DE69737656T2

DE69737656T2 - Cxcr3 chemokine rezeptor, antikoerper, nukleinsaeure und deren verfahren zur anwendung

Info

Publication number: DE69737656T2
Application number: DE69737656T
Authority: DE
Inventors: Marcel Loetscher; Bernhard Moser; Shixin Lexington QIN; Charles R. Watertown MACKAY
Original assignee: THEODOR KOCHER INSTITUT; Kocher Theodor Institut; Millennium Pharmaceuticals Inc
Current assignee: THEODOR KOCHER INSTITUT; Kocher Theodor Institut; Millennium Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1996-09-10
Filing date: 1997-09-10
Publication date: 2008-01-03
Anticipated expiration: 2017-09-11
Also published as: CA2265915A1; EP0925358B1; EP0925358A1; DE69737656D1; ES2288305T3; CA2265915C; WO1998011218A1; ATE360689T1; AU4260897A; JP4502408B2; AU734090B2; JP2002513388A

Description

Chemokine stellen eine Familie kleiner Cytokine dar, die bei Entzündungsreaktionen produziert werden und Leukozyten-Aktivierung steuern (Baggiolini, M. et al., Adv. Immunol. 55 (1994), 97–179; Springer, T. A., Annu. Rev. Physiol. 57 (1995), 827–872; und Schall, T. J. und Bacon, Curr. Opin. Immunol. 6 (1994), 865–873). Chemokine können selektiv Chemotaxis der gebildeten Elemente des Bluts (andere als rote Blutzellen) induzieren, einschließlich Leukozyten, wie Neutrophile, Monozyten, Makrophagen, Eosinophile, Basophile, Mastzellen und Lymphozyten, wie T-Zellen und B-Zellen. Zusätzlich zur Stimulierung der Chemotaxis können durch Chemokine selektiv andere Änderungen in antwortenden Zellen induziert werden, einschließlich Änderungen der Zellform, einem vorübergehenden Anstieg der Konzentration an intrazellulären freien Calciumionen ([Ca²⁺]_i), Granul-Exozytose, Heraufregulierung von Integrin, Bildung bioaktiver Lipide (beispielsweise Leukotrienen) und Oxidations-Ausbruch (respiratory burst), die mit Leukozyten-Aktivierung assoziiert sind. Die Chemokine sind daher frühe Auslöser der entzündlichen Antwort und bewirken eine Freisetzung von Entzündungs-Mediatoren, Chemotaxis und Extravasation von Infektions- oder Entzündungsstellen.
Zwei Unterfamilien von Chemokinen, die als CXC- und CC-Chemokine bezeichnet werden, unterscheiden sich durch die Anordnung der ersten zwei der vier konservierten Cystein-Reste, die entweder durch eine Aminosäure getrennt (wie in den CXC-Chemokinen IL-8, γIP-10, Mig, PF4, ENA-78, GCP-2, GROα, GROβ, GROγ, NAP-2, NAP-4) oder benachbart sind (wie in den CC-Chemokinen MIP-1α, MIP1β, RANTES, MCP-1, MCP-2, MCP-3, I-309). Die meisten CXC-Chemokine ziehen neutrophile Leukozyten an. So sind beispielsweise die CXC-Chemokine Interleukin 8 (IL-8) der Plateletfaktor 4 (PF4), und das Neutrophil aktivierende Peptid 2 (NAP-2) starke Chemoattraktoren und Aktivatoren von Neutrophilen. Die als CXC-Chemokine bezeichneten MIG (Monokin Induziertes Gamma Interferon) und IP-10 (γIP-10, Interferon-gamma induzierbares 10 kDa Protein) sind insbesondere bei der Induzierung der Chemotaxis aktivierter peripherer Blut-Lymphozyten aktiv. CC-Chemokine sind im Allgemeinen weniger selektiv und können eine Vielzahl von Leukozyten-Zelltypen anziehen, einschließlich Monozyten, Eosinophile, Basophile, T-Lymphozyten und natürliche Killerzellen. CC-Chemokine, wie die humanen Monozyten chemotaktischen Proteine 1–3 (MCP-1, MCP-2 und MCP-3), RANTES (Reguliert bei Aktivierung, normalerweise T-exprimiert und sezerniert), und die entzündlichen Makrophagen-Protein 1α und 1β (MIP-1α und MIP-1β) wurden als Chemoattraktoren und als Aktivatoren von Monozyten und Lymphozyten gekennzeichnet, scheinen jedoch keine Chemoattraktoren für Neutrophile zu sein.
CC- und CXC-Chemokine wirken über Rezeptoren, die zu einer Superfamilie von sieben Transmembran überspannenden G-Protein gekoppelten Rezeptoren gehören (Murphy, P. M. Ann. Rev. Immunol. 12 (1994), 593–633; Gerard, C. und N. P. Gerard Curr. Opin. Immunol. 6 (1994), 140–145). Diese Familie von G-Protein gekoppelten (Serpentinen) Rezeptoren umfasst eine grosse Gruppe integraler Membranproteine, die sieben Transmembran überspannende Regionen aufweist. Die Rezeptoren sind mit G-Proteinen gekoppelt, die heterodimere regulatorische Proteine sind, die GTP binden und eine Signalübertragung von gekoppelten Rezeptoren übermitteln können, beispielsweise durch Herstellung intrazellulärer Mediatoren.
Die Chemokin-Rezeptoren können in zwei Gruppen unterteilt werden: die CC-Chemokin-Rezeptoren 1 bis 5 (CCR1–5), die CC-Chemokine binden, und die CXC-Chemokin-Rezeptoren 1 bis 4 (CXCR1–4), die CXC-Chemokine binden. Die CC-Chemokin-Rezeptoren kommen auf mehreren Typen von Leukozyten vor und sind für die Migration von Monozyten, Eosinophilen, Basophilen und T-Zellen von Bedeutung (Qin, S. et al., Eur. J. Immunol. 26 (1996), 640–647; Carr, M. W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(9) (1994), 3652–3656; Taub, D. D. et al., J. Clin. Invest. 95(3) (1995), 1370–1376; Neote K. et al., Cell 72 (1993), 415–425; Gao, J.-L. et al., J. Exp. Med. 177 (1993), 415–425; Charo, I. F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 2752–2756; Myers, S. J. et al., J. Biol. Chem. 270 (1995), 5786–5792; Combadiere C. et al., J. Biol. Chem. 270(27) (1995), 16491–16494; und Correction, J. Biol. Chem. 270 (1995), 30235; Ponath, P. D. et al., J. Exp. Med. 183 (1996), 2437–2448; und Daugherty, B. L. et al., J. Exp. Med. 183 (1996), 2349–2354; Power, C. A. et al., J. Biol. Chem. 270 (1995), 19495–19500; Hoogewerf, A. J. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 218 (1996), 337–343; Samson, M. et al., Biochemistry, 35 (1996), 3362–3367). Im Gegensatz dazu sind die zwei IL-8-Rezeptoren, CXCR1 und CXCR2, im Grossen und Ganzen auf Neutrophile begrenzt und für die Migration von Neutrophilen wichtig (Baggiolini, M. et al., Adv. Immunol. 55 (1994), 97179). Die IL-8-Rezeptoren, CXCR1 (IL-8R1, Interleukin-8 Receptortyp 1; Holmes, W. E. et al., Science 253 (1991), 1278–1280) und CXCR2 (IL-8R2, Interleukin-8 Rezeptortyp 2; Murphy, P. M. und H. L. Tiffany, Science 253 (1991), 1280–1283) erkennen das NH₂-terminale Glu-Leu-Arg (ELR) Motiv, ein essentielles Bindungs-Epitop in CXC-Chemokinen, das Neutrophile Chemotaxis induziert (Clark-Lewis, I. et al., J. Biol. Chem., 266 (1991), 23128–23134; Hébert, C. A. et al., J. Biol. Chem. 266 (1991), 18989–18994; und Clark-Lewis, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 3574–3577).
Im Gegensatz zu Monozyten und Granulozyten sind die Lymphozyten-Antworten auf Chemokine nicht voll verstanden. Interessanterweise scheint keiner der Rezeptoren bekannter Spezifität auf Lymphozyten beschränkt zu sein und die Chemokine, die diese Rezeptoren erkennen, können daher nicht für Effekte verantwortlich sein, wie selektive Rekrutierung von T-Lymphozyten, was bei T-Zell vermittelten Entzündungszuständen beobachtet wird. Darüber hinaus verbleiben, obwohl eine Anzahl an Proteinen mit erheblicher Sequenzähnlichkeit und ähnlicher Gewebe- und Leukozyten-Subpopulations-Verteilung gegenüber bekannten Chemokin-Rezeptoren identifiziert und kloniert wurden, die Liganden für diese Rezeptoren unbekannt. Diese Rezeptoren werden daher als Waisen-Rezeptoren bezeichnet. Die Charakterisierung des/der Liganden eines Rezeptors ist für ein Verständnis der Interaktion von Chemokinen mit deren Zielzellen, der durch diese Interaktion stimulierten Abläufe, einschließlich Chemotaxis und zellulärer Aktivierung von Leukozyten, und der Entwicklung von Therapien basierend auf der Modulation der Rezeptorfunktion von Bedeutung.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG
Die vorliegende Erfindung betrifft Antikörper oder Antigen-bindende Fragmente davon und Verfahren, wie in den anliegenden Ansprüchen definiert. Proteine oder Polypeptide, wie hier definiert, können isolierte und/oder rekombinante Säuger- (beispielsweise Primaten, wie Mensch) IP-10/Mig-Rezeptorproteine sein, die als CXC-Rezeptor 3 bezeichnet werden (CXCR3), oder Varianten davon. Rekombinante CXCR3-Proteine und Varianten können in Wirtszellen wie hier beschrieben, hergestellt werden. Ein CXCR3-Protein oder eine Variante davon ist durch selektives Binden (beispielsweise hochaffines Binden) einer oder mehrerer Chemokine, wie IP-10 und/oder Mig, gekennzeichnet und/oder durch die Fähigkeit eine (ein oder mehrere) zelluläre Antwort(en) zu induzieren (beispielsweise Chemotaxis, Exocytose, Freisetzung von einem oder mehreren Entzündungsmediatoren).
Isolierte und/oder rekombinante Nukleinsäuren, die ein Säuger- (beispielsweise ein Primaten, wie Mensch) CXCR3-Protein oder eine Variante davon codieren, sind hier lediglich zur Erläuterung beschrieben.
Rekombinante Nukleinsäurekonstrukte, wie Plasmide oder retrovirale Vektoren, die eine Nukleinsäure enthalten, die ein Protein oder eine Variante davon kodiert, sind hier lediglich zur Erläuterung beschrieben. Die Nukleinsäuren und Konstrukte können dazu verwendet werden, rekombinante Rezeptorproteine und Wirtszellen, die ein Konstrukt enthalten, herzustellen. Die Nukleinsäure kann eine antisense Nukleinsäure kodieren, die mit einer zweiten Nukleinsäure, die CXCR3-Protein kodiert, hybridisieren und, nach Einbringen in eine Zelle, die Expression des Rezeptors inhibieren kann.
Die Erfindung betrifft Antikörper, wie hier definiert, die mit CXCR3-Proteinen reaktiv sind, und die beispielsweise unter Verwendung der Proteine und Varianten davon (beispielsweise einem Peptid) oder von das Rezeptorprotein oder Varianten exprimierenden Zellen als Immunogen hergestellt werden können. Derartige Antikörper oder Fragmente davon sind bei therapeutischen, diagnostischen und Forschungs-Einsätzen, einschließlich der Reinigung und der Untersuchung des Rezeptorproteins, der Identifizierung von den Oberflächerezeptor tragenden Zellen und der Sortierung oder dem Zählen von Zellen nützlich. Die vorliegende Erfindung umfasst daher die Verwendung eines Antikörpers oder eines Fragments davon, wie hier beschrieben (beispielsweise dem mAb 1C6 oder einem Antigen bindenden Fragment davon), bei der Therapie (einschließlich Prophylaxe) oder der Diagnose, und die Verwendung derartiger Antikörper oder Fragmente zur Herstellung eines Medikaments zur Verwendung bei der Behandlung von hier beschriebenen Erkrankungen oder Zuständen.
Von der vorliegenden Erfindung ebenfalls umfasst sind wie vorstehend definierte Verfahren zur Identifizierung von Liganden der Rezeptoren, Inhibitoren (beispielsweise Antagonisten) oder Promotoren (beispielsweise Agonisten) der Rezeptorfunktion. In einer Ausführungsform werden geeignete Wirtszellen, die verändert wurden, um ein von einer in die Zellen eingebrachten Nukleinsäure kodiertes Rezeptorprotein oder eine Variante zu exprimieren in einem Assay eingesetzt, um die Wirksamkeit von Liganden, Inhibitoren oder Promotoren der Rezeptorfunktion zu identifizieren und zu bewerten. Derartige Zellen sind auch bei der Bewertung der Funktion des exprimierten Rezeptorproteins oder Polypeptids nützlich.
Erfindungsgemäss können Liganden, Inhibitoren und Promotoren der Rezeptorfunktion in einem geeigneten Assay identifiziert werden, und weiter auf eine therapeutische Auswirkung bewertet werden. Inhibitoren der Rezeptorfunktion können dazu verwendet werden, die Rezeptoraktivität zu inhibieren (reduzieren und verhindern) und Liganden und/oder Promotoren können dazu verwendet werden eine normale Rezeptorfunktion, wo angezeigt, zu induzieren (auslösen oder verstärken). Die erfindungsgemässen Antikörper können zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung entzündlicher Erkrankungen verwendet werden, einschließlich Autoimmunerkrankungen und Gewebeabstossung, welche umfasst, Verabreichen eine Inhibitors einer Rezeptorfunktion an ein Individuum (beispielsweise einen Säuger).
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 ist eine Darstellung der von dem 1670 bp Insert einer cDNA bestimmten Nukleinsäuresequenz, die einen als CXCR3 bezeichneten humanen IP-10/Mig-Rezeptor kodiert, und aus einer humanen CD4⁺ T-Zell (KT30) cDNA-Bank (SEQ. ID. NR. 1) isoliert wurde. Ein offener Leseraster (69–1175) kodiert ein vorhergesagtes Protein von 368 Aminosäuren (SEQ. ID. Nr. 2). Ein mögliches poly-A-Signal und eine poly-A-Stelle sind an den Positionen 1534–1539 bzw. bei 1624–1670 angeordnet.
2 ist eine Darstellung der möglichen Translation des offenen Leserasters der Sequenz in 1, die einen humanen IP-10/Mig-Rezeptor (SEQ. ID. Nr. 2) kodiert. Pfeile zeigen mögliche N-verknüpfte Glycosylierungsstellen und horizontale Linien zeigen die Stelle der möglichen Transmembrandomänen (TM1–TM7).
Die 3A–3C sind Graphen, die die durch IP-10 und Mig in stabil transfizierten, IP-10/Mig exprimierenden Zellen induzierten Antworten zeigen. 3A ist ein Graph, der die Konzentration-abhängigen [Ca²⁺]i-Änderungen in den IP-10/Mig-transfizierten Zellen zeigen. IP-10 oder Mig wurden jeweils in einer Konzentration von 1, 10 und 100 nM zu Fura-2/AM beladenen Zellen (Pfeil) gegeben und [Ca²⁺]_i-abhängige Fluoreszenz-Änderungen wurden verzeichnet. Nicht transfizierte Zellen (niedrigere Verfolgung/untere Linie) wurden mit IP-10 oder Mig bei 100 nM bei gleichen Bedingungen stimuliert.
Die 3B ist ein Graph, der die Ergebnisse von Studien zeigt, die die Rezeptor-Desensitivierung und Quer-Desensitivierung zeigt, worin IP-10/MigR exprimierende 300–19 Zellen nacheinander mit 100 nM IP-10 oder Mig stimuliert wurden und mit IP-10 gefolgt von Mig oder umgekehrt, wobei Fluoreszenzänderungen aufgezeichnet wurden.
Die 3C ist ein Graph, der die Chemotaxis von IP-10/MigR exprimierenden Jurkat-Zellen, die mit IP-10 (ausgefüllte Kreise) oder Mig (ausgefüllte Rechtecke) stimuliert wurden, zeigt. Das untere Panel zeigt die Antwort nicht-transfizierter Jurkat-Zellen bei Stimulation mit ansteigenden Mengen an IP-10 (leere Kreise) oder Mig (leere Rechtecke). Die mittleren Werte (±SD) migrierender/wandernder Zellen pro fünf Hochleistungsfelder (high power fields) sind gezeigt.
Die 4A und 4B sind Graphen, die die Antwort peripherer Blut-Lymphozyten (PBL) auf IP-10 und Mig zeigen. Frisch isolierte PBL eines Donorblut-Leukozytenfilm wurden als solche eingesetzt (untere Linie und leere Symbole), oder wurden nach Züchten für 10 Tage in der Anwesenheit von IL-2 (400 U/ml) (obere Verfolgung und ausgefüllte Symbole) eingesetzt. Die 4A ist ein Graph, der die durch IP-10 oder Mig induzierten [Ca²⁺]_i-Änderungen zeigt. IP-10 oder Mig wurden jeweils bei 1, 10 und 100 nM mit Fura-2/AM-beladene, gezüchtete Zellen (Pfeile) zugesetzt und [Ca²⁺]_i-abhängige Fluoreszenzänderungen wurden aufgezeichnet (obere Linie). Frisch isolierte Zellen (untere Linie) wurden mit IP-10 oder Mig bei 100 nM unter den gleichen Bedingungen stimuliert. Die 4B ist ein Graph, der die Chemotaxis von PBL als Antwort auf ansteigende Konzentrationen von IP-10 (ausgefüllte Kreise) oder Mig (ausgefüllte Rechtecke) zeigt (mittlere Werte (±SD) von wandernden/migrierenden Zellen pro fünf Hochleistungsfeldern sind gezeigt).
Die 5A–5B sind Graphen, die die Bindung von radioaktiv markiertem IP-10 an mit CXCR3-cDNA transfizierte L1.2 Zellen (5A) und an aktivierte T-Zellen (5B) zeigt. Die Zellen wurden mit 0,05 nM ¹²⁵I-markiertem IP-10 in der Anwesenheit ansteigender Konzentrationen an nicht markiertem IP-10 inkubiert. Eine Scatchard-Analyse (Einsatz) zeigte 37.000 Rezeptoren pro Zelle (Kd von 614 pM) für CXCR L1.2 Transfektanten und 17.000 Rezeptoren pro Zelle (Kd von 156 pM) für CD3-Blastozysten.
Die 6 ist eine Darstellung der Spezifität des anti-CXCR3 Antikörpers 1C6, bewertet durch Anfärben stabiler L1.2-Transfektanten, die entweder CCR1, CCR3, CCR4, CCR5, CXCR1, CXCR2, CXCR3 oder CXCR4 exprimieren, mittels anti-CXCR3-Peptid mAb 1C6. Ein Anfärben als Negativkontrolle für alle L1.-Transfektanten (nicht gezeigt) ähnelte dem Anfärben, das für 1C6 auf nicht transfizierten L1.2-Zellen (L1.2 wt) gezeigt wurde.
Die 7A–7C sind Fluoreszenz-Histogramme, die die Expression von CXCR3 auf Neutrophilen (7A), Lymphozyten (7B) und aktivierten T-Zellen (7C) zeigen. Leukozyten-Untergruppen wurden im Gesamtblut durch deren Vorwärtswinkel und Seitenstreuung identifiziert und entsprechend geleitet. Um CD3-Blastozysten zu bilden, wurden PBMC mit anti-CD3 mAb für 3 Tage aktiviert und dann 7 Tage in Medien gehalten, das IL-2 enthielt. In jedem Ausdruck stellt das geschwärzte Profil ein Anfärben mit anti-CXCR3 mAB 1C6 dar und das nicht-ausgefüllte Profil stellt ein Anfärben mit einem Isotypen-angepassten Kontroll-mAb dar.
8 ist eine Reihe von Ausdrucken, die die CXCR3-Expression auf Populationen von Blutlymphozyten zeigen. Ein Zwei-Farben Anfärbe-Protokoll wurde dazu verwendet, die Expression von CXCR3 auf T-Zellen (CD3), B-Zellen (CD20) und NK-Zellen (CD56) zu bewerten.
9 ist eine Reihe von Ausdrucken, die die CXCR3-Expression, aufgetragen gegen verschiedene Marker auf der CD3+-Untermenge von Blutlymphozyten zeigen, analysiert durch drei-Farben Analyse der Immunfluoreszenz. Anti-CD3 Cy-Chrom wurde dazu verwendet, T-Zellen anzufärben und diese Zellen wurden elektronisch zur Analyse geleitet (gated). Die Quadranten wurden gemäß der Färbung der Kontroll-mAb gesetzt. Die gezeigte Anfärbung war repräsentativ für die analysierten fünf Donoren.
10 ist ein Histogramm, das die Inhibierung von IP-10- oder MCP-1-vermittelter Chemotaxis aktivierter T-Zellen durch ein Panel von anti-CXCR3-mAb. 1 × 10⁶ humane CD3-Blastocysten wurde in der oberen Kammer einer Platte mit Vertiefungen (transwell) und Chemokin (12,5 nM) wurde in die untere Kammer zugesetzt. Verschiedene CXCR3 mAb (in Gewebekulturüberstand, ohne FCS) wurden zusammen mit Zellen am Beginn des Assays in die obere Vertiefung überführt. Nach 1,5 Stunden wurden die Zellen, die zum Boden der Kammer gewandert waren, unter Verwendung von Strömungszytometrie gemessen. Die prozentuale Inhibierung der Chemotaxis wurde berechnet, wobei die Anzahl von Zellen, die in Abwesenheit von mAb wanderten, als 100% gesetzt wurde. Die Ergebnisse sind für mindestens 4 unterschiedliche Experimente repräsentativ.
11 ist ein Graph, der die Inhibierung der IP-10 vermittelten Chemotaxis durch gereinigten anti-CXCR3 mAb 1C6 zeigt. Verschiedene Konzentrationen von 1C6 mAb wurden in die obere Vertiefung überführt und der Assay wurde wie für 10 gezeigt durchgeführt. mAb 1C6 inhibierte 50% der gesamten Chemotaxis bei einer Konzentration von 856 ng/ml (IC₅₀ = 856 ng/ml).
12 ist ein Graph, der die Inhibierung der Bindung von ¹²⁵I IP-10 an aktivierte T-Zellen durch mAb 1C6 zeigt. CD3-Blastozysten wurden mit 0,05 nM ¹²⁵I-IP-10 in Anwesenheit steigender Konzentrationen von 1C6, wie gezeigt, inkubiert. Nach 60 Minuten bei Raumtemperatur wurden die Pellets gewaschen und gezählt. Die Daten wurden mittels eines Kaleidagraphen analysiert, was einen IC₅₀ von 0,16 μg/ml ergab.
Die 13A–13H zeigen die Inhibierung von [Ca²⁺]_i durch humane T-Zellen als Antwort auf IP-10, jedoch nicht Mig, mittels mAb 1C6. Anti-CD3 aktivierte, IL-2 stimulierte humane T-Zellen wurden mit Fura-2 markiert und nacheinander mit den jeweiligen Chemokinen (13A–13B) stimuliert, oder mit mAb gefolgt 40 Sekunden später durch die betreffenden Chemokine (13C–13H). [Ca²⁺]_i-Fluoreszenzänderungen wurden unter Verwendung eines Spektrofluorimeters aufgezeichnet. Die Verfolgungen waren für fünf individuelle Experimente repräsentativ. Ein Antikörper wurde in einer Endkonzentration von entweder 50 μg/ml (13C–13D); 25 μg/ml (13E); 12,5 μg/ml (13F); 6,125 μg/ml (13G); oder 3,0625 μg/ml (13H) eingesetzt. Die Chemokine wurden bei 2 nM eingesetzt.
Die 14A–14D sind Fluoreszenz-Histogramme, die die Ergebnisse einer Strömungszytometrie-Analyse zeigen, bei der CXCR3-exprimierende Transfektanden mit mAb 1C6 in der Anwesenheit von P1 Peptid (14D), P2-Peptid (14C), P3 Peptid (14D), oder in der Abwesenheit von Peptid (14A) gefärbt wurden. In jedem Ausdruck stellt das durch die dicke Linie dargestellte Profil eine Färbung mit mAb 1C6 dar und das durch die gestrichelte Linie dargestellte Profil eine Färbung mit einem Isotypen-angepassten unbedeutenden Kontrol-mAb.
15 ist ein Histogramm, das die prozentuale Inhibierung der Bindung von radioaktiv markiertem IP-10 an CXCR3-Transfektanten durch 40 nM kaltem IP-10, mAb 1C6, gegen CXCR3 Transfektanden hergestellten monoklonalen Antikörpern (2F8, 3A12, 3E2, 4B4, 4D2, 5B12, 7B8 oder 8D5) oder durch anti-CXCR2 mAb zeigt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Wie hier beschrieben wurde eine Nukleinsäure kloniert und charakterisiert, die einen neuen Chemokin-Rezeptor kodiert, der für die Chemokine IP-10 und Mig selektiv ist. Der Klon, der aus einer humanen CD4⁺-T-Zellen-Bank isoliert wurde, wurde in von Monocyten und Granulocyten abgeleiteten cDNA-Banken nicht nachgewiesen. Sequenzanalysen des Klons zeigten einen offenen Leserahmen von 1104 Basenpaaren (1, SEQ ID Nr. 1), der ein vorhergesagtes Protein von 368 Aminosäuren mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 40.659 Dalton (2, SEQ ID Nr. 2) kodiert. Die Aminosäuresequenz umfasst sieben mögliche Transmembransegmente, die für G-Protein-gekoppelte Rezeptoren gekennzeichnet sind und in anderen Chemoattraktor-Rezeptoren gefunden werden. Übereinstimmend mit dieser Beobachtung vermittelt der Rezeptor eine Ca²⁺-(Calciumion)-Mobilisierung und Chemotaxis als Antwort auf IP-10 und Mig (Beispiel 2). Unter gleichartigen Bedingungen wurde keine signifikante Antwort auf die CXC-Chemokine IL-8, GROα, NAP-2 (Neutrophilen-aktivierendes Protein-2), GCP-2 (Granulozyten-chemotaktisches Protein-2), ENA78 (epithelial abgeleitetes Neutrophilen-aktivierendes Peptide 78), PF4 (Blutplättchen-Faktor 4) oder die CC-Chemokine MCP-1 (Monozyten-chemotaktisches Protein-1), MCP-2, MCP-3, MCP-4, MIP-1α (Makrophagen entzündliches Protein-1α), MIP-1β, RANTES (reguliert auf Aktivierung, in normalen T-Zellen exprimiert und abgesondert, I309, Eotaxin oder Lymphotactin beobachtet.
Die begrenzte Expression des humanen CXCR3 in aktivierten T-Lymphozyten und die Ligandenselektivität des Rezeptors für IP-10 und Mig sind bemerkenswert. Der humane Rezeptor wird in IL-2-aktivierten T-Lymphozyten stark exprimiert, wurde jedoch unter den in Beispiel 2 verwendeten Bedingungen in ruhenden T-Lymphozyten, B-Lymphozyten, Monocyten oder Granulocyten nicht nachgewiesen. Zusätzliche Studien der Rezeptor-Verteilung zeigen, dass es hauptsächlich CD3+-Zellen sind, die CXCR3 exprimieren, umfassend Zellen, die CD95+, CD45RO+ und CD45RA^niedrig sind, ein Phänotyp, der mit einer vorausgegangenen Aktivierung übereinstimmt, obwohl ein Teil der CD20+ (B)-Zellen und CD56+ (NK)-Zellen diesen Rezeptor ebenfalls exprimieren. Die selektive Expression in aktivierten T-Lymphozyten ist von Interesse, da andere Rezeptoren für Chemokine, von denen berichtet wird, dass sie Lymphozyten anziehen (beispielsweise MCP-1, MCP-2, MCP-3, MIP-1α, MIP-1β und RANTES) ebenfalls in Granulozyten, wie Neutrophilen, Eosinophilen und Basophilen, sowie Monocyten gefunden werden. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass der als CXCR3 bezeichnete IP-10/Mig-Rezeptor an der selektiven Rekrutierung von Effektor-T- Zellen beteiligt ist.
Der Rezeptor erkennt zwei ungewöhnliche CXC-Chemokine, die als IP-10 und Mig bezeichnet werden. Obwohl sowohl IP-10 als auch Mig, im Unterschied zu IL-8 und anderen CXC-Chemokinen, die starke Chemoattraktoren für Neutrophile sind, zu der CXC-Superfamilie gehören, sind die primären Ziele von IP-10 und Mig Lymphozyten, insbesondere Effektor-Zellen, wie aktivierte oder stimulierte T-Lymphozyten und natürliche Killerzellen (NK) (Taub, D. D. et al., J. Exp. Med. 177 (1993), 18090–1814; Taub, D. D. et al., J. Immunol. 155 (1995), 3877–3888). (NK-Zellen sind größere, granuläre Lymphozyten, denen ein spezifischer T-Zell-Rezeptor zur Antigenerkennung fehlt, die jedoch eine zytolytische Aktivität gegen Zellen, wie Tumorzellen und von Viren infizierten Zellen besitzen.) Übereinstimmend fehlt IP-10 und Mig das ELR-Motiv, ein wesentliches Bindungsepitop in derartigen CXC-Chemokinen, das eine Neutrophilen-Chemotaxis wirksam induziert (Clark-Lewis, I. et al., J. Biol. Chem. 266 (1991), 23128–23134; Hébert, C. A. et al., J. Biol. Chem. 266 (1991), 18989–18994; und Clark-Lewis, I. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 3574–3577). Zusätzlich wurde berichtet, dass sowohl rekombinantes, humanes Mig als auch rekombinantes, humanes IP-10 einen Calcium-Fluss im Tumor-infiltrierenden Lymphozyten (TIL) induzieren (Liao, F. et al., J. Exp. Med. 182 (1995), 1301–1314). Obwohl berichtet wurde, dass IP-10 eine Chemotaxis von Monozyten in vitro induziert (Taub, D. D. et al., J. Exp. Med. 177 (1993), 1809–1814), wurde der verantwortliche Rezeptor nicht identifiziert, humanes Mig erscheint hoch selektiv und zeigt keine derartige Wirkung (Liao, F. et al., 1995, J. Exp. Med., 182: 1301–1314). Eine IP-10-Expression wird in einer Vielzahl von Geweben bei entzündlichen Bedingungen, wie Psoriasis, fixes Arzneimittelexanthem, Haut-Allergien vom Spättyp bzw. DTH (cutaneous delayed-type hypersensitivity responses), tuberkuloide Leprosis, und in experimenteller Glumerulonephritis und experimenteller allergischer Encephalomyelitis induziert. IP-10 weist weiter in vivo eine starke Antitumorwirkung auf, die T-Zell abhängig ist, und ist berichtetermassen in vivo ein Inhibitor der Angiogenese, und kann eine Chemotaxis und Degranulierung von NK-Zellen in vitro induzieren, was eine Rolle als ein Mediator einer NK-Zellen-Rekrutierung und Degranulierung vermuten lässt (beispielsweise bei einer Zerstörung von Tumorzellen) (Luster, A. D. und P. Leder, J. Exp. Med., 178 (1993), 1057–1065; Luster, A. D. et al., J. Exp. Med. 182 (1995), 219–231; Angiolillo, A. L. et al., J. Exp. Med. 182 (1995), 155–162; Taub, D. D. et al., J. Immunol. 155 (1995), 3877–3888). Die Expressionsmuster von IP-10 und Mig sind ebenfalls dadurch verschieden, dass eine Expression von beiden durch Gamma-Interferon (IFNγ) induziert wird, während die Expression von IL-8 durch IFNγ herunter reguliert wird (Luster, A. D. et al., Nature 315 (1985), 672–676; Farber, J. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 5238–5242; Farber, J. M., Biochem. Biophys. Res. Commun., 192(1) (1993), 223–230, Liao, F. et al., J. Exp. Med. 182 (1995), 1301–1314; Seitz, M. et al., J. Clin. Invest. 87 (1991), 463–469; Galy, A. H. M. und H. Spits, J. Immunol. 147 (1991), 3823–3830).
Kürzlich wurden Chemokine also die lange gesuchten Mediatoren der Rekrutierung von Lymphozyten erkannt. Es wurde gefunden, dass mehrere CC-Chemokine eine Lymphozyten-Chemotaxis auslösen (Loetscher P. et al., FASEB J. 8 (1994), 1055–1060), wobei sie jedoch ebenfalls aktiv sind bei Granulocyten und Monocyten (Uguccioni, M. et al., Eur. J. Immunol. 25 (1995), 64–68; Baggiolini, M. und C. A. Dahinden, Immunol. Today 15 (1994), 127–133). Die Situation ist für IP-10 und Mig verschieden, die in ihrer Wirkung auf Lymphozyten, umfassend aktivierte T-Lymphozyten und NK-Zellen, selektiv sind und die CXCR3 binden, ein Rezeptor, der viele andere Chemokine nicht erkennt und der ein selektives Expressionsmuster zeigt (Beispiel 2, Beispiel 5).
Angesichts dieser Beobachtungen ist es sinnvoll anzunehmen, dass die Bildung der charakteristischen Infiltrate in entzündlichen Verletzungen, wie Verletzungen von Allergien von Spättyp, Stellen von viralen Infektionen und bestimmte Tumore, ein Prozess ist, der mittels CXCR3 vermittelt und durch eine CXCR3-Expression reguliert wird. Lymphozyten, insbesondere T-Lymphozyten, die einen CXCR3-Rezeptor als ein Ergebnis einer Aktivierung tragen, können zu entzündlichen Verletzungen, Infektionsstellen oder Tumoren durch IP-10 und/oder Mig rekrutiert werden, die lokal durch Gamma-Interferon induziert werden können. Somit spielt CXCR3 eine Rolle bei der selektiven Rekrutierung von Lymphozyten, insbesondere von Effektor-Zellen, wie aktivierte oder stimulierte T-Lymphozyten.
Proteine und Peptide
Isolierte und/oder rekombinante (umfassend beispielsweise im Wesentlichen reine) Proteine oder Polypeptide werden hier lediglich zur Erläuterung beschrieben. Sie werden als Säuger-CXCR3-Proteine und Varianten davon bezeichnet. Die isolierten und/oder rekombinanten Proteine weisen mindestens ein Merkmal, eine Aktivität oder Funktion auf, das/die für ein Säuger-CXCR3-Protein (wie hier definiert) kennzeichnend ist, wie eine Bindungs aktivität (beispielsweise Binden eines Liganden, Inhibitors und/oder Promotors), eine Signalisierungs-Aktivität (beispielsweise Aktivierung eines Säuger-G-Proteins, Induktion eines schnellen und transienten Anstiegs der Konzentration an im Cytosol frei vorkommenden Calcium [Ca²⁺]_i, zelluläre Antwortfunktion (beispielsweise Stimulierung einer Chemotaxis, Exozytose oder Freisetzung von Entzündungsmediator durch Leukozyten) und/oder ein immunologisches Merkmal, wie hier definiert. So können beispielsweise einige Proteine selektiv an IP-10 und/oder Mig binden, eine zelluläre Signalisierung und/oder eine Antwort darauf in vitro und/oder in vivo vermitteln (beispielsweise Calcium-Fluss, Chemotaxis und/oder Degranulation, insbesondere von aktivierten T-Lymphozyten). So kann beispielsweise, wie hier gezeigt, ein humanes CXCR3-Protein, das in einer Säugetierzelle durch Expression eines cDNA-Klons erzeugt wurde, selektiv an die CXC-Chemokine IP-10 und/oder Mig binden und eine Signalisierung und eine zelluläre Antwort (beispielsweise Chemotaxis) vermitteln. Hier offenbarte Proteine können an ein CXC-Chemokin der gleichen oder einer unterschiedlichen Säugerspezies binden (beispielsweise humanes IP-10, murines IP-10, humanes Mig, murines Mig) (humanes IP-10, Luster, A. D. et al., Nature 315 (1985), 672–676; murines IP-10 (ebenfalls als CRG-2 bezeichnet), Vanguri, P. und J. M. Farber, J. Biol. Chem. 265 (1990), 15049, und Luster, A. D. und P. Leder, J. Exp. Med. 178 (1993), 1057–1065; murines Mig, Farber, J. M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87 (1990), 5238–5242; humanes Mig, Farber, J. M., Biochem. Biophys. Res. Commun. 192(1) (1993), 223–230 und Liao, F. et al., J. Exp. Med. 182 (1995), 1301–1314).
Proteine oder Polypeptide, die hier als "isoliert" bezeichnet werden, sind Proteine oder Polypeptide, die über einen Zustand gereinigt werden, in dem sie in Säugerzellen vorliegen, wobei sie Proteine oder Polypeptide umfassen, die durch hier beschriebene Verfahren, ähnliche Verfahren oder andere geeignete Verfahren erhalten wurden, wobei umfasst sind im Wesentlichen reine Proteine oder Polypeptide, Proteine oder Polypeptide, die durch chemische Synthese (beispielsweise synthetische Peptide) oder durch Kombinationen von biologischen und chemischen Verfahren erzeugt wurden, und rekombinante Proteine oder Polypeptide, die isoliert wurden. Die Proteine können in einem isolierten Zustand von mindestens ungefähr 50 Gew.-% erhalten werden, vorzugsweise mindestens ungefähr 75 Gew.-% oder in einer im Wesentlichen reinen Form. Proteine oder Polypeptide, die hier als "rekombinant" bezeichnet werden, sind Proteine oder Polypeptide, die durch Expression rekombinanter Nukleinsäuren erzeugt werden.
Wie hier verwendet bezieht sich "Säuger-CXCR3-Protein" auf natürlich vorkommende oder endogene Säuger-CXCR3-Proteine und auf Proteine, die eine Aminosäuresequenz aufweisen, die die gleiche wie die eines entsprechenden natürlich vorkommenden oder endogenen Säuger-CXCR3-Proteins ist (beispielsweise rekombinante Proteine). Folglich umfasst, wie hier definiert, der Begriff "Säuger-CXCR3-Protein" reifes Protein, polymorphe oder allelische Varianten und andere Isoformen eines Säuger-CXCR3 (beispielsweise erzeugt durch alternatives Spleißen oder andere zelluläre Prozesse) und modifizierte oder nicht-modifizierte Formen der vorstehend aufgeführten (beispielsweise glycosylierte, nicht-glykosylierte, phoshorylierte oder nicht-phosphorylierte CXCR3-Proteine). Natürlich vorkommende oder endogene Säuger-CXCR3-Proteine umfassen Wildtyp-Proteine, wie reifes CXCR3, polymorphe oder allelische Varianten und andere Isoformen, die natürlicherweise in Säugern (beispielsweise Menschen, nicht-humanen Primaten) vorkommen. Derartige Proteine können beispielsweise aus einer Quelle gewonnen werden, die natürlicherweise Säuger-CXCR3 erzeugt. Diese Proteine und Säuger-CXCR-3-Proteine, die die gleiche Aminosäuresequenz wie eine entsprechendes natürlich vorkommendes oder endogenes Säuger-CXCR3, aufweisen, werden durch den Namen des entsprechenden Säugetiers gekennzeichnet. Ist beispielsweise das entsprechende Säugetier ein Mensch, wird das Protein als ein humanes CXCR3-Protein bezeichnet (beispielsweise ein rekombinantes humanes CXCR3, das in einer geeigneten Wirtszelle erzeugt bzw. hergestellt wird).
"Funktionale Varianten" von Säuger-CXCR3-Proteinen umfassen funktionale Fragmente, funktionale mutante Proteine und/oder funktionale Fusionsproteine (beispielsweise mittels Mutagenese und/oder Rekombinationstechniken erzeugt). Im Allgemeinen umfassen Fragmente oder Abschnitte bzw. Bereiche von Säuger-CXCR3-Protein solche, die eine Deletion (d.h. eine oder mehrere Deletionen) einer Aminosäure (d.h. von einer oder mehrere Aminosäuren) in Bezug auf das reife Säuger-CXCR3-Protein aufweisen (wie N-terminale, C-terminale oder interne Deletionen). Ebenfalls sind Fragmente oder Abschnitte, in denen lediglich in Bezug auf das reife Säuger-CXCR3-Protein aufeinanderfolgende Aminosäuren deletiert sind oder in denen nicht aufeinanderfolgende Aminosäuren deletiert sind, ins Auge gefasst.
Im Allgemeinen umfassen Mutanten oder Derivate von Säuger-CXCR3-Proteinen natürliche und artifizielle Varianten, die sich durch die Addition, Deletion und/oder Substitution von einer oder mehrerer aufeinanderfolgender oder nicht-aufeinanderfolgender Aminosäurereste unterschieden, oder modifizierte Polypeptide, bei denen ein oder mehrere Reste modifiziert ist/sind und Mutanten, die einen oder mehrere modifizierte Reste umfassen.
Mutanten können natürliche und artifizielle Varianten von Säuger-CXCR3-Proteinen sein, die sich durch die Addition, Deletion und/oder Substitution von einer oder mehrerer aufeinanderfolgender oder nicht-aufeinanderfolgender Aminosäurereste unterschieden. Derartige Mutationen können beispielsweise in einer konservierten Region oder einer nicht-konservierten Region (verglichen mit anderen CXC- und/oder CC-Chemokin-Rezeptoren), einer extrazellulär, cytoplasmatischen Region oder Transmembranregion sein.
Ein "funktionales/r Fragment oder Anschnitt", ein "funktionaler Mutant" und/oder ein "funktionales Fusionsprotein" eines Säuger-CXCR3-Proteins betrifft ein isoliertes und/oder rekombinantes Protein oder Oligopeptid, das mindestens ein Merkmal, eine Aktivität oder Funktion aufweist, das/die für ein Säuger-CXCR3-Protein (wie hier definiert) kennzeichnend ist, wie eine Bindungsaktivität (beispielsweise Binden eines Liganden, Inhibitors und/oder Promotors), eine Signalisierungs-Aktivität (beispielsweise Aktivierung eines Säuger-G-Proteins, Induktion eines schnellen und transienten Anstiegs der Konzentration an im Cytosol frei vorkommenden Calcium [Ca²⁺]_i, eine zelluläre Antwortfunktion (beispielsweise Stimulierung einer Chemotaxis, Exocytose oder Freisetzung von Entzündungsmediator durch Leukozyten) und/oder ein immunologisches Merkmal, wie hier definiert.
Wie hier verwendet, ist eine Protein oder Polypeptide mit "mindestens einem immunologischen Merkmal" eines Säuger-CXCR3-Proteins eines, das (a) durch mindestens einen Antikörper mit einer ausgewählten Epitop-Spezifität gebunden wird, die an ein natürlich vorkommendes oder endogenes Säuger-CXCR3-Protein oder ein Protein bindet, das die gleiche Aminosäuresequenz, wie das natürlich vorkommende oder endogene Säuger-CXCR3-Protein (beispielsweise humanes CXCR3) aufweist und/oder (b) ein Immunogen ist, das (beispielsweise wenn es an einen geeigneten Träger konjugiert ist) in einem geeigneten Tier die Bildung eines Antikörpers mit einer ausgewählten Epitop-Spezifität induzieren kann, die an natürlich vorkommendes oder endogenes Säuger-CXCR3 oder ein Protein bindet, das die gleiche Aminosäuresequenz wie das natürlich vorkommende oder endogene Säuger-CXCR3 aufweist. So kann beispielsweise ein geeignetes Fragment mit einem Antikörper kreuzreagieren, der gerichtet ist gegen und/oder reaktiv ist mit isoliertem Säuger-CXCR3.
Geeignete Fragmente oder Mutanten können durch ein Screenen bzw. Durchmustern identifiziert werden. So können beispielsweise die N-terminalen, C-terminalen oder internen Regionen des Proteins in einer schrittweisen Art und Weise deletiert werden und das so erhaltene Protein oder Polypeptid kann durch Verwendung eines geeigneten Assays bzw. Tests durchmustert werden, wie durch einen hier beschriebenen Assay (beispielsweise Chemotaxis, Calcium-Fluss). Zeigt das so erhaltene Protein in dem Assay eine Aktivität, ist das so erhaltene Protein ("Fragment") funktional. Eine Information bezüglich der Struktur und Funktion von Säuger-G-Protein-gekoppelten Rezeptoren, umfassend CXC-Chemokin- und CC-Chemokin-Rezeptoren, liefert eine Basis zum Unterteilen von Säuger-CXCR3-Proteinen in funktionale Domainen (Murphy, P. M., 1994, Annu. Rev. Immunol., 12: 593–633 und Gerard, C. und N. P. Gerard, 1994, Curr. Opin. Immunol., 6: 140–145 sowie darin aufgeführter Quellen).
Der Begriff Variante umfasst ebenfalls Fusionsproteine, umfassend Säuger-CXCR3-Proteine (beispielsweise humanes CXCR3) als einen ersten Rest bzw. Teil, der mit einem zweiten Rest verknüpft bzw. verbunden ist, der in dem Säuger-CXCR3, wie es in der Natur gefunden wird, nicht auftritt. Somit kann der zweite Rest eine Aminosäure sein, ein Oligopeptid oder ein Polypeptid. Der erste Rest kann N-terminal, C-Terminal oder intern in dem Fusionsprotein lokalisiert sein. Das Fusionsprotein kann als den ersten Rest einen Affinitätsliganden umfassen (beispielsweise eine(n) Enzym-, Antigen-, Epitop-Markierung bzw. Tag) und einen zweiten Rest, der eine Linkersequenz und humanes CXCR3 oder einen Abschnitt davon umfasst.
Beispiele für Säuger-CXCR3-Proteine umfassen Proteine, die durch eine hier beschriebene Nukleinsäure kodiert werden, wie ein Protein mit einer Aminosäuresequenz, die in 2 (SEQ ID Nr. 2) dargelegt oder im Wesentlichen dargelegt ist. So kann ein Säuger-CXCR3 oder eine Variante (beispielsweise eine das extrazelluläre N-terminale Segment umfassende Variante) eine Aminosäuresequenz aufweisen, die mindestens ungefähr 50% identisch, noch bevorzugter mindestens ungefähr 70% identisch und noch mehr bevorzugt mindestens ungefähr 80% identisch zu dem in 2 (SEQ ID Nr. 2) gezeigten Protein ist.
Es ist klar, dass isolierte und/oder rekombinante Säuger-CXCR3-Proteine und Varianten davon modifiziert werden können, beispielsweise durch Inkorporation von oder durch Anfügen (direkt oder indirekt (beispielsweise mittels eines Linkers)) von einem nachweisbaren Marker, wie ein Radioisotop, ein Spin-Marker, ein Antigen (beispielsweise eine Epitop-Marker wie einer FLAG-Markierung) oder eine Enzym-Marker, eine fluoreszierende oder chemolumineszierende Gruppe oder dergleichen.
Nukleinsäuren, Konstrukte und Vektoren
Es werden hier isolierte und/oder rekombinante (umfassend beispielsweise im Wesentlichen reine) Nukleinsäuren beschrieben, die eine Sequenz aufweisen, die ein Säuger-CXCR3-Protein (beispielsweise humanes) oder Varianten davon kodieren. Nukleinsäuren, die hier als "isoliert" bezeichnet werden, sind Nukleinsäuren, die von den Nukleinsäuren der genomischen DNA oder zellulärer RNA von deren Ursprungsquelle (wie es beispielsweise in Zellen oder in einem Gemisch von Nukleinsäuren, wie einer Bank, vorliegt) abgetrennt wurden und die einer weiteren Bearbeitung unterzogen worden sein können. "Isolierte" Nukleinsäuren umfassen Nukleinsäuren, die durch hier beschriebene Verfahren, ähnliche Verfahren oder andere geeignete Verfahren erhalten wurden, wobei umfasst sind im Wesentlichen reine Nukleinsäuren, Nukleinsäuren, die durch chemische Synthese, durch Kombinationen von biologischen und chemischen Verfahren erzeugt wurden und isolierte rekombinante Nukleinsäuren. Nukleinsäuren, die hier als "rekombinant" bezeichnet werden, sind Nukleinsäuren, die durch DNA-Rekombinationsverfahren erzeugt wurden, umfassend solche Nukleinsäuren, die durch Techniken erzeugt werden, die auf Verfahren einer artifiziellen Rekombination beruhen, wie die Polymerasekettenreaktion (PCR) und/oder Klonieren in einen Vektor unter Verwendung eines Restriktionsenzyms. "Rekombinante" Nukleinsäuren sind ebenfalls solche, die von Rekombinationsereignissen herrühren, die durch die natürlichen Mechanismen der Zellen auftreten, auf die jedoch nach Einführen von Nukleinsäuren in die Zellen, die derart aufgebaut, dass ein gewünschtes Rekombinationsereignis ermöglicht und wahrscheinlich wird, selektioniert werden.
Die Nukleinsäure oder ein Abschnitt davon kann ein Protein oder Polypeptid kodieren, das mindestens eine Funktion aufweist, die für ein Säuger-CXCR3-Protein (beispielsweise einen humanen CXCR3-Rezeptor) kennzeichnend ist, wie eine Bindungsaktivität (beispielsweise Binden eines Liganden, Inhibitors und/oder Promotors), eine Signalisierungs-Aktivität (beispielsweise Aktivierung eines Säuger-G-Proteins, Induktion eines schnellen und transienten Anstiegs der Konzentration an im Cytosol frei vorkommenden Calcium [Ca²⁺]_i, und/oder Stimulierung einer zelluläre Antwort (beispielsweise Stimulierung einer Chemo taxis, Exocytose oder Freisetzung von Entzündungsmediator durch Leukozyten). Es werden hier im Speziellen isolierte und/oder rekombinante Nukleinsäuren oder ein Abschnitt davon beschrieben, die Sequenzen umfassen, die einen Säuger-CXCR3-Rezeptor oder einen Abschnitt davon kodieren. Ebenfalls sind hier im Speziellen isolierte und/oder rekombinante Nukleinsäuren beschrieben, die Sequenzen umfassen, die ein humanes CXCR3-Protein kodieren.
Hier beschriebene isolierte und/oder rekombinante Nukleinsäuren umfassen doppel- oder einzelsträngige DNA oder RNA, die gekennzeichnet sind durch (1) ihre Fähigkeit zu hybridisieren mit (a) einer Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID Nr. 1, (b) einer Nukleinsäure mit einer zur SEQ ID Nr. 1 komplementären Sequenz oder (c) einem Abschnitt der vorstehend aufgeführten, der den offenen Leserahmen der SEQ ID Nr. 1 umfasst (ein Abschnitt von dem in 1 gezeigten Strang oder dem entsprechenden Abschnitt des komplementären Strangs); und/oder (2) ihre Fähigkeit ein Polypeptid zu kodieren, das die Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 aufweist, oder ein funktionales Äquivalent davon (d.h. ein Polypeptid mit einer Ligandenbindungsaktivität für einen oder mehrere natürliche(n) oder physiologische(n) Liganden des Rezeptors und/oder mit einer stimulatorische Funktion als Antwort auf ein Binden eines Liganden, so dass es eine zelluläre Antwort induzieren kann (beispielsweise Induktion (umfassend Auslösen (triggering) oder Stimulieren) einer Chemotaxis, Exozytose oder Freisetzung von Entzündungsmediator durch Leukozyten); und/oder (3) durch beide Eigenschaften.
Der Prozentsatz der Aminosäuresequenzidentität zwischen SEQ ID Nr. 2 und funktionalen Äquivalenten davon wird in einem erläuternden Beispiel mit mindestens ungefähr 60% (≥ 60%) beschrieben. Funktionale Äquivalente von SEQ ID Nr. 2 weisen zumindest eine ungefähr 70%ige Sequenzidentität mit SEQ ID Nr. 2 auf. Noch bevorzugter beträgt der Prozentsatz der Aminosäuresequenzidentität zwischen SEQ ID Nr. 2 und funktionalen Äquivalenten davon mindestens ungefähr 80% und noch mehr bevorzugt mindestens ungefähr 90%.
Isolierte und/oder rekombinante Nukleinsäuren, die diese Kriterien erfüllen, umfassen Nukleinsäuren mit Sequenzen, die identisch mit Sequenzen von natürlich vorkommenden Säuger-CXCR3-Rezeptoren und Abschnitten davon sind oder mit Varianten der natürlich vorkommenden Sequenzen. Derartige Varianten umfassen Mutanten, die sich durch Addition, Deletion oder Substitution von einem oder mehrerer Reste unterscheiden, modifizierte Nukleinsäuren, bei denen ein oder mehrere Reste modifiziert sind (beispielsweise DNA- oder RNA-Analoga) und Mutanten, die einen oder mehrere modifizierte Reste umfassen. Die Nukleinsäure kann mindestens ungefähr 50% Nukleotidsequenzähnlichkeit zeigen, noch bevorzugter mindestens ungefähr 75% Nukleotidsequenzähnlichkeit und noch mehr bevorzugt mindestens ungefähr 90% Nukleotidsequenzähnlichkeit mit einem Strang der in SEQ ID Nr. 1 gezeigten Sequenz oder mit der kodierenden Region davon. Hier beschriebene Nukleinsäuren können Längen von mindestens ungefähr 40 Nukleotiden, noch bevorzugter mindestens ungefähr 50 Nukleotiden und noch mehr bevorzugt mindestens ungefähr 75 Nukleotiden aufweisen.
Derartige Nukleinsäuren können beispielsweise durch Hybridisierung unter hoch stringenten Bedingungen oder mäßig stringenten Bedingungen nachgewiesen und isoliert werden. "Hoch stringente Bedingungen" und "mäßig bzw. moderat stringente Bedingungen" für Nukleinsäurehybridisierungen werden auf den Seiten 2.10.1–2.10.16 (siehe insbesondere 2.10.8–11) und den Seiten 6.3.1–6 in Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. M. et al., Herausgeber, Band 1, Suppl. 26, 1991) erklärt. Faktoren wie Sondenlänge, Basenzusammensetzung, prozentuale Fehlpaarung zwischen den hybridisierenden Sequenzen, Temperatur und Ionenstärke, beeinflussen die Stabilität der Nukleinsäurehybride. Somit können hohe oder mäßige Stringenzbedingungen empirisch bestimmt werden, um die gewünschte Selektivität zu erreichen.
Isolierte und/oder rekombinante Nukleinsäuren, die gekennzeichnet sind durch ihre Fähigkeit an eine Nukleinsäure mit der Sequenz SEQ ID Nr. 1 oder dem Komplement davon (beispielsweise unter hohen oder mäßigen Stringenzbedingungen) zu hybridisieren, können ferner ein Protein oder Polypeptid kodieren, das mindestens eine Funktion aufweist, die für ein Säuger-CXCR3-Protein (beispielsweise ein humanes CXCR3-Protein) kennzeichnend ist, wie eine Bindungsaktivität (beispielsweise Binden eines Liganden, Inhibitors und/oder Promoters), eine Signalisierungs-Aktivität (beispielsweise Aktivierung eines Säuger-G-Proteins, Induktion eines schnellen und transienten Anstiegs der Konzentration an im Cytosol frei vorkommenden Calcium [Ca²⁺]_i‚ und/oder Stimulierung einer zelluläre Antwort (beispielsweise Stimulierung einer Chemotaxis, Exocytose oder Freisetzung von Entzündungsmediator durch Leukozyten).
Die hier beschriebene humane CXCR3-Nukleinsäure oder ausreichende Abschnitte davon, ob isoliert, rekombinant und/oder synthetisch, umfassend durch PCR erzeugte Fragmente, können als Sonden oder Primer verwendet werden, um Nukleinsäuren (beispielsweise genomische DNA, allelische Varianten, cDNA) nachzuweisen und/oder zu gewinnen, die CXCR3-Rezeptoren (Homologe) oder andere verwandte Rezeptorgene (beispielsweise neue CXC-Chemokin-Rezeptorgene) aus anderen Säugerspezies kodieren, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf Primaten (beispielsweise ein nicht-humaner Primat, wie eine Affe (beispielsweise Javaneraffe (cynomolgus monkey)), Rind, Schaf, Pferd, Hund, Katze und Nager (beispielsweise Meerschweinchen, mausartige Spezies, wie Ratte und Maus). Dies kann durch Verwendung der hier beschriebenen Techniken bzw. Methoden oder anderer geeigneter Verfahren erzielt werden, umfassend Hybridisierung, PCR oder andere geeignete Techniken. Es können Nukleinsäuren aus Säugern verwendet werden, um Konstrukte (beispielsweise Vektoren), Rezeptoren oder Fragmente davon und Wirtsstämme herzustellen, die in der Herstellung und in Verfahren zur Verwendung des Rezeptors nützlich sind.
Eine Nukleinsäure, die ein Säuger-CXCR3-Protein (oder eine Variante) kodiert, kann durch Verfahren, wie PCR-Amplifikation, erzeugt werden. So können beispielsweise passende Primer (beispielsweise ein Paar von Primers oder ineinander geschachtelten (nested) Primern) gestaltet werden, die eine Sequenz umfassen, die komplementär oder in Wesentlichen komplementär zu einem Abschnitt der hier beschriebenen humanen CXCR3-cDNA ist. So können beispielsweise Primer gestaltet werden, die komplementär zu den 5'- oder 3'-Enden der kodierenden Sequenz sind und/oder die kodierende Sequenz flankieren. Derartige Primer können beispielsweise in einer Polymerasekettenreaktion mit einer geeigneten Nukleinsäurevorlage verwendet werden, um eine Nukleinsäure zu erhalten, die ein Säuger-CXCR3 kodiert. Geeignete Vorlagen umfassen beispielsweise hier beschriebene Konstrukte (wie pcDNA3-Klon8), eine cDNA- oder genomische Bank oder andere geeignete Quellen von Säuger-cDNA oder genomischer Säuger-DNA (beispielsweise eines Menschen, Primaten). Die Primer können, soweit erforderlich, Abschnitte enthalten, die komplementär zu flankierenden Sequenzen eines Konstrukts sind, das als eine Vorlage ausgewählt wurde.
Die bindende Funktion eines Proteins oder Polypeptides (beispielsweise durch eine hybridisierende Nukleinsäure kodiert) kann in Bindungs- oder Bindungsinhibierungs-Assays nachgewiesen werden, wobei beispielsweise Rezeptor enthaltende Membranfraktionen oder Rezeptor exprimierende Zellen verwendet werden (siehe beispielsweise Van Riper et al., J. Exp. Med. 177 (1993), 851–856; Sledziewski et al., US-P-5,284,746 (8. Februar 1994). Somit kann die Fähigkeit des kodierten Proteins oder Polypeptides einen Liganden, wie IP-10 oder Mig, einen Inhibitor und/oder Promotor zu binden, bestimmt werden. Die antigenischen Merkmale der durch Nukleinsäuren kodierten Proteine oder Polypeptide können durch immunologische Verfahren bestimmt werden, die Antikörper einsetzen, die an Säuger-CXCR3 binden, wie Immunoblotting, Immunopräzipitation und Immunoassay (beispielsweise Radioimmunoassay, ELISA).
Die Signalisierungs-Aktivität eines Proteins oder Polypeptides (beispielsweise kodiert durch hybridisierende Nukleinsäure) kann durch enzymatische Assays für G-Protein-Aktivität, die auf eine Rezeptorbindung reagiert, bestimmt werden (beispielsweise Austausch von GTP durch GDP an der α-Untereinheit des G-Proteins, wobei Membranfraktionen verwendet werden). Eine G-Protein-Kopplung kann ferner beispielsweise durch Assays bestimmt werden, in denen eine Stimulierung durch G-Protein mittels Behandlung oder Vorbehandlung der Zellen oder einer geeigneten zellulären Fraktion (beispielsweise Membranen) mit spezifischen G-Protein-Inhibitoren blockiert ist, wie das Bordetella pertussis-Toxin (Bischoff, S. C. et al., Eur. J. Immunol. 23 (1993), 761–767; Sozzani, S. et al., J. Immunol. 147 (1991), 2215–2221).
Die stimulierende Funktion eines Proteins oder Polypeptides (beispielsweise kodiert durch hybridisierende Nukleinsäure) kann durch Standardassays für Chemotaxis oder Mediator-Freisetzung nachgewiesen werden, wobei Zellen verwendet werden, die das Protein oder Polypeptid exprimieren (beispielsweise Assays, die beobachten eine Chemotaxis, Exocytose (beispielsweise Degranulation von Enzymen, wie Esterasen (beispielsweise Serin-Esterasen), Perforin, Granzyme) oder Mediator-Freisetzung (beispielsweise Histamin, Leukotrien) als Antwort auf einen Liganden (beispielsweise einem Chemokin, wie IP-10 oder Mig) oder einen Promotor (siehe beispielsweise Taub, D. D. et al., J. Immunol. 155 (1995), 3877–3888; Baggliolini, M. und C. A. Dahinden, Immunology Today 15 (1994), 127–133 und dort zitierte Quellen). Funktionseigenschaften eines Säuger-CXCR3-Rezeptors können durch andere geeignete Verfahren ebenfalls bestimmt werden.
Diese Verfahren, alleine oder in Kombination mit anderen geeigneten Verfahren, können in Techniken/Methoden zur Identifizierung und/oder Isolierung von Nukleinsäuren ebenfalls verwendet werden, die ein Polypeptid mit der Aminosäuresequenz SEQ ID Nr. 2 oder funktionaler Äquivalente davon und mit einer durch den Assay nachgewiesen Aktivität kodieren. In dieser Art und Weise können weiter Abschnitte der isolierten Nukleinsäuren, die Polypeptidabschnitte von SEQ ID Nr. 2 mit einer bestimmten Funktion kodieren, identifiziert und isoliert werden.
Die Nukleinsäuren können für die Herstellung der Proteine oder Polypeptide verwendet werden. So kann beispielsweise eine Nukleinsäure, die die gesamte kodierende Sequenz für einen Säuger-CXCR3-Rezeptor oder einen Teil davon enthält, oder DNA, die an die Sequenz SEQ ID Nr. 1 hybridisiert, oder das Komplement davon in ein Konstrukt inkorporiert werden, um die Sequenz weiter zu manipulieren oder um das kodierte Polypeptide in geeigneten Wirtszellen zu herzustellen. So können beispielsweise Nukleinsäuren durch Inkorporierung von oder Anfügen (direkt oder indirekt) von einem nachweisbaren Marker, wie einem Radioisotop, einem Spin-Marker, einem Antigen- oder Enzym-Marker, einer fluoreszierende oder chemolumineszierende Gruppe und dergleichen.
Antisense-Konstrukte
Die hier beschriebene Nukleinsäure kann eine antisense-Nukleinsäure sein, die im Ganzen oder in einem Teil komplementär zu einem Zielmolekül ist, die den Sense-Strang umfasst, und mit dem Zielmolekül hybridisieren kann. Das Ziel kann DNA oder deren RNA-Duplikat sein (d.h. worin T-Reste der DNA U-Reste in dem RNA-Duplikat sind). Unter Verwendung geeigneter Verfahren in eine Zelle eingeführt, kann eine Antisense Nukleinsäure die Expression des durch den Sense-Strang kodierten Gens unterdrücken. Antisense Nukleinsäuren können durch Standardtechniken hergestellt werden.
Die antisense-Nukleinsäure kann gänzlich oder teilweise komplementär sein zu und kann hybridisieren mit einer Zielnukleinsäure, wobei die Zielnukleinsäure mit einer Nukleinsäure mit der Sequenz des Komplements von SEQ ID Nr. 1 hybridisieren kann. So kann beispielsweise die antisense-Nukleinsäure komplementär zu einer Ziel-Nukleinsäure sein, die die Sequenz von SEQ ID Nr. 1 oder einem Abschnitt davon aufweicht, der ausreichend ist, um eine Hybridisierung zu ermöglichen. Die antisense-Nukleinsäure kann gänzlich oder teilweise komplementär sein zu und kann hybridisieren mit einer Zielnukleinsäure, die einen Säuger-CXCR3-Rezeptor (beispielsweise humanen IP-10/Mig-Rezeptor CXCR3) kodiert.
Die antisense-Nukleinsäuren können für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden, umfassend Forschung und therapeutische Anwendungen. So kann beispielsweise ein eine antisense-Nukleinsäure umfassendes Konstrukt in eine geeignete Zelle eingeführt werden, um eine Rezeptor-Expression zu inhibieren. Eine derartige Zelle stellt eine nützliche Kontrollzelle bereit, um beispielsweise die Spezifität einer Rezeptor-Liganden-Wechselwirkung mit der Elternzelle oder anderen verwandten Zelltypen zu bestimmen. Ein derartiges Konstrukt kann in einige oder alle der Zellen eines Säugetiers eingeführt werden. Die antisense-Nukleinsäure inhibiert bzw. unterdrückt eine Expression eines Rezeptors, und wobei in den Zellen, die das Konstrukt enthalten, entzündliche Prozesse, die durch CXCR3-Rezeptoren vermittelt werden, unterdrückt werden können. Somit kann eine entzündliche Erkrankung oder ein entzündlicher Zustand durch Verwendung einer antisense-Nukleinsäure behandelt werden. Geeignete Labortiere, die ein antisense-Konstrukt beinhalten, können weiter nützliche Modelle für Mängel einer Leukozyten-Funktion und insbesondere für einen Mängel einer aktivierten T-Lymphozyte bereitstellen und können weitere Informationen bezüglich einer CXCR3-Rezeptor-Funktion liefern. Derartige Tiere können nützliche Modelle für Infektionserkrankungen oder Krebs bereitstellen, die zur Aufklärung der Rolle der Leukozyten, wie T-Lymphozyten und NK-Zellen, in den Abwehrkräften des Wirts nützlich sind.
Verfahren zur Herstellung rekombinanter Proteine
Lediglich zur Erklärung wird hier ein Verfahren zum Erzeugen eines Säuger-CXCR3-Proteins oder einer Variante (beispielsweise einem Abschnitt) davon beschrieben. Rekombinantes Protein kann beispielsweise durch die Expression eines rekombinanten Nukleinsäuremoleküls (beispielsweise DNA) erhalten werden, das ein Säuger-CXCR3 oder eine Variante davon beispielsweise in einer geeigneten Wirtszelle kodiert.
Es werden weiter Konstrukte (beispielsweise Expressionsvektoren) beschrieben, die für die Expression eines Säuger-CXCR3-Proteins oder einer Variante davon geeignet sind. Die Konstrukte können in eine geeignete Wirtszelle eingeführt werden, wobei Zellen, die ein rekombinantes Säuger-CXCR3-Protein oder eine Variante davon exprimieren, erzeugt und in Kultur gehalten werden können. Derartige Zellen können für eine Vielzahl von Zwecken verwendet werden, beispielsweise umfassend einer Verwendung in der Erzeugung von Protein zur Charakterisierung, Isolierung und/oder Reinigung (beispielsweise Affinitätsreinigung), Verwendung als Immunogen und in Bindungsassays oder anderen funktionalen Assays (beispielsweise um nach Liganden, Inhibitoren und/oder Promotoren der Rezeptor-Funktion zu durchmustern. Geeignete Wirtszellen können prokaryotisch sein, umfassend Bakterienzellen wie E. coli, B. subtilis und oder andere geeignete Bakterien, oder eukaryotisch sein, wie pilzliche Zellen oder Hefezellen (beispielsweise Pichia pastoris, Aspergillus species, Saccharomyces cerevisiae, Schizosaccharomyces pombe, Neurospora crassa) oder andere Zellen niedriger Eukaryonten und Zellen höherer Eukaryonten, wie solche von Insekten (beispielsweise Sf9-Insektenzellen ( WO 94/26087 , O'Connor, veröffentlicht am 24. November 1994) oder von Säugern (beispielsweise Chinese Hamster Ovary Zellen (CHO), COS-Zellen, Hut 78-Zellen, 293-Zellen). (Siehe beispielsweise Ausubel, F. M. et al., Herausgeber, 1993, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing Associates und John Wiley & Söhne Inc.).
Wirtszellen, die ein rekombinantes Säuger-CXCR3-Protein oder eine Variante davon erzeugen, können wie folgt hergestellt werden. So kann beispielsweise eine Nukleinsäure, die die gesamte kodierende Sequenz für das gewünschte Protein oder einen Teil kodiert, in einen Nukleinsäurevektor eingefügt werden, wie beispielsweise einen DNA-Vektor, wie ein Plasmid, einen Virus oder ein anderes geeignetes Replikon zur Expression. Es ist eine Vielzahl an Vektoren verfügbar, umfassend Vektoren, die in einfacher Kopie oder in Mehrfachkopie beibehalten werden können, oder die in ein Chromosom der Wirtszelle integriert werden.
Zur Steuerung der Expression können Transkriptions- und/oder Translationssignale eines Säuger-CXCR3-Gens verwendet werden. Geeignete Expressionsvektoren für die Expression einer Nukleinsäure, die die gesamte kodierende Sequenz für das gewünschte Protein oder einen Teil kodiert, sind ebenfalls verfügbar. Geeignete Expressionsvektoren können mehrere Komponenten enthalten, die umfassen, jedoch nicht beschränkt sind auf eines oder mehrere der folgenden: einen Replikationsursprung, ein Gen für einen Selektionsmarker, ein oder mehrere Expressionssteuerelemente, wie ein Steuerelement der Transkription (beispielsweise einen Promotor, einen Enhancer, einen Terminator) und/oder ein oder mehrere Translationssignale, eine Signalsequenz oder Leader-Sequenz zum Membran-Targeting in einer ausgewählten Wirtszelle (mit beispielsweise Säugerursprung oder von einem heterologen Säuger oder einer Nicht-Säuger-Spezies). So kann in einem Konstrukt eine Signalsequenz durch den Vektor, die Säuger-CXCR3 kodierende Sequenz oder eine andere Quelle bereitgestellt werden. Diese Elemente können ebenfalls von Sequenzen bereitgestellt werden, die an einer Integrationsstelle vorliegen.
Zur Expression in einer geeigneten Wirtszelle kann ein Promotor bereitgestellt werden. Die Promotoren können konstitutiv oder induzierbar sein. So kann beispielsweise ein Promotor mit einer Nukleinsäure funktionsfähig verknüpft sein, die das Säuger-CXCR3-Protein oder eine Variante davon kodiert, so dass er die Expression des kodierten Polypeptides lenkt. Es ist eine Vielzahl an geeigneten Promotoren für prokaryotische (beispielsweise lac-, tac-, T3-, T7-Promotoren für E. coli) und eukaryotische (beispielsweise Alkoholdehydrogenase der Hefe (ADH1), SV40, CMV) Wirtszellen verfügbar.
Zusätzlich umfassen die Expressionsvektoren üblicherweise einen Selektionsmarker, um den Vektor tragende Wirtszellen selektionieren zu können und im Falle eines replizierbaren Expressionvektors einen Replikationsursprung. Übliche Selektionsmarker sind Gene, die Produkte kodieren, die eine Antibiotika- oder Arzneimittel-Resistenz verleihen, wobei sie in prokaryotischen (beispielsweise β-Lactamase-Gen (Ampicillin-Resistenz), Tet-Gen für eine Tetracyclin-Resistenz) und eukaryotischen Zellen (beispielsweise Neomycin (G418 oder Geneticin)-, gpt (Mycophenolsäure)-, Ampicillin- oder Hygromycin-Resistenzgene) verwendet werden können. Dihydrofolatreduktase-Marker-Gene ermöglichen in einer Vielzahl von Wirten eine Selektion mit Methotrexat. In Hefe werden oftmals Gene, die das Genprodukt von auxotrophen Markern des Wirts (beispielsweise LEU2, URA3, HIS3) kodieren, als Selektionsmarker bzw. selektionierbare Marker verwendet. Klar ist, dass virale (beispielsweise Baculovirus) oder Phagen-Vektoren und Vektoren, die in das Genom der Wirtszelle integrieren können, wie retrovirale Vektoren, ebenfalls in Betracht gezogen sind. Zellen, die diese Expressionsvektoren tragen werden hier ebenfalls beschrieben.
So kann beispielsweise eine Nukleinsäure, die Säuger-CXCR3-Protein oder eine Variante davon kodiert, oder ein Konstrukt, das eine derartige Nukleinsäure umfasst, in eine geeignete Wirtszelle eingeführt werden, wobei ein Verfahren verwendet wird, das für die ausgewählte Wirtszelle passend ist (beispielsweise Transformation, Transfektion, Elektroporation, Infektion), so dass die Nukleinsäure funktionsfähig an ein oder mehrere Expressionssteuerelemente gekoppelt ist (beispielsweise in einem Vektor, in einem Konstrukt, das durch Prozesse in der Zelle erzeugt wird, integriert in das Genom der Wirtszelle). Wirtszellen können unter Bedingungen gehalten werden, die für eine Expression geeignet sind (beispielsweise in der Gegenwart eines Induktors (inducer), mit passenden Salzen, Wachstumsfaktoren, Antibiotika, Nahrstoffergänzungen etc. ergänzten Medien), wobei das kodierte Polypeptid hergestellt wird. Falls gewünscht, kann das kodierte Protein (beispielsweise humanes CXCR3) isoliert werden (beispielsweise von den Wirtszellen, dem Medium, der Milch). Es ist klar, dass das Verfahren eine Expression in einer Wirtszelle eines transgenen Tiers umfasst (siehe beispielsweise WO 92/03918 , Genfharm International, veröffentlicht am 19. März 1992).
Auf diese Art und Weise können ebenfalls Fusionsproteine erzeugt werden. So können beispielsweise einige Ausführungsformen erzeugt werden durch die Insertion einer Säuger-CXCR3-Protein-cDNA oder eines Teils davon in einen geeigneten Expressionsvektor, wie Bluescript^® II SK +/– (Stratagene), pGEX-4T-2 (Pharmacia), pcDNA-3 (Invitrogen) oder pEP-15b (Novagen). Das so erhaltene Konstrukt kann in eine geeignete Wirtszelle zur Expression eingeführt werden. Nach Expression kann das Fusionsprotein aus einem Zell-Lysat isoliert oder gereinigt werden mittels einer geeigneten Affinitätsmatrix (siehe beispielsweise Current Protocols in Molecular Biology (Ausubel, F. M. et al., Herausgeber, 1991, Band 2, Suppl. 26, pp. 16.4.1–16.7.8). Zusätzlich stellen Affinitätsmarker ein Mittel zum Nachweis eines Fusionsproteins bereit. So kann beispielsweise die Expression an der Zelloberfläche oder das Vorliegen in einer bestimmten Zellfraktion von einem Fusionsprotein, das einen Antigen- oder Epitop-Affinitätsmarker umfasst, mittels eines geeigneten Antikörpers nachgewiesen werden.
Antikörper
Die Erfindung betrifft Antikörper, die mit einem Säuger-CXCR3-Protein oder einem Abschnitt davon reagieren, wie in den anliegenden Ansprüchen definiert ist. Die Antikörper binden im Speziellen einen Säuger-CXCR3-Rezeptor, der die Aminosäuresequenz der SEQ ID Nr. 2 aufweist. In einer Ausführungsform werden Antikörper gegen ein isoliertes und/oder rekombinantes Säuger-CXCR3-Protein oder einen Abschnitt davon (beispielsweise ein Peptid) gerichtet oder gegen eine Wirtszelle, die rekombinantes Säuger-CXCR3 exprimiert.
Die erfindungsgemäßen Antikörper inhibieren eine oder mehrere Funktionen, die für ein Säuger-CXCR3-Protein (beispielsweise von einem Primaten, wie einem Menschen) kennzeichnend sind, wie eine Bindungs-Aktivität, eine Signalisierungs-Aktivität und/oder eine Stimulierung einer zellulären Antwort. Die erfindungsgemäßen Antikörper inhibieren ein Binden von IP-10 oder Mig (d.h. eines oder mehrerer Liganden) an ein Säuger-CXCR3- Protein und/oder können eine oder mehrere Funktionen inhibieren, die durch ein Säuger-CXCR3-Protein als Antwort auf das Binden eines Liganden vermittelt werden. So können beispielsweise, wie hier gezeigt, erfindungsgemäße Antikörper die Wechselwirkung eines humanen CXCR3-Proteins mit IP-10 selektiv inhibieren und/oder Rezeptor-Funktionen als Antwort darauf selektiv inhibieren (beispielsweise Signalisierungs-Aktivität und/oder eine zelluläre Antwort). Ein als 1C6 bezeichneter Antikörper, der diese Selektivität zeigt, kann ein Binden von IP-10 an ein humanes CXCR3-Protein inhibieren, sowie eine(n) durch IP-10 induzierte(n) Calcium-Fluss und Chemotaxis, inhibiert jedoch einen durch Mig induzierten Calcium-Fluss unter den gleichen Bedingungen nicht signifikant. Wie hier gezeigt, können zusätzliche Antikörper ein Binden von IP-10 an CXCR3 (beispielsweise 3A8, 2F8, 3A12, 3E2, 4B4, 4D2, 5B12, 7B8 und 8D5) oder eine IP-10 induzierte Chemotaxis (beispielsweise 1A5, 3A8, 5F10 und 10C6) inhibieren, obwohl diese Antikörper unter den verwendeten Bedingungen eine Mig-induzierte Signalisierung nicht inhibieren, was zeigt, dass sie ebenfalls selektive Inhibitoren für die Wechselwirkung eines humanen CXCR3-Proteins mit IP-10 und/oder von Rezeptor-Funktionen als Antwort darauf sind.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform weisen die erfindungsgemäßen Antikörper eine Spezifität für ein humanes CXCR3-Protein auf, und weisen noch mehr bevorzugt eine epitopische Spezifität auf, die gleich oder ähnlich ist zu der eines mausartigen monoklonalen Antikörpers (mAb), der als 1C6 bezeichnet ist. Antikörper, die eine epitopische Spezifität aufweisen, die gleich oder ähnlich ist zu der von mAb 1C6 ist, können durch Verwendung einer oder mehrerer geeigneter Techniken zur Charakterisierung der epitopischen Spezifität identifiziert werden. So können beispielsweise Antikörper mit einer epitopischen Spezifität, die gleich oder ähnlich zu der von mAb 1C6 ist durch ihre Fähigkeit identifiziert werden mit dem mausartigen mAb 1C6 um ein Binden an ein humanes CXCR3-Protein oder einen Abschnitt davon (beispielsweise an Zellen, die humanes CXCR3 tragen, umfassend Lymphozyten, wie aktivierte T-Zellen, NK-Zellen oder rekombinante Wirtzellen, die eine Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung umfassen) zu konkurrieren. In einer Ausführungsform sind Antikörper mit einer Epitop-Spezifität, die gleich oder ähnlich zu der von mAb 1C6 ist, ferner gekennzeichnet durch die Fähigkeit, dass ein Polypeptid mit einer Sequenz, die gleich ist zu der der Reste 1–15 ("P1") der SEQ ID Nr. 2, eine Bindung der Antikörper an humanes CXCR3-Protein in einem geeigneten Assay unterdrückt (siehe beispielsweise Beispiel 8). In einem Aspekt dieser Ausführungsform wird ein Binden an ein humanes CXCR3-Protein durch derartige Antikörper nicht signifikant unterdrückt durch ein Polypeptid mit einer Sequenz, die gleich ist zu der der Reste 16–30 ("P2") oder 31–45 ("P3") von SEQ ID Nr. 2.
Andere, durch die vorliegende Erfindung umfasste Antikörper betreffen Antikörper, die an ein humanes CXCR3-Protein binden, wobei das Binden durch einen Abschnitt der SEQ ID Nr. 2 unterdrückt werden kann, der dem N-terminalen, extrazellulären Segment oder einem Abschnitt davon entspricht. Geeignete Abschnitte des N-terminalen, extrazellulären Segments umfassen N-terminalen, interne oder C-terminale Abschnitte des Segments, wie ein Polypeptid, das beispielsweise den N-Terminus umfasst und eine Sequenz aufweist, die gleich ist zu der der Reste 1–30, 1–45 oder 1–58 von SEQ ID Nr. 2, oder ein Polypeptid mit einer Sequenz, die gleich ist zu der der Reste 16–30 oder 45–58 von SEQ ID Nr. 2. In einer bevorzugten Ausführungsform weisen derartige Abschnitte "mindestens ein immunologisches Merkmal" eines Säuger-CXCR3-Proteins auf, wie vorstehend erläutert, wobei der Säuger ein Mensch ist. So wurden beispielsweise Antikörper erhalten, die mit einem humanen CXCR3-Protein reagieren, für die ein Binden durch ein Polypeptid inhibiert werden kann, das eine Sequenz aufweist, die gleich ist zu der der Reste 16–30 von SEQ ID Nr. 2 (Beispiel 9).
Die erfindungsgemäßen Antikörper können polyklonal oder monoklonal sein, und der Begriff Antikörper soll sowohl polyklonale als auch monoklonale Antikörper umfassen. Die Begriffe polyklonal und monoklonal beziehen sich auf das Ausmaß der Homogenität einer Antikörper-Präparation und sind nicht auf bestimmte Herstellungsverfahren beschränkt.
Erfindungsgemäße Antikörper können gegen ein passendes bzw. geeignetes Immunogen gerichtet werden, umfassend hier beschriebene Proteine oder Polypeptide, wie isoliertes und/oder rekombinantes Säuger-CXCR3-Protein oder ein Abschnitt davon (umfassend synthetische Moleküle, wie synthetische Peptide). Zusätzlich können Zellen, die rekombinantes Säuger-CXCR3 exprimieren, wie transfizierte Zellen, als Immunogene oder zu einem Durchmustern nach Antikörper verwendet werden, der an Rezeptor bindet. Siehe beispielsweise Chuntharapai et al., J. Immunol. 152 (1994), 1783–1789 und Chuntharapai et al., US-P-5,440,021 .
Eine Präparation eines immunisierenden Antigens und die Herstellung polyklonaler und monoklonaler Antikörper kann durch Verwendung einer beliebigen geeigneten Technik durchgeführt werden. Es ist eine Vielzahl von Verfahren beschrieben (siehe beispielsweise Kohler et al., Nature 256 (1975), 495–497 und Eur. J. Immunol. 6 (1976), 511–519; Milstein et al., Nature 266 (1977), 550–552; Koprowski et al., US-P-4,172,124 ; Harlow, E. und D. Lane, 1988, Antibodies: A Laborstory Manual, (Cold Spring Harbor Laborstory: Cold Spring Harbor, NY); Current Protocols In Molecular Biology, Band 2 (Supplement 27, Sommer 94), Ausubel, F. M. et al., Herausgeber, (John Wiley & Söhne: New York, NY), Kapitel 11, (1991)). Im Allgemeinen kann ein Hybridom erzeugt werden, indem eine geeignete, unsterbliche Zell-Linie (beispielsweise eine Myelom-Zell-Linie wie SP2/0) mit Antikörper erzeugenden Zellen fusioniert wird. Die Antikörper erzeugenden Zelle, vorzugsweise solche aus der Milz oder den Lymphknoten, kann aus Tieren erhalten werden, die mit dem interessierenden Antigen immunisiert wurden. Die fusionierten Zellen (Hybridome) können durch Verwendung selektiver Kulturbedingungen isoliert und durch begrenzende Verdünnung kloniert werden. Zellen, die Antikörper mit der gewünschten Spezifität erzeugen, können mit einem geeigneten Assay (beispielsweise ELISA) ausgewählt werden.
Es können andere geeignete Verfahren zum Erzeugen oder Isolieren von Antikörpern mit der erforderlichen Spezifität verwendet werden, umfassend beispielsweise Verfahren, die rekombinante Antikörper aus einer Bank auswählen oder die auf einer Immunisierung von transgenen Tieren (beispielsweise Mäusen) beruhen, die ein volles Repertoir an humanen Antikörpern erzeugen können (siehe beispielsweise Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 2551–2555; Jakobovits et al., Nature 362 (1993), 255–258; Lonberg et al., US-P-5,545,806 ; Surani et al., US-P-5,545,807 ).
In der vorliegenden Erfindung und dem Begriff "Antikörper" sind ebenfalls Einzelketten-Antikörper und chimäre, humanisierte oder primatisierte (CDR-grafted) oder funierte (veneered) Antikörper sowie chimäre, CDR-grafted oder funierte Einzelketten-Antikörper, die Abschnitte umfassen, die von verschiedenen Spezies abgeleitet sind, und dergleichen umfasst. Die verschiedenen Abschnitte dieser Antikörper können durch herkömmliche Techniken chemisch miteinander verbunden werden, oder es kann/können (ein) Polypeptid(e) als ein aufeinanderfolgendes Protein hergestellt werden, wobei gentechnologische Methoden verwendet werden. Der Begriff "humanisierter Antikörper oder Immunoglobulin" betrifft, wie hier verwendet, einen Antikörper oder ein Immunoglobulin, der/das Abschnitte von Immunoglobulinen mit verschiedenem Ursprung umfasst, wobei mindestens ein Abschnitt humanen Ursprungs ist. Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung einen humanisierten Antikörper (umfassend Antigen bindender Fragmente davon), der eine Bindungsspezifität für ein Säuger-CXCR3-Protein (beispielsweise humanes CXCR3-Protein) aufweist, wobei Antigen bindende Regionen mit nicht-humanen Ursprung (beispielsweise Nager) umfasst sind und mindestens ein Abschnitt eines Immunoglobulins mit humanen Ursprung (beispielsweise eine humane Rahmenregion, eine humane konstante Region oder Abschnitte davon). So können beispielsweise humanisierte Antikörper Abschnitte umfassen, die von einem Immunglobulin mit nicht-humanem Ursprung mit der erforderlichen Spezifität abgeleitet sind (beispielsweise eine nicht-humane variable Region der Maus) und von Immunglobulin-Sequenzen mit humanem Ursprung (beispielsweise einer humanen konstanten Region oder ein Abschnitt davon), die chemisch aneinander verbunden sind oder als ein aufeinanderfolgendes Polypeptid durch Verwendung von gentechnologischen Techniken hergestellt werden. Ein anderes Beispiel eines erfindungsgemäßen humanisierten Antikörpers ist ein Immunoglobulin, das eine oder mehrere Immunoglobulinketten umfasst, wobei das Immunoglobulin ein CDR mit nicht-humanen Ursprung (beispielsweise ein oder mehrere CDRs, die von einem Antikörper mit nicht-humanem Ursprung abgeleitet sind) und eine Rahmenregion umfasst, die von einer leichten und/oder schweren Kette mit humanem Ursprung abgeleitet ist (beispielsweise CDR-gepfropfte (CDR-grafted) Antikörper mit oder ohne Rahmenänderungen). In einem Aspekt dieser Erfindung umfasst das Immunoglobulin die CDRs der leichten Kette (CDR1, CDR2 und CDR3) und CDRs der schweren Kette (CDR1, CDR2, CDR3) eines nicht-humanen Immunoglobulins. In einer Ausführungsform weist das humanisierte Immunoglobulin eine epitopische Spezifität auf, die gleich oder ähnlich zu der von mAB 1C6 ist. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Antigen bindende Region des humanisierten Immunoglobulins von mAb 1C6 abgeleitet. Der Begriff humanisierter Antikörper umfasst ebenfalls Einzelketten-Antikörper. Siehe beispielsweise Cabilly et al., US-P-4,816,567 ; Cabilly et al., EP 0 125 023 B1 ; Boss et al., US-P-4,816,397 ; Boss et al., EP 0 120 694 B1 ; Neuberger, M. S. et al., WO 86/01533 ; Neuberger, M. S. et al., EP 0 194 276 B1 ; Winter, US-P-5,225,539 ; Winter, EP 0 239 400 B1 ; Queen et al., EP 0 451 216 B1 ; und Padlan, E. A. et al., EP 0 519 596 A1 . Siehe ebenfalls Newman, R. et al., BioTechnology 10 (1992), 1455–1460, in Bezug auf primanisierte Antikörper und Ladner et al., US-P-4,946,778 und Bird, R. E. et al., Science 242 (1988), 423–426 in Bezug auf Einzelketten-Antikörper.
Weiter können funktionale Fragmente von Antikörpern erzeugt werden, umfassend Fragmente von chimären, humanisierten oder primatisierten, funierten oder Einzelketten-Antikörpern. Funktionale Fragmente der vorstehend aufgeführten Antikörper behalten mindestens eine Bindungsfunktion und/oder Modulationsfunktion des Volllängen-Antikörpers bei, von dem sie abgeleitet sind. So umfasst die Erfindung beispielsweise Antikörper-Fragmente, die an Säuger-CXCR3-Protein oder einen Abschnitt davon binden können, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf Fv-, Fab-, Fab'- und F(ab')₂-Fragmente. Derartige Fragmente können durch enzymatische Spaltung oder durch Rekombinationstechniken erzeugt werden. So kann beispielsweise eine Papain- oder Pepsin-Spaltung Fab- bzw. F(ab')₂-Fragmente hervorbringen. Antikörper können ebenfalls in einer Vielzahl von gekürzten Formen erzeugt werden, wobei Antikörper-Gene verwendet werden, in denen ein oder mehrere Stopp-Codons stromaufwärts der natürlichen Stopp-Stelle eingeführt wurden. So kann beispielsweise ein chimeres Gen aufgebaut werden, das einen F(ab')₂-Abschnitt der schwere Kette kodiert, um eine DNA-Sequenz zu umfassen, die die CH₁-Domäne und Gelenk-Region der schweren Kette kodiert.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können in einer Vielzahl von Anwendungen verwendet werden, umfassend Forschung, diagnostische und therapeutische Anwendungen. So können sie beispielsweise verwendet werden, um Rezeptoren oder Abschnitte davon zu isolieren, reinigen und/oder nachzuweisen und um Struktur (beispielsweise Konformation) und Funktion eines Rezeptors zu untersuchen.
Die erfindungsgemäßen Antikörper können weiter verwendet werden, um in der Forschung und in therapeutischen Anwendungen eine Rezeptor-Funktion zu modulieren. So können Antikörper beispielsweise als Inhibitoren wirken, um (a) ein Binden (beispielsweise eines Liganden, eines zweiten Inhibitors oder eines Promotors) an den Rezeptor, (b) eine Rezeptor-Signalisierung und/oder (c) eine zelluläre Antwort zu inhibieren (verringern oder verhindern). Antikörper, die als Inhibitoren der Rezeptor-Funktion wirken, können das Binden eines Liganden oder Promotors direkt oder indirekt blockieren (beispielsweise indem sie eine Konformationsänderung in dem Rezeptor verursachen). So können beispielsweise Antikörper eine Rezeptor-Funktion inhibieren, indem sie ein Binden eines Liganden inhibieren, oder durch Desensibilisierung (mit oder ohne Inhibierung des Bindens eines Liganden). Erfindungsgemäßen Antikörper können als Antagonisten von Effektorzellen, wie aktivierte oder stimulierte T-Lymphozyten und natürliche Killer-Zellen (HK-Zellen) verwendet werden, und finden eine Verwendung in Verfahren einer Therapie (umfassend einer Prophylaxe) von Erkrankungen oder Zuständen, die mit Inhibitoren einer CXCR3-Funktion, wie hier beschrieben, behandelt werden können. Antikörper, die die Wechselwirkung eines humanen CXCR3-Proteins mit IP-10 selektiv inhibieren können und/oder Rezeptor-Funktionen als Antwort darauf selektiv inhibieren können (beispielsweise mAb 1C6, Antikörper mit einer Epitop-Spezifität, die gleich ist zu der von mAb 1C6), sind insbesondere nützlich in der Behandlung von Erkrankungen oder Störungen, die durch Wechselwirkungen von IP-10 und CXCR3 vermittelt werden. So sind beispielsweise entzündliche Erkrankungen, wie Psoriasis, entzündliche Darmerkrankung, Nephritis und Multiple Sklerose, insbesondere für eine Therapie zugänglich.
Überraschenderweise inhibiert mAb 1C6 eine T-Zell-Aktivierung, wie in einer gemischten Lymphozyten-Reaktion (MLR) bestimmt wurde. Entsprechend können mAb 1C6 und andere anti-CXCR3-Antikörper, die eine T-Zell-Aktivierung inhibieren können, verwendet werden, um eine T-Zell-Aktivierung und (eine) Funktion(en), die mit der Aktivierung assoziiert ist/sind, wie Cytokin-Produktion, cytotoxisches T-Zell-Töten und/oder Bereitstellung einer T-Zellen-Hilfe, zu inhibieren. Bei Verwendung in Verfahren zur Therapie oder Prophylaxe, wie hier beschrieben, können derartige Antikörper den zusätzlichen Vorteil einer Inhibierung einer weiteren T-Zell-Aktivierung aufweisen. Derartige Antikörper sind insbesondere attraktiv als therapeutische Agenzien zur Behandlung von Gewebeabstoßung (beispielsweise bei Transplantationen), umfassend allogene Gewebe- bzw. Transplantatabstoßung oder Transplantat-gegen-Wirt-Erkrankung, oder anderen Erkrankungen oder Bedingungen, bei denen eine Inhibierung der Aktivierung von T-Zellen wünschenswert ist.
Antikörper, die Rezeptor binden, können weiter als Agonisten einer Rezeptor-Funktion wirken, wobei sie eine Rezeptor-Funktion nach Binden an einen Rezeptor auslösen oder stimulieren, wie eine Signalisierung und/oder eine zelluläre Antwort (beispielsweise Calcium-Fluss, Chemotaxis, Exocytose oder pro-entzündliche Mediator-Freisetzung). Entsprechend können derartige Antikörper als Agonisten von Effektor-Zellen, wie aktivierte oder stimulierte T-Lymphozyten und natürliche Killer-Zellen (NK-Zellen) verwendet werden, und finden eine Verwendung in Verfahren einer Therapie (umfassend einer Prophylaxe) von Erkrankungen oder Zuständen, die mit Promotoren einer CXCR3-Funktion, wie hier beschrieben, behandelt werden können.
Zusätzlich können die verschiedenen, erfindungsgemäßen Antikörper verwendet werden, um die Rezeptor-Expression nachzuweisen oder zu erfassen, beispielsweise auf Leukozyten, wie aktivierte T-Zellen oder natürliche Killer-Zellen (NK-Zellen), oder auf Zellen, die mit einem Rezeptor-Gen transfiziert wurden. Somit finden sie ebenfalls eine Verwendung in Anwendungen, wie Zell-Sortierung (beispielsweise Strömungs-Zytometrie, Fluoreszenz-aktiviertes Zell-Sortieren) für diagnostische Zwecke und Forschungszwecke.
Es werden weiter anti-idiotypische Antikörper bereitgestellt. Anti-idiotypische Antikörper erkennen Antigen-Determinanten, die mit der Antigen bindenden Stelle eines anderen Antikörpers assoziiert sind. Anti-idiotypische Antikörper können gegen einen ersten Antikörper erzeugt werden, indem ein Tier der gleichen Spezies und vorzugsweise des gleichen Stamms wie das Tiers, das zum Erzeugen des ersten Antikörpers verwendet wurde, mit dem ersten Antikörper immunisiert wird. Siehe beispielsweise US-P-4,699,880 .
In einer Ausführungsform werden Antikörper gegen einen Rezeptor oder einen Teil davon gerichtet, wobei diese Antikörper wiederum als Immunogen verwendet werden, um einen anti-idiotypischen Antikörper zu erzeugen. Der dadurch erzeugte anti-Id kann einen Rezeptor nachahmen und Verbindungen binden, die ein Rezeptor bindet, wie Liganden, Inhibitoren oder Promotoren der Rezeptor-Funktion, und kann in einem Immunoassay verwendet werden, um derartige Verbindungen nachzuweisen, zu identifizieren oder zu quantifizieren. Ein derartiger anti-idiotypische Antikörper kann ebenfalls ein Inhibitor einer Rezeptor-Funktion sein, obwohl er einen Rezeptor selbst nicht bindet.
Eine anti-idiotypische Antikörper (d.h. Anti-Id) selbst kann verwendet werden, um einen anti-idiotypische Antikörper (d.h. Anti-anti-Id) zu erzeugen. Ein derartiger Antikörper kann in der Spezifität ähnlich oder identisch mit dem ursprünglich immunisierenden Antikörper sein. In einer Ausführungsform können Antikörper-Antagonisten verwendet werden, die ein Binden an einen Rezeptor blockieren, um Anti-Id zu erzeugen, wobei der Anti-Id verwendet werden kann einen Anti-anti-Id zu erzeugen, der eine Spezifität aufweisen kann, die ähnlich oder identisch mit der des Antikörper-Antagonisten ist. Diese anti-anti-Id- Antikörper können hinsichtlich einer inhibitorischen Wirkung auf eine Rezeptor-Funktion bewertet werden, um zu bestimmen, ob sie Antagonisten sind.
Es können Einzelketten-, chimäre, humanisierte, primatisierte (CDR-gepfropfte), funierte (veneered) Antikörper, sowie chimäre, CDR-gepfropfte oder funierte Einzelketten-anti-idiotypische Antikörper erzeugt werden, wobei diese von dem Begriff anti-idiotypischer Antikörper umfasst sind. Es können weiter Antikörper-Fragmente derartiger Antikörper hergestellt werden.
Die erfindungsgemäßen Antikörper und Fragmente können modifiziert werden, beispielsweise durch Inkorporation von oder durch Anfügen (direkt oder indirekt) von eines nachweisbaren Markers, wie eines Radioisotops, eines Spin-Markers, eines Antigen- oder Enzym-Markers, einer fluoreszierenden oder chemolumineszierenden Gruppe und dergleichen, wobei derartige modifizierte Formen im Umfang der Erfindung umfasst sind.
Identifizierung von Liganden, Inhibitoren oder Promotoren einer Rezeptor-Funktion
Wie hier verwendet, ist ein Ligand eine Substanz, die an ein Rezeptorprotein bindet. Ein Ligand eines ausgewählten Säuger-CXCR3-Proteins ist eine Substanz, die an ein ausgewähltes Säuger-CXCR3-Protein bindet. In einer bevorzugten Ausführungsform erfolgt das Binden eines Liganden an ein Säuger-CXCR3-Protein mit hoher Affinität. Der Begriff Ligand betrifft Substanzen, die umfassen, jedoch nicht beschränkt sind auf einen natürlichen Liganden, ob isoliert und/oder gereinigt, synthetisch und/oder rekombinant, ein Homolog eines natürlichen Liganden (beispielsweise von einem anderen Säuger), Antikörper, Abschnitte derartiger Moleküle und andere Substanzen, die einen Rezeptor binden. Ein natürlicher Ligand eines ausgewählten Säuger-Rezeptors kann unter physiologischen Bedingungen an den Rezeptor binden und stammt von dem gleichen Säuger ab, wie das Säuger-CXCR3-Protein. Der Begriff Ligand umfasst Substanzen, die Inhibitoren oder Promotoren einer Rezeptor-Aktivität sind, sowie Substanzen, die selektiv an einen Rezeptor binden, denen jedoch eine Inhibitor- oder Promotor-Aktivität fehlt.
Wie hier verwendet, ist ein Inhibitor eine Substanz, die mindestens eine Funktion inhibiert, die kennzeichnend für ein Säuger-CXCR3-Protein (beispielsweise ein humanes CXCR3) ist, wie eine Bindungs-Aktivität (beispielsweise Binden eines Liganden, Binden eines Promotors), eine Signalisierungs-Aktivität (beispielsweise Aktivierung eines Säuger-G-Proteins, Induktion eines schnellen und transienten Anstiegs der Konzentration an im Cytosol frei vorkommenden Calcium [Ca²⁺]_i) und/oder eine zelluläre Antwortfunktion (beispielsweise Stimulierung einer Chemotaxis, Exozytose oder Freisetzung von Entzündungsmediator durch Leukozyten). Der Begriff Inhibitor betrifft Substanzen, die Antagonisten umfassen, die einen Rezeptor binden (beispielsweise ein Antikörper, ein Mutant eines natürlichen Liganden oder kompetitive Inhibitoren eines Bindens eines Liganden) und Substanzen, die eine Rezeptor-Funktion inhibieren ohne daran zu binden (beispielsweise ein anti-idiotypischer Antikörper).
Wie hier verwendet, ist ein Promotor eine Substanz, die mindestens eine für ein Säuger-CXCR3-Protein (beispielsweise ein humanes CXCR3) kennzeichnende Funktion fördert (induziert oder verstärkt), wie eine Bindungsaktivität (beispielsweise Binden eines Liganden, Inhibitors und/oder Promotors), eine Signalisierungs-Aktivität (beispielsweise Aktivierung eines Säuger-G-Proteins, Induktion eines schnellen und transienten Anstiegs der Konzentration an im Cytosol frei vorkommenden Calcium [Ca²⁺]_i) und/oder eine zelluläre Antwortfunktion (beispielsweise Stimulierung einer Chemotaxis, Exocytose oder Freisetzung von Entzündungsmediator durch Leukozyten). Der Begriff Promotor betrifft Substanzen, die Agonisten umfassen, die einen Rezeptor binden (beispielsweise einen Antikörper, ein Homolog eines natürlichen Liganden von einer anderen Spezies) und Substanzen, die eine Rezeptor-Funktion fördern ohne daran zu binden (beispielsweise durch Aktivieren eines assoziierten Proteins). In einer bevorzugten Ausführungsform ist der Agonist kein Homolog eines natürlichen Liganden. Die nachstehend beschriebenen Assays, die auf hier beschriebene Nukleinsäuren und Proteine beruhen, können alleine oder in Kombination miteinander oder mit anderen geeigneten Verfahren verwendet werden, um Liganden, Inhibitoren oder Promotoren eines Säuger-CXCR3-Proteins oder eine Variante zu identifizieren. In vitro Verfahren können angepasst werden für ein Durchmustern im Hochdurchsatz, wobei große Probenzahlen abgearbeitet werden (beispielsweise ein 96-Well-Format). Wirtszellen, die eine erfindungsgemäße Nukleinsäure umfassen und rekombinantes Säuger-CXCR3 (beispielsweise humanes CXCR3) in einer Höhe exprimieren, die für ein Durchmustern im Hochdurchsatz geeignet ist, können verwendet werden und sind somit insbesondere zur Identifizierung und/oder Isolierung von Liganden, Inhibitoren und Promotoren von Säuger-CXCR3-Proteinen nützlich. Eine Expression eines Rezeptors kann auf eine Vielzahl von Wegen beobachtet werden. So kann eine Expression beispielsweise durch Verwendung von erfindungsgemäßen Antikörpern beobachtet werden, die einen Rezeptor oder einen Abschnitt davon binden. Es können ebenfalls im Handel verfügbare Antikörper verwendet werden, um eine Expression eines Antigen- oder Epitop-markierten Fusionsproteins nachzuweisen, das ein Rezeptor-Protein oder -Polypeptid umfasst (beispielsweise FLAG-markierte Rezeptoren (FLAG tagged receptors), und es können Zellen ausgewählt werden, die gewünschte Spiegel exprimieren.
Eine Nukleinsäure, die ein Säuger-CXCR3-Protein kodiert, kann, wie vorstehend beschrieben, in ein Expressionssystem inkorporiert werden, um ein Rezeptor-Protein oder – Polypeptid zu erzeugen. In Tests für eine Rezeptor-Funktion kann ein isoliertes und/oder rekombinantes Rezeptor-Protein oder -Polypeptid, wie ein Rezeptor, der in Zellen exprimiert wird, die stabil oder transient mit einem eine erfindungsgemäße Nukleinsäure umfassenden Konstrukt transfiziert sind, oder eine Rezeptor-enthaltenden Zellfraktion (beispielsweise eine Membranfraktion von transfizierten Zellen, Rezeptor-inkorporierende Liposomen) verwendet werden. Falls gewünscht, kann der Rezeptor weiter gereinigt werden. Ein Testen der Rezeptor-Funktion kann in vitro oder in vivo durchgeführt werden.
Ein isoliertes und/oder rekombinantes Säuger-CXCR3-Protein, wie ein humanes CXCR3, wie in 2 (SEQ ID Nr. 2) gezeigt, kann in dem vorliegenden Verfahren, in dem die Wirkung einer Verbindung durch Beobachten einer Rezeptor-Funktion, wie hier beschrieben, oder durch Verwenden anderer geeigneter Techniken bewertet wird. So können beispielsweise in Bindungsassays stabile oder transiente Transfektanten verwendet werden, wie solche, die in Beispiel 2 beschrieben sind oder andere geeignete Zellen (beispielsweise mit Baculovirus infizierte Sf9-Zellen), stabile Transfektanten von L1-2 pre-B-Zellen der Maus (abgeleitet von einem pre-B-Lymphom, Dr. Eugene Butcher (Stanford University, Stanford, CA)). In Chemotaxis-Assays können beispielsweise stabile Transfektanten von Jurkat-Zellen (Beispiel 2) oder von anderen geeigneten Zellen, die zur Chemotaxis befähigt sind (beispielsweise L1-2 pre-B-Zellen der Maus), verwendet werden.
Gemäß des erfindungsgemäßen Verfahrens können Verbindungen individuell durchmustert werden oder es können eine oder mehrere Verbindungen gemäß der hier aufgeführten Verfahren gleichzeitig getestet werden. Wird ein Gemisch an Verbindungen getestet, können die durch die beschriebenen Prozesse ausgewählten Verbindungen getrennt werden (wie angebracht) und durch geeignete Verfahren (beispielsweise PCR, Sequenzieren, Chromatographie) identifiziert werden. Gemäß dieser Verfahren kann das Vorliegen von einer oder mehrerer Verbindungen (beispielsweise eines Liganden, Inhibitors, Promotors) in einer Testprobe ebenfalls bestimmt werden.
Es können große kombinatorische Banken von Verbindungen (beispielsweise organische Verbindungen, rekombinante oder synthetische Peptide, "Peptoide", Nukleinsäuren), die durch kombinatorische chemische Synthese oder andere Verfahren erzeugt wurden, getestet werden (siehe Zuckerman, R. N. et al., J. Med. Chem. 37 (1994), 2678–2685 und dort zitierte Quellen; siehe ebenfalls Ohlmeyer, M. H. J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 10922–10926 und DeWitt, S. H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 6909–6913, bezüglich markierter Verbindungen; Rutter, W. J. et al. US-P-5,010,175 ; Huebner, V. D. et al., US-P-5,182,366 ; und Geysen, H. M., US-P-4,833,092 ). Werden durch das vorliegende Verfahren Verbindungen aus seiner kombinatorischen Bank ausgewählt, die einzigartige Markierungen bzw. Tags tragen, ist durch chromatographische Verfahren eine Identifizierung von individuellen Verbindungen möglich.
In einer Ausführungsform wird ein Phagen-Display-Verfahren verwendet. So kann beispielsweise ein Rezeptor mit einem Phagen in Kontakt gebracht werden (beispielsweise einem Phagen oder einer Sammlung von Phagen, wie einer Bank), der/die ein Polypeptid unter für ein Binden eines Rezeptors passenden Bedingungen (beispielsweise in einem geeigneten Bindungspuffer) präsentierten. Ein Phage, der an einen Rezeptor gebunden ist, kann durch Verwendung von Standardtechniken oder anderer geeigneter Verfahren ausgewählt werden. Ein Phage kann vom Rezeptor durch Verwendung eines geeigneten Elutionspuffers getrennt werden. So kann beispielsweise eine Änderung in der Ionenstärke oder des pH-Werts zur Freisetzung des Phagen (ihren. Alternativ kann der Elutionspuffer einer Freisetzungskomponente oder -komponenten umfassen, die so gestaltet sind, dass sie ein Binden von Verbindungen trennen (beispielsweise einer oder mehrerer Verbindungen, die das Binden des präsentierten Peptides an den Rezeptor trennen, wie ein Ligand, Inhibitor und/oder Promotor, der ein Binden kompetitiv inhibieren kann). Wahlweise kann der Selektionsprozess wiederholt werden oder es kann ein anderer Selektionsschritt verwendet werden, um einen Phagen, der einen Rezeptor bindet, weiter anzureichern. Das präsentierte Polypeptid kann charakterisiert werden (beispielsweise durch Sequenzieren der Phagen- DNA). Die identifizierten Polypeptide können erzeugt werden und weiter getestet werden hinsichtlich eines Bindens eines Liganden, Inhibitor- und/oder Promotor-Funktion. Es können Analoge derartiger Peptide erzeugt werden, die eine erhöhte Stabilität oder andere gewünschte Merkmale aufweisen werden.
In einer Ausführungsform kann ein Phage erzeugt werden, der Fusionsproteine exprimiert und präsentiert, die ein Mantelprotein (coat Protein) mit einem N-terminalen Peptid umfassen, das durch eine zufällige Sequenz von Nukleinsäuren kodiert wird. Geeignete Wirtszellen, die ein erfindungsgemäßes Rezeptor-Protein oder -Polypeptid exprimieren, werden mit dem Phagen in Kontakt gebracht, wobei gebundener Phage ausgewählt, gewonnen und charakterisiert wird. (Siehe beispielsweise Doorbar, J. und G. Winter, J. Mol. Biol. 244 (1994), 361 die ein Phagen-Display-Verfahren erläutern, das mit einem G-Protein-gekoppelten Rezeptor verwendet wird).
Andere Quellen potentieller Liganden, Inhibitoren und/oder Promotoren von Säuger-CXCR3-Proteinen umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf Varianten von CXCR3-Liganden, umfassend natürlich vorkommende, synthetische oder rekombinante Varianten von IP-10 oder Mig, Substanzen wie andere Chemoattraktoren oder Chemokine, Varianten davon, andere Inhibitoren und/oder Promotoren (beispielsweise anti-CXCR3-Antikörper, Antagonisten, Agonisten), andere Liganden, Inhibitoren und/oder Promotoren von G-Protein-gekoppelten Rezeptoren (beispielsweise Antagonisten oder Agonisten) und lösliche Abschnitte eines Säuger-CXCR3-Rezeptors, wie ein geeignetes Rezeptor-Peptid oder ein Analog, das eine Rezeptor-Funktion inhibieren kann (siehe beispielsweise Murphy, R. B., WO 94/05695 ).
Bindungs-Assays
Die isolierten und/oder rekombinanten Rezeptor-Proteine oder funktionale Varianten davon, umfassend Abschnitte davon oder geeignete Fusionsproteine, können in einem Verfahren verwendet werden, um Agenzien auszuwählen und zu identifizieren, die an ein (eines oder mehrere) Säuger-CXCR3-Protein, wie ein humanes CXCR3, binden, und die Liganden oder potentielle Inhibitoren oder Promotoren einer Rezeptor-Aktivität sind. Agenzien, die durch das Verfahren ausgewählt werden, umfassend Liganden, Inhibitoren oder Promotoren, können hinsichtlich einer inhibitorischen oder stimulierenden Wirkung auf eine Rezeptor-Funktion und/oder hinsichtlich therapeutischer Verwendbarkeit weiter bewertet werden.
In einer Ausführungsform wird durch das Verfahren ein Agens identifiziert, das an ein aktives, isoliertes und/oder rekombinantes Säuger-CXCR3-Protein oder -Polypeptid bindet. In dieser Ausführungsform weist das verwendete Rezeptor-Protein oder -Polypeptid mindestens ein Merkmal, eine Aktivität oder Funktion auf, die für ein Säuger-CXCR3-Protein (wie hier erläutert) kennzeichnend ist, wie eine Bindungsaktivität (beispielsweise Binden eines Liganden, Inhibitors und/oder Promotors), eine Signalisierungs-Aktivität (beispielsweise Aktivierung eines Säuger-G-Proteins, Induktion eines schnellen und transienten Anstiegs der Konzentration an im Cytosol frei vorkommenden Calcium [Ca²⁺]_i), zelluläre Antwortfunktion (beispielsweise Stimulierung einer Chemotaxis, Exozytose oder Freisetzung von Entzündungsmediator durch Leukozyten) und/oder ein immunologisches Merkmal, wie hier definiert. In einer bevorzugten Ausführungsform weist das isolierte und/oder rekombinante Rezeptor-Protein oder eine Variante eine Liganden-Bindungs-Funktion auf, und bindet noch bevorzugter einen natürlichen Liganden des Rezeptors. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist das isolierte und/oder rekombinante Protein ein humanes CXCR3-Protein, das durch die in 1 (SEQ ID Nr. 1) gezeigte Nukleinsäure kodiert wird.
So kann beispielsweise eine Zusammensetzung, die ein isoliertes und/oder rekombinantes Säuger-CXCR3-Protein oder eine Variante davon umfasst, unter Bedingungen gehalten werden, die für ein Binden geeignet sind, wobei der Rezeptor mit einem Agens (beispielsweise eine Zusammensetzung, die ein oder mehrere Agenzien umfasst) in Kontakt gebracht werden kann, um getestet zu werden, und wobei ein Binden nachgewiesen und erfasst wird. In eine Ausführungsform kann ein Rezeptor-Protein in Zellen exprimiert werden, die stabil oder transient mit einem Konstrukt transfiziert sind, das eine einen erfindungsgemäßen Rezeptor kodierende Nukleinsäuresequenz umfasst. Die Zellen können unter Bedingungen gehalten werden, die für eine Expression des Rezeptors geeignet sind. Die Zellen werden unter Bedingungen, die für ein Binden geeignet sind (beispielsweise in einem geeigneten Bindungspuffer), mit einem Agens in Kontakt gebracht, und wobei ein Binden durch Standardtechniken nachgewiesen werden kann. So kann beispielsweise das Ausmaß des Bindens relativ zu einer geeigneten Kontrolle bestimmt werden (beispielsweise verglichen mit dem Hintergrund, der in der Abwesenheit des Agens bestimmt wird, verglichen mit einem Binden eines zweiten Agens (d.h. eines Standards), verglichen mit einem Binden des Agens an nicht transfizierte Zellen). Wahlweise kann anstelle von ganzen Zellen eine Zellfraktion, wie eine den Rezeptor enthaltende Membranfraktion, verwendet werden.
Ein Binden oder eine Komplexbildung kann direkt oder indirekt nachgewiesen werden. In einer Ausführungsform kann das Agens mit einem geeigneten Marker markiert sein (beispielsweise einem Fluoreszens-Marker, Chemoluminesz-Marker, Isotop-Marker-Enzym-Marker), wobei ein Binden durch Nachweis des Markers nachgewiesen werden kann. Die Spezifität des Bindens kann beispielsweise durch Konkurrenz oder Ersetzen bewertet werden, wobei ein nicht-markiertes Agens oder ein Ligand (beispielsweise IP-10) als Konkurrent verwendet wird.
Auf diese Art und Weise können Liganden des Säuger-Rezeptors, umfassend natürliche Liganden aus den gleichen Säuger-Spezies oder von anderen Spezies, identifiziert werden. Die Bindungsaktivität eines Promotors oder Inhibitors, der einen Rezeptor bindet, kann ebenfalls bestimmt werden, wobei ein Liganden-Bindungs-Assay verwendet wird.
Es können weiter Bindungs-Inhibierungs-Assays verwendet werden, um Liganden und Inhibitoren und Promotoren zu identifizieren, die den Rezeptor binden und das Binden eines anderen Agens, wie eines Liganden inhibieren. So kann beispielsweise ein Bindungs-Assay durchgeführt werden bei dem eine Reduktion bzw. Abnahme des Bindens eines ersten Agens (in der Abwesenheit eines zweiten Agens) verglichen mit einem Binden des ersten Agens in der Gegenwart des zweiten Testagens nachgewiesen oder erfasst wird. Der Rezeptor kann mit dem ersten und zweiten Agens gleichzeitig oder mit einem nach dem anderen in beiden Anordnungen in Kontakt gebracht werden. Eine Reduktion im Ausmaß des Bindens des ersten Agens in der Gegenwart des zweiten Testagens ist ein Anzeichen für eine Bindungsinhibierung durch das zweite Agens. So kann beispielsweise ein Binden des ersten Agens verringert oder aufgehoben werden.
In einer Ausführungsform wird eine direkte Inhibierung des Bindens eines ersten Agens (beispielsweise eines Chemokins, wie IP-10, Mig) an ein humanes CXCR3 durch ein zweites Testagens beobachtet. So kann beispielsweise die Fähigkeit eines Agens beobachtet werden das Binden eines ¹²⁵I-markierten Mig an humanes CXCR3 zu inhibieren. Ein derartiger Assay kann beispielsweise unter Verwendung ganzer Zellen (beispielsweise einer geeigneten Zell-Linie, die eine einen humanen CXCR3-Rezeptor kodierende Nukleinsäure umfasst) oder einer Membranfraktion von den Zellen durchgeführt werden.
Es sind andere Verfahren verfügbar, um des Vorliegens eines Agens/von Agenzien, die einen Rezeptor binden, zu identifizieren, wie Verfahren, die Ereignisse beobachten, die durch Rezeptorbindung ausgelöst werden, wobei Signalisierungs-Funktionen und/oder Stimulierung einer zellulären Antwort umfasst sind.
Es ist klar, dass die inhibitorische Wirkung der erfindungsgemäßen Antikörper in einem Bindungs-Inhibierungs-Assay bestimmt werden kann. Weiter kann in dem Verfahren, in dem das erste Agens in dem Assay ein anderer Antikörper ist, unter für eine Antikörper-Bindung geeigneten Bedingungen ein Wettbewerb zwischen Antikörper bezüglich einer Rezeptorbindung bestimmt werden.
Auf diese Art und Weise identifizierte Liganden, Inhibitoren und Promotoren einer Rezeptorbindung können weiter beurteilt bzw. bewertet werden, um zu bestimmen, ob sie nach einem Binden als Inhibitor oder Aktivator von anderen CXCR3-Funktionen wirken und/oder um ihre therapeutische Verwendbarkeit zu beurteilen.
Signalisierungs-Assays
Das Binden eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors (beispielsweise durch einen Agonisten) kann zu einer Signalisierung durch den Rezeptor und zu einer Stimulierung der Aktivität des G-Proteins führen. Die Induktion einer Signalisierungs-Funktion durch ein Agens kann durch Verwendung eines beliebigen geeigneten Verfahrens beobachtet werden. So können beispielsweise eine G-Protein-Aktivität, wie die Hydrolyse von GTP zu GDP, oder spätere durch das Binden eines Rezeptor ausgelöste Signalisierungs-Ereignisse, wie eine Induktion eines schnellen und transienten Anstiegs der Konzentration an intrazellulär (cytosolisch) frei vorkommenden Calciums [Ca²⁺]_i, durch im Stand der Technik bekannter Verfahren oder anderer geeigneter Verfahren getestet werden (Beispiel 2; siehe ebenfalls Neote, K. et al., Cell, 72 (1993), 415–425; Van Riper et al., J. Exp. Med. 177 (1993), 851–856; Dahinden, C. A. et al., J. Exp. Med. 179 (1994), 751–756).
Der funktionale Assay von Sledziewski et al., der Hybrid-G-Protein-gekoppelte Rezeptoren verwendet, kann ebenfalls verwendet werden, um eine Liganden oder Promotor durch dessen Fähigkeit ein Hybrid-G-Protein zu aktivieren zu identifizieren oder um einen Inhibitor durch dessen Fähigkeit eine derartige Aktivierung zu inhibieren zu identifizieren (Sledziewski et al., US-P-5,284,746, wobei dessen Lehren hier unter Bezugnahme aufgenommen sind). In einer Ausführungsform kann eine biologische Antwort der Wirtszelle (ausgelöst durch Binden an einen Hybrid-Rezeptor) beobachtet werden, wobei ein Nachweis der Antwort ein Anzeichen für das Vorliegen eines Liganden in der Testprobe ist. So wird beispielsweise ein Verfahren zum Nachweis des Vorliegens eines Liganden in einer Testprobe beschrieben, wobei der Ligand ein Agens ist, das durch die Liganden-Bindungsdomäne eines Rezeptors gebunden werden kann. In einer Ausführungsform des Verfahrens werden Hefe-Wirtszellen mit einem DNA-Konstrukt transformiert, das die Expression eines biologisch aktiven Hybrid-G-Protein-gekoppelten Rezeptors (d.h. ein Fusionsprotein) steuern kann. Der Hybrid-Rezeptor umfasst einen Säuger-G-Protein-gekoppelten Rezeptor mit mindestens einer Domäne außer der Liganden-Bindungsdomäne, die durch eine entsprechende Domäne eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors einer Hefe, wie ein STE2-Genprodukt, ersetzt wird. Die das Konstrukt beinhaltenden Hefe-Wirtszellen werden unter Bedingungen gehalten, unter denen der Hybrid-Rezeptor exprimiert wird, und die Zellen werden unter Bedingungen, die das Binden eines Liganden an den Hybrid-Rezeptor ermöglichen, mit einer Testprobe in Kontakt gebracht. Eine biologische Antwort der Wirtszelle (ausgelöst durch das Binden an einen Hybrid-Rezeptor) wird beobachtet, wobei ein Nachweis der Antwort ein Anzeichen für eine Signalisierungs-Funktion ist. So kann beispielsweise das Binden an einen Hybrid-Rezeptor, der von einem STE2-Genprodukt abgeleitet ist, zur Induktion des BAR1-Promotors führen. Eine Induktion des Promotors kann mittels eines Reportergens (beispielsweise β-gal) erfasst werden, das mit dem BAR1-Promotor verknüpft und in Wirtszellen auf einem zweiten Konstrukt eingeführt wurde. Eine Expression des Reportergens kann beispielsweise durch einen in vitro Enzymassay in Zell-Lysaten oder durch das Vorliegen von blauen Kolonien auf Platten, die einen Indikator (beispielsweise X-gal) in dem Medium enthalten, nachgewiesen werden.
In einer anderen Ausführungsform kann der Assay verwendet werden, um potentielle Inhibitoren einer Rezeptor-Funktion zu identifizieren. So kann die inhibitorische Aktivität eines Agens durch Verwendung eines Liganden oder Promotors in dem Assay bestimmt werden, und wobei die Fähigkeit des Testagens, die durch den Liganden oder Promotor induzierte Aktivität zu inhibieren, beurteilt wird.
Es können ebenfalls Varianten bekannter Liganden hinsichtlich einer verringerten Fähigkeit (verminderte Fähigkeit oder keine Fähigkeit), eine Aktivität eines gekoppelten G-Proteins zu stimulieren, durchmustert werden. Obwohl das Agens eine Liganden-Bindungs aktivität aufweist (wie durch ein anderes Verfahren bestimmt) löst in dieser Ausführungsform das in Eingriff kommen mit dem Rezeptor keine Aktivität eines gekoppelten G-Proteins aus oder löst sie nur schwach aus. Derartige Agenzien sind potentielle Antagonisten und können weiter hinsichtlich einer inhibitorischen Aktivität bewertet bzw. beurteilt werden.
Chemotaxis und andere Assays für zelluläre Antworten
Es können ebenfalls Chemotaxis-Assays verwendet werden, um eine Rezeptor-Funktion zu bewerten. Diese Assays basieren auf der funktionalen durch ein Agens induzierten Wanderung von Zellen in vitro oder in vivo, und können verwendet werden, um das Binden und/oder die Wirkung auf eine Chemotaxis von Liganden, Inhibitoren oder Promotoren zu bewerten.
In Beispiel 2 wird die Verwendung eines in vitro Chemotaxis-Assays zum Bewerten der Antwort von Zellen auf IP-10 und Mig beschrieben. Springer et al. beschrieben einen transendothelialen Lymphozyten-Chemotaxis-Assay (Springer et al., WO 94/20142 , veröffentlicht am 15. September 1994, wobei deren Lehren hier unter Bezugnahme aufgenommen sind; siehe ebenfalls Berman et al., Immunol. Invest. 17 (1988), 625–677). Eine Wanderung über das Endothelium in Kollagen-Gele wurde ebenfalls beschrieben (Kavanaugh et al., J. Immunol. 146 (1991), 4149–4156).
Im Allgemeinen beobachten Chemotaxis-Assays die direktionale Bewegung oder Wanderung geeigneter Zellen, die zur Chemotaxis befähigt sind, wie beispielsweise eine Leukozyte (beispielsweise T-Lymphozyten, HK-Zellen, Monozyten), stabile Transfektanten von Jurkat-Zellen, L1-2 pre-B-Zellen von Maus oder von anderen geeigneten Wirtszellen, in oder durch eine Barriere (beispielsweise Endothelium, einen Filter) in Richtung eines erhöhten Spiegels eines Agens von einer ersten Oberfläche der Barriere in Richtung einer abgewandten zweiten Oberfläche. Membranen oder Filter stellen zweckdienliche Barrieren dar, so dass die direktionale Bewegung oder Wanderung einer geeigneten Zelle in oder durch einen Filter in Richtung erhöhter Spiegel eines Agens von einer ersten Oberfläche des Filters in Richtung einer abgewandten zweiten Oberfläche des Filters beobachtet wird. In einigen Assays wird die Membran mit einer Substanz, wie ICAM-1, Fibronectin oder Collagen, beschichtet, um eine Adhäsion zu erleichtern.
So kann beispielsweise die Wanderung von Zellen in einem geeigneten Behälter (einem enthaltenden Mitteln) von einer ersten Kammer in oder durch eine mikroporöse Membran in eine zweite Kammer nachgewiesen oder erfasst werden, die ein zu testendes Agens enthält und die von der ersten Kammer durch die Membran abgeteilt ist. Es wird eine geeignete Membran, beispielsweise Nitrocellulose, Polycarbonat umfassend, mit einer geeigneten Porengröße zum Beobachten einer spezifischen Wanderung als Antwort auf das Agens ausgewählt. So kann beispielsweise eine Porengröße von ungefähr 3–8 Microns und vorzugsweise von ungefähr 5–8 Microns verwendet werde. Die Porengröße kann auf einem Filter einheitlich sein oder in einem Bereich von geeigneten Porengrößen liegen.
Um eine Wanderung zu bewerten, kann die Strecke bzw. Entfernung der Wanderung in den Filter, die Anzahl der den Filter durchquerenden Zellen, die an der zweiten Oberfläche des Filters angehaftet bleiben und/oder die Anzahl der Zellen, die sich in der zweiten Kammer anreichern unter Verwendung von Standardtechniken (beispielsweise durch Mikroskopie) bestimmt werden. In einer Ausführungsform werden die Zellen mit einem nachweisbaren Marker markiert (beispielsweise ein Radioisotop, Fluoreszenzmarker, Antigen- oder Epitop-Marker), wobei eine Wanderung durch Bestimmen des Vorliegens des Markers, der an die Membran angehaftet ist und/oder in der zweiten Kammer vorliegt durch Verwendung eines geeigneten Verfahrens (beispielsweise durch Nachweis der Radioaktivität, Fluoreszenz, Immunassay) bewertet werden kann. Das Ausmaß der durch ein Agens induzierten Wanderung kann relativ zu einer geeigneten Kontrolle bestimmt werden (beispielsweise verglichen mit einer Hintergrunds-Wanderung, die in der Abwesenheit des Agens bestimmt wurde, mit dem Ausmaß der Wanderung, die durch ein zweites Agens (d.h. einem Standard) induziert wurde, verglichen mit einer durch das Agens induzierten Wanderung von nicht-transfizierten Zellen).
Kammern können aus verschiedenen Feststoffen, wie Kunststoff, Glas, Polypropylen, Polystyrol etc., gebildet werden. Membranen, die von den Kammern gelöst werden können, wie eine Biocoat- (Collaborative Biomedical Products) oder Transwell- (Costar, Cambridge, mGluR-Antagonist) Kultureinsatz erleichtern das Zählen angehaftender Zellen. In dem Behälter kann der Filter so untergebracht werden, dass er mit einer die Zellen umfassenden Flüssigkeit in der ersten Kammer und der Flüssigkeit in der zweiten Kammer in Kontakt steht. Außer des Testagens oder eines zusätzlichen Liganden, Inhibitors oder Promotors, die zum Zweck des Assays vorliegen, ist die Flüssigkeit auf beiden Seiten der Membran vorzugsweise die gleiche oder im wesentlichen ähnlich. Die Flüssigkeit in den Kammern kann Proteinlösungen (beispielsweise bovines Serumalbumin, fetales Kälberserum, humanes Serumalbumin) umfassen, die die Stabilität erhöhen und ein nicht spezifisches Binden von Zellen inhibieren können, und/oder Kulturmedium.
In einer Ausführungsform wird eine transendotheliale Wanderung bewertet. Zusätzlich zu einem geringeren Hintergrund (Signal-Stör-Verhältnis) modelliert eine transendotheliale Wanderung in vivo Bedingungen, in denen Leukozyten von Blutgefäßen in Richtung eines Chemoattraktors auswandern, der in den Geweben an Entzündungsstellen vorliegt, indem sie die endotheliale Zellschicht durchqueren, die die Gefäßwandung auskleidet. In dieser Ausführungsform wird ein Auswanderung durch eine endotheliale Zellschicht bewertet. Um die Zellschicht zu erzeugen, können endotheliale Zellen auf einem/einer mikroporösen Filter oder Membran kultiviert werden, der/die optional mit einer Substanz wie Kollagen, Fibronectin oder anderen extrazellulären Matrixproteinen beschichtet ist, um das Anfügen der endothelialen Zellen zu erleichtern. Die endothelialen Zellen werden vorzugsweise kultiviert, bis sich eine konfluente Monoschicht gebildet hat. Es ist eine Vielzahl von endothelialen Säuger-Zellen zur Bildung von Monoschichten verfügbar, umfassend beispielsweise Venen-, Arterien-Endothelium, mikrovaskuläres Endothelium, wie humane endotheliale Zellen der Nabelvene (Clonetics Corp, San Diego, CA) oder eine geeignete Zell-Linie, wie die verwendete ECV 304-Zell-Linie (Europäische Sammlung tierischer Zellkulturen, Porton Down, Salisbury, UK). Um eine Chemotaxis als Antwort auf einen bestimmten Säuger-Rezeptor zu testen, werden endotheliale Zellen des gleichen Säugers bevorzugt; es können jedoch auch endotheliale Zellen heterologer Säuger-Spezies oder -Gattungen verwendet werden.
Im Allgemeinen wird der Assay durchgeführt, indem eine direktionale Wanderung von Zellen in oder durch eine Membran oder einen Filter in Richtung erhöhter Spiegel eines Agens von einer ersten Oberfläche des Filters in Richtung einer abgewandten zweiten Oberfläche des Filters nachgewiesen wird, wobei der Filter auf einer ersten Oberfläche ein Schicht endothelialer Zellen enthält. Die direktionale Wanderung erfolgt von dem Gebiet, das an die erste Oberfläche angrenzt, in oder durch die Membran in Richtung eines Agens, das an der abgewandten Seite des Filters untergebracht ist. Die Konzentration des Agens in dem an die zweite Oberfläche angrenzenden Gebiet ist größer als die in dem an die erste Oberfläche angrenzenden Gebiet.
In einer Ausführungsform wird ein Chemotaxis-Assay dazu eingesetzt, ein Agens hinsichtlich Liganden- oder Promotor-Aktivität zu testen, wobei eine Zusammensetzung, die Zellen umfasst, die zur Wanderung befähigt sind und ein Säuger-CXCR3-Protein oder eine funktionale Variante davon exprimieren, in der ersten Kammer positioniert werden, und eine Zusammensetzung, die das zu testende Agens umfasst (ein oder mehrere Agenzien) in der zweiten Kammer positioniert wird, vorzugsweise in der Abwesenheit anderer Liganden oder Promotoren, die eine Chemotaxis der Zellen in der ersten Kammer induzieren können (Chemoattraktor-Funktion aufweisend). Es können jedoch ein oder mehrere Liganden oder Promotoren mit Chemoattraktor-Funktion vorliegen. Die Fähigkeit eines Agens eine Chemotaxis der Zellen, die einen Säuger-CXCR3-Rezeptor exprimieren, in diesem Assay zu induzieren, ist ein Anzeichen, dass das Agens ein Ligand oder Promotor der Rezeptor-Funktion ist.
In einer Ausführungsform, die zum Testen auf einen Inhibitor verwendet wird, wird eine Zusammensetzung, die zur Wanderung befähigte und ein Säuger-CXCR3-Protein oder eine funktionale Variante davon exprimierende Zellen umfasst, in der ersten Kammer positioniert. In der zweiten Kammer wird eine Zusammensetzung vorgelegt, die einen Liganden oder Promotor (d.h. einen oder mehrere Liganden oder Promotoren) umfasst, der eine Chemotaxis der Zellen in der ersten Kammer induzieren kann (mit Chemoattraktor-Funktion). Bevor (vorzugsweise kurz bevor) die Zellen in der ersten Kammer vorgelegt werden, oder gleichzeitig mit den Zellen, wird vorzugsweise in der ersten Kammer eine Zusammensetzung positioniert, die das zu testende Agens umfasst. Die Fähigkeit eines Agens eine Liganden- oder Promotor-induzierte Chemotaxis der Zellen, die einen Säuger-CXCR3-Rezeptor exprimieren, in diesem Assay zu induzieren, ist ein Anzeichen, dass das Agens ein Inhibitor der Rezeptor-Funktion ist (beispielsweise ein Inhibitor einer zellulären Antwort-Funktion). Eine Verringerung des Ausmaßes der Wanderung, die durch den Liganden oder Promotor in der Gegenwart des Testagens induziert wird, ist ein Anzeichen bzw. Zeichen für eine inhibitorische Aktivität. Es können getrennte Bindungsstudien (siehe vorstehend aufgeführt) durchgeführt werden, um zu bestimmen, ob eine Inhibierung das Ergebnis des Bindens des Testagens an einen Rezeptor ist oder ob sie über einen anderen Mechanismus erfolgt.
Nachstehend werden in vivo Assays, die eine Leukozyten-Infiltration von Gewebe, als Antwort auf die Injektion eines Agens in das Gewebe beobachten, beschrieben. Diese Modelle erfassen die Fähigkeit von Zellen auf einen Liganden oder Promotor durch Emigration und Chemotaxis an eine Entzündungsstelle zu antworten.
Die Wirkungen eines Liganden, Inhibitors oder Promotors auf die zelluläre Antwort-Funktion eines CXCR3-Rezeptors kann durch Beobachten anderer zellulärer Antworten bewertet werden, die durch einen aktiven Rezeptor induziert werden, wobei geeignete Wirtszellen verwendet werden, die den Rezeptor enthalten. In ähnlicher Weise können diese Assays verwendet werden, um die Funktion eines Rezeptors zu bestimmen. So können beispielsweise Exozytose (beispielsweise Degranulation von natürlichen Killer-Zellen, die zur Freisetzung eines oder mehrerer Enzyme oder anderer Komponenten der Körnchen bzw. Granula führt, wie Esterasen (beispielsweise Serin-Esterasen), Perforin und/oder Granzyme), Freisetzung von Entzündungsmediator (wie eine Freisetzung von bioaktiven Lipiden, wie Leukotriene (beispielsweise Leukotrien C₄)) und Atmungs-Ausbruch bzw. -Burst (respiratory burst) durch im Stand der Technik bekannter Verfahren und anderer geeigneter Verfahren beobachtet werden. (Siehe beispielsweise Taub, D. D. et al., J. Immunol. 155 (1995), 3877–3888, hinsichtlich Assays zur Freisetzung von Körnchen-abgeleiteter Serin-Esterasen (wobei dessen Lehren hier unter Bezugnahme aufgenommen sind) und Loetscher et al., J. Immunol., 156 (1996), 322–327, hinsichtlich Assays zur Freisetzung von Enzym und Granzym durch NK-Zellen und cytotoxischen T-Lymphozyten (CTLs) (wobei deren Lehren hier unter Bezugnahme aufgenommen sind); Rot, A. et al., J. Exp. Med. 176 (1992), 1489–1495, hinsichtlich Atmungs-Ausbruch; Bischoff, S. C. et al., Eur. J. Immunol. 23 (1993), 761–767 und Baggliolini, M. und C. A. Dahinden, Immunology Today 15 (1994), 127–133).
In einer Ausführungsform wird ein Ligand, Inhibitor und/oder Promotor durch Beobachten der Freisetzung eines Enzyms nach Degranulation oder Exozytose durch eine zu dieser Funktion befähigten Zelle identifiziert. Zellen, die eine Nukleinsäure der vorliegenden Erfindung enthalten, die ein aktives Rezeptor-Protein kodiert, das eine Exozytose oder Degranulation stimulieren kann, werden in einem geeigneten Medium unter geeigneten Bedingungen gehalten, wobei ein Rezeptor exprimiert wird und eine Degranulation induziert werden kann. Der Rezeptor wird mit einem zu testenden Agens in Kontakt gebracht und eine Freisetzung von Enzym wird bewertet. Die Freisetzung eines Enzyms in das Medium kann durch Verwendung eines geeigneten Assays nachgewiesen oder erfasst werden, wie einen immunologischen Assay oder biochemischen Assay für eine Enzymaktivität.
Das Medium kann direkt getestet werden, in dem in das Medium (beispielsweise bevor, gleichzeitig mit oder nachdem die Zellen und das Agens kombiniert werden) Komponenten des Assays eingeführt werden (beispielsweise Substrat, Cofaktoren, Antikörper). Alternativ kann der Assay mit Medium durchgeführt werden, das vor dem Assay von den Zellen getrennt oder weiter bearbeitet (beispielsweise fraktioniert) wurde. So sind beispielsweise zweckdienliche Assays für Enzyme wie Serin-Esterasen verfügbar (siehe beispielsweise Taub, D. D. et al., 1995, J. Immunol., 155: 3877–3888, hinsichtlich Assays zur Freisetzung von Körnchen-abgeleiteter Serin-Esterasen).
Eine Stimulierung einer Degranulation durch ein Agens kann ein Anzeichen dafür sein, dass das Agens ein Ligand oder Promotor eines Säuger-CXCR3-Proteins ist. In einer anderen Ausführungsform werden Rezeptor-exprimierende Zellen mit einem Liganden oder Promotor kombiniert, wobei ein zu testendes Agens zuvor, nachdem oder gleichzeitig damit zugesetzt wird und die Degranulation bewertet wird. Eine Inhibierung der Liganden- oder Promotor-induzierten Degranulation ist ein Anzeichen, dass das Agens ein Inhibitor einer Säuger-CXCR3-Protein-Funktion ist.
Durch im Stand der Technik bekannte Verfahren oder andere geeignete Verfahren kann weiter ein zelluläres Anhaften beobachtet werden. So kann die Auswirkung der Chemokin-Rezeptoren eines Lymphozyten eine Integrin-Aktivierung und eine Induktion des Anhaftens an Adhäsionsmoleküle, die in Gefäßen oder dem perivaskulären Raum exprimiert werden, bewirken. In einer Ausführungsform wird ein Ligand, Inhibitor und/oder Promotor durch Beobachten der zellulären Anhaftung durch eine zur Adhäsion befähigten Zelle identifiziert. So kann beispielsweise ein zu testendes Agens kombiniert werden mit (a) Zellen, die einen Rezeptor exprimieren (vorzugsweise nicht-haftende bzw. nicht-adhärente Zellen, die durch Transfektion mit einem Rezeptor die Fähigkeit zum Anhaften erlangen), (b) einer Zusammensetzung, die ein geeignetes Adhäsions-Molekül umfasst (beispielsweise ein Substrat, wie eine Kulturvertiefung, die mit einem Adhäsions-Molekül, wie Fibronectin, beschichtet ist) und (c) mit einem Liganden oder Promotor (beispielsweise einem Agonisten) und unter Bedingungen gehalten werden, die für eine Liganden- oder Promotor-induzierte Adhäsion geeignet sind. Eine Markierung von Zellen mit einem Fluoreszenzfarbstoff stellt ein zweckdienliches Mittel zum Nachweis haftender Zellen bereit. Nicht-haftende Zellen können entfernt werden (beispielsweise durch Waschen) und es kann die Anzahl der haftenden Zellen bestimmt werden. Die Wirkung des Agens eine Liganden- oder Promotor-induzierte Adhäsion zu inhibieren oder zu fördern kann ein Anzeichen für eine Inhibitor- bzw. Promotor-Aktivität sein. In dem Assay aktive Agenzien umfassen Inhibitoren und Promotoren eines Bindens, einer Signalisierung und/oder von zellulären Antworten. In einer anderen Ausführungsform kann das zu testende Agens mit Zellen, die einen Rezeptor exprimieren, und einer Zusammensetzung, die ein geeignetes Adhäsionsmolekül umfasst, unter Bedingungen kombiniert werden, die für eine Liganden- oder Promotor-induzierte Adhäsion geeignet sind, wobei die Adhäsion beobachtet wird. Eine relativ zu einer geeigneten Kontrolle erhöhte Adhäsion ist ein Anzeichen für das Vorliegen eines Liganden und/oder eines Promotors.
Entzündungsmodelle
Es ist eine Vielzahl von in vivo Entzündungsmodellen verfügbar, die zur Bewertung der in vivo Wirkungen von Liganden, Inhibitoren oder Promotoren als therapeutische Agenzien verwendet werden können, umfassend, ein Schaf-Modell für Asthma (siehe beispielsweise Weg, V. B. et al., J. Exp. Med. 177 (1993), 561), ein Ratten-Modell für eine Allergie vom Spättyp (Rand, M. L. et al., Am. J. Pathol. 148 (1996), 855–864) oder andere geeignete Modelle. In derartigen Tieren kann die Aktivität der Antikörper, die mit anderen Säuger-CXCR3-Proteinen kreuzreagieren, bewertet werden.
Zusätzlich kann eine Leukozyten-Infiltration nach intradermaler Injektion einer Verbindung in ein geeignetes Tier, wie ein Kaninchen, eine Ratte oder ein Meerschweinchen, beobachtet werden (siehe beispielsweise Van Damme J. et al., J. Exp. Med. 176 (1992), 59–65; Zachariae, C. O. C. et al., J. Exp. Med. 171 (1990), 2177–2182; Jose, P. J. et al., J. Exp. Med. 179 (1994), 881–887). In einer Ausführungsform werden der Haut-Biopsien histologisch auf eine Infiltration von Leukozyten (beispielsweise T-Lymphozyten, Monocyten, natürliche Killer-Zellen) bewertet. In einer anderen Ausführungsform werden einem Tier markierte Zellen (beispielsweise Zellen, die ein Säuger-CXCR3-Protein exprimieren, die beispielsweise mit ¹¹¹In markiert sind), die zur Chemotaxis und Extravasation befähigt sind, verabreicht. Eine Infiltration markierter Zellen in der Nähe der Injektionsstelle einer Testprobe (beispielsweise einer zu testenden Verbindung in einem geeigneten Puffer oder einem physiologischen Träger) ist ein Anzeichen dafür, dass in der Probe ein Ligand oder Promotor, wie ein Agonist, vorliegt. Diese Assays können ebenfalls modifiziert werden, um Inhibitoren einer Chemotaxis und Extravasation von Leukozyten zu identifizieren. So kann beispielsweise ein Inhibitor verabreicht werden, entweder bevor, gleichzeitig mit oder nachdem dem Versuchstier ein Ligand oder Agonist verabreicht worden ist. Eine Abnahme des Ausmaßes der Infiltration in der Gegenwart eines Inhibitors, verglichen mit dem Ausmaß der Infiltration in der Abwesenheit eines Inhibitors ist ein Anzeichen für eine Inhibierung.
Diagnostische Anwendungen
Die vorliegende Erfindung weist eine Vielzahl von diagnostischen Anwendungen auf. So kann/können beispielsweise (eine) Mutation(en) in einem Gen, das ein Säuger-CXCR3-Protein kodiert, einen Mangel in mindestens einer Funktion des kodierten Rezeptor verursachen, wodurch eine Rezeptor-Funktion verringert oder gefördert wird. So kann beispielsweise eine Mutation, die eine Rezeptor-Variante erzeugt oder die Expressionshöhe verändert, eine Rezeptor-Funktion verringern oder fördern, wobei durch den Rezeptor vermittelte Prozesse (beispielsweise entzündliche Prozesse) verringert oder gefördert werden. Das Vorliegen einer derartigen Mutation kann durch Verwendung von Verfahren bestimmt werden, die das Vorliegen des Rezeptor oder der Rezeptor-Funktion in Zellen (beispielsweise Leukozyten, wie aktivierte T-Lymphozyten) eines Individuums oder in einer von derartigen Zellen isolierten Rezeptor-Präparation nachweist oder erfasst. In diesen Assays können verringerte oder erhöhte Rezeptor-Spiegel und/oder verringerte oder erhöhte Rezeptor-Funktionen bewertet werden.
Die hier beschriebenen Nukleinsäuren stellen Reagenzien bereit, wie Sonden und PCR-Primer, die zum Durchmustern nach, Charakterisieren und/oder Isolieren eines defekten Säuger-CXCR3-Gens verwendet werden können, das einen Rezeptor mit verringerter oder erhöhter Aktivität kodiert. Es können beispielsweise Standardverfahren zum Durchmustern nach einem defekten Gen eingesetzt werden. Ein defektes Gen kann zur weiteren Bewertung, wie hier für Säuger-CXCR3-Proteine beschrieben, isoliert und in einer geeigneten Wirtszelle exprimiert werden. Eine Vielzahl von humanen Erkrankungen sind mit Mangeln in der Funktion eines G-Protein-gekoppelten Rezeptors assoziiert (Clapham, D. E., Cell, 75 (1993), 1237–1239; Lefkowitz, R. J., Nature, 365 (1993), 603–04).
Die hier beschriebenen Nukleinsäuren stellen Reagenzien bereit, wie Sonden und PCR-Primer, die ebenfalls dazu verwendet werden können, um die Expression eines Rezeptor (beispielsweise durch Nachweis der Transkription von mRNA) durch Zellen in einer Probe (beispielsweise durch Northern-Analyse, durch in situ Hybridisierung) zu bewerten. So kann beispielsweise eine Expression in aktivierten T-Lymphozyten oder in anderen Zell-Typen bewertet werden.
Die erfindungsgemäßen Antikörper finden Anwendung in Verfahren, bei denen ein Rezeptor auf der Oberfläche von Zellen nachgewiesen werden kann. Der Rezeptor stellt einen Marker des Leukozyten-Zelltyps bereit, in dem er exprimiert wird, insbesondere von aktivierten T-Zellen. So können beispielsweise Antikörper, die gegen ein Rezeptor-Protein oder -Peptid gerichtet sind, wie die hier beschriebenen Antikörper (beispielsweise mAb 1C6) verwendet werden, um Zellen, die den Rezeptor exprimieren, nachzuweisen und/oder zu quantifizieren. In einer Ausführungsform können die Antikörper verwendet werden, um Zellen, die einen Rezeptor exprimieren, aus einem Gemisch von Zellen zu sortieren (um beispielsweise aktivierte T-Zellen, wie CD4⁺ T-Zellen zu isolieren). Hierzu können geeignete Verfahren zum Zählen und/oder Sortieren von Zellen verwendet werden (beispielsweise Strömungszytometrie, Fluoreszenz-aktiviertes Zellsortieren). Zellzahlen können in der Diagnose von Erkrankungen oder Zuständen verwendet werden, bei denen eine Zunahme oder Abnahme von Leukozyten-Zelltypen (beispielsweise aktivierte T-Zellen) beobachtet wird. Das Vorliegen eines erhöhten Spiegels an aktivierten T-Zellen in einer von einem Individuum erhaltenen Probe kann ein Anzeichen für eine Infiltration aufgrund einer entzündlichen Erkrankung oder Zustandes sein, wie eine allergische Reaktion vom Spättyp, Allotransplantat-Abstoßung oder ein pathologischer Zustand, umfassend eine bakterielle oder virale Infektion.
Weiterhin können die Antikörper verwendet werden, um die Expression eines Rezeptor nachzuweisen oder zu erfassen. So können beispielsweise erfindungsgemäße Antikörper verwendet werden, um einen Rezeptor in einer Probe (beispielsweise Gewebe oder Körperflüssigkeiten von einem Individuum, wie Blut, Serum, Leukozyten (beispielsweise aktivierte T-Lymphozyten), bronchoveoläre Spülungsflüssigkeit, Speichel, Darmflüssigkeit) nachzuweisen oder zu erfassen. So kann beispielsweise eine Probe (beispielsweise Gewebe und/oder Flüssigkeit) von einem Individuum erhalten werden und es kann ein geeigneter Assay verwendet werden, um das Vorliegen oder die Menge an CXCR3-Protein zu bewerten. Geeignete Assays umfassen immunologische Verfahren, wie FACS-Analysen und Enzym-gekoppelte Immunoadsorptions-Assays (ELISA), umfassend Chemolumineszenz-Assays, Radioimmuno-Assay und Immunohistologie. Im Allgemeinen werden eine Probe und ein erfindungsgemäßer Antikörper unter Bedingungen kombiniert, die zur Bildung eines Antikörper-Rezeptor-Komplexes geeignet sind, wobei die Bildung des Antikörper-Rezeptor-Komplexes (direkt oder indirekt) bewertet wird.
Das Vorliegen eines erhöhten Spiegels an Rezeptor-Reaktivität in der von einem Individuum erhaltenen Probe kann ein Anzeichen sein für eine Entzündung und/oder eine Infiltration und/oder Akkumulation von Leukozyten (beispielsweise aktivierten T-Zellen), die mit einer entzündlichen Erkrankung oder eines Zustands assoziiert sind, wie eine Allotransplantat-Abstoßung, allergische Reaktion von Spättyp oder eine Infektion, wie eine virale oder bakterielle Infektion. Die Expressionshöhe eines Säuger-CXCR3-Proteins oder einer Variante kann ebenfalls verwendet werden, um eine erhöhte oder verminderte Expression eines Säuger-CXCR3-Proteins mit einer bestimmten Erkrankung oder einem Zustand zu korrelieren, und in der Diagnose einer Erkrankung oder eines Zustands bei der/dem eine erhöhte oder verminderte Expression eines Säuger-CXCR3-Proteins auftritt (beispielsweise erhöht oder vermindert in Bezug auf eine geeignete Kontrolle, wie die Expressionshöhe in einem normalen Individuum). In ähnlicher Weise kann der Verlauf einer Therapie beobachtet werden, indem in einer Probe von einem Patienten eine CXCR3-Immunoreaktivität bewertet wird. So können beispielsweise erfindungsgemäße Antikörper verwendet werden, um die Anzahl an CXCR3 tragenden Zellen in einer Probe (beispielsweise Blut, Gewebe) eines mit einem entzündungshemmenden oder immunsuppressiven Agens behandelten Patienten zu beobachten.
Transgene Tiere
Es können transgene Tiere erstellt werden, bei denen das Genom des Wirtstiers unter Verwendung von DNA-Rekombinationstechniken verändert wurde. Die Veränderung kann nicht erblich sein (beispielsweise werden somatische Zellen, wie Vorläuferzellen im Knochenmark, verändert). Alternativ kann die Veränderung erblich sein (die Keimlinie wird verändert). Transgene Tiere können durch Verwendung von Standardtechniken oder anderer geeigneter Verfahren konstruiert werden (siehe beispielsweise Cooke, M. P. et al., Cell 65 (1991), 281–291 hinsichtlich einer Veränderung von T-Lymphozyten; Hanahan, D., Science (1989), 246: 1265–1275; Anderson et al., US-P-5,399,346 ).
Ein endogenes Säuger-CXCR3-Gen kann in einem geeigneten Ausgangstier bzw. Wirtstier als Ganzes oder in Teilen inaktiviert oder unbrauchbar gemacht (disabled) werden (beispielsweise durch Genunterbrechungs-Techniken), um ein transgenes Tier zu erzeugen. Um eine erfolgreiche Konstruktion eines Wirts, der ein inaktiviertes oder unbrauchbar gemachtes CXCR3-Gen umfasst, zu bewerten, können Nukleinsäuren verwendet werden (beispielsweise Southern-Hybridisierung). Zusätzlich kann eine erfolgreiche Konstruktion eines Wirts, der ein inaktiviertes oder unbrauchbar gemachtes CXCR3-Gen umfasst, durch geeignete Assays bewertet werden, die die Funktion des kodierten Rezeptors beobachten. Derartige Tiere können verwendet werden, um die Wirkung einer Rezeptor-Inaktivierung auf eine Entzündung und Wirtsabwehrmechanismen gegen Krebs und Pathogene (beispielsweise ein virales Pathogen) zu bewerten.
Eine Nukleinsäure, die ein Säuger-CXCR3-Protein oder -Polypeptid kodiert, kann in einen geeigneten Wirt eingeführt werden, um ein transgenes Tier zu erzeugen. In dem transgenen Tier vorliegende endogene CXCR3-Rezeptorgene können inaktiviert werden (beispielsweise gleichzeitig mit dem Einführen der Nukleinsäure durch homologe Rekombination, welche die endogenen Gene trennt und ersetzt. So kann beispielsweise ein transgenes Tier (beispielsweise eine Maus, ein Meerschweinchen, ein Schaf) erzeugt werden, das eine Nukleinsäure, die einen Säuger-CXCR3-Rezeptor von einer anderen Säuger-Spezies (beispielsweise ein humanes, durch SEQ ID Nr. 1 kodiertes CXCR3) in Leukozyten (wie Lymphozyten (beispielsweise aktivierte T-Lymphozyten), natürliche Killer-Zellen) exprimiert, wobei ein zweckdienliches Tiermodell zum Bewerten der Funktion des eingeführten Rezeptors bereitgestellt wird. Zusätzlich kann dem transgenen Tier ein Testagens verabreicht werden und die Wirkung des Agens auf einen Rezeptor-vermittelten Prozess (beispielsweise Entzündung) kann, wie hier beschrieben, oder durch Verwendung anderer geeigneter Assays beobachtet werden. Auf diese Art und Weise können Agenzien, die eine Rezeptor-Funktion inhibieren oder fördern, identifiziert oder für eine in vivo Wirkung bewertet werden.
Therapieverfahren
Eine Modulation einer Säuger-CXCR3-Funktion gemäß der vorliegenden Erfindung durch die Inhibierung oder Förderung mindestens einer Funktion, die für ein SäugerCXCR3-Protein kennzeichnend ist, stellt einen wirksamen und selektiven Weg zum Inhibieren oder Fördern von Rezeptor-vermittelten Funktionen bereit. Da CXC-Chemokin-Rezeptoren selektiv auf aktivierten Lymphozyten exprimiert werden, die auf Chemokine wie IP-10 und Mig reagieren, deren primäre Ziele Lymphozyten, insbesondere Effektor-Zellen wie aktivierte oder stimulierte T-Lymphozyten und NK-Zellen sind, stellen Säuger-CXCR3-Proteine ein Ziel zum selektiven Beeinträchtigen oder Fördern einer Lymphozyten-Funktion in einem Säuger, wie einem Menschen, bereit. Sobald Lymphozyten an eine Stelle rekrutiert sind, können andere Leukozyten-Typen, wie Monocyten, durch sekundäre Signale rekrutiert werden. Somit können Agenzien, die eine CXCR3-Funktion inhibieren oder fördern, umfassend Liganden, Inhibitoren (beispielsweise 1C6) und oder Promotoren, wie solche, die wie hier beschrieben identifiziert wurden, verwendet werden, um für therapeutische Zwecke eine Leukozyten-Funktion zu modulieren (beispielsweise Leukozyten-Infiltration umfassend Rekrutierung und/oder Akkumulation), insbesondere von Lymphozyten.
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Verwendung in der Herstellung eines Medikaments zum Inhibieren oder Fördern einer entzündlichen Antwort in einem Individuum bereit, das eine derartige Therapie benötigt. Es kann ein Agens verabreicht werden, das eine Säuger-CXCR3-Funktion in einem Individuum, das eine derartige Therapie bedarf, inhibiert oder fördert. Eine Verbindung, die eine oder mehrere Funktionen eines Säuger-CXCR3-Proteins (beispielsweise eines humanen CXCR3) inhibiert, kann verabreicht werden, um eine Entzündung zu inhibieren (verringern oder verhindern). So können beispielsweise erfindungsgemäße Antikörper, umfassend mAb 1C6 verwendet werden. Als ein Ergebnis wird/werden ein oder mehrere entzündliche Prozesse, wie eine Leukozyten-Emigration, Chemotaxis, Exozytose (beispielsweise von Enzymen) oder eine Freisetzung von Entzündungsmediator inhibiert. So kann beispielsweise eine Leukocyten-Infiltration in Entzündungstellen (beispielsweise in einer Allergie vom Spät-Typ) inhibiert werden.
So kann ein Agens (beispielsweise eine Rezeptor-Agonist) verabreicht werden, das ein oder mehrere Funktionen eines Säuger-CXCR3-Proteins (beispielsweise humanes CXCR3) fördert, um eine entzündliche Antwort, wie Leukozyten-Emigration, Chemotaxis, Exocytose (beispielsweise von Enzymen) oder eine Freisetzung von Entzündungsmediator induziert (auslöst oder fördert), was zu der vorteilhaften Stimulierung der entzündlichen Prozesse führt. So können beispielsweise natürliche Killer-Zellen rekrutiert werden, um virale Infektionen oder eine neoplastische Erkrankung zu bekämpfen.
Der Begriff „Individuum" umfasst hier definitionsgemäß Sauger, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf Primaten (beispielsweise Menschen), Kühe, Schafe, Ziegen, Pferde, Hunde, Katzen, Kaninchen, Meerschweinchen, Raten, Mäuse oder andere rinderartige, schafartige, pferdeartige, hundeartige, katzenartige, nagerartige oder mausartige Spezies. Erkrankungen und Zustände, die mit einer Entzündung, Infektion und Krebs assoziiert sind, können durch Verwendung des Verfahrens behandelt werden. In einer bevorzugten Ausführungsform ist die Erkrankung oder der Zustand eine/einer, in der/dem die Wirkungen von Lymphozyten, insbesondere von Effektor-Zellen, wie aktivierte oder stimulierte T-Lymphozyten und natürliche Killer-Zellen (NK) für therapeutische Zwecke (umfassend prophylaktische) inhibiert oder gefördert werden. In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist die entzündliche Erkrankung oder der Zustand eine T-Zellen-vermittelte Erkrankung oder Zustand.
Erkrankungen oder Zustände, umfassend chronische Erkrankungen, von Menschen oder anderen Spezies, die mit Inhibitoren einer CXCR3-Funktion behandelt werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf:

• Entzündliche oder allergische Erkrankungen und Zustände, umfassend systemische Anaphylaxis oder hypersensitive Antworten, Arzneimittel-Allergien (beispielsweise gegen Penicillin, Cephalosporine), Insektenstich-Allergien, entzündliche Darmerkrankungen, wie Crohn's-Erkrankung, Colitis ulcerosa, Ileitis und Enteritis; Vaginitis, Psoriasis und entzündliche Dermatosen, wie Dermatitis, Ekzeme, atopische Dermatitis, allergische Kontakt-Dermatitis, Urticaria; Vasculitis (beispielsweise nekrotisierende, kutane und hypersensitive Vasculitis); Spondyloarthopathien; Skleroderma; Atmungs-allergische Erkrankungen, wie Asthma, allergische Rhinitis, hypersensitive Lungenerkrankungen, hypersensitive Pneumonitis, interstitielle Lungenerkrankungen (ILD) (beispielsweise idiopathische Lungenfibrose oder ILD assoziiert mit rheumatoider Arthrithis oder andere Autoimmunzustände);
• Autoimmunerkrankungen, wie Arthritis (beispielsweise rheumatoide Arthritis, psoriatische Arthritis), Multiple Sklerose, systemischer Lupus erythematodes, Myasthenia gravis, Diabetes, umfassend Diabetes mellitus und jugendliche Diabetes, Glomerulonephritis und andere nephritische Erkrankungen (nephritides), Autoimmun-Thyreoiditis, Behcet's-Erkrankung;
• Gewebeabstoßung (beispielsweise bei Transplantation), umfassend Allogewebe bzw. Transplantat-Abstoßung oder Transplantat-gegen-Wirt-Reaktions-Erkrankungen;
• Es können andere Erkrankungen oder Zustände, bei denen unerwünschte entzündliche Antworten inhibiert werden müssen, behandelt werden, umfassend, jedoch nicht beschränkt auf Arteriosklerose, Cytokin-induzierte Toxizität, Myositis (umfassend Polymyositis, Dermatomyosists).
• Erkrankungen und Zustande von Menschen oder anderen Spezies, die mit Promotoren (beispielsweise einem Agonisten) einer CXCR3-Funktion behandelt werden können, umfassen, sind jedoch nicht beschränkt auf:
• Krebs, insbesondere solche mit Leukozyten Infiltration der Haut oder von Organen, wie kutane T-Zell-Lymphome (beispielsweise Mycosis fungoides);
• Erkrankungen, bei denen Angiogenese und Neovascularisation eine Rolle spielt, umfassend neoplastische Erkrankung, Retinopathie (beispielsweise diabetische Retinopathie) und Makuladegeneration;
• Infektiöse Erkrankungen, wie bakterielle Infektionen und Lepra tuberculoides, und speziell virale Infektionen;
• Immunsuppression, wie die in Individuen mit Immunschwache-Syndromen, wie AIDS, in Individuen, die sich einer Strahlentherapie, Chemotherapie oder einer anderen Therapie unterziehen, die eine Immunsuppression verursacht; Immunsuppression durch einen angeborenen Mangel in einer Rezeptor-Funktion oder andere Ursachen. Promotoren einer CXCR3-Funktion können ebenfalls schützende Wirkungen haben, die nützlich sind, um eine Verarmung von Stammzellen während einer Krebs-Chemotherapie zu bekämpfen (Sarris, A. H. et al., J. Exp. Med., 178 (1993): 1127–1132).

Verabreichungs-Modi
Es können ein oder mehrere Agenzien über eine geeignete Route an den Wirt verabreicht werden, entweder alleine oder in Kombination mit einem anderen Arzneimittel. Es wird eine wirksame Menge eines Agens (beispielsweise eines Rezeptor-Peptides, das das Binden eines Liganden inhibiert, ein anti-CXCR3-Antikörper oder ein Antigen bindendes Fragment davon) verabreicht. Eine wirksame Menge ist eine Menge, die ausreichend ist, um die gewünschte therapeutische oder prophylaktische Wirkung unter den Bedingungen der Verabreichung zu erzielen, wie eine Menge, die ausreichend ist, um eine CXCR3-Rezeptor- Funktion zu inhibieren oder zu fördern, um dadurch einen Rezeptor-vermittelten Prozess (beispielsweise einen entzündlichen Prozess) zu inhibieren bzw. zu fördern.
Es ist eine Vielzahl an Verabreichungsrouten möglich, umfassend, jedoch nicht notwendigerweise beschränkt auf orale, diätetische, topische, parenterale (beispielsweise intravenöse, intraarterielle, intramuskuläre, subkutane Injektion) und Inhalations- (beispielsweise intrabronchiale, intranasale oder orale Inhalation, intranasale Tropfen) Verabreichungsrouten in Abhängigkeit von dem Agens und der zu behandelnden Erkrankung oder des Zustands. Für respiratorische allergische Erkrankungen, wie Asthma, stellt eine Inhalation den bevorzugten Verabreichungsmodus dar.
Formulierungen eines zu verabreichenden Agens werden gemäß der ausgewählten Verabreichungsroute variieren (beispielsweise Lösung, Emulsion, Kapseln). Eine geeignete Zusammensetzung, die das zu verabreichende Agens umfasst, kann in einem physiologisch annehmbaren Vehikel oder Träger hergestellt werden. Für Lösungen oder Emulsionen umfassen geeignete Träger beispielsweise wässrige oder alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, umfassend Salzlösung und gepufferte Medien. Parenterale Vehikel können beispielsweise umfassen Natriumchlorid-Lösung, Ringer's Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, Laktat-Ringer's oder feste Öl (fixed oils). Intravenöse Vehikel können verschiedene Additive, Konservierungsmittel oder Fluide, Nährstoff- oder Elektrolyt-Nachfüller und dergleichen umfassen (siehe im Allgemeinen Remington's Pharmaceutical Sciences, 17. Auflage, Mack Publishing Co., PA, 1985). Zur Inhalation kann das Agens solubilisiert werden und in einen geeigneten Spender zur Verabreichung geladen werden (beispielsweise einen Zerstäuber, Vernebler oder einen Spender mit unter Druck stehendem Aerosol).
Ist das Agens ein Protein oder Polypeptid kann es weiterhin mittels einer in vivo Expression des rekombinanten Proteins verabreicht werden. Eine Expression in vivo kann mittels einer somatischen Zell-Expression gemäß geeigneter Verfahren geleistet werden (siehe beispielsweise US-P-5,399,346 ). In dieser Ausführungsform kann eine das Protein kodierende Nukleinsäure zum Zuführen in einen retroviralen, adenoviralen oder anderen geeigneten Vektor (vorzugsweise ein Replikations-defizienter Vektor) inkorporiert werden, oder kann in eine transfizierte oder transformierte Wirtszelle eingeführt werden, die das Protein zum Zuführen exprimieren kann. In der letzteren Ausführungsform können die Zellen implantiert werden (alleine oder in einer Barriereneinrichtung), injiziert oder andersartig in einer Menge eingeführt werden, die wirksam ist, um das Protein in einer Therapeutisch wirksamen Menge zu exprimieren.
Beispiele
Die vorliegende Erfindung wird nun durch die folgenden Beispiele erläutert.
Humane Chemokine (Beispiele 1–2)
Die CXC-Chemokine Mig, IL-8, GROα, NAP-2, GCP-2, ENA78, PF4, die CC-Chemokine MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, I309, Eotaxin und das Chemokin-verwandte Lymphotactin werden gemäß etablierter Protokolle chemisch synthetisiert (Clark-Lewis, I. et al., 1991, Biochemistry 30: 3128–3135). Das CXC-Chemokin IP-10 wurde von PeproTech, Rocky Hill, NJ. bezogen.
Beispiel 1: Klonieren einer Rezeptor-cDNA (erläuterndes Beispiel)
Molekularbiologische Standard-Techniken wurden verwendet (Sambrook, J. et al., 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NY).
DNA-Fragmente, die möglicherweise auf T-Lymphozyten beschränkte Chemokin-Rezeptoren kodieren, werden durch Verwendung der Polymerase-Kettenreaktion (PCR) erzeugt. Basierend auf konservierten Motiven der Chemokin-Rezeptoren werden zwei degenerierte Oligonukleotid-Primer aufgestaltet. Die Gestaltung der Primer basierte auf den konservierten Nukleotidsequenzen in der Transmembrandomäne 2 (TM2) und der Transmembrandomäne 7 (TM7) der Chemokin-Rezeptoren IL-8R1 (CXCR1), IL-8R2 (CXCR2), CC-CKR1 (CCR1), CC-CKR2 (CCR2) und den Orphan-Rezeptoren EBI I, LESTR und BLR1/MDR15 (EBI I, Birkenbach, M. et al., J. Virol. 67 (1993), 2209–2220); LESTR, Loetscher, M. et al., J. Biol. Chem. 269 (1994), 232–237; und BLR1/MDR15, Dobner, T. et al., Eur. J. Immunol. 22 (1992), 2795–2799 und Barella, L. et al., Biochem. J., 309 (1995), 773–779).
Die Sequenzen der Primer waren die folgenden:
SEQ ID NO: 3:
5'-GGG CTG CAG CII T(T/G) (T/G) C(C/A)G AC(A/C) TIC TI(C/T) T-3'
SEQ ID NO: 4:
5'-GGG TCT AGA IGG GTT IAI (G/A)CA (G/A)C(T/A) (G/A) (T/C)G-3'
(I = Inosin). Diese Primer wurden in einer Polymerase-Kettenreaktion (PCR) zum Amplifizieren von DNA-Fragmenten verwendet, wobei humane genomische DNA, die von humanen peripheren Blut-Lymphozyten isoliert wurde, als Vorlage wie folgt verwendet wurde. Ein 100 μl Reaktionsgemisch, das 2 μg humane genomische DNA, 1 × DynaZyme-Puffer (Finnzymes OY, Espoo, Finnland), 1,5 mM MgCl₂, 500 μM je Desoxynukleotid, 1 μM von beiden Primern und 2,5 U DynaZyme DNA-Polymerase umfasste, wurde in einem DNA-Thermocycler (rechne PHC-2, Brouwer, Schweiz) 30 Zyklen unterzogen (94°C für 1 Minute; 55°C für 1 Minute und 72°C für 2 Minuten). PCR-Produkte der vorhergesagten Größe (ungefähr 700 bp) wurden in die Gene Scribe-Bakterien-Vektoren pTZ18/19 U/R (USB, Cleveland, OH) kloniert, teilweise sequenziert (Sanger, F. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 74 (1977), 5463–5467) und hinsichtlich ihrer Ähnlichkeit zu bekannten Chemokin-Rezeptoren und einer Expression ihrer entsprechenden mRNA in Leukozyten beurteilt. Eine als 2MLC22 bezeichnetes DNA-Fragment zeigte eine 64%-ige Nukleotidsequenzidentität mit IL-8R2. Das Fragment 2MLC22 hybridisierte spezifisch mit RNA von Bakterienzellen, jedoch nicht von Monocyten oder Neutrophilen, wie durch Northern-Blot-Analyse bewertet wurde, wobei eine Hybridisierungsprobe verwendet wurde, die durch enzymatische Markierung von 2MLC22 mit dem radioaktiven Isotop ³²P erzeugt wurde, wobei das Klenow-Fragment der DNA-Polymerase I und ein im Handel verfügbarer Markierungs-Kit mit zufälligen Primern verwendet wurde.
Das Fragment 2MLC22 wurde enzymatisch mit 32P, wie beschrieben, markiert und als Probe verwendet, um eine humane Tetanus-Toxoid-spezifische CD4⁺ T-Zell (KT30)-cDNA-Bank zu durchmustern, die in Lambda-ZAP Express erzeugt wurde (Stratagene, Zürich, Schweiz) (Loetscher, M. et al., 1994, J. Biol. Chem., 269: 232–237). Es wurde gemäß den Herstellerangaben eine cDNA-Bank in einem λ ZAP Express-System erzeugt, wobei Poly(A)⁺ RNA von humanen Tetanus-Toxoid-spezifischen CD4⁺ T-Zellen (KT30) verwendet wurde. Die so erhaltene Bank umfasste ungefähr 1,8 × 10⁶ unabhängige Klone mit einer durchschnittlichen Insertgröße von ungefähr 1,1 kb. Zum Plaque-Hybridisierungs-Screening wurden ungefähr 4 × 10⁵ Klone auf Biodyne Nylonmembranen (PALL AG, Muttenz, Schweiz) übertragen und mit MLC22 beprobt, das zu einer spezifischen Aktivität von 1 × 10⁹ dpm/μg DNA markiert wurde, wobei der "high prime" DNA-Markierungs-Kit (Boehringer Mannheim, Mannheim, Deutschland) verwendet wurde. Die Hybridisierung erfolgte in 50% Formamide, 6 × SSC, 0,5% SDS, 100 μg/ml denaturierter Heringssperma-DNA bei 42°C für 20 Stunden, wobei 1 × 10⁶ dpm 2MLC22/ml Hybridisierungslösung verwendet wurde. Die Membranen wurden einmal in 2 × SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur für 10 Minuten, zweimal in 1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C für 30 Minuten und schließlich einmal in 0,5 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C für 10 Minuten gewaschen. Von positiven Lambda Plaque-Hybridisierungen nach den hochstringenten Waschungen wurden dreiundzwanzig Klone isoliert, wobei das größte Insert (1670 bp) sequenziert wurde. Eine CXCR3-cDNA wurde in im Handel verfügbare Plasmidvektoren subkloniert zur Nukleotidsequenzierung, zum Erzeugen von Hybridisierungsproben und zur Konstruktion von stabil transfizierten Säuger-Zell-Klonen, die CXCR3 exprimieren, wobei diese CXCR3-cDNA umfassenden Konstrukte in E. coli-Stämmen gehalten wurden.
Ergebnisse
Beim Suchen nach für T-Lymphozyten spezifischen Chemokin-Rezeptoren wurde aus einer humanen CD4⁺ T-Zell-Bank ein cDNA isoliert (1, SEQ ID Nr. 1). Diese cDNA wurde nicht aufgefunden im Verlauf eines Absuchens einer herkömmlich verwendeten Monozyten-abgeleiteten cDNA-Bank oder einer Granulocyten (HL60)-abgeleiteten cDNA-Bank nach cDNAs neuer Chemokin-Rezeptoren; wobei jedoch eine direkte Suche der Banken speziell nach CXCR3-cDNA nicht durchgeführt wurde. Die CXCR3-cDNA, von der gezeigt wurde, dass sie einen IP-10/Mig-Rezeptor kodiert (siehe nachstehend aufgeführt), weist einen offenen Leserahmen (ORF) von 1104 bp auf, der an Rest 69 beginnt und ein Protein mit 368 Aminosäuren mit einem vorhergesagten Molekulargewicht von 40659 Dalton kodiert. Die Aminosäuresequenz (2, SEQ ID Nr. 2) umfasst sieben putative Transmembransegmente, die durch G-Protein-gekoppelte Rezeptoren gekennzeichnet sind, und drei mögliche N-Glykosylierungsstellen (Asn²², Asn³² und Asn¹⁹⁹) (2). Zusätzlich können in der intrazellulären COOH-terminalen Region ein Threonin- und neun Serin-Reste gefunden werden (2), die mögliche Phosphorylisierungsstellen für Rezeptor-Kinasen sind (Palczewski, K. und J. L. Benovic, Trends Biochem. Sci., 16 (1991), 387–391; Chuang, T. T. et al., J. Biol. Chem. 267 (1992), 6886–6892; und Giannini, E. et al., J. Biol. Chem. 270 (1995), 19166–19172).
Die 368 Aminosäuresequenz des Rezeptors (IP-10/MigR, 2, SEQ ID Nr. 2) wurde mit den Aminosäuresequenzen anderer humaner Chemokin-Rezeptoren ausgerichtet, um fassend IL-8R1 (CXCR1), IL-8R2 (CXCR2), CC-CKR1 (CCR1), CC-CKR2A (CCR2a), CC-CKR3 (CCR3) und CC-CKR4 (CCR4). Es wurden mehrere Proteinausrichtungen gemäß Higgins und Sharp durchgeführt (Higgins, D. G. und P. M. Sharp, "Description of the method used in CLUSTAL," Gene 73 (1988), 237–244). Die in 2 schwarz umrandeten Reste stellen Regionen dar, die zwischen IP-10/MigR und mindestens zwei anderen Chemokin-Rezeptoren identisch sind. Die Ausrichtung zeigte mehrere konservierte Motive, insbesondere in den Transmembrandomänen und in der zweiten intrazellulären Schleife. In der dritten und in der sechsten Transmembrandomaine (2) wurde eine signifikante Sequenzidentität mit den CXC-Rezeptoren IL-8R1 und IL-8R2, jedoch nicht mit den CC-Chemokin-Rezeptoren beobachtet.

Die Sequenz besitzt insgesamt eine 40,9%-ige und 40,3%-ige Aminosäureidentität mit den IL-8R1- bzw. IL-8R2-Rezeptoren, und eine 34,2%-ige bis 36,9%-ige Identität mit den fünf bekannten CC-Chemokin-Rezeptoren (Tabelle 1). Ein geringerer Grad an Ähnlichkeit wurde mit Sieben-Transmembrandomän-Rezeptoren gefunden, die in T-Zellen exprimiert werden, die jedoch keine Chemokine binden, beispielsweise eine 27,2%-ige Identität mit dem Thromin-Rezeptor (Vu, T.-K. H. et al., 1991, Cell, 64: 1057–1068). Aus einer humanen, genomischen DNA-Bank wurde kürzlich ein verkürzter Klon mit nicht identifizierter Funktion isoliert mit einer unvollständigen kodierenden Sequenz, die mit der von 2 ausgerichtet werden kann (Marchese, A. et al., 1995, Genomics, 29: 335–344). Tabelle 1 Aminosäuresequenzvergleich von IP-10/Mig mit humanen Chemokin-Rezeptoren

	IL-8R1 (CXCR1)	IL-8R2 (CXCR2)	CC-CKR1 (CCR1)	CC-CKR2A (CCR2a)	CC-CKR3 (CCR3)	CC-CKR4 (CCR4)	CC-CKR(CCR5)	ThrombR
IP-10/MigR	40,9^a	40,3	34,9	34,2	34,4	35,8	36,9	27,2
IL-8R1		77,1	33,7	32,9	34,3	39,7	34,3	29,1
IL-8R2			34,9	33,6	34,1	40,8	34,4	29,7
CC-CKR1				54,1	63,1	49,3	56,3	26,8
CC-CKR2A					50,7	46,1	68,8	24,6
CC-CKR3						46,5	52,3	27,3
CC-CKR4							50,0	29,2
CC-CKR5								23,6

a Die Zahlen beziehen sich auf die prozentuale Aminosäureidentität. Paarweise Proteinsequenz-Ausrichtungen wurden unter Verwendung des Programms PALIGN mit einem offenen Lückenaufwand (open gap cost) und einen einheitlichen Lückenaufwand (unit gap cost) von 3 bzw. 2 durchgeführt.

Beispiel 2. Biologische Aktivität (erläuterndes Beispiel)
Expression in aktivieren T-Lymphozyten
Angesichts der beobachteten Chemokin-Selektivität wurde das Vorliegen von IP-10/MigR in Leukozyten und verwandten Zell-Linien durch Northern-Blot-Analysen untersucht. Es wurden 10 μg Proben von Gesamt-RNA aus frisch isolierten humanen Blut-Monocyten, Neutrophilen, Lymphozyten (PBL), mit Nylonwolle gereinigte T-Zellen und von kultivierten Zellen, umfassend geklonte humane CD4⁺ T-Zellen (KT30) und CD8⁺ T-Zellen (ERCD8), klonierten NK-Zellen (ERNK57) und PBL, die für 10 Tage kultiert wurden (1–2,5 × 10⁶ Zellen/ml in RPMI 1640 Medium, das 2 mM Glutamin, 1 × nicht-essentielle Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat, 100 μg/ml Kanamycin, 5 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol und 5% humanes Serum umfasste) in der Gegenwart von 400 U/ml hrIL-2 untersucht (das humane rekombinante IL-2 wurde von Dr. A. Lanzavecchia, Basel Institute of Immunology, Basel, Schweiz zu Verfügung gestellt). Agarosegele wurden mit Ethidiumbromid gefärbt, um die Integrität und die Menge der Gesamt-RNA auf dem Gel vor dem Transfer zu überprüfen. Die RNA-Proben wurden mit einem ³²P-markierten 5'-Fragment der IP-10/MigR DNA (10⁹ cpm/μg DNA) bei 5 × 10⁶ cpm/ml Hybridisierungslösung wie beschrieben analysiert (Loetscher, M. et al., 1994, J. Biol. Chem., 269: 232–237). Das als Northern-Sonde verwendete 5'-Fragment wurde durch Verdau einer CXCR3-cDNA in pBK-CMV-Vektor (Stratagene GmbH, Zürich, Schweiz) mit PstI erzeugt, was zu dem 724 bp 5'-Ende der CXCR3-cDNA (1) führte.
Ergebnisse
In den klonierten CD4⁺ T-Zellen, KT30, wurde eine starke Expression der mRNA der erwarteten Größe gefunden, die zur Isolierung der Rezeptor-cDNA verwendet wurde. Ähnliche Expressionsspiegel wurden in dem CD8⁺ T-Zell-Klon, ERCD8 und dem NK-Zell-Klon, ERNK57 gefunden. Im Unterschied dazu waren in frisch isolierten Blut-Lymphozyten und mit Nylonwolle gereinigten T-Zellen IL 10/MigR-Transkripte kaum nachweisbar. Wurden diese Zellen jedoch in der Gegenwart von IL-2 kultiviert, wurde eine starke Hochregulierung beobachtet und der Spiegel der Rezeptor-mRNA erreichte den der T- und NK-Zellklone. Unter diesen Bedingungen wurden in frisch isolierten Blut-Monocyten, neutrophilen Leukozyten oder eosinophilen Leukozyten keine IL-10/MigR-Transkripte nachgewiesen. Zusätzlich exprimierten Leukozyten-verwandte Zellen die IL 10/MigR-mRNA nicht, umfassend die Mastzell-Linie, HMC-1, die promyelocytische Leukämie-Linie, HL60, das histocytische Lymphom, U937, die chronische myelogene Leukämie-Linie, K562, die akute T-Zell-Leukämie-Linie, Jurkat, die akute lymphoblastische Leukämie-Linie, Molt, die B-lymphoblastischen Zell-Linien Daudi und Raji, Lymphozyten von Patienten mit chronischer und akuter B-Lymphoid-Leukämie (B-CLL und B-ALL), reife Basophile von einem Patient mit basophiler Leukämie und die Erythroleukämie-Zell-Linie, HEL. Im Gegensatz wurde gezeigt, dass die Rezeptoren, von denen kürzlich gezeigt wurde, dass sie Lymphocyten anziehen, d.h. MCP-1, MCP-2, MCP-3, MIP-1α, MIP-1β und RANTES (Loetscher, P. et al., FASEB J. 8 (1994), 1055–1060; Carr, M. W. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 (1994), 3652–3656; Taub, D. D. et al., Science 260 (1993), 355–358; Schall, T. J. et al., J. Exp. Med. 177 (1993), 1821–1825; Schall, T. J. et al., 1990, Nature, 347: 669–672), ebenfalls auf Monocyten und Granulocyten gefunden werden. Die begrenzte Expression von IP-10/MigR in aktivierten T-Lymphozyten und einer natürlichen Killer-Zell-Linie läßt vermuten, dass dieser neue Rezeptor eine selektive Lymphozyten-Rekrutierung vermitteln kann.
Stabile Transfektanten
Die CXCR3-cDNA wurde mittels Verdau mit BamHI and XbaI aus pBK-CMV (Stratagene GmbH, Zürich, Schweiz) freigesetzt und in BamHI- und XbaI-Stellen von pcDNA3 (Invitrogen BV, WB Leek, Niederlande) kloniert, um pcDNA3-Klon 8 zu ergeben, der in Escherichia coli (XL1 Blue) gehalten und gelagert wurde.
Um stabile Transfektanten zu erzeugen, wurden entweder 4 × 10⁶ pre-B Zellen der Maus (300–19) (Thelen, M. et al., FASEB. J. 2 (1988), 2702–2706), humane promyelocytische Zellen (GM-1) (Garotta, G. et al., J. Leukozyte Biol. 49 (1991), 294–301) oder humane akute T-Zell-Leukämie-Zellen (Jurkat) (Loetscher, P. et al., FEBS Lett. 341 (1994), 187–192) durch Elektroporation mit 20 μg Rezeptor-cDNA in pcDNA3, der mit BglII linearisiert wurde, wie kürzlich beschrieben, transfiziert (Moser, B. et al., Biochem. J. 294 (1993), 285–292). IP-10/MigR-transfizierte Zellen wurden durch begrenzende Verdünnung unter G-418-Selektion (Life Technologies, Inc.) kloniert (1,0 mg/ml G-418 für 300–19 und 0,8 mg/ml G- 418 für Jurkat- and GM-1-Zellen). G-418 resistente Klone wurden nach einer Rezeptor-Expression mittels RNA-Dot-Blot-Analyse durchmustert.
Ca²⁺-Fluss
Um die Funktionalität des Rezeptors zu bestimmen, wurden Klone muriner pre-B-Zellen (300–19), humaner promyelocytische Zellen (GM-1) und humaner T-Zell-Leukämie-Zellen (Jurkat) mit Rezeptor-cDNA, wie vorstehend beschrieben, stabil transfiziert. Eine Aktivierung der Chemokin-Rezeptoren führte zu einer transienten Zunahme der im Cytosol frei vorkommenden Ca²⁺-Konzentration ([Ca²⁺]_i), wobei dieser Assay verwendet wurde, um eine Signalisierung in den transfizierten Zellen zu beobachten.
Veränderungen der im Cytosol frei vorkommenden Ca²⁺-Konzentration ([Ca²⁺]_i) wurden in Zellen, die mit Fura-2 beladen waren, erfaßt, durch eine 30-minutige Inkubation bei 37°C mit 0,1 nmol Fura-2-acetoxymethylester pro 10⁶ Zellen in einem Puffer, der 136 mM NaCl, 4,8 mM KCl, 1 mM CaCl₂, 5 mM Glucose und 20 mM HEPES, pH-Wert 7,4 umfasste. Nach Zentrifugation wurden beladene Zellen in dem gleichen Puffer (10⁶ Zellen/ml) resuspendiert, mit dem angezeigten Chemokin bei 37°C stimuliert und es wurden [Ca²⁺]_i-bezogene Fluoreszenzänderungen aufgezeichnet (von Tscharner, V. et al., Nature 324 (1986), 69–372).
Ergebnisse
Als Antwort auf IP-10 und Mig wurde eine schnelle [Ca²⁺]_i-Zunahme beobachtet. Es wurde gezeigt, dass das Chemokin IP-10 bei hypersensitiven Reaktionen der Haut von Spat-Typ exprimiert wird (Luster, A. D. et al., 1985, Nature, 315: 672–676; Kaplan, G. et al., 1987, J. Exp. Med., 166: 1098–1108). Das als Mig bezeichnete Chemokin wurde kürzlich identifiziert (Farber, J. M., 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87: 5238–5242; Farber, J. M., 1993, Biophys. Res. Commun., 192: 223–230). Beide Chemokine weisen die CXC-Anordnung der ersten beiden Cysteine wie IL-8 auf, sind jedoch nicht chemotaktisch für neutrophile Leukozyten. Es wurde kürzlich berichtet, dass IP-10 T-Lymphozyten anzieht (Luster, A. D. und P. Leder, 1993, J. Exp. Med., 178: 1057–1065; Taub, D. D. et al., 1993, J. Exp. Med., 177: 1809–1814), und dass Mig chemotaktisch für Tumor-assoziierte Lymphozyten ist (Liao, F. et al., 1995, J. Exp. Med., 182: 1301–1314).
3A–3C fassen die Wirkungen von IP-10 und Mig auf Zellen zusammen, die mit der cDNA transfiziert wurden und die funktionalen IP-10/Mig exprimieren. Wie durch ([Ca²⁺]_i-Änderungen gezeigt (3A), war die Wirkung von IP-10 und Mig konzentrationsabhängig und bereits bei 1 nM nachweisbar, was zeigt, dass beide Chemokine eine hohe Affinität für den neuen Rezeptor aufweisen. Im Gegensatz antworteten die IP-10/Mig-Transfektanten bei Konzentration bis zu 100 nM nicht auf irgendeines der 16 anderen potentiellen Agonisten, umfassend die Chemokine IL-8, GROα, NAP-2, GCP-2, ENA78, PF4; die CC-Chemokine MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4, MIP-1α, MIP-1β, RANTES, I309, Eotaxin oder das Chemokin-verwandte Lymphotactin (nicht gezeigt). Mit mäuseartigen und den humanen transfizierten Zellen wurden identische Ergebnisse erzielt. Diese Beobachtungen zeigen, dass der neue Rezeptor hoch selektiv für IP-10 und Mig ist. Entsprechend wird der Rezeptor hier als ein IP-10/Mig-Rezeptor (IP-10/MigR) oder als "CXCR3" bezeichnet, was dessen Spezifität für CXC-Chemokine wiederspiegelt.
Wie in 3B gezeigt führt eine wiederholte Stimulierung mit IP-10 oder Mig zu einer Deallergisierung, die für Chemokin-Rezeptoren typisch ist. Weiterhin kommt es zu einer Kreuz-Deallergisierung, wenn die Zellen mit IP-10 gefolgt von Mig oder umgekehrt stimuliert werden, was bestätigt, dass der Rezeptor eine hohe Affinität für beide Chemokine aufweist. Bei einer Konzentration von 100 nM wird deutlich, dass Mig in einer Kreuz-Deallergisierung wirksamer als IP-10 ist, was eine höhere Affinität oder Bindungs-Stabilität des IP-10/Mig-Rezeptors für Mig vermuten lässt.
Obwohl eine Expression von funktionalem IP-10/MigR gezeigt wurde, haben Bindungsexperimente unter Verwendung von radioaktiven Liganden ein nicht-spezifisches Binden zwischen 60 und 80% des Gesamten deutlich gemacht, was eine Bestimmung von Bindungsparametern verhinderte. Da IP-10 und Mig stark kationisch sind (pI-Werte von 10,8 und 11,1) kann eine nichtspezifische Wechselwirkung mit Proteoglykanen der Zelloberfläche diese Ergebnisse erklären. Tatsächlich wurden auf einer Vielzahl von Blut- und Gewebezellen nicht auf den Chemokin-Rezeptor bezogene, Heparine-sensitive Bindungsstellen für IP-10 (und PF4) nachgewiesen (Luster, A. D. et al., 1995, J. Exp. Med., 182: 219–231), wobei Heparansulfat IP-10 und Mig bindet und eine Lymphozyten-Chemotaxis verhindert (nicht gezeigt). Die Heparin-Bindungsstelle ist wahrscheinlich nicht an einer Bindung CXCR3-Rezeptor-Bindung beteiligt und es kann ein Einschluss eines geeigneten Heparin-Derivates, wie Chondroitinsulfat in der Reaktion (beispielsweise im Bindungspuffer) verwendet werden, um ein nicht-spezifisches Binden an Zellen durch die Heparin-Bindungsstelle zu inhibieren.
Chemotaxis
PBL wurden von Leukozytenfilmen (buffy coats) aus Spenderblut frisch isoliert. Die Leukozytenfilme aus Spenderblut wurden von dem zentralen Labor-Blut-Transfusions-Service der Schweiz (SRK) bereitgestellt. Eine Isolation von PBL des Leukozytenfilms wurde durchgeführt wie beschrieben in Colotta, F. et al., J. Immunol. 132 (1984), 936–944.
Von Leukozytenfilmen aus Spenderblut frisch isolierte PBL wurden ohne weiteres Bearbeiten verwendet oder wurden nach einer 10-tägigen Kultivierung in der Gegenwart von IL-2 verwendet (1–2,5 × 10⁶ Zellen/ml in RPMI 1640 Medium das 2 mM Glutamin, 1 × nicht-essentielle Aminosäuren, 1 mM Natriumpyruvat, 100 μg/ml Kanamycin, 5 × 10^–5 M 2-Mercaptoethanol und 5% humanes Serum in der Gegenwart von 400 U/ml hrIL-2 umfasste).
Eine Zellwanderung wurde in Kammern mit 48 Vertiefungen bewertet (Neuro Probe, cabin John, MD, USA), wobei Polyvinylpyrrolidine-freie Polycarbonat-Membranen (Nucleopore) mit 5 μm Poren für IP-10/MigR transfizierte Zellen (Loetscher, P. et al., FEBS Lett. 341 (1994), 187–192) oder mit 3 μm Poren für humane PBL (Loetscher, P. et al., FASER J. 8 (1994), 1055–1060) verwendet wurden. Es wurde mit 20 mM Hepes, pH-Wert 7,4, und 1% pasteurisierte Plasma-Proteinlösung (Labor des Roten Kreuzes der Schweiz, Bern, Schweiz) ergänztes RPMI 1640 verwendet, um die Chemokine zu lösen (unter Vertiefungen) und um die Zellen zu verdünnen (100000 Rezeptor-Transfektanten oder PBL in der oberen Vertiefung). Nach 60 Minuten bei 37°C wurde die Membran entfernt, an der oberen Seite mit PBS gewaschen, fixiert und gefärbt. Alle Assays wurde als Dreifachbestimmung durchgeführt und die gewanderten Zellen wurden in fünf willkürlich ausgewählten Feldern bei 1000-facher Vergrößerung gezählt. Die spontane Wanderung wurde in der Abwesenheit eines Chemoattraktors durchgeführt.
Ergebnisse – transfizierte Zellen
Transfizierte Zellen, die IP-10/MigR bereitwillig exprimieren, wandern in Richtung IP-10 oder Mig, während die nicht-transfizierten Eltern-Zellen nicht antworteten (3C). beide Agonisten zeigten eine übliche zweiphasige Konzentrationsabhängigkeit. IP-10 induzierte eine Wanderung bei Konzentrationen unter 1 nM, während die Antwort von Mig bei Konzentrationen über 10 nM nachweisbar wurde. Die Wirksamkeit, die durch die maximale Zahl der gewanderten Zellen erfasst wird, war ungefähr zweimal so hoch für Mig als für IP-10. Diese Ergebnisse zeigen, dass IP-10/MigP, wie alle bekannten Chemokin-Rezeptoren in Leukozyten, eine Chemotaxis als Antwort auf einen Liganden vermittelt.
Ergebnisse – Leukozyten aus humanem Blut
Übereinstimmend mit der zellulären Verteilung des IP-10/MigR, wurde festgestellt, dass humane T-Lymphozyten auf IP-10 and Mig stark reagieren (4A–4B). Die Aktivität von IP-10 und Mig als Inducer von [Ca²⁺]_i-Änderungen (4A) und einer in vitro Chemotaxis (4B) stimmte mit den Wirkungen überein, die bei Verwendung von transfizierten Zellen beobachtet wurden, die IP-10/MigR exprimieren, wobei IP-10 stärker, aber weniger wirksam als Mig war. Eine Aktivierung der T-Lymphozyten durch Kultiviren in der Gegenwart von IL-2 war für eine Induktion eines Calcium-Flusses und einer Chemotaxis erforderlich, wobei mit frisch isolierten Blut-Lymphozyten unter den verwendeten Bedingungen keine Antwort beobachtet wurde.
Materialien und Verfahren für Beispiele 3–9
In den Beispielen 3–9 wurden die folgenden Materialien und Verfahren verwendet.
Chemokine
Rekombinante humane Chemokine wurden von Peprotech (Rocky Hill, NJ) bezogen, mit Ausnahme von dem kürzlich beschriebenen Eotaxin (Ponath, P. D., et al., 1996, J. Clin. Invest., 97: 604–612; siehe ebenfalls Ponath et al., WO 97/00960 , veröffentlicht am 9. Januar 1997), das von Dr. Ian Clark-Lewis zur Verfügung gestellt wurde. ¹²⁵I-markierte Chemokine von Du Pont NEN (Boston, MA) bezogen.
Zellen und Zell-Linien
Neutrophile und PBMCs wurden wie beschrieben isoliert (Ponath, P. D., et al., J. Clin. Invest., 97 (1996), 604–612). Um CD3-Blasten/Blastocysten (blasts) zu erzeugen, wurde Gewebekulturplatten, die mit dem anti-CD3-Antikörper TR66 beschichtet wurden, 2 × 10⁶ PBMC/ml in RPMI-1640 plus 10% FCS zugesetzt. Nach 4–6 Tagen wurden Blasten/Blastocysten in neues Medium überführt und mit IL-2 (freundlicherweise bereitgestellt von Antonio Lanzavecchia, Basel) mit 50 Units/ml ergänzt.
Andere verwendete Zell-Linien umfassten Transfektanten des mäuseartigen L1.2 pre B-Zell-Lymphoms, die entweder CXCR3 (siehe nachstehend aufgeführt), IL-8 RA (Ponath, P. D., et al., 1996, J. Exp. Med., 183: 2437–2448), IL-8 RB (Ponath, P. D., et al., J. Exp. Med., 183 (1996), 2437–2448), CCR2b (G. LaRosa, nicht veröffentlicht), CCR4, CCR5 (Wu, L., et al., Nature 384 (1996), 179–183) oder CCR1 (Campbell, J. J., et al., J. Cell Biol. 134 (1996), 255–266) exprimieren.
Erzeugen von CXCR3-Transfektanten
Zellen
L1.2-Zellen wurden in RPMI-Medium 1640, 10% Fetal Clone (von Hyclone, Inc.), 50 U/ml Penicillin/Streptomycin, 1 × L-Glutamin, 1 mM Natriumpyruvat und 5,5 × 10^–5 M β-Mercaptoethanol wachsen gelassen. Die Medienkomponenten wurden von GibcoBRL bezogen, mit Ausnahme des 10% Fetal Clone, das von Hyclone, Inc. bezogen wurde. Zwei Tage vor einer Transfektion wurden die L1.2-Zellen in frischem Medium 1:5 verdünnt. Dies führte zu 150 Millionen Zellen in der log-Phase des Wachstums mit einer Konzentration von ungefähr 1–3 Millionen Zellen/ml.
CXCR3-DNA und Transfektion
E. coli XL1Blue Zellen (Stratagene, Inc. (Kat. Nr. 200236)) wurden gemäß dem Protokoll des Herstellers mit pcDNA3-Klon 8 transformiert (Beispiel 2; Loetscher, M., et al., 1996, J. Exp. Med., 184: 963–969). Die Transformanten wurden bei 37°C wachsen gelassen, während sie bei 250 rpm in 500 ml 100 μg/ml Ampicillin beinhaltendem LB geschüttelt wurden. Die Kultur wurde dann durch Zentrifugation bei 8000 × g gesammelt, und das Plasmid wurde unter Verwendung einer Maxi Plasmid-Reinigungs-Säule and des Protokolls gereinigt (Qiagen, Kat. Nr. 12162). Die Plasmidkonzentration und Reinheit wurde mittels eines 1%-igen Agarosegels und mittels OD260/280-Verhältnissen bestimmt. Die Plasmid-DNA wurde in ddH₂O gelöst und bis zur Verwendung bei –20°C gelagert.
Zum Linearisieren des Vektors wurde eine ScaI-Endonuclease verwendet. 100 μg DNA wurde mit 10 μl ScaI für 8 Stunden bei 37°C gemäß dem Herstellerprotokoll verdaut (GibcoBRL, Kat. Nr. 15436-017). 20 μg wurde direkt zum Ausführen einer stabilen Transfektion verwendet. 80 μg wurde von Proteinen und Salzen mit einer Phenol:Chloroform:Isoamylalkohol (25:24:1)-Extraktion, Fällung in 100% Ethanol (mit 0,1 Volumen NH₄COOH) und einem Waschen mit 70% Ethanol gereinigt.
Stabile Transfektanten einer mäuseartigen pre-B Lymphom-Zellline (L1.2) wurden im Wesentlichen wie beschrieben erzeugt (Ponath, P. D., et al., 1996, J. Exp. Med., 183: 2437–2448). Es wurden 25 Millionen L1.2-Zellen einer Elektroporation in 0,8 ml 1 × PBS unterzogen mit 20 μg linearisierter DNA, 20 μg linearisierter DNA, die dann gereinigt wurde (siehe vorstehend unter Linearisierung des DNA aufgeführt) oder ohne DNA. Vor der Elektroporation wurden die L1.2-Zellen und die DNA für 10 Minuten in 50 ml konischen Röhrchen (Falcon Modell 2070) bei sanftem Mischen (Verwirbeln) alle 2 Minuten inkubiert. Das L1.2-Zell-DNA-Gemisch wurde in Gene Pulser-Küvetten mit einer 0,4 cm Elektrodenlücke überführt (BioRad, Kat. Nr. 165-2088). Das Gemisch wurde dann einer Elektroporation bei 250 V und 960 μF unterzogen, wobei die Dauer des Schocks und die tatsächliche Spannung erfasst wurden. Nach der Elektroporation wurde die Küvette für 10 Minuten bei Raumtemperatur in Ruhe gelassen. Dann wurde das gesamte L1.2-Zell-DNA-Gemisch in einen T-25-Kolben (Costar) überführt und für 2 Tage in 10 ml nicht-selektivem Medium wachsen gelassen.
Selektion
CXCR3 exprimierende Zellen wurden dann einer Selektion auf Neomycinresistenz unterzogen. Nach zweitägigem Wachstum in nicht-selektivem Medium wurde 10 ml von 1,6 g/L Geneticin (GibcoBRL) mit einer Endkonzentration von 0,8 g/L zugesetzt (die selektive und beibehaltene Konzentration). Dies konnte dann für 10 bis 15 Tage wachsen, wobei frisches Selektionsmedium zugesetzt wurde, wenn die Zellen zu überwuchern begannen. Frisches Selektionsmedium bestand aus RPMI-1640, das mit 10% Rinderserum und 800 μg/ml G418 ergänzt wurde.
Die Zelloberflächenexpression von CXCR3 wurde mittels Chemotaxis bewertet, wobei ebenfalls eine Ligandenbindungs- und Scatchard-Analyse verwendet wurde, um eine Oberflächenexpression zu beobachten. Nach G418-Selektion wurden CXCR3-exprimierende Zellen auf Basis der Fähigkeit zur Chemotaxis selektioniert. Für jede Elektroporationsreaktion wurden 30 ml (800000 Zellen/ml) gesammelt und in 600 μl selektivem Medium suspendiert. Das selektive Medium, 600 μl, die 10 nM IP-10 umfassten, wurde in der unteren Kammer von BioCoat-Zellkulturplatten von Becton-Dickinson (Kat. Nr. 40575) angeordnet. In die obere Kammer der BioCoat-Platten wurden 100 μl/Vertiefung der L1.2-Zellen zugesetzt. Diese Zellen konnten dann über Nacht eine Chemotaxis in einer CO₂-Inkubationsvorrichtung bei 37°C durchführen. Die obere Kammer mit den Zellen, die keine Chemotaxis zeigten, wurde entfernt. Die Chemotaxis zeigenden Zellen wurden gesammelt, in frisches Medium überführt und in einer Platte mit 24 Vertiefungen wachsen gelassen. Sie wurden nacheinander in einen T-25 und den einen T-75-Kolben von Costar expandiert.
Transfektanten, die den Rezeptor mit hohen Spiegeln exprimierten, wurden durch begrenzende Verdünnung kloniert. CXCR3-transfizierte Zellen wurden in G418 umfassenden Selektionsmedium verdünnt, so dass zwischen 30–3 Zellen/ml vorlagen. Zu Gewebekulturplatten mit 96 Vertiefungen wurden Teilmengen von 100 μl/Vertiefung zugesetzt. Nach 14 Tagen bei 37°C und 5% CO₂ wurden Vertiefungen, die einzelne Kolonien enthielten, unter einem Inversionsmikroskop identifiziert. Es wurden dann 50 ml der Zellen überführt und mit einem anti-CXCR3 mAb, wie vorstehend aufgeführt, gefärbt und durch Strömungszytometrie analysiert. Die Spiegel bzw. Höhe der Rezeptor-Expression korrelierte mit der mittleren Fluoreszenzintensität und es wurde starke Exprimierer ausgewählt. Sobald eine stabile Zell-Linie etabliert wurde, wurde die Linie zur Verwendung expandiert.
Zusätzlich zur Selektion nach Antibiotikaresistenz und Chemotaxis, können CXCR3-Transfektanten ferner durch ein Sortieren nach höherer Rezeptor-Expression durch Antikörper-Färbung selektioniert werden, obwohl dies hier nicht durchgeführt wurde. Zum Färben können transfizierte Zellen auf 5 × 10⁶/ml in sterilem PBS resuspendiert werden, das 1% Rinderserumalbumin umfasst. Es können isolierte, sterile anti-CXCR3 mAb mit einer Endkonzentration von 3 μg/ml zugesetzt werden, wobei die Zellen für 30 Minuten auf Eis inkubiert werden. Nach Waschen mit kalten, sterilen PBS kann der gebundene mAb durch FITC-konjugiertes anti-Maus IgG nachgewiesen werden, das durch Filtration durch einen 0,2 um Filter sterilisiert wurde. Die Zellen können wieder gewaschen werden und mittels Strömungszytometrie sortiert werden. Die oberen 5% an positiven Zellen können gesammelt werden und in eine Gewebekultur rückgeführt werden, um unter selektiven Bedingungen expandiert zu werden (beispielsweise RPMI-1640 ergänzt mit 10% Rinderserum und 800 μg/ml G418).
Beispiel 3: IP-10 bindet mit hoher Affinität an einen Rezeptor, der auf mit CXCR3-DNA transfizierten L1.2-Zellen und auf aktivierten Zellen exprimiert wird (erläuterndes Beispiel)
Es wurden zusätzliche Bindungsstudien unter Verwendung von radioaktiv markiertem IP-10 durchgeführt. Ein Binden von Chemokin an Ziel-Zellen wurde wie kürzlich beschrieben durchgeführt (Ponath, P. D., et al., 1996, J. Clin. Invest. 97: 604–612; Van Riper, G., et al., 1993, J. Exp. Med., 177(3): 851–856). Die Zellen wurden einmal in PBS gewaschen und in Bindungspuffer (50 mM HEPES, pH-Wert 7,5, 1 mM CaCl₂, 5 mM MgCl₂, 0,5% BSA und 0,05% Azid) mit einer Konzentration von 10⁷/ml resuspendiert. Teilmengen von 50 μl (5 × 10⁵ Zellen) wurden in Microfugen-Röhrchen verteilt, gefolgt von der Zugabe von kaltem Konkurrenten (nicht-markiertes IP-10) und radioaktiv markiertem Chemokin (0,05 nM ¹²⁵I-markiertes IP-10). Das Endreaktionsvolumen betrug 200 μl. Durch Inkubation von Zellen mit radioaktiv markierten Chemokinen in der Gegenwart von 250–500 nM nicht-markierten Chemokinen wird ein nicht-spezifisches Binden bestimmt. Nach einer 60-minütigen Inkubation bei Raumtemperatur wurden die Zellen dreimal mit 1 ml Bindungspuffer, der 0,5 M NaCl umfasst, gewaschen. Die Zellpellets wurden dann gezählt. Der Wettbewerb wurde dargestellt als der Prozentsatz an spezifischer Bindung, die berechnet wurde durch 100 × [(S – B)/(T – B)], wobei S die Radioaktivität der Probe ist, B der Bindungshintergrund und T die Gesamtbindung ohne Konkurrenten ist. Der Bindungshintergrund wurde dadurch erhalten, dass Zellen mit radioaktiv markierten Chemokinen und einem mindestens 400-fachen Überschuss an nicht-markierten Chemokinen inkubiert wurden. Während der Experimente wurden Duplikate verwendet und die Standardabweichung betrug immer < 10% des Mittels. Alle Experimente wurden mindestens dreimal wiederholt. Eine Kurvenanpassung und Konzentrationen, die 50% an spezifischem Binden inhibieren (IC₅₀) wurden durch die KaleidaGraph-Software/Synery Software, Reading, PA) berechnet.
Die 5A–5B zeigen, dass ¹²⁵I-markiertes IP-10 an L1.2-Zellen, die mit CXCR3 transfiziert sind (5A) und an CD3-aktivierte T-Zellen (5B) bindet und dass dieses Binden durch ansteigende Konzentrationen an kaltem IP-10 inhibiert werden kann. Eine Scatchard-Analyse macht deutlich, dass IP-10 an L1.2-CXCR3-Transfektanten mit einem Kd von 614 pM gebunden ist, und dass diese Transfektanten 37000 Rezeptoren pro Zelle exprimieren (5A, Einfügung). Eine ähnliche Analyse der anti-CD3 aktivierten, IL-2 stimulierten T-Zellen verdeutlicht einen Kd von 156 pM und 17000 Rezeptoren pro Zellen (5B). Ein Binden von ¹²⁵I-markiertem IP-10 an aktivierte T-Zellen kann durch kaltes Mig unter den gleichen Bedingungen vollständig inhibiert werden, auch wenn Mig etwas weniger wirksam beim Blockieren des Bindens von ¹²⁵I-markiertem IP-10 war, als es kaltes IP-10 war (nicht gezeigt). IP-10 und Mig binden CXCR3 mit hoher Affinität (Kd ~150–600 pM).
Beispiel 4: Erzeugung und Charakterisierung monoklonaler Antikörper (mAbs), die für CXCR3 spezifisch sind
Um Antagonisten von CXCR3 zu entwickeln und um eine Rezeptor-Expression und Regulation zu studieren, wurde ein mAbs-Panel durch Immunisierung von Mäusen mit einem synthetischen Peptid erzeugt, das dem N-Terminus dieses Rezeptor entspricht. Diese mAbs erkennen spezifisch CXCR3-Transfektanten, jedoch nicht ein Auswahl anderer Rezeptor-Transfektanten.
mAb-Erzeugung und Strömungszytometrie
Mit CXCR3 reagierende mAbs wurden durch fünfmalige Immunisierung über einen Zeitraum von 10 Wochen von Balb/C-Mäusen mit 10 μg eines 37meren synthetischen Peptides erzeugt, das den ersten 37 N-terminalen Aminosäuren von CXCR3 entspricht (siehe ebenfalls Loetscher M., et al., J. Exp. Med. 184 (1996), 963–969). Dieses Peptid wurde synthetisiert und an ein gereinigtes Proteinderivat von Tuberculin gekoppelt (Severn Biotech Ltd., Kidderminster, UK). Die erste Immunisierung erfolgte intraperitioneal (IP) mit vollständigen Freund's Adjuvans (FCA). Die zweite, dritte und vierte Immunisierung erfolgten IP mit unvollständigem Freund's Adjuvans (FIA) und die letzte Immunisierung erfolgte lediglich mit Peptidkonjugat (kein Adjuvans) und wurde intravenös (IV) verabreicht. Vier Tage nach der letzten Immunisierung wurde die Milz entnommen und es wurde ein Zellfusion unter Verwendung der Zell-Linie SP2/0, wie beschrieben, durchgeführt (Coligan, J. E., et al., 1992, Current Protocols In Immunology (John Wiley und Söhne, New York), Einheit 2.5.4). Es wurden mAbs erzeugt, die mit dem N-terminalen 37-mer Peptid reagieren, was mittels ELISA bewertet wurde (Coligan, J. E., et al., 1992, Current Protocols In Immunology (John Wiley und Söhne, New York), Einheit 2.1.3). Es wurden mit CXCR3 reagierende mAbs identifiziert, wobei nicht-transfizierte und CXCR3-transfizierte L1.2-Zellen oder 300.19 Zellen (eine mäuseartige B-Zell-Linie, Loetscher, M. et al., 1996, J. Exp. Med., 184: 963–969) und eine Immunofluoreszenz-Färbung und -Analyse durch ein FACScan^® (Becton Dickinson & Co., Mountain View, CA) verwendet wurden.
Es wurden für CXCR3 spezifische monoklonale Antikörper erzeugt. Es wurde festgestellt, dass acht mAbs an der Oberfläche exprimierten CXCR3 erkennen, wie durch Färbung von CXCR3-transfizierten L1.2-Zellen bewertet wurde, jedoch nicht nicht-transfizierte L1.2-Zellen oder L1.2-Zellen, die mit anderen Rezeptor-Typen transfiziert wurden. Das FACS-Profil eines dieser mAbs 1C6 ist in 6 gezeigt. Diese mAbs färbten ebenfalls humane T-Zellen und T-Zell-Klone, die in vitro mit PHA oder anti-CD3 aktiviert wurden (in 7C mit 1C6 gezeigt). Diese anti-CXCR3 mAbs reagierten jedoch nicht mit Neutrophilen (in 7A mit 1C6 gezeigt), Monocyten oder Eosinophilen (nicht gezeigt). Dieses Reaktivitätsmuster stimmte mit der Northern Blot-Analyse überein. Jedoch verdeutlichte die phänotypische Analyse überraschenderweise, dass CXCR3 auf einer großen Untergruppe von zirkulierenden Lymphozyten exprimiert wird (7B). Dieses Expressionsmuster wurde in allen untersuchten Individuen beobachtet, was zeigt, dass CXCR3 üblicherweise auf einer Untergruppe von Lymphozyten des Bluts exprimiert wird. Es wurde festgestellt, dass CXCR3 eine Population von zirkulierenden T-Zellen markiert, die in der CD45RO+ (Gedächtnis) Untergruppe umfasst sind.
Das murine Hybridom 1C6 (ebenfalls als LS77-1C6 bezeichnet) wurde am 28. März 1997 in der American Type Culture Collection, 12301 Parklaven Drive, Rockville, MD, 20852, gemäß dem Budapester Übereinkommen unter der ATCC-Hinterlegungsnummer HB-12330 von LeukoSite, Inc., 215 First Street, Cambridge, MA, 02142, USA hinterlegt.
Beispiel 5: CXCR3 wird auf aktivierten T-Zellen/Gedächtnis-T-zellen exprimiert (erläuterndes Beispiel)
Strömungszytometrie
mAbs gegen CXCR1, CXCR2, CXCR3 und CCR5 sind beschrieben worden (Qin, S., et al., Eur. J. Immunol. 26 (1996), 640–647; Heath, H., et al., 1997, J. Clin. Invest., im Druck). Anti-CXCR4 mAb 12G5 (Endres, M. J., et al., 1996, Cell, 87: 745–756) wurde freundlicherweise von Jim Hoxie (Univ. Penn.) bereitgestellt. PE-konjugierte mAbs gegen CD4, CD8, CD14, CD20, CD25, CD26, CD69, CD45RO, CD45RA, CD95 und anti-CD3 und anti-CD4Cy-Chrome wurden von PharMingen (La Jolla, CA) angeboten.
Um die Reaktivität der mAbs gegen transfizierte Zellen oder Leukozyten zu bewerten, wurde in indirekte Immunofluoreszenz und Strömungszytometrie verwendet. Die Zellen wurden einmal in PBS gewaschen und in 100 μl PBS, der 2% humanes Serum und 0,1% Natriumazid (Färbepuffer), 5 μg/ml gereinigten Antikörper, 5 μg/ml IgG_2a Isotyp passender Kontrol-mAb (Sigma Chemical Co., St. Louis, MO) umfasst, oder in 50 μl Hybridomkultur-Überstand resuspendiert. Nach 20 Minuten bei 4°C wurden die Zellen zweimal mit Färbepuffer gewaschen und in 50 μl FITC-konjugiertem, Affinitäts-gereinigtem F(ab')₂-Ziegen-anti-Maus IgG (Jackson ImmunoResearch Laboratories) resuspendiert. Nach Inkubation für 20 Minuten bei 4°C wurden die Zellen zweimal in Färbepuffer gewaschen und auf dem FACScan^® zur Bestimmung der Höhe der Oberflächenexpression analysiert. Zum Ausschluss von toten Zellen wurde Propidiumiodid verwendet.
Eine Immunofluoreszenzanalyse mit zwei Farben von Lymphozyten zeigte, dass es am häufigsten CD3+-Zellen waren, die CXCR3 exprimierten, obwohl ein kleiner Anteil von CD20+ (B)-Zellen und CD56+ (NK)-Zellen diesen Rezeptor ebenfalls exprimiert (8).
Eine Analyse von T-Zellen mit drei Farben, die unter Verwendung von anti-CD3 Cy-Chrome zum Markieren von T-Zellen durchgeführt wurde, zeigte, dass ein Anteil der CD4+-Zellen und ein Anteil der CD8+-Zellen CXCR3 exprimiert (9). Eine Analyse unter Verwendung von Markern der zellulären Aktivierung, wie CD25 und CD69, verdeutlichte, dass aktivierte T-Zellen diesen Rezeptor im Allgemeinen exprimieren. CXCR3+ T-Zellen waren CD95+, CD45RO+ und CD45RA^niedrig, ein Phänotyp, der mit einer vorhergehenden Aktivierung übereinstimmt. Die Expression von CXCR3 und CCR5, ein Chemokin-Rezeptor, der in seiner Expression ebenfalls von vorher aktivierten T-Zellen beeinflußt ist (Wu, L., persönliche Mitteilung), wurde ebenfalls verglichen. 9 zeigt, dass die CCR5+-Zellen im Blut in der CXCR3+-Untergruppe enthalten waren und dass CXCR3 weitreichender als CCR5 exprimiert wurde. Im Unterschied zu anderen Chemokin-Rezeptoren der T-Zellen, wie CCR5 oder CXCR4, wurde CXCR3 auf der Mehrheit der zirkulierenden, aktivierten T-Zellen exprimiert.
Beispiel 6: Anti-CXCR3 mAb blockiert ein Binden von IP-10 und eine Chemotaxis
Eine Chemotaxis humaner Leukozyten wurde unter Verwendung einer Modifikation eines transendothelialen Assays bewertet (Carr, M. W., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91(9) (1994), 3652–3656), der kürzlich beschrieben wurde (Ponath, P. D., et al., J. Clin. Invest. 97 (1996), 604–612), wobei die endotheliale Zell-Linie ECV 304 (Europäische Sammlung tierischer Zellkulturen, Porton Down, Salisbury, UK) verwendet wurde. Zellen, die zu der unteren Kammer wanderten, wurden in ein Röhrchen überführt und durch Verwendung des FACScans^® wurden relative Zellzahlen erhalten.
Die anti-Peptid-mAbs wurden weiter hinsichtlich ihrer Fähigkeit getestet, die Chemotaxis von CD3 aktivierten T-Zell-Blasten zu inhibieren. Die Ergebnisse für die als 1A5, 1C6, 3A8, 5F10, 10C6 und 10G12 bezeichneten mAbs sind in 10 gezeigt. Ein mAb, 1C6, war in seiner Fähigkeit, die Chemotaxis von T-Zellen auf IP-10 zu blockieren den anderen mAbs überlegen. Der mAb 1C6 konnte die Chemotaxis von T-Zellen auf IP-10 in einer von der Dosierung abhängigen Art und Weise vollständig inhibieren, mit einem IC₅₀ von ~0,8 μg/ml (11). Eine Konzentration von 2–5 μg/ml führte zu einer 100%-igen Inhibierung, wobei in der Unterseite des Transwells eine optimale IP-10-Konzentraion (12,5 nM) verwendet wurde. Unter den verwendeten Bedingungen konnte 1C6 eine Chemotaxis von T-Zellen auf MCP-1, die durch den Chemokin-Rezeptor CCR2b erfolgt, nicht signifikant inhibieren (10).
mAb 1C6 konnte weiter das Binden von ¹²⁵I-markiertem IP-10 an aktivierte T-Zellen vollständig blockieren, mit einem IC₅₀ von 0,16 μg/ml (12). Eine vollständige Inhibierung ergab sich zwischen 1 und 10 μg/ml des Antikörpers. Die vollständige Inhibierung von sowohl einem Binden von IP-10 als auch einer Chemotaxis durch mAb 1C6 zeigt, dass aktivierte T-Zellen keinen anderen Rezeptor exprimieren, der dieses Chemokin bindet.
Northern-Blot-Analysen haben gezeigt, dass CXCR3 in aktivierten T-Zellen exprimiert wurde. Durch Verwendung eines Panels von spezifischen mAbs wurde festgestellt, dass CXCR3 auf einer Untergruppe von T-Zellen des Bluts sowie auf anderen Leukozyten-Typen (B-Zellen und NK-Zellen) exprimiert wird. CXCR3 exprimierende T-Zellen wiesen einen Phänotyp auf der mit einer vorhergehenden Aktivierung übereinstimmt, d.h. CD45RO+, CD26+ (Beispiel 5). Ein Färben von T-Zellen wurde merklich erhöht, wenn die T-Zellen durch CD3 and IL-2 aktiviert wurden, was mit einer erhöhten Zell-Wanderung als Antwort auf IP-10 und einem Binden von radioaktiv markiertem Ligand übereinstimmte bzw. korrelierte.
Die geringe Empfindlichkeit von T-Zellen des Bluts auf IP-10 oder Mig, zumindest in Chemotaxis-Assays, erscheint ungewöhnlich. Eine mögliche Erklärung ist, dass andere Faktoren als eine Rezeptor-Expression die zelluläre Empfindlichkeit auf Chemoattraktoren bestimmen kann. So kann zur Signalisierung ein passendes Koppeln von G-Protein erforderlich sein. Eine andere Möglichkeit ist, dass das Verfahren zur Bluttrennung diesen Rezeptor zerstört, wie es für IL-8-Rezeptoren auf T-Zellen und NK-Zellen beobachtet wurde (C. R. Mackay). Eine Injektion von IP-10 in die Haut eines geeigneten Versuchstiers kann die Wichtigkeit der CXCR3-Expression auf T-Zellen des Bluts behandeln. IP-10 ist einer der stärksten bzw. wirksamsten Chemoattraktoren bei aktivierten T-Zellen. Eine Aktivierung von T-Zellen kann Rezeptor-Signalisierungs-Moleküle oder ein Koppeln induzieren, das zu Signalübertragung nötig ist.
Beispiel 7: mAb 1C6 inhibiert selektiv [Ca²⁺]_i durch T-Zellen als Antwort auf IP-10, jedoch nicht auf Mig
Die intrazelluläre Calciumkonzentration ([Ca²⁺]_i) wurde wie folgt bestimmt. Eine Lagerlösung von Fura-2 AM (Molecular Probes, Eugene, OR) wurde durch Lösen von 50 μg des Farbstoffes in 44 μl DMSO hergestellt. Unmittelbar vor Zugabe der Zellen wurde dieser Bestand in HBSS mit Ca²⁺ und Mg²⁺ und 2% BSA 1:100 verdünnt. Fura-2 AM wurde zu Zellen in einer Endkonzentration von 0,2 Mol/106 Zellen bei 37°C für 30 Minuten zugesetzt. Nach dem Markieren wurde überschüssiger Farbstoff durch Zentrifugation entfernt und die Zellen wurden in einer Konzentration von 106/ml in 125 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 1 mM CaCl2, 0,5 mM Glucose, 0,025% BSA und 20 mM HEPES, pH 7,4 resuspendiert. [Ca²⁺]_i wurde unter Anregung bei 340 und 380 nm auf einem Hitachi-Fluoreszenz-Spektrometer gemessen. Eine Kalibrierung wurde unter Verwendung von 1% NP-40 für eine Gesamtfreisetzung und 25 μM EGTA zur Chelatierung freien Ca²⁺ durchgeführt.
IP-10 und Mig induzieren [Ca2+]i durch humane T-Zellen, wobei jedes Chemokin in der Lage war, die Antworten auf andere Chemokine zu desensitivieren (13A–13B). Eine Titrierung der Chemokine zeigte, dass maximales [Ca²⁺]_i mit so wenig wie 2 nM IP-10 oder 2 nM Mig erreicht wird. Um die Agonisten/Antagonisten-Funktion von mAb 1C6 zu untersuchen, wurden aktivierte T-Zellen nach Injektion von mAb 1C6 oder einem unbedeutenden Isotypen angepassten Kontroll-mAb auf [Ca²⁺]_i untersucht. Die mit einem unbedeutenden, Isotypen-angepassten Kontroll-mAb injizierten T-Zellen zeigten auf nachfolgendes Einbringen von IP-10 eine starke [Ca²⁺]_i-Antwort (nicht gezeigt). T-Zellen, die mit dem mAb 1C6 behandelte wurden, zeigten jedoch bei Stimulierung mit 2 nM IP-10 kein [Ca²⁺]_i. [Ca²⁺]_i in aktivierten T-Zellen als Antwort auf IP-10 wurde durch 12,5 mg 1C6 vollständig unterdrückt. So viel wie 50 μg/ml 1C6 zeigte jedoch keine Auswirkungen auf die Antwort von T-Zellen auf 2 nM Mig (13D), was anzeigt, dass die zwei Liganden durch diesen mAb unterschiedlich beeinträchtigt wurde. Als Kontrolle wurde mAb 1C6 auf dessen Wirksamkeit auf das [Ca²⁺]_i in T-Zellen als Antwort auf MIP-1a oder RANTES, was über von CXCR3 verschiedene Rezeptoren abläuft, untersucht (nicht gezeigt). Das mAb wies bei den verwendeten Bedingungen keinen Effekt auf.
mAb 1C6, der IP-10-Bindung und IP-10 induzierte Chemotaxis inhibiert, inhibierte auch den Calciumstrom durch aktivierte T-Zellen, inhibierte jedoch nicht Mig-induzierten Calciumstrom unter diesen Bedingungen. Diese Ergebnisse zeigen, dass IP-10 und Mig an unterschiedliche Bereiche von CXCR3 binden oder darüber signalisieren, und dass mAb 1C6 in der Lage war, die IP-10-Bindungsstelle und eine nachfolgende Signalübertragung zu inhibieren. Es ist daher möglich, Rezeptor-Antagonisten zu entwickeln, die die Auswirkungen einzelner Chemokine selektiv inhibieren, wie hier unter Verwendung von mAb 1C6 gezeigt ist.
Wie nachstehend erläutert, kann eine Färbung von CXCR3-Transfektanten durch ein Peptid inhibiert werden, das die ersten 15 N-terminalen Aminosäurereste von CXCR umfasst. Die Inhibierung der IP-10-Bindung und nachfolgende Antworten durch mAb 1C6 legen nahe, dass dieser Bereich für die Ligandenbindung von besonderer funktioneller Bedeutung ist. Basierend auf dem Unvermögen von 1C6, Mig-induzierten Calciumstrom unter den verwendeten Bedingungen zu inhibieren, scheint das von mAb 1C6 erkannte Epitop, das für einen Bindung von IP-10 wichtig zu sein scheint, nicht bei der Bindung von Mig und/oder der Signalübertragung involviert zu sein.
Beispiel 8.: Epitop-Kartierung
Peptide wurde von Genemed, South San Francisco, CA, bestellt. Die jeweils 15 Aminosäuren langen Peptide entsprechen unterschiedlichen Bereichen der ersten 45 N-terminalen Reste des CXCR3-Proteins:
P1: MVLEVSDHQVLNDAE (SEQ ID Nr. 2, Reste 1–15)
P2: VALLENFSSSYDYG (SEQ ID Nr. 2, Reste 16–30)
P3: ENESDSCCTSPPCPQ (SEQ ID Nr. 2, Reste 31–45)
Die Peptide wurden zuerst in DMSO gelöst und auf 1 mg/ml in mit Phosphat gepufferter Kochsalzlösung (PBS) verdünnt. Um die Fähigkeit der Peptide zur Blockierung des Anfärbens mit 1C6-Antikörper zu untersuchen, wurde 1 μg/ml gereinigter 1C6-Antikörper in 1 × PBS, 5% fötalem Kälberserum, mit CXCR3 L1.2 Transfektanten (105 Zellen; siehe Materialien und Methoden für Beispiele 3–9) in der Anwesenheit von 100 μg/ml eines jeden Peptids für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Das Endvolumen betrug 100 μl. Ein positives Anfärben wurde in Abwesenheit eines Peptids durchgeführt. Gebundener mAb wurde mit anti-Maus IgG-FITC erfaßt und die Ergebnisse wurden durch Strömungszytometrie analysiert.
Eine Anfärbung mit mAb 1C6 wurde durch P1 vollständig inhibiert, was darauf hinweist, dass der mAb ein Epitop in den ersten N-terminalen 15 Aminosäuren des CXCR3-Proteins erkennt (14A–14D). Ein Binden eines anderen, als 3A8 bezeichneten mAb (auch als LS77-3A8 bezeichnet), der von der gleichen Fusion (LS-77) wie mAb 1C6 hergestellt wurde, wurde durch das P1-Peptid ebenfalls inhibiert.
Beispiel 9. Herstellung von monoklonalen anti-CXCR3 Antikörpern durch Immunisierung mit transfizierten Zellen
Weitere monoklonale anti-CXCR3-Antikörper wurden durch Immunisieren von Mäusen mit L1.2 Zellen, die mit einem CXCR3-Konstrukt transfiziert waren und grosse Mengen an humanem CXCR3 exprimieren erzeugt (siehe Materialien und Methoden, vorstehend). Eine Immunisierung und Erzeugung von Fusionshybridoma wurde wie beschrieben durchgeführt (Qin, S. et al., Eur. J. Immunol. 26 (1996), 640; und Heath, H. et al., J. CLin. Invest. 99(2) (1997), 178). Anti-CXCR3 mAbs wurden durch positives Färben aktivierter humaner T-Zellen und CXCR3-Transfektanten identifiziert. Acht anti-CXCR3 Antikörper wurden in einer Fusion erhalten (LS-104).
Die Fähigkeit dieser Antikörper, eine Bindung an CXCR3 zu inhibieren, wurde untersucht. Gewebekulturüberstände (25 μl) von positive Klonen wurden mit CXCR3 L1.2 transfizierten Zellen (Material und Methoden für Beispiele 3–9) und 0,05 nM radioaktiv mit ¹²⁵I markiertem IP-10 in 1 × PBS, 5% fötalem Kälberserum (FCS) (100 μl Endvolumen) für 30 Minuten bei 4°C inkubiert. Die Überstände des mAb 1C6 und eines anti-CXCR2 (IL-8 Rezeptor B) mAb wurden jeweils als spezifische und nichtspezifische mAb-Kontrollen verwendet. Eine Gesamtbindung wurde in Abwesenheit von Antikörpern bestimmt. Eine Hintergrundbindung wurde unter Verwendung von 40 nM nicht markiertem IP-10 als der Kompetitor erhalten und dieser Wert wurde dazu verwendet, die prozentuale Inhibierung der mAbs zu berechnen. Die Ergebnisse sind in 15 gezeigt. Alle Antikörper dieser Fusion (LS-104 waren in der Lage IP-10-Bindung zu blockieren, wobei die prozentuale Inhibierung sich im Bereich von 50–70% bewegte.
Diese mAbs wurden darüber hinaus im Wesentlichen wie in Beispiel beschrieben auf deren Fähigkeit bewertet, eine Signalübertragung (Fähigkeit zur Induzierung des Ca²⁺-Stromes) zu inhibieren, wobei jedoch keiner der Antikörper in der Lage war, Mig-vermittelte Ca²⁺-Signalisierung bei den verwendeten Bedingungen zu blockieren. Eine Antikörper- Inhibierung von IP-10-vermittelter CXCR3-Bindung und Signalübertragung, jedoch nicht eine Mig-vermittelte Signalübertragung über CXCR3, zeigt, dass diese Antikörper IP-10-vermittelte CXCR3-Funktionen selektiv inhibieren kann.
Epitop-Kartierungsstudien wurden unter Verwendung der Antikörper aus der LS-104 Fusion im Wesentlichen wie in Beispiel 8 beschrieben ebenfalls durchgeführt. Die Ergebnis zeigen, dass eine Vielzahl von Bindungsstellen erkannt werden (Tabelle 2). Die Ergebnisse weisen darauf hin, dass drei der Antikörper ein (mehrere) Epitop(e) innerhalb der ersten 15 N-terminalen Aminosäuren von CXCR3 erkennen (Reste 1–15 von SEQ. ID. Nr. 2) und zwei der Antikörper erkennen Epitop(e) innerhalb der Aminosäuren 16–30 von CXCR3 (Reste 16–30 der SEQ. ID. Nr. 2). Das P3-Peptid blockierte keine Anfärbung mit diesen Antikörpern, was darauf hinweist, dass keines dieser Antikörper das durch die Aminosäuren 31–45 von CXCR3 dargestellte Peptid band (reste 31–45 der SEQ. ID. Nr. 2). Ein Anfärben unter Verwendung der drei verbleibenden mAbs konnte durch keines der Peptide bei den verwendeten Bedingungen erheblich inhibiert werden, was darauf hinweist, dass diese mAbs Epitope binden könnten, die überlappende Segmente der Peptide, Konformationsepitope, die auf der Zelloberfläche gezeigt werden oder Epitope an anderen Stellen des Rezeptors umfassen.

Diese Daten weisen weiter darauf hin, dass mAbs gegen verschiedene Bereiche von CXCR3 durch Immunisieren von Mäusen mit Rezeptor-Transfektanten erhalten werden können. Tabelle 2 Epitop-Kartierung von anti-CXCR3-mAbs

Fusionszahl mAb-Name	Peptide, die mAb-Färbung von CXCR3-Transfektanten inhibieren	Bindungsregion
LS-77²
_1C6	_P1	_AA _1–15
3A8	P1	AA 1–15
LS-104²
_2F8	_Kein
3A12	P1	AA 1–15
3E2	P1	AA 1–15
4B4	P2	AA 16–30
4D2	Kein
5B12	Kein
7B8	P2	AA 16–30
8D5	P1	AA 1–15

¹ Antikörper, die durch Peptid-Immunisierung erhalten wurden
² Antikörper, die durch Immunisierung mit CXCR3-Transfektanten erhalten wurden
³ Aminosäureposition in SEQ. ID. Nr. 2

Beispiel 10. Immunhistochemische Analyse von normalen und entzündlichen Geweben unter Verwendung des mAb 1C6
Gewebe
Humane Gewebe (normale und entzündliche) wurden von dem National Disease Research Institut erhalten, eine Serviceorganisation, die vom National Institute of Health bezuschusst wird. Normale Malak-(Macaca mulatta)Gewebe wurden vom New England Regional Primate Research Center, Southboro, MA erhalten.
Immunhistochemie
Alkalische Phosphatatse-Technik. Gewebe wurde in einer Dicke von 4 μm geschnitten, getrocknet und dann in 2% Paraformaldehyd/0,5 × PBS für 10 Minuten bei 4°C fixiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden nicht-spezifische Antikörper-Bindungsstellen mit 10% normalem Ziegenserum/5% humanem Ab-Serum/PBS für 30 Minuten bei Raumtemperatur blockiert. Anschließend wurde gereinigter muriner anti-CXCR3 mAb 1C6 auf eine Konzentration von 10 μg/ml in 0,3% Triton X 100/0,2% Tween 20/1% FCS/5% humanes AB-Serum, und 0,1% Natriumazid, verdünnt und auf Gewebeschnitte aufgebracht, die über Nacht bei 4°C inkubiert wurden. Ein Isotyp angepaßter, unbedeutender monoklonaler Antikörper wurde als negative Kontrolle beim Schritt Gewebeschnitte eingesetzt (IgG1, MOPC-21, Sigma, St. Louis, MO) Anschließend wurden biotinylierte Ziegen-anti-Maus IgG (Vektor, Burlingame, Ca) und Avidin-Biotin-alkalische Phosphatase-Komplexe (Biogenex, San Ramon, CA) nacheinander zugesetzt. Fast Red (Biogenex, San Remon, CA), das Levamisol zur Blockierung einer endogenen alkalischen Phosphatase-Aktivität enthielt, wurde als das Chromogen und Mayers Hematoxylin als die Gegenfärbung verwendet.
Ergebnisse
Normale humane und Makal-Lymphknoten: in beiden Spezies war ein Anfärben auf 70–80% der Lymphozyten in dem Paracortex und der Nebennierenrinden, was konsistent ist mit der Expression von CXCR3 auf T-Lymphozyten.
Humane und Makal-Milz: in beiden Spezies war die Anfärbung begrenzt auf Lymphozyten entlang der Peripherie lymphoider Follikel des aus lymphatischem Gewebe zusammengesetzten Bereichs der Milz (white pule) und verteilte Lymphozyten in der sinusoiden Milz. Dieses Muster geht einher mit der CXCR3-Expression auf T-Lymphozyten.
Humaner Thymus: Die Thymus-Medulla enthielt verteilte CXCR3 immunreaktive mononukleäre Zellen, konsistent mit Lymphozyten.
Diese Analyse zeigte, dass Makal-CXCR3 von mAb 1C6 erkannt wird. Separate Studien zeigten, dass CXCR3 durch Züchten von Makal-Zellen T-Lymphozyten mit Concavalin A und IL-2 hochreguliert werden kann, wobei Makal T-Zell-Blastocysten als Antwort auf humanes IP-10 Chemotaxis erfahren können, die durch mAb 1C6 blockiert werden kann, und vor Inkubation mit humanem IP-10 Makal-Blastocysten, wie durch Chemotaxis bewertet, desensitiviert wird.
In der nachfolgenden Diskussion wurden unterschiedliche Mengen CXCR3-immunreaktiver mononuklearer Zellen in normalem als auch entzündlichem Geweben nachgewiesen. Diese mononukleären Zellen sind aus den folgenden Gründen höchstwahrscheinlich T-Lymphozyten: Strömungszytometrie zeigte, dass die Mehrheit von CXCR3⁺-Zellen T-Lymphozyten sind, obwohl CXCR3 auf einigen B-Zellen und NK-Zellen entdeckt wurde, jedoch nicht auf anderen mononukleären Zellen; b) in dem Lymphknoten und der Milz, Lymphozyten in Bereichen, die bekanntermaßen von T-Zellen populiert sind, sind nur Zellen, die für CXCR3 immunreaktiv sind; und c) die für CXCR3 immunreaktive mononukleären Zellen in den nachstehende aufgeführten Geweben sind mit Lymphozyten morphologisch konsistent.
Nicht-entzündliche humane Gewebe: in nicht entzündlichen humanen Geweben, einschließlich Herz, Leber, Niere, Lunge, Haut, Brust, Skelettmuskel, Speicheldrüse, Pankreas, Vagina, Uterus und Ovarien, war die CXCR3-Expression auf seltene, verstreute interstitielle mononukleäre Zellen beschränkt. In Bereichen des Dünn- und Dickdarms wurden in dem Bereich der Lamina propria und den Peyer's Stellen (Peyer's patches) CXCR3-exprimierende mononukleäre Zellen beobachtet. In der Leber wurden periductale Lymphozyten ebenfalls angefärbt und Hepatozyten leicht gefärbt.
Humanes Gehirn: Kein Anfärben wurde verzeichnet.
Entzündliche humane Gewebe: Mehrere Bereiche chronisch entzündlichen Gewebes, die durch interstitielle und perivaskuläre Akkumulierung mononukleärer Zellen gekennzeichnet sind, wurden auf CXCR3-Expression untersucht. In diesen Geweben, einschließlich Gewebe von menschlichen Patienten mit interstitieller Nephritis (1 Fall, Nierengewebe), ulcerative Colitis (1 Fall, Darmgewebe, Enteritis (1 Fall, Dünndarm) und chronischer Vaginitis (4 Fälle, Vagina) waren etwa 50–90% der mononuklearen Zellen auf CXCR3 immunreaktiv.
Chronisch entzündliche Gewebe enthielte daher verglichen mit normalem Gewebe eine grössere Anzahl an interstitiellen mononuklearen Zelle und ein größerer Prozentsatz dieser Zellen waren auf CXCR3 immunreaktiv.
Eine Analyse von entzündlichem Gewebe zeigt, dass etwa 50–90% der Lymphozyten CXCR3 exprimierten, während ein viel kleinerer Prozentsatz von Lymphozyten in den entsprechenden normalen Geweben CXCR3 exprimierte. Diese Beobachtungen legen eine spezifische Rekrutierung von CXCR3 exprimierenden Lymphozyten, höchstwahrscheinlich CXCR3 exprimierende T-Lymphozyten an Stellen chronischer Entzündung nahe. CXCR3 scheint T-Zellen mit einer Vorliebe, zu Entzündungsstellen zu gehen oder dorthin zu wandern, zu markieren.
SEQUENZAUFLISTUNG

Claims

Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment davon, welches das humane CXC-Chemokin-Rezeptor-3 Protein (CXCR3) bindet, das die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2 aufweist, worin der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment ein oder mehrere Funktionen des humanen CXCR3-Proteins inhibiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus Binden eines Liganden, Liganden induzierte Signalisierungs-Aktivität, Liganden induzierte zelluläre Antwort-Funktion, worin der Ligand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus IP-10 und Mig.
Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment nach Anspruch 1, worin der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment die Bindung von IP-10 an das humane CXCR3-Protein selektiv inhibiert.
Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment nach Anspruch 1, worin der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment eine IP-10 induzierte Signalisierungs-Aktivität oder zelluläre Antwort-Funktion inhibiert.
Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment nach Anspruch 3, worin die Signalisierungs-Aktivität ein schneller und transienter Anstieg der Konzentration an im Cytosol frei vorkommenden Calzium [Ca²⁺]_i ist, und worin die zelluläre Antwort Chemotaxis ist.
Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment nach Anspruch 1, worin die Bindung des Antikörpers oder des Antigen-bindenden Fragments an humanes CXCR3-Protein durch ein Polypeptid inhibiert wird, welches dem extrazellulären, N-terminalen Segment der SEQ ID NO: 2 entspricht.
Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment nach Anspruch 1, worin die Bindung des Antikörpers oder des Antigen-bindenden Fragments an CXCR3-Protein durch ein Polypeptid inhibiert wird, welches aus den Resten 1–15 der SEQ ID NR: 2 besteht.
Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment nach Anspruch 6, worin die Bindung durch ein Polypeptid, welches aus den Resten 16–30 der SEQ ID NR: 2 besteht, oder durch ein Polypeptid, welches aus den Resten 31–45 der SEQ ID NR: 2 besteht, nicht inhibiert wird.
Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment nach Anspruch 1, worin ein Bindung des Antikörpers oder des Antigen-bindenden Fragments an ein humanes CXCR3-Protein durch ein Polypeptid inhibiert wird, welches aus den Resten 16–30 der SEQ ID NR: 2 besteht.
Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment nach Anspruch 1, worin der Antikörper oder das Fragment eine T-Zell Aktivierung inhibiert.
Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment nach Anspruch 1, worin der Ligand humanes Mig ist.
Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment nach Anspruch 1, worin der Ligand humanes IP-10 ist.
Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment nach einen der Ansprüche 1–7, worin der Antikörper oder das Antigen-bindenden Fragments mit dem monoklonalen Antikörper 1C6 (ATCC Hinterlegungsnummer HB-12330) um die Bindung an humanes CXCR3-Protein konkurriert.
Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment nach Anspruch 1, worin der Antikörper ein humanisiertes Immunglobulin ist, welches CDRs der leichten Kette (CDR1, CDR2 und CDR3) und die CDRs der schweren Kette (CDR1, CDR2 und CDR3) des monoklonalen Antikörpers 1C6 (ATCC Hinterlegungsnummer HB-12330) und einen Gerüstbereich humanen Ursprungs umfasst, worin das humanisierte Immunglobulin die Epitop-Spezifität des monoklonalen Antikörpers 1C6 (ATCC Hinterlegungsnummer HB-12330) aufweist.
Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment nach Anspruch 1, worin der Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment der monoklonale Antikörper 1C6 (ATCC Hinterlegungsnummer HB-12330) oder ein Antigen-bindendes Fragment davon ist.
Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment nach einen der Ansprüche 1, 3, 4, 10 und 11, worin der Antikörper ein humaner Antikörper, ein humanisierter Antikörper, ein chimärer Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment eines der Vorstehenden ist.
Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment nach einen der Ansprüche 1, 3, 4, 10, 11 und 15, worin das Antigen-bindende Fragment ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Fab-Fragment, einem Fab'-Fragment, einem F(ab)'₂-Fragment und einem Fv-Fragment.
Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment nach einen der Ansprüche 2, 5–9 und 12–14, worin der Antikörper ein humaner Antikörper, ein humanisierter Antikörper, ein chimärer Antikörper oder ein Antigen-bindendes Fragment eines der Vorstehenden ist.
Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment nach einen der Ansprüche 2, 5–9, 12–14 und 17, worin das Antigen-bindende Fragment ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus einem Fab-Fragment, einem Fab'-Fragment, einem F(ab)'₂-Fragment und einem Fv-Fragment.
Hybridom-Zelllinie HB-12330 (ATCC Hinterlegungsnummer HB-12330)
Anti-CXCR3-Antikörper, hergestellt durch die Hybridom-Zelllinie nach Anspruch 19 oder ein Antigen-bindendes Fragment davon.
Zusammensetzung, welche den Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment nach einer der Ansprüche 1, 3, 4, 10, 11, 15 und 16 umfasst, und ein physiologisch annehmbares Vehikel oder Trägermaterial.
Zusammensetzung, welches den Antikörper oder das Antigen-bindende Fragment nach einen der Ansprüche 2, 5–7, 12–14, 17, 18 und 20 umfasst, und ein physiologisch annehmbares Vehikel oder Trägermaterial.
Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment nach einen der Ansprüche 1, 3, 4, 10, 11, 15 und 16 zur Verwendung in der Therapie oder Diagnose.
Verwendung eines Antikörpers oder Antigen-bindenden Fragments davon nach einen der Ansprüche 1, 3, 4, 10, 11, 15 und 16 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer entzündlichen Erkrankung oder eines entzündlichen Zustandes.
Verwendung nach Anspruch 24, wobei die entzündliche Erkrankung oder der entzündliche Zustand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Psoriasis, entzündlicher Darmerkrankung, Nephritis, Multiple Sklerose und Gewebeabstoßung.
Antikörper oder Antigen-bindendes Fragment davon nach einer der Ansprüche 2, 5–7, 12–14, 17, 18 und 20 zur Verwendung in der Therapie oder Diagnose.
Verwendung eines Antikörpers oder Antigen-bindenden Fragments davon nach einen der Ansprüche 2, 5–7, 12–14, 17, 18 und 20 zur Herstellung eines Medikaments zur Behandlung einer entzündlichen Erkrankung oder eines entzündlichen Zustandes.
Verwendung nach Anspruch 27, wobei die entzündliche Erkrankung oder der entzündliche Zustand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus Psoriasis, entzündlicher Darmerkrankung, Nephritis, Multiple Sklerose und Gewebeabstoßung.
Verfahren zum Nachweis eines humanen CXC-Chemokin-Rezeptor 3 Proteins (CXCR3) in einer Probe umfassend: a) Inkontaktbringen einer Probe mit einem Antikörper oder einem Antigen-bindenden Fragments davon nach einem der Ansprüche 1, 3, 4, 10, 11, 15 und 16 unter Bedingungen, welche für ein spezifisches Binden des Antikörpers oder Fragments an humanes CXCR3-Protein, welches die Sequenz der SEQ ID NR: 2 aufweist, geeignet ist, und b) Erfassen des Antikörper-CXCR3- oder Antikörperfragment-CXCR3-Komplexes, wobei die Erfassung des Komplexes die Anwesenheit eines humanes CXCR3 in der Probe anzeigt.
Verfahren zum Nachweis eines humanen CXCR3-Proteins nach Anspruch 29, wobei der Antikörper oder das Fragment einen nachweisbaren Marker umfasst.
Verfahren zum Nachweis eines humanen CXC-Chemokin-Rezeptor 3 Proteins (CXCR3) in einer Probe umfassend: a) Inkontaktbringen einer Probe mit einem Antikörper oder einem Antigen-bindenden Fragment davon nach einen der Ansprüche 2, 5–7, 12–14, 17, 18 und 20 unter Bedingungen, welche für ein spezifisches Binden des Antikörpers oder Fragments an humanes CXCR3-Protein, welches die Sequenz der SEQ ID NR: 2 aufweist, geeignet ist, und b) Erfassen des Antikörper-CXCR3- oder Antikörperfragment-CXCR3-Komplexes, wobei die Erfassung des Komplexes die Anwesenheit eines humanes CXCR3 in der Probe anzeigt.
Verfahren zum Nachweis oder zur Identifizierung eines Inhibitors der Ligandenbindung an ein Säuger-CXC-Chemokin-Rezeptor 3 Protein (CXCR3) umfassend: a) Kombinieren eines zu untersuchenden Mittels, eines Liganden des Säuger CXCR3-Proteins, wobei der Ligand ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus IP-10 und Mig, und einer Zusammensetzung, welche ein isoliertes und/oder rekombinantes Säuger-CXCR3-Protein oder eine funktionelle Variante davon umfasst, unter Bedingungen, welche zur Bindung des Liganden daran geeignet sind, und b) Erfassen oder Messen der Bildung eines Komplexes zwischen dem Säuger CXCR3-Protein oder einer funktionellen Variante, und dem Liganden, wobei eine Inhibierung der Komplexbildung durch das Mittel anzeigt, dass das Mittel ein Inhibitor ist, wobei das Säuger CXCR3-Protein oder eine funktionelle Variante davon, ein oder mehrere Chemokine bindet, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IP-10 und Mig und, i) mindestens 90% Aminosäuresequenzidentität zur SEQ ID NR: 2 aufweist, oder ii) durch eine Nukleinsäure kodiert ist, welche an eine zweite Nukleinsäure hybridisiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem Komplement der SEQ ID NR: 1 und dem Komplement des offenen Leserrasters der SEQ ID NR: 1 unter hoch stringenten Waschbedingungen von 2 × SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur für 10 Minuten gefolgt von zwei Waschungen in 1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C für 30 Minuten und einer Endwaschung in 0,5 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C für 10 Minuten.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Zusammensetzung mit einem isolierten und/oder rekombinanten Säuger-CXCR3-Protein oder einer funktionellen Variante davon ein isoliertes oder rekombinantes humanes CXCR3-Protein enthält.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Zusammensetzung mit einem isolierten und/oder rekombinanten Säuger-CXCR3-Protein oder einer funktionellen Variante davon eine Wirtszelle enthält, die rekombinantes humanes CXCR3-Protein exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Zusammensetzung mit einem isolierten und/oder rekombinanten Säuger CXCR3-Protein oder einer funktionellen Variante davon ein isoliertes oder rekombinantes Fusions-Protein enthält, das humanes CXCR3-Protein umfasst.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Zusammensetzung mit einem isolierten und/oder rekombinanten Säuger CXCR3-Protein oder einer funktionellen Variante davon eine Wirtszelle enthält, welche ein rekombinantes Fusions-Protein exprimiert, das humanes CXCR3-Protein umfasst.
Verfahren nach einer der Ansprüche 33–36, wobei das humane CXCR3-Protein die Aminosäuresequenz der SEQ ID NR: 2 umfasst.
Verfahren nach einer der Ansprüche 33–36, wobei die Aminosäuresequenz des humanen CXCR3-Proteins eine Aminosäuresequenz ist, die durch SEQ ID NR: 1 kodiert wird.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei der Ligand mit einem Marker markiert ist, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Radioisotop, einem Spin-Marker, einem Antigen-Marker, einem Enzym-Marker, einer fluoreszierenden Gruppe oder einer chemolumineszenten Gruppe.
Verfahren nach einem der Ansprüche 32–38, wobei das Säuger-CXCR3-Protein oder eine funktionelle Variante davon oder das humane CXCR3-Protein eine zelluläre Signalisierung und/oder zelluläre Antwort vermittelt, wobei die Bildung eines Komplex durch das Erfassen oder Messen einer Signalisierungs-Aktivität oder zellulären Antwort des CXCR3-Proteins, welche durch Ligandenbindung induziert wurde, erfasst oder gemessen wird.
Verfahren nach Anspruch 40, wobei die Signalisierungs-Aktivität ein schneller und transienter Anstieg der Konzentration an freiem cytosolischem Calcium [Ca²⁺]_i, ist, und wobei die zelluläre Antwort Chemotaxis ist.
Verfahren nach einen der Ansprüche 33–38, wobei das humane CXCR3-Protein mindestens ein Chemokin bindet ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus humanem IP-10 und humanem Mig.
Verfahren zum Nachweis oder Identifizieren eines Inhibitors eines Säuger-CXCR3-Proteins umfassend: a) Kombinieren eines zu untersuchenden Mittels, einer Wirtszelle, die rekombinantes Protein exprimiert, das ein Säuger-CXCR3-Protein oder eine funktionelle Variante davon umfasst, und eines Liganden des Säuger-CXCR3-Proteins, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IP-10 und Mig, unter Bedingungen, welche zur Erfassung einer Liganden induzierten Antwort geeignet sind, und b) Bewerten der Fähigkeit des Testmittels zur Inhibierung der Liganden induzierten Antwort, wobei eine Inhibierung der Liganden induzierten Antwort durch das Mittel anzeigt, dass das Mittel ein Inhibitor ist, wobei das Säuger-CXCR3-Protein oder die funktionelle Variante davon ein oder mehrere Chemokine bindet, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IP-10 und Mig, und i) mindestens 90% Aminosäuresequenzidentität zur SEQ ID NR: 2 aufweist, oder ii) durch eine Nukleinsäure kodiert ist, welche an eine zweite Nukleinsäure hybridisiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem Komplement der SEQ ID NR: 1 und dem Komplement des offenen Leserrasters der SEQ ID NR: 1 unter hoch stringenten Waschbedingungen von 2 × SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur für 10 Minuten gefolgt von zwei Waschungen in 1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C für 30 Minuten und einer Endwaschung in 0,5 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C für 10 Minuten.
Verfahren nach Anspruch 43, wobei die Wirtszelle, die ein rekombinantes Protein exprimiert, das ein Säuger-CXCR3-Protein oder eine funktionelle Variante davon umfasst, eine Wirtszelle ist, die rekombinantes humanes CXCR3-Protein exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 43, wobei die Wirtszelle, die ein rekombinantes Protein exprimiert, ein Säuger-CXCR3-Protein oder eine funktionelle Variante davon umfasst, eine Wirtszelle ist, die rekombinantes Fusions-Protein exprimiert, das humanes Säuger-CXCR3-Protein umfasst.
Verfahren nach Anspruch 44 oder 45, wobei das humane Säuger-CXCR3-Protein die Aminosäuresequenz SEQ ID NR: 2 umfasst.
Verfahren nach Anspruch 44 oder 45, wobei die Aminosäuresequenz des humanen CXCR3-Proteins eine Aminosäuresequenz ist, die durch SEQ ID NR: 1 kodiert wird.
Verfahren nach einen der Ansprüche 43–47, wobei die Liganden- oder Promotor-induzierte Antwort eine Signalisierungs-Aktivität oder eine zelluläre Antwort auf das Säuger-CXCR3-Protein oder einer funktionellen Variante davon ist, welches durch Liganden-Bindung induziert wurde.
Verfahren nach Anspruch 48, wobei die Signalisierungs-Aktivität ein schneller und transienter Anstieg der Konzentration an freiem cytosolischem Calcium [Ca²⁺]_i ist, und wobei die zelluläre Antwort Chemotaxis ist.
Verfahren nach einen der Ansprüche 44–47, wobei das humane Säuger-CXCR3-Protein selektiv mindestens ein Chemokin bindet, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus humanem IP-10 und humanem Mig.
Verfahren zum Nachweis oder zur Identifizierung eines Mittels, welches ein Säuger-CXC-Chemokin-Rezeptor 3 Protein (CXCR3) bindet, umfassend, Kombinieren eines zu untersuchenden Mittels und einer Zusammensetzung, welche ein isoliertes und/oder rekombinantes Protein umfasst, das Säuger Säuger-CXCR3-Protein oder eine funktionelle Variante davon enthält, unter Bedingungen, die zur Bindung eines Liganden daran geeignet sind, und Erfassen oder Messen der Bildung eines Komplexes zwischen dem Mittel und dem CXCR3-Protein oder einer funktionellen Variante davon, wobei das Verfahren ein Kompetitions-Assay ist, bei dem die Bindung in Anwesenheit von einem oder mehreren Liganden ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IP-10 und Mig bestimmt wird, wobei das Säuger-CXCR3-Protein oder eine funktionelle Variante ein oder mehrere Chemokine bindet ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus IP-10 und Mig, und i) mindestens 90% Aminosäuresequenzidentität zur SEQ ID NR: 2 aufweist, oder ii) durch eine Nukleinsäure kodiert ist, welche an eine zweite Nukleinsäure hybridisiert, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus dem Komplement der SEQ ID NR: 1 und dem Komplement des offenen Leserrasters der SEQ ID NR: 1 unter hoch stringenten Waschbedingungen von 2 × SSC, 0,1% SDS bei Raumtemperatur für 10 Minuten gefolgt von zwei Waschungen in 1 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C für 30 Minuten und eine Endwaschung in 0,5 × SSC, 0,1% SDS bei 65°C für 10 Minuten.
Verfahren nach Anspruch 51, wobei die Zusammensetzung mit einem isolierten und/oder rekombinanten Säuger-CXCR3-Protein oder einer funktionellen Variante davon ein isoliertes und/oder rekombinantes humanes Säuger-CXCR3-Protein enthält.
Verfahren nach Anspruch 51, wobei die Zusammensetzung mit einem isolierten und/oder rekombinanten Säuger-CXCR3-Protein oder einer funktionellen Variante davon ein isoliertes und/oder rekombinantes Fusions-Protein enthält, welches humanes Säuger-CXCR3-Protein umfasst.
Verfahren nach Anspruch 51, wobei die Zusammensetzung mit einem isolierten und/oder rekombinanten Säuger-CXCR3-Protein oder einer funktionellen Variante davon eine Wirtszelle enthält, die ein rekombinantes humanes Säuger-CXCR3-Protein exprimiert.
Verfahren nach Anspruch 51, wobei die Zusammensetzung mit einem isolierten und/oder rekombinanten Säuger-CXCR3-Protein oder einer funktionellen Variante davon eine Wirtszelle enthält, die ein rekombinantes Fusions-Protein exprimiert, das humanes Säuger-CXCR3-Protein umfasst.
Verfahren nach Anspruch 51, wobei die einen oder mehreren Liganden mit einem Marker markiert sind, ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus einem Radioisotop, einem Spin-Marker, einem Antigen-Marker, einem Enzym-Marker, einer fluoreszierenden Gruppe oder einer chemilumineszenten Gruppe.
Verfahren nach einen der Ansprüche 51–56, wobei das Säuger-CXCR3-Protein oder eine funktionelle Variante davon eine zelluläre Signalisierung und/oder zellulare Antwort vermittelt, wobei die Bildung eines Komplexes durch Erfassen oder Messen einer Signalisierungs-Aktivität oder zellulären Antwort des bei Binden des Liganden induzieren CXCR3-Proteins überwacht wird.
Verfahren nach Anspruch 57, wobei Signalisierungs-Aktivität ein schneller und transienter Anstieg der Konzentration an freiem cytosolischem Calcium [Ca²⁺]_i ist, und wobei die zelluläre Antwort Chemotaxis ist.
Verfahren nach einen der Ansprüche 51–55, wobei das Säuger-CXCR3-Protein oder eine funktionelle Variante davon selektiv mindestens ein Chemokin bindet ausgewählt aus der Gruppe bestehend aus humanem IP-10 und humanem Mig.