JP2002513388A - Ｃｘｃｒ３ケモカイン受容体、抗体、核酸および使用方法 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、１種以上のケモカイン類（例えば、ＩＰ−１０および／またはＭｉｇ）の選択的な結合、および／または細胞応答（例えば、走化性、エキソサイトーシス）の誘導能により特徴付けられるものを含む、ＣＸＣケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ３）と称する組換え哺乳類（例えば、ヒト）ＩＰ−１０／Ｍｉｇ受容体タンパク質およびその改変体に関する。本発明の他の側面は、アンチセンス核酸、プラスミドもしくはレトロウイルスベクターなどの組換え核酸構築物、リガンドおよび受容体機能の阻害剤（例えば、アンタゴニスト）もしくは促進剤（例えば、アゴニスト）を同定する方法に関する。

Description

【発明の詳細な説明】 ＣＸＣＲ３ケモカイン受容体、抗体、核酸および使用方法 背景技術 ケモカイン類は、炎症において生成される小さいサイトカイン類のファミリー を構成し、白血球補充(recruitment)を制御する[Baggiolini，M．et al.，Adv． Immunol．55:97-179(1994);Springer,T.A.，Annu．Rev．Physiol．57:827-872(1 995);and Schall，T.J．and K.B．Bacon，Curr．Opin．Immunol．6:865-873(199 4)]。ケモカイン類は、例えば、好中球、単球、マクロファージ、好酸球、好塩 基球、マスト細胞などの白血球、ならびにT細胞、B細胞などのリンパ球などを含 む血液を構成する（赤血球以外の）要素の走化性を選択的に誘導できる。走化性 の刺激に加えて、ケモカイン類は、応答性細胞において、細胞形状の変化、細胞 内遊離カルシウム濃度（［Ca²⁺］_i）の一過性上昇、顆粒エキソサイトーシス、 インテグリンアップレギュレーション、生理活性脂質（ロイコトリエンなど）の 形成および呼吸バーストなどの白血球の活性化に伴う他の変化を選択的に誘発す ることもできる。したがってケモカイン類は炎症性応答の初期誘因剤であり、感 染または炎症部位への炎症媒介物質の放出、走化性および管外溢出を引き起こす 。 CXCおよびCCケモカインと称されたケモカイン類の2つのサブファミリーは、1 つのアミノ酸により分けられること(CXCケモカイン類として、IL-8、γIP-10、M ig、PF4、ENA-78、GCP-2、GRO α、GRO β、GRO γ、NAP-2、NAP-4)または隣接 残基であること(CCケモカインとして、MIP-1 α、MIP-1 β、RANTES、MCP-1、MC P-2、MCP-3、I-309)のいずれかである、4つの保存システイン残基の最初の2つの アレンジメントにより分けられる。多くのCXCケモカイン類は、好中球の白血球 を引きつける。例えば、CXCケモカイン類インターロイキン 8(IL-8)、血小板因子4(PF4)、好中球活性化ペプチド2(NAP-2)は、強力な化学誘 引物質および好中球の活性化因子である。Mig[monokine induced by gammainter feron(ガンマインターフェロンにより誘導されたモノカイン)]およびIP-10(γIP -10、インターフェロン-ガンマ誘導性の10kDaタンパク質)と称するCXCケモカイ ン類は、活性化末梢血リンパ球の走化性を誘導することに特に活性である。CCケ モカイン類は、一般的に、選択性がなく、単球、好酸球、好塩基球、Tリンパ球 およびナチュラルキラー細胞を含む多様な白血球細胞型を引きつけることができ る。ヒト単球走化性タンパク質1〜3（MCP-1、MCP-2およびMCP-3）、RANTES[Regu lated on Activation，Normal T Expressed and Secreted(活性化制御、正常T発 現および分泌)]およびマクロファージ炎症性タンパク質1 αおよび1 β（MIP-1 αおよびMIP-1 β）などのC-Cケモカイン類は、単球またはリンパ球の化学誘引 物質および活性化因子として特徴付けられるが、好中球の化学誘引物質であると は思われない。 CCおよびCXCケモカイン類は、7回膜貫通型Ｇタンパク質共役受容体のスーパー ファミリーに属する受容体を介して作用する。［Murphy,P.M.，Annu．Rev．Immu nol.，12:593-633(1994);Gerard，C．およびN.P．Gerard，Curr．Opin．Immunol .，6:140-145(1994)］。このGタンパク質共役（ヘビ状）受容体ファミリーは、7 つの膜貫通領域を含有する内在性膜タンパク質の大きいグループを含む。前記受 容体はGタンパク質に共役し、それはGTPに結合することができ、例えば、細胞内 媒介物質の生成により、共役受容体からシグナル伝達を媒介することが可能なヘ テロ3量体の制御タンパク質である。 ケモカイン受容体を2つのグループに分けることができる：CCケモカイン類を 結合するCCケモカイン受容体1〜5(CCR1-5)、およびCXCケモカイン類を結合するC XCケモカイン受容体1〜4(CXCR1-4)。一般的に、CCケモカイン受容体は、複数の 型の白血球上に存在し、単球、好酸球、好塩基球およびT細胞の移動に重要であ る[Qin，S.，et al.，Eur．J．Immunol.,26:640-647(1996);Carr，M．W.， et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，91(9):3652-3656(1994);Taub,D.D.，et al.，J．Clin．Invest.，95(3):1370-1376(1995);Neote，K．et al.，Cell，72: 415-425(1993);Gao,J.-L．et al.，J．Exp．Med.，177:1421-1427(1993);Charo ，I.F．et al.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA,91:2752-2756(1994);Myers，S.J. ，et al.，J．Biol．Chem.，270:5786-5792(1995);Combadiere，C．et al.，J． Blol．Chem.，270(27):16491-16494(1995);and Correction，J．Biol．Chem.，2 70:30235(1995);Ponath，P．D．et al.，J．Exp．Med.，183:2437-2448(1996);a nd Daugherty，B．L．et al.，J．Exp．Med.，183:2349-2354(1996);Power，C． A．et al.，1995，J．Biol．Chem.，270:19495-19500(1995);Hoogewerf，A．J． et al.，Biochem．Biophys．Res．Commun.，218:337-343(1996);Samson，M．et al.，Biochemistry，35:3362-3367(1996)]。対照的に2つのIL-8受容体、CXCR1お よびCXCR2は、主として好中球に限定され、好中球の移動に重要である(Baggioli ni,M.,et al.,Adv.Immunol.,55:97-179(1994)]。該IL-8受容体、CXCR1[IL-8R1， 1型インターロイキン−8受容体；Holmes，W．E．et al.，Science，253:1278-12 80(1991)]およびCXCR2[IL-8R2，2型インターロイキン−8受容体;Murphy，P．M． and H．Ｌ．Tiffany，Science，253:1280-1283(1991)]は、好中球の走化性を誘 導するCXCケモカインに観察される本質的な結合エピトープであるNH2末端Glu-Le u-Arg(ELR)モチーフを認識する[Clark-Lewis,I.et al.,J.Biol.Chem.,266:23128 -23134(1991);Hebert,C.A．et al.,J.Biol.Chem.,266:18989-18994(1991);and C lark-Lewis，I.et al.,Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90:3574-3577(1993)]。 単球および顆粒細胞とは対照的に、ケモカインに応答するリンパ球は、良く理 解されていない。特に、公知の特異性の受容体は、リンパ球に限定されるように は思われず、したがって、これらの受容体を認識するケモカインは、Ｔ細胞媒介 炎症状態に観察されるＴリンパ球の選択的補充などの事象を説明できない。さら に、公知のケモカイン受容体との顕著な配列類似性ならびに類似の組織および白 血球亜集団分布を有する多くのタンパク質が同定され、クローン化されているが 、これらの受容体のリガンドは決定されないままである。したがって、これらの タンパク質をオーファン受容体という。該受容体の１もしくは複数のリガンドの キャラクタリゼーションは、ケモカイン類とそれらの標的細胞との相互作用、こ の相互作用により刺激され、走化性および白血球の細胞活性化を含む事象、なら びに受容体機能の調節に基づく治療の開発の理解に必須である。 発明の要旨 本発明は、本明細書において、CXCケモカイン受容体3(CXCR3)と称する単離お よび／または組換え哺乳類（例えば、ヒトなどの霊長類）IP-10/Mig受容体タン パク質ならびにその改変体を称するタンパク質またはポリペプチドに関する。組 換えCXCR3タンパク質および改変体は、本明細書に記載のように宿主細胞中で生 産されうる。1つの態様として、CXCR3タンパク質またはその改変体は、IP-10お よび／またはMigなどの1以上のケモカイン類の選択的結合（例えば、高いアフィ ニティー結合）、および／または（1種以上の）細胞応答(例えば、走化性、エキ ソサイトーシス、1種以上の炎症媒介物質の放出など)を誘導する能力により特徴 付けられる。 本発明の他の側面は、哺乳類(例えば、ヒトなどの霊長類など)のCXCR3タンパ ク質またはその改変体をコードする単離および／または組換え核酸に関する。さ らに本発明は、本発明のタンパク質またはその改変体をコードする核酸を含む、 プラスミドまたはレトロウイルスベクターなどの組換え核酸構築物に関する。該 核酸および構築物を用いて、組換え受容体タンパク質および構築物を含む宿主細 胞を生産することができる。他の態様として、核酸は、CXCR3タンパク質をコー ドする第2の核酸とハイブリダイズすることができるアンチセンス核酸をコード し、細胞に導入された場合、受容体の発現を阻害することができる。 さらに本発明は、例えば、該タンパク質もしくはその改変体(例えばペプチド など)または受容体タンパク質もしくは改変体を発現する細胞を免疫原として用 いて生産することができる、CXCR3受容体と反応する抗体に関する。かかる抗体 またはその断片は、受容体タンパク質の精製および研究、表面受容体を発現する 細胞の同定、および細胞の分類または計数を含む、治療、診断、ならびに研究応 用に有益である。したがって、本発明は、本明細書記載の抗体もしくはその断片 （例えば、mA b1C6またはその抗原結合断片）の治療（予防を含む）または診断 への使用および本明細書に記載の疾患または状態の処置に用いる薬剤の製造のた めのかかる抗体もしくは断片の使用を包含する。 また、本発明は、受容体のリガンド、受容体機能の阻害剤（例えばアンタゴニ スト）や促進剤（例えばアゴニスト）を同定する方法をも包含する。1つの態様 として、該細胞に導入された核酸によってコードされる受容体タンパク質または 改変体を発現するように操作されている適切な宿主細胞をアッセイに用いて、リ ガンド、受容体機能の阻害剤または促進剤の効き目を同定し評価する。かかる細 胞は、発現された受容体タンパク質またはポリペプチドの機能を評価する際にも 有用である。 本発明によれば、リガンド、受容体機能の阻害剤および促進剤を適切なアッセ イで同定し、さらに治療の効果について評価することができる。受容体機能の阻 害剤は受容体活性を阻害(減少もしくは妨害)するために使用でき、リガンドおよ び／または促進剤は指示された場合、正常な受容体機能を誘導(引き起こすまた は促進)するために使用できる。したがって本発明は、個体（例えば哺乳類）に 受容体機能の阻害剤を投与する過程を含む、自己免疫疾患および移植片拒絶を含 む炎症性疾患を治療する方法を提供する。さらに、本発明は、個体にリガンドま たは促進剤を投与することにより受容体機能を刺激する方法を提供し、それは、 例えば、感染性疾患および癌の処置に有益な白血球機能の選択的刺激への新たな アプローチを提供する。 図面の簡単な説明 図１は、CXCR3と呼ばれるヒトIP-10/Mig受容体をコードするcDNA（ヒトCD4⁺Ｔ 細胞（KT30）cDNAライブラリーから単離）の1670bpインサートから決定されたヌ クレオチド配列（配列番号：１）を示す図である。オープンリーディングフレー ム（69〜1175）は368アミノ酸の予想タンパク質（配列番号：２）をコードする 。推定されるポリＡシグナルとポリＡ部位はそれぞれ1534〜1539と1624〜1670に 位置する。 図２は、ヒトIP-10/Mig受容体をコードする図１の配列のオープンリーディン グフレームの概念上の翻訳（配列番号：２）を示す図である。矢印は潜在的Ｎ結 合型グリコシル化部位を示し、水平方向の線は推定される膜貫通ドメイン（TM1- TM7）の位置を示す。 図３Ａ〜３Ｃは、IP-10/MigRを発現する安定にトランスフェクトされた細胞に おいて、IP-10とMigによって誘導される応答を示すグラフである。図３Ａは、IP -10/MigRトランスフェクト300-19細胞での濃度依存的[Ca²⁺]_i変化を示すグラフ である。IP-10またはMigをそれぞれ１、10および100nMの濃度でFura-2/AM負荷細 胞に添加し（矢印）、[Ca²⁺]_i依存性の蛍光変化を記録した。非トランスフェク ト細胞（下側の軌線）は同じ条件下に100nMのIP-10またはMigで刺激した。 図３Ｂは、受容体の脱感作および交差脱感作を評価した試験の結果を示すグラ フである。IP−10/MigR発現300-19細胞を、100nMのIP-10またはMigと、IP-10の 後Mig（もしくはその逆）で順次刺激し、蛍光変化を記録した。 図３Ｃは、IP-10（黒丸）またはMig（黒四角）で刺激したIP-10/MigR発現Jurk at細胞の走化性を示すグラフである。下側の図は、増加するIP-10（白丸）また はMig（白四角）量で刺激した場合の非トランスフェクトJurkat細胞の応答を示 す。高倍率視野５つあたりの平均移動細胞数（±SD）を表わす。 図４Ａ〜４Ｂは、IP-10とMigに対する末梢血リンパ球（PBL）の応答を示すグ ラフである。献血血液バフィーコートから新たに単離したPBLをそのまま（下側 の軌線、白抜きの記号）またはIL-2（400U/ml）の存在下に10日間培養してから （上側の軌線、黒塗りの記号）使用した。図４ＡはIP-10またはMigによって誘導 される[Ca²⁺]_i変化を示すグラフである。IP-10またはMigをそれぞれ１、10およ び100nMの濃度でFura-2/AM負荷培養細胞に添加し（矢印）、[Ca²⁺]_i依存性の蛍 光変化を記録した（上側の軌線）。新たに単離した細胞（下側の軌線）は同じ条 件下に100nMのIP-10またはMigで刺激した。図４Ｂは増加するIP-10（黒丸）また はMig（黒四角）濃度に応答したPBLの走化性を示すグラフである（高倍率視野５ つあたりの平均移動細胞数（±SD）を表わす）。 図５Ａ〜５Ｂは、CXCR3 DNAをトランスフェクトしたL1.2細胞（図５Ａ）と活 性化Ｔ細胞（図５Ｂ）に対する放射標識IP-10の結合を示すグラフである。増加 する非標識IP-10濃度の存在下に細胞を0.05nMの¹²⁵I標識IP-10と共にインキュベ ートした。スキャッチャード分析（挿入図）は、CXCR3 L1.2トランスフェクタン トに関して１細胞あたり37,000受容体（Kdは614pM）とCD3芽球に関して１細胞あ たり17,000受容体（Kdは156pM）を示した。 図６は、CCR1、CCR2b、CCR3、CCR4、CCR5、CXCR1、CXCR2、CXCR3またはCXCR4 のいずれかを発現する安定なL1.2トランスフェクタントを抗CXCR3ペプチドモノ クローナル抗体（mAb）1C6で染色することによって評価した、抗CXCR3抗体1C6の 特異性を示す図である。陰性対照染色（非掲載）はどのL1.2トランスフェクタン トについても、非トランスフェクトL1.2細胞（L1.2wt）での1C6について示す染 色と似ていた。 図７Ａ〜７Ｃは、好中球（図７Ａ）、リンパ球（図７Ｂ）および活性化Ｔ細胞 （図７Ｃ）でのCXCR3の発現を示す蛍光ヒストグラムである。全血中の白血球亜 集団をその前方および側方散乱光によって同定し、相応にゲーティングした。CD 3芽球を生成するため、PBMCを抗CD3 mAbで３日間活性化した後、IL-2含有培 地で７日間維持した。各図表において、黒いグラフは抗CXCR3 mAb 1C6による染 色を表わし、中空のグラフは同イソタイプの対照mAbによる染色を表わす。 図８は、血液リンパ球の各集団でのCXCR3発現を示す一連の図表である。二色 染色法を用いてＴ細胞（CD3）、Ｂ細胞（CD20）およびNK細胞（CD56）でのCXCR3 の発現を評価した。 図９は、免疫蛍光三色分析法によって分析した、血液リンパ球のCD3+亜集団上 のCXCR3発現と種々のマーカーの対比を示す一連の図表である。抗CD3 Cy-Chrome を用いてＴ細胞を染色し、分析のためそれらの細胞を電気的にゲーティングした 。各象限は対照mAbの染色に従って設定した。ここに示す染色は分析した５人の 献血者を代表するものであった。 図10は、一群の抗CXCR3 mAbによる、活性化Ｔ細胞のIP-10またはMCP-1媒介性 走化性の阻害を示すヒストグラムである。１×10⁶個のヒトCD3芽球をトランスウ ェルの上部チャンバーに入れ、ケモカイン（12.5nM）を下部チャンバーに入れた 。アッセイ開始時に、種々の抗CXCR3 mAb（組織培養上清中；FCSなし）を細胞と 共にその上部ウェルに入れた。1.5時間後、下部チャンバーに移動する細胞数を フローサイトメトリーで数えた。走化性阻害百分率は、mAbの非存在下で移動し た細胞数を100％として計算した。結果は、少なくとも４回の独立した実験を代 表するものである。 図11は、精製抗CXCR3 mAb 1C6によるIP-10媒介性走化性の阻害を示すグラフで ある。様々な濃度の1C6 mAbを上部ウェルに入れ、図10について記述したように アッセイを行なった。mAb 1C6は856ng/mlの濃度で総走化性を50％阻害した（IC_{5 0} ＝856ng/ml）。 図12は、活性化Ｔ細胞に対する¹²⁵I-IP-10結合の、mAb 1C6による阻害を示す グラフである。表示のように増加する1C6濃度の存在下に、CD3芽球を0.05nMの^{12 5} I-IP-10と共にインキュベートした。室温で60分の後、細胞ペレットを洗浄し、 カウントした。データをソフトウェア・カレイダグラフ（KaleidaGraph）で分析 したところ、0.16μg/mlのIC₅₀値が得られた。 図13Ａ〜13Ｈは、IP-10に応答したヒトＴ細胞による[Ca²⁺]_iのmAb 1C6による 阻害を示す（Migの場合は阻害されない）。抗CD3活性化IL-2刺激ヒトＴ細胞をFu ra-2で標識し、表示したケモカインで順次刺激するか（図13Ａ〜13Ｂ）、mAbで 刺激した40秒後に表示したケモカインで刺激した（図13Ｃ〜13Ｈ）。[Ca²⁺]_i蛍 光変化を分光蛍光計で記録した。各軌線は５回の独立した実験を代表するもので あった。抗体は、50μg/ml（図13Ｃ〜13Ｄ）、25μg/ml（図13Ｅ）、12.5μg/ml （図13Ｆ）、6.125μg/ml（図13Ｇ）または3.0625μg/ml（図13Ｈ）の最終濃度 で使用した。ケモカイン類は2nMの濃度で使用した。 図14Ａ〜14Ｄは、P1ペプチド（図14Ｂ）、P2ペプチド（図14Ｃ）、P3ペプチド （図14Ｄ）の存在下またはペプチドの非存在下（図14Ａ）に、CXCR3発現トラン スフェクタントをmAb 1C6で染色したフローサイトメトリー分析の結果を示す蛍 光ヒストグラムである。各図において、太い線で規定されるグラフはmAb 1C6染 色を表わし、破線で規定されるグラフは同イソタイプの無関係な対照mAbによる 染色を表わす。 図15は、40nMの非放射性IP-10、mAb 1C6、CXCR3トランスフェクタントに対し て生じたモノクローナル抗体（2F8、3A12、3E2、4B4、4D2、5B12、7B8または8D5 ）または抗CXCR2 mAbによる、CXCR3トランスフェクタントに対する放射標識IP-1 0結合の阻害百分率を示すヒストグラムである。 発明の詳細な説明 本明細書に記述するように、CXCケモカインIP-10およびMigに選択的な新規ケ モカイン受容体をコードする核酸をクローニングし、特徴づけた。ヒトCD4⁺Ｔ細 胞ライブラリーから単離されたこのクローンは、単球または顆粒球由来のcDNAラ イブラリーには検出されなかった。このクローンの配列を分析したところ、40,6 59ダルトンの予想分子量を持つ368アミノ酸の予想タンパク質（図２、配列 番号：２）をコードする1104塩基対のオープンリーディングフレームが明らかに なった（図１、配列番号：１）。このアミノ酸配列は、Ｇタンパク質共役受容体 の特徴であり、かつ他の化学誘引物質受容体にも認められる７つの推定膜貫通セ グメントを含んでいる。この知見と合致して、本受容体は、IP-10およびMigに応 答して起こるCa²⁺（カルシウムイオン）の流動化と走化性とを媒介する（実施例 ２）。類似の条件下で、CXCケモカイン類IL-8、GROα、NAP-2（好中球活性化タ ンパク質-2）、GCP-2（顆粒球走化性タンパク質-2）、ENA78（上皮由来好中球活 性化ペプチド78）、PF4（血小板因子４）や、CCケモカイン類MCP-1（単球走化性 タンパク質-1）、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MIP-1α（マクロファージ炎症性タンパ ク質-1α）、MIP-1β、RANTES（regulated on activation，normal T cell expr essed and secreted）（発現かつ分泌された正常Ｔ細胞活性化制御）、1309、エ オタキシンまたはリンフォタクチンに対する有意な応答は検出されなかった。 活性化Ｔリンパ球におけるヒトCXCR3の限定的発現と、この受容体のIP-10およ びMigに対するリガンド選択性は注目に値する。実施例２で使用した条件下に、 このヒト受容体はIL-2活性化Ｔリンパ球で強く発現されるが、休止Ｔリンパ球、 Ｂリンパ球、単球または顆粒球には検出されなかった。受容体分布のさらなる研 究は、CD20+（Ｂ）細胞とCD56+（NK）細胞の一部もこの受容体を発現するものの 、CXCR3を発現するのはそのほとんどが、先の活性化に合致する表現型、CD95+、 CD45R0+およびCD45RA^lowである細胞を含むCD3+細胞であることを示す。リンパ球 を誘引すると報告されている他のケモカイン（例えばMCP-1、MCP-2、MCP-3、MIP -1α、MIP-1βおよびRANTES）の受容体は、好中球、好酸球および好塩基球など の顆粒球や単球にも認められるので、この活性化Ｔリンパ球における選択的発現 は興味深い。これらの結果は、CXCR3と呼ばれるこのIP-10/Mig受容体が、エフェ クターＴ細胞の選択的補充に関与することを示唆している。 本受容体は、IP-10およびMigと呼ばれる２つの珍しいCXCケモカインを認識 する。IP-10とMigは共にCXCサブファミリーに属するが、好中球に対する強力な 化学誘引物質であるIL-8や他のCXCケモカインとは対照的に、IP-10とMigの主な 標的はリンパ球、特に活性化または刺激されたＴリンパ球やナチュラルキラー（ NK）細胞などのエフェクター細胞である（Taub，D.D.ら，J．Exp．Med.，177：1 8090-1814（1993）；Taub，D.D.ら，J．Immunol.，155：3877-3888(1995)）（NK 細胞は、抗原認識用の特異的Ｔ細胞受容体を持たないが、腫瘍細胞やウイルス感 染細胞などの細胞に対して細胞傷害活性を持つ大形顆粒リンパ球である）。この ことと合致して、IP-10とMigは、好中球走化性を効率よく誘導するCXCケモカイ ン中の必須結合エピトープであるELRモチーフを持たない（Clark-Lewis，I.ら， J．Biol．Chem.，266：23128-23134(1991)；Hebert，C.A.ら，J．Biol．Chem.， 266：18989-18994(1991)；およびClark-Lewls，I．ら，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA，90：3574-3577(1993)）。また、組換えヒトMigと組換えヒトIP-10は共に 、腫瘍浸潤性リンパ球（TIL）内のカルシウム流動を誘導すると報告されている （Liao，F.ら，J．Exp．Med.，182：1301-1314(1995)）。IP-10はイン・ビトロ で単球の走化性を誘導すると報告されているが（Taub，D.D.ら，J．Exp．Med.， 177：1809-1814(1993)；原因となる受容体は同定されていない）、ヒトMigは高 度に選択的と思われ、そのような作用を示さない（Liao，F.ら，J．Exp．Med.， 182：1301-1314(1995)）。IP-10発現は、乾癬、固定薬疹、皮膚の遅延型過敏反 応、類結核癩などの炎症状態にある様々な組織、実験的糸球体腎炎および実験的 アレルギー性脳脊髄炎で誘導される。またIP-10は、Ｔ細胞依存性の強力なイン ・ビボ抗腫瘍作用を持ち、生体内で血管形成の阻害因子であると報告されており 、イン・ビトロでNK細胞の走化性と脱顆粒を誘導できることから、（例えば腫瘍 細胞破壊における）NK細胞の補充および脱顆粒の媒介物質としての役割が示唆さ れる（Luster，A.D.およびP．Leder，J．Exp．Med.，178：1057-1065(1993)；Lu ster，A.D.ら，J．Exp．Med．182：219-231(1995)；Angiolillo，A.L.ら，J．Ex p．Med.，182：155-162(1995)； Taub，D.D.ら，J．Immunol.，155：3877-3888(1995)）。IP-10とMigの発現パタ ーンは、それぞれの発現がインターフェロン・ガンマ（IFNγ）によって誘導さ れるという点でも独特であり、これに対し、IL-8の発現はIFNγによってダウン レギュレートされる（Luster，A.D.ら，Nature，315：672-676(1985)；Farber， J.M.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87：5238-5242(1990)；Farber，J.M.，Bio chem．Biophys．Res．Commun.，192(1)：223-230(1993)；Liao，F．ら，J．Exp ．Med.，182：1301-1314(1995)；Seitz，M.ら，J．Clin．Invest.，87：463-469 (1991)；Galy，A.H.M.およびH．Spits，J．Immunol.，147：3823-3830(1991)） 。 最近、ケモカイン類は、長く捜し求められていたリンパ球補充の媒介物質であ ると認識されるようになった。数種類のCCケモカインがリンパ球走化性を惹起す ることが発見されたが（Loetscher，P.ら，FASEB J.，8：1055-1060(1994)）、 それらは顆粒球と単球に対しても活性である（Uguccinoni，M.ら，Eur．J．Immu nol.，25：64-68(1995)；Baggiolini，M.およびC.A．Dahinden，Immunol．Today ，15：127-133(1994)）。この状況は、その作用が活性化Ｔリンパ球とNK細胞を 含むリンパ球に選択的であって、かつ、数多くの他のケモカイン類を認識せず選 択的発現パターンを示す受容体CXCR3を結合するIP-10とMigでは異なる（実施例 ２、実施例５）。 これらの知見を考慮すれば、遅延型過敏性病巣などの炎症性病巣、ウイルス感 染部位およびある種の腫瘍における特徴的な浸潤物の形成が、CXCR3を介して媒 介されCXCR3発現によって調節される過程であると結論することは妥当である。 活性化の結果としてCXCR3受容体を保持するリンパ球、特にＴリンパ球は、イン ターフェロン・ガンマによって局所的に誘導されうるIP-10および／またはMigに よって炎症性病巣、感染部位または腫瘍に補充されうる。したがって、CXCR3は リンパ球、特に活性化または刺激されたＴリンパ球などのエフェクター細胞の選 択的補充にその役割を果たす。タンパク質とペプチド 本発明は、哺乳類CXCR3タンパク質と呼ばれる単離および／または組換え（例 えば本質的に純粋なものを含む）タンパク質またはポリペプチドおよびその改変 体に関する。好ましい態様として、本発明の単離および／または組換えタンパク 質は、哺乳類CXCR3タンパク質（本明細書に定義する）に特有な、結合活性（例 えばリガンド、阻害因子および／または促進因子結合性）、シグナル伝達活性（ 例えば哺乳類Ｇタンパク質の活性化、サイトゾル遊離カルシウム濃度[Ca²⁺]_iの 迅速かつ一過性の上昇の誘導）、細胞応答機能（例えば走化性、エキソサイトー シスまたは白血球による炎症媒介物質放出の刺激）および／または本明細書に定 義する免疫学的性質などの性質、活性または機能を少なくとも一つは持つ。例え ば、本発明のタンパク質には、IP-10および／またはMigに選択的に結合でき、そ れに対する細胞のシグナル伝達および／または応答（例えば（とりわけ活性化Ｔ リンパ球の）カルシウム流動、走化性および／または脱顆粒）をイン・ビトロお よび／または生体内で媒介できるものがある。例えば本明細書に示すように、cD NAクローンの発現により哺乳類細胞中で生産されたヒトCXCR3タンパク質は、CXC ケモカインIP-10および／またはMigに選択的に結合して、シグナル伝達と細胞応 答（例えば走化性）を媒介することかできる。一態様として本発明のタンパク質 は、同じ哺乳類種または異なる哺乳類種に由来するCXCケモカイン（例えばヒトI P-10、ネズミIP-10、ヒトMig、ネズミMig）を結合できる（ヒトIP-10，Luster， A.D.ら，Nature，315：672-676(1985)；ネズミIP-10（CRG-2とも呼ばれる），Va nguri，P.およびJ.M．Farber，J．Biol．Chem.，265：15049（1990）ならびにLu ster，A.D.およびP．Leder，J．Exp．Med.，178：1057-1065(1993)；ネズミMig ，Farber，J.M.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87:5238-5242(1990)；ヒトMig ，Farber，J.M.，Biochem．Biophys．Res．Commun.，192(1)：223-230(1993)な らびにLiao，F.ら，J．Exp．Med.， 182：1301-1314(1995)）。 本明細書で「単離（された）」と称するタンパク質またはポリペプチドは、そ れらが哺乳類細胞中に存在する時よりも精製された状態にあるタンパク質または ポリペプチドであり、本明細書に記述する方法や類似の方法あるいは他の適当な 方法によって得られるタンパク質またはポリペプチド、例えば本質的に純粋なタ ンパク質またはポリペプチド、化学合成法（例：合成ペプチド）あるいは生物学 的方法と化学法の併用によって生産されるタンパク質またはポリペプチド、およ び単離された組換えタンパク質またはポリペプチドなどが含まれる。これらのタ ンパク質は少なくとも約50重量％、好ましくは少なくとも約75重量％の単離状態 で、または本質的に純粋な形で得ることができる。ここで「組換え」と称するタ ンパク質またはポリペプチドは、組換え核酸の発現によって生産されるタンパク 質またはポリペプチドである。 本明細書において「哺乳類CXCR3タンパク質」とは、天然に存在するまたは内 因性の哺乳類CXCR3タンパク質、ならびに天然に存在するまたは内因性の対応す る哺乳類CXCR3タンパク質と同じアミノ酸配列を持つタンパク質（例えば組換え タンパク質）をいう。したがって、本明細書に定義される用語「哺乳類CXCR3タ ンパク質」は、哺乳類CXCR3の成熟タンパク質、多形または対立遺伝子改変体、 およびその他のアイソフォーム（例えば選択的スプライシングその他の細胞過程 によって産生されるもの）、ならびにそれらの修飾体または未修飾体（例えばグ リコシル化、非グリコシル化、リン酸化または非リン酸化CXCR3タンパク質）を 包含する。天然に存在するまたは内因性の哺乳類CXCR3タンパク質には、成熟型C XCR3等の野生型タンパク質、哺乳動物（例えばヒト、ヒト以外の霊長類）に天然 に存在する多形または対立遺伝子改変体およびその他のアイソフォームが含まれ る。これらのタンパク質は、例えば哺乳類CXCR3を本来産生する供給源から回収 することができる。これらのタンパク質と、天然に存在するまたは内因性の対応 する哺乳類CXCR3と同じアミノ酸配列を持つ哺乳類CXCR3タンパク質は、対応 する哺乳類の名前で呼ばれる。例えば対応する哺乳動物がヒトである場合、その タンパク質はヒトCXCR3タンパク質と呼ばれる（例えば適当な宿主細胞で生産さ れた組換えヒトCXCR3）。 哺乳類CXCR3タンパク質の「機能的改変体」には、機能的断片、機能的突然変 異タンパク質および／または機能的融合タンパク質（例えば突然変異誘発および ／または組換え技術によって生産されるもの）が含まれる。一般に、本発明によ って包含される哺乳類CXCR3タンパク質の断片または部分は、成熟型哺乳類CXCR3 タンパク質と比較してアミノ酸（すなわち１またはそれ以上のアミノ酸）の欠失 （すなわち１またはそれ以上の欠失）を有するもの（例えばＮ末端、Ｃ末端また は内部欠失体）を包含する。成熟型哺乳類CXCR3タンパク質と比較して、隣接し ているアミノ酸のみが欠失している断片もしくは部分または隣接していないアミ ノ酸が欠失している断片または部分も想定される。 一般に、本発明に包含される哺乳類CXCR3タンパク質の突然変異体または誘導 体には、１またはそれ以上の隣接するまたは隣接していないアミノ酸残基の付加 、欠失および／または置換により異なる天然または人工の改変体、１またはそれ 以上の残基が修飾されている修飾ポリペプチド、および１またはそれ以上の修飾 残基を含む突然変異体が含まれる。好ましい突然変異体は、１またはそれ以上の 隣接するまたは隣接していないアミノ酸残基の付加、欠失および／または置換に より異なる天然または人工の哺乳類CXCR3タンパク質改変体である。そのような 突然変異は、例えば（他のCXCおよび／またはCCケモカイン受容体と比較して） 保存されている領域または保存されていない領域、細胞外領域、細胞質領域また は膜貫通領域に存在しうる。 哺乳類CXCR3タンパク質の「機能的断片または部分」「機能的突然変異体」お よび／または「機能的融合タンパク質」とは、哺乳類CXCR3受容体（本明細書に 定義する）に特有な、結合活性（例えばリガンド、阻害因子および／または促進 因子結合性）、シグナル伝達活性（例えば哺乳類Ｇタンパク質の活性化、サイト ゾル遊離カルシウム濃度[Ca²⁺]_iの迅速かつ一過性の上昇の誘導）、細胞応答機 能（例えば走化性、エキソサイトーシスまたは白血球による炎症媒介物質放出の 刺激）および／または本明細書に定義する免疫学的性質などの性質、活性または 機能を少なくとも一つは持つ単離および／または組換えタンパク質もしくはオリ ゴペプチドを指す。 本明細書において、哺乳類CXCR3タンパク質の「免疫学的性質を少なくとも一 つ」持つタンパク質またはポリペプチドとは、（a）天然に存在するまたは内因 性の哺乳類CXCR3タンパク質もしくは天然に存在するまたは内因性の哺乳類CXCR3 タンパク質（例えばヒトCXCR3）と同じアミノ酸配列を持つタンパク質に結合す る、選択されたエピトープ特異性を持つ少なくとも一つの抗体によって結合され 、および／または、（b）天然に存在するもしくは内因性の哺乳類CXCR3タンパク 質または天然に存在するもしくは内因性の哺乳類CXCR3タンパク質と同じアミノ 酸配列を持つタンパク質に結合する、選択されたエピトープ特異性を持つ抗体の 適当な動物における形成を（例えば適当な担体と複合体化した時に）誘導しうる 免疫原であるものである。例えば、好適な断片は、単離された哺乳類CXCR3に対 して生じたおよび／またはそれと反応する抗体と交差反応できる。 好適な断片または突然変異体は、スクリーニングによって同定できる。例えば 本タンパク質のＮ末端、Ｃ末端または内部領域を段階的に欠失させることができ 、得られたタンパク質またはポリペプチドを本明細書に記述するような適当なア ッセイ（例えば走化性、カルシウム流動）を使ってスクリーニングすることがで きる。得られたタンパク質がそのアッセイで活性を示す場合、その得られたタン パク質（「断片」）は機能的である。CXCケモカイン受容体やCCケモカイン受容 体を含む哺乳類Ｇタンパク質共役受容体の構造と機能に関する情報は、哺乳類CX CR3タンパク質を機能ドメインに分割する際の根拠となる（Murphy，P.M.，Ann． Rev．Immunol.，12：593-633（1994）ならびにGerard，C.およびN.P．Gerard，C urr．Opin．Immunol.，6：140-145（1994）とそれらに引用されてい る文献）。 改変体という用語は、第一の成分として哺乳類CXCR3タンパク質（例えばヒトC XCR3）を含み、その第一成分が、自然界に認められるその哺乳類CXCR3には存在 しない第二の成分に連結している融合タンパク質をも包含する。したがってこの 第二成分はアミノ酸、オリゴペプチドまたはポリペプチドでありうる。第一成分 は、その融合タンパク質のＮ末端、Ｃ末端または内部のいずれにあってもよい。 一態様として本融合タンパク質は、第一成分としてのアフィニティーリガンド（ 例えば酵素、抗原、エピトープタグ）と、リンカー配列およびヒトCXCR3または その一部からなる第二成分とを含有する。 哺乳類CXCR3タンパク質の例としては、本発明の核酸によってコードされるタ ンパク質、例えば図２（配列番号：２）に記述されているようなまたは実質上記 述されているようなアミノ酸配列を持つタンパク質が挙げられる。好ましい態様 として、哺乳類CXCR3または改変体（例えば細胞外Ｎ末端部分を含む改変体）は 、図２（配列番号：２）に示すタンパク質と少なくとも約50％同一、より好まし くは少なくとも約70％同一、さらにより好ましくは少なくとも約80％同一である アミノ酸配列を持つ。 放射性同位体、スピン標識、抗原（例えばFLAGタグなどのエピトープ標識）、 酵素標識、蛍光基、化学発光基などといった検出可能な標識の組み込みまたは付 加（直接的付加もしくは（例えばリンカーを介した）間接的付加）によって、単 離および／または組換え哺乳類CXCR3タンパク質とその改変体を修飾することが でき、それら修飾体も本発明の範囲に包含されることは理解されるだろう。核酸、構築物およびベクター 本発明は、本明細書に記載された哺乳類（ヒト等）ＣＸＣＲ３タンパク質また はその改変体をコードする単離および／または（本質的に純粋な等を含む）組換 え核酸に関する。本明細書でいう「単離」核酸とは、起源の供給源のゲノムＤＮ Ａまたは細胞ＲＮＡの（例えば、細胞中またはライブラリー等の核酸混合物中に 存在するような）核酸から離れて分離された核酸をいい、さらなるプロセッシン グを受けてもよい。「単離」核酸は、本明細書に記載された方法、類似の方法ま たは他の好適な方法により得られた核酸を含み、本質的に純粋な核酸、化学合成 により製造された核酸、生物学的方法と化学的方法との組み合わせにより製造さ れた核酸および単離された組換え核酸を含む。本明細書でいう「組換え」核酸と は、組換えＤＮＡ方法論により製造された核酸をいい、ポリメラーゼ連鎖反応（ ＰＣＲ）および／または制限酵素を用いるベクターへのクローニング等の人工的 な組換え方法に依存する手法により生成される核酸を含む。また、「組換え」核 酸は、細胞の天然のメカニズムを介して起こる組換え事象からも生ずるが、所望 の組換え事象の可能性および蓋然性を生じさせるように設計された核酸の細胞に 導入後に選択されるものである。 １つの態様において、核酸またはその一部は、結合活性（例えば、リガンド、 阻害剤および／または促進剤結合）、シグナル伝達活性（例えば、哺乳類Ｇタン パク質の活性化、サイトゾル遊離カルシウムの濃度[Ｃａ²⁺]_iの迅速かつ一過性 の増加の誘導）、および／または細胞応答の刺激（例えば、走化性、エキソサイ トーシスまたは白血球による炎症性媒介物質放出の刺激）等の哺乳類ＣＸＣＲ３ タンパク質（例えば、ヒトＣＸＣＲ３受容体）に特有の機能の少なくとも１種を 有するタンパク質またはポリペプチドをコードする。また、本発明は、より具体 的には、哺乳類ＣＸＣＲ３受容体またはその一部をコードする配列を含有する単 離および／または組換え核酸またはその一部に関する。さらにより具体的には、 本発明は、ヒトＣＸＣＲ３タンパク質をコードする配列を含有する単離および／ または組換え核酸に関する。 さらに、本発明は、 （１）（ａ）配列番号：１の配列を有する核酸、 （ｂ）配列番号：１に相補的な配列を有する核酸、または （ｃ）配列番号：１のオープンリーディングフレームを含有する前記核酸 の一部（図１に示した鎖の部分または相補鎖の対応する部分）、 にハイブリダイズする能力；および／または （２）配列番号：２のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的同等 物（即ち、受容体の１以上の天然または生理学的リガンドに関するリガンド結合 活性を有するポリペプチド、および／または細胞応答（例えば、走化性、エキソ サイトーシスまたは白血球による炎症性媒介物質放出の（誘発または刺激を含む ）誘導）を誘導可能なように、リガンド結合に応答可能な刺激する機能）をコー ドする能力；および／または （３）両方の特性、 により特徴付けられる、二本鎖もしくは一本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡを含む単離お よび／または組換え核酸に関する。 １つの態様において、配列番号：２とその機能的同等物との間のアミノ酸配列 同一性率は、少なくとも約６０％（≧６０％）である。好ましい態様において、 配列番号：２の機能的同等物は、配列番号：２と少なくとも約７０％の配列同一 性を共有する。さらに好ましくは、配列番号：２とその機能的同等物との間のア ミノ酸配列同一性率は、少なくとも約８０％、さらにより好ましくは少なくとも 約９０％である。 これらの基準に合致する単離および／または組換え核酸には、天然に存在する 哺乳類ＣＸＣＲ３受容体の配列およびその一部と同一の配列を持つ核酸、または 天然に存在する配列の改変体が含まれる。かかる改変体には、１以上の残基の付 加、欠失または置換によって相違する突然変異体、１以上の残基が修飾されてい る修飾核酸（ＤＮＡまたはＲＮＡ類縁体など）および１以上の修飾残基を含む突 然変異体が含まれる。１つの態様において、核酸は、配列番号：１に示された配 列の一方の鎖とまたはそのコーディング領域に対して、少なくとも約５０％のヌ クレオチド配列類似性、より好ましくは少なくとも約７５％のヌクレオチド配列 類似性、およびさらにより好ましくは少なくとも約９０％のヌクレオチド配列類 似性を共有する。好ましい核酸は、少なくとも約４０ヌクレオチド、より好まし くは少なくとも約５０およびさらにより好ましくは少なくとも約７５ヌクレオチ ドの長さを有する。 かかる核酸は、例えば高ストリンジェンシー条件または中程度のストリンジェ ンシー条件下でのハイブリダイゼーションによって検出および単離できる。核酸 ハイブリダイゼーションに関する「高ストリンジェンシー条件」と「中程度のス トリンジェンシー条件」は、その教示が参照により本明細書に取り込まれるCurr ent Protocols in Molecular Biology(Ausubel，F.M．ら編，第1巻，補遺26,199 1)の2.10.1-2.10.16頁（特に2.10.8-11を参照のこと）と6.3.1-6頁に説明されて いる。プローブ長、塩基組成、ハイブリダイズする配列間のミスマッチ率、温度 およびイオン強度などの因子が核酸ハイブリッドの安定性に影響を与える。した がって、高ストリンジェンシー条件または中程度のストリンジェンシー条件は、 所望の選択性を達成するように経験的に決定できる。 配列番号：１またはその相補鎖の配列を有する核酸に（例えば高または中程度 のストリンジェンシー条件下で）ハイブリダイズできることを特徴とする単離お よび／または組換え核酸は、さらに、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質（ヒトＣＸＣ Ｒ３タンパク質など）の特有の機能、例えば結合活性（リガンド、阻害剤および ／または促進剤結合など）、シグナル伝達活性（哺乳類Ｇタンパク質の活性化、 サイトゾル遊離カルシウム濃度[Ca²⁺]_iの迅速かつ一過性の増加の誘導など）お よび／または細胞応答の刺激（走化性、エキソサイトーシスまたは白血球による 炎症媒介物質の放出の刺激など）などの少なくとも１つを持つタンパク質または ポリペプチドをコードしてもよい。 本明細書に記載されるヒトＣＸＣＲ３核酸またはＰＣＲにより生成された断片 を含むその十分な部分、単離、組換えおよび／または合成のいずれかは、プロー ブまたはプライマーとして使用され、霊長類（例えば、サル（カニクイザル等） 等のヒト以外の霊長類）、ウシ、ヒツジ、ウマ、イヌ、ネコおよび齧歯類（例え ば、モルモット、ラット、マウス等のネズミ種）を含むがこれに限定されない他 の哺乳類種由来のＣＸＣＲ３受容体（ホモログ）または他の関連する受容体遺伝 子（例えば、新規ＣＸＣケモカイン受容体遺伝子）をコードする核酸（例えば、 ゲノムＤＮＡ、対立遺伝子改変体、ｃＤＮＡ）を検出および／または回収するこ とができる。これは、本明細書に記載された手法またはハイブリダイゼーション 、ＰＣＲもしくは他の好適な技術を含む他の適当な方法を用いて達成されうる。 哺乳類核酸を用いて、構築物（例えば、ベクター）、受容体またはその断片なら びに受容体の生産および使用方法に有用な宿主株を調製することが可能である。 １つの態様において、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質（または改変体）をコード する核酸は、ＰＣＲ増幅等の方法により製造可能である。例えば、本明細書に記 載されたヒトＣＸＣＲ３ｃＤＮＡの一部に相補的または実質的に相補的な配列を 含有する適当なプライマー（例えば、プライマー対またはネステッドプライマー ）を設計することができる。例えば、コーディング配列および／またはコーディ ング配列に隣接する配列の５’または３’末端に相補的なプライマーを設計する ことができる。かかるプライマーを、適当な鋳型核酸を用いるポリメラーゼ連鎖 反応に使用して、哺乳類ＣＸＣＲ３等をコードする核酸を得ることができる。好 適な鋳型には例えば、本明細書に記載された構築物（ｐｃＤＮＡ３−Ｃｌｏｎｅ ８等）、ｃＤＮＡもしくはゲノムライブラリー、または哺乳類（ヒト、霊長類等 ）ｃＤＮＡもしくはゲノムＤＮＡの他の好適な供給源を含む。プライマーは、鋳 型として適するものとして選択された構築物の隣接する配列に相補的な部分を含 むことができる。 タンパク質またはポリペプチド（例えば、ハイブリダイズする核酸によってコ ードされる）の結合機能は、例えば、受容体を含む膜画分または受容体を発現す る細胞を用いて、結合または結合阻害アッセイにおいて検出されうる（Van Ripe rら、J．Exp．Med.，177:851-856(1993);Sledziewskiら、米国特許第５， ２８４，７４６号明細書（１９９４年２月８日）等を参照のこと）。したがって 、コードされたタンパク質またはポリペプチドのＩＰ−２０またはＭｉｇ等のリ ガンド、阻害剤および／または促進剤結合能を評価することができる。本発明の 核酸によりコードされるタンパク質またはポリペプチドの抗原特性は、イムノブ ロッティング、免疫沈降およびイムノアッセイ（例えば、ラジオイムノアッセイ 、ＥＬＩＳＡ）等の哺乳類ＣＸＣＲ３に結合する抗体を用いる免疫学的方法によ り決定することができる。 タンパク質またはポリペプチド（例えば、ハイブリダイズする核酸によってコ ードされる）のシグナル伝達機能は、受容体結合に応答するＧタンパク質活性（ 例えば、膜画分を用いるＧタンパク質αサブユニットでのＧＴＰのＧＤＰへの交 換）に関する酵素アッセイにより検出されうる。Ｇタンパク質共役は、例えば、 Ｇタンパク質による刺激が、細胞もしくは適当な細胞画分（膜等）を百日咳菌毒 素等のＧタンパク質の特異的阻害剤で処理または前処理することにより阻止され るアッセイを用いて、さらに評価することができる(Bischoff，S．C．ら、Eur． J．Immunol.，23:761-767(1993);Sozzani，S．ら、J．Immunol.，147、2215-222 1(1991))。 タンパク質またはポリペプチド（例えば、ハイブリダイズする核酸によってコ ードされる）の刺激機能は、そのタンパク質またはポリペプチドを発現する細胞 を用いて、走化性または媒介物質放出に関する標準的アッセイ（リガンド（例え ば、ＩＰ−２０またはＭｉｇなどのケモカイン）または促進剤に応答して起こる 走化性、エキソサイトーシス（エステラーゼ（セリンエステラーゼ等）、パーフ ォリン、グランザイム等の酵素の脱顆粒反応）または媒介物質放出（例えば、ヒ スタミン、ロイコトリエン）をモニターするアッセイ等）で検出できる（Taub， D．D．ら、J．Immunol.，155:3877-3888(1995);Baggliolini，M．とC．A．Dahin den，Immunology Today，15:127-133(1994)およびそれらに記載された参考文献 等を参照のこと）。また、哺乳類ＣＸＣＲ３受容体に特有の機能は、他の 適当な方法によって評価してもよい。 これらの方法は単独で、もしくは他の適当な方法と組み合わせて、配列番号： ２またはそれらの機能的同等物のアミノ酸配列を持ち、かつ、そのアッセイで検 出される活性を持つポリペプチドをコードする核酸の同定および／または単離操 作にも使用できる。特定の機能を持つ配列番号：２のポリペプチド部分をコード する単離核酸の一部もこの方法で同定および単離できる。 本発明の核酸はタンパク質またはポリペプチドの生産に使用できる。例えば、 哺乳類ＣＸＣＲ３受容体のコード配列の全部または一部を含有する核酸、または 配列番号：１の配列またはそれらの相補鎖にハイブリダイズするＤＮＡを、さら なる配列操作用またはコードされたポリペプチドの適当な宿主細胞における生産 用の構築物に組込むことができる。また、本発明の核酸は、例えば、放射性同位 体、スピン標識、抗原もしくは酵素標識、蛍光もしくは化学発光基などのような 検出可能標識の取り込みまたは（直接または間接）付着により修飾することも可 能であり、かかる修飾型は、本発明の範疇に含まれる。アンチセンス構築物 別の態様において、核酸は、センス鎖からなる標的分子に全体または一部が相 補的で、その標的分子とハイブリダイズできるアンチセンス核酸である。標的は ＤＮＡであってもよいし、そのＲＮＡ体（すなわちＤＮＡのＴ残基がＲＮＡ体で はＵ残基である）であってもよい。適当な方法で細胞に導入すると、アンチセン ス核酸は、そのセンス鎖がコードする遺伝子の発現を阻害できる。アンチセンス 核酸は標準的な技術で製造できる。 １つの態様において、アンチセンス核酸は、ある標的核酸に対して全体的また は部分的に相補的であり、標的核酸とハイブリダイズでき、ここで、該標的核酸 は、配列番号：１の相補鎖の配列を持つ核酸にハイブリダイズできる。例えばア ンチセンス核酸は、配列番号：１またはハイブリダイゼーションが十分可能なそ の一部の配列を持つ標的核酸に相補的であってもよい。別の態様において、アン チセンス核酸が哺乳類ＣＸＣＲ３受容体（例えば、ヒトＩＰ−１０／Ｍｉｇ受容 体ＣＸＣＲ３）をコードする標的核酸に対して全体的または部分的に相補的で、 該標的核酸とハイブリダイズできる。 アンチセンス核酸は、研究的応用や治療的応用を含む種々の目的に有用である 。例えば、アンチセンス核酸を含む構築物を適当な細胞に導入して、受容体発現 を阻害することができる。かかる細胞は、例えばその親細胞や他の関連細胞型を 用いて受容体−リガンド相互作用の特異性を評価する際に貴重な対照細胞となる 。もう１つの側面として、かかる構築物を哺乳類の細胞の一部または全部に導入 する。アンチセンス核酸は受容体発現を阻害し、その構築物を含有する細胞にお いてＣＸＣＲ３受容体が媒介する炎症過程を阻害できる。したがって、本発明の アンチセンス核酸を用いて、炎症性の疾患や状態を治療できる。アンチセンス構 築物を含有する適当な実験動物は、白血球機能欠損症、特に活性化Ｔリンパ球欠 損症の有用なモデルにもなり、ＣＸＣＲ３受容体機能に関してさらなる情報を提 供することができる。かかる動物は、宿主防御におけるＴリンパ球およびＮＫ細 胞などの白血球の役割を解明するのに有用な、感染性疾患または癌の貴重なモデ ルにもなりうる。組換えタンパク質の製造方法 本発明のもう１つの側面は、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはその改変体（ 一部等）を製造する方法に関する。組換えタンパク質は、例えば、適当な宿主細 胞において哺乳類ＣＸＣＲ３またはその改変体をコードする組換え核酸（例えば 、ＤＮＡ）分子の発現等により得ることができる。 また、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはその改変体の発現に適する構築物（ 例えば、発現ベクター）も提供される。該構築物は適当な宿主細胞に導入可能で あり、組換え哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはその改変体を発現する細胞を 製造し、培地中に維持することができる。かかる細胞は、例えば、特徴づけ、単 離および／または精製（例えば、アフィニティー精製）用のタンパク質の製造に おける使用、結合アッセイまたは他の機能アッセイ（リガンド、受容体機能の阻 害剤および／または促進剤のスクリーニングのため等）での免疫原としての使用 を含む、種々の目的に有用である。適当な宿主細胞は、大腸菌、枯草菌および他 の適当な細菌等の細菌細胞を含む原核細胞であってもよいし、カビ細胞もしくは 酵母細胞（例えばピチア・パストリス（Pichia pastoris）、アスペルギルスス ピーシーズ、サッカロミセス・セレビシエ、シゾサッカロミセス・ポンベ、ニュ ーロスポラ・クラッサ）などの真核細胞、または他の下等真核細胞および昆虫由 来の細胞（例えばSf9昆虫細胞（国際公開第９４／２６０８７号パンフレット、 オコナー(0'connor)、１９９４年１１月２４日公開））または哺乳類由来の細胞 （例えば、チャイニーズハムスター卵巣細胞(CHO)、COS細胞、HuT78細胞、293細 胞）などの高等真核細胞であってもよい。（例えばAusubel，F.M．ら編，Curren t Protocols in Molecular Biology，Greene Publishing Associates and John Wiley & Sons Inc.，(1993)を参照のこと。） 組換え哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはその改変体を生産する宿主細胞は、 次のように作製できる。所望のタンパク質のコード配列の全部または一部をコー ドする核酸を、例えばプラスミド、ウイルスまたは他の適当な発現用レプリコン などのＤＮＡベクターなどの核酸ベクターに挿入することができる。シングルコ ピーもしくはマルチコピーとして維持されるベクターまたは宿主細胞染色体に組 込まれるベクターを含む種々のベクターが利用可能である。 哺乳類ＣＸＣＲ３遺伝子の転写および／または翻訳シグナルを直接発現に使用 することができる。所望のタンパク質のコード配列の全部または一部をコードす る核酸を発現させるための適当な発現ベクターも使用できる。発現に適したベク ターは、いくつかの成分を含有してもよく、次の１以上が含まれるがこれらに限 定されない：複製起点、選択可能マーカー遺伝子、１以上の発現制御要素、例え ば転写制御要素（プロモーター、エンハンサー、ターミネーターなど）および／ または１以上の翻訳シグナル；選択された宿主細胞（例えば、哺乳類起源のもの または異種哺乳類もしくは非哺乳類種由来のもの）で膜標的用のシグナル配列ま たはリーダー配列。構築物において、シグナル配列は、ベクター、哺乳類ＣＸＣ Ｒ３コード配列または他の供給源により提供されうる。また、組み込み部位に存 在する配列は、これらの要素を提供する。 プロモーターは、適当な宿主細胞での発現用に提供されうる。プロモーターは 構成的であってもよいし、誘導性であってもよい。例えば、プロモーターは、哺 乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはその改変体をコードする核酸に操作可能に連結 しており、コードされたポリペプチドの発現を制御することができる。原核細胞 宿主に適した種々のプロモーター（例えば大腸菌用のlac、tac、T3、T7プロモー ター）および真核細胞宿主に適した種々のプロモーター（例えば酵母アルコール デヒドロゲナーゼ（ADH1）、SV40、CMV）が利用できる。 さらに、発現ベクターは、典型的には、そのベクターを保持する宿主細胞を選 択するための選択可能マーカーおよび複製可能発現ベクターの場合複製起点をも 含む。抗生物質または薬剤耐性を付与する産物をコードする遺伝子は、慣用の選 択可能マーカーであり、原核細胞（例えばβ-ラクタマーゼ遺伝子（アンピシリ ン耐性）、テトラサイクリン耐性に対するTet遺伝子）および真核細胞（例えば ネオマイシン（G418またはゼネティシン）、gpt（ミコフェノール酸）、アンピ シリンまたはハイグロマイシン耐性遺伝子）に使用してもよい。ジヒドロ葉酸レ ダクターゼマーカー遺伝子は、種々の宿主におけるメトトレキセートによる選択 を可能にする。宿主の栄養要求性マーカー（例えばLEU2、URA3、HIS3）の遺伝子 産物をコードする遺伝子は、酵母における選択可能マーカーとしてしばしば使用 される。ウイルス（例えばバキュロウイルス）ベクターまたはファージベクター および、レトロウイルスベクターなどの宿主細胞のゲノムに組み込むことができ るベクターの使用も予想される。また、本発明は、これらの発現ベクターを保持 する細胞にも関する。 例えば、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質もしくはその改変体をコードする核酸、 またはかかる核酸を含有する構築物を、核酸が１以上の発現制御要素に操作可能 に連結されるように（例えば、ベクター中、細胞中でのプロセッシングにより創 出された構築物中で、宿主細胞ゲノムに組み込まれて）、選択された宿主細胞に 適した方法（例えば、形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーショ ン、感染）により適当な宿主細胞に導入することができる。宿主細胞は、発現に 適した条件下で（例えば、誘導剤の存在下で、適する塩、成長因子、抗生物質、 栄養補給物等を補足した適当な培地）維持することが可能であり、それによって コードされたポリペプチドが製造される。所望ならば、コードされたタンパク質 （ヒトＣＸＣＲ３等）を、（例えば、宿主細胞、培地、ミルクから）単離するこ とができる。該方法がトランスジェニック動物の宿主細胞での発現を包含するこ とがふさわしいであろう（例えば、国際公開第９２／０３９１８号パンフレット 、GenPharm International、１９９２年３月１９日公開）。 また、融合タンパク質もこの方法で生産できる。例えば、いくつかの態様は、 /−（Stratagene）、pGEX-4T-2（Pharmacia）、pcDNA-3(Invitrogen)またはpET- 15b（Novagen）などの適当な発現ベクターに挿入することによって作製できる。 得られた構築物を適当な発現用宿主細胞に導入することができる。発現後、融合 タンパク質を適当なアフィニティー担体を用いて細胞溶解液から単離または精製 できる（例えばCurrent Protocols in Molecular Biology（Ausubel，F.M．ら編 ，第2巻，補遺26,16.4.1-16.7.8頁（1991）を参照のこと）。さらに、アフィニ ティー標識は、融合タンパク質の検出手段を提供する。例えば、抗原またはエピ トープアフィニティー標識を含有する融合タンパク質の細胞表面発現や特定の細 胞画分における該融合タンパク質の存在は、適当な抗体により検出できる。抗体 さらに本発明は、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはその一部と反応する抗体 に関する。好ましい態様において、抗体は、単数または複数の哺乳類ＣＸＣＲ３ 受容体またはその一部を特異的に結合する。１つの態様において、単離および／ または組換え哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはその一部（例えばペプチド）ま たは組換え哺乳類ＣＸＣＲ３を発現する宿主細胞に対して抗体を生じさせる。 また、哺乳類（例えば、ヒト等の霊長類）ＣＸＣＲ３タンパク質に特有の結合 活性、シグナル伝達活性および／または細胞応答刺激等の機能の１以上を阻害可 能な抗体も本発明の範疇にある。１つの態様において、本発明の抗体は、リガン ド（即ち、１以上のリガンド）の哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質への結合を阻害す ることおよび／またはリガンド結合に応答して哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質によ り媒介される１以上の機能を阻害することができる。特に好ましい態様において 、抗体は、ＩＰ−１０および／またはＭｉｇ等の天然のリガンドと受容体との相 互作用を阻害（低減または妨害）することができる。例えば、本明細書に示され たように、本発明の抗体は、ヒトＣＸＣＲ３タンパク質とＩＰ−１０との相互作 用を選択的に阻害および／またはそれに応答して受容体機能（例えば、シグナル 伝達活性および／または細胞応答）を選択的に阻害することができる。この選択 性を発揮する１Ｃ６と称される抗体は、ＩＰ−１０のヒトＣＸＣＲ３タンパク質 への結合ならびにＩＰ−１０により誘導されるカルシウム流動および走化性を阻 害することができるが、同一条件下でのＭｉｇにより誘導されるカルシウム流動 を有意に阻害しない。本明細書に示されるように、追加の抗体は、用いた条件下 でＭｉｇ誘導性シグナル伝達を阻害しなかったけれども、これらの抗体は、ＣＸ ＣＲ３へのＩＰ−１０結合（３Ａ８、２Ｆ８、３Ａ１２、３Ｅ２、４Ｂ４、４Ｄ ２、５Ｂ１２、７Ｂ８および８Ｄ５等）またはＩＰ−１０により誘導される走化 性（１Ａ５、３Ａ８、５Ｆ１０および１０Ｃ６等）を阻害可能であり、それらも またヒトＣＸＣＲ３タンパク質とＩＰ−１０との相互作用および／またはそれに 応 答した受容体機能の選択的阻害剤であることを示唆する。 特に好ましい態様において、本発明の抗体は、ヒトＣＸＣＲ３タンパク質に対 する特異性を有し、さらにより好ましくは、１Ｃ６と称するネズミモノクローナ ル抗体（ｍＡｂ）のエピトープ特異性と同一または類似であるエピトープ特異性 を有する。ｍＡｂ １Ｃ６のエピトープ特異性と同一または類似であるエピトー プ特異性を有する抗体は、エピトープ特異性をキャラクタライズするための１以 上の適当な技術を用いて同定することができる。例えば、ｍＡｂ １Ｃ６のエピ トープ特異性と同一または類似であるエピトープ特異性を有する抗体は、ヒトＣ ＸＣＲ３タンパク質またはその一部（例えば、活性化Ｔ細胞、ＮＫ細胞等のリン パ球または本発明の核酸を含有する組換え宿主細胞を含むヒトＣＸＣＲ３を産生 する細胞）への結合に関してネズミｍＡｂ １Ｃ６と競合する能力により同定す ることができる。１つの態様において、ｍＡｂ １Ｃ６のエピトープ特異性と同 一または類似であるエピトープ特異性を有する抗体は、適当なアッセイで、配列 番号：２の残基１−１５（「Ｐ１」）の配列と同一である配列を有するポリペプ チドの、抗体とヒトＣＸＣＲ３タンパク質との結合を阻害する能力によりさらに キャラクタライズされる（例えば、実施例８を参照のこと）。この態様の１つの 側面において、かかる抗体によるヒトＣＸＣＲ３タンパク質への結合は、配列番 号：２の残基１６−３０（「Ｐ２」）または３１−４５（「Ｐ３」）の配列と同 一である配列を有するポリペプチドにより有意に阻害されない。 本発明に包含される他の抗体は、ヒトＣＸＣＲ３タンパク質に結合可能な抗体 を含み、ここで、該結合は、Ｎ末端細胞外セグメントまたはその一部に対応する 配列番号：２の一部により阻害されうる。Ｎ末端細胞外セグメントの好適な部分 は、Ｎ末端を含有し、反応番号：２の残基１−３０、１−４５もしくは１−５８ の配列と同一である配列を有するポリペプチドまたは反応番号：２の残基１６− ３０もしくは４５−５８の配列と同一である配列を有するポリペプチド等のその セグメントのＮ末端、内部またはＣ末端部分を含む。好ましい態様において、か かる部分は、前記本明細書に規定された哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質、ここで哺 乳類はヒトである、の「少なくとも１つの免疫学的性質」を有する。例えば、配 列番号：２の残基１６−３０の配列と同一である配列を有するポリペプチドによ り結合が阻害されうるヒトＣＸＣＲ３タンパク質と反応する抗体が得られた（実 施例９）。 本発明の抗体はポリクローナル抗体であってもよいし、モノクローナル抗体で あってもよく、抗体という用語はポリクローナル抗体とモノクローナル抗体の両 方を包含するものとする。ポリクローナルおよびモノクローナルという用語は、 抗体標品の均一性の程度をいい、特定の製造方法に限定されることを意図されて いない。 本発明の抗体は、単離および／または組換え哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質また はその一部（合成ペプチドなどの合成分子を含む）等の本発明のタンパク質また はポリペプチドを含む適当な免疫原に対して生じさせることができる。さらに、 トランスフェクションされた細胞などの組換え哺乳類ＣＸＣＲ３を発現する細胞 を免疫原として使用したり、受容体を結合する抗体のスクリーニングに使用する ことができる。例えばチャンタラパイ（Chuntharapai）ら，J．Immunol．152:17 83-1789（1994）；およびチャンタラパイ（Chuntharapai）ら，米国特許第５， ４４０，０２１号明細書を参照のこと。 免疫感作抗原の調製ならびにポリクローナルおよびモノクローナル抗体の製造 は、任意の適当な技術で行なえる。様々な方法が記述されている（例えばKohler ら，Nature，256:495-497（1975）およびEur．J．Immunol．6:511-519（1976） ；Milsteinら，Nature 266:550-552（1977）；Koprowskiら，米国特許第4,172,1 24号；Harlow，E.およびD．Lane，1988，Antibodies:A Laboratory Manual，（C old Spring Harbor Laboratory:ニューヨーク州コールドスプリングハーバー） ：Current Protocols In Molecular Biology，第2巻（補遺27,94年夏）,Ausubel ，F.M.ら編（John Wiley & Sons:ニューヨーク州ニューヨーク）， 第11章（1991）を参照のこと）。一般的には、適当な不死化細胞株（例えばSP2/ 0のような骨髄腫細胞株）を抗体産生細胞と融合することによってハイブリドー マを作製することができる。抗体産生細胞、好ましくは脾臓またはリンパ節のも のは、目的の抗原で免疫感作した動物から得ることができる。選択培養条件を用 いて融合細胞（ハイブリドーマ）を単離し、限界希釈法でクローニングすること ができる。所望の特異性を持つ抗体を産生する細胞を適当なアッセイ（例えばEL ISA）で選択することかできる。 必要な特異性の抗体を製造または単離する他の好適な方法を使用することが可 能であり、例えば、ライブラリーから組換え抗体を選択する方法、またはヒト抗 体の全レパートリーを製造可能なトランスジェニック動物（マウス等）の免疫化 に依る方法を含む（例えば、Jakobovitsら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90:2 551-2555(1993);Jakobovltsら、Nature，362:255-258（1993）;Lonbergら、米国 特許第５，５４５，８０６号明細書;Suraniら、米国特許第５，５４５，８０７ 号明細書）。 単鎖抗体および異なる種に由来する部分を含有するキメラ、ヒト化もしくは霊 長類化（CDR移植）もしくはベニヤ化(veneered)抗体ならびにキメラまたはCDR移 植もしくはベニヤ化単鎖抗体なども本発明に包含され、「抗体」という用語に含 まれる。これらの抗体の様々な部分を、慣用の技術で化学的に結合するか、１ま たは複数のポリペプチドを遺伝子工学的技術を用いて連続的(cotiguous)タンパ ク質として調製することができる。本明細書で用いられる「ヒト化抗体または免 疫グロブリン」という用語は、異なる起源由来の免疫グロブリンの一部を含有す る抗体または免疫グロブリンをいい、少なくとも１つの部分がヒト起源のもので ある。したがって、本発明は、非ヒト起源（齧歯類等）の抗原結合領域およびヒ ト起源の免疫グロブリンの少なくとも一部（ヒト枠組み領域、ヒト定常領域また はその一部）を含有する、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質（ヒトＣＸＣＲ３タンパ ク質等）に結合特異性を有するヒト化抗体（その抗原結合断片を含む）に関す る。例えば、ヒト化抗体は、化学的に結合するか遺伝子工学的技術を用いて連続 的ポリペプチドとして調製された、必要な特異性を有する非ヒト起源の免疫グロ ブリン（非ヒトマウス可変領域等）およびヒト起源の免疫グロブリン配列（ヒト 定常領域またはその一部等）に由来する部分を含有することができる。本発明の ヒト化抗体の別の例は、１以上の免疫グロブリン鎖を含有する免疫グロブリンで あり、前記免疫グロブリンは、非ヒト起源のＣＤＲ（非ヒト起源の抗体に由来す る１以上のＣＤＲ等）およびヒト起源の軽鎖および／または重鎖に由来する枠組 み領域（枠組み変化有無のＣＤＲ移植抗体等）を含有する。この態様の１つの側 面において、免疫グロブリンは、非ヒト免疫グロブリンの軽鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ１ 、ＣＤＲ２およびＣＤＲ３）ならびに重鎖ＣＤＲ（ＣＤＲ１、ＣＤＲ２およびＣ ＤＲ３）を含有する。１つの態様において、ヒト化免疫グロブリンは、ｍＡＢ １Ｃ６のエピトープ特異性と同一または類似のエピトープ特異性を有する。好ま しい態様において、ヒト化免疫グロブリンの抗原結合領域は、ｍＡｂ １Ｃ６に 由来する。また、ヒト化抗体という用語は、単鎖抗体をも包含する。例えば、例 えば、キャビリー(Cabilly)ら、米国特許第４，８１６，５６７号明細書；キャ ビリーら、欧州特許第０，１２５，０２３ Ｂ１号明細書；ボス(Boss)ら、米国 特許第４，８１６，３９７号明細書；ボスら、欧州特許第０，１２０，６９４ Ｂ１号明細書；ニューバーガー(Neuberger，M．S.)ら、国際公開第８６／０１５ ３３号パンフレット；ニューバーガーら、欧州特許第０，１９４，２７６ Ｂ１ 号明細書；ウインター(Winter)、米国特許第５，２２５，５３９号明細書；ウイ ンター、欧州特許第０，２３９，４００ Ｂ１号明細書；クィーン(Queen)ら、 欧州特許第０，４５１，２１６ Ｂ１号明細書；およびパドラン(Padlan，E．A. )ら、欧州特許出願第０，５１９，５９６ Ａ１号明細書を参照のこと。また、 霊長類化抗体に関しては、ニューマン(Newman，R.)ら、BioTechnology，10:1455 -1460（1992）を、単鎖抗体に関しては、ラドナー(Ladner)ら、米国特許第４， ９４６，７７８号明細書；およびバード(Bird，R．E.)ら、Science，242:423- 426(1988)）をも参照のこと。 さらに、キメラ、ヒト化、霊長類化、ベニヤ化または単鎖抗体の断片を含む抗 体の機能的断片も製造できる。上述の抗体の機能的断片は、それらが由来する完 全長抗体の結合機能および／または調節機能の少なくとも１つを保持する。例え ば、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはその一部に結合できる抗体断片は、Fv、 Fab、Fab'およびF(ab')₂断片を含めて本発明に包含されるが、これらに限られる わけではない。かかる断片は、酵素的切断や組換え技術によって生産できる。例 えばパパインまたはペプシン切断によって、それぞれFabまたはF(ab')₂断片を生 成することができる。また、天然の終結部位の上流に１以上の終止コドンが導入 されている抗体遺伝子を用いて、様々な先端欠失型の抗体を生産することもでき る。例えば、F(ab')₂重鎖部分をコードするキメラ遺伝子を、重鎖のCH₁ドメイン およびヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように設計できる。 本発明の抗体は、研究的応用、診断的応用および治療的応用を含む種々の応用 に有用である。例えば、これらを使用して、受容体またはその一部を単離および ／または精製したり、受容体の構造（例えばコンフォメーション）および機能を 研究することができる。 また、本発明の抗体は、研究的応用および治療的応用において受容体機能を調 節するためにも使用できる。例えば、抗体は、（ａ）受容体に対する結合（例え ばリガンド、第２の阻害剤または促進剤の結合）、（ｂ）受容体シグナル伝達お よび／または（ｃ）細胞応答を阻害（減少または妨害）する阻害剤として作用で きる。受容体機能の阻害剤として作用する抗体は、リガンドまたは促進剤の結合 を直接または間接に（例えば、受容体におけるコンフォメーション変化を引き起 こすことによって）遮断できる。例えば抗体は、リガンドの結合を阻害すること によって、または（リガンドの結合の阻害を伴う、または伴わない）脱感作によ って、受容体機能を阻害できる。本発明の抗体は、活性化または刺激されたＴリ ンパ球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞等のエフェクター細胞のアンタゴ ニストとして使用したり、本明細書に記載されたＣＸＣＲ３機能の阻害剤で処置 可能な疾患または状態の治療（予防を含む）方法における使用が見出されうる。 ヒトＣＸＣＲ３タンパク質とＩＰ−１０との相互作用を選択的に阻害可能および ／またはそれに応答して受容体機能を選択的に阻害可能な抗体（ｍＡｂ １Ｃ６ 、ｍＡｂ １Ｃ６のエピトープ特異性と類似のエピトープ特異性を有する抗体等 ）は、ＩＰ−１０−ＣＸＣＲ３相互作用により媒介される疾患または障害の治療 に特に有用である。例えば、乾癬、炎症性腸疾患、腎炎および多発性硬化症等の 炎症状態は、特に治療に影響を受けやすい。 驚くべきことに、ｍＡｂ １Ｃ６は、混合リンパ球反応（ＭＬＲ）で評価され たように、Ｔ細胞活性化を阻害する。したがって、Ｔ細胞活性化を阻害しうるｍ Ａｂ １Ｃ６および他の抗ＣＸＣＲ３抗体を用いて、Ｔ細胞活性化ならびにサイ トカイン産生、細胞傷害性Ｔ細胞殺傷および／またはＴ細胞のヘルパーの供給等 の活性化に関連した１または複数の機能を阻害することができる。本明細書に記 載された治療または予防方法に使用した場合、かかる抗体は、さらにＴ細胞活性 化を阻害する付加的な有利性を有しうる。かかる抗体は、同種移植片拒絶または 移植片対宿主病またはＴ細胞の活性化の阻害か望まれる他の疾患もしくは状態を 含む移植片拒絶（例えば、移植における）を治療するための治療剤として、特に 魅力がある。 また、受容体を結合する抗体は、受容体に結合した際に、シグナル伝達および ／または細胞応答（カルシウム流動、走化性、エキソサイトーシスまたは前炎症 媒介物質放出等）等の受容体機能を誘発するまたは刺激する、受容体機能のアゴ ニストとして作用することもできる。したがって、かかる抗体を、活性化または 刺激されたＴリンパ球およびナチュラルキラー（ＮＫ）細胞等のエフェクター細 胞のアゴニストとして使用したり、本明細書に記載されたＣＸＣＲ３機能の促進 剤で処置可能な疾患または状態の治療（予防を含む）方法における使用が見出さ れうる。 さらに、本発明の種々の抗体を用いて、例えば活性化Ｔリンパ球またはナチュ ラルキラー細胞（ＮＫ細胞）等の白血球または受容体遺伝子でトランスフェクシ ョンされた細胞における受容体の発現を検出または測定することもできる。した がってこれらの抗体は、診断または研究目的の細胞選別（例えばフローサイトメ トリー、蛍光活性化細胞選別）などの応用にも有用である。 抗イディオタイプ抗体も提供される。抗イディオタイプ抗体は、別の抗体の抗 原結合部位に関連する抗原決定基を認識する。抗イディオタイプ抗体は、同一の 種の動物を免疫することにより第１の抗体に対して調製され、第１抗体を生産す るのに使用した動物と同じ種、好ましくは第１の抗体を製造するために用いた動 物と同じ株の動物を前記第１の抗体で免疫感作することによって調製できる。例 えば米国特許第4,699,880号明細書を参照のこと。 １つの態様において、抗体を受容体またはその一部に対して生じさせ、今度は これらの抗体を免疫原として使用して抗イディオタイプ抗体を生産する。そのよ うにして生産した抗Idは、受容体を模倣して、例えばリガンド、受容体機能の阻 害剤または促進剤などの受容体を結合する化合物を結合でき、かかる化合物を検 出、同定または定量するための免疫アッセイに使用できる。かかる抗イディオタ イプ抗体は受容体自体には結合しないが、受容体機能の阻害剤でもありうる。 抗イディオタイプ（すなわち抗Id）抗体自体を使用して抗イディオタイプ抗体 （すなわち抗-抗Id）を生じさせることができる。かかる抗体は最初の免疫感作 抗体と特異性が似ているか同一でありうる。１つの態様において、受容体への結 合を遮断する抗体アンタゴニストを用いて抗Idを生じさせ、その抗Idを用いて、 その抗体アンタゴニストと類似するか同一の特異性を持ちうる抗-抗Idを生じさ せることができる。これらの抗-抗Id抗体を受容体機能に対する阻害効果につい て評価することによって、それらがアンタゴニストであるかどうかを決定できる 。 単鎖およびキメラ、ヒト化、霊長類化（CDR移植）、ベニヤ化ならびにキメラ 、CDR移植またはベニヤ化単鎖抗イディオタイプ抗体を調製することが可能であ り、 これらは抗イディオタイプ抗体という用語に包含される。また、かかる抗体の抗 体断片も調製できる。 本発明の抗体および断片は、例えば放射性同位体、スピン標識、抗原もしくは 酵素標識、蛍光もしくは化学発光基などの検出可能な標識の取り込みまたは付着 （直接または間接）により修飾することが可能であり、かかる修飾型は、本発明 の範疇に含まれる。リガンド、受容体機能の阻害剤または促進剤の同定 本明細書において、リガンドは、受容体タンパク質を結合する物質である。選 択された哺乳類CXCR3タンパク質のリガンドは、選択された哺乳類CXCR3タンパク 質に結合する物質である。好ましい態様として、哺乳類CXCR3タンパク質のリガ ンド結合は、高いアフィニティーで生じる。リガンドという用語は、限定されな いが、天然リガンド、単離および／または精製された、合成および／または組換 え体、天然リガンドのホモログ（例えば別の哺乳類由来のもの）、抗体、かかる 分子の一部ならびに受容体を結合する他の物質などの物質を意味する。選択した 哺乳類受容体の天然リガンドは生理学的条件下でその受容体に結合でき、哺乳類 CXCR3タンパク質のものと同じ哺乳類起源のものである。リガンドという用語は 、受容体活性の阻害剤または促進剤である物質ならびに選択的に受容体に結合す るが阻害剤活性や促進剤活性を欠く物質を包含する。 本明細書で用いられるように、阻害剤は、哺乳類CXCR3タンパク質（例えばヒ トCXCR3など）に特有の機能、例えば結合活性（例えば、リガンド結合、促進剤 結合など）、シグナル伝達活性（哺乳類Gタンパク質の活性化、サイトゾル遊離 カルシウム濃度[Ca²⁺]_iの迅速かつ一過性の増加の誘導など）、および/または細 胞応答機能(例えば、走化性、エキソサイーシスまたは白血球による炎症媒介物 質の放出の刺激)などの少なくとも1つを阻害する物質である。阻害剤という用語 は、受容体を結合するアンタゴニスト（例えば、抗体、天然リガンドの突 然変異体、その他のリガンド結合の競合的阻害剤）および受容体に結合すること なく受容体機能を阻害する物質（例えば抗イディオタイプ抗体）を含む物質を意 味する。 本明細書で用いられるように、促進剤は、哺乳類CXCR3タンパク質（例えば、 ヒトCXCR3など）に特有の機能、例えば結合活性（リガンド、阻害剤および/また は促進剤結合など）、シグナル伝達活性（哺乳類Gタンパク質の活性化、サイト ゾル遊離カルシウム濃度[Ca²⁺]_iの迅速かつ一過性の増加の誘導など）、および/ または細胞応答機能(例えば、走化性、エキソサイトーシスまたは白血球による 炎症媒介物質の放出の刺激)などの少なくとも1種を促進（誘導または増大）する 物質である。促進剤という用語は、受容体を結合するアゴニスト（例えば抗体、 別の種に由来する天然リガンドのホモログ）および受容体に結合することなく受 容体機能を（例えば関連するタンパク質を活性化することによって）促進する物 質を含む物質を意味する。好ましい態様として、該アゴニストは天然のリガンド のホモログ以外のものである。 本発明の核酸およびタンパク質をあてにする下記のアッセイは、単独または相 互にもしくは他の適切な方法と組み合わせて、哺乳類CXCR3タンパク質または改 変体のリガンド、阻害剤または促進剤を同定するために使用されうる。本発明の イン・ビトロ方法は、多くの試料を処理する高処理のスクリーニング(例えば、9 6ウェルフォーマット)に適合しうる。本発明の核酸を含み、組換え哺乳類CXCR3( 例えば、ヒトCXCR3など)を高処理のスクリーニングに適するレベルで発現する宿 主細胞を用いることができ、したがって、哺乳類CXCR3タンパク質のリガンド、 阻害剤および促進剤の同定および／または単離に特に価値がある。受容体の発現 を多様な方法でモニターすることができる。例えば、受容体またはその一部を結 合する本発明の抗体を用いて発現をモニターすることができる。また、市販の利 用可能な抗体を用いて、受容体タンパク質またはポリペプチドを含む抗原標識- またはエピトープ標識-融合タンパク質（例えばFLAG標識受容体）の発 現を検出することもでき、所望のレベルで発現する細胞を選択することができる 。 哺乳類CXCR3タンパク質をコードする核酸を発現系に組み込んで前記した受容 体タンパク質またはポリペプチドを生産することができる。例えば本発明の核酸 を含む構築物で安定にもしくは一過性にトランスフェクトした細胞中で発現した 受容体または受容体を含有する細胞画分（例えばトランスフェクト細胞の膜画分 、受容体を組み込んだリポソーム）中の受容体などの単離および/または組換え 受容体タンパク質もしくはポリペプチドを、受容体機能の試験に使用することが できる。所望であれば、その受容体をさらに精製することもできる。受容体機能 の試験は、イン・ビトロまたはイン・ビボで行なうことができる。 本明細書記載の受容体機能をモニターすることによりまたは他の適切な技術を 用いることにより、化合物の効果を評価する本発明の方法に、図2(配列番号:2) に示されるヒトCXCR3などの単離および／または組換え哺乳類CXCR3タンパク質を 使用することができる。例えば、実施例2記載のものまたは他の適切な細胞(例え ば、バキュロウイルス感染Sf9細胞、マウスIL-2前B細胞[前Bリンパ腫由来、オイ ゲン・ブッチャー(Eugene Butcher)博士(スタンフォード大学，スタンフォード ，カリフォルニア)]などの安定なまたは一過性のトランスフェクタントを結合ア ッセイに用いることができる。Jurkat細胞の安定なトランスフェクタント（実施 例2）または走化性を行ないうる他の適切な細胞の安定なトランスフェクタント （例えばマウスL1-2前B細胞）は、例えば走化性アッセイに用いることができる 。 本発明の方法によれば、化合物を個別にスクリーニングすることもできるし、 1以上の化合物を本明細書記載の方法に従って同時に試験することもできる。化 合物の混合物を試験する場合、記載された過程で選択された化合物を、適切な方 法（例えばPCR、配列決定、クロマトグラフィー）で（適宜）分離、同定するこ とができる。試験試料中の1以上の化合物（リガンド、阻害剤、促進剤など）の 存在も、これらの方法によって決定できる。 複合化学合成や他の方法で作製された大きな複合化合物ライブラリー（例えば 有機化合物、組換えまたは合成ペプチド、「ペプトイド」、核酸）を試験するこ とができる［例えばZuckerman，R．N．et al.，J．Med．Chem.，37:2678-2685(1 994)とそこに引用されている文献を参照のこと;また、Ohlmeyer，M．H．J．et a l．，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:10922-10926(1993)とDeWitt，S．H．et a l.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:6909-6913(1993)(標識した化合物について );Rutter，W.J．et al.，米国特許第5,010,175号明細書，Huebner，V.D．et al. ,米国特許第5,182,366号明細書，Geysen，H.M.，米国特許第4,833,092号明細書 をも参照のこと）。本発明方法によって複合ライブラリーから選択される化合物 が独自の標識を持つ場合は、クロマトグラフィー法による個々の化合物の同定が 可能である。 １つの態様において、ファージディスプレイ法を使用する。例えば、受容体結 合（例えば適切な結合緩衝液において）に適した条件下でポリペプチドを呈示す るファージ（例えばファージまたはライブラリーのようなファージの収集物）と 受容体を接触させることができる。受容体に結合したファージを、標準的な技術 または他の適切な方法で選択できる。ファージは適当な溶出緩衝液を用いて受容 体から分離できる。例えば、イオン強度やpHの変化はファージの放出をもたらし うる。別法として、溶出緩衝液が、化合物の結合を破壊するように設計された1 または複数の放出成分[結合を競合的に阻害するリガンド、阻害剤および／また は促進剤などの例えば呈示されたペプチドと受容体との結合を破壊できる1以上 の化合物]を含んでもよい。任意に、この選択過程を繰り返すか、別の選択過程 を用いることによって、受容体に結合するファージをさらに濃縮することもでき る。呈示されたポリペプチドを（例えばファージDNAの配列決定などによって） 特徴づけることができる。同定されたポリペプチドを生産し、さらにリガンド結 合機能、阻害剤機能および/または促進剤機能について試験することができる。 増大した安定性や他の望ましい特性を持つかかるペプチドの類縁体を製造できる 。 １つの態様において、ランダムな配列の核酸によりコードされるN-末端ペプチ ドを有するコートタンパク質を含む融合タンパク質を発現し、それを呈示するフ ァージを生産できる。本発明の受容体タンパク質またはポリペプチドを発現する 適切な宿主細胞を該ファージと接触させ、結合したファージを選択し、回収し、 特徴づける。（例えば、Gタンパク質共役受容体を用いるファージディスプレイ 法について議論しているDoorbar，J．およびG．Winter，J．Mol．Biol.，244:36 1（1994）を参照のこと）。 哺乳類CXCR3タンパク質の潜在的リガンド、阻害剤および/または促進剤の他の 供給源としては、限定されないが、IP-10またはMigの天然、合成または組換え改 変体を含むCXCR3リガンドの改変体、他の化学誘引物質またはケモカイン類など の物質、その改変体、他の阻害剤および／または促進剤(例えば、抗CXCR3抗体、 アンタゴニスト、アゴニスト)、他のGタンパク質共役受容体リガンド、阻害剤お よび／または促進剤(例えば、アンタゴニストまたはアゴニスト)、および受容体 機能を阻害しうる適切な受容体ペプチドまたはアナログなどの哺乳類CXCR3受容 体の可溶性部分が挙げられる（例えばMurphy,R.B.,国際公開第94/05695号パンフ レットを参照のこと）。結合アッセイ 本発明の単離および/または組換え受容体タンパク質もしくはその機能的改変 体、その一部または適当な融合タンパク質は、ヒトCXCR3などの（1以上の）哺乳 類CXCR3タンパク質に結合する薬剤、およびリガンドあるいは受容体活性の潜在 的阻害剤または促進剤である薬剤を選択および同定する方法に使用できる。この 方法によって選択される、リガンド、阻害剤または促進剤を含む薬剤を、受容体 機能に対する阻害または刺激効果および/または治療的用途についてさらに評価 できる。 1つの態様において、活性な単離および/または組換え哺乳類CXCR3タンパク 質またはポリペプチドに結合する化合物を該方法で同定する。この態様では、使 用する受容体タンパク質またはポリペプチドが、哺乳類CXCR3タンパク質（本明 細書規定）に特有の例えば結合活性(例えば、リガンド、阻害剤および／または 促進剤結合)、シグナル伝達活性（哺乳類Gタンパク質の活性化、サイトゾル遊離 カルシウム濃度[Ca²⁺]_iにおける迅速かつ一過性の増加の誘導）、細胞応答機能 （例えば、走化性、エキソサイトーシスまたは白血球による炎症媒介物質放出の 刺激など）、および/または本明細書に規定された免疫学的性質などの少なくと も1種の性質、活性または機能を有する。好ましい態様において、単離および/ま たは組換え哺乳類CXCR3タンパク質または改変体は、リガンド結合機能を持ち、 さらに好ましくは、受容体の天然リガンドを結合する。特に好ましい態様として 、該単離および／または組換えタンパク質は、図1に示された核酸によりコード されたヒトCXCR3タンパク質である（配列番号:1）。 例えば、結合に適する条件下に単離および／または組換え哺乳類CXCR3タンパ ク質またはその改変体を含有する組成物を維持することができ、受容体は、試験 対象の薬剤（例えば、1以上の薬剤を含有する組成物）に接触させることができ 、結合を検出もしくは測定できる。1つの態様として、本発明の受容体をコード する核酸配列を含有する構築物で安定にもしくは一過性にトランスフェクトした 細胞で、受容体タンパク質を、発現させることができる。細胞を受容体の発現に 適切な条件下に維持しうる。結合に適する条件下（例えば適切な結合緩衝液など ）に該細胞を薬剤と接触させ、結合を標準技術により検出することができる。例 えば、結合の程度は、適切な対照と比較して（例えば、薬剤の非存在下に決定し たバックグラウンドと比較、第2薬剤の結合と比較（すなわち標準）、トランス フェクトしていない細胞への薬剤の結合を比較など）決定されうる。任意に、受 容体を含む膜画分などの細胞画分を全細胞の代わりに用いることができる。 結合または複合体形成を直接または間接に検出することができる。1つの態様 において、薬剤を適切な標識（例えば蛍光標識、化学発光標識、同位体標識、酵 素標識）で標識し、その標識の検出によって結合を決定することができる。結合 の特異性は、例えば非標識薬剤またはリガンド（例えば、IP-10、Migなど）を競 合剤として用いる競合または置換によって評価できる。 哺乳類受容体のリガンドは、同じ哺乳類種由来の天然リガンドまたは別の種由 来の天然リガンドを含めて、この方法で同定できる。受容体を結合する促進剤ま たは阻害剤の結合活性も、かかるリガンド結合アッセイで評価できる。 結合阻害アッセイを用いて、リガンドならびに受容体に結合し、リガンドなど 他の薬剤の結合を阻害する阻害剤および促進剤を同定することもできる。例えば 、第2の試験薬剤の存在下での第1の薬剤の結合に比べて、（第2の薬剤の非存在 下で起こる）第1の薬剤の結合の減少を検出または測定する結合アッセイを行な うことができる。受容体を第1および第2の薬剤と同時に接触させてもよいし、逐 次順番は問わずに接触させてもよい。第2試験薬剤の存在下で起こる第1薬剤の結 合の程度の減少は、第2薬剤による結合の阻害の指標となる。例えば、第1薬剤の 結合が減少したり、妨げられたりされうる。 1つの態様において、ヒトCXCR3に対する第1薬剤（例えばIP-10、Migなどのケ モカイン）の結合の第2の試験薬剤による直接阻害をモニターする。例えば、ヒ トCXCR3への¹²⁵I-標識Migの結合を阻害する薬剤の能力をモニターしうる。かか るアッセイは、例えば、全細胞（例えばヒトCXCR3受容体をコードする核酸を含 む適切な細胞株）または該細胞由来の膜画分を用いて行なうことができる。 受容体を結合する1もしくは複数の薬剤の存在を同定する他の方法も利用でき 、例えば、シグナル伝達機能および/または細胞応答の刺激などを含む、受容体 結合によって誘発される事象をモニターする方法である。 本発明の抗体の阻害効果を結合阻害アッセイで評価できることは理解されるだ ろう。また、該アッセイにおける第1薬剤が別の抗体である方法で、抗体結合に 適した条件下に、受容体結合に関する抗体間の競合を評価できる。 この方法で同定されるリガンド、受容体結合阻害剤および促進剤をさらに評価 して、結合に引き続いて、それらがCXCR3受容体の他の機能を阻害または活性化 するように作用するかどうかを決定すること、および／または、それらの治療的 有用性を評価することができる。シグナル伝達アッセイ Gタンパク質共役受容体の（アゴニストなどによる）結合は、該受容体による シグナル伝達をもたらすことができ、Gタンパク質の活性化を刺激する。薬剤に よるシグナル伝達機能の誘導は、いかなる適切な方法をも用いてモニターできる 。例えば、GTPからGDPへの加水分解、または受容体結合により誘発される後期の シグナル伝達事象、例えば、細胞内（サイトゾル）遊離カルシウム濃度[Ca²⁺]_i の迅速かつ一過性の増加の誘導などを、当該分野公知の方法または他の適切な方 法で評価できる（実施例2;Neote，K.et al.，Cell，72:415-425 1993）Van Ripe r et al.，J．Exp．Med.，177:851-856(1993);Dahinden，C.A．et al.，J．Exp ．Med.，179:751-756（1994）をも参照のこと）。 ハイブリッドGタンパク質共役受容体を用いるSledziewskiらの機能アッセイを 用いて、ハイブリッドGタンパク質を活性化するその能力によりリガンドもしく は促進剤を同定すること、またはかかる活性化を阻害するその能力により阻害剤 を同定することも可能である（Sledziewskiら，米国特許第5,284,746号明細書； その教示は参照により本明細書に合体される）。1つの態様として、試験試料中 のリガンドの存在の指標である応答の検出で、（ハイブリッド受容体への結合に より誘発される）宿主細胞の生物学的応答がモニターされうる。例えば、試験試 料中の、受容体のリガンド−結合ドメインにより結合されうる薬剤であるリガン ドの存在を検出する方法が記載される。本方法の１つの態様として、酵母宿主細 胞を、生物学的に活性なハイブリッドGタンパク質共役受容体（即ち、融合タン パク質）の発現を仕向けることが可能なDNA構築物で形質転換する。該ハイブリ ッド受容体は、STE2遺伝子産物などの酵母Gタンパク質共役受容体の対応す るドメインと置換されたリガンド結合ドメイン以外の少なくとも1種のドメイン を有する哺乳類Gタンパク質共役受容体を含有する。構築物を含む酵母宿主細胞 をハイブリッド受容体が発現する条件下に維持し、該細胞をリガンドのハイブリ ッド受容体への結合を可能にするに適した条件下に試験試料と接触させる。（ハ イブリッド受容体への結合により誘発される）宿主細胞の生物学的応答がモニタ ーされ、応答の検出はシグナル伝達機能の指標となる。例えば、STE2遺伝子産物 由来のハイブリッド受容体への結合がBAR1プロモーターの誘導をもたらすことが できる。該プロモーターの誘導は、BAR1プロモーターに連結され第2の構築物で 宿主細胞に導入されるレポーター遺伝子（例えば、β-galなど）を利用して測定 される。該リポーター遺伝子の発現は、例えば細胞溶解液に対するイン・ビトロ 酵素検定によって、あるいは培地に指示薬（例えば、X-galなど）を含む平板で の青色コロニーの存在によって検出できる。 他の態様において、該アッセイを用いて受容体機能の潜在的阻害剤を同定する ことができる。ある薬剤の阻害活性は、該アッセイでリガンドまたは促進剤を用 い、リガンドまたは促進剤によって誘導される活性を阻害する試験薬剤の能力を 評価することによって決定できる。 既知リガンドの改変体を、共役Gタンパク質の活性を刺激する能力の減少（減 少した能力または能力がない）についてスクリーニングすることもできる。この 態様では、薬剤は（他の方法で決定したように）リガンド結合活性を持つが、受 容体の連動が共役Gタンパク質の活性を誘発しないか、わずかにしか誘発しない 。かかる薬剤は潜在的アンタゴニストであり、さらに阻害活性を評価することが できる。走化性および細胞応答の他のアッセイ 受容体機能を評価するため走化性アッセイも使用できる。これらのアッセイは 薬剤によって誘発されるイン・ビトロまたはイン・ビボの細胞の機能的移動に基 づいており、これらのアッセイを用いてリガンド、阻害剤または促進剤の結合お よび/または走化性への効果を評価できる。 IP-10およびMigに対する細胞の応答を評価するためのイン・ビトロ走化性アッ セイの使用を実施例2に記述する。Springerらは経内皮リンパ球走化性アッセイ について記述している（Springerら，国際公開第94/20142号パンフレット,1994 年9月15日公開；その教示は参照により本明細書に合体される；さらにBermanら ，Immunol Invest．17:625-677（1988）も参照のこと）。内皮を横切るコラーゲ ンゲルへの移動も記述されている（Kavanaughら，J．Immunol，146:4149-4156（ 1991））。 一般に走化性アッセイでは、障壁の第1表面から反対側の第2表面に向かって、 薬剤の増加レベルにそって障壁（内皮、フィルターなど）内へ、または障壁を通 過して移動する、走化性の能力を有する適切な細胞、例えば白血球など（Tリン パ球、NK細胞、単球など）、Jurkat細胞、マウスIL-2前B細胞、または他の適切 な宿主細胞の安定なトランスフェクタントの指向的な運動または移動をモニター する。膜やフィルターは、フィルターの第1表面からフィルターの反対側の第2表 面の方向に増大する薬剤レベルに向かってフィルター内に、またはフィルターを 通過して移動する、適切な細胞の指向的運動または移動をモニターするのに便利 な障壁を提供する。いくつかのアッセイでは、ICAM-1、フィブロネクチンまたは コラーゲンなどの接着を容易にする物質で膜をコートする。 例えば、適切な容器（含有手段）内で、第1チャンバーから第2チャンバー中へ の、もしくは細孔膜を通過して、試験対象の薬剤を含有し、膜によって第1チャ ンバーから隔離された第2チャンバーへの細胞の移動を検出または測定できる。 薬剤に応答して起こる特異的な移動をモニターするに適した孔サイズを持つ適切 な膜、例えばニトロセルロース、ポリカーボネートなどを選択する。例えば約3 〜8ミクロン、好ましくは約5〜8ミクロンの孔サイズを使用できる。フィルター 上の孔サイズは均一であってもよいし、適切な孔サイズの範囲に分布して いてもよい。 移動を評価するため、フィルターへの移動距離、フィルターを横切ってフィル ターの第２表面に接着している細胞数および/または第2チャンバー中に蓄積する 細胞数を標準的な技術（例えば顕微鏡）を用いて決定できる。1つの態様におい て、細胞を検出可能な標識（例えば放射性同位体、蛍光標識、抗原またはエピト ープ標識）で標識し、膜に接着したその標識および/または第2チャンバー中に存 在するその標識の存在を適切な方法で（例えば放射活性や蛍光を検出するか、免 疫アッセイで）決定することによって、移動を評価できる。薬剤によって誘発さ れる移動の程度を、適切な対照と比較して（例えば薬剤の非存在下に決定したバ ックグラウンド移動と比較して、第2の薬剤（すなわち標準）によって誘発され る移動の程度と比較して、その薬剤によって誘発される非トランスフェクト細胞 の移動と比較して）決定することができる。 チャンバーは、プラスチック、ガラス、ポリプロピレン、ポリスチレンなど、 種々の固体で形成することができる。チャンバーから取り外せる膜、例えばBioc oat（Collaborative Biomedical Products）やTranswell（Costar，マサチュー セッツ州ケンブリッジ）培養インサートなどは、接着細胞の計数を容易にする。 容器には、第1チャンバー内の細胞を含む液体と第2チャンバー内の液体に接触す るようにフィルターを設置することができる。試験薬剤またはアッセイの目的の ために存在する追加のリガンド、阻害剤もしくは促進剤以外は、膜の両側の液体 が好ましくは同じであるか、実質的に類似している。チャンバー内の液体は、細 胞の安定性を増大させ、細胞の非特異的結合を阻害するように作用するタンパク 質溶液（例えばウシ血清アルブミン、ウシ胎児血清、ヒト血清アルブミン）およ び/または培養培地を含みうる。 1つの態様として、経内皮移動を評価する。より低いバックグラウンド(ノイズ に対するシグナル割合)に加え、経内皮移動は、血管壁に沿う内皮細胞層を横切 ることにより白血球が炎症部位の組織に存在する化学誘引剤に向かって血管か ら移出するイン・ビボ条件をモデルにする。この態様では、内皮細胞層を通過す る遊出を評価する。細胞層を調製するため、内皮細胞の接着を促進するように任 意にコラーゲン、フィブロネクチンまたは他の細胞外マトリックスタンパク質な どの物質でコートされた細孔フィルターまたは膜上で内皮細胞を培養できる。好 ましくは、コンフルエントな単層が生成するまで内皮細胞を培養する。例えば静 脈、動脈または微小血管内皮、例えば、ヒト請静脈内皮細胞（Clonetlcs Corp， サンディエゴ，カリフォルニア州）などや適切な細胞株、例えば、用いられたEC V304細胞株(European Collection of Animal Cell Cultures，Porton Down，Sal isbury，U.K.)などの多様な哺乳類内皮細胞が単層形成に利用できる。特定の哺 乳類受容体に応答して起こる走化性を検定するために、同じ哺乳類の内皮細胞が 好ましい;しかしながら、異なる哺乳類種または属由来の内皮細胞も使用できる 。 一般的には、フィルターの第1表面からフィルターの反対側の第2表面に向かっ て、薬剤のレベルが増大する方向に、膜またはフィルター内へ、または膜または フィルターを通過して移動する細胞の指向的移動を検出することによって、この アッセイを行ない、そのフィルターは第1表面に内皮細胞層を含む。指向的移動 は第1表面に隣接する領域から膜内へ、または膜を通過して、フィルターの反対 側に置かれた薬剤に向かって起こる。第２表面に隣接する領域に存在する薬剤の 濃度は、第1表面に隣接する領域に存在する薬剤の濃度より大きい。 1つの態様において、薬剤のリガンドまたは促進剤活性の試験に走化性アッセ イを用い、移動能を持ち哺乳類CXCR3タンパク質またはその機能的改変体を発現 できる細胞を含む組成物を第1チャンバーに入れ、好ましくは第1チャンバー内の 細胞の走化性を誘導できる（化学誘引機能を持つ）他のリガンドや促進剤の非存 在下に、試験対象の薬剤(1以上の薬剤)を含む組成物を第2チャンバーに入れる。 しかしながら、化学誘引機能を持つ1以上のリガンドまたは促進剤が存在しても よい。本アッセイで哺乳類CXCR3受容体を発現する細胞の走化性を誘導する 薬剤の能力は、薬剤が受容体機能のリガンドまたは促進剤であることの指標であ る。 阻害剤の試験に使用する１つの態様において、移動能を持ち、哺乳類CXCR3タ ンパク質または機能的改変体を発現できる細胞を含む組成物を第1チャンバーに 入れる。第1チャンバー内の細胞の走化性を誘導できる（化学誘引機能を持つ） リガンドまたは促進剤を含む組成物（すなわち１以上のリガンドまたは促進剤） を第2チャンバーに入れる。細胞を第1チャンバーに入れる前（好ましくは直前） か、細胞と同時に、試験対象の薬剤を含む組成物を、好ましくは第1チャンバー に入れる。このアッセイで哺乳類CXCR3タンパク質を発現する細胞のリガンドま たは促進剤誘導走化性を阻害する薬剤の能力は、薬剤が受容体機能の阻害剤（例 えば、細胞応答機能の阻害剤）であることの指標である。試験薬剤の存在下に、 リガンドまたは促進剤によって誘導された移動の程度の減少は、阻害活性の指標 となる。別個に結合試験（上記参照）を行なって、阻害が受容体に対する試験薬 剤の結合の結果であるのか、それとも異なる機構によって起こるのかを決定する こともできる。 組織に対する薬剤の注射に応答して起こる組織の白血球浸潤をモニターするイ ン・ビボアッセイを後述する。これらのモデルでは、炎症部位への移動および走 化性によってリガンドまたは促進剤に応答する細胞の能力を測定する。 受容体を含有する適切な宿主細胞を用いて、活性な受容体により誘導される他 の細胞応答をモニターすることによって、CXCR3受容体の細胞応答機能に対する リガンド、阻害剤または促進剤の効果を評価することができる。同様に、これら のアッセイを用いて受容体の機能を決定することもできる。例えば、エキソサイ トーシス［例えば1以上の酵素または他の顆粒成分、例えば、エステラーゼ（例 えば、セリンエステラーゼ）、パーフォリンおよび／またはグランザイムなど） などの放出をもたらすナチュラルキラー細胞の脱顆粒］、炎症媒介物質放出［例 えばロイコトリエン類（ロイコトリエンC₄など）などの生理活性脂質の放出な ど］、ならびに呼吸バーストを、当該分野公知の方法や他の適切な方法で監視す ることができる。［例えば、顆粒誘導セリンエステラーゼの放出のアッセイに関 するTaub,D.D et al.，J．Inlmunol.,155:3877-3888(1995)（その教示は、参照 により本明細書中に取り込まれる）ならびにNK細胞および細胞傷害性Tリンパ球( CTLs)による酵素およびグランザイム放出のアッセイに関するLoetscher et al． ，J．Immunol.，156:322-327(1996)，(その教示は、参照により本明細書中に取 り込まれる);呼吸バーストに関するRot,A．et al.,J.Exp.Med.,176:1489-1495(1 992);Blschoff，S.C．ら，Eur．J．Immunol.，23:761-767（1993）ならびにBagg liolini，M．およびC.A．Dahinden，Immunology Today，15:127-133（1994）を 参照のこと。］ １つの態様において、脱顆粒またはエキソサイトーシス機能を持つ細胞による 脱顆粒またはエキソサイトーシス時の酵素放出をモニターすることによって、リ ガンド、阻害剤および/または促進剤を同定する。エキソサイトーシスまたは脱 顆粒を刺激することのできる活性な受容体タンパク質をコードする本発明の核酸 を含有する細胞を、適切な条件下に適切な培地中で維持し、それによって受容体 を発現させ、脱顆粒を誘発させうる。受容体を試験対象の薬剤と接触させ、酵素 放出を評価する。培地への酵素の放出は、免疫学的アッセイまたは酵素活性に関 する生化学的アッセイなど、適切な方法で検出または測定できる。 アッセイ成分（基質、補因子、抗体など）を培地に（例えば細胞と薬剤を合わ せる前、同時にもしくは後に）導入することによって、培地を直接的にアッセイ できる。別法として、アッセイに先立って細胞から分離し、さらに工程を経た（ 分画した）培地に対してアッセイを行なうこともできる。例えば、セリンエステ ラーゼなどの酵素の慣用のアッセイを利用できる［顆粒誘導セリンエステラーゼ の放出に関するTaub,D.D.et al.,J.Immunol.,155:3877-3888(1995)などを参照の こと］。 薬剤による脱顆粒の刺激は、薬剤が、哺乳類CXCR3タンパク質のリガンドまた は促進剤であることの指標となりうる。他の態様として、受容体を発現している 細胞は、リガンドまたは促進剤と組み合わされ、それより前、後、または同時に 試験対象の薬剤を添加し、脱顆粒が評価される。リガンド−促進剤−誘導脱顆粒 の阻害は、該薬剤が、哺乳類CXCR3タンパク質機能の阻害剤であることの指標で ありうる。 また、細胞接着は、当該分野に公知の方法または他の適切な方法によりモニタ ーされうる。リンパ球のケモカイン受容体の連動状態はインテグリン活性化、お よび脈管構造または末梢血管領域に発現した接着分子への接着の誘導を引き起こ しうる。1つの態様として、接着することができる細胞による細胞接着をモニタ ーすることにより、リガンド、阻害剤および／または促進剤を同定する。例えば 、試験対象の薬剤は、(a)受容体を発現する細胞（好ましくは受容体でトランス フェクトされたときに接着能を獲得する非接着性細胞）、(b)適切な接着分子を 含む組成物（例えば、フィブロネクチンなどの接着分子でコートされた培養ウェ ルなどの基質）、およびリガンドまたは促進剤（例えば、アゴニスト）と組み合 わされることができ、リガンドまた促進剤誘導接着に適する条件下に維持しうる 。蛍光色素による細胞の標識は、接着細胞を検出する簡便な方法を提供する。非 接着細胞は、（例えば、洗浄により）取り除くことができ、接着細胞の数が決定 する。リガンドまたは促進剤誘導接着を阻害するまたは増強することにおける薬 剤の効果は、それぞれ、阻害剤または促進剤活性の指標となりうる。該アッセイ に活性な薬剤としては、結合、シグナル伝達および／または細胞応答の阻害剤お よび促進剤があげられる。他の態様として、試験対象の薬剤は、リガンドまたは 促進剤誘導接着に適する条件下に受容体を発現する細胞と適切な接着分子を含む 組成物とに組み合わせられることができ、接着がモニターされる。適切な対照と 比較した増加した接着は、リガンドおよび／または促進剤の存在の指標となる。炎症のモデル 治療薬として、イン・ビボでのリガンド、阻害剤、または促進剤の効果を評価 するために用いられうる多様な炎症のイン・ビボモデルが利用でき、ヒツジ喘息 モデル[例えば、Weg，V．B．et al.，J．Exp．Med.，177:561(1993)を参照のこ と、その教示は、参照により本明細書に取り込まれる]、ラット遅延型過敏モデ ル[Rand，M.L．et al.，Am.J.Pathol.，148:855-864(1996)、その教示は、参照 により本明細書に取り込まれる]または、他の適切なモデルがあげられる。他の 哺乳類CXCR3タンパク質と交差反応する抗体の活性をかかる哺乳類で評価するこ とができる。 また、ウサギ、ラット、モルモットなどの適切な動物に薬剤を皮膚内注射した 時の白血球浸潤もモニターできる［例えばVan Damme J.ら，J．Exp．Med.，176: 59-65（1992）、Zachariae，C.O.C．ら，J．Exp．Med．171:2177-2182（1990） 、Jose，P.J.ら，J．Exp．Med．179:881-887（1994）を参照のこと］。1つの態 様において、皮膚生検を白血球（Tリンパ球、単球、ナチュラルキラー細胞など ）の浸潤について組織学的に評価する。もう1つの態様として、走化性を持ち管 外溢出能を持つ標識細胞（例えば、¹¹¹Inで標識された哺乳類CXCR3タンパク質を 発現する細胞）を動物に投与する。試験試料（例えば適切な緩衝液または生理学 的担体中の試験対象の薬剤）の注射部位に近接して起こる標識細胞の浸潤が、そ の試料中のリガンドまたは促進剤、例えば、アゴニストなどの存在の指標となる 。これらのアッセイを改良して、走化性と白血球管外溢出の阻害剤を同定するこ ともできる。例えば、リガンドまたはアゴニストを試験動物に投与する前、後も しくは同時に、阻害剤を投与できる。阻害剤の非存在下での浸潤の程度に比べて 、阻害剤の存在下で浸潤の程度の減少が阻害の指標である。診断的用途 本発明は様々な診断的用途を持つ。例えば、哺乳類CXCRタンパク質をコードす る遺伝子の1もしくは複数の変異は、コードされる受容体の機能の少なくとも1 種の欠損を引き起こし、それにより受容体機能を減少または促進することかでき る。例えば、受容体の改変体を生じるまたは発現のレベルを変える変異は、受容 体機能、受容体により媒介される減少または促進段階(例えば、炎症過程)を減少 または促進することができる。かかる変異の存在は、個々の細胞（例えば、活性 化Ｔリンパ球などの白血球など）中またはかかる細胞から単離した受容体標品に おけるの受容体もしくは受容体機能の存在を検出あるいは測定する方法を用いて 決定されうる。これらのアッセイにおいて、受容体の減少したもしくは促進した レベルおよび／または減少したもしくは促進した受容体機能を評価しうる。 本発明の核酸は、活性が減少または増大している受容体をコードする欠損哺乳 類CXCR3遺伝子のスクリーニング、特徴づけおよび/または単離に使用できる試薬 、例えば、プローブ、PCRプライマーなどを提供する。例えば、標準的な欠損遺 伝子スクリーニング法を使用できる。欠損遺伝子を単離し、それらを適切な宿主 細胞中で発現させて、哺乳類CXCR3タンパク質について本明細書に記述するよう な評価をさらに行なうことができる。多くのヒト疾患は、Gタンパク質共役受容 体機能の欠損に関係している[Clapham，D．E.，Cell，75:1237-1239(1993);Lefk owitz，R．J.，Nature，365:603-04(1993)]。 本発明の核酸は、（例えば、mRNAの転写を検出することにより）受容体の発現 を（ノーザン解析、イン・サイチュハイブリダイゼーションにより）評価するた めにも使用しうるプローブおよびPCRプライマーなどの試薬を提供する。例えば 、活性化Tリンパ球または他の細胞型での発現を評価しうる。 本発明の抗体は、受容体を細胞の表面に検出することができる手法への応用を 有する。該受容体は、発現される白血球細胞型マーカー、特に活性化T細胞マー カーを提供する。例えば、受容体タンパク質またはペプチドに対して生じさせた 抗体、例えば、本明細書に記載された抗体(例えば、mAb 1C6)を用いて、受容体 を発現する細胞を検出および／または定量することができる。1つの態様として 、抗体を用いて、細胞の混合物全体から受容体を発現する細胞を分類することが で きる（例えば、CD4⁺T細胞などの活性化T細胞を単離すること）。この目的には、 細胞の計数および/または選別に適した方法（例えばフローサイトメトリー、蛍 光活性化細胞選別法）を使用できる。細胞数は、白血球細胞型（例えば、活性化 T細胞）におけ増加または減少が観察される疾患または状態の診断に用いられう る。個体から得られた試料中の活性化T細胞の増加レベルの存在は、遅延型過敏 反応、同種移植片拒絶、または細菌もしくはウイルス感染を含む病原性状態など の炎症性疾患または状態による浸潤の指標でありうる。 さらに、抗体を用いて、受容体の発現を検出または測定することができる。例 えば、本発明の抗体を用いて、試料中（例えば、血液、血清、白血球（例えば、 活性化Tリンパ球）、気管支肺胞洗浄液、唾液、腸液などの組織もしくは体液） の受容体を検出または測定することができる。例えば、試料（例えば、組織およ び／または体液）を個体から得ることかでき、適切な方法を用いて、CXCR3タン パク質の存在または量を評価することができる。適切な方法としては、FACS解析 および酵素結合免疫吸着アッセイ(ELISA)などの免疫学的方法があげられ、化学 発光アッセイ、放射免疫アッセイ、免疫組織学が含まれる。一般的に、試料およ び本発明の抗体は、抗体−受容体複合体の形成に適する条件下に組み合わせられ 、抗体−受容体複合体の形成は、（直接的または間接的に）評価される。 個体から得られた試料中の受容体反応性の増加レベルの存在は、同種移植片拒 絶、遅延型過敏反応、または細菌もしくはウイルス感染を含む病原性条件などの 炎症性疾患または状態が関連する炎症および／または白血球（例えば、活性化T 細胞）浸潤および／または蓄積の指標でありうる。哺乳類CXCR3タンパク質また は改変体の発現レベルを用いて、哺乳類CXCR3タンパク質の増加または減少した 発現と特定の疾患または状態とを相関させることができ、哺乳類CXCR3タンパク 質の増加または減少した発現が生じる（例えば、正常な個体での発現レベルなど の適切な対照に相対して増加または減少）疾患あるいは状態の診断において、用 いることができる。同様に、治療の経過を、患者の試料中のCXCR3免疫反応性を 評価することによりモニターすることができる。例えば、本発明の抗体を用いて 、抗炎症性または免疫抑制剤で処置された患者由来の試料（血液、組織など）中 にCXCR3を生じる細胞の数をモニターすることができる。トランスジェニック動物 組換えDNA技術を用いて宿主動物のゲノムが改変されたトランスジェニック動 物を構築することができる。１つの態様において、その改変が遺伝性でない（例 えば骨髄中の先祖細胞などの体細胞を改変する）。別の態様において、その改変 が遺伝性である（生殖細胞系を改変する）。トランスジェニック動物は標準的な 技術または他の適当な方法で構築できる［例えば、Tリンパ球の改変に関するCoo ke，M.P．ら，Cell，65:281-291（1991）;Hanahan，D.，Science，246:1265-127 5(1989);Anderson，et al.，米国特許第5,399,346号明細書］。 一側面として、内因性哺乳類CXCR3遺伝子を適切な動物宿主中での完全に、も しくは部分的に（例えば遺伝子破壊技術によって）不活性化または無力化するこ とによって、トランスジェニック動物を作製することができる。本発明の核酸を 用いて、不活性化または無力化されたCXCR3遺伝子を含有する宿主の構築の成功 を（例えばサザンハイブリッド形成法によって）評価することができる。さらに 、不活性化または無力化されたCXCR3遺伝子を含有する宿主の構築の成功は、コ ードされている受容体の機能をモニターする適切なアッセイによっても評価でき る。かかる動物を用いて、炎症および癌または病原体（ウイルス病原体）に対す る宿主防御における受容体不活性化の影響を評価しうる。 別の態様において、哺乳類CXCR3タンパク質またはポリペプチドをコードする 核酸を適当な宿主に導入してトランスジェニック動物を作製することもできる。 好ましい態様では、そのトランスジェニック動物中に存在する内因性CXCR3受容 体遺伝子を、（例えば、該内因性遺伝子を破壊し置換する相同組換えによる該核 酸の導入と同時に）不活性化する。例えば、白血球［例えばリンパ球（活性化T リンパ球など）、ナチュラルキラー細胞］中で異なる哺乳類種（例えば、配列番 号:1にコードされるCXCR3などのヒトCXCR3］の哺乳類CXCR3受容体をコードする 核酸を発現できるトランスジェニック動物（マウス、モルモット、ヒツジなど） を作製することができ、導入された受容体の機能を評価するための便利な動物モ デルを提供する。さらに、トランスジェニック動物に試験薬剤を投与し、受容体 媒介過程（例えば、炎症）に対する該薬剤の効果を本明細書に記載されたように または適切なアッセイでモニターすることもできる。この方法で、受容体機能を 阻害または促進する薬剤を同定したり、そのイン・ビボ効果を同定または評価す ることができる。治療方法 哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質に特有の少なくとも１種の機能の阻害または促進 を介して、本発明の哺乳類ＣＸＣＲ３機能の調節は、受容体媒介機能を阻害又は 促進する有効かつ選択的な方法を提供する。ＣＸＣケモカイン受容体は、主要な 標的がリンパ球、特に活性化または刺激Ｔリンパ球およびＮＫ細胞などのエフェ クター細胞であるＩＰ−１０およびＭｉｇなどのケモカインに反応しうる、活性 化リンパ球に選択的に発現するので、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質は、ヒト等の 哺乳類におけるリンパ球機能を選択的に妨害するまたは促進するための標的を提 供する。一度リンパ球を部位に補充するやいなや、単球などの他の白血球型が二 次的なシグナルで補充されるであろう。したがって、リガンド、阻害剤（例えば 、１Ｃ６）および／または促進剤、本明細書記載のように同定されたものなどを 含むＣＸＣＲ３機能を阻害または促進する薬剤を用いて、白血球機能（例えば、 補充および／または蓄積を含む白血球浸潤）、特にリンパ球の白血球機能を治療 目的のために調整することができる。 １側面として、本発明は、哺乳類ＣＸＣＲ３機能を阻害または促進する薬剤の かかる治療が必要な個体への投与を含む、かかる治療が必要な個体における炎症 性応答を阻害または促進する方法を提供する。１つの態様として、哺乳類ＣＸＣ Ｒ３タンパク質（例えば、ヒトＣＸＣＲ３）の１以上の機能を阻害する化合物を 投与して炎症を阻害（すなわち減少または妨げる）。例えば、ｍＡｂ １Ｃ６を 含む本発明の抗体を本方法に用いることかできる。結果として、白血球移動、走 化性、エキソサイトーシス（例えば、酵素の）または炎症媒介放出などの１以上 の炎症過程が阻害される。例えば、炎症部位の白血球浸潤（例えば、遅延型過敏 応答）を本発明の方法にしたがって阻害することができる。 他の態様として、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質（例えば、ヒトＣＸＣＲ３）の １以上の機能を促進する薬剤（例えば、受容体アゴニスト）を投与して、炎症過 程の有益な刺激に帰する、白血球移動、走化性、エキソサイトーシス（例えば、 酵素の）または炎症媒介放出などの炎症応答を誘導（誘発または促進する）する 。例えば、ナチュラルキラー細胞をウイルス感染または腫瘍形成疾患に対抗する ために補充することができる。 「個体」という用語は、本明細書に規定され、特に限定されないが、霊長類（ 例えば、ヒト）、ウシ、ヒツジ、ヤギ、ウマ、イヌ、ネコ、ウサギ、モルモット 、ラット、マウス、他のウシ属、ヒツジ、ウマ科、イヌ科、ネコ科、ネズミ、ハ ツカネズミの種などが挙げられる。炎症、感染および癌に関連する疾患および状 態を本発明の方法を用いて処置することができる。好ましい態様として、疾患ま たは状態は、リンパ球、特に活性化または刺激Ｔリンパ球およびナチュラルキラ ー（ＮＫ）細胞などのエフェクター細胞などの作用が治療（予防を含む）目的で 阻害または促進されるべきものである。特に好ましい態様として、炎症疾患また は状態は、Ｔ細胞媒介疾患または状態である。 ＣＸＣＲ３機能の阻害剤で処置されうるヒトまたは他の種の慢性疾患を含む疾 患または条件は、特に限定されないが： ・ 全身性過敏症または過敏応答、薬剤アレルギー（例えば、ペニシリン、セフ ァロスポリンに対する）、昆虫咬傷アレルギー；クローン病などの炎症腸疾患、 潰瘍性大腸炎、回腸炎および腸炎；膣炎；皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、ア レルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹などの乾癬および炎症性皮膚病；血管炎（壊死性 、皮膚および過敏性血管炎など）など；脊椎関節症；硬皮症；喘息、アレルギー 性鼻炎、過敏性肺疾患、過敏性肺炎、間質性肺疾患（ILD）（特発性肺繊維症、 関節リウマチに関連するILD、または他の自己免疫状態）などの呼吸アレルギー 疾患；などを含む炎症性またはアレルギー性疾患および状態； ・ 関節炎（例えば関節リウマチ、乾癬関節炎）、多発性硬化症、全身性エリテ マトーデス、重症筋無力症、真性糖尿病および若年発症糖尿病を含む糖尿病、糸 球体腎炎および他の腎炎、自己免疫甲状腺炎、ベーチェット病などの自己免疫疾 患； ・ 同種移植片拒絶または対宿主性移植片病を含む（移植などにおける）移植片 拒絶； ・ 望ましくない炎症応答を阻害すべきその他の疾患または状態、限定されない か、アテローム性動脈硬化症、サイトカイン誘導毒性、筋炎（多発性筋炎、皮膚 筋炎）も治療できる があげられる。 ＣＸＣＲ３機能の促進剤（例えば、アゴニスト）で処置しうるヒトもしくは他 の種の疾患または状態としては、限定されないが： ・ 皮膚Ｔ細胞リンパ腫（例えば、菌状息肉腫）などの癌、特に皮膚または組織 の白血球浸潤を伴うもの； ・ 新形成疾患、網膜症（例えば、糖尿病性網膜症）、および黄斑変性を含む、 脈管形成または新生血管形成が役割を果たす疾患； ・ 細菌感染および結核様らい、ならびに特にウイルス性感染などの感染性疾患 ； ・ 免疫抑制、例えばAIDSなどの免疫不全症候群にかかっている患者や、放射線 療法、化学療法、あるいは免疫抑制を引き起こすその他の療法を受けている患者 に認められるもの；受容体機能の先天的欠乏症または他の原因による免疫抑制な ど。さらに、ＣＸＣＲ３機能の促進剤は癌化学療法の間、幹細胞消耗に対抗する に有益な保護効果をも有する[Sarris，A.H．et al.,J.Exp.Med.,178:1127-1132( 1993)]。投与経路 本発明によれば、1以上の薬剤を単独で、あるいは別の薬物と組み合わせて、 適当な経路で宿主に投与できる。薬剤（例えばリガンド結合を阻害する受容体ペ プチド、抗CXCR3抗体またはその抗原結合断片）の有効量を投与する。有効量と は、その投与条件下で所望の治療効果を達成するに足る量であり、例えばCXCR3 受容体機能の阻害または促進と、それによるそれぞれ、受容体媒介段階(例えば 、炎症性応答)の阻害または促進に十分な量である。 種々の投与経路が可能で、例えば薬剤および治療しようとする状態または疾患 に応じて、経口投与法、食餌法、局所投与法、腸管外投与法（静脈内注射、動脈 内注射、筋肉内注射、皮下注射など）、吸入投与法（気管支内吸入、鼻孔内吸入 または経口吸入、鼻孔内滴剤など）が挙げられるが、必ずしもこれらに限られる わけではない。喘息などの呼吸アレルギー性疾患には、吸入法が好ましい投与法 である。 投与すべき薬剤の製剤は、選択した投与経路に応じて変化するだろう（例えば 液剤、乳剤、カプセル剤など）。投与すべき薬剤を含む適当な組成物を、生理学 的に許容される賦形剤または担体中に調製することができる。例えば液剤や乳剤 の場合は、適当な担体として、食塩水や緩衝培地などの水溶液、アルコール/水 溶液、乳液、懸濁液などが挙げられる。腸管外用の賦形剤には、塩化ナトリウム 溶液、リンゲルデキストロース、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸化 リンゲルまたは固定油などを含めることができる。静脈内用の賦形剤には、種々 の添加物、保存剤、液体、栄養または電解物質補充剤などを含めることができる （一般的にはRemington's Pharmaceutical Science，第17版,Mack編，1985を参 照のこと）。吸入法の場合は、薬剤を可溶化し、適当な投与用ディスペンサー（ アトマイザー、ネブライザーまたは加圧エアロゾールディスペンサーなど）に入 れることができる。 さらに、該薬剤が、タンパク質またはペプチドである場合、薬剤を組換えタン パク質のイン・ビボ発現を介して投与することができる。イン・ビボ発現は、適 切な方法（米国特許第5,399,346号明細書などを参照のこと）に従って、体幹細 胞発現を介してなし遂げられる。この態様において、該タンパク質をコードする 核酸を運搬のためにレトロウイルス、アデノウイルスまたは他の適切なベクター （好ましくは、複製欠損感染性ベクター）に取り込むことができ、運搬のタンパ ク質を発現することができるトランスフェクトまたは形質転換宿主細胞に導入す ることができる。後者の態様において、治療に有効な量でタンパク質を発現させ るに有効な量で、該細胞を(単独もしくは障壁装置中に)埋め込み、注入し、さら に導入することができる。実施例 次に、下記の実施例によって本発明を例証するが、これらの実施例は決して限 定を意図するものはない。 ヒトケモカイン（実施例１〜２） CXCケモカインMig、IL-8、GROα、NAP-2、GCP-2、ENA78、PF4、CCケモカインM CP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、1309、エオタキシン 、およびケモカイン関連リンフォタクチンは、確立された手順に従って化学的に 合成した（Clark-Lewis，I.ら，Biochemistry 30：3128-3135(1991)）。CXCケモ カインIP-10はPeproTech社（ニュージャージー州ロッキーヒル）から購入した。実施例１．受容体cDNAのクローニング 標準的な分子生物学的技術を使用した（Sambrook，J.ら，1989，Molecular Cl oning:A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press,ニューヨ ーク州コールドスプリングハーバー）。 推定されるＴリンパ球限定的ケモカイン受容体をコードするDNA断片を、ポリ メラーゼ連鎖反応（PCR）を使って作製した。２つの縮重オリゴヌクレオチドプ ライマーをケモカイン受容体の保存されたモチーフに基いて設計した。プライマ ーの設計は、ケモカイン受容体IL-8R1(CXCR1)、比-8R2(CXCR2)、CC-CKR1(CCR1) 、CC-CKR2（CCR2）およびオーファン受容体EBI I、LESTRおよびBLR1/MDR15の膜 貫通ドメイン２（TM2）および膜貫通ドメイン７（TM7）内の保存されたヌクレオ チド配列に基いた（EBI I，Birkenbach，M.ら，J．Virol.，67：2209-2220(1993 )；LESTR，Loetscher，M.ら，J．Biol．Chem．，269：232-237(1994)；BLR1/MDR 15，Dobner，T.ら，Eur．J．Immnol.，22：2795-2799（1992）ならびにBarella ，L.ら，Biochem．J.，309：773-779(1995)）。 プライマーの配列は次の通りとした。 配列番号：３ ５’−ＧＧＧ ＣＴＧ ＣＡＧ ＣＩＩ Ｔ（Ｔ／Ｇ）（Ｔ／Ｇ）Ｃ（Ｃ ／Ａ）Ｇ ＡＣ（Ａ／Ｃ）ＴＩＣ ＴＩ（Ｃ／Ｔ）Ｔ−３’ 配列番号：４ ５’−ＧＧＧ ＴＣＴ ＡＧＡ ＩＧＧ ＧＴＴ ＩＡＩ（Ｇ／Ａ）ＣＡ （Ｇ／Ａ）Ｃ（Ｔ／Ａ）（Ｇ／Ａ）（Ｔ／Ｃ）Ｇ−３’ （Ｉ＝イノシン）。これらのプライマーをポリメラーゼ連鎖反応（PCR）で使用 することにより、ヒト末梢血リンパ球から単離されたヒトゲノムDNAを鋳型とし て、次のようにDNA断片を増幅した。ヒトゲノムDNA ２μg、１×Dyn aZyme緩衝 液（Finnzymes OY社，フィンランド・エスポー）、1.5mM MgCl₂、500μMの各デ オキシヌクレオチド、１μMの両プライマーおよびDynaZyme DNAポリメラーゼ2.5 Uを含有する反応混合物100μlを、DNAサーマルサイクラー（Techne PHC-2，Brou wer社，スイス）での30サイクル（94℃で１分間、55℃で１分間、72℃で２分間 ）にかけた。予想されるサイズ（約700bp）のPCR産物をGene Scribe-Zベクターp TZl8/19 U/R（USB社，オハイオ州クリーブランド）にクローニングし、部分的に 配列決定し（Sanger，F.ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，74:5463-5467(1977) ）、それらの既知ケモカイン受容体との類似性と、それらに対応するmRNAの白血 球における発現について評価した。2MLC22と命名したDNA断片は、IL-8R2と64％ のヌクレオチド配列同一性を示した。DNAポリメラーゼIのクレノウ断片と市販の ランダムプライムラベリングキットを使用して放射活性同位体³²Pで2MLC22を酵 素により標識することによって調製したハイブリダイゼーションプローブを用い たノーザンブロット分析で評価したところ、断片2MLC22はＴ細胞由来のRNAに特 異的にハイブリダイズしたが、単球または好中球由来のRNAにはしなかった。 断片2MLC22を上述のように酵素により³²Pで標識し、それをラムダ-ZAP Expres s（Stratagene社，スイス・チューリッヒ）中に調製されたヒト破傷風トキソイ ド特異的CD4⁺Ｔ細胞（KT30）cDNAライブラリーをスクリーニングするためのプロ ーブとして使用した(Loetscher，M.ら，J．Biol．Chem.，269:232-237(1994))。 cDNAライブラリーは、ヒト破傷風トキソイド特異的CD4⁺Ｔ細胞（KT30）由来のポ リ(A)⁺RNAを用いて、λZAP Expressシステム中に、その製造業者のプロトコール （Stratagene GMBH社，スイス・チューリッヒ）に従って調製した。得られたラ イブラリーは約1.1kbの平均インサートサイズを持つ約1.8×10⁶個の独立クロー ンを含んでいた。プラークハイブリダイゼーションスクリーニングのため、約４ ×10⁵クローンをBiodyneナイロン膜（PALLAG社，スイス・ムッテンツ）に転写し 、ハイプライムDNAラベリングキット（ Boehringer Mannheim社，ドイツ・マンハイム）を使って１×10⁹dpm/μg DNAの 比活性に標識しておいた2MLC22でプローブした。ハイブリダイゼーションは、１ ×10⁶dpm 2MLC22/mlのハイブリダイゼーション溶液を使って、50％ホルムアミド 、６×SSC、0.5% SDS、100μg/ml変性サケ精子DNA中42℃で20時間行なった。そ の膜を２×SSC/0.1％SDS中室温で10分間を１回、１×SSC/0.1％SDS中65℃で30分 間を２回、最後に0.5×SSC/0.1％SDS中65℃で10分間を１回洗浄した。この高ス トリンジェンシー洗浄の後、ハイブリダイゼーション陽性ラムダプラークから23 個のクローンを単離し、最大のインサート（I670bp）を持つクローンを配列決定 した。CXCR3 cDNAを市販のヌクレオチド配列決定用、ハイブリダイゼーションプ ローブ作製用、およびCXCR3を発現する安定にトランスフェクトされた哺乳類細 胞クローン構築用のプラスミドベクターにサブクローニングした。それらCXCR3 cDNA含有構築物は大腸菌株中に維持される。 結果 Ｔリンパ球特異的ケモカイン受容体を探索することにより、ヒトCD⁴⁺Ｔ細胞ラ イブラリーからcDNAを単離した（図１、配列番号：１）。このcDNAは、汎用され ている単球由来のcDNAライブラリーまたは顆粒球（HL60）由来のcDNAライブラリ ーを新規ケモカイン受容体cDNAに関して探索する過程では回収されなかった。し かしながら、CXCR3 cDNAに関して特異的なライブラリーの直接探索は行われてい ない。IP-10/Mig受容体（下記参照）をコードすることが明らかになったこのCXC R3 cDNAは、残基69から始まる1104bpのオープンリーディングフレーム（ORF）を 持ち、これは40,659ダルトンの予想分子量を持つアミノ酸数368のタンパク質を コードする。そのアミノ酸配列（図２、配列番号：２）は、Ｇタンパク質共役受 容体の特徴である７つの推定膜貫通セグメントと、３つの潜在的Ｎグリコシル化 部位（Asn²²、Asn³²およびAsn¹⁹⁹）を含む（図２）。また、受容体キナーゼの潜 在的リン酸化部位（Palczewski，K.およびJ.L．Benovic，Trends Biochem．Sci.，16:387-391(1991)；Chuang，T.T.ら，J．Biol．Chem.，267:688 6-6892（1992）；Giannini，E.ら，J．Biol．Chem.，270:19166-19172（1995） ）であるスレオニン残基１個とセリン残基９個が、細胞内COOH末端領域に認めら れる（図２）。 この受容体の368アミノ酸配列（IP-10/MigR、図２、配列番号：２）を、IL-8R l（CXR1）、IL-8R2(CXCR2)、CC-CKR1(CCR1)、CC-CKR2A(CCR2a)、CC-CKR3（CCR3 ）およびCC-CKR4（CCR4）を含む他のヒトケモカイン受容体のアミノ酸配列と整 列した。多重タンパク質整列は、HigginsおよびSharp（Higgins，D.G.およびP.M ．Sharp「Description of the method used in CLUSTAL（CLUSTALで使用される 方法の説明）」Gene，73:237-244(1988)）に従って行なった。図２の黒く囲んだ 残基は、IP-10/MigRと他の少なくとも２つのケモカイン受容体の間で同一な領域 を表わす。ハイフンは、整列中のギャップを表わす。この整列により、数個の保 存されたモチーフが、具体的には膜貫通ドメインと第二細胞内ループ中に明らか になった。第三および第六膜貫通ドメインにはCXC受容体IL-8R1およびIL-8R2と の有意な配列同一性が認められたが、CCケモカイン受容体との有意な配列同一性 は認められなかった（図２）。 この配列は、IL-8R1受容体およびIL-8R2受容体と全体でそれぞれ40.9％および 40.3％のアミノ酸同一性を持ち、５種類の既知CCケモカイン受容体とは34.2〜36 .9％の同一性を持つ（表１）。Ｔ細胞で発現されるがケモカイン類を結合しない 七膜貫通ドメイン型受容体とは、より低い類似性が認められた（例えば、トロン ビン受容体（Vu，T.-K.H.ら，Cell，64:1057-1068(1991)）とは27.2％同一）。 図２の配列と整列することができる不完全なコード配列を持つ機能未確認の先端 欠失型クローンは、過去にヒトゲノムDNAライブラリーから単離されている（Mar chese，A.ら，Genomics，29:335-344(1995)）。 実施例２．生物学的活性 活性化Ｔリンパ球での発現 観察されたケモカイン選択性に着目して、白血球とそれに関連する細胞株での IP-10/MigRの出現をノーザンブロット分析で調べた。新たに単離したヒト血液単 球、好中球、リンパ球(PBL)、ナイロンウール精製Ｔ細胞、ならびに400U/ml hrI L-2の存在下に10日間培養（2mMグルタミン、１×非必須アミノ酸、1mMピルビン 酸ナトリウム、100μg/mlカナマイシン、５×10^-5M 2-メルカプトエタノールお よび５％ヒト血清を含有するRPMI 1640培地中、１〜2.5×10⁶細胞/ml）したクロ ーン化ヒトCD4⁺Ｔ細胞（KT30）およびCD8⁺Ｔ細胞(ERCD8)、クローン化NK細胞（E RNK57）およびPBLを含む培養細胞由来の全RNA試料10μgを調べた。（ヒト組換え IL-2はバーゼル免疫学研究所（スイス・バーゼル）のA．Lanzavecchia博士から 供与された）。ブロッティングに先立って、ゲル上の全RNAの完全性と量を調べ るために、アガロースゲルを臭化エチジウムで染色した。RNA試料は、IP-10/Mig R DNAの³²P標識5'断片（10⁹cpm/μg DNA）を５×10⁶cpm/mlのハイブリダイゼー ション溶液の濃度で使用して、記述されているように分析した（Loestscher，M. ら，J．Biol．Chem.，269:232-237（1994））。ノーザンプローブとして使用し た5'断片は、pBK-CMVベクター（Stratagene GMBH社，スイス・チューリッヒ）中 のCXCR3 cDNAをPstIで消化してCXCR3 cDNA（図１）の5'末端724bpを得ることに よって調製した。 結果 予想されるサイズのmRNAの豊富な発現が、受容体cDNAの単離に使用したクロー ン化CD4⁺Ｔ細胞KT30に認められた。同等レベルの発現がCD8⁺Ｔ細胞クローンERCD 8とNK細胞クローンERNK57に観察された。これに対し、新たに単離された血液リ ンパ球とナイロンウール精製Ｔ細胞には、IL10/MigR転写物はほとんど検出でき なかった。しかし、これらの細胞をIL-2の存在下で培養すると、強いアップ レギュレーションが得られ、受容体mRNAのレベルはＴおよびNK細胞クローンでの レベルに近づいた。新たに単離された血液単球、好中性白血球または好酸性白血 球では、これらの条件下にIP-10/MigR転写物が検出されなかった。IP-10/MigR m RNAを発現しなかったその他の白血球関連細胞には、マスト細胞株HMC-1、前骨髄 球性白血病株HL60、組織球性白血病株U937、慢性骨髄性白血病株K562、急性Ｔ細 胞白血病株Jurkat、急性リンパ芽球性白血病株Molt、Ｂリンパ芽球株Daudiおよ びRaji、慢性および急性Ｂリンパ性白血病（B-CLLおよびB-ALL）患者由来のリン パ球、好塩基球性白血病患者由来の成熟好塩基球、および赤白血病細胞株HELが 含まれる。対照的に、単球および顆粒球には、リンパ球を誘引することが過去に 示されているケモカイン、すなわちMCP-1、MCP-2、MCP-3、MIP-1α、MIP-1βお よびRANTESの受容体（Loetscher，P.ら，FASEB J.，8:1055-1060(1994)；Carr， M.W.ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 91:3652−3656（1994）；Taub，D.D.ら， Science，266:355-358(1993)；Schall，T.J.ら，J．Exp．Med.，177:1821-1825 （1993）；Schall，T.J.ら，Nature，347:669-672（1990））も認められる。活 性化Ｔリンパ球とナチュラルキラー細胞株におけるIP-10/MigRの限定的発現は、 この新規受容体が選択的なリンパ球補充を媒介しうることを示唆している。 安定なトランスフェクタント CXCR3 cDNAをpBK-CMV（Stratagene GMBH社，スイス・チューリッヒ）からBamH IとXbaIによる消化で切り出し、pcDNA3（Invitrogen BV社，オランダ・WBリーク ）のBamHI部位とXbaI部位にクローニングすることによりpCDNA3-Clone8を得て、 それを大腸菌（XL1Blue）で維持、保存した。 安定なトランスフェクタントを作製するため、４×10⁶個のマウスプレＢ細胞( 300-19)（Thelen，M.ら，FASEB．J.，2:2702-2706(1988)）、ヒト前骨髄球細胞( GM-1)（Garotta，G.ら，J．Leukocyte Biol.，49:294-301(1991)）また はヒト急性Ｔ細胞白血病細胞(Jurkat)（Loetscher，P.ら，FEBS Lett．341：187 -192(1994)）に、Bgl IIで直線化したpcDNA3中の受容体cDNA 20μgを、既に記述 されているようにエレクトロポレーション法でトランスフェクトした（Moser，B .ら，Biochem．J.，294:185-192(1993)）。 IP-10/MigRトランスフェクト細胞をG-418（Life Technologies社）選択下に限 界希釈法でクローン化した（300-19については1.0mg/ml G-418、Jurkat細胞とGM -1細胞については0.8mg/ml G-418）。RNAドットーブロット分析により、G-418耐 性クローンを受容体発現についてスクリーニングした。 Ca²⁺流動 本受容体が機能的であるかどうかを決定するため、ネズミプレＢ細胞（300-19 ）、ヒト前骨髄球細胞（GM-1）およびヒトＴ細胞白血病細胞（Jurkat）のクロー ンに、上述のように受容体cDNAを安定にトランスフェクトした。ケモカイン受容 体の活性化はサイトゾル遊離Ca²⁺濃度（[Ca²⁺]_i）の一過性の上昇をもたらす。 そこでトランスフェクト細胞におけるシグナル伝達のモニターにこのアッセイを 使用した。 136mM NaCl、4.8mM KCl、1mM CaCl₂、5mMグルコースおよび20mM HEPES（pH7.4 ）を含有する緩衝液中、10⁶細胞あたり0.1nmolのfura-2アセトキシメチルエステ ルと共に37℃で30分間インキュベートすることによってfura-2を負荷した細胞で 、サイトゾル遊離Ca²⁺濃度（[Ca²⁺]_i）の変化を測定した。遠心分離後、負荷し た細胞を同じ緩衝液に再懸濁し(10⁶細胞/ml)、37℃で表記のケモカインによって 刺激し、[Ca²⁺]_i関連蛍光変化を記録した（von Tscharner，V．ら，Nature，324 :69-372(1986)）。 結果 IP-10およびMigに応答して、迅速な[Ca²⁺]_i上昇が観察された。ケモカイ ンIP-10は皮膚の遅延型過敏反応において発現されることが示されている（Luste r，A.D.ら，Nature，315:672-676（1985）；Kaplan，G.ら，J．Exp．Med.，166: 1098-1108（1987））。Migと呼ばれるケモカインが最近になって同定された（Fa rber，J.M.，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，87:5238-5242(1990)；Farber，J.M. ，Biophys．Res．Commun.，192:223-230(1993)）。どちらのケモカインも、IL-8 と同様に最初の２つのシステインがCXC配置を取っているが、好中性白血球に対 して走化作用を持たない。最近、IP-10がＴリンパ球を誘引すること（Luster，A .D.およびP．Leder，J．Exp．Med.，178:1057-1065（1993）；Taub，D.D.ら，J ．Exp．Med.，177:1809-1814（1993））と、Migが腫瘍関連リンパ球に対して走 化作用を持つこと（Liao，F.ら，J．Exp．Med.，182:1301-1314(1995)）が報告 された。 上記cDNAをトランスフェクトされ機能的IP-10/MigRを発現する細胞に対するIP -10とMigの作用を、図３Ａ〜３Ｃに要約する。[Ca²⁺]_i変化（図３Ａ）によって 示されるように、IP-10とMigの作用は濃度依存的であり、1nMで既に検出可能で あることから、両ケモカインはこの新規受容体に対して高い親和性を持つことが 示される。対照的に、これらIP-10/MigRトランスフェクタントは、CXCケモカイ ン類IL-8、GROα、NAP-2、GCP-2、ENA78、PF4、CCケモカイン類MCP-1、MCP-2、M CP-3、MCP-4、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、1309、エオタキシン、またはケモカ イン関連リンフォタクチンを含む他の16種類の潜在的アゴニストのいずれにも、 100nMまでの濃度で反応しなかった（非掲載）。同じ結果がネズミとヒトのトラ ンスフェクト細胞で得られた。これらの知見は、この新規受容体がIP-10とMigに 高度に選択的であることを証明している。したがって、本明細書では本受容体を IP-10/Mig受容体（IP-10/MigR）もしくはそのCXCケモカインに対する特異性を反 映して「CXCR3」と呼ぶ。 図３Ｂに示すように、IP-10またはMigによる反復刺激は、ケモカイン受容体に 典型的な脱感作をもたらした。さらに、これら細胞をIP-10で刺激した後、 Migで（またはその逆で）刺激すると交差脱感作が起り、この受容体が両ケモカ インに対して高い親和性を持つことが確認された。100nMの濃度で、Migが交差脱 感作に関してIP-10よりも強力であることが明白となり、Migに対するIP-10/Mig 受容体のより高い親和性または結合安定性が示唆された。 機能的IP-10/MigRの発現は証明されたが、放射活性リガンドを用いて結合実験 を行なったところ、結合パラメーターの決定を妨げる、全体の60〜80％に及ぶ非 特異的結合が明らかになった。IP-10とMigはカチオン性が高い（pI値は10.8と11 .1）ので、細胞表面プロテオグリカンとの非特異的相互作用がこれらの結果の説 明となりうる。実際、種々の血液細胞と組織細胞には、ケモカイン受容体と無関 係なヘパリナーゼ感受性のIP-10（およびPF4）結合部位が検出されており(Luste r，A.D.ら，J．Exp．Med.，182:219-231(1995))、またヘパラン硫酸はIP-10とMi gを結合し、リンパ球走化性を妨げる（非掲載）。ヘパリン結合部位はおそらくC XCR3受容体結合には関与しないと思われ、ヘパリン結合部位を介した細胞への非 特異的結合を阻害するには、反応（例えば結合緩衝液）へのコンドロイチン硫酸 などの適当なヘパリン誘導体の包含を使用できる。 走化性 献血血液バフィーコートからPBLを新たに単離した。献血血液バフィーコート はスイス赤十字社スイス中央研究所輸血部門によって提供された。バフィーコー トPBLの単離はColotta，F.ら，J．Immunol.，132:936-944（1984）に記述されて いるように行なった。 献血血液バフィーコートから新たに単離されたPBLをさらに処理することなく 使用するか、IL-2の存在下に10日間培養（2mMグルタミン、１×非必須アミノ酸 、1mMピルビン酸ナトリウム、100μg/mlカナマイシン、５×10^-5M 2−メルカプ トエタノールおよび５％ヒト血清を含有するRPMI1640培地中、400U/ml hrIL-2の 存在下に、１〜2.5×10⁶細胞/ml）した後、使用した。 細胞移動は、IP-10/MigRトランスフェクト細胞については孔径５μm（Loetsch er，P.ら，FEBS Lett．341:187-192(1994)）、ヒトPBLについては孔径３μm（Lo etscher，P.ら，FASEB J.，8:1055-1060（1994））のポリビニルピロリドン非含 有ポリカーボネート膜（Nucleopore）を用いて、48ウェルチャンバー（Neuro Pr obe社，米国メリーランド州キャビンジョン）で評価した。ケモカイン（下部ウ ェル）の溶解と、細胞（上部ウェル中100,000個の受容体トランスフェクタント またはPBL）の希釈には、20mM HEPES（pH7.4）と１％低温殺菌血漿タンパク質溶 液（スイス赤十字社研究所，スイス・ベルン）を添加したRPMI1640を使用した。 37℃で60分後、膜を取り出し、上面をPBSで洗浄し、固定し、染色した。全ての アッセイを３連で行ない、移動した細胞を倍率1,000倍の無作為に選択した視野 ５つで数えた。自発的な移動は、化学誘引物質の非存在下で決定した。 結果−トランスフェクト細胞 IP-10/MigRを発現するトランスフェクト細胞はIP-10またはMigに向かってたや すく移動し、一方、非トランスフェクト親細胞は応答しなかった（図３Ｃ）。ど ちらのアゴニストも典型的な二相型濃度依存性を示した。IP-10は1nMを超える濃 度で移動を誘導し、一方、Migの応答は10nM以上で検出可能になった。移動細胞 の最大数によって測定される効力は、Migの方がIP-10の約２倍高かった。これら の結果はIP-10/MigRが、白血球のすべての既知ケモカイン受容体と同様に、リガ ンドに応答して起こる走化性を媒介することを示している。 結果−ヒト血液白血球 IP-10/MigRの細胞分布と合致して、活性化ヒトＴリンパ球はIP10とMigに対し て高い反応性を持つことがわかった（図4A〜4B）。[Ca²⁺]_i変化（図4A）とイン ・ビトロ走化性（図4B）の誘導因子としてのIP-10とMigの活性は、IP- 10/MigRを発現するトランスフェクト細胞を用いて観察された作用と合致し、IP- 10はMigより強力であるが、効力はMigより低くかった。カルシウム流動と走化性 の誘導にはIL-2の存在下で培養することによるＴリンパ球の活性化が必要であり 、単離したばかりの血液リンパ球には使用した条件下で応答が認められなかった 。実施例３〜９に関する材料と方法 実施例３〜９では次の材料と方法を使用した。 ケモカイン 組換えヒトケモカイン類は、イアン クラーク−ルイス(Ian Clark-Lewis)博 士から提供された既に記述されているエオタキシン（Ponath，P.D.ら，J．Clin ．Invest.，97:604-612(1996)；Ponathら，国際公開第97/00960号パンフレット （1997年１月９日公開）も参照されたい）以外は、Peprotech社（ニュージャー ジー州ロッキーヒル）から入手した。¹²⁵I標識ケモカイン類はDu Pont NEN社（ マサチューセッツ州ボストン）から入手した。 細胞と細胞株 好中球とPBMCは記述されているように単離した（Ponath，P.D.ら，J．Clin．I nvest.，97:604-612(1996)）。CD3芽球を生成するため、RPMI-1640+10％FCS中２ ×10⁶個/mlのPBMCを抗CD3抗体TR66でコーティングしてある組織培養プレートに 添加した。４〜６日後、芽球を新しい培地に取り出し、IL-2（Antonio Lanzavec chia（バーゼル）の厚意で提供されたもの）を50単位/mlの濃度で添加した。 使用した他の細胞株には、CXCR3（下記参照）、IL-8RA（Ponath，P.D.ら，J． Exp．Med.，183:2437-2448（1996））、IL-8RB（Ponath，P.D.ら，J．Exp． Med.，183:2437-2448（1996））、CCR2b（G．LaRosa，未公表）、CCR4、CCR5（W u，L.ら，Nature，384:179-183（1996））、またはCCR１（Campbell，J.J.ら，J ．Cell．Biol.，134:255-266（1996））のいずれかを発現するL1.2ネズミプレＢ 細胞リンパ腫のトランスフェクタントが含まれる。 CXCR3トランスフェクタントの調製 細胞 L1.2細胞は、RPMI培地1640、10％ FetalClone（Hyclone社製）、50U/mlペニシ リン／ストレプトマイシン、１×L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウムおよ び5.5×10^-5Mβ-メルカプトエタノール中で生育した。培地成分は、Hyclone社か ら購入した10％ FetalClone以外は、GlbcoBRL社から購入した。トランスフェク ションの２日前に、L1.2細胞を新しい培地に１：５の比率で希釈した。これによ り、約100〜300万細胞/mlの濃度の対数増殖期の細胞１億5000万個が得られた。 CXCR3 DNAとトランスフェクション 大腸菌XL1Blue細胞（Stratagene社，カタログ番号200236）を、製造者の実験 案に従い、pcDNA3-Clone8（実施例２；Loetscher，M.ら，J．Exp．Med.，184:96 3-969（1996））で形質転換した。100μg/mlアンピシリンを含有するLB500ml中 、250rpmで振盪しながら、形質転換体を37℃で生育した。次にその培養物を8000 ×gでの遠心分離によって集め、Maxiプラスミド精製カラムとその実験案（Qiage n社，カタログ番号12162）を使って、プラスミドを精製した。プラスミドの濃度 と純度は、１％アガロースゲルとOD260/280比を使って決定した。プラスミドDNA を二回蒸留水に懸濁し、使用時まで−20℃で保存した。 ベクターの直線化にはScaIエンドヌクレアーゼを使用した。100μgのDNAを10 μlのScaIで、製造者の実験案（GibcoBRL，カタログ番号15436-017）に従っ て37℃で８時間消化した。20μgを安定トランスフェクション構築に直接使用し た。80μgはフェノール：クロロホルム：イソアミルアルコール（25：24：１） 抽出、100％エタノール沈殿（0.1体積のNH₄COOHを使用）および70％エタノール 洗浄により、タンパク質と塩を除去した。 ネズミプレＢリンパ腫細胞株（L1.2）の安定トランスフェクタントは基本的に 記述されているように調製した（Ponath，P.D.ら，J．Exp．Med.，183:2437-244 8（1996））。１×PBS 0.8ml中のL1.2細胞2500万個を、直線化したDNA 20μg、 または直線化の後、洗浄したDNA 20μg（上記DNAの直線化の項を参照されたい） と共に、またはDNAなしで、エレクトロポレーションにかけた。エレクトロポレ ーション前に、L1.2細胞とDNAを50mlコニカルチューブ（Falcon 2070型）中で２ 分おきに穏やかに混合（旋回）しながら10分間インキュベートした。そのL1.2細 胞-DNA混合物を、電極間隔0.4cmのGene Pulserキュベット（BioRad社，カタログ 番号165-2088）に移した。次にその混合物を250V、960μFで、ショックの持続時 間と実際の電圧を測定しながらエレクトロポレーションした。エレクトロポレー ション後、キュベットを10分間室温に放置した。次にL1.2細胞-DNA混合物のすべ てをT-25フラスコ（Costar社）に移し、10mlの非選択培地で２日間生育した。 選択 次にCXCR3を発現するL1.2細胞をネオマイシン耐性に関する選択にかけた。非 選択培地で２日間生育した後、10mlの1.6g/Lジェネティシン（GibcoBRL社）を0. 8g/L（選択および維持濃度）の最終濃度で加えた。次にこれを、細胞が過剰増殖 を始めたら新しい選択培地を加えながら、10〜15日間生育した。新しい選択培地 は10％ウシ血清と800μg/ml G418を添加したRPMI-1640からなった。 CXCR3の細胞表面発現を走化性によって評価し、また表面発現をモニターする ためにリガンド結合分析とスキャッチャード分析も使用した。G418選択後、 CXCR3発現L1.2細胞を走化能に基いて選択した。各エレクトロポレーション反応 について、30ml（800,000細胞/ml）を集め、600μlの選択培地に懸濁した。 10nM IP-10を含有する選択培地600μlを、Becton-Dickinson社製のBioCoat細胞 培養プレート（カタログ番号40575）の下部チャンバーに入れた。100μl/ウェル の上記L1.2細胞をそのBioCoatプレートの上部チャンバーに加えた。次に、それ らの細胞を37℃のCO₂培養器中に終夜放置して走化反応させた。非走化細胞の入 った上部チャンバーを除去した。走化細胞を集め、新しい培地に移し、24ウェル プレートで生育した。次に、それらをCostar製T-25フラスコに拡張した後、T-75 フラスコに拡張した。 高レベルの受容体を発現するトランスフェクタントを、限界希釈法によってク ローン化した。G418を含む選択培地に、CXCR3トランスフェクト細胞を30〜３細 胞/mlまで希釈した。それを96ウェル組織培養プレートに100μl/ウェルずつ分注 した。37℃、５％CO₂で14日後、単一コロニーを含有するウェルを倒立顕微鏡下 で同定した。次にその細胞の50μlを移し、抗CXCR3 mAbで上述のように染色し、 フローサイトメトリーで分析した。受容体発現レベルは平均蛍光強度と相関し、 高発現体が選択された。安定な細胞株が樹立されたら、その株を使用するために 増殖した。 CXCR3トランスフェクタント細胞は、抗生物質耐性と走化性に関する選択に加 えて、抗体染色法で受容体発現量がより高いものを分別することによって、さら に選択することができるが、ここではそれを行なわなかった。染色するには、１ ％ウシ血清アルブミンを含む滅菌PBSにトランスフェクタント細胞を５×10⁶個/m lの密度で再懸濁すればよい。単離された滅菌抗CXCR3 mAbは３μg/mlまでの最終 濃度で加えることができ、細胞を氷上で30分間インキュベートする。冷滅菌PBS で洗浄した後、結合したmAbは、0.2μmフィルターを通した濾過によって滅菌し たFITC結合抗マウスIgGで検出できる。それらの細胞を再び洗浄し、フローサイ トメトリーで分別することができる。上位５％の陽性細胞を集め、選択 条件下に増殖用の組織培養（例えば10％ウシ血清と800μg/ml G418を添加したRP MI-1640）に戻すことができる。実施例３．IP-10はCXCR3 DNAをトランスフェクトしたL1.2細胞上と活性化Ｔ細胞 上に発現した受容体に高い親和性で結合する 放射標識IP-10を使用してさらなる結合試験を行なった。標的細胞へのケモカ イン結合は既に記述されているように行なった（Ponath，P.D.ら，J．Clin．Inv est.，97:604-612(1996)；Van Riper，G.ら，J．Exp．Med.，177(3):851-856（1 993））。細胞をPBSで１回洗浄し、結合緩衝液（50mM HEPES(pH7.5)、1mM CaCl₂ 、5mM MgCl₂、0.5％BSAおよび0.05％アジド）に10⁷個/mlの濃度で再懸濁した。 それを微量遠心管に50μl（５×10⁵細胞）ずつ分注し、次いで非放射性競合因子 （非標識IP-10）と放射標識ケモカイン（0.05nM¹²⁵I標識IP-10）を加えた。最終 反応体積は200μlだった。非特異的結合は、250〜500nMの非標識ケモカインの存 在下に細胞を放射標識ケモカインと共にインキュベートすることによって決定し た。室温で60分間インキュベートした後、0.5M NaClを含む結合緩衝液1mlで細胞 を３回洗浄した。次に、細胞ペレットをカウントした。競合は100×[(S-B)/(T-B )]（式中、Ｓは試料の放射活性、Ｂはバックグラウンド結合量、Ｔは競合因子が ない場合の全結合量である）によって計算される特異的結合百分率として表わし た。バックグラウンド結合量は、細胞を放射標識ケモカインおよび少なくとも40 0倍過剰の非標識ケモカインと共にインキュベートすることによって得た。全実 験を通じて２連を使用し、標準偏差は常に平均の10％未満だった。すべての実験 を少なくとも３回繰返した。カーブフットおよび特異的結合を50％阻害する濃度 （IC₅₀）は、カレイダグラフ（KaleidaGraph）ソフトウェア（Synergy Software 社，ペンシルバニア州レディング）で計算した。 図５Ａ〜５Ｂは、CXCR3をトランスフェクトしたL1.2細胞（図５Ａ）とCD3活 性化Ｔ細胞（図５Ｂ）に¹²⁵I-標識IP-10が結合したことと、非放射性IP-10の濃 度を上げることでその結合を阻害できたことを示している。スキャッチャード分 析から、IP-10がL1.2 CXCR3トランスフェクタントに614pMのKdで結合することと 、それらのトランスフェクタントが１細胞あたり37,000個の受容体を発現させた ことが明らかになった（図５Ａ、挿入図）。抗CD3活性化IL-2刺激Ｔ細胞の同様 の分析では、156pMのKdと１細胞あたり17,000個の受容体が明らかになった（図 ５Ｂ）。Migは¹²⁵I標識IP-10結合の遮断に関して非標識IP-10よりわずかに有効 性が低かったものの（非掲載）、活性化Ｔ細胞への¹²⁵I標識IP-10結合は同じ条 件下に非標識Migによって完全に阻害することができた。IP-10とMigは高い親和 性でCXCR3を結合する（Kd約150〜600pM）。実施例４．CXCR3に特異的なモノクローナル抗体（mAb）の作製と特徴づけ CXCR3のアンタゴニストを開発するために、また受容体の発現と調節を研究す るために、この受容体のＮ末端に対応する合成ペプチドでマウスを免疫すること により、一群のmAbを作製した。これらのmAbはCXCR3トランスフェクタントを特 異的に認識したが、他の一連の受容体トランスフェクタントは特異的に認識しな かった。 mAbの作製とフローサイトメトリー CXCR3と反応するmAbは、Balb/CマウスをCXCR3の最初の37Ｎ末端アミノ酸に対 応する37マー合成ペプチド（Loetscher M.ら，J．Exp．Med.，184:963-969（199 6）をも参照されたい）10μｇで10週間にわたって５回免疫することによって作 製した。このペプチドを合成し、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体（Severn Biotech社，英国キッダーミンスター）に結合した。最初の免疫処置はフロイン ト完全アジュバント（FCA）を使って腹腔内（IP）に行なった。第二、第三、第 四の免疫処置はフロイント不完全アジュバント（FIA）を使って腹腔内に 行い、最後の免疫処置はペプチド複合体のみ（アジュバントなし）を使って、静 脈内（IV）に投与した。最後の免疫処置の４日後に、脾臓を摘出し、細胞株SP2/ 0を用いて、記述されているように細胞融合を行なった（Coligan，J.E.ら，Curr ent Protocols In Immunology(John Wiley and Sons社，ニューヨーク)，Unit 2 .5.4(1992)）。ELISAで評価したところ、上記Ｎ末端37マーペプチドと反応するm Abが生成した（Coligan，J.E.ら，Current Protocols In Immunology（John Wil ey and Sons社，ニューヨーク），Unit 2.1.3（1992））。CXCR3と反応するmAb は、非トランスフェクトおよびCXCR3トランスフェクトL1.2細胞または300.19細 胞（ネズミＢ細胞株，Loetscher，M.ら，J．Exp．Med.， Co.社，カリフォルニア州マウンテンビュー）を用いて同定した。 CXCR3に特異的なモノクローナル抗体が生成した。CXCR3トランスフェクトL1.2 細胞が染色されるが、非トランスフェクトL1.2細胞または他の受容体タイプをト ランスフェクトしたL1.2細胞が染色されないことから判断して、８種類のmAbが 表面発現したCXCR3を認識することがわかった。これらmAbの一つ1C6のFACSプロ フィールを図６に示す。また、これらmAbはPHAまたは抗CD3によりイン・ビトロ で活性化されたヒトＴ細胞とＴ細胞クローンをも染色した（1C6について図７Ｃ に図示）。しかし、これらの抗CXCR3 mAbは、好中球（1C6について図７Ａに図示 ）、単球または好酸球（非掲載）とは反応しなかった。この反応性のパターンは 、ノーザンブロットによる分析と合致した。しかし、意外にも表現型分析では循 環リンパ球の大きな亜集団でのCXCR3の発現が明らかになった（図７Ｂ）。この 発現パターンは調査した全ての個体で観察され、このことはCXCR3が血液リンパ 球の亜集団に常態で発現されることを示す。CXCR3は、CD45RO+（メモリー）サブ セットに包含される循環Ｔ細胞の一集団を特徴づけることがわかった。 ネズミハイブリドーマ1C6（LS77-1C6ともいう）は、1997年３月28日に、ブダ ペスト条約の条件に基き、LeukoSite社（米国02142マサチューセッツ州ケンブリ ッジ・ファーストストリート215）の名でアメリカン・タイプ・カルチャー・コ レクション（American Type Culture Collection）（20852メリーランド洲ロッ クビル・パークローンドライブ12301）に、ATCC寄託番号HB-12330の下で寄託さ れた。実施例５．CXCR3は活性化／メモリーＴ細胞上に発現される フローサイトメトリー CXCR1、CXCR2、CXCR3およびCCR5に対するmAbは既に記述されている（Qin，S. ら，Eur．J．Immunol.，26:640-647(1996)；Heath，H.ら，J．Clin．Invest．印 刷中（1997））。抗CXCR4 mAb 12G5（Endres，M.J.ら，Cell，87：745-756(1996 )）は、ジム ホキシー(Jim Hoxie)（ペンシルバニア大学）の厚意で提供された 。CD4、CD8、CD14、CD20、CD25、CD26、CD69、CD45RO、CD45RA、CD95に対するPE 結合mAb、抗CD3および抗CD4 Cy-ChromeはPharMingen社（カリフォルニア州ラホ ーヤ）によって供給された。 トランスフェクト細胞または白血球に対するmAbの反応性を評価するために、 間接免疫蛍光法とフローサイトメトリーを使用した。細胞をPBSで１回洗浄し、 ２％ヒト血清と0.1％アジ化ナトリウムを含む100μlのPBS（染色緩衝液）、５μ g/ml精製抗体、５μg/ml IgG_2a同イソタイプ対照mAb（Sigma Chemical社，ミズ ーリ州セントルイス）または50μlのハイブリドーマ培養上清に再懸濁した。４ ℃で20分後、細胞を染色緩衝液で２回洗浄し、50μlのFITC結合アフィニテイー 精製Ｆ(ab')₂ヤギ抗マウスIgG（Jackson ImmunoResearch Laboratories社）に再 懸濁した。４℃で20分間インキュベートした後、細胞を染色緩衝液で２にはヨウ化プロピジウムを使用した。 リンパ球の二色免疫蛍光分析は、CD20+（Ｂ）細胞とCD56+(NK)細胞のごく一 部もCXCR3を発現するものの、CXCR3を発現する細胞はそのほとんどがCD3+細胞で あることを示した（図８）。Ｔ細胞を標識するために抗CD3 Cy-Chromeを用いて 行なったＴ細胞の三色分析は、CD4+細胞の一部とCD8+細胞の一部がCXCR3を発現 することを示した（図９）。ＣD25やCD69などの細胞活性化のマーカーを使った 分析では、活性化Ｔ細胞が一般にこの受容体を発現することが明らかになった。 CXCR3+ Ｔ細胞は、先の活性化に合致する表現型CD95+、CD45RO+およびCD45RA^low だった。CXCR3の発現と、やはり前もって活性化されたＴ細胞にその発現が偏っ ているケモカイン受容体CCR5（Wu，L.，私信）の発現も比較した。図９は、血中 のCCR5+細胞がCXCR3＋亜集団に包含されていたことと、CXCR3がCCR5より広範に 発現されたことを示している。CCR5やCXCR4などの他のＴ細胞ケモカイン受容体 とは異なり、CXCR3は循環する活性化Ｔ細胞の大半で発現した。実施例６．抗CXCR3 mAbはIP-10結合と走化性を遮断する ヒト白血球の走化性を、ECV 304内皮細胞株（European Collection of Animal Cell Cultures，英国ソールズベリー・ポートンダウン）を使って、既に記述さ れている（Ponath，P.D.ら，J．Clin．Invest.，97:604-612(1996)）経内皮アッ セイ（Carr，M.W.ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，91(9):3652-3656(1994)） の変法で評価した。下部チャンバーに移動した細胞をチューブに また、CD3活性化Ｔ細胞芽球の走化性を阻害する能力について、抗ペプチドmAb を試験した。1A5、1C6、3A8、5F10、10C6および10G12と呼ばれるmAbに関する結 果を図10に示す。mAbの一つ1C6は、IP-10へのＴ細胞の走化性を遮断する能力が 他のmAbより優れていた。mAb 1C6は、IP-10へのＴ細胞の走化性を約0.8μg/mlの IC₅₀で用量依存的に完全に阻害することができた（図11）。トランスウェルの底 に至適濃度のIP-10（12.5nM）を使用すると、２〜５μg/mlの濃度で100％阻害が 達成された。使用した条件下で1C6は、ケモカイン受容体 CCR2bを介して起こるMCP-1へのＴ細胞走化性を有意に阻害できなかった（図10） 。 またmAb 1C6は活性化Ｔ細胞への¹²⁵I標識IP-10結合を0.16μg/mlのIC₅₀で完全 に遮断することができた（図12）。１〜10μg/mlの抗体で完全な阻害が得られた 。mAb 1C6によってIP-10結合と走化性の両方が完全に阻害されることは、活性化 Ｔ細胞がこのケモカインを結合する別の受容体を発現しないことを示している。 ノーザンブロット分析は、CXCR3が活性化Ｔ細胞で発現されることを示した。 一群の特異的mAbを使用することにより、CXCR3は血液Ｔ細胞の亜集団と他の白血 球タイプ（Ｂ細胞およびNK細胞）に発現されることがわかった。CXCR3を発現す るＴ細胞は先の活性化と合致した表現型、すなわちCD45R0+、CD26+を有した（実 施例５）。Ｔ細胞の染色は、Ｔ細胞がCD3とIL-2で活性化されると著しく増大し 、それはIP-10に応答して起こる細胞移動および放射標識リガンド結合量の増大 と相関した。 血液Ｔ細胞が少なくとも走化性アッセイでIP-10またはMigに対して低い応答性 を示すことは変則的であるように思われる。その理由として、受容体発現以外の 要因が化学誘引物質に対する細胞の応答性を決定しうることが考えられる。シグ ナル伝達には適当なＧタンパク質共役が必要かもしれない。もう一つの可能性は 、Ｔ細胞上とNK細胞上のIL-8受容体について観察されているように(C.R．Mackay )、血液分離操作がこの受容体を破壊することである。適当な実験動物の皮膚へ のIP-10の注射により、血液Ｔ細胞でのCXCR3発現の意義を検討できる。活性化Ｔ 細胞では、IP-10が最も強力な化学誘引物質の一つである。Ｔ細胞の活性化は、 受容体シグナル伝達分子またはシグナル伝達に必要な共役を誘導しうる。実施例７．mAb 1C6はIP-10に応答したＴ細胞による[Ca²⁺]_iを選択的に阻害する が、Migに応答したＴ細胞による[Ca²⁺]_iは阻害しない 細胞内カルシウム濃度（[Ca²⁺]_i）は次のように測定した．Fura-2 AM（Molecu lar Probes社，オレゴン州ユージーン）の原液は、その色素50μgを44μlのDMSO に溶解することによって調製した。細胞に添加する直前に、その原液をCa²⁺とMg²⁺ を含むHBSSおよび２％BSAに１：100に希釈した。Fura-2 AMを0.2モル/10⁶細胞 の最終濃度で37℃で30分間細胞に添加した。標識化の後、過剰の色素を遠心分離 によって除去し、細胞を125mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl₂、1mM CaCl₂、0.5mMグ ルコース、0.025％BSAおよび20mM HEPES（pH7.4）に10⁶個/mlの濃度で再懸濁し た。[Ca²⁺]_iは日立F-2000蛍光分光計で340nmと380nmでの励起を使って測定した 。較正は、全放出に１％NP-40を使用し、遊離Ca²⁺のキレートに25μM EGTAを使 用して行なった。 IP-10とMigはヒトＴ細胞による[Ca²⁺]_iを誘導し、各ケモカインは他方のケモ カインに対する応答を完全に脱感作することができた（図13Ａ〜13Ｂ）。ケモカ インの滴定により、最大[Ca²⁺]_iがわずか2nM IP-10または2nM Migで達成される ことが明らかになった。mAb 1C6のアゴニスト/アンタゴニスト機能を調べるため 、mAb 1C6または無関係な同イソタイプの対照mAb注入後に、活性化Ｔ細胞を[Ca^{2 +} ]_iについて評価した。無関係な同イソタイプ対照mAbを注入されたＴ細胞は、そ れに続くIP-10の注入に対して強い[Ca²⁺]_i応答を示した（非掲載）。しかし、mA b 1C6で処理されたＴ細胞は、2nM IP-10で刺激しても[Ca²⁺]_iを示さなかった。I P-10に応答した活性化Ｔ細胞における[Ca²⁺]_iは、12.5mgの1C6によって完全に抑 制された。しかし50μg/mlの1C6でも、2nM Migに対するＴ細胞の応答には影響が なく（図13Ｄ）、これら２つのリガンドがこのmAbによって異なる影響を受ける ことが示された。対照として、CXCR3以外の受容体を介して起こるMIP-1αまたは RANTESに応答したＴ細胞の[Ca²⁺]_iへの効果について、mAb 1C6を試験した（非掲 載）。このmAbは、使用した条件下に効果がなかった。 IP-10結合とIP-10誘導性走化性を阻害するmAb 1C6は、活性化Ｔ細胞による カルシウム流動をも阻害したが、それらの条件下でMig誘導性カルシウム流動を 阻害しなかった。これらの結果は、IP-10とMigがCXCR3の異なる領域を介して結 合および／またはシグナル伝達することと、mAb 1C6がIP-10結合部位とそれに続 くシグナル伝達を遮断できたことを示唆している。したがって、ここにmAb 1C6 を用いて例証したように、個々のケモカインの作用を選択的に阻害する受容体ア ンタゴニストを開発することが可能である。 後述するように、CXCR3トランスフェクタントの染色は、CXCR3の最初の15Ｎ末 端アミノ酸残基を含むペプチドによって阻害されうる。mAb 1C6によるIP-10結合 とそれに続く応答の阻害は、この領域がリガンド結合にとって機能上とりわけ重 要であることを示唆している。1C6がMig誘導性のカルシウム流動を、使用した条 件下に阻害できないことから、IP-10結合とシグナル伝達にとって重要だと思わ れるmAb 1C6によって認識されるエピトープは、Mig結合および／またはシグナル 伝達には関与しないようである。実施例８．エピトープマッピング ペプチドはGenemed社（カリフォルニア州サウスサンフランシスコ）に発注し た。各15アミノ酸長のそれらペプチドは、CXCR3タンパク質の最初の45Ｎ末端残 基の異なる部分に相当する。 Ｐ１：ＭＶＬＥＶＳＤＨＱＶＬＮＤＡＥ（配列番号：２、残基１−１５） Ｐ２：ＶＡＡＬＬＥＮＦＳＳＳＹＤＹＧ（配列番号：２、残基１６−３０） Ｐ３：ＥＮＥＳＤＳＣＣＴＳＰＰＣＰＱ（配列番号：２、残基３１−４５） それらペプチドをますDMSOに溶解し、リン酸緩衝食塩水（PBS）で1mg/mlに希釈 した。1C6抗体による染色を遮断するペプチドの能力を調べるために、１μg/ml の精製1C6抗体を１×PBS、５％ウシ胎仔血清（FCS）中、100μg/mlの各ペプチド の存在下にCXCR3 L1.2トランスフェクタント（10⁵細胞；実施例３〜９に関 する材料と方法の項を参照されたい）と共に４℃で30分間インキュベートした。 最終体積は100μlだった。陽性染色はペプチドの非存在下に行なった。結合した mAbを抗マウスIgG-FITCで検出し、その結果をフローサイトメトリーで分析した 。 mAb 1C6による染色はP1によって完全に阻害され、このmAbがCXCR3タンパク質 の最初のＮ末端15アミノ酸中のエピトープを認識することが示唆された（図14Ａ 〜14Ｄ）。mAb 1C6と同じ融合（LS-77）から生成した3A8と呼ばれるもう一つのm Ab（LS77-3A8ともいう）の結合も、P1ペプチドによって阻害された。実施例９．トランスフェクト細胞での免疫化による抗CXCR3モノクローナル抗体 の作製 CXCR3構築物をトランスフェクトされ高レベルのヒトCXCR3を発現するL1.2細胞 でマウスを免疫することにより、さらなる抗CXCR3モノクローナル抗体を作製し た（上記材料と方法の項を参照されたい）。免疫化と融合ハイブリドーマの作製 は記述されているように行なった（Qin，S.ら，Eur．J．Immunol.，26：640(199 6)；Heath，H.ら，J．Clin．Invest.，99(2):178（1997））。抗CXCR3mAbは、活 性化ヒトＴ細胞とCXCR3トランスフェクタントの陽性染色によって同定した。８ 種類の抗CXCR3抗体が一つの融合（LS-104）で得られた。 CXCR3へのIP-10の結合を阻害するそれら抗体の能力を試験した。陽性クローン から得た組織培養上清（25μl）を、１×PBS、５％ウシ胎仔血清（FCS）(最終体 積100μl)中、CXCR3 L1.2トランスフェクタント細胞（実施例３〜９に関する材 料と方法の項）および0.05nMの放射標識¹²⁵I標識IP-10と共に４℃で30分間イン キュベートした。mAb 1C6と抗CXCR2（IL-8受容体Ｂ）mAbの上清も、それぞれ特 異的および非特異的mAb対照として使用した。総結合量は抗体の不在下に決定し た。40nMの非標識IP-10を競合因子として使用することによってバックグラウン ド結合量を求め、その値をmAbによる阻害百分率の計算に使用した。結 果を図15に示す。この融合（LS-104）から得られた抗体はすべて、50〜70％の範 囲の阻害百分率でIP-10結合を遮断できた。 これらのmAbを、シグナル伝達（Ca²⁺流動誘導能）を阻害する能力についても 、基本的に実施例７に記述したように評価したが、これらの抗体はいずれも使用 した条件下にMig媒介性のCa²⁺シグナル伝達を遮断できなかった。IP-10媒介性の CXCR3結合およびシグナル伝達が抗体によって阻害され、CXCR3を介したMig媒介 性のシグナル伝達が抗体によって阻害されないことは、これらの抗体がIP-10に よって媒介されるCXCR3機能を選択的に阻害できることを示している。 また、基本的に実施例８に記述したようにLS-104融合から得た抗体を用いて、 エピトープマッピング研究を行なった。その結果は種々の結合部位が認識される ことを示している（表２）。この結果は、これら抗体のうち３つがCXCR3の最初 の15Ｎ末端アミノ酸（配列番号：２の第１〜15残基）内のエピトープを認識し、 これら抗体のうち２つがCXCR3のアミノ酸16〜30（配列番号：２の第16〜30残基 ）内のエピトープを認識することを示唆している。P3ペプチドはこれら抗体のい ずれによる染色をも遮断せず、これは、これらの抗体がいずれもCXCR3のアミノ 酸31〜45（配列番号：２の第31〜45残基）に相当するペプチドを結合しなかった ことを示す。残り３つのmAbを用いた染色は、使用した条件下にどのペプチドに よっても有意に阻害されず、これらmAbが、一部重複した上記ペプチドの区間か らなるエピトープ、細胞表面に提示される構造エピトープ(conformational epit opes)、または受容体の他の部分にあるエピトープを結合しうることが示唆され た。また、これらのデータは、受容体トランスフェクタントでマウスを免疫する ことにより、CXCR3の様々な部分に対するmAbが得られうることをも示唆している 。 実施例10．mAb 1C6を用いた正常組織と炎症組織の免疫組織化学的分析 組織 ヒト組織（正常および炎症）は米国立衛生研究所（National Institutes of H ealth）の資金提供を受けた公共機関National Disease Research Instituteから 入手した。正常マカーク（アカゲザル）組織はNew England Regional Primate R esearch Center（ニューイングランド地方霊長類研究センター；マサチューセッ ツ州サウスボロ）から入手した。 免疫組織化学 アルカリホスファターゼ法．組織を厚さ４μmに切片化し、乾燥した後、２％ パラホルムアルデヒド／0.5×PBS中４℃で10分間固定した。PBS洗浄の後、非特 異的抗体結合部位を10％正常ヤギ血清／５％ヒトAB血清／PBSにより室温で30分 間遮断した。次に、精製した抗CXCR3ネズミmAb 1C6を0.3％Triton X100／0.2％T ween 20／１％FCS／５％ヒトAB血清および0.1％アジ化ナトリウム中に10μg/ml の濃度に希釈し、それを組織切片に適用して４℃で終夜インキュベートした。同 イソタイプの無関係なmAbを組織のステップセクション（step sections）に対し て陰性対照として使用した（IgG1，MOPC-21，Sigma社，ミズーリ州セントルイス ）。次に、ビオチニル化ヤギ抗マウスIgG（Vector社，カリフォルニア州バーリ ンゲーム）とアビジン-ビオチン-アルカリホスファターゼ複合体（Biogenex社， カリフォルニア州サンラモン）を順次加えた。内因性アルカリホスファターゼ活 性を遮断するためにレバミゾールを含有するFast Red（Biogenex社，カリフォル ニア州サンラモン）を発色原として使用し、マイヤーヘマトキシリンを対比染色 剤として使用した。 結果 ヒトおよびマカークの正常リンパ節：どちらの種でも、染色は、Ｔリンパ球で のCXCR3発現と合致して、リンパ球の傍皮質と髄索内のリンパ球の70〜80％に限 定された。 ヒトおよびマカクの脾臓：どちらの種でも、染色は、白色脾髄のリンパ濾胞の 周縁部に沿ったリンパ球と脾洞内に散在したリンパ球に限定された。このパター ンはＴリンパ球でのCXCR3発現と合致する。 ヒト胸腺：胸腺髄質はリンパ球と形態学的に合致する散在したCXCR3免疫反応 性単核細胞を含んだ。 この分析により、マカークCXCR3がmAb 1C6によって認識されることが明らかに なった。独立した実験により、マカーク細胞Ｔリンパ球をコンカナバリンＡお よびIL-2と共に培養することによってCXCR3がアップレギュレートされること、 マカークＴ細胞芽球かヒトIP-10に応答して走化性を示しうること、mAb 1C6がそ の走化性を遮断できること、および前もってヒトIP-10と共にインキュベートす ると、走化性によって評価されるマカーク芽球の脱感作が起こることが示された 。 下記の考察では、様々な数のCXCR3免疫反応性「単核細胞」が正常組織と炎症 組織の両方に同定された。これらの単核細胞は次の理由からおそらくＴリンパ球 だろう：ａ）フローサイトメトリーにより、CXCR3は多少のＢ細胞とNK細胞にも 検出されたものの、他の単核細胞には検出されず、CXCR3⁺細胞の大半がＴリンパ 球であることが明らかになった；ｂ）リンパ節と脾臓内では、Ｔ細胞が配置され ていることが知られている領域内のリンパ球がCXCR3に免疫反応性を示す唯一の 細胞である；ならびにｃ）次に挙げる組織内のCXCR3免疫反応性単核細胞は形態 学的にリンパ球と合致する。 非炎症ヒト組織：心臓、肝臓、腎臓、肺、皮膚、胸部、骨格筋、唾液腺、膵臓 、膣、子宮および卵巣を含む非炎症ヒト組織では、CXCR3発現かまばらで散在し た間質単核細胞に限定された。小腸と大腸の切片では、CXCR3を発現する単核細 胞が固有層とパイアー斑内に観察された。肝臓では、管周辺リンパ球も染色され 、肝細胞はわずかに染色された。 ヒト脳：染色は観察されなかった。 炎症ヒト組織：単核細胞の間質および血管周辺蓄積を特徴とする慢性的炎症組 織の複数切片をCXCR3発現について調べた。間質性腎炎（１症例，腎組織）、潰 瘍性大腸炎（１症例，結腸組織）、腸炎（１症例，小腸）および慢性膣炎（４症 例，膣）のヒト患者由来の組織を含むこれらの組織では、単核細胞の約50％〜90 ％がCXCR3に免疫反応性を示した。したがって、慢性的炎症組織は正常組織と比 較して、そこに含まれる間質単核細胞の数が多く、それら細胞のうちCXCR3に免 疫反応性を示すものの割合も高かった。 炎症組織の分析はリンパ球の約50〜90％がCXCR3を発現することを明らかにし たが、対応する正常組織ではCXCR3を発現するリンパ球の割合ははるかに低かっ た。これらの知見は、CXCR3を発現するリンパ球（おそらくはCXCR3を発現するＴ リンパ球）の慢性炎症部位への特異的な補充を示唆している。CXCR3はホーミン グまたは炎症部位に遊走する傾向を持つＴ細胞を特徴づけるようである。 均等物 当業者であれば、単なる日常的実験手法により、本明細書に記載された本発明 の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、あるいは確認することができるで あろう。かかる均等物は、下記請求の範囲に包含されるように意図されている。

【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１０年１０月１９日（１９９８．１０．１９） 【補正内容】 請求の範囲 １． 試験対象の薬剤と単離および／または組換え哺乳類ＣＸＣケモカイン受容 体３（ＣＸＣＲ３）タンパク質あるいはそのリガンド結合改変体を含む組成物と を、リガンドの結合に適する条件下に合わせる工程、および該薬剤と該哺乳類Ｃ ＸＣＲ３タンパク質もしくは改変体との間の複合体の形成を検出または測定する 工程を含む、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはそのリガンド結合改変体を結合 する薬剤を検出または同定する方法。 ２． 該薬剤がヒトＩＰ−１０、ヒトＭｉｇ、ＩＰ−１０の哺乳類ホモログおよ びＭｉｇの哺乳類ホモログからなる群より選ばれたリガンドである、請求項１記 載の方法。 ３． 該リガンドが放射性同位体、スピン標識、抗原標識、酵素標識、蛍光基ま たは化学発光基からなる群より選ばれた標識で標識される、請求項２記載の方法 。 ４． アッセイがヒトＩＰ−１０、ヒトＭｉｇ、ＩＰ−１０の哺乳類ホモログお よびＭｉｇの哺乳類ホモログからなる群より選ばれた１種以上のリガンドの存在 下に結合が決定される競合アッセイである、請求項２記載の方法。 ５． ａ） 試験対象の薬剤と組換え哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはそのリ ガンド結合改変体を発現する宿主細胞とを、リガンドの結合に適する条件下に合 わせる工程、および ｂ） 該薬剤と哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質もしくはそのリガンド結合改変体と の間の複合体の形成を検出または測定する工程、 を含む、哺乳類ＣＸＣケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ３）タンパク質またはその リガンド結合改変体を結合する薬剤を検出または同定する方法。 ６． 該薬剤がヒトＩＰ−１０、ヒトＭｉｇ、ＩＰ−１０の哺乳類ホモログおよ びＭｉｇの哺乳類ホモログからなる群より選ばれたリガンドである、請求項５記 載の方法。 ７． アッセイがヒトＩＰ−１０、ヒトＭｉｇ、ＩＰ−１０の哺乳類ホモログお よびＭｉｇの哺乳類ホモログからなる群より選ばれた１種以上のリガンドの存在 下に結合が決定される競合アッセイである、請求項５記載の方法。 ８． 哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質もしくはそのリガンド結合改変体が細胞シグ ナル伝達および／または細胞応答を媒介し、かつシグナル伝達活性またはそれに 応答する該ＣＸＣＲ３タンパク質もしくは改変体の細胞応答を検出または測定す ることにより複合体形成をモニターする、請求項５記載の方法。 ９． ａ） 試験対象の薬剤と、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質のリガンドと単離 および／または組換え哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質あるいはそのリガンド結合改 変体を含む組成物とを、リガンドの結合に適する条件下に合わせる工程、および ｂ） 該哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質もしくは改変体と該リガンドとの間の複合 体の形成を検出または測定する工程であり、該薬剤による複合体形成の阻害が、 該薬剤が阻害剤であることの指標である、 を含む、哺乳類ＣＸＣケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ３）タンパク質もしくはそ のリガンド結合改変体へのリガンド結合の阻害剤を検出または同定する方法。 １０． 該リガンドがヒトＩＰ−１０、ヒトＭｉｇ、ＩＰ−１０の哺乳類ホモロ グおよびＭｉｇの哺乳類ホモログからなる群より選ばれた、請求項９記載の方法 。 １１． 単離および／または組換え哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはそのリガ ンド結合改変体を含む該組成物が組換え哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはその リガンド結合改変体を発現する宿主細胞を含有する、請求項９記載の方法。 １２． 該哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはそのリガンド結合改変体が細胞シ グナル伝達および／または細胞応答を媒介し、かつシグナル伝達活性またはそれ に応答する該ＣＸＣＲ３タンパク質もしくは改変体の細胞応答を検出あるいは測 定することにより複合体形成をモニターする、請求項１１記載の方法。 １３． ａ） 試験対象の薬剤と、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質のリガンドと組 換え哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質もしくはそのリガンド結合改変体を発現する宿 主細胞とを、リガンドの結合に適する条件下に合わせる工程、および ｂ） 該タンパク質もしくは改変体と該リガンドとの間の複合体の形成を検出ま たは測定する工程であり、該薬剤による複合体形成の阻害が、該薬剤が阻害剤で あることの指標である、 を含む、哺乳類ＣＸＣＲ３ケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ３）タンパク質もしく はそのリガンド結合改変体へのリガンド結合の阻害剤を検出または同定する方法 。 １４． 該リガンドがヒトＩＰ−１０、ヒトＭｉｇ、ＩＰ−１０の哺乳類ホモロ グおよびＭｉｇの哺乳類ホモログからなる群より選ばれた、請求項１３記載の方 法。 １５． 哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはそのリガンド結合改変体が細胞シグ ナル伝達および／または細胞応答を媒介することができ、かつシグナル伝達活性 またはそれに応答する該ＣＸＣＲ３タンパク質または改変体の細胞応答を検出あ るいは測定することにより複合体形成をモニターする、請求項１３記載の方法。 １６． 該薬剤が抗体または抗体断片である、請求項１３記載の方法。 １７． 試験対象の薬剤と （ａ） 組換え哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはその機能的改変体を発現する 宿主細胞と （ｂ） リガンドまたはその促進剤とを、リガンドもしくは促進剤誘導応答を検 出するに適する条件下に合わせる工程、および 試験対象薬剤の該応答を阻害する能力を評価する工程であり、薬剤によるリガン ドまたは促進剤誘導応答の阻害が、薬剤が阻害剤であることの指標である、 を含み、該機能的改変体がＩＰ−１０、Ｍｉｇ、ＩＰ−１０のホモログおよびＭ ｉｇのホモログからなる群より選ばれた少なくとも１種のケモカインを選択的に 結合することができる、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質もしくはその機能的改変体 の阻害剤を検出または同定する方法。 １８． 該応答がシグナル伝達活性またはそれに応答する該哺乳類ＣＸＣＲ３タ ンパク質もしくはその改変体の細胞応答を検出あるいは測定することによりモニ ターされる、請求項１７記載の方法。 １９． 試験対象の薬剤と組換え哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質もしくはその機能 的改変体を発現する宿主細胞とを、受容体媒介応答を検出するに適する条件下に 合わせる工程、および 該応答を検出または測定する工程であり、該薬剤による応答の誘導または刺激が 薬剤が促進剤であることの指標である、 を含み、該機能的改変体がＩＰ−１０、Ｍｉｇ、ＩＰ−１０のホモログおよびＭ ｉｇのホモログからなる群より選ばれた少なくとも１種のケモカインを選択的に 結合することができる、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質もしくはその機能的改変体 の促進剤を検出または同定する方法。 ２０． 請求項９記載の方法によって同定された、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質 に特有の少なくとも１種の機能の阻害剤。 ２１． 請求項１７記載の方法によって同定された、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク 質に特有の少なくとも１種の機能の阻害剤。 ２２． 請求項１９記載の方法によって同定された、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク 質に特有の少なくとも１種の機能の促進剤。 ２３． 哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質と該タンパク質の少なくとも１種の機能の 阻害剤または促進剤とを接触させる工程、 を含む、哺乳類ＣＸＣケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ３）タンパク質の機能の少 なくとも１種を調節する方法。 ２４． 哺乳類へ治療上有効な量の哺乳類ＣＸＣケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ ３）タンパク質の阻害剤を投与して、それにより炎症を減少させること、 を含む、炎症性疾患または状態を処置する方法。 ２５． 炎症性疾患または状態がＴ細胞媒介疾患または状態である、請求項２４ 記載の方法。 ２６． 該阻害剤がヒトＣＸＣケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ３）タンパク質を 特異的に結合し、かつリガンドの結合、シグナル伝達活性および細胞応答機能か らなる群より選ばれたヒトＣＸＣＲ３タンパク質の機能の１種以上を阻害するこ とができる抗体またはその抗原結合断片である、請求項２４記載の方法。 ２７． 該抗体またはその断片がモノクローナル抗体１Ｃ６のヒトＣＸＣＲ３タ ンパク質への結合を競合することができる、請求項２６記載の方法。 ２８． 該抗体またはその断片がモノクローナル抗体またはその抗原結合断片で ある、請求項２７記載の方法。 ２９． 哺乳類ＣＸＣケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ３）タンパク質の天然のリ ガンド以外の促進剤の治療上有効な量を哺乳類へ投与すること、 を含む、抗腫瘍治療方法。 ３０． 哺乳類ＣＸＣケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ３）タンパク質の天然のリ ガンド以外の促進剤の治療上有効な量を哺乳類へ投与すること、 を含む、抗ウイルス治療方法。 ３１． ヒトＣＸＣケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ３）タンパク質を特異的に結 合し、かつリガンドの結合、シグナル伝達活性および細胞応答機能からなる群よ り選ばれたヒトＣＸＣＲ３タンパク質の機能の１種以上を阻害することができる 抗体またはその抗原結合断片。 ３２． リガンドの該ヒトＣＸＣＲ３タンパク質への結合を阻害する、請求項３ １記載の抗体またはその抗原結合断片。 ３３． ヒトＣＸＣＲ３タンパク質とＩＰ−１０およびＭｉｇからなる群より選 ばれた１種以上のリガンドとの相互作用を阻害することができる、請求項３１記 載の抗体またはその抗原結合断片。 ３４． モノクローナル抗体１Ｃ６のヒトＣＸＣＲ３タンパク質への結合を競合 することができる、請求項３３記載の抗体またはその抗原結合断片。 ３５． ヒトＣＸＣＲ３タンパク質とＩＰ−１０との相互作用を選択的に阻害す る、請求項３１記載の抗体またはその抗原結合断片。 ３６． 該受容体とのＩＰ−１０相互作用により媒介されるシグナル伝達活性ま たは細胞応答機能を阻害する、請求項３５記載の抗体またはその抗原結合断片。 ３７． 配列番号：２のＮ−末端細胞外セグメントに対応するヒトＣＸＣＲ３の 一部またはヒトＣＸＣＲ３タンパク質の少なくとも１種の免疫学的性質を有する その一部により、該結合が阻害されうる、請求項３１記載の抗体またはその抗原 結合断片。 ３８． 配列番号：２の１〜１５残基の配列と同じである配列を有するポリペプ チドにより、該結合が阻害されうる、請求項３１記載の抗体またはその抗原結合 断片。 ３９． 配列番号：２の１６〜３０残基の配列と同じである配列を有するポリペ プチドまたは配列番号：２の３１〜４５残基の配列と同じである配列を有するポ リペプチドにより、該結合が阻害されうる、請求項３８記載の抗体またはその抗 原結合断片。 ４０． 配列番号：２の１６〜３０残基の配列と同じである配列を有するポリペ プチドにより、該結合が有意に阻害されない、請求項３１記載の抗体またはその 抗原結合断片。 ４１． ヒトＩＰ−１０のヒトＣＸＣケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ３）タンパ ク質への結合を阻害することができ、かつシグナル伝達活性および細胞応答機能 からなる群より選ばれたＩＰ−１０結合に応答して該ＣＸＣＲ３タンパク質によ り媒介された機能の１種以上を阻害することができ、ヒトＣＸＣＲ３タンパク質 に結合できる、抗体またはその抗原結合断片。 ４２． １種以上のＩＰ−１０誘導カルシウム流動またはＩＰ−１０誘導走化性 を阻害することができる、請求項４１記載の抗体またはその抗原結合断片。 ４３． ヒトＣＸＣケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ３）タンパク質を結合する、 モノクローナル抗体１Ｃ６またはその抗原結合断片。 ４４． ａ） 試料と抗体またはその抗原結合断片とを接触させる工程であり、 該抗体または断片とヒトＣＸＣＲ３タンパク質との特異的結合に適する条件下に 、該抗体またはその断片がヒトＣＸＣＲ３タンパク質を結合する；および ｂ） 抗体−ＣＸＣＲ３または抗体断片−ＣＸＣＲ３複合体を検出する工程、 を含み、複合体の検出が該試料中のヒトＣＸＣＲ３の存在の指標である、試料中 のヒトＣＸＣケモカイン受容体３（ＣＸＣＲ３）タンパク質を検出する方法。 ４５． 該抗体または断片が検出可能な標識を含有する、請求項４４記載のヒト ＣＸＣＲ３タンパク質を検出する方法。 ４６． 該試料を該タンパク質を結合する抗体と接触する、請求項４４記載のヒ トＣＸＣＲ３タンパク質を検出する方法。 ４７． 該試料を該タンパク質を結合する抗体の抗原結合断片と接触する、請求 項４４記載のヒトＣＸＣＲ３タンパク質を検出する方法。 ４８． ハイブリドーマ細胞株ＨＢ−１２３３０。 【手続補正書】 【提出日】平成１２年８月２８日（２０００．８．２８） 【補正内容】 【図２】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｇ０１Ｎ 33/15 Ｇ０１Ｎ 33/50 Ｚ 33/50 Ｃ１２Ｎ 5/00 Ｂ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ， ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，Ｓ Ｄ，ＳＺ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＴ ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ， ＣＨ，ＣＮ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，Ｆ Ｉ，ＧＢ，ＧＥ，ＧＨ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＳ， ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，Ｍ Ｘ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＷ (72)発明者 モーゼル，ベルンハルト スイス国 シュテットレン チェーハー― 3066 カメンシュトラーセ 11 (72)発明者 チン，シーシン アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02173 レキシントン，タフト アヴェニ ュー 14 (72)発明者 マッケイ，チャールズ，アール. アメリカ合衆国 マサチューセッツ 02172 ウォータータウン，チャーチ ス トリート 126

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １． タンパク質または改変体が１種以上のケモカイン類を選択的に結合するこ とができ、かつ細胞シグナル伝達および／またはそれに応答した細胞応答を媒介 することができる、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはその機能的改変体をコー ドする単離核酸。 ２． 該核酸が中程度のストリンジェンシー条件下に、図１（配列番号：１）の 配列、その相補鎖、またはコード配列を含む図１（配列番号：１）の配列の一部 もしくはその相補鎖を有する２番目の核酸にハイブリダイズすることができる、 請求項１記載の単離核酸。 ３． 該単離核酸が本質的に純粋である、請求項１記載の単離核酸。 ４． 該タンパク質または改変体がヒトＩＰ−１０、ヒトＭｉｇ、ヒトＩＰ−１ ０の哺乳類ホモログおよびヒトＭｉｇの哺乳類ホモログからなる群より選ばれた ケモカインに選択的に結合することができる、請求項１記載の単離核酸。 ５． 該哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはその機能的改変体がヒトＣＸＣＲ３ タンパク質またはその機能的改変体である、請求項１記載の単離核酸。 ６． 配列番号：１、その相補鎖、またはコード配列を含む配列番号：１の一部 もしくはその相補鎖を含有してなる、請求項１記載の単離核酸。 ７． 該ヒトＣＸＣＲ３タンパク質が配列番号：２に示されたアミノ酸配列を有 する、請求項１記載の単離核酸。 ８． 請求項１記載の核酸を含有してなる単離核酸構築物。 ９． 該核酸が操作可能に発現制御配列に連結される、請求項８記載の単離核酸 構築物。 １０． 該核酸が配列番号：１、その相補鎖、またはコード配列を含む配列番号 ：１の一部もしくはその相補鎖を含有してなる、請求項８記載の単離核酸構築物 。 １１． 該核酸が図２（配列番号：２）に示されたアミノ酸配列を有するポリペ プチドをコードする、請求項８記載の単離核酸構築物。 １２． 該核酸が哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質を含む融合タンパク質をコードす る核酸であり、任意にコード配列が操作可能に発現制御配列に連結される、請求 項８記載の単離核酸構築物。 １３． タンパク質が１種以上のケモカイン類を選択的に結合することができ、 かつ細胞シグナル伝達および／またはそれに応答した細胞応答を媒介することが できる、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはその機能的改変体をコードする組換 え核酸を含有してなる宿主細胞。 １４． 該核酸が操作可能に発現制御配列に連結される、請求項１３記載の宿主 細胞。 １５． 該核酸が配列番号：１によりコードされるヒトＣＸＣＲ３タンパク質を コードする、請求項１３記載の宿主細胞。 １６． タンパク質が１種以上のケモカイン類を選択的に結合することができ、 かつ細胞シグナル伝達および／またはそれに応答した細胞応答を媒介することが できる、単離哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはその機能的改変体。 １７． 該哺乳類がヒトであり、かつ該タンパク質がヒトＩＰ−１０およびヒト Ｍｉｇからなる群より選ばれた１種以上のケモカイン類に選択的に結合すること ができる、請求項１６記載の単離哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはその機能的 改変体。 １８． 中程度のストリンジェンシー条件下に、図１（配列番号：１）の配列、 その相補鎖、またはコード配列を含む図１（配列番号：１）の配列の一部もしく はその相補鎖を有する２番目の核酸にハイブリダイズすることができる核酸によ りコードされる、請求項１６記載の単離哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはその 機能的改変体。 １９． 図１（配列番号：１）に示された核酸によりコードされる、単離ヒトＣ ＸＣＲ３タンパク質。 ２０． 配列番号：２に示されたアミノ酸配列を有する、請求項１９記載の単離 ヒトＣＸＣＲ３タンパク質。 ２１． 哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質を含有してなる融合タンパク質。 ２２． （ａ）宿主細胞に哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはその改変体をコー ドする核酸を導入する工程であり、それによりコード配列が発現制御配列に操作 可能に連結されたコード配列を有する組換え宿主細胞を生産する、および （ｂ）工程（ａ）で生産された宿主細胞を該核酸が発現する条件下に維持する工 程、 を含む、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはその改変体の生産方法。 ２３． さらに哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはその改変体を単離する工程を 含む、請求項２２記載の方法。 ２４． 哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはその改変体をコードする組換え核酸 を含む宿主細胞を核酸の発現に適する条件下に維持する工程を含む、哺乳類ＣＸ ＣＲ３タンパク質またはその改変体を生産する方法。 ２５． さらに哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはその改変体を単離する工程を 含む、請求項２４記載の方法。 ２６． 該哺乳類がヒトであり、かつ該タンパク質またはその改変体が、ヒトＩ Ｐ−１０およびヒトＭｉｇからなる群より選ばれた１種以上のケモカイン類を選 択的に結合することができる、請求項２４記載の方法。 ２７． 哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質を結合する、抗体または機能的抗体断片。 ２８． 該抗体または抗体断片が哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質の１種以上の機能 を阻害することができる、請求項２７記載の抗体または機能的抗体断片。 ２９． 該抗体または抗体断片がリガンドの哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質への結 合を阻害する、請求項２８記載の抗体または機能的抗体断片。 ３０． 該抗体または抗体断片がヒトＣＸＣＲ３タンパク質を結合することがで き、かつヒトＣＸＣＲ３タンパク質とＩＰ−１０および／またはＭｉｇからなる 群より選ばれた１種以上のリガンドとの相互作用を阻害することができる、請求 項２８記載の抗体または機能的抗体断片。 ３１． 該抗体または断片が、モノクローナル抗体１Ｃ６がヒトＣＸＣＲ３タン パク質またはその一部に結合することに競合することができる、請求項３０記載 の抗体または機能的抗体断片。 ３２． 該抗体または抗体断片がヒトＣＸＣＲ３タンパク質とＩＰ−１０との相 互作用を選択的に阻害する、請求項２８記載の抗体または機能的抗体断片。 ３３． 該抗体または断片がモノクローナル抗体１Ｃ６またはその抗原結合断片 である、請求項３２記載の抗体または機能的抗体断片。 ３４． ヒトＣＸＣＲ３タンパク質を結合する、抗体またはその抗原結合断片。 ３５． 配列番号：２のＮ−末端細胞外セグメントに対応するヒトＣＸＣＲ３の 一部またはヒトＣＸＣＲ３タンパク質の少なくとも１種の免疫学的性質を有する その一部により、該結合が阻害されうる、請求項３４記載の抗体またはその抗原 結合断片。 ３６． 配列番号：２の１〜１５残基の配列と同じである配列を有するポリペプ チドと配列番号：２の１６〜３０残基の配列と同じである配列を有するポリペプ チドとからなる群より選ばれたポリペプチドにより、該結合が阻害されうる、請 求項３４記載の抗体またはその抗原結合断片。 ３７． 試験対象の薬剤と単離および／または組換え哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク 質あるいはそのリガンド結合改変体を含む組成物とを、リガンドの結合に適する 条件下に合わせる工程、および該薬剤と該哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質もしくは 改変体との間の複合体の形成を検出または測定する工程を含む、哺乳類ＣＸＣＲ ３タンパク質またはそのリガンド結合改変体を結合する薬剤を検出または同定す る方法。 ３８． 該薬剤がヒトＩＰ−１０、ヒトＭｉｇ、ＩＰ−１０の哺乳類ホモログお よびＭｉｇの哺乳類ホモログからなる群より選ばれたリガンドである、請求項３ ７記載の方法。 ３９． 該リガンドが放射性同位体、スピン標識、抗原標識、酵素標識、蛍光基 または化学発光基からなる群より選ばれた標識で標識される、請求項３８記載の 方法。 ４０． アッセイがヒトＩＰ−１０、ヒトＭｉｇ、ＩＰ−１０の哺乳類ホモログ およびＭｉｇの哺乳類ホモログからなる群より選ばれた１種以上のリガンドの存 在下に結合が決定される競合アッセイである、請求項３８記載の方法。 ４１． ａ） 試験対象の薬剤と組換え哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはその リガンド結合改変体を発現する宿主細胞とを、リガンドの結合に適する条件下に 合わせる工程、および ｂ） 該薬剤と哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質もしくはそのリガンド結合改変体と の間の複合体の形成を検出または測定する工程、 を含む、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはそのリガンド結合改変体を結合する 薬剤を検出または同定する方法。 ４２． 該薬剤がヒトＩＰ−１０、ヒトＭｉｇ、ＩＰ−１０の哺乳類ホモログお よびＭｉｇの哺乳類ホモログからなる群より選ばれたリガンドである、請求項４ １記載の方法。 ４３． アッセイがヒトＩＰ−１０、ヒトＭｉｇ、ＩＰ−１０の哺乳類ホモログ およびＭｉｇの哺乳類ホモログからなる群より選ばれた１種以上のリガンドの存 在下に結合が決定される競合アッセイである、請求項４１記載の方法。 ４４． 哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質もしくはそのリガンド結合改変体が細胞シ グナル伝達および／または細胞応答を媒介し、かつシグナル伝達活性またはそれ に応答する該ＣＸＣＲ３タンパク質もしくは改変体の細胞応答を検出または測定 することにより複合体形成をモニターする、請求項４１記載の方法。 ４５． ａ）試験対象の薬剤と、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質のリガンドと単離 および／または組換え哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質あるいはそのリガンド結合改 変体を含む組成物とを、リガンドの結合に適する条件下に合わせる工程、および ｂ） 該哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質もしくは改変体と該リガンドとの間の複合 体の形成を検出または測定する工程であり、該薬剤による複合体形成の阻害が、 該薬剤が阻害剤であることの指標である、 を含む、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質もしくはそのリガンド結合改変体へのリガ ンド結合の阻害剤を検出または同定する方法。 ４６． 該リガンドがヒトＩＰ−１０、ヒトＭｉｇ、ＩＰ−１０の哺乳類ホモロ グおよびＭｉｇの哺乳類ホモログからなる群より選ばれた、請求項４５記載の方 法。 ４７． 単離および／または組換え哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質を含む該組成物 が組換え哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質を発現する宿主細胞を含有する、請求項４ ５記載の方法。 ４８． 該哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質が細胞シグナル伝達および／または細胞 応答を媒介し、かつシグナル伝達活性またはそれに応答する該ＣＸＣＲ３タンパ ク質もしくは改変体の細胞応答を検出あるいは測定することにより複合体形成を モニターする、請求項４７記載の方法。 ４９． ａ）試験対象の薬剤と、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質のリガンドと組換 え哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質もしくはそのリガンド結合改変体を発現する宿主 細胞とを、リガンドの結合に適する条件下に合わせる工程、および ｂ） 該タンパク質もしくは改変体と該リガンドとの間の複合体の形成を検出ま たは測定する工程であり、該薬剤による複合体形成の阻害が、該薬剤が阻害剤で あることの指標である、 を含む、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質もしくはそのリガンド結合改変体へのリガ ンド結合の阻害剤を検出または同定する方法。 ５０． 該リガンドがＩＰ−１０、Ｍｉｇ、ＩＰ−１０の哺乳類ホモログおよび Ｍｉｇの哺乳類ホモログからなる群より選ばれた、請求項４９記載の方法。 ５１． 該哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質が細胞シグナル伝達および／または細胞 応答を媒介することができ、かつシグナル伝達活性またはそれに応答する該ＣＸ ＣＲ３タンパク質の細胞応答を検出あるいは測定することにより複合体形成をモ ニターする、請求項４９記載の方法。 ５２． 該薬剤が抗体または抗体断片である、請求項４９記載の方法。 ５３． 試験対象の薬剤と（ａ）組換え哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質またはその 機能的改変体を発現する宿主細胞と（ｂ）リガンドまたはその促進剤とを、リガ ンドもしくは促進剤誘導応答を検出するに適する条件下に合わせる工程、および 試験対象薬剤の該応答を阻害する能力を評価する工程であり、薬剤によるリガン ドまたは促進剤誘導応答の阻害が、薬剤が阻害剤であることの指標である、 を含む哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質もしくはその機能的改変体の阻害剤を検出ま たは同定する方法。 ５４． 該応答がシグナル伝達活性またはそれに応答する該哺乳類ＣＸＣＲ３タ ンパク質もしくはその改変体の細胞応答を検出あるいは測定することによりモニ ターされる、請求項５３記載の方法。 ５５． 試験対象の薬剤と組換え哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質もしくはその機能 的改変体を発現する宿主細胞とを、受容体媒介応答を検出するに適する条件下に 合わせる工程、および 該応答を検出または測定する工程であり、該薬剤による応答の誘導または刺激が 薬剤が促進剤であることの指標である、 を含む、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質もしくはその機能的改変体の促進剤を検出 または同定する方法。 ５６． 請求項４５記載の方法によって同定された、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク 質に特有の少なくとも１種の機能の阻害剤。 ５７． 該阻害剤が受容体に結合可能な抗体またはその一部である、請求項５６ 記載の阻害剤。 ５８． 請求項５３記載の方法によって同定された、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク 質に特有の少なくとも１種の機能の阻害剤。 ５９． 請求項５５記載の方法によって同定された、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク 質に特有の少なくとも１種の機能の促進剤。 ６０． ａ） 抗体と選択された哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質との特異的結合に 適する条件下に、試料と該タンパク質を結合する抗体とを接触させる工程；およ び ｂ） 抗体−ＣＸＣＲ３複合体を検出する工程、 を含む、試料中の選択された哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質の検出方法。 ６１． 哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質と該タンパク質の少なくとも１種の機能の 阻害剤または促進剤とを接触させる工程、 を含む、哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質の機能の少なくとも１種を調節する方法。 ６２． 哺乳類へ治療上有効な量の哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質の阻害剤を投与 して、それにより炎症を減少させること、 を含む、炎症性疾患または状態を処置する方法。 ６３． 炎症性疾患または状態がＴ細胞媒介疾患または状態である、請求項６２ 記載の方法。 ６４． 該阻害剤が哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質に特異的に結合する抗体または その抗原結合断片である、請求項６２記載の方法。 ６５． 該抗体またはその断片がモノクローナル抗体１Ｃ６のヒトＣＸＣＲ３タ ンパク質への結合を競合することができる、請求項６４記載の方法。 ６６． 該抗体またはその断片がモノクローナル抗体１Ｃ６またはその抗原結合 断片である、請求項６５記載の方法。 ６７． 哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質の天然のリガンド以外の促進剤の治療上有 効な量を哺乳類へ投与すること、 を含む、抗腫瘍治療方法。 ６８． 哺乳類ＣＸＣＲ３タンパク質の天然のリガンド以外の促進剤の治療上有 効な量を哺乳類へ投与すること、 を含む、抗ウイルス治療方法。 ６９． 配列：ａ）配列番号：１、 ｂ）コード領域を含むその一部、 ｃ）または（ａ）および（ｂ）のいずれかのＲＮＡ体 を有する核酸にハイブリダイズする配列をもつ核酸を含有してなるアンチセンス 核酸。