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Fachgebiet der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung betrifft die Verwendung von Liganden für Tumornekrosefaktor-Rezeptoren
(TNF-Rs), die die Wirkung des TNF, nicht jedoch seine Bindung an
die TNF-Rs hemmen, und außerdem
Liganden, die mit anderen Rezeptoren der TNF/NGF-Rezeptorfamilie
interagieren. Diese Liganden sind Antikörper, davon abgeleitete Peptide
oder ein Salz oder Mutein der Antikörper. Gemäß der Erfindung werden die
Liganden zur Herstellung eines Arzneimittels für die Behandlung von septischem Schock,
Kachexie, Transplant-gegen-Empfänger-Erkrankung
und Autoimmunkrankheiten, insbesondere Arthritis rheumatica, verwendet.
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Stand der Technik
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Der
Tumornekrosefaktor (TNF) ist ein pleiotropes Cytokin, das durch
verschiedene Zelltypen, hauptsächlich
durch aktivierte Makrophagen produziert wird. Er ist einer der maßgeblichen
Mediatoren der Immun- und Entzündungsantwort.
Das Interesse an seiner Funktion hat kürzlich stark zugenommen, als
deutlich wurde, dass der TNF an der Pathogenese eines großen Spektrums
von Krankheiten beteiligt ist; hierzu zählen der Endotoxin-Schock,
die zerebrale Malaria und die Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktion.
Da viele der Effekte von TNF für
den Organismus schädlich
sind, besteht ein großes
Interesse daran, Wege zu finden, wie seine Wirkung auf Wirtszellen
blockiert werden kann. Ein offensichtliches Ziel einer solchen Beeinflussung
sind die Moleküle,
an die der TNF binden muss, um seine Wirkungen auszulösen, nämlich die
TNF-Rs. Diese Moleküle
liegen nicht nur zellgebunden vor, sondern es gibt sie auch in löslichen
Formen, die aus den gespaltenen extrazellulären Domänen der intakten Rezeptoren
bestehen (vgl. Nophar et al., EMBO Journal 9 (10), (1990), 3269–3278).
Die löslichen
Rezeptoren behalten die Fähigkeit,
an den TNF zu binden, und besitzen somit die Fähigkeit, seine Funktion zu
blockieren, indem sie mit den Oberflächenrezeptoren kompetieren.
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Ein
weiteres Verfahren der TNF-Hemmung, das auf dem Prinzip des Kompetierens
mit zellgebundenen Molekülen
beruht, ist die Verwendung von Antikörpern, die TNF-Rezeptoren erkennen
und die Bindung von Liganden blockieren.
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Die
Zelloberflächen-TNF-Rs
werden in fast allen Zellen des Körpers exprimiert. Die TNF-Rezeptoren
fungieren über
die Bindung des TNF an sie als Signalgeber für die verschiedenen Wirkungen
des TNF, d. h. die cytotoxische Wirkung, die wachstumsfördernde
Wirkung und andere. Zwei Formen dieser Rezeptoren, die sich in ihrer
Molekülgröße von 55 und
von 75 Kilodalton unterscheiden, wurden beschrieben und werden hier
mit p55- bzw. p75-TNF-R bezeichnet. Es sollte jedoch beachtet werden,
dass es auch Veröffentlichungen
gibt, in denen diese Rezeptoren als p60 und p80 beschrieben werden.
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Die
TNF-Rs gehören
zu einer Familie von Rezeptoren, die an anderen kritischen biologischen Prozessen
beteiligt sind. Zu Beispielen dieser Rezeptoren zählt der
Niederaffinitäts-NGF-Rezeptor, der
bei der Regulation des Wachstums und der Differenzierung von Nervenzellen
eine wichtige Rolle spielt. Verschiedene andere Rezeptoren sind
an der Regulation des Lympocyten-Wachstums beteiligt, wie CDw40
und einige andere. Ein weiteres Mitglied der Familie ist der FAS-Rezeptor,
der auch APO genannt wird, ein Rezeptor, der am Signal für die Apoptose
beteiligt ist und der aufgrund einer Studie mit Mäusen, bei
denen seine Funktion fehlt, in der Ätiologie einer Lupus-ähnlichen
Krankheit eine wichtige Rolle zu spielen scheint. Hier wird diese
Familien von Rezeptoren mit „TNF/NGF-Rezeptorfamilie" bezeichnet.
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Eine
der wichtigsten Eigenschaften des TNF im Vergleich zu anderen Cytokinen,
die vermutlich an der Pathogenese verschiedener Krankheiten beteiligt sind,
ist seine Fähigkeit,
den Zelltod hervorzurufen. Die zelltötende Aktivität von TNF
wird vermutlich durch den p55-Rezeptor induziert. Diese Aktivität des p55-Rezeptors
wird jedoch möglicherweise
auch durch den p75-Rezeptor über
einen bisher unbekannten Mechanismus unterstützt.
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Die
Europäischen Patentveröffentlichungen Nr.
0 398 327 und
0 412
486 beschreiben Antikörper gegen
die löslichen
TNF-Rs. Dabei wurde gefunden, dass diese Antikörper die löslichen TNF-Rs erkennen und
die Bindung von TNF an die TNF-Rs auf der Zelloberfläche hemmen.
Monovalente F(ab)-Fragmente blockierten die Wirkung von TNF, während festgestellt
wurde, dass intakte Antikörper
die zytotoxische Wirkung von TNF nachahmen.
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Marsters
et al. (J. Biol. Chem. 267 (1992), 5747–5750) beschreiben die Identifizierung
von Cystein-reichen Domänen
des Tumornekrosefaktor-Rezeptors Typ-1, die an der Bindung von Liganden beteiligt
sind, und außerdem
beschreiben sie einen monoclonalen Antikörper, der an den TNF-Rezeptor-1 bindet.
Dieser Antikörper
ist jedoch im Gegensatz zu den Liganden der vorliegenden Anmeldung
nicht in der Lage, eine Konformationsänderung des Rezeptors zu induzieren.
Außerdem
wird nicht überzeugend
gezeigt, dass die monoclonalen Antikörper tatsächlich mit der Region des TNF-Rezeptors-1
interagieren, die CDR4 entspricht.
EP-A1 0 444 560 beschriebt spezielle Antikörper gegen
einen TNF-Rezeptor. In
EP-A1
0 444 560 werden jedoch keine Antikörper beschrieben, die die Merkmale
der Antikörper
der vorliegenden Anmeldung besitzen, z. B. werden keine Antikörper beschrieben,
die an die Region des TNF-Rezeptors binden, die der Region entspricht,
an die die Liganden der vorliegenden Anmeldung binden. Aus
EP-A1 0 444 560 geht
nicht einmal klar hervor, ob die Antikörper gegen das extrazelluläre Epitop
des Rezeptors gerichtet sind.
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Zusammenfassung der Erfindung
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Die
vorliegende Erfindung stellt die Verwendung eines wie in den Ansprüchen gekennzeichneten
Liganden für
ein Mitglied der TNF/NGF-Rezeptorfamilie bereit, der an die Region
der C-terminalen Cysteinschleife eines solchen Rezeptors bindet
und der ein Inhibitor des Signals für den zellabtötenden Effekt dieses
Rezeptors ist, wobei die Cysteinschleife die Aminosäuresequenz
von cys-163 bis thr-179 in dem p75-TNF-R oder eine entsprechende
C-terminale Cysteinschleife in einem anderen Mitglied der TNF/NGF-Familie
umfasst.
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Vorzugsweise
ist der Rezeptor der TNF-R, insbesondere der p75-TNF-R.
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Ein
solcher Ligand umfasst die Aminosäuresequenz für die CDR-Region
der schweren Kette des monoclonalen Antikörpers Nr. 32, dargestellt in 11,
und/oder die Aminosäuresequenz
für die CDR-Region
der leichten Kette dieses Antikörpers, dargestellt
in 12.
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Ein
weiterer Ligand umfasst die Aminosäuresequenz für die CDR-Region
der schweren Kette des monoclonalen Antikörpers Nr. 70, dargestellt in 11.
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Noch
ein weiterer Ligand umfasst die Aminosäuresequenz für die CDR-Region
der schweren Kette des monoclonalen Antikörpers Nr. 57, dargestellt in 11.
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Die
vorstehenden Antikörper
werden hier der Einfachheit halber als „Gruppe 32"-Antikörper bezeichnet.
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In
einem anderen Aspekt der Erfindung umfassen die Liganden das scFv
eines Gruppe-32-Antikörpers.
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Die
Liganden sind die in den Ansprüchen
gekennzeichneten Liganden.
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Der
Ligand kann in einem Fusionsprotein mit einem anderen Protein, gegebenenfalls
verbunden durch einen Peptidlinker, enthalten sein. Ein solches Fusionsprotein
kann die Verweilzeit des Liganden im Körper erhöhen und es auf diese Weise
sogar möglich
machen, dass der Ligand-Protein-Komplex als ein latentes Mittel
oder als ein Impfstoff verwendet wird.
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Die
Peptide der Erfindung können
durch verschiedene Verfahren synthetisiert werden, die im Prinzip
bekannt sind, nämlich
durch chemische Kopplungsverfahren (vgl. Wunsch, E.: „Methoden
der organischen Chemie",
Band 15, Band 1 und 2, Synthese von Peptiden, Thieme Verlag, Stuttgart
(1974), und Barrang, G.: Marrifield, R. B., „The Peptides", Hrsg. E. Gross,
J. Meienhofer, Bd. 2, Kapitel 1, S. 1–284, Academic Press (1980))
oder durch enzymatische Kopplungsverfahren (vgl. Widmer, F., Johansen,
J. T., Carlsberg Res. Commun., Bd. 44, (1979), S. 37–46; und
Kullmann, W.: „Enzymatic Peptide Synthesis", CRC Press Inc.,
Boca Raton, Fl., (1987); und Widmer, F., Johansen, J. T., in „Synthetic
Pepides in Biology and Medicines",
Hrsg., Alitalo, K., Partanen, P., Vatieri, A., S. 79–86, Elsevier,
Amsterdam (1985)) oder durch eine Kombination von chemischen und
enzymatischen Verfahren, sofern dies für die Gestaltung und die Wirtschaftlichkeit
des Verfahrens vorteilhaft ist.
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Ein
Cysteinrest kann sowohl am Amino- als auch am Carboxyende des Peptids
angehängt
werden, wodurch die Cyclisierung des Peptids durch die Bildung einer
Disulfidbindung ermöglicht
wird.
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Modifikationen
der Peptide der vorliegenden Erfindung, die die biologische Aktivität nicht
abschwächen,
liegen im Umfang der vorliegenden Erfindung.
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Die
jeweilige Spezifität
von Antikörpern
liegt in den Strukturen der Peptidschleifen, welche die Komplementaritäts-bestimmenden
Regionen (CDRs) der variablen Domänen der Antikörper ausmachen.
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Alle
Moleküle
(Peptide usw.) können
durch herkömmliche
chemische Verfahren, wie hier beschrieben, oder durch DNA-Rekombinationsverfahren
hergestellt werden.
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Die
Erfindung stellt außerdem
DNA-Moleküle,
die die Liganden gemäß der Erfindung
codieren, Vektoren, die sie enthalten, und Wirtszellen bereit, die
die Vektoren umfassen und die in der Lage sind, die erfindungsgemäßen Liganden
zu exprimieren.
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Die
Wirtszelle kann eine prokaryontische oder eukaryontische Zelle sein.
Die Erfindung stellt ferner DNA-Moleküle bereit, die mit den vorstehenden
DNA-Molekülen hybridisieren
und Liganden codieren, die die gleiche Aktivität aufweisen.
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Die
Erfindung stellt außerdem
Arzneimittel bereit, die die vorstehenden Liganden umfassen, die zur
Behandlung von Krankheiten eingesetzt werden können, die durch die Effekte
des TNF ausgelöst oder
verursacht werden, der entweder endogen produziert oder von außen zugeführt wird.
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Kurze Beschreibung der Figuren
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In 1 sind
die bakteriellen Konstrukte schematisch dargestellt, die zur Bestimmung
der Sequenz verwendet wurden, an die Antikörper der Gruppe-32 binden.
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In 2 ist
ein Beispiel der Western-Blot-Analysetechnik dargestellt, durch
die die Bindung der Antikörper
an die in 1 gezeigten Konstrukte bestimmt
wurde.
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Die 3 und 4 zeigen
das Kompetieren synthetischer Peptide, deren Sequenzen die Region
des Epitops enthalten, das durch die monoclonalen Antikörper der
Gruppe-32 oder von Teilen davon erkannt wird, um die Bindung eines
Antikörpers dieser
Gruppe an ein Konstrukt, umfassend einen Teil von TBP-II, in dem
dieses Epitop vorliegt.
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5 zeigt
die Nucleotidsequenz und die hergeleitete Aminosäuresequenz des p75-Rezeptors.
TBP-II- und Transmembran-Domänen
sind mit Kästchen
versehen und schattiert. Die Region, die durch die Gruppe-32-Antikörper erkannt
wird, ist unterstrichen.
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6 zeigt
das Muster des Schutzes von HeLa p75.3-Zellen (wie nachstehend definiert)
vor der TNF-Cytotoxizität
durch verschiedene monoclonale Antikörper gegen p75-TNF-R und Fragmente davon.
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7 zeigt
die Effekte eines monoclonalen Antikörpers gegen TBP-I und verschiedener
monoclonaler Antikörper
gegen TBP-II, wie effektiv U937-Zellen durch TNF abgetötet werden.
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Die 8a und 8b zeigen
die Effekte des monoclonalen Antikörpers 70 und von Fab-Fragmenten
davon auf die Bindung von TNF an HeLa p75.3-Zellen bzw. U937-Zellen.
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9 zeigt
einen Vergleich der Effekte des Antikörpers Nr. 32 mit anderen Antikörpern gegen den
p75-TNF-R auf die TNF-Bindung an HeLa p75.3-Zellen.
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10 zeigt
die Dissoziation von TNF von HeLa p75.3-Zellen in Gegenwart und
in Abwesenheit des Antikörpers
Nr. 70 und seines monovalenten Fab-Fragments.
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11 zeigt
die Nucleotidsequenz und die hergeleitete Aminosäuresequenz für die CDR-Region
der schweren Ketten von drei monoclonalen Antikörpern der Gruppe-32.
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12 zeigt
die Nucleotidsequenz und die hergeleitete Aminosäuresequenz für die CDR-Region
der leichten Ketten des monoclonalen Antikörpers Nr. 32.
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13 zeigt
die Sequenzhomologie zwischen verschiedenen Mitgliedern der TNF/NGF-Rezeptorfamilie.
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Genaue Beschreibung der Erfindung
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TNF
ist, wie vorstehend schon festgestellt, ein Cytokin, das seine Wirkung
auf die Zellfunktion in Gang setzt, indem es an zwei spezifische
Zelloberflächen-Rezeptoren
bindet: an den p55- und an den p75-Rezeptor. Seine Wirkung kann
durch die Bindung von Antikörpern
an die extrazelluläre
Domäne dieser
Rezeptoren gestört
werden. Wie jedoch in mehreren Studien gezeigt wurde, können Antikörper, die
an die extrazelluläre
Domäne
der Rezeptoren binden, auch die Effekte von TNF auslösen, indem
sie die Aggregation der p55-Rezeptoren induzieren und indem sie
außerdem
die Aggregation der p75-Rezeptoren induzieren (Engelmann et al.,
J. Biol. Chem. 265, Nr. 24 (1990), 14497–14504; und unveröffentlichte
Ergebnisse).
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Wir
fanden, dass bestimmte Antikörper,
die an eine bestimmte Region im p75-Rezeptor binden, das Signal für die zellabtötende Wirkung
durch diesen Rezeptor nicht nachahmen, sondern vielmehr hemmen.
Dies erfolgt trotz der Tatsache, dass diese Antikörper, wenn
sie an diese Region binden, die TNF-Bindung nicht blockieren, sondern
sie vielmehr in einem gewissen Ausmaß erhöhen.
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Die
vorliegende Erfindung zeigt, dass diese Region, die durch diese
Antikörper
erkannt wird, die wir die Gruppe-32 nennen, die Region ist, die
sich zwischen den zwei C-terminalen Cysteinresten in der extrazellulären Domäne des p75-Rezeptors
erstreckt, plus eine zusätzliche
Aminosäure,
thr179. Diese Region wird in der vorliegenden Beschreibung der Einfachheit
halber als „Cysteinschleife" bezeichnet.
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Die
vorliegende Erfindung stellt auch die Nucleotidsequenzen und hergeleiteten
Aminosäuresequenzen
in der CDR der schweren Kette der drei zu dieser Gruppe gehörenden Antikörper bereit,
nämlich Nr.
32 und 57. Außerdem
stellt die Erfindung die Nucleotidsequenz und die hergeleitete Aminosäuresequenz
der leichten Kette des Antikörpers
Nr. 32 bereit. Aufgrund dieser Sequenzen können Peptide definiert werden,
die die Funktion der p75-Rezeptoren hemmen.
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Aufgrund
dieser Ergebnisse und der großen Ähnlichkeit
der Rezeptoren in dieser bestimmten Familie betrifft diese Erfindung
auch Mittel, die an die C-terminale Cysteinschleife in der extrazellulären Domäne der verschiedenen
anderen Mitglieder der TNF/NGF-Rezeptorfamilie binden und die Funktion der
anderen Rezeptoren modulieren, ähnlich
wie die TNF-Funktion moduliert wird. In dieser Rezeptorfamilie sind
die Lage von Cystein in der extrazellulären Domäne und der Abstand hoch-konserviert.
Bestimmte Mitglieder dieser Familie, z. B. CDw40, zeigen eine besonders
große Ähnlichkeit
zu dem p75-Rezeptor. Insbesondere bei solchen Rezeptoren kann man
davon ausgehen, dass Mittel, die an diese Regionen binden, Wirkungen
zeigen, die ähnlich
sind wie die Wirkung der Antikörper
Nr. 32 auf den p75-Rezeptor.
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Die
durch die vorstehenden Verfahren erhaltenen aktiven Moleküle können, sofern
sie biologische Substanzen sind, auch durch biotechnologische Verfahren
hergestellt werden. Auf diese Weise wird eine massive Produktion
dieser Moleküle
möglich
gemacht. Peptide können
entweder durch bekannte Verfahren der Peptidsynthese oder unter
Verwendung von Expressionvektoren hergestellt werden, die DNA-Sequenzen
enthalten, die sie codieren. Andere Moleküle, wenn sie auf enzymatischem
Weg hergestellt werden, können
gebildet werden, indem die beteiligten Enzyme in den geeigneten
gezüchteten
Zellen produziert werden.
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Arzneimittel,
die die Liganden der vorliegenden Erfindung enthalten, können verwendet
werden, um den Effekten von TNF in Säugern entgegenzuwirken.
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Solche
Mittel umfassen die erfindungsgemäßen Liganden als Wirkstoff.
Die Arzneimittel sind für Zustände indiziert
wie septischer Schock, Kachexie, Transplantat-gegen-Empfänger-Reaktionen, Autoimmunkrankheiten
wie rheumatoide Arthritis und dergleichen. Sie sind auch indiziert,
um z. B. einer Überdosis
eines von außen
zugeführten
TNF entgegenzuwirken.
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Die
Arzneimittel gemäß der Erfindung
werden abhängig
von dem zu behandelnden Zustand über
die anerkannten Verabreichungswege appliziert. Z. B. ist im Fall
eines septischen Schocks die intravenöse Verabreichung bevorzugt.
Die Arzneimittel können
auch kontinuierlich, d. h. durch Infusion, oder oral appliziert
werden. Die Formulierung und Dosis hängt von der zu behandelnden
Krankheit, der Verabreichungsroute und dem Zustand und Körpergewicht
des Patienten ab, der behandelt werden soll. Der behandelnde Arzt
kann die genaue Dosis bestimmen.
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Die
Arzneimittel gemäß der Erfindung
werden auf herkömmliche
Art hergestellt, z. B. indem der Wirkstoff mit pharmazeutisch und
physiologisch verträglichen
Trägern
und/oder Stabilisatoren und/oder Excipienten, wie im jeweiligen
Fall gewünscht,
gemischt und in einer bestimmten Dosierungsform, z. B. durch Gefriertrocknung
in Dosisgläschen,
zubereitet wird.
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Der
hier verwendete Begriff „Muteine" bezieht sich auf
Analoga der Liganden, in denen ein Aminosäurerest oder mehrere Aminosäurereste
des Liganden, der, wie gefunden wurde, bindet, durch unterschiedliche
Aminosäurereste
ersetzt ist/sind oder fehlt/fehlen oder in denen ein Aminosäurerest
oder mehrere Aminosäurereste
zu der ursprünglichen
Sequenz zugefügt
wurde/n, ohne dass die Aktivität
des resultierenden Produkts deutlich verändert wird. Diese Muteine werden
durch bekannte Synthese- und/oder
ortsgerichtete Mutagenesetechniken oder durch eine beliebige andere
bekannte, hierfür
geeignete Technik hergestellt.
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Der
Begriff „fusioniertes
Protein" bezieht
sich auf ein Polypeptid, das die Liganden oder ein Mutein davon
umfasst, die/das mit einem anderen Protein verknüpft sind/ist, das eine verlängerte Verweilzeit
in Körperflüssigkeiten
aufweist. Die Liganden können auf
diese Weise mit einem anderen Protein, Polypeptid oder dergleichen
verknüpft
sein, z. B. einem Immunglobulin oder einem Fragment davon.
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Der
Begriff „Salze" bezieht sich hier
sowohl auf Salze von Carboxylgruppen als auch auf Säureadditionssalze
von Aminogruppen der Liganden, Muteine und fusionierten Proteine
davon. Salze einer Carboxylgruppe können durch Verfahren, die dem Fachmann
bekannt sind, hergestellt werden und umfassen anorganische Salze,
z. B. Natrium-, Calcium-, Ammonium, Eisen- oder Zinksalze und dergleichen, sowie
Salze mit organischen Basen, z. B. Salze, die mit Aminen wie Triethanolamin,
Arginin oder Lysin, Piperidin, Procain und dergleichen gebildet
werden. Säureadditionssalze
umfassen z. B. Salze mit Mineralsäuren wie z. B. Salzsäure oder
Schwefelsäure und
Salze mit organischen Säuren
wie z. B. Essigsäure
oder Oxalsäure.
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Derivate
umfassen Polyethylenglykol-Seitenketten, die antigene Stellen maskieren
und die Verweilzeit der Liganden in Körperflüssigkeiten verlängern können.
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Die
Erfindung wird durch die folgenden Beispiele erläutert, die die Erfindung in
keiner Weise einschränken
sollen.
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Beispiel 1
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Bestimmung der Region des p75-Rezeptors,
die durch die Gruppe-32-Antikörper
erkannt wird
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In
Beispiel 5 der Hauptanmeldung wurden mehrere Konstrukte durch Expression
in E. coli hergestellt und daraus gefolgert, dass das durch den
Antikörper
Nr. 32 erkannte Epitop zwischen den Aminosäuren 125 und 182 liegt.
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Wir
haben nun weitere Konstrukte hergestellt, wobei die vollständige Liste
der untersuchten Konstrukte und außerdem ihre Beziehung zur Struktur
des löslichen
p75R in 1 dargestellt sind. Die Konstrukte,
die durch die Antikörper
der Gruppe-32 erkannt werden, sind als fette Ziffern angegeben und als
durchgezogene Linien dargestellt. Die Konstrukte, die nicht mit
diesen Antikörpern
reagieren, sind als dünne
Ziffern angegeben und als unterbrochene Linien dargestellt. Alle
Konstrukte werden durch ihre N- und C-terminalen Aminosäurereste
identifiziert.
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1 zeigt
oberhalb der schematischen Darstellung der Konstrukte die Aminosäuresequenz eines
Teils des p75-TNF-R, wobei die Regionen von Kästchen umgeben sind, die der
löslichen
Form des Rezeptors und der Transmembranregion entsprechen. Aminosäurereste,
die zwischen Mensch und Maus konserviert sind, sind unterstrichen.
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Die
in 2 dargestellte Western-Blot-Analyse der Bindung
der Gruppe-32-Antikörper an
einige der in 1 gezeigten Konstrukte wurde
wie in Beispiel 5 der Hauptanmeldung durchgeführt.
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Beispiel 2
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Kompetieren zwischen Gruppe-32-Antikörpern und synthetischen
Peptiden um die Bindung an die extrazelluläre Domäne des p75-TNF-R
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Eine
Reihe synthetischer Peptide, deren Sequenzen verschiedenen Teilen
der Region auf dem TNF-R entsprechen, von der vermutet wird, dass
sie das Gruppe-32-Epitop
darstellt, wurden synthetisiert (Reste 160–179, 162–179, 163–179, 165–179 und 167–179). Die
Peptide wurden in einem ELISA-Test auf ihre Fähigkeit untersucht, um die
Bindung an die Antikörper
der Gruppe-32 zu kompetieren.
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Ein
bakteriell hergestelltes Konstrukt, das den Aminosäuren 3 bis
180 des p75-TNF-R
entspricht (p75-Konstrukt in 3), wurde
mit den angegebenen Konzentrationen auf PVC-Platten aufgetragen,
die mit Antikörper-32
vorbeschichtet waren, worauf die Zugabe des Kaninchen-Antiserums
gegen TBP-II (löslicher
p75-TNF-R) folgte.
Die Menge des an die Platte gebundenen Kaninchen-Antiserums wurde
bestimmt, indem ein gegen Kaninchen-Immunglobulin gerichtetes Ziegen-Antiserum, das
mit Meerrettich-Peroxidase verknüpft
war, zugegeben und die Menge des an die Platte gebundenen Ziegen-Immunglobulins
enzymatisch ermittelt wurde. In 3 sind die
Ergebnisse eines Experiments dargestellt, in dem gefunden wurde,
dass ein synthetisches Peptid, das den Aminosäureresten 163 bis 179 entspricht,
um die Bindung kompetierte.
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In 4 sind
die Ergebnisse eines Experiments dargestellt, in dem ein Fusionsprotein
aus Maltose-bindendem Protein (MBP) mit der Sequenz der Aminosäuren von
125 bis 192 des p75-Rezeptors verwendet wurde, um PVC-Platten mit
einer Konzentration von 10 μg/ml
zu beschichten, anschließend wurde
der mcAb Nr. 32 mit einer Konzentration von 2 μg/ml zusammen mit den angegebenen
Konzentrationen unterschiedlicher Proteine zugegeben:
DW16 – Aminosäuren 165–179,
DW18 – Aminosäuren 163–179,
DW19 – Aminosäuren 162–179,
DW21 – Aminosäuren 160–179.
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Danach
wurde die Reaktion durch Zugabe von Ziegen-anti-Maus, gekoppelt
an Meerrettich-Peroxidase, entwickelt. Wie in 4 zu
sehen ist, konnte eine deutliche Hemmung der Erkennung des Fusionsproteins
durch den monoclonalen Antikörper
Nr. 32 nur mit den drei Peptiden festgestellt werden, die das ganze
Epitop abdecken.
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Beispiel 3
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Mutationsstudie des 32-Epitops
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Das
Ersetzen von Cystein-178 durch Alanin in einem rekombinanten Peptid,
dessen Sequenz den Aminosäuren
3 bis 181 entspricht, führte
dazu, dass dieses Protein durch die Gruppe-32-Antikörper nicht
mehr erkannt werden konnte. Dieses Ergebnis legt nahe, dass, damit
eine Erkennung durch diese Antikörper
erfolgt, die zwei Cysteinreste in der Gruppe-32-Epitopregion frei
sein müssen,
so dass sie miteinander interagieren können; d. h. dass die Struktur, die
von den Antikörpern
erkannt wird, eine Schleife ist. Zur Bestätigung dieser Feststellung
fanden wir, dass eine Reduktion des Peptids durch Dithiothreit vor
der SDS-PAGE und der Western-Blot-Analyse die Effektivität seiner
Erkennung durch die Gruppe-32-Antikörper etwas herabsetzte und
dass eine Reduktion durch Dithiothreit und eine anschließende Alkylierung
mit Iodacetimid dazu führte,
dass es durch die Antikörper überhaupt
nicht mehr erkannt werden konnte.
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Beispiel 4
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Effekte verschiedener Antikörper und
Fragmente davon auf die TNF-Toxizität
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- (a) Um die Funktion der Gruppe-32-Antikörper zu vergleichen,
und zwar nicht nur mit Antikörpern, die
an den Rezeptor stromaufwärts
der 32-Epitopregion binden (wie von den meisten anti-TBP-II-Antikörpern zu
erwarten ist), sondern auch mit Antikörpern, die an den Rezeptor
stromabwärts
dieser Epitopregion binden, immunisierten wir Mäuse mit einem chimären Konstrukt,
das der Region entsprach, die sich stromabwärts des 32-Epitops erstreckte
(Aminosäuren
181 bis 235; die „Stiel"-Region), verknüpft mit
MBP. Die Kaninchen entwickelten Antikörper, die an die Chimären, mit
denen sie immunisiert worden waren, und außerdem an den intakten p55-TNF-Rezeptor banden.
Diese Antikörper
wurden affinitätsgereinigt,
indem sie an das chimäre
Protein, gekoppelt an eine Affi-Gel-10-Säule, gebunden wurden, und auf
eine Wirkung auf die TNF-Funktion und Bindung getestet. (Das affinitätsgereinigte
Antikörperpräparat wurde
mit „318" bezeichnet).
- (b) Alle monoclonalen anti-TBP-II-Antikörper und außerdem die affinitätsgereinigten
anti-Stiel-Antikörper
wurden auf eine Wirkung auf die TNF-Toxizität in Clonen der epitheloiden
HeLa-Zellen getestet, die dazu gebracht wurden, dass sie die p75-Rezeptoren überexprimierten
(durch ihre Transfektion mit der cDNA des p75-Rezeptors. Den bestimmten überexprimierenden
Clon, der in den hier dargestellten Experimenten verwendet wurde,
bezeichneten wir mit HeLa p75.3). Die einzigen Antikörper, die
die TNF-Funktion hemmten, waren die Antikörper des Gruppe-32-Epitops;
und dies trotz der Tatsache, dass sie die TNF-Bindung an den Rezeptor
nicht hemmen, jedoch etwas steigern (8 und 9).
Zwei der anderen anti-TBP-II-Antikörper (Nr. 67, 6 und 9,
und Nr. 81) hatten eine sehr geringe Wirkung auf die TNF-Bindung
an den Rezeptor oder auf die TNF-Toxizität. Alle anderen monoclonalen
anti-TBP-II-Antikörper
verstärkten
die zellabtötende Wirkung
von TNF etwas, obwohl sie mit der TNF-Bindung kompetierten (z. B.
der Antikörper 36
der 6 und 9). Die „anti-Stiel"-Antikörper zeigten
eine sehr geringe Wirkung auf die Bindung oder Funktion von TNF
(6 und 9). Wenn man zu den Zellen anti-Stiel-Antikörper zusammen
mit Antikörpern
der Gruppe-32 zugab, wurde die Hemmwirkung der Letzteren auf die TNF-Funktion
nicht gestört.
- (c) Die gleiche Reihe von Antikörpern wurde auf eine Wirkung
auf das Abtöten
der Myelocyt-Zellen U937 durch TNF getestet. Im Gegensatz zur nachahmenden
Wirkung der anti-TNF-Rezeptor-Antikörper in den HeLa-Zellen wurde
weder bei anti-p55- noch bei anti-p75-Rezeptor-Antikörpern gefunden,
dass sie unter den Bedingungen des durchgeführten Experiments die zellabtötende Wirkung
von TNF auf die U937-Zellen nachahmten. Da sie keine Fähigkeit
zum Nachahmen der TNF-Wirkung besitzen, wirken alle monoclonalen
Antikörper,
die um die TNF-Bindung entweder an den p75-Rezeptor (z. B. die Antikörper 14, 31
und 36 von 9) oder an den p55-Rezeptor (z.
B. Antikörper
Nr. 18 von 7) kompetieren, auf die TNF-Effekte
inhibitorisch. Antikörper,
die keine Wirkung auf die TNF-Bindung an die Rezeptoren aufwiesen
(z. B. die Nr. 67 von 9), hatten keinen Effekt auf
die TNF-Funktion (6). Die Gruppe-32-Antikörper waren
darin einzigartig, dass sie eine Fähigkeit zur Hemmung der TNF-Funktion in dieser
Zelle besaßen,
ohne eine Hemmwirkung auf die TNF-Bindung zu zeigen. Die Antikörper steigerten
tatsächlich
die Bindung von TNF an diese Zellen, viel mehr als in den HeLa-p75.3-Zellen
(8). Die Hemmwirkung der Gruppe-32-Antikörper war
zu der von Antikörpern
additiv, die die TNF-Bindung an den p55-Rezeptor blockieren (z. B. die Kombination 18/32
in 7).
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Beispiel 5
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Effekt von Gruppe-32-Antikörpern und
monovalenten Fab-Fragmenten davon auf die Dissoziation von TNF von
den TNF-Rs
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Um
den Mechanismus zu untersuchen, durch den die Gruppe-32-Antikörper eine
Steigerung der TNF-Bindung bewirken, verglichen wir die Rate der
TNF-Dissoziation von HeLa-p75.3-Zellen in Gegenwart und in Abwesenheit
dieser Antikörper.
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Ein
radiomarkierter TNF wurde zu konfluenten HeLa-p75.3-Zellen zugegeben,
und die Zellen wurden zwei Stunden auf Eis inkubiert. Ungebundener
Ligand wurde ausgewaschen und 1 ml Bindungspuffer, enthalten 500
ng/ml kalten TNF, wurde zu den Vertiefungen in vierfacher Ausführung über die
angegebenen Zeiträume
auf Eis zugegeben. Danach wurden die Vertiefungen erneut mit kalter
PBS gewaschen und die Menge des restlichen Liganden durch Messen
der Radioaktivität
der Zellen bestimmt, die durch Inkubation mit PBS/EDTA-Lösung von
den Platten abgelöst
wurden. Die Antikörper
wurden im ganzen Test in einer Konzentration von 10 μg/ml angewendet.
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Wie
in 10 erläutert,
bewirkten sowohl diese Antikörper
als auch ihre monovalenten F(ab)-Fragmente eine Abnahme der Rate
der TNF-Dissoziation von den Rezeptoren. Hierdurch wird einerseits
eine mögliche
Erklärung
für die
Art und Weise, wie diese Antikörper
die Bindung des TNF an seinen Rezeptoren beeinträchtigen, gegeben, und andererseits
wird durch dieses Ergebnis eine weitere Anwendungsmöglichkeit
dieser Wirkung gezeigt. Lösliche
Formen der p75-TNF-Rs oder des p55-Rezeptors oder eines anderen
Mitglieds der TNF/BGF-Rezeptorfamilie, in denen eine Konformationsänderung
wie beim Gruppe-32-Antikörper
erfolgen wird, werden als bessere inhibitoren des entsprechenden
Agonisten dienen.
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Beispiel 6
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Bestimmung von Nucleotidsequenzen und
hergeleiteten Aminosäuresequenzen
in der CDR der schweren Ketten der monoclonalen Antikörper Nr.
32, 57 und 70 (Gruppe-32-Antikörper)
und in der CDR der leichten (kappa)-Kette des Antikörpers Nr.
32
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Um
die Nucleotidsequenzen der CDR der schweren Ketten der Antikörper Nr.
32, 57 und 70 zu bestimmen, wurde die Gesamt-RNA aus den entsprechenden
Hybridomzellen durch das Promega-Protokoll unter Verwendung von
Guanidiniumthioisocyanat isoliert. Die Erststrang-cDNA-Synthese auf
dieser RNA erfolgte, indem die AMV-reverse Transkriptase und als
Primer entweder Oligo(dT)15–18
oder ein Oligonucleotid verwendet wurden, das zur konstanten Region
der schweren Kette des murinen IgG komplementär war. Die cDNA wurde als Matrize
für die
PCR eingesetzt, wobei ein partiell degenerierter 5'-Primer verwendet
wurde. 40 Zyklen der PCR wurden durchgeführt. Die PCR-Produkte mit der
Größe von etwa
350 bp wurden elektrophoretisch gereinigt und in den Bluescript-Vektor
cloniert. Clone, die Inserteionen mit der richtigen Größe enthielten,
wurden sequenziert. Auf ähnliche
Weise wurde die doppelsträngige
cDNA der CDR-Region der leichten Kette des Antikörpers Nr. 32 synthetisiert.
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Die
Nucleotidsequenzen, die durch das Didesoxy-Kettenabbruchverfahren
erhalten wurden, und die hieraus hergeleiteten Aminosäuresequenzen sind
in den 11 und 12 dargestellt.
Die CDR1-, 2- und 3-Regionen sind unterstrichen.
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Beispiel 7
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Herstellung von scFv der Gruppe-32-Antikörper
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Die
clonierten variablen Regionen der schweren und leichten Ketten der
monoclonalen Antikörper
der Gruppe-32 werden mit einem Linker in einer Länge von 15 Aminosäuren verknüpft und
in einen kommerziellen Expressionvektor eingeführt. Der Vektor enthält einen
Promotor, z. B. lac, eine Leader-Sequenz, z. B. pel-B, und außerdem eine
Sequenz, die ein kleines Peptid codiert (Marker-Peptid), gegen das
ein monoclonaler Antikörper
im Handel verfügbar
ist. Das Plasmid wird nun in E. coli eingeführt, und die Bakterien werden
bis zu O.D. von 0,5 bis 1,0 gezüchtet.
Die Expression von scFv wird durch Zugabe von IPTG induziert und
das Wachstum weitere 6 bis 24 Stunden fortgesetzt. Der lösliche scFv-Marker-Komplex
wird anschließend
aus dem Kulturmedium durch Immunaffinitätsreinigung unter Verwendung
des monoclonalen Antikörpers
gegen den Mrker isoliert und anschließend auf einer Metallaffinitäts-Säule gereinigt.
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Jegliches
innerhalb der Bakterien akkumulierende scFv wird durch Isolieren
und wiederholtes Waschen der Einschlusskörper gereinigt, worauf das Solubilisieren
durch z. B. Harnstoff oder Guanidinium und das anschließende Renaturieren
folgen.
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Andere
Möglichkeiten
bestehen darin, ein Oligohistidin als Marker zu verwenden, anstelle
von Lac einen stärkeren
Promotor, d. h. T7, einzusetzen, den Vektor ohne die Leader-Sequenz
zu konstruieren oder eine Sequenz, die einen „Schwanz" von irrelevanten Sequenzen codiert,
in den Vektor am 5'-Ende
des scFv einzuführen.
Dieser „Schwanz" sollte nicht biologisch
aktiv sein, da sein einziger Zweck darin besteht, ein längeres Molekül als das
native scFv herzustellen, so dass eine längere Verweilzeit im Körper erhalten
wird.
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Beispiel 8
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13 zeigt
die inneren Cystein-reichen Wiederholungen in den extrazellulären Domänen der zwei
TNF-Rs und ihr Ausrichten mit den homologen Wiederholungen in der
extrazellulären
Domäne
des menschlichen FAS-, Nervenwachstumsfaktor (NGF)-Rezeptors und CDw40,
und außerdem
des Ratten-Ox40. Die Aminosäuresequenzen
(Ein-Buchstaben-Symbole) sind auf maximale Homologie ausgerichtet.
Die Positionen der Aminosäuren
innerhalb der Rezeptoren sind am linken Rand angegeben.
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Beispiel 9
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Herstellen rekombinanter DNA-Moleküle, die
Nucleotidsequenzen umfassen, die die aktiven Peptide und andere
Moleküle
codieren, und ihre Expression
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Die
Peptide und andere Moleküle
können auch
durch gentechnische Verfahren hergestellt werden, und ihre Herstellung
umfasst alle Hilfsmittel, die bei diesen Techniken eingesetzt werden.
Auf diese Weise werden DNA-Moleküle
bereitgestellt, die die Nucleotidsequenz umfassen, die solche Peptide
und andere biologische Moleküle
codiert. Diese DNA-Moleküle
können
genomische DNA, cDNA, synthetische DNA und eine Kombination davon
sein.
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Die
DNA-Moleküle,
die solche Peptide und Moleküle
codieren, werden durch herkömmliche
Verfahren hergestellt, sobald die Aminosäuresequenz dieser Peptide und
anderer Moleküle
bestimmt wurde.
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Die
Expression der rekombinanten Proteine kann in eukaryotischen Zellen,
Bakterien oder Hefen erfolgen, wobei die geeigneten Expressionvektoren eingesetzt
werden. Jedes Verfahren kann verwendet werden, das dem Fachmann
bekannt ist.
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Z.
B. werden die durch die vorstehenden Verfahren erhaltenen DNA-Moleküle, die die
Peptide oder anderen Moleküle
codieren, in geeignet konstruierte Expressionsvektoren eingefügt, wobei
Techniken verwendet werden, die dem Fachmann bekannt sind (vgl.
Maniatis, T., et al., Molecular Cloning: A Laborstory Manual, Cold
Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor (1982)). Doppelsträngige cDNA wird
mit Plasmidvektoren durch homopolymeres Tailing oder durch Restriktions-Verknüpfung unter
Verwendung synthetischer DNA-Linker oder Techniken der Ligierung
mit glatten Enden verknüpft.
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DNA-Ligasen
werden eingesetzt, um die DNA-Moleküle zu verknüpfen, wobei eine unerwünschte Kopplung
durch Behandlung mit alkalischer Phosphatase verhindert wird.
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Um
eine gewünschte
biologische Substanz exprimieren zu können, d. h. ein Peptid oder
Protein (nachstehend der Einfachheit halber „Protein"), sollte ein Expressionsvektor auch
spezifische Nucleotidsequenzen umfassen, die transkriptionale und
translationale regulatorische Informationen enthalten, die mit der
DNA, die das gewünschte
Protein codiert, so verknüpft
sind, dass die Genexpression und Produktion des Proteins erfolgen
kann. Erstens muss vor dem Gen, damit es transkribiert wird, ein
Promotor stehen, der von einer RNA-Polymerase erkannt werden kann und
an den die Polymerase bindet und auf diese Weise den Transkriptionsprozess
in Gang setzt. Verschiedene solche Promotoren werden verwendet,
die mit unterschiedlichen Wirksamkeiten arbeiten (starke und schwache
Promotoren). Sie sind für
prokaryontische und eukaryontische Zeilen verschieden.
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Die
Promotoren, die in der vorliegenden Erfindung eingesetzt werden
können,
können
entweder konstitutiv sein, z. B. der int-Promotor des Bakteriophagen
Lambda, der bis-Promotor des β-Lactamase-Gens
von pBR322 und der CAT-Promotor des Chloramphenicol-Acetyltransferase-Gens
von pPR325 usw., oder sie können
induzierbar sein, z. B. die prokaryotischen Promotoren, einschließlich der hauptsächlichen
rechten und linken Promotoren des Bakteriophagen Lambda (PL und PR), der trp-, recA-, lacZ-, lacI-,
ompF- und gal-Promotoren von E. coli oder des trp-lac-Hybridpromotors usw.
(Glick, B. R., J. Ind. Microbiol. 1 (1987), 277–282).
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Um
hohe Genexpressionsraten in prokaryontischen Zellen zu erreichen,
ist es zusätzlich
zur Verwendung starker Promotoren, um große Mengen an mRNA zu erzeugen,
außerdem
erforderlich, Ribosomen-Bindungsstellen einzusetzen, um sicherzustellen,
dass die mRNA effizient translatiert wird. Ein Beispiel ist die
Shine-Dalgarno (SD)-Sequenz,
die in geeigneter Entfernung vom Initiationscodon positioniert wird
und zu der 3'-terminalen
Sequenz der 16S-RNA komplementär
ist.
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Für eukaryontische
Wirte können
verschiedene transkriptionale und translationale regulatorische
Sequenzen eingesetzt werden, dies hängt von der Art des Wirts ab.
Sie können
von Viren stammen, z. B. Adenovirus, Rinder-Papillomvirus, Affen-Virus oder dergleichen,
wo die regulatorischen Signale mit einem bestimmten Gen assoziiert
sind, das eine hohe Expressionsrate aufweist. Beispiele sind der TK-Promotor
von Herpes-Virus, der frühe
SV40-Promotor, der ga14-Gen-Promotor der Hefe usw.. Transkription-Initiation-regulatorische
Signale können
ausgewählt
werden, die eine Repression und Aktivierung ermöglichen, so dass die Expression
der Gene moduliert werden kann.
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Das
DNA-Molekül,
das die Nucleotidsequenz, die die Peptide oder anderen Moleküle der Erfindung
codiert, und die funktionell verbundenen transkriptionalen und translationalen
Regulationssignale enthält,
wird in einen Vektor eingefügt,
der die gewünschten
Gensequenzen in das Chromosom der Wirtszelle integrieren kann. Damit
die Zellen, bei denen die eingeführte
DNA stabil in ihre Chromosomen eingebaut vorliegt, selektiert werden
können,
werden außerdem
ein oder mehrere Marker eingeführt,
die eine Selektion der Wirtszellen erlauben, welche den Expressionsvektor
enthalten. Der Marker kann bewirken, dass ein auxotropher Wirt prototroph
wird, dass eine Resistenz gegen ein Biozid, z. B. Antibiotika oder
Schwermetalle wie Kupfer, entsteht, oder dergleichen. Das Gen des
selektierbaren Markers kann entweder direkt mit den zu exprimierenden DNA-Gensequenzen
verknüpft
werden, oder es kann in die gleiche Zelle durch Co-Transfektion
eingeführt werden.
Für eine
optimale Synthese einer einzelkettigen Bindungsprotein-mRNA können auch
noch weitere Elemente erforderlich sein. Diese Elemente können Spleiß-Signale
und außerdem
Transkriptions-Promotoren,
Enhancer und Terminationssignale umfassen. cDNA-Expressionsvektoren,
die solche Elemente umfassen, werden von Okayama, H., Mol. Cell
Biol. 3 (1983), 280, beschrieben.
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In
einer bevorzugten Ausführungsform
werden die eingeführten
DNA-Moleküle
in ein Plasmid oder einen Virusvektor eingebaut, das/der sich in dem
Empfängerwirt
autonom replizieren kann. Faktoren, die beim Selektieren eines bestimmten
Plasmids oder Virusvektors von Wichtigkeit sind, umfassen: die Einfachheit,
mit der Empfängerzellen,
die den Vektor enthalten, erkannt und von denjenigen Empfängerzellen
selektiert werden können,
die den Vektor nicht enthalten; die Kopienzahl des Vektors, die
in einem bestimmten Wirt gewünscht
wird; und die Frage, ob es wünschenswert
ist, den Vektor zwischen Wirtszellen verschiedener Arten als "Shuttle"-Vektor verwenden
zu können.
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Bevorzugte
prokaryontische Vektoren umfassen Plasmide, z. B. solche, die sich
in E. coli replizieren können,
z. B. pBR322, ColE1, pSC101, pACYC 184 usw. (vgl. Maniatis et al.,
(1982), a.a.O.); Bacillus-Plasmide, z. B. pC194, pC221, pT127 usw. (Gryczan,
T., The Molecular Biology of the Bacilli, Academic Press, NY, (1982));
Streptomyces-Plasmide, einschließlich plJ101 (Kendall, K. J.,
et al., J. Bacteriol. 169 (1987), 4177–4183); Streptomyces-Bakteriophagen,
wie ϕC31 (Chater, K. F., et al., in: Sixth International
Symposium an Actinomycetales Biology, (1986)); und Pseudomonas-Plasmide (John, J.
F., et al., Rev. Infect. Dis. 8 (1986), 693–704; und Izaki, K., Jpn.,
J. Bacteriol. 33 (1978), 729–742).
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Bevorzugte
eukaryontische Plasmide umfassen BPV, Vaccinia, SV40, 2-Mikron-Ring usw. oder ihre
Derivate. Solche Plasmide sind dem Fachmann bekannt (Botstein, D.,
et al., Miami Wint. Symp. Bd. 19 (1982), S. 265–274; Broach, J. R., in: The
Molecular Biology of the Yeast Saccharomyces: Life Cycle and Inheritance,
Cold Spring Harbor Laborstory, Cold Spring Harbor, NY, S. 445–470 (1981);
Broach, J. R., Cell 28 (1982), 203–204; Bollon, D. P., et al.,
J. Clin. Hematol. Oncol. 10 (1980), 39–48; Maniatis, T., in: Cell
Biology: A Comprehensive Treatise, Bd. 3: Gene Expression, Academic
Press, NY, S. 563–608 (1980)).
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Sobald
der Vektor oder die DNA-Sequenz, der/die das (die) Konstrukt(e)
enthält,
für die
Expression hergestellt wurde, kann das (können die) DNA-Konstrukt(e)
durch eines von verschiedenen geeigneten Verfahren in eine geeignete
Wirtszelle eingeführt
werden: z. B. durch Transformation, Transfektion, Konjugation, Protoplastenfusion,
Elektroporation, Calciumphosphat-Fällung, direkte Mikroinjektion
usw..
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Wirtszellen,
die in dieser Erfindung verwendet werden können, können entweder prokaryontische
oder eukaryontische Zellen sein. Bevorzugte prokaryontische Wirte
umfassen Bakterien wie E. coli, Bacillus, Streptomyces, Pseudomonas,
Salmonella, Serratia usw.. Der am stärksten bevorzugte prokaryontische
Wirt ist E. coli. Bakterielle Wirte von besonderem Interesse umfassen
E. coli K12 Stamm 294 (ATCC 31446), E. coli X1776 (ATCC 31537),
E. coli W3110 (F–, Lambda–,
prototroph (ATCC 27325)) und andere Enterobakterien wie Salmonella
typhimurium oder Serratia marcescens und verschiedene Pseudomonas-Arten.
Unter solchen Bedingungen wird das Protein nicht glykosyliert sein.
Der prokaryontische Wirt muss mit dem Replikon und den Kontrollsequenzen
im Expressionsplasmid kompatibel sein.
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Bevorzugte
eukaryontische Wirte sind Säugerzellen,
z. B. menschliche Zellen, Affenzellen, Mauszellen und Zellen des
Ovars des chinesischen Hamsters (CHO), da sie an den Proteinmolekülen posttranslationale
Modifikationen bereitstellen, einschließlich einer korrekten Faltung
oder Glykosylierung an den korrekten Stellen. Auch Hefezellen können posttranslationale
Peptidmodifikationen, einschließlich
Glykosylierung, durchführen.
Es gibt verschiedene rekombinante DNA-Strategien, bei denen starke
Promotorsequenzen und eine hohe Kopienzahl der Plasmide eingesetzt
werden, die zur Produktion der gewünschten Proteine in Hefe genutzt
werden können.
Hefe erkennt Leader-Sequenzen auf clonierten Sängergen-Produkten und sezerniert
Peptide, die Leader-Sequenzen enthalten (d. h., Prä-Peptide).
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Nach
dem Einführen
des Vektors werden die Wirtszellen in einem Selektivmedium gezüchtet, auf dem
die Vektor-enthaltenden Zellen durch ihr Wachstum selektiert werden
können.
Die Expression der clonierten Gensequenz(en) führt zur Produktion der gewünschten
Proteine.
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Die
Reinigung der rekombinanten Proteine erfolgt durch eines der Verfahren,
die für
diesen Zweck bekannt sind.
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Angaben zur Hinterlegung
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Das
Hybridom TBP-II 70-2 wurde bei der Collection National de Cultures
de Microorganismes, Institute Pasteur (CNCM) am 12. März 1990
hinterlegt und mit der Nr. I-928 bezeichnet.
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Das
Hybridom TBP-II 32-5 wurde bei der CNCM m 1. September 1993 hinterlegt
und mit der Nr. I-1358 bezeichnet.
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Die
hinterlegten Hybridome TBP-II 70-2 und TBP-II 32-5 sind Subclone
der Hybridome TBP-II 70 bzw. TBP-II 32 und haben identische Eigenschaften. Die
Produktion und die Clonierung dieser Hybridome wurden in
EP-A 398 327 beschrieben.