KR101175416B1

KR101175416B1 - Ｃｘｃｌ10과 이의 수용체인 ｃｘｃｒ3의 결합 억제를 이용한 골전이 억제 방법

Info

Publication number: KR101175416B1
Application number: KR1020090114896A
Authority: KR
Inventors: 이장희
Original assignee: 서울대학교산학협력단
Priority date: 2009-11-26
Filing date: 2009-11-26
Publication date: 2012-08-20
Also published as: KR20110058198A

Abstract

본 발명은 CXCL10에 특이적인 항체를 이용한 암세포의 골전이 억제 방법; CXCL10에 특이적인 항체 또는 CXCL10 및 CXCR3 수용체와의 결합억제제를 유효성분으로 함유하는 암세포의 골전이에 의한 전이성 암질환을 치료 및 예방하기 위한 약학 조성물; 및 siRNA를 이용하여 암세포에서의 CXCR3의 발현을 억제시킴을 포함하는 암세포의 골전이를 억제하기 위한 억제 방법에 관한 것이다.

CXCL10, CXCR3 수용체, 골전이, siRNA, 암세포

Description

ＣＸＣＬ10과 이의 수용체인 ＣＸＣＲ3의 결합 억제를 이용한 골전이 억제 방법 {Method to inhibit the bone metastasis by blocking of interaction between CXCL10 and its receptor CXCR3}

[문헌 1] DeVita VT, Hellman S, Rosenberg SA. Cancer: principles and practice of oncology. 7th ed. Lippincott: Williams and Wilkins Ltd; 2004.

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유방암, 전립선암, 대장암등 다양한 암세포들이 골(뼈)로 전이가 되는 것으로 알려져 있고, 폐, 간에 이어서 세 번째로 흔한 전이 장소로 알려져 있다. 이러한 암들의 골(뼈)전이는 단순한 전이뿐 아니라, 골수에서 골의 생성에 관여하는 조골세포에의 영향, 골의 흡수에 관여하는 파골세포에 영향을 미쳐, 궁극적으로는 과도한 골 흡수를 야기시키며, 이것이 다시 암세포에 영향을 주어 암세포의 증식을 촉진시키는 일련의 악순환 과정을 유도하게 된다. 골 전이암의 하나인 유방암은 2004년 미국에서만 일 년에 41,500의 새로운 유방암 환자가 발생되었으며 이들 중 80%-90%가 골 조직으로 암세포가 전이되어 골 조직을 약화로 쉽게 골절이 발생하여 더욱 큰 고통을 주는 치명적인 질환이 되며(DeVita VT, Hellman S, Rosenberg SA. Cancer: principles and practice of oncology. 7th ed. Lippincott: Williams and Wilkins Ltd; 2004. 문헌 1), 한국에서도, 최근 식생활이 서구화 되고 인스턴트 음식, 동물성 지방 과다 섭취, 음주, 여성 호르몬의 불균형으로 2001년에 유방암 발생률이 16.1%로 여성 암 중에서 가장 많은 비중을 차지하고 있으며 2004년 우리나라 유방암 환자는 9668명으로 최근 들어 급속도로 유방암 환자가 늘어나고 있다. 그러나 유방암 치료제로 사용되는 엑스메스테인, 타목시펜, 허셉틴(Herceptin), 페마라(femara)등의 시약들은 암세포 뿐 아니라 정상 세포에 악영향을 주는 부작용을 가지고 있으며 암세포의 골 조직 전이에 의한 골 손실을 억제하지 못하고 골 조직 손상 치료제인 비스포스포네이트(Deil IJ, Solomayer EF, Bastert G. Treatment of metastatic bone disease in breast cancer, bisphosphonates. Clin Breast Cancer 2000, 1:4351. 문헌 2)가 사용되지만 이것 역시 부작용이 있고 유방암 환자의 고통을 반감 시키지 못한다. 따라서 암세포가 골 조직으로 전이되는 작용기전을 규명하고 암세포의 전이를 예방 또는 치료할 수 있는 치료제의 개발이 절실히 요구되고 있다. 골전이암에 의한 골소실 연구는 암세포에 의한 파골세포의 분화 촉진 기전연구가 주를 이루고 있으며, 어떠한 기전에 의해 암세포가 뼈로 전이 또는 증식이 촉진되는 지의 연구는 거의 잘 밝혀져 있지 않으며 in vitro 상에서의 결과로의 추측에 의존하고 있다. 최근에 골 생성 및 흡수에 관여하는 세포들로부터 또는 골 흡수에 의한 뼈의 기질로부터 방출된 여러 인자들이 암 전이에 따른 골 소실에의 관여가 다소 밝혀짐으로써 골 흡수 억제제를 통한 골 소실을 감소시키려는 연구가 시도되고 있다. 따라서, 골흡수에 관여하는 파골세포 분화의 중추적 인자인 RANKL의 억제수용체(decoy receptor)로 작용하는 osteoprotegerin(OPG)을 이용한 Fc-OPG를 다발성 골수종 환자와 유방암 환자대상으로 피하 주사한 경우, 골 소실이 감소되는 것을 확인하였다(Body 등, 2003. 문헌 3). 또한, 대표적인 골흡수 억제제로 골다공증 치료제로 사용하고 있는 bisphosphonate 계열의 제제는 암 세포에 의한 골 소실억제와 더불어 암세포들의 뼈에의 부착 및 증식을 억제한다는 보고가 되고 있다(Stresing 등, 2007. 문헌 4). 그러나 기존에 사용되고 있는 골억제제인 비스포스포네이트(bisphosphonate)의 경우, 투여방법이 까다롭고 심각한 소화계통의 이상반응을 유발하는 등 약물 투여 시 겪는 부작용이 심각하여 새로운 치료제 개발이 절실히 요구된다.

이에 본 발명자는 키모카인 중 하나인 CXCL10(다른말로 하면, IP-10, interferon gamma inducible protein-10)이 암세포가 골(뼈)로 전이하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 CXCL10의 수용체이며 암세포에 발현하는 CXCR3에 대한 RNA interference system을 이용하여 CXCR3의 발현이 억제된 암세포주와 CXCL10 유전자가 결핍된 마우스를 사용하여 증명하였다. 이러한 사실에 기초하여 CXCL10에 대한 특이적인 항체를 사용하여 CXCL10의 기능을 억제함으로써 골전이를 억제하였으며, 아울러 CXCL10과 이의 수용체인 CXCR3의 결합을 억제하는 화합물을 사용하여 CXCL10의 기능을 억제함으로써 골전이를 억제하는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.

상기의 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 CXCL10에 특이적인 항체를 이용한 암세포의 골전이 억제 방법을 제공한다.

또한 본 발명은 CXCL10에 특이적인 항체를 유효성분으로 하고 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 암세포의 골전이에 의한 전이성 암질환을 치료 및 예방하기 위한 약학 조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 암세포의 골전이에 의한 전이성 암질환으로는 전이성 유방암, 전이성 전립선암, 전이성 대장암, 전이성 폐암, 전이성 간암, 전이성 신장암, 전이성 방광암, 전이성 흑색종, 전이성 다발성 골수종, 전이성 갑상선암등을 포함한다.

본원에서 정의되는 CXCL10 특이적인 항체로는 인간, 포유류, 가금류, 소동물에서 유래된 CXCL10에 특이적인 항체, 바람직하게는 인간 CXCL10에 특이적인 항체,보다 바람직하게는 CXCL10 중화항체로서 당업계에 잘 알려진 항체 제조방법으로 제조된 것을 포함한다.

또한 본 발명은 CXCL10을 유효성분으로 함유하는 암세포의 골전이를 예측하기 위한 마커(marker)를 제공한다.

또한 본 발명은 암세포의 골전이를 예측하기 위한 마커(marker)로서의 CXCL10의 용도를 제공한다.

또한 본 발명은 상기에 정의한 바와 같은 CXCL10 및 탐지 가능한 라벨(label)을 포함하는 암세포의 골전이를 탐지하기 위한 진단용 키트(kit)에 관한 것이다.

또한 본 발명은 암세포의 골전이에 의한 전이성 암질환을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한, CXCL10에 특이적인 항체의 용도를 제공하는 것이다.

또한 본 발명은 암세포의 골전이에 의한 전이성 암질환을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한, CXCL10 및 CXCR3 수용체와의 결합억제제의 용도를 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 CXCL10 및 CXCR3 수용체와의 결합억제제를 유효성분으로 하고 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 암세포의 골전이에 의한 전이성 암질환을 치료 및 예방하기 위한 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 또 다른 측면은 효과적인 양의 CXCL10에 특이적인 항체를 암세포 의 골전이에 의한 전이성 암질환을 갖는 객체에게 투여함을 포함하는, 상기 전이성 암질환을 치료하기 위한 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 siRNA를 이용하여 암세포에서의 CXCR3의 발현을 억제시킴을 포함하는 암세포의 골전이를 억제하기 위한 억제 방법을 제공하는 것이다.

본 발명의 또 다른 측면은 효과적인 양의 CXCL10 및 CXCR3 수용체와의 결합억제제를 암세포의 골전이에 의한 전이성 암질환을 갖는 객체에게 투여함을 포함하는, 상기 전이성 암질환을 치료하기 위한 치료 방법을 제공하는 것이다.

본 발명은 인간 객체에 대하여 예방적(preventive) 또는 교정적인(curative) 치료 목적으로 단독 또는 타 활성제(active agents) 또는 치료법(treatment)과의 조합으로 사용가능하다.

본 발명의 CXCL10 특이적인 항체는 하기와 같은 방법으로 수득가능하다:

예를 들어, 펩타이드 서열(NP_067249; Seq. #7)의 중화 항체(PeproTech 사; Catalog # 500-P129, Rocky Hill, NJ; chemokine (C-X-C motif) ligand 10 precursor [Mus musculus])의 아미노산 서열 중 약 77개의 CXCL10 아미노산에 해당하는 서열을, 대장균에 발현시켜 정제하여 얻은 유전자 재조합 단백질을 인간, 포유류, 가금류, 토끼 등의 소동물에 주사하여 다클론 항체를 수득가능한데, 문헌(Antibodies A Laboratory Manual, by Ed Harlow and David Lane, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York)의 표준 체세포 혼성화 기술로 제조가능하다.

원칙적으로 체세포 절차가 바람직하기는 하지만 다클론 항체의 다른 제조 기술, 예를 들어, B 림프구의 바이러스성 또는 발암성 형질전환법이 이용가능하다.

본원에서 정의되는 “CXCL10에 특이적인 다클론 항체‘는 서열번호 9의 아미노산, 바람직하게는 상시 서열과 95% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열, 보다 바람직하게는 98% 이상의 상동성을 갖는 아미노산 서열을 포함하는 CXCL10에 특이적인 항체, 바람직하게는, 다클론 항체를 포함한다.

본 발명의 CXCL10은 암세포가 골(뼈)로 전이하는 데 중요한 역할을 한다는 것을 CXCR3에 대한 RNA interference system을 이용하여 CXCR3의 발현이 억제된 암세포주와 CXCL10 유전자가 결핍된 마우스를 사용하여 증명하였으며, CXCL10에 대한 특이적인 항체를 사용하여 CXCL10의 기능을 억제함으로써 골 전이를 억제함을 확인하였으며(실시예 3 참조), 아울러 CXCL10과 이의 수용체인 CXCR3의 결합을 억제하는 화합물을 사용하여 CXCL10의 기능을 억제함으로써 골 전이를 억제하는 것을 확인하였다(실시예 4 참조).

본 발명의 조성물은, 조성물 총 중량에 대하여 상기 항체 또는 화합물을 0.1 내지 50% 중량으로 포함한다.

그러나 상기와 같은 조성은 반드시 이에 한정되는 것은 아니고, 환자의 상태 및 질환의 종류 및 진행 정도에 따라 변할 수 있다.

본 발명의 항체 또는 화합물을 포함하는 조성물은 약학적 조성물의 제조에 통상적으로 사용하는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.

본 발명에 따른 항체 또는 화합물을 포함하는 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있으며, 화합물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 항체 또는 화합물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 칼슘카보네이트(calcium carbonate), 수크로스(sucrose) 또는 락토오스(lactose), 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스티레이트 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜(propylene glycol), 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트 윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

본 발명의 항체 또는 화합물의 바람직한 투여량은 환자의 상태 및 체중, 질병의 정도, 약물형태, 투여경로 및 기간에 따라 다르지만, 당업자에 의해 적절하게 선택될 수 있다. 그러나 바람직한 효과를 위해서, 항체 또는 화합물은 1일 0.01 mg/kg 내지 10 g/kg으로, 바람직하게는 1 mg/kg 내지 1 g/kg으로 투여하는 것이 좋다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수 있다. 따라서 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다.

본 발명의 조성물은 쥐, 생쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내(intracerebroventricular) 주사에 의해 투여될 수 있다.

또한, 본 발명은 상기 CXCL10 단백질을 포함하는 암세포의 골 전이를 예측하기 위한 마커(marker)를 제공한다.

또한 암세포의 골 전이를 예측하기 위한 마커(marker)로서의 CXCL10 단백질의 용도를 제공한다.

추가적으로, 본 발명은 CXCL10 단백질 및 탐지 가능한 라벨(label)을 포함하는 암세포의 골 전이를 검출하기 위한 진단용 키트(kit)를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 항체를, 암세포의 골 전이를 포함하는 시료에 반응시키고, 상기 항체에 대하여 양성반응을 탐지하여 암세포의 골 전이를 검출하는 방법, 또는 상기 항체를 포함하는 암세포의 골 전이 검출 키트에 관한 것이다.

상기 검출수단은 유세포측정, 면역조직화학염색, 효소결합 면역흡착 분석(enzyme liked immunosorbent assay:ELISA), 방사선 면역측정법(radioimmunoassay: RIA), 효소 면역분석(enzyme immunoassay: EIA), 형광면역분석(Floresence immunoassay: FIA) 및 발광면역분석(luminescence immunoassay: LIA)으로 이루어진 군으로부터 선택된 방법을 실시하기 위한 통상의 물질 일 수 있다. 즉, 표지수단으로는 효소의 경우 HRP(horse radishperoxidase)가 있으며, 형광물질로는 FITC(Fluoresceinthiocarbamyl ethylenediamine)가, 발광물질로는 루미놀(luminol), 이소루미놀 및 루시게닌(lucigenin)이, 방사선 동위원소로는 125I, 3H, 14C 및 131I가 있으나 이에 한정되는 것은 아니다. 상기 표지수단에 의한 표지여부는 효소의 기질이나, 형광, 발광 또는 방사선을 측정하기 위한 도구를 이용하여 확인가능하다. 일예로 상기 항체는 ELISA 키트 또는 스트립 키트로 제조될 수 있다.

본 연구는 암세포의 표면에 해당하는 캡시드 단백질의 보존적이고 항원성을 나타내는 펩타이드 항원을 제조하고 쥐와 토끼를 사용하여 다클론 항체를 제조가능하다. 이러한 다클론 항체의 제작은 암세포의 신속하고 정확하게 검체를 확인할 수 있는 도구로써 사용이 가능하다. 이러한 항체는 암세포의 생물학적 특성을 연구할 수 있는 기본적인 도구를 제공할 뿐만 아니라 진단 등에 응용이 가능한 중요한 기능을 가지고 있다.

예를 들어, 다클론 항체의 제작과정은 CXCL10 단백질에 대한 특이 항체를 만들기 위해 CXCL10 단백질을 제각기 동량의 프룬드 컴퍼리트 어쥬번트(Freund's Complete adjuvant)와 혼합하여 토끼의 임파선에 주사하여 면역시키는 제 1정제품 면역단계를 실행한 후, 수일 간격으로 CXCL10 단백질와 동량의 프룬드 인컴퍼리트 어쥬번트와 섞어 피하에 수회 주사하는 제 2정제품 면역단계를 수행하였다.

상기 제2정제품 면역단계를 통해 CXCL10 단백질을 토끼에 수회 마지막주사 후에 면역 확인을 위하여 토끼 혈액으로부터 혈청을 분리하여 웨스턴 이뮤노 부롯팅법(Western immuno blot)으로 항체 특이성을 조사한다.

즉, 토끼의 경동맥을 절단하여 전 채혈하는 채혈단계를 수행한 다음, 채혈된 혈액을 1 내지 10℃, 바람직하게는 약 4℃에서 10시간 내지 24시간 동안, 바람직하게는, 14시간 내지 18시간 동안 비등화시킨 후, 원심 분리를 수행하여 항혈청을 분리하는 항혈청 분리단계를 수행하였으며, 분리된 각각의 항혈청을 분주 및 동결 건조시킨 후, 사용할 때까지 냉동 보관한다.

상기 다클론 항체 제작방법은 본원에서 단순히 참고로 개시한 것일 뿐, 어떠한 목적 또는 의도로든 본 발명의 범위를 제한하거나 한정하고자 함이 아니다.

또한, 본 발명은 암세포의 골 전이에 의한 전이성 암질환을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한, CXCL10에 특이적인 항체의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 암세포의 골 전이에 의한 전이성 암질환을 치료하기 위한 약제를 제조하기 위한, CXCL10 및 CXCR3 수용체와의 결합 억제제의 용도를 제공한다.

또한, 본 발명은 CXCL10 및 CXCR3 수용체와의 결합억제제를 유효성분으로 하고 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 암세포의 골 전이에 의한 전이성 암질환을 치료 및 예방하기 위한 약학 조성물을 제공한다.

본원에서 정의되는 “CXCL10 및 CXCR3 수용체와의 결합 억제제”는 2-(2-아세틸-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)-1-(4-니트로페닐)에탄온(화학식 1)(Hayes 등, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 18:1573-1576, 2008. 문헌 6), 데카노익산{1-[3-(4-시아노-페닐]-4-옥소-3,4-디히드로-퀴나졸린-2-일]-에틸}-(2-디메틸아미노-에틸)-아미드(VUF 5834; 화학식 2), N-(1-(3-(4-에톡시페닐)-4-옥소-3,4-디히드로피리도(2,3-d)피리미딘-2-일)에틸)-N-피리딘-3-일메틸-2-(4-트리플루오로메톡시페닐)아세트아미드(AMG487; 화학식 3), N-1R-(3-(4-에톡시페닐)-4-옥소-3,4-디히드로피리도(2,3-d)피리미딘-2-일)-에틸-N-피리딘-3-일메틸-2-(4-플루오로-3-트리풀로오로메틸페닐)아세트아미드(NBI-74330; 화학식 4)(Stefania 등, Synthesis and Structure-Activity Relationships of 3H-Quinazolin-4-ones and 3H-Pyrido[2,3-d]pyrimidin-4-ones as CXCR3 receptor antagonists. 문헌 7) 등과 같은 공지의 “CXCL10 및 CXCR3 수용체와의 결합 억제제”또는 신규한 결합 억제제를 포함한다.

또한, 본 발명은 효과적인 양의 CXCL10에 특이적인 항체를 암세포의 골 전이에 의한 전이성 암질환을 갖는 객체에게 투여함을 포함하는, 상기 전이성 암질환을 치료하기 위한 치료 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 CXCR3-siRNA를 이용하여 암세포에서의 CXCR3의 발현을 억제 시킴을 포함하는 암세포의 골 전이를 억제하기 위한 억제 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 효과적인 양의 CXCL10 및 CXCR3 수용체와의 결합억제제를 암세포의 골 전이에 의한 전이성 암질환을 갖는 객체에게 투여함을 포함하는, 상기 전이성 암질환을 치료하기 위한 치료 방법을 제공한다.

상기와 같이, 본 발명의 CXCL10에 대한 특이적인 항체는 CXCL10의 기능을 억제함으로써 골 전이를 억제함을 확인하였으며, 아울러 CXCL10과 이의 수용체인 CXCR3의 결합을 억제하는 화합물은 CXCL10의 기능을 억제함으로써 골 전이를 억제하므로 암세포의 골 전이에 의한 전이성 암질환을 치료 및 예방하는데 유용하게 사용가능하다.

이하, 본 발명을 하기 참고예 및 실험예에 의하여 상세히 설명한다. 단, 이는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용은 이에 의해 한정되는 것은 아니다.

실시예 1. 유방암 및 흑색종 세포주를 이용한 마우스 골전이암 모델 확립

암세포를 이용한 마우스 골 전이 모델을 확립하기 위하여 사용한 유방암 세포주는 MDA-MB231으로 인간의 유방암에서 유래되었으며, 흑색종 세포주는 B16F10으 로 C57BL/6 마우스 종에서 유래된 것으로 모두 한국세포주은행(Seoul, Korea)에서 구입하여 사용하였다. 암세포주의 배양에 사용한 배지는 10% 우태아혈청(fetal calf serum)과 페니실린(100 U/ml), 스트렙토마이신(100 ug/ml)이 포함된 DMEM(Dulbecco's Modified Eagle's Medium, WelGENE, Korea)을 사용하였다. 배지는 최소 3일에 한번 갈아주며, 암세포주의 분리는 최소 1 : 4 이상의 비율로 하며, 세포배양접시에 70% 이하를 차지할 때까지 배양하여 사용하였다. Trypsin-EDTA(Invitrogen)를 이용하여 암세포주를 배양접시에서 분리한 후에 인산완충용액(Phosphate buffered saline containing sodium chloride, sodium phosphate, and potassium chloride and potassium phosphate, pH 7.2~7.4) 0.1 ml 당 1 × 10⁵ 세포를 균일하게 부유시켜 마우스에 주입할 수 있도록 준비하였다.

유방암 세포주인 MDA-MB231은 인간에서 유래된 것이기 때문에 마우스에 주입 시 면역거부반응을 나타나지 않고 성장하기 위하여 면역결핍 마우스인 암컷의 athymic BALB/C nude mice(NIH/ Charles River, Bethesda, MD)를 사용하며, 흑색종 세포주인 B16F10은 C57BL/6 마우스 종에서 유래된 것이어서 C57BL/6 마우스종(NIH/ Charles River, Bethesda, MD)을 사용하였다. 마우스를 1.2% Avertin(2,2,2-Tribromoethanol, 2-methyl-2-butanol, Sigma-Aldrich사, St. Louis, MO)을 이용하여 마취를 시킨 후, 상기에서 기술한 준비된 암 세포주를 30 게이지 주사바늘을 이용하여 문헌에 기재된 방법으로 좌심실에 주입하였다.

암세포주마다 뼈로 전이되는 시기가 각각 다르다. 흑색종세포주인 B16F10의 경우, 암 세포주를 주입한 후 10일 부터 확인 되며, 보통 12~14일째 희생시켜 확인한다. 아울러 B16F10은 검정색의 멜라닌 색소를 내기 때문에 전이가 일어난 장기를 적출 후 바로 눈으로 확인 가능하다. 흑색종 세포주인 B16F10에 의한 골 파괴는 관찰하기가 용이하지 않다. 왜냐하면 이 암 세포주는 골파괴능이 있음에도 불구하고 골 파괴가 발생하기 전에 마우스의 생명유지에 중요한 장기(폐, 난소, 골 등)로 전이되어 사망하기 때문이다(약 20일 전후). 그렇지만 악골로의 전이에 의한 치조골의 파괴는 관찰할 수 있다(Arguello F 등, Cancer Research 1988, 23:6876-6881. 문헌 8). B16F10 세포주에 의한 골 파괴 현상을 관찰하기 위한 방법으로는 세포주를 직접 경골내 주입(direct intratibial injection)으로 유도할 수 있다. 이 경우에는 심장내 주입에 의한 전이와는 달리 국소적으로 암세포주를 주입하기 때문에 생명에 필수적인 중요한 장기에 영향을 주지 않아 국소적인 골 파괴를 관찰할 수 있으며, 약 14일 정도부터 골 파괴가 발생한다(Bakewell SJ 등, Proc Natl Acad Sci U S A. 2003, 24:14205-14210. 문헌 9).

유방암 세포주인 MDA-MB231 경우에는 골 전이에 의한 골 파괴는 암세포 주입 후 5~7주 정도에 확인이 가능하다. 즉, 이 시기에 soft X-ray (CMB-2, SOFTEX, Ebina-city, Japan)를 통하여 골 파괴정도를 확인하고 마우스를 희생 시킨 후 다음 단계로 넘어갔다.

뼈로 전이된 암세포에 의한 골 파괴 정도의 분석을 위하여 적출된 경골을 인산완충용액으로 3-4회 수세한 다음에 4% 파라포름알데하이드 용액에 24시간 고정하였다. 고정이 끝난 마우스 경골은 마이크로전산화단층촬영(micro-computed tomography scan, SMX-90CT, Shimadzu, Japan)을 수행하였다. 또한, 조직학적 분석을 위하여 촬영이 끝난 경골을 12% EDTA 용액(pH7.2 - 7.4)에서 14일 동안 탈회(2-3일에 한 번씩 용액을 교환해줌)시킨 후에 파라핀에 포매하였다. 포매된 절편에 헤마톡실린-에오신 염색과 TRAP 염색(Sigma-Aldrich사, St. Louis, MO)을 시행하여 전체적인 조직학적 사진과 파골세포를 관찰하였다.

마우스의 생존능 검사(Survival assay)는 암세포주를 심장내로 주입 후에 마우스가 죽는 날짜를 각각 기록하여 Log-rank (Mantal-Cox) test(Mantel N. Cancer Chemother Rep. 1966, 3:163-170. 문헌 10)로 통계 처리하여 Kaplan-Meier curves를 통해 나타냈다.

실시예 2. CXCL10 의 수용체인 CXCR -3 결핍 암세포주의 제작과 골전이능 확인

CXCL10이 이의 수용체인 CXCR3와 상호작용하여 골 전이에 중요한 역할을 한다는 것을 증명하기 위하여 암세포에 존재하는 CXCL10의 수용체인 CXCR3을 RNA interference system (Tuschl 등, Genes and Development 24:3191-3197, 1999; Elbashir 등, Nature 6836:494-498, 2001. 문헌 11)을 이용하여 CXCR3 유전자를 발현되지 않는 암세포주를 제작하였다. 본 실험에서 사용된 siRNA 시스템은 OligoEngine사(Seattle, WA)의 polymerase-III H1-RNA gene promoter가 있는 pSUPER 벡터(pSUPER.puro, catalog# VEC-PBS-0008)를 사용하였다 (Brummelkamp 등, Science 5567:550-553, 2002. 문헌 12).

인간유방암세포주인 MDA-MB231은 인간 CXCR3 유전자 서열(Seq. #1: NCBI GenBank 유전자 서열 : AY242128)을 참고하여 표 1 및 표 2에 기재된 염기서열(Seq. #3 및 #4)을 이용하여 인간 CXCR3 siRNA 제작에 사용하였으며, 마우스 흑색종세포주의 경우에는 마우스 CXCR3 유전자 서열(Seq. #2: NCBI GenBank 유전자 서열 : NM_009910) 을 참고하여 표 3 및 표 4에 기재된 염기서열(Seq. #5 및 #6)을 이용하여 마우스 CXCR3 siRNA 제작에 사용하였다.

인간 CXCR3 siRNA 제작에 사용된 염기서열(Seq. #3)

Forward

5'-gatcccc cacaccacccagcagccag ttcaagaga ctggctgctgggtggtgtg ttttta-3'

인간 CXCR3 siRNA 제작에 사용된 염기서열(Seq. #4)

Reverse

5'-agcttaaaaa cacaccacccagcagccag tctcttgaa ctggctgctgggtggtgtg ggg-3'

마우스 CXCR3 siRNA 제작에 사용된 염기서열(Seq. #5)

Forward

5'-gatcccc caggcgccttgttcaacat ttcaagaga atgttgaacaaggcgcctg ttttta-3'

마우스 CXCR3 siRNA 제작에 사용된 염기서열(Seq. #6)

Reverse

5'-agcttaaaaa caggcgccttgttcaacat tctcttgaa atgttgaacaaggcgcctg ggg-3'

상쇄하고자 하는 CXCL10에서 CXCR3수용체와 결합하여 골전이로 가는 단백질 합성을 도와주는 mRNA인 target mRNA의 19개의 염기 서열(밑줄표시)을 포함하는 60-염기 올리고머 Forward와 Reverse 각각을 제작하였다(Bioneer, 대전, 대한민국). 제작된 Forward 와 Reverse 각각을 annealing 시킨 후에 pSUPER 벡터의 BglII/HindIII site에 도입시켰다. 도입된 벡터를 대장균에 형질전환을 실시하고 플라스미드를 추출하여 제한효소인 BglII(New England BioLabs, Ipswich, MA, Cat. R0144L)/EcoRI (New England BioLabs, Ipswich, MA, Cat. R0101L)로 처리하여 287bp의 절편이 유리되는 지를 확인하였다. 원하는 자리에 60-염기 올리고머가 잘 도입이 됐는지 확인한 후, 다량으로 플라스미드를 준비하여 다음 실험에 사용하였다. 플라스미드를 함유한 레트로바이러스를 얻기 위하여 인간배아신장세포주인 293T 세포주로부터 유래된 retrovirus packaging cell line인 Platinum-E(Plat-E)(Morita 등, Gene Therapy 12:1063-1066, 2000. 문헌 13)에 상기에서 기술한 플라스미드를 형질전환시켰다. 형질전환 후 6시간이 지난 다음에 신선한 배지로 바꿔주고 12 시간 이상 동안 안정화시키고, 다시 바이러스를 모으기 위해 신선한 배지로 바꿔주었다. 이틀 동안 배양된 배지에 포함된 레트로바이러스를 튜브에 모으고, 얻어진 레트로바이러스를 polybren(6 μg/ml, Sigma-Aldrich, St. Louis, MO) 존재 하에서 암세포주인 MDA-MB231과 B16F10 세포주에 12시간 동안 감염시켰다. 감염이 끝나면 신선한 배지로 갈아주며 12시간에서 24시간 정도 안정화시켰다. 상기에서 제작한 siRNA가 포함된 pSUPER 벡터가 암세포주의 염색체로 안정하게 삽입되어 들어가지 않은 세포들을 없애기 위해 항생제인 puromycin (P8833, Sigma-Aldrich)을 처리하여 죽이고, 일주일 정도의 기간 동안 처리하여 pSUPER를 안정적으로 함유된 세포주를 만들었다(Abramson 등, Immunology Letters 1-2:179-184, 2004). 각각의 벡터(pSUPER-Vector, pSUPER-siCXCR3)를 포함하는 MDA-MB231과 B16F10 세포주를 수득하였고, 각각의 세포주로부터 얻어진 protein과 mRNA를 통해 CXCR3의 발현 정도를 확인하여 siRNA system이 잘 도입 되었는지를 확인하였다. 최종적으로 만들어진 CXCR3의 발현이 결핍된 인간 유방암 세포주와 마우스 흑색종 세포주는 전항에서 기술한 방법에 따라 각각 athymic mice(오리엔트, 가평), C57BL/6 마우스(오리엔트, 가평)의 심장 내에 주입하여 골전이능 실험을 실시하였다.

실험 결과, 도1a는 유방암세포에서 발현되는 CXCR3가 골 전이에 있어서의 중요성을 파악하고자 CXCR3에 대한 RNA interference technology를 이용하여 유방암세포주인 MDA-MB 231 세포주에서 CXCR3의 발현이 억제되었음을 보여주는 도면(V : 비히클 벡터 대조군, si : CXCR3에 특이적인 벡터 사용군)이며, 도1b는 비히클 벡터 와 si-CXCR3 벡터 처리에 의해 만들어진 각각의 유방암 세포주를 athymic BALB/C nude mice의 심장에 주입한 후 6주가 지난 후 골 전이를 유도한 후 관찰한 외형이다. 암세포주가 척추뼈와 장골에 전이되어 척추가 휘어지고 몸집이 왜소해지고 거동이 불편해지는 비히클 벡터 처리 암세포주 주입 마우스에 비해 si-CXCR3 암세포주 처리군에서는 정상적인 마우스의 외형을 관찰할 수 있었다. 또한, 도1c는 상기에서 기술한 각각의 세포주의 골 전이를 유도한 마우스를 희생시켜 얻어진 혈청에서 골 전이에 의해 유도된 골 흡수에 따라 뼈로부터 용해되어 혈청으로 유리된 뼈의 구성성분인 PYD(pyridinoline, 뼈로부터 나온 제1형 콜라젠 분해물)의 양을 측정한 결과를 나타낸 도로서, 비히클 벡터 처리 암세포주 주입군에 비해 si-CXCR3 벡터 처리 암세포주 주입군에서 PYD의 양이 감소되어 있는 것을 확인할 수 있었다.

뼈로 전이된 유방암세포에 의한 골 전이 정도를 확인하기 위하여 포매된 경골 절편을 헤마톡실린-에오신 염색을 실시한 결과, 도 1d에 나타난 바와 같이, 비히클 벡터 처리 세포주를 주입한 마우스의 경골에서는 암세포의 골 전이에 의해 골 흡수가 현저히 일어나 골소주(trabeculae)를 관찰할 수 없고, 골수강(bone marrow) 부위(M으로 표시)에 종양조직으로(T로 표시) 채워져 있는 반면에, si-CXCR3 벡터 처리 세포주를 주입한 마우스에서의 경골에서는 암세포에 의한 골 전이가 현저히 억제되어 골소주를 관찰할 수 있으며, 골수강(M)에 종양조직(T)도 현저히 감소하였음을 확인할 수 있었다. 도 1e 에 나타난 바와 같이, 헤마톡실린-에오신 염색 결과를 토대로 경골로 전이된 암세포 면적을 측정하여 통계 처리한 결과, si-CXCR3 벡터 처리군이 비히클 벡터 처리군에 비하여 전이된 종양의 면적이 현저히 감소하였음을 확인할 수 있었다(p<0.01).

상기에서 기술한 각각의 암세포주의 골 전이로 얻어진 경골을 마이크로전산화단층촬영(micro-computed tomography scan)을 수행하여 뼈의 윤곽을 관찰한 결과, 도 1f에 나타난 바와 같이, 비히클 벡터 처리 암세포주 주입에 의한 광범위한 골흡수가 si-CXCR3 암세포주 주입에서는 거의 관찰되지 않았으며, 상기에서 얻어진 마이크로전산화단층촬영 영상을 이용하여 정량분석을 실시하여 전체 조직에서 골 조직이 차지한 비율인 BV/TV(Bone volume/Tissue volume)와 골소주의 이격도를 나타내는 Tb.Sp(Trabecular separation)의 값을 측정한 결과, 도 1g에 나타난 바와 같이, 비히클 벡터 처리 암세포주 주입군에 비해 si-CXCR3 벡터처리 암세포주 주입군에서 골 조직이 차지하는 비율이 증가하였으며, 골소주의 이격도가 감소하였음을 확인할 수 있었다.

또한, 도 2a에 나타난 바와 같이, 흑색종에서 발현되는 CXCR3가 골 전이에 있어서의 중요성을 파악하고자 RNA interference technology를 이용하여 마우스 흑색종 세포주인 B16F10 세포주에서 CXCR3 발현이 현저히 억제되었음을 RT-PCR로 확인할 수 있었고(V : 비히클 벡터 대조군, si : CXCR3에 특이적인 벡터 사용군), 상기에서 만들어진 각각의 세포주를 C57BL/6 마우스의 심장에 주입시켜 골 전이를 유도하였으며, 2주일이 경과된 후에 장골을 적출하여 뼈로 전이된 흑색종으로부터 발현되는 멜라닌 색소를 관찰한 결과, 도 2b에 나타난 바와 같이, 비히클 벡터 처리 암세포주를 주입한 마우스에서 멜라닌 색소 침착에 비하여, si-CXCR3 처리 암세포주를 주입한 마우스에서 멜라닌 색소의 침착이 현저히 줄어들었다. 즉, 흑색종의 골 전이가 현저히 억제되었음을 확인할 수 있었다. 또한, 뼈로 전이된 흑색종 세포에 의한 골 전이 정도를 확인하기 위하여 포매된 장골 절편을 헤마톡실린-에오신 염색을 실시한 결과, 도 2c에 나타난 바와 같이, 비히클 벡터 처리 세포주를 주입한 마우스의 경골에서는 암세포의 골 전이에 의해 골 흡수가 현저히 일어나 골소주(trabeculae)를 관찰할 수 없고, 골수강(bone marrow) 부위(M으로 표시)에 종양조직으로 (T로 표시) 채워져 있는 반면, si-CXCR3 벡터 처리 세포주를 주입한 마우스에서의 장골에서는 암세포에 의한 골 전이가 현저히 억제되어, 골소주를 관찰할 수 있으며, 골수강(M)에 종양조직(T)도 현저히 적게 관찰되었으며, 헤마톡실린-에오신 염색 결과를 토대로 장골로 전이된 암세포 면적을 측정하여 통계 처리한 결과, 도 2d에 나타난 바와 같이, si-CXCR3 벡터 처리군이 비히클 벡터 처리군에 비하여 전이된 종양의 면적이 현저히 감소함을 확인할 수 있었다.

실시예 3. CXCL10 중화항체를 이용한 골 전이 억제능 및 생존능 확인

뼈내에 존재하는 CXCL10이 암세포의 골 전이에서의 역할을 알아보기 위해서 CXCL10의 기능을 억제시킬 수 있는 중화항체를 이용하였다.

중화항체는 PeproTech 사 (Catalog # 500-P129, Rocky Hill, NJ)에서 제조한 것으로 NCBI (National Center for Biotechnology Information)의 서열(유전자 서열: NM_021274.1-펩타이드 서열: NP_067249 (Seq. #7)-chemokine (C-X-C motif) ligand 10 precursor [Mus musculus])에 해당하는 것으로, 이중 CXCL10 아미노산에 해당하는 약 77개의 서열[유전자 서열(Seq. #8) : 및 아미노산 서열(Seq. #9)]을 대장균에서 발현시켜 정제하여 얻은 유전자 재조합 단백질을 토끼에 주사하여 다클론 항체를 얻었다.

6주령의 암컷 C57BL/6 마우스에 CXCL10 중화항체(rabbit polyclonal antibody, Catalog# 500-P129, PeproTech, Rocky Hill, NJ)를 각 마우스당 200 ug씩 꼬리 정맥으로 주입하였다. CXCL10 중화항체를 주입하고 12시간 뒤에 앞에서 언급한 실험 방법으로 마우스를 마취시킨 후, 마우스흑색종 세포주를 심장으로 주입하였다. 골 전이에서의 CXCL10 중화항체의 효과를 확인하기 위해서 암 세포주 주입 13일 후에 마우스를 희생시켜 뼈로의 전이 정도를 비교 분석하였다. 또한, CXCL10 중화 항체의 생존능에서의 효과를 확인하기 위해서 실시예 1에서와 같은 실험과정을 통하여 마우스가 죽는 날짜를 기록하여 통계 처리하였다.

실험 결과, 키모카인 CXCL10의 중화가 흑색종의 골전이 억제에 미치는 영향을 확인하기 위하여 C57BL/6 마우스 심장에 흑색종 세포를 주입하여 골 전이를 유발시킨 후에 토끼 유래 항-CXCL10 항체를 처리하여 CXCL10의 기능을 중화시키는 실험을 실시하였다. 마우스 꼬리 정맥으로 대조항체와 항-CXCL10항체를 각각 주입하고 12시간 뒤에 흑색종을 심장을 통해 골 전이를 유도한다. 골전이를 유도한 후 2주일 후에 장골을 적출하여 흑색종으로부터 발현되는 멜라닌 색소를 관찰한 결과, 도 4a에 나타난 바와 같이, 대조항체 처리군에 비해 항-CXCL10 항체 처리군에서 멜라닌 색소가 덜 관찰 되어, 흑색종의 골 전이가 현저히 억제되었음을 확인할 수 있었다.

뼈로 전이된 흑색종 세포에 의한 골 전이 정도를 확인하기 위하여 포매된 장골 절편을 헤마톡실린-에오신 염색을 실시한 결과, 도 4b에 나타난 바와 같이, 대조항체를 처리한 마우스의 장골에서는 암세포의 골 전이에 의해 골 흡수가 현저히 일어나 골소주(trabeculae)를 관찰할 수 없고, 골수강(bone marrow) 부위(M으로 표시)에 종양조직으로(T로 표시) 채워져 있는 반면에, 항-CXCL10 항체를 처리한 마우스에서의 장골에서는 암세포에 의한 골 전이가 현저히 억제되어, 골소주를 관찰할 수 있으며, 골수강(M)에 종양조직(T)도 현저히 적게 관찰할 수 있었다. 또한, 헤마톡실린-에오신 염색 결과를 토대로 장골로 전이된 암세포 면적을 측정하여 통계 처리한 결과, 도 4c에 나타난 바와 같이, 항-CXCL10 항체를 처리한 마우스가 대조 항체를 처리한 마우스에 비하여 전이된 종양의 면적이 현저히 감소하였음을 확인할 수 있었다(p<0.01). 항-CXCL10 항체에 의한 골 전이 억제 뿐만 아니라 마우스의 생존능에는 어떤 영향을 미치는지를 알아보았다. 앞에서 언급한 실험 조건에서 마우스를 희생시키지 않고 각각의 처리군에서 죽어가는 날짜를 기록하여 Log-rank(Mantal-Cox) test로 통계 처리하여 Kaplan-Meier curves를 통해 나타내었다. 도 4d에 나타난 바와 같이, 대조항체 처리군과 비교하여 항-CXCL10 항체 처리군에서 마우스의 생존능이 유의성있게 증가되는 것을 확인할 수 있었다(p<0.01).

실시예 4. CXCL10 / CXCR3 결합 억제제를 이용한 골전이억제능 및 생존능 확인

마우스흑색종세포주의 골 전이에 있어서 CXCL10의 기능을 파악하기 위한 또 하나의 방법으로 CXCL10/CXCR3 결합 억제제로 알려진 화합물(2-(2-acetyl-1H-benzo[d]imidazol-1-yl)-1-(4-nitrophenyl)ethanone을 이용할 수 있다. 앞에서 설명한 골 전이 실험을 토대로 암세포주 주입 하루 전(-1일)부터 합성한 화합물을 마우스당 0.1 mg을 복강을 통해 매일 투여하였다. 암세포주 주입 13일 후에 마우스를 희생시켜 화합물을 투여한 마우스와 투여하지 않은 마우스의 골 전이 정도를 비교 분석하였다.

또한, 위와 같은 실험 방법으로 화합물을 투여한 마우스와 투여하지 않은 마우스가 죽는 날짜를 기록하여 생존능에는 어떤 효과가 있는지를 실시예 1에서와 같은 과정을 거쳐 확인하였다.

키모카인 CXCL10과 이의 수용체인 CXCR3와의 결합 억제가 흑색종의 골 전이 억제에 미치는 영향을 확인하기 위하여 C57BL/6 마우스 심장에 흑색종 세포를 주입하여 골 전이를 유발시킨 후 CXCL10과 CXCR3와의 결합을 억제시키는 화합물을 처리하였다. 흑색종 세포를 심장으로 주입하기 하루 전부터 마우스를 희생시키는 날까지 화합물을 복강을 통하여 매일 주입하였다. 골 전이를 유도한 후 2주일 후에 장골을 적출하여 흑색종으로부터 발현되는 멜라닌 색소를 관찰한 결과, 도 5a에 나타난 바와 같이, 대조군으로 사용한 비히클 처리군에 비해 화합물을 처리한 군에서 멜라닌 색소가 덜 관찰 되어, 흑색종의 골 전이가 현저히 억제되었음을 알 수 있었다.

뼈로 전이된 흑색종 세포에 의한 골 전이 정도를 확인하기 위하여 포매된 장골 절편을 헤마톡실린-에오신 염색을 실시한 결과, 도 5b에 나타난 바와 같이, 비히클을 처리한 마우스의 장골에서는 암세포의 골 전이에 의해 골 흡수가 현저히 일어나 골소주(trabeculae)를 관찰할 수 없고, 골수강(bone marrow) 부위(M으로 표시)에 종양조직으로 (T로 표시)으로 채워져 있는 반면에, 화합물을 처리한 마우스에서의 장골에서는 암세포에 의한 골 전이가 현저히 억제되어, 골소주를 관찰할 수 있으며, 골수강(M)에 종양조직(T)도 현저히 적게 관찰되었고, 헤마톡실린-에오신 염색 결과를 토대로 장골로 전이된 암세포 면적을 측정하여 통계 처리한 결과, 도 5c에 나타난 바와 같이, 화합물을 처리한 마우스가 비히클을 처리한 마우스에 비하여 전이된 종양의 면적이 현저히 감소하였음을 확인할 수 있었다(p<0.01). CXCL10과 CXCR3와의 결합을 억제하는 화합물이 골 전이 억제 뿐만 아니라 마우스의 생존능에는 어떤 영향을 미치는지를 알아보았다. 앞에서 언급한 실험 조건에서 마우스를 희생 시키지 않고 각각의 처리군에서 죽어가는 날짜를 기록하여 Log-rank (Mantal-Cox) test로 통계 처리하여 Kaplan-Meier curves로 나타내었다. 도 5d에 나타난 바와 같이, 비히클 처리군과 비교하여 화합물 처리군에서 마우스의 생존능이 유의성있게 증가되는 것을 확인할 수 있었다(p<0.01).

실시예 5. CXCL10 유전자 결핍 마우스의 골 전이 억제능 확인

골 전이에서의 CXCL10의 역할을 파악하기 위한 하나로 CXCL10 유전자 결핍 마우스를 이용하는 것이다. 'The Jackson Laboratory'에서 판매되고 있는 CXCL10 유전자 결핍 마우스인 B6.129S4-Cxcl10(tm1Adl)/J (stock number : 006087)을 골 전이 실험에 사용하였다. 이 유전자 결핍마우스는 C57BL/6J (stock number : 000664) 마우스 종이기 때문에 C57BL/6J에서 기원한 마우스흑색종세포주(B16F10)를 주입하여도 종양거부가 일어나지 않아, 마우스를 이용한 골전이 실험을 진행하였다. 6주령이 된 암컷 마우스(CXCL10-Wild type, CXCL10-Knock out)를 준비한 후, 실시예 1에서 기술한 방법에 따라 흑색종세포주를 마우스 심장 내에 주입하여 골 전이능 실험을 실시하였고, CXCL10 결핍 마우스에서 대조군과 비교하였을 때 어느 정도의 골 전이를 나타내는지를 비교 분석하였다.

CXCR3에 결합하는 리간드인 키모카인 CXCL10이 흑색종의 골전이에 있어 중요한 역할을 수행하는지를 확인하고자 CXCL10이 결핍된 마우스에서 흑색종을 심장에 주입하여 골 전이를 유도하였다. 골전이를 유도한지 2주일이 지나면 희생시켜 포매된 경골 절편을 헤마톡실린-에오신 염색을 실시한 결과, 도 3a에 나타난 바와 같이, 정상 마우스의 경골에서는 암세포의 골 전이에 의해 골 흡수가 현저히 일어나 골소주(trabeculae)를 관찰할 수 없고, 골수강(bone marrow) 부위(M으로 표시)에 종양조직으로 (T로 표시) 채워져 있는 반면에, CXCL10 결핍 마우스의 경골에서는 암세포에 의한 골 전이가 현저히 억제되어, 골소주를 관찰할 수 있으며, 골수강(M)에 종양조직(T)도 현저히 적게 관찰할 수 있었고, 헤마톡실린-에오신 염색 결과를 토대로 경골로 전이된 암세포 면적을 측정하여 통계 처리한 결과, 도 3b에 나타난 바와 같이, CXCL10 결핍 마우스가 정상마우스에 비하여 전이된 종양의 면적이 현저히 감소하였음을 확인할 수 있었다(p<0.01).

하기에 본 발명의 화합물을 함유하는 조성물의 제제예를 설명하나, 본 발명은 이를 한정하고자 함이 아닌 단지 구체적으로 설명하고자 함이다.

제제예 1. 산제의 제조

항-CXCL10항체 20 mg

유당 100 mg

탈크 10 mg

상기의 성분들을 혼합하고 기밀포에 충진하여 산제를 제조한다.

제제예 2. 정제의 제조

항-CXCL10항체 10 mg

옥수수전분 100 mg

유당 100 mg

스테아린산 마그네슘 2 mg

상기의 성분들을 혼합한 후 통상의 정제의 제조방법에 따라서 타정하여 정제를 제조한다.

제제예 3. 캅셀제의 제조

항-CXCL10항체 10 mg

결정성 셀룰로오스 3 mg

락토오스 14.8 mg

마그네슘 스테아레이트 0.2 mg

통상의 캅셀제 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하고 젤라틴 캡슐에 충전하여 캅셀제를 제조한다.

제제예 4. 주사제의 제조

항-CXCL10항체 10 mg

만니톨 180 mg

주사용 멸균 증류수 2974 mg

Na₂HPO₄ _,12H₂O 26 mg

통상의 주사제의 제조방법에 따라 1 앰플당 (2 ml) 상기의 성분 함량으로 제조한다.

제제예 5. 액제의 제조

항-CXCL10항체 20 mg

이성화당 10 g

만니톨 5 g

정제수 적량

통상의 액제의 제조방법에 따라 정제수에 각각의 성분을 가하여 용해시키고 레몬향을 적량 가한 다음 상기의 성분을 혼합한 다음 정제수를 가하여 전체를 정제수를 가하여 전체 100 ml로 조절한 후 갈색병에 충진하여 멸균시켜 액제를 제조한다.

[서열번호 1] NCBI GenBank 유전자 서열 : AY242128 (Seq. #1)

1 atggtccttg aggtgagtga ccaccaagtg ctaaatgacg ccgaggttgc cgccctcctg

61 gagaacttca gctcttccta tgactatgga gaaaacgaga gtgactcgtg ctgtacctcc

121 ccgccctgcc cacaggactt cagcctgaac ttcgaccggg ccttcctgcc agccctctac

181 agcctcctct ttctgctggg gctgctgggc aacggcgcgg tggcagccgt gctgctgagc

241 cggcggacag ccctgagcag caccgacacc ttcctgctcc acctagctgt agcagacacg

301 ctgctggtgc tgacactgcc gctctgggca gtggacgctg ccgtccagtg ggtctttggc

361 tctggcctct gcaaagtggc aggtgccctc ttcaacatca acttctacgc aggagccctc

421 ctgctggcct gcatcagctt tgaccgctac ctgaacatag ttcatgccac ccagctctac

481 cgccgggggc ccccggcccg cgtgaccctc acctgcctgg ctgtctgggg gctctgcctg

541 cttttcgccc tcccagactt catcttcctg tcggcccacc acgacgagcg cctcaacgcc

601 acccactgcc aatacaactt cccacaggtg ggccgcacgg ctctgcgggt gctgcagctg

661 gtggctggct ttctgctgcc cctgctggtc atggcctact gctatgccca catcctggcc

721 gtgctgctgg tttccagggg ccagcggcgc ctgcgggcca tgcggctggt ggtggtggtc

781 gtggtggcct ttgccctctg ctggaccccc tatcacctgg tggtgctggt ggacatcctc

841 atggacctgg gcgctttggc ccgcaactgt ggccgagaaa gcagggtaga cgtggccaag

901 tcggtcacct caggcctggg ctacatgcac tgctgcctca acccgctgct ctatgccttt

961 gtaggggtca agttccggga gcggatgtgg atgctgctct tgcgcctggg ctgccccaac

1021 cagagagggc tccagaggca gccatcgtct tcccgccggg attcatcctg gtctgagacc

1081 tcagaggcct cctactcggg cttgtga

[서열번호 2] NCBI GenBank 유전자 서열 : NM_009910 (Seq. #2)

1 gcaagttccc aaccacaagt gccaaaggca gagaagcagg cagcacgaga cctgacccca

61 gcagccacag ccggagcacc agccaagcca tgtaccttga ggttagtgaa cgtcaagtgc

121 tagatgcctc ggactttgcc tttcttctgg aaaacagcac ctctccctac gattatgggg

181 aaaacgagag cgacttctct gactccccgc cctgcccaca ggatttcagc ctgaactttg

241 acagaacctt cctgccagcc ctctacagcc tcctcttctt gctggggctg ctaggcaatg

301 gggcggtggc tgctgtgcta ctgagtcagc gcactgccct gagcagcacg gacaccttcc

361 tgctccacct ggctgtagcc gatgttctgc tggtgttaac tcttccattg tgggcagtgg

421 atgctgctgt ccagtgggtt ttcggccctg gcctctgcaa agtggcaggc gccttgttca

481 acatcaactt ctatgcaggg gccttcctgc tggcttgtat aagcttcgac agatatctga

541 gcatagtgca cgccacccag atctaccgca gggacccccg ggtacgtgta gccctcacct

601 gcatagttgt atggggtctc tgtctgctct ttgccctccc agatttcatc tacctatcag

661 ccaactacga tcagcgcctc aatgccaccc attgccagta caacttccca caggtgggtc

721 gcactgctct gcgtgtactg cagctagtgg ctggtttcct gctgcccctt ctggtcatgg

781 cctactgcta tgcccatatc ctagctgttc tgctggtctc cagaggccag aggcgttttc

841 gagctatgag gctagtggta gtggtggtgg cagcctttgc tgtctgctgg accccctatc

901 acctggtggt gctagtggat atcctcatgg atgtgggagt tttggcccgc aactgtggtc

961 gagaaagcca cgtggatgtg gccaagtcag tcacctcggg catggggtac atgcactgct

1021 gcctcaatcc gctgctctat gcctttgtgg gagtgaagtt cagagagcaa atgtggatgt

1081 tgttcacgcg cctgggccgc tctgaccaga gagggcccca gcggcagccg tcatcttcac

1141 ggagagaatc atcctggtct gagacaactg aggcctccta cctgggcttg taattctgga

1201 ctggaactgt agcctgcgca gcccaagtcc taacacactc caagtgcttg tcctccttgt

1261 agttgggcta gctcgaactt acccgtaact ttgctgccag gatgcactga cagctcagca

1321 tatatccagg tctcctgaga atcaatctca gcaacaagga caacaccatt actgtgcctt

1381 agctgccatg ccctatcttg ctgttttaga actagctgcc tggagcccca ccgccctact

1441 aaattagcaa gtagaactca gccatccctg tgtgagaaga gggagaggca aatagcacag

1501 agggccaggc gttgtcagca ctgaatgtgc ccatctcagt atctcaatat ttgcccaatt

1561 ttatttctag aaacctcact taaactttca ataaacaagg taatgagg

[서열번호 3] 인간 CXCR3 siRNA 제작에 사용된 염기서열(Seq. #3)

Forward :

[서열번호 4] 인간 CXCR3 siRNA 제작에 사용된 염기서열(Seq. #4)

Reverse :

[서열번호 5] 마우스 CXCR3 siRNA 제작에 사용된 염기서열(Seq. #5)

Forward :

[서열번호 6] 마우스 CXCR3 siRNA 제작에 사용된 염기서열(Seq. #6)

Reverse :　

[서열번호 7] chemokine (C-X-C motif) ligand 10 precursor [Mus musculus](peptide(아미노산)서열-Seq. #7)

mnpsaavifc lillglsgtq giplartvrc ncihiddgpv rmraigklei ipaslscprv eiiatmkknd eqrclnpesk tiknlmkafs qkrskrap

[서열번호 8] 유전자 서열(Seq. #8)

atccctctcgcaaggacggtccgctgcaactgcatccatatcgatgacgggccagtgagaatgagggccatagggaagcttgaaatcatccctgcgagcctatcctgcccacgtgttgagatcattgccacgatgaaaaagaatgatgagcagagatgtctgaatccggaatctaagaccatcaagaatttaatgaaagcgtttagccaaaaaaggtctaaaagggctcct

[서열번호 9] 아미노산 서열(Seq. #9)

IPLARTVRCNCIHIDDGPVRMRAIGKLEIIPASLSCPRVEIIATMKKNDEQRCLNPESKTIKNLMKAFSQKRSKRAP

[이 발명을 지원한 국가연구개발사업]

[과제고유번호] 0617-20090007

[부처명] 교육과학기술부

[연구사업명] 선도연구센터육성사업

[연구과제명] 골대사제어물질탐색과 평가시스템 확립

[주관기관] 서울대학교 산학협력단

[연구기간] 2009년 3월 1일 ~ 2010년 2월 28일

도1 a. 유방암세포에서 발현되는 CXCR3가 골 전이에 있어서의 중요성을 파악하고자 CXCR3에 대한 RNA interference technology를 이용하여 유방암세포주인 MDA-MB 231 세포주에서 CXCR3의 발현이 억제되었음을 보여주는 도면 (V : 비히클 벡터 대조군, si : CXCR3에 특이적인 벡터 사용군) 이며;

도1 b. 비히클 벡터와 si-CXCR3 벡터 처리에 의해 만들어진 각각의 유방암세포주를 athymic BALB/C nude mice의 심장에 주입한 후 6주가 지난 후 골 전이를 유도한 후 관찰한 외형이며;

도1 c. 상기에서 기술한 각각의 세포주의 골 전이를 유도한 마우스를 희생시켜 얻어진 혈청에서 골 전이에 의해 유도된 골흡수에 따라 뼈로부터 용해되어 혈청으로 유리된 뼈의 구성성분인 PYD (pyridinoline, 뼈로부터 나온 제1형 콜라젠 분해물)의 양을 측정한 결과이며;

도1 d. 뼈로 전이된 유방암세포에 의한 골 전이 정도를 확인하기 위하여 포매된 경골 절편을 헤마톡실린-에오신 염색을 실시한 결과를 나타낸 도이며;

도1 e. 앞 실험의 헤마톡실린-에오신 염색 결과를 토대로 경골로 전이된 암세포 면적을 측정하여 통계 처리하여 얻는 결과를 나타낸 도이며 (p<0.01);

도1 f. 각각의 암세포주의 골 전이로 얻어진 경골을 마이크로전산화단층촬영(micro-computed tomography scan) 을 수행하여 뼈의 윤곽을 관찰한 도이며;

도1 g. 도 1f에서 얻어진 마이크로전산화단층촬영 영상을 이용하여 정량분석을 실시 하여 전체조직에서 골 조직이 차지한 비율인 BV/TV (Bone volume/Tissue volume)와 골소주의 이격도를 나타내는 Tb.Sp (Trabecular separation) 의 값을 측정한 결과를 나타낸 도이며;

도2 a. RNA interference technology를 이용하여 마우스 흑색종 세포주인 B16F10 세포주 에서 CXCR3 발현이 현저히 억제되었음을 확인한 RT-PCR 실험 결과를 나타낸 도이며 (V : 비히클 벡터 대조군, si : CXCR3에 특이적인 벡터 사용군);

도2 b. 골 전이를 유도한 C57BL/6 마우스의 장골을 적출하여 뼈로 전이된 흑색종으로부터 발현되는 멜라닌 색소를 관찰한 결과를 나타낸 도이며;

도2 c. 뼈로 전이된 흑색종 세포에 의한 골 전이 정도를 확인하기 위하여 포매된 장골 절편을 헤마톡실린-에오신 염색을 실시한 결과를 나타낸 도이며 (M: 골수강(bone marrow) 부위, T: 종양조직);

도2 d. 앞 실험 (도2c)의 헤마톡실린-에오신 염색 결과를 토대로 장골로 전이된 암세포 면적을 측정하여 통계 처리한 결과를 나타낸 도이며 (p<0.01);

도3 a. 흑색종을 심장에 주입하여 골 전이를 유도한 CXCL10이 결핍된 마우스에서 포매된 경골 절편의 헤마톡실린-에오신 염색을 실시한 결과를 나타낸 도이며 (M: 골수강(bone marrow) 부위, T: 종양조직);

도3 b. 앞 실험 (도3b)의 헤마톡실린-에오신 염색 결과를 토대로 경골로 전이된 암세포 면적을 측정하여 통계 처리한 결과를 나타낸 도이며 (p<0.01);

도4 a. 키모카인 CXCL10의 중화가 흑색종의 골 전이 억제에 미치는 영향을 확인하기 위하여 C57BL/6 마우스 심장에 흑색종 세포를 주입하여 골 전이를 유발시킨 후 토끼 유래 항-CXCL10 항체를 처리하여 CXCL10의 기능을 중화시킨 후 흑색종으로 부터 발현되는 멜라닌 색소를 관찰한 결과를 나타낸 도이며;

도4 b. 뼈로 전이된 흑색종 세포에 의한 골 전이 정도를 확인하기 위하여 포매된 장골 절편을 헤마톡실린-에오신 염색을 실시한 결과를 나타낸 도이며(M: 골수강(bone marrow) 부위, T: 종양조직);

도4 c. 도4b의 헤마톡실린-에오신 염색 결과를 토대로 장골로 전이된 암세포 면적을 측정하여 통계 처리한 결과를 나타낸 도이며 (p<0.01);

도4 d. 항-CXCL10 항체에 의한 마우스의 생존능에는 미치는 영향을 나타낸 도이며(p<0.01);

도5 a. 골 전이를 유발시킨 C57BL/6 마우스 심장에 CXCL10과 CXCR3와의 결합을 억제시키는 화합물을 처리한 후에 적출된 장골에서의 흑색종으로부터 발현되는 멜라닌 색소를 관찰한 결과를 나타낸 도이며;

도5 b. 뼈로 전이된 흑색종 세포에 의한 골 전이 정도를 확인하기 위하여 포매된 장골 절편을 헤마톡실린-에오신 염색을 실시한 결과를 나타낸 도이다 (M: 골수강(bone marrow) 부위, T: 종양조직);

도5 c. 도5b의 헤마톡실린-에오신 염색 결과를 토대로 장골로 전이된 암세포 면적을 측정하여 통계 처리하한 결과를 나타낸 도이며 (p<0.01);

도5 d. CXCL10과 CXCR3와의 결합을 억제하는 화합물의 마우스의 생존능에는 미치는 영향을 확인한 도이다(p<0.01).

<110> SNU R&DB FOUNDATION <120> Method to inhibit the bone metastasis by blocking of interaction between CXCL10 and its receptor CXCR3 <130> DIF/2009-09-0003/RSD <160> 9 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 1107 <212> DNA <213> Seq. #1 <400> 1 atggtccttg aggtgagtga ccaccaagtg ctaaatgacg ccgaggttgc cgccctcctg 60 gagaacttca gctcttccta tgactatgga gaaaacgaga gtgactcgtg ctgtacctcc 120 ccgccctgcc cacaggactt cagcctgaac ttcgaccggg ccttcctgcc agccctctac 180 agcctcctct ttctgctggg gctgctgggc aacggcgcgg tggcagccgt gctgctgagc 240 cggcggacag ccctgagcag caccgacacc ttcctgctcc acctagctgt agcagacacg 300 ctgctggtgc tgacactgcc gctctgggca gtggacgctg ccgtccagtg ggtctttggc 360 tctggcctct gcaaagtggc aggtgccctc ttcaacatca acttctacgc aggagccctc 420 ctgctggcct gcatcagctt tgaccgctac ctgaacatag ttcatgccac ccagctctac 480 cgccgggggc ccccggcccg cgtgaccctc acctgcctgg ctgtctgggg gctctgcctg 540 cttttcgccc tcccagactt catcttcctg tcggcccacc acgacgagcg cctcaacgcc 600 acccactgcc aatacaactt cccacaggtg ggccgcacgg ctctgcgggt gctgcagctg 660 gtggctggct ttctgctgcc cctgctggtc atggcctact gctatgccca catcctggcc 720 gtgctgctgg tttccagggg ccagcggcgc ctgcgggcca tgcggctggt ggtggtggtc 780 gtggtggcct ttgccctctg ctggaccccc tatcacctgg tggtgctggt ggacatcctc 840 atggacctgg gcgctttggc ccgcaactgt ggccgagaaa gcagggtaga cgtggccaag 900 tcggtcacct caggcctggg ctacatgcac tgctgcctca acccgctgct ctatgccttt 960 gtaggggtca agttccggga gcggatgtgg atgctgctct tgcgcctggg ctgccccaac 1020 cagagagggc tccagaggca gccatcgtct tcccgccggg attcatcctg gtctgagacc 1080 tcagaggcct cctactcggg cttgtga 1107 <210> 2 <211> 1608 <212> DNA <213> Seq. #2 <400> 2 gcaagttccc aaccacaagt gccaaaggca gagaagcagg cagcacgaga cctgacccca 60 gcagccacag ccggagcacc agccaagcca tgtaccttga ggttagtgaa cgtcaagtgc 120 tagatgcctc ggactttgcc tttcttctgg aaaacagcac ctctccctac gattatgggg 180 aaaacgagag cgacttctct gactccccgc cctgcccaca ggatttcagc ctgaactttg 240 acagaacctt cctgccagcc ctctacagcc tcctcttctt gctggggctg ctaggcaatg 300 gggcggtggc tgctgtgcta ctgagtcagc gcactgccct gagcagcacg gacaccttcc 360 tgctccacct ggctgtagcc gatgttctgc tggtgttaac tcttccattg tgggcagtgg 420 atgctgctgt ccagtgggtt ttcggccctg gcctctgcaa agtggcaggc gccttgttca 480 acatcaactt ctatgcaggg gccttcctgc tggcttgtat aagcttcgac agatatctga 540 gcatagtgca cgccacccag atctaccgca gggacccccg ggtacgtgta gccctcacct 600 gcatagttgt atggggtctc tgtctgctct ttgccctccc agatttcatc tacctatcag 660 ccaactacga tcagcgcctc aatgccaccc attgccagta caacttccca caggtgggtc 720 gcactgctct gcgtgtactg cagctagtgg ctggtttcct gctgcccctt ctggtcatgg 780 cctactgcta tgcccatatc ctagctgttc tgctggtctc cagaggccag aggcgttttc 840 gagctatgag gctagtggta gtggtggtgg cagcctttgc tgtctgctgg accccctatc 900 acctggtggt gctagtggat atcctcatgg atgtgggagt tttggcccgc aactgtggtc 960 gagaaagcca cgtggatgtg gccaagtcag tcacctcggg catggggtac atgcactgct 1020 gcctcaatcc gctgctctat gcctttgtgg gagtgaagtt cagagagcaa atgtggatgt 1080 tgttcacgcg cctgggccgc tctgaccaga gagggcccca gcggcagccg tcatcttcac 1140 ggagagaatc atcctggtct gagacaactg aggcctccta cctgggcttg taattctgga 1200 ctggaactgt agcctgcgca gcccaagtcc taacacactc caagtgcttg tcctccttgt 1260 agttgggcta gctcgaactt acccgtaact ttgctgccag gatgcactga cagctcagca 1320 tatatccagg tctcctgaga atcaatctca gcaacaagga caacaccatt actgtgcctt 1380 agctgccatg ccctatcttg ctgttttaga actagctgcc tggagcccca ccgccctact 1440 aaattagcaa gtagaactca gccatccctg tgtgagaaga gggagaggca aatagcacag 1500 agggccaggc gttgtcagca ctgaatgtgc ccatctcagt atctcaatat ttgcccaatt 1560 ttatttctag aaacctcact taaactttca ataaacaagg taatgagg 1608 <210> 3 <211> 60 <212> DNA <213> Seq. #3 <400> 3 gatcccccac accacccagc agccagttca agagactggc tgctgggtgg tgtgttttta 60 60 <210> 4 <211> 60 <212> DNA <213> Seq. #4 <400> 4 agcttaaaaa cacaccaccc agcagccagt ctcttgaact ggctgctggg tggtgtgggg 60 60 <210> 5 <211> 60 <212> DNA <213> Seq. #5 <400> 5 gatcccccag gcgccttgtt caacatttca agagaatgtt gaacaaggcg cctgttttta 60 60 <210> 6 <211> 60 <212> DNA <213> Seq. #6 <400> 6 agcttaaaaa caggcgcctt gttcaacatt ctcttgaaat gttgaacaag gcgcctgggg 60 60 <210> 7 <211> 98 <212> PRT <213> Seq. #7 <400> 7 Met Asn Pro Ser Ala Ala Val Ile Phe Cys Leu Ile Leu Leu Gly Leu 1 5 10 15 Ser Gly Thr Gln Gly Ile Pro Leu Ala Arg Thr Val Arg Cys Asn Cys 20 25 30 Ile His Ile Asp Asp Gly Pro Val Arg Met Arg Ala Ile Gly Lys Leu 35 40 45 Glu Ile Ile Pro Ala Ser Leu Ser Cys Pro Arg Val Glu Ile Ile Ala 50 55 60 Thr Met Lys Lys Asn Asp Glu Gln Arg Cys Leu Asn Pro Glu Ser Lys 65 70 75 80 Thr Ile Lys Asn Leu Met Lys Ala Phe Ser Gln Lys Arg Ser Lys Arg 85 90 95 Ala Pro <210> 8 <211> 231 <212> DNA <213> Seq. #8 <400> 8 atccctctcg caaggacggt ccgctgcaac tgcatccata tcgatgacgg gccagtgaga 60 atgagggcca tagggaagct tgaaatcatc cctgcgagcc tatcctgccc acgtgttgag 120 atcattgcca cgatgaaaaa gaatgatgag cagagatgtc tgaatccgga atctaagacc 180 atcaagaatt taatgaaagc gtttagccaa aaaaggtcta aaagggctcc t 231 <210> 9 <211> 77 <212> PRT <213> Seq. #9 <400> 9 Ile Pro Leu Ala Arg Thr Val Arg Cys Asn Cys Ile His Ile Asp Asp 1 5 10 15 Gly Pro Val Arg Met Arg Ala Ile Gly Lys Leu Glu Ile Ile Pro Ala 20 25 30 Ser Leu Ser Cys Pro Arg Val Glu Ile Ile Ala Thr Met Lys Lys Asn 35 40 45 Asp Glu Gln Arg Cys Leu Asn Pro Glu Ser Lys Thr Ile Lys Asn Leu 50 55 60 Met Lys Ala Phe Ser Gln Lys Arg Ser Lys Arg Ala Pro 65 70 75

Claims

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2-(2-아세틸-1H-벤조[d]이미다졸-1-일)-1-(4-니트로페닐)에탄온을 유효성분으로 하고 약학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제를 함유하는 암세포의 골 전이에 의한 전이성 암질환을 치료 및 예방하기 위한 약학 조성물.
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