JP4057243B2 - 抗−ｃｃｒ２抗体及びその使用方法 - Google Patents

Description

【０００１】
関連出願
本出願は、１９９８年７月２３日に提出された米国特許出願番号第０９／１２１／７８１号の一部継続出願である。その全体の教示は、本明細書中でその全体において本明細書中で参考として援用されている。
【０００２】
発明の背景
ケモカインと呼ばれる、白血球化学接着因子／活性化因子の拡大しつつあるファミリーが最近の数年間で記載されている（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｊ．Ｊ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：６１７−６４８（１９９１）；Ｓｃｈａｌｌ及びＢａｃｏｎ、Ｃｕｒｒ．Ｏｐｉｎ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，６：８６５−８７３（１９９４）；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ，Ｍ．ら、Ａｄｖ．Ｉｍｕｎｏｌ．，５５：９７−１７９（１９９４））。このファミリーのメンバーは、ＩＬ−１β又はＴＮＦαのような初期の炎症媒介因子に応答する多くの細胞型によって産生され、そして分泌される。ケモカインスーパーファミリーは、２つの主鎖：α−ケモカイン（又はＣＸＣケモカイン）及びβ−ケモカイン（ＣＣケモカイン）を含む。α−ケモカインの鎖は、ＩＬ−８、好中球活性化ペプチド−２（ＮＡＰ−２）、黒色腫成長刺激活性（ＭＧＳＡ／ｇｒｏ又はＧＲＯα）、及びＥＮＡ−７８（これらのそれぞれは、好中球に対して主に引きつける効果及び活性化効果を有する）のようなタンパク質を含む。β−ケモカインの鎖のメンバーは、単球、リンパ球、好塩基球、及び好酸球のような他の細胞型に対して影響を与え（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｊ．Ｊ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：６１７−６４８（１９９１）；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ，Ｍ．ら、Ａｄｖ．Ｉｍｕｎｏｌ．，５５：９７−１７９（１９９４）；Ｍｉｌｌｅｒ及びＫｒａｎｇｅｌ、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：１７−４６（１９９２）；Ｊｏｓｅ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７９：８８１−１１８（１９９４）；Ｐｏｎａｔｈ，Ｐ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９７：６０４−６１２（１９９６））、そして単球の化学走化性（ｃｈｅｍｏｔａｃｔｉｃ）タンパク質１−４（ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、及びＭＣＰ−４）、ＲＡＮＴＥＳ，及びマクロファージ炎症性タンパク質（ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β）のようなタンパク質を含む。最近、ＣＸＣ３ケモカインと命名された、膜に結合したケモカインの新規のクラスが、同定されている（Ｂａｚａｎ，Ｊ．Ｆ．ら、Ｎａｔｕｒｅ ３８５：６４０−６４４（１９９７））。ケモカインは、化学走化性の誘発、脱顆粒、脂質媒介因子の合成、及びインテグリンの活性化のような、一定の範囲の白血球に対するプロ炎症性の影響を媒介し得る（Ｏｐｐｅｎｈｅｉｍ，Ｊ．Ｊ．ら、Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，９：６１７−６４８（１９９１）；Ｂａｇｇｉｏｌｉｎｉ，Ｍ．ら、Ａｄｖ．Ｉｍｕｎｏｌ．，５５：９７−１７９（１９９４）；Ｍｉｌｌｅｒ，Ｍ．Ｄ．及びＫｒａｎｇｅｌ，Ｍ．Ｓ．、Ｃｒｉｔ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：１７−４６（１９９２））。最近、特定のβ−ケモカインが、インビトロでヒトのＴ細胞株のＨＩＶ−１感染を抑制することが示されている（Ｃｏｃｃｈｉ，Ｆ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈ．ＤＣ）、２７０：１８１１−１８１５（１９９５））。
【０００３】
ケモカインは、７個の膜貫通スパン（７ＴＭＳ）のＧタンパク質結合レセプターに結合する（Ｍｕｒｐｈｙ，Ｐ．Ｍ．，Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１２：５９３−６３３（１９９４））。ＣＣ又はβケモカインについてのいくつかの既知のレセプターは、ＣＣＲ１（これは、ＭＩＰ−１α及びＲＡＮＴＥＳに結合する（Ｎｅｏｔｅ，Ｋ．ら、Ｃｅｌｌ，７２：４１５−４２５（１９９３）；Ｇａｏ，Ｊ．Ｌ．、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１７７：１４２１−１４２７（１９９３）））；ＣＣＲ２（これは、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、及びＭＣＰ−４を含むケモカインに結合する（Ｃｈａｒｏ，Ｉ．Ｆ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：２７５２−２７５６（１９９４）；Ｍｙｅｒｓ，Ｓ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：５７８６−５７９２（１９９５）；Ｇｏｎｇら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７２：１１６８２−１１６８５（１９９７）；Ｇａｒｃｉａ−Ｚｅｐｅｄａら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５７：５６１３−５６２６（１９９６）））；ＣＣＲ３（これは、エオタキシン、ＲＡＮＴＥＳ、及びＭＣＰ−３を含むケモカインに結合する（Ｐｏｎａｔｈ，Ｐ．Ｄ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．，１８３：２４３７−２４４８（１９９６）））；ＣＣＲ４（これは、ＭＣＰ−１、ＭＩＰ−１α、及びＲＡＮＴＥＳに応答してシグナルを伝達することが見出されている（Ｐｏｗｅｒ，Ｃ．Ａ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７０：１９４９５−１９５００（１９９５）））；ならびにＣＣＲ５（これは、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β、及びＲＡＮＴＥＳに応答してシグナルを伝達することが示されている（Ｂｏｒｉｎｇ，Ｌ．ら、Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１（１３）：７５５１−７５５８（１９９６）；Ｒａｐｏｒｔ，Ｃ．Ｊ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，２７１：１７１６１−１７１６６（１９９６）；及びＳａｍｓｏｎ，Ｍ．ら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，３５：３３６２−３３６７（１９９６）））を含む。
【０００４】
ＣＣＲ２は、いくつかの白血球サブセットの表面で発現され、そしてカルボキシ末端領域をコードするｍＲＮＡの異なったスプライシングに起因して２つのわずかに異なる形態（ＣＣＲ２ａ及びＣＣＲ２ｂ）で発現されるようである（Ｃｈａｒｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：２７５２−２７５６（１９９４））。ＭＣＰ−１は、単球、リンパ球、及び好塩基球に対して作用して、化学走化性、顆粒の放出、呼吸バースト、ならびにヒスタミン及びサイトカインの放出を誘導する。研究は、ＭＣＰ−１が関節リウマチ、アテローム性動脈硬化、肉芽腫性の疾患及び多発性硬化症のような疾患の病因であると考えられることを示唆した（Ｋｏｃｈ，Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．９０：７７２−７９（１９９２）；Ｈｏｓａｋａら、Ｃｌｉｎ．Ｅｘｐ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９７：４５１−４５７（１９９４）；Ｓｃｈｗａｒｔｚら、Ａｍ．Ｊ．Ｃａｒｄｉｏｌ．７１（６）：９Ｂ−１４Ｂ（１９９３）；Ｓｃｈｉｍｍｅｒら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１６０：１４６６−１４７１（１９９８）；Ｆｌｏｒｙら、Ｌａｂ．Ｉｎｖｅｓｔ．６９：３９６−４０４（１９９３）；Ｇｏｎｇら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８６：１３１−１３７（１９９７））。さらに、ＣＣＲ２は、ＨＩＶの共レセプターとして作用し得る（Ｃｏｎｎｏｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１８５：６２１−６２８（１９９７））。従って、ＣＣＲ２レセプターアンタゴニストは、重要な治療薬の新規のクラスを提示し得る。
【０００５】
発明の要旨
本発明は、抗体（イムノグロブリン）又はその機能的なフラグメント（例えば、抗原結合フラグメント）に関する。これは、哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター−２（ＣＣＲ２、ＣＫＲ−２、ＭＣＰ−１ＲＡ又はＭＣＰ−１ＲＢともまた呼ばれる）又はレセプター（抗−ＣＣＲ２）の一部に結合する。１つの実施態様においては、本発明の抗体又はそのフラグメントは、ヒト若しくはアカゲザルのＣＣＲ２又はその一部への特異性を有する。別の実施態様においては、本発明の抗体又はフラグメントは、レセプターへのリガンド（例えば、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４）の結合をブロックし、そしてレセプターへのリガンドの結合に関連する機能（例えば、白血球輸送）を阻害する。例えば、本明細書中に記載されているように、ヒト若しくはアカゲザルのＣＣＲ２又はその一部に結合する本発明の抗体及びそのフラグメントは、レセプターへのケモカイン（例えば、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４）の結合をブロックし、そしてレセプターに対するケモカインの結合に関連する機能を阻害する。１つの実施態様においては、抗体は、モノクローナル抗体（ｍＡｂ）、ＬＳ１３２．１Ｄ９（１Ｄ９）、又はヒトのＣＣＲ２若しくはヒトのＣＣＲ２の一部への結合について１Ｄ９と競合し得る抗体である。上記の抗体の機能的なフラグメントもまた想定される。
【０００６】
別の実施態様においては、本発明の抗体又は機能的なフラグメントは、ヒトのＣＣＲ２又はその一部に結合し、そしてレセプターに対するヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）の結合を阻害し、それによってレセプターに対するＨＩＶの結合に関連する機能（例えば、ＨＩＶ抗原の放出及び感染性）を阻害する。１つの実施態様においては、抗体は、モノクローナル抗体１Ｄ９、又はヒトのＣＣＲ２若しくはヒトのＣＣＲ２の一部への結合に関して１Ｄ９と競合することができる抗体である。
【０００７】
本発明はまた、哺乳動物のＣＣＲ２又はレセプターの一部に結合し、そして他の抗−ＣＣＲ２抗体と比較して、ＣＣＲ２又はＣＣＲ２を含む組成物の増大した蛍光染色強度を提供する、抗体又はその機能的なフラグメント（例えば、抗体結合フラグメント）に関する。１つの実施態様においては、抗体は、モノクローナル抗体１Ｄ９若しくはＬＳ１３２．８Ｇ２（８Ｇ２）、又はヒトのＣＣＲ２若しくはヒトのＣＣＲ２の一部への結合に関して１Ｄ９若しくは８Ｇ２と競合することができる抗体である。
【０００８】
本発明はさらに、細胞が保有している哺乳動物（例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類、又はマウス）のＣＣＲ２とそのリガンドとの相互作用を阻害する方法に関する。この方法は、細胞を、哺乳動物のＣＣＲ２若しくはＣＣＲ２の一部に結合する有効量の抗体若しくはその機能的なフラグメントと接触させる工程を包含する。適切な細胞として、顆粒球、白血球（例えば、単球、マクロファージ、好塩基球、及び好酸球）、肥満細胞、及びＴ細胞を含むリンパ球（例えば、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤ２５＋細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞）、ならびにＣＣＲ２を発現する組換え細胞（例えば、トランスフェクトされた細胞）のようなＣＣＲ２を発現する他の細胞が挙げられる。特定の実施態様においては、抗体は、１Ｄ９、又はヒトのＣＣＲ２若しくはヒトのＣＣＲ２の一部への結合に関して１Ｄ９と競合することができる抗体である。
【０００９】
本発明の別の実施態様は、ケモカインと哺乳動物のＣＣＲ２を保有する細胞との相互作用を阻害する方法に関する。この方法は、ＣＣＲ２又は上記のレセプターの一部に結合する有効量の抗体又はその機能的なフラグメントと、上記の細胞とを接触させる工程を包含する。この方法の１つの実施態様においては、抗体又はその機能的なフラグメントは、任意の１つ以上の、１Ｄ９、１Ｄ９の抗原結合フラグメント、又は１Ｄ９のものと同一若しくは類似のエピトープ特異性を有する抗体若しくはそのフラグメントである。さらに、本発明は、ＣＣＲ２に対するケモカインの結合に関連する機能を阻害する方法に関する。この方法は、哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質又は上記のレセプターの一部に結合する、有効量の抗体又はその機能的なフラグメントを投与する工程を包含する。この方法の１つの局面においては、抗体又はその機能的なフラグメントは、任意の１つ以上の、１Ｄ９、１Ｄ９の抗原結合フラグメント、又は１Ｄ９のものと同一若しくは類似のエピトープ特異性を有する抗体若しくはそのフラグメントである。
【００１０】
本発明の別の局面は、細胞による、哺乳動物のＣＣＲ２又はレセプターの一部の発現を同定する方法である。この方法に従うと、細胞又はその画分（例えば、膜画分）を含む組成物は、哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質又はレセプターの一部に結合する抗体又はそのフラグメント（例えば、１Ｄ９又は８Ｇ２）と、それに対する抗体の結合に適切な条件下で接触させられ、そして容器の抗体又はフラグメントと、上記のタンパク質又はその一部との複合体の形成が検出される。複合体の検出は、直接的又は間接的に、細胞上のレセプターの存在を示す。本発明はまた、生物学的サンプル中のＣＣＲ２又はその一部の存在を検出することにおける使用のためのキットに関する。キットは、哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２又は上記のレセプターの一部に結合する抗体又はそのフラグメント、及び上記の抗体又はフラグメントと上記のタンパク質又はその一部との複合体の存在を検出するために適切な１つ以上の付属の試薬を含む。
【００１１】
哺乳動物のＣＣＲ２のインヒビター及び／又はプロモーターを含む、哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質に結合するさらなるリガンド又はたの物質を同定する方法もまた、本発明によって含まれる。例えば、本発明の抗体又はその機能的なフラグメントのものと同一若しくは類似の結合特異性を有する試薬が、上記の抗体又はフラグメントを用いる競合アッセイによって同定され得る。従って、本発明はまた、レセプター機能のインヒビター（例えば、アンタゴニスト）又はプロモーター（例えば、アゴニスト）を含む、ＣＣＲ２レセプターに結合するリガンド又は他の基質を同定する方法を含む。１つの実施態様においては、ＣＣＲ２レセプタータンパク質を天然に発現する細胞、又は核酸によってコードされるＣＣＲ２レセプター又は変異体を発現するように操作されている適切な宿主細胞が、リガンド、レセプター機能のインヒビター又はプロモーターを同定し、そしてそれらの効率を評価するためのアッセイにおいて使用される。このような細胞はまた、発現されたレセプタータンパク質又はポリペプチドの機能を評価することにおいて有用である。
【００１２】
従って、本発明はまた、哺乳動物のＣＣＲ２又はそのリガンド結合変異体に結合する試薬を検出するか又は同定する方法に関する。この方法は、試験される試薬、本発明の抗体又は抗原結合フラグメント（例えば、モノクローナル抗体１Ｄ９、１Ｄ９のものと同一又は類似のエピトープ特異性を有する抗体、１Ｄ９の抗原結合フラグメント、モノクローナル抗体８Ｇ２、８Ｇ２のものと同一又は類似のエピトープ特異性を有する抗体、及び８Ｇ２の抗原結合フラグメント）、及び哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質又はそのリガンド結合変異体を含有する組成物を混合する工程を包含する。上記の成分は、抗体又は抗原結合フラグメントの、哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質又はそのリガンド結合変異体への結合に適切な条件下で混合され得、そして哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質又はリガンド結合変異体への抗体又はフラグメントの結合が、本明細書中に記載されている方法又は他の適切な方法に従って直接又は間接的に検出される。適切なコントロール（例えば、試験される試薬の非存在下）と比較して形成された複合体の量における減少は、その試薬が上記のレセプター又は変異体に結合することの指標である。哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質又はそのリガンド結合変異体を含有する組成物は、組換えＣＣＲ２タンパク質又はそのリガンド結合変異体を保有している細胞の膜画分であり得る。抗体又はそのフラグメントは、放射性同位元素、スピン標識、抗原標識、酵素標識，蛍光基、及び化学発光基のような標識を用いて標識され得る。これら及び類似のアッセイが、リガンド（例えば、ＣＣＲ２と相互作用するケモカイン）又は他の物質（ＣＣＲ２に結合し、そしてレセプターへの結合に関して本明細書中に記載されている抗体と競合する、レセプター機能のインヒビター又はプロモーター）を含む、試薬を検出するために使用され得る。
【００１３】
本発明に従うと、リガンド、レセプター機能のインヒビター又はプロモーターは、適切なアッセイにおいて同定され得、そして治療効果についてさらに評価され得る。レセプター機能のインヒビターは、レセプター活性を阻害する（低減させるか又は妨げる）ために使用され、そしてリガンド及びプロモーターは、示されていような正常なレセプター機能を誘導する（誘発するか又は増強する）ために使用され得る。本発明はまた、炎症性の疾患、自己免疫疾患、アテローム性動脈硬化、及び移植拒絶、又はＨＩＶ感染を治療する方法を提供する。この方法は、レセプター機能（例えば、ケモカインの結合又はＨＩＶの結合）のインヒビターを個体（例えば、ヒトのような哺乳動物）に投与する工程を包含する。本発明はさらに、個体に対して新規のリガンド又はプロモーターを投与することによる、レセプター機能を刺激する方法をさらに提供する。この方法によって、白血球機能の選択的な刺激に対する新規のアプローチを提供する。これは、例えば、感染性の疾患及びガンの治療において有用である。
【００１４】
本発明の別の局面は、哺乳動物のＣＣＲ２又はその一部を発現する細胞のＨＩＶ感染を阻害する方法に関する。この方法は、哺乳動物のＣＣＲ２又はレセプターの一部に結合しそしてＨＩＶの結合及び感染を阻害する、有効量の抗体又はその機能的なフラグメントと、細胞とを接触させる工程を包含する。本発明の特定の実施態様においては、抗体又はその機能的なフラグメントは、任意の、１Ｄ９、１Ｄ９のものと同一又は類似のエピトープ特異性を有する抗体、及びその抗原結合フラグメントである。
【００１５】
患者においてＨＩＶを阻害する（例えば、治療する）方法もまた、本発明によって含まれる。この方法は、哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質又は上記のレセプターの一部に結合し、そしてＣＣＲ２レセプターへのＨＩＶの結合を阻害する、有効量の抗体又はその機能的なフラグメントを患者に投与する工程を包含する。抗−ＣＣＲ２抗体又はフラグメントは、単独で、又は１つ以上のさらなる治療薬（例えば、ＨＩＶ感染についての共レセプターに結合し、そして上記の共レセプター（例えば、抗−ＣＣＲ３、抗−ＣＣＲ５、及び／又は抗−ＣＸＣＲ４抗体）への結合を阻害する１つ以上の抗体）と組み合わせて投与され得る。
【００１６】
本発明の別の局面はまた、個体におけるＨＩＶ感染を予防するか又は阻害する方法にも関する。この方法は、ＣＣＲ２に結合し、そしてＣＣＲ２へのＨＩＶの結合を阻害する、有効量の抗体又はその機能的なフラグメントを個体に投与する工程を包含する。この方法に従うと、ＨＩＶ感染を防ぐことは、感染した個体における新たな細胞の感染を防ぐ（低減させるか又は排除する）ため、又は感染の可能性があるか、ＨＩＶに曝される可能性があるか、若しくはＨＩＶに曝されている個体における感染を防ぐための治療を含む。例えば、ＨＩＶに感染した個体、ＨＩＶに感染した女性の胎児、又は健常な看護従事者のような個体は、本発明の方法に従って治療され得る。
【００１７】
本発明はまた、患者における白血球の輸送を阻害する方法をも含む。この方法は、哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質又は上記のレセプターの一部に結合し、そしてレセプターへのリガンドの結合に関連する機能を阻害する、有効量の抗体又はその機能的なフラグメントを患者に投与する工程を包含する。
【００１８】
本発明はまた、炎症性の障害のようなＣＣＲ２に媒介される障害を阻害又は治療する方法にも関する。この方法は、哺乳動物のＣＣＲ２又は上記のレセプターの一部に結合し、そしてＣＣＲ２によって媒介される機能を阻害する、有効量の抗体又はその機能的なフラグメントを患者に投与する工程を包含する。例えば、本発明は、脈管系の狭窄又は再狭窄を阻害又は治療する方法に関する。この方法は、哺乳動物のＣＣＲ２又は上記のレセプターの一部に結合し、そしてＣＣＲ２によって媒介される機能を阻害する、有効量の抗体又はその機能的なフラグメントを患者に投与する工程を包含する。
【００１９】
本発明はさらに、治療（予防を含む）又は診断における使用のため本明細書中に記載されているような抗体若しくはそのフラグメント（例えば、モノクローナル抗体１Ｄ９、又はその抗原結合フラグメント）、及びＣＣＲ２によって媒介される障害又は本明細書中に記載されているような疾患若しくは炎症性の状態の治療のための医薬品のためのこのような抗体若しくはフラグメントの使用に関する。
【００２０】
発明の詳細な記載
本発明は、哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２（ＣＣＲ２、ＣＫＲ−２、ＭＣＰ−１ＲＡ、若しくはＭＣＰ−１ＲＢ）又はＣＣＲ２の部分に結合する、抗体（抗−ＣＣＲ２）又はその機能的なフラグメントに関する。一実施態様においては、抗体は、ヒト若しくはアカゲザルンのＣＣＲ２又はその一部に対する特異性を有する。一実施態様においては、抗体（イムノグロブリン）は、単離された及び／又は組換えの哺乳動物ＣＣＲ２又はその部分（例えば、ペプチド）に対して、あるいは、哺乳動物のＣＣＲ２を発現する宿主細胞に対して、産生される。好ましい実施態様においては、抗体は、ヒトＣＣＲ２レセプター（単数又は複数）（例えば、ＣＣＲ２ａ及び／又はＣＣＲ２ｂ）又はその部分に特異的に結合し、そして特に好ましい実施態様においては、抗体は、天然に存在するか又は内因性のヒトＣＣＲ２に対して特異性を有する。本明細書中で使用されているように、「ＣＣ−ケモカインレセプター２」（「ＣＣＲ２」）は、ＣＣ−ケモカインレセプター２ａ及び／又はＣＣ−ケモカインレセプター２ｂをいう。哺乳動物のＣＣＲ２に特有の１つ以上の機能（例えば、結合活性（例えば、リガンド、インヒビター、及び／又はプロモーターの結合）、シグナル伝達活性（例えば、哺乳動物のＧタンパク質の活性化、細胞質ゾルの遊離のカルシウムの濃度［Ｃａ²⁺］ｉにおける迅速でありそして一時的な増大の誘導）、及び／又は細胞性の応答の刺激（例えば、化学走性の刺激、エキソサイトーシス、又は白血球による炎症性媒介因子の放出、インテグリンの活性化）を阻害し得る抗体又はその機能的なフラグメントもまた、本発明によって含まれる。このような抗体は、リガンド（すなわち、１つ以上のリガンド）の、ＣＣＲ２に対する結合を阻害、及び／又はリガンドに応答してＣＣＲ２により媒介される１つ以上の機能を阻害する。例えば、１つの局面においては、抗体又はその機能的なフラグメントは、天然のリガンド（例えば、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−３、及び／又はＭＣＰ−４）とレセプターとの相互作用を阻害し得る（低減し得るか又は妨げ得る）。別の局面においては、ＣＣＲ２に結合する抗体又はその機能的なフラグメントは、哺乳動物のＣＣＲ２（例えば、ヒトのＣＣＲ２、ヒト以外の霊長類のＣＣＲ２、マウスのＣＣＲ２）に対する、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、及び／又はＭＣＰ−４、及び／又はＨＩＶの結合を阻害し得る。本発明の抗体又はその機能的なフラグメントは、ヒトのＣＣＲ２によって媒介される機能（白血球の輸送（ｔｒａｆｆｉｃｋｉｎｇ）、細胞中へのＨＩＶの侵入、Ｔ細胞の活性化、炎症性媒介因子の放出、及び／又は白血球の脱顆粒を含む）を阻害し得る。好ましくは、抗体又はフラグメントは、少なくとも約０．１×１０^-9Ｍの、好ましくは、少なくとも約１×１０^-9Ｍ、そしてより好ましくは、少なくとも約３×１０^-9Ｍの親和性で、ＣＣＲ２に結合し得る。特定の実施態様においては、抗体又はその機能的なフラグメントは、ケモカインによって誘導される（例えば、ＭＣＰ−１によって誘導される）細胞（例えば、ＰＢＭＣ）の化学走性を、約１５０μｇ／ｍｌ未満、好ましくは、１００μｇ／ｍｌ未満、より好ましくは約５０μｇ／ｍｌ未満、及びなおより好ましくは、約２０μｇ／ｍｌ未満の阻害を示す。
【００２１】
本発明のさらなる実施態様においては、本発明の抗体又はその機能的なフラグメントは、約１．０μｇ／ｍｌ未満、好ましくは、約０．０５μｇ／ｍｌ未満、及びより好ましくは、０．００５μｇ／ｍｌ未満のＩＣ₅₀で、ＣＣＲ２に対するＣＣＲ２リガンド（例えば、ケモカイン）の結合を阻害し得る。
【００２２】
ＣＣＲ２に対して特異的なマウスのモノクローナル抗体（１Ｄ９及び８Ｇ２と命名した）を、本明細書中に記載されているように産生した。好ましい実施態様においては、本発明の抗体は、ヒトのＣＣＲ２に結合し、そして本明細書中に記載されているマウスの１Ｄ９又は８Ｇ２抗体のものと同じであるか又は類似であるエピトープ特異性を有する。マウスの１Ｄ９モノクローナル抗体のものと同じであるか又は類似であるエピトープ特異性を有する抗体は、ヒトのＣＣＲ２に対する（例えば、ヒトのＣＣＲ２を保有している細胞（例えば、ＣＣＲ２を保有しているトランスフェクタント、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４＋細胞、ＣＤＲ４５ＲＯ＋細胞、ＣＤ２５＋細胞、単球、樹状細胞、マクロファージ、及び好塩基球）に対する）結合についてマウスの１Ｄ９モノクローナル抗体と競合するそれらの能力によって同定され得る。同様に、マウスの８Ｇ２モノクローナル抗体のものと同じであるか又は類似であるエピトープ特異性を有する抗体は、ヒトのＣＣＲ２に対する結合についてマウスの８Ｇ２モノクローナル抗体と競合するそれらの能力によって同定され得る。レセプターのキメラ（Ｒｕｃｋｅｒら、Ｃｅｌｌ ８７：４３７−４４６（１９９６））を使用して、ｍＡｂ １Ｄ９及び８Ｇ２の結合部位が、タンパク質の約アミノ酸１から約アミノ酸３０までを含むエピトープに特異的である、ヒトのＣＣ−ケモカインレセプター２のアミノ末端ドメインにマップされている。これら又は他の適切な技術を使用して、本発明の抗体のものと同じであるか又は類似であるエピトープ特異性を有する抗体が、同定され得る。ｍＡｂ １Ｄ９及び８Ｇ２は、ＣＣＲ２レセプターのアミノ末端ドメイン（例えば、該レセプタータンパク質の約アミノ酸番号１から約アミノ酸番号３０まで）に対するエピトープ特異性を有する。従って、本発明は、哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２のアミノ末端ドメイン又はその部分に結合する、そして特に、哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２の約アミノ酸１から約アミノ酸３０までを含むエピトープに結合する抗体又はその機能的な部分に関する。
【００２３】
本発明はまた、二重特異性抗体又はその機能的なフラグメント（例えば、Ｆ（ａｂ’）₂ ）にも関する。これは、本明細書中に記載されている抗体の少なくとも２つと同じであるか又は類似のエピトープ特異性を有する（例えば、米国特許第５，１４１，７３６号（Ｉｗａｓａら）、米国特許第４，４４４，８７８号、第５，２９２，６６８号、第５，５２３，２１０号（全て、Ｐａｕｌｕｓら）、及び米国特許第５，４９６，５４９号（Ｙａｍａｚａｋｉら）を参照のこと）。例えば、本発明の二重特異性抗体は、ｍＡｂ １Ｄ９及び８Ｇ２と同じであるか又は類似のエピトープ特異性を有し得、例えば、哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質のアミノ末端ドメイン又はその部分に結合する。
【００２４】
本発明の抗体を産生するハイブリドーマ細胞株は、１９９８年７月１７日に、ＬｅｕｋｏＳｉｔｅ，Ｉｎｃ．，２１５ Ｆｉｒｓｔ Ｓｔｒｅｅｔ，Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ，ＭＡ ０２１４２，Ｕ．Ｓ．Ａ．を代表してアメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ）、１０８０１、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｂｏｕｌｅｖａｒｄ，Ｍａｎａｓｓａｓ，Ｖｉｒｇｉｎｉａ ２０１１０，Ｕ．Ｓ．Ａ．に、登録番号第ＨＢ−１２５４９号（１Ｄ９）及び第ＨＢ−１２５５０号（８Ｇ２）で寄託された。本発明はまた、ＡＴＣＣ登録番号第ＨＢ−１２５４９号及びＡＴＣＣ登録番号第ＨＢ−１２５５０号の下で寄託されたハイブリドーマ細胞株、ならびにＡＴＣＣ登録番号第ＨＢ−１２５４９号及びＨＢ−１２５５０号の下で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体に関する。
【００２５】
本発明の抗体は、ポリクローナル又はモノクローナルであり得、そして用語「抗体」は、ポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両方を含むことが意図される。さらに、８Ｇ２を利用する本明細書中に記載されている方法はまた、８Ｇ２の機能的なフラグメント（例えば、抗原結合性フラグメント）、８Ｇ２のものと同じであるか又は類似のエピトープ特異性を有する抗体、及びその組み合わせも、必要に応じて、８Ｇ２と同じでも類似でもないエピトープ特異性を有する抗体又はフラグメントとの組み合わせをもまた利用し得る；同様に、１Ｄ９を利用する記載されている方法もまた、１Ｄ９の機能的なフラグメント、１Ｄ９のものと同じであるか又は類似のエピトープ特異性を有する抗体、及びその組み合わせも、必要に応じて、１Ｄ９と同じでも類似でもないエピトープ特異性を有する抗体又はフラグメントとの組み合わせて利用し得ることが理解される。本発明の抗体は、適切な免疫原（例えば、単離された及び／又は組換えの哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質若しくはその部分）又は合成分子（例えば、合成ペプチド）に対して産生され得る。好ましい実施態様においては、レセプターを発現する細胞（例えば、トランスフェクトされた細胞）は、免疫原として、又はレセプターに結合する抗体についてのスクリーニングにおいて使用され得る。
【００２６】
本発明の抗体及びそのフラグメントは、本明細書中で記載されているように、治療適用、診断適用、及び研究適用において有用である。本発明は、治療（予防を含む）又は（例えば、本明細書中に記載されているような特定の疾患若しくは状態の）診断における使用、及び本明細書中に記載されているような疾患若しくは状態の治療における使用のための薬物の製造のための、本発明の抗体又はその機能的な部分（例えば、ｍＡｂ １Ｄ９若しくは８Ｇ２、又はそれらの抗原結合性フラグメント）の使用を含む。
【００２７】
免疫化抗原の調製、ならびにポリクローナル及びモノクローナル抗体の産生は、本明細書中で記載されているように、又は他の適切な技術を使用して、行われ得る。種々の方法が、記載されている（例えば、Ｋｏｈｌｅｒら、Ｎａｔｕｒｅ，２５６：４９５−４９７（１９７５）及びＥｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６：５１１−５１９（１９７６）；Ｍｉｌｓｔｅｉｎら、Ｎａｔｕｒｅ，２６６：５５０−５５２（１９７７）；Ｋｏｐｒｏｗｓｋｉら、米国特許第４，１７２，１２４号；Ｈａｒｌｏｗ，Ｅ．及びＤ．Ｌａｎｅ，１９８８，Ａｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，（Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ：Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ，ＮＹ）；Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ Ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ，第２巻（増刊号 ２７、１９９４年、夏）、Ａｕｓｕｂｅｌ，Ｆ．Ｍ．ら編、（Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ＆ Ｓｏｎｓ：Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ＮＹ）、第１１章、（１９９１）を参照のこと）。一般的には、ハイブリドーマは、適切な不死細胞株（例えば、ＳＰ２／０のような骨髄腫細胞株）を抗体産生細胞と融合させることによって産生され得る。抗体産生細胞（好ましくは、脾臓又はリンパ節の細胞）は、目的の抗原を用いて免疫化された動物から得られる。融合細胞（ハイブリドーマ）は、選択的な培養条件を使用して単離され得、そして限界希釈によってクローン化され得る。所望の結合特性を有する抗体を産生する細胞は、適切なアッセイ（例えば、ＥＬＩＳＡ）によって選択され得る。
【００２８】
ＣＣＲ２に結合する抗体（ヒト抗体又は人工的な抗体を含む）を産生又は単離する他の適切な方法が使用され得る。これは、例えば、ライブラリーから組換え抗体（例えば、単鎖Ｆｖ又はＦａｂ）を選択する方法、又はヒト抗体のレパートリーを産生し得るトランスジェニック動物（例えば、マウス）の免疫化による方法を含む（例えば、Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，９０：２５５１−２５５５（１９９３）；Ｊａｋｏｂｏｖｉｔｓら、Ｎａｔｕｒｅ、３６２：２５５−２５８（１９９３）；Ｌｏｎｂｅｒｇら、米国特許第５，５４５，８０６号；Ｓｕｒａｎｉら、米国特許第５，５４５，８０７号を参照のこと）。
【００２９】
単鎖抗体、及びキメラ抗体、ヒト化抗体、又は霊長類化（ｐｒｉｍａｔｉｚｅｄ）（ＣＤＲ−移植）抗体、ならびにキメラ又はＣＤＲ移植単鎖抗体など（異なる種に由来する部分を含む）もまた、本発明及び用語「抗体」に含まれる。これらの抗体の種々の部分は、従来技術によって互いに化学的に連結され得るか、又は遺伝子操作技術を使用して連続するタンパク質として調製され得る。例えば、キメラ鎖又はヒト化鎖をコードする核酸は、連続するタンパク質を産生するように発現させられ得る。例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｃａｂｉｌｌｙら、欧州特許第０，１２５，０２３ Ｂ１号；Ｂｏｓｓら、米国特許第４，８１６，３９７号；Ｂｏｓｓら、欧州特許第０，１２０，６９４ Ｂ１号、Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、国際公開第８６／０１５３３号；Ｎｅｕｂｅｒｇｅｒ，Ｍ．Ｓ．ら、欧州特許第０，１９４，２７６ Ｂ１号；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号；Ｗｉｎｔｅｒ、欧州特許第０，２３９，４００ Ｂ１号、；ならびにＱｅｅｎら、米国特許第５，５８５０８９号、第５，６９８，７６１号、及び第５，６９８，７６２号を参照のこと。また、霊長類化抗体に関しては、Ｎｅｗｍａｎ，Ｒ．ら、ＢｉｏＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，１０：１４５５−１４６０（１９９２）を、そして単鎖抗体に関しては、Ｌａｄｎｅｒら、米国特許第４，９４６，７７８号及びＢｉｒｄ，Ｒ．Ｅ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ，２４２：４２３−４２６（１９８８）も参照のこと。
【００３０】
さらに、キメラ抗体、ヒト化抗体、霊長類化抗体、又は単鎖抗体のフラグメントを含む、抗体の機能的なフラグメントもまた、産生され得る。上記の抗体の機能的なフラグメントは、それらが由来する全長の抗体の少なくとも１つの結合機能及び／又は調節機能を保持している。好ましい機能的なフラグメントは、対応する全長の抗体の抗原結合性機能（例えば、哺乳動物のＣＣＲ２に結合する能力）を保持している。特に好ましい機能的なフラグメントは、哺乳動物のＣＣＲ２に特有の１つ以上の機能（例えば、結合活性、シグナル伝達活性、及び／又は細胞性応答の刺激）を阻害する能力を保持している。例えば、一実施態様においては、機能的なフラグメントは、１つ以上のそのリガンド（例えば、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、及び／又はＭＣＰ−４）とＣＣＲ２との相互作用を阻害し得、及び／又は１つ以上のレセプター媒介性機能（例えば、白血球の輸送、細胞中へのＨＩＶの侵入、Ｔ細胞の活性化、炎症媒介因子の放出、及び／又は白血球の脱顆粒）を阻害し得る。
【００３１】
例えば、哺乳動物のＣＣＲ２レセプター又はその部分に対して結合し得る抗体フラグメント（Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’、及びＦ（ａｂ’）₂ フラグメントを含むが、これらに限定されない）は、本発明によって包含される。このようなフラグメントは、例えば、酵素的な切断によって又は組換え技術によって産生され得る。例えば、パパイン又はペプシンによる切断によって、それぞれＦａｂ又はＦ（ａｂ’）₂ フラグメントが生成され得る。抗体はまた、１つ以上の停止コドンが天然の停止部位の上流に導入されている抗体遺伝子を使用して、種々の短縮された形態で産生され得る。例えば、Ｆ（ａｂ’）₂ の重鎖部分をコードするキメラ遺伝子は、重鎖のＣＨ₁ ドメイン及びヒンジ領域をコードするＤＮＡ配列を含むように設計され得る。
【００３２】
本明細書中で使用される用語「ヒト化イムノグロブリン」は、異なる起源のイムノグロブリンの部分を含むイムノグロブリンをいう。ここで、少なくとも１つの部分は、ヒト起源のものである。従って、本発明は、哺乳動物のＣＣＲ２（例えば、ヒトのＣＣＲ２、マウスのＣＣＲ２）に結合するヒト化イムノグロブリンに関する。上記のイムノグロブリンは、ヒト以外の起源（例えば、げっ歯類）の抗原結合性領域、及びヒト起源のイムノグロブリンの少なくとも部分（例えば、ヒトのフレームワーク領域、ヒトの定常領域、又はその部分）を含む。例えば、ヒト化抗体は、従来技術（例えば、合成）によって互いに化学的に連結されたか、又は遺伝子操作技術を使用して連続するポリペプチドとして調製された（例えば、キメラ抗体のタンパク質部分をコードするＤＮＡは、連続するポリペプチド鎖を産生するように発現され得る）、必要条件の特異性を有するヒト以外の起源（例えば、マウス）のイムノグロブリンに由来する部分、及びヒト起源のイムノグロブリン配列に由来する部分（例えば、キメライムノグロブリン）を含み得る。本発明のヒト化イムノグロブリンの別の例は、ヒト以外の起源のＣＤＲ（例えば、ヒト以外の起源の抗体に由来する１種以上のＣＤＲ）、及びヒト起源の軽鎖及び／又は重鎖に由来するフレームワーク領域（例えば、フレームワーク変更を有するか又は有しないＣＤＲ−移植抗体）を含有する１つ以上のイムノグロブリン鎖を含有するイムノグロブリンである。一実施態様においては、ヒト化イムノグロブリンは、ヒトのＣＣＲ２に対する結合について、１Ｄ９又は８Ｇ２モノクローナル抗体と競合し得る。好ましい実施態様においては、ヒト化イムノグロブリンの抗原結合性領域は、（ａ）１Ｄ９モノクローナル抗体に由来する（例えば、１Ｄ９の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３、ならびに１Ｄ９の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含有するヒト化イムノグロブリン中におけるような）か、又は（ｂ）８Ｇ２モノクローナル抗体に由来する（例えば、８Ｇ２の軽鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、ＣＤＲ３、ならびに８Ｇ２の重鎖のＣＤＲ１、ＣＤＲ２、及びＣＤＲ３を含有するヒト化イムノグロブリン中におけるような）。キメラ又はＣＤＲ−移植単鎖抗体もまた、ヒト化イムノグロブリンという用語に含まれる。
【００３３】
このようなヒト化イムノグロブリンは、所望されるヒト化鎖をコードする遺伝子（例えば、ｃＤＮＡ）を調製するために、合成及び／又は組換え核酸を使用して産生され得る。例えば、ヒト化可変領域をコードする核酸（例えば、ＤＮＡ）配列は、ヒトの又はヒト化された鎖（例えば、予めヒト化された可変領域に由来するＤＮＡ鋳型）をコードするＤＮＡ配列を変更するために、ＰＣＲ変異誘発方法を使用して構築され得る（例えば、Ｋａｍｍａｎ，Ｍ．ら、Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，１７：５４０４（１９８９）；Ｓａｔｏ，Ｋ．ら、Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，５３：８５１−８５６（１９９３）；Ｄａｕｇｈｅｒｔｙ，Ｂ．Ｌ．ら、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ，１９（９）：２４７１−２４７６（１９９１）；ならびにＬｅｗｉｓ，Ａ．Ｐ．及びＪ．Ｓ．Ｃｒｏｗｅ，Ｇｅｎｅ，１０１：２９７−３０２（１９９１）を参照のこと）。変異体はまた、これら又は他の適切な方法を使用して、容易に産生され得る。一実施態様においては、クローン化された可変領域は、変異誘発され得、そして所望される特異性を有する変異体をコードする配列が、選択され得る（例えば、ファージライブラリーから；例えば、Ｋｒｅｂｂｅｒら、米国特許第５，５１４，５４８号；１９９３年４月１日に公開された、Ｈｏｏｇｅｎｂｏｏｍら、国際公開第９３／０６２１３号を参照のこと）。
【００３４】
抗−イディオタイプ抗体もまた、提供される。抗−イディオタイプ抗体は、別の抗体の抗原結合性部位に関連する抗原決定基を認識する。抗−イディオタイプ抗体は、二次抗体を産生するために使用される動物と同じ種、好ましくは同じ系統の動物を免疫化することによって、二次抗体に対して調製され得る。例えば、米国特許第４，６９９，８８０号を参照のこと。
【００３５】
本発明はまた、ＡＴＣＣアクセッション番号第ＨＢ−１２５４９号及び第ＨＢ−１２５５０号の下で寄託されたハイブリドーマ細胞株、ならびにＡＴＣＣアクセッション番号第ＨＢ−１２５４９号及び第ＨＢ−１２５５０号の下で寄託されたハイブリドーマ細胞株によって産生されるモノクローナル抗体にも関する。本発明の細胞株は、モノクローナル抗体の産生のため以外の用途を有する。例えば、本発明の細胞株は、さらなるハイブリドーマを産生するように他の細胞（例えば、適切な薬物の耐性マーカーを有する、ヒトの骨髄腫、マウスの骨髄腫、ヒト−マウスへテロ骨髄腫、又はヒトのリンパ芽細胞）と融合され得、そして従って、モノクローナル抗体をコードする遺伝子の伝達を提供する。さらに、細胞株は、抗−ＣＣＲ２イムノグロブリン鎖をコードする核酸の供給源として使用され得る。これは、単離され得、そして発現され得る（例えば、任意の適切な技術（例えば、Ｃａｂｉｌｌｙら、米国特許第４，８１６，５６７号；Ｗｉｎｔｅｒ、米国特許第５，２２５，５３９号を参照のこと）を使用して他の細胞に導入したとき）。例えば、再配列された抗−ＣＣＲ２軽鎖又は重鎖を含むクローンが単離され得る（例えば、ＰＣＲによって）か、又はｃＤＮＡライブラリーが、細胞株から単離されたｍＲＮＡから調製され得、そして抗−ＣＣＲ２イムノグロブリン鎖をコードするｃＤＮＡクローンが単離され得る。従って、抗体又はその部分の重鎖及び／又は軽鎖をコードする核酸を得ることができ、そして種々の宿主細胞中、又はインビトロ翻訳系中での、特異的なイムノグロブリン、イムノグロブリン鎖、又はその変異体（例えば、ヒト化イムノグロブリン）の産生のための組換えＤＮＡ技術に従って使用され得る。例えば、核酸（ｃＤＮＡ、又はヒト化イムノグロブリン若しくはイムノグロブリン鎖のような変異体をコードするその誘導体を含む）は、適切な原核生物又は真核生物ベクター（例えば、発現ベクター）中に配置され得、そして適切な方法（例えば形質転換、トランスフェクション、エレクトロポレーション、感染）によって適当な宿主細胞中に導入され得る。その結果、核酸は、１つ以上の発現制御エレメントに作動可能に連結される（例えば、ベクター中、又は宿主細胞のゲノム中に組み込まれる）。産生のためには、宿主細胞は、発現のために適切な条件下（例えば、インデューサー、適切な塩を補充された適切な培地、成長因子、抗生物質、栄養補充物などの存在下）で維持することができ、それによって、コードされたポリペプチドが産生される。所望される場合は、コードされたタンパク質は回収、及び／又は単離することができる（例えば、宿主細胞、培地、乳から）。産生方法が、トランスジェニック動物の宿主細胞中での発現を含むことは理解される（例えば、１９９２年３月１９日に公開された、国際公開第９２／０３９１８号、ＧｅｎＰｈａｒｍ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌを参照のこと）。
【００３６】
本明細書中で記載されているように、本発明の抗体及びその機能的なフラグメントは、ＣＣＲ２に対するリガンドの結合をブロック（阻害）及び／又はＣＣＲ２に対するリガンドの結合に関連する機能を阻害し得る。以下に議論されるように、種々の方法が、ＣＣＲ２に対するリガンドの結合の阻害、及び／又はレセプターに対するリガンドの結合に関連する機能を評価するために使用され得る。
【００３７】
結合アッセイ
本明細書中で使用されるように、「哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質」は、天然に存在するか又は内因性の哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質、及び天然に存在するか又は内因性の対応する哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質のものと同じであるアミノ酸配列を有するタンパク質（例えば、組換えタンパク質）をいう。従って、本明細書中で定義しているように、この用語は、成熟レセプタータンパク質、多形性又は対立遺伝子変異体、及び哺乳動物のＣＣＲ２の他のイソタイプ（例えば、異なったスプライシング又は他の細胞性のプロセシングによって産生される）、ならびに上記の改変されたか又は改変されていない形態（例えば、グリコシル化、非グリコシル化）を含む。哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質は、単離さたタンパク質及び／又は組換えタンパク質（合成によって産生されたタンパク質を含む）であり得る。天然に存在するか又は内因性の哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質として、成熟ＣＣＲ２のような野生型のタンパク質、多形性又は対立遺伝子変異体、及び哺乳動物（例えば、ヒト、ヒト以外の霊長類）中に天然に存在する他のイソタイプ（例えば、タンパク質のカルボキシ末端の異なったスプライシングによって産生される、レセプタータンパク質のＣＣＲ２ａ及びＣＣＲ２ｂの形態）が挙げられる。このようなタンパク質は、例えば、哺乳動物のＣＣＲ２を天然に産生する供給源から回収、又は単離され得る。天然に存在するか又は内因性の対応する哺乳動物のＣＣＲ２と同じアミノ酸配列を有するこれらのタンパク質及び哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質は、対応する哺乳動物の名称によって言及される。例えば、対応する哺乳動物がヒトである場合は、タンパク質は、ヒトのＣＣＲ２タンパク質と命名される（例えば、組換えのヒトのＣＣＲ２が適切な宿主細胞中で産生される）。
【００３８】
哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質の「機能的な変異体」として、機能的なフラグメント、機能的な変異体タンパク質、及び／又は機能的な融合タンパク質（例えば、変異誘発及び／又は組換え技術により産生される）が挙げられる。一般的には、哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質のフラグメント又は部分は、成熟哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質と比較して、アミノ酸（すなわち、１つ以上のアミノ酸）の欠失（すなわち、１つ以上の欠失）（例えば、Ｎ−末端、Ｃ−末端、又は内部欠失）を有するものを含む。成熟哺乳動物ＣＣＲ２タンパク質と比較して、連続するアミノ酸のみが欠失されているか、又は連続しないアミノ酸が欠失されているフラグメント又は部分もまた、想定される。
【００３９】
一般的には、哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質の変異体は、１つ以上の連続するか、又は連続しないアミノ酸残基の付加、欠失、及び／又は置換によって異なる、哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質の天然の又は人工的な変異体（例えば、レセプターキメラ）を含む。このような変異は、例えば、保存されている領域内であり得るか、又は保存されていない領域内であり得るか（他のＣＸＣ及び／又はＣＣケモカインレセプタ−と比較して）、細胞外、細胞質、又は膜貫通領域であり得る。
【００４０】
一般的には、融合タンパク質は、天然に見出されるような哺乳動物ＣＣＲ２中には存在しない第２の部分に対してペプチド結合（ｃｏｎｄ）を介して連結された、第１の部分としての哺乳動物のＣＣＲ２（例えば、ヒトのＣＣＲ２）を含むポリペプチドを含む。従って、第２の部分は、アミノ酸、オリゴペプチド、又はポリペプチドであり得る。第１の部分は、融合タンパク質に対して、Ｎ−末端位置、Ｃ−末端位置、又は内部であり得る。１つの実施態様においては、融合タンパク質は、第１の部分としての親和性リガンド（例えば、酵素、抗原、エピトープタグ）、ならびに、リンカー配列及びヒトのＣＣＲ２又はその部分を含む第２の部分を含む。
【００４１】
哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質の、「機能的なフラグメント又はその部分」、「機能的な変異体」、及び／又は「機能的な融合タンパク質」は、本明細書中に記載されている哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質に特有の少なくとも１つの機能（例えば、結合活性、シグナル伝達活性、及び／又は細胞性の応答を刺激する能力）を有する、単離された及び／又は組換えのタンパク質又はポリペプチドをいう。好ましい機能的な変異体は、リガンド（すなわち、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、及び／又はＭＣＰ−４などの１つ以上のリガンド）に結合し得、そして本明細書中では「リガンド結合性変異体」と呼ばれる。
【００４２】
１つの実施態様においては、哺乳動物のＣＣＲ２の機能的な変異体は、上記の哺乳動物のＣＣＲ２と、少なくとも約８５％の配列同一性を、好ましくは、少なくとも約９０％の配列同一性を、そしてより好ましくは、上記の哺乳動物のＣＣＲ２と少なくとも約９５％の配列同一性を、共有する。ヒトのＣＣＲ２ａ及びＣＣＲ２ｂの核酸及びアミノ酸配列は、米国特許第５，７０７，８１５号に記載されている。配列同一性は、Ｂｌａｓｔｘプログラム（バージョン１．４）のような適切なプログラムを使用して、適切なパラメーター（例えば、デフォルトパラメーター）を使用して決定され得る。１つの実施態様においては、Ｂｌａｓｔｘ検索のためのパラメーターは、マトリックスＢＬＯＳＵＭ６２、Ｗ＝３をスコアする。別の実施態様においては、機能的な変異体は、天然に存在する核酸分子とは異なるが、遺伝子コードの縮重に起因して、哺乳動物のＣＣＲ２又はその部分をコードする核酸配列を含む。
【００４３】
単離された及び／又は組換えの哺乳動物のＣＣＲ２又はその機能的な変異体を含有する組成物は、結合のために適切な条件下で維持され得、哺乳動物のＣＣＲ２又は変異体は、試験される抗体又はフラグメントと接触させられ、そして結合が、直接又は間接的に検出又は測定される。１つの実施態様においては、ＣＣＲ２を天然に発現する細胞、又は哺乳動物のＣＣＲ２若しくはその変異体をコードする組換え核酸配列を含む細胞が、使用される。細胞は、レセプターの発現に適切な条件下で維持される。細胞は、結合に適切な条件下（例えば、適切な結合緩衝液中）で抗体又はフラグメントと接触させられ、そして結合が、標準的な技術によって検出される。結合を決定するためには、結合の程度が、適切な対照と比較して（例えば、抗体の非存在下で決定されたバックグラウンドと比較して、二次抗体（すなわち、標準）の結合と比較して、トランスフェクトされていない細胞に対する抗体の結合と比較して）決定され得る。レセプター又はレセプターを含有するリポソームを含む細胞性の画分（例えば、膜画分）が、全細胞の代わりに使用され得る。
【００４４】
１つの実施態様においては、抗体は、適切な標識（例えば、蛍光標識、放射性同位元素標識、抗原又はエピトープ標識、酵素標識）を用いて標識され、そして結合は、標識の検出によって決定される。別の実施態様においては、結合した抗体は、標識された二次抗体によって検出され得る。結合の特異性は、例えば、標識していない抗体又は競合因子としてのリガンドを使用して、競合又は置き換えによって評価され得る。
【００４５】
結合阻害アッセイもまた、ＣＣＲ２に結合し、そしてＣＣＲ２又はその機能的な変異体に対するリガンド（例えば、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、及び／又はＭＣＰ−４）のような別の化合物の結合を阻害する、抗体又はそのフラグメントを同定するために使用され得る。例えば、結合アッセイが行われ得る。ここでは、抗体の非存在下でのリガンドの結合と比較した場合の、ＣＣＲ２のリガンドの結合（抗体の存在下）における減少が検出されるか又は測定される。単離された及び／又は組換えの哺乳動物ＣＣＲ２又はその機能的な変異体を含有する組成物は、リガンド及び抗体と、同時に、又はいずれかの順で順番に、接触させられ得る。抗体の存在下でのリガンドの結合の程度における減少は、抗体による結合の阻害の指標である。例えば、リガンドの結合は、減少又は回避され得る。
【００４６】
１つの実施態様においては、抗体又はフラグメントによる、哺乳動物のＣＣＲ２又はその変異体に対するリガンド（例えば、ＭＣＰ−１のようなケモカイン）の結合の直接的な阻害が、モニターされる。例えば、哺乳動物のＣＣＲ２に対する、¹²⁵ Ｉで標識されたＭＣＰ−１、¹²⁵ Ｉで標識されたＭＣＰ−２、¹²⁵ Ｉで標識されたＭＣＰ−３、又は¹²⁵ Ｉで標識されたＭＣＰ−４の結合を阻害する抗体の能力が、モニターされ得る。このようなアッセイは、例えば、単離された全血球（例えば、Ｔ細胞、ＰＢＭＣ）のようなＣＣＲ２又はその機能的な変異体を保有している適切な細胞、あるいはＣＣＲ２を天然に発現する適切な細胞株、あるいは哺乳動物のＣＣＲ２をコードする核酸を含有している細胞株、あるいは上記の細胞に由来する膜画分を使用して行われ得る。
【００４７】
他の適切な結合アッセイ、又はレセプター結合によって誘発される事象（シグナル伝達機能、及び／又は細胞性の応答の刺激（例えば、白血球の輸送）を含む）をモニターする方法のような、ＣＣＲ２に結合する抗体の存在を同定する他の方法が、利用可能である。
【００４８】
本発明の抗体の阻害性の影響が、結合阻害アッセイにおいて評価され得ることが、理解される。レセプターの結合についての抗体間での競合もまた、これらの方法において評価され得る。このようにして同定される抗体はさらに、続いて結合するかどうか、それらがＣＣＲ２の他の機能を阻害するように作用するかどうかを決定するため、及び／又はそれらの治療的な有用性を評価するために、評価され得る。
【００４９】
シグナル伝達アッセイ
ＣＣＲ２に対するリガンド又はプロモーター（例えば、アゴニスト）の結合は、このＧタンパク質結合レセプターによるシグナル伝達を生じ得、そしてＧタンパク質及び他の細胞内シグナル伝達分子の活性化が刺激される。化合物（例えば、抗体又はそのフラグメント）によるシグナル伝達機能の誘導は、任意の適切な方法を使用してモニターされ得る。このようなアッセイは、ＣＣＲ２の抗体アゴニストを同定するために使用され得る。抗体又はその機能的なフラグメントの阻害活性は、アッセイにおいてリガンド又はプロモーターを使用して、そしてリガンド又はプロモーターによって誘導される活性を阻害する抗体の能力を評価することによって決定され得る。
【００５０】
Ｇタンパク質の活性（例えば、ＧＴＰからＧＤＰへの加水分解、又はその後のレセプターの結合によって誘発されるシグナル伝達事象（例えば、細胞内（細胞質ゾル）の遊離のカルシウム［Ｃａ²⁺］ｉの濃度における迅速でありそして一時的な増大の誘導）は、当該分野で公知の方法又は他の適切な方法によってアッセイされ得る（例えば、Ｎｅｏｔｅ，Ｋ．ら、Ｃｅｌｌ、７２：４１５−４２５、１９９３）；Ｖａｎ Ｒｉｐｅｒら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７７：８５１−８５６（１９９３）；Ｄａｈｉｎｄｅｎ，Ｃ．Ａ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７９：７５１−７５６（１９９４）を参照のこと）。
【００５１】
例えば、ハイブリッドＧタンパク質結合レセプターを使用する、Ｓｌｅｄｚｉｅｗｓｋｉらの機能的アッセイは、レセプターに結合し、そしてＧタンパク質を活性化する、リガンド又はプロモーターの能力をモニターするために使用され得る（Ｓｌｅｄｚｉｅｗｓｋｉら、米国特許第５，２８４，７４６号、その教示は本明細書中で参考として援用されている）。
【００５２】
かかるアッセイは、評価される抗体又はそのフラグメントの存在下で行われ得る。そしてリガンド又はプロモーターによって誘導される、活性を阻害する抗体又はフラグメントの能力は、公知の方法及び／又は本明細書中に記載される方法を使用して決定される。
【００５３】
化学走化性及び細胞性の刺激のアッセイ
化学走化性アッセイもまた、哺乳動物のＣＣＲ２又はその機能的な変異体に対するリガンドの結合をブロックし、及び／又はレセプターに対するリガンドの結合に関連する機能を阻害する抗体又はその機能的なフラグメントの能力を評価するために使用され得る。これらのアッセイは、化合物によって誘導されるインビトロ又はインビボでの細胞の機能的な移動に基づく。化学走化性は、例えば、９６−ウェル化学走化プレートを利用するアッセイで、又は化学走化性を評価するための他の当該分野で認識されている方法を使用して、実施例において記載されているように評価され得る。例えば、インビトロでの内皮を通過する（ｔｒａｎｓｅｎｄｏｔｈｅｌｉａｌ）化学走化性アッセイの使用が、Ｓｐｒｉｎｇｅｒらによって記載されている（Ｓｐｒｉｎｇｅｒら、１９９４年９月１５日に公開された、第ＷＯ９４／２０１４２号、その教示は、本明細書中で参考として援用されている；Ｂｅｒｍａｎら、Ｉｍｍｕｎｏｌ．Ｉｎｖｅｓｔ．１７：６２５−６７７（１９８８）をもまた参照のこと）。コラーゲンゲル中への内皮を通過する移動もまた、記載されている（Ｋａｖａｎａｕｇｈら、Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．、１４６：４１４９−４１５６（１９９１））。例えば、マウスのＬ１−２プレ−Ｂ細胞又は化学走化し得る他の適切な宿主細胞の安定なトランスフェクタントが、化学走化性アッセイにおいて使用され得る。
【００５４】
一般的には、化学走化性アッセイは、化合物の増大したレベルに対する、バリアの第１の表面から反対側の第２の表面への、バリア（例えば、内皮、フィルター）中へ又はそれを通じる適切な細胞（例えば、白血球（例えば、リンパ球、好酸球、好塩基球））の直接的な運動又は移動をモニターする。膜又はフィルターは、便利なバリアを提供する。その結果、化合物の増大したレベルに対する、フィルターの第１の表面からフィルターの反対側の第２の表面に対する、フィルター中へ又はそれを通じる適切な細胞の直接的な運動又は移動がモニターされる。いくつかのアッセイにおいては、膜は、接着を容易にするために物質（例えば、ＩＣＡＭ−１、フィブロネクチン、又はコラーゲン）でコーティングされる。このようなアッセイは、白血球の「帰巣」のインビトロでの概算を提供する。
【００５５】
例えば、当業者は、微小孔の膜中へ又はそれを通じる第１のチャンバーからの、試験される抗体を含みそして膜によって第１のチャンバーとは分けられている第２のチャンバーへの、適切な容器（包含する手段）中の細胞の移動の阻害を検出又は測定し得る。化合物に応答する特異的な移動をモニターするための適切な孔のサイズを有する適切な膜（例えば、ニトロセルロース、ポリカーボネート）が、選択される。例えば、孔のサイズ約３〜８マイクロン、及び好ましくは約５〜８マイクロンが使用され得る。孔のサイズは、フィルター上で均一であり得、そして適切な孔のサイズの範囲内であり得る。
【００５６】
移動及び移動の阻害を評価するために、フィルター中への移動の距離、フィルターの第２の表面に対して接着したままであるフィルターを通過しつつある細胞の数、及び／又は第２のチャンバー中に蓄積している細胞の数が、標準的な技術（例えば、顕微鏡）を使用して決定され得る。１つの実施態様においては、細胞は、検出可能な標識（例えば、放射性同位元素、蛍光標識、抗原、又はエピトープ標識）を用いて標識され、そして移動は、適切な方法（例えば、放射活性、蛍光、イムノアッセイを検出することによる）を使用して、膜の標識接着物の存在及び／又は第２のチャンバー中の存在を決定することによって、抗体又はフラグメントの存在及び非存在下で評価され得る。抗体アゴニストによって誘導される移動の程度は、適切な対照と比較して〔例えば、抗体の非存在下で決定されたバックグラウンドの移動と比較して、第２の化合物（すなわち、標準）によって誘導される移動の程度と比較して、抗体によって誘導されるトランスフェクトされていない細胞の移動と比較して〕決定され得る。
【００５７】
１つの実施態様においては、特に、Ｔ細胞、単球、又は哺乳動物のＣＣＲ２を発現する細胞については、内皮を通過する移動がモニターされ得る。この実施態様においては、内皮細胞層を通じる移動が評価される。細胞の層を調製するために、内皮細胞は、微小孔のフィルター又は膜上で培養され得、必要に応じて、内皮細胞の接着を容易にするために、コラーゲン、フィブロネクチン、又は他の細胞外マトリックスタンパク質のような物質を用いてコーティングされ得る。好ましくは、内皮細胞は、均質な単層が形成されるまで培養される。例えば、静脈、動脈、微小血管の内皮（例えば、ヒトの臍帯静脈の内皮細胞（Ｃｌｏｎｅｔｉｃｓ Ｃｏｒｐ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ））を含む、種々の哺乳動物の内皮細胞が、単層の形成のために利用可能であり得る。特定の哺乳動物のレセプターに対して応答する化学走化性をアッセイするためには、同じ哺乳動物の内皮細胞が好ましい；しかし、異種の哺乳動物種又は属に由来する内皮細胞もまた、使用され得る。
【００５８】
一般的には、アッセイは、化合物の増大したレベルに対する、フィルターの第１の表面からフィルターの反対側の第２の表面に対する膜又はフィルター中へ又はそれを通過する細胞の方向性の移動を検出することによって行われる。ここでは、フィルターは、第１の表面上の内皮細胞の層を含む。方向性の移動は、第１の表面に対して隣接する領域から、膜の内部又はそれを通じて、フィルターの反対側上に配置された化合物に対して生じる。第２の表面に隣接する領域中に存在する化合物の濃度は、第１の表面に隣接する領域中の濃度よりも大きい。
【００５９】
抗体インヒビターについて試験するために使用される１つの実施態様においては、移動し得る細胞を含み、そして哺乳動物のＣＣＲ２レセプターを発現する組成物が、第１のチャンバー内に配置され得る。第１のチャンバー中の細胞の化学走化性を誘導し得る１つ以上のリガンド又はプロモーターを含有する組成物（化学接着機能を有する）は、第２のチャンバー内に配置される。好ましくは、細胞のすぐ前に、第１のチャンバー中に配置されるか、又は細胞と同時に配置され、試験される抗体を含有する組成物は、好ましくは、第１のチャンバー中に配置される。このアッセイにおいては、レセプターに結合しそして哺乳動物のＣＣＲ２を発現する細胞の、リガンド又はプロモーターによる化学走化性の誘導を阻害し得る抗体又はその機能的なフラグメントは、レセプター機能のインヒビター（例えば、刺激機能のインヒビター）である。抗体又はフラグメントの存在下でのリガンド又はプロモーターによって誘導される移動の程度における減少は、阻害活性の指標である。別の結合研究（上記を参照のこと）は、阻害が、レセプターに対する抗体の結合の結果であるか、又は異なる機構を介して生じるかどうかを決定するために行われ得る。
【００６０】
組織中の化合物（例えば、ケモカイン又は抗体）の注射に応答する、組織の白血球の浸潤をモニターするインビボでのアッセイが、以下に記載される（炎症のモデルを参照のこと）。インビボでの帰巣のこれらのモデルは、この移動をブロックする抗体又はそのフラグメントの能力を評価するために、炎症の部位に対する移動及び化学走化性による、リガンド又はプロモーターに応答する細胞の能力を測定する。
【００６１】
記載されている方法に加えて、ＣＣＲ２の刺激機能に対する抗体又はフラグメントの影響が、レセプターを含有する適切な宿主細胞を使用して、活性なレセプターによって誘導される細胞性の応答をモニターすることによって評価され得る。
【００６２】
さらなる哺乳動物のＣＣＲ２機能のリガンド、インヒビター及び／又はプロモーターの同定
本発明の抗体及びフラグメントの結合及び機能を評価するために使用され得る上記のアッセイは、哺乳動物のＣＣＲ２又はその機能的なフラグメントに結合するさらなるリガンド又は他の物質、ならびに哺乳動物のＣＣＲ２の機能のインヒビター及び／又はプロモーターを同定するために適合させられ得る。例えば、本発明の抗体又はその機能的な部分のものと同じであるか又は類似の結合特異性を有する試薬が、上記の抗体又はその一部を用いる競合アッセイによって同定され得る。従って、本発明はまた、哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質に結合するレセプターのリガンド又は他の物質、ならびにレセプター機能のインヒビター（例えば、アンタゴニスト）又はプロモーター（例えば、アゴニスト）を同定する方法を含む。１つの実施態様においては、哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質又はその機能的な変異体を保有している細胞（例えば、白血球、上記の細胞中に導入された核酸によってコードされる哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質又は機能的な変異体を発現するように操作されている細胞株又は適切な宿主細胞）が、レセプター機能のインヒビター又はプロモーターを含むリガンド又はレセプターに結合する他の物質の同定及びそれらの効率を評価するためのアッセイにおいて使用される。このような細胞はまた、発現されたレセプタータンパク質又はポリペプチドの機能を評価することにおいても有用である。
【００６３】
本発明に従うと、リガンド又はレセプターに結合する他の物質、レセプター機能のインヒビター及びプロモーターは、適切なアッセイにおいて同定され得、そしてさらに治療的な効果について評価され得る。レセプター機能のインヒビターは、レセプター活性を阻害する（低減させるか又は妨げる）ために使用され得、そしてリガンド及び／又はプロモーターは、示されているような正常なレセプター機能を誘導する（誘発するか又は増強する）ために使用され得る。従って、本発明は、自己免疫疾患及び移植拒絶を含む炎症性の疾患を治療する方法を提供する。この方法は、個体（例えば、哺乳動物）に対してレセプター機能のインヒビターを投与する工程を包含する。本発明はさらに、個体に対してレセプター機能の新規のリガンド又はプロモーターを投与することによってレセプター機能を刺激する方法を提供し、これによって、例えば、感染性の疾患及びガンの治療において有用である、白血球の機能を選択的に刺激するための新規のアプローチを提供する。
【００６４】
本明細書中で使用される場合は、哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質の「リガンド」は、哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質に結合する物質の特定のクラスをいう。これは、天然のリガンド、ならびに天然のリガンドの合成の及び／又は組換えの形態を含む。哺乳動物のＣＣＲ２−ポジティブである細胞に対する指向性を有する感染性の試薬（例えば、ＨＩＶのようなウイルス）もまた、哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質に結合し得る。選択された哺乳動物のレセプターの天然のリガンドは、哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質（例えば、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２．ＭＣＰ−３及び／又はＭＣＰ−４のようなケモカイン）のものと同じである哺乳動物起源である。好ましい実施態様においては、哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質のリガンド結合は、高い親和性を伴って生じる。
【００６５】
本明細書中で使用される場合は、「インヒビター」は、哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質（例えば、ヒトのＣＣＲ２）の少なくとも１つの機能的特徴、例えば、結合活性（例えば、リガンド結合、プロモーター結合、抗体結合）、シグナル伝達活性（例えば、哺乳動物のＧタンパク質の活性化、細胞質ゾルの遊離のカルシウム［Ｃａ²⁺］ｉの濃度における迅速でありそして一時的な増加の誘導）、及び／又は細胞性応答機能（例えば、化学走化性の刺激、エキソサイトーシス又は白血球による炎症性媒介因子の放出）を阻害する（低減する又は妨げる）物質である。インヒビターはまた、細胞へのＨＩＶの侵入を阻害する物質でもある。用語インヒビターは、レセプターに結合するアンタゴニスト（例えば、抗体、天然のリガンドの変異体、低分子量の有機分子、リガンドの結合の他の競合的なインヒビター）を含む物質、及びそれに対して結合することなくレセプター機能を阻害する物質（例えば、抗−イディオタイプ抗体）をいう。
【００６６】
本明細書中で使用される場合は、「プロモーター」は、哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質（例えば、ヒトのＣＣＲ２）の少なくとも１つの機能的な特徴、例えば、結合活性（例えば、リガンド、インヒビター及び／又はプロモーターの結合）、シグナル伝達活性（例えば、哺乳動物のＧタンパク質の活性化、細胞質ゾルの遊離のカルシウム［Ｃａ²⁺］ｉの濃度における迅速でありそして一時的な増加の誘導）、及び／又は細胞性応答機能（例えば、化学走化性の刺激、エキソサイトーシス又は白血球による炎症性媒介因子の放出）を促進する（誘導する、引き起こす、高める又は増大する）物質である。用語プロモーターは、レセプターに結合するアゴニスト（例えば、抗体、別の種に由来する天然のリガンドのホモログ）を含む物質、及びそれに対して結合することなくレセプター機能を促進する（例えば、関連するタンパク質を活性化することによって）物質をいう。好ましい実施態様においては、アゴニストは、天然のリガンドのホモログ以外である。
【００６７】
従って、本発明はまた、哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２又はそのリガンド結合変異体（リガンド、インヒビター、プロモーター、及び哺乳動物のＣＣＲ２レセプター若しくは機能的な変異体に結合する他の物質を含む）に結合する試薬を検出又は同定する方法に関する。この方法に従うと、試験される試薬、本発明の抗体又は抗原結合フラグメント（例えば、８Ｇ２、１Ｄ９、８Ｇ２又は１Ｄ９ものと同じであるか又は類似であるエピトープ特異性を有する抗体、及びそれらの抗原結合フラグメント）、及び哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２又はそのリガンド結合変異体を含有する組成物が、混合され得る。上記の成分は、哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２又はそのリガンド結合変異体に対する抗体又は抗原結合フラグメントの結合に適切な条件下で混合され、そして哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２又はリガンド結合変異体に対する抗体又はフラグメントの結合は、本明細書中に記載されている方法又は他の適切な方法に従って、直接又は間接的にのいずれかで、検出されるか又は測定される。適切な対照（例えば、試験される試薬の非存在下）と比較して、形成された複合体の量における減少は、試薬が上記のレセプター又は変異体に結合することの指標である。哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２又はそのリガンド結合変異体を含有する組成物は、組換えのケモカインレセプター２タンパク質又はそのリガンド結合変異体を保有している細胞の膜画分であり得る。抗体又はそのフラグメントは、放射性同位元素、スピン標識、抗原、又はエピトープ標識、酵素標識、蛍光基、及び化学発光基のような標識で標識され得る。
【００６８】
１つの実施態様においては、本発明は、哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２又はそのリガンド結合変異体に結合する試薬を検出又は同定する方法に関する。この方法は、試験される試薬、本発明の抗体又は抗原結合フラグメント（例えば、１Ｄ９、８Ｇ２、１Ｄ９若しくは８Ｇ２のものと同じであるか若しくは類似であるエピトープ特異性を有する抗体、又はそれらの抗原結合フラグメント）、及び哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２又はそのリガンド結合変異体を保有している細胞を混合する工程を包含する。上記の成分は、ＣＣＲ２タンパク質又はそのリガンド結合変異体に対する抗体又は抗原結合フラグメントの結合のために適切な条件下で混合され、そして哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２又は変異体に対する抗体又はフラグメントの結合は、本明細書中に記載されている方法及び／又は他の適切な方法によって、直接又は間接的のいずれかで、検出されるか又は測定される。適切なコントロールと比較した、形成された複合体の量における減少は、試薬がレセプター又は変異体に結合することの指標である。抗体又はそのフラグメントは、放射性同位元素、スピン標識、抗原又はエピトープ標識、酵素標識、蛍光基、及び化学発光基からなる群より選択される標識で標識され得る。これら及び類似のアッセイは、リガンド（例えば、ケモカイン、又はＣＣＲ２と相互作用するＨＩＶの株）又は他の物質（ＣＣＲ２に結合し得、そしてレセプターに対する結合について本明細書中に記載されている抗体と競合し得る、レセプター機能のインヒビター、又はプロモーターを含む）を含む試薬を検出するために使用され得る。
【００６９】
上記に記載されているアッセイは、単独で、あるいは互いに、又は他の適切な方法と組み合わせて、リガンド又は哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質に結合する他の物質、及び哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質若しくは変異体のインヒビター又はプロモーターを同定するために使用され得る。本発明のインビトロでの方法は、多数のサンプルが処理される高スループットスクリーニング（例えば、９６−ウェル形式）について適合させられ得る。哺乳動物のＣＣＲ２（例えば、ヒトのＣＣＲ２）を高スループットスクリーニングに適切なレベルで発現する細胞が使用され得、そして従って、リガンド又はレセプターに結合する他の物質、及び哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質のインヒビター又はプロモーターの同定及び／又は単離において特に有用である。レセプターの発現は、種々の方法においてモニターされ得る。例えば、発現は、レセプター又はその一部に結合する本発明の抗体を使用してモニターされ得る。また、市販によって入手可能な抗体が、レセプタータンパク質又はポリペプチド（例えば、ＦＬＡＧタグ化レセプター）を含有する抗原−又はエピトープ−タグ化融合タンパク質の発現を検出するために使用され得、そして所望のレベルを発現する細胞が選択され得る。
【００７０】
哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質又はその機能的な変異体をコードする核酸は、レセプタータンパク質又はポリペプチドを産生するように、発現システム中に取りこまれ得る。単離された及び／又は組換えの哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質又は変異体（例えば、哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質又は変異体をコードする組換え核酸を含む構築物を用いて安定に又は一時的にトランスフェクトされた細胞中で、あるいはレセプターを含有している細胞の画分中で（例えば、トランスフェクトされた細胞に由来する膜画分、レセプターを取りこんでいるリポソーム）発現されるレセプター）が、レセプター機能についての試験において使用され得る。レセプターは、所望される場合は、さらに精製され得る。レセプター機能の試験は、インビトロ又はインビボで行われ得る。
【００７１】
単離された及び／又は組換えの哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質又はその機能的な変異体（例えば、ヒトのＣＣＲ２）が、本発明の方法において使用され得る。ここでは、化合物の影響は、本明細書中に記載されているようにレセプター機能をモニターすることによって、又は他の適切な技術を使用して評価される。例えば、安定な又は一時的なトランスフェクタント（例えば、バキュロウイルスに感染したＳｆ９細胞、マウスのＬ１／２プレ−Ｂ細胞の安定なトランスフェクタント）が、結合アッセイにおいて使用され得る。例えば、Ｊｕｒｋａｔ細胞の安定なトランスフェクタント又は化学走化し得る他の適切な細胞の安定なトランスフェクタント（例えば、マウスのＬ１／２プレ−Ｂ細胞）が、化学走化性アッセイにおいて使用され得る。
【００７２】
本発明の方法に従うと、化合物は、個々にスクリーニングされ得るか、又は１以上の化合物は、本明細書中の方法に従って同時に試験され得る。化合物の混合物が試験される場合は、記載されている処理によって選択された化合物は、分離され得（適切である場合は）、そして適切な方法（例えば、ＰＣＲ、配列決定、クロマトグラフィー、質量スペクトル分析）によって同定され得る。試験サンプル中の１つ以上の化合物（例えば、リガンド、インヒビター、プロモーター）の存在もまた、これらの方法に従って決定され得る。
【００７３】
組み合わせ化学合成又は他の方法によって産生された化合物（例えば、有機化合物、組換え又は合成のペプチド、「ペプトイド」、核酸）の大きな組合せライブラリーが、試験され得る（例えば、Ｚｕｃｋｅｒｍａｎ，Ｒ．Ｎ．ら、Ｊ．Ｍｅｄ．Ｃｈｅｍ．、３７：２６７８−２６８５（１９９４）、及びその中で引用されている参考文献を参照のこと；タグ化化合物に関しては、Ｏｈｌｍｙｅｒ，Ｍ．Ｈ．Ｊ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：１０９２２−１０９２６（１９９３）及びＤｅＷｉｔｔ，Ｓ．Ｈ．ら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９０：６９０９−６９１３（１９９３）をもまた参照のこと；Ｒｕｔｔｅｒ，Ｗ．Ｊ．ら、米国特許第５，０１０，１７５号；Ｈｕｅｂｎｅｒ，Ｖ．Ｄ．ら、米国特許第５，１８２，３６６号；及びＧｅｙｓｅｎ，Ｈ．Ｍ．、米国特許第４，８３３，０９２号）。本発明の方法による組み合わせライラリーから選択された化合物が特有のタグを保有する場合は、クロマトグラフィーの方法による個々の化合物の同定が可能である。
【００７４】
１つの実施態様においては、ファージディスプレイ方法が使用される。例えば、哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質又は機能的な変異体、本発明の抗体又はその機能的な部分、及びポリペプチドを提示するファージ（例えば、ファージ又はライブラリーのようなファージのコレクション）が、哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質又は変異体に対する抗体又はその一部の結合について適切な条件下（例えば、適切な結合緩衝液中）で混合され得る。抗体又はその一部と競合し得、そして哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質又は変異体に結合し得るファージは、標準的な技術又は他の適切な方法を使用して、検出又は選択され得る。結合したファージは、適切な溶出緩衝液を使用してレセプターから分離され得る。例えば、イオン強度又はｐＨにおける変更は、ファージの放出を導き得る。あるいは、溶出緩衝液は、化合物（例えば、結合を競合的に阻害するリガンド、インヒビター、及び／又はプロモーターのような、レセプターに対する提示されたペプチドの結合を破壊し得る、１つ以上の化合物）の結合を破壊するように設計された放出成分（単数又は複数）を含み得る。必要に応じて、選択プロセスが繰り返され得るか、又は別の選択工程が、レセプターに結合するファージについてさらに富化するために使用され得る。提示されたポリペプチドは、特徴付けられ得る（例えば、ファージＤＮＡの配列決定によって）。同定されたポリペプチドは産生され得、そしてさらに、結合について、及びインヒビター又はプロモーター機能について試験される。増大した安定性又は他の所望される特性を有するこのようなペプチドのアナログが、産生され得る。
【００７５】
１つの実施態様においては、ランダムな配列の核酸によってコードされるＮ−末端のペプチドを有するコートタンパク質を含む融合タンパク質を発現しそして提示するファージが、産生され得る。哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質又は変異体、及び抗−ＣＣＲ２抗体又はその機能的なフラグメントを発現する適切な宿主細胞はファージと混合され得、結合したファージが選択され、回収され、そして特徴付けられる。（例えば、Ｇタンパク質結合レセプターとともに使用されるファージディスプレイ手順を議論している、Ｄｏｏｒｂａｒ，Ｊ．及びＧ．Ｗｉｎｔｅｒ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，２４４：３６１（１９９４）を参照のこと）。
【００７６】
可能性のあるリガンド又はそれに結合する他の物質、あるいは哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質のインヒビター及び／又はプロモーターの他の供給源として、ＣＣＲ２リガンドの変異体（ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、及び／又はＭＣＰ−４の天然に存在する、合成の、又は組換えの変異体を含む）、他の化学接着因子又はケモカインのような物質、それらの変異体、低分子量の有機分子、他のインヒビター及び／又はプロモーター（例えば、抗−ＣＣＲ２抗体、アンタゴニスト、アゴニスト）、他のＧタンパク質結合レセプターリガンド、インヒビター及び／又はプロモーター（例えば、アンタゴニスト又はアゴニスト）、及び哺乳動物のＣＣＲ２レセプターの可溶性の部分（例えば、可溶性のレセプターペプチド又はレセプター機能を阻害し得るアナログ（例えば、Ｍｕｒｐｈｙ，Ｒ．Ｂ．、第ＷＯ９４／０５６９５号を参照のこと））が挙げられるが、これらに限定されない。
【００７７】
炎症のモデル
治療薬としてのインビボでの本発明の抗体及びフラグメントの影響を評価するために使用され得るインビボの炎症のモデルが、利用可能である。例えば、適切な動物（例えば、ウサギ、マウス、ラット、モルモット、又はアカゲザル、マカク）中への、ケモカイン及び抗体又は哺乳動物のＣＣＲ２の反応性であるそのフラグメントの経皮注射の際の白血球の浸潤が、モニターされ得る（例えば、Ｖａｎ Ｄａｍｍｅ，Ｊ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．、１７６：５９−６５（１９９２）；Ｚａｃｈａｒｉａｅ，Ｃ．Ｏ．Ｃ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７１：２１７７−２１８２（１９９０）；Ｊｏｓｅ，Ｐ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｅｘｐ．Ｍｅｄ．１７９：８８１−８８７（１９９４）を参照のこと）。１つの実施態様においては、皮膚の生検が、白血球（例えば、好酸球、顆粒球）の浸潤について組織学的に評価される。別の実施態様においては、化学走化及び血管外遊出し得る標識された細胞（例えば、例えば¹¹¹ Ｉｎで標識された、哺乳動物のＣＣＲ２を発現する安定にトランスフェクトされた細胞）が、動物に投与される。例えば、評価される抗体又はフラグメントは、リガンド又はアゴニストが試験動物に対して投与される前に、それと同時に、あるいはその後にのいずれかで投与され得る。インヒビターの非存在下での浸潤の程度と比較した場合の、抗体の存在下での浸潤の程度の低下は、阻害の指標である。
【００７８】
診断適用及び治療適用
本発明の抗体及びフラグメントは、研究、診断、及び治療適用を含む種々の適用において有用である。１つの実施態様においては、抗体は、適切な標識（例えば、蛍光標識、化学発光標識、放射性同位元素標識、抗原、又はエピトープ標識、又は酵素標識）を用いて標識される。例えば、これらは、レセプター又はその一部を単離及び／又は精製するために、そしてレセプターの構造（例えば、立体構造）及び機能を研究するために使用され得る。
【００７９】
さらに、本発明の種々の抗体は、ＣＣＲ２を検出するため、又は例えばＴ細胞（例えば、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ４５ＲＯ＋細胞）、単球、及び／又はレセプター遺伝子でトランスフェクトされた細胞上でのレセプターの発現を測定するために使用され得る。従って、これらは、診断又は研究目的のための、細胞分離（例えばフローサイトメトリー、蛍光活性化細胞分離）のような適用における有用性をもまた有する。
【００８０】
本発明の抗−ＣＣＲ２抗体は、診断適用における価値を有する。抗−ＣＣＲ２抗体又はそのフラグメントは、ＨＩＶ感染した個体中でのこのレセプターの発現をモニターするために、抗−ＣＤ４が疾患の段階の診断の指標として使用されている方法と同様に、使用され得る。
【００８１】
代表的には、診断アッセイは、ＣＣＲ２に対する抗体又はそのフラグメントの結合によって生じる複合体の形成を検出することを必要とする。診断目的については、抗体又は抗原結合フラグメントは、標識され得るか又は標識され得ない。抗体又はフラグメントは、直接標識され得る。放射性核種、蛍光、酵素、酵素基質、酵素補因子、酵素インヒビター、及び酵素リガンド（例えば、ビオチン、ハプテン）を含むがこれらに限定されない種々の標識が、使用され得る。多数の適切なイムノアッセイが、当業者に公知である（例えば、米国特許第３，８１７，８２７号；同第３，８５０，７５２号；同第３，９０１，６５４号；及び同第４，０９８，８７６号を参照のこと）。標識されていない場合は、抗体又はフラグメントは、例えば、凝集アッセイにおける場合は、適切な手段を使用して検出され得る。標識されていない抗体又はフラグメントはまた、抗体を検出するために使用され得る別の（すなわち、１つ以上の）適切な試薬（例えば、一次抗体（例えば、標識されていないイムノグロブリンについて特異的である抗−イディオタイプ抗体又は他の抗体）又は他の適切な試薬（例えば、標識されたプロテインＡ）と反応性である標識された抗体（例えば、二次抗体））と組み合わせて使用され得る。
【００８２】
１つの実施態様においては、本発明の抗体又はフラグメントは、酵素イムノアッセイにおいて利用され得る。ここでは、被検抗体又はフラグメント、あるいは二次抗体は、酵素に対して結合させられる。哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質を含有している生物学的サンプルが被検抗体と混合される場合は、結合は、抗体とＣＣＲ２タンパク質との間で生じる。１つの実施態様においては、哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質を発現する細胞を含有しているサンプル（例えば、ヒトの血液）は、被検抗体と混合され、そして結合は、抗体と、抗体によって認識されるエピトープを含むヒトのＣＣＲ２タンパク質を保有している細胞との間で生じる。これらの結合した細胞は、結合していない試薬から分離され得、そして細胞に対して特異的に結合した抗体−酵素結合体の存在が、例えば、酵素によって作用された場合に、色素又は他の検出可能な変化を生じる酵素の基質とサンプルとを接触させることによって、決定され得る。別の実施態様においては、被検抗体は標識されなくてよく、被検抗体を認識する標識された二次抗体が、添加され得る。
【００８３】
生物学的サンプル中の哺乳動物のＣＣＲ２タンパク質の存在を検出することにおける使用のためのキットもまた、調製され得る。このようなキットは、哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２又は上記のレセプターの一部に結合する抗体又はその機能的なフラグメント、ならびに抗体又はフラグメントとＣＣＲ２又はその一部との間での複合体の存在を検出するために適切な１つ以上の付属の試薬を含む。本発明の抗体組成物は、単独で、又は他のエピトープに特異的なさらなる抗体と組み合わせて、凍結乾燥させられた形態で提供され得る。抗体（これは、標識され得るか、又は標識され得ない）は、補助的な成分（例えば、緩衝液（例えば、トリス、リン酸塩、及び炭酸塩）、安定剤、賦形剤、殺生物剤及び／又は不活性なタンパク質（例えば、ウシ血清アルブミン）とともに、キット中に含まれ得る。例えば、抗体は、補助的な成分とともに凍結乾燥された混合物として提供され得るか、又は補助的な成分は、使用者による組み合わせのために別々に提供され得る。一般的には、これらの補助的な物質は、活性な抗体の量に基づいて約５重量％未満で存在し、そして通常は、抗体の濃度に基づいて少なくとも約０．００１重量％の全量で存在する。モノクローナル抗体に結合し得る二次抗体が使用される場合は、かかる抗体は、例えば、別々のバイアル又は容器中で、キット中に提供され得る。二次抗体は、存在する場合は、代表的には標識され、そして上記の抗体処方物と類似の様式で処方され得る。
【００８４】
同様に、本発明はまた、細胞による、哺乳動物のＣＣＲ２又はレセプターの一部の発現の検出及び／又は定量の方法にも関する。ここでは、細胞又はその画分（例えば、膜画分）を含む組成物は、哺乳動物のＣＣＲ２又はレセプターの一部に対して抗体又はそのフラグメントの結合について適切な条件下で結合する抗体又はその機能的なフラグメント（例えば、１Ｄ９及び／又は８Ｇ２）と接触させられ、そして結合がモニターされる。抗体の検出は、抗体とＣＣＲ２又はその一部との間での複合体の形成の指標であり、これは、レセプターの存在を示す。細胞に対する抗体の結合は、例えば、「結合アッセイ」と表題された、上記のように決定され得る。この方法は、個体による細胞上でのＣＣＲ２の発現を検出するために使用され得る（例えば、体液（例えば、血液、唾液、又は他の適切なサンプル）のようなサンプル中で）。Ｔ細胞又は単球の表面上でのＣＣＲ２の発現のレベルもまた、例えば、フローサイトメトリーによって決定され得、そして発現のレベル（例えば、染色強度）は、疾患のかかりやすさ、進行、又は危険性と相関し得る。
【００８５】
ケモカインレセプターは、体、特に炎症部位を通じる白血球の移動において機能する。血管からの炎症性の細胞の移動は、白血球及び内皮細胞接着タンパク質及び細胞特異的化学接着因子及び活性化因子の相互作用を含む、３工程のプロセスによって調節される（Ｓｐｒｉｎｇｅｒ，Ｔ．Ａ．、Ｃｅｌｌ、７６：３０１−３１４（１９９４）；Ｂｕｔｃｈｅｒ、Ｅ．Ｃ．、Ｃｅｌｌ、６７：１０３３−１０３６（１９９１）；Ｂｕｔｃｈｅｒ，Ｅ．Ｃ．及びＰｉｃｋｅｒ，Ｌ．Ｊ．、Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈ．ＤＣ）、２７２：６０−６６（１９９６））。（ａ）白血球のセレクチンと内皮細胞の炭水化物との間の低い親和性相互作用；（ｂ）白血球の化学接着因子レセプターと化学接着因子／活性化因子との間での高親和性の相互作用；及び（ｃ）白血球のインテグリンとイムノグロブリンスーパーファミリーの内皮細胞接着タンパク質との間での密接な結合が、存在する。異なる白血球のサブセットは、選択、化学接着因子レセプター、及びインテグリンの異なるレパートリーを発現する。さらに、炎症は、内皮の接着タンパク質の発現、及び化学接着因子の発現、及び白血球活性化因子の発現を変更する。結果として、血管外部位に対する白血球の漸増の選択性を調節するための多くの多様性が存在する。第２の工程は、白血球の化学接着因子レセプターの活性化がインテグリンによって媒介される密接な結合を導くセレクチンによって媒介される細胞による移動を生じると考えられる点で、決定的である。このことは、血管周囲の部位への白血球の容易な移動を生じる。化学接着因子／化学接着因子レセプターの相互作用はまた、組織内での内皮を経由する移動及び局在化についても決定的である（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｊ．Ｊ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ．、１３４：２５５−２６６（１９９６）；Ｃａｒｒ，Ｍ．Ｗ．ら、Ｉｍｍｕｎｉｔｙ、４：１７９−１８７（１９９６））。この移動は、化学接着因子の濃度勾配によって、炎症の中心に対して指向され得る。
【００８６】
ＣＣＲ２は、白血球の輸送において重要な役割を有する。ＣＣＲ２は、特定の炎症部位に対するＴ細胞又はＴ細胞のサブセット又は単球の移動についての鍵となるケモカインレセプターであるようである。それゆえこのような抗−ＣＣＲ２ ｍＡｂは、Ｔ細胞又は単球の移動を阻害する（低減させるか又は妨げる）ために使用され得る。特にこれは、自己免疫疾患、又はアレルギー反応のようなＴ細胞の不全に、あるいはアテローム性動脈硬化のような単球によって媒介される障害に関連する。従って、本発明の抗体又はそのフラグメントはまた、研究及び治療適用においてレセプターの機能を調節するためにも使用され得る。例えば、本明細書中に記載されている抗体及び機能的なフラグメントは、（ａ）レセプターへの（例えば、リガンド、インヒビター、又はプロモーターの）結合、（ｂ）レセプターのシグナル伝達機能、及び／又は（ｃ）刺激機能を阻害する（低減させるか又は妨げる）ためのインヒビターとして作用し得る。レセプター機能のインヒビターとして作用する抗体は、リガンド又はプロモーターの結合を、直接又は間接的にブロックし得る（例えば、立体構造的な変化を生じることによる）。例えば、抗体は、リガンドの結合を阻害することによって、又は脱感作によって（リガンドの結合の阻害を伴って、又はそれを伴わずに）レセプターの機能を阻害し得る。レセプターに結合する抗体はまた、レセプター機能のアゴニストとして作用し得、その結果、レセプター機能（例えば、レセプターへの結合の際の、レセプターのシグナル伝達及び／又は刺激機能（例えば、白血球輸送））を誘発又は刺激する。
【００８７】
従って、本発明は、哺乳動物（例えば、ヒトの患者）における白血球の輸送を阻害する方法を提供する。この方法は、本発明の抗体又は機能的なフラグメントの有効量を哺乳動物に投与する工程を包含する。本発明の抗体又はフラグメントの投与は、疾患状態の緩和又は排除を生じ得る。
【００８８】
本発明の抗体又はその機能的なフラグメントはまた、障害を治療するためにも使用される。ここでは、ケモカインの結合によるＣＣＲ２レセプターの活性化が関与している。例えば、抗体又はその機能的なフラグメント（例えば、１Ｄ９及び／若しくは８Ｇ２、又はそれらの機能的なフラグメント）が、アレルギー、アテローム形成、アナフィラキシー、悪性腫瘍、慢性及び急性の炎症、ヒスタミン及びＩｇＥによって媒介されるアレルギー反応、ショック、及び慢性関節リウマチ、アテローム性動脈硬化、多発性硬化症、移植拒絶、繊維性の疾患、喘息、ならびに糸球体腎炎を治療するために使用され得る。
【００８９】
ＣＣＲ２レセプター機能のインヒビター（抗体又はその適切なフラグメントを含む）を用いて治療され得るヒト又は他の種の疾患又は状態として、以下が挙げられるが、これらに限定されない：
・炎症又はアレルギー疾患及び状態。これは、呼吸性のアレルギー疾患（例えば、喘息、アレルギー性鼻炎、過敏性肺疾患（ＩＬＤ）（例えば、突発性肺繊維症、又はＩＬＤに関連する関節リウマチ、全身性紅班性狼瘡、強直性脊椎炎、全身性硬化症、シェーグレン症候群、多筋炎又は皮膚筋炎）、アナフィラキシ−又は超過敏性応答、薬剤アレルギー（例えば、ペニシリン、セファロスポリンに対する）、昆虫の刺毛アレルギー；炎症性の腸疾患（例えば、クローン病、及び腸潰瘍）；脊髄関節症；強皮症；乾癬及び炎症性の皮膚疾患（例えば、皮膚炎、湿疹、アトピー性皮膚炎、アレルギー性接触皮膚炎、じんま疹；脈管炎（例えば、壊死、皮膚、及び過敏性の脈管炎）を含む；
・自己免疫疾患、例えば、関節炎（例えば、関節リウマチ、乾癬性の関節炎）、多発性硬化症、全身性エリテマトーデス、重症筋無力症、若年性で発症する糖尿病、糸球体腎炎のような腎炎、自己免疫性甲状腺炎、ベーチェット病；
・同種移植片の拒絶又は移植片−対−宿主疾患、及び器官の移植に関連するアテローム性動脈硬化を含む、移植拒絶（例えば、移植における）
・アテローム性動脈硬化；
・皮膚又は器官の白血球の浸潤をともなうガン
・血管形成（特に、動脈（例えば、環状血管動脈）の狭窄又は再狭窄、例えば、血管の介入（例えば、外科手術による介入、治療的な介入、又は機械的な介入）ならびに新内膜（ｎｅｏｉｎｔｉｍａｌ）の過形成によって生じる狭窄又は再狭窄。例えば、代表的には、血管の内腔の開口の狭窄を生じる再狭窄は、以下を含むが、これらに限定されない血管の損傷によって生じ得る：血管の移植手順、血管形成術（バルーン、アテレクトミー、レーザー、又は他の適切な方法（例えば、経皮的な経内腔の環状血管の血管形成術（ＰＴＣＡ））、ステントの配置（例えば、機械的又は生物学的な脈管内皮ステントの配置）、血管のバイパス手順、又はそれらの組み合わせ、ならびに狭窄又は閉塞した血管を治療するために使用される他の手順を含む）によって生じるもの。
・他の疾患又は状態（ＣＣＲ２によって媒介される疾患又は状態を含む）（ここでは、所望されない炎症性の応答は、阻害されるべきである）は、再灌流障害、特定の血液学的な悪性腫瘍、サイトカインによって誘導される毒性（例えば、敗血症のショック、内毒性のショック）、多発性筋炎、皮膚筋炎、及び類肉腫症を含む肉芽腫性の疾患を含むが、これらに限定されないものが治療され得る。
【００９０】
ヒト又は他の種の疾患又は状態（これは、ＣＣＲ２レセプター機能のプロモーター（抗体又はそのフラグメントを含む）を用いて治療され得る）として, 以下が挙げられるが、これらに限定されない：
・免疫抑制、例えば、ＡＩＤＳのような免疫不全症候群を有する個体、放射線治療、化学療法、自己免疫疾患のための治療、又は他の薬物療法（例えば、副腎皮質ホルモン治療）（これは、免疫抑制を生じる）を受けているう個体、におけるもの；及びレセプター機能又は他の原因における先天的な不全による免疫抑制。
【００９１】
本発明の抗−ＣＣＲ２抗体は、１つ以上のケモカインの結合をブロックし得、それによって、上記の障害を導く１つ以上の事象の下流のカスケードをブロックする。
【００９２】
ＣＣＲ２のアンタゴニストである抗体及びそのフラグメントは、ＡＩＤＳ、及び特定の炎症性の疾患のための治療薬として使用され得る。ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２は、ヒトにおける後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）の原因論的な因子である。ＡＩＤＳは、ＨＩＶに感染した個体におけるＣＤ４＋Ｔリンパ球の枯渇によって、一部生じる。ＨＩＶ−１は、主にＴリンパ球、単球／マクロファージ、樹状細胞に感染し、そして中枢神経システム中の小神経膠細胞に感染する。これらの細胞の全てが、ＣＤ４糖タンパク質を発現し、これは、ＨＩＶ−１及びＨＩＶ−２に対するレセプターをとして作用する。標的細胞中へのＨＩＶの効率的な侵入は、アミノ末端のＣＤ４ドメインへの、ウイルスの外部エンベロープ糖タンパク質であるｇｐ１２０の結合に依存する。ウイルスの結合後、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質は、ウイルスと宿主細胞膜との融合を媒介し、それによって、侵入プロセスを完了する。感染した細胞の表面上で発現されたＨＩＶ−１のエンベロープ糖タンパク質によって指向された膜の融合は、細胞−細胞の融合を導き、それによって融合細胞を生じる。
【００９３】
最近、ＣＤ４に加えて宿主細胞因子が、ＨＩＶ−１のエンベロープ糖タンパク質によって媒介される膜の融合の効率を決定することが示唆されている。ＨＵＭＳＴＳＲ、ＬＥＳＴＲ、又は「ｆｕｓｉｎ」と呼ばれる、７膜貫通レセプター（７ＴＭＲ）は、一連のＣＤ４を発現する細胞が研究室用に適合されたＨＩＶ−１のエンベロープ糖タンパク質によって媒介される感染及び細胞の融合を支持することを可能にすることが示されている（Ｆｅｎｇ，Ｙ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈ．ＤＣ）、２７２：８７２−８７７（１９９６））。ＨＵＭＳＴＳＲに対する抗体は、細胞の融合及び研究室用に適合されたＨＩＶ−１単離物による感染をブロックしたが、マクロファージ向性一次ウイルスによる感染はインビトロではブロックしなかった（Ｆｅｎｇ，Ｙ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ（Ｗａｓｈ．ＤＣ）、２７２：８７２−８７７（１９９６））。
【００９４】
サイトカインレセプター及び関連する分子の、一次的的な臨床的なＨＩＶ−１単離物の感染を促進する能力が、いくつかのグループによって最近報告されている（例えば、Ｂａｔｅｓ、Ｐ．、Ｃｅｌｌ、８６：１−３（１９９６）；Ｃｈｏｅ，Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ、８５：１１３５−１１４８（１９９６）；Ｄｏｒａｎｚら、Ｃｅｌ、８５：１１４９−１１５８（１９９６）を参照のこと）。これらの研究は、ＨＩＶ−１感染の初期段階におけるサイトカインレセプターファミリーの種々のメンバーの関与が、ウイルスの向性及び一次ＨＩＶ−１単離物のβ−ケモカインの阻害を説明することを手助けすることを示す。
【００９５】
本発明はまた、細胞のＨＩＶ感染（例えば、新たな感染及び／又は融合細胞の形成）を阻害する方法を提供する。細胞は、哺乳動物のＣＣＲ２又はその一部を発現する。この方法は、哺乳動物のＣＣＲ２又は上記のレセプターの一部に結合する抗体又はその機能的なフラグメントの有効量を含有する組成物と、細胞とを接触させる工程を包含する。この組成物はまた、抗−ＣＣＲ３抗体、抗−ＣＣＲ５抗体、及び抗−ｆｕｓｉｎ抗体を含むがこれらに限定されない、ＨＩＶに対して有効である１つ以上のさらなる試薬を含み得る。
【００９６】
種々の方法は、本発明の抗体の存在下での、細胞へのＨＩＶの結合及び／又はＨＩＶによる細胞の感染を評価するために使用され得る。例えば、レセプターへのｇｐ１２０又はその一部の結合、ＨＩＶ感染、及び融合細胞の形成を評価するアッセイが、使用され得る（例えば、Ｃｈｏｅ，Ｈ．ら、Ｃｅｌｌ、８５：１１３５−１１４８（１９９６））。本発明の抗体の、これらのプロセスを阻害する能力は、これらの又は他の適切な方法を使用して評価され得る。
【００９７】
さらに、本発明は、患者におけるＨＩＶを治療する方法を提供する。この方法は、哺乳動物のＣＣＲ２又は上記のレセプターの一部に結合する抗体又はその機能的なフラグメントの有効量を含有する組成物を患者に投与する工程を包含する。さらに、組成物はまた、抗−ＣＣＲ３抗体、抗−ＣＣＲ５抗体、及び抗−ｆｕｓｉｎ抗体を含むがこれらに限定されない、ＨＩＶに対して有効である１つ以上のさらなる試薬を含み得る。ＨＩＶを治療するための抗体の治療的用途として、予防的な使用（例えば、ＨＩＶに曝される可能性があるか、又はＨＩＶに曝されている可能性がある患者の治療のため）が挙げられる。例えば、ＨＩＶに曝される可能性があるか又はＨＩＶに曝されている可能性がある（例えば，針刺による）健常な医療従事者は、この方法に従って治療され得る。別の例は、防御しなかった性的な接触又は防御の不備の後のウイルスに曝された患者の治療である。
【００９８】
ＡＩＤＳにおいては、複数の薬剤治療が最も見こみがあるようである。ＨＩＶ感染を阻害する抗−ケモカインレセプターアンタゴニストが、薬剤治療レジメに、特に、新たな細胞のウイルス感染をブロックすることによって、添加され得る。従って、１つ以上の他の治療薬（例えば、ヌクレオシドアナログ（例えば、ＡＺＴ、３ＴＣ、ｄｄＩ）及び／又はプロテアーゼインヒビター）との組み合わせでの本発明の抗体又はフラグメントの投与が想定され、そして、ＨＩＶ治療レジメに対する重要な相化作用を提供する。１つの実施態様においては、ヒト化抗―ＣＣＲ２ ｍＡｂは、患者からのウイルスの負荷を低減するために、新たな細胞の融合及び／又は感染を妨げることによって、治療薬と（すなわち、１つ以上の）組み合わせて使用される。このような抗体は、出産時の感染を妨げることにおいて有用であり得る。
【００９９】
本発明の別の局面は、個体におけるＨＩＶの感染を防ぐ方法に関する。この方法は、ＣＣＲ２に結合する抗体又はそのフラグメントの有効量を個体に投与する工程を包含する。この方法に従うと、ＨＩＶ感染を防ぐことは、感染した個体中の新たな細胞の感染を防ぐ（低減するか又は排除する）ため、又はＨＩＶに曝される可能性があるか、曝されている可能性があるか、若しくはＨＩＶに曝されている個体における感染を防ぐための治療を含む。例えば、ＨＩＶに感染した個体、ＨＩＶに感染した女性の胎児、又は健常な医療従事者のような個体は、本発明の方法に従って治療され得る。
【０１００】
投与の態様
本発明の１つ以上の抗体又はフラグメントは、外科的、機械的、若しくは治療的な介入の前、それと同時、若しくはその後で、単独又は別の薬物若しくは薬剤（その前、それと同時、若しくはその後で）と組み合わせて、適切な経路によって個体に投与され得る。例えば、本発明の抗体はまた、他のモノクローナル若しくはポリクローナル抗体と組み合わせて（例えば、ＣＣＲ３及びＣＣＲ５を含むがこれらに限定されない、他のケモカインレセプターに結合する抗体と組み合わせて）、又は予防的若しくは治療的治療において使用される市販されているガンマグロブリン及び免疫グロブリン産物のような、既存の血液血漿生成物と組み合わせて、使用され得る。本発明の抗体又はフラグメントは、抗性物質及び／又は抗真菌剤と組み合わせて、別々に投与される組成物として使用され得る。
【０１０１】
抗体又はフラグメント（すなわち、１つ以上の抗体又はフラグメント）の有効量が投与される。有効量は、投与の条件下で、所望の治療的（予防的を含む）効果を達成するために十分な量（例えば、ＣＣＲ２の機能の阻害に充分な量、及び従って、示されているように、炎症性応答若しくはＨＩＶ感染の阻害、又はＣＣＲ２の機能の促進に十分な量）である。
【０１０２】
種々の投与経路が、可能であり、これは以下を含むが必ずしもこれらに限定されない：試験される疾患又は状態に依存して、経口、摂食、非経口（例えば、静脈内、動脈内、筋肉内、皮下注射又は注入）、吸入（例えば、気管支内、鼻腔内、又は経口吸入、鼻腔内滴剤）。他の適切な投与方法はまた、再充電できるか又は生体分解性のデバイス及び緩徐放出ポリマーデバイスを含む。本発明の医薬組成物はまた、他の薬剤との組み合わせ治療の一部として投与され得る。
【０１０３】
投与される抗体又はフラグメントの処方は、選択される投与の経路及び処方（例えば、溶液、乳濁物、カプセル）に従って変化する。投与される抗体又はそのフラグメントを含有する適切な薬学的組成物は、生理学的に受容可能なビヒクル又はキャリア中に調製され得る。抗体及び／又はフラグメントの混合物が、使用され得る。溶液又は乳濁物については、適切なキャリアとして、例えば、水溶液又はアルコール／水溶液、乳濁物又は懸濁物が挙げられ、これらは生理食塩水及び緩衝化された媒体を含む。非経口的なビヒクルは、塩化ナトリウム溶液、リンガーのデキストロース、デキストロース及び塩化ナトリウム、乳酸化されたリンガーの又は固定された油を含み得る。種々の適切な水溶性のキャリアが、当業者に公知である。これらは、水、緩衝化された水、緩衝化生理食塩水、ポリオール（例えば、グリセロール、プロピレングリコール、液体のポリエチレングリコール）、デキストロース溶液及びグリシンを含む。静脈内ビヒクルは、種々の添加物、保存料、又は液体、栄養素、又は電解質、補充液を含み得る（一般的には、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ、第１６版、Ｍａｃｋ編、１９８０を参照のこと）。組成物は、必要に応じて、ｐＨの調節及び薬剤の緩衝化のような適切な生理学的条件のために必要とされる場合は薬学的に受容可能な補助物質、及び毒性の調節試薬（例えば、酢酸ナトリウム、塩化ナトリウム、塩化カリウム、塩化カルシウム、及び乳酸ナトリウム）を含み得る。本発明の抗体及びフラグメントは、当業者に公知の凍結乾燥及び再構成技術に従って、使用の前に、適切なキャリア中での保存のために凍結乾燥され得る。選択された媒体中での有効成分（単数又は複数）の最適な濃度は、当業者に周知の手順に従って経験的に決定され得、そして所望される最終的な薬学的処方物に依存する。吸入については、抗体又はフラグメントは可溶化させられ得、そして投与に適切なディスペンサー（例えば、アトマイザー、ネブライザー、又は加圧したエアゾールディスペンサー）中に充填され得る。
【０１０４】
本発明は、以下の実施例によって本明細書中で説明される。これらは決して限定を意図しない。本明細書中で引用されている全ての参考文献が、本明細書中で参考として援用されている。
【０１０５】
実施例
材料：
以下の材料を、示されている供給源より入手した：
ＰＥに結合させた抗−ＣＤ１６、ＰＥに結合させたストレプトアビジン、及びビオチニル化抗−ヒトＩｇＥは、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）による。ＦＩＴＣに結合させたヤギ抗−マウスＩｇＧは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｉｍｍｕｎｏｒｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｗｅｓｔ Ｇｒｏｖｅ，ＰＡ）による。ＦＡＣＳ溶解緩衝液は、Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ，ＣＡ）により、そして［¹²⁵ Ｉ］−ＭＣＰ−１はＮＥＮ（Ｂｏｓｔｏｎ，ＭＡ）による。
【０１０６】
細胞、細胞株、及び組織培養物
マウスのプレ−Ｂリンパ腫細胞株Ｌ１／２を、１０％のＦｅｔａｌ Ｃｌｏｎｅ Ｉ（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）、５０ユニット／ｍＬのペニシリン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、５０μｇ／ｍＬのストレプトアビジン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、２ｍＭのＬ−グルタミン（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）、及び５５μＭのβ−メルカプトエタノール（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）を補充したＲＰＭＩ−１６４０中で維持した。他の細胞株（ＣＣＲ１（Ｃａｍｐｂｅｌｌ，Ｊ．ら（１９９６）Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏ．，１３４：２５５−２６６）、ＣＣＲ５（Ｗｕら、Ｎａｔｕｒｅ、３８４：１７９−１８３（１９９６））のいずれかを発現するＬ１／２細胞のトランスフェクタントを含む）を、８００μｇ／ｍｌの活性なＧ４１８を補充した上記の培養培地中で増殖させた。ＴＨＰ−１細胞（ＡＴＣＣ番号第ＴＩＢ２０２号）を、ＡＴＣＣの指示に従って増殖させた。ＰＢＭＣを、Ｐｏｎａｔｈら、Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．，９７：６０４−６１２（１９９６）に記載されているように、ヘパリン化した血液から精製した。
【０１０７】
ＣＣＲ２ｂ発現構築物及び安定なトランスフェクタントの調製
ヒトのＣＣＲ２ｂのコード領域（Ｃｈａｒｏら、（１９９４）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：２７５２）を、記載されているように（Ｑｉｎ，Ｓ．ら、（１９９６）Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，２６：６４０−６４７）、ＲＴ−ＰＣＲ増幅によって得た。ｃＤＮＡを、オリゴ（ｄＴ）−プライミングを使用して作成し、そしてＣＣＲ２ｂのコード領域の増幅を、示されているように、ＣＣＲ２ｂ配列の一部に対応する以下のプライマーのセットを用いるネスティッドＰＣＲによって達成した（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号第Ｕ０３９０５号；Ｃｈａｒｏら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ、９１：２７５２−２７５６（１９９４））：
１）５’プライマー：５’−ＴＧＡＧＡＣＡＡＧＣＣＡＣＡＡＧＣＴＧＡＡＣ−３’（ヌクレオチド１１から３２；配列番号：１）；
３’プライマー：５’−ＴＣＴＧＴＡＴＴＡＧＴＡＣＡＣＡＣＡＧＣＣＣ−３’（ヌクレオチド１３０１から１２８０；配列番号：２）；
２）５’プライマー：５’−ＡＴＧＣＴＧＴＣＣＡＣＡＴＣＴＣＧＴＴＣＴＣＧＧ−３’（ヌクレオチド８１から１０４；配列番号：３）；
３’プライマー：５’−ＴＴＡＴＡＡＡＣＣＡＧＣＣＧＡＧＡＣＴＴＣＣＴＧＣＴＣ−３’（ヌクレオチド１１６４から１１３７；配列番号：４）。
【０１０８】
ＣＣＲ２ＢのｃＤＮＡをコードする領域を、ＣＤ５シグナルペプチドリーダー配列（Ａｒｕｆｆｏら、Ｃｅｌｌ、６１：１３０３−１３１３（１９９０））を含むように改変した。このペプチドの推定されるアミノ酸配列は、以下である：
ＮＨ₂ −Ｍｅｔ−Ｐｒｏ−Ｍｅｔ−Ｇｌｙ−Ｓｅｒ−Ｌｅｕ−Ｇｌｎ−Ｐｒｏ−Ｌｅｕ−Ａｌａ−Ｔｈｒ−Ｌｅｕ−Ｔｙｒ−Ｌｅｕ−Ｌｅｕ−Ｇｌｙ−Ｍｅｔ−Ｌｅｕ−Ｖａｌ−Ａｌａ−Ｓｅｒ−Ｖａｌ−Ｌｅｕ−Ａｌａ．．．（配列番号：５）。
【０１０９】
鋳型としてＣＣＲ２ｂのｃＤＮＡを、そしてＢａｍＨＩ制限部位を含み、ＣＤ５のシグナルペプチド配列及びＣＣＲ２ｂのアミノ末端配列をコードする２個の重複している５’プライマー、ならびにＣＣＲ２ｂのコード領域の内部に位置する３’プライマーを使用する、ＰＣＲ。
【０１１０】
５’ＣＤ５ Ｓｅｑ１プライマー
５’−ＧＧＧＧＡＴＣＣＡＧＡＡＡＣＣＡＴＧＣＣＣＡＴＧＧＧＧＴＣＴＣＴＧＣＡＡＣＣＧＣＴＧＧＣＣＡＣＣＴＴＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧ−３’（配列番号６）
５’ＣＤ５ Ｓｅｑ２プライマー
５’−ＧＣＣＡＣＣＴＴＧＴＡＣＣＴＧＣＴＧＧＧＧＡＴＧＣＴＧＧＴＣＧＣＴＴＣＣＧＴＧＣＴＡＧＣＧＡＴＧＣＴＧＴＣＣＡＣＡＴＣＴＣＧＴＴＣ−３’（配列番号：７）
３’ＣＣＲ２ＡＢ２プライマー− ５’−ＧＡＣＧＡＣＣＡＧＣＡＴＧＴＴＧＣＣ−３’（配列番号：８；Ｕ０３９０５のヌクレオチド２７２から２５５）。
【０１１１】
２７８塩基対の増幅したフラグメントを、ＢａｍＨＩ及びＡｐａＩで消化し、そして得られた２０９塩基対のフラグメントを、ＣＣＲ２の内因性の５’の塩基対のフラグメントを置きかえるために、ＣＣＢ２ｂのｃＤＮＡ（ＧｅｎＢａｎｋアクセッション番号第Ｕ０３９０５号）の２０６位のＡｐａＩ部位に挿入した。哺乳動物発現プラスミドｐＣＤ５ＭＣＰＲＢを作成するために、レセプターの開始メチオニンのすぐ前にＣＤ５のシグナルペプチドリーダー配列を有するＣＣＲ２ｂをコードする得られた配列を、ｐｃＤＮＡ３（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ，Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）のＢａｍＨＩ及びＸｈｏＩ部位に挿入した。ＣＤ５−ＣＣＲ２ｂフラグメントを、ｐＣＤＥＦ３（Ｇｏｌｄｍａｎら、（１９９６）Ｂｉｏｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ ２１：１０１３−１０１５）のＢａｍＨＩ−ＮｏｔＩ部位中にサブクローン化し、そしてこの構築物を、ＣＣＲ２ｂＤＥＦ３と命名した。この発現ベクターにおいては、挿入した遺伝子の発現は、ＥＦ−１αプロモーターによって駆動される。
【０１１２】
５０ｍＬのＬ１／２細胞を、エレクトロポレーションの１日前に４×１０⁵ 細胞／ｍＬで播種した。エレクトロポレーションの日に、１×１０⁶ 細胞／ｍＬの密度にまで増殖した細胞を、それらの培地から遠心分離し、そして８００μｌの室温のエレクトロポレーション緩衝液（Ｚａｊａｃら、ＤＮＡ、７：５０９−５１３）中に再懸濁した。１２０ｍＭのＬ−グルタミン酸（Ｓｉｇｍａ）、７ｍＭの酢酸（ＥＭ Ｓｃｉｅｎｃｅ）、４．３ｍＭのグルコース（Ｓｉｇｍａ）、１７ｍＭのＫ Ｐｉｐｅｓ、ｐＨ６．９（Ｓｉｇｍａ）、１ｍＭのＥＧＴＡ（Ｓｉｇｍａ）、５ｍＭのＡＴＰ、ｐＨ７．０（Ｓｉｇｍａ）。２５μｇのＳｃａＩで直鎖状にし、フェノール／クロロホルム／イソアミルアルコールで抽出し、そしてイソプロパノールで沈殿させた、ＣＣＲ２ｂＤＥＦ３プラスミドＤＮＡを、０．４ｃｍの間隙のエレクトロポレーションキュベット中に配置した。再懸濁した細胞を、キュベットに添加し、そして一回のパルスを、４５０ボルト、９６０μＦｄで適用した。次いで、細胞を、キュベットから１５ｍＬのＬ１／２増殖培地（上記）を含有するＴ−７５フラスコに移し、そして３日間増殖させた。その時点で細胞をそれらの培地から遠心分離し、そして１ｍＭのピルビン酸ナトリウム（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）及び０．８ｍｇ／ｍＬの活性なＧ４１８（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）をさらに補充したＬ１／２増殖培地中に再懸濁した。
【０１１３】
化学走化性によるＣＣＲ２ｂを発現する細胞の選択
トランスフェクトした細胞を、１１日間増殖させ、その時点で、それらを新しい増殖培地中に１：２０に分けた。１７日目に、細胞を化学相化性によって選択した。０．５％のＢＳＡ（ＲＰＭＩ／ＢＳＡ）を補充したＲＰＭＩ １６４０中の６００μＬの１μＭのＭＣＰ−１を、下部のチャンバーに配置し、そして１００μｌのＲＰＭＩ／ＢＳＡ中の１×１０⁶ のＣＣＲ２ｂＤＥＦ３細胞を、３．０ミクロンの孔の２４ウェル化学走化プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）の上部のチャンバー中に配置した。細胞を、４時間と２０分間、３７℃にて５％のＣＯ₂ 、加湿したインキュベーター中で化学走化させ、その時点で、上部のチャンバーを回収した。このインキュベーション時間を実験のときに選択した。なぜならば、それがＭＣＰ−１に応答する細胞が化学走化するのに十分に長く、バックグラウンドを低く維持するのに十分に短いからである。
【０１１４】
ＦＡＣＳ分類によるＣＣＲ２ｂを発現する細胞の二次選択
膜を通じて下部のチャンバーに化学走化した細胞を増殖させ、滅菌したＦＡＣＳ分類によってさらに精製した。１０００万個のＣＣＲ２ｂＤＥＦ３細胞をそれらの培地から遠心分離し、１％の熱不活化したウシの胎児の血清（「ＨＩ ＦＣＳ」）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）及び２．５ｍＬの滅菌濾過した抗−ＣＣＲ２ｂアミノ末端ペプチド抗体の上清５Ａ１１を補充した２．５ｍＬのＰＢＳ（＋Ｃａ、Ｍｇ）中に再懸濁した。細胞及び抗体を混合し、そして３０分間氷上でインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳ（＋）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で２回洗浄し、そして１％のＨＩ ＦＣＳを補充したＰＢＳ（＋）中のＦＩＴＣに結合させた、アフィニティー精製したＦ（ａｂ¹ ）₂ ヤギ抗−マウスＩｇＧ（Ｊａｃｋｓｏｎ ＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）の、５ｍＬの滅菌濾過した１：２５０希釈物中に再懸濁した。細胞を暗所で氷上で３０分間インキュベートし、そして次いで、ＰＢＳ（＋）（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）で２回洗浄した。細胞を、ＦＡＣＳＣａｌｉｂｕｒ（登録商標）上で分類し、そして最も明るい４％の細胞を回収した（ＦＬ１≧３×１０² ）。
【０１１５】
分類した細胞を増殖させ、そしてそれらを、上記と同じプロトコールを使用して再度分類した。最も明るい１％の細胞を回収した（ＦＬ１≧３×１０³ ）。
【０１１６】
モノクローナル抗体の産生
ＣＣＲ２ｂに対するｍＡｂを産生するために、トランスフェクタントを継続的にモニターし、発現のレベルが次第に減少しないことを確実にした。ＦＡＣＳ染色を、トランスフェクタント上でのレセプターの発現を確認するために、二次抗体としてヤギ抗−マウスＩｇＧ ＦＩＴＣを有する抗ＣＣＲ２ｂ抗体の上清５Ａ１１を使用して、定期的に行った。
【０１１７】
２０００万個のＣＣＲ２ｂＤＥＦ３．Ｌ１／２細胞をＲＰＭＩ １６４０（Ｇｉｂｃｏ ＢＲＬ）中で洗浄し、そしてＲＰＭＩ １６４０及び０．２ｍｇ／ｍＬのマイトマイシンＣ中で３０分間、３７℃にてインキュベートした。次いで、細胞をＰＢＳ（＋）中で２回洗浄し、そして０．５ｍＬのＰＢＳ（＋）中の２×１０⁷ 個の細胞を、Ｃ５７ ＢＬ／６雌性マウス中に腹膜内で注射した。これを、２週間の間隔で２回以上繰り返した。４回目に、２×１０⁷ 個の細胞を、０．２５ｍＬ中に再懸濁し、そして静脈内で注射した。静脈注射の３日後、マウスを屠殺し、そして脾臓を取り出し、そして記載されているように、細胞をＳＰ２／０細胞株と融合させた（Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ ａｎｄ Ｓｏｎｓ、Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ、１９９２）。
【０１１８】
このマウスのセットを、予め、２つの異なる細胞株及び合成のペプチドを用いて複数回免疫化したが、ＣＣＲ２陽性細胞を染色した抗体、数回の融合からは生成されなかった。上記の、高レベルのＣＣＲ２を発現するＣＣＲ２ｂＤＥＦ３．Ｌ１／２細胞株での４回の免疫化は、記載されている抗体を得るために重要であった。
【０１１９】
限界希釈によるＣＣＲ２トランスフェクタントの単一の細胞クローンの選択
マウスに最後の注射を受けさせた後、２回分類した細胞を再び増殖させ、そして次いで、それらをさらに、限界希釈によって精製した。細胞を、９６ウェルプレート中に、１ウェルあたり１個及び０．５個の細胞で配置した。１ウェルあたり０．５個の細胞の希釈物からサブクローン化した細胞を増殖させ、そしてヤギ抗−マウスＩｇＧ ＦＩＴＣを二次抗体として有する抗−ＣＣＲ２抗体上清５Ａ１１を使用する、間接的な免疫蛍光ＦＡＣＳ分析によってＣＣＲ２ｂの発現について試験した。手順は、染色の容量が１００μｌであったことを除いて、上記のものと同じであった。４つのポジティブを選択し、そして凍結させた。
【０１２０】
陽性モノクローナル抗体の同定
ＦＡＣＳｃａｎ（登録商標）（Ｂｅｃｋｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ ＆ Ｃｏ．、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）を使用する免疫蛍光染色分析を、ＣＣＲ２ｂレセプターと反応するモノクローナル抗体を同定するために使用した。ハイブリドーマ培養上清を、二次抗体としてヤギ抗−マウスＩｇＧ ＦＩＴＣを使用する９６−ウェル形式でアッセイした。ＣＣＲ２ｂＤＥＦ３．Ｌ１／２細胞を、ＣＣＲ２ｂと反応するモノクローナル抗体を同定するために使用し、そしてトランスフェクトしていないＬ１／２細胞を、他の細胞の表面タンパク質と反応するモノクローナル抗体を排除するために使用した。
【０１２１】
ＦＡＣＳ染色−培養した細胞
培養したトランスフェクタント細胞株の染色のために、５０μｌ中の０．５×１０⁶ 個の細胞を、９６ウェルのポリスチレンＶ底プレート中のＰＢＳ＋１％のＦＣＳ中に再懸濁した。５０μｌの１次抗体の上清又はＨＴ培地（陰性対照）を添加し、そしてサンプルを、４℃にて３０分間インキュベートした。１００μｌのＰＢＳを添加し、そして細胞を遠心分離によってペレット状にし、そしてＰＢＳで１回洗浄した。ペレットを、ＦＩＴＣに結合させたヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体を含有する（１：２５０希釈）１００μｌのＰＢＳ＋１％のＦＣＳ中に再懸濁し、そして３０分間、暗所にて４℃でインキュベートした。細胞を、ＰＢＳで２回洗浄し、ＰＢＳ中に再懸濁し、そしてＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を使用してＦａｃＳｃａｎサイトメーターを用いてフローサイトメトリーによって分析した。細胞を、ＰＢＳ／１％のホルムアルデヒド（それらが同じ日に分析されない場合は）で固定した。モノクローナル抗体１Ｄ９及び８Ｇ２は、ＣＣＲ２トランスフェクタントを染色したが、ＣＣＲ１又はＣＣＲ５トランスフェクタントは染色しなかった（図１Ａ〜１Ｏ）。
【０１２２】
ＦＡＣＳ染色−全血
１００μｌの全血を、１００μＬの１Ｄ９抗体ハイブリドーマ上清又はＨＴ培地（陰性対照）と混合し、そして４℃にて３０分間インキュベートした。ＰＢＳでの１回の洗浄後、１００μＬのＦＩＴＣに結合させたヤギ抗−マウスＩｇＧ抗体（１：２５０希釈）を各サンプルに添加し、そして３０分間、４℃にて暗所でインキュベートした。次いで、サンプルを、二次的な色素染色が行われる場合はＰＢＳで１回洗浄し、そうでなければＰＢＳで２回洗浄した。２つの色素染色のために、５μｌのマウスの血清を１回の洗浄後に細胞のペレットに添加し、混合し、そして５分間、４℃にてにて暗所でインキュベートした。第２の一次抗体（又は陰性対照としてのＰＢＳ）を添加し（１０μｌの抗−ＣＤ１６、抗ＩｇＧの１００μｌの１：２００希釈物）を添加し、そして３０分間、４℃にて暗所でインキュベートした。次いで、サンプルをＰＢＳで１回洗浄し、そして１００μＬのストレプトアビジンＰＥ（１：２００のＰＢＳ＋１％のＢＳＡ）中に再懸濁し、そして１５分間、４℃にて暗所でインキュベートした。赤血球を、各サンプルに２ｍｌのＦＡＣＳ溶解緩衝液を添加すること、及び室温にて暗所で１５分間又はサンプルが透明になるまでインキュベートすることによって溶解させた。細胞を、遠心分離によってペレット状にし、２００μｌの上清以外を吸引した。サンプルを、ＣｅｌｌＱｕｅｓｔソフトウェア（Ｂｅｃｋｔｏｎ−Ｄｉｃｋｅｎｓｏｎ）を使用してＦａｃＳｃａｎサイトメーター上でフローサイトメトリーによって分析した。ＣＣＲ２ｂはほとんどの単球、リンパ球のサブ集団、及び顆粒球のサブセット上で発現される（図２Ａ〜２Ｌ）。ＣＣＲ２ｂは、末梢血中のＩｇＥ陽性の集団（好塩基球）上で発現される（図３Ａ〜３Ｉ）。
【０１２３】
ＭＣＰ−１結合アッセイ
ＭＣＰ−１結合を、２．５μｇのＴＨＰ−１膜タンパク質又は５００，０００個のＰＭＢＣ及び０．１ｎＭの［¹²⁵ Ｉ］−ＭＣＰ−１のいずれかを含有する、５０ｍＭのＨｅｐｅｓ、ｐＨ７．４、１ｍＭのＣａＣｌ₂ 、５ｍＭのＭｇＣｌ₂ 、０．０２％のアジ化ナトリウム、０．５％のＢＳＡ（ＨＢＢ）の０．１ｍｌの最終容量で行った。競合結合実験を、標識していないＭＣＰ−１、１Ｄ９抗体、又は陰性対照のＩｇＧ２ａの種々の濃度を含ませることによって行った。非特異的な結合を、２５００倍過剰の標識していないＭＣＰ−１の添加後に決定した。サンプルを６０分間室温にてインキュベートし、そして結合したトレーサー及び遊離のトレーサーを、０．３％のポリエチレンイミン中に予め浸した９６−ウェルＧＦ／Ｂフィルタープレートを通す濾過によって分離した。フィルターを、０．５ＭのＮａＣｌをさらに補充したＨＢＢ中で洗浄し、乾燥させ、そして結合した放射活性の量を、液体シンチレーションカウンティングによって決定した。ｍＡｂ １Ｄ９は、［¹²⁵ Ｉ］−ＭＣＰ−１のＴＨＰ−１細胞膜への結合を、約０．００４μｇ／ｍｌのＩＣ₅₀で（約０．０２ｎＭ；図４）、そして新鮮なＰＢＭＣへの結合を、０．０４μｇ／ｍｌのＩＣ₅₀で（約０．２ｎＭ；図５）阻害する。
【０１２４】
ＰＢＭＣの化学走化性
化学走化性を、３μｍの孔サイズの９６ウェル化学走化プレート（Ｎｅｕｒｏｐｒｏｂｅ、Ｃａｂｉｎ Ｊｏｈｎ，ＭＤ）を使用してアッセイした。Ｆｉｃｏｌｌ−Ｈｙｐａｑｕｅ密度勾配遠心分離を使用する標準的な方法によって単離したＰＢＭＣを、ＰＢＳ／０．５％のＢＳＡで洗浄し、そして次いで、１０×１０⁶ 個の細胞／ｍｌになるように化学走化アッセイ培地（ＨＢＳＳ／１０ｍｌのＨＥＰＥＳ／０．５％の脂肪酸を含まないＢＳＡ）中に再懸濁した。細胞を、化学走化アッセイ培地中に室温で２０分間、種々の濃度の抗−ＣＣＲ２抗体、１Ｄ９、又は非特異的なマウスのＩｇＧ２ａとともに、予めインキュベートした。抗体の同じ希釈物をケモカインと混合し、そして３０μｌの混合物を、化学走化プレートの底ウェルのそれぞれに添加した。底ウェルをメンブレンで覆い、そして２５μｌの細胞と抗体の混合物を、フィルターの上部に添加した。プレートを、３７℃にて５％のＣＯ₂ インキュベーター中で、約８０分間インキュベートした。移動の完了時点で、メンブレンを回収し、そして底ウェルを伴うプレートを、内容物を凍結させるために−８０℃にて３０分間インキュベートした。プレートを３７℃にて１０分間で融解させた。供給元によって提供された溶解緩衝液中のＣｙＱｕａｎｔ試薬（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）の６μｌの１：４００希釈物を各ウェルに添加し、そして細胞の移動を、４８５ｅｘ／５３５ｅｍでＣｙｔｏＦｌｏｕｒ蛍光プレートリーダーを使用して決定した蛍光強度によって、示されているように定量した。ｍＡｂ １Ｄ９は、新鮮なＰＢＭＣのＭＣＰ−１によって誘導される化学走化を阻害するが、ＲＡＮＴＥＳによって誘導される化学走化は阻害しない（図６Ａ及び６Ｂ）。新鮮なＰＢＭＣのＭＣＰ−１によって誘導される化学走化の阻害は、１０μｇ／ｍｌ（約４０ｎＭ）を用いて実証された。
【０１２５】
本発明は、その好ましい実施態様を参照して詳細に示されそして記載されているが、形態及び詳細における種々の変更が、添付の特許請求の範囲によって定義されているような本発明の精神及び範囲を逸脱することなくその範囲内で行われ得ることが、当業者によって理解される。
【０１２６】
【表１】

【図面の簡単な説明】
【図１】 図１Ａ〜１Ｏは、蛍光活性化細胞スキャン（ＦＡＣＳ）ヒストグラムプロフィールである。これは、ｍＡｂ １Ｄ９及び８Ｇ２は、ＣＣＲ２トランスフェクタントを染色するが、ＣＣＲ５又はＣＣＲ１トランスフェクタントは染色しないことを示す。Ｌ１／２（本明細書中では、Ｌ１．２とも呼ばれる）マウスプレ−Ｂリンパ腫宿主細胞を、図に示したＣＣＲ２、ＣＣＲ５、及びＣＣＲ１でトランスフェクトし、そして異なるレセプター特異性を有する抗体を用いて染色した。染色を、フローサイトメトリーによって分析した。
【図２】 図２Ａ〜２Ｌは、ＦＡＣＳドットプロットである。これは、ほとんどの単球、リンパ球のサブ集団、及び顆粒球の小さいサブセット上でのＣＣＲ２の発現を示す。全血細胞を、３個の抗−ＣＣＲ２ ｍＡｂの１つを用いて染色した（５Ａ１１は、免疫原としてＣＣＲ２のアミノ末端の最初の３２個のアミノ酸からなるペプチドを使用して生成し、そして１Ｄ９及び８Ｇ２は、免疫原としてＣＣＲ２ｂ Ｌ１／２細胞のトランスフェクタントを使用して本明細書中に記載されているように生成した）。染色を、フローサイトメトリーによって分析し、そしてリンパ球、顆粒球、及び単球の集団を、前方向及び側方向の光の散乱を使用して導いた（ｇａｔｅ）。Ｘ軸は、前方光散乱（細胞の大きさの測定値）を示し、そしてＹ軸は、ＣＣＲ２についての染色の蛍光強度を示す。陰性対照染色のレベルは、直線で示す。
【図３】 図３Ａ〜３Ｉは、ＦＡＣＳドットプロットである。これは、ｍＡｂ １Ｄ９が、ＩｇＥ及びＣＣＲ２についての２色染色を使用して、末梢血中のＩｇＥポジティブな集団（好塩基球）を染色することを示す。全血細胞を、最初に、図に示した陰性対照抗体（抗−Ｆｌａｇ）、抗−ＣＣＲ２抗体１Ｄ９、又は抗−ＣＸＣＲ１抗体のいずれかを用いて染色し、そして抗−マウス−ＦＩＴＣ結合によって検出した。第２回目の染色を、図に示したＰＢＳ、又はＩｇＥ若しくはＣＤ１６に特異的なビオチニル化した抗体のいずれかを使用して行い、そしてストレプトアビジン−フィコエリトリンを用いて検出した。染色を、フローサイトメトリーによって分析した。
【図４】 図４は、ｍＡｂ １Ｄ９がＴＨＰ−１細胞膜に対する［¹²⁵ Ｉ］ＭＣＰ−１の結合を阻害することを示す。３．０μｇのＴＨＰ−１膜タンパク質を、０．１ｎＭの［¹²⁵ Ｉ］ＭＣＰ−１とともに、種々の濃度の１Ｄ９又はイソタイプ適合抗−ＣＸＣＲ３抗体１Ｃ６の存在下でインキュベートした。結合したトレーサーの量を、濾過及びシンチレーションカウンティングによる、結合物からの非結合物の分離によって決定した。データを、ＫａｌｅｉｄａＧｒａｐｈソフトウェアを用いる４−パラメーターの記号論理学の方程式（ｌｏｇｉｔｉｃ ｅｑｕａｔｉｏｎ）を使用して、非直線的回帰によって、ＩＣ₅₀値を決定するために分析した。
【図５】 図５は、ｍＡｂ １Ｄ９が新鮮なヒトのＰＢＭＣに対する［¹²⁵ Ｉ］ＭＣＰ−１の結合を阻害することを示す。新たに単離した末梢血単核細胞（５００，０００個）を、０．１ｎＭの［¹²⁵ Ｉ］ＭＣＰ−１とともに、種々の濃度の１Ｄ９又はイソタイプ適合抗−ＣＸＣＲ３抗体１Ｃ６の存在下でインキュベートした。結合したトレーサーの量を、濾過及びシンチレーションカウンティングによる、結合物からの非結合物の分離によって決定した。データを、図４についてと同様に、ＩＣ₅₀値を決定するために分析した。
【図６】 図６Ａ及び６Ｂは、ｍＡｂ １Ｄ９が、ＭＣＰ−１によって誘導される化学走性を阻害するが、新鮮なＰＢＭＣのＲＡＮＴＥＳによって誘導される化学走性は阻害しないことを示すグラフである。図６Ａは、抗体なし、あるいは０．１若しくは１０μｇ／ｍｌの１Ｄ９、又は非特異的マウスＩｇＧ２ａを用いる、１０ｎＭのＭＣＰ−１に対するＰＢＭＣの化学走性アッセイの結果を示す。自発的な非特異的な移動もまた、示される。図６Ｂは、抗体なし、１０μｇ／ｍｌの１Ｄ９若しくは１０μｇ／ｍｌの非特異的マウスＩｇＧ２ａを用いる、１０ｎＭのＲＡＮＴＥＳに対するＰＢＭＣの化学走性アッセイの結果を示す。ＲＡＮＴＥＳの非存在下での自発的な非特異的な移動もまた、示される。
【配列表】

Claims (54)

1. ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−１２５４９を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体のヒト化抗体またはその抗原結合性フラグメントである、抗体または抗原結合フラグメントであって、ここで、該抗体またはその抗原結合フラグメントは、哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２に対するリガンドの結合を阻害し、そして、該リガンドの該レセプターへの結合に関連する１つ以上の機能を阻害する、抗体またはその抗原結合フラグメント。
2. ＡＴＣＣ寄託番号ＨＢ−１２５４９を有するハイブリドーマにより産生されるモノクローナル抗体の６つの相補性決定領域を含有する、請求項１記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
3. 前記哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２がヒトＣＣ−ケモカインレセプター２である、請求項１および２いずれか記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
4. リガンドがケモカインである、請求項１および２いずれか記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
5. ケモカインが、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるものである、請求項４記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
6. リガンドが、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）である、請求項１および２いずれか記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
7. 白血球の輸送、細胞中へのＨＩＶの侵入、Ｔ細胞の活性化、炎症媒介因子の放出及び白血球の脱顆粒の１つ又はそれ以上を阻害するものである、請求項１および２いずれか記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
8. 前記レセプターへのケモカインの結合に関連する機能が白血球の輸送である、請求項４記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
9. 前記レセプターへのケモカインの結合に関連する機能が化学走化性である、請求項４記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
10. 前記レセプターへのケモカインの結合に関連する機能がＨＩＶ感染性である、請求項６記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
11. 抗原結合フラグメントがＦｖフラグメント、Ｆａｂフラグメント、Ｆａｂ’フラグメント、及びＦ（ａｂ’）_２フラグメントからなる群より選択される、請求項１〜１０いずれか記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
12. 少なくとも約０．１×１０^−９Ｍの親和性でＣＣ−ケモカインレセプター２を結合する、請求項１〜１１いずれか記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
13. ケモカインによって誘導される細胞の化学走化性を、１５０μｇ／ｍｌ未満で阻害する、請求項５記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
14. 細胞が、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）である、請求項１３記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
15. 約１．０μｇ／ｍｌ未満のＩＣ_５０で前記レセプターへのリガンドの結合を阻害する、請求項１〜１４いずれか記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
16. 標識されている、請求項１〜１５いずれか記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
17. 標識が、放射性同位元素、スピン標識、抗原標識、酵素標識、蛍光標識、化学発光標識及びエピトープ標識より選択される、請求項１６記載の抗体又はその抗原結合フラグメント。
18. 請求項１〜１７いずれか記載の抗体又はその抗原結合フラグメント、及び任意の生理学的に受容可能なビヒクルを含んでなる組成物。
19. 凍結乾燥させられた形態である、請求項１８記載の組成物。
20. 緩衝液、安定剤、賦形剤、殺生物剤及び不活性なタンパク質の１つ以上をさらに含んでなる、請求項１８及び１９のいずれか記載の組成物。
21. ＡＴＣＣアクセッション番号ＨＢ−１２５４９の下に寄託されたハイブリドーマ細胞株。
22. 凍結乾燥させられた形態である請求項１〜１５いずれか記載の抗体又はその抗原結合フラグメント；及び
    薬学的に受容可能なキャリアを含んでなるキット。
23. 請求項１〜１５いずれか記載の一次抗体又はその抗原結合フラグメント；及び
    該抗体又はその抗原結合フラグメントとレセプターとの複合体の存在を検出するのに適した１つ又はそれ以上の補助試薬を含んでなる、ＣＣ−ケモカインレセプター２の存在を検出するためのキット。
24. レセプターの一次抗体又はその抗原結合フラグメントとは異なるエピトープに対して特異的であるか、又は一次抗体又はその抗原結合部分に結合する、二次抗体又はその抗原結合フラグメントをさらに含む、請求項２３記載のキット。
25. 二次抗体又はその抗原結合フラグメントが標識されている、請求項２４記載のキット。
26. 哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２産生細胞と、請求項１〜１７いずれか記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの有効量とを接触させる工程を含む、哺乳動物のＣＣケモカインレセプター２産生細胞と、そのリガンドとの相互作用のインビトロ阻害方法。
27. 前記細胞が、リンパ球、単球、顆粒球、Ｔ細胞、好塩基球、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、及びＣＣＲ２をコードする組換え核酸又はその一部を含有する細胞からなる群より選択されるものである、請求項２６記載の方法。
28. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ２５＋細胞、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ４５ＲＯ＋細胞からなる群より選択されるものである、請求項２７記載の方法。
29. 前記哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２がヒトＣＣ−ケモカインレセプター２である、請求項２６記載の方法。
30. 前記リガンドがケモカインである、請求項２６記載の方法。
31. 前記ケモカインが、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるものである、請求項３０記載の方法。
32. 哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２又はその一部を含有してなる組成物と、請求項１〜１５いずれか記載の抗体又はその抗原結合フラグメントの有効量とを接触させる工程を含む、哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２又は前記レセプターの機能性部分へのケモカインの結合に関連する機能の阻害方法。
33. ケモカインが、ＭＣＰ−１、ＭＣＰ−２、ＭＣＰ−３、ＭＣＰ−４及びそれらの組み合わせからなる群より選択されるものである、請求項３２記載の方法。
34. 前記機能が、
    （ａ）シグナル伝達活性；
    （ｂ）細胞性の応答の刺激；並びに
    （ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組合せ
    からなる群より選択される、請求項３２記載の方法。
35. 前記機能が、シグナル伝達活性であり、かつ
    （ａ）哺乳動物のＧタンパク質の活性化；
    （ｂ）細胞質ゾルの遊離のカルシウム［Ｃａ^２＋］Ｉの濃度における迅速でありそして一時的な増大の誘導；並びに
    （ｃ）（ａ）及び（ｂ）の組合せ
    からなる群より選択される、請求項３４記載の方法。
36. 前記機能が、細胞性の応答の刺激であり、かつ
    （ａ）化学走化性の刺激；
    （ｂ）エキソサイトーシス；
    （ｃ）白血球による炎症性媒介因子の放出；
    （ｄ）インテグリンの活性化；
    （ｅ）Ｔ細胞の活性化；
    （ｆ）白血球の脱顆粒；並びに
    （ｇ）（ａ）、（ｂ）、（ｃ）、（ｄ）、（ｅ）及び（ｆ）の組合せ
    からなる群より選択される、請求項３４記載の方法。
37. 前記組成物が、哺乳動物のＣＣ−ケモカイン２レセプター産生細胞である、請求項３２記載の方法。
38. 前記細胞が、リンパ球、単球、顆粒球、Ｔ細胞、好塩基球、樹状細胞、好酸球、肥満細胞、及びＣＣＲ２をコードする組換え核酸又はその一部を含有する細胞からなる群より選択されるものである、請求項３７記載の方法。
39. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ２５＋細胞、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ４５ＲＯ＋細胞からなる群より選択されるものである、請求項３８記載の方法。
40. 前記哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２がヒトＣＣ−ケモカインレセプター２である、請求項３２記載の方法。
41. ａ）試験対象の薬剤；
    ｂ）請求項１〜１７いずれか記載の抗体又はその抗原結合フラグメント；
    ｃ）哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２又はそのリガンド結合変異体を含有してなる組成物を、前記哺乳動物ＣＣ−ケモカインレセプター２又はそのリガンド結合変異体への前記抗体又は抗原結合フラグメントの結合に好適な条件下で混合する工程、ならびに前記哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２又はそのリガンド結合変異体への前記抗体又は抗原結合フラグメントの結合を検出又は測定する工程を含み、ここで、適切な対照と比較して形成された複合体の量における減少が、薬剤が前記レセプター又はそのリガンド結合変異体に結合することを示す、哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２又はそのリガンド結合変異体に結合する薬剤の検出又は同定方法。
42. 哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２又はそのリガンド結合変異体を含有してなる前記組成物が、組換えＣＣ−ケモカインレセプター２又はそのリガンド結合変異体を産生する細胞である、請求項４１記載の方法。
43. 哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２又はそのリガンド結合変異体を含有してなる前記組成物が、哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２又はそのリガンド結合変異体を天然に発現する細胞である、請求項４１記載の方法。
44. 哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２又はそのリガンド結合変異体を含有してなる前記組成物が、前記組換えＣＣ−ケモカインレセプター２又はそのリガンド結合変異体を産生する細胞の膜画分である、請求項４１記載の方法。
45. 薬剤が、哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２に対する特異性を有する抗体又はその抗原結合フラグメントである、請求項４１記載の方法。
46. 前記哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２又はそのリガンド結合変異体がヒトＣＣ−ケモカインレセプター２又はそのリガンド結合変異体である、請求項４１記載の方法。
47. 薬剤を治療効果について評価する工程をさらに含む、請求項４１〜４６いずれか記載の方法。
48. 試料を、請求項１〜１７いずれか記載の抗体又はその抗原結合フラグメントと、該レセプターへの該抗体又は抗原結合フラグメントの結合に適切な条件下で接触させる工程、
    抗体又はその抗原結合フラグメントとレセプターとの結合が起こり、複合体が形成されたかどうかを調べる工程を含み、
    複合体が、試料中の哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２の存在を示すものである、試料中の哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２の発現のインビトロ検出方法。
49. 試料が体液である、請求項４８記載の方法。
50. 体液が血液又は唾液である、請求項４９記載の方法。
51. 哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２がヒトＣＣ−ケモカインレセプター２である、請求項４８〜５０いずれか記載の方法。
52. 細胞を、請求項１〜１７いずれか記載の抗体又はその抗原結合フラグメントと、該レセプターへの該抗体又は抗原結合フラグメントの結合に適切な条件下で接触させる工程、
    抗体又はその抗原結合フラグメントとレセプターとの結合が起こり、複合体が形成されたかどうかを調べる工程を含み、
    複合体が、細胞による哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２の発現を示すものである、細胞による哺乳動物のＣＣ−ケモカインレセプター２の発現のインビトロ検出方法。
53. 細胞が、単球及びＴ細胞からなる群より選択されるものである、請求項５２記載の方法。
54. 前記Ｔ細胞が、ＣＤ８＋細胞、ＣＤ２５＋細胞、ＣＤ４＋細胞及びＣＤ４５ＲＯ＋細胞からなる群より選択されるものである、請求項５３記載の方法。

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