 경쇄: κ 및 λ 중 하나일 수 있다. 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 통상, 특정 항원으로의 결합을 가능하게 하는 수많은 단백질 서열들의 독특한 조합으로 제조된다.
본 발명에 따르면, 용어 "항체"는 또한 단리된 항체를 포괄한다.
일반적으로, 각각의 중쇄는 경쇄 중 하나에 연결되고, 이로써 중쇄 및 경쇄의 가변 영역은 조합되어 2개의 동일한 항원-결합 부위 중 하나를 형성하고, 이들의 불변 영역은 조합되어 항체의 불변 영역을 형성한다. 나아가, 1개의 중쇄 및 1개의 경쇄의 구축물은 둘 다, 이들의 중쇄의 불변 영역을 통해 연결되어, "Y"-형 분자를 형성할 수 있으며, 이로써 2개의 암(arm)이 항원-결합 가변 영역을 도시하고, 스템(stem)이 불변 영역을 도시한다.
제2 양태에 따른 항체는 완전(complete) 항체일 수 있으며, 이는 통상 이러한 항체가 각각의 가변 도메인뿐만 아니라 3 또는 4개의 불변 도메인의 중쇄 및 1개의 불변 도메인의 경쇄를 포함하는 것을 의미하며, 이로써, 각각의 도메인은 돌연변이, 결실 또는 삽입과 같은 추가의 변형을 포함할 수 있고, 이러한 변형은 전체 도메인 구조를 변화시키지 않는다.
나아가, 본 발명의 제2 양태에 따른 항체는 동종이량체 또는 이종이량체, 또는 동종다량체 또는 이종다량체를 형성할 수 있으며, 이로써, "이량체" 및 "다량체"는, 2개 및 적어도 3개의 항체가 각각 조합되어 복합체를 형성할 수 있음을 의미한다. 접두사 "동종(homo)"은, 복합체가 동일한 항체 분자로 형성될 수 있음을 의미하고, 이로써 접두사 "이종(hetero)"은 복합체가 상이한 항체 분자로 형성될 수 있음을 의미한다.
일반적으로, 용어 "항체"는 상기-언급된 면역글로불린 이소형을 모두 포함하고자 하며, 즉, 항체는 IgA, IgD, IgE, IgG 또는 IgM 항체일 수 있으며 이들 이소형의 임의의 서브클래스를 포함한다. 바람직하게는 항체는 IgG 항체이고, 보다 바람직하게는 항체는 IgG1 항체이다. 항체가 재조합적으로 발현되고 생성될 수 있기 때문에, 이러한 항체는 또한, 중쇄의 2개의 상이한 불변 영역, 예를 들어 1개의 IgG1 및 1개의 IgG2 중쇄, 또는 상이한 종으로부터의 중쇄를 포함할 수 있다. 그러나, 중쇄는 바람직하게는, 동일한 종으로부터의 것이다. 더욱이, 항체는 람다 또는 카파 경쇄를 포함할 수 있다.
본 발명의 제1 양태의 항체 중 하나가 인지하는 것과 동일한 에피토프를 인지하는 항체는 추가로 상보성 결정 영역 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역 및 상보성 결정 영역 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체일 수 있으며, 여기서, CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 아미노산 서열 GFTFSSFGMH, YISSGSGNFYYVDTVKG, STYYHGSRGAMDY, SASSSVSSMYWY, DTSKMAS 및 QQWSSYPPIT를 각각 가진다.
더욱이, 본 발명의 제1 양태의 항체 중 하나가 인지하는 것과 동일한 에피토프를 인지하는 항체는, 상기 언급된 서열과 비교하여 CDR이 적어도 하나의 보존적 아미노산 교환, 예를 들어 원래의 아미노산과 유사한 화학 구조 및 특성 및/또는 기능을 갖는 유사한 아미노산을 갖는 항체일 수 있다.
본 발명의 제1 양태의 항체 중 하나가 인지하는 것과 동일한 에피토프를 인지하는 항체는 또한, 본 발명의 제1 양태의 항체 중 하나와 비교하여 증가된 또는 저하된 친화성 또는 특이성을 갖는 항체일 수 있다. 이러한 항체는 당업계에 공지되고 본원 하기에 추가로 기재된 방법에 의해 쉽게 수득된다.
일반적으로, 본 발명의 제2 양태에 따른 항체는 ICLC PD n° 16001 하에 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 모노클로날 마우스 항체의 서열과 적어도 75%, 80%, 85%, 90%, 95% 또는 100%(예를 들어 적어도 86, 87, 88, 89, 90, 91, 92, 93, 94, 95, 96, 97, 98 또는 99%) 동일한 서열을 특히 이러한 항체의 가변 영역에 가질 수 있다.
통상, 본 발명에 따른 항체는 모노클로날, 이중특이적 또는 다중특이적 항체일 수 있다. 이러한 항체들은 본 기술 분야에서 공지되어 있다. 본 발명의 맥락에 사용된 바와 같이, 용어 "모노클로날"은 가장 넓은 의미에서, B 림프구의 단일 클론에 의해 생성되는 항체 또는 동일하거나 유사한 아미노산 서열을 갖는 항체를 기재하는 것으로 이해될 수 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "이중특이적"은 가장 넓은 의미에서, 2개의 상이한 에피토프와 상호작용하는 항체를 기재하는 것으로 이해될 수 있다. 이중특이적 항체는 2개의 모노클로날 항체로부터 유래될 수 있다. 선택적으로, 이들 2개의 상이한 에피토프는 동일한 항원 상에 위치할 수 있으나, 이들 에피토프는 또한 2개의 상이한 항원 상에 위치할 수도 있다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "다중특이적"은 가장 넓은 의미에서, 3개 이상의 상이한 유형의 에피토프와 상호작용하는 항체를 기재하는 것으로 이해될 수 있다. 선택적으로, 이들 에피토프는 동일한 항원 상에, 또는 2개 이상의 항원 상에 위치할 수 있다.
바람직하게는, 본 발명의 양태 2에 따른 항체는 모노클로날 항체이다. 나아가, 본 발명의 양태 2에 따른 항체는 바람직하게는 이중특이적 또는 다중특이적 항체이다.
항체의 생성 방법은 통상의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 바람직하게는, 항체는 하이브리도마 세포를 제조함으로써 생성된다. 하이브리도마 세포의 도움을 받아 항체를 생성하는 방법뿐만 아니라 하이브리도마 세포를 생성하는 방법은 통상의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 일반적으로, 마우스에게 요망되는 항원을 주사하고, 수일 후 안락사시켜, 상기 요망되는 항원에 대한 항체를 분비하는 비장 세포를 단리한다. 일반적으로, 이들 항체-분비성 비장 세포와 불멸 비-분비성 골수종 세포의 융합은 하이브리도마 세포를 초래한다. 그 후에, 이들 하이브리도마 세포를 스크리닝하고, 요망되는 항체를 생성하는 하이브리도마를 선택한다. 그 후에, 선택된 하이브리도마를 생체내 또는 시험관내에서 배양할 수 있고, 요망되는 항체를 단리할 수 있다.
이작용성 또는 이중특이적 항체는 상이한 특이성의 항원 결합 부위를 가질 수 있다. 다양한 형태의 이중특이적 항체 및 이들의 생성은 통상의 기술자에게 공지되어 있다. 예를 들어 이들 항체는, 소위 "하이브리드 하이브리도마"에 의해 분비되는 2개의 별개의 중쇄 및 2개의 별개의 경쇄를 포함하는 IgG 분자인 BSIgG, 및 상이한 특이성의 항체 또는 항체 단편의 화학적 공액에 의해 생성되는 이종항체 공액체를 포함한다(문헌[Segal DM et al. Current Opin. Immunol. 1999, 11:558-562; Van Spriel AB et al. Immunology Today 2000, 21:391-397]).
이중특이적 항체는 세포, 세포독소 또는 약물을 특이적 부위에 전달하기 위해 발생될 수 있다. 중요한 용도는 숙주의 세포독성 세포, 예컨대 NK 또는 세포독성 T 세포를 특이적인 세포 표적에 전달하는 것일 수 있다(문헌[P. J. Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 1990, 79: 315]). 또 다른 중요한 용도는 세포독성 단백질을 특이적인 세포 표적에 전달하는 것일 수 있다(문헌[V. Raso, T. Griffin, Cancer Res. 1981, 41:2073; S. Honda et al., Cytotechnology, 1990, 4:59]). 추가의 중요한 용도는 항암 비-단백질 약물을 특이적인 세포 표적에 전달하는 것일 수 있다(문헌[J. Corvalan et al., Intl. J. Cancer Suppl. 1988, 2:22; M. Pimm et al., British J. of Cancer 1990, 61:508]). 이러한 이중특이적 항체는 화학적 가교(문헌[M. Brennan et al., 1985, Science 229:81]), 이황화 교환 또는 하이브리드-하이브리도마(쿼드로마(quadroma))의 생성에 의해 제조될 수 있다. 쿼드로마는 2개의 상이한 항원에 대해 2개의 상이한 유형의 항체를 분비하는 하이브리도마를 융합함으로써 구축될 수 있다(문헌[Milstein and Cuello, Nature, 1983, 305: 537-539]).
본 발명의 맥락에 사용된 바와 같이, 용어 "에피토프"는 가장 넓은 의미에서, 항체의 항원 결합 영역 중 하나 이상에서 ICLC PD n° 16001 하에 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체에 의해 인지되고 결합될 수 있는 CD43 분자의 일부로서 이해될 수 있다. 에피토프에 결합하는 항체의 부분은 파라토프(paratope)로 지칭된다. 많은 경우, 에피토프는 파라토프에 대한 결합 부위를 특이적으로 발생시키는 입체형태 특성을 가진다.
에피토프는 통상, 아미노산 또는 당 측쇄와 같은 분자의 화학적 활성 표면 그룹핑으로 구성되고, 일반적으로 특이적인 전하 특징뿐만 아니라 특이적인 3차원 구조 특징을 가진다.
나아가, 에피토프와 항체 사이의 상호작용이 일반적으로 항원의 1차 구조, 즉 아미노산의 연속 서열을 기초로 할 수 있는 것으로 통상의 기술자에 의해 이해되고 인정된다. 통상, 상호작용은 또한, 글리코실화와 같은 번역후 변형뿐만 아니라 에피토프의 2차 구조, 3차 구조 또는 4차 구조를 기초로 할 수 있다. 에피토프와 항체 사이의 상호작용은 추가로, 항원의 3차원 구조 및 생성된 표면 특징을 기초로 할 수 있으며, 이는 원거리 위치에서 항체와 상호작용하게 되는 아미노산을 포함하는 아미노산 서열의 불연속 구획을 수반할 수 있다.
2개의 항체가 동일하거나 입체적으로 중첩되는 에피토프를 인지할 때, 항체는 제1 양태에 따른 항체가 인지하는 것과 "동일한 에피토프"를 인지한다. 일반적으로, 2개의 에피토프가 동일하거나 입체적으로 중첩되는 에피토프를 인지하는지 결정하기 위한 가장 광범위하게 사용되고 신속한 방법은 경쟁 검정법이고, 이는 표지 항원 또는 표지 항체를 사용하여 모든 수의 상이한 포맷에서 배치될 수 있다. 예를 들어, 항원은 96-웰 플레이트 상에 고정되고, 표지 항체의 결합을 차단하는 비표지 항체의 능력은 방사성 또는 효소 표지를 사용하여 측정된다.
제1 양태에 따른 항체가 인지하는 것과 "동일한 에피토프"를 인지하는 항체는 통상, 경쟁 검정법에서 항원으로의 참조 항체의 결합을 50% 이상 차단하는 항체를 지칭하고, 역으로, 참조 항체는 통상, 경쟁 검정법에서 항원으로의 상기 항체의 결합을 50% 이상 차단한다.
일반적으로, ICLC PD n° 16001 하에 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체에 의해 인지되고 결합되는 에피토프는, ICLC PD n° 16001 하에 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체와 조합하여 당업계에 공지된 임의의 적합한 에피토프 맵핑 방법에 의해 식별될 수 있다.
이러한 방법의 예는 ICLC PD n° 16001 하에 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체로의 결합에 대해 CD43으로부터 유래된 다양한 길이의 펩타이드를 스크리닝하는 단계를 포함하며, 이로써 항체에 특이적으로 결합할 수 있는 최소 단편은 통상, 항체에 의해 인지되는 에피토프의 서열을 함유한다. 일반적으로, CD43 펩타이드는 합성적으로, 또는 CD43의 단백용해성 분해(proteolytic digestion)에 의해 생성될 수 있다. 항체에 결합하는 펩타이드의 식별 방법, 예컨대 질량분광계 분석은 통상의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 또 다른 예에서, NMR 분광법은 본 발명의 항체와 상호작용하는 잔기를 식별하는 데 사용될 수 있다. 예를 들어, 15N 및 2H에 의해 균일하게 표지된 CD43 펩타이드는 비표지 항체와 혼합될 수 있고, 비표지 항체와 상호작용하는 표지 펩타이드 내의 아미노산은 NMR 스펙트럼 범위 내에서 이들 아미노산의 위치가 변할 때 검출될 수 있다. 전형적으로, 2개의 스펙트럼 사이의 차이는 항체와의 상호작용에 관여하는 CD43 내의 아미노산의 식별을 가능하게 한다. 바람직하게는, 질량분광계 분석은 항체에 결합하는 펩타이드의 식별에 사용된다.
예시적으로, ICLC PD n° 16001 하에 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 항체에 의해 인지되고 결합되는 에피토프는 또한, CD43 DNA의 다양한 DNA 단편을 중합효소 연쇄 반응(PCR)에 의해 증폭시키는 단계, 이들 단편을 히스티딘 융합 단백질로의 이들의 연결을 포함하는 발현 벡터 내로 통합시키는 단계, 및 단백질 발현 후, 에피토프를 예를 들어 웨스턴 블롯에 의해 검출하는 단계를 포함하는 방법에 의해 식별될 수 있다.
바람직한 실시형태에서, 양태 1 또는 2에 따른 항체는 인간 CD43에 O-연결된 GalNAc을 포함하는 에피토프를 인지한다.
추가의 예에서, ICLC PD n° 16001 하에 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체에 의해 인지되고 결합되는 CD43 상의 부위를 결정하기 위해, CD43으로 클로닝된 발현 벡터에 결실 돌연변이를 PCR 방법에 의해 도입하여, 돌연변이체 시리즈, 예컨대 에스케리키아 콜라이(이. 콜라이) 돌연변이체 시리즈를 제조할 수 있으며, 이러한 시리즈는 CD43에 다양한 결실된 부위를 갖는 단백질을 발현한다. 이들 이. 콜라이 돌연변이체는 발현을 위해 배양되고 유도될 수 있다. 웨스턴 블롯 분석은 세포 용해물을 항원으로서 사용하여 수행될 수 있다.
ICLC PD n° 16001 하에 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체에 의해 인지되고 결합되는 에피토프를 식별하기 위한 추가의 방법은 효소-연결 면역흡착 검정법(ELISA)과 같은 면역검정법을 통한 검출을 포함할 수 있다.
본 발명의 맥락에 사용된 바와 같이, 용어 "친화성"은 가장 넓은 의미에서, 에피토프와 항체의 에피토프-결합 부위 사이의 상호작용의 강도로서 이해될 수 있다. 항체 친화성에 대한 절대값, 즉, 친화성 상수를 결정하는 방법은 통상의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 그러나, 항체 친화성의 상대값 또한, 일반적으로 결정될 수 있으며, 즉, 2개의 항체의 친화성은 이들의 절대값을 결정하지 않고도 비교된다. 항체의 친화성을 비교하는 방법은 통상의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 유세포분석이 사용될 수 있으며, 이로써 요망되는 에피토프를 갖는 세포가 독립적으로, 상이한 항체와 접촉하게 될 수 있으며, 이러한 세포는 후속해서 면역형광 2차 항체를 이용하여 표시된다. 통상, 유세포분석을 이용한 검출 후, 항체의 신호의 세기가 비교될 수 있다.
제1 양태의 항체에 따른 항체가 인지하는 것과 동일한 에피토프를 인지하는 제2 양태에 따른 항체의 식별 방법은 통상의 기술자에게 잘 공지되어 있다. 예를 들어, 제2 양태에 따른 항체는 항체 라이브러리를 기초로 파지 디스플레이에 의해 식별될 수 있다.
결과적으로, 동일한 에피토프를 인지하는 본 발명의 항체는 또한, 인간 항체일 수 있다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 제2 양태에 따른 항체는 키메라 항체이다. 보다 바람직한 실시형태에서, 제2 양태에 따른 항체는 제1 양태에 따른 키메라 항체이다.
키메라 항체는, 항체의 면역원성을 감소시키기 위해 하나의 종의 면역글로불린의 적어도 하나의 영역이 또 다른 종의 면역글로불린의 또 다른 영역에 유전자 조작에 의해 융합된 항체이다(예를 들어 미국 특허 4,816,567 및 미국 특허 4,816,397 참조).
또 다른 바람직한 실시형태에서, 제2 양태에 따른 항체는 인간화 항체이다. 보다 바람직한 실시형태에서, 제2 양태에 따른 항체는 제1 양태의 항체에 따른 키메라 또는 인간화 항체이다.
일반적으로, 인간화 항체는 특정 유형의 키메라 항체이다. 예를 들어, 인간화 항체는 인간 항체의 DNA를 마우스 항체 프레임워크 코딩 DNA 내로 이식하거나, 또는 마우스 항체의 DNA를 인간 항체 프레임워크 코딩 DNA 내로 이식함으로써 생성될 수 있다. 바람직하게는, 인간 항체의 DNA는 마우스 항체 프레임워크 코딩 DNA 내로 이식된다. 일반적으로, DNA의 이식은 하나 이상의 DNA 서열을 표적 항체 프레임워크 코딩 DNA 내로 이식하는 단계를 포함한다. 선택적으로, 중쇄 및 경쇄뿐만 아니라 가변 영역 및 불변 영역은 부분적으로 또는 완전히 인간화될 수 있다. 바람직하게는, 마우스 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 인간화된다. 보다 바람직하게는, 마우스 항체의 중쇄 가변 영역 및 경쇄 가변 영역은 1 내지 50개, 바람직하게는 1 내지 30개, 보다 바람직하게는 1 내지 20개의 아미노산을 인코딩하는 DNA 서열을 변화시킴으로써 인간화된다. 이식된 DNA는 일반적으로, 상보성 결정 영역(CDR)이라고도 하는 항원 특이성을 결정하는 6개의 초가변 루프의 DNA 영역, 또는 CDR을 포함하지 않는 DNA 영역, 또는 둘 다를 포함할 수 있다. 바람직하게는, 인간화는 CDR을 포함하지 않는 DNA의 이식을 포함한다.
일반적으로, 생성된 DNA 구축물은 그 후에 비-인간 부모 항체와 비교하여 통상 덜 면역원성이거나 면역원성이지 않은 항체를 발현하고 생성하는 데 사용될 수 있다. 이는 탈글리코실화된 항체 또는 탈푸코실화된 항체와 같은 변형된 항체의 생성을 포함한다. 이러한 방법은 당업계에 잘 공지되어 있다.
결과적으로, 동일한 에피토프를 인지하는 본 발명의 항체는 또한, 탈글리코실화된 항체 또는 탈푸코실화된 항체일 수 있다.
또 다른 바람직한 실시형태에서, 양태 2의 항체에 따른 모노클로날 항체는 T 세포 급성 림프아구성 백혈병(T-ALL) 세포의 EGIL T3 하위그룹에 대해, T 세포 림프아구성 림프종 세포에 대해, 및 발덴스트롬 거대글로불린혈증(WM) 세포에 대해 항체 의존적 세포성 세포독성(ADCC)을 유도할 수 있다.
림프구는 백혈구의 군에 속하고, 체액성 및 세포-매개 면역력의 매개자이다. 2개의 림프구 군, B-세포 및 T-세포가 존재한다.
많은 다른 세포 유형과 마찬가지로, B-세포 및 T-세포는 B-세포 및 T-세포 종양으로 비정상적으로 발달할 수 있다. B-세포 및 T-세포를 발달시키는 수많은 발달 단계로 인해, 다양한 종류의 종양이 존재한다. B-세포 및 T-세포는 둘 다, 림프양 전구체 세포로부터 기원한다.
B-세포의 경우, 이러한 림프구양 전구체 세포는, 각각 형질 세포가 형성될 때까지 소정의 정의 가능한 세포 유형을 포함하는 많은 B 세포 발달 단계를 통해 발달한다. 이들 단계 중 하나는 소위 "IgM-분비성 B 세포"를 포함하고, 이러한 세포는 마지막으로 항체-생성 형질 세포로 발달한다. "IgM-분비성 B-세포"로부터 기원하는 종양은 발덴스트롬 거대글로불린혈증"(WM)으로 지칭된다. WM은 드물고 무통성인 난치 질병이다. 이러한 세포는 클로날 IgM 분비 림프형질세포성 세포의 골수 축적을 특징으로 한다.
T-세포는 림프구양 전구체 세포로부터 성숙한 T-세포로 불과 몇 개 발달 단계에서 발달한다. 종양은 특히, 성숙한 T-세포 또는 림프구양 전구체 세포로부터 진화할 수 있으며, 림프구양 전구체 세포는 B- 또는 T-세포 급성 림프아구성 백혈병, (B-ALL) 및 (T-ALL)을 각각 초래한다. T-세포 표현형 T-ALL은 모든 급성 림프아구성 백혈병 사례 중 약 20%를 차지하고, 아동에서보다 성인에서 더 자주 발생한다. T-ALL은 T-세포 림프아구성 림프종(T-LBL)과 밀접하게 관련이 있고, 두 질병 사이의 차별적인 진단은 특이적인 부위에서의 우세한 국소화, 예컨대 T-ALL에서는 골수 또는 T-LBL에서는 2차 림프양 기관을 기초로 한다. 백혈병의 면역학적 특징화에 대한 유럽 그룹(EGIL)은 T-ALL을 이들의 면역학적 표현형에 따라 4개의 하위그룹으로 나누었다(문헌[Bene MC, Leukemia 1995;9:1783]):
1) EGIL T1(프로-), CD3(cCD3)에 대한 세포질 양성 및 CD7의 표면 발현을 특징으로 함;
2) EGIL T2(프리-) cCD3, CD7에 대한 양성 및 CD2 또는 CD5의 양성을 특징으로 함;
3) EGIL T3(피질) cCD3, CD1a에 대한 양성 및 표면 CD3(sCD3)의 존재 또는 부재를 특징으로 함, 및
4) EGIL T4(성숙 백혈병), cCD3 및 sCD3에 대한 양성 및 CD1a에 대한 음성을 특징으로 함.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "항체-의존적 세포성 세포독성(ADCC)"은 자연 살해(NK) 세포와 같은 세포독성 효과기 세포에 의한, 항체에 의해 결합되고 표시된 세포의 사멸화이다.
항체가 ADCC를 유도할 수 있는지 검사하기 위해, 하기 검정법이 사용될 수 있다. 효과기 세포를 포함하는 건강한 공여자로부터 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를, 상이한 항체 농도의 존재 하에 에피토프를 발현하는 표적 세포와 함께 공동-배양함으로써 탈과립화 검정법을 수행한다. 4 x 104개의 표적 세포를 96웰 둥근 바닥 플레이트에 접종하고, 상이한 농도의 항체(0, 10, 50, 100 및 200 ug/ml) 또는 대조군 IgG1의 존재 하에 37℃ 5% CO2에서 30분 동안 배양한다. 후속적으로, 동일한 공여자로부터의 0.4 x 106개의 PBMC(고정된 효과기 세포(E) : 표적 세포(T) = 10 : 1)를 각각의 웰에 20 μl/ml의 피코에리트린(PE)-공액 항-CD107a 모노클로날 항체(mAb) (BD)와 함께 첨가하고, 그 후에 세포를 37℃ 5% CO2에서 3시간 동안 인큐베이션한다. 1시간 후, 6 μg/ml 모네신을 각각의 웰(GolgiStop, BD)에 첨가한다. 인큐베이션 기간의 종료 시, 세포를 알로피코시아닌(APC)-공액 항-CD56 및 페리디닌 클로로필 단백질 복합체(PerCp)-공액 항-CD3으로 염색하고, ATTUNE NxT 유세포분석기(THERMO Scientific) 상에서 분석한다. CD3-/CD56+/CD107a+ 세포를 검출함으로써, 표적 세포 용해(CD107a+)를 유도하는 NK 세포(CD3-/CD56+)를 측정한다. 따라서, 증가하는 항체 농도에 따른 CD3-/CD56+/CD107a+ 세포의 증가는 ADCC를 유도하는 항체의 잠재력을 확인시켜 준다. 생성된 데이터는, 면역 표적화 접근법을 설계하는 것을 가능하게 하며, 이는 예를 들어 T 세포 급성 림프아구성 백혈병/림프아구성 림프종에서 긴급하고 충족되지 않는 임상적 요구이다. 항체가 ADCC를 유도할 수 있는지 검사하기 위한 추가의 방법이 또한 사용될 수 있고, 통상의 기술자에게 잘 공지되어 있다.
제3 양태에서, 본 발명은 양태 1 또는 양태 2에 따른 항체로부터 유래되는 결합 분자에 관한 것이다.
본 발명에 따르면, 결합 분자는 ICLC PD n° 16001 하에 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 마우스 항체로부터 유래되는 분자이다. 바람직하게는, 결합 분자는 분자를 포함하는 면역글로불린이며, 즉, 결합 분자는 적어도 하나의 면역글로불린(Ig) 도메인을 포함한다.
바람직한 실시형태에서, 본 발명의 결합 분자는 단쇄 항체로 구성된 군으로부터 선택되고 있다. 보다 바람직한 실시형태에서, 결합 분자는 단쇄 가변 단편(scFv), 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody) 또는 테트라바디(tetrabody)와 같은 scFv의 다량체, 항체 단편, 바람직하게는 Fab, 탄다브(tandab) 및 플렉시바디(flexibody)로 구성된 군으로부터 선택되고 있다.
항체의 구조와, 특히 항체의 CDR의 기능은 일반적으로 당업계에 공지되어 있다(문헌[Carter PJ. Potent antibody therapeutics by design. Nature Rev. Immunol. 6:343-357, 2006]). 단쇄 Fv(scFv) 및 이의 다량체, 탄다브, 디아바디 및 플렉시바디는 일반적으로, 당업계에 공지된, 예를 들어 WO 1988/001649 A1, WO 1993/011161 A1, WO 1999/057150 A2 및 EP1293514B1로부터 공지된 표준 항체 포맷이다.
scFv에서, 항체의 경쇄 및 중쇄의 2개의 항원 결합 가변 영역(VH Fv 및 VL Fv)은 일반적으로 링커 펩타이드에 의해 인위적으로 연결되며, 단쇄 가변 단편 또는 단쇄 항체로 지정된다(문헌[Bird, et al. (1988) Science 242:423-426; Orlandi, et al (1989) Proc Natl Acad Sci USA 86:3833-3837; Clarkson et al., Nature 352: 624-628 (1991)]). 항원 결합 부위는 모노클로날 항체의 경쇄 및 중쇄의 가변 도메인으로 제조될 수 있다. 몇몇 조사는, scFv 단편이 전체 항체의 1개의 결합 부위의 완전 고유한 항원 결합 친화성을 사실상 가질 수 있다고 나타내었다.
본 발명의 맥락에서, 디아바디는 2개의 결합 특이성을 갖는 scFv이고, 단일특이적 및 2가일 수 있거나, 이중특이적 및 2가일 수 있다.
탄다브 및 플렉시바디는 예를 들어 US2007031436 및 EP1293514B1에서 각각 정의된 추가의 항체 포맷이다.
이디오형(idiotype)의 단백질을 함유하는 항체 단편은 당업계에 공지된 기술에 의해 발생될 수 있다. 예를 들어, 이러한 단편으로는, 항체 분자의 펩신 분해에 의해 생성될 수 있는 F(ab')2 단편; F(ab')2 단편의 이황화 연결을 환원시킴으로써 발생될 수 있는 Fab' 단편; 항체 분자를 파파인 및 환원제로 처리함으로써 발생될 수 있는 Fab 단편; 및 Fv 단편이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 항체 또는 결합 분자는 추가로, 활성 성분, 바람직하게는 독소, 나노입자, 사이토카인 또는 방사성핵종에 연결될 수 있다. 이러한 항체 공액체는 당업계에 공지되어 있다(문헌[Wu AM, Senter PD. Nature Biotechnol. 23:1137-1146, 2005, Pastan et al. Annu. Rev. Med. 58:221-237, 2007], WO 1990/012592 A1, WO 2007/030642 A2, WO 2004/067038 A1, WO 2004/003183 A1, US 2005/0074426 A1, WO 1994/004189 A1).
나아가, 본 발명은 이의 추가의 양태에서, 바람직하게는 하나 이상의 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인에 연결된 양태 3의 결합 분자를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)에 관한 것이다.
바람직하게는, 본 발명은 CD3ζ 사슬을 포함하는 세포내 영역, T 세포 수용체의 신호전달 영역, 및 2개의 공동-자극 도메인 CD28과 4-1BB에 연결된 양태 3의 결합 분자의 바람직한 실시형태의 scFv를 포함하는 키메라 항원 수용체(CAR)에 관한 것이다.
본 발명에 따른 CAR은 T-세포 또는 NK 세포에서 발현될 때, 양태 1 또는 양태 2의 모노클로날 항체에 의해 인지되고 결합되는 에피토프를 갖는 악성 세포를 표적화하기 위한 적당한 툴이다. 본원에 사용된 바와 같이, 용어 "키메라 항원 수용체"(CAR)는 단일 융합 분자 내에서 하나 이상의 신호전달 도메인과 연관된 표적 모이어티를 포함하는 합성 수용체를 지칭한다. 일반적으로, CAR의 결합 모이어티는 scFv를 포함하지만, 이는 또한, 다른 결합 엔터티를 포함할 수 있다. 수용체 또는 리간드 도메인을 기초로 한 결합 모이어티가 또한, 성공적으로 사용되어 왔다. CAR에 대한 신호전달 도메인은 CD3ζ 또는 Fc 수용체 감마 사슬의 세포질 영역으로부터 유래될 수 있을 뿐만 아니라, 다른 세포질 영역으로부터도 유래될 수 있다. 1세대 CAR은 T-세포 세포독성을 성공적으로 전용하는(redirect) 것으로 나타났다. 막관통 및 힌지 도메인뿐만 아니라 공동-자극 분자로부터의 신호전달 도메인이첨가되어, 2세대 및 3세대 CAR을 형성해 왔으며, 이는 인간에서 일부 성공적인 치료 시험을 초래하였고, 여기서, T-세포는 CD19를 발현하는 악성 세포에 대해 전용될 수 있을 것이다(문헌[Porter DL et al., N Eng J Med, 2011]).
제5 양태에서, 본 발명은 양태 4에 따른 키메라 항원 수용체, 양태 1 및 2에 따른 항체 또는 양태 3에 따른 결합 분자에 따른 결합 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터에 관한 것이다.
일반적으로, 발현 벡터는 요망되는 핵산 서열, 예컨대 유전자를 표적 세포 내로 도입하여, 핵산 서열에 의해 인코딩되는 단백질, 즉, 키메라 항원 수용체, 항체 또는 결합 분자의 전사 및 번역을 초래하는 플라스미드이다. 따라서, 발현 벡터는 일반적으로, 폴리아데닐화 부위뿐만 아니라, 조절 서열, 예컨대 프로모터 및 인핸서 영역을 발현 벡터 상에서 핵산 서열의 효율적인 전사를 지시하기 위해 포함한다. 발현 벡터는 추가의 필수적인 또는 유용한 영역, 예컨대 진핵 또는 원핵 세포에서 선택을 위한 선택용 마커, 생성된 단백질의 정제를 위한 정제 태그, 다수의 클로닝 부위 또는 복제 기원을 추가로 포함할 수 있다.
통상, 발현 벡터는 바이러스 또는 비-바이러스 벡터일 수 있다. 일반적으로, 다양한 종류의 바이러스 벡터, 예컨대 레트로바이러스 벡터, 예를 들어 렌티바이러스 또는 아데노바이러스 벡터, 또는 플라스미드가 사용될 수 있다. 바람직한 실시형태에서, 양태 5에 따른 발현 벡터는 바이러스 벡터이다. 보다 바람직한 실시형태에서, 발현 벡터는 렌티바이러스 벡터이다.
제6 양태에서, 본 발명은 양태 4에 따른 키메라 항원 또는 양태 5에 따른 발현 벡터를 포함하는 CD3+ 림프구, NK 림프구, 사이토카인 유도 살해(CIK) 세포, 감마-델타 림프구, NKT 세포 또는 또 다른 면역 효과기 세포에 관한 것이다.
일반적으로, CD3은 기능성 T-세포 수용체 복합체 내의 T-세포 수용체의 α:β 이종이량체와 연관된 4개의 신호전달 사슬의 복합체이다. CD3 복합체는 통상, T-세포 수용체 신호전달에 필요하다. 일반적으로, CD3+ 림프구 그룹은 흉선 세포 및 T-세포만 함유한다. CD3+ 세포의 검출은 예를 들어 유세포분석에 의해 달성될 수 있다.
제7 양태에서, 본 발명은 양태 1 또는 2에 따른 모노클로날 항체, 또는 양태 3에 따른 결합 분자, 또는 양태 6에 따른 CD3+ 림프구, NK 림프구, 사이토카인 유도 살해(CIK) 세포, 감마-델타 림프구, NKT 세포 또는 다른 면역 효과기 세포를 포함하는 약제학적 조성물에 관한 것이다.
본원에 사용된 바와 같이, 용어 "약제학적 조성물"은 용어 "약물"과 상호 교환적으로 사용될 수 있다.
약제학적 조성물 내에서 항체, 결합 분자 또는 CD3+ 림프구의 함량은, 이것이 치료 또는 예방에 유용한 한 제한되지 않으나, 바람직하게는 총 조성물 당 0.0000001 내지 10 중량%를 함유한다. 나아가, 본원에 기재된 항체, 결합 분자 또는 CD3+ 림프구는 바람직하게는, 담체 내에서 이용된다. 담체의 선택은 활성제(들)의 투여 경로 및 농도에 의존할 수 있고, 담체는 동결건조된 조성물 또는 수용액의 형태로 존재할 수 있다. 일반적으로, 적절한 양의 약제학적으로 허용 가능한 염이 담체에 사용되어, 조성물을 등장성으로 만든다. 담체의 예로는, 링거액 및 덱스트로스 용액이 있으나, 이들로 한정되는 것은 아니다. 바람직하게는, 완충제, 예컨대 시트레이트, 포스페이트 및 다른 유기산; 염-형성 반대-이온, 예를 들어 나트륨 및 칼륨; 저분자량(> 10개의 아미노산 잔기) 폴리펩타이드; 단백질, 예를 들어 혈청 알부민 또는 젤라틴; 친수성 중합체, 예를 들어 폴리비닐피롤리돈; 아미노산, 예컨대 히스티딘, 글루타민, 라이신, 아스파라긴, 아르기닌 또는 글리신; 글루코스, 만노스 또는 덱스트린을 포함한 탄수화물; 단당류; 이당류; 다른 당, 예를 들어 수크로스, 만니톨, 트레할로스 또는 소르비톨; 킬레이트제, 예를 들어 EDTA; 비-이온성 계면활성제, 예를 들어 트윈(Tween), 플루로닉스(Pluronics) 또는 폴리에틸렌 글리콜; 메티오닌, 아스코르브산 및 토코페롤을 포함한 항산화제; 및/또는 보존제, 예를 들어 옥타데실디메틸벤질 암모늄 클로라이드; 헥사메토늄 클로라이드; 벤즈알코늄 클로라이드, 벤제토늄 클로라이드; 페놀, 부틸 또는 벤질 알코올; 알킬 파라벤, 예를 들어 메틸 또는 프로필 파라벤; 카테콜; 레조르시놀; 사이클로헥사놀; 3-펜타놀; 및 m-크레졸을 포함한 허용 가능한 부형제, 담체 또는 안정화제는 이용되는 투약량 및 농도에서 무독성이다. 적합한 담체 및 이들의 제제는 문헌[Remington's Pharmaceutical Sciences, 17th ed., 1985, Mack Publishing Co]에 보다 상세히 기재되어 있다. 조성물은 또한, 적어도 하나의 추가의 활성 화합물, 예컨대 화학치료제를 함유할 수 있다.
바람직하게는, 항체, 결합 분자, CD3+ 림프구 및/또는 활성 화합물은 유효량으로 포함된다. 용어 "유효량"은 약제학적 조성물이 투여되는 대상체에서 검출 가능한 치료 반응을 유도하기에 충분한 양을 지칭한다.
제8 양태에서, 본 발명은 양태 1 또는 2에 따른 항체 또는 양태 3에 따른 결합 분자를 인코딩하는 핵산 또는 폴리뉴클레오타이드에 관한 것이다.
또한, 예를 들어, 코돈/RNA 최적화, 이종성 신호 서열로의 대체, 및 mRNA 불안정성 요소의 제거에 의해 최적화되는 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드가 본원에 제공된다. mRNA 내에서 코돈 변화를 도입하고/거나 저해 영역을 제거함으로써 재조합 발현을 위해 항체 또는 이의 단편(예를 들어 경쇄, 중쇄, VH 도메인 또는 VL 도메인)을 인코딩하는 최적화된 핵산을 발생시키는 방법은 예를 들어 미국 특허 5,965,726; 6,174,666; 6,291,664; 6,414,132; 및 6,794,498에 기재된 최적화 방법을 이에 맞게 채택함으로써 수행될 수 있다. 예를 들어, RNA 내의 잠재적인 스플라이스 부위 및 불안정성 요소(예를 들어 A/T 또는 A/U 풍부 요소)는, 재조합 발현을 위해 RNA의 안정성을 증가시키기 위해 핵산 서열에 의해 인코딩되는 아미노산을 변경시키지 않으면서 돌연변이화될 수 있다. 이러한 변경은 예를 들어 동일한 아미노산에 대한 대안적인 코돈을 사용하여 유전자 코드의 축퇴성(degeneracy)을 이용한다. 일부 실시형태에서, 보존적 돌연변이, 예를 들어 원래의 아미노산과 유사한 화학 구조 및 특성 및/또는 기능을 갖는 유사한 아미노산을 인코딩하기 위해 하나 이상의 코돈을 변경시키는 것이 바람직할 수 있다. 이러한 방법은 항체 또는 이의 단편의 발현을, 최적화되지 않은 폴리뉴클레오타이드에 의해 인코딩되는 항체의 발현에 비해 적어도 1배, 2배, 3배, 4배, 5배, 10배, 20배, 30배, 40배, 50배, 60배, 70배, 80배, 90배 또는 100배만큼 증가시킬 수 있다.
소정의 실시형태에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 단편(예를 들어 VL 도메인 및/또는 VH 도메인)을 인코딩하는 최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열은 본원에 기재된 항체 또는 이의 단편(예를 들어 VL 도메인 및/또는 VH 도메인)을 인코딩하는 비최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열의 안티센스(예를 들어 상보적) 폴리뉴클레오타이드에 혼성화할 수 있다. 구체적인 실시형태에서, 본원에 기재된 항체 또는 단편을 인코딩하는 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 높은 엄격한 조건 하에, 본원에 기재된 항체 또는 이의 단편을 인코딩하는 비최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열의 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 혼성화한다. 구체적인 실시형태에서, 본원에 기재된 항체 또는 이의 단편을 인코딩하는 최적화된 뉴클레오타이드 서열은 높은 엄격한, 중간 엄격한 또는 더 낮은 엄격한 혼성화 조건 하에, 본원에 기재된 항체 또는 이의 단편을 인코딩하는 비최적화된 폴리뉴클레오타이드 서열의 안티센스 폴리뉴클레오타이드에 혼성화한다. 혼성화 조건에 관한 정보는 기재되어 있으며, 예를 들어 미국 특허 출원 공개 US 2005/0048549(예를 들어 단락 72 내지 73)를 참조한다.
본 발명의 폴리뉴클레오타이드가 수득될 수 있고, 이러한 폴리뉴클레오타이드의 뉴클레오타이드 서열은 당업계에 공지된 방법에 의해 결정될 수 있다. 본원에 기재된 항체, 및 이들 항체의 변형된 버전을 인코딩하는 뉴클레오타이드 서열은 당업계에 잘 공지된 방법을 사용하여 결정될 수 있으며, 즉, 특정 아미노산을 인코딩하는 것으로 공지된 뉴클레오타이드 코돈은, 항체를 인코딩하는 핵산을 발생시키는 방식으로 조립된다. 항체를 인코딩하는 이러한 폴리뉴클레오타이드는 화학적으로 합성된 올리고클레오타이드로부터 조립될 수 있으며(예를 들어 문헌[Kutmeier G et al., (1994), BioTechniques 17: 242-6]에 기재된 바와 같음), 이는 간략하게는, 항체를 인코딩하는 서열의 일부를 함유하는 중첩 올리고뉴클레오타이드를 합성하는 단계, 이들 올리고뉴클레오타이드의 어닐링하고 연결하는 단계, 및 그 후에 연결된 올리고뉴클레오타이드를 PCR에 의해 증폭시키는 단계를 수반한다.
대안적으로, 본원에 기재된 항체를 인코딩하는 폴리뉴클레오타이드는 적합한 공급원(예를 들어 하이브리도마)으로부터의 핵산으로부터 당업계에 잘 공지된 방법(예를 들어 PCR 및 다른 분자 클로닝 방법)을 사용하여 발생될 수 있다. 예를 들어, 공지된 서열의 3' 및 5' 말단에 혼성화 가능한 합성 프라이머를 사용한 PCR 증폭은 관심 항체를 생성하는 하이브리도마 세포로부터 수득된 게놈 DNA를 사용하여 수행될 수 있다. 이러한 PCR 증폭 방법은 항체의 경쇄 및/또는 중쇄를 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 수득하는 데 사용될 수 있다. 이러한 PCR 증폭 방법은 항체의 가변 경쇄 영역 및/또는 가변 중쇄 영역을 인코딩하는 서열을 포함하는 핵산을 수득하는 데 사용될 수 있다. 증폭된 핵산은 숙주 세포에서의 발현을 위해, 및 추가의 클로닝을 위해, 예를 들어 키메라 항체 및 인간화 항체를 발생시키기 위해 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
특정 항체를 인코딩하는 핵산을 함유하는 클론이 이용 가능하지 않으나 항체 분자의 서열은 공지되어 있다면, 면역글로불린을 인코딩하는 핵산은 예를 들어 항체를 인코딩하는 cDNA 라이브러리로부터 cDNA 클론을 식별하기 위해, 적합한 공급원(예를 들어 항체를 발현하는 임의의 조직 또는 세포, 예컨대 본원에 기재된 항체를 발현하도록 선택된 하이브리도마 세포로부터 발생된 항체 cDNA 라이브러리 또는 cDNA 라이브러리, 또는 이로부터 단리된 핵산, 바람직하게는 폴리 A+ RNA)으로부터, 서열의 3' 및 5' 말단에 혼성화 가능한 합성 프라이머를 사용하는 PCR 증폭에 의해, 또는 특정 유전자 서열에 특이적인 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용하는 클로닝에 의해 화학적으로 합성되거나 수득될 수 있다. 그 후에, PCR에 의해 발생된 증폭 핵산은 당업계에 잘 공지된 임의의 방법을 사용하여 복제 가능한 클로닝 벡터 내로 클로닝될 수 있다.
본원에 기재된 본 발명의 항체를 인코딩하는 DNA는 종래의 절차를 사용하여(예를 들어 항체의 중쇄 및 경쇄를 인코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 올리고뉴클레오타이드 프로브를 사용함으로써) 쉽게 단리되고 시퀀싱될 수 있다. 하이브리도마 세포는 이러한 cDNA의 공급원으로서 역할을 할 수 있다. DNA는 일단 단리되면, 발현 벡터 내에 놓일 수 있으며, 그 후에, 그렇지 않다면 면역글로불린 단백질을 생성하지 않는 이. 콜라이 세포, 시미안(simian) COS 세포, 차이니즈 햄스터 난소(CHO) 세포(예를 들어 CHO GS System™(Lonza)사의 CHO 세포), 또는 골수종 세포와 같은 숙주 세포 내로 형질감염되어, 재조합 숙주 세포 내에서 항체의 합성을 수득한다.
완전 항체를 발생시키기 위해, VH 또는 VL 뉴클레오타이드 서열, 제한효소 부위, 및 이러한 제한효소 부위를 보호하기 위한 인접(flanking) 서열을 포함하는 PCR 프라이머를 사용하여, scFv 클론 또는 다른 클론 내에서 VH 또는 VL 서열을 증폭시킬 수 있다. 통상의 기술자에게 공지된 클로닝 기술을 이용하여, PCR 증폭된 VH 도메인은 중쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 감마 4 불변 영역을 발현하는 벡터 내로 클로닝될 수 있고, PCR 증폭된 VL 도메인은 경쇄 불변 영역, 예를 들어 인간 카파 또는 람다 불변 영역을 발현하는 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 소정의 실시형태에서, VH 또는 VL 도메인을 발현시키기 위한 벡터는 프로모터, 분비 신호, 가변 영역에 대한 클로닝 부위, 불변 도메인, 및 선별 마커, 예컨대 네오마이신을 포함한다. VH 및 VL 도메인은 또한, 필수적인 불변 영역을 발현하는 1개의 벡터 내로 클로닝될 수 있다. 그 후에, 중쇄 전환 벡터 및 경쇄 전환 벡터는 세포주 내로 공동-형질감염되어, 전장 항체, 예를 들어 IgG를 발현하는 안정한 또는 일시적인 세포주를 통상의 기술자에게 공지된 기술을 사용하여 발생시킨다.
DNA는 또한, 예를 들어 뮤린 서열 대신에 인간 중쇄 및 경쇄 불변 도메인에 대한 코딩 서열을 치환함으로써, 또는 비-면역글로불린 폴리펩타이드에 대한 코딩 서열의 모두 또는 일부를 면역글로불린 코딩 서열에 공유 접합시킴으로써 변형될 수 있다.
가변 영역의 부위-특이적 또는 고-밀도 돌연변이 유발 또는 다른 돌연변이 유발 방법은 모노클로날 항체의 특이성, 친화성 등을 최적화하기 위해 사용될 수 있다. 특히, 친화성 성숙 전략 및 사슬 셔플링 전략은 당업계에 공지되어 있고(문헌[Marks et al., 1992, Bio/Technology 10:779-783]), 고 친화성 인간 항체를 발생시키기 위해 이용될 수 있다.
제9 양태에서, 본 발명은 양태 1 또는 2의 항체에 따른 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포에 관한 것이다.
제10 양태에서, 본 발명은 ICLC PD n° 16001 하에 기탁된 하이브리도마에 관한 것이다.
제11 양태에서, 본 발명은 양태 1 또는 2에 따른 모노클로날 항체를 생성하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 ICLC PD n° 16001 하에 기탁된 하이브리도마 세포로부터 상기 항체를 단리하는 단계를 포함한다.
제12 양태에서, 본 발명은 T-세포 급성 림프아구성 백혈병 세포, T 림프종 세포, 발덴스트롬 거대글로불린혈증 세포 또는 종양-연관 대식세포를 식별하거나 단리하는 방법에 관한 것이며, 상기 방법은 상기 세포를 포함하는 세포 시료를 양태 1 또는 2에 따른 모노클로날 항체 또는 양태 3에 따른 결합 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다.
일반적으로, 대식세포는 종양 미세환경에서 가장 대표적인 비-악성 세포이다. 이들 종양 연관 대식세포(TAM)는 프로-종양(pro-tumoral) 염증성 및 면역-억제성 표현형을 획득하고 화학-내성, 혈관신생, 세포 이동성 및 유입(intravasation)/유출(extravasation)을 선호하는 것으로 생가된다. 따라서, TAM을 표적화하는 것은 현재의 항암 치료의 효능을 개선하기 위해 신규 치료 및 여전히 탐구되지 않은 임상 옵션을 나타낼 수 있다.
항체 또는 결합 분자를 기초로, 특이적인 세포, 예컨대 T-세포 급성 림프아구성 백혈병 세포, T 림프종 세포, 발덴스트롬 거대글로불린혈증 세포 또는 종양-연관 대식세포를 식별하거나 단리하는 방법, 예컨대 유세포분석에 의한 형광 세포 소팅(sorting), 자기 세포 단리 또는 예를 들어 세포 소터(sorter)에 의한 단일 세포 소팅은 일반적으로, 통상의 기술자에게 잘 공지되어 있다.
제13 양태에서, 본 발명은 양태 4의 키메라 항원 수용체에 따른 키메라 항원 수용체를 발현하는 CD3+ 림프구, NK 림프구, 사이토카인 유도 살해(CIK) 세포, 감마-델타 림프구, NKT 세포 또는 다른 면역 효과기 세포를 생성하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 양태 5의 발현 벡터에 따른 발현 벡터를 상기 CD3+ 림프구, NK 림프구, 사이토카인 유도 살해(CIK) 세포, 감마-델타 림프구, NKT 세포 또는 다른 면역 효과기 세포 내로 도입하는 단계를 포함한다.
이러한 방법은 또한, 단일 세포를 생성하거나 발현 벡터를 단일 세포 내로 도입시키는 가능성을 포함한다.
제14 양태에서, 본 발명은 CD45+, CD3+, CD8-, CD127+, CCR7+ T 림프구를 식별하거나 단리하는 방법에 관한 것으로서, 상기 방법은 상기 T 림프구를 포함하는 세포 시료를 양태 1 또는 2에 따른 항체 또는 양태 3에 따른 결합 분자와 접촉시키는 단계를 포함한다.
바람직한 실시형태는 T-세포 급성 림프아구성 백혈병 또는 발덴스트롬 거대글로불린혈증의 치료 방법에 사용하기 위한, 양태 1 또는 2의 항체에 따른 항체, 양태 3에 따른 결합 분자, 양태 5에 따른 발현 벡터, 양태 6에 따른 CD3+ 림프구, NK 림프구, 사이토카인 유도 살해(CIK) 세포, 감마-델타 림프구, NKT 세포 또는 다른 면역 효과기 세포 또는 양태 7에 따른 약제학적 조성물이다.
또한, 다른 악성물 역시 치료될 수 있을 것이며, 여기서, 세포는 본 발명의 양태 1 및 2의 항체에 의해 인지되는 에피토프를 발현한다.
추가의 바람직한 실시형태는 CD45+, CD3+, CD8-, CD127+, CCR7+ T 림프구를 식별하거나 단리하는 방법에 사용하기 위한, 양태 1 또는 2에 따른 항체 또는 양태 3에 따른 결합 분자이다.
또 다른 바람직한 실시형태는 T-세포 급성 림프아구성 백혈병 세포, T 림프종 세포, 발덴스트롬 거대글로불린혈증 세포 또는 종양-연관 대식세포를 식별하거나 단리하는 방법에 사용하기 위한, 양태 1 또는 2에 따른 항체 또는 양태 3에 따른 결합 분자이다.
추가의 바람직한 실시형태는 T-세포 급성 림프아구성 백혈병 또는 발덴스트롬 거대글로불린혈증을 진단하는 방법에 사용하기 위한, 양태 1 또는 2에 따른 항체 또는 양태 3에 따른 결합 분자이다.
또한, 다른 악성물 역시 진단될 수 있을 것이며, 여기서, 세포는 본 발명의 양태 1 및 2의 항체에 의해 인지되는 에피토프를 발현한다.
하기에서, 본 발명은 도면 및 실시예에 의해 추가로 기재되고, 이들은 설명을 위한 것이지 본 발명을 제한하려는 것이 아니다.
도 1: 건강한 공여자의 패널의 말초 혈액 단핵구 세포 상에서 본 발명에 따라 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체의 에피토프의 발현, 및 최신 CD43-검출 항체와의 비교이다.
상부 산점도는 유세포분석에 의해 수득된 데이터를 제시한다. x-축은 검출된 포워드 스캐터(FSC)를 제시하고, y-축은 사이드 스캐터(SSC)를 도시한다. 각각의 점(dot)은 1개의 세포에 상응한다.
하기 히스토그램은 피코에리트린 신호 세기를 x-축 상에 도시한 것이다. y-축은 100%의 염색되지 않은 시료의 최대 신호 세기에 대한 신호 세기에 관한 것이다. 채워지지 않은 곡선은 염색되지 않은 대조군을 나타내며, 수평선으로 채워진 곡선은 스크램블 IgG1 염색 세포(즉, 음성 대조군)를 나타내며, 교차선으로 채워진 곡선은 mAb UN1 염색 세포를 나타내고, 대각선으로 채워진 곡선은 CD43 염색 세포를 나타낸다.
도 2: 본 발명에 따라 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체에 의해 인지되는 세포 집단이다.
도 2는 4개의 산점도를 보여준다. 좌측의 2개의 산점도는 림프구에 속한다. 우측의 2개의 산점도는 본 발명에 따라 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체에 의해 검출된 림프구로부터이다.
상부의 2개의 산점도에서, x-축은 CD4 신호 세기를 나타내는 한편, y-축은 CD8 신호 세기를 도시한다. 하부의 2개의 산점도에서, x-축은 CD45ro 신호 세기를 나타내고, y-축은 CCR7 신호 세기를 나타낸다.
도 3은 2개의 히스토그램을 보여준다. 상부의 히스토그램은 BCWM.1 세포주 상에서, 본 발명에 따라 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체에 의해 검출되는 에피토프 UN1(mAb UN1)의 발현을 제시한다. 하부의 히스토그램은 MWCL.1 세포주 상에서 UN1 발현을 제시한다. 채워지지 않은 곡선은 염색되지 않은 대조군을 나타내며, 수평선으로 채워진 곡선은 2차 mAb 염색 세포를 나타내며, 수직선으로 채워진 곡선은 스크램블 IgG + 2차 염색 세포를 나타내고, 대각선으로 채워진 곡선은 mAb UN1에 의해 염색된 세포를 나타낸다.
도 4: 본 발명에 따라 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체에 의해 인지되는 종양 연관 대식세포(TAM)이다. 백색 화살표는 결장직장암종의 표본에 침윤하는 TAM을 가리킨다.
도 5: 종양 세포의 부재 시 대조군 IgG1(첫번째 화살표), 종양 세포의 부재 시 UMG1-CH(본 발명의 양태 2에 따른 키메라 항체로서, 여기서, 원래의 뮤린 Fc 영역은 완전 인간 IgG1 Fc 영역으로 대체되었음)(두번째 화살표) 및 PANC1 췌장암 세포주의 존재 시 UMG1-CH(세번째 화살표, 특히 좌측에 있음)로 염색된 THP1-유래 대식세포이다. 첫번째 컬럼은 DAPI 염색을 나타내며, 두번째 컬럼은 항체 + alexa-fluor 488 표지 2차 항체를 나타내고, 세번째 컬럼은 겹쳐진 이미지를 나타낸다.
도 6: HPB-ALL(좌측 다이어그램) 및 H9 세포주(우측 다이어그램)에서 ADCC를 평가하기 위한 탈과립화 검정법의 결과이다. x-축의 숫자는 상이한 시료를 나타내며: 표적 없음 (1), E+T (2), 음성 대조군(NC) 200 μg/ml (3), UMG1-CH 10 μg/ml (4), UMG1-CH 50 μg/ml (5), UMG1-CH 100 μg/ml (6), UMG1-CH 200 μg/ml (7), 양성 대조군 (PC) 200 μg/ml (8)를 의미한다. y-축은 1개 시료 당 시험된 CD107a+ NK 세포의 총 수와 관련하여, ADCC에 의해 영향을 받는 CD107a+ NK 세포의 퍼센트를 나타낸다.
도 7: BCWM.1 세포주에서 ADCC를 평가하기 위한 탈과립화 검정법의 결과이다. x-축의 숫자는 상이한 시료를 나타낸다. 넘버링은 도 6의 넘버링에 따른 것이다. y-축은 1개 시료 당 시험된 CD107a+ NK 세포의 총 수와 관련하여, ADCC에 의해 영향을 받는 CD107a+ NK 세포의 퍼센트를 나타낸다.
도 8: CD3+ 발현 림프구(CAR-T)는 H9 세포의 존재 시 유의하게 더 높은 양의 인테페론 감마(IFNγ)를 방출시킬 수 있었다. y-축은 ng/ml로 표현된 IFNγ의 농도를 보고한다. x-축은: 비-형질도입된 T 세포 (1), 대조군 CAR로 형질도입된 T 세포 (2) 및 UMG-1 CAR로 형질도입된 T 세포 (3)를 보고한다.
도 9: CAR-T는 H9 세포의 존재 시 유의하게 더 높은 양의 인테루킨 2(IL-2)를 방출시킬 수 있었다. y-축은 ng/ml로 표현된 IL2의 농도를 보고한다. x-축은: 비-형질도입된 T 세포 (1), 대조군 CAR로 형질도입된 T 세포 (2) 및 UMG-1 CAR로 형질도입된 T 세포 (3)를 보고한다.
도 10: CAR-T는 H9 세포의 선택적 사멸화를 유도시킬 수 있었다. y-축은 사멸된/살아 있는 세포 비(ratio)를 보고한다. x-축은: H9 단독 (1), 비-형질도입된 T 세포의 존재 시 H9 (2), 대조군 CAR로 형질도입된 T 세포의 존재 시 H9 (3) 및 UMG-1 CAR로 형질도입된 T 세포의 존재 시 H9 (4)를 보고한다.
도 11: 이 도면은 대조군 IgG1 대 인간화 버전의 UN1-mAb(h-UN1) 및 탈푸코실화된 버전의 UN1-mAb(a-h-UN1)를 비교한 생체내 실험의 종양 부피 곡선을 보여준다.
Figure pct00001
실시예
하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위해 제공되지만, 본 발명을 제한하는 것으로 간주되어서는 안 된다. 실시예는 기술적 특징을 포함하고, 본 발명은 또한 이러한 예시적인 단락에 제시된 기술적 특징들의 임의의 조합에 관한 것임을 이해할 것이다.
실시예 1
건강한 공여자 패널의 말초 혈액 단핵구 세포 상에서 본 발명에 따라 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체의 에피토프의 발현 및 최신 CD43-검출 항체와의 비교
우선, 상이한 건강한 공여자로부터의 말초 혈액 단핵구 세포(PBMC)를 Ficoll 구배 분리에 의해 수득하였다. 후속적으로, 세포를 5 ml 튜브에 접종하고, 100 μl의 결합 용액(포스페이트 완충 식염수(PBS) + 0.5% 태아 소 혈청(FBS)) 중 ICLC 수탁 번호 ICLC PD n° 16001 하에 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 1 μg/ml의 mAb(mAb UN1) 또는 1 μg/ml의 스크램블 뮤린 IgG1 항체로 염색하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 세포를 결합 용액 내에서 2회 세척하고, 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC)-공액 2차 항체로 4℃, 암실에서 30분 동안 염색하였다. 후속적으로, 세포를 결합 용액 내에서 2회 세척하고, ATTUNE NxT 유세포분석기(THERMO Scientific) 상에서 획득하였다. 각각의 공여자에 대한 1개의 튜브를 염색하지 않은 채로 두고, 각각의 공여자에 대한 1개의 튜브를 FITC-공액 2차 항체만으로 염색하였다. 전체적으로, 본 발명에 따라 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체는 상이한 공여자의 가변 림프구 하위집단(범위: 0 내지 15%)을 인지할 수 있었다. 더욱이, 이는 골수 유래 세포를 포함하여 PBMC 내의 모든 다른 세포 집단과 임의의 반응성을 보이지 않았으며, 따라서, 이는 각각의 항원의 발현에 대해 음성이었다(도 1, 상부 참조).
대조적으로, 본 발명자들이 상업적인 클론(Beckton Dickinson의 S7)을 사용하여 CD43 발현에 대해 동일한 PBMC를 검정하였을 때, 모든 림프구 및 골수 세포는 양성인 것으로 확인되었다(도 1, 하부 참조).
결과적으로, 본 발명에 따라 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성되는 항체는, CD43에 대한 이미 기존의 항체가 갖지 않는 반응성 및 특성의 특이적인 제약된 패턴을 나타낸다.
실시예 2
본 발명에 따라 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체에 의해 인지되는 세포 집단
본 발명에 따라 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체에 의해 검출되는 림프구 하위집단을 특징화하기 위해, 본 발명자들은 각각의 림프구의 면역-자기 소팅을 수행하였다(Easysep do-it-yourself, Stemcell technologies). 간략하게는, 15 μg의 항체를 제조업체에 의해 제공된 구성성분과 혼합하여, 면역자기 분리 준비가 된 용액을 수득하였다. 이 용액을, FcR 차단 후 항체에 의해 검출되는 적어도 10%의 림프구를 갖는, 3명의 상이한 공여자로부터의 PBMC에 첨가하고, 세포를 실온(r.t.)에서 15분 동안 인큐베이션하였다. 후속적으로, EasySep® 자기 나노입자를 상기 용액에 첨가하고, 세포를 r.t.에서 추가의 10분 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 상기 용액을 자석(magnet)에 놓고, 비결합된 세포를 제거하였다. 본 발명에 따른 항체에 의해 검출된 세포는 대체로 모두 CD45+CD3+CD4+CD8-CD127+CCR7+ T 림프구였으며, 이들 중 대부분은 CD45ro-이었다(도 2 및 표 1 참조).
Figure pct00002
실시예 3
본 발명에 따라 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체(mAb UN1)는 T-ALL 및 발덴스트롬 거대글로불린혈증 세포주를 인지한다.
다양한 암 세포주(표 2)를 UN1의 발현에 대해 평가하였다(MM: 다발성 골수종). 간략하게는, 세포를 5 ml 튜브에 접종하고, 100 μl의 결합 용액(포스페이트 완충 식염수(PBS) + 0.5% 태아 소 혈청(FBS)) 중 1 μg/ml의 mAb UN1 또는 1 μg/ml의 스크램블 뮤린 IgG1 항체로 염색하고, 4℃에서 30분 동안 인큐베이션하였다. 그 후에, 세포를 결합 용액 내에서 2회 세척하고, 플루오레신 이소티오시아네이트(FITC)-공액 2차 항체로 4℃, 암실에서 30분 동안 염색하였다. 후속적으로, 세포를 결합 용액 내에서 2회 세척하고, ATTUNE NxT 유세포분석기(THERMO Scientific) 상에서 획득하였다. 각각의 세포주에 대한 1개의 튜브를 염색하지 않은 채로 두고, 각각의 세포주에 대한 1개의 튜브를 FITC-공액 2차 항체만으로 염색하였다.
EGIL T3 분류 및 발덴스트롬 거대글로불린혈증에 속하는 T-ALL 세포주(도 3)는 모두 UN1 발현에 대해 양성인 것으로 관찰되었다.
Figure pct00003
실시예 4
본 발명에 따라 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체(mAb UN1)는 종양-연관 대식세포를 인지한다.
이미 기재된 바와 같이, CD43은 일반적으로 조혈 계통의 상이한 세포로 제약된 특이적인 백혈구 마커이다. mAb UN1에 의해 결합되고 CD43 이소폼(isoform) 상의 특이적인 에피토프는 종양-연관 대식세포(TAM)에 의해 고도로 발현되는 것으로 확인되었다.
상이한 종류의 암으로부터의 표본을 면역조직화학을 통해 평가함으로써(표 3, 도 4), UN1+ 대식세포는 대부분의 종양의 높은 침윤성 구성성분이며, 이때 췌장암 및 난소암에서 특이적이고 특정한 높은 등급의 침윤이 있는 것으로 관찰되었다.
더욱이, 대식세포 분화 모델에서, UN1 발현이 공동-배양된 암세포의 존재 또는 부재 시 변화하는지 평가하였다.
이러한 목적을 위해, THP1 단핵구성 백혈병 세포를 사용하였으며, 이는 이전에 나타낸 바와 같이 UN1을 발현하지 않는다. 분화된 인간 비편극화된(unpolarized) M0 대식세포(THP1-M)를 수득하기 위해, 이들 세포를 50 ng/ml의 포볼 12-미리스테이트 13-아세테이트(PMA)의 존재 시 완전 적절 배지 내에서 48시간동안 배양하였다. 그 후에, 배지를 PMA가 없는 신선한 배지로 대체하였다. 이 단계에서, 선택된 웰에서, PANC1 췌장암 세포주를 1:1 비율로 48시간 동안 첨가하였다. 그 후에, 모든 세포를 면역형광 분석용으로 제조하였다. 간략하게는, 고정 후, THP1-M을 UMG1-CH 또는 인간 IgG1 대조군으로 염색하고, 4℃에서 밤새 인큐베이션하였다. 그 후에, FITC 항-인간 2차 mAb를 상기 세포에 2시간 동안 첨가하였다. 세척 후, DAPI(Vectashield, Vectorlabs)와 함께 안티페이드 마운팅(antifade mounting) 배지를 세포에 첨가하고, 판독을 위해 커버슬립을 완료하였다.
도 5의 우측에 제시된 바와 같이, 대조군 IgG1로 염색된 THP1-유래 대식세포는 완전히 음성인 한편, UMG1-CH로 염색된 세포는 약하게 양성이었다. 흥미롭게는, PANC1의 존재 시, THP1-유래 대식세포는 UN1 발현에 대해 밝게 되었다. 특히, THP1-유래 대식세포(백색 화살표)와 PANC1(적색 화살표) 사이의 상호작용이 제시된다(도 5, 좌측). 이들 확인은, 대식세포가 재구성된 종양 미세환경 내에서 암세포와 함께 공동-배양되고 상호작용할 때, UN1 특이적인 에피토프가 유의하게 상향조절됨을 나타낸다. 이러한 상향조절은 그 자체로 관련이 있으며, 종양-연관 대식세포 퍼징(purging)에 초점이 맞춰진 치료 접근법을 위한 잘 나타내어진 표적이다. 치료 툴로서의 이러한 관련된 잠재력을 넘어서, mAb UN1은 또한, 검출, 예후 역할의 분석 및 예측 연구에 대해 유용성을 제공할 것이다.
Figure pct00004
실시예 5
키메라 mAb UMG1-CH(본 발명의 양태 2에 따름)는 T 세포 급성 림프아구성 백혈병/림프아구성 림프종에 대한 활성 면역치료 툴이다.
면역치료 툴로서의 mAb UMG1-CH의 잠재적인 활성을 결정하기 위해, 항체-의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)을 유도하는 이러한 항체의 능력을 우선, 평가하였다. 이를 위해, 건강한 공여자로부터의 PBMC(효과기 세포)를 HPB-ALL 또는 H9 T-ALL 세포주(표적 세포)와 공동-배양함에 의한 탈과립화 검정법을 하기와 같이 상이한 농도의 mAb UMG1-CH의 존재 시 수행하였다:
4x104개 표적 세포를 96웰 둥근-바닥 플레이트에 접종하고, 상이한 농도의 mAb UMG1-CH(0, 10, 50, 100, 200 μg/ml) 또는 최고 농도(200 μg/ml)에서 키메라 음성 또는 양성 대조군(각각 NC 및 PC, 각각 200 μg/ml) IgG1의 존재 시 37℃ 5% CO2에서 30분 동안 배양하였다. 후속적으로, 동일한 공여자로부터의 0.4x106개 PBMC(고정된 E:T=10:1)를 20 μl/ml의 PE-공액 항-CD107a mAb(BD)와 함께 각각의 웰에 첨가하고, 그 후에 상기 세포를 37℃ 5% CO2에서 3시간 동안 인큐베이션하였다. 1시간 후, 6 μg/ml 모넨신을 각각의 웰(GolgiStop, BD)에 첨가하였다. 인큐베이션 기간의 종료 시, 세포를 APC-공액 항-CD56 및 PerCp-공액 항-CD3으로 염색하고, ATTUNE NxT 유세포분석기(THERMO Scientific) 상에서 분석하였다. CD3-/CD56+/CD107a+ 세포는 mAb UMG1-CH 농도에 따라 유의하게 증가하는 것으로 확인되었으며, 따라서 ADCC 유도자로서의 mAb UMG1-CH의 잠재력을 확인시켜 준다(도 6).
이들 데이터는 면역 표적화 접근법을 설계하는 것을 가능하게 하며, 이러한 접근법은 T 세포 급성 림프아구성 백혈병/림프아구성 림프종에서 긴급하고 충족되지 않은 임상 요구이다.
실시예 6
키메라 mAb UMG1-CH(본 발명의 양태 2)는 발덴스트롬 거대글로불린혈증에 대한 활성 면역치료 툴이다.
mAb UMG1-CH의 면역치료 잠재력을 조사하기 위해, 본 발명자들은 항체-의존적 세포 매개 세포독성(ADCC)을 유도하는 이러한 항체의 능력을 평가하였다. 이를 위해, 본 발명자들은 건강한 공여자로부터의 정제된 NK 세포(효과기 세포) 및 BCWM.1 세포주(표적 세포)를 상이한 농도의 mAb UMG1-CH 또는 음성/양성 대조군의 존재 시 공동-배양함으로써 탈과립화 검정법을 수행하였다. 본 발명자들은 mAb 세툭시맙(cetuximab)을 음성 대조군으로서 선택하고, mAb 리툭시맙(rituximab)을 양성 대조군으로서 선택하였다. 구체적으로, 105개 표적 세포를 96웰 둥근-바닥 플레이트에 접종하고, 상이한 농도의 mAb UMG1-CH(0, 10, 50, 100, 200 μg/ml), 200 ug/ml 세툭시맙 또는 200 μg/ml 리툭시맙의 존재 시 37℃ 5% CO2에서 30분 동안 배양하였다. 후속적으로, 동일한 공여자로부터의 105개 NK 세포(고정된 E:T=1:1)를 20 μl/ml의 PE-공액 항-CD107a mAb(BD)와 함께 각각의 웰에 첨가하고, 그 후에 상기 세포를 37℃ 5% CO2에서 2시간 동안 인큐베이션하였다. 1시간 후, 6 μg/ml 모넨신을 각각의 웰(GolgiStop, BD)에 첨가하였다. 인큐베이션 기간의 종료 시, 세포를 APC-공액 항-CD56 및 PerCp-공액 항-CD3으로 염색하고, ATTUNE NxT 유세포분석기(THERMO Scientific) 상에서 분석하였다. CD3-/CD56+/CD107a+ 세포는 mAb UMG1-CH 농도에 따라 유의하게 증가하여, 리툭시맙으로 수득된 동일한 효과에 정확하게 도달하였으며, 따라서, ADCC 유도자로서의 mAb의 잠재력을 확인시켜 준다(도 7).
실시예 7
키메라 항원 수용체(CAR)-UMG1은 본 발명에 따라 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체의 에피토프를 발현하는 세포에 대해 유의한 세포독성을 유도한다.
본 발명에 따라 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 항체의 면역치료 툴로서의 면역치료 잠재력을 추가로 개선하기 위해, 3세대 CAR을 개발하였다. 구체적으로, 항체의 서열로부터 유래된 scFv로 구성된 세포외 도메인을, CD3ζ 사슬로 구성된 세포내 영역, TCR의 신호전달 영역, 및 2개의 공동-자극 도메인, CD28과 4-1BB와 커플링함으로써 CAR-T를 설계하였으며, 따라서 생리학적 T-세포 활성화를 모방하였다. 이를 위해, 항체 scFv를 3개의 선택된 공동-자극 도메인과 함께 CAR 카세트 내로 클로닝하여, 렌티바이러스 벡터를 발생시켰다. 후속적으로, 바이러스 입자를 사용하여, 건강한 공여자로부터의 CD3+ 림프구를 5의 감염 다중도(MOI; multiplicity of infection)에서 형질도입하고, 형질도입 효율을 유세포분석에 의해 평가하였다(약 38%). 마지막으로, 항체의 에피토프에 대한 CAR-T를 표적 세포의 존재 시 IFNγ 및 IL-2를 방출시키는 이들의 능력, 및 이들의 선택적 세포독성능에 대해 검정하였다. 도 8 및 도 9에 제시된 바와 같이, CAR-UMG1은 H9 세포의 존재 시에만 유의하게 더 높은 양의 인터페론 감마(IFNγ) 및 인터루킨 2(IL-2)를 방출시킬 수 있었다. 추가로, CAR-UMG1만 H9 세포의 선택적 사멸화를 유도할 수 있었고(도 10 참조), 따라서 H9 세포를 인지하고 T-세포 활성화를 유도하는 생성된 CAR의 능력을 나타낸다.
실시예 8
이 실시예는 대조군 IgG1 대 인간화 버전의 UN1-mAb(h-UN1) 및 탈푸코실화된 버전의 UN1-mAb(a-h-UN1)를 비교하는 생체내 실험의 종양 부피 곡선을 보고한다. 이 실험에서, 15 마리의 NOD-SCID-g-chain-null(NSG) 마우스에게 5x10^6개의 HPB-ALL 세포를 피하 이식하였다. 그 후에, 상기 마우스를 제1일로부터 출발하여 사망, 2000 mm^3 초과의 종양 부피 또는 허용 불가능한 독성 시까지 15 mg/kg의 대조군 IgG1, h-UN1 또는 a-h-UN1의 매주 복강내 투여를 제공받도록 무작위화하였다. 종양 부피를 격일로 평가하였으며, 각각의 시점에서 각각의 그룹의 평균 부피를 도 11에 보고한다. 제29일로부터 출발하여, h-UN1 및 a-h-UN1은 둘 다, 유의하게 감소된 질병 부담(burden)을 제시하였으며, 이는 생체내에서 두 항체 모두의 강한 활성을 확인시켜 준다.
SEQUENCE LISTING <110> Tassone, Pierfrancesco <120> A monoclonal antibody targeting a unique sialoglycosilated cancer-associated epitope of CD43 <130> U70414PC <150> DE 102016015379.2 <151> 2016-12-22 <160> 6 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain CDR1 <400> 1 Gly Phe Thr Phe Ser Ser Phe Gly Met His 1 5 10 <210> 2 <211> 17 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain CDR2 <400> 2 Tyr Ile Ser Ser Gly Ser Gly Asn Phe Tyr Tyr Val Asp Thr Val Lys 1 5 10 15 Gly <210> 3 <211> 13 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Heavy chain CDR3 <400> 3 Ser Thr Tyr Tyr His Gly Ser Arg Gly Ala Met Asp Tyr 1 5 10 <210> 4 <211> 12 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain CDR1 <400> 4 Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Ser Met Tyr Trp Tyr 1 5 10 <210> 5 <211> 7 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain CDR2 <400> 5 Asp Thr Ser Lys Met Ala Ser 1 5 <210> 6 <211> 10 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> Light chain CDR3 <400> 6 Gln Gln Trp Ser Ser Tyr Pro Pro Ile Thr 1 5 10

Claims (21)

  1. ICLC 수탁 번호 ICLC PD n° 16001 하에 기탁된 하이브리도마 세포에 의해 생성된 모노클로날 마우스 항체.
  2. 상보성 결정 영역 CDRH1, CDRH2 및 CDRH3을 포함하는 중쇄 가변 영역, 및 상보성 결정 영역 CDRL1, CDRL2 및 CDRL3을 포함하는 경쇄 가변 영역을 포함하는 항체로서, 여기서, CDRH1, CDRH2, CDRH3, CDRL1, CDRL2 및 CDRL3은 아미노산 서열 GFTFSSFGMH, YISSGSGNFYYVDTVKG, STYYHGSRGAMDY, SASSSVSSMYWY, DTSKMAS 및 QQWSSYPPIT를 각각 포함하는, 항체.
  3. 제1항 또는 제2항의 항체가 인지하는 것과 동일한 에피토프를 인지하는 항체로서, 바람직하게는 상기 항체는 모노클로날 항체 또는 이중특이적 항체이거나, 상기 항체는 인간 항체, 키메라 항체 또는 인간화 항체, 보다 바람직하게는 제1항의 항체의 키메라 항체 또는 인간화 항체인, 항체.
  4. 제3항에 있어서, 상기 항체가 T 세포 급성 림프아구성 백혈병(T-ALL) 세포의 EGIL T3 하위그룹에 대해, T 세포 림프아구성 림프종 세포에 대해, 및 발덴스트롬 거대글로불린혈증(WM; Waldenstrom's Macroglobulinemia) 세포에 대해 항체 의존적 세포성 세포독성(ADCC)을 유도할 수 있는 것인, 항체.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 항체가 인간 CD43에 O-연결된 GalNAc를 포함하는 에피토프를 인지하는, 항체.
  6. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체로부터 유래된 결합 분자로서, 바람직하게는 단쇄 항체로 구성된 군으로부터 선택되며, 바람직하게는 scFv, 디아바디(diabody), 트리아바디(triabody) 또는 테트라바디(tetrabody)와 같은 scFv의 다량체, 항체 단편, 바람직하게는 Fab, 탄다브(tandab) 및 플렉시바디(flexibody)로 구성된 군으로부터 선택되는, 결합 분자.
  7. 바람직하게는 하나 이상의 신호전달 도메인을 포함하는 세포내 도메인에 연결된 제5항의 결합 분자를 포함하는 키메라 항원 수용체.
  8. 제7항의 키메라 항원 수용체, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체, 또는 제6항의 결합 분자를 인코딩하는 핵산 서열을 포함하는 발현 벡터로서, 바람직하게는 상기 벡터는 바이러스 또는 비-바이러스 벡터이며, 보다 바람직하게는 바이러스 벡터이고, 보다 더 바람직하게는 렌티바이러스 벡터인, 발현 벡터.
  9. 제6항의 키메라 항원 수용체 또는 제8항의 발현 벡터를 포함하는 CD3+ 림프구, NK 림프구, 사이토카인 유도 살해(CIK; Cytokine induced killer) 세포, 감마-델타 림프구 또는 NKT 세포.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체, 또는 제6항의 결합 분자, 또는 제7항의 CD3+ 림프구, CD3+ 림프구, NK 림프구, 사이토카인 유도 살해(CIK) 세포, 감마-델타 림프구 또는 NKT 세포를 포함하는 약제학적 조성물.
  11. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 제6항의 결합 분자를 인코딩하는 핵산.
  12. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 모노클로날 항체를 생성하는 하이브리도마 세포.
  13. ICLC 수탁 번호 ICLC PD n° 16001 하에 기탁된 하이브리도마.
  14. 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 모노클로날 항체를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은 ICLC 수탁 번호 ICLC PD n° 16001 하에 기탁된 하이브리도마 세포로부터 상기 항체를 단리하는 단계를 포함하는, 방법.
  15. CD45+, CD3+, CD8-, CD127+, CCR7+ T 림프구를 식별하거나 단리하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 T 림프구를 포함하는 세포 시료를 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 제6항의 결합 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  16. T-세포 급성 림프아구성 백혈병 세포, T 림프종 세포, 발덴스트롬 거대글로불린혈증 세포 또는 종양-연관 대식세포를 식별하거나 단리하는 방법으로서, 상기 방법은 상기 세포를 포함하는 세포 시료를 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 모노클로날 항체 또는 제6항의 결합 분자와 접촉시키는 단계를 포함하는, 방법.
  17. 제6항의 키메라 항원 수용체를 발현하는, CD3+ 림프구, NK 림프구, 사이토카인 유도 살해(CIK) 세포, 감마-델타 림프구, 또는 NKT 세포를 생성하는 방법으로서, 상기 방법은 제8항의 발현 벡터를 상기 CD3+ 림프구, NK 림프구, 사이토카인 유도 살해(CIK) 세포, 감마-델타 림프구, 또는 NKT 세포 내로 도입하는 단계를 포함하는, 방법.
  18. T-세포 급성 림프아구성 백혈병 또는 발덴스트롬 거대글로불린혈증을 치료하는 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체, 제6항의 결합 분자, 제8항의 발현 벡터, 제9항의 CD3+ 림프구, NK 림프구, 사이토카인 유도 살해(CIK) 세포, 감마-델타 림프구 또는 NKT 세포, 또는 제10항의 약제학적 조성물.
  19. CD45+, CD3+, CD8-, CD127+, CCR7+ T 림프구를 식별하거나 단리하는 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 제6항의 결합 분자.
  20. T-세포 급성 림프아구성 백혈병 세포, T 림프종 세포, 발덴스트롬 거대글로불린혈증 세포 또는 종양-연관 대식세포를 단리하거나 식별하는 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 제6항의 결합 분자.
  21. T-세포 급성 림프아구성 백혈병 또는 발덴스트롬 거대글로불린혈증을 진단하는 방법에 사용하기 위한, 제1항 내지 제5항 중 어느 한 항의 항체 또는 제6항의 결합 분자.
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