DE69027210T2 - Rekombinantes antikörper-toxin-fusion-protein - Google Patents

Rekombinantes antikörper-toxin-fusion-protein

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Description

    Rekombinantes Antikörper-Toxin-Fusionsprotein
  • Dies ist eine Continuation-in-Part-Anmeldung der anhängigen, am 24. September 1986 eingereichten Anmeldung mit dem Aktenzeichen 06/911,227, die hiermit unter Bezugnahme aufgenommen ist. Die Stammanmeldung (06/911,227) lehrt die Herstellung von rekombinanten Proteinen des veränderten Pseudomonas Exotoxin (PE)-Gens, das mit DNA-Sequenzen, die für ein Erkennungsprotein kodieren, für das ein spezifischer Rezeptor auf den Zellen vorhanden ist, fusioniert ist. Das PE- Gen wurde verändert, um eine Änderung spezifischer Abschnitte oder Sequenzen von verschiedenen Domänen des PE-Noleküles zu erzielen. Dies wurde in der Stammanmeldung mit der Konstruktion und Expression eines IL-2-PE-Fusionsgenes beispielhaft dargelegt. Die vorliegende Anmeldung betrifft die Herstellung von verbesserten Toxinen unter Verwendung von PE und insbesondere die Synthese von rekombinanten Antikörper-Toxin- Fusionsproteinen, die in der Lage sind, wirksam und selektiv Zellen, die die passenden Antigene oder Rezeptoren tragen, zu töten. Die hier beschriebene Arbeit wurde zum Teil durch die U.S. Regierung unterstützt.
    • Kurze Beschreibung der Abbildungen
  • Verschiedene Aufgaben, Eigenschaften und viele der damit verbundenen Vorteile der Erfindung werden nach dem Lesen der folgenden genauen Beschreibung besser verstanden, wenn sie in Verbindung mit den beiliegenden Zeichnungen betrachtet werden, wobei:
  • Figur 1(a) eine schematische Konstruktion des Expressionsplasmids pVC70108 veranschaulicht. Das Plasmid pVC70108 enthält ein Fusionsgen, das für verschiedene Domänen von anti-Tac kodiert: Die VH-variable Domäne der schweren Kette (die ersten 116 Aminosäuren der reifen schweren Kette), ein 15- Aminosäure-Bindeglied (linker) [(Gly-Gly-Gly-Gly-Ser)&sub3;], die VL-variable Domäne der leichten Kette (die ersten 106 Aminosäuren der reifen leichten Kette) und die Aminosäuren 253- 613 des PE, das translozierende und ADP-ribosylierende Aktivität besitzt, in Form einer einzigen Polypeptidkette. Das kodierte Protein wird als ein Antikörper-Toxin-Fusionsprotein oder spezifischer als anti-Tac(Fv)-PE40 bezeichnet. Das Fusionsgen ist unter der Kontrolle eines T7-Promotors, der mit einer Shine-Dalgarno-Region und einem Startkodon (PT7) verbunden ist. Der E. coli-Stamm BL21 (λDE3), der das pVC70108 enthält, wurde verwendet, um das Hybridprotein nach IPTG- Induktion zu exprimieren. Ampr, β-Lactamasegen; B, BamHI, A, AvaI. Die für die PCR verwendeten Oligonukleotide werden als horizontale Pfeile gezeigt. In dem Plasmid pVC701 werden vier zusätzliche Basen in einer schraffierten Box gezeigt.
  • Figur 1(b) zeigt die für die Polymerasekettenreaktion (PCR) verwendeten Oligonukleotide VK074, VK075 und VK076, die jeweils in zwei Zeilen gezeigt werden. Bereiche von VK073 und VK075 sind zu den nichtkodierenden cDNA-Strängen der schweren und leichten Ketten komplementär, während die von VK074 und VK076 entsprechend zu den kodierenden cDNA-Strängen der schweren und leichten Ketten komplementär sind. VK073 und VK074 wurden verwendet, um den VH-Abschnitt unter Verwendung der cDNA der anti-Tac schweren Kette zu vervielfältigen, während VK075 und VK076 verwendet wurden, um, wie in Figur 1(a) gezeigt, den VL- Abschnitt unter Verwendung der cDNA der leichten Kette des anti-Tac zu erzeugen. Die Oligonukleotide wurden alle in der Richtung von 5' nach 3' geschrieben. Die zu den kodierenden oder nichtkodierenden cDNA-Strängen von VL oder VH komplementären Sequenzen sind in nichtausgefüllten Boxen gezeigt. Die für die Polypeptidbindeglieder (peptide linker) kodierenden Sequenzen zwischen VH und VL sind mit einer gestrichelten Linie unterstrichen.
  • Figur 2(a) zeigt die Reinigungsergebnisse der renaturierten löslichen anti-Tac(Fv)-PE40 nach Mono-Q-Säulenchromatographie. Das renaturierte Material wurde auf eine Mono-Q-Säule gegeben, und die Proteine wurden in einem NaCl-Gradienten (0-0,5 M) eluiert, und 4 ml Fraktionen wurden gesammelt. Die Position des aktiven monomeren anti-Tac(Fv)-PE40 wird durch einen senkrechten Pfeil angezeigt.
  • Die Figur 2(b) zeigt die SDS-PAGE-Ergebnisse der Proben nach verschiedenen Reinigungsstufen. Das Gel wurde mit Coomassie-Blau angefärbt. Spur 1, Gesamtzellsediment; Spur 2, Sphäroplasten; Spur 3, 100.000 xg Sediment beschallter Sphäroplasten; Spur 4, vereinigte Fraktionen (32-33) der Mono- Q-Säulen; Spur 5, vereinigte Spitzenfraktionen der TSK-250- Säule; Spur 6, natives PE, MG 66 kDa. Die Molekulargewichtsmarker mit dem MG in kDa befinden sich an der Seite.
  • Figur 3 zeigt die Ergebnisse einer Zytotoxizitätsstudie von anti-Tac(Fv)-PE40 auf HUT-102-Zellen, die IL2-Rezeptoren exprimieren. Die Zytotoxizität des anti-Tac(Fv)-PE40 auf HUT- 102-Zellen wurde durch Vermessen der Proteinsynthese mit ( ) anti-Tac(fv)-PE40; (º) anti-Tac(Fv)-PE40 + 10 µg anti-Tac; (Δ) anti-Tac(Fv)-PE40 + 10 µg OVB3 bestimmt.
  • Figur 4 zeigt eine Kompetitionsbindungsanalyse von anti- Tac(Fv)-PE40. Die Kompetitionsdaten des anti-Tac(Fv)-PE40 (offene Quadrate) und nativem Maus-anti-Tac-Antikörper (ausgefüllte Kreise) mit I-125 markiertem anti-Tac- Antikörpermarker, um an das Tac-Antigen auf HUT-102-Zellen zu binden, werden gezeigt. Die durchgezogenen Linien sind vom Computer erzeugte idealisierte Kurven, die die Bindungskompetition nachbilden. Ro ist das Verhältnis gebunden/frei für den Marker in der Abwesenheit des Kompetitors, und Ro/2 ist der 50% Inhibitionspunkt der Markerbindung, aus dem eine Bindungsaff inität von 3,5 x 10&sup9; M&supmin;¹ für anti-Tac(Fv)-PE40 berechnet wird, verglichen mit 9,7 x 10&sup9; M&supmin;¹ für natives anti-Tac.
    • Genaue Beschreibung der Erfindung
  • Ein rekombinantes Immuntoxin umfaßt gemäß der vorliegenden Erfindung ein Antikörper-PE40 rekombinantes Fusionsprotein. Das Fusionsprotein ist anti-Tac(Fv)-PE40. Gemäß der Erfindung wird das rekombinante Fusionsprotein über einen Expressionsvektor oder ein Plasmid, umfassend DNA-Abschnitte, die die Synthese des Fusionsproteins steuern, erzeugt. Eine Zusammensetzung gemäß der Erfindung umfaßt eine wirksame Menge des Antikörper- PE40, dem rekombinanten Fusionsprotein der Erfindung, um Zellen, die einen Rezeptor oder ein Antigen, an die der Antikörper bindet, tragen und einen pharmazeutisch annehmbaren Träger. Gemäß der Erfindung umfaßt ein Verfahren zum Erreichen von selektiver Zytotoxizität ein Kontaktieren der ausgewählten Zellen, die mit einer zytotoxischen Menge der Zusammensetzung des Antikörper-PE40 rekombinanten Fusionsproteins getötet werden sollen, wobei die ausgewählten Zellen solche mit Rezeptoren oder Antigenen sind, an die der Antikörper bindet, wobei aber die Zusammensetzung für Zellen, denen die Rezeptoren oder Antigene für die Bindung des Antikörpers fehlen, keine signifikante Zytotoxizität besitzt (Tabelle 2).
  • Wenn nicht anders definiert, haben alle hier verwendeten technischen und wissenschaftlichen Ausdrücke dieselbe Bedeutung, die ein Durchschnittsfachmann des Faches, zu dem diese Erfindung gehört, normalerweise versteht. Obwohl jegliche Verfahren und Materialien, die ähnlich oder gleichwertig zu den hier beschriebenen sind, bei der Anwendung oder der Durchführung der vorliegenden Erfindung verwendet werden können, werden die bevorzugten Verfahren und Materialien nun beschrieben. Alle im folgenden erwähnten Veröffentlichungen sind unter Bezugnahme darauf hier aufgenommen. Wenn nicht anders erwähnt, sind die hier verwendeten Techniken Standardverfahren, die einem Durchschnittsfachmann gut bekannt sind. Die Materialien, Verfahren und Beispiele sind nur veranschaulichend und nicht begrenzend.
  • Der Begriff "Antikörper" wie hier verwendet bedeutet ein Teil eines Immunglobulinmoleküls (siehe W.E. Paul, Hrsg., "Fundamental Immunology", Raven Press, N.Y., 1984, Seiten 131- 165), das in der Lage ist, an ein Antigen zu binden. Dieser Definition entsprechend beinhaltet die Bezeichnung "Antikörper" verschiedene Formen von veränderten oder geänderten Antikörpern wie ein intaktes Immunglubolin, ein Fv-Fragment, das nur die variablen Regionen der leichten und schweren Kette enthält, ein Fab oder (Fab)'&sub2;-Fragment, das die variablen Regionen und Teile der konstanten Regionen enthält, einen einzelkettigen Antikörper (Bird et al., 1988, Science 242, 424-426; Huston et al., 1988, Proc. Nat. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883) und ähnliche. Der Antikörper kann einem tierischen (insbesondere Maus oder Ratte) oder menschlichen Ursprung entstammen oder kann chimär sein (Morrison et al., 1984, Proc Nat. Acad. Sci. USA 81, 6851-6855) oder vermenschlicht sein (Jones et al., 1986, Nature 321, 522-525, und die veröffentlichte UK Patentanmeldung # 8707252). Verfahren zum Erzeugen von Antikörpern, die für die Verwendung in der vorliegenden Erfindung geeignet sind, sind dem Fachmann gut bekannt und können beschrieben in einer solchen Publikation wie Harlow & Lane, Antibodies: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, 1988 gefunden werden. Die für die Antikörperketten kodierenden Gene können in cDNA oder genomischer Form durch jedes dem Fachmann bekannte Klonierungsverfahren kloniert werden. Siehe zum Beispiel Maniatis et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory, 1982. Die Bezeichnung "ohne signifikante Zytotoxizität" wie hier verwendet bedeutet, daß das Fusionsprotein der vorliegenden Erfindung nicht die Funktion von nichtausgewählten Zellen zu einem nennenswerten Grad oder zu einem abnormalem Niveau beeinträchtigt.
  • Das rekombinante Antikörper-PE40-Fusionsprotein kann aus einer oder zwei Polypeptidketten zusammengesetzt sein. Die Herstellung eines einzelkettigen Fusionsproteines wird hier veranschaulicht. Um zweikettige Fusionsproteine zu erzeugen, wurde kein Aminosäurebindeglied zwischen die VH und VL-Sequenzen eingefügt werden. Statt dessen wurde ein Terminationskodons nach der VH-Sequenz eingefügt werden, und ein Initiationskodon und eine Ribosomenbindungssequenz würden vor der VL-Sequenz eingefügt werden. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung werden die VL und VH-Sequenzen teilweise oder vollständig von den konstanten Regionen der leichten und schweren Kette z.B. von der gesamten konstanten Region der leichten Kappa-Kette und der CHL-Domäne der konstanten Region der schweren Kette mit oder ohne Scharnierregion entsprechend gefolgt werden. Die VL, VH und PE40-Gene können in jeder Reihenfolge auf dem Plasmid erscheinen, daher kann das PE40-Gen entweder an das 5' oder 3'-Ende des Genes von entweder der leichten oder schweren Kette angehängt werden. Die Fachleute werden erkennen, daß zusätzliche Veränderungen, Deletionen, Einfügungen und ähnliche bei den Antikörper- und PE40-Genen eingeführt werden können. Insbesondere können Deletionen oder Veränderungen im PE40 oder in dem Bindeglied, das das Antikörpergen mit dem PE40 verbindet, eingeführt werden, um die Zytotoxizität des Fusionsproteines gegenüber Zielzellen zu vergrößern oder um die unspezifische Zytotoxizität gegenüber Zellen ohne Antigen für die Antikörper zu verringern. Die gesamten Konstruktionen können durch Verfahren genetischer Techniken, die dem Fachmann gut bekannt sind (siehe allgemein Maniatis et al., oben), hergestellt werden und können Proteine erzeugen, die verschiedene Eigenschaften in bezug auf Affinität, Spezifität, Stabilität und Toxizität haben, was sie für verschiedene klinische oder biologische Anwendungen besonders geeignet macht.
  • In dem hier offenbarten Beispiel sind die VL, VH und PE40- Gene auf einem einzigen Plasmid enthalten. Außerdem verbleibt das rekombinante Antikörper-PE40-Protein nach der Erzeugung im Inneren der E. coli-Wirtszelle, bis es gereinigt wird. In einer anderen Ausführungsform der Erfindung ist das VL-Gen und jegliche konstante Region der leichten Kette auf einem Plasmid, während das VH-Gen, jegliche konstante Region der schweren Kette und das PE40-Gen auf einem zweiten Plasmid sind. In jedem Fall kann den VL und/oder VH-Genen eine Signalsequenz vorausgehen, die die Sekretion des rekombinanten Fusionsproteins aus den Zellen steuert (Better et al., 1988, Science 240, 1041-1043; Skerra & Pluckthun, 1988, Science 240, 1038-1041).
  • Die Fusionsproteine der Erfindung können in einer Vielzahl von Wirtszellen einschließlich E.coli, anderen bakteriellen Wirten, Hefe und verschiedenen höheren eukaryotischen Zellen wie den COS, CHO und HeLa-Zellinien und Myelomazellinien exprimiert werden. Das rekombinante Proteingen wird für jeden Wirt mit geeigneten Expressionskontrollsequenzen funktionsfähig verbunden. Für E.coli schließt dies einen Promoter wie den T7, trp, oder Lambda-Promotoren, eine Ribosomenbindungsstelle und bevorzugt ein Transkriptionsterminationssignal ein. Für eukaryotische Zellen beinhalten die Kontrollsequenzen einen Promotor und bevorzugt einen Verstärker (enhancer), abgeleitet von Immunglobulingenen, SV40, Zytomegalovirus, etc., und eine Polyadenylierungssequenz und können Spleißdonor- und Akzeptorsequenzen einschließen. Die Plasmide der Erfindung können in die ausgewählte Wirtszelle durch gut bekannte Verfahren wie die Calciumchloridtransformation bei E.coli und die Calciumphosphatbehandlung oder die Elektroporation bei Säugetierzellen überführt werden. Die mit den Plasmiden transformierten Zellen können aufgrund von Antibiotikaresistenz, die durch Gene, die auf den Plasmiden wie die amp, gpt, neo und hyg-Gene enthalten sind, verliehen werden, selektioniert werden.
  • Einmal exprimiert können die rekombinanten Fusionsproteine gemäß den Standardverfahren im Stand der Technik, was Ammoniumsulfatfällung, Affinitätssäulen, Säulenchromatographie, Gelelektrophorese und ähnliche (siehe allgemein, R. Scopes, "Protein Purification", Springer-Verlag, N.Y. (1982)) einschließt, gereinigt werden. Für pharmazeutische Verwendungen sind im wesentlichen reine Zusammensetzungen von wenigsten annähernd 90 bis 95% Homogenität bevorzugt und noch bevorzugter mit 98 bis 99% Homogenität. Einmal teilweise oder bis zur Homogenität nach Wunsch gereinigt, können die Polypeptide dann therapeutisch (auch außerhalb vom Körper) oder andererseits wie beim Entwickeln und Durchführen von Testverfahren (siehe allgemein, Immunology Methods, Vols. I und II, Lefkovits und Pernis, eds., Academic Press, New York, N.Y. (1979 und 1981)) verwendet werden.
  • Die rekombinanten Fusionsproteine und pharmazeutischen Zusammensetzungen dieser Erfindung sind insbesondere für parenterale Verabreichungen verwendbar, d.h. subkutan, intramuskulär oder intravenös. Die Zusammensetzungen für die parenterale Verabreichung werden normalerweise eine Lösung des Antikörpers oder eine in einem annehmbaren Träger, bevorzugt einem wäßrigen Träger aufgelöste Mischung davon umfassen. Eine Vielzahl von wäßrigen Trägern kann verwendet werden wie z.B. Wasser, gepuffertes Wasser, 0,4% Saline, 0/3% Glycin und ähnliche. Diese Lösungen sind steril und im allgemeinen frei von unerwünschten Stoffen. Diese Zusammensetzungen können durch herkömmliche, gut bekannte Sterilisierungstechniken sterilisiert werden. Die Zusammensetzungen können pharmazeutisch annehmbare Hilfssubstanzen, wenn diese zum Erreichen physiologischer Bedingungen benötigt werden, wie zum Einstellen des pH und abpuffernde Mittel, Toxizität einstellende Mittel und ähnliche wie zum Beispiel Natriumazetat, Natriumchlorid, Kaliumchlorid, Calciumchlorid, Natriumlaktat und ähnliche enthalten. Die Konzentration des Fusionsproteins kann in diesen Formulierungen breit variieren, d.h. von weniger als ungefähr 0,5%, von gewöhnlich oder wenigstens ungefähr 1% bis zu soviel wie 15 oder 20 Gew.% und wird primär basierend auf Flüssigkeitsvolumina, Viskositäten, Körpergewicht und ähnlichem in Übereinstimmung mit der besonderen, ausgewählten Verabreichungsart ausgewählt.
  • So kann eine typische pharmazeutische Zusammensetzung für eine intramuskuläre Injektion 1 ml steriles, gepuffertes Wasser und 10 mg Fusionsprotein umfassen. Eine typische Zusammensetzung für intravenöse Infusionen kann 250 ml einer sterilen Ringerlösung und 10 mg Protein umfassen. Tatsächliche Verfahren zum Herstellen von parenteral verabreichbaren Zusammensetzungen werden den Fachleuten bekannt oder ersichtlich sein und sind genauer in Publikationen beschrieben wie Remington's Pharmaceutical Science, 15th ed., Mack Publishing Company, Easton, Pennsylvania (1980), was hiermit unter Bezugnahme aufgenommen ist.
  • Die Zusammensetzungen, die die vorliegenden Fusionsproteine oder eine Mischung davon (d.h. mit anderen Proteinen) enthalten, können bei prophylaktischen und/oder therapeutischen Behandlungen verabreicht werden. Bei therapeutischen Anwendungen werden die Zusammensetzungen einem Patienten, der an einer Krankheit leidet, in einer ausreichenden Menge verabreicht, um die Krankheit und deren Komplikationen zu heilen oder wenigstens zum Teil zum Stillstand zu bringen. Eine geeignete Menge um dieses zu erreichen, ist als eine "therapeutisch wirksame Dosis" definiert. Wirksame Mengen für diese Verwendung hängen von der Schwere der Krankheit und dem allgemeinen Gesundheitszustand des Patienten ab.
  • In prophylaktischen Anwendungen werden Zusammensetzungen, die die vorliegenden Antikörper oder eine Mischung davon enthalten, einem Patienten, der sich noch nicht in einem Krankheitszustand befindet, verabreicht, um den Ausbruch einer Krankheit zu verhindern. Eine solche Menge wird definiert, eine "prophylaktisch wirksame Dosis" zu sein. In diesem Fall hängen die genauen Mengen wieder von dem Gesundheitszustand des Patienten und dem allgemeinen Immunstatus ab.
  • Einmalige oder mehrfache Verabreichungen der Zusammensetzungen können in Abhängigkeit von der Dosierung und der Häufigkeit, wie es von dem Patienten benötigt und toleriert wird, verabreicht werden. In jedem Fall sollte die Zusammensetzung eine ausreichende Menge der Proteine dieser Erfindung bereitstellen, um den Patienten wirksam zu behandeln.
  • Unter vielen Verwendungen der rekombinanten Fusionsproteine der vorliegenden Erfindung sind eine Vielzahl von Krankheitszuständen, die durch spezifische menschliche Zellen, die durch die toxische Wirkung des Proteines entfernt werden können, verursacht werden, eingeschlossen. Eine bevorzugte Anwendung ist die Behandlung von Autoimmunzuständen wie Spender-gegen-Wirt-Erkrankung (graft-versus-host disease), organische Transplantatabstoßung, Typ 1 Diabetes, Multiple Sklerose, rheumatoide Arthritis, systemischer Lupus erythematodes, Myasthenia Gravis und ähnliche, die durch T- und B-Zellen verursacht werden. Das hier offenbarte Beispiel ist veranschaulichend. Eine andere bevorzugte Anwendung ist bei der Behandlung von Krebs, der durch verschiedene Arten an bösartigen Zellen verursacht wird. Die Fusionsproteine können auch in vitro wie z.B. bei der Entfernung von schädlichen Zellen aus dem Knochenmark vor der Transplantation verwendet werden. Der Antikörperteil des Fusionsproteins ist gemäß der beabsichtigten Verwendung ausgewählt. Proteine auf den Membranen von T-Zellen, die als Ziel für den Antikörper dienen, schließen CD2 (T11), CD3, CD4 und CDB ein. Proteine, die vorwiegend auf B-Zellen gefunden werden, die als Ziele dienen könnten, schließen CD10 (CALLA-Antigen), CD19 und CD20 ein. CD45 ist ein mögliches Ziel, das auf lymphatischen Zellen weit vorkommt. Diese und andere mögliche Lymphozytenzielantigene für den Antikörper sind in Leucocyte Typing III, A.J. McMichael, ed., Oxford University Press, 1987 beschrieben. Antigene, die auf Krebszellen gefunden werden, die als Ziele für die Antikörper dienen können, beinhalten das karzinoembryonische Antigen (CEA), den Transferrinrezeptor, das P-Glycoprotein, c- erbB2, und Antigene, die in den Abstracts of the Third International Conference on Monoclonal Antibody Immunoconjugates for Cancer (San Diego, CA 1988) beschrieben werden. Fachleute werden erkennen, daß Antikörper ausgewählt werden können, die an Antigene binden, die auf ganz anderen Zelltypen exprimiert werden wie z.B. Membranglycoproteine oder Wachstumsfaktor- oder Hormonrezeptoren wie der epidermale Wachstumsfaktorrezeptor und ähnliche.
    • Materialen und Verfahren
  • Das folgende Beispiel wird zum Zweck der Veranschaulichung, nicht als Einschränkung, gezeigt.
    • Konstruktion eines Expressionsplasmids für anti-Tac (Fv)-PE40
  • Ein hier als pVC70108 bezeichnetes Plasmid wurde zusammengebaut, so daß es ein für ein Startmethionin kodierendes ATG, einen 348 bp DNA-Abschnitt, der für anti-Tac VH kodiert, verbunden mit einem 318 bp DNA-Abschnitt, der für VL kodiert, über ein 45 bp Bindeglied, enthält; VL wurde wiederum mit einem DNA-Abschnitt, der für die Aminosäuren 253- 613 von PE (Figur 1) kodiert, verbunden. Die vollständigen Sequenzen des VH-VL-Bindeglied-PE40 DNA-Abschnittes und des kodierten anti-Tac (Fv)-PE40 Fusionsproteins sind in Tabelle 1 dargestellt. Die Sequenzen von VH und VL sind in der U.S.S.N. 182,682 aufgelistet, die hiermit unter Bezugnahme spezifisch aufgenommen wird.
  • Wie in Fig. 1a und 1b gezeigt, werden zwei Oligonukleotidsätze in der auf der Polymerasekettenreaktion (PCR) basierenden Vervielfältigung (unter Verwendung des Gene Amp kit, Perkin Elmer Cetus) verwendet, um das folgende zu erzeugen:
  • (a) eine NdeI Schnittstelle an dem 5' Ende des VH-Genes, die VH-Domäne und die ersten neun aminoterminalen Kodons des Bindegliedes gefolgt von einer KpnI-Schnittstelle (unter Verwendung von VK073 und VK074 mit der cDNA der schweren Ketten des anti-Tac im Plasmid phTac2).
  • (b) Sieben carboxyterminale Kodons des Peptidbindegliedes mit einer KpnI-Schnittstelle, die VL-Domäne und HindIII- Schnittstelle an dem 3' Ende des Genes, das für VL kodiert (unter Verwendung von VK075 und VK076 mit der cDNA der leichten Kette im Plasmid pLTac2).
  • Plasmide, die cDNAs mit voller Länge beeinhalten, die für die schweren und leichten Ketten von anti-Tac kodieren, wurden als EcoRI-Einfügungen in pUC18 als Matritze (template) verwendet. Nach der PCR-Vervielfältigung wurden zwei Fragmente isoliert: (1) einen 413 bp Abschnitt, der die variable Domäne der schweren Kette und den aminoterminalen Teil des Peptidbindegliedes enthält; (2) einen 396 bp Abschnitt, der den carboxyterminalen Teil des Peptidbindegliedes und die variable Domäne der leichten Kette enthält. Der 413 bp Abschnitt wurde mit NdeI und KpnI geschnitten, um einen 377 bp Abschnitt zu ergeben. Der 396 bp Abschnitt wurde mit KpnI und HindIII geschnitten, um einen 340 bp Abschnitt zu ergeben. Gesondert wurde das Plasmid pVC20, das ein für von PE abstammendes PE43 kodierendes Gen trägt (Chaudhary et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85:2939-2943, 1988), mit Ndei und HindIII geschnitten und desphosphoryliert, um einen 3,75 Kb Abschnitt zu isolieren. Dieser wurde dann mit den früher isolierten 377 bp und 340 bp Abschnitten verbunden. Das sich ergebende Plasmid pVC701 enthält ein Fusionsgen unter dem T7-Promotor. Dieses Gen enthält 4 zusätzliche Basen in dem Peptidbindeglied. Das Plasmid pVC701 wurde mit KpnI geschnitten, mit T4 DNA- Polymerase behandelt, um 3'-Überhänge abzubauen und zu dem isolierten Plasmid pVC701020 verbunden. Das pVC701020 (4,4 Kb) kodiert für ein Fusionsprotein, das variable Domänen von anti- Tac und PE43 umfaßt.
  • Das pVC701020 wurde mit HindIII geschnitten, mit SI- Nuklease behandelt, um 5' Überhänge zu entfernen, mit BamHI geschnitten und dephosphoryliert, um einen 3,65 Kb Abschnitt zu isolieren. Gesondert wurde pVC701020 mit Aval geschnitten, mit SI-Nuklease behandelt und mit BamHI geschnitten, um einen 750 bp Abschnitt zu isolieren. Die 3,65 Kb und 750 bp Abschnitt wurden miteinander verbunden, um ein Plasmid pVC70108 zu ergeben. Das pVC70108 trägt ein Fusionsgen, das für VH, das mit VL über ein 15 Aminosäure-Bindeglied verbunden ist und VL mit den Aminosäuren 253-613 von PE verbunden ist, kodiert. Am 5' Ende von VH wurde ein Methioninkodon erzeugt.
  • Wie früher angemerkt befindet sich das zusammengebaute Gen unter der Kontrolle eines T7-Promotors. Die Richtigkeit der kodierenden Region des Plasmids wurde durch DNA-Sequenzierung (Daten nicht gezeigt) bestätigt.
  • Eine Hinterlegung des Plasmids pVC70108 wurde bei der ATCC, Rockville, Maryland am 31. März 1989 unter der Zugangsnummer 67913 vorgenommen. Die Hinterlegung soll für einen Zeitraum von 30 Jahren ab dem Datum der Hinterlegung oder für 5 Jahre ab dem letzten Datum einer Anfrage nach einer Probe der Hinterlegung, je nach dem, was länger dauert, lebend erhalten werden und wird, wenn sie nichtlebensfähig wird, ersetzt, und wird für die Öffentlichkeit nach Erteilung eines Patentes dieser Anmeldung ohne Beschränkung in Übereinstimmung mit den gesetzlichen Bestimmungen verfügbar gemacht. Der Bevollmächtigte für Patente und Marken soll auf Antrag Zugang zu der Hinterlegung haben.
    • Reinigung und Charakterisierung von anti-Tac(Fv)-PE40
  • Nach IPTG-Induktion stellt der E. coli-Stamm BL21 (λDE3), der das Plasmid p70108 trägt, große Mengen eines Proteines mit annähernd 65 kDa her, wie durch SDS PAGE (Spur 1, Fig. 2b) gezeigt. Auf Immunoblots reagiert das chimäre 65 kDa Protein mit einem Antikörper gegen PE (Daten nicht gezeigt) . Das Fusionsprotein war überwiegend in dem 100.000 xg Sediment (Spur 3, Fig. 2b) der beschallten Sphäroplasten (Spur 2, Fig. 2b) enthalten. Dieser Niederschlag wurde als Quelle verwendet, um anti-Tac(Fv)-PE40 herzustellen. Es wurde die Technik der Guanidinhydrochlorid-Denaturierung, die von einer schnellen Verdünnung gefolgt wird, verwendet, um das chimäre Protein in Lösung zu bringen und zu renaturieren (Chaudhary et al, 1988, Nature 335, 369-372; Siegall et al, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 9738-9742). DTT wurde in dem Renaturierungspuffer vermieden, und die Renaturierung wurde für 16 Stunden ausgeführt. Nach der Renaturierung und Dialyse wurde die Probe auf eine Mono-Q-Säule (HR 10/10) mit 3 ml/min gegeben. Die Säule wurde mit 40 ml Puffer A (20 mM Tris-HCl, pH 7,6) gewaschen und mit einem 200 ml linearen Gradienten (0-0,5 M NaCl) entwickelt. Die eluierten Proteine wurden bei 280 nm beobachtet. Die Fraktionen (4 ml) wurden gesammelt und auf Zytotoxizität bei HUT-102 Zellen untersucht. Für die SDS-PAGE, wurden die Proben mit Laemmli-Probenpuffer gekocht und auf einem 10% Gel elektrophoretisch aufgetrennt. Die monomere Form des Fusionsproteins eluierte bei 0,2-0,22 M NaCl (Fig. 2b, Spur 4 und Fig. 2a). Aggregate mit hohem Molekulargewicht wurden bei einer höheren Ionenstärke eluiert (Fraktionen 42-50, Fig. 2a). Eine weitere Reinigung des chimären Proteins wurde auf einer TSK-250 Gelfiltrationssäule durchgeführt; das chimäre Protein eluierte als symmetrischer Peak an der erwarteten Stelle für ein 65 kDa Protein (Daten nicht gezeigt). Das SDS-PAGE zeigte, daß das Protein zu > 95% rein war (Spur 5, Fig. 2b) und die N- terminale Aminosäuresequenzanalyse zeigte, daß das Protein die erwartete N-terminale Sequenz, Met, Gln, Val besitzt. Es wurden ungefähr 200 µg hoch gereinigtes, monomeres anti-Tac(FV)-PE40 aus 1 Liter Zellen, die vor der Induktion bis zu einer OD&sub6;&sub5;&sub0; von 0,6 wuchsen, erhalten.
    • Untersuchung der Zytotoxizität von anti-Tac(Fv)-PE40
  • HUT-102 Zellen wurden zweimal mit serumfreiem Medium gewaschen und in RPMI 1640 Medium mit 5% fötalem Rinderserum mit 3 x 10&sup5; Zellen/Napf in 24-Napfplatten ausplattiert. Es wurden verschiedene Verdünnungen von anti-Tac(Fv)-PE40 in PBS mit 0,2% humanem Serumalbumin hergestellt und zu den entsprechenden Näpfen zugegeben. Nach 20 Stunden wurden die Zellen mit ³H-Leucin für 90 Minuten markiert, und die Radioaktivität wurde in dem TCA-Niederschlag des Zellsedimentes bestimmt. Die Ergebnisse sind in % der Kontrolle, zu der kein Toxin zugegeben wurde, dargestellt. Bei Kompetition, 10 µg an anti-Tac(Fv)-PE40.
    • Kompetitionsbindungsanalysen von anti-Tac(Ev)-PE40
  • I-125 markiertes anti-Tac (1µCi/µg) wurde als Marker mit 1,5 ng pro Test und variierenden Konzentrationen des Kompetitors und 4 x 10&sup5; HUT-102 Zellen als Quelle für das Tac- Antigen in 0,2 ml eines Bindepuffers (RPMI 1640 mit 10% fötalem Rinderserum, 100 µg/ml humanem IgG, 0,1% Natriumazid) verwendet und bei Zimmertemperatur (22º-24ºC) unter Mischen für 2 Stunden inkubiert. Unter diesen Bedingungen betrug die Konzentration des Markers 50 pM und des Tac-Peptides 500 pM. Der freie Marker beträgt laut Berechnung 10 pM und erfüllt für die Annahmen der Kompetitionsanalyse die Bedingung, daß der freie Marker weniger als 1/Ka = 100 pM (unter Verwendung von 10¹&sup0; M&supmin;¹ als Ka des anti-Tac) ist. Die Versuche wurden parallel mit einem nichtmarkiertem anti-Tac Kontrollantikörper durchgeführt, und die Kurvenverschiebungen wurden am 50% Inhibitionspunkt der Markerbindung gebunden/frei (Ro/2) gegen die log Kompetitorkonzentration berechnet. Die Konzentrationen wurden aus den entlogarithmierten Werten der Abszisse erhalten, und die Affinitätskonstante Kx für das Konstrukt X wurde aus der Formel (Berzofsky et al, 1981, Molec. Immunol 18, 751-763)
  • ([X]1/2 - [anti-Tac]1/2) = 1/Kx - 1/Ka
  • abgeleitet, wobei [X]1/2 die Konzentration des Kompetitors angibt, bei der die Bindung des Markers Ro/2 ist. Eine Standard-Scatchard-Auftragung der Bindungsdaten mit anti-Tac ergab ähnliche Kurven und ein Ka von 9,7 x 10&sup9; M&supmin;¹, was vergleichbar mit dem ist, was andere Forscher erhielten (Robb et al, 1984, J. Exp. Med. 160, 1126-1146). Der Ka von 3,5 x 10&sup9; M&supmin;¹ für anti-Tac(Fv)-PE40 wurde aus der obigen Formel berechnet. Alle Konzentrationen wurden über einen Bradford- Proteinmikrotest gegen eine Standardkurve mit humanern IgG bestimmt. Für die Kompetitionsanalyse wurden diese Konzentrationen auf der Basis der bindungsfähigen Fraktion, die in verschiedenen Untersuchungen mit radiomarkiertern anti- Tac(Fv)-PE40 (0,44) und radiomarkiertem anti-Tac (0,8) und einem Überschuß an HUT-102 Zellen, um die Konzentrationen an bindungsfähigem Protein für die Abzisse zu ergeben, erhalten wurde, normalisiert.
    • Selektive Zytotoxizität von anti-Tac(Fv)-PE40
  • Da die anti-Tac Antikörper an die p55 Untereinheit (Tac- Antigen) des IL-2 Rezeptors binden, der in großen Mengen auf HUT-102 Zellen vorhanden ist (Uchiyama et al, 1981, J. Immunol. 126, 1393-1397), wurde das chimäre Protein wie oben beschrieben anfänglich auf Zytotoxizität bei HUT-102 Zellen untersucht. Das anti-Tac(Fv)-PE40 inhibierte die Proteinsynthese in einer Dosis-abhängigen Art mit einer ID&sub5;&sub0; von 0,15 ng/mnl (2,3 x 10&supmin;¹² M) in einem 20-Stunden-Test (Fig. 3 und Tabelle 2). Bei Konzentrationen von größer als 4 ng/ml gab es eine vollständige Inhibition der Proteinsynthese. Es wurden mehrere Spezifitätskontrollen ausgeführt. Die Zugabe eines Überschusses an anti-Tac (10 µg/ml) verhinderte die Zytotoxizität des anti- Tac(Fv)-PE40 bei HUT-102 Zellen, wobei ein monoklonaler Kontrollantikörper OVB3, der gegen ein Antigen gerichtet ist, daß auf Eierstockkrebszellen gefunden wird, diese nicht inhibierte (Fig. 3). Eine andere humane T-Zellinie CrII.2, welche eine geringere Zahl an IL2-Rezeptoren als HUT-102 hat, war auch empfindlich gegenüber anti-Tac(Fv)-PE40 mit einer ID&sub5;&sub0; von 2,7 ng/ml (Tabelle 2). Weiterhin wurden mehrere humane Zellinien ohne IL-2 Rezeptoren, die die T-Zellinien CEM, A431, KB und OVCAR-3 einschließen, nicht durch anti-Tac(Fv)-PE40 sogar bei 1 µg/ml (Tabelle 2) beeinträchtigt.
  • Es wurde berichtet, daß anti-Tac, das chemisch an PE (anti- Tac-PE) PE40 gebunden war, HUT-102 Zellen tötete (Kondo et al, 1988. J. Biol. Chem. 263, 9470-9475; Fitzgerald et al, 1984. J. Clin. Invest. 74, 966-971). Wenn Thioetherkonjugate hergestellt werden, hat anti-TacPE eine ID&sub5;&sub0; von ungefähr 1,2 ng/ml und ähnlich hergestelltes anti-Tac-PE40 hat eine ID von 13 ng/ml.
  • Da anti-Tac(Fv)-PE40 (65 kDa) ungefähr 30% des Molekulargewichts von anti-Tac-PE (216 kDa) hat, ist das chimäre Toxin der vorliegenden Erfindung auf einer molaren Basis siebenmal aktiver als das anti-Tac-PE und beträchtlich aktiver als anti-Tac-PE40. Die sehr hohe Aktivität des anti- Tac(Fv)-PE40 auf den Zielzellen HUT102, ungefähr zehnmal größer als die des chemisch hergestellten anti-Tac-PE40 oder des rekombinanten Fusionsproteins IL-2-PE40 (Lorberboum-Galski et al., 1988, Proc. Nat. Acd. Sci. USA 85, 1922-1926), ist unerwartet und hätte aus dem Stand der Technik nicht vorhergesagt werden können. Es ist insbesondere unerwartet, daß anti-Tac(Fv)-PE40 zytotoxischer ist als jedes andere IL-2-PE- Fusionsprotein, weil der anti-Tac(Fv)-Antikörper eine viel geringere Affinität, Ka = 3,5 x 10&sup9; M&supmin;¹ wie oben angegeben, für den vollständigen IL-2-Rezeptor als IL-2, Ka = 10¹¹ M&supmin;¹, hat (Tsudo et al., 1987 Proc. Nat. Acad. Sci. USA., 84, 5394-5398).
  • Die Kompetitionsbindungsstudien ergaben eine Affinität von 3,5 x 10&sup9; M&supmin;¹ für anti-Tac(Fv)-PE40, die, bezogen auf die mit 9,7 x 10&sup9; M&supmin;¹ für anti-Tac gemessene (Fig. 4), ungefähr dreimal geringer ist. Das kann mit einem vierfachen Verlust der Affinität eines Fv-Konstruktes gegenüber einem Fab-Fragment eines anti-Rinderwachstumshormons (Bird et al, 1988, Science 242, 423-426) und mit einem sechsfachen Verlust des Fv- Konstruktes eines anti-Digoxin gegenüber einem Fab-Fragment von anti-Digoxin (Houston et al, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85, 5879-5883) verglichen werden.
  • Die relative Erhaltung der Affinität der Fv-Bindungsstelle ist bei anti-Tac in bezug auf die bei anti-BGH und anti-Digoxin Antikörpern beobachtete offenbar überragend.
  • Zusammenfassend zeigen die hier dargestellten Daten klar die Synthese eines aktiven rekombinanten Immunotoxins in E. coli durch Fusion von cDNAs, die für die anti-Tac variablen Regionen kodieren, mit einem DNA-Abschnitt, der für eine veränderte Form eines Pseudomonas Exotoxins kodiert. Diese Ausführung ermöglicht nun die Erzeugung von ähnlich aktiven rekombinanten Immunotoxinen mit anderen Antikörpern unter Verwendung von E. coli oder anderen Expressionsvektoren, die dem Fachmann bekannt sind.
  • Es wird verstanden, daß die hier beschriebenen Beispiele und Ausführungen nur für veranschaulichende Zwecke sind und das verschiedene Veränderungen oder Änderungen in derem Lichte für den Fachmann naheliegen und die in dem Geist und Rahmen dieser Anmeldung und im Rahmen der beigefügten Ansprüche eingeschlossen sind. Tabelle 1: Sequenz von Anti-Tac(Fv)-PE40
  • Die entsprechenden Pfeile trennen die VH-, Bindeglied-, VL- und PE40-Regionen. TABELLE 2 ZYTOTOXIZITÄT (ID&sub5;&sub0;) VON ANTI-TAC(Fv)-PE40 FÜR VERSCHIEDENE ZELLINIEN
  • Die Zellinie OVCAR3, KB und A431 wurden einen Tag vor der Zugabe des Toxins mit 1 x 10&sup5;/ml in 24 Napfplatten ausgesät. HUT-102 und CEM wurden zweimal gewaschen und mit 3 x 10&sup5;/ml in 24 Napfplatten (siehe auch Fig. 3) ausgesät. Verschiedene Verdünnungen der Toxinaufbereitungen wurden zugegeben, und 20 Stunden später wurden die Zellen für 1,5 Stunden mit ³H-Leucin markiert. Die Radioaktivität wurde in dem TCA-Niederschlag der Zellen bestimmt. Die ID&sub5;&sub0; ist die Konzentration des Toxins, die die Proteinsynthese zu 50% inhibiert, verglichen mit einer Kontrolle, zu der kein Toxin zugegeben wurde. Die Versuche wurden alle in Duplikaten durchgeführt und dreimal wiederholt.

Claims (14)

1. Konstrukt mit DNA-Segmenten, welche die Synthese eines rekombinanten Fusionsproteins in einem geeigneten Expressionsvektor steuern, wobei es sich bei dem Fusionsprotein um anti-Tac(Fv)-PE40 handelt.
2. Konstrukt nach Anspruch 1, wobei die DNA-Segmente in einem Plasmid enthalten sind.
3. Konstrukt nach Anspruch 2, welches das Plasmid ATCC Nr. 67913 aufweist.
4. Prokaryotische oder eukaryotische Zelle, die mit dem Konstrukt nach Anspruch 1 transformiert oder transfiziert ist.
5. Rekombinantes Antikörper-PE40-Fusionsprotein, das mindestens die Translokations- und ADP-Ribosylierungsaktivität von PE besitzt, wobei es sich bei dem Fusionsprotein um anti-Tac(Fv)PE40 handelt.
6. Fusionsprotein nach Anspruch 5, wobei das Protein eine einzige Polypeptidkette aufweist.
7. Zusammensetzung mit einem wirksamen Anteil des Fusionsproteins nach Anspruch 5 zum Abtöten von Zellen, die einen Rezeptor oder ein Antigen tragen, an den (das) der Antikörper bindet&sub1; und mit einem pharmazeutisch annehmbaren Träger.
8. Verfahren zum Erreichen einer gezielten Cytotoxizität, wobei abzutötende Zielzellen mit einer cytotoxischen Menge der Zusammensetzung nach Anspruch 7 in Kontakt gebracht werden, wobei die Zielzellen Rezeptoren oder Antigene aufweisen, an die der Antikörper bindet, wobei aber die Zusammensetzung gegenüber Zellen, die keine Rezeptoren oder Antigene für die Bindung des Antikörpers aufweisen, keine signifikante Cytotoxizität aufweist.
9. Konstrukt nach Anspruch 1, wobei das Fusionsprotein ein einkettiges Polypeptid ist.
10. Zelle nach Anspruch 4, die mit dem Konstrukt nach Anspruch 9 transfiziert oder transformiert ist.
11. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Antikörper- PE40-Fusionsproteins, mit den Schritten: Züchtung der Zelle nach Anspruch 4 und Rückgewinnung des rekombinanten Antikörper- PE40-Fusionsproteins aus der Kultur.
12. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Antikörper- PE40-Fusionsproteins, mit den Schritten: Züchtung der Zelle nach Anspruch 9 und Rückgewinnung des rekombinanten Antikörper- PE40-Fusionsproteins aus der Kultur.
13. Konstrukt nach Anspruch 1, wobei das Fusionsprotein wirksamer ist als ein identisches nichtrekombinantes Fusionsprotein.
14. Konstrukt nach Anspruch 1, wobei Kodierungssequenzen für eine variable Region mit schwerer Kette von Kodierungssequenzen für eine variable Region mit leichter Kette gefolgt werden, an die sich das PE40-Gen anschließt.
DE69027210T 1989-04-21 1990-04-20 Rekombinantes antikörper-toxin-fusion-protein Expired - Lifetime DE69027210T2 (de)

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