DE69331510T2

DE69331510T2 - TNF-Liganden

Info

Publication number: DE69331510T2
Application number: DE69331510T
Authority: DE
Inventors: Igor Beletsky; Jacek Bigda; Igor Mett; David Wallach
Original assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Current assignee: Yeda Research and Development Co Ltd
Priority date: 1992-09-03
Filing date: 1993-09-03
Publication date: 2002-08-29
Anticipated expiration: 2013-09-04
Also published as: JP2006014742A; DE69331510D1; ES2171404T3; PT585939E; IL106271A; ES2171404T5; EP0585939B1; ATE212666T1; EP0585939B2; JPH06315394A; EP0585939A2; AU4612793A; JP2004254703A; IL106271A0; DK0585939T4; JP4044970B2; CA2105534C; DK0585939T3; AU678369B2; EP0585939A3

Description

Fachgebiet der Erfindung

Die vorliegende Erfindung betrifft Liganden für Tumornekrosefaktor-Rezeptoren (TNF-Rs), die die Wirkung des TNF, nicht jedoch seine Bindung an die TNF-Rs hemmen, und außerdem Liganden, die mit anderen Rezeptoren der TNF/NGF- Rezeptorfamilie interagieren.

Stand der Technik

Der Tumornekrosefaktor (TNF) ist ein pleiotropes Cytokin, das durch verschiedene Zelltypen, hauptsächlich durch aktivierte Makrophagen produziert wird. Er ist einer der maßgeblichen Mediatoren der Immun- und Entzündungsantwort. Das Interesse an seiner Funktion hat kürzlich stark zugenommen, als deutlich wurde, dass der TNF an der Pathogenese eines großen Spektrums von Krankheiten beteiligt ist; hierzu zählen der Endotoxin-Schock, die zerebrale Malaria und die Graftversus- Host-Reaktion. Da viele der Effekte von TNF für den Organismus schädlich sind, besteht ein großes Interesse daran, Wege zu finden, wie seine Wirkung auf Wirtszellen blockiert werden kann. Ein offensichtliches Ziel einer solchen Beeinflussung sind die Moleküle, an die der TNF binden muss, um seine Wirkungen auszulösen, nämlich die TNF-Rs. Diese Moleküle liegen nicht nur zellgebunden vor, sondern es gibt sie auch in löslichen Formen, die aus den gespaltenen extrazellulären Domänen der intakten Rezeptoren bestehen (vgl. Nophar et al., EMBO Journal 9 (10), (1990), 3269-3278). Die löslichen Rezeptoren behalten die Fähigkeit, an den TNF zu binden, und besitzen somit die Fähigkeit, seine Funktion zu blockieren, indem sie mit den Oberflächenrezeptoren kompetieren.
Ein weiteres Verfahren der TNF-Hemmung, das auf dem Prinzip des Kompetierens mit zellgebundenen Molekülen beruht, ist die Verwendung von Antikörpern, die TNF-Rezeptoren erkennen und die Bindung von Liganden blockieren.
Die Zelloberflächen-TNF-Rs werden in fast allen Zellen des Körpers exprimiert. Die TNF-Rezeptoren fungieren über die Bindung des TNF an sie als Signalgeber für die verschiedenen Wirkungen des TNF, d. h. die cytotoxische Wirkung, die wachstumsfördernde Wirkung und andere. Zwei Formen dieser Rezeptoren, die sich in ihrer Molekülgröße von 55 und von 75 Kilodalton unterscheiden, wurden beschrieben und werden hier mit p55- bzw. p75-TNF-R bezeichnet. Es sollte jedoch beachtet werden, dass es auch Veröffentlichungen gibt, in denen diese Rezeptoren als p60 und p80 beschrieben werden.
Die TNF-Rs gehören zu einer Familie von Rezeptoren, die an anderen kritischen biologischen Prozessen beteiligt sind. Zu Beispielen dieser Rezeptoren zählt der Niederaffinitäts-NGF-Rezeptor, der bei der Regulation des Wachstums und der Differenzierung von Nervenzellen eine wichtige Rolle spielt. Verschiedene andere Rezeptoren sind an der Regulation des Lympocyten-Wachstums beteiligt, wie CDw40 und einige andere. Ein weiteres Mitglied der Familie ist der FAS-Rezeptor, der auch APO genannt wird, ein Rezeptor, der am Signal für die Apoptose beteiligt ist und der aufgrund einer Studie mit Mäusen, bei denen seine Funktion fehlt, in der Ätiologie einer Lupus-ähnlichen Krankheit eine wichtige Rolle zu spielen scheint. Hier wird diese Familien von Rezeptoren mit "TNF/NGF-Rezeptorfamilie" bezeichnet.
Eine der wichtigsten Eigenschaften des TNF im Vergleich zu anderen Cytokinen, die vermutlich an der Pathogenese verschiedener Krankheiten beteiligt sind, ist seine Fähigkeit, den Zelltod hervorzurufen. Die zelltötende Aktivität von TNF wird vermutlich durch den p55-Rezeptor induziert. Diese Aktivität des p55-Rezeptors wird jedoch möglicherweise auch durch den p75-Rezeptor über einen bisher unbekannten Mechanismus unterstützt.
Die Europäischen Patentveröffentlichungen Nr. 0 398 327 und 0 412 486 beschreiben Antikörper gegen die löslichen TNF-Rs. Dabei wurde gefunden, dass diese Antikörper die löslichen TNF-Rs erkennen und die Bindung von TNF an die TNF-Rs auf der Zelloberfläche hemmen. Monovalente F(ab)-Fragmente blockierten die Wirkung von TNF, während festgestellt wurde, dass intakte Antikörper die zytotoxische Wirkung von TNF nachahmen.
Marsters et al. (J. Biol. Chem. 267 (1992), 5747-5750) beschreiben die Identifizierung von Cystein-reichen Domänen des Tumornekrosefaktor-Rezeptors Typ-1, die an der Bindung von Liganden beteiligt sind, und außerdem beschreiben sie einen monoclonalen Antikörper, der an den TNF-Rezeptor-1 bindet. Dieser Antikörper ist jedoch im Gegensatz zu den Liganden der vorliegenden Anmeldung nicht in der Lage, eine Konformationsänderung des Rezeptors zu induzieren. Außerdem wird nicht überzeugend gezeigt, dass die monoclonalen Antikörper tatsächlich mit der Region des TNF-Rezeptors-1 interagieren, die CDR4 entspricht. EP-A1 0 444 560 beschriebt spezielle Antikörper gegen einen TNF-Rezeptor. In EP-A1 0 444 560 werden jedoch keine Antikörper beschrieben, die die Merkmale der Antikörper der vorliegenden Anmeldung besitzen, z. B. werden keine Antikörper beschrieben, die an die Region des TNF-Rezeptors binden, die der Region entspricht, an die die Liganden der vorliegenden Anmeldung binden. Aus EP-A1 0 444 560 geht nicht einmal klar hervor, ob die Antikörper gegen das extrazelluläre Epitop des Rezeptors gerichtet sind.

Zusammenfassung der Erfindung

Die vorliegende Erfindung stellt einen Liganden für ein Mitglied der TNF/NGF- Rezeptorfamilie bereit, der an die Region der C-terminalen Cysteinschleife eines solchen Rezeptors bindet und der ein Inhibitor des Signals für den cytotoxischen Effekt dieses Rezeptors ist, wobei die Cysteinschleife die Aminosäuresequenz von cys-163 bis thr-179 in dem p75-TNF-R oder eine entsprechende C-terminale Cysteinschleife in einem anderen Mitglied der TNF/NGF-Familie umfasst.
Vorzugsweise ist der Rezeptor der TNF-R, insbesondere der p75-TNF-R.
Ein solcher Ligand umfasst die Aminosäuresequenz für die CDR-Region der schweren Kette des monoclonalen Antikörpers Nr. 32, dargestellt in Fig. 11, und/oder die Aminosäuresequenz für die CDR-Region der leichten Kette dieses Antikörpers, dargestellt in Fig. 12.
Ein weiterer Ligand umfasst die Aminosäuresequenz für die CDR-Region der schweren Kette des monoclonalen Antikörpers Nr. 70, dargestellt in Fig. 11.
Ein weiterer Ligand umfasst die Aminosäuresequenz für die CDR-Region der schweren Kette des monoclonalen Antikörpers Nr. 57, dargestellt in Fig. 11.
Die vorstehenden Antikörper werden hier der Einfachheit halber als "Gruppe 32"-Antikörper bezeichnet.
In einem anderen Aspekt der Erfindung umfassen die Liganden das scFv eines Gruppe-32-Antikörpers.
Die Liganden können z. B. Proteine, Peptide, Immunadhäsine, Antikörper oder andere organische Verbindungen umfassen.
Die Proteine können z. B. ein Fusionsprotein des Liganden mit einem anderen Protein umfassen, gegebenenfalls verbunden durch einen Peptidlinker. Ein solches Fusionsprotein kann die Verweilzeit des Liganden im Körper erhöhen und es auf diese Weise sogar möglich machen, dass der Ligand-Protein-Komplex als ein latentes Mittel oder als ein Impfstoff verwendet wird.
Der Begriff "Proteine" umfasst Muteine und fusionierte Proteine, ihre Salze, funktionale Derivate und aktive Fraktionen.
Die Peptide umfassen Peptid-gebundene Ersatzstoffe und/oder Peptidnachahmer, d. h. Pseudopeptide, die dem Fachmann bekannt sind (vgl. z. B. Proceedings of the 20th European Peptide Symposium, Hrsg., G. Jung, E. Bayer, S. 289-336, und die Referenzen darin), und Salze und Arzneimittel und/oder Formulierungen, die bewirken, dass das biologisch aktive Peptid (die biologisch aktiven Peptide) für die orale, örtliche, Nasenspray-, Augen-, Lungen-, i.v.- oder subkutane Verabreichung besonders geeignet ist (sind), abhängig von der bestimmten angezeigten Behandlung.
Solche Salze, Formulierungen, Aminosäureersatzstoffe und Pseudopeptidstrukturen können erforderlich und wünschenswert sein, um die Stabilität, Formulierung, Appilzierbarkeit (z. B. langsame Freisetzung, Pro-Drugs) zu verbessern oder um die Wirtschaftlichkeit der Herstellung zu erhöhen, so lange sie die biologische Aktivität des Peptids nicht nachteilig beeinflussen.
Neben Substitutionen können drei besondere Formen von Peptid-nachahmenden und/oder analogen Strukturen spezifisch erwähnt werden, die zum Bestimmen biologisch aktiver Peptide besonders wichtig sind, die an einen Rezeptor binden müssen, während die Gefahr besteht, dass sie durch Proteinasen und Peptidasen im Blut, in Geweben oder anderswo abgebaut werden; diese werden durch die folgenden Beispiele erläutert. Erstens kann eine Inversion des Chiralitätszentrums des Rückgrats, die D-Aminosäurestrukturen zur Folge hat, besonders am N-Terminus zu einer erhöhten Stabilität gegenüber dem proteolytischen Abbau führen, ohne dass die Aktivität nachteilig beeinflusst wird. Ein Beispiel ist in der Veröffentlichung "Tritriated D-ala'-Peptide T Binding", Smith, C.S., et al., Drug Development Res. 15 (1988), S. 371-379, dargestellt. Zweitens kann die cyclische Struktur zur Stabilität beitragen, z. B. als N zu C-Imide und -Lactame zwischen den Ketten (Ede et al., in: Smith und Rivier (Hrsg.), "Peptides: Chemistry and Biology", Escom, Leiden (1991), S. 268-270), und manchmal kann auch die Rezeptorbindung durch die Bildung cyclischer Analoga gesteigert werden. Ein Beispiel hiervon ist in "Confirmationally restricted thymopentin-like compounds", US-Patent 4 457 489 (1985), Goldstein, G., et al., dargestellt. Drittens können durch Einführen von Ketomethylen, Methylsulfid oder retroinversen Bindungen zum Ersetzen von Peptidbindungen, d. h. Vertauschen der CO- und NH-Gruppen, wahrscheinlich sowohl die Stabilität als auch die Wirksamkeit erhöht werden. Ein Beispiel dieser Art ist in der Veröffentlichung "Biologically active retroinverso analogues of thymopentin", Sisto, A., et al., in: Rivier, J. E., und Marshall, G.R., (Hrsg.), "Peptides, Chemistry, Structure and Biology", Escom, Leiden (1990), S. 722-773, dargestellt.
Die Peptide der Erfindung können durch verschiedene Verfahren synthetisiert werden, die im Prinzip bekannt sind, nämlich durch chemische Kupplungsverfahren (vgl. Wunsch, E.: "Methoden der organischen Chemie", Band 15, Band 1 und 2, Synthese von Peptiden, Thieme Verlag, Stuttgart (1974), und Barrany, G.: Marrifield, R. B., "The Peptides", Hrsg. E. Gross, J. Meienhofer, Bd. 2, Kapitel 1, S. 1-284, Academic Press (1980)) oder durch enzymatische Kupplungsverfahren (vgl. Widmer, F., Johansen, J.T., Carlsberg Res. Commun., Bd. 44, (1979), S. 37-46; und Kullmann, W.: "Enzymatic Peptide Synthesis", CRC Press Inc., Boca Raton, FI., (1987); und Widmer, F., Johansen, J.T., in "Synthetic Pepides in Biology and Medicines", Hrsg., Alitalo, K., Partanen, P., Vatieri, A., S. 79-86, Elsevier, Amsterdam (1985)) oder durch eine Kombination von chemischen und enzymatischen Verfahren, sofern dies für die Gestaltung und die Wirtschaftlichkeit des Verfahrens vorteilhaft ist.
Ein Cysteinrest kann sowohl am Amino- als auch am Carboxyende des Peptids angehängt werden, wodurch die Kristallisation des Peptids durch die Bildung einer Disulfidbindung ermöglicht wird.
Modifikationen der Peptide der vorliegenden Erfindung, die die biologische Aktivität nicht abschwächen, liegen im Umfang der vorliegenden Erfindung.
Es gibt zahlreiche Beispiele, die die Fähigkeit von anti-idiotypischen Antikörpern (anti-Id-Abs) eines Antigens, das mit tierischen Zellen und mit Komponenten von Zellen interagiert, erläutern, die darin besteht, wie dieses Antigen zu funktionieren. Somit können anti-Id-Abs eines Peptidhormon-Antigens eine hormonartige Aktivität aufweisen und genauso wie der Rezeptor spezifisch mit einem Mediator interagieren. (Eine Übersicht dieser Eigenschaften findet sich in: Gaulton, G.N., und Greane, M.I.; "Idiotypic mimicry of biological receptors", Ann. Rev. Immunol., Bd. 4, (1986), S. 253-280; Sege, K., und Peterson, P.A., "Use of anti-idiotypic antibodies as cell surface receptor probes", Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 75 (1978), S. 2443-2447).
Aus der Ähnlichkeit in der Funktion von anti-Id-Ab und Antigen ist zu erwarten, dass anti-Id-Abs, die das innere Abbild eines Antigens darstellen, die Immunität gegen ein solches Antigen induzieren können (Vgl. die Übersicht in Hiernaux, J.R., "Idiotypic vaccines and infectious diseases", Infect. Immun. Bd. 56 (1988), S. 1407- 1413).
Deshalb ist es möglich, anti-idiotypische Antikörper der Peptide der vorliegenden Erfindung herzustellen, die eine ähnliche biologische Aktivität aufweisen.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung auch anti-idiotypische Antikörper der Peptide der vorliegenden Erfindung bereit, wobei der anti-idiotypische Antikörper die Toxizität des TNF, nicht jedoch seine Bindung an den Rezeptor hemmen kann.
Die jeweilige Spezifität von Antikörpern liegt in den Strukturen der Peptidschleifen, welche die Komplementarität-bestimmenden Regionen (CDR5) der variablen Domänen der Antikörper ausmachen. Da im allgemeinen die Aminosäuresequenzen der CDR-Peptide eines anti-Id-Ab nicht identisch sind mit der Aminosäuresequenz des Peptidantigens, von dem er ursprünglich hergeleitet wurde, oder nicht einmal ähnlich hierzu sind, folgt hieraus, dass Peptide, deren Aminosäuresequenzen ziemlich verschieden sind, unter bestimmten Umständen eine sehr ähnliche dreidimensionale Strukturen einnehmen können. Das Konzept dieses Peptidtyps ist bekannt, der von Geyson als eine "funktional äquivalente Sequenz" oder Mimotop bezeichnet wurde (Geyson, H.M., et al., "Strategies for epitope analysis using peptide synthesis", J. Immun. Methods Bd. 102 (1987), S. 259-274).
Darüber hinaus kann die dreidimensionale Struktur und Funktion der biologisch aktiven Peptide durch andere Verbindungen simuliert werden, von denen einige nicht einmal peptidischer Natur sind, jedoch trotzdem die Aktivität solcher Peptide nachahmen. Dieses Fachgebiet wird in einer Übersicht von Goodman, M., (1990), zusammengefasst ("Synthesis, Spectroscopy and computer simulations in peptide research", Proc. 11 th. American Peptide Symposium, veröffentlicht in: Peptides- Chemistry, Structure and Biology, S. 3-29, Hrsg.: Rivier, J.E., und Marshall, G.R., Publisher Escom).
Außerdem ist es möglich, Peptid- und Nicht-Peptid-Verbindungen herzustellen, die die gleiche dreidimensionale Struktur wie die Peptide der vorliegenden Erfindung aufweisen. Diese "funktional äquivalenten Strukturen" oder "Peptidnachahmer" werden mit Antikörpern reagieren, die gegen das Peptid der vorliegenden Erfindung gerichtet sind, und sind möglicherweise auch in der Lage, die Toxizität von TNF zu hemmen.
Demgemäß stellt eine weitere Ausführungsform der vorliegenden Erfindung eine Verbindung bereit, deren dreidimensionale Struktur wie eine Pharmakophore zur dreidimensionalen Struktur der erfindungsgemäßen Peptide ähnlich ist, wobei die Verbindung dadurch gekennzeichnet ist, dass sie mit Antikörpern reagiert, die gegen die Peptide der vorliegenden Erfindung gerichtet sind, und dass die Verbindung in der Lage ist, die Toxizität von TNF zu hemmen.
Mehr Einzelheiten bezüglich Pharmakophoren finden sich in Bolin et al., S. 150, Polinsky et al., S. 287, und Smith et al., S. 485, in: Smith und Rivier (Hrsg.), "Peptides: Chemistry and Biology", Escom, Leiden (1991).
Alle Moleküle (Proteine, Peptide usw.) können durch herkömmliche chemische Verfahren wie hier beschrieben oder durch DNA-Rekombinationsverfahren hergestellt werden.
Die Erfindung stellt außerdem DNA-Moleküle, die die Liganden gemäß der Erfindung codieren, Vektoren, die sie enthalten, und Wirtszellen bereit, die die Vektoren umfassen und die in der Lage sind, die erfindungsgemäßen Liganden zu exprimieren.
Die Wirtszelle kann eine prokaryotische oder eukaryotische Zelle sein.
Die Erfindung stellt ferner DNA-Moleküle bereit, die mit den vorstehenden DNA-Molekülen hybridisieren und Liganden codieren, die die gleiche Aktivität aufweisen.
Die Erfindung stellt außerdem Arzneimittel bereit, die die vorstehenden Liganden umfassen, die zur Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden können, die durch die Effekte des TNF ausgelöst oder verursacht werden, der entweder endogen produziert oder von außen zugeführt wird.

Kurze Beschreibung der Figuren

In Fig. 1 sind die bakteriellen Konstrukte schematisch dargestellt, die zur Bestimmung der Sequenz verwendet wurden, an die Antikörper der Gruppe-32 binden.
In Fig. 2 ist ein Beispiel der Western-Blot-Analysetechnik dargestellt, durch die die Bindung der Antikörper an die in Fig. 1 gezeigten Konstrukte bestimmt wurde.
Die Fig. 3 und 4 zeigen das Kompetieren synthetischer Peptide, deren Sequenzen die Region des Epitops enthalten, das durch die monoclonalen Antikörper der Gruppe-32 oder von Teilen davon erkannt wird, mit der Bindung eines Antikörpers dieser Gruppe an ein Konstrukt, umfassend einen Teil von TBP-II, in dem dieses Epitop vorliegt.
Fig. 5 zeigt die Nucleotidsequenz und die hergeleitete Aminosäuresequenz des p75-Rezeptors. TBP-II- und Transmembran-Domänen sind mit Kästchen versehen und schattiert. Die Region, die durch die Gruppe-32-Antikörper erkannt wird, ist unterstrichen.
Fig. 6 zeigt das Muster des Schutzes von HeLa p75.3-Zellen (wie nachstehend definiert) vor der TNF-Cytotoxizität durch verschiedene monoclonale Antikörper gegen p75-TNF-R und Fragmente davon.
Fig. 7 zeigt die Effekte eines monoclonalen Antikörpers gegen TBP-I und verschiedener monoclonaler Antikörper gegen TBP-II, wie effektiv U937-Zellen durch TNF abgetötet werden.
Die Fig. 8a und 8b zeigen die Effekte des monoclonalen Antikörpers 70 und von Fab-Fragmenten davon auf die Bindung von TNF an HeLa p75.3-Zellen bzw. U937-Zellen.
Fig. 9 zeigt einen Vergleich der Effekte des Antikörpers Nr. 32 mit anderen Antikörpern gegen den p75-TNF-R auf die TNF-Bindung an HeLa p75.3-Zellen.
Fig. 10 zeigt die Dissoziation von TNF von HeLa p75.3-Zellen in Gegenwart und in Abwesenheit des Antikörpers Nr. 70 und seines monovalenten Fab- Fragments.
Fig. 11 zeigt die Nucleotidsequenz und die hergeleitete Aminosäuresequenz für die CDR-Region der schweren Ketten von drei monoclonalen Antikörpern der Gruppe-32.
Fig. 12 zeigt die Nucleotidsequenz und die hergeleitete Aminosäuresequenz für die CDR-Region der leichten Ketten des monoclonalen Antikörpers Nr. 32.
Fig. 13 zeigt die Sequenzhomologie zwischen verschiedenen Mitgliedern der TNF/NGF-Rezeptorfamilie.

Genaue Beschreibung der Erfindung

TNF ist, wie vorstehend schon festgestellt, ein Cytokin, das seine Wirkung auf die Zelifunktion in Gang setzt, indem es an zwei spezifische Zelloberflächen- Rezeptoren bindet: an den p55- und an den p75-Rezeptor. Seine Wirkung kann durch die Bindung von Antikörpern an die extrazelluläre Domäne dieser Rezeptoren gestört werden. Wie jedoch in mehreren Studien gezeigt wurde, können Antikörper, die an die extrazelluläre Domäne der Rezeptoren binden, auch die Effekte von TNF auslösen, indem sie die Aggregation der p55-Rezeptoren induzieren und indem sie außerdem die Aggregation der p75-Rezeptoren induzieren (Engelmann et al., J. Biol. Chem. 265, Nr. 24 (1990), 14497-14504; und unveröffentlichte Ergebnisse).
Wir fanden, dass bestimmte Antikörper, die an eine bestimmte Region im p75- Rezeptor binden, das Signal für die cytotoxische bzw. zellabtötende Wirkung durch diesen Rezeptor nicht nachahmen, sondern vielmehr hemmen. Dies erfolgt trotz der Tatsache, dass diese Antikörper, wenn sie an diese Region binden, die TNF-Bindung nicht blockieren, sondern sie vielmehr in einem gewissen Ausmaß erhöhen.
Die vorliegende Erfindung zeigt, dass diese Region, die durch diese Antikörper erkannt wird, die wir die Gruppe-32 nennen, die Region ist, die sich zwischen den zwei C-terminalen Cysteinresten in der extrazellulären Domäne des p75-Rezeptors erstreckt, plus eine zusätzliche Aminosäure, thr179. Diese Region wird in der vorliegenden Beschreibung der Einfachheit halber als "Cysteinschleife" bezeichnet.
Die vorliegende Erfindung stellt auch die Nucleotidsequenzen und hergeleiteten Aminosäuresequenzen in der CDR der schweren Kette der drei zu dieser Gruppe gehörenden Antikörper bereit, nämlich Nr. 32, 57 und 70. Eine bemerkenswerte Ähnlichkeit zwischen der Sequenz der Aminosäuren in der CDR der schweren Kette der Antikörper Nr. 32 und 70 wurde gefunden; dies zeigt, dass die Aminosäuresequenz in der CDR der schweren Kette dieser zwei Antikörper nahe beim Optimum liegt, das für die Bindung an das Antigen erforderlich ist. Außerdem stellt die Erfindung die Nucleotidsequenz und die hergeleitete Aminosäuresequenz der leichten Kette des Antikörpers Nr. 32 bereit. Aufgrund dieser Sequenzen können Verbindungen mit kleinem Molekulargewicht, Peptide oder nachahmende Verbindungen definiert werden, die die Funktion der p75-Rezeptoren hemmen.
Nachdem gezeigt wurde, dass solche kleinen Verbindungen dies tatsächlich erreichen können und dass keine Aggregation von Rezeptoren erforderlich ist, von der man weiß, dass Antikörper dies bewirken können, wurde gefunden, dass auch monovalente F(ab)-Fragmente der Antikörper der Gruppe-32 das Signal für die Toxizität durch den p75-Rezeptor hemmen, wenn es durch TNF ausgelöst wird.
Aufgrund dieser Ergebnisse und der großen Ähnlichkeit der Rezeptoren in dieser bestimmten Familie betrifft diese Erfindung auch Mittel, die an die C-terminale Cysteinschleife in der extrazellulären Domäne der verschiedenen anderen Mitglieder der TNF/NGF-Rezeptorfamilie binden und die Funktion der anderen Rezeptoren modulieren, ähnlich wie die TNF-Funktion moduliert wird. In dieser Rezeptorfamilie sind die Lage von Cystein in der extrazellulären Domäne und der Abstand hochkonserviert. Bestimmte Mitglieder dieser Familie, z. B. CDw40, zeigen eine besonders große Ähnlichkeit zu dem p75-Rezeptor. Insbesondere bei solchen Rezeptoren kann man davon ausgehen, dass Mittel, die an diese Regionen binden, Wirkungen zeigen, die ähnlich sind wie die Wirkung der Antikörper Nr. 32 auf den p75-Rezeptor.
Wie vorstehend angegeben, können die Liganden gemäß der vorliegenden Erfindung Proteine, Peptide, Immunadhäsine, Antikörper oder andere organische Verbindungen umfassen.
Proteine können aus Zellextrakten isoliert werden, z. B. durch Ligand- Affinitätsreinigung, wobei als Ligand ein Molekül verwendet wird, das eine Aminosäuresequenz aufweist, die im wesentlichen dem vorstehend erwähnten Abschnitt entspricht.
Peptide können hergestellt werden, indem zuerst Ziel-Peptide synthetisiert werden, die dem Aminosäureabschnitt des TNF-R entsprechen, bei dem gemäß der Erfindung gefunden wurde, dass er an die Liganden bindet, die die Effekte von TNF hemmen. Danach werden die Peptidbanken nach anderen Liganden abgesucht, die hieran binden. Die Peptide, die an diese Regionen binden, werden weiter nach denjenigen abgesucht, die auch an TNF-R binden. Schließlich werden die Peptide, die zu einer Hochaffinitätsbindung mit sowohl den Zielpeptiden als auch dem TNF-R in der Lage sind, nach der Fähigkeit des Peptids abgesucht, die gewünschte biologische Wirkung zu zeigen.
In ähnlicher Weise werden verschiedene organische Moleküle, einschließlich Arzneistoffe, die für andere Indikationen bekannt sind, auf ihre Fähigkeit abgesucht, an den Aminosäureabschnitt zu binden, der sich für die Hemmung der Effekte von TNF als kritisch erwiesen hat.
Zusätzlich zu den organischen Molekülen werden außerdem Brühen aus biologischem Material wie Bakterienkulturprodukte, Pilzkulturprodukte, eukaryotische Kulturprodukte und rohe Cytokinpräparate mit den vorstehend beschriebenen Aminosäure-Zielpeptiden abgesucht. Die durch dieses Absuchen erhaltenen Moleküle werden anschließend weiter auf ihre Fähigkeit abgesucht, die gewünschte biologische Funktion durchzuführen.
Andererseits werden Moleküle entworfen, die der Quartärstruktur des Aminosäurebereichs im Rezeptor räumlich entsprechen.
Die durch die vorstehenden Verfahren erhaltenen aktiven Moleküle können, sofern sie biologische Substanzen sind, auch durch biotechnische Verfahren hergestellt werden. Auf diese Weise wird eine massive Produktion dieser Moleküle möglich gemacht. Peptide können entweder durch bekannte Verfahren der Peptidsynthese oder unter Verwendung von Expressionvektoren hergestellt werden, die DNA- Sequenzen enthalten, die sie codieren. Andere Moleküle, wenn sie auf enzymatischem Weg hergestellt werden, können gebildet werden, indem die beteiligten Enzyme in den geeigneten gezüchteten Zellen produziert werden.
Arzneimittel, die die Liganden der vorliegenden Erfindung enthalten, können verwendet werden, um den Effekten von TNF in Säugern entgegenzuwirken.
Solche Mittel umfassen die erfindungsgemäßen Liganden als Wirkstoff. Die Arzneimittel sind für Zustände indiziert wie septischer Schock, Kachexie, Graftversus-Host-Reaktionen, Autoimmunkrankheiten wie rheumatoide Arthritis und dergleichen. Sie sind auch indiziert, um z. B. einer Überdosis eines von außen zugeführten TNF entgegenzuwirken.
Die Arzneimittel gemäß der Erfindung werden abhängig von dem zu behandelnden Zustand über die anerkannten Verabreichungswege appliziert. Z. B. ist im Fall eines septischen Schocks die intravenöse Verabreichung bevorzugt. Die Arzneimittel können auch kontinuierlich, d. h. durch Infusion, oder oral appliziert werden. Die Formulierung und Dosis hängt von der zu behandelnden Krankheit, der Verabreichungsroute und dem Zustand und Körpergewicht des Patienten ab, der behandelt werden soll. Der behandelnde Arzt kann die genaue Dosis bestimmen.
Die Arzneimittel gemäß der Erfindung werden auf herkömmliche Art hergestellt, z. B. indem der Wirkstoff mit pharmazeutisch und physiologisch verträglichen Trägern und/oder Stabilisatoren und/oder Excipienten, wie im jeweiligen Fall gewünscht, gemischt und in einer bestimmten Dosierungsform, z. B. durch Gefriertrocknung in Dosisgläschen, zubereitet wird.
Der hier verwendete Begriff "Muteine" bezieht sich auf Analoga der Proteine, Peptide und dergleichen, in denen ein Aminosäurerest oder mehrere Aminosäurereste des Proteins, das, wie gefunden wurde, bindet, durch unterschiedliche Aminosäurereste ersetzt ist/sind oder fehlt/fehlen oder in denen ein Aminosäurerest oder mehrere Aminosäurereste zu der ursprünglichen Sequenz zugefügt wurden, ohne dass die Aktivität des resultierenden Produkts deutlich verändert wird. Diese Muteine werden durch bekannte Synthese- und/oder ortsgerichtete Mutagenesetechniken oder durch eine beliebige andere bekannte, hierfür geeignete Technik hergestellt.
Der Begriff "fusioniertes Protein" bezieht sich auf ein Polypeptid, das die Liganden oder ein Mutein davon umfasst, die/das mit einem anderen Protein verknüpft sind/ist, das eine verlängerte Verweilzeit in Körperflüssigkeiten aufweist. Die Liganden können auf diese Weise mit einem anderen Protein, Polypeptid oder dergleichen verknüpft sein, z. B. einem Immunglobulin oder einem Fragment davon.
Der Begriff "Salze" bezieht sich hier sowohl auf Salze von Carboxylgruppen als auch auf Säureadditionssalze von Aminogruppen der Liganden, Muteine und fusionierten Proteine davon. Salze einer Carboxylgruppe können durch Verfahren, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden und umfassen anorganische Salze, z. B. Natrium-, Calcium-, Ammonium, Eisen- oder Zinksalze und dergleichen, sowie Salze mit organischen Basen, z. B. Salze, die mit Aminen wie Triethanolamin, Arginin oder Lysin, Piperidin, Procain und dergleichen gebildet werden. Säureadditionssalze umfassen z. B. Salze mit Mineralsäuren wie z. B. Salzsäure oder Schwefelsäure, und Salze mit organischen Säuren wie z. B. Essigsäure oder Oxalsäure.
Der hier verwendete Begriff "funktionale Derivate" bezieht sich auf Derivate der Liganden und ihrer fusionierten Proteine und Muteine, die aus den funktionalen Gruppen, die als Seitenketten auf den Resten vorliegen, oder den N- oder Cterminalen Gruppen durch Techniken, die dem Fachmann bekannt sind, hergestellt werden können, und sie sind in der Erfindung eingeschlossen, so lange sie pharmazeutisch verträglich bleiben, d. h. sie zerstören nicht die Aktivität des Liganden und übertragen auf die Zusammensetzungen, die sie enthalten, keine toxischen Eigenschaften. Diese Derivate können z. B. Polyethylenglykol-Seitenketten umfassen, die antigene Stellen maskieren und die Verweilzeit der Liganden in Körperflüssigkeiten verlängern können. Andere Derivate umfassen aliphatische Ester der Carboxylgruppen, Amide der Carboxylgruppen durch Reaktion mit Ammoniak oder mit primären oder sekundären Aminen, N-Acylderivate von freien Aminogruppen der Aminosäurereste, gebildet mit Acylresten (z. B. Alkanoyl- oder carbocyclischen Aroylresten) oder O-Acyl-Derivate freier Hydroxylgruppen (z. B. die von Seryl- oder Threonylgruppen), gebildet mit Acylresten.
Die Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert, die die Erfindung in keiner Weise einschränken sollen.

Beispiel 1

Bestimmung der Region des p75-Rezeptors, die durch die Gruppe-32-Antikörper erkannt wird

In Beispiel 5 der Hauptanmeldung wurden mehrere Konstrukte durch Expression in E. coli hergestellt und daraus gefolgert, dass das durch den Antikörper Nr. 32 erkannte Epitop zwischen den Aminosäuren 125 und 182 liegt.
Wir haben nun weitere Konstrukte hergestellt, wobei die vollständige Liste der untersuchten Konstrukte und außerdem ihre Beziehung zur Struktur des löslichen p75R in Fig. 1 dargestellt sind. Die Konstrukte, die durch die Antikörper der Gruppe- 32 erkannt werden, sind als fette Ziffern angegeben und als durchgezogene Linien dargestellt. Die Konstrukte, die nicht mit diesen Antikörpern reagieren, sind als dünne Ziffern angegeben und als unterbrochene Linien dargestellt. Alle Konstrukte werden durch ihre N- und C-terminalen Aminosäurereste identifiziert.
Fig. 1, die schematische Darstellung der Konstrukte, zeigt die Aminosäuresequenz eines Teils des p75-TNF-R, wobei die Regionen von Kästchen umgeben sind, die der löslichen Form des Rezeptors und der Transmembranregion entsprechen. Aminosäurereste, die zwischen Mensch und Maus konserviert sind, sind unterstrichen.
Die in Fig. 2 dargestellte Western-Blot-Analyse der Bindung der Gruppe-32- Antikörper an einige der in Fig. 1 gezeigten Konstrukte wurde wie in Beispiel 5 der Hauptanmeldung durchgeführt.

Beispiel 2

Kompetieren zwischen Gruppe-32-Antikörpern und synthetischen Peptiden um die Bindung an die extrazelluläre Domäne des p75-TNF-R

Eine Reihe synthetischer Peptide, deren Sequenzen verschiedenen Teilen der Region auf dem TNF-R entsprechen, von der vermutet wird, dass sie das Gruppe- 32-Epitop darstellt, wurden synthetisiert (Reste 160-179, 162-179, 163-179, 165-179 und 167-179). Die Peptide wurden in einem ELISA-Test auf ihre Fähigkeit untersucht, um die Bindung an die Antikörper der Gruppe-32 zu kompetieren.
Ein bakteriell hergestelltes Konstrukt, das den Aminosäuren 3 bis 180 des p75-TNF-R entspricht (p75-Konstrukt in Fig. 3), wurde mit den angegebenen Konzentrationen auf PVC-Platten aufgetragen, die mit Antikörper-32 vorbeschichtet waren, worauf die Zugabe des Kaninchen-Antiserums gegen TBP-II (löslicher p75-TNF- R) folgte. Die Menge des an die Platte gebundenen Kaninchen-Antiserums wurde bestimmt, indem ein gegen Kaninchen-Immunglobulin gerichtetes Ziegen-Antiserum, das mit Meerrettich-Peroxidase verknüpft war, zugegeben und die Menge des an die Platte gebundenen Ziegen-Immunglobulins enzymatisch ermittelt wurde. In Fig. 3 sind die Ergebnisse eines Experiments dargestellt, in dem gefunden wurde, dass ein synthetisches Peptid, das den Aminosäureresten 163 bis 179 entspricht, um die Bindung kompetierte.
In Fig. 4 sind die Ergebnisse eines Experiments dargestellt, in dem ein Fusionsprotein aus Maltose-bindendem Protein (MBP) mit der Sequenz der Aminosäuren von 125 bis 192 des p75-Rezeptors verwendet wurde, um PVC-Platten mit einer Konzentration von 10 ug/ml zu beschichten, anschließend wurde der mcAb Nr. 32 mit einer Konzentration von 2 ug/ml zusammen mit den angegebenen Konzentrationen unterschiedlicher Proteine zugegeben:
DW16 - Aminosäuren 165-179,
DW18 - Aminosäuren 163-179,
DW19 - Aminosäuren 162-179,
DW21 - Aminosäuren 160-179.
Danach wurde die Reaktion durch Zugabe von Ziegen-anti-Maus, gekoppelt an Meerrettich-Peroxidase, entwickelt. Wie in Fig. 4 zu sehen ist, konnte eine deutliche Hemmung der Erkennung des Fusionsproteins durch den monoclonalen Antikörper Nr. 32 nur mit den drei Peptiden festgestellt werden, die das ganze Epitop abdecken.

Beispiel 3

Mutationsstudie des 32-Epitops

Das Ersetzen von Cystein-178 durch Alanin in einem rekombinanten Peptid, dessen Sequenz den Aminosäuren 3 bis 181 entspricht, führte dazu, dass dieses Protein durch die Gruppe-32-Antikörper nicht mehr erkannt werden konnte. Dieses Ergebnis legt nahe, dass, damit eine Erkennung durch diese Antikörper erfolgt, die zwei Cysteinreste in der Gruppe-32-Epitopregion frei sein müssen, so dass sie miteinander interagieren können; d. h. dass die Struktur, die von den Antikörpern erkannt wird, eine Schleife ist. Zur Bestätigung dieser Feststellung fanden wir, dass eine Reduktion des Peptids durch Dithiothreit vor der SDS-PAGE und der Western-Blot- Analyse die Effektivität seiner Erkennung durch die Gruppe-32-Antikörper etwas herabsetzte und dass eine Reduktion durch Dithiothreit und eine anschließende Alkylierung mit Iodacetimid dazu führte, dass es durch die Antikörper überhaupt nicht mehr erkannt werden konnte.

Beispiel 4

Effekte verschiedener Antikörper und Fragmente davon auf die TNF-Toxizität

(a) Um die Funktion der Gruppe-32-Antikörper zu vergleichen, und zwar nicht nur mit Antikörpern, die an den Rezeptor stromaufwärts der 32-Epitopregion binden (wie von den meisten anti-TBP-II-Antikörpern zu erwarten ist), sondern auch mit Antikörpern, die an den Rezeptor stromabwärts dieser Epitopregion binden, immunisierten wir Mäuse mit einem chimären Konstrukt, das der Region entsprach, die sich stromabwärts des 32-Epitops erstreckte (Aminosäuren 181 bis 235; die "Stiel"-Region), verknüpft mit MBP. Die Kaninchen entwickelten Antikörper, die an die Chimären, mit denen sie immunisiert worden waren, und außerdem an den intakten p55-TNF- Rezeptor banden. Diese Antikörper wurden affinitätsgereinigt, indem sie an das chimäre Protein, gekoppelt an eine Afft-Gel-10-Säule, gebunden wurden, und auf eine Wirkung auf die TNF-Funktion und Bindung getestet. (Das affinitätsgereinigte Antikörperpräparat wurde mit "318" bezeichnet).
(b) Alle monoclonalen anti-TBP-II-Antikörper und außerdem die affinitätsgereinigten anti-Stiel-Antikörper wurden auf eine Wirkung auf die TNF-Toxizität in Clonen der epitheloiden HeLa-Zellen getestet, die dazu gebracht wurden, dass sie die p75- Rezeptoren überexprimierten (durch ihre Transfektion mit der cDNA des p75- Rezeptors. Den bestimmten überexprimierenden Clon, der in den hier dargestellten Experimenten verwendet wurde, bezeichneten wir mit HeLa p75.3). Die einzigen Antikörper, die die TNF-Funktion hemmten, waren die Antikörper des Gruppe-32- Epitops; und dies trotz der Tatsache, dass sie die TNF-Bindung an den Rezeptor nicht hemmen, jedoch etwas steigern (Fig. 8 und 9). Zwei der anderen anti-TBP- II-Antikörper (Nr. 67, Fig. 6 und 9, und Nr. 81) hatten eine sehr geringe Wirkung auf die TNF-Bindung an den Rezeptor oder auf die TNF-Toxizität. Alle anderen monoclonalen anti-TBP-II-Antikörper verstärkten die zellabtötende Wirkung von TNF etwas, obwohl sie mit der TNF-Bindung kompetierten (z. B. der Antikörper 36 der Fig. 6 und 9). Die "anti-Stiel"-Antikörper zeigten eine sehr geringe Wirkung auf die Bindung oder Funktion von TNF (Fig. 6 und 9). Wenn man zu den Zellen anti- Stiel-Antikörper zusammen mit Antikörpern der Gruppe-32 zugab, wurde die Hemmwirkung der Letzteren auf die TNF-Funktion nicht gestört. (c) Die gleiche Reihe von Antikörpern wurde auf eine Wirkung auf das Abtöten der Myelocyt-Zellen U937 durch TNF getestet. Im Gegensatz zur nachahmenden Wirkung der anti-TNF-Rezeptor-Antikörper in den HeLa-Zellen, wurde weder bei antip55- noch bei anti-p75-Rezeptor-Antikörpern gefunden, dass sie unter den Bedingungen des durchgeführten Experiments die zellabtötende Wirkung von TNF auf die U937-Zellen nachahmten. Da sie keine Fähigkeit zum Nachahmen der TNF-Wirkung besitzen, wirken alle monoclonalen Antikörper, die um die TNF-Bindung entweder an den p75-Rezeptor (z. B. die Antikörper 14, 31 und 36 von Fig. 9) oder an den p55- Rezeptor (z. B. Antikörper Nr. 18 von Fig. 7) kompetieren, auf die TNF-Effekte inhibitorisch. Antikörper, die keine Wirkung auf die TNF-Bindung an die Rezeptoren aufwiesen (z. B. die Nr. 67 von Fig. 9), hatten keinen Effekt auf die TNF-Funktion (Fig. 6). Die Gruppe-32-Antikörper waren darin einzigartig, dass sie eine Fähigkeit zur Hemmung der TNF-Funktion in dieser Zelle besaßen, ohne eine Hemmwirkung auf die TNF-Bindung zu zeigen. Die Antikörper steigerten tatsächlich die Bindung von TNF an diese Zellen, viel mehr als in den HeLa-p75.3-Zellen (Fig. 8). Die Hemmwirkung der Gruppe-32-Antikörper war zu der von Antikörpern additiv, die die TNF- Bindung an den p55-Rezeptor blockieren (z. B. die Kombination 18/32 in Fig. 7).

Beispiel 5

Effekt von Gruppe-32-Antikörpern und monovalenten Fab-Fracimenten davon auf die Dissoziation von TNF von den TNF-Rs

Um den Mechanismus zu untersuchen, durch den die Gruppe-32-Antikörper eine Steigerung der TNF-Bindung bewirken, verglichen wir die Rate der TNF- Dissoziation von HeLa-p75.3-Zellen in Gegenwart und in Abwesenheit dieser Antikörper.
Ein radiomarkierter TNF wurde zu konfluenten HeLa-p75.3-Zellen zugegeben, und die Zellen wurden zwei Stunden auf Eis inkubiert. Ungebundener Ligand wurde ausgewaschen und 1 ml Bindungspuffer, enthalten 500 ng/ml kalten TNF, wurde zu den Vertiefungen in vierfacher Ausführung über die angegebenen Zeiträume auf Eis zugegeben. Danach wurden die Vertiefungen erneut mit kalter PBS gewaschen und die Menge des restlichen Liganden durch Messen der Radioaktivität der Zellen bestimmt, die durch Inkubation mit PBS/EDTA-Lösung von den Platten abgelöst wurden. Die Antikörper wurden im ganzen Test in einer Konzentration von 10 pg/ml angewendet.
Wie in Fig. 10 erläutert, bewirkten sowohl diese Antikörper als auch ihre monovalenten F(ab)-Fragmente eine Abnahme der Rate der TNF-Dissoziation von den Rezeptoren. Hierdurch wird einerseits eine mögliche Erklärung für die Art und Weise, wie diese Antikörper die Bindung des TNF an seinen Rezeptoren beeinträchtigen, gegeben, und andererseits wird durch dieses Ergebnis eine weitere Anwendungsmöglichkeit dieser Wirkung gezeigt. Lösliche Formen der p75-TNF-Rs oder des p55- Rezeptors oder eines anderen Mitglieds der TNF/BGF-Rezeptorfamilie, in denen eine Konformationsänderung wie beim Gruppe-32-Antikörper erfolgen wird, werden als bessere Inhibitoren des entsprechenden Agonisten dienen.

Beispiel 6

Bestimmung von Nucleotidseguenzen und hergeleiteten Aminosäureseguenzen in der CDR der schweren Ketten der monoclonalen Antikörper Nr. 32. 57 und 70 (Gruppe-32-Antikörper) und in der CDR der leichten (kahpa)-Kette des Antikörpers Nr. 32

Um die Nucleotidsequenzen der CDR der schweren Ketten der Antikörper Nr. 32, 57 und 70 zu bestimmen, wurde die Gesamt-RNA aus den entsprechenden Hybridomzellen durch das Promega-Protokoll unter Verwendung von Guanidiniumthioisocyanat isoliert. Die Erststrang-cDNA-Synthese auf dieser RNA erfolgte, indem die AMV-reverse Transkriptase und als Primer entweder Oligo(dT)15-18 oder ein Oligonucleotid verwendet wurden, das zur konstanten Region der schweren Kette des murinen IgG komplementär war. Die cDNA wurde als Matrize für die PCR eingesetzt, wobei ein partiell degenerierter 5'-Primer verwendet wurde. 40 Zyklen der PCR wurden durchgeführt. Die PCR-Produkte mit der Größe von etwa 350 bp wurden elektrophoretisch gereinigt und in den Bluescript-Vektor cloniert. Clone, die Inserteionen mit der richtigen Größe enthielten, wurden sequenziert. Auf ähnliche Weise wurde die doppelsträngige cDNA der CDR-Region der leichten Kette des Antikörpers Nr. 32 synthetisiert.
Die Nucleotidsequenzen, die durch das Didesoxy-Kettenabbruchverfahren erhalten wurden, und die hieraus hergeleiteten Aminosäuresequenzen sind in den Fig. 11 und 12 dargestellt. Die CDR1-, 2- und 3-Regionen sind unterstrichen.

Beispiel 7

Herstellung von scFv der Gruppe-32-Antikörper

Die clonierten variablen Regionen der schweren und leichten Ketten der monoclonalen Antikörper der Gruppe-32 werden mit einem Linker in einer Länge von 15 Aminosäuren verknüpft und in einen kommerziellen Expressionvektor eingeführt. Der Vektor enthält einen Promotor, z. B. lac, eine Leader-Sequenz, z. B. pel-B, und außerdem eine Sequenz, die ein kleines Peptid codiert (Marker-Peptid), gegen das ein monoclonaler Antikörper im Handel verfügbar ist. Das Plasmid wird nun in E. coli eingeführt, und die Bakterien werden bis zu O D. von 0,5 bis 1,0 gezüchtet. Die Expression von scFv wird durch Zugabe von IPTG induziert und das Wachstum weitere 6 bis 24 Stunden fortgesetzt. Der lösliche scFv-Marker-Komplex wird anschließend aus dem Kulturmedium durch Immunaffinitätsreinigung unter Verwendung des monoclonalen Antikörpers gegen den Mrker isoliert und anschließend auf einer Metallaffinitäts-Säule gereinigt.
Jegliches innerhalb der Bakterien akkumulierendes scFv wird durch Isolieren und wiederholtes Waschen der Einschlusskörper gereinigt, worauf das Solubilisieren durch z. B. Harnstoff oder Guanidinium und das anschließende Renaturieren folgen.
Andere Möglichkeiten bestehen darin, ein Oligohistidin als Marker zu verwenden, anstelle von Lac einen stärkeren Promotor, d. h. T7, einzusetzen, den Vektor ohne die Leader-Sequenz zu konstruieren oder eine Sequenz, die einen "Schwanz" von irrelevanten Sequenzen codiert, in den Vektor am 5'-Ende des scFv einzuführen. Dieser "Schwanz" sollte nicht biologisch aktiv sein, da sein einziger Zweck darin besteht, ein längeres Molekül als das native scFv herzustellen, so dass eine längere Verweilzeit im Körper erhalten wird.

Beispiel 8

Fig. 13 zeigt die inneren Cystein-reichen Wiederholungen in den extrazellulären Domänen der zwei TNF-Rs und ihr Ausrichten mit den homologen Wiederholungen in der extrazellulären Domäne des menschlichen FAS-, Nervenwachstumsfaktor (NGF)-Rezeptors und CDw40, und außerdem des Ratten-Ox40. Die Aminosäuresequenzen (Ein-Buchstaben-Symbole) sind auf maximale Homologie ausgerichtet. Die Positionen der Aminosäuren innerhalb der Rezeptoren sind am linken Rand angegeben.

Beispiel 9

Herstellen rekombinanter DNA-Moleküle, die Nucleotidseauenzen umfassen, die die aktiven Peptide und andere Moleküle codieren, und ihre Expression

Die Peptide und andere Moleküle können auch durch gentechnische Verfahren hergestellt werden, und ihre Herstellung umfasst alle Hilfsmittel, die bei diesen Techniken eingesetzt werden. Auf diese Weise werden DNA-Moleküle bereitgestellt, die die Nucleotidsequenz umfassen, die solche Peptide und andere biologische Moleküle codiert. Diese DNA-Moleküle können genomische DNA, cDNA, synthetische DNA und eine Kombination davon sein.
Die DNA-Moleküle, die solche Peptide und Moleküle codieren, werden durch herkömmliche Verfahren hergestellt, sobald die Aminosäuresequenz dieser Peptide und anderer Moleküle bestimmt wurde.
Die Expression der rekombinanten Proteine kann in eukaryotischen Zellen, Bakterien oder Hefen erfolgen, wobei die geeigneten Expressionvektoren eingesetzt werden. Jedes Verfahren kann verwendet werden, das dem Fachmann bekannt ist.
Z. B. werden die durch die vorstehenden Verfahren erhaltenen DNA-Moleküle, die die Peptide oder anderen Moleküle codieren, in geeignet konstruierte Expressionsvektoren eingefügt, wobei Techniken verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind (vgl. Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor (1982)). Doppelsträngige cDNA wird mit Plasmidvektoren durch homopolymeres Tailing oder durch Restriktions- Verknüpfung unter Verwendung synthetischer DNA-Linker oder Techniken der Ligierung mit glatten Enden verknüpft. DNA-Ligasen werden eingesetzt, um die DNA- Moleküle zu verknüpfen, wobei eine unerwünschte Kupplung durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase verhindert wird.
Um eine gewünschte biologische Substanz exprimieren zu können, d. h. ein Peptid oder Protein (nachstehend der Einfachheit halber "Protein"), sollte ein Expressionsvektor auch spezifische Nucleotidsequenzen umfassen, die transkriptionale und translationale regulatorische Informationen enthalten, die mit der DNA, die das gewünschte Protein codiert, so verknüpft sind, dass die Genexpression und Produktion des Proteins erfolgen kann. Erstens muss vor dem Gen, damit es transkribiert wird, ein Promotor stehen, der von einer RNA-Polymerase erkannt werden kann und an den die Polymerase bindet und auf diese Weise den Transkriptionsprozess in Gang setzt. Verschiedene solche Promotoren werden verwendet, die mit unterschiedlichen Wirksamkeiten arbeiten (starke und schwache Promotoren). Sie sind für prokaryotische und eukaryotische Zellen verschieden.
Die Promotoren, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden können, können entweder konstitutiv sein, z. B. der int-Promotor des Bakteriophagen Lambda, der bla-Promotor des β-Lactamase-Gens von pBR322 und der CAT-Promotor des Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gens von pPR325 usw., oder sie können induzierbar sein, z. B. die prokaryotischen Promotoren, einschließlich der hauptsächlichen rechten und linken Promotoren des Bakteriophagen Lambda (PL und PR), der trp-, recA-, lacZ-, lacI-, ompF- und gal-Promotoren von E. coli oder des trp-lac- Hybridpromotors usw. (Glick, B.R., J. Ind. Microbiol. 1 (1987), 277-282).
Um hohe Genexpressionsraten in prokaryotischen Zellen zu erreichen, ist es zusätzlich zur Verwendung starker Promotoren, um große Mengen an mRNA zu erzeugen, außerdem erforderlich, Ribosomen-Bindungsstellen einzusetzen, um sicherzustellen, dass die mRNA effizient translatiert wird. Ein Beispiel ist die Shine- Dalgarno (SD)-Sequenz, die in geeigneter Entfernung vom Initiationscodon positioniert wird und zu der 3'-terminalen Sequenz der 16S-RNA komplementär ist.
Für eukaryotische Wirte können verschiedene transkriptionale und translationale regulatorische Sequenzen eingesetzt werden, dies hängt von der Art des Wirts ab. Sie können von Viren stammen, z. B. Adenovirus, Rinder-Papillomvirus, Affen- Virus oder dergleichen, wo die regulatorischen Signale mit einem bestimmten Gen assoziiert sind, das eine hohe Expressionsrate aufweist. Beispiele sind der TK- Promotor von Herpes-Virus, der frühe SV40-Promotor, der ga14-Gen-Promotor der Hefe usw.. Transkription-Initiation-regulatorische Signale können ausgewählt werden, die eine Repression und Aktivierung ermöglichen, so dass die Expression der Gene moduliert werden kann.
Das DNA-Molekül, das die Nucleotidsequenz, die die Peptide oder anderen Moleküle der Erfindung codiert, und die funktionell verbundenen transkriptionalen und translationalen Regulationssignale enthält, wird in einen Vektor eingefügt, der die gewünschten Gensequenzen in das Chromosom der Wirtszelle integrieren kann. Damit die Zellen, bei denen die eingeführte DNA stabil in ihre Chromosomen eingebaut vorliegt, selektiert werden können, werden außerdem ein oder mehrere Marker eingeführt, die eine Selektion der Wirtszellen erlauben, welche den Expressionsvektor enthalten. Der Marker kann bewirken, dass ein auxotropher Wirt prototroph wird, dass eine Resistenz gegen ein Biozid, z. B. Antibiotika oder Schwermetalle wie Kupfer, entsteht, oder dergleichen. Das Gen des selektierbaren Markers kann entweder direkt mit den zu exprimierenden DNA-Gensequenzen verknüpft werden, oder es kann in die gleiche Zelle durch Co-Transfektion eingeführt werden. Für eine optimale Synthese einer einzelkettigen Bindungsprotein-mRNA können auch noch weitere Elemente erforderlich sein. Diese Elemente können Spleiß-Signale und außerdem Transkriptions-Promotoren, Enhancer und Terminationssignale umfassen. cDNA- Expressionsvektoren, die solche Elemente umfassen, werden von Okayama, H., Mol. Cell Biol. 3 (1983), 280, beschrieben.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die eingeführten DNA-Moleküle in ein Plasmid oder einen Virusvektor eingebaut, das/der sich in dem Empfängerwirt autonom replizieren kann. Faktoren, die beim Selektieren eines bestimmten Plasmids oder Virusvektors von Wichtigkeit sind, umfassen: die Einfachheit, mit der Empfängerzellen, die den Vektor enthalten, erkannt und von denjenigen Empfängerzellen selektiert werden können, die den Vektor nicht enthalten; die Kopienzahl des Vektors, die in einem bestimmten Wirt gewünscht wird; und die Frage, ob es wünschenswert ist, den Vektor zwischen Wirtszellen verschiedener Arten als "Shuttle"- Vektor verwenden zu können.
Bevorzugte prokaryotische Vektoren umfassen Plasmide, z. B. solche, die sich in E. coli replizieren können, z. B. pBR322, ColE1, pSC101, pACYC 184 usw. (vgl. Maniatis et al., (1982), a.a.O.); Bacillus-Plasmide, z. B. pC194, pC221, pT127 usw. (Gryczan, T., The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY, (1982));
Streptomyces-Plasmide, einschließlich piJ101 (Kendall, K.J., et al., J. Bacteriol. 169 (1987), 4177-4183); Streptomyces-Bakteriophagen, wie φC31 (Chater, K.F., et al., in: Sixth International Symposium on Actinomycetales Biology, (1986)); und Pseudomonas-Plasmide (John, J.F., et al., Rev. Infect. Dis. 8 (1986), 693-704; und Izaki, K., Jpn., J. Bacteriol. 33 (1978), 729-742).
Bevorzugte eukaryotische Plasmide umfassen BPV, Vaccinia, SV40, 2- Mikron-Ring usw. oder ihre Derivate. Solche Plasmide sind dem Fachmann bekannt (Botstein, D., et al., Miami Wint. Symp. Bd. 19 (1982), S. 265-274; Broach, J.R., in: The Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and lnheritance, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY, S. 445-470 (1981); Broach, J.R., Cell 28 (1982), 203-204; Bollon, D.P., et al., J. Clin. Hematol. Oncol. 10 (1980), 39- 48; Maniatis, T., in: Cell Biology: A Comprehensive Treatise, Bd. 3: Gene Expression, Academic Press, NY, S. 563-608 (1980)).
Sobald der Vektor oder die DNA-Sequenz, der/die das (die) Konstrukt(e) enthält, für die Expression hergestellt wurde, kann das (können die) DNA-Konstrukt(e) durch eines von verschiedenen geeigneten Verfahren in eine geeignete Wirtszelle eingeführt werden: z. B. durch Transformation, Transfektion, Konjugation, Protoplastenfusion, Elektroporation, Calciumphosphat-Fällung, direkte Mikroinjektion usw.
Wirtszellen, die in dieser Erfindung verwendet werden können, können entweder prokaryotische oder eukaryotische Zellen sein. Bevorzugte prokaryotische Wirte umfassen Bakterien wie E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas, Salmonella, Serratia usw.. Der am stärksten bevorzugte prokaryotische Wirt ist E. coli. Bakterielle Wirte von besonderem Interesse umfassen E. coli K12 Stamm 294 (ATCC 31446), E.
coli X1776 (ATCC 31537), E. coli W3110 (F-, Lambda-, prototroph (ATCC 27325)) und andere Enterobakterien wie Salmonella typhimurium oder Serratia marcescens und verschiedene Pseudomonas-Arten. Unter solchen Bedingungen wird das Protein nicht glykosyliert sein. Der prokaryotische Wirt muss mit dem Replikon und den Kontrollsequenzen im Expressionsplasmid kompatibel sein.
Bevorzugte eukaryotische Wirte sind Säugerzellen, z. B. menschliche Zellen, Affenzellen, Mauszellen und Zellen des Ovars des chinesischen Hamsters (CHO), da sie an den Proteinmolekülen posttranslationale Modifikationen bereitstellen, einschließlich einer korrekten Faltung oder Glykosylierung an den korrekten Stellen. Auch Hefezellen können posttranslationale Peptidmodifikationen, einschließlich Glykosylierung, durchführen. Es gibt verschiedene rekombinante DNA-Strategien, bei denen starke Promotorsequenzen und eine hohe Kopienzahl der Plasmide eingesetzt werden, die zur Produktion der gewünschten Proteine in Hefe genutzt werden können. Hefe erkennt Leader-Sequenzen auf clonierten Säugergen-Produkten und sezerniert Peptide, die Leader-Sequenzen enthalten (d. h., Prä-Peptide).
Nach dem Einführen des Vektors werden die Wirtszellen in einem Selektivmedium gezüchtet, auf dem die Vektor-enthaltenden Zellen durch ihr Wachstum selektiert werden können. Die Expression der clonierten Gensequenz(en) führt zur Produktion der gewünschten Proteine.
Die Reinigung der rekombinanten Proteine erfolgt durch eines der Verfahren, die für diesen Zweck bekannt sind.

Angaben zur Hinterlegung

Das Hybridom TBP-II 70-2 wurde bei der Collection National de Cultures de Microorganismes, Institute Pasteur (CNCM) am 12. März 1990 hinterlegt und mit der Nr. I-928 bezeichnet.
Das Hybridom TBP-II 32-5 wurde bei der CNCM m 1. September 1993 hinterlegt und mit der Nr. I-1358 bezeichnet.
Die hinterlegten Hybridome TBP-Il 70-2 und TBP-11 32-5 sind Subclone der Hybridome TBP-II 70 bzw. TBP-II 32 und haben identische Eigenschaften. Die Produktion und die Clonierung dieser Hybridome wurden in EP-A 398327 beschrieben.

Claims

1. Ligand für ein Mitglied der Tumornekrosefaktor-/Nervenwachstumsfaktor (TNF/NGF)-Rezeptorfamilie, welcher an den Bereich der C-terminalen Cysteinschleife dieses Rezeptors bindet und welcher ein Inhibitor des Signals für den cytotoxischen Effekt dieses Rezeptors ist, wobei die Cysteinschleife die Aminosäuresequenz cys-163 bis thr-179 des p75-TNF-R (Fig. 5) oder eine entsprechende C-terminale Cysteinschleife eines anderen Mitglieds der TNF-/ NGF-Rezeptortamilie umfasst.

2. Ligand nach Anspruch 1, umfassend einen Liganden des TNF-R.

3. Ligand nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Rezeptor der p75-TNF-R ist.

4. Ligand nach einem der Ansprüche 1 bis 3, einschließlich der in Fig. 11 dargestellten Aminosäuresequenz für die CDR-Region der schweren Kette des monoclonalen Antikörpers Nr. 32.

5. Ligand nach einem der Ansprüche 1 bis 3, einschließlich der in Fig. 12 dargestellten Aminosäuresequenz für die CDR-Region der leichten Kette des monoclonalen Antikörpers Nr. 32.

6. Ligand nach einem der Ansprüche 1 bis 3, einschließlich der in Fig. 11 dargestellten Aminosäuresequenz für die CDR-Region der schweren Kette des monoclonalen Antikörpers Nr. 70.

7. Ligand nach einem der Ansprüche 1 bis 3, einschließlich der in Fig. 11 dargestellten Aminosäuresequenz für die CDR-Region der schweren Kette des monoclonalen Antikörpers Nr. 57.

8. Ligand nach einem der Ansprüche 1 bis 3, einschließlich der Aminosäuresequenz eines Antikörpers, der gegen die C-terminale Schleife eines Mitglieds der TNF-/NGF-Rezeptorfamilie gerichtet ist.

9. Ligand nach einem der Ansprüche 1 bis 3, umfassend das scFv eines Antikörpers der Gruppe 32.

10. Ligand nach einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend ein Protein.

11. Ligand nach einem der Ansprüche 1 bis 9, umfassend ein Peptid.

12. Ligand nach einem der Ansprüche 1 bis 9, dessen dreidimensionale Struktur als Pharmakophor der dreidimensionalen Struktur des Proteins oder Peptids nach Anspruch 10 und 11 ähnlich ist und der den Effekt von TNF aber nicht dessen Bindung an TNF-R hemmen kann.

13. DNA-Molekül, das einen Liganden nach einem der Ansprüche 1 bis 12 codiert und zur Expression eines solchen Liganden geeignet ist.

14. DNA-Molekül, das an ein DNA-Molekül nach Anspruch 13 hybridisiert und zur Expression eines Liganden nach einem der Ansprüche 1 bis 12 geeignet ist.

15. Replizierbares Expressionsvehikel, das ein DNA-Molekül nach Anspruch 13 oder 14 umfasst und das zur Expression eines Liganden nach einem der Ansprüche 1 bis 12 in einer transformierten Wirtszelle geeignet ist.

16. Wirtszelle, transformiert mit dem replizierbaren Expressionsvehikel nach Anspruch 15.

17. Wirtszelle nach Anspruch 16, die eine eukaryontische Zelle ist.

18. Wirtszelle nach Anspruch 16, die eine eukaryontische Zelle ist.

19. Verfahren zur Herstellung eines rekombinanten Liganden nach einem der Ansprüche 1 bis 12, umfassend die Züchtung einer transformierten Wirtszelle nach einem der Ansprüche 16 bis 18 und die Gewinnung des rekombinanten Liganden.

20. Anti-idiotypischer Antikörper zu einem Liganden nach einem der Ansprüche 1 bis 12, der die Wirkung des TNF, nicht jedoch dessen Bindung an TNF-R hemmen kann.

21. Arzneimittel, umfassend einen Liganden nach einem der Ansprüche 1 bis 12 und/oder einen anti-idiotypischen Antikörper nach Anspruch 20.

22. Verwendung eines Liganden nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder eines anti-idiotypischen Antikörpers nach Anspruch 20 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Steigerung des inhibitorischen Effekts eines löslichen Rezeptors der TNF-/NGF-Rezeptorfamilie.

23. Mutein oder funktionales Derivat eines Liganden nach einem der Ansprüche 1 bis 12, welches immer noch an den Bereich der C-terminalen Cysteinschleife des TNF-/ NGF-Rezeptors bindet und auf das Signal für den cytotoxischen Effekt dieses Rezeptors oder des Antikörpers nach Anspruch 20 inhibitorisch wirkt, der immer noch die Wirkung von TNF, nicht aber dessen Bindung an TNF-R hemmen kann.

24. Fusionsprotein, umfassend einen Liganden nach einem der Ansprüche 1 bis 12 oder einen Antikörper nach Anspruch 20.