JP4955040B2 - Cxcr3ケモカイン受容体、抗体、核酸および使用方法 - Google Patents
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Description
ケモカイン類は、炎症において生成される小さいサイトカイン類のファミリーを構成し、白血球補充(recruitment) を制御する[Baggiolini, M. et al., Adv. Immunol. 55: 97-179 (1994); Springer,T.A., Annu. Rev. Physiol. 57: 827-872(1995); and Schall, T.J. and K.B. Bacon, Curr. Opin. Immunol. 6:865-873(1994)]。ケモカイン類は、例えば、好中球、単球、マクロファージ、好酸球、好塩基球、マスト細胞などの白血球、ならびにT 細胞、B 細胞などのリンパ球などを含む血液を構成する(赤血球以外の)要素の走化性を選択的に誘導できる。走化性の刺激に加えて、ケモカイン類は、応答性細胞において、細胞形状の変化、細胞内遊離カルシウム濃度([Ca2+]i )の一過性上昇、顆粒エキソサイトーシス、インテグリンアップレギュレーション、生理活性脂質(ロイコトリエンなど)の形成および呼吸バーストなどの白血球の活性化に伴う他の変化を選択的に誘発することもできる。したがってケモカイン類は炎症性応答の初期誘因剤であり、感染または炎症部位への炎症媒介物質の放出、走化性および管外溢出を引き起こす。
〔1〕ヒトCXCケモカインレセプター3(CXCR3)タンパク質への、IP−10およびMigからなる群より選択されるリガンドの結合を阻害する方法であって、該CXCR3タンパク質を、配列番号:2のアミノ酸配列を有するヒトCXCケモカインレセプター3(CXCR3)タンパク質に結合する抗体または抗原結合断片と接触させる工程を含む、方法、
〔2〕ヒトCXCR3タンパク質への、IP−10およびMigからなる群より選択されるリガンドの結合を阻害する方法であって、該CXCR3タンパク質を、ヒトCXCR3タンパク質に結合する抗体または抗原結合断片と接触させる工程を含み、結合が、配列番号:2の残基1〜15の配列と同じアミノ酸配列からなるポリペプチドによって阻害される、方法、
〔3〕配列番号:2に示されるアミノ酸配列を有する哺乳動物CXCケモカインレセプター3(CXCR3)タンパク質のシグナル伝達活性または細胞応答機能を阻害する方法であって、該タンパク質を、配列番号:2のアミノ酸配列を有するヒトCXCR3タンパク質と結合する抗体または抗原結合断片と接触させる工程を含む、方法、
〔4〕配列番号:2に示されるアミノ酸配列を有するヒトCXCケモカインレセプター3(CXCR3)タンパク質への、IP−10およびMigからなる群より選択されるリガンドの結合を阻害する方法であって、該タンパク質を、モノクローナル抗体1C6(ATCC受託番号HB−12330)またはその抗原結合断片と接触させる工程を含む、方法、
〔5〕配列番号:2に示されるアミノ酸配列を有するヒトCXCケモカインレセプター3(CXCR3)タンパク質によって媒介されるIP−10誘導カルシウムフラックスを阻害する方法であって、該タンパク質を、配列番号:2のアミノ酸配列を有するヒトCXCR3タンパク質と結合する抗体または抗原結合断片と接触させる工程を含む、方法、
〔6〕配列番号:2に示されるアミノ酸配列を有するヒトCXCケモカインレセプター3(CXCR3)タンパク質を介するIP−10誘導走化性を阻害する方法であって、該タンパク質を、配列番号:2のアミノ酸配列を有するヒトCXCR3タンパク質と結合する抗体または抗原結合断片と接触させる工程を含む、方法、
〔7〕CXCケモカインレセプター3(CXCR3)タンパク質のシグナル伝達活性または細胞応答機能を阻害する方法であって、該CXCR3タンパク質を、配列番号:2のアミノ酸配列を有するヒトCXCR3タンパク質と結合する抗体または抗原結合断片と接触させる工程を含み、該抗体がモノクローナル抗体1C6(ATCC受託番号HB−12330)の軽鎖CDR(CDR1、CDR2およびCDR3)および重鎖CDR(CDR1、CDR2およびCDR3)ならびにヒト枠組み領域を含むヒト化免疫グロブリンであり、該ヒト化免疫グロブリンがモノクローナル抗体1C6(ATCC受託番号HB−12330)と同じまたは類似のエピトープ特異性を有する、方法、
〔8〕ヒトCXCケモカインレセプター3(CXCR3)タンパク質への、IP−10およびMigからなる群より選択されるリガンドの結合を阻害する方法であって、該CXCR3タンパク質を、ハイブリドーマ細胞株HB−12330により産生される抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程を含む、方法、
〔9〕哺乳動物CXCケモカインレセプター3(CXCR3)タンパク質のシグナル伝達活性または細胞応答機能を阻害する方法であって、該CXCR3タンパク質を、配列番号:2のアミノ酸配列を有するヒトCXCR3タンパク質と結合する抗体または抗原結合断片と接触させる工程を含み、該抗体がモノクローナル抗体1C6(ATCC受託番号HB−12330)の軽鎖CDR(CDR1、CDR2およびCDR3)および重鎖CDR(CDR1、CDR2およびCDR3)ならびにヒト枠組み領域を含むヒト化免疫グロブリンであり、該ヒト化免疫グロブリンがモノクローナル抗体1C6(ATCC受託番号HB−12330)と同じまたは類似のエピトープ特異性を有する、方法
に関する。
本発明は、本明細書において、CXC ケモカイン受容体3(CXCR3)と称する単離および/または組換え哺乳類(例えば、ヒトなどの霊長類)IP-10/Mig 受容体タンパク質ならびにその改変体を称するタンパク質またはポリペプチドに関する。組換えCXCR3 タンパク質および改変体は、本明細書に記載のように宿主細胞中で生産されうる。1 つの態様として、CXCR3 タンパク質またはその改変体は、IP-10 および/またはMig などの1 以上のケモカイン類の選択的結合 (例えば、高いアフィニティー結合) 、および/または (1 種以上の) 細胞応答( 例えば、走化性、エキソサイトーシス、1 種以上の炎症媒介物質の放出など) を誘導する能力により特徴付けられる。
本明細書に記述するように、CXCケモカインIP-10およびMigに選択的な新規ケモカイン受容体をコードする核酸をクローニングし、特徴づけた。ヒトCD4+ T細胞ライブラリーから単離されたこのクローンは、単球または顆粒球由来のcDNAライブラリーには検出されなかった。このクローンの配列を分析したところ、40,659ダルトンの予想分子量を持つ368アミノ酸の予想タンパク質(図2、配列番号:2)をコードする1104塩基対のオープンリーディングフレームが明らかになった(図1、配列番号:1)。このアミノ酸配列は、Gタンパク質共役受容体の特徴であり、かつ他の化学誘引物質受容体にも認められる7つの推定膜貫通セグメントを含んでいる。この知見と合致して、本受容体は、IP-10およびMigに応答して起こるCa2+(カルシウムイオン)の流動化と走化性とを媒介する(実施例2)。類似の条件下で、CXCケモカイン類IL-8、GROα、NAP-2(好中球活性化タンパク質-2)、GCP-2(顆粒球走化性タンパク質-2)、ENA78(上皮由来好中球活性化ペプチド78)、PF4(血小板因子4)や、CCケモカイン類MCP-1(単球走化性タンパク質-1)、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MIP-1α(マクロファージ炎症性タンパク質-1α)、MIP-1β、RANTES(regulated on activation, normal T cell expressed and secreted)(発現かつ分泌された正常T細胞活性化制御)、I309、エオタキシンまたはリンフォタクチンに対する有意な応答は検出されなかった。
本発明は、哺乳類CXCR3タンパク質と呼ばれる単離および/または組換え(例えば本質的に純粋なものを含む)タンパク質またはポリペプチドおよびその改変体に関する。好ましい態様として、本発明の単離および/または組換えタンパク質は、哺乳類CXCR3タンパク質(本明細書に定義する)に特有な、結合活性(例えばリガンド、阻害因子および/または促進因子結合性)、シグナル伝達活性(例えば哺乳類Gタンパク質の活性化、サイトゾル遊離カルシウム濃度[Ca2+]iの迅速かつ一過性の上昇の誘導)、細胞応答機能(例えば走化性、エキソサイトーシスまたは白血球による炎症媒介物質放出の刺激)および/または本明細書に定義する免疫学的性質などの性質、活性または機能を少なくとも一つは持つ。例えば、本発明のタンパク質には、IP-10および/またはMigに選択的に結合でき、それに対する細胞のシグナル伝達および/または応答(例えば(とりわけ活性化Tリンパ球の)カルシウム流動、走化性および/または脱顆粒)をイン・ビトロおよび/または生体内で媒介できるものがある。例えば本明細書に示すように、cDNAクローンの発現により哺乳類細胞中で生産されたヒトCXCR3タンパク質は、CXCケモカインIP-10および/またはMigに選択的に結合して、シグナル伝達と細胞応答(例えば走化性)を媒介することができる。一態様として本発明のタンパク質は、同じ哺乳類種または異なる哺乳類種に由来するCXCケモカイン(例えばヒトIP-10、ネズミIP-10、ヒトMig、ネズミMig)を結合できる(ヒトIP-10, Luster, A.D.ら, Nature, 315:672-676 (1985);ネズミIP-10(CRG-2とも呼ばれる),Vanguri, P.およびJ.M. Farber, J. Biol. Chem., 265:15049 (1990) ならびにLuster, A.D.およびP. Leder, J. Exp. Med., 178:1057-1065 (1993);ネズミMig, Farber, J.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87:5238-5242 (1990);ヒトMig, Farber, J.M., Biochem. Biophys. Res. Commun., 192 (1):223-230 (1993) ならびにLiao, F.ら, J. Exp. Med., 182:1301-1314 (1995))。
本発明は、本明細書に記載された哺乳類(ヒト等)CXCR3タンパク質またはその改変体をコードする単離および/または(本質的に純粋な等を含む)組換え核酸に関する。本明細書でいう「単離」核酸とは、起源の供給源のゲノムDNAまたは細胞RNAの(例えば、細胞中またはライブラリー等の核酸混合物中に存在するような)核酸から離れて分離された核酸をいい、さらなるプロセッシングを受けてもよい。「単離」核酸は、本明細書に記載された方法、類似の方法または他の好適な方法により得られた核酸を含み、本質的に純粋な核酸、化学合成により製造された核酸、生物学的方法と化学的方法との組み合わせにより製造された核酸および単離された組換え核酸を含む。本明細書でいう「組換え」核酸とは、組換えDNA方法論により製造された核酸をいい、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)および/または制限酵素を用いるベクターへのクローニング等の人工的な組換え方法に依存する手法により生成される核酸を含む。また、「組換え」核酸は、細胞の天然のメカニズムを介して起こる組換え事象からも生ずるが、所望の組換え事象の可能性および蓋然性を生じさせるように設計された核酸の細胞に導入後に選択されるものである。
(1)(a)配列番号:1の配列を有する核酸、
(b)配列番号:1に相補的な配列を有する核酸、または
(c)配列番号:1のオープンリーディングフレームを含有する前記核酸
の一部(図1に示した鎖の部分または相補鎖の対応する部分)、
にハイブリダイズする能力;および/または
(2)配列番号:2のアミノ酸配列を有するポリペプチドまたはその機能的同等物(即ち、受容体の1以上の天然または生理学的リガンドに関するリガンド結合活性を有するポリペプチド、および/または細胞応答(例えば、走化性、エキソサイトーシスまたは白血球による炎症性媒介物質放出の(誘発または刺激を含む)誘導)を誘導可能なように、リガンド結合に応答可能な刺激する機能)をコードする能力;および/または
(3)両方の特性、
により特徴付けられる、二本鎖もしくは一本鎖DNAまたはRNAを含む単離および/または組換え核酸に関する。
別の態様において、核酸は、センス鎖からなる標的分子に全体または一部が相補的で、その標的分子とハイブリダイズできるアンチセンス核酸である。標的はDNAであってもよいし、そのRNA体(すなわちDNAのT残基がRNA体ではU残基である)であってもよい。適当な方法で細胞に導入すると、アンチセンス核酸は、そのセンス鎖がコードする遺伝子の発現を阻害できる。アンチセンス核酸は標準的な技術で製造できる。
本発明のもう1つの側面は、哺乳類CXCR3タンパク質またはその改変体(一部等)を製造する方法に関する。組換えタンパク質は、例えば、適当な宿主細胞において哺乳類CXCR3またはその改変体をコードする組換え核酸(例えば、DNA)分子の発現等により得ることができる。
組換え哺乳類CXCR3タンパク質またはその改変体を生産する宿主細胞は、次のように作製できる。所望のタンパク質のコード配列の全部または一部をコードする核酸を、例えばプラスミド、ウイルスまたは他の適当な発現用レプリコンなどのDNAベクターなどの核酸ベクターに挿入することができる。シングルコピーもしくはマルチコピーとして維持されるベクターまたは宿主細胞染色体に組込まれるベクターを含む種々のベクターが利用可能である。
さらに本発明は、哺乳類CXCR3タンパク質またはその一部と反応する抗体に関する。好ましい態様において、抗体は、単数または複数の哺乳類CXCR3受容体またはその一部を特異的に結合する。1つの態様において、単離および/または組換え哺乳類CXCR3タンパク質またはその一部(例えばペプチド)または組換え哺乳類CXCR3を発現する宿主細胞に対して抗体を生じさせる。
本明細書において、リガンドは、受容体タンパク質を結合する物質である。選択された哺乳類CXCR3 タンパク質のリガンドは、選択された哺乳類CXCR3 タンパク質に結合する物質である。好ましい態様として、哺乳類CXCR3 タンパク質のリガンド結合は、高いアフィニティーで生じる。リガンドという用語は、限定されないが、天然リガンド、単離および/ または精製された、合成および/ または組換え体、天然リガンドのホモログ(例えば別の哺乳類由来のもの)、抗体、かかる分子の一部ならびに受容体を結合する他の物質などの物質を意味する。選択した哺乳類受容体の天然リガンドは生理学的条件下でその受容体に結合でき、哺乳類CXCR3 タンパク質のものと同じ哺乳類起源のものである。リガンドという用語は、受容体活性の阻害剤または促進剤である物質ならびに選択的に受容体に結合するが阻害剤活性や促進剤活性を欠く物質を包含する。
本発明の単離および/ または組換え受容体タンパク質もしくはその機能的改変体、その一部または適当な融合タンパク質は、ヒトCXCR3 などの(1 以上の)哺乳類CXCR3 タンパク質に結合する薬剤、およびリガンドあるいは受容体活性の潜在的阻害剤または促進剤である薬剤を選択および同定する方法に使用できる。この方法によって選択される、リガンド、阻害剤または促進剤を含む薬剤を、受容体機能に対する阻害または刺激効果および/ または治療的用途についてさらに評価できる。
G タンパク質共役受容体の(アゴニストなどによる)結合は、該受容体によるシグナル伝達をもたらすことができ、G タンパク質の活性化を刺激する。薬剤によるシグナル伝達機能の誘導は、いかなる適切な方法をも用いてモニターできる。例えば、GTP からGDP への加水分解、または受容体結合により誘発される後期のシグナル伝達事象、例えば、細胞内(サイトゾル)遊離カルシウム濃度[Ca2+]iの迅速かつ一過性の増加の誘導などを、当該分野公知の方法または他の適切な方法で評価できる(実施例2; Neote, K.et al., Cell, 72: 415-425 1993) Van Riper et al., J. Exp. Med., 177: 851-856 (1993); Dahinden, C.A. et al., J. Exp. Med., 179: 751-756(1994)をも参照のこと)。
受容体機能を評価するため走化性アッセイも使用できる。これらのアッセイは薬剤によって誘発されるイン・ビトロまたはイン・ビボの細胞の機能的移動に基づいており、これらのアッセイを用いてリガンド、阻害剤または促進剤の結合および/ または走化性への効果を評価できる。
治療薬として、イン・ビボでのリガンド、阻害剤、または促進剤の効果を評価するために用いられうる多様な炎症のイン・ビボモデルが利用でき、ヒツジ喘息モデル[例えば、Weg, V. B. et al., J. Exp. Med., 177: 561(1993)を参照のこと、その教示は、参照により本明細書に取り込まれる]、ラット遅延型過敏モデル[Rand, M.L. et al., Am.J.Pathol., 148:855-864(1996)、その教示は、参照により本明細書に取り込まれる]または、他の適切なモデルがあげられる。他の哺乳類CXCR3タンパク質と交差反応する抗体の活性をかかる哺乳類で評価することができる。
本発明は様々な診断的用途を持つ。例えば、哺乳類CXCRタンパク質をコードする遺伝子の1 もしくは複数の変異は、コードされる受容体の機能の少なくとも 1種の欠損を引き起こし、それにより受容体機能を減少または促進することができる。例えば、受容体の改変体を生じるまたは発現のレベルを変える変異は、受容体機能、受容体により媒介される減少または促進段階( 例えば、炎症過程) を減少または促進することができる。かかる変異の存在は、個々の細胞(例えば、活性化Tリンパ球などの白血球など)中またはかかる細胞から単離した受容体標品におけるの受容体もしくは受容体機能の存在を検出あるいは測定する方法を用いて決定されうる。これらのアッセイにおいて、受容体の減少したもしくは促進したレベルおよび/または減少したもしくは促進した受容体機能を評価しうる。
組換えDNA 技術を用いて宿主動物のゲノムが改変されたトランスジェニック動物を構築することができる。1つの態様において、その改変が遺伝性でない(例えば骨髄中の先祖細胞などの体細胞を改変する)。別の態様において、その改変が遺伝性である(生殖細胞系を改変する)。トランスジェニック動物は標準的な技術または他の適当な方法で構築できる [例えば、T リンパ球の改変に関するCooke, M.P. ら, Cell, 65: 281-291 (1991); Hanahan, D., Science, 246: 1265-1275 (1989); Anderson, et al., 米国特許第5,399,346 号明細書] 。
哺乳類CXCR3タンパク質に特有の少なくとも1種の機能の阻害または促進を介して、本発明の哺乳類CXCR3機能の調節は、受容体媒介機能を阻害又は促進する有効かつ選択的な方法を提供する。CXCケモカイン受容体は、主要な標的がリンパ球、特に活性化または刺激Tリンパ球およびNK細胞などのエフェクター細胞であるIP−10およびMigなどのケモカインに反応しうる、活性化リンパ球に選択的に発現するので、哺乳類CXCR3タンパク質は、ヒト等の哺乳類におけるリンパ球機能を選択的に妨害するまたは促進するための標的を提供する。一度リンパ球を部位に補充するやいなや、単球などの他の白血球型が二次的なシグナルで補充されるであろう。したがって、リガンド、阻害剤(例えば、1C6)および/または促進剤、本明細書記載のように同定されたものなどを含むCXCR3機能を阻害または促進する薬剤を用いて、白血球機能(例えば、補充および/または蓄積を含む白血球浸潤)、特にリンパ球の白血球機能を治療目的のために調整することができる。
・ 全身性過敏症または過敏応答、薬剤アレルギー(例えば、ペニシリン、セファロスポリンに対する)、昆虫咬傷アレルギー;クローン病などの炎症腸疾患、潰瘍性大腸炎、回腸炎および腸炎;膣炎;皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、蕁麻疹などの乾癬および炎症性皮膚病;血管炎(壊死性、皮膚および過敏性血管炎など)など;脊椎関節症;硬皮症;喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患、過敏性肺炎、間質性肺疾患(ILD )(特発性肺繊維症、関節リウマチに関連するILD 、または他の自己免疫状態)などの呼吸アレルギー疾患;などを含む炎症性またはアレルギー性疾患および状態;
・ 関節炎(例えば関節リウマチ、乾癬関節炎)、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、真性糖尿病および若年発症糖尿病を含む糖尿病、糸球体腎炎および他の腎炎、自己免疫甲状腺炎、ベーチェット病などの自己免疫疾患;
・ 同種移植片拒絶または対宿主性移植片病を含む(移植などにおける)移植片拒絶;
・ 望ましくない炎症応答を阻害すべきその他の疾患または状態、限定されないが、アテローム性動脈硬化症、サイトカイン誘導毒性、筋炎(多発性筋炎、皮膚筋炎)も治療できる
があげられる。
・ 皮膚T細胞リンパ腫(例えば、菌状息肉腫)などの癌、特に皮膚または組織の白血球浸潤を伴うもの;
・ 新形成疾患、網膜症(例えば、糖尿病性網膜症)、および黄斑変性を含む、脈管形成または新生血管形成が役割を果たす疾患;
・ 細菌感染および結核様らい、ならびに特にウイルス性感染などの感染性疾患;
・ 免疫抑制、例えばAIDSなどの免疫不全症候群にかかっている患者や、放射線療法、化学療法、あるいは免疫抑制を引き起こすその他の療法を受けている患者に認められるもの;受容体機能の先天的欠乏症または他の原因による免疫抑制など。さらに、CXCR3機能の促進剤は癌化学療法の間、幹細胞消耗に対抗するに有益な保護効果をも有する[Sarris, A.H. et al.,J.Exp.Med.,178:1127-1132(1993)]。
本発明によれば、1 以上の薬剤を単独で、あるいは別の薬物と組み合わせて、適当な経路で宿主に投与できる。薬剤(例えばリガンド結合を阻害する受容体ペプチド、抗CXCR3 抗体またはその抗原結合断片)の有効量を投与する。有効量とは、その投与条件下で所望の治療効果を達成するに足る量であり、例えばCXCR3 受容体機能の阻害または促進と、それによるそれぞれ、受容体媒介段階( 例えば、炎症性応答) の阻害または促進に十分な量である。
次に、下記の実施例によって本発明を例証するが、これらの実施例は決して限定を意図するものはない。
CXCケモカインMig、IL-8、GROα、NAP-2、GCP-2、ENA78、PF4、CCケモカインMCP-1、MCP-2、MCP-3、MCP-4、MIP-1α、MIP-1β、RANTES、I309、エオタキシン、およびケモカイン関連リンフォタクチンは、確立された手順に従って化学的に合成した(Clark-Lewis, I.ら, Biochemistry 30:3128-3135 (1991))。CXCケモカインIP-10はPeproTech社(ニュージャージー州ロッキーヒル)から購入した。
標準的な分子生物学的技術を使用した(Sambrook, J.ら, 1989, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press,ニューヨーク州コールドスプリングハーバー)。
配列番号:3
5’−GGG CTG CAG CII T(T/G)(T/G) C(C/A)G AC(A/C) TIC TI(C/T) T−3’
配列番号:4
5’−GGG TCT AGA IGG GTT IAI (G/A)CA (G/A)C(T/A) (G/A)(T/C)G−3’
(I=イノシン)。これらのプライマーをポリメラーゼ連鎖反応(PCR)で使用することにより、ヒト末梢血リンパ球から単離されたヒトゲノムDNAを鋳型として、次のようにDNA断片を増幅した。ヒトゲノムDNA 2μg、1×DynaZyme緩衝液(Finnzymes OY社,フィンランド・エスポー)、1.5mM MgCl2、500μMの各デオキシヌクレオチド、1μMの両プライマーおよびDynaZyme DNAポリメラーゼ2.5Uを含有する反応混合物100μlを、DNAサーマルサイクラー(Techne PHC-2, Brouwer社,スイス)での30サイクル(94℃で1分間、55℃で1分間、72℃で2分間)にかけた。予想されるサイズ(約700bp)のPCR産物をGene Scribe-ZベクターpTZ18/19 U/R(USB社,オハイオ州クリーブランド)にクローニングし、部分的に配列決定し(Sanger, F.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 74 :5463-5467 (1977))、それらの既知ケモカイン受容体との類似性と、それらに対応するmRNAの白血球における発現について評価した。2MLC22と命名したDNA断片は、IL-8R2と64%のヌクレオチド配列同一性を示した。DNAポリメラーゼIのクレノウ断片と市販のランダムプライムラベリングキットを使用して放射活性同位体32Pで2MLC22を酵素により標識することによって調製したハイブリダイゼーションプローブを用いたノーザンブロット分析で評価したところ、断片2MLC22はT細胞由来のRNAに特異的にハイブリダイズしたが、単球または好中球由来のRNAにはしなかった。
Tリンパ球特異的ケモカイン受容体を探索することにより、ヒトCD4+ T細胞ライブラリーからcDNAを単離した(図1、配列番号:1)。このcDNAは、汎用されている単球由来のcDNAライブラリーまたは顆粒球(HL60)由来のcDNAライブラリーを新規ケモカイン受容体cDNAに関して探索する過程では回収されなかった。しかしながら、CXCR3 cDNAに関して特異的なライブラリーの直接探索は行われていない。IP-10/Mig受容体(下記参照)をコードすることが明らかになったこのCXCR3 cDNAは、残基69から始まる1104bpのオープンリーディングフレーム(ORF)を持ち、これは40,659ダルトンの予想分子量を持つアミノ酸数368のタンパク質をコードする。そのアミノ酸配列(図2、配列番号:2)は、Gタンパク質共役受容体の特徴である7つの推定膜貫通セグメントと、3つの潜在的Nグリコシル化部位(Asn22、Asn32およびAsn199)を含む(図2)。また、受容体キナーゼの潜在的リン酸化部位(Palczewski, K.およびJ.L. Benovic, Trends Biochem. Sci., 16 :387-391 (1991);Chuang, T.T.ら, J. Biol. Chem., 267 :6886-6892(1992);Giannini, E.ら, J. Biol. Chem., 270 :19166-19172(1995))であるスレオニン残基1個とセリン残基9個が、細胞内COOH末端領域に認められる(図2)。
活性化Tリンパ球での発現
観察されたケモカイン選択性に着目して、白血球とそれに関連する細胞株でのIP-10/MigRの出現をノーザンブロット分析で調べた。新たに単離したヒト血液単球、好中球、リンパ球(PBL)、ナイロンウール精製T細胞、ならびに400U/ml hrIL-2の存在下に10日間培養(2mMグルタミン、1×非必須アミノ酸、1mMピルビン酸ナトリウム、100μg/mlカナマイシン、5×10-5 M 2-メルカプトエタノールおよび5%ヒト血清を含有するRPMI 1640培地中、1〜2.5×106細胞/ml)したクローン化ヒトCD4+ T細胞(KT30)およびCD8+ T細胞(ERCD8)、クローン化NK細胞(ERNK57)およびPBLを含む培養細胞由来の全RNA試料10μgを調べた。(ヒト組換えIL-2はバーゼル免疫学研究所(スイス・バーゼル)のA. Lanzavecchia博士から供与された)。ブロッティングに先立って、ゲル上の全RNAの完全性と量を調べるために、アガロースゲルを臭化エチジウムで染色した。RNA試料は、IP-10/MigR DNAの32P標識5'断片(109cpm/μg DNA)を5×106cpm/ml のハイブリダイゼーション溶液の濃度で使用して、記述されているように分析した(Loestscher, M.ら, J. Biol. Chem., 269 :232-237 (1994) )。ノーザンプローブとして使用した5'断片は、pBK-CMVベクター(Stratagene GMBH社,スイス・チューリッヒ)中のCXCR3 cDNAをPstIで消化してCXCR3 cDNA(図1)の5'末端724bpを得ることによって調製した。
予想されるサイズのmRNAの豊富な発現が、受容体cDNAの単離に使用したクローン化CD4+ T細胞KT30に認められた。同等レベルの発現がCD8+ T細胞クローンERCD8とNK細胞クローンERNK57に観察された。これに対し、新たに単離された血液リンパ球とナイロンウール精製T細胞には、IL10/MigR転写物はほとんど検出できなかった。しかし、これらの細胞をIL-2の存在下で培養すると、強いアップレギュレーションが得られ、受容体mRNAのレベルはTおよびNK細胞クローンでのレベルに近づいた。新たに単離された血液単球、好中性白血球または好酸性白血球では、これらの条件下にIP-10/MigR転写物が検出されなかった。IP-10/MigR mRNAを発現しなかったその他の白血球関連細胞には、マスト細胞株HMC-1、前骨髄球性白血病株HL60、組織球性白血病株U937、慢性骨髄性白血病株K562、急性T細胞白血病株Jurkat、急性リンパ芽球性白血病株Molt、Bリンパ芽球株DaudiおよびRaji、慢性および急性Bリンパ性白血病(B-CLLおよびB-ALL)患者由来のリンパ球、好塩基球性白血病患者由来の成熟好塩基球、および赤白血病細胞株HELが含まれる。対照的に、単球および顆粒球には、リンパ球を誘引することが過去に示されているケモカイン、すなわちMCP-1、MCP-2、MCP-3、MIP-1α、MIP-1βおよびRANTESの受容体(Loetscher, P.ら, FASEB J., 8 :1055-1060 (1994);Carr, M.W.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91 :3652-3656(1994);Taub, D.D.ら, Science, 266 :355-358 (1993);Schall, T.J.ら, J. Exp. Med., 177 :1821-1825(1993);Schall, T.J.ら, Nature, 347 :669-672(1990))も認められる。活性化Tリンパ球とナチュラルキラー細胞株におけるIP-10/MigRの限定的発現は、この新規受容体が選択的なリンパ球補充を媒介しうることを示唆している。
CXCR3 cDNAをpBK-CMV (Stratagene GMBH社,スイス・チューリッヒ)からBamHIとXbaIによる消化で切り出し、pcDNA3(Invitrogen BV社, オランダ・WBリーク)のBamHI部位とXbaI部位にクローニングすることによりpCDNA3-Clone8を得て、それを大腸菌(XL1Blue)で維持、保存した。
本受容体が機能的であるかどうかを決定するため、ネズミプレB細胞(300-19)、ヒト前骨髄球細胞(GM-1)およびヒトT細胞白血病細胞(Jurkat)のクローンに、上述のように受容体cDNAを安定にトランスフェクトした。ケモカイン受容体の活性化はサイトゾル遊離Ca2+濃度([Ca2+]i)の一過性の上昇をもたらす。そこでトランスフェクト細胞におけるシグナル伝達のモニターにこのアッセイを使用した。
IP-10およびMigに応答して、迅速な[Ca2+]i上昇が観察された。ケモカインIP-10は皮膚の遅延型過敏反応において発現されることが示されている(Luster, A.D.ら, Nature, 315 :672-676(1985);Kaplan, G.ら, J. Exp. Med., 166 :1098-1108(1987))。Migと呼ばれるケモカインが最近になって同定された(Farber, J.M., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 87 :5238-5242 (1990);Farber, J.M., Biophys. Res. Commun., 192 :223-230 (1993))。どちらのケモカインも、IL-8と同様に最初の2つのシステインがCXC配置を取っているが、好中性白血球に対して走化作用を持たない。最近、IP-10がTリンパ球を誘引すること(Luster, A.D.およびP. Leder, J. Exp. Med., 178 :1057-1065(1993);Taub, D.D.ら, J. Exp. Med., 177 :1809-1814(1993))と、Migが腫瘍関連リンパ球に対して走化作用を持つこと(Liao, F.ら, J. Exp. Med., 182 :1301-1314 (1995))が報告された。
献血血液バフィーコートからPBLを新たに単離した。献血血液バフィーコートはスイス赤十字社スイス中央研究所輸血部門によって提供された。バフィーコートPBLの単離はColotta, F.ら, J. Immunol., 132 :936-944 (1984) に記述されているように行なった。
IP-10/MigRを発現するトランスフェクト細胞はIP-10またはMigに向かってたやすく移動し、一方、非トランスフェクト親細胞は応答しなかった(図3C)。どちらのアゴニストも典型的な二相型濃度依存性を示した。IP-10は1nMを超える濃度で移動を誘導し、一方、Migの応答は10nM以上で検出可能になった。移動細胞の最大数によって測定される効力は、Migの方がIP-10の約2倍高かった。これらの結果はIP-10/MigRが、白血球のすべての既知ケモカイン受容体と同様に、リガンドに応答して起こる走化性を媒介することを示している。
IP-10/MigRの細胞分布と合致して、活性化ヒトTリンパ球はIP10とMigに対して高い反応性を持つことがわかった(図4A〜4B)。[Ca2+]i変化(図4A)とイン・ビトロ走化性(図4B)の誘導因子としてのIP-10とMigの活性は、IP-10/MigRを発現するトランスフェクト細胞を用いて観察された作用と合致し、IP-10はMigより強力であるが、効力はMigより低くかった。カルシウム流動と走化性の誘導にはIL-2の存在下で培養することによるTリンパ球の活性化が必要であり、単離したばかりの血液リンパ球には使用した条件下で応答が認められなかった。
実施例3〜9では次の材料と方法を使用した。
組換えヒトケモカイン類は、イアン クラーク−ルイス(Ian Clark-Lewis)博士から提供された既に記述されているエオタキシン(Ponath, P.D.ら, J. Clin. Invest., 97 :604-612 (1996);Ponathら, 国際公開第97/00960号パンフレット(1997年1月9日公開)も参照されたい)以外は、Peprotech社(ニュージャージー州ロッキーヒル)から入手した。125I標識ケモカイン類はDu Pont NEN社(マサチューセッツ州ボストン)から入手した。
好中球とPBMCは記述されているように単離した(Ponath, P.D.ら, J. Clin. Invest., 97 :604-612 (1996))。CD3芽球を生成するため、RPMI-1640+10%FCS中2×106個/mlのPBMCを抗CD3抗体TR66でコーティングしてある組織培養プレートに添加した。4〜6日後、芽球を新しい培地に取り出し、IL-2(Antonio Lanzavecchia(バーゼル)の厚意で提供されたもの)を50単位/mlの濃度で添加した。
細胞
L1.2細胞は、RPMI培地1640、10% FetalClone (Hyclone社製)、50U/mlペニシリン/ストレプトマイシン、1×L-グルタミン、1mMピルビン酸ナトリウムおよび5.5×10-5 Mβ-メルカプトエタノール中で生育した。培地成分は、Hyclone社から購入した10% FetalClone以外は、GibcoBRL社から購入した。トランスフェクションの2日前に、L1.2細胞を新しい培地に1:5の比率で希釈した。これにより、約100〜300万細胞/mlの濃度の対数増殖期の細胞1億5000万個が得られた。
大腸菌XL1Blue細胞(Stratagene社,カタログ番号200236)を、製造者の実験案に従い、pcDNA3-Clone8(実施例2;Loetscher, M.ら, J. Exp. Med., 184 :963-969(1996))で形質転換した。100μg/mlアンピシリンを含有するLB 500ml中、250rpmで振盪しながら、形質転換体を37℃で生育した。次にその培養物を8000×gでの遠心分離によって集め、Maxiプラスミド精製カラムとその実験案(Qiagen社,カタログ番号12162)を使って、プラスミドを精製した。プラスミドの濃度と純度は、1%アガロースゲルとOD260/280比を使って決定した。プラスミドDNAを二回蒸留水に懸濁し、使用時まで−20℃で保存した。
次にCXCR3を発現するL1.2細胞をネオマイシン耐性に関する選択にかけた。非選択培地で2日間生育した後、10mlの1.6g/Lジェネティシン(GibcoBRL社)を0.8g/L(選択および維持濃度)の最終濃度で加えた。次にこれを、細胞が過剰増殖を始めたら新しい選択培地を加えながら、10〜15日間生育した。新しい選択培地は10%ウシ血清と800μg/ml G418 を添加したRPMI-1640からなった。
放射標識IP-10を使用してさらなる結合試験を行なった。標的細胞へのケモカイン結合は既に記述されているように行なった(Ponath, P.D.ら, J. Clin. Invest., 97 :604-612 (1996);Van Riper, G.ら, J. Exp. Med., 177 (3): 851-856(1993))。細胞をPBSで1回洗浄し、結合緩衝液(50mM HEPES(pH7.5)、1mM CaCl2、5mM MgCl2、0.5%BSAおよび0.05%アジド)に107個/mlの濃度で再懸濁した。それを微量遠心管に50μl(5×105細胞)ずつ分注し、次いで非放射性競合因子(非標識IP-10)と放射標識ケモカイン(0.05nM 125I標識IP-10)を加えた。最終反応体積は200μlだった。非特異的結合は、250〜500nMの非標識ケモカインの存在下に細胞を放射標識ケモカインと共にインキュベートすることによって決定した。室温で60分間インキュベートした後、0.5M NaClを含む結合緩衝液1mlで細胞を3回洗浄した。次に、細胞ペレットをカウントした。競合は100×[(S-B)/(T-B)] (式中、Sは試料の放射活性、Bはバックグラウンド結合量、Tは競合因子がない場合の全結合量である)によって計算される特異的結合百分率として表わした。バックグラウンド結合量は、細胞を放射標識ケモカインおよび少なくとも400倍過剰の非標識ケモカインと共にインキュベートすることによって得た。全実験を通じて2連を使用し、標準偏差は常に平均の10%未満だった。すべての実験を少なくとも3回繰返した。カーブフットおよび特異的結合を50%阻害する濃度(IC50)は、カレイダグラフ(KaleidaGraph)ソフトウェア(Synergy Software社,ペンシルバニア州レディング)で計算した。
CXCR3のアンタゴニストを開発するために、また受容体の発現と調節を研究するために、この受容体のN末端に対応する合成ペプチドでマウスを免疫することにより、一群のmAb を作製した。これらのmAb はCXCR3トランスフェクタントを特異的に認識したが、他の一連の受容体トランスフェクタントは特異的に認識しなかった。
CXCR3と反応するmAb は、Balb/CマウスをCXCR3の最初の37N末端アミノ酸に対応する37マー合成ペプチド(Loetscher M.ら, J. Exp. Med., 184 :963-969(1996)をも参照されたい)10μgで10週間にわたって5回免疫することによって作製した。このペプチドを合成し、ツベルクリンの精製タンパク質誘導体(Severn Biotech社,英国キッダーミンスター)に結合した。最初の免疫処置はフロイント完全アジュバント(FCA)を使って腹腔内(IP)に行なった。第二、第三、第四の免疫処置はフロイント不完全アジュバント(FIA)を使って腹腔内に行い、最後の免疫処置はペプチド複合体のみ(アジュバントなし)を使って、静脈内(IV)に投与した。最後の免疫処置の4日後に、脾臓を摘出し、細胞株SP2/0を用いて、記述されているように細胞融合を行なった(Coligan, J.E.ら, Current Protocols In Immunology (John Wiley and Sons社,ニューヨーク), Unit 2.5.4 (1992))。ELISAで評価したところ、上記N末端37マーペプチドと反応するmAb が生成した(Coligan, J.E.ら, Current Protocols In Immunology (John Wiley and Sons社,ニューヨーク), Unit 2.1.3 (1992) )。CXCR3と反応するmAb は、非トランスフェクトおよびCXCR3トランスフェクトL1.2細胞または300.19細胞(ネズミB細胞株, Loetscher, M.ら, J. Exp. Med., 184 :963-969(1996))、免疫蛍光染色およびFACScan(登録商標) (Becton Dickinson & Co.社, カリフォルニア州マウンテンビュー)を用いて同定した。
フローサイトメトリー
CXCR1、CXCR2、CXCR3およびCCR5に対するmAb は既に記述されている(Qin, S.ら, Eur. J. Immunol., 26 :640-647 (1996);Heath, H.ら, J. Clin. Invest. 印刷中(1997))。抗CXCR4 mAb 12G5(Endres, M.J.ら, Cell, 87 :745-756 (1996))は、ジム ホキシー (Jim Hoxie)(ペンシルバニア大学)の厚意で提供された。CD4、CD8、CD14、CD20、CD25、CD26、CD69、CD45RO、CD45RA、CD95に対するPE結合mAb 、抗CD3および抗CD4 Cy-ChromeはPharMingen社(カリフォルニア州ラホーヤ)によって供給された。
ヒト白血球の走化性を、ECV 304内皮細胞株(European Collection of Animal Cell Cultures, 英国ソールズベリー・ポートンダウン)を使って、既に記述されている(Ponath, P.D.ら, J. Clin. Invest., 97 :604-612 (1996))経内皮アッセイ(Carr, M.W.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91(9): 3652-3656 (1994))の変法で評価した。下部チャンバーに移動した細胞をチューブに入れ、相対細胞数をFACScan(登録商標)を用いて得た。
細胞内カルシウム濃度([Ca2+]i)は次のように測定した.Fura-2 AM (Molecular Probes社, オレゴン州ユージーン)の原液は、その色素50μgを44μlのDMSOに溶解することによって調製した。細胞に添加する直前に、その原液をCa2+とMg2+を含むHBSSおよび2%BSAに1:100に希釈した。Fura-2 AMを0.2モル/106細胞の最終濃度で37℃で30分間細胞に添加した。標識化の後、過剰の色素を遠心分離によって除去し、細胞を125mM NaCl、5mM KCl、1mM MgCl2、1mM CaCl2、0.5mMグルコース、0.025%BSAおよび20mM HEPES(pH7.4)に106個/mlの濃度で再懸濁した。[Ca2+]iは日立F-2000蛍光分光計で340nmと380nmでの励起を使って測定した。較正は、全放出に1%NP-40を使用し、遊離Ca2+のキレートに25μM EGTAを使用して行なった。
ペプチドはGenemed社(カリフォルニア州サウスサンフランシスコ)に発注した。各15アミノ酸長のそれらペプチドは、CXCR3タンパク質の最初の45N末端残基の異なる部分に相当する。
P1: MVLEVSDHQVLNDAE(配列番号:2、残基1−15)
P2: VAALLENFSSSYDYG(配列番号:2、残基16−30)
P3: ENESDSCCTSPPCPQ(配列番号:2、残基31−45)
それらペプチドをまずDMSOに溶解し、リン酸緩衝食塩水(PBS)で1mg/mlに希釈した。1C6抗体による染色を遮断するペプチドの能力を調べるために、1μg/mlの精製1C6抗体を1×PBS、5%ウシ胎仔血清(FCS)中、100μg/mlの各ペプチドの存在下にCXCR3 L1.2トランスフェクタント(105細胞;実施例3〜9に関する材料と方法の項を参照されたい)と共に4℃で30分間インキュベートした。最終体積は100μlだった。陽性染色はペプチドの非存在下に行なった。結合したmAb を抗マウスIgG-FITCで検出し、その結果をフローサイトメトリーで分析した。
CXCR3構築物をトランスフェクトされ高レベルのヒトCXCR3を発現するL1.2細胞でマウスを免疫することにより、さらなる抗CXCR3 モノクローナル抗体を作製した(上記材料と方法の項を参照されたい)。免疫化と融合ハイブリドーマの作製は記述されているように行なった(Qin, S.ら, Eur. J. Immunol., 26 : 640 (1996) ; Heath, H.ら, J. Clin. Invest., 99(2):178(1997))。抗CXCR3 mAb は、活性化ヒトT細胞とCXCR3トランスフェクタントの陽性染色によって同定した。8種類の抗CXCR3抗体が一つの融合(LS-104)で得られた。
組織
ヒト組織(正常および炎症)は米国立衛生研究所(National Institutes of Health)の資金提供を受けた公共機関National Disease Research Instituteから入手した。正常マカーク(アカゲザル)組織はNew England Regional Primate Research Center(ニューイングランド地方霊長類研究センター;マサチューセッツ州サウスボロ)から入手した。
アルカリホスファターゼ法.組織を厚さ4μmに切片化し、乾燥した後、2%パラホルムアルデヒド/0.5×PBS中4℃で10分間固定した。PBS洗浄の後、非特異的抗体結合部位を10%正常ヤギ血清/5%ヒトAB血清/PBSにより室温で30分間遮断した。次に、精製した抗CXCR3ネズミmAb 1C6 を0.3%Triton X100/0.2%Tween 20/1%FCS/5%ヒトAB血清および0.1%アジ化ナトリウム中に10μg/mlの濃度に希釈し、それを組織切片に適用して4℃で終夜インキュベートした。同イソタイプの無関係なmAb を組織のステップセクション(step sections)に対して陰性対照として使用した(IgG1,MOPC-21, Sigma社,ミズーリ州セントルイス)。次に、ビオチニル化ヤギ抗マウスIgG(Vector社, カリフォルニア州バーリンゲーム)とアビジン-ビオチン-アルカリホスファターゼ複合体(Biogenex社, カリフォルニア州サンラモン)を順次加えた。内因性アルカリホスファターゼ活性を遮断するためにレバミゾールを含有するFast Red(Biogenex社, カリフォルニア州サンラモン)を発色原として使用し、マイヤーヘマトキシリンを対比染色剤として使用した。
ヒトおよびマカークの正常リンパ節:どちらの種でも、染色は、Tリンパ球でのCXCR3発現と合致して、リンパ球の傍皮質と髄索内のリンパ球の70〜80%に限定された。
当業者であれば、単なる日常的実験手法により、本明細書に記載された本発明の具体的態様に対する多くの均等物を認識し、あるいは確認することができるであろう。かかる均等物は、下記請求の範囲に包含されるように意図されている。
[1]タンパク質または改変体が1種以上のケモカイン類を選択的に結合することができ、かつ細胞シグナル伝達および/またはそれに応答した細胞応答を媒介することができる、哺乳類CXCR3タンパク質またはその機能的改変体をコードする単離核酸。
[2]該核酸が中程度のストリンジェンシー条件下に、図1(配列番号:1)の配列、その相補鎖、またはコード配列を含む図1(配列番号:1)の配列の一部もしくはその相補鎖を有する2番目の核酸にハイブリダイズすることができる、[1]記載の単離核酸。
[3]該単離核酸が本質的に純粋である、[1]記載の単離核酸。
[4]該タンパク質または改変体がヒトIP−10、ヒトMig、ヒトIP−10の哺乳類ホモログおよびヒトMigの哺乳類ホモログからなる群より選ばれたケモカインに選択的に結合することができる、[1]記載の単離核酸。
[5]該哺乳類CXCR3タンパク質またはその機能的改変体がヒトCXCR3タンパク質またはその機能的改変体である、[1]記載の単離核酸。
[6]配列番号:1、その相補鎖、またはコード配列を含む配列番号:1の一部もしくはその相補鎖を含有してなる、[1]記載の単離核酸。
[7]該ヒトCXCR3タンパク質が配列番号:2に示されたアミノ酸配列を有する、[1]記載の単離核酸。
[8][1]記載の核酸を含有してなる単離核酸構築物。
[9]該核酸が操作可能に発現制御配列に連結される、[8]記載の単離核酸構築物。
[10]該核酸が配列番号:1、その相補鎖、またはコード配列を含む配列番号:1の一部もしくはその相補鎖を含有してなる、[8]記載の単離核酸構築物。
[11]該核酸が図2(配列番号:2)に示されたアミノ酸配列を有するポリペプチドをコードする、[8]記載の単離核酸構築物。
[12]該核酸が哺乳類CXCR3タンパク質を含む融合タンパク質をコードする核酸であり、任意にコード配列が操作可能に発現制御配列に連結される、[8]記載の単離核酸構築物。
[13]タンパク質が1種以上のケモカイン類を選択的に結合することができ、かつ細胞シグナル伝達および/またはそれに応答した細胞応答を媒介することができる、哺乳類CXCR3タンパク質またはその機能的改変体をコードする組換え核酸を含有してなる宿主細胞。
[14]該核酸が操作可能に発現制御配列に連結される、[13]記載の宿主細胞。
[15]該核酸が配列番号:1によりコードされるヒトCXCR3タンパク質をコードする、[13]記載の宿主細胞。
[16]タンパク質が1種以上のケモカイン類を選択的に結合することができ、かつ細胞シグナル伝達および/またはそれに応答した細胞応答を媒介することができる、単離哺乳類CXCR3タンパク質またはその機能的改変体。
[17]該哺乳類がヒトであり、かつ該タンパク質がヒトIP−10およびヒトMigからなる群より選ばれた1種以上のケモカイン類に選択的に結合することができる、[16]記載の単離哺乳類CXCR3タンパク質またはその機能的改変体。
[18]中程度のストリンジェンシー条件下に、図1(配列番号:1)の配列、その相補鎖、またはコード配列を含む図1(配列番号:1)の配列の一部もしくはその相補鎖を有する2番目の核酸にハイブリダイズすることができる核酸によりコードされる、[16]記載の単離哺乳類CXCR3タンパク質またはその機能的改変体。
[19]図1(配列番号:1)に示された核酸によりコードされる、単離ヒトCXCR3タンパク質。
[20]配列番号:2に示されたアミノ酸配列を有する、[19]記載の単離ヒトCXCR3タンパク質。
[21]哺乳類CXCR3タンパク質を含有してなる融合タンパク質。
[22](a)宿主細胞に哺乳類CXCR3タンパク質またはその改変体をコードする核酸を導入する工程であり、それによりコード配列が発現制御配列に操作可能に連結されたコード配列を有する組換え宿主細胞を生産する、および
(b)工程(a)で生産された宿主細胞を該核酸が発現する条件下に維持する工程、
を含む、哺乳類CXCR3タンパク質またはその改変体の生産方法。
[23]さらに哺乳類CXCR3タンパク質またはその改変体を単離する工程を含む、[22]記載の方法。
[24]哺乳類CXCR3タンパク質またはその改変体をコードする組換え核酸を含む宿主細胞を核酸の発現に適する条件下に維持する工程を含む、哺乳類CXCR3タンパク質またはその改変体を生産する方法。
[25]さらに哺乳類CXCR3タンパク質またはその改変体を単離する工程を含む、[24]記載の方法。
[26]該哺乳類がヒトであり、かつ該タンパク質またはその改変体が、ヒトIP−10およびヒトMigからなる群より選ばれた1種以上のケモカイン類を選択的に結合することができる、[24]記載の方法。
[27]哺乳類CXCR3タンパク質を結合する、抗体または機能的抗体断片。
[28]該抗体または抗体断片が哺乳類CXCR3タンパク質の1種以上の機能を阻害することができる、[27]記載の抗体または機能的抗体断片。
[29]該抗体または抗体断片がリガンドの哺乳類CXCR3タンパク質への結合を阻害する、[28]記載の抗体または機能的抗体断片。
[30]該抗体または抗体断片がヒトCXCR3タンパク質を結合することができ、かつヒトCXCR3タンパク質とIP−10および/またはMigからなる群より選ばれた1種以上のリガンドとの相互作用を阻害することができる、[28]記載の抗体または機能的抗体断片。
[31]該抗体または断片が、モノクローナル抗体1C6がヒトCXCR3タンパク質またはその一部に結合することに競合することができる、[30]記載の抗体または機能的抗体断片。
[32]該抗体または抗体断片がヒトCXCR3タンパク質とIP−10との相互作用を選択的に阻害する、[28]記載の抗体または機能的抗体断片。
[33]該抗体または断片がモノクローナル抗体1C6またはその抗原結合断片である、[32]記載の抗体または機能的抗体断片。
[34]ヒトCXCR3タンパク質を結合する、抗体またはその抗原結合断片。
[35]配列番号:2のN−末端細胞外セグメントに対応するヒトCXCR3の一部またはヒトCXCR3タンパク質の少なくとも1種の免疫学的性質を有するその一部により、該結合が阻害されうる、[34]記載の抗体またはその抗原結合断片。
[36]配列番号:2の1〜15残基の配列と同じである配列を有するポリペプチドと配列番号:2の16〜30残基の配列と同じである配列を有するポリペプチドとからなる群より選ばれたポリペプチドにより、該結合が阻害されうる、[34]記載の抗体またはその抗原結合断片。
[37]試験対象の薬剤と単離および/または組換え哺乳類CXCR3タンパク質あるいはそのリガンド結合改変体を含む組成物とを、リガンドの結合に適する条件下に合わせる工程、および該薬剤と該哺乳類CXCR3タンパク質もしくは改変体との間の複合体の形成を検出または測定する工程を含む、哺乳類CXCR3タンパク質またはそのリガンド結合改変体を結合する薬剤を検出または同定する方法。
[38]該薬剤がヒトIP−10、ヒトMig、IP−10の哺乳類ホモログおよびMigの哺乳類ホモログからなる群より選ばれたリガンドである、[37]記載の方法。
[39]該リガンドが放射性同位体、スピン標識、抗原標識、酵素標識、蛍光基または化学発光基からなる群より選ばれた標識で標識される、[38]記載の方法。
[40]アッセイがヒトIP−10、ヒトMig、IP−10の哺乳類ホモログおよびMigの哺乳類ホモログからなる群より選ばれた1種以上のリガンドの存在下に結合が決定される競合アッセイである、[38]記載の方法。
[41]a) 試験対象の薬剤と組換え哺乳類CXCR3タンパク質またはそのリガンド結合改変体を発現する宿主細胞とを、リガンドの結合に適する条件下に合わせる工程、および
b) 該薬剤と哺乳類CXCR3タンパク質もしくはそのリガンド結合改変体との間の複合体の形成を検出または測定する工程、
を含む、哺乳類CXCR3タンパク質またはそのリガンド結合改変体を結合する薬剤を検出または同定する方法。
[42]該薬剤がヒトIP−10、ヒトMig、IP−10の哺乳類ホモログおよびMigの哺乳類ホモログからなる群より選ばれたリガンドである、[41]記載の方法。
[43]アッセイがヒトIP−10、ヒトMig、IP−10の哺乳類ホモログおよびMigの哺乳類ホモログからなる群より選ばれた1種以上のリガンドの存在下に結合が決定される競合アッセイである、[41]記載の方法。
[44]哺乳類CXCR3タンパク質もしくはそのリガンド結合改変体が細胞シグナル伝達および/または細胞応答を媒介し、かつシグナル伝達活性またはそれに応答する該CXCR3タンパク質もしくは改変体の細胞応答を検出または測定することにより複合体形成をモニターする、[41]記載の方法。
[45]a)試験対象の薬剤と、哺乳類CXCR3タンパク質のリガンドと単離および/または組換え哺乳類CXCR3タンパク質あるいはそのリガンド結合改変体を含む組成物とを、リガンドの結合に適する条件下に合わせる工程、および
b) 該哺乳類CXCR3タンパク質もしくは改変体と該リガンドとの間の複合体の形成を検出または測定する工程であり、該薬剤による複合体形成の阻害が、該薬剤が阻害剤であることの指標である、
を含む、哺乳類CXCR3タンパク質もしくはそのリガンド結合改変体へのリガンド結合の阻害剤を検出または同定する方法。
[46]該リガンドがヒトIP−10、ヒトMig、IP−10の哺乳類ホモログおよびMigの哺乳類ホモログからなる群より選ばれた、[45]記載の方法。
[47]単離および/または組換え哺乳類CXCR3タンパク質を含む該組成物が組換え哺乳類CXCR3タンパク質を発現する宿主細胞を含有する、[45]記載の方法。
[48]該哺乳類CXCR3タンパク質が細胞シグナル伝達および/または細胞応答を媒介し、かつシグナル伝達活性またはそれに応答する該CXCR3タンパク質もしくは改変体の細胞応答を検出あるいは測定することにより複合体形成をモニターする、[47]記載の方法。
[49]a)試験対象の薬剤と、哺乳類CXCR3タンパク質のリガンドと組換え哺乳類CXCR3タンパク質もしくはそのリガンド結合改変体を発現する宿主細胞とを、リガンドの結合に適する条件下に合わせる工程、および
b) 該タンパク質もしくは改変体と該リガンドとの間の複合体の形成を検出または測定する工程であり、該薬剤による複合体形成の阻害が、該薬剤が阻害剤であることの指標である、
を含む、哺乳類CXCR3タンパク質もしくはそのリガンド結合改変体へのリガンド結合の阻害剤を検出または同定する方法。
[50]該リガンドがIP−10、Mig、IP−10の哺乳類ホモログおよびMigの哺乳類ホモログからなる群より選ばれた、[49]記載の方法。
[51]該哺乳類CXCR3タンパク質が細胞シグナル伝達および/または細胞応答を媒介することができ、かつシグナル伝達活性またはそれに応答する該CXCR3タンパク質の細胞応答を検出あるいは測定することにより複合体形成をモニターする、[49]記載の方法。
[52]該薬剤が抗体または抗体断片である、[49]記載の方法。
[53]試験対象の薬剤と(a)組換え哺乳類CXCR3タンパク質またはその機能的改変体を発現する宿主細胞と(b)リガンドまたはその促進剤とを、リガンドもしくは促進剤誘導応答を検出するに適する条件下に合わせる工程、および
試験対象薬剤の該応答を阻害する能力を評価する工程であり、薬剤によるリガンドまたは促進剤誘導応答の阻害が、薬剤が阻害剤であることの指標である、
を含む哺乳類CXCR3タンパク質もしくはその機能的改変体の阻害剤を検出または同定する方法。
[54]該応答がシグナル伝達活性またはそれに応答する該哺乳類CXCR3タンパク質もしくはその改変体の細胞応答を検出あるいは測定することによりモニターされる、[53]記載の方法。
[55]試験対象の薬剤と組換え哺乳類CXCR3タンパク質もしくはその機能的改変体を発現する宿主細胞とを、受容体媒介応答を検出するに適する条件下に合わせる工程、および
該応答を検出または測定する工程であり、該薬剤による応答の誘導または刺激が薬剤が促進剤であることの指標である、
を含む、哺乳類CXCR3タンパク質もしくはその機能的改変体の促進剤を検出または同定する方法。
[56][45]記載の方法によって同定された、哺乳類CXCR3タンパク質に特有の少なくとも1種の機能の阻害剤。
[57]該阻害剤が受容体に結合可能な抗体またはその一部である、[56]記載の阻害剤。
[58][53]記載の方法によって同定された、哺乳類CXCR3タンパク質に特有の少なくとも1種の機能の阻害剤。
[59][55]記載の方法によって同定された、哺乳類CXCR3タンパク質に特有の少なくとも1種の機能の促進剤。
[60]a) 抗体と選択された哺乳類CXCR3タンパク質との特異的結合に適する条件下に、試料と該タンパク質を結合する抗体とを接触させる工程;および
b) 抗体−CXCR3複合体を検出する工程、
を含む、試料中の選択された哺乳類CXCR3タンパク質の検出方法。
[61]哺乳類CXCR3タンパク質と該タンパク質の少なくとも1種の機能の阻害剤または促進剤とを接触させる工程、
を含む、哺乳類CXCR3タンパク質の機能の少なくとも1種を調節する方法。
[62]哺乳類へ治療上有効な量の哺乳類CXCR3タンパク質の阻害剤を投与して、それにより炎症を減少させること、
を含む、炎症性疾患または状態を処置する方法。
[63]炎症性疾患または状態がT細胞媒介疾患または状態である、[62]記載の方法。
[64]該阻害剤が哺乳類CXCR3タンパク質に特異的に結合する抗体またはその抗原結合断片である、[62]記載の方法。
[65]該抗体またはその断片がモノクローナル抗体1C6のヒトCXCR3タンパク質への結合を競合することができる、[64]記載の方法。
[66]該抗体またはその断片がモノクローナル抗体1C6またはその抗原結合断片である、[65]記載の方法。
[67]哺乳類CXCR3タンパク質の天然のリガンド以外の促進剤の治療上有効な量を哺乳類へ投与すること、
を含む、抗腫瘍治療方法。
[68]哺乳類CXCR3タンパク質の天然のリガンド以外の促進剤の治療上有効な量を哺乳類へ投与すること、
を含む、抗ウイルス治療方法。
[69]配列:a)配列番号:1、
b)コード領域を含むその一部、
c)または(a)および(b)のいずれかのRNA体
を有する核酸にハイブリダイズする配列をもつ核酸を含有してなるアンチセンス核酸。
(1)一般情報:
(i)出願人:
(A)名称:テオドーア−コッヒャー インスティトゥーテ
(B)ストリート:フライエシュトラーセ 1
(C)市:ベルン
(D)州:
(E)国:スイス国
(F)郵便番号:CH−3012
(G)電話番号:41−31−631−4141
(I)ファクシミリ番号:41−31−631−3799
(i)出願人:
(A)名称:ロイコサイト,インコーポレーテッド
(B)ストリート:ファースト ストリート 215
(C)市:ケンブリッジ
(D)州:マサチューセッツ
(E)国:アメリカ合州国
(F)郵便番号:02142
(G)電話番号:617−621−9350
(I)テレファックス:617−621−9349
(ii)発明の名称:CXCR3、抗体、核酸、および使用方法
(iii)配列の数:4
(iv)連絡先住所:
(A)宛名:ハミルトン,ブルック,スミス アンド レイノルズ,
ピー.シー.
(B)ストリート:ミリティア ドライブ 2
(C)市:レキシントン
(D)州:マサチューセッツ
(E)国:アメリカ合衆国
(F)郵便番号:02173
(v)コンピュータ可読フォーム:
(A)媒体型:フロッピーディスク
(B)コンピュータ:IBM PC 互換機
(C)オペレーティングシステム:PC−DOS/MS−DOS
(D)ソフトウェア:パテントイン リリース #1.0,
バージョン #1.30
(vi)現出願データ:
(A)出願番号:
(B)出願日:
(C)分類:
(vii)先願データ:
(A)出願番号:US 08/829,839
(B)出願日:1997年3月31日
(vii)先願データ:
(A)出願番号:US 08/709,838
(B)出願日:1996年9月10日
(viii)代理人情報:
(A)氏名:ブルック,デビッド イー.
(B)登録番号:22,592
(C)リファランス/ドケット番号:TKI96−01A2 PCT
(ix)テレコミュニケーション情報:
(A)電話番号:(781)861−6240
(B)テレファックス:(781)861−9540
(2)配列番号:1の情報:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:1670塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:二本鎖
(D)トポロジー:不明
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:CDS
(B)存在位置:69..1172
(xi)配列:配列番号:1:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:28塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:不明
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:modified base
(B)存在位置:11
(D)他の情報:/修飾塩基=「イノシン」
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:modified base
(B)存在位置:12
(D)他の情報:/修飾塩基=「イノシン」
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:modified base
(B)存在位置:23
(D)他の情報:/修飾塩基=「イノシン」
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:modified base
(B)存在位置:26
(D)他の情報:/修飾塩基=「イノシン」
(xi)配列:配列番号:3:
(i)配列の特徴:
(A)配列の長さ:27塩基対
(B)配列の型:核酸
(C)鎖の数:一本鎖
(D)トポロジー:不明
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:modified base
(B)存在位置:10
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(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:modified base
(B)存在位置:16
(D)他の情報:/修飾塩基=「イノシン」
(ix)配列の特徴:
(A)特徴を表す記号:modified base
(B)存在位置:18
(D)他の情報:/修飾塩基=「イノシン」
(xi)配列:配列番号:4:
Claims (9)
- ヒトCXCケモカインレセプター3(CXCR3)タンパク質への、IP−10およびMigからなる群より選択されるリガンドの結合を阻害する方法であって、該CXCR3タンパク質を、配列番号:2のアミノ酸配列を有するヒトCXCケモカインレセプター3(CXCR3)タンパク質に結合する抗体または抗原結合断片と接触させる工程を含む、方法。
- ヒトCXCR3タンパク質への、IP−10およびMigからなる群より選択されるリガンドの結合を阻害する方法であって、該方法は、該CXCR3タンパク質を、ヒトCXCR3タンパク質に結合する抗体または抗原結合断片と接触させる工程を含み、結合が、配列番号:2の残基1〜15の配列と同じアミノ酸配列からなるポリペプチドによって阻害される、方法。
- 配列番号:2に示されるアミノ酸配列を有する哺乳動物CXCケモカインレセプター3(CXCR3)タンパク質のシグナル伝達活性または細胞応答機能を阻害する方法であって、該タンパク質を、配列番号:2のアミノ酸配列を有するヒトCXCR3タンパク質に結合する抗体または抗原結合断片と接触させる工程を含む、方法。
- 配列番号:2に示されるアミノ酸配列を有するヒトCXCケモカインレセプター3(CXCR3)タンパク質への、IP−10およびMigからなる群より選択されるリガンドの結合を阻害する方法であって、該タンパク質を、モノクローナル抗体1C6(ATCC受託番号HB−12330)またはその抗原結合断片と接触させる工程を含む、方法。
- 配列番号:2に示されるアミノ酸配列を有するヒトCXCケモカインレセプター3(CXCR3)タンパク質によって媒介されるIP−10誘導カルシウムフラックスを阻害する方法であって、該タンパク質を、配列番号:2のアミノ酸配列を有するヒトCXCR3タンパク質に結合する抗体または抗原結合断片と接触させる工程を含む、方法。
- 配列番号:2に示されるアミノ酸配列を有するヒトCXCケモカインレセプター3(CXCR3)タンパク質を介するIP−10誘導走化性を阻害する方法であって、該タンパク質を、配列番号:2のアミノ酸配列を有するヒトCXCR3タンパク質に結合する抗体または抗原結合断片と接触させる工程を含む、方法。
- CXCケモカインレセプター3(CXCR3)タンパク質のシグナル伝達活性または細胞応答機能を阻害する方法であって、該方法は、該CXCR3タンパク質を、配列番号:2のアミノ酸配列を有するヒトCXCR3タンパク質に結合する抗体または抗原結合断片と接触させる工程を含み、該抗体はモノクローナル抗体1C6(ATCC受託番号HB−12330)の軽鎖CDR(CDR1、CDR2およびCDR3)および重鎖CDR(CDR1、CDR2およびCDR3)ならびにヒト枠組み領域を含むヒト化免疫グロブリンであり、該ヒト化免疫グロブリンがモノクローナル抗体1C6(ATCC受託番号HB−12330)のエピトープ特異性を有する、方法。
- ヒトCXCケモカインレセプター3(CXCR3)タンパク質への、IP−10およびMigからなる群より選択されるリガンドの結合を阻害する方法であって、該CXCR3タンパク質を、ハイブリドーマ細胞株HB−12330により産生される抗体またはその抗原結合断片と接触させる工程を含む、方法。
- 哺乳動物CXCケモカインレセプター3(CXCR3)タンパク質のシグナル伝達活性または細胞応答機能を阻害する方法であって、該方法は、該CXCR3タンパク質を、配列番号:2のアミノ酸配列を有するヒトCXCR3タンパク質に結合する抗体または抗原結合断片と接触させる工程を含み、該抗体はモノクローナル抗体1C6(ATCC受託番号HB−12330)の軽鎖CDR(CDR1、CDR2およびCDR3)および重鎖CDR(CDR1、CDR2およびCDR3)ならびにヒト枠組み領域を含むヒト化免疫グロブリンであり、該ヒト化免疫グロブリンがモノクローナル抗体1C6(ATCC受託番号HB−12330)のエピトープ特異性を有する、方法。
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