ES2335948T3 - Anticuerpos anti-ccr2 y metodos de uso de los mismos. - Google Patents

Abstract

Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al dominio amino-terminal de un receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero (CCR2), siendo dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo un antagonista de la quimiotaxia inducida por MCP-1 y teniendo el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo especificidad epitópica por el dominio amino-terminal del receptor CCR2 desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 30 de la proteína receptora.

Description

Anticuerpos anti-CCR2 y métodos de uso de los mismos.

Antecedentes de la invención

Durante los últimos años, se ha descrito una familia cada vez mayor de factores quimioatrayentes/activadores de leucocitos denominados quimiocinas (Oppenheim, J.J. et al., Annu. Rev. Immunol., 9:617-648 (1991); Schall y Bacon, Curr. Opin. Immunol., 6:865-873 (1994); Baggiolini, M., et al., Adv. Imunol., 55:97-179 (1994)). Los miembros de esta familia se producen y secretan por muchos tipos de células en respuesta a mediadores inflamatorios de fase temprana tales como IL-1\beta o TNF-\alpha. La superfamilia de quimiocinas comprende dos ramas principales: las \alpha-quimiocinas (o quimiocinas CXC) y las \beta-quimiocinas (quimiocinas CC). La rama de \alpha-quimiocinas incluye proteínas tales como IL-8, péptido activador de neutrófilos 2 (NAP-2), actividad estimuladora del crecimiento de melanoma (MGSA/gro o GRO\alpha) y ENA-78, cada uno de los cuales tiene efectos atrayentes y activadores predominantemente sobre los neutrófilos. Los miembros de la rama de \beta-quimiocinas afectan a otros tipos de células tales como monocitos, linfocitos, basófilos y eosinófilos (Oppenheim; J.J. et al., Annu. Rev. Immunol., 9:617-648 (1991); Baggiolini, M., et al., Adv. Imunol., 55:97-179 (1994); Miller y Krangel, Crit. Rev. Immunol., 12:17-46 (1992); Jose, P.J., et al., J. Exp. Med., 179:881-118 (1994); Ponath, P.D., et al., J. Clin. Invest., 97:604-612 (1996)), e incluyen proteínas tales como proteínas quimiotácticas de monocitos 1-4 (MCP-1, MCP-2, MCP-3 y MCP-4), RANTES y proteínas inflamatorias de macrófagos (MIP-1\alpha, MIP-1\beta). Recientemente, se ha identificado una nueva clase de quimiocinas unidas a la membrana designadas quimiocinas CX3C (Bazan, J.F., et al., Nature 385:640-644 (1997)). Las quimiocinas pueden mediar una variedad de efectos proinflamatorios sobre los leucocitos, tales como desencadenamiento de quimiotaxia, desgranulación, síntesis de mediadores lipídicos y activación de integrinas (Oppenheim, J.J. et al., Annu. Rev. Immunol., 9:617-648 (1991); Baggiolini, M., et al., Adv. Imunol., 55:97-179 (1994); Miller, M.D. y Krangel, M.S., Crit. Rev. Immunol., 12:17-46 (1992)). Últimamente, se ha mostrado que ciertas \beta-quimiocinas suprimen la infección por VIH-1 de líneas de células T humanas in vitro (Cocchi, F., et al., Science (Wash. DC), 270:1811-1815 (1995)).

Las quimiocinas se unen a receptores acoplados a proteínas G con 7 dominios transmembrana (7TMS) (Murphy, P.M., Annu. Rev. Immunol., 12:593-633 (1994)). Algunos receptores conocidos para las \beta-quimiocinas o CC incluyen CCR1, que se une a MIP-1\alpha y RANTES (Neote, K., et al., Cell, 72:415-425 (1993); Gao, J.L., J. Exp. Med., 177:1421-1427 (1993)); CCR2, que se une a quimiocinas que incluyen MCP-1, MCP-2, MCP-3 y MCP-4 (Charo, I.F., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:2752-2756 (1994); Myers, S.J., et al., J. Biol. Chem., 270:5786-5792 (1995); Gong et al., J. Biol Chem 272:11682-11685 (1997); Garcia-Zepeda et al., J. Immunol. 157:5613-5626 (1996)); CCR3, que se une a quimiocinas que incluyen eotaxina, RANTES y MCP-3 (Ponath, P.D., et al., J. Exp. Med., 183:2437-2448 (1996)); CCR4, que se ha encontrado que produce señales en respuesta a MCP-1, MIP-1\alpha y RANTES (Power, C.A., et al., J. Biol. Chem., 270:19495-19500 (1995)); y CCR5, que se ha mostrado que produce señales en respuesta a MIP-1\alpha, MIP-1\beta y RANTES (Boring, L., et al., J. Biol. Chem., 271 (13):7551-7558 (1996); Raport, C.J., J. Biol. Chem., 271:17161-17166 (1996); y Samson, M. et al., Biochemistry, 35:3362-3367 (1996)).

CCR2 se expresa en la superficie de varios subconjuntos de leucocitos, y parece expresarse en dos formas ligeramente diferentes (CCR2a y CCR2b) debido al corte y empalme alternativo del ARNm que codifica para la región carboxi-terminal (Charo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2752-2756 (1994)). MCP-1 actúa sobre los monocitos, linfocitos y basófilos, induciendo quimiotaxia, liberación de gránulos, estallido respiratorio y liberación de histaminas y citocinas. Los estudios han sugerido que MCP-1 está implicado en la patología de enfermedades tales como artritis reumatoide, aterosclerosis, enfermedades granulomatosas y esclerosis múltiple (Koch, J. Clin. Invest. 90:772-79 (1992); Hosaka et al., Clin. Exp. Immunol. 97:451-457 (1994); Schwartz et al., Am. J. Cardiol. 71(6):98-14B (1993); Schimmer et al., J. Immunol. 160:1466-1471 (1998); Flory et al., Lab. Invest. 69:396-404 (1993); Gong et al., J. Exp. Med. 186:131-137 (1997)). Adicionalmente, CCR2 puede actuar como un correceptor para el VIH (Connor et al., J. Exp. Med. 185:621-628 (1997)). Por tanto, los antagonistas del receptor CCR2 pueden representar una nueva clase de importantes agentes terapéuticos.

El documento WO 97/31949 se refiere a anticuerpos que se unen al receptor (CCR2) de la proteína quimioatrayente de monocitos 1 (MCP-1). El documento da a conocer anticuerpos que se unen a CCR2 incluyendo MCPR-03, MCPR-04, MCPR-05 y MCPR-6 derivados de ratones inmunizados con péptidos sintéticos acoplados a KLH correspondientes al tercer bucle extracelular de CCR2 (aminoácidos 273-292). La tabla III del documento establece que estos anticuerpos reconocen los aminoácidos 273-292 de CCR2. J. Clin. Invest. (1999) 100:497-502 se refiere al dominio amino-terminal del receptor de quimiocinas CCR2 que actúa como correceptor para la infección por VIH-1. El documento describe un conjunto de anticuerpos específicos para el tercer dominio extracelular (aminoácidos 273-292), de los cuales se describe el anticuerpo monoclonal MCP-1RD5 como ilustrativo.

El documento WO 95/19436 se refiere a receptores de proteínas quimioatrayentes de monocitos de mamífero. El documento da a conocer ADN que codifican para los receptores de quimiocinas humanos MCP-1R y MCP-1RB.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un anticuerpo (inmunoglobulina) o un fragmento de unión a antígeno del mismo tal como se define en las reivindicaciones adjuntas. En una realización, el anticuerpo o fragmento de la invención bloquea la unión de una quimiocina (por ejemplo, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4) al receptor e inhibe una función asociada con la unión del ligando al receptor (por ejemplo, tráfico leucocitario). Por ejemplo, tal como se describe en el presente documento, anticuerpos y fragmentos de los mismos de la presente invención que se unen a CCR2 humano o de Rhesus o una parte del mismo, pueden bloquear la unión de una quimiocina (por ejemplo, MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4) al receptor e inhibir una función asociada con la unión de la quimiocina al receptor. En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal (Acm) LS132.1D9 (1D9) o un anticuerpo que puede competir con 1D9 por la unión a CCR2 humano o una parte de CCR2 humano. También se prevén fragmentos funcionales de los anticuerpos anteriores.

Tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo o fragmento funcional de la presente invención se une a CCR2 humano o una parte del mismo, e inhibe la unión del virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) al receptor, inhibiendo así una función asociada con la unión de VIH al receptor (por ejemplo, la liberación de antígenos y la infectividad del VIH). En una realización, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal 1D9 o un anticuerpo que puede competir con 1D9 por la unión a CCR2 humano o una parte de CCR2 humano.

Tal como se describe en el presente documento, un anticuerpo o fragmento funcional del mismo (por ejemplo, un fragmento de unión a antígeno) se une a CCR2 de mamífero o parte del receptor y proporciona un aumento de la intensidad de tinción fluorescente de CCR2 o composiciones que comprenden CCR2 con respecto a otros anticuerpos anti-CCR2. Tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal 1D9 o LS132.8G2 (8G2) o un anticuerpo que puede competir con 1D9 o 8G2 por la unión a CCR2 humano o una parte de CCR2 humano.

Se describe en el presente documento un método de inhibición de la interacción de una célula que porta CCR2 de mamífero (por ejemplo, humano, de primate no humano o murino) con un ligando del mismo, que comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que se une a un CCR2 de mamífero o una parte de CCR2. Las células adecuadas incluyen granulocitos, leucocitos, tales como monocitos, macrófagos, basófilos y eosinófilos, mastocitos y linfocitos incluyendo células T (por ejemplo, células CD8+, células CD4+, células CD25+, células CD45RO+), y otras células que expresan CCR2 tales como una célula recombinante que expresa CCR2 (por ejemplo, células transfectadas). Tal como se describe en el presente documento, el anticuerpo es 1D9 o un anticuerpo que puede competir con 1D9 por la unión a CCR2 humano o una parte de CCR2 humano.

Esta descripción da a conocer un método de inhibición de la interacción de una célula que porta CCR2 de mamífero con una quimiocina, que comprende poner en contacto dicha célula con una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que se une a CCR2 o una parte de dicho receptor. En una realización del método, el anticuerpo o fragmento funcional del mismo es uno cualquiera o más de 1D9, un fragmento de unión a antígeno de 1D9 o un anticuerpo o fragmento del mismo que tiene una especificidad epitópica que es igual que o similar a la de 1D9. Además, esta descripción da a conocer un método de inhibición de una función asociada con la unión de una quimiocina a CCR2, que comprende administrar una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que se une a una proteína CCR2 de mamífero o una parte de dicho receptor. En el método, el anticuerpo o fragmento funcional del mismo puede ser uno cualquiera o más de 1D9, un fragmento de unión a antígeno de 1D9 o un anticuerpo o fragmento del mismo que tiene una especificidad epitópica que es igual que o similar a la de 1D9.

Esta descripción da a conocer un método de identificación de la expresión de un CCR2 de mamífero o parte del receptor por una célula. Según el método, una composición que comprende una célula o fracción de la misma (por ejemplo, una fracción de membrana) se pone en contacto con un anticuerpo o fragmento funcional del mismo (por ejemplo, 1D9 u 8G2) que se une a una proteína CCR2 de mamífero o parte del receptor en condiciones apropiadas para la unión del anticuerpo al mismo, y se detecta la formación de un complejo entre dicho anticuerpo o fragmento y dicha proteína o parte de la misma. La detección del complejo, directa o indirectamente, indica la presencia del receptor en la célula. La descripción da a conocer un kit para su uso en la detección de la presencia de CCR2 o una parte del mismo en una muestra biológica, que comprende un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que se une a un receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero o una parte de dicho receptor, y uno o más reactivos auxiliares adecuados para detectar la presencia de un complejo entre dicho anticuerpo o fragmento y dicha proteína o parte de la misma.

También se describen en el presente documento métodos de identificación de ligandos adicionales u otras sustancias que se unen a una proteína CCR2 de mamífero, incluyendo inhibidores y/o promotores de la función de CCR2 de mamífero. Por ejemplo, pueden identificarse agentes que tienen una especificidad de unión igual que o similar a la de un anticuerpo de la presente invención o fragmento funcional del mismo mediante un ensayo de competición con dicho anticuerpo o fragmento. Por tanto, la descripción da a conocer métodos de identificación de ligandos u otras sustancias que se unen al receptor CCR2, incluyendo inhibidores (por ejemplo, antagonistas) o promotores (por ejemplo, agonistas) de la función del receptor. En una realización, se usan células que expresan de forma natural la proteína receptora CCR2 o células huésped adecuadas que se han modificado mediante ingeniería para expresar un receptor CCR2 o una variante codificados por un ácido nucleico introducido en dichas células en un ensayo para identificar y evaluar la eficacia de ligandos, inhibidores o promotores de la función del receptor. Tales células son también útiles en la evaluación de la función de la proteína o del polipéptido receptores expresados.

Por tanto, se describe en el presente documento un método de detección o identificación de un agente que se une a CCR2 de mamífero o variante de unión a ligando del mismo, que comprende combinar un agente que va a someterse a prueba, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente invención (por ejemplo, anticuerpo monoclonal 1D9, un anticuerpo que tiene una especificidad epitópica que es igual que o similar a la de 1D9, fragmentos de unión a antígeno de 1D9, anticuerpo monoclonal 8G2, un anticuerpo que tiene una especificidad epitópica que es igual que o similar a la de 8G2, y fragmentos de unión a antígeno de 8G2) y una composición que comprende una proteína CCR2 de mamífero o una variante de unión a ligando del mismo. Pueden combinarse los componentes anteriores en condiciones adecuadas para la unión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno a la proteína CCR2 de mamífero o una variante de unión a ligando del mismo, y se detecta o se mide la unión del anticuerpo o fragmento a la proteína CCR2 de mamífero o variante de unión a ligando, o bien directa o bien indirectamente, según los métodos descritos en el presente documento u otros métodos adecuados. Una disminución en la cantidad de complejo formado con respecto a un control adecuado (por ejemplo, en ausencia del agente que va a someterse a prueba) es indicativa de que el agente se une a dicho receptor o dicha variante. La composición que comprende proteína CCR2 de mamífero o una variante de unión a ligando de la misma puede ser una fracción de membrana de una célula que porta proteína CCR2 recombinante o variante de unión a ligando de la misma. El anticuerpo o fragmento del mismo puede marcarse con un marcador tal como un radioisótopo, marcador de espín, marcador antigénico, marcador enzimático, grupo fluorescente y grupo quimioluminiscente. Pueden usarse estos ensayos y similares para detectar agentes, incluyendo ligandos (por ejemplo, quimiocinas que interaccionan con CCR2) u otras sustancias, incluyendo inhibidores o promotores de la función del receptor, que pueden unirse a CCR2 y competir con los anticuerpos descritos en el presente documento por la unión al receptor.

Pueden identificarse ligandos, inhibidores o promotores de la función del receptor en un ensayo adecuado, y evaluarse además para determinar el efecto terapéutico. Pueden usarse inhibidores de la función del receptor para inhibir (reducir o evitar) la actividad del receptor, y pueden usarse ligandos y/o promotores para inducir (desencadenar o potenciar) la función normal del receptor cuando esté indicado. La presente descripción da a conocer un método de tratamiento de enfermedades inflamatorias, enfermedades autoinmunitarias, aterosclerosis y rechazo de un injerto, o infección por VIH, que comprende administrar un inhibidor de la función del receptor (por ejemplo, unión a quimiocinas o unión a VIH) a un individuo (por ejemplo, un mamífero, tal como un ser humano). La presente descripción da a conocer un método de estimulación de una función del receptor administrando un ligando o promotor novedoso a un individuo, proporcionando un nuevo enfoque para la estimulación selectiva de la función leucocitaria, que es útil, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades infecciosas y cáncer.

Se describe en el presente documento un método de inhibición de la infección por VIH de una célula que expresa un CCR2 de mamífero o parte del mismo, que comprende poner en contacto la célula con una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que se une a CCR2 de mamífero o parte del receptor e inhibe la unión e infección de VIH. En una realización particular de la invención, el anticuerpo o fragmento funcional del mismo es cualquiera de 1D9, un anticuerpo que tiene una especificidad epitópica que es igual que o similar a la de 1D9, un anticuerpo que puede competir con 1D9 por la unión a CCR2 humano y fragmentos de unión a antígeno de los mismos.

Se da a conocer un método de inhibición (por ejemplo, tratamiento) del VIH en un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que se une a CCR2 de mamífero o una parte de dicho receptor e inhibe la unión del VIH al receptor CCR2. El anticuerpo anti-CCR2 o fragmento puede administrarse solo o en combinación con uno o más agentes terapéuticos adicionales, por ejemplo, uno o más anticuerpos que se unen a un correceptor para la infección por VIH e inhibir la unión a dicho correceptor, tal como un anticuerpo anti-CCR3, anti-CCR5 y/o anti-CXCR4.

Se describe en el presente documento un método de prevención o inhibición de la infección por VIH en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que se une a CCR2 e inhibe la unión del VIH a CCR2. Según el método, la prevención de la infección por VIH incluye el tratamiento con el fin de prevenir (reducir o eliminar) la infección de nuevas células en un individuo infectado o con el fin de prevenir la infección en un individuo que puede estar, puede haber estado o ha estado expuesto al VIH. Por ejemplo, individuos tales como un individuo infectado por VIH, un feto de una mujer infectada por VIH, o un profesional sanitario pueden tratarse según el método de la presente invención.

La presente invención también engloba un método de inhibición del tráfico leucocitario en un paciente, que comprende administrar al paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo según las reivindicaciones.

La descripción da a conocer un método de inhibición o tratamiento de trastornos mediados por CCR2, tales como trastornos inflamatorios, que comprende administrar a un paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que se une a CCR2 de mamífero o parte de dicho receptor e inhibe una función mediada por CCR2. Por ejemplo, la invención se refiere a un método de inhibición o tratamiento de estenosis o reestenosis de la vasculatura que comprende administrar a un paciente una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que se une a CCR2 de mamífero o parte de dicho receptor e inhibe una función mediada por CCR2.

La presente invención se refiere además a un anticuerpo o fragmento del mismo tal como se describe en el presente documento (por ejemplo, el anticuerpo monoclonal 1D9 o un fragmento de unión a antígeno del mismo) para su uso en terapia (incluyendo profilaxis) o diagnóstico, y al uso de tal anticuerpo o fragmento para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de un trastorno mediado por CCR2, u otra enfermedad o estado inflamatorio tal como se describe en el presente documento.

Breve descripción de las figuras

Las figuras 1A-1O son perfiles de histograma de un barrido de células activadas por fluorescencia (FACS) que ilustran que los Acm 1D9 y 8G2 tiñen los transfectantes de CCR2 pero no los transfectantes de CCR5 o CCR1. Se transfectaron células huésped de linfoma pre-B murino L1/2 (también denominado en el presente documento como L1.2) con CCR2, CCR5 y CCR1 según esté indicado, y se tiñeron con anticuerpos con diferentes especificidades de receptor. Se analizó la tinción mediante citometría de flujo.

Las figuras 2A-2L son gráficos de puntos de FACS que muestran la expresión de CCR2 en la mayoría de los monocitos, una subpoblación de linfocitos y un pequeño subconjunto de granulocitos. Se tiñeron las células de sangre completa con uno de los tres Acm anti-CCR2 (5A11, generado usando un péptido que consiste en los primeros 32 aminoácidos del extremo amino-terminal de CCR2 como inmunógeno, y 1D9 y 8G2 generados tal como se describe en el presente documento usando los transfectantes de células L1/2 CCR2b como el inmunógeno). Se analizó la tinción mediante citometría de flujo, y se clasificaron las poblaciones de linfocitos, granulocitos y monocitos usando la dispersión frontal y lateral de la luz. El eje X representa la dispersión frontal de la luz (una medida del tamaño celular), y el eje Y la intensidad de fluorescencia de la tinción para CCR2. El nivel de tinción del control negativo está indicado mediante una línea.

Las figuras 3A-3I son gráficos de puntos de FACS que muestran que el Acm 1D9 tiñe una población positiva para IgE en sangre periférica (basófilos) usando una tinción bicolor para IgE y CCR2. En primer lugar se tiñeron las células de sangre completa con o bien un anticuerpo de control negativo (anti-Flag), anticuerpo anti-CCR2 1D9, o bien un anticuerpo anti-CXCR1, según esté indicado, y se detectaron mediante un conjugado anti-ratón-FITC. Se realizó una segunda tinción usando o bien PBS o bien un anticuerpo biotinilado específico para IgE o CD16, según esté indicado, y se detectó con estreptavidina-ficoeritrina. Se analizó la tinción mediante citometría de flujo.

La figura 4 ilustra que el Acm 1D9 inhibe la unión de [^{125}I]MCP-1 a membranas de células THP-1. Se incubaron 3,0 \mug de proteína de membrana de THP-1 con [^{125}I]MCP-1 0,1 nM en presencia de diversas concentraciones de 1D9 o el anticuerpo anti-CXCR3 del mismo isotipo 1C6. Se determinó la cantidad de indicador unido mediante la separación de la parte libre de la unida mediante filtración y recuento por centelleo. Se analizaron los datos para determinar el valor de CI_{50} mediante regresión no lineal usando una ecuación logística de 4 parámetros con el software KaleidaGraph.

La figura 5 ilustra que el Acm 1D9 inhibe la unión de [^{125}I]MCP-1 a PBMC humanas frescas. Se incubaron las células mononucleares de sangre periférica recién aisladas (500.000) con [^{125}I]MCP-1 0,1 nM en presencia de diversas concentraciones de 1D9 o el anticuerpo anti-CXCR3 del mismo isotipo 1C6. Se determinó la cantidad de indicador unido mediante la separación de la parte libre de la unida mediante filtración y recuento por centelleo. Se analizaron los datos para determinar el valor de CI_{50} como para la figura 4.

Las figuras 6A y 6B son gráficas que demuestran que el Acm 1D9 inhibe la quimiotaxia inducida por MCP-1, pero no la quimiotaxia inducida por RANTES, de PBMC frescas. La figura 6A muestra los resultados de ensayos de quimiotaxia de PBMC frente a MCP-1 10 nM sin anticuerpo, o 0,1 o 10 \mug/ml de 1D9 o IgG2a murina no específica. También se indica la migración no específica espontánea. La figura 6B muestra los resultados de ensayos de quimiotaxia de PBMC frente a RANTES 10 nM sin anticuerpo, 1D9 10 \muCg/ml o IgG2a murina no específica 10 \muCg/ml. También se indica migración no específica espontánea en ausencia de RANTES.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se define en las reivindicaciones adjuntas. En una realización, el anticuerpo tiene especificidad por CCR2 humano o de Rhesus o parte del mismo. En una realización, los anticuerpos (inmunoglobulinas) se producen frente a un CCR2 de mamífero recombinante y/o aislado o parte del mismo (por ejemplo, péptido) o frente a una célula huésped que expresa CCR2 de mamífero. En una realización preferida, los anticuerpos se unen específicamente a receptor(es) CCR2 humano(s) (por ejemplo, CCR2a y/o CCR2b) o una parte del/de los mismo(s), y en una realización particularmente preferida los anticuerpos tienen especificidad por un CCR2 humano endógeno o que se produce de manera natural. Tal como se usa en el presente documento, "receptor de quimiocinas CC 2" ("CCR2") se refiere al receptor de quimiocinas CC 2a y/o al receptor de quimiocinas CC 2b. Los anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos que pueden inhibir una o más funciones características de un CCR2 de mamífero, tal como una actividad de unión (por ejemplo, unión a ligando, inhibidor y/o promotor), una actividad de señalización (por ejemplo, activación de una proteína G de mamífero, inducción de un aumento rápido y transitorio en la concentración de calcio libre citosólico [Ca^{2+}]i), y/o estimulación de una respuesta celular (por ejemplo, estimulación de quimiotaxia, exocitosis o liberación de mediadores inflamatorios por los leucocitos, activación de integrinas) también están englobados por la presente invención, tales como un anticuerpo que puede inhibir la unión de un ligando (es decir, uno o más ligandos) a CCR2 y/o una o más funciones mediadas por CCR2 en respuesta a un ligando. Por ejemplo, en un aspecto, los anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos pueden inhibir (reducir o evitar) la interacción del receptor con un ligando natural, tal como MCP-1, MCP-2, MCP-3 y/o MCP-4. En otro aspecto, un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que se unen a CCR2 pueden inhibir la unión de MCP-1, MCP-2, MCP-3 y/o MCP-4 y/o VIH a un CCR2 de mamífero (por ejemplo, CCR2 humano, CCR2 de primate no humano, CCR2 murino). Los anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos de la presente invención pueden inhibir funciones mediadas por CCR2 humano, incluyendo el tráfico leucocitario, la entrada del VIH en una célula, la activación de células T, la liberación de mediadores inflamatorios y/o la desgranulación leucocitaria. Preferiblemente, los anticuerpos o fragmentos pueden unirse a CCR2 con una afinidad de al menos aproximadamente 0,1 x 10^{-9} M, preferiblemente al menos aproximadamente 1 x 10^{-9} M y más preferiblemente al menos aproximadamente 3 x 10^{-9} M. En una realización particular, los anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos demuestran inhibición de la quimiotaxia inducida por quimiocinas (por ejemplo, inducida por MCP-1) de células (por ejemplo, PBMC) a menos de aproximadamente 150 \mug/ml, preferiblemente a menos de aproximadamente 100 \mug/ml, más preferiblemente a menos de aproximadamente 50 \mug/ml, e incluso más preferiblemente a menos de aproximadamente 20 \mug/ml.

En una realización adicional de la invención, los anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos de la invención pueden inhibir la unión de un ligando de CCR2 (por ejemplo, una quimiocina) a CCR2 con una CI_{50} inferior a aproximadamente 1,0 \mug/ml, preferiblemente inferior a aproximadamente 0,05 \mug/ml y más preferiblemente inferior a aproximadamente 0,005 \mug/ml.

Se produjeron los anticuerpos monoclonales murinos específicos para CCR2, designados como 1D9 y 8G2, tal como se describe en el presente documento. En una realización preferida, los anticuerpos de la presente invención se unen a CCR2 humano, y tienen una especificidad epitópica que es igual que o similar a la del anticuerpo 8G2 o 1D9 murino descritos en el presente documento. Pueden identificarse los anticuerpos con una especificidad epitópica que es igual que o similar a la del anticuerpo monoclonal 1D9 murino mediante su capacidad para competir con el anticuerpo monoclonal 1D9 murino por la unión a CCR2 humano (por ejemplo, a células que portan CCR2 humano, tales como transfectantes que portan CCR2, células CD8+, células CD4+, células CDR45RO+, células CD25+, monocitos, células dendríticas, macrófagos y basófilos). De manera similar, pueden identificarse los anticuerpos con una especificidad epitópica que es igual que o similar a la del anticuerpo monoclonal 8G2 murino mediante su capacidad para competir con el anticuerpo monoclonal 8G2 murino por la unión a CCR2 humano. Usando quimeras del receptor (Rucker et al., Cell 87:437-446 (1996)), el sitio de unión de los Acm 1D9 y 8G2 se ha mapeado en el dominio amino-terminal del receptor de quimiocinas CC 2 humano, específicamente en un epítopo que comprende desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 30 de la proteína. Usando estas u otras técnicas adecuadas, pueden identificarse los anticuerpos que tienen una especificidad epitópica que es igual que o similar a la de un anticuerpo de la presente invención. Los Acm 1D9 y 8G2 tienen especificidad epitópica por el dominio amino-terminal del receptor CCR2, por ejemplo, desde aproximadamente el aminoácido número 1 hasta aproximadamente el aminoácido número 30 de la proteína receptora. Por tanto, la invención se refiere a un anticuerpo o parte funcional del mismo que se une al dominio amino-terminal o parte del mismo del receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero, y particularmente a un epítopo que comprende desde aproximadamente el aminoácido 1 hasta aproximadamente el aminoácido 30 del receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero.

La invención se refiere también a un anticuerpo biespecífico, o fragmento funcional del mismo (por ejemplo,
F(ab')_{2}), que tienen una especificidad epitópica igual o similar a la de al menos dos de los anticuerpos descritos en el presente documento (véanse, por ejemplo, la patente estadounidense número 5.141.736 (Iwasa et al.), las patentes estadounidenses números 4.444.878, 5.292.668, 5.523.210 (todas concedidas a Paulus et al.) y la patente estadounidense número 5.496.549 (Yamazaki et al.). Por ejemplo, un anticuerpo biespecífico de la presente invención puede tener una especificidad epitópica igual o similar a la de los Acm 1D9 y 8G2, por ejemplo, se une al dominio amino-terminal, o parte del mismo, de la proteína CCR2 de mamífero.

Se depositaron líneas celulares de hibridoma que producen anticuerpos según la presente invención el 17 de julio de 1998, en nombre de LeukoSite, Inc., 215 First Street, Cambridge, MA 02142, EE.UU., en la Colección Americana de Cultivos Tipo, 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110, EE.UU., con los números de registro HB-12549 (1D9) y HB-12550 (8G2). La presente invención también se refiere a las líneas celulares de hibridoma depositadas con el número de registro ATCC HB-12549 y el número de registro ATCC HB-12550, así como a los anticuerpos monoclonales producidos por las líneas celulares de hibridoma depositadas con los números de registro ATCC HB-12549 y HB-12550.

Los anticuerpos de la presente invención pueden ser policlonales o monoclonales, y el término "anticuerpo" pretende englobar tanto anticuerpos policlonales como monoclonales. Además, se entiende que los métodos descritos en el presente documento que utilizan 8G2 también pueden utilizar fragmentos funcionales (por ejemplo, fragmentos de unión a antígeno) de 8G2, anticuerpos que tienen una especificidad epitópica igual o similar a la de 8G2, y combinaciones de los mismos, opcionalmente en combinación con anticuerpos o fragmentos que tienen una especificidad epitópica que no es igual que o similar a 8G2; de manera similar, los métodos descritos como que utilizan 1D9 también pueden utilizar fragmentos funcionales de 1D9, anticuerpos que tienen una especificidad epitópica igual o similar a la de 1D9, y combinaciones de los mismos, opcionalmente en combinación con anticuerpos o fragmentos que tienen una especificidad epitópica que no es igual que o similar a 1D9. Pueden producirse los anticuerpos de la presente invención frente a un inmunógeno apropiado, tal como proteína CCR2 de mamífero recombinante y/o aislada o parte de la misma, o moléculas sintéticas, tales como péptidos sintéticos. En una realización preferida, pueden usarse células que expresan el receptor, tales como células transfectadas, como inmunógenos o en una selección de anticuerpos que se unen al receptor.

Los anticuerpos de la presente invención, y fragmentos de los mismos, son útiles en aplicaciones terapéuticas, de diagnóstico y de investigación tal como se describe en el presente documento. La presente invención engloba un anticuerpo o parte funcional del mismo de la presente invención (por ejemplo, Acm 1D9 o 8G2, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos) para su uso en terapia (incluyendo profilaxis) o diagnóstico (por ejemplo, de enfermedades o estados particulares tal como se describe en el presente documento), y el uso de tales anticuerpos o partes funcionales de los mismos para la fabricación de un medicamento para su uso en el tratamiento de enfermedades o estados tal como se describe en el presente documento.

La preparación del antígeno de inmunización y la producción de anticuerpos policlonales y monoclonales pueden realizarse tal como se describe en el presente documento, o usando otras técnicas adecuadas. Se ha descrito una variedad de métodos (véanse por ejemplo, Kohler et al., Nature, 256: 495-497 (1975) y Eur. J. Immunol. 6: 511-519 (1976); Milstein et al., Nature 266: 550-552 (1977); Koprowski et al., la patente estadounidense número 4.172.124; Harlow, E. y D. Lane, 1988, Antibodies: A Laboratory Manual, (Cold Spring Harbor Laboratory: Cold Spring Harbor, NY); Current Protocols In Molecular Biology, Vol. 2 (Suplemento 27, verano del 94), Ausubel, F.M. et al., Eds., (John Wiley & Sons: Nueva York, NY), Capítulo 11, (1991)). Generalmente, puede producirse un hibridoma fusionando una línea celular inmortal adecuada (por ejemplo, una línea celular de mieloma tal como SP2/0) con células que producen anticuerpos. Las células que producen anticuerpos, preferiblemente las del bazo o los ganglios linfáticos, se obtienen de animales inmunizados con el antígeno de interés. Las células fusionadas (hibridomas) pueden aislarse usando condiciones de cultivo selectivas, y clonarse mediante dilución limitante. Pueden seleccionarse las células que producen anticuerpos con las propiedades de unión deseadas mediante un ensayo adecuado (por ejemplo, ELISA).

Pueden usarse otros métodos adecuados de producción o aislamiento de anticuerpos que se unen a CCR2, incluyendo anticuerpos humanos o artificiales, que incluyen, por ejemplo, métodos que seleccionan anticuerpos recombinantes (por ejemplo, Fab o Fv de cadena sencilla) de una biblioteca, o que se basan en la inmunización de animales transgénicos (por ejemplo, ratones) que pueden producir un repertorio de anticuerpos humanos (véanse por ejemplo, Jakobovits et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90: 2551-2555 (1993); Jakobovits et al., Nature, 362: 255-258 (1993); Lonberg et al., la patente estadounidense número 5.545.806; Surani et al., la patente estadounidense número 5.545.807).

Los anticuerpos de cadena sencilla, y anticuerpos quiméricos, humanizados o primatizados (injertados con CDR), así como los anticuerpos de cadena sencilla quiméricos o injertados con CDR, y similares, que comprenden partes derivadas de diferentes especies, también están englobados por la presente invención y el término "anticuerpo". Las diversas partes de estos anticuerpos pueden unirse entre sí químicamente mediante técnicas convencionales, o pueden prepararse como una proteína contigua usando técnicas de ingeniería genética. Por ejemplo, pueden expresarse ácidos nucleicos que codifican para una cadena quimérica o humanizada para producir una proteína contigua. Véanse, por ejemplo, Cabilly et al., la patente estadounidense número 4.816.567; Cabilly et al., la patente europea número 0.125.023 B1; Boss et al., la patente estadounidense número 4.816.397; Boss et al., la patente europea número 0.120.694 B1; Neuberger, M.S. et al., documento WO 86/01533; Neuberger, M.S. et al., la patente europea número 0.194.276 B1; Winter, la patente estadounidense número 5.225.539; Winter, la patente europea número 0.239.400 B1; y Queen et al., las patentes estadounidenses números 5.585.089, 5.698.761 y 5.698.762. Véanse también, Newman, R. et al., BioTechnology, 10: 1455-1460 (1992), con respecto a los anticuerpos primatizados, y Ladner et al., la patente estadounidense número 4.946.778 y Bird, R.E. et al., Science, 242: 423-426 (1988)) con respecto a los anticuerpos de cadena sencilla.

Además, también pueden producirse fragmentos funcionales de anticuerpos, incluyendo fragmentos de anticuerpos quiméricos, humanizados, primatizados o de cadena sencilla. Los fragmentos funcionales de los anticuerpos anteriores conservan al menos una función de unión y/o función de modulación del anticuerpo de longitud completa del que se derivan. Los fragmentos funcionales preferidos conservan una función de unión a antígeno de un correspondiente anticuerpo de longitud completa (por ejemplo, la capacidad para unirse a un CCR2 de mamífero). Los fragmentos funcionales particularmente preferidos conservan la capacidad para inhibir una o más funciones características de un CCR2 de mamífero, tales como una actividad de unión, una actividad de señalización, y/o estimulación de una respuesta celular. Por ejemplo, en una realización, un fragmento funcional puede inhibir la interacción de CCR2 con uno o más de sus ligandos (por ejemplo, MCP-1, MCP-2, MCP-3 y/o MCP-4) y/o pueden inhibir una o más funciones mediadas por el receptor, tales como tráfico leucocitario, entrada del VIH en células, activación de células T, liberación de mediadores inflamatorios y/o desgranulación leucocitaria.

Por ejemplo, los fragmentos de anticuerpos que pueden unirse a un receptor CCR2 de mamífero o parte del mismo, incluyendo, pero sin limitarse a, fragmentos Fv, Fab, Fab' y F(ab')_{2}, están englobados por la invención. Tales fragmentos pueden producirse, por ejemplo, mediante escisión enzimática o mediante técnicas recombinantes. Por ejemplo, la escisión de de papaína o pepsina puede generar fragmentos Fab o F(ab')_{2}, respectivamente. También pueden producirse anticuerpos en una variedad de formas truncadas usando genes de anticuerpos en los que se ha introducido uno o más codones de terminación en el sentido de 5' del sitio de terminación natural. Por ejemplo, puede diseñarse un gen quimérico que codifica para una parte de cadena pesada de F(ab')_{2} para que incluya secuencias de ADN que codifican para el dominio CH_{1} y la región bisagra de la cadena pesada.

La expresión "inmunoglobulina humanizada" tal como se usa en el presente documento se refiere a una inmunoglobulina que comprende partes de inmunoglobulinas de diferente origen, en la que al menos una parte es de origen humano. Por consiguiente, la presente invención se refiere a una inmunoglobulina humanizada que se une a CCR2 de mamífero (por ejemplo, CCR2 humano, CCR2 murino), comprendiendo dicha inmunogobulina una región de unión a antígeno de origen no humano (por ejemplo, roedores) y al menos una parte de una inmunoglobulina de origen humano (por ejemplo, una región de entramado humana, una región constante humana o parte de las mismas). Por ejemplo, el anticuerpo humanizado puede comprender partes derivadas de una inmunoglobulina de origen no humano con la especificidad requerida, tal como un ratón, y de secuencias de inmunoglobulina de origen humano (por ejemplo, una inmunoglobulina quimérica), unidas entre sí químicamente mediante técnicas convencionales (por ejemplo, sintéticas) o preparado como un polipéptido contiguo usando técnicas de ingeniería genética (por ejemplo, puede expresarse ADN que codifica para las partes de proteína del anticuerpo quimérico para producir una cadena polipeptídica contigua). Otro ejemplo de una inmunoglobulina humanizada de la presente invención es una inmunoglobulina que contiene una o más cadenas de inmunoglobulina que comprenden una CDR de origen no humano (por ejemplo, una o más CDR derivadas de un anticuerpo de origen no humano) y una región de entramado derivada de una cadena ligera y/o pesada de origen humano (por ejemplo, anticuerpos injertados con CDR con o sin cambios de entramado). En una realización, la inmunoglobulina humanizada puede competir con el anticuerpo monoclonal 8G2 o 1D9 murino por la unión a CCR2 humano. En una realización preferida, la región de unión a antígeno de la inmunoglobulina humanizada (a) se deriva del anticuerpo monoclonal 1D9 (por ejemplo, como en una inmunoglobulina humanizada que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de 1D9 y CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de 1D9) o (b) se deriva del anticuerpo monoclonal 8G2 (por ejemplo, como en una inmunoglobulina humanizada que comprende CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena ligera de 8G2 y CDR1, CDR2 y CDR3 de la cadena pesada de 8G2). Los anticuerpos de cadena sencilla injertados con CDR o quiméricos también están englobados por la expresión inmunoglobulina humanizada.

Tales inmunoglobulinas humanizadas pueden producirse usando ácidos nucleicos recombinantes y/o sintéticos para preparar genes (por ejemplo, ADNc) que codifica para la cadena humanizada deseada. Por ejemplo, pueden construirse secuencias de ácido nucleico (por ejemplo, ADN) que codifican para regiones variables humanizadas usando métodos de mutagénesis por PCR para alterar secuencias de ADN que codifican una cadena humana o humanizada, tal como un molde de ADN de una región variable previamente humanizada (véanse por ejemplo, Kamman, M., et al., Nucl. Acids Res., 17: 5404 (1989)); Sato, K., et al., Cancer Research, 53: 851-856 (1993); Daugherty, B.L. et al., Nucleic Acids Res., 19(9): 2471-2476 (1991); y Lewis, A.P. y J.S. Crowe, Gene, 101:297-302 (1991)). Usando estos u otros métodos adecuados, también pueden producirse fácilmente variantes. En una realización, pueden mutagenizarse regiones variables clonadas, y pueden seleccionarse secuencias que codifican para variantes con la especificidad deseada (por ejemplo, de una biblioteca de fago; véanse por ejemplo, Krebber et al., documento U.S. 5.514.548; Hoogenboom et al., documento WO 93/06213, publicado el 1 de abril de 1993)). También se proporcionan anticuerpos antiidiotípicos. Los anticuerpos antiidiotípicos reconocen determinantes antigénicos asociados con el sitio de unión a antígeno de otro anticuerpo. Los anticuerpos antiidiotípicos pueden prepararse frente a un segundo anticuerpo mediante inmunización de un animal de la misma especie y preferiblemente de la misma raza, que el animal usado para producir el segundo anticuerpo. Véase por ejemplo, la patente estadounidense número 4.699.880.

La presente invención también se refiere a las líneas celulares de hibridoma depositadas con los números de registro ATCC HB-12549 y HB-12550, así como a los anticuerpos monoclonales producidos por las líneas celulares de hibridoma depositadas con los números de registro ATCC HB-12549 y HB-12550. Las líneas celulares de la presente invención tienen usos distintos de la producción de los anticuerpos monoclonales. Por ejemplo, las líneas celulares de la presente invención pueden fusionarse con otras células (tales como células linfoblastoides humanas, de heteromieloma de ratón y humano, de mieloma de ratón y de mieloma humano marcadas con fármacos de manera adecuada) para producir hibridomas adicionales y así proporcionar la transferencia de los genes que codifican para los anticuerpos monoclonales. Además, las líneas celulares pueden usarse como fuente de ácidos nucleicos que codifican para las cadenas de inmunoglobulina anti-CCR2, que pueden aislarse y expresarse (por ejemplo, con la transferencia a otras células usando cualquier técnica adecuada (véanse por ejemplo, Cabilly et al., la patente estadounidense número 4.816.567; Winter, la patente estadounidense número 5.225.539)). Por ejemplo, pueden aislarse los clones que comprenden una cadena ligera o pesada de anti-CCR2 reorganizada (por ejemplo, mediante PCR) o pueden prepararse bibliotecas de ADNc a partir del ARNm aislado de las líneas celulares, y pueden aislarse clones de ADNc que codifican para una cadena de inmunoglobulina anti-CCR2. Por tanto, pueden obtenerse ácidos nucleicos que codifican para las cadenas ligeras y/o pesadas de los anticuerpos o partes de los mismos y pueden usarse según técnicas de ADN recombinante para la producción de la inmunoglobulina específica, cadena de inmunoglobulina, o variantes de las mismas (por ejemplo, inmunoglobulinas humanizadas) en una variedad de células huésped o en un sistema de traducción in vitro. Por ejemplo, los ácidos nucleicos, incluyendo los ADNc, o derivados de los mismos que codifican para variantes tales como una inmunoglobulina humanizada o cadena de inmunoglobulina, pueden colocarse en vectores procariotas o eucariotas adecuados (por ejemplo, vectores de expresión) e introducirse en una célula huésped adecuada mediante un método apropiado (por ejemplo, transformación, transfección, electroporación, infección), de tal manera que el ácido nucleico se una operativamente a uno o más elementos de control de la expresión (por ejemplo, en el vector o integrado en el genoma de la célula huésped). Para la producción, las células huésped pueden mantenerse en condiciones adecuadas para la expresión (por ejemplo, en presencia de inductor, medios adecuados complementados con sales, factores de crecimiento, antibióticos, complementos nutricionales apropiados, etc.), mediante lo cual se produce el polipéptido codificado. Si se desea, la proteína codificada puede recuperarse y/o aislarse (por ejemplo, de las células huésped, medio, leche). Se apreciará que el método de producción engloba la expresión en una célula huésped de un animal transgénico (véase por ejemplo, el documento WO 92/03918, GenPharm International, publicado el 19 de marzo de 1992).

Tal como se describe en el presente documento, los anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos de la presente invención pueden bloquear (inhibir) la unión de un ligando a CCR2 y/o inhibir una función asociada con la unión del ligando al CCR2. Tal como se trata a continuación, pueden usarse diversos métodos para evaluar la inhibición de la unión de un ligando a CCR2 y/o una función asociada con la unión del ligando al receptor.

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Ensayos de unión

Tal como se usa en el presente documento "proteína CCR2 de mamífero" se refiere a proteínas CCR2 de mamífero endógenas o que se producen de manera natural y a proteínas que tienen una secuencia de aminoácidos que es igual a la de la correspondiente proteína CCR2 de mamífero endógena o que se produce de manera natural (por ejemplo, proteínas recombinantes). En consecuencia, tal como se define en el presente documento, la expresión incluye proteína receptora madura, variantes polimórficas o alélicas, y otras isoformas de un CCR2 de mamífero (por ejemplo, producidas mediante corte y empalme alternativo u otros procesos celulares), y formas modificadas y no modificadas de las anteriores (por ejemplo, glicosiladas, no glicosiladas). Las proteínas CCR2 de mamífero puede aislarse y/o las proteínas recombinantes (incluyendo las proteínas producidas sintéticamente). Las proteínas CCR2 de mamíferos endógenas o que se producen de manera natural incluyen las proteínas de tipo natural tales como CCR2 maduro, variantes polimórficas o alélicas y otras isoformas que se producen de manera natural en mamíferos (por ejemplo, seres humanos, primates no humanos), tal como las formas CCR2a y CCR2b de la proteína receptora que se producen mediante corte y empalme alternativo del extremo carboxi-terminal de la proteína. Tales proteínas pueden recuperarse o aislarse de una fuente que produce de manera natural CCR2 de mamífero, por ejemplo. Estas proteínas y proteína CCR2 de mamífero que tienen la misma secuencia de aminoácidos que un CCR2 de mamífero correspondiente endógeno o que se produce de manera natural, se denominan por el nombre del mamífero correspondiente. Por ejemplo, cuando el mamífero correspondiente es un ser humano, la proteína se designa como una proteína CCR2 humana (por ejemplo, un CCR2 humano recombinante producido en una célula huésped adecuada).

Las "variantes funcionales" de las proteínas CCR2 de mamífero incluyen fragmentos funcionales, proteínas mutantes funcionales y/o proteínas de fusión funcionales (por ejemplo, producidas mediante mutagénesis y/o técnicas recombinantes). Generalmente, los fragmentos o partes de proteínas CCR2 de mamífero incluyen aquellos que tienen una deleción (es decir, una o más deleciones) de un aminoácido (es decir, uno o más aminoácidos) con respecto a la proteína CCR2 de mamífero madura (tal como deleciones N-terminal, C-terminal o internas). También se prevén los fragmentos o partes en los que se han delecionado sólo aminoácidos contiguos o en los que se han delecionado aminoácidos no contiguos con respecto a la proteína CCR2 de mamífero madura.

Generalmente, los mutantes de las proteínas CCR2 de mamífero incluyen variantes naturales o artificiales de una proteína CCR2 de mamífero que difieren mediante la adición, deleción y/o sustitución de uno o más residuos de aminoácido contiguos o no contiguos (por ejemplo, quimeras del receptor). Tales mutaciones pueden estar en una región conservada o región no conservada (en comparación con otros receptores de quimiocinas CXC y/o CC), región extracelular, citoplásmica o transmembrana, por ejemplo.

Generalmente, las proteínas de fusión engloban polipéptidos que comprenden un CCR2 de mamífero (por ejemplo, CCR2 humano) como un primer resto, unido mediante un enlace peptídico a un segundo resto que no aparece en el CCR2 de mamífero tal como se encuentra en la naturaleza. Por tanto, el segundo resto puede ser un aminoácido, oligopéptido o polipéptido. El primer resto puede estar en una ubicación N-terminal, ubicación C-terminal o de manera interna en la proteína de fusión. En una realización, la proteína de fusión comprende un ligando de afinidad (por ejemplo, una enzima, un antígeno, etiqueta epitópica) como el primer resto, y un segundo resto que comprende una secuencia ligadora y CCR2 humano o una parte del mismo.

Una "parte o fragmento funcional", un "mutante funcional" y/o una "proteína de fusión funcional" de una proteína CCR2 de mamífero se refiere a una proteína o polipéptido aislado y/o recombinante que tiene al menos una función característica de una proteína CCR2 de mamífero tal como se describe en el presente documento, tal como una actividad de unión, una actividad de señalización y/o capacidad para estimular una respuesta celular. Las variantes funcionales preferidas pueden unirse a un ligando (es decir, uno o más ligandos tales como MCP-1, MCP-2, MCP-3 y/o MCP-4), y se denominan en el presente documento como "variantes de unión a ligando".

En una realización, una variante funcional de CCR2 de mamífero comparte una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 85% con dicho CCR2 de mamífero, preferiblemente una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 90%, y más preferiblemente una identidad de secuencia de al menos aproximadamente el 95% con dicho CCR2 de mamífero. El ácido nucleico y las secuencias de aminoácidos de CCR2a y CCR2b humanos se describen en la patente estadounidense número 5.707.815. La identidad de secuencia puede determinarse usando un programa adecuado, tal como el programa Blastx (versión 1.4), usando parámetros apropiados, tales como los parámetros por defecto. En una realización, los parámetros para la búsqueda Blastx son matrices de puntuación BLOSUM62, W=3. En otra realización, una variante funcional comprende una secuencia de ácido nucleico que es diferente de la molécula de ácido nucleico que se produce de manera natural pero que, debido a la degeneración del código genético, codifica para CCR2 de mamífero o una parte del mismo.

Una composición que comprende un CCR2 de mamífero aislado y/o recombinante o variante funcional del mismo puede mantenerse en condiciones adecuadas para la unión, el CCR2 de mamífero o variante se pone en contacto con un anticuerpo o fragmento que va a someterse a prueba, y se detecta la unión o se mide directa o indirectamente. En una realización, se usan células que expresan de forma natural CCR2 o células que comprenden una secuencia de ácido nucleico recombinante que codifica para un CCR2 de mamífero o variante del mismo. Las células se mantienen en condiciones apropiadas para la expresión del receptor. Las células se ponen en contacto con un anticuerpo o fragmento en condiciones adecuadas para la unión (por ejemplo, en un tampón de unión adecuado), y se detecta la unión mediante técnicas convencionales. Para determinar la unión, puede determinarse el grado de unión con respecto a un control adecuado (por ejemplo, comparado con el fondo determinado en ausencia de anticuerpo, comparado con la unión de un segundo anticuerpo (es decir, un patrón), comparado con la unión de anticuerpo a células no transfectadas). Puede usarse una fracción celular, tal como una fracción de membrana, que contiene el receptor o liposomas que comprenden el receptor en lugar de células completas.

En una realización, el anticuerpo se marca con un marcador adecuado (por ejemplo, marcador fluorescente, marcador isotópico, marcador antigénico o epitópico, marcador enzimático), y se determina la unión mediante la detección del marcador. En otra realización, el anticuerpo unido puede detectarse mediante un segundo anticuerpo marcado. Puede evaluarse la especificidad de unión mediante competencia o sustitución, por ejemplo, usando anticuerpo no marcado o un ligando como competidor.

También pueden usarse ensayos de inhibición de la unión para identificar anticuerpos o fragmentos de los mismos que se unen a CCR2 e inhibir la unión de otro compuesto tal como un ligando (por ejemplo, MCP-1, MCP-2, MCP-3 y/o MCP-4) a CCR2 o una variante funcional. Por ejemplo, puede llevarse a cabo un ensayo de unión en el que se detecta o se mide una reducción en la unión de un ligando de CCR2 (en presencia de un anticuerpo), en comparación con la unión del ligando en ausencia del anticuerpo. Una composición que comprende un CCR2 de mamífero aislado y/o recombinante o variante funcional del mismo pueden ponerse en contacto con el ligando y el anticuerpo simultáneamente, o uno después del otro, en cualquier orden. Una reducción en el grado de la unión del ligando en presencia del anticuerpo, es indicativa de la inhibición de la unión por el anticuerpo. Por ejemplo, la unión del ligando podría disminuir o suprimirse.

En una realización, se monitoriza la inhibición directa de la unión de un ligando (por ejemplo, una quimiocina tal como MCP-1) a un CCR2 de mamífero o variante del mismo por un anticuerpo o fragmento. Por ejemplo, puede monitorizarse la capacidad de un anticuerpo para inhibir la unión de MCP-1 marcado con ^{125}I, MCP-2 marcado con ^{125}I, MCP-3 marcado con ^{125}I o MCP-4 marcado con ^{125}I a CCR2 de mamífero. Una ensayo de este tipo puede realizarse usando células adecuadas que portan CCR2 o una variante funcional del mismo, tal como células sanguíneas aisladas (por ejemplo, células T, PBMC) o una línea celular adecuada que expresa de manera natural CCR2, o una línea celular que contiene ácido nucleico que codifica para un CCR2 de mamífero, o una fracción de membrana de dichas células, por ejemplo.

Están disponibles otros métodos de identificación de la presencia de un anticuerpo que se une a CCR2, tales como otros ensayos de unión adecuados, o métodos que monitorizan acontecimientos que se desencadenan por la unión al receptor, incluyendo la función de señalización y/o la estimulación de una respuesta celular (por ejemplo, tráfico leucocitario).

Se entenderá que puede evaluarse el efecto inhibidor de los anticuerpos de la presente invención en un ensayo de inhibición de la unión. La competencia entre anticuerpos por unirse al receptor también puede evaluarse en el método. Los anticuerpos que se identifican de esta manera pueden evaluarse además para determinar si, posterior a la unión, actúan para inhibir otras funciones de CCR2 y/o para evaluar su utilidad terapéutica.

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Ensayos de señalización

La unión de un ligando o promotor, tal como un agonista, a CCR2 puede dar como resultado la señalización por este receptor acoplado a proteínas G, y se estimula la actividad de las proteínas G así como de otras moléculas de señalización intracelular. La inducción de la función de señalización por un compuesto (por ejemplo, un anticuerpo o fragmento del mismo) puede monitorizarse usando cualquier método adecuado. Puede usarse un ensayo de este tipo para identificar agonistas de anticuerpo de CCR2. Puede determinarse la actividad inhibidora de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo usando un ligando o promotor en el ensayo, y evaluando la capacidad del anticuerpo para inhibir la actividad inducida por el ligando o promotor.

Puede someterse a ensayo la actividad de las proteínas G, tal como la hidrólisis de GTP en GDP, o acontecimientos de señalización posteriores desencadenados por la unión al receptor, tal como la inducción de un aumento rápido y transitorio en la concentración de calcio libre intracelular (citosólico) [Ca^{2+}]i, mediante métodos conocidos en la técnica u otros métodos adecuados (véanse por ejemplo, Neote, K. et al., Cell, 72: 415-425 1993); Van Riper et al., J. Exp. Med., 177; 851-856 (1993); Dahinden, C.A. et al., J. Exp. Med, 179: 751-756 (1994)).

Por ejemplo, puede usarse el ensayo funcional de Sledziewski et al. que usa receptores híbridos acoplados a proteínas G para monitorizar la capacidad de un ligando o promotor para unirse al receptor y activar una proteína G (Sledziewski et al., patente estadounidense número 5.284.746, cuyas enseñanzas se incorporan al presente documento como referencia).

Tales ensayos pueden realizarse en presencia del anticuerpo o fragmento del mismo que va a evaluarse, y se determina la capacidad del anticuerpo o fragmento para inhibir la actividad inducida por el ligando o promotor usando métodos conocidos y/o los métodos descritos en el presente documento.

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Quimiotaxia y ensayos de estimulación celular

También pueden usarse ensayos de quimiotaxia para evaluar la capacidad de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo para bloquear la unión de un ligando a CCR2 de mamífero o variante funcional del mismo y/o inhibir una función asociada con la unión del ligando al receptor. Estos ensayos se basan en la migración funcional de células in vitro o in vivo inducida por un compuesto. Puede evaluarse la quimiotaxia según se describe en los ejemplos, por ejemplo, en un ensayo que utiliza una placa para quimiotaxia de 96 pocillos, o usando otros métodos reconocidos en la técnica para evaluar la quimiotaxia. Por ejemplo, se describe el uso de un ensayo de quimiotaxia transendotelial in vitro por Springer et al. (Springer et al., documento WO 94/20142, publicado el 15 de septiembre de 1994, cuyas enseñanzas se incorporan al presente documento como referencia; véase también Berman et al., Immunol. Invest. 17: 625-677 (1988)). También se ha descrito la migración a través del endotelio al interior de geles de colágeno (Kavanaugh et al., J. Immunol., 146: 4149-4156 (1991)). Pueden usarse transfectantes estables de células pre-B L1-2 de ratón o de otras células huésped adecuadas que pueden dar quimiotaxia en ensayos de quimiotaxia, por ejemplo.

Generalmente, los ensayos de quimiotaxia monitorizan el movimiento direccional o migración de una célula adecuada (tal como un leucocito (por ejemplo, linfocito, eosinófilo, basófilo)) al interior de o a través de una barrera (por ejemplo, el endotelio, un filtro), hacia el aumento de los niveles de un compuesto, desde una primera superficie de la barrera hacia una segunda superficie opuesta. Las membranas o filtros proporcionan barreras convenientes, de tal manera que se monitoriza el movimiento direccional o migración de una célula adecuada al interior de o a través de un filtro, hacia el aumento de los niveles de un compuesto, desde una primera superficie del filtro hacia una segunda superficie opuesta del filtro. En algunos ensayos, se recubre la membrana con una sustancia para facilitar la adhesión, tal como ICAM-1, fibronectina o colágeno. Tales ensayos proporcionan una aproximación in vitro del "asentamiento" leucocitario.

Por ejemplo, puede detectarse o medirse la inhibición de la migración de células en un contenedor adecuado (un medio de contención), desde una primera cámara al interior de o a través de una membrana microporosa hacia una segunda cámara que contiene un anticuerpo que va a someterse a prueba, y que está dividida de la segunda cámara por la membrana. Se selecciona una membrana adecuada, que tiene un tamaño de poro adecuado, para monitorizar la migración específica en respuesta al compuesto, incluyendo, por ejemplo, nitrocelulosa, policarbonato. Por ejemplo, pueden usarse tamaños de poro de aproximadamente 3-8 micras, y preferiblemente de aproximadamente 5-8 micras. El tamaño de poro puede ser uniforme en un filtro o estar dentro de un intervalo de tamaños de poro adecuados.

Para evaluar la migración y la inhibición de la migración, pueden determinarse la distancia de migración en el interior del filtro, el número de células que cruzan el filtro que permanecen adheridas a la segunda superficie del filtro, y/o el número de células que se acumulan en la segunda cámara usando técnicas convencionales (por ejemplo, microscopía). En una realización, las células se marcan con un marcador detectable (por ejemplo, radioisótopo, marcador fluorescente, antígeno o marcador epitópico), y puede evaluarse la migración en presencia y ausencia del anticuerpo o fragmento determinando la presencia del marcador adherido a la membrana y/o presente en la segunda cámara usando un método apropiado (por ejemplo, detectando la radioactividad, fluorescencia, inmunoensayo). Puede determinarse el grado de migración inducida por un agonista de anticuerpo con respecto a un control adecuado (por ejemplo, comparado con la migración de fondo determinada en ausencia del anticuerpo, comparado con el grado de migración inducida por un segundo compuesto (es decir, un patrón), comparado con la migración de células no transfectadas inducida por el anticuerpo).

En una realización, particularmente para células T, monocitos o células que expresan un CCR2 de mamífero, puede monitorizarse la migración transendotelial. En esta realización, se evalúa la transmigración a través de una capa de células endoteliales. Para preparar la capa de células, pueden cultivarse células endoteliales sobre una membrana o filtro microporoso, opcionalmente recubierto con una sustancia tal como colágeno, fibronectina, u otras proteínas de la matriz extracelular, para facilitar la fijación de las células endoteliales. Preferiblemente, se cultivan las células endoteliales hasta que se forma una monocapa confluente. Puede estar disponible una variedad de células endoteliales de mamífero para la formación de monocapas, incluyendo por ejemplo, endotelio de vena, arteria o microvascular, tal como células endoteliales de vena umbilical humana (Clonetics Corp, San Diego, CA). Para someter a ensayo la quimiotaxia en respuesta a un receptor de mamífero particular, se prefieren células endoteliales del mismo mamífero; sin embargo, también pueden usarse células endoteliales de una especie o género de mamífero heterólogo.

Generalmente, el ensayo se realiza detectando la migración direccional de células al interior de o a través de una membrana o filtro, en un sentido hacia el aumento de los niveles de un compuesto, desde una primera superficie del filtro hacia una segunda superficie opuesta del filtro, en el que el filtro contiene una capa de células endoteliales sobre una primera superficie. La migración direccional se produce desde la zona adyacente a la primera superficie, al interior de o a través de la membrana, hacia un compuesto situado en el lado opuesto del filtro. La concentración de compuesto presente en la zona adyacente a la segunda superficie, es mayor que en la zona adyacente a la primera superficie.

En un método usado para someter a prueba un inhibidor de anticuerpo, puede ponerse una composición que comprende células que pueden migrar y que expresan un receptor CCR2 de mamífero en la primera cámara. Se pone una composición que comprende uno o más ligandos o promotores que pueden inducir la quimiotaxia de las células en la primera cámara (que tiene función quimioatrayente) en la segunda cámara. Preferiblemente, justo antes de que se pongan las células en la primera cámara, o simultáneamente con las células, se pone una composición que comprende el anticuerpo que va a someterse a prueba, preferiblemente, en la primera cámara. Los anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos que pueden unirse al receptor e inhibir la inducción de quimiotaxia, por un ligando o promotor, de las células que expresan un CCR2 de mamífero en este ensayo son inhibidores de la función del receptor (por ejemplo, inhibidores de la función estimuladora). Una reducción en el grado de migración inducida por el ligando o promotor en presencia del anticuerpo o fragmento es indicativa de actividad inhibidora. Podrían realizarse estudios de unión (véase anteriormente) por separado para determinar si la inhibición es el resultado de la unión del anticuerpo al receptor o se produce a través de un mecanismo diferente.

A continuación se describen ensayos in vivo que monitorizan la infiltración leucocitaria de un tejido, en respuesta a la inyección de un compuesto (por ejemplo, quimiocina o anticuerpo) en el tejido (véase modelos de inflamación). Estos modelos de asentamiento in vivo miden la capacidad de las células para responder a un ligando o promotor mediante emigración y quimiotaxia a un sitio de inflamación y evalúan la capacidad de un anticuerpo o fragmento del mismo para bloquear esta emigración.

Además de los métodos descritos, pueden evaluarse los efectos de un anticuerpo o fragmento sobre la función estimuladora de CCR2 monitorizando las respuestas celulares inducidas por el receptor activo, usando células huésped adecuadas que contienen el receptor.

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Identificación de ligandos adicionales, inhibidores y/o promotores de la función de CCR2 de mamífero

Los ensayos descritos anteriormente, que pueden usarse para evaluar la unión y función de los anticuerpos y fragmentos de la presente invención, pueden adaptarse para identificar ligandos adicionales u otras sustancias que se unen a un CCR2 de mamífero o variante funcional del mismo, así como inhibidores y/o promotores de la función de CCR2 de mamífero. Por ejemplo, los agentes que tienen una especificidad de unión igual que o similar a la de un anticuerpo de la presente invención o parte funcional del mismo, pueden identificarse mediante un ensayo competitivo con dicho anticuerpo o parte del mismo. Por tanto, la presente invención también engloba métodos de identificación de ligandos del receptor u otras sustancias que se unen a una proteína CCR2 de mamífero, así como inhibidores (por ejemplo, antagonistas) o promotores (por ejemplo, agonistas) de la función del receptor. En una realización, se usan células que portan una proteína CCR2 de mamífero o variante funcional de la misma (por ejemplo, leucocitos, líneas celulares o células huésped adecuadas que se han modificado mediante ingeniería para expresar proteína CCR2 de mamífero o variante funcional codificada por un ácido nucleico introducido en dichas células) en un ensayo para identificar y evaluar la eficacia de ligandos u otras sustancias que se unen a receptor, incluyendo inhibidores o promotores de la función del receptor. Tales células son también útiles en la evaluación de la función de la proteína o polipéptido receptores expresados.

Según la presente invención, pueden identificarse ligandos y otras sustancias que se unen a receptor, inhibidores y promotores de la función del receptor en un ensayo adecuado, y evaluarse además para determinar el efecto terapéutico. Pueden usarse inhibidores de la función del receptor para inhibir (reducir o evitar) la actividad del receptor, y pueden usarse ligandos y/o promotores para inducir (desencadenar o potenciar) la función normal del receptor cuando esté indicado. Por tanto, la presente invención proporciona un método de tratamiento de enfermedades inflamatorias, incluyendo enfermedad autoinmunitaria y rechazo de un injerto, que comprende administrar un inhibidor de la función del receptor a un individuo (por ejemplo, un mamífero). La presente invención proporciona además un método de estimulación de la función del receptor administrando un ligando o promotor novedoso de la función del receptor a un individuo, proporcionando un nuevo enfoque para la estimulación selectiva de la función leucocitaria, que es útil, por ejemplo, en el tratamiento de enfermedades infecciosas y cáncer.

Tal como se usa en el presente documento, un "ligando" de una proteína CCR2 de mamífero se refiere a una clase particular de sustancias que se unen a una proteína CCR2 de mamífero, incluyendo ligandos naturales y formas sintéticas y/o recombinantes de ligandos naturales. Los agentes infecciosos que tienen un tropismo para células positivas para CCR2 de mamífero (por ejemplo, virus tales como VIH) también pueden unirse a una proteína CCR2 de mamífero. Un ligando natural de un receptor de mamífero seleccionado es de un origen de mamífero que es el mismo que el de la proteína CCR2 de mamífero (por ejemplo, una quimiocina tal como MCP-1, MCP-2, MCP-3 y/o MCP-4). En una realización preferida, la unión a ligando de una proteína CCR2 de mamífero se produce con alta afinidad.

Tal como se usa en el presente documento, un "inhibidor" es una sustancia que inhibe (reduce o evita) al menos una función característica de una proteína CCR2 de mamífero (por ejemplo, una CCR2 humana), tal como una actividad de unión (por ejemplo, la unión a ligando, unión a promotor, unión a anticuerpo), una actividad de señalización (por ejemplo, activación de una proteína G de mamífero, inducción de un aumento rápido y transitorio en la concentración de calcio libre citosólico [Ca^{2+}]i), y/o función de respuesta celular (por ejemplo, estimulación de quimiotaxia, exocitosis o liberación de mediadores inflamatorios por los leucocitos). Un inhibidor es también una sustancia que inhibe la entrada del VIH en una célula. El término inhibidor se refiere a sustancias que incluyen antagonistas que se unen a receptor (por ejemplo, un anticuerpo, un mutante de un ligando natural, moléculas orgánicas de bajo peso molecular, otros inhibidores competitivos de la unión a ligando), y sustancias que inhiben la función del receptor sin unirse al mismo (por ejemplo, un anticuerpo antiidiotípico).

Tal como se usa en el presente documento, un "promotor" es una sustancia que promueve (induce, provoca, potencia o aumenta) al menos una función característica de una proteína CCR2 de mamífero (por ejemplo, una CCR2 humana), tal como una actividad de unión (por ejemplo, unión a ligando, inhibidor y/o promotor), una actividad de señalización (por ejemplo, activación de una proteína G de mamífero, inducción de un aumento rápido y transitorio en la concentración de calcio libre citosólico [Ca^{2+}]i), y/o una función de respuesta celular (por ejemplo, estimulación de quimiotaxia, exocitosis o liberación de mediadores inflamatorios por los leucocitos). El término promotor se refiere a sustancias que incluyen agonistas que se unen a receptor (por ejemplo, un anticuerpo, un homólogo de un ligando natural de otra especie), y sustancias que promueven la función del receptor sin unirse al mismo (por ejemplo, activando una proteína asociada). En una realización preferida; el agonista es distinto de un homólogo de un ligando natural.

Por tanto, la invención se refiere también a un método de detección o identificación de un agente que se une a un receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero o variante de unión a ligando del mismo, incluyendo ligandos, inhibidores, promotores, y otras sustancias que se unen a un receptor CCR2 de mamífero o variante funcional. Según el método, pueden combinarse un agente que va a someterse a prueba, un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente invención (por ejemplo, 8G2, 1D9, un anticuerpo que tiene una especificidad epitópica que es igual que o similar a la de 8G2 o 1D9, y fragmentos de unión a antígeno de los mismos) y una composición que comprende un receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero o una variante de unión a ligando del mismo. Los componentes anteriores se combinan en condiciones adecuadas para la unión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno al receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero o a una variante de unión a ligando del mismo, y se detecta o se mide la unión del anticuerpo o fragmento al receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero o a la variante de unión a ligando, o bien directa o bien indirectamente, según los métodos descritos en el presente documento u otros métodos adecuados. Una disminución en la cantidad de complejo formado con respecto a un control adecuado (por ejemplo, en ausencia del agente que va a someterse a prueba) es indicativa de que el agente se une a dicho receptor o dicha variante. La composición que comprende un receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero o una variante de unión a ligando del mismo puede ser una fracción de membrana de una célula que porta proteína receptora de quimiocinas 2 recombinante o variante de unión a ligando de la misma. El anticuerpo o fragmento del mismo puede marcarse con un marcador tal como un radioisótopo, marcador de espín, marcador antigénico o de epítopo, marcador enzimático, grupo fluorescente y grupo quimioluminiscente.

La descripción da a conocer un método de detección o identificación de un agente que se une a un receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero o una variante de unión a ligando del mismo, que comprende combinar un agente que va a someterse a prueba; un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno de la presente invención (por ejemplo, 1D9, 8G2, un anticuerpo que tiene una especificidad epitópica que es igual que o similar a la de 1D9 o 8G2, o fragmentos de unión a antígeno de los mismos) y una célula que porta un receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero o una variante de unión a ligando del mismo. Los componentes anteriores se combinan en condiciones adecuadas para la unión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno a la proteína CCR2 o variante de unión a ligando de la misma, y se detecta o se mide la unión del anticuerpo o fragmento al receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero o variante, o bien directa o bien indirectamente, mediante los métodos descritos en el presente documento y/u otros métodos adecuados. Una disminución en la cantidad de complejo formado con respecto a un control adecuado es indicativa de que el agente se une al receptor o variante. El anticuerpo o fragmento del mismo puede marcarse con un marcador seleccionado del grupo que consiste en un radioisótopo, marcador de espín, marcador antigénico o de epítopo, marcador enzimático, grupo fluorescente y grupo quimioluminiscente. Pueden usarse estos ensayos y similares para detectar agentes, incluyendo ligandos (por ejemplo, quimiocinas o cepas de VIH que interaccionan con CCR2) u otras sustancias, incluyendo inhibidores o promotores de la función del receptor, que pueden unirse a CCR2 y competir con los anticuerpos descritos en el presente documento por la unión al receptor.

Los ensayos descritos anteriormente pueden usarse, solos o en combinación entre sí u otros métodos adecuados, para identificar ligandos u otras sustancias que se unen a proteína CCR2 de mamífero, e inhibidores o promotores de proteína CCR2 de mamífero o variante. Los métodos in vitro de la presente invención pueden adaptarse para selección de alto rendimiento en la que se procesan un gran número de muestras (por ejemplo, un formato de 96 pocillos). Puede usarse células que expresan CCR2 de mamífero (por ejemplo, CCR2 humano) a niveles adecuados para la selección de alto rendimiento, y por tanto, son particularmente valiosos en la identificación y/o el aislamiento de ligandos u otras sustancias que se unen a receptor, e inhibidores o promotores de proteínas CCR2 de mamífero. La expresión del receptor puede monitorizarse de muchas maneras. Por ejemplo, la expresión puede monitorizarse usando anticuerpos de la presente invención que se unen al receptor o una parte del mismo. También, pueden usarse anticuerpos disponibles comercialmente para detectar la expresión de una proteína de fusión marcada con antígeno o con epítopo que comprende una proteína o polipéptido receptores (por ejemplo, receptores marcados con FLAG), y pueden seleccionarse células que expresan el nivel deseado.

El ácido nucleico que codifica para una proteína CCR2 de mamífero o variante funcional de la misma puede incorporarse en un sistema de expresión para producir una proteína o polipéptido receptores. Una proteína CCR2 de mamífero recombinante y/o aislada o variante, tal como un receptor expresado en células transfectadas de manera estable o transitoria con un constructo que comprende un ácido nucleico recombinante que codifica para una proteína CCR2 de mamífero o variante, o en una fracción celular que contiene receptor (por ejemplo, una fracción de membrana de células transfectadas, liposomas que incorporan receptor), pueden usarse en pruebas para determinar la función del receptor. El receptor puede purificarse adicionalmente si se desea. Las pruebas de la función del receptor pueden llevarse a cabo in vitro o in vivo.

Una proteína CCR2 de mamífero recombinante y/o aislada o variante funcional de la misma, tal como una CCR2 humana, pueden usarse en el presente método, evaluando el efecto de un compuesto monitorizando la función del receptor tal como se describe en el presente documento o usando otras técnicas adecuadas. Por ejemplo, pueden usarse transfectantes estables o transitorios (por ejemplo, células Sf9 infectadas por baculovirus, transfectantes estables de células L1/2 pre-B de ratón), en ensayos de unión. Pueden usarse transfectantes estables de células Jurkat o de otras células adecuadas que pueden producir quimiotaxia (por ejemplo, células L1/2 pre-B de ratón) en ensayos de quimiotaxia, por ejemplo.

Según el método de la presente invención, los compuestos pueden seleccionarse individualmente o pueden someterse a prueba uno o más compuestos simultáneamente según los métodos del presente documento. Cuando se somete a prueba una mezcla de compuestos, los compuestos seleccionados mediante los procedimientos descritos pueden separarse (según sea apropiado) e identificarse mediante métodos adecuados (por ejemplo, PCR, secuenciación, cromatografía, espectroscopía de masas). La presencia de uno o más compuestos (por ejemplo, un ligando, inhibidor, promotor) en una muestra de prueba también puede determinarse según estos métodos.

Pueden someterse a prueba grandes bibliotecas combinatorias de compuestos (por ejemplo, compuestos orgánicos, péptidos recombinantes o sintéticos, "peptoides", ácidos nucleicos) producidos mediante síntesis química combinatoria u otros métodos (véanse por ejemplo, Zuckerman, RN. et al., J. Med. Chem., 37: 2678-2685 (1994) y las referencias citadas en ese documento; véanse también, Ohlmeyer, M.H.J. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:10922-10926 (1993) y DeWitt, S.H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:6909-6913 (1993), que se refieren a compuestos marcados; Rutter, W.J. et al., patente estadounidense número 5.010.175; Huebner, V.D. et al., patente estadounidense número 5.182.366; y Geysen, H.M., patente estadounidense número 4.833.092). Cuando los compuestos seleccionados de una biblioteca combinatoria mediante el presente método portan marcadores únicos, es posible la identificación de compuestos individuales mediante métodos cromatográficos. Puede usarse metodología de presentación en fago. Por ejemplo, pueden combinarse una proteína CCR2 de mamífero o variante funcional, un anticuerpo o parte funcional del mismo de la presente invención, y un fago (por ejemplo, un fago o colección de fagos tal como una biblioteca) que presenta un polipéptido, en condiciones apropiadas para la unión del anticuerpo o de parte del mismo a la proteína CCR2 de mamífero o variante (por ejemplo, en un tampón de unión adecuado). El fago que puede competir con el anticuerpo o parte del mismo y unirse a la proteína CCR2 de mamífero o variante puede detectarse o seleccionarse usando técnicas convencionales u otros métodos adecuados. El fago unido puede separarse del receptor usando un tampón de elución adecuado. Por ejemplo, un cambio en la fuerza iónica o pH puede conducir a una liberación de fago. Alternativamente, el tampón de elución puede comprender un componente o componentes de liberación diseñados para interrumpir la unión de compuestos (por ejemplo, uno o más compuestos que pueden interrumpir la unión del péptido presentado al receptor, tal como un ligando, inhibidor, y/o promotor que inhibe de manera competitiva la unión). Opcionalmente, el proceso de selección puede repetirse o puede usarse otra etapa de selección para enriquecer adicionalmente con fago que se une a receptor. El polipéptido presentado puede caracterizarse (por ejemplo, secuenciando el ADN del fago). Pueden producirse los polipéptidos identificados y someterse adicionalmente a prueba para determinar la unión, y para determinar la función del inhibidor o promotor. Pueden producirse análogos de tales péptidos que tendrán una estabilidad aumentada u otras propiedades deseables.

Puede producirse un fago que expresa y presenta proteínas de fusión que comprenden una cubierta proteica con un péptido N-terminal codificado por ácidos nucleicos de secuencia aleatoria. Las células huésped adecuadas que expresan proteína CCR2 de mamífero o variante y un anticuerpo anti-CCR2 o una parte funcional del mismo, se combinan con el fago, se seleccionan los fagos unidos, se recuperan y se caracterizan. (Véase por ejemplo, Doorbar, J. y G. Winter, J. Mol. Biol., 244: 361 (1994) que trata un procedimiento de presentación en fago usado con un receptor acoplado a proteína G).

Otras fuentes de posibles ligandos u otras sustancias que se unen a, o inhibidores y/o promotores de, proteína CCR2 de mamíferos incluyen, pero no se limitan a, variantes de ligandos de CCR2, incluyendo variantes que se producen de manera natural, variantes sintéticas o recombinantes de MCP-1, MCP-2, MCP-3 y/o MCP-4, sustancias tales como otros quimioatrayentes o quimiocinas, variantes de los mismos, moléculas orgánicas de bajo peso molecular, otros inhibidores y/o promotores (por ejemplo, anticuerpos anti-CCR2, antagonistas, agonistas), otros ligandos de receptor acoplados a proteína G, inhibidores y/o promotores (por ejemplo, antagonistas o agonistas), y partes solubles de receptor CCR2 de mamífero, tal como un péptido receptor o análogo adecuados que pueden inhibir la función del receptor (véase por ejemplo, Murphy, R.B., WO 94/05695).

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Modelos de inflamación

Están disponibles modelos de inflamación in vivo que pueden usarse para evaluar los efectos de anticuerpos y fragmentos de la invención in vivo como agentes terapéuticos. Por ejemplo, puede monitorizarse la infiltración leucocitaria tras la inyección intradérmica de una quimiocina y un anticuerpo o fragmento del mismo reactivo con CCR2 de mamífero en un animal adecuado, tal como conejo, ratón, rata, cobaya o Macaca rhesus (véanse por ejemplo, Van Damme, J. et al., J. Exp. Med., 176: 59-65 (1992); Zachariae, C.O.C. et al., J. Exp. Med. 171: 2177-2182 (1990); Jose, P.J. et al., J. Exp. Med. 179: 881-887 (1994)). En una realización, se evalúan histológicamente biopsias de la piel para determinar la infiltración de leucocitos (por ejemplo, eosinófilos, granulocitos). En otra realización, se administran células marcadas (por ejemplo, células transfectadas de manera estable que expresan un CCR2 de mamífero, marcadas con ^{111}In por ejemplo) que puede producir quimiotaxia y extravasación al animal. Por ejemplo, puede administrarse un anticuerpo o fragmento que va a evaluarse, o bien antes de, simultáneamente con o bien después del ligando o se administra agonista al animal de prueba. Una disminución del alcance de la infiltración en presencia de anticuerpo comparada con el alcance de la infiltración en ausencia de inhibidor es indicativa de inhibición.

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Aplicaciones diagnósticas y terapéuticas

Los anticuerpos y fragmentos de la presente invención son útiles en una variedad de aplicaciones, incluyendo aplicaciones de investigación, diagnósticas y terapéuticas. En una realización, los anticuerpos se marcan con un marcador adecuado (por ejemplo, marcador fluorescente, marcador quimioluminiscente, marcador isotópico, marcador antigénico o de epítopo o marcador enzimático). Por ejemplo, pueden usarse para aislar y/o purificar un receptor o partes del mismo, y para estudiar la estructura del receptor (por ejemplo, conformación) y su función.

Además, los diversos anticuerpos de la presente invención pueden usarse para detectar CCR2 o para medir la expresión de receptor, por ejemplo, en células T (por ejemplo, células CD8+, células CD45RO+), monocitos y/o en células transfectadas con un gen de receptor. Por tanto, éstos también tienen utilidad en aplicaciones tales como clasificación de células (por ejemplo, citometría de flujo, clasificación de células activada mediante fluorescencia), para fines diagnósticos o de investigación.

Los anticuerpos anti-CCR2 de la presente invención tienen valor en aplicaciones diagnósticas. Un anticuerpo anti-CCR2 o fragmento del mismo pueden usarse para monitorizar la expresión de este receptor en individuos infectados por VIH, de manera similar a la manera en la que se ha usado anti-CD4 como indicador diagnóstico del estadio de la enfermedad.

Normalmente, los ensayos diagnósticos implican detectar la formación de un complejo que resulta de la unión de un anticuerpo o fragmento del mismo a CCR2. Para fines diagnósticos, los anticuerpos o fragmentos de unión a antígeno pueden estar marcados o sin marcar. Los anticuerpos o fragmentos pueden marcarse directamente. Puede emplearse una variedad de marcadores, incluyendo, pero sin limitarse a, radionúclidos, agentes fluorescentes, enzimas, sustratos enzimáticos, cofactores enzimáticos, inhibidores enzimáticos y ligandos (por ejemplo, biotina, haptenos). El experto conoce numerosos inmunoensayos apropiados (véanse, por ejemplo, las patentes estadounidenses números 3.817.827; 3.850.752; 3.901.654 y 4.098.876). Cuando están sin marcar, los anticuerpos o fragmentos pueden detectarse usando medios adecuados, como en ensayos de aglutinación, por ejemplo. También pueden usarse anticuerpos o fragmentos sin marcar en combinación con otro (es decir, uno o más) reactivo adecuado que puede usarse para detectar anticuerpo, tal como un anticuerpo marcado (por ejemplo, un segundo anticuerpo) reactivo con el primer anticuerpo (por ejemplo, anticuerpos antiidiotípicos u otros anticuerpos que son específicos para la inmunoglobulina sin marcar) u otro reactivo adecuado (por ejemplo, proteína A marcada).

En una realización, los anticuerpos o fragmentos de la presente invención pueden utilizarse en inmunoensayos enzimáticos, en los que el anticuerpo o fragmento sujeto, o segundos anticuerpos, se conjugan a una enzima. Cuando se combina una muestra biológica que comprende proteína CCR2 de mamífero con los anticuerpos sujeto, se produce la unión entre los anticuerpos y proteína CCR2. En una realización, una muestra que contiene células que expresan proteína CCR2 de mamífero, tal como sangre humana, se combina con los anticuerpos sujeto, y se produce la unión entre los anticuerpos y células que portan una proteína CCR2 humana que comprende un epítopo reconocido por el anticuerpo. Estas células unidas pueden separarse de los reactivos sin unir y puede determinarse la presencia del conjugado anticuerpo-enzima unido específicamente a las células, por ejemplo, poniendo en contacto la muestra con un sustrato de la enzima que produce un color u otro cambio detectable cuando actúa sobre la enzima. En otra realización, los anticuerpos sujeto pueden estar sin marcar, y puede añadirse un segundo anticuerpo marcado que reconoce el anticuerpo sujeto.

También pueden prepararse kits para su uso en la detección de la presencia de una proteína CCR2 de mamífero en una muestra biológica. Tales kits incluirán un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que se une a un receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero o parte de dicho receptor, así como uno o más reactivos auxiliares adecuados para detectar la presencia de un complejo entre el anticuerpo o fragmento y CCR2 o parte del mismo. Las composiciones de anticuerpo de la presente invención pueden proporcionarse en forma liofilizada, o bien solas o en combinación con anticuerpos adicionales específicos para otros epítopos. Los anticuerpos, que pueden estar marcados o sin marcar, pueden incluirse en los kits con componentes complementarios (por ejemplo, tampones, tales como Tris, fosfato y carbonato, estabilizadores, excipientes, biocidas y/o proteínas inertes, por ejemplo, albúmina sérica bovina). Por ejemplo, los anticuerpos pueden proporcionarse como una mezcla liofilizada con los componentes complementarios, o los componentes complementarios pueden proporcionarse por separado para su combinación por el usuario. Generalmente, estos materiales complementarios estarán presentes en menos de aproximadamente el 5% en peso basado en la cantidad de anticuerpo activo, y normalmente estarán presentes en una cantidad total de al menos aproximadamente el 0,001% en peso basado en la concentración de anticuerpo. Cuando se emplea un segundo anticuerpo que puede producir la unión al anticuerpo monoclonal, tal anticuerpo puede proporcionarse en el kit, por ejemplo en un recipiente o vial separado. El segundo anticuerpo, si está presente, está normalmente marcado, y puede formularse de una manera análoga a las formulaciones de anticuerpo descritas anteriormente. De manera similar, la presente invención se refiere también a un método de detección y/o cuantificación de la expresión de un CCR2 de mamífero o una parte del receptor por una célula, en el que una composición que comprende una célula o fracción de la misma (por ejemplo, fracción de membrana) se pone en contacto con un anticuerpo o fragmento funcional del mismo (por ejemplo, 1D9 y/o 8G2) que se une a un CCR2 de mamífero o parte del receptor en condiciones apropiadas para la unión del anticuerpo o fragmento al mismo, y se monitoriza la unión. La detección del anticuerpo, indicativo de la formación de un complejo entre anticuerpo y CCR2 o una parte del mismo, indica la presencia del receptor. La unión de anticuerpo a la célula puede determinarse tal como se describió anteriormente bajo el título "Ensayos de unión", por ejemplo. El método puede usarse para detectar la expresión de CCR2 en células de un individuo (por ejemplo, en una muestra, tal como un fluido corporal, tal como sangre, saliva u otra muestra adecuada). El nivel de la expresión de CCR2 en la superficie de células T o monocitos también puede determinarse, por ejemplo, mediante citometría de flujo, y el nivel de la expresión (por ejemplo, intensidad de tinción) puede correlacionarse con la sensibilidad, la evolución o el riesgo de enfermedad.

Los receptores de quimiocinas funcionan en la migración de leucocitos por todo el cuerpo, particularmente a sitios inflamatorios. La emigración de células inflamatorias de la vasculatura se regula mediante un procedimiento de tres etapas que implica interacciones de leucocito y proteínas de adhesión a células endoteliales y quimioatrayentes específicos de células y factores de activación (Springer, T.A., Cell, 76:301-314 (1994); Butcher, E.C., Cell, 67:1033-1036 (1991); Butcher, E.C. y Picker, L.J., Science (Wash. DC), 272:60-66 (1996)). Éstas son: (a) una interacción de baja afinidad entre selectinas leucocitarias e hidratos de carbono de células endoteliales; (b) una interacción de alta afinidad entre receptores de quimioatrayente leucocitarios y factores quimioatrayentes/de activación; y (c) una unión estrecha entre integrinas leucocitarias y proteínas de adhesión a células endoteliales de la superfamilia de las inmunoglobulinas. Diferentes subconjuntos de leucocitos expresan diferentes repertorios de selectinas, receptores de quimioatrayente e integrinas. Adicionalmente, la inflamación altera la expresión de proteínas de adhesión endoteliales y la expresión de quimioatrayentes y factores de activación leucocitarios. Como consecuencia, existe una gran diversidad para regular la selectividad del reclutamiento leucocitario en sitios extravasculares. Se piensa que la segunda etapa es crucial porque la activación de los receptores de quimioatrayentes leucocitarios provoca la transición del rodamiento ("rolling") celular mediada por selectina a la unión estrecha mediada por integrina. Esto da como resultado que el leucocito esté listo para transmigrar a sitios perivasculares. La interacción quimioatrayente/receptor de quimioatrayente también es crucial para la migración transendotelial y localización dentro de un tejido (Campbell, J.J., et al., J. Cell Biol., 134:255-266 (1996); Carr, M.W., et al., Immunity, 4:179-187 (1996)). Esta migración está dirigida por un gradiente de concentración de quimioatrayente que conduce hacia el centro inflamatorio.

El CCR2 tiene un papel importante en el tráfico leucocitario. Es probable que el CCR2 sea un receptor de quimiocinas clave para la migración de las células T o de un subconjunto de células T o de monocitos a ciertos sitios inflamatorios, y así los AcM anti-CCR2 pueden usarse para inhibir (reducir o evitar) la migración de células T o monocitos, particularmente la asociada con la disfunción de células T, tal como enfermedad autoinmunitaria, o reacciones alérgicas o con trastornos mediados por monocitos tales como aterosclerosis. Por consiguiente, los anticuerpos y fragmentos de los mismos de la presente invención también pueden usarse para modular la función del receptor en aplicaciones de investigación y terapéuticas. Por ejemplo, los anticuerpos y fragmentos funcionales descritos en el presente documento pueden actuar como inhibidores para inhibir (reducir o evitar) (a) la unión (por ejemplo, de un ligando, un inhibidor o un promotor) al receptor, (b) una función de señalización de receptor, y/o (c) una función de estimulación. Los anticuerpos que actúan como inhibidores de la función del receptor pueden bloquear la unión a ligando o a promotor directa o indirectamente (por ejemplo, provocando un cambio conformacional). Por ejemplo, los anticuerpos pueden inhibir la función del receptor inhibiendo la unión de un ligando, o mediante desensibilización (con o sin inhibición de la unión de un ligando). Los anticuerpos que se unen a receptor también pueden actuar como agonistas de la función del receptor, desencadenando o estimulando una función del receptor, tal como una señalización y/o una función de estimulación de un receptor (por ejemplo, tráfico leucocitario) tras la unión a receptor.

Por tanto, la presente invención proporciona un método de inhibición del tráfico leucocitario en un mamífero (por ejemplo, un paciente humano), que comprende administrar al mamífero una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento funcional de la presente invención. La administración de un anticuerpo o fragmento de la presente invención puede dar como resultado una mejora o eliminación del estado patológico.

El anticuerpo de la presente invención, o un fragmento funcional del mismo, también pueden usarse para tratar trastornos en los que está implicada la activación del receptor CCR2 mediante la unión de quimiocinas. Por ejemplo, los anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos (por ejemplo, 1D9 y/o 8G2 o fragmentos funcionales de los mismos) pueden usarse para tratar alergia, aterogénesis, anafilaxis, tumor maligno, inflamación crónica y aguda, reacciones alérgicas mediadas por histamina e IgS, choque, y artritis reumatoide, aterosclerosis, esclerosis múltiple, rechazo de un aloinjerto, enfermedad fibrótica, asma y glomerulopatías inflamatorias.

Las enfermedades o estados de seres humanos u otras especies que pueden tratarse con inhibidores de la función del receptor CCR2 (incluyendo anticuerpos o fragmentos adecuados de los mismos), incluyen, pero no se limitan a:

\bullet

enfermedades y estados inflamatorios o alérgicos, incluyendo enfermedades alérgicas respiratorias tales como asma, rinitis alérgica, enfermedades pulmonares de hipersensibilidad, pneumonitis de hipersensibilidad, enfermedades interticiales del pulmón (ILD) (por ejemplo fibrosis pulmonar idiopática o ILD asociada con artritis reumatoide, lupus eritematoso sistémico, espondilitis anquilosante, esclerosis sistémica, síndrome de Sjogren, polimiositis o dermatomiositis); anafilaxis o respuestas de hipersensibilidad, alergias a fármacos (por ejemplo, a penicilina, cefalosporinas), alergia a picaduras de insectos, enfermedades inflamatorias del intestino, tales como enfermedad de Crohn y colitis ulcerosa, espondiloartropatias, esclerodermia; psoriasis y dermatosis inflamatorias tales como dermatitis, eczema, dermatitis atópica, dermatitis alérgica de contacto, urticaria; vasculitis (por ejemplo, vasculitis necrotizante, cutánea y por hipersensibilidad);

\bullet

enfermedades autoinmunitarias, tales como artritis (por ejemplo, artritis reumatoide, artritis reumatoide juvenil, artritis psoriásica), esclerosis múltiple, lupus eritematoso sistémico, miastenia grave, diabetes de aparición juvenil, nefritis tales como glomerulonefritis, tiroiditis autoinmunitaria, enfermedad de Behcet;

\bullet

rechazo de un injerto (por ejemplo, en trasplante), incluyendo rechazo de un aloinjerto o enfermedad injerto contra huésped, y arteriosclerosis asociada al trasplante de órganos;

\bullet

aterosclerosis;

\bullet

cánceres con infiltración leucocitaria de la piel u órganos;

\bullet

estenosis o reestenosis de la vasculatura, particularmente de las arterias, por ejemplo, la arteria coronaria, tal como estenosis o reestenosis que resulta de intervención vascular (por ejemplo, intervención quirúrgica, terapéutica o mecánica), así como hiperplasia de la neoíntima. Por ejemplo, la reestenosis, que normalmente produce un estrechamiento de la abertura luminal del vaso, puede resultar de una lesión vascular incluyendo, pero sin limitarse a, la producida por procedimientos de injerto vascular, angioplastia, incluyendo angioplastia realizada mediante globo, aterectomía, láser u otro método adecuado (por ejemplo, angioplastia coronaria transluminal percutánea (ACTP)), colocación de endoprótesis (por ejemplo, colocación de endoprótesis endovascular biológica o mecánica), procedimientos de derivación vascular o combinaciones de los mismos, así como otros procedimientos usados para tratar vasos sanguíneos ocluidos o estenóticos;

\bullet

pueden tratarse otras enfermedades o estados (incluyendo enfermedades o estados mediados por CCR2), en los que han de inhibirse respuestas inflamatorias indeseables, incluyendo, pero sin limitarse a, lesión por reperfusión, ciertos tumores malignos hematológicos, toxicidad inducida por citocinas (por ejemplo, choque séptico, choque endotóxico), polimiositis, dermatomiositis, y enfermedades granulomatosas incluyendo sarcoidosis.

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Las enfermedades o los estados de seres humanos u otras especies que pueden tratarse con promotores de la función del receptor CCR2 (incluyendo anticuerpos o fragmentos de los mismos), incluyen, pero no se limitan a:

\bullet

inmunosupresión, tal como aquélla en individuos con síndromes de inmunodeficiencia tal como SIDA, individuos que se someten a radioterapia, quimioterapia, terapia para enfermedad autoinmunitaria u otra terapia con fármacos (por ejemplo, terapia con corticosteroides), que provoca inmunosupresión; e inmunosupresión debida a una deficiencia congénita en la función del receptor u otras causas.

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Los anticuerpos anti-CCR2 de la presente invención pueden bloquear la unión de una o más quimiocinas, bloqueando de este modo la cascada posterior de uno o más acontecimientos que conducen a los trastornos anteriores.

Los anticuerpos y fragmentos funcionales de los mismos que son antagonistas de CCR2 pueden usarse como agentes terapéuticos para el SIDA, así como ciertas enfermedades inflamatorias. VIH-1 y VIH-2 son los agentes etiológicos del síndrome de inmunodeficiencia adquirida (SIDA) en seres humanos. El SIDA resulta en parte de la disminución de linfocitos T CD4+ en individuos infectados por VIH. El VIH-1 infecta principalmente a los linfocitos T, monocitos/macrófagos, células dendríticas y, en el sistema nervioso central, a la microglía. Todas estas células expresan la glucoproteína CD4, que sirve como receptor para VIH-1 y VIH-2. La entrada eficaz del VIH en las células diana depende de la unión de la glucoproteína de la envuelta exterior viral, gp120, al dominio CD4 amino-terminal. Tras la unión al virus, las glucoproteínas de la envuelta de VIH-1 median en la fusión de las membranas viral y de la célula huésped para completar el proceso de entrada. La fusión de membrana dirigida por las glucoproteínas de la envuelta de VIH-1
expresadas sobre la superficie de la célula infectada conduce a la fusión célula-célula, dando como resultado sincitios.

Recientemente, se ha sugerido que los factores de célula huésped además de CD4 determinan la eficacia de la fusión de membrana mediada por la glucoproteína de la envuelta de VIH-1. El receptor de 7 dominios transmembrana (7TMR) denominado HUMSTSR, LESTR, o "fusina" ha demostrado permitir un intervalo de células que expresan CD4 para apoyar la infección y la fusión celular mediadas por glucoproteínas de la envuelta de VIH-1 adaptadas en laboratorio (Feng, Y., et al., Science (Wash. DC), 272:872-877 (1996)). Los anticuerpos frente a HUMSTSR bloquearon la fusión celular e infección mediante aislados de VIH-1 adaptados en laboratorio pero no mediante virus primarios macrófagos-trópicos in vitro (Feng, Y., et al., Science (Wash. DC), 272:872-877 (1996)).

La capacidad de los receptores de quimiocina y de moléculas relacionadas para facilitar la infección de aislados de VIH-1 clínicos primarios se ha notificado recientemente por diversos grupos (véanse por ejemplo, Bates, P., Cell, 86:1-3 (1996); Choe, H., et al., Cell, 85: 1135-1148 (1996); Doranz et al., Cell 85:1149-1158 (1996)). Estos estudios indicaban que la implicación de diversos miembros de la familia de los receptores de quimiocinas en los estadios tempranos de la infección por VIH-1 ayuda a explicar el tropismo viral y la inhibición de \beta-quimiocina de aislados de VIH-1 primarios.

La descripción también proporciona un método de inhibición de la infección por VIH de una célula (por ejemplo, nueva infección y/o formación de sincitio) que expresa CCR2 de mamífero o parte del mismo, que comprende poner en contacto la célula con una composición que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que se une a CCR2 de mamífero o parte de dicho receptor. La composición también puede comprender uno o más agentes adicionales eficaces frente a VIH, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos anti-CCR3, anticuerpos anti-CCR5 y anticuerpos anti-fusina.

Pueden usarse diversos métodos para evaluar la unión de VIH a una célula y/o la infección de una célula por VIH en presencia de los anticuerpos de la presente invención. Por ejemplo, pueden usarse ensayos que evalúan la unión de gp 120 o una parte de la misma al receptor, infección por VIH y formación de sincitio (véase, por ejemplo, Choe, H., et al., Cell, 85:1135-1148 (1996)). La capacidad del anticuerpo de la presente invención para inhibir estos procesos puede evaluarse usando éstos u otros métodos adecuados.

Además, la descripción da a conocer un método de tratamiento del VIH en un paciente, que comprende administrar al paciente una composición que comprende una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que se une a CCR2 de mamífero o parte de dicho receptor. De nuevo, la composición también puede comprender uno o más agentes adicionales eficaces frente a VIH, incluyendo, pero sin limitarse a, anticuerpos anti-CCR3, anticuerpos anti-CCR5 y anticuerpos anti-fusina. El uso terapéutico de un anticuerpo para tratar el VIH incluye el uso profiláctico (por ejemplo, para el tratamiento de un paciente que puede estar o que puede haberse expuesto al VIH). Por ejemplo, los profesionales sanitarios que pueden estar expuestos o que pueden haber estado expuestos al VIH (por ejemplo, por pinchazo de una aguja) pueden tratarse según el método. Otro ejemplo es el tratamiento de un paciente expuesto al virus tras un contacto sexual sin protección o un fallo en la protección.

En el SIDA, el tratamiento con múltiples fármacos parece ser lo más prometedor. Puede añadirse una antagonista anti-receptor de quimiocinas que inhibe la infección por VIH al régimen de tratamiento con fármacos, en particular bloqueando la infección de nuevas células por el virus. Por tanto, la administración de un anticuerpo o fragmento de la presente invención en combinación con uno o más de otros agentes terapéuticos tales como análogos de nucleósido (por ejemplo, AZT, 3TC, ddI) y/o inhibidores de proteasas está previsto, y proporciona una adición importante a un régimen de tratamiento contra el VIH. En una realización, se usa un AcM anti-CCR2 humanizado en combinación con un (es decir, uno o más) agente terapéutico para reducir la carga viral de pacientes, evitando la fusión y/o infección de nuevas células. Un anticuerpo de este tipo también puede ser útil para prevenir la infección perinatal.

La descripción da a conocer un método de prevención de la infección por VIH en un individuo, que comprende administrar al individuo una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que se une a CCR2. Según el método, prevenir la infección por VIH incluye un tratamiento con el fin de prevenir (reducir o eliminar) la infección de nuevas células en un individuo infectado o con el fin de prevenir la infección en un individuo que puede estar, puede haber estado o ha estado, expuesto al VIH. Por ejemplo, pueden tratarse individuos tales como un individuo infectado por VIH, un feto de una mujer infectada por VIH, o un profesional sanitario según el método de la presente invención.

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Modos de administración

Pueden administrarse uno o más anticuerpos o fragmentos de la presente invención a un individuo mediante una vía apropiada, o bien solos o bien en combinación con (antes de, simultáneamente con, o tras) otro fármaco o agente, o antes de, simultáneamente con o tras una intervención quirúrgica, mecánica o terapéutica. Por ejemplo, los anticuerpos de la presente invención también pueden usarse en combinación con otros anticuerpos monoclonales o policlonales (por ejemplo, en combinación con anticuerpos que se unen a otros receptores de quimiocinas, incluyendo, pero sin limitarse a, CCR3 y CCR5) o con productos de plasma sanguíneo existentes, tales como productos de gamma-globulina e inmunoglobulina disponibles comercialmente usados en tratamientos profilácticos o terapéuticos. Los anticuerpos o fragmentos de la presente invención pueden usarse como composiciones administradas por separado junto con antibióticos y/o agentes antimicrobianos.

Se administra una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento (es decir, uno o más anticuerpos o fragmentos). Una cantidad eficaz es una cantidad suficiente para conseguir el efecto terapéutico (incluyendo profiláctico) deseado, en las condiciones de administración, tal como una cantidad suficiente para la inhibición de una función CCR2, y de este modo, la inhibición de una respuesta inflamatoria o infección por VIH, o una cantidad suficiente para la promoción de una función de CCR2, según esté indicado.

Es posible una variedad de vías de administración incluyendo, pero no necesariamente limitándose a, vía oral, a través de la dieta, vía tópica, vía parenteral (por ejemplo, vía intravenosa, vía intraarterial, vía intramuscular, por infusión o inyección subcutánea), por inhalación (por ejemplo, vía intrabronquial, vía intraocular, vía intranasal o inhalación oral, gotas intranasales), dependiendo de la enfermedad o condición que ha de tratarse. Otros métodos adecuados de administración también pueden incluir dispositivos recargables o biodegradables y dispositivos poliméricos de liberación lenta. Las composiciones farmacéuticas de esta invención también pueden administrarse como parte de una terapia combinatoria con otros agentes.

La formulación de un anticuerpo o fragmento que ha de administrarse variará según la vía de administración y formulación (por ejemplo, disolución, emulsión, cápsula) seleccionada. Una composición farmacéutica apropiada que comprende un anticuerpo o fragmento funcional del mismo que ha de administrarse pueden prepararse en un vehículo o excipiente fisiológicamente aceptable. También puede usarse una mezcla de anticuerpos y/o fragmentos. Para las disoluciones o emulsiones, los excipientes adecuados incluyen, por ejemplo, disoluciones acuosas o alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, incluyendo medios salinos y tamponados. Los vehículos parenterales pueden incluir disolución de cloruro de sodio, dextrosa de Ringer, dextrosa y cloruro de sodio, Ringer lactado o aceites fijados. El experto conoce una variedad de excipientes acuosos apropiados, incluyendo agua, agua tamponada, solución salina tamponada, polioles (por ejemplo, glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido), disolución de dextrosa y glicina. Los vehículos intravenosos pueden incluir diversos aditivos, conservantes o agentes de reposición de fluidos, nutrientes o electrolitos (véanse, generalmente, Remington's Pharmaceutical Science, 16ª edición, Mack, Ed. 1980). Las composiciones pueden contener opcionalmente sustancias auxiliares farmacéuticamente aceptables según sea requerido para estados fisiológicos aproximados tales como agentes de tamponamiento y de ajuste del pH y agentes de ajuste de toxicidad, por ejemplo, acetato de sodio, cloruro de sodio, cloruro de potasio, cloruro de calcio y lactato de sodio. Los anticuerpos y fragmentos de esta invención pueden liofilizarse para su almacenamiento y reconstituirse en un excipiente adecuado antes de su uso según las técnicas de liofilización y reconstitución conocidas en la técnica. La concentración óptima del/de los principio(s) activo(s) en el medio elegido puede determinarse empíricamente, según procedimientos bien conocidos por el experto, y dependerá de la última formulación farmacéutica deseada. Para la inhalación, el anticuerpo o fragmento puede solubilizarse y cargarse en un dispensador adecuado para la administración (por ejemplo, un atomizador, nebulizador o dispensador de aerosol presurizado).

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Ejemplos Materiales

Se obtuvieron los siguientes materiales a partir de las fuentes indicadas:

El anti-CD16 conjugado con PE, la estreptavidina conjugada con PE y la IgE antihumana biotinilada eran de Pharmingen (San Diego, CA). La IgG de cabra anti-ratón conjugada con FITC era de Jackson Immunoresearch Laboratories (West Grove, PA). El tampón de lisis FACS era de Becton Dickenson (Mountain View, CA) y la [^{125}I]-MCP-1 era de NEN (Boston, MA).

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Células, líneas celulares y cultivo tisular

Se mantuvo la línea celular L1/2 de linfoma de células pre-B murinas en RPMI-1640 complementado con Fetal Clone I al 10% (Gibco BRL, Gaithersburg, MD), 50 unidades/ml de penicilina (Gibco BRL), 50 \mug/ml de estreptomicina (Gibco BRL), L-glutamina 2 mM (Gibco BRL) y \beta-mercaptoetanol 55 \muM (Gibco BRL). Otras líneas celulares incluían transfectantes de células L1/2 que expresan tanto CCR1 (Campbell, J. et al. (1996) J. Cell Bio., 134:255-266) como CCR5 (Wu et al., Nature 384:179-183 (1996)) cultivadas en el medio de cultivo anterior complementado con 800 \mug/ml de G418 activa. Se hicieron crecer células THP-1 (nº ATCC TIB202) según las instrucciones de la ATCC. Se purificaron PBMC a partir de sangre heparinizada tal como se describe en Ponath et al., J. Clin. Invest., 97:604-612 (1996).

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Preparación del constructo de expresión de CCR2b y transfectantes estables

Se obtuvo la región codificante para CCR2b humano (Charo et al. (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 91:2752) mediante amplificación por RT-PCR tal como se describe (Qin, S: et al. (1996) Eur. J. Immunol., 26:640-647). Se preparó ADNc usando cebado con oligonucleótidos (dT), y se consiguió la amplificación de la región codificante de CCR2b mediante PCR anidada con los siguientes conjuntos de cebadores que corresponden a las posiciones de la secuencia de CCR2b (número de registro GenBank U03905; Charo et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91:2752-2756 (1994)) según esté indicado:

1)

cebador en 5': 5'-TGAGACAAGCCACAAGCTGAAC-3' (nucleótidos 11 a 32; SEQ ID NO:1);

cebador en 3': 5'-TCTGTATTAGTACACACAGCCC-3' (nucleótidos 1301 a 1280; SEQ ID NO:2);

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2)

cebador en 5': 5'-ATGCTGTCCACATCTCGTTCTCGG-3' (nucleótidos 81 a 104; SEQ ID NO:3);

cebador en 3': 5'-TTATAAACCAGCCGAGACTTCCTGCTC-3' (nucleótidos 1164 a 1137; SEQ ID NO:4).

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Se modificó la región codificante de ADNc de CCR2B para que contuviera la secuencia líder de péptido señal de CD5 (Aruffo et al., Cell 61:1303-1313 (1990)). La secuencia prevista de aminoácidos de este péptido es:

NH_{2}-Met-Pro-Met-Gly-Ser-Leu-Gln-Pro-Leu-Ala-Thr-Leu-Tyr-Leu-Leu-Gly-Met-Leu-Val-Ala-Ser-Val-Leu-
Ala... (SEQ ID NO:5).

Usando PCR con el ADNc de CCR2b como molde y dos cebadores en 5' solapantes que contienen un sitio de restricción BamHI, se codifica la secuencia de péptido señal de CD5 y la secuencia amino terminal de CCR2b, y un cebador en 3' ubicado internamente en la región codificante de CCR2b.

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Cebador en 5' Seq1 de CD5

1

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Cebador en 5' Seq2 de CD5

2

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Cebador de CCR2AB2 3' - 5'-GACGACCAGCATGTTGCC-3' (SEQ ID NO:8; U03905 nucleótidos 272 a 255)

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Se sometió a digestión el fragmento amplificado de 278 pares de bases con BamHI y ApaI y se insertó el fragmento de 209 pares de bases resultante en el sitio ApaI en la posición 206 del ADNc de CCR2b (número de registro GenBank U03905) para sustituir el fragmento de pares de bases en 5' endógeno de CCR2. Se insertó la secuencia resultante que codifica para un CCR2b con la secuencia líder de péptido señal de CD5 inmediatamente anterior a la metionina iniciadora de receptor, en los sitios BamHI y XhoI de pcDNA3 (Invitrogen, San Diego, CA) para crear el plásmido de expresión de mamífero pCD5MCPRB. Se subclonó el fragmento CD5-CCR2b en el sitio BamHI-NotI de pCDEF3 (Goldman et al., (1996) Biotechniques 21: 1013-1015), y se denominó a este constructo CCR2bDEF3. En este vector de expresión, se acciona la expresión del gen insertado mediante el promotor EF-1\alpha.

Se sembraron cincuenta mililitros de células L1/2 a 4 x 10^{5} células/ml el día antes de la electroporación. El día de la electroporación, se separaron por centrifugación las células, que habían crecido hasta una densidad de 1 x 10^{6}/ml, de su medio y se resuspendieron en 800 \mul de tampón de electroporación a temperatura ambiente (Zajac et al., ADN 7:509-513), ácido L-glutámico 120 mM (Sigma), acetato de Mg 7 mM (EM Science), glucosa 4,3 mM (Sigma), K Pipes 17 mM, pH 6,9 (Sigma), EGTA 1 mM (Sigma), ATP 5 mM, pH 7,0 (Sigma). Se colocaron veinticinco microgramos de ADN de plásmido CCR2bDEF3 precipitado con isopropanol y extraído con fenol/cloroformo/alcohol isoamílico, linealizado con ScaI en una cubeta de electroporación de 0,4 cm de hueco. Se añadieron las células resuspendidas a la cubeta, y se aplicó un único pulso a 450 voltios, 960 \muFd. Entonces se transfirieron las células de la cubeta a un matraz T-75 que contenía 15 ml de medio de crecimiento L1/2 (descrito anteriormente, y se hicieron crecer durante tres días, momento en el cual se separaron por centrifugación de su medio y se resuspendieron en medio de crecimiento L1/2 complementado adicionalmente con piruvato de sodio 1 mM (Gibco BRL) y G418 activa 0,8 mg/ml (Gibco BRL).

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Selección de células que expresan CCR2b mediante quimiotaxia

Se dejaron crecer las células transfectadas durante once días, momento en el cual se dividieron a 1:20 en medio de cultivo reciente. El día dieciséis, se seleccionaron las células mediante quimiotaxia. Se colocaron 600 \muL de MCP-1 1 nM en RPMI 1640 complementado con BSA al 0,5% (RPMI/BSA) en la cámara inferior y se colocaron 1 x 10^{6} células CCR2bDEF3 en 100 \mul de RPMI/BSA en la cámara superior de una placa de quimiotaxia de 24 pocillos con poros de 3,0 micras (Becton Dickinson). Se dejó que las células experimentaran quimiotaxia durante cuatro horas y veinte minutos en una incubadora humidificada a 37ºC, con CO_{2} al 5%, momento en el cual se retiró la cámara superior. Este tiempo de incubación se eligió en el momento del experimento porque era suficientemente largo para que las células respondieran a la MCP-1 con respecto a la quimitoxia, pero lo suficientemente corto para mantener el fondo bajo.

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Selección secundaria de células que expresan CCR2b mediante clasificación por FACS

Se cultivaron las células que habían experimentado quimiotaxia a través de la membrana y hacia la cámara inferior, y se purificaron adicionalmente mediante clasificación por FACS estéril. Se eliminaron por centrifugación diez millones de células CCR2bDEF3 de su medio, se resuspendieron en 2,5 ml de PBS (+Ca, Mg) complementado con suero bovino fetal inactivado por calor al 1% ("HI FCS") (Gibco BRL) y 2,5 ml de sobrenadante 5A11 de anticuerpo de péptido amino terminal anti-CCR2b filtrado estéril. Se mezclaron las células y el anticuerpo y se dejaron incubar en hielo durante treinta minutos. Entonces se lavaron las células dos veces con PBS (+) (Gibco BRL) y se resuspendieron en 5 ml de una dilución 1:250, filtrada, estéril, de IgG de cabra anti-ratón F(ab^{1})_{2} purificado por afinidad, conjugado con FITC (Jackson ImmunoResearch Laboratories) en PBS (+) complementado con HIV FCS al 1%. Se incubaron las células durante treinta minutos en hielo en la oscuridad, y entonces se lavaron dos veces con PBS(+) (GIBCO BRL). Se clasificaron las células en el FACSCalibur® y se recogió el 4% más brillante de las células. (FL1 \geq 3 x 10^{2}).

Se dejaron crecer las células clasificadas y volvieron a clasificar usando el mismo protocolo que anteriormente. Se recogió el 1% más brillante de las células. (FL1 \geq 3 x 10^{3}).

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Producción de anticuerpos monoclonales

Para producir los Acm frente a CCR2b, se monitorizaron de manera continua transfectantes para garantizar que los niveles de expresión no descendían. Se realizó una tinción mediante FACS periódicamente para determinar la expresión del receptor en los transfectantes usando el sobrenadante 5A11 de anticuerpo anti-CCR2b con IgG FITC de cabra anti-ratón como el anticuerpo secundario.

Se lavaron veinte millones de células CCR2bDEF3.L1/2 en RPMI 1640 (Gibco BRL) y se incubaron en RPMI 1640 más mitomicina C 0,2 mg/ml durante 30 minutos a 37ºC. Entonces se lavaron las células dos veces con PBS (+) y se inyectaron por vía intraperitoneal 2 x 10^{7} células en 0,5 ml de PBS (+) en un ratón hembra C57 BL/6. Esto se repitió dos veces más a intervalos de dos semanas. La cuarta vez, se resuspendieron 2 x 10^{7} células en 0,25 ml y se inyectaron por vía intravenosa. Tres días tras la inyección intravenosa, se sacrificó el ratón y se extirpó el bazo y se fusionaron las células con la línea celular SP2/0 tal como se describió (Current Protocols in Immunology, John Wiley and Sons, Nueva York, 1992).

Se había inmunizado este conjunto de ratones previamente muchas veces con 2 líneas celulares diferentes así como un péptido sintético, pero no se generó ningún anticuerpo que teñía células CCR2 positivas a partir de varias fusiones. Las cuatro inmunizaciones anteriores con la línea celular CCR2bDEF3.L1/2 que expresa niveles altos de CCR2b eran críticas para obtener el anticuerpo descrito.

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Selección de un clon de una única célula de transfectantes CCR2 mediante dilución limitativa

Una vez que el ratón había recibido la última inyección, se dejó que las células separadas dos veces crecieran de nuevo, y se purificaron adicionalmente mediante dilución limitativa. Se colocaron las células a 1 y 0,5 células por pocillo en placas de 96 pocillos. Se hicieron crecer células subclonadas a partir de la dilución de 0,5 células por pocillo y se sometieron a prueba para determinar la expresión de CCR2b mediante análisis por FACS inmunofluorescente indirecto usando el sobrenadante 5A11 de anticuerpo anti-CCR2b con IgG FITC de cabra anti-ratón como el anticuerpo secundario. El procedimiento fue el mismo que el descrito anteriormente, excepto porque el volumen de tinción fue de 100 \mul. Se seleccionaron cuatro positivos y se congelaron.

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Identificación de anticuerpos monoclonales positivos

Se usó un análisis de tinción inmunofluorescente usando un FACScan® (Becton Dickinson & Co., Mountain View, CA) para identificar los anticuerpos monoclonales que eran reactivos con el receptor CCR2b. Se sometieron a ensayo sobrenadantes de cultivo de hibridoma en un formato de 96 pocillos usando IgG FITC de cabra anti-ratón como el anticuerpo secundario. Se usaron células CCR2bDEF3.L1/2 para identificar anticuerpos monoclonales reactivos con CCR2b, y se usaron células L1/2 no transfectadas para eliminar los anticuerpos monoclonales reactivos con otras proteínas de la superficie celular.

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Tinción mediante FACS - Células cultivadas

Para la tinción de líneas celulares transfectantes cultivadas se resuspendieron 0,5 x 10^{6} células en 50 \mul en PBS + FCS al 1% en una placa con fondo en forma de V de poliestireno de 96 pocillos. Se añadieron 50 \mul de sobrenadantes de anticuerpo primario o medio HT (control negativo), y se incubaron las muestras a 4ºC durante 30 min. Se añadieron 100 \mul de PBS y se hicieron sedimentar las células mediante centrifugación y se lavaron una vez con PBS. Se resuspendió el sedimento en 100 \mul de PBS + FCS al 1% que contenía anticuerpo IgG de cabra anti-ratón conjugado con FITC (una dilución 1:250) y se incubó durante treinta minutos a 4ºC en la oscuridad. Se lavaron las células dos veces con PBS, se resuspendieron en PBS y se analizaron mediante citometría de flujo con un citómetro FacScan usando el software CellQuest (Becton-Dickenson). Se fijaron las células con PBS/formaldehído al 1% si no iban a analizarse el mismo día. Los anticuerpos monoclonales 1D9 y 8G2 tiñen los transfectantes CCR2 pero no los transfectantes CCR1 ni CCR5 (figuras 1A-1O).

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Tinción mediante FACS - Sangre completa

Se mezclaron 100 \mul de sangre completa con 100 \mul de sobrenadantes de hibridoma de anticuerpo 1D9 o medio HT (control negativo) y se incubaron a 4ºC durante 30 min. Tras un lavado con PBS, se añadieron 100 \mul de anticuerpo IgG de cabra anti-ratón conjugado con FITC (una dilución 1:250) a cada muestra y se incubaron durante 30 min a 4ºC en la oscuridad. Entonces se lavaron las muestras una vez con PBS si había que realizar una segunda tinción con color, si no se lavó dos veces más en PBS. Para dos tinciones con color se añadieron 5 \mul de suero de ratón a los sedimentos de células tras el único lavado, se mezclaron y se incubaron durante cinco minutos a 4ºC en la oscuridad. Se añadieron los segundos anticuerpos primarios (o PBS como control negativo) (10 \mul anti-CD16, 100 \mul de dilución 1:200 de anti-IgE) y se incubaron durante treinta minutos a 4ºC en la oscuridad. Entonces se lavaron las muestras una vez con PBS y se resuspendieron en 100 \mul de estreptavidina PE (1:200 de PBS + BSA al 1%) y se incubaron durante quince minutos a 4ºC en la oscuridad. Se lisaron eritrocitos añadiendo 2 ml de tampón de lisis FACS a cada muestra e incubando a temperatura ambiente en la oscuridad durante quince minutos o hasta que las muestras fueron transparentes. Se hicieron sedimentar las células mediante centrifugación y se aspiró todo el sobrenadante excepto 200 \mul. Se analizaron las muestras mediante citometría de flujo en un citómetro FacScan usando el software CellQuest (Becton-Dickenson). El CCR2b se expresa en la mayoría de los monocitos, una subpoblación de linfocitos y un subconjunto de granulocitos (figuras 2A-2L). El CCR2b se expresa en una población IgE-positiva en sangre periférica (basófilos) (figuras 3A-3I).

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Ensayos de unión a MCP-1

Se realizó la unión a MCP-1 en un volumen final de 0,1 ml de Hepes 50 mM, pH 7,4, CaCl_{2} 1 mM, MgCl_{2} 5 mM, azida de sodio al 0,02%, BSA al 0,5% (HBB), que contenía o bien 2,5 \mug de proteína de membrana THP-1 o 500.000 PBMC y 0,1 nM de [^{125}I]-MCP-1. Se realizaron experimentos de unión competitiva incluyendo concentraciones variables de MCP-1 sin marcar, anticuerpo 1D9 o IgG2a control negativa. Se determinó la unión no específica tras la adición de un exceso de 2500 veces de MCP-1 sin marcar. Se incubaron las muestras durante 60 minutos a temperatura ambiente, y se separó el espaciador unido y libre mediante filtración a través de placas de filtro GF/B de 96 pocillos empapados previamente en polietilenimina al 0,3%. Se lavaron los filtros en HBB complementado adicionalmente NaCl 0,5 M, se secaron y se determinó la cantidad de radiactividad unida mediante recuento por centelleo líquido. El Acm 1D9 inhibe la unión de [^{125}I]MCP-1 a membranas de células THP-1 con una CI_{50} de aproximadamente 0,004 \mug/ml (aproximadamente 0,02 nM; figura 4) y a PBMC recientes con una CI_{50} de 0,04 \mug/ml (aproximadamente 0,2 nM; figura 5).

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Quimiotaxia de PBMC

Se sometió a ensayo la quimiotaxia usando una placa de quimiotaxia de 96 pocillos con un tamaño de poro de 3 \mum (Neuroprobe, Cabin John, MD). Se lavaron las PBMC aisladas mediante métodos convencionales usando centrifugación con gradiente de densidad Ficoll-Hypaque con PBS/BSA al 0,5% y entonces se resuspendieron en medios de ensayo de quimiotaxia (HBSS/HEPES 10 mM /BSA libre de ácido graso al 0,5%) hasta una concentración final de 10 x 10^{6} células/ml. Se incubaron previamente células en medios de ensayo de quimiotaxia a temperatura ambiente durante 20 min con diversas concentraciones del anticuerpo anti-CCR2, 1D9 o IgG2a murina no específica. Se mezclaron las mismas diluciones de anticuerpo con quimiocina y se añadieron 30 \mul de la mezcla a cada uno de los pocillos de fondo de la placa de quimiotaxia. Se cubren los pocillos de fondo con la membrana, y se añaden 25 \mul de la mezcla de célula y anticuerpo a la parte superior del filtro. Se incuban las placas a 37ºC en una incubadora con CO_{2} al 5% durante aproximadamente 80 min. Al finalizar la migración, se elimina la membrana y se incuba la placa con los pocillos de fondo a -80ºC durante 30 minutos para congelar el contenido. Se descongelan las placas a 37ºC durante 10 minutos. Se añaden 6 \mul de un dilución 1:400 de reactivo CyQuant (Molecular Probes, Eugene, O) en un tampón de lisis proporcionado por el proveedor a cada pocillo, y se cuantifica la migración celular según esté indicado mediante la intensidad de fluorescencia determinada usando un lector de placas de fluorescencia CitoFlour a 485ex/535em. El Acm 1D9 inhibe la quimiotaxia inducida por MCP-1, pero no la quimiotaxia inducida por RANTES, de PBMC recientes (figuras 6A y 6B). Se ha demostrado la inhibición de quimiotaxia inducida por MCP-1 de PBMC recientes con 10 \mug/ml (= 40 nM).

3

<110> LeukoSite, Inc.

\hskip1cm

LaRosa, Gregory J.

\hskip1cm

Horvath, Christopher

\hskip1cm

Newman, Walter

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<120> ANTICUERPOS ANTI-CCR2 Y MÉTODOS DE USO DE LOS MISMOS

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<130> LKS98-04A

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<150> 09/121.781

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<151> 23-07-1998

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<160> 8

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<170> FastSEQ para Windows versión 3.0

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<210> 1

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 1

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\hskip-.1em\dddseqskip

tgagacaagc cacaagctga ac

\hfill

22

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<210> 2

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<211> 22

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 2

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tctgtattag tacacacagc cc

\hfill

22

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<210> 3

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<211> 24

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 3

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\hskip-.1em\dddseqskip

atgctgtcca catctcgttc tcgg

\hfill

24

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<210> 4

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<211> 27

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 4

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\hskip-.1em\dddseqskip

ttataaacca gccgagactt cctgctc

\hfill

27

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<210> 5

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<211> 24

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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5

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<210> 6

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<211> 60

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 6

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\hskip1cm

6

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<210> 7

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<211> 65

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 7

\hskip1cm

7

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<210> 8

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<211> 18

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<212> ADN

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<213> Secuencia artificial

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<220>

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<223> Cebador

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<400> 8

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\hskip-.1em\dddseqskip

gacgaccagc atgttgcc

\hfill

18

Claims (75)

1. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al dominio amino-terminal de un receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero (CCR2), siendo dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo un antagonista de la quimiotaxia inducida por MCP-1 y teniendo el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo especificidad epitópica por el dominio amino-terminal del receptor CCR2 desde el aminoácido 1 hasta el aminoácido 30 de la proteína receptora.

2. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, siendo dicho anticuerpo o fragmento del mismo un anticuerpo recombinante o fragmento de unión a antígeno del mismo; un anticuerpo quimérico o fragmento de unión a antígeno del mismo; un anticuerpo humanizado o fragmento de unión a antígeno del mismo; o un anticuerpo humano o fragmento de unión a antígeno del mismo.

3. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, seleccionándose el anticuerpo del grupo que consiste en:

a)

el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12549;

b)

un anticuerpo que tiene la especificidad epitópica del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12549;

c)

un anticuerpo que compite por la unión con el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12549;

d)

el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12550;

e)

un anticuerpo que tiene la especificidad epitópica del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12550;

f)

un anticuerpo que compite por la unión con el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12550; y

g)

fragmentos de unión a antígeno de uno cualquiera de (a) a (f) que se unen al extremo amino terminal del receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero.

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4. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 2, teniendo el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo la especificidad epitópica del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12549; tiene la especificidad epitópica del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12550; compite por la unión del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12549; o compite por la unión con el anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12550.

5. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, comprendiendo el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo: una o más regiones de unión a antígeno del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12549; una o más regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12549; o seis regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12549.

6. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, comprendiendo el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo: una o más regiones de unión a antígeno del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12550; una o más regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12550; o seis regiones determinantes de complementariedad del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12550.

7. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, comprendiendo el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo una región de unión a antígeno de una secuencia de aminoácidos seleccionada de una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable producida por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12549, una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable producida por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12549, una secuencia de aminoácidos seleccionada de una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable producida por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12550, y una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable producida por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12550.

\newpage

8. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, comprendiendo el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo una región de unión a antígeno de una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable producida por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12549, y una región de unión a antígeno de una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable producida por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12549, o una región de unión a antígeno de una secuencia de aminoácidos de la cadena pesada variable producida por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12550, y una región de unión a antígeno de una secuencia de aminoácidos de la cadena ligera variable producida por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12550.

9. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, comprendiendo el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo una región de unión a antígeno de una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico seleccionada del grupo que consiste en una secuencia de ácido nucleico que codifica para la cadena pesada variable producida por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12549, una secuencia de ácido nucleico que codifica para la cadena ligera variable producida por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12549, una secuencia de ácido nucleico que codifica para la cadena pesada variable producida por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12550, y una secuencia de ácido nucleico que codifica para la cadena ligera variable producida por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC
HB-12550.

10. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, comprendiendo el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo una región de unión a antígeno de una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que codifica para la cadena pesada variable producida por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12549, y una región de unión a antígeno de una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que codifica para la cadena ligera variable producida por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12549, o una región de unión a antígeno de una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que codifica para la cadena pesada variable producida por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12550, y una región de unión a antígeno de una secuencia de aminoácidos codificada por una secuencia de ácido nucleico que codifica para la cadena ligera variable producida por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12550.

11. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1, 3 y 5-10, siendo el anticuerpo o fragmento del mismo un anticuerpo monoclonal o fragmento del mismo.

12. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 11, produciéndose el anticuerpo frente a una célula que expresa el receptor de quimiocinas CC 2.

13. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1, siendo el anticuerpo un anticuerpo policlonal.

14. Anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-13, en el que el receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero es el receptor de quimiocinas CC 2 humano.

15. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-14, inhibiendo el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo uno o más de:

el tráfico leucocitario, la activación de células T, la liberación de mediadores inflamatorios y la desgranulación leucocitaria.

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16. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 15, en el que la función asociada con la unión de la quimiocina a dicho CCR2 es el tráfico leucocitario.

17. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-16, seleccionándose el fragmento de unión a antígeno del grupo que consiste en un fragmento Fv, un fragmento Fab, un fragmento Fab' y un fragmento F(ab')_{2}.

18. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-17, uniéndose el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo a CCR2 con una afinidad de al menos 0,1 x 10^{-9} M; al menos 1 x 10^{-9} M; o al menos 3 x 10^{-9} M.

19. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 16, inhibiendo el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo la quimiotaxia de células inducida por quimiocina a menos de 150 \mug/ml; a menos de 100 \mug/ml; a menos de 50 \mug/ml; o a menos de 20 \mug/ml.

20. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-19, inhibiendo el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo la unión de la quimiocina a dicho CCR2 con una CI_{50} inferior a 1,0 \mug/m; inferior a 0,05 \mug/ml; o inferior a 0,005 \mug/ml.

21. Anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-20, estando el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo marcado, tal como con un marcador seleccionado de un radioisótopo, un marcador de espín, un marcador antigénico, un marcador enzimático, un marcador fluorescente, un marcador quimioluminiscente y un marcador de epítopo.

22. Composición que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21, y un vehículo fisiológicamente aceptable opcional.

23. Composición según la reivindicación 22, estando la composición en forma liofilizada.

24. Composición según una cualquiera de las reivindicaciones 22 y 23, comprendiendo además la composición uno o más de un tampón, un estabilizante, un excipiente, un biocida y una proteína inerte.

25. Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21, y un vehículo fisiológicamente aceptable.

26. Composición farmacéutica según la reivindicación 25, en la que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo es un anticuerpo liofilizado o fragmento de unión a antígeno del mismo reconstituido en un vehículo farmacéuticamente aceptable.

27. Línea celular de hibridoma depositada con el número de registro ATCC HB-12549 o depositada con el número de registro ATCC HB-12550.

28. Ácido nucleico que codifica para una secuencia de aminoácidos de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según la reivindicación 1 seleccionado de: una secuencia de aminoácidos que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la cadena pesada variable del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12549; una secuencia de aminoácidos que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la cadena ligera variable del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12549; una secuencia de aminoácidos que comprende las regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la cadena pesada variable del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12550; y una secuencia de aminoácidos que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la cadena ligera variable del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12550.

29. Ácido nucleico según la reivindicación 28, en el que la secuencia de aminoácidos comprende tres CDR de la cadena pesada variable del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12549, o tres CDR de la cadena pesada variable del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12550.

30. Ácido nucleico según la reivindicación 28, en el que la secuencia de aminoácidos comprende tres CDR de la cadena ligera variable del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12549, o tres CDR de la cadena ligera variable del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12550.

31. Secuencia de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 28, codificando la secuencia de ácido nucleico para una secuencia de aminoácidos que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la cadena pesada variable del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12549 y codifica para una secuencia de aminoácidos que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la cadena ligera variable del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12549.

32. Ácido nucleico según la reivindicación 28, en el que la secuencia de aminoácidos comprende la cadena pesada variable del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12549, la cadena pesada variable del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12550, la cadena ligera variable del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC Hub-12549, o la cadena ligera variable del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12550.

33. Secuencia de ácido nucleico que comprende un ácido nucleico según la reivindicación 28, codificando la secuencia de ácido nucleico para una secuencia de aminoácidos que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la cadena pesada variable del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12550 y codifica para una secuencia de aminoácidos que comprende regiones determinantes de complementariedad (CDR) de la cadena ligera variable del anticuerpo monoclonal producido por el hibridoma que tiene el número de depósito ATCC HB-12550.

34. Vector que comprende un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 28-33.

35. Célula huésped que comprende un ácido nucleico según una cualquiera de las reivindicaciones 28-33.

36. Kit que comprende: un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21 en forma liofilizada; y un vehículo farmacéuticamente aceptable.

37. Kit para detectar la presencia del receptor de quimiocinas 2 CC, que comprende:

un primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21; y

uno o más reactivos auxiliares adecuados para detectar la presencia de un complejo entre el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y el receptor, y

opcionalmente, un segundo anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo específico para un epítopo diferente del receptor del primer anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo o que se une al primer anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo tal como un anticuerpo marcado.

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38. Método in vitro de inhibición de la interacción de una célula que porta el receptor de quimiocinas CC 2 (CCR2) de mamífero con una quimiocina, que comprende poner en contacto dicha célula con una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21.

39. Método según la reivindicación 38, en el que dicha célula se selecciona del grupo que consiste en linfocitos, monocitos, granulocitos, células T, basófilos, células dendríticas, eosinófilos, mastocitos y células que comprenden un ácido nucleico recombinante que codifica para CCR2 o una parte del mismo.

40. Método según la reivindicación 39, en el que dichas células T se seleccionan del grupo que consiste en células CD8+, células CD25+, células CD4+ y células CD45RO+.

41. Método según la reivindicación 38, en el que dicho receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero es un receptor de quimiocinas CC 2 humano.

42. Método según la reivindicación 38, en el que dicha quimiocina se selecciona de MCP-1, MCP-2, MCP-3, MCP-4 y combinaciones de los mismas.

43. Método in vitro de inhibición de una función asociada con la unión de una quimiocina a un receptor de quimiocinas CC 2 (CCR2) o una parte funcional de dicho receptor, que comprende poner en contacto una composición que comprende el CCR2 o parte del mismo con una cantidad eficaz de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21.

44. Método según la reivindicación 43, en el que la quimiocina se selecciona del grupo que consiste en MCP-1, MCP-2, MCP-3 MCP-4 y combinaciones de las mismas.

45. Método según la reivindicación 43, en el que dicha función se selecciona del grupo que consiste en:

(a)

actividad de señalización, por ejemplo,

(i)

activación de una proteína G de mamífero;

(ii)

inducción de un aumento rápido y transitorio en la concentración de calcio libre citosólico [Ca^{2+}]I; y

(iii)

combinaciones de (i) e (ii).

(b)

estimulación de una respuesta celular, por ejemplo,

(i)

estimulación de quimiotaxia;

(ii)

exocitosis;

(iii)

liberación de mediadores inflamatorios por los leucocitos;

(iv)

activación de integrinas;

(v)

activación de células T;

(vi)

desgranulación leucocitaria; y

(vii)

combinaciones de (i), (ii), (iii), (iv), (v) y (vi); y

(c)

combinaciones de (a) y (b).

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46. Método según la reivindicación 43, en el que dicha composición es una célula que porta el receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero.

47. Método según la reivindicación 46, en el que dicha célula se selecciona del grupo que consiste en linfocitos, monocitos, granulocitos, células T, basófilos, células dendríticas, eosinófilos, mastocitos, y células que comprenden un ácido nucleico recombinante que codifica para CCR2 o una parte del mismo.

48. Método según la reivindicación 47, en el que dichas células T se seleccionan del grupo que consiste en células CD8+, células CD25+, células CD4+ y células CD45RO+.

49. Método según la reivindicación 43, en el que dicho receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero es un receptor de quimiocinas CC 2 humano.

50. Método in vitro de detección o identificación de un agente que se une a un receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero o variante de unión a ligando del mismo, que comprende combinar:

a)

un agente que va a someterse a prueba;

b)

un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21; y

c)

una composición que comprende un receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero o una variante de unión a ligando del mismo,

en condiciones adecuadas para la unión de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo a dicho receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero o variante de unión a ligando del mismo, y detectar o medir la unión de dicho anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo a dicho receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero o variante de unión a ligando del mismo, en el que una disminución en la cantidad de complejo formado en relación con un control adecuado es indicativa de que el agente se une a dicho receptor o variante de unión a ligando del mismo.

51. Método según la reivindicación 50, en el que dicha composición que comprende un receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero o una variante de unión a ligando del mismo es: una célula que porta el receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero recombinante o variante de unión a ligando del mismo, una célula que expresa de manera natural el receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero o una variante de unión a ligando del mismo, o una fracción de membrana de dicha célula que porta el receptor de quimiocinas CC 2 recombinante o variante de unión a ligando del mismo.

52. Método según la reivindicación 50, en el que el agente es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que tiene especificidad por un receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero.

53. Método según la reivindicación 50, en el que dicho receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero o variante de unión a ligando del mismo es un receptor de quimiocinas CC 2 humano o variante de unión a ligando del mismo.

54. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 50-53, que comprende además evaluar el agente para determinar el efecto terapéutico.

55. Método de detección de la expresión del receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero es una muestra, que comprende poner en contacto la muestra con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21 en condiciones apropiadas para la unión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo al receptor, determinar si se produce unión entre el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y el receptor para formar un complejo, en el que un complejo es indicativo de la presencia del receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero en la muestra.

56. Método según la reivindicación 55, en el que la muestra es un fluido corporal tal como sangre o saliva.

57. Método según una cualquiera de las reivindicaciones 55 ó 56, en el que el receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero es un receptor de quimiocinas CC 2 humano.

58. Método in vitro de detección de la expresión del receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero por una célula, que comprende:

poner en contacto una célula con un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21 en condiciones apropiadas para la unión del anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo al receptor,

determinar si se produce unión entre el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo y el receptor para formar un complejo,

en el que un complejo es indicativo de la expresión del receptor de quimiocinas CC 2 de mamífero por la célula.

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59. Método según la reivindicación 58, en el que la célula se selecciona del grupo que consiste en monocitos y células T.

60. Método según la reivindicación 59, en el que dichas células T se seleccionan del grupo que consiste en células CD8+, células CD25+, células CD4+ y células CD45RO+.

61. Uso de un anticuerpo o parte de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21 en la preparación de un medicamento para inhibir el tráfico leucocitario en un sujeto en el que el tráfico leucocitario está asociado con uno o más de: una enfermedad o un estado alérgico o inflamatorio; una enfermedad autoinmunitaria; rechazo de un injerto, aterosclerosis, un cáncer con infiltración de leucocitos de la piel u órganos, estenosis, reestenosis e inmunosupresión.

62. Uso según la reivindicación 61, en el que el medicamento es para inhibir la migración de células T.

63. Uso de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-22 en la preparación de un medicamento para tratar un trastorno, seleccionándose el trastorno de una enfermedad o un estado alérgico o inflamatorio, una enfermedad autoinmunitaria, rechazo de un injerto, aterosclerosis, un cáncer con infiltración de leucocitos de la piel u órganos, estenosis, reestenosis e inmunosupresión.

64. Uso según la reivindicación 63, en el que dicho trastorno es un trastorno autoinmunitario tal como artritis reumatoide o esclerosis múltiple.

65. Uso según la reivindicación 63, en el que el trastorno es aterogénesis, asma o aterosclerosis.

66. Uso de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21, en la preparación de un medicamento para tratar o prevenir la estenosis o reestenosis en un sujeto.

67. Uso según la reivindicación 66, en el que la reestenosis está asociada con intervención vascular en el sujeto tal como angioplastia, colocación de endoprótesis o ambos.

68. Uso de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21 en la preparación de un medicamento para inhibir el estrechamiento de una luz de un vaso en un sujeto.

69. Uso según la reivindicación 68, en el que el estrechamiento de la luz de un vaso está asociado con intervención vascular en el sujeto tal como angioplastia, colocación de endoprótesis o ambos.

70. Uso de un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo según una cualquiera de las reivindicaciones 1-21 en la preparación de un medicamento para inhibir la hiperplasia de la neoíntima de un vaso de un sujeto.

71. Uso según la reivindicación 70, en el que la hiperplasia de la neoíntima del vaso está asociada con intervención vascular en el sujeto tal como angioplastia, colocación de endoprótesis o ambos.

72. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 61-71, en el que el sujeto es un ser humano.

73. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 61-71, en el que el medicamento se formula para administración parenteral tal como administración intravenosa o inyección o infusión subcutánea.

74. Uso según una cualquiera de las reivindicaciones 61-71, en el que el medicamento se prepara para la administración con otro fármaco o agente tal como un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un receptor de quimiocinas distinto al receptor de quimiocinas CC 2, o \gamma-globulina, inmunoglobulina o ambas.

75. Uso según la reivindicación 74, en el que el anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une a un receptor de quimiocinas distinto al receptor de quimiocinas CC 2 es un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al receptor de quimiocinas CC 3 o un anticuerpo o fragmento de unión a antígeno del mismo que se une al receptor de quimiocinas CC 5.