KR20230152099A - 당뇨병 및 합병증의 신규 치료, 진단 및 검출을 위한 방법 및 제제 - Google Patents

당뇨병 및 합병증의 신규 치료, 진단 및 검출을 위한 방법 및 제제 Download PDF

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Abstract

본 개시는, 줄기 세포의 유주와 조합한 HDAC 저해제에 의한 이상 줄기 세포를 표적으로 하는 당뇨병 치료를 제공한다. 하나의 실시 형태에서는, 본 개시는, 줄기 세포의 유주와 조합한 HDAC 저해제에 의한 이상 줄기 세포를 표적으로 하는 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상의 치료를 제공한다. 하나의 실시 형태에서는, 본 개시는, 이상 줄기 세포가 검출된 피험체에 있어서의 줄기 세포의 유주와 조합한 HDAC 저해제에 의한 이상 줄기 세포를 표적으로 하는 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상의 치료를 제공한다.

Description

당뇨병 및 합병증의 신규 치료, 진단 및 검출을 위한 방법 및 제제
본 개시는, HDAC 저해에 기초하는 이상 줄기 세포의 억제와 줄기 세포의 유주를 조합한 당뇨병 및/또는 그 관련 질환의 치료, 그리고 이상 줄기 세포의 존재, 유주 및/또는 잔류를 지표로 하는 당뇨병 및/또는 그 관련 질환의 진단에 관한 것이다. 보다 특정하면, 본 개시는, 이상 조혈 줄기 세포를 유주시켜 억제하는 것에 의한 당뇨병 및/또는 그 관련 질환의 치료, 그리고 이상 조혈 줄기 세포의 존재, 특정 니치로부터의 유주 및/또는 특정 니치에 있어서의 잔류를 검출하는 것에 의한 당뇨병 및/또는 그 관련 질환의 진단에 관한 것이다.
당뇨병은, 일반적으로 1형과 2형으로 분류된다(비특허문헌 1). 그러나, 양자 모두 발증의 상세가 불분명하므로, 1형 및 2형의 분류 그 자체가, 병인에 기초하는 것으로서의 타당성을 결여하고 있다고 하지 않을 수 없다. 또한, 현재, 당뇨병 치료를 위하여 여러가지 약물이 개발되어 있지만, 대부분은 혈당 컨트롤을 목적으로 한 것이며, 당뇨병의 진행 방지에는 유효할 수 있지만, 당뇨병의 치유에는 불충분할 수 있다. 또한, 신경 장애, 신증, 간장 장애, 망막증, 지방간, 위장 장애, 골절 치유 지연, 섭식 장애, 및 피부 장애 등의 당뇨병 합병증도 1형 및 2형으로 분류되는 당뇨병에 공통적으로 발증하는데, 일단 발증하면 치유는 곤란할 수 있다.
당뇨병 진료 가이드 라인 2016, 일본 당뇨병학회, 난코도
본 발명자들은, 줄기 세포의 유주와 조합한 HDAC 저해에 기초하는 이상 줄기 세포의 억제에 의한 당뇨병 및/또는 그 관련 질환의 치료 전략이, 매우 효과적이라는 것을 발견하였다. 이 새로운 지견에 기초하여, 본 개시는, 당뇨병 및/또는 그 관련 질환의 치료 및 진단을 위한 수단을 제공한다.
따라서, 본 개시는 이하를 제공한다.
(항목 1)
이상 조혈 줄기 세포(HSC)의 억제제를 포함하는 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하기 위한 조성물이며, 해당 억제제는 히스톤 탈아세틸화 효소(HDAC) 저해제를 포함하고, 해당 조성물은 줄기 세포 유주제와 조합하여 투여되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
(항목 2)
상기 이상 HSC는, HDAC의 유전자 또는 단백질이 통상의 레벨에서 발현되지 않거나 및/또는 기능하고 있지 않은 것인, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 3)
상기 통상의 레벨이 아닌 발현은 과잉 발현인, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 4)
당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상을 치료하기 위한, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 5)
상기 억제제는, 항CD106 항체, 항TNF-α 항체 또는 그 기능적 개변체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 추가로 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 6)
상기 이상 HSC는, 추가로, 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), CD106, 및 프로인슐린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자 또는 단백질이 통상의 레벨에서 발현되어 있지 않은 것인, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 7)
상기 질환, 장애 및/또는 증상은, 당뇨병 합병증을 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 8)
상기 질환, 장애 및/또는 증상은, 신경 장애, 신증, 간장 장애, 망막증, 지방간, 위장 장애, 골절 치유 지연, 섭식 장애, 및 피부 장애로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 9)
상기 줄기 세포 유주제는, 상기 이상 HSC를 니치로부터 유주시키는 능력을 가진, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 10)
상기 줄기 세포 유주제는, CXCR4 길항제, CXCR2 자극제, 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 저해제, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 약제를 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 11)
상기 줄기 세포 유주제는, 플레릭사포르, GROβ2(MIP2), 게피티닙, 에를로티닙, 아파티닙, 오시머티닙, 필그라스팀, 나르토그라스팀, 레노그라스팀, 페그필그라스팀으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 12)
상기 HDAC 저해제는, TSA(트리코스타틴 A), VPA(발프로산), 부티르산 나트륨(NaBu), SAHA(수베로일아닐리드히드록삼산 또는 보리노스탓), 나트륨페닐부티레이트, 뎁시펩티드(FR901228, FK228), 트라폭신(TPX), 환식 히드록삼산 함유 펩티드 1(CHAP1), MS-275, LBH589, 기비노스탓, 핑골리모드(FTY720) 및 PXD101로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 13)
HDAC 저해제를 포함하는 이상 조혈 줄기 세포(HSC)의 억제제와, 줄기 세포 유주제의 조합을 포함하는 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하기 위한 의약.
(항목 14)
줄기 세포 유주제를 포함하는 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하기 위한 조성물이며, 해당 줄기 세포 유주제는, HDAC 저해제를 포함하는 이상 조혈 줄기 세포(HSC)의 억제제와 조합하여 투여되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
(항목 15)
HDAC의 검출제를 포함하는 이상 조혈 줄기 세포(HSC) 검출제를 포함하는 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상 혹은 그 리스크를 진단하기 위한 조성물.
(항목 16)
HDAC의 검출제를 포함하는 이상 조혈 줄기 세포(HSC)의 유주 및/또는 잔류를 검출하는 약제를 포함하는 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방을 위한 처치의 선택을 위한 조성물.
(항목 17)
상기 유주 및/또는 잔류가, 골수의 니치로부터의 유주 및/또는 골수의 니치에 있어서의 잔류인, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 18)
상기 유주의 검출은, CD106 또는 기능적 등가물의 검출에 의해 달성되는 것을 특징으로 하는, 상기 항목 중 어느 것의 기재된 조성물.
(항목 19)
상기 조성물의 사용에 의해 당뇨병 또는 그 리스크를 가진다고 진단된 피험체는, HDAC 저해제가 투여되어야 하는 것으로 나타내어지는 것을 특징으로 하는, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 20)
피험체에 있어서 당뇨병 또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 방법이며, 해당 피험체에 대하여 HDAC 저해제를 포함하는 이상 조혈 줄기 세포(HSC)를 저감 또는 소실시키는 약제 및 줄기 세포 유주제를 유효량 투여하는 공정을 포함하는, 방법.
(항목 21)
피험체에 있어서 당뇨병 또는 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상 혹은 그 리스크를 진단하는 방법이며, 해당 피험체에 있어서의 이상 조혈 줄기 세포(HSC)를 HDAC의 유전자 또는 단백질의 발현에 기초하여 검출하는 공정을 포함하는, 방법.
(항목 22)
이상 조혈 줄기 세포(HSC)의 유주 및/또는 잔류를, 피험체에 있어서 당뇨병 또는 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방을 위한 처치의 지표로 하는 방법이며, 해당 피험체에 있어서의 이상 조혈 줄기 세포(HSC)의 유주 및/또는 잔류를 HDAC의 유전자 또는 단백질의 발현에 기초하여 검출하는 공정을 포함하는, 방법.
(항목 23)
피험체에 있어서 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상을 처치하는 방법이며,
해당 피험체에 있어서의 이상 조혈 줄기 세포(HSC)를 HDAC의 유전자 또는 단백질의 발현에 기초하여 검출하는 공정과
이상 조혈 줄기 세포(HSC)가 검출된 피험체에, 상기 항목 중 어느 것의 조성물 또는 의약의 유효량을 투여하는 공정
을 포함하는, 방법.
(항목 24)
상기 조성물은, 약학적 조성물인, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 25)
약학적으로 허용 가능한 부형제를 추가로 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 26)
피험체에 있어서의 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 방법이며, 유효량의 이상 조혈 줄기 세포(HSC)의 억제제 및 줄기 세포 유주제를 해당 피험체에 투여하는 공정을 포함하고, 해당 억제제는 히스톤 탈아세틸화 효소(HDAC) 저해제를 포함하는, 방법.
(항목 27)
상기 이상 HSC는, HDAC의 유전자 또는 단백질이 통상의 레벨에서 발현되지 않거나 및/또는 기능하고 있지 않은 것인, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 28)
상기 통상의 레벨이 아닌 발현은 과잉 발현인, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 29)
당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상을 치료하기 위한, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 30)
상기 억제제는, 항CD106 항체, 항TNF-α 항체 또는 그 기능적 개변체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 추가로 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 31)
상기 이상 HSC는, 추가로, 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), CD106, 및 프로인슐린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자 또는 단백질이 통상의 레벨에서 발현되어 있지 않은 것인, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 32)
상기 질환, 장애 및/또는 증상은, 당뇨병 합병증을 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 33)
상기 질환, 장애 및/또는 증상은, 신경 장애, 신증, 간장 장애, 망막증, 지방간, 위장 장애, 골절 치유 지연, 섭식 장애, 및 피부 장애로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 34)
상기 줄기 세포 유주제는, 상기 이상 HSC를 니치로부터 유주시키는 능력을 가진, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 35)
상기 줄기 세포 유주제는, CXCR4 길항제, CXCR2 자극제, 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 저해제, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 약제를 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 36)
상기 줄기 세포 유주제는, 플레릭사포르, GROβ2(MIP2), 게피티닙, 에를로티닙, 아파티닙, 오시머티닙, 필그라스팀, 나르토그라스팀, 레노그라스팀, 페그필그라스팀으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 37)
상기 HDAC 저해제는, TSA(트리코스타틴 A), VPA(발프로산), 부티르산 나트륨(NaBu), SAHA(수베로일아닐리드히드록삼산 또는 보리노스탓), 나트륨페닐부티레이트, 뎁시펩티드(FR901228, FK228), 트라폭신(TPX), 환식 히드록삼산 함유 펩티드 1(CHAP1), MS-275, LBH589, 기비노스탓, 핑골리모드(FTY720) 및 PXD101로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 38)
HDAC를 검출하는 것을 포함하는 이상 조혈 줄기 세포(HSC)를 검출하는 공정을 포함하는, 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상 혹은 그 리스크를 진단하는 방법.
(항목 39)
HDAC를 검출하는 것을 포함하는 이상 조혈 줄기 세포(HSC)의 유주 및/또는 잔류를 검출하는 공정을 포함하는, 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방을 위한 처치를 선택하는 방법.
(항목 40)
상기 유주 및/또는 잔류가, 골수의 니치로부터의 유주 및/또는 골수의 니치에 있어서의 잔류인, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 41)
CD106 또는 기능적 등가물을 검출하는 것을 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 42)
상기 방법에 의해 당뇨병 또는 그 리스크를 가진다고 진단된 피험체는, HDAC 저해제가 투여되어야 한다는 것으로 나타내어지는, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 43)
당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하기 위한 의약 제조에 있어서의, 이상 조혈 줄기 세포(HSC)의 억제제 및 줄기 세포 유주제의 사용이며, 해당 억제제는 히스톤 탈아세틸화 효소(HDAC) 저해제를 포함하는, 사용.
(항목 44)
상기 이상 HSC는, HDAC의 유전자 또는 단백질이 통상의 레벨에서 발현되지 않거나 및/또는 기능하고 있지 않은 것인, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 45)
상기 통상의 레벨이 아닌 발현은 과잉 발현인, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 46)
당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상을 치료하기 위한, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 47)
상기 억제제는, 항CD106 항체, 항TNF-α 항체 또는 그 기능적 개변체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 추가로 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 48)
상기 이상 HSC는, 추가로, 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), CD106, 및 프로인슐린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자 또는 단백질이 통상의 레벨에서 발현되어 있지 않은 것인, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 49)
상기 질환, 장애 및/또는 증상은, 당뇨병 합병증을 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 50)
상기 질환, 장애 및/또는 증상은, 신경 장애, 신증, 간장 장애, 망막증, 지방간, 위장 장애, 골절 치유 지연, 섭식 장애, 및 피부 장애로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 51)
상기 줄기 세포 유주제는, 상기 이상 HSC를 니치로부터 유주시키는 능력을 가진, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 52)
상기 줄기 세포 유주제는, CXCR4 길항제, CXCR2 자극제, 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 저해제, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 약제를 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 53)
상기 줄기 세포 유주제는, 플레릭사포르, GROβ2(MIP2), 게피티닙, 에를로티닙, 아파티닙, 오시머티닙, 필그라스팀, 나르토그라스팀, 레노그라스팀, 페그필그라스팀으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 54)
상기 HDAC 저해제는, TSA(트리코스타틴 A), VPA(발프로산), 부티르산 나트륨(NaBu), SAHA(수베로일아닐리드히드록삼산 또는 보리노스탓), 나트륨페닐부티레이트, 뎁시펩티드(FR901228, FK228), 트라폭신(TPX), 환식 히드록삼산 함유 펩티드 1(CHAP1), MS-275, LBH589, 기비노스탓, 핑골리모드(FTY720) 및 PXD101로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 55)
당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상 혹은 그 리스크를 진단하기 위한 의약 제조에 있어서의, HDAC의 검출제를 포함하는 이상 조혈 줄기 세포(HSC) 검출제의 사용.
(항목 56)
당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방을 위한 의약 제조에 있어서의, HDAC의 검출제를 포함하는 이상 조혈 줄기 세포(HSC)의 유주 및/또는 잔류를 검출하는 약제의 사용.
(항목 57)
상기 유주 및/또는 잔류가, 골수의 니치로부터의 유주 및/또는 골수의 니치에 있어서의 잔류인, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 58)
상기 유주 검출제는, CD106 또는 기능적 등가물의 검출제를 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 기재된 사용.
(항목 59)
상기 조성물의 사용에 의해 당뇨병 또는 그 리스크를 가진다고 진단된 피험체는, HDAC 저해제가 투여되어야 하는 것으로 나타내어지는 것을 특징으로 하는, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 1A)
히스톤 탈아세틸화 효소(HDAC) 저해제를 포함하는 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하기 위한 조성물이며, 해당 조성물은 줄기 세포 유주제와 조합하여 투여되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
(항목 2A)
HDAC의 유전자 또는 단백질이 통상의 레벨에서 발현되지 않거나 및/또는 기능하고 있지 않은 대상에 대하여 투여되는 것을 특징으로 하는, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 3A)
상기 통상의 레벨이 아닌 발현은 과잉 발현인, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 4A)
당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상을 치료하기 위한, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 5A)
추가로 항CD106 항체, 항TNF-α 항체 또는 그 기능적 개변체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나와 조합하여 투여되는 것을 특징으로 하는, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 6A)
투여되는 대상이 추가로, 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), CD106, 및 프로인슐린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자 또는 단백질이 통상의 레벨에서 발현되어 있지 않은 것인, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 7A)
상기 질환, 장애 및/또는 증상은, 당뇨병 합병증을 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 8A)
상기 질환, 장애 및/또는 증상은, 신경 장애, 신증, 간장 장애, 망막증, 지방간, 위장 장애, 골절 치유 지연, 섭식 장애, 및 피부 장애로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 9A)
상기 줄기 세포 유주제는, 상기 이상 HSC를 니치로부터 유주시키는 능력을 가진, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 10A)
상기 줄기 세포 유주제는, CXCR4 길항제, CXCR2 자극제, 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 저해제, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 약제를 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 11A)
상기 줄기 세포 유주제는, 플레릭사포르, GROβ2(MIP2), 게피티닙, 에를로티닙, 아파티닙, 오시머티닙, 필그라스팀, 나르토그라스팀, 레노그라스팀, 페그필그라스팀으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 12A)
상기 HDAC 저해제는, TSA(트리코스타틴 A), VPA(발프로산), 부티르산 나트륨(NaBu), SAHA(수베로일아닐리드히드록삼산 또는 보리노스탓), 나트륨페닐부티레이트, 뎁시펩티드(FR901228, FK228), 트라폭신(TPX), 환식 히드록삼산 함유 펩티드 1(CHAP1), MS-275, LBH589, 기비노스탓, 핑골리모드(FTY720) 및 PXD101로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 13A)
HDAC 저해제와, 줄기 세포 유주제의 조합을 포함하는 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하기 위한 의약.
(항목 14A)
줄기 세포 유주제를 포함하는 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하기 위한 조성물이며, 해당 줄기 세포 유주제는, HDAC 저해제와 조합하여 투여되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
(항목 15A)
HDAC의 검출제를 포함하는 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상 혹은 그 리스크를 진단하기 위한 조성물.
(항목 16A)
HDAC의 검출제를 포함하는 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방을 위한 처치의 선택을 위한 조성물.
(항목 17A)
이상 조혈 줄기 세포(HSC)의 유주 및/또는 잔류를 검출함으로써 상기 선택이 이루어지는 것을 특징으로 하는, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 18A)
상기 유주 및/또는 잔류가, 골수의 니치로부터의 유주 및/또는 골수의 니치에 있어서의 잔류인, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 19A)
상기 유주의 검출은, CD106 또는 기능적 등가물의 검출에 의해 행해지는 것을 특징으로 하는, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 20A)
상기 조성물의 사용에 의해 당뇨병 또는 그 리스크를 가진다고 진단된 피험체는, HDAC 저해제가 투여되어야 하는 것으로 나타내어지는 것을 특징으로 하는, 상기 항목 중 어느 것의 조성물.
(항목 21A)
피험체에 있어서 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 방법이며, 해당 피험체에 히스톤 탈아세틸화 효소(HDAC) 저해제 및 줄기 세포 유주제를 유효량 투여하는 공정을 포함하는, 방법.
(항목 22A)
상기 피험체가, HDAC의 유전자 또는 단백질이 통상의 레벨에서 발현되지 않거나 및/또는 기능하고 있지 않은 피험체인, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 23A)
상기 통상의 레벨이 아닌 발현은 과잉 발현인, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 24A)
당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상을 치료하는, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 25A)
상기 피험체에 추가로 항CD106 항체, 항TNF-α 항체 또는 그 기능적 개변체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 투여하는, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 26A)
상기 피험체가 추가로, 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), CD106, 및 프로인슐린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자 또는 단백질이 통상의 레벨에서 발현되어 있지 않은 것인, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 27A)
상기 질환, 장애 및/또는 증상은, 당뇨병 합병증을 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 28A)
상기 질환, 장애 및/또는 증상은, 신경 장애, 신증, 간장 장애, 망막증, 지방간, 위장 장애, 골절 치유 지연, 섭식 장애, 및 피부 장애로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 29A)
상기 줄기 세포 유주제는, 상기 이상 HSC를 니치로부터 유주시키는 능력을 가진, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 30A)
상기 줄기 세포 유주제는, CXCR4 길항제, CXCR2 자극제, 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 저해제, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 약제를 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 31A)
상기 줄기 세포 유주제는, 플레릭사포르, GROβ2(MIP2), 게피티닙, 에를로티닙, 아파티닙, 오시머티닙, 필그라스팀, 나르토그라스팀, 레노그라스팀, 페그필그라스팀으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 32A)
상기 HDAC 저해제는, TSA(트리코스타틴 A), VPA(발프로산), 부티르산 나트륨(NaBu), SAHA(수베로일아닐리드히드록삼산 또는 보리노스탓), 나트륨페닐부티레이트, 뎁시펩티드(FR901228, FK228), 트라폭신(TPX), 환식 히드록삼산 함유 펩티드 1(CHAP1), MS-275, LBH589, 기비노스탓, 핑골리모드(FTY720) 및 PXD101로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 33A)
HDAC를 검출하는 공정을 포함하는, 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상 혹은 그 리스크를 진단하는 방법.
(항목 34A)
HDAC를 검출하는 공정을 포함하는, 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방을 위한 처치를 선택하는 방법.
(항목 35A)
이상 조혈 줄기 세포(HSC)의 유주 및/또는 잔류를 검출함으로써 상기 선택이 이루어지는 것을 특징으로 하는, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 36A)
상기 유주 및/또는 잔류가, 골수의 니치로부터의 유주 및/또는 골수의 니치에 있어서의 잔류인, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 37A)
상기 유주의 검출은, CD106 또는 기능적 등가물의 검출에 의해 행해지는 것을 특징으로 하는, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 38A)
당뇨병 또는 그 리스크를 가진다고 진단된 피험체에 HDAC 저해제를 투여하는 공정을 추가로 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 방법.
(항목 39A)
당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하기 위한 의약 제조에 있어서의, 히스톤 탈아세틸화 효소(HDAC) 저해제 및 줄기 세포 유주제의 사용.
(항목 40A)
상기 의약은, HDAC의 유전자 또는 단백질이 통상의 레벨에서 발현되지 않거나 및/또는 기능하고 있지 않은 대상에 대하여 투여되는 것을 특징으로 하는, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 41A)
상기 통상의 레벨이 아닌 발현은 과잉 발현인, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 42A)
당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상을 치료하기 위한, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 43A)
상기 의약은, 추가로 항CD106 항체, 항TNF-α 항체 또는 그 기능적 개변체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나와 조합하여 투여되는 것을 특징으로 하는, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 44A)
투여되는 대상이 추가로, 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), CD106, 및 프로인슐린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자 또는 단백질이 통상의 레벨에서 발현되어 있지 않은 것인, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 45A)
상기 질환, 장애 및/또는 증상은, 당뇨병 합병증을 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 46A)
상기 질환, 장애 및/또는 증상은, 신경 장애, 신증, 간장 장애, 망막증, 지방간, 위장 장애, 골절 치유 지연, 섭식 장애, 및 피부 장애로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 47A)
상기 줄기 세포 유주제는, 상기 이상 HSC를 니치로부터 유주시키는 능력을 가진, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 48A)
상기 줄기 세포 유주제는, CXCR4 길항제, CXCR2 자극제, 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 저해제, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 약제를 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 49A)
상기 줄기 세포 유주제는, 플레릭사포르, GROβ2(MIP2), 게피티닙, 에를로티닙, 아파티닙, 오시머티닙, 필그라스팀, 나르토그라스팀, 레노그라스팀, 페그필그라스팀으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 50A)
상기 HDAC 저해제는, TSA(트리코스타틴 A), VPA(발프로산), 부티르산 나트륨(NaBu), SAHA(수베로일아닐리드히드록삼산 또는 보리노스탓), 나트륨페닐부티레이트, 뎁시펩티드(FR901228, FK228), 트라폭신(TPX), 환식 히드록삼산 함유 펩티드 1(CHAP1), MS-275, LBH589, 기비노스탓, 핑골리모드(FTY720) 및 PXD101로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 51A)
당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상 혹은 그 리스크를 진단하기 위한 의약 제조에 있어서의 HDAC의 검출제의 사용.
(항목 52A)
당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방을 위한 처치의 선택을 위한 의약 제조에 있어서의 HDAC의 검출제의 사용.
(항목 53A)
이상 조혈 줄기 세포(HSC)의 유주 및/또는 잔류를 검출함으로써 상기 선택이 이루어지는 것을 특징으로 하는, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 54A)
상기 유주 및/또는 잔류가, 골수의 니치로부터의 유주 및/또는 골수의 니치에 있어서의 잔류인, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 55A)
상기 유주의 검출은, CD106 또는 기능적 등가물의 검출에 의해 행해지는 것을 특징으로 하는, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 56A)
상기 의약의 사용에 의해 당뇨병 또는 그 리스크를 가진다고 진단된 피험체는, HDAC 저해제가 투여되어야 하는 것으로 나타내어지는 것을 특징으로 하는, 상기 항목 중 어느 것의 사용.
(항목 57A)
당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하기 위한, 히스톤 탈아세틸화 효소(HDAC) 저해제 및 줄기 세포 유주제의 조합에 있어서의 사용을 위한, HDAC 저해제 또는 줄기 세포 유주제.
(항목 58A)
HDAC의 유전자 또는 단백질이 통상의 레벨에서 발현되지 않거나 및/또는 기능하고 있지 않은 대상에 대하여 투여되는 것을 특징으로 하는, 상기 항목 중 어느 것의 HDAC 저해제 또는 줄기 세포 유주제.
(항목 59A)
상기 통상의 레벨이 아닌 발현은 과잉 발현인, 상기 항목 중 어느 것의 HDAC 저해제 또는 줄기 세포 유주제.
(항목 60A)
당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상을 치료하기 위한, 상기 항목 중 어느 것의 HDAC 저해제 또는 줄기 세포 유주제.
(항목 61A)
추가로 항CD106 항체, 항TNF-α 항체 또는 그 기능적 개변체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나와 조합하여 투여되는 것을 특징으로 하는, 상기 항목 중 어느 것의 HDAC 저해제 또는 줄기 세포 유주제.
(항목 62A)
투여되는 대상이 추가로, 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), CD106, 및 프로인슐린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자 또는 단백질이 통상의 레벨에서 발현되어 있지 않은 것인, 상기 항목 중 어느 것의 HDAC 저해제 또는 줄기 세포 유주제.
(항목 63A)
상기 질환, 장애 및/또는 증상은, 당뇨병 합병증을 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 HDAC 저해제 또는 줄기 세포 유주제.
(항목 64A)
상기 질환, 장애 및/또는 증상은, 신경 장애, 신증, 간장 장애, 망막증, 지방간, 위장 장애, 골절 치유 지연, 섭식 장애, 및 피부 장애로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 상기 항목 중 어느 것의 HDAC 저해제 또는 줄기 세포 유주제.
(항목 65A)
상기 줄기 세포 유주제는, 상기 이상 HSC를 니치로부터 유주시키는 능력을 가진, 상기 항목 중 어느 것의 HDAC 저해제 또는 줄기 세포 유주제.
(항목 66A)
상기 줄기 세포 유주제는, CXCR4 길항제, CXCR2 자극제, 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 저해제, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 약제를 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 HDAC 저해제 또는 줄기 세포 유주제.
(항목 67A)
상기 줄기 세포 유주제는, 플레릭사포르, GROβ2(MIP2), 게피티닙, 에를로티닙, 아파티닙, 오시머티닙, 필그라스팀, 나르토그라스팀, 레노그라스팀, 페그필그라스팀으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 HDAC 저해제 또는 줄기 세포 유주제.
(항목 68A)
상기 HDAC 저해제는, TSA(트리코스타틴 A), VPA(발프로산), 부티르산 나트륨(NaBu), SAHA(수베로일아닐리드히드록삼산 또는 보리노스탓), 나트륨페닐부티레이트, 뎁시펩티드(FR901228, FK228), 트라폭신(TPX), 환식 히드록삼산 함유 펩티드 1(CHAP1), MS-275, LBH589, 기비노스탓, 핑골리모드(FTY720) 및 PXD101로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 상기 항목 중 어느 것의 HDAC 저해제 또는 줄기 세포 유주제.
(항목 69A)
당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상 혹은 그 리스크를 진단하기 위한 HDAC의 검출제.
(항목 70A)
당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방을 위한 처치의 선택을 위한 HDAC의 검출제.
(항목 71A)
이상 조혈 줄기 세포(HSC)의 유주 및/또는 잔류를 검출함으로써 상기 선택이 이루어지는 것을 특징으로 하는, 상기 항목 중 어느 것의 HDAC의 검출제.
(항목 72A)
상기 유주 및/또는 잔류가, 골수의 니치로부터의 유주 및/또는 골수의 니치에 있어서의 잔류인, 상기 항목 중 어느 것의 HDAC의 검출제.
(항목 73A)
상기 유주의 검출은, CD106 또는 기능적 등가물의 검출에 의해 행해지는 것을 특징으로 하는, 상기 항목 중 어느 것의 HDAC의 검출제.
(항목 74A)
상기 HDAC의 검출제의 사용에 의해 당뇨병 또는 그 리스크를 가진다고 진단된 피험체는, HDAC 저해제가 투여되어야 하는 것으로 나타내어지는 것을 특징으로 하는, 상기 항목 중 어느 것의 HDAC의 검출제.
본 개시에 있어서, 상기의 1개 또는 복수의 특징은, 명시된 조합에 더하여, 추가로 조합하여 제공될 수 있다는 것으로 의도된다. 본 개시의 추가적인 실시 형태 및 이점은, 필요에 따라 이하의 상세한 설명을 읽고 이해하면, 당업자에게 인식된다.
본 개시는, 당뇨병 및/또는 그 관련 질환의 새로운 치료 및 진단을 제공한다. 종래, 당뇨병 환자에게 있어서 인슐린 분비를 회복시키는 방법인 췌장 이식이나 췌도 이식 등에서 필요했던 장기 기증자를 필요하지 않게 하고, 수혜자의 수에 대한 공급 능력의 제한을 극복할 수 있다. 또한, 수혜자가 받고 있던 수술 등의 환자 부하도 회피할 수 있다. 이와 같이, 본 개시의 치료는, 약제 투여에 의해 달성될 수 있기 때문에, 훨씬 간편하고 저부하일 수 있다. 또한, 근본 치료가 가능하기 때문에, 예후도 좋을 것으로 기대된다.
도 1은 비당뇨병(비DM) 및 스트렙토조토신 유도 당뇨병(STZ-DM)의 단핵 세포에 있어서의 c-kit 양성 Sca-1 양성 계통 마커 음성 세포(KSL) 분획 중의 프로인슐린 양성 세포의 형광 활성화 셀 소팅(FACS)분석이다. 좌측 상단의 2개의 패널(좌: 비DM, 우: STZ-DM)은 계통 음성 세포 중 KSL 세포(사각으로 둘러싸임)를 나타내고, 세로 축은 c-kit의 형광 강도, 가로 축은 Sca-1의 형광 강도를 나타낸다. 좌측 하단의 2개의 패널(좌: 비DM, 우: STZ-DM)은 프로인슐린 양성 세포(사각으로 둘러싸임)의 분포를 나타내고, 세로 축은 KSL 세포수, 가로 축은 프로인슐린의 형광 강도를 나타낸다. 우측 그래프(좌: 비DM, 우: STZ-DM)는 KSL 세포 중의 프로인슐린 양성 세포의 비율을 나타낸다(1군당 n=3). **: P<0.01.
도 2는 비DM 및 STZ-DM의 단핵 세포에 있어서의 KSL 세포 중의 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) 양성 세포의 FACS 분석이다. 좌측 상단의 2개의 패널(좌: 비DM, 우: STZ-DM)은 계통 음성 세포 중 KSL 세포(사각으로 둘러싸임)를 나타내고, 세로 축은 c-kit의 형광 강도, 가로 축은 Sca-1의 형광 강도를 나타낸다. 좌측 하단의 2개의 패널(좌: 비DM, 우: STZ-DM)은 TNF-α 양성 세포(사각으로 둘러싸임)의 분포를 나타내고, 세로 축은 KSL 세포수, 가로 축은 TNF-α의 형광 강도를 나타낸다. 우측 그래프는, KSL 세포 중의 TNF-α 양성 세포의 비율을 나타낸다(1군당 n=5). 데이터는 평균±표준 오차로서 나타낸다. **: P<0.01.
도 3은 비DM 및 STZ-DM의 단핵 세포에 있어서의 KSL 세포의 CD106 발현에 대한 FACS 분석이다. 좌측의 2개의 패널(상: 비DM, 하: STZ-DM)은 계통 음성 세포 중 KSL 세포(사각으로 둘러싸임)를 나타내고, 세로 축은 c-kit의 형광 강도, 가로 축은 Sca-1의 형광 강도를 나타낸다. 우측의 2개의 패널(상: 비DM, 하: STZ-DM)은 CD106 양성 세포(사각으로 둘러싸임)의 분포를 나타내고, 세로 축은 측방 산란광(SSC)의 강도, 가로 축은 CD106의 형광 강도를 나타낸다. 우측 그래프(좌: 비DM, 우: STZ-DM)는 KSL 세포 중의 CD106 양성 세포의 비율(1눈금은 1%임)을 나타낸다(1군당 n=4). **: P<0.01.
도 4는 ICR 마우스 및 NOD 마우스의 단핵 세포 FACS 분석이다. 2개의 패널(좌: ICR, 우: NOD)은 계통 음성 세포 중 KSL 세포(사각으로 둘러싸임)를 나타내고, 세로 축은 c-kit의 형광 강도, 가로 축은 Sca-1의 형광 강도를 나타낸다.
도 5는 ICR 마우스 및 NOD 마우스의 단핵 세포에 있어서의 KSL 세포 중의 종양 괴사 인자 알파(TNF-α) 양성 세포 및 CD106 양성 세포의 FACS 분석이다. 상단의 2개의 패널(좌: ICR, 우: NOD)은 TNF-α 양성 세포(사각으로 둘러싸임)의 분포를 나타내고, 세로 축은 전방 산란광(FSC)의 강도, 가로 축은 TNF-α의 형광 강도를 나타낸다. 하단의 2개의 패널(좌: ICR, 우: NOD)은 CD106 양성 세포(사각으로 둘러싸임)의 분포를 나타내고, 세로 축은 전방 산란광(FSC)의 강도, 가로 축은 CD106의 형광 강도를 나타낸다.
도 6은 비DM 및 STZ-DM의 KSL 세포 중의 사이드 포퓰레이션(SP) 분획 및 비SP 분획의 FACS 분석이다. 좌측의 2개의 패널(상: 비DM, 하: STZ-DM)은 KSL 세포 중의 SP 분획(좌측 하단의 동그라미 부분) 및 비SP 분획(우측 상단의 동그라미 부분)을 나타내고, 세로 축은 훽스트 블루(Hoechst Blue)의 형광 강도, 가로 축은 훽스트 레드(Hoechst Red)의 형광 강도를 나타낸다. 우측 그래프(좌: SP, 우: 비SP)는 비DM(좌측의 바) 및 STZ-DM(우측의 바)의 KSL 세포 중의 SP 분획 및 비SP 분획의 비율을 나타낸다(n=3). 데이터는 평균값±표준 오차로서 나타낸다. **: P<0.01.
도 7은 a) 비DM 및 STZ-DM의 KSL-비SP 세포에 있어서의 CD106 양성 세포의 FACS 분석이다. 2개의 패널(상: 비DM, 하: STZ-DM)은 CD106 양성 세포(사각으로 둘러싸임)의 분포를 나타내고, 세로 축은 측방 산란광(SSC)의 강도, 가로 축은 CD106의 형광 강도를 나타낸다. 그래프(좌: 비DM, 우: STZ-DM)는 KSL-비SP 세포 중의 CD106 양성 세포의 비율을 나타낸다(1군당 n=3). b) 비DM 및 STZ-DM의 KSL-SP 세포에 있어서의 CD106 양성 세포의 FACS 분석이다. 2개의 패널(상: 비DM, 하: STZ-DM)은 CD106 양성 세포(사각으로 둘러싸임, 0%였다)의 분포를 나타내고, 세로 축은 측방 산란광(SSC)의 강도, 가로 축은 CD106의 형광 강도를 나타낸다. 그래프(좌: 비DM, 우: STZ-DM)는 KSL-SP 세포 중의 CD106 양성 세포 비율을 나타낸다(1군당 n=3). c) 비DM 및 STZ-DM의 KSL-비SP 세포에 있어서의 TNF-α 양성 세포의 FACS 분석이다. 2개의 패널(상: 비DM, 하: STZ-DM)은 TNF-α 양성 세포(사각으로 둘러싸임)의 분포를 나타내고, 세로 축은 측방 산란광(SSC)의 강도, 가로 축은 TNF-α의 형광 강도를 나타낸다. 그래프(좌: 비DM, 우: STZ-DM)는 KSL-비SP 세포 중의 TNF-α 양성 세포의 비율을 나타낸다(1군당 n=3). d) 비DM 및 STZ-DM의 KSL-SP 세포에 있어서의 TNF-α 양성 세포의 FACS 분석이다. 2개의 패널(상: 비DM, 하: STZ-DM)은 TNF-α 양성 세포(사각으로 둘러싸임, 0%였다)의 분포를 나타내고, 세로 축은 측방 산란광(SSC)의 강도, 가로 축은 TNF-α의 형광 강도를 나타낸다. 그래프(좌: 비DM, 우: STZ-DM)는 KSL-SP 세포 중의 TNF-α 양성 세포의 비율을 나타낸다(1군당 n=3). 데이터는 평균값±표준 오차로서 나타낸다. *: P<0.05.
도 8은 비DM 및 STZ-DM 마우스의 KSL 세포에 있어서의 히스톤 탈아세틸화 효소 유전자군(HDACs)의 유전자 발현 비교를 나타낸다. 좌측으로부터, Hdac3, Hdac4, Hdac8, 및 Hdac9의 발현량을 나타내고, 각 막대 그래프에 있어서, 좌측은, 비DM 마우스의 결과이며, 우측은, STZ-DM 마우스의 결과이다. 세로 축은, 비DM 마우스에 있어서의 mRNA 발현량을 1이라고 했을 경우의 두 마우스에 있어서의 mRNA 발현량의 상대량을 나타낸다. *: P<0.05.
도 9는 정상 혈당 마우스에 대한 비DM 또는 STZ-DM 마우스 유래 KSL 세포의 이식을 위한 실험 개략을 나타낸다. 그린 형광 단백질을 유전자 도입한 트랜스제닉 마우스(GFP-Tg 마우스)를 STZ로 처치하여 당뇨병을 유발한 마우스(STZ-DM GFP), 및 정맥 내 시트르산 완충액 주사의 대조 처치를 한 비DM 마우스를 준비하였다(비DM GFP). 3개월 후, 비DM 마우스 및 STZ-DM 마우스의 각각으로부터 얻은 KSL 세포를, 9Gy의 치사량 조사 정상 혈당 야생형 마우스에게 이식하였다(비DM 유래 KSL-T, STZ-DM 유래 KSL-T).
도 10은 비DM 유래 KSL-T(n=9) 및 STZ-DM 유래 KSL-T(n=10)에 있어서의 혈당 농도(mg/gL)(좌) 및 비DM 유래의 KSL-T에 있어서의 측정값을 1이라고 했을 경우의 좌골 신경에 있어서의 지각 신경 전달 속도(SNCV)의 상대비(우)를 나타낸다. N.S는 유의차가 없다는 것을 나타내고, **은 P<0.01을 나타낸다.
도 11은 후근 신경절(DRG)에 있어서의 MAP2, 프로인슐린, 및 TNF-α의 면역 형광 염색상이다. 좌측으로부터 4열은 STZ-DM 유래 KSL-T의 결과이며, 좌측으로부터, 핵(청), GFP(녹), 표적 분자(상단: MAP2, 중단: 프로인슐린, 하단: TNF-α)(적), 머지(Merge)의 화상이다. 우측 열은 비DM 유래 KSL-T의 결과이며, 핵(청), GFP(녹), 및 표적 분자(상단: MAP2, 중단: 프로인슐린, 하단: TNF-α)(적)의 머지 화상이다. 화살 머리는 융합 세포를 나타낸다. 스케일 바=10㎛.
도 12는 비DM 유래 KSL-T 및 STZ-DM 유래 KSL-T의 단핵 세포에 있어서의 KSL 분획 중의 프로인슐린 양성 세포의 FACS 분석이다. 좌측 상단의 2개의 패널(좌: 비DM 유래 KSL-T, 우: STZ-DM 유래 KSL-T)은 계통 음성 세포 중 KSL 세포(사각으로 둘러싸임)를 나타내고, 세로 축은 c-kit의 형광 강도, 가로 축은 Sca-1의 형광 강도를 나타낸다. 좌측 하단의 2개의 패널(좌: 비DM 유래 KSL-T, 우: STZ-DM 유래 KSL-T)은 프로인슐린 양성 세포(사각으로 둘러싸임)의 분포를 나타내고, 세로 축은 KSL 세포수, 가로 축은 프로인슐린의 형광 강도를 나타낸다. 우측 그래프(좌: 비DM 유래 KSL-T, 우: STZ-DM 유래 KSL-T)는 KSL 세포 중의 프로인슐린 양성 세포의 비율을 나타낸다(1군당 n=3). *: P<0.05.
도 13은 비DM 유래 KSL-T 및 STZ-DM 유래 KSL-T의 단핵 세포에 있어서의 KSL 분획 중의 TNF-α 양성 세포의 FACS 분석이다. 좌측 상단의 2개의 패널(좌: 비DM 유래 KSL-T, 우: STZ-DM 유래 KSL-T)은 계통 음성 세포 중 KSL 세포(사각으로 둘러싸임)를 나타내고, 세로 축은 c-kit의 형광 강도, 가로 축은 Sca-1의 형광 강도를 나타낸다. 좌측 하단의 2개의 패널(좌: 비DM 유래 KSL-T, 우: STZ-DM 유래 KSL-T)은 TNF-α 양성 세포(사각으로 둘러싸임)의 분포를 나타내고, 세로 축은 KSL 세포수, 가로 축은 TNF-α의 형광 강도를 나타낸다. 우측 그래프(좌: 비DM 유래 KSL-T, 우: STZ-DM 유래 KSL-T)는 KSL 세포 중의 TNF-α 양성 세포의 비율을 나타낸다(1군당 n=3). **: P<0.01.
도 14는 인간 당뇨병 환자(DM) 및 건강한 인간 피험자(non-DM)의 혈액 시료에 있어서의 각 유전자의 발현량 비교. 패널은, 각각, 인슐린(좌측 상단), CD34(우측 상단), TNF-α(좌측 하단), CD106(우측 하단)을 나타낸다. 각 패널에 있어서, 좌측의 바는 건강한 인간 피험자의 결과를, 우측의 바는 인간 당뇨병 환자의 결과를 나타낸다. 세로 축은, 건강한 인간 피험자의 평균 결과를 1이라고 했을 경우의, 상대적인 mRNA 발현량을 나타낸다.
도 15는 DM 없음의 환자(DM(-))와 DM 있음의 환자(DM(+))의 골수의 프로인슐린 염색. 프로인슐린 항체로 염색된 골수 세포(화살표)는 DM(+)예에서는 관찰되지만, DM(-)예에서는 관찰되지 않는다. 스케일 바는 50㎛를 나타낸다.
도 16은 STZ 당뇨병 마우스의 골수 이식 치료 개요를 나타내는 모식도이다. 인슐린 펠릿 또는 블랭크 펠릿 처치 하에서 비당뇨병 또는 당뇨병 유래의 골수를 STZ 당뇨병 마우스에게 이식하는 개요를 나타낸다.
도 17은 도 16에 나타내는 치료를 했을 경우의 혈당값의 변화를 나타낸다. 세로 축은, 각 시점에 있어서의 혈당값(mg/dL)의 평균을 표준 오차와 함께 나타낸다. 가로 축은, 골수 이식한 시점을 0주째라고 설정한 처치의 시간 경과를 나타낸다. 인슐린 펠릿의 유효 기간도 도시하고 있다. **P<0.01을 나타낸다. 8주째 시점에서의 혈당값이 높은 순으로, 블랭크 펠릿 및 당뇨병 골수 이식으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스, 블랭크 펠릿 및 비당뇨병 골수 이식으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스, 인슐린 펠릿 및 당뇨병 골수 이식으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스, 그리고 인슐린 펠릿 및 비당뇨병 골수 이식으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스의 결과이다.
도 18은 도 16에 나타내는 치료를 했을 경우의 췌장 동결 절편의 결과이다. (상부 패널) 동결 절편의 인슐린 및 핵의 염색상이다. 각 절편을 취득한 마우스의 조건을 각각의 화상 위에 표시한다. 스케일 바는 10㎛를 나타낸다. (하부 패널) 각 마우스에 있어서 췌도를 랜덤하게 선택하고, 췌도의 크기에 대한 인슐린 양성 세포의 비율(%)을 Image J 소프트웨어로 산출한 결과이다. 좌측으로부터, 비당뇨병 마우스, STZ 당뇨병 마우스, 블랭크 펠릿 및 당뇨병 골수 이식으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스, 블랭크 펠릿 및 비당뇨병 골수 이식으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스, 인슐린 펠릿 및 당뇨병 골수 이식으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스, 그리고 인슐린 펠릿 및 비당뇨병 골수 이식으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스의 결과를 나타낸다. **P<0.01을 나타낸다.
도 19는 도 16에 나타내는 치료를 했을 경우의 췌장 동결 절편의 결과이다. (상부 패널) 동결 절편의 글루카곤 및 핵의 염색상이다. 각 절편을 취득한 마우스의 조건을 각각의 화상 위에 표시한다. 스케일 바는 10㎛를 나타낸다. (하부 패널) 각 마우스에 있어서 췌도를 랜덤하게 선택하고, 췌도의 크기에 대한 글루카곤 양성 세포의 비율(%)을 Image J 소프트웨어로 산출한 결과이다. 좌측으로부터, 비당뇨병 마우스, STZ 당뇨병 마우스, 블랭크 펠릿 및 당뇨병 골수 이식으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스, 블랭크 펠릿 및 비당뇨병 골수 이식으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스, 인슐린 펠릿 및 당뇨병 골수 이식으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스, 그리고 인슐린 펠릿 및 비당뇨병 골수 이식으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스의 결과를 나타낸다. **P<0.01을 나타낸다.
도 20은 도 16에 나타내는 치료를 했을 경우의 대표적인 적출 흉선의 크기 비교를 나타낸다. 좌측으로부터, 비당뇨병 마우스, STZ 당뇨병 마우스, 블랭크 펠릿 및 당뇨병 골수 이식으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스, 블랭크 펠릿 및 비당뇨병 골수 이식으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스, 인슐린 펠릿 및 당뇨병 골수 이식으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스, 그리고 인슐린 펠릿 및 비당뇨병 골수 이식으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스로부터 적출한 흉선을 나타낸다.
도 21은 STZ 당뇨병 마우스의 약물 치료의 개요를 나타내는 모식도이다. STZ 당뇨병 마우스에, 인슐린 펠릿 또는 블랭크 펠릿 처치 하에서 트리코스타틴(줄기 세포 유주제+트리코스타틴 A) 처치를 행하는 개요를 나타낸다.
도 22는 도 21에 나타내는 치료를 했을 경우의 혈당값의 변화를 나타낸다. 세로 축은, 각 시점에 있어서의 혈당값(mg/dL)의 평균을 표준 오차와 함께 나타낸다. 가로 축은, 당뇨병 치료 개시시점을 0주째라고 설정한 처치의 시간 경과를 나타낸다. 인슐린 펠릿의 유효 기간도 도시하고 있다. *P<0.05를 나타낸다. 8주째 시점에서의 혈당값이 높은 순으로, 블랭크 펠릿 및 트리코스타틴으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스, 인슐린 펠릿만으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스, 그리고 인슐린 펠릿 및 트리코스타틴으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스의 결과이다.
도 23은 도 21에 나타내는 치료를 했을 경우의 췌장 동결 절편의 결과이다. (상부 패널) 동결 절편의 인슐린 및 핵의 염색상이다. 각 절편을 취득한 마우스의 조건을 각각의 화상 위에 표시한다. 스케일 바는 10㎛를 나타낸다. (하부 패널) 각 마우스에 있어서 췌도를 랜덤하게 선택하고, 췌도의 크기에 대한 인슐린 양성 세포의 비율(%)을 Image J 소프트웨어로 산출한 결과이다. 좌측으로부터, 비당뇨병 마우스, STZ 당뇨병 마우스, 인슐린 펠릿만으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스, 블랭크 펠릿 및 트리코스타틴으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스, 그리고 인슐린 펠릿 및 트리코스타틴으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스의 결과를 나타낸다. **P<0.01을 나타낸다.
도 24는 도 21에 나타내는 치료를 했을 경우의 췌장 동결 절편의 결과이다. (상부 패널) 동결 절편의 글루카곤 및 핵의 염색상이다. 각 절편을 취득한 마우스의 조건을 각각의 화상 위에 표시한다. 스케일 바는 10㎛를 나타낸다. (하부 패널) 각 마우스에 있어서 췌도를 랜덤하게 선택하고, 췌도의 크기에 대한 글루카곤 양성 세포의 비율(%)을 Image J 소프트웨어로 산출한 결과이다. 좌측으로부터, 비당뇨병 마우스, STZ 당뇨병 마우스, 인슐린 펠릿만으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스, 블랭크 펠릿 및 트리코스타틴으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스, 그리고 인슐린 펠릿 및 트리코스타틴으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스의 결과를 나타낸다. **P<0.01을 나타낸다.
도 25는 도 21에 나타내는 치료를 했을 경우의 대표적인 적출 흉선의 크기 비교를 나타낸다. 좌측으로부터, 비당뇨병 마우스, STZ 당뇨병 마우스, 인슐린 펠릿 및 트리코스타틴으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스, 인슐린 펠릿만으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스, 그리고 블랭크 펠릿 및 트리코스타틴으로 처치한 STZ 당뇨병 마우스로부터 적출한 흉선을 나타낸다. 또한, 비당뇨병 마우스, STZ 당뇨병 마우스로부터 적출한 흉선의 화상은 도 20의 것과 동일하다.
도 26은 NOD 마우스의 골수 이식 치료 개요를 나타내는 모식도이다. 인슐린 펠릿 또는 블랭크 펠릿 처치 하에서 비당뇨병 또는 당뇨병 유래의 골수를 NOD 마우스에게 이식하는 개요를 나타낸다.
도 27은 도 26에 나타내는 치료를 했을 경우의 혈당값의 변화 예상을 나타낸다. 세로 축은, 각 시점에 있어서의 혈당값(mg/dL)을 나타낸다. 가로 축은, 골수 이식한 시점을 0주째라고 설정한 처치의 시간 경과를 나타낸다. 인슐린 펠릿의 유효 기간도 도시하고 있다.
도 28은 도 26에 나타내는 치료를 했을 경우의 췌장 동결 절편의 관찰 결과를 나타낸다. (상부 패널) 동결 절편의 인슐린 및 핵의 염색상이다. 각 절편을 취득한 마우스의 조건을 각각의 화상 위에 표시한다. ICR 마우스 및 당뇨병 발증 NOD 마우스의 화상은 실제의 화상이다. 스케일 바는 10㎛를 나타낸다. (하부 패널) 각 마우스에 있어서 췌도를 랜덤하게 선택하고, 췌도의 크기에 대한 인슐린 양성 세포의 비율(%)을 Image J 소프트웨어로 산출한 결과이다. 좌측으로부터, ICR 마우스, 당뇨병 발증 NOD 마우스, 블랭크 펠릿 및 당뇨병 골수 이식으로 처치한 NOD 당뇨병 마우스, 인슐린 펠릿 및 당뇨병 골수 이식으로 처치한 NOD 당뇨병 마우스, 블랭크 펠릿 및 비당뇨병 골수 이식으로 처치한 NOD 당뇨병 마우스, 그리고 인슐린 펠릿 및 비당뇨병 골수 이식으로 처치한 NOD 당뇨병 마우스의 결과를 나타낸다.
도 29는 도 26에 나타내는 치료를 했을 경우의 췌장 동결 절편의 관찰 결과를 나타낸다. (상부 패널) 동결 절편의 글루카곤 및 핵의 염색상이다. 각 절편을 취득한 마우스의 조건을 각각의 화상 위에 표시한다. (하부 패널) 각 마우스에 있어서 췌도를 랜덤하게 선택하고, 췌도의 크기에 대한 글루카곤 양성 세포의 비율(%)을 Image J 소프트웨어로 산출한 결과이다. 좌측으로부터, ICR 마우스, 당뇨병 발증 NOD 마우스, 블랭크 펠릿 및 당뇨병 골수 이식으로 처치한 NOD 당뇨병 마우스, 인슐린 펠릿 및 당뇨병 골수 이식으로 처치한 NOD 당뇨병 마우스, 블랭크 펠릿 및 비당뇨병 골수 이식으로 처치한 NOD 당뇨병 마우스, 그리고 인슐린 펠릿 및 비당뇨병 골수 이식으로 처치한 NOD 당뇨병 마우스의 결과를 나타낸다.
도 30은 도 26에 나타내는 치료를 했을 경우의 대표적인 적출 흉선의 크기 비교를 나타낸다. 상단의 ICR 마우스(좌), 당뇨병 미발증 NOD 마우스(중앙), 및 당뇨병 발증 NOD 마우스(우)로부터 적출한 흉선의 화상은 실제의 것이고, 스케일은 합쳐져 있다. 스케일 바는 200㎛를 나타낸다. 하단은, 좌측으로부터, 블랭크 펠릿 및 당뇨병 골수 이식으로 처치한 NOD 당뇨병 마우스, 블랭크 펠릿 및 비당뇨병 골수 이식으로 처치한 NOD 당뇨병 마우스, 인슐린 펠릿 및 당뇨병 골수 이식으로 처치한 NOD 당뇨병 마우스, 그리고 인슐린 펠릿 및 비당뇨병 골수 이식으로 처치한 NOD 당뇨병 마우스로부터 적출한 흉선의 예상도를 나타낸다.
도 31은 NOD 마우스의 약물 치료의 개요를 나타내는 모식도이다. NOD 마우스에게, 인슐린 펠릿 또는 블랭크 펠릿 처치 하에서 트리코스타틴(줄기 세포 유주제+트리코스타틴 A) 처치를 행하는 개요를 나타낸다.
도 32는 도 31에 나타내는 치료를 했을 경우의 혈당값의 변화 예상을 나타낸다. 세로 축은, 각 시점에 있어서의 혈당값(mg/dL)을 나타낸다. 가로 축은, 당뇨병 치료 개시시점을 0주째라고 설정한 처치의 시간 경과를 나타낸다. 인슐린 펠릿의 유효 기간도 도시하고 있다.
도 33은 도 31에 나타내는 치료를 했을 경우의 췌장 동결 절편의 관찰 결과를 나타낸다. (상부 패널) 동결 절편의 인슐린 및 핵의 염색상이다. 각 절편을 취득한 마우스의 조건을 각각의 화상 위에 표시한다. ICR 마우스 및 당뇨병 발증 NOD 마우스의 화상은 실제의 화상이다. 스케일 바는 10㎛를 나타낸다. (하부 패널) 각 마우스에 있어서 췌도를 랜덤하게 선택하고, 췌도의 크기에 대한 인슐린 양성 세포의 비율(%)을 Image J 소프트웨어로 산출한 결과이다. 좌측으로부터, ICR 마우스, 당뇨병 발증 NOD 마우스, 인슐린 펠릿만으로 처치한 NOD 당뇨병 마우스, 블랭크 펠릿 및 트리코스타틴으로 처치한 NOD 당뇨병 마우스, 그리고 인슐린 펠릿 및 트리코스타틴으로 처치한 NOD 당뇨병 마우스의 결과를 나타낸다.
도 34는 도 31에 나타내는 치료를 했을 경우의 췌장 동결 절편의 관찰 결과를 나타낸다. (상부 패널) 동결 절편의 글루카곤 및 핵의 염색상이다. 각 절편을 취득한 마우스의 조건을 각각의 화상 위에 표시한다. (하부 패널) 각 마우스에 있어서 췌도를 랜덤하게 선택하고, 췌도의 크기에 대한 글루카곤 양성 세포의 비율(%)을 Image J 소프트웨어로 산출한 결과이다. 좌측으로부터, ICR 마우스, 당뇨병 발증 NOD 마우스, 인슐린 펠릿만으로 처치한 NOD 당뇨병 마우스, 블랭크 펠릿 및 트리코스타틴으로 처치한 NOD 당뇨병 마우스, 그리고 인슐린 펠릿 및 트리코스타틴으로 처치한 NOD 당뇨병 마우스의 결과를 나타낸다.
도 35는 도 26에 나타내는 치료를 했을 경우의 대표적인 적출 흉선의 크기 비교를 나타낸다. 상단의 ICR 마우스(좌), 당뇨병 미발증 NOD 마우스(중앙), 및 당뇨병 발증 NOD 마우스(우)로부터 적출한 흉선의 화상은 실제의 것이고, 스케일은 합쳐져 있다. 스케일 바는 200㎛를 나타낸다. 하단은, 좌측으로부터, 인슐린 펠릿만으로 처치한 NOD 당뇨병 마우스, 블랭크 펠릿 및 트리코스타틴으로 처치한 NOD 당뇨병 마우스, 그리고 인슐린 펠릿 및 트리코스타틴으로 처치한 NOD 당뇨병 마우스로부터 적출한 흉선의 예상도를 나타낸다.
도 36은 당뇨병에 관여하는 골수 세포의 모식도를 당뇨병과 정상을 비교하여 나타낸다.
도 37은 2형 당뇨병에서 골수 유래 세포가 이상을 야기하는 메커니즘을 나타내는 모식도이다.
도 38은 1형 당뇨병에서 골수 유래 세포가 이상을 야기하는 메커니즘을 나타내는 모식도이다.
이하, 본 개시를 최선의 형태를 나타내면서 설명한다. 본 명세서의 전체에 걸쳐, 단수형의 표현은, 특별히 언급하지 않는 한, 그 복수형의 개념도 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 단수형의 관사(예를 들어 영어의 경우에는 "a", "an", "the" 등)는 특별히 언급하지 않는 한, 그 복수형의 개념까지도 포함하는 것으로 이해되어야 한다. 또한, 본 명세서에 있어서 사용되는 용어는, 특별히 언급하지 않는 한, 당해 분야에서 통상 사용할 수 있는 의미로 사용되어야 하는 것으로 이해되어야 한다. 따라서, 달리 정의되지 않는 한, 본 명세서 중에서 사용되는 모든 전문 용어 및 과학 기술 용어는, 본 개시가 속하는 분야의 당업자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가진다. 모순될 경우, 본 명세서(정의를 포함시켜)가 우선한다.
이하에 본 명세서에 있어서 특별히 사용되는 용어의 정의 및/또는 기본적 기술 내용을 적절히 설명한다.
(정의)
본 명세서에 있어서, "당뇨병"은 당해 분야에 있어서 사용되는 통상의 의미로 사용되고, 임신에 수반되는 것이나 특이한 유전자 이상에 의한 것을 제외하고, 통상적으로는, 췌장의 β세포의 파괴에 의해 인슐린이 고갈되어 발생하는 1형 당뇨병, 및 비만 등을 원인으로 하여, 췌장의 랑게르한스섬(췌도)의 β세포로부터의 인슐린 분비량이 감소되고, 근육, 지방 조직으로의 글루코오스의 도입 능력이 저하되어서 생기는 2형 당뇨병으로 분류된다. 또한, 본 연구의 결과에 따르면, 1형 당뇨병 및 2형 당뇨병의 양자는 지금까지 원인이라고 생각되고 있던 것과는 완전히 다른, 면역 이상을 통한 공통의 세포 원인에 의해 일어난다고 추측된다. 당뇨병은, 예를 들어 2회 이상의 검사에서, 공복 시 혈당≥126mg/dL, HbA1c≥6.5%, 경구 포도당 부하 시험(75gOGTT)에서 2시간값이 200mg/dL 이상 등에 의해 진단될 수 있다. 본 명세서에 있어서의 "당뇨병"에는 청년 발증 성인형 당뇨병, 경계형 당뇨병도 포함된다.
본 명세서에 있어서 "당뇨병의 관련 질환" 또는 "당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상"은, 당뇨병과 관련되는 임의의 질환, 장애 및 증상이 포함될 수 있고, 그것들의 예로서, 당뇨병성 신경 장애, 당뇨병성 망막증, 당뇨병성 신증, 속발성 당뇨병, 당뇨병성 혼수, 의식 장애, 복통, 다리 경련, 신경 장애, 고삼투압 고혈당 증후군, 알부민뇨, 부종, 신부전, 실명, 알츠하이머형 인지증, 심근경색, 폐색성 동맥 경화증, 뇌경색, 지방간, 피부 증상(당뇨병성 리포이드류 괴사 등), 창상 치유 능력의 저하, 이감염성(패혈증 등), 암(간암, 신장암, 췌장암, 결장암, 위암, 간암, 난소암, 대장암, 결장암 등), 당뇨병성 케토애시도시스, 심장병, 뇌혈관 장애, 스테로이드 당뇨병, 변비, 현기증(기립성 저혈압), 발기 부전, 심근경색, 흉통, 중증 충수염, 복막 자극 증상, 저온 화상, 임신 당뇨병, 구갈, 다음, 다뇨 등을 들 수 있다.
특별히 언급하지 않는 한, 본 명세서에 있어서 "비당뇨병 피험체"란, 당뇨병도 그 관련 질환도 갖지 않는 피험체를 의미한다.
본 명세서에 있어서 "치료"란, 어느 질환 또는 장애에 대하여, 그러한 상태가 되었을 경우에, 그러한 질환 또는 장애의 악화를 방지, 바람직하게는, 현상 유지, 보다 바람직하게는, 경감, 더욱 바람직하게는 치유하는 것을 말하고, 환자의 질환, 혹은 질환에 수반하는 한 가지 이상의 증상의, 증상 개선 효과 혹은 예방 효과를 발휘할 수 있는 것을 포함한다. 본 명세서에 있어서 "경감"이란, 어느 질환 또는 장애에 대하여, 그러한 상태가 되었을 경우에, 그러한 질환 또는 장애의 중증도를 저감시키는 것을 말하고, "치유"란, 이미 그러한 질환 또는 장애를 가진다고 진단되지 않게 되는 것을 말한다. 사전에 진단을 행하여 적절한 치료를 행하는 것은 "컴패니언 치료"라고 말하고, 그것을 위한 진단약을 "컴패니언 진단약"이라고 하는 경우가 있다.
본 명세서에 있어서 "예방"이란, 어느 질환 또는 장애에 대하여, 그러한 상태가 되기 전에, 그러한 상태가 되지 않도록 하는 것을 말한다. 본 개시의 약제를 사용하여, 진단을 행하고, 필요에 따라 본 개시의 약제를 사용하여 예를 들어 당뇨병 등의 예방을 하거나, 혹은 예방을 위한 대책을 강구할 수 있다.
본 명세서에 있어서 "진단"이란, 피험체에 있어서의 상태(예를 들어 질환, 장애) 등에 관련되는 여러가지 파라미터를 동정하고, 그러한 상태의 현상 또는 미래를 판정하는 것을 말한다. 본 개시의 방법, 조성물, 시스템을 사용함으로써, 체 내의 상태를 조사할 수 있고, 그러한 정보를 사용하여, 피험체에 있어서의 상태, 투여해야 할 처치 또는 예방을 위한 처방물 또는 방법 등의 여러가지 파라미터를 선정할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 협의로는, "진단"은, 현상을 진단하는 것을 말하지만, 광의로는 "조기 진단", "예측 진단", "사전 진단" 등을 포함한다. 본 개시의 진단 방법은, 원칙적으로, 신체로부터 나온 것을 이용할 수 있고, 의사 등의 의료 종사자의 손을 떠나서 실시할 수 있으므로, 산업상 유용하다. 본 명세서에 있어서, 의사 등의 의료 종사자의 손을 떠나서 실시할 수 있다는 것을 명확히 하기 위하여, 특히 "예측 진단, 사전 진단 혹은 진단"을 "지원"한다고 칭하는 경우가 있다. 본 개시의 기술은, 이러한 진단 기술에 응용 가능하다.
본 명세서에 있어서 표적 세포의 "억제"는, 표적 세포의 증식 속도의 저하, 표적 세포의 상해, 표적 세포의 감소 및/또는 표적 세포의 사멸을 초래하는 것을 의미한다. 표적 세포의 억제는 직접적 작용 및/또는 간접적 작용에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어 표적 세포를 억제하는 직접적 작용은, 이 세포가 가진 임의의 특징(예를 들어 발현 분자)을 표적화하여, 표적 세포의 상해, 표적 세포의 감소 및/또는 표적 세포의 사멸을 초래함으로써 달성되고, 예를 들어 방사선 조사, 아폽토시스의 유도, 면역 세포에 의한 공격의 유도 등의 기구를 들 수 있지만, 이것들로 한정되지 않는다. 표적 세포를 억제하는 간접적 작용은, 이 표적 세포를 인식하여 억제하도록 면역계에 학습시키는 방법 등을 들 수 있지만, 이것으로 한정되지 않는다.
본 명세서에 있어서 표적 세포의 "억제제"는, 임의의 수단으로 표적 세포를 억제하는 약제를 의미한다. 본 명세서에 기재되는 억제제에 있어서, 표적 세포를 억제하는 수단은 임의일 수 있으며, 예를 들어 표적 세포에 있어서의 분자 기구에 개입하는 것에 의한 아폽토시스의 촉진, 표적 세포와 표적화 분자(예를 들어 항체)의 결합에 의해 야기되는 면역 세포에 의한 공격, 방사선 발생 분자의 사용 등을 들 수 있지만, 이것으로 한정되지 않는다.
본 명세서에 있어서 세포의 "유주"란, 세포가 생체 내의 어느 장소로부터 다른 장소로 이동하는 것을 의미하지만, 전형적으로는, 세포가 말초 혈액 및/또는 순환 혈액 중으로 이동하는 것을 의미한다. 보다 구체적인 실시 형태에서는, 유주는, 세포가, 골수(또는 그 중의 특정한 부위)로부터 말초 혈액 및/또는 순환 혈액 중으로 이동하는 것을 의미한다. 이러한 골수 중의 특정 부위는, 니치(niche) 또는 특정 니치라고 하는 경우가 있고, 특정 니치란, 생체 내에서 줄기 세포가 그 성질을 유지하기 위하여 필요한 미소 환경을 말한다. 따라서, 본 명세서에서는, 특정한 실시 형태에서는, 니치로부터 줄기 세포를 유주시키는 것을 말하지만, 이것으로 한정되지 않는다.
본 명세서에 있어서 세포의 "유주제"는, 임의의 수단으로 표적 세포를 유주시키는 약제를 의미한다.
본 명세서에 있어서 "조혈 줄기 세포" 또는 "HSC"란, 혈구계 세포로 분화 가능한 줄기 세포를 가리킨다. 인간 성체에서는 주로 골수에 존재하고, 백혈구(호중구, 호산구, 호염기구, 림프구, 단핵구, 마크로파지), 적혈구, 혈소판, 비만 세포, 수지상 세포를 만들어 낸다. 인간 조혈 줄기 세포는, 예를 들어 CD34 양성 Thy-1 양성에 의해 특징지어질 수 있고, 또한, Lineage 음성 CD34 양성 CD38 음성 CD90 양성 CD45RA 음성(즉, Lin-CD34+CD38-CD90+CD45RA-)에 의해서도 특징지어질 수 있다(예를 들어 Proc Natl Acad Sci USA. 2011 Dec 13; 108(50): 20012-20017 참조). 마우스 조혈 줄기 세포는, c-kit 양성 Sca-1 양성 계통 마커 음성(KSL)세포로서 특징지어질 수 있다. 또한, 조혈 줄기 세포는, Hoechest 33342 색소로 염색한 골수 세포를, 자외광(350nm)으로 여기하고, Hoechst blue 및 Hoechst red의 2종류의 광학 필터로 전개했을 경우에 양쪽 모두 음성인 것으로써도 특징지어질 수 있다. 조혈 줄기 세포는, 장기 조혈 줄기 세포(LT-HSC), 단기 조혈 줄기 세포(ST-HSC) 등으로 세분류될 수 있다. 예를 들어 조혈 줄기 세포의 특징은, Cytometry Research 19(2): 25-32, 2009를 참조할 수 있다.
본 명세서에 있어서 "장기 조혈 줄기 세포(LT-HSC)"란 장기 골수 세포 재건능을 가진 조혈 줄기 세포를 말한다. LT-HSC는, 통상, 표면 항원 마커에 의해 특정되고, (예를 들어 마우스에 있어서는) CD34 음성, CD150 양성, CD48 음성, Lin 음성, sca1 양성, c-kit 양성(혹은, Lineage-c-Kit+Sca-1+CD34-/lowCD150+ 세포)라고 표현될 수 있다. 또한, LT-HSC는, (예를 들어 인간에 있어서는) CD34 음성, CD38 음성(혹은, CD34-CD38- 세포)이라고 표현될 수 있다(예를 들어 Nat Immunol. 2010 Jul; 11(7): 585-93; Blood 108, 2446-2454, 2006).
본 명세서에 있어서 "단기 조혈 줄기 세포(ST-HSC)"란, 단기 골수 재건능을 가진 조혈 줄기 세포를 말한다. ST-HSC는, 통상, 표면 항원 마커에 의해 특정되고, (예를 들어 마우스에 있어서는) CD34 양성, CD150 양성, CD48 음성, Lin 음성, sca-1 양성, c-kit 양성이라고 표현될 수 있다. 또한, ST-HSC는, (예를 들어 인간에 있어서는) CD34 양성, CD38 음성(혹은, CD34+CD38- 세포)라고 표현될 수 있다(예를 들어 Nat Immunol. 2010 Jul; 11(7): 585-93; Blood 108, 2446-2454, 2006).
본 명세서에 있어서 "이상 조혈 줄기 세포" 또는 "이상 HSC"란, 이상한 기능을 발현하고 있거나, 및/또는 정상적인 기능을 적어도 일부 결여하고 있는 조혈 줄기 세포를 말한다. 대표적으로는, 이상 HSC는, HDAC, TNF-α, CD106 또는 그 기능적 등가물의 유전자 또는 단백질이 통상 레벨에서 발현되지 않거나 및/또는 기능하지 않은 세포를 말한다.
본 명세서에 있어서, 유전자 또는 단백질이 "통상의 레벨에서 발현되어 있지 않은"이란, 정상적인 기능을 가진 세포에서 보여지는 발현량이 아닌 양이나 레벨에서 당해 유전자 또는 단백질이 발현되어 있는 것을 말한다. 예를 들어 CD106에 대하여 말하자면, CD106이 통상 발현되어 있는 (정상 세포에서 보여지는 통상의 값)으로부터 벗어나는 경우에 이상하다고 판단할 수 있고, 바람직하게는, CD106이 통상보다도 많이 발현되어 있을 경우에 이상하다고 판정할 수 있다. 예를 들어 비당뇨병 및 당뇨병의 마우스로부터 KSL 세포를 FACS로 분취하고, RNA를 추출한 후, QT-PCR을 사용하여 유전자 발현량의 비교 해석을 행함으로써 유전자의 통상 레벨이 아닌 발현(예를 들어 과잉 발현)을 시험할 수 있다. 예를 들어 FACS 해석을 실시하여, 이상한 조혈 줄기 세포의 표면 항원을 검출하고, 당뇨병 피험체와 비당뇨병 피험체를 비교함으로써 단백질의 통상의 레벨이 아닌 발현을 시험할 수 있다.
본 명세서에 있어서, 유전자 또는 단백질이 "통상의 레벨에서 기능하고 있지 않은"이란, 정상적인 기능을 가진 세포에서 보여지는 레벨의 기능이 당해 유전자 또는 단백질에 대하여 보여지지 않는 것을 말한다. 예를 들어 CD106에 대하여 말하자면, CD106이 통상 기능하는 레벨(정상 세포에서 보여지는 통상의 레벨 또는 값)에서 벗어나는 경우에 이상하다고 판단할 수 있고, 바람직하게는, CD106이 통상보다도 많은 레벨에서 기능이 관찰되는 경우에 이상하다고 판정할 수 있다. 예를 들어 FACS 해석을 실시하여, 이상한 조혈 줄기 세포의 표면 항원을 검출하고, 당뇨병 피험체와 비당뇨병 피험체를 비교하여 단백질의 활성화를 관찰함으로써 단백질이 통상의 레벨에서 기능하고 있지 않은 것을 시험할 수 있다.
본 명세서에 있어서 "CXCR4"란, CD184 또는 Fusin으로서도 알려지는 7회 막관통형의 G단백 공액 수용체(GPCR)이다. CXCR4의 생리적 리간드는, CXC 케모카인의 하나로, 단핵구 및 림프구의 유주를 강하게 유도하는 stromal cell-derived factor-1(SDF-1)이다. CXCR4의 저해에 의해 조혈 줄기 세포의 유주가 생기게 할 수 있다(Future Oncol. 2007 Feb; 3(1): 19-27).
본 명세서에 있어서 "CD106"란, 표면 항원의 1종이며, 접착 분자 VCAM-1(Vascular cell adhesion molecule-1) 또는 INCAM-100으로서도 알려지는, Ig 슈퍼패밀리 멤버의 I형 막단백질이며, 사이토카인 활성화 내피에 의해 발현되는 세포 표면 시알로 당단백질이며, 백혈구-내피 세포 접착 및 시그널 전달을 매개하는 것이 알려진다. 인간에서는, VCAM-1 아이소폼 a 프리커서(핵산 서열: NM_001078.4, 아미노산 서열: NP_001069.1), VCAM-1 아이소폼 b 프리커서(핵산 서열: NM_080682.2, 아미노산 서열: NP_542413.1), VCAM-1 아이소폼 c 프리커서(핵산 서열: NM_001199834.1, 아미노산 서열: NP_001186763.1)가 대표적이다.
본 명세서에 있어서 "CD34"란, 줄기 세포의 골수 세포 외 매트릭스 또는 간질 세포로의 부착에 관여한다고 생각되고 있는 표면 단백질이며, 고도로 글리코실화되어, 프로틴 키나아제 C에 의해 인산화되는 것으로 알려진다. 인간에서는, CD34 전사 배리언트 1(핵산 서열: NM_001025109.2, 아미노산 서열: NP_001020280.1), CD34 전사 배리언트 2(핵산 서열: NM_001773.3, 아미노산 서열: NP_001764.1)가 대표적이다.
본 명세서에 있어서 "종양 괴사 인자 알파" 또는 그 생략형인 "TNF-α"란, TNF, DIF, TNFA, TNFSF2, TNLG1F로서도 알려지는 종양 괴사 인자(TNF) 슈퍼패밀리에 속하는 다기능 염증 유발성 사이토카인이며, 주로 마크로파지에 의해 분비되는 단백질을 가리킨다. TNF-α는, 수용체 TNFRSF1A/TNFR1 및 TNFRSF1B/TNFBR를 개재시켜 기능할 수 있고, 세포 증식, 분화, 아폽토시스, 지질 대사, 및 응혈 등 광범위한 생물학적 프로세스의 조절에 관여한다. 인간에서는, 핵산 서열: NM_000594.4, 아미노산 서열: NP_000585.2이 대표적이다.
본 명세서에 있어서 "프로인슐린"이란, 인슐린의 전구체 단백질을 가리킨다. 프로인슐린은, 췌장 β세포의 소포체에 있어서 프로세싱되어, 미성숙된 분비 과립 내에서 C 펩티드 영역이 제거됨으로써 A쇄 및 B쇄로 구성되는 인슐린이 생성된다. 인간에서는, 프로인슐린 전사 배리언트 1(핵산 서열: NM_000207.3, 아미노산 서열: NP_000198.1), 프로인슐린 전사 배리언트 2(핵산 서열: NM_001185097.2, 아미노산 서열: NP_001172026.1), 프로인슐린 전사 배리언트 3(핵산 서열: NM_001185098.1, 아미노산 서열: NP_001172027.1), 프로인슐린 전사 배리언트 4(핵산 서열: NM_001291897.2, 아미노산 서열: NP_001278826.1)가 대표적이다.
본 명세서에 있어서 "c-Kit"란, PBT, SCFR, KIT, CD117 또는 MASTC으로서도 알려지는 MGF(비만 세포 증식 인자, 줄기 세포 인자로서도 알려짐)의 3형 막관통 수용체를 가리킨다. 인간에서는, Kit아이소폼 1 프리커서(핵산 서열: NM_000222.2, 아미노산 서열: NP_000213.1), Kit 아이소폼 2 프리커서(핵산 서열: NM_001093772.1, 아미노산 서열: NP_001087241.1)가 대표적이다.
본 명세서에 있어서 "CD20"란, MS4A1, B1, S7, Bp35, CD20, CVID5, MS4A2 또는 LEU-16으로서도 알려지는 막관통형 4A 유전자 패밀리의 멤버이며, B세포의 형질 세포로의 발달 및 분화에 있어서 역할을 하는 B 림프구 표면 분자를 가리킨다. 인간에서는, CD20전사 배리언트 1(핵산 서열: NM_152866.2, 아미노산 서열: NP_690605.1), CD20전사 배리언트 3(핵산 서열: NM_021950.3, 아미노산 서열: NP_068769.2)이 대표적이다.
본 명세서에 있어서 "히스톤 탈아세틸화 효소(HDAC)"란, 히스톤 등의 단백질상의 리신 아세틸화 수식을 해제하는 효소 활성을 가진다로 생각되는 단백질의 패밀리이며, 그 멤버로서 HDAC1, 2, 3, 6, 8, 9 등이 알려진다. 인간에서는, HDAC1(핵산 서열: NM_004964.2, 아미노산 서열: NP_004955.2), HDAC2(핵산 서열: NM_001527.3, 아미노산 서열: NP_001518.3), HDAC3(핵산 서열: NM_003883.3, 아미노산 서열: NP_003874.2), HDAC4(핵산 서열: NM_006037.3, 아미노산 서열: NP_006028.2), HDAC6(핵산 서열: NM_001321226.1, 아미노산 서열: NP_001308155.1), HDAC8(핵산 서열: NM_001166418.1, 아미노산 서열: NP_001159890.1), HDAC9(핵산 서열: NM_001204144.2, 아미노산 서열: NP_001191073.1)가 대표적이다.
특별히 언급하지 않는 한, 본 명세서에 있어서, 각 단백질에 관한 언급은, 특정한 액세션 번호에 기재되는 아미노산 서열을 가진 단백질(혹은 그것을 코드하는 핵산)뿐만 아니라, 그 기능적 등가물도 또한 기도되는 것으로 이해된다.
본 명세서에 있어서, 어떤 분자의 "기능적 등가물"에는, 그 분자의 변이체 또는 개변체(예를 들어 아미노산 서열 개변체 등)이며, 본 명세서에 기재되는 특징(예를 들어 마커)로서의 기능을 가진 것, 그 분자의 생물학적 기능과 마찬가지의 기능(동일한 정도가 아니어도 됨)을 발휘하는 것, 그리고, 작용하는 시점에 있어서, 그 분자 자체로 변화할 수 있다는 것이 포함되는 것으로 이해된다.
본 명세서에 있어서, 어떤 분자의 "기능적 개변체"에는, 그 분자의 기능을 유지한(정도는 변경되어도 됨) 채 그 분자를 개변한 물질이 포함된다. 예를 들어 항체 등의 결합 분자의 기능적 개변체에는, 표적 분자와의 결합 기능을 유지하도록, 다른 부분(표지, 다른 기능성 분자(단백질 등) 등)와 콘주게이트화한 것, 프래그먼트화한 것 등이 포함된다. 이와 같이, 본 명세서에서 사용되는 경우, 기능적 개변체는, 개변 전의 기본이 되는 기능을 유지하는 것이다.
본 개시의 기능적 등가물로서는, 아미노산 서열에 있어서, 1 혹은 복수개의 아미노산의 삽입, 치환 혹은 결실, 또는 그 한쪽 혹은 양쪽 말단으로의 부가된 것을 사용할 수 있다. 본 명세서에 있어서, "아미노산 서열에 있어서, 1 혹은 복수개의 아미노산의 삽입, 치환 혹은 결실, 또는 그 한쪽 혹은 양쪽 말단으로의 부가"란, 부위 특이적 돌연 변이 유발법 등의 주지의 기술적 방법에 의해, 혹은 천연의 변이에 의해, 천연적으로 발생할 수 있을 정도의 복수개의 아미노산 치환 등에 의해 개변이 이루어지고 있는 것을 의미한다.
본 명세서에 있어서 "생물학적 기능"이란, 어느 유전자 또는 그것에 관한 핵산 분자 혹은 폴리펩티드에 대하여 언급할 때, 그 유전자, 핵산 분자 또는 폴리펩티드가 생체 내에 있어서 가질 수 있는 특정한 기능을 말하고, 여기에는, 예를 들어 특이적인 항체의 생성, 효소 활성, 저항성의 부여 등을 들 수 있지만 그것들로 한정되지 않는다. 이러한 생물학적 활성은, 상술한 표 중에서 언급되는 액세션 번호, Entrez 번호 등에 있어서 인용되는 문헌 등을 참조할 수 있고, 본 명세서에 있어서 그러한 문헌 등도 또한 참고로서 인용한다. 본 명세서에 있어서, 생물학적 기능은, "생물학적 활성"에 의해 발휘될 수 있다. 본 명세서에 있어서 "생물학적 활성"이란, 어느 인자(예를 들어 폴리뉴클레오티드, 단백질 등)가 생체 내에 있어서 가질 수 있는 활성을 말하고, 여러가지 기능(예를 들어 전사 촉진 활성)을 발휘하는 활성이 포함되고, 예를 들어 어느 분자와의 상호 작용에 의해 다른 분자가 활성화 또는 불활성화되는 활성도 포함된다. 2개의 인자가 상호 작용하는 경우, 그 생물학적 활성은, 그 2분자와의 사이의 결합 및 그것에 의하여 생기는 생물학적 변화, 예를 들어 하나의 분자를 항체를 사용하여 침강시켰을 때에 다른 분자도 공침 할 때, 2분자는 결합하고 있다고 생각된다. 따라서, 그러한 공침을 보는 것을 하나의 판단 수법으로서 들 수 있다. 예를 들어 어느 인자가 효소일 경우, 그 생물학적 활성은, 그 효소 활성을 포함한다. 다른 예에서는, 어느 인자가 리간드일 경우, 그 리간드가 대응하는 리셉터로의 결합을 포함한다. 그러한 생물학적 활성은, 당해 분야에 있어서 주지의 기술에 의해 측정할 수 있다.
본 명세서에서 사용되는 단백질 또는 핵산의 "유도체" 또는 "유사체" 또는 "변이체"는, 한정을 의도하는 것은 아니지만, 단백질 또는 핵산에 실질적으로 상동인 영역을 포함하는 분자를 포함하고, 이러한 분자는, 여러가지 실시 형태에 있어서, 동일 사이즈의 아미노산 서열 또는 핵산 서열에 걸쳐, 또는 당해 분야에서 공지된 컴퓨터 상동성 프로그램에 의해 얼라인먼트를 행하여 얼라인되는 서열과 비교했을 때, 적어도 30%, 40%, 50%, 60%, 70%, 80%, 90%, 95%, 98% 또는 99% 동일하거나, 혹은 이러한 핵산의 "유도체" 또는 "유사체" 또는 "변이체"는, 엄격한 조건, 중간 정도로 엄격한 조건, 또는 엄격하지 않은 조건 하에서, 원래의 핵산으로 혼성화 가능하다. 대표적으로는, 단백질의 "유도체" 또는 "유사체" 또는 "변이체"는, 천연 존재 단백질에 아미노산 치환, 결실 및 부가 등의 수식이 생긴 산물이며, 또한, 천연 존재 단백질의 생물학적 기능을, 반드시 동일한 정도가 아니어도 좋지만 나타내는 단백질을 의미한다. 예를 들어 본 명세서에 있어서 기재되거나 혹은 당해 분야에서 공지된 적절하고 이용 가능한 in vitro 어세이에 의해, 이러한 단백질의 생물학적 기능을 조사하는 것도 가능하다. 본 개시에서는, 인간에 대하여 주로 논해지지만, 다른 종 예를 들어 영장류 내의 다른 종 혹은 이 밖의 속의 동물 종의 것에도 들어 맞는다는 것이 이해되고, 이러한 포유 동물에 대하여도, 본 개시의 범위 내에 들어가는 것으로 이해된다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "활성"은, 가장 넓은 의미에서의 분자의 기능을 가리킨다. 활성은, 한정을 의도하는 것은 아니지만, 대체적으로, 분자의 생물학적 기능, 생화학적 기능, 물리적 기능 또는 화학적 기능을 포함한다. 활성은, 예를 들어 효소 활성, 다른 분자와 상호 작용하는 능력, 및 다른 분자 기능을 활성화하거나, 촉진하거나, 안정화하거나, 저해하거나, 억제하거나, 또는 불안정화하는 능력, 안정성, 특정한 세포 내 위치에 국재하는 능력을 포함한다. 적용 가능한 경우, 이 용어는 또한, 가장 넓은 의미에서의 단백질 복합체의 기능에도 관련된다.
본 명세서에서 사용되는 "기능적으로 활성인" 단백질, 폴리펩티드, 프래그먼트 또는 유도체는, 생물학적 활성 등의, 단백질의 구조적 기능, 제어 기능, 또는 생화학적 기능을 가진다.
본 명세서에 있어서 "유전자"란, 유전 형질을 규정하는 인자를 말한다. 통상 염색체 상에 일정한 순서로 배열되어 있다. 단백질의 일차 구조를 규정하는 유전자를 구조 유전자라고 하고, 그 발현을 좌우하는 유전자를 조절 유전자라고 한다. 본 명세서에서는, "유전자"는, "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드" 및 "핵산"(여기서는, DNA, RNA 등을 포함한다)을 가리키는 경우가 있다. "유전자 산물"이란, 유전자에 기초하여 산생된 물질이며 단백질, mRNA 등을 가리킨다. 따라서, mRNA는 유전자의 개념에도 들어갈 수 있고, 유전자 산물에도 해당할 수 있다. 또한 "유전자의 발현"이라고 하는 경우에는, mRNA 등의 전사 레벨을 가리키는 경우가 많다.
본 명세서에 있어서 "단백질", "폴리펩티드", "올리고 펩티드" 및 "펩티드"는, 본 명세서에 있어서 동일한 의미로 사용되고, 임의의 길이의 아미노산의 폴리머를 말한다. 이 폴리머는, 직쇄이어도 분지되어 있어도 되고, 환상이어도 된다. 아미노산은, 천연의 것이어도 비천연의 것이어도 되고, 개변된 아미노산이어도 된다. 이 용어는 또한, 복수의 폴리펩티드쇄의 복합체에 어셈블된 것을 포함할 수 있다. 이 용어는 또한, 천연 또는 인공적으로 개변된 아미노산 폴리머도 포함한다. 그러한 개변으로서는, 예를 들어 디술피드 결합 형성, 글리코실화, 지질화, 아세틸화, 인산화 또는 임의의 다른 조작 혹은 개변(예를 들어 표지 성분과의 결합체화)이 포함된다. 이 정의에는 또한, 예를 들어 아미노산의 1 또는 2 이상의 아날로그를 포함하는 폴리펩티드(예를 들어 비천연 아미노산 등을 포함함), 펩티드양 화합물(예를 들어 펩토이드) 및 당해 분야에 있어서 공지된 다른 개변이 포함된다.
본 명세서에 있어서 "폴리뉴클레오티드", "올리고뉴클레오티드" 및 "핵산"은, 본 명세서에 있어서 동일한 의미로 사용되고, 임의의 길이의 뉴클레오티드의 폴리머를 말한다. 이 용어는 또한, "올리고뉴클레오티드 유도체" 또는 "폴리뉴클레오티드 유도체"를 포함한다. "올리고뉴클레오티드 유도체" 또는 "폴리뉴클레오티드 유도체"란, 뉴클레오티드의 유도체를 포함하거나, 또는 뉴클레오티드간의 결합이 통상과는 다른 올리고뉴클레오티드 또는 폴리뉴클레오티드를 말하고, 호환적으로 사용된다. 그러한 올리고뉴클레오티드로서 구체적으로는, 예를 들어 2'-O-메틸-리보뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드 중의 인산 디에스테르 결합이 포스포로티오에이트 결합으로 변환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 인산 디에스테르 결합이 N3'-P5'포스포로아미데이트 결합으로 변환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 리보오스와 인산 디에스테르 결합이 펩티드 핵산 결합으로 변환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 우라실이 C-5 프로피닐우라실로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 우라실이 C-5 티아졸우라실로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 시토신이 C-5 프로피닐시토신으로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, 올리고뉴클레오티드 중의 시토신이 페녹사진 수식 시토신(phenoxazine-modified cytosine)으로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체, DNA 중의 리보오스가 2'-O-프로필리보오스로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체 및 올리고뉴클레오티드 중의 리보오스가 2'-메톡시에톡시리보오스로 치환된 올리고뉴클레오티드 유도체 등이 예시된다. 달리 그렇지 않다고 나타내어지지 않으면, 특정한 핵산 서열은 또한, 명시적으로 나타내어진 서열과 마찬가지로, 그 보존적으로 개변된 개변체(예를 들어 축중 코돈 치환체) 및 상보 서열을 포함하는 것으로 기도된다. 구체적으로는, 축중 코돈 치환체는, 1 또는 그 이상의 선택된(또는, 모든) 코돈의 3번째의 위치가 혼합 염기 및/또는 데옥시이노신 잔기로 치환된 서열을 작성함으로써 달성될 수 있다(Batzer et al., Nucleic Acid Res.19: 5081(1991); Ohtsuka et al., J.Biol.Chem.260: 2605-2608 (1985); Rossolini et al., Mol. Cell. Probes 8: 91-98(1994)). 본 명세서에 있어서 "핵산"은 또한, 유전자, cDNA, mRNA, 올리고뉴클레오티드, 및 폴리뉴클레오티드와 호환 가능하게 사용된다. 본 명세서에 있어서 "뉴클레오티드"는, 천연적인 것이어도 비천연적인 것이어도 된다.
본 명세서에 있어서 유전자의 "상동성"이란, 2 이상의 유전자 서열의, 서로에 대한 동일성의 정도를 말하고, 일반적으로 "상동성"을 가진다란, 동일성 또는 유사성의 정도가 높다는 것을 말한다. 따라서, 어떤 2개의 유전자의 상동성이 높을수록, 그것들의 서열의 동일성 또는 유사성은 높다. 2종류의 유전자가 상동성을 갖는지 여부는, 서열의 직접적인 비교, 또는 핵산의 경우 엄격한 조건 하에서의 하이브리다이제이션법에 의해 조사할 수 있다. 2개의 유전자 서열을 직접 비교하는 경우, 그 유전자 서열 사이에서 DNA 서열이, 대표적으로는 적어도 50% 동일할 경우, 바람직하게는 적어도 70% 동일할 경우, 보다 바람직하게는 적어도 80%, 90%, 95%, 96%, 97%, 98% 또는 99% 동일할 경우, 그러한 유전자는 상동성을 가진다. 따라서 본 명세서에 있어서 "상동체" 또는 "상동 유전자 산물"은, 본 명세서에 추가로 기재하는 복합체의 단백질 구성 요소와 동일한 생물학적 기능을 발휘하는, 다른 종, 바람직하게는 포유 동물에 있어서의 단백질을 의미한다. 그러한 상동체는 또한, "오르토로그 유전자 산물"이라고 칭해지는 경우도 있다.
아미노산은, 그 일반적으로 공지된 3문자 기호나, 또는 IUPAC-IUB Biochemical Nomenclature Commission에 의해 권장되는 1문자 기호 중 어느 것에 의해, 본 명세서 중에서 언급될 수 있다. 뉴클레오티드도 마찬가지로, 일반적으로 인지된 1문자 코드에 의해 언급될 수 있다. 본 명세서에서는, 아미노산 서열 및 염기 서열의 유사성, 동일성 및 상동성의 비교는, 서열 분석용 툴인 BLAST를 사용하여 default parameter를 사용하여 산출된다. 동일성의 검색은 예를 들어 NCBI의 BLAST 2.2.9(2004.5.12 발행)를 사용하여 행할 수 있다. 본 명세서에 있어서의 동일성의 값은 통상적으로는 상기 BLAST를 사용하고, 디폴트의 조건으로 얼라인했을 때의 값을 말한다. 단, 파라미터의 변경에 의해, 더 높은 값이 나오는 경우에는, 가장 높은 값을 동일성의 값으로 한다. 복수의 영역에서 동일성이 평가되는 경우에는 그 중의 가장 높은 값을 동일성의 값으로 한다. 유사성은, 동일성에 더하여, 유사한 아미노산에 대하여도 계산에 넣은 수치이다.
본 명세서에 있어서 "엄격(한) 조건에서 혼성화하는 폴리뉴클레오티드"란, 당해 분야에서 관용되는 주지의 조건을 말한다. 본 개시의 폴리뉴클레오티드 중에서 선택된 폴리뉴클레오티드를 프로브로 하여, 콜로니·하이브리다이제이션법, 플라크·하이브리다이제이션법 혹은 서던 블롯 하이브리다이제이션법 등을 사용함으로써, 그러한 폴리뉴클레오티드를 얻을 수 있다. 구체적으로는, 콜로니 혹은 플라크 유래의 DNA를 고정화한 필터를 사용하여, 0.7 내지 1.0M의 NaCl 존재 하, 65℃에서 하이브리다이제이션을 행한 후, 0.1 내지 2배 농도의 SSC(saline-sodium citrate)용액 (1배 농도의 SSC 용액의 조성은, 150mM 염화 나트륨, 15mM 시트르산 나트륨임)을 사용하여, 65℃ 조건 하에서 필터를 세정함으로써 동정할 수 있는 폴리뉴클레오티드를 의미한다. 하이브리다이제이션은, Molecular Cloning 2nd ed., Current Protocols in Molecular Biology, Supplement 1~38, DNA Cloning 1: Core Techniques, A Prac1tical Approach, Second Edition, Oxford University Press(1995) 등의 실험서에 기재되어 있는 방법에 준하여 행할 수 있다. 낮은 엄격도 조건은, 35% 포름아미드, 5xSSC, 50mM Tris-HCl(pH7.5), 5mM EDTA, 0.02% 폴리비닐피롤리돈(PVP), 0.02% BSA, 100μg/ml 변성 연어 정자 DNA, 및 10%(중량/체적) 덱스트란 황산을 포함하는 완충액 중, 40℃에서 18 내지 20시간 하이브리다이제이션하고, 2xSSC, 25mM Tris-HCl(pH7.4), 5mM EDTA, 및 0.1% SDS로 이루어지는 완충액 중, 55℃에서 1 내지 5시간 세정하고, 그리고 2xSSC, 25mM Tris-HCl(pH7.4), 5mM EDTA, 및 0.1% SDS로 이루어지는 완충액 중, 60℃에서 1.5시간 세정하는 것을 포함한다.
본 명세서에 있어서 "정제된" 물질 또는 생물학적 인자(예를 들어 핵산 또는 단백질 등)란, 그 생물학적 인자에 천연적으로 수반하는 인자의 적어도 일부가 제거된 것을 말하다. 따라서, 통상 정제된 생물학적 인자에 있어서의 그 생물학적 인자의 순도는, 그 생물학적 인자가 통상 존재하는 상태보다도 높다(즉 농축되어 있음). 본 명세서 중에서 사용되는 용어 "정제된"은, 바람직하게는 적어도 75중량%, 보다 바람직하게는 적어도 85중량%, 보다 더욱 바람직하게는 적어도 95중량%, 그리고 가장 바람직하게는 적어도 98중량%의, 동일 유형의 생물학적 인자가 존재하는 것을 의미한다. 본 개시에서 사용되는 물질은, 바람직하게는 "정제된" 물질이다.
본 명세서에 있어서 "대응되는" 아미노산 또는 핵산이란, 어떤 폴리펩티드 분자 또는 폴리뉴클레오티드 분자에 있어서, 비교의 기준이 되는 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드에 있어서의 소정의 아미노산 또는 뉴클레오티드와 마찬가지의 작용을 갖거나, 또는 갖는 것이 예측되는 아미노산 또는 뉴클레오티드를 말하고, 특히 효소 분자에 있어서는, 활성 부위 중의 마찬가지의 위치에 존재하여 촉매 활성에 마찬가지의 기여를 하는 아미노산을 말한다. 예를 들어 안티 센스 분자라면, 그 안티 센스 분자의 특정한 부분에 대응하는 오르토로그에 있어서의 동일한 부분일 수 있다. 대응되는 아미노산은, 예를 들어 시스테인화, 글루타치온화, S-S 결합 형성, 산화(예를 들어 메티오닌 측쇄의 산화), 포르밀화, 아세틸화, 인산화, 당쇄 부가, 미리스틸화 등이 되는 특정한 아미노산일 수 있다. 혹은, 대응되는 아미노산은, 이량체화를 담당하는 아미노산일 수 있다. 이러한 "대응되는" 아미노산 또는 핵산은, 일정 범위에 걸치는 영역 또는 도메인이어도 된다. 따라서, 그러한 경우, 본 명세서에 있어서 "대응되는" 영역 또는 도메인이라고 칭해진다.
본 명세서에 있어서 "대응되는" 유전자(예를 들어 폴리뉴클레오티드 서열 또는 분자)란, 어느 종에 있어서, 비교의 기준이 되는 종에 있어서의 소정의 유전자와 마찬가지의 작용을 갖거나, 또는 갖는 것이 예측되는 유전자(예를 들어 폴리뉴클레오티드 서열 또는 분자)를 말하고, 그러한 작용을 가진 유전자가 복수개 존재하는 경우, 진화학적으로 동일한 기원을 가진 것을 말하다. 따라서, 어떤 유전자에 대응되는 유전자는, 그 유전자의 오르토로그일 수 있다. 그러한 대응되는 유전자는, 당해 분야에 있어서 주지의 기술을 사용하여 동정할 수 있다. 따라서, 예를 들어 어떤 동물(예를 들어 마우스, 래트)에 있어서의 대응되는 유전자는, 대응되는 유전자(예를 들어 인간의 것)의 기준이 되는 유전자의 서열을 쿼리 서열로서 사용하여 그 동물의 서열 데이터 베이스를 검색함으로써 발견할 수 있다.
본 명세서에 있어서 "프래그먼트(단편)"란, 전장의 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드(길이가 n)에 대하여 1 내지 n-1까지의 서열 길이를 가진 폴리펩티드 또는 폴리뉴클레오티드를 말한다. 프래그먼트의 길이는, 그 목적에 따라, 적절히 변경할 수 있으며, 예를 들어 그 길이의 하한으로서는, 폴리펩티드의 경우, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50 및 그 이상의 아미노산을 들 수 있고, 여기의 구체적으로 열거하고 있지 않은 정수로 나타내는 길이(예를 들어 11 등)도 또한, 하한으로서 적절할 수 있다. 또한, 폴리뉴클레오티드의 경우, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 15, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100 및 그 이상의 뉴클레오티드를 들 수 있고, 여기의 구체적으로 열거하고 있지 않은 정수로 나타내는 길이(예를 들어 11 등)도 또한, 하한으로서 적절할 수 있다. 본 명세서에 있어서, 이러한 프래그먼트는, 예를 들어 전장의 것이 마커로서 기능할 경우, 그 프래그먼트 자체도 또한 마커로서의 기능을 가진 한, 본 개시의 범위 내에 들어가는 것으로 이해된다. 본 개시에 있어서, 분자의 프래그먼트란, 이 분자가 임의의 영역을 포함하는 물질(대표적으로는 폴리펩티드)이며, 본 개시의 목적(예를 들어 치료, 검출, 진단 등)에 사용할 수 있는 한, 천연 분자의 생물학적 기능을 가지고 있지 않아도 된다.
본 명세서에 있어서 유전자, 폴리뉴클레오티드, 폴리펩티드 등의 "발현"이란, 그 유전자 등이 생체 내에서 일정한 작용을 받아, 다른 형태가 되는 것을 말한다. 바람직하게는, 유전자, 폴리뉴클레오티드 등이, 전사 및 번역되어, 폴리펩티드의 형태가 되는 것을 말하는데, 전사되어 mRNA가 제작되는 것도 또한 발현의 일 양태일 수 있다. 보다 바람직하게는, 그러한 폴리펩티드의 형태는, 번역 후 프로세싱을 받은 것(본 명세서에서 말하는 유도체)일 수 있다. 예를 들어 분자의 발현 레벨은, 임의의 방법에 의해 결정할 수 있다. 구체적으로는, 이 분자의 mRNA의 양, 단백질의 양, 또는 단백질의 생물학적인 활성을 평가함으로써 발현 레벨을 알 수 있다.
본 명세서에 있어서 "발현량"이란, 목적으로 하는 세포, 조직 등에 있어서, 폴리펩티드 또는 mRNA 등이 발현되는 양을 말한다. 그러한 발현량으로서는, 본 개시의 항체를 사용하여 ELISA법, RIA법, 형광 항체법, 웨스턴 블롯법, 면역 조직 염색법 등의 면역학적 측정 방법을 포함하는 임의의 적절한 방법에 의해 평가되는 본 개시 폴리펩티드의 단백질 레벨에서의 발현량, 또는 노던 블롯법, 도트 블롯법, PCR법 등의 분자 생물학적 측정 방법을 포함하는 임의의 적절한 방법에 의해 평가되는 본 개시에 있어서 사용되는 폴리펩티드의 mRNA 레벨에서의 발현량을 들 수 있다. "발현량의 변화"란, 상기 면역학적 측정 방법 또는 분자 생물학적 측정 방법을 포함하는 임의의 적절한 방법에 의해 평가되는 본 개시에 있어서 사용되는 폴리펩티드의 단백질 레벨 또는 mRNA 레벨에서의 발현량이 증가 혹은 감소하는 것을 의미한다. 어떤 마커의 발현량을 측정함으로써, 마커에 기초하는 여러가지 검출 또는 진단을 행할 수 있다.
본 명세서에 있어서 "마커(물질, 단백질 또는 유전자(핵산))"란, 어느 상태(예를 들어 세포의 종류, 정상 세포 상태, 질환 상태, 장애 상태, 혹은 증식 능력, 분화 상태의 레벨 등)에 있거나 또는 그 위험성이 있는지 여부를 추적하는 지표가 되는 물질을 말한다. 이러한 마커로서는, 유전자(핵산=DNA 레벨), 유전자 산물(mRNA, 단백질 등), 대사 물질, 효소 등을 들 수 있다. 본 개시에 있어서, 어떤 상태(당뇨병 등)에 대한 검출, 진단, 예비적 검출, 예측 또는 사전 진단은, 그 상태에 관련되는 마커에 특이적인 약제, 제제, 인자 또는 수단, 혹은 그것들을 포함하는 조성물, 키트 또는 시스템 등을 사용하여 실현할 수 있다.
본 명세서에 있어서 "항체"는, 광의로는 폴리클로날 항체, 모노클로날 항체, 다중 특이성 항체, 키메라 항체, 및 항이디오타입 항체, 그리고 그것들의 프래그먼트, 예를 들어 Fv 프래그먼트, Fab' 프래그먼트, F(ab')2 및 Fab 프래그먼트, 그리고 그 밖의 재조합에 의해 생산된 결합체 또는 기능적 등가물(예를 들어 키메라 항체, 인간화 항체, 다기능 항체, 이중 특이성 또는 올리고 특이성(oligospecific) 항체, 단쇄 항체, scFV, 디아바디, sc(Fv)2(single chain (Fv)2), scFv-Fc)을 포함한다. 추가로 이러한 항체를, 효소, 예를 들어 알칼리성 포스파타아제, 서양 고추냉이 페록시다아제, α갈락토시다아제 등에 공유 결합시키거나 또는 재조합에 의해 융합시켜도 된다. 본 개시에서 사용되는 항체는, 그 유래, 종류, 형상 등은 문제되지 않는다. 구체적으로는, 비인간 동물의 항체(예를 들어 마우스 항체, 래트 항체, 낙타 항체), 인간 항체, 키메라 항체, 인간화 항체 등의 공지된 항체를 사용할 수 있다. 본 개시에 있어서는, 모노클로날, 혹은 폴리클로날을 항체로서 이용할 수 있지만 바람직하게는 모노클로날 항체이다. 항체의 표적 단백질로의 결합은 특이적인 결합인 것이 바람직하다.
본 명세서에 있어서 "수단"이란, 어느 목적(예를 들어 검출, 진단, 치료, 예방, 유주)을 달성하는 임의의 도구가 될 수 있다는 것을 말하고，특히 본 명세서에서는, "선택적으로 인식(검출)하는 수단"이란, 어느 대상을 다른 것과는 다르게 인식(검출)할 수 있는 수단을 말한다.
본 명세서에 있어서 폴리뉴클레오티드 또는 폴리펩티드 발현의 "검출" 또는 "정량"은, 예를 들어 마커 검출제로의 결합 또는 상호 작용을 포함하는, mRNA의 측정 및 면역학적 측정 방법을 포함하는 적절한 방법을 사용하여 달성될 수 있다. 분자 생물학적 측정 방법으로서는, 예를 들어 노던 블롯법, 도트 블롯법 또는 PCR법 등이 예시된다. 면역학적 측정 방법으로서는, 예를 들어 방법으로서는, 마이크로타이터 플레이트를 사용하는 ELISA법, RIA법, 형광 항체법, 발광 면역 검정(LIA), 면역 침강법(IP), 면역 확산법(SRID), 면역 비탁법(TIA), 웨스턴 블롯법, 면역 조직 염색법 등이 예시된다. 또한, 정량 방법으로서는, ELISA법 또는 RIA법 등이 예시된다. 어레이(예를 들어 DNA 어레이, 프로틴 어레이)를 사용한 유전자 해석 방법에 의해서도 행해질 수 있다. DNA 어레이에 대하여는, (슈쥰사 편, 세포 공학 별책 "DNA 마이크로 어레이와 최신 PCR법")에 널리 개설되어 있다. 프로틴 어레이에 대하여는, Nat Genet. 2002 Dec; 32 Suppl: 526-32에 상세히 기술되어 있다. 유전자 발현의 분석법으로서는, 상술한 것에 더하여, RT-PCR, RACE법, SSCP법, 면역 침강법, two-hybrid 시스템, in vitro 번역 등을 들 수 있지만 그것들로 한정되지 않는다. 그러한 추가의 분석 방법은, 예를 들어 게놈 해석 실험법·나카무라 유우스케 라보 매뉴얼, 편집·나카무라 유우스케 요도샤(2002) 등에 기재되어 있고, 본 명세서에 있어서 그러한 기재는 모두 참고로서 인용된다.
본 개시의 검출제 또는 검출 수단은, 검출 가능하게 하는 부분(예를 들어 항체 등)에 다른 물질(예를 들어 표지 등)을 결합시킨 복합체 또는 복합 분자이어도 된다. 본 명세서에 있어서 사용되는 경우, "복합체" 또는 "복합 분자"란, 2 이상의 부분을 포함하는 임의의 구성체를 의미한다. 예를 들어 한 쪽 부분이 폴리펩티드일 경우에는, 다른 쪽 부분은, 폴리펩티드이어도 되고, 그 이외의 물질(예를 들어 기재, 당, 지질, 핵산, 다른 탄화 수소 등)이어도 된다. 본 명세서에 있어서 복합체를 구성하는 2 이상의 부분은, 공유 결합으로 결합되어 있어도 되고, 그 이외의 결합(예를 들어 수소 결합, 이온 결합, 소수성 상호 작용, 반데르발스 힘 등)으로 결합되어 있어도 된다. 2 이상의 부분이 폴리펩티드인 경우에는, 키메라 폴리펩티드라고도 칭할 수 있다. 따라서, 본 명세서에 있어서 "복합체"는, 폴리펩티드, 폴리뉴클레오티드, 지질, 당, 저분자 등의 분자가 복수종 연결하여 생긴 분자를 포함한다.
본 개시의 검출제 또는 기타 의약은, 프로브 및 프라이머의 형태를 취할 수 있다. 본 개시의 프로브 및 프라이머는, 표적의 핵산 분자와 특이적으로 혼성화할 수 있다. 본 개시의 프로브 및 프라이머는, 표적 핵산 분자의 발현을 검출할 수 있으면 되고, 복수의 데옥시리보 핵산(DNA) 또는 리보 핵산(RNA) 등의 염기 또는 염기쌍으로 이루어지는 중합체일 수 있다. 이중 가닥 cDNA도 조직 in situ 하이브리다이제이션에 있어서 이용 가능하다는 것으로 알려져 있어, 본 개시의 프로브 및 프라이머에는 그러한 이중 가닥 cDNA도 포함된다. 조직 중의 RNA의 검출에 있어서 특히 바람직한 프로브 및 프라이머로서는, RNA 프로브(리보 프로브)를 들 수 있다.
본 개시에 의한 프라이머 및 프라이머 세트는, PCR법, RT-PCR법, 실시간 PCR법, in situ PCR법, LAMP법 등의 핵산 증폭법을 이용하여 목적 유전자를 검출하는 공지된 방법에 있어서, 통상의 방법에 따라 프라이머 및 프라이머 세트로서 이용할 수 있다.
본 명세서에 있어서 "프로브"란, 시험관 내 및/또는 생체 내 등의 스크리닝 등의 생물학적 실험에서 사용되는, 검색의 수단이 되는 물질을 말하고, 예를 들어 특정의 염기 서열을 포함하는 핵산 분자 또는 특정한 아미노산 서열을 포함하는 펩티드, 특이적 항체 또는 그 프래그먼트 등을 들 수 있지만 그것으로 한정되지 않는다. 본 명세서에 있어서 프로브는, 마커 검출 수단으로서 이용할 수 있다.
통상 프로브로서 사용할 수 있는 핵산 분자로서는, 목적으로 하는 유전자의 핵산 서열과 상동인 또는 상보적인, 적어도 8의 연속되는 뉴클레오티드 길이의 핵산 서열을 가진 것을 들 수 있다. 그러한 핵산 서열은, 바람직하게는, 적어도 9의 연속되는 뉴클레오티드 길이의, 보다 바람직하게는 적어도 10의 연속되는 뉴클레오티드 길이의, 더욱 바람직하게는 적어도 11의 연속되는 뉴클레오티드 길이의, 적어도 12의 연속되는 뉴클레오티드 길이의, 적어도 13의 연속되는 뉴클레오티드 길이의, 적어도 14의 연속되는 뉴클레오티드 길이의, 적어도 15의 연속되는 뉴클레오티드 길이의, 적어도 20의 연속되는 뉴클레오티드 길이의, 적어도 25의 연속되는 뉴클레오티드 길이의, 적어도 30의 연속되는 뉴클레오티드 길이의, 적어도 40의 연속되는 뉴클레오티드 길이의, 적어도 50의 연속되는 뉴클레오티드 길이의, 적어도 핵산 서열일 수 있다. 프로브로서 사용되는 핵산 서열에는, 상술한 서열에 대하여 적어도 약 70% 상동인, 보다 바람직하게는, 적어도 약 80% 상동인, 더욱 바람직하게는, 적어도 약 90% 상동인, 적어도 약 95% 상동인 핵산 서열이 포함된다.
1개의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 검출제는, 표지된 것일 수 있다. 혹은, 본 개시의 검출제는, 태그를 결합시킨 것이어도 된다.
본 명세서에 있어서 "표지"란, 목적이 되는 분자 또는 물질을 다른 것으로부터 식별하기 위한 존재(예를 들어 물질, 에너지, 전자파 등)를 말한다. 그러한 표지 방법으로서는, RI(라디오아이소토프)법, 형광법, 바이오틴법, 화학 발광법 등을 들 수 있다. 본 개시의 마커 또는 그것을 포착하는 인자 또는 수단을 복수개, 형광법에 의해 표지하는 경우에는, 형광 발광 극대 파장이 서로 다른 형광 물질에 의해 표지를 행한다. 형광 발광 극대 파장의 차이는, 10nm 이상인 것이 바람직하다. 리간드를 표지하는 경우, 기능에 영향을 주지지 않는 것이라면 모두 사용할 수 있지만, 형광 물질로서는, AlexaTMFluor가 바람직하다. AlexaTMFluor는, 쿠마린, 로다민, 플루오레세인, 시아닌 등을 수식하여 얻어진 수용성의 형광 색소이며, 광범위한 형광 파장에 대응한 시리즈이며, 다른 해당 파장의 형광 색소에 비해, 매우 안정되고, 밝고, 또한 pH감수성이 낮다. 형광 극대 파장이 10nm 이상인 형광 색소의 조합으로서는, AlexaTM555와 AlexaTM633의 조합, AlexaTM488과 AlexaTM555의 조합 등을 들 수 있다. 핵산을 표지하는 경우에는, 그 염기 부분과 결합할 수 있는 것이라면 모두 사용할 수 있지만, 시아닌 색소(예를 들어 CyDyeTM 시리즈의 Cy3, Cy5 등), 로다민 6G 시약, N-아세톡시-N2-아세틸아미노플루오렌(AAF), AAIF(AAF의 요오드 유도체) 등을 사용하는 것이 바람직하다. 형광 발광 극대 파장의 차이가 10nm 이상인 형광 물질로서는, 예를 들어 Cy5와 로다민 6G 시약의 조합, Cy3과 플루오레세인의 조합, 로다민 6G 시약과 플루오레세인의 조합 등을 들 수 있다. 본 개시에서는, 이러한 표지를 이용하여, 사용되는 검출 수단으로 검출될 수 있도록 목적으로 하는 대상을 개변할 수 있다. 그러한 개변은, 당해 분야에 있어서 공지되어 있으며, 당업자는 표지에 및 목적으로 하는 대상에 따라 적절히 그러한 방법을 실시할 수 있다.
본 명세서에 있어서 사용되는 경우, "태그"란, 수용체-리간드와 같은 특이적 인식 기구에 의해 분자를 선별하기 위한 물질, 보다 구체적으로는, 특정한 물질을 결합하기 위한 결합 파트너의 역할을 하는 물질(예를 들어 바이오틴-아비딘, 바이오틴-스트렙타비딘과 같은 관계를 가짐)을 말하고, "표지"의 범주에 포함될 수 있다. 따라서, 예를 들어 태그가 결합된 특정 물질은, 태그 서열의 결합 파트너를 결합시킨 기재를 접촉시킴으로써, 이 특정 물질을 선별할 수 있다. 이러한 태그 또는 표지는, 당해 분야에서 주지되어 있다. 대표적인 태그 서열로서는, myc 태그, His 태그, HA, Avi 태그 등을 들 수 있지만, 이것들로 한정되지 않는다. 본 개시의 마커 또는 마커 검출제에는 이러한 태그를 결합시켜도 된다.
본 명세서에 있어서 "약제", "제제" 또는 "인자"(모두 영어에서는 agent에 상당함)는 광의로는, 교환 가능하게 사용되고, 의도하는 목적을 달성할 수 있는 한 어떤 물질 또는 다른 요소(예를 들어 광, 방사능, 열, 전기 등의 에너지)이어도 된다. 그러한 물질로서는, 예를 들어 세포(예를 들어 T세포), 단백질, 폴리펩티드, 올리고펩티드, 펩티드, 폴리뉴클레오티드, 올리고뉴클레오티드, 뉴클레오티드, 핵산(예를 들어 cDNA, 게놈 DNA와 같은 DNA, mRNA와 같은 RNA를 포함함), 폴리사카리드, 올리고사카리드, 지질, 유기 저분자(예를 들어 호르몬, 리간드, 정보 전달 물질, 유기 저분자, 콤비너토리얼 케미스트리에서 합성된 분자, 의약품으로서 이용될 수 있는 저분자(예를 들어 저분자 리간드 등) 등), 이것들의 복합 분자를 들 수 있지만 그것들로 한정되지 않는다.
본 명세서에 있어서 "키트"란, 통상 2개 이상의 구획으로 나누고, 제공되어야 할 부분(예를 들어 검사약, 진단약, 치료약, 항체, 표지, 설명서 등)이 제공되는 유닛을 말한다. 안정성 등을 위하여, 혼합되어 제공되어야 하는 것이 아니고, 사용 직전에 혼합하여 사용하는 것이 바람직한 것과 같은 조성물의 제공을 목적으로 할 때에, 이 키트의 형태는 바람직하다. 그러한 키트는, 바람직하게는, 제공되는 부분(예를 들어 검사약, 진단약, 치료약을 어떻게 사용하는지, 혹은, 시약을 어떻게 처리해야 하는지를 기재하는 지시서 또는 설명서를 구비하고 있는 것이 유리하다. 본 명세서에 있어서 키트가 시약 키트로서 사용되는 경우, 키트에는, 통상 검사약, 진단약, 치료약, 항체 등의 사용법 등을 기재한 지시서 등이 포함된다.
본 명세서에 있어서 "지시서"는, 본 개시를 사용하는 방법을 의사 또는 다른 사용자에 대한 설명을 기재한 것이다. 이 지시서는, 본 개시의 검출 방법, 진단약의 사용법, 또는 의약 등을 투여하는 것을 지시하는 문언이 기재되어 있다. 또한, 지시서에는, 투여 부위로서, 경구, 식도로의 투여(예를 들어 주사 등에 의한)하는 것을 지시하는 문언이 기재되어 있어도 된다. 이 지시서는, 본 개시가 실시되는 국가의 감독 관청(예를 들어 일본이면 후생 노동성, 미국이면 식품 의약품국(FDA) 등)이 규정한 양식에 따라 작성되고, 그 감독 관청에 의해 승인을 받았다는 것이 명기된다. 지시서는, 이른바 첨부 문서(package insert)이며, 통상적으로는 종이 매체로 제공되는데, 그것으로 한정되지 않고, 예를 들어 전자 매체(예를 들어 인터넷으로 제공되는 홈페이지, 전자 메일)와 같은 형태로도 제공될 수 있다.
본 명세서에서 사용될 때, 시료 중의 분석물 등의 "양"은, 일반적으로는, 시료의 체적 중에서 검출할 수 있는 분석물의 질량을 반영하는 절댓값을 가리킨다. 그러나, 양은, 다른 분석 물량과 비교한 상대량도 기도한다. 예를 들어 시료 중의 분석물의 양은, 시료 중에 통상 존재하는 분석물의 대조의 값 또는 정상인 값보다 큰 양이어도 된다.
본 명세서에서 사용될 때, 시료 중의 분석물 등의 "레벨"은, 일반적으로는, 분석물이 효소 등의 기능을 발휘하는 대상일 경우에, 그 분석물의 활성 등의 값을 반영하는 절댓값을 가리킨다. 그러나, 레벨은, 다른 분석물 레벨과 비교한 상대 레벨도 기도한다. 예를 들어 시료 중의 분석물의 레벨은, 시료 중에 통상 존재하는 분석물의 대조의 값 또는 정상인 값보다 큰 레벨이어도 된다.
용어 "약"은, 본 명세서에서 사용될 때, 나타내어진 값 플러스 또는 마이너스 10%를 가리킨다. 또한, "약"이라고 명시적으로 나타내어지지 않는 경우에도 "약"이 있는 것과 동일 의미로 해석될 수 있다.
(본 개시의 개요)
본 발명자들은, CD106 등의 이상 발현에 의해 특징지어지는 이상 줄기 세포를 표적으로 하는 당뇨병 치료의 효과가, 줄기 세포의 유주와 조합함으로써 개선될 수 있다고 하는 새로운 국면을 발견하였다. 본 개시는, 이 새로운 당뇨병 치료 전략에 기초하여 당뇨병 및/또는 그 관련 질환에 대하여 새로운 치료 전략 및 진단을 제공하는 것이다.
(바람직한 실시 형태)
이하에 본 개시의 바람직한 실시 형태를 설명한다. 이하에 제공되는 실시 형태는, 본 개시의 보다 좋은 이해를 위하여 제공되는 것이며, 본 개시의 범위는 이하의 기재로 한정되어야 하는 것은 아니라고 이해된다. 따라서, 당업자는, 본 명세서 중의 기재를 참작하여, 본 개시의 범위 내에서 적절히 개변을 행할 수 있다는 것은 명확하다. 또한, 본 개시의 이하의 실시 형태는 단독으로도 사용되거나 혹은 그것들을 조합하여 사용할 수 있다는 것이 이해된다.
(당뇨병 및/또는 그 관련 질환에 관한 이상 줄기 세포의 특징)
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시가 대상으로 하는 이상 줄기 세포는, 조혈 줄기 세포일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 이상 줄기 세포는, CD106, 히스톤 탈아세틸화 효소(HDACs), CD34, TNF-α, 및 프로인슐린 중의 적어도 하나를 통상의 레벨에서 발현하지 않거나 및/또는 기능하고 있지 않은 것을 특징으로 하고, 필요에 따라, 본 명세서에 기재된 이상 줄기 세포의 다른 특징(예를 들어 c-Kit 양성, Sca-1 양성, 조혈 줄기 세포의 계통 마커 음성, 상기 단기 조혈 줄기 세포의 특징(CD38 음성 등))을 갖는 것을 추가 특징으로 할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 이상 줄기 세포는, CD106을 통상의 레벨에서 발현하고 있지 않는 것을 특징으로 할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 이상 줄기 세포는, (a) CD106을 통상의 레벨에서 발현하고 있지 않고, (b) CD34 이상 발현, TNF-α 이상 발현, 히스톤 탈아세틸화 효소(HDACs) 이상 발현, 및 프로인슐린 이상 발현 중의 적어도 하나를 통상의 레벨에서 발현하고 있지 않음을 특징으로 하고, 필요에 따라, 본 명세서에 기재된 이상 줄기 세포의 다른 특징(예를 들어 c-Kit 양성, Sca-1 양성, 조혈 줄기 세포의 계통 마커 음성, 상기 단기 조혈 줄기 세포의 특징(CD38 음성 등))을 갖는 것을 추가 특징으로 할 수 있다.
하나의 대표적인 실시 형태에 있어서, 본 개시가 대상으로 하는 이상 줄기 세포(예를 들어 조혈 줄기 세포)는 CD106의 이상 발현에 의해 특징지어질 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 이상 줄기 세포는, 비당뇨병 피험체 집단의 전골수 세포 또는 조혈 줄기 세포(예를 들어 CD34 양성 Thy-1 양성 세포)에 있어서의 CD106 발현량보다 높은 CD106 발현량에 의해 특징지어질 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 이상 줄기 세포는, 세포 1개당 1×102 이상, 2×102 이상, 5×102 이상, 1×103 이상, 2×103 이상, 5×103 이상, 1×104 이상, 2×104 이상, 5×104 이상, 1×105 이상, 2×105 이상, 5×105 이상, 1×106 이상, 2×106 이상, 5×106 이상, 또는 1×107 이상의 CD106 분자를 세포 표면에 발현하는 것을 특징으로 할 수 있다. 구체적인 실시 형태에 있어서, 본 개시의 이상 줄기 세포는, 세포 1개당 약 1×104 이상의 CD106 분자를 세포 표면에 발현하는 것을 특징으로 할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 이상 줄기 세포는, 정상인 피험체 (예를 들어 인간)의 전골수 세포 또는 조혈 줄기 세포(예를 들어 CD34 양성 Thy-1 양성 세포)를 CD106에 대한 형광 색소 콘주게이트화 항체로 표지하여 FACS로 분석했을 경우에, 전골수 세포 또는 조혈 줄기 세포에 대하여 관찰되는 이 형광 색소 유래의 형광 강도의 중앙값의 1배 이상, 2배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 200배 이상, 500배 이상, 또는 1000배 이상의 형광 강도를 보이는 발현량에 의해 나타내질 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 이상 줄기 세포는, 비당뇨병 피험체 집단 유래의 조혈 줄기 세포(예를 들어 CD34 양성 세포)보다도 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 150% 이상 또는 200% 이상 높은 CD106의 mRNA 발현량에 의해 특징지어질 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시가 대상으로 하는 이상 줄기 세포는, 히스톤 탈아세틸화 효소 유전자군(HDACs)의 발현에 의해 특징지어질 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 이상 줄기 세포는, 비당뇨병 피험체 집단 유래의 조혈 줄기 세포(예를 들어 c-Kit 양성 계통 마커 음성 세포)보다도 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 150% 이상, 200% 이상, 300% 이상, 400% 이상 또는 500% 이상 높은 히스톤 탈아세틸화 효소 유전자군(HDACs)(예를 들어 Hdac3, Hdac4, Hdac8, Hdac9)의 1개 또는 복수의 발현량에 의해 특징지어질 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시가 대상으로 하는 이상 줄기 세포는, TNF-α의 발현에 의해 특징지어질 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 이상 줄기 세포는, TNF-α의 발현에 대하여 양성인 것에 의해 특징지어질 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, TNF-α의 발현에 대하여 양성인 것은, 정상인 피험체 (예를 들어 인간)의 전골수 세포 또는 조혈 줄기 세포(예를 들어 CD34 양성 Thy-1 양성 세포)를 TNF-α에 대한 형광 색소 콘주게이트화 항체로 표지하여 FACS로 분석했을 경우에, 전골수 세포 또는 조혈 줄기 세포에 대하여 관찰되는 이 형광 색소 유래의 형광 강도의 중앙값의 1배 이상, 2배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 200배 이상, 500배 이상, 또는 1000배 이상의 형광 강도를 보이는 발현량에 의해 나타내질 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 이상 줄기 세포는, 비당뇨병 피험체 집단 유래의 조혈 줄기 세포(예를 들어 CD34 양성 세포)보다도 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 150% 이상 또는 200% 이상 높은 TNF-α의 mRNA 발현량에 의해 특징지어질 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시가 대상으로 하는 이상 줄기 세포는, 프로인슐린의 이상한 발현에 의해 특징지어질 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 이상 줄기 세포는, 프로인슐린의 발현에 대하여 양성인 것에 의해 특징지어질 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 프로인슐린의 발현에 대하여 양성인 것은, 비당뇨병 피험체(예를 들어 인간)의 전골수 세포 또는 조혈 줄기 세포(예를 들어 CD34 양성 Thy-1 양성 세포)를 프로인슐린에 대한 형광 색소 콘주게이트화 항체로 표지하여 FACS로 분석했을 경우에, 전골수 세포 또는 조혈 줄기 세포에 대하여 관찰되는 이 형광 색소 유래의 형광 강도의 중앙값의 1배 이상, 2배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 200배 이상, 500배 이상, 또는 1000배 이상의 형광 강도를 보이는 발현량에 의해 나타내질 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 이상 줄기 세포는, 비당뇨병 피험체 집단 유래의 조혈 줄기 세포(예를 들어 CD34 양성 세포)보다도 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 150% 이상, 200% 이상, 300% 이상, 400% 이상, 500% 이상, 700% 이상 또는 1000% 이상 높은 인슐린 (또는 프로인슐린)의 mRNA 발현량에 의해 특징지어질 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시가 대상으로 하는 이상 줄기 세포는, c-Kit의 발현에 의해 특징지어질 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 이상 줄기 세포는, c-Kit의 발현에 대하여 양성인 것에 의해 특징지어질 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, c-Kit의 발현에 대하여 양성인 것은, 비당뇨병 피험체(예를 들어 인간)의 전골수 세포 또는 조혈 줄기 세포(예를 들어 CD34 양성 Thy-1 양성 세포)를 c-Kit에 대한 형광 색소 콘주게이트화 항체로 표지하여 FACS로 분석했을 경우에, 전골수 세포 또는 조혈 줄기 세포에 대하여 관찰되는 이 형광 색소 유래의 형광 강도의 중앙값의 0.1배 이상, 0.2배 이상, 0.5배 이상, 1배 이상, 2배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 200배 이상, 500배 이상, 또는 1000배 이상의 형광 강도를 보이며, 및/또는 이 형광 색소 유래의 형광 강도가 큰 순으로 세포를 늘어 놓았을 경우에 상위 70% 이내, 60% 이내, 50% 이내, 40% 이내, 30% 이내, 20% 이내 또는 10% 이내에 속하는 형광 강도를 보이는 발현량에 의해 나타내질 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시가 대상으로 하는 이상 줄기 세포는, Sca-1의 발현에 의해 특징지어질 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 이상 줄기 세포는, Sca-1의 발현에 대하여 양성인 것에 의해 특징지어질 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, Sca-1의 발현에 대하여 양성인 것은, 비당뇨병 피험체(예를 들어 인간)의 전골수 세포를 Sca-1에 대한 형광 색소 콘주게이트화 항체로 표지하여 FACS로 분석했을 경우에, 전골수 세포에 대하여 관찰되는 이 형광 색소 유래의 형광 강도의 중앙값의 0.1배 이상, 0.2배 이상, 0.5배 이상, 1배 이상, 2배 이상, 5배 이상, 10배 이상, 20배 이상, 50배 이상, 100배 이상, 200배 이상, 500배 이상, 또는 1000배 이상의 형광 강도를 보이며, 및/또는 이 형광 색소 유래의 형광 강도가 큰 순으로 전골수 세포를 늘어 놓았을 경우에 상위 70% 이내, 60% 이내, 50% 이내, 40% 이내, 30% 이내, 20% 이내 또는 10% 이내에 속하는 형광 강도를 보이는 발현량에 의해 나타내질 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시가 대상으로 하는 이상 줄기 세포는, 조혈 줄기 세포의 계통 마커의 발현에 의해 특징지어질 수 있다. 조혈 줄기 세포의 계통 마커로서는, CD3(T세포), CD19(B세포), NK1.1(NK세포), CD11c (수지상 세포), CD11b(단핵구), FcεRI(마스트 세포), Gr-1(과립구) 등을 들 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 이상 줄기 세포는, CD3, CD19, NK1.1, CD11c, CD11b, FcεRI, 및 Gr-1 중의 1개 또는 복수개(예를 들어 전부)의 발현에 대하여 음성인 것에 의해 특징지어질 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, CD3, CD19, NK1.1, CD11c, CD11b, FcεRI, 및 Gr-1의 각각의 발현에 대하여 음성인 것은, 비당뇨병 피험체(예를 들어 인간)의 전골수 세포를 CD3, CD19, NK1.1, CD11c, CD11b, FcεRI 또는 Gr-1에 대한 형광 색소 콘주게이트화 항체로 표지하여 FACS로 분석했을 경우에, 전골수 세포에 대하여 관찰되는 이 형광 색소 유래의 형광 강도의 중앙값의 1000% 이하, 500% 이하, 200% 이하, 100% 이하, 50% 이하, 20% 이하, 10% 이하, 5% 이하, 2% 이하, 또는 1% 이하의 형광 강도를 보이며, 및/또는 이 형광 색소 유래의 형광 강도가 큰 순으로 전골수 세포를 늘어 놓았을 경우에 하위 50% 이내, 20% 이내, 10% 이내, 5% 이내, 2% 이내, 또는 1% 이내에 속하는 형광 강도를 보이는 발현량에 의해 나타내질 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 이상 줄기 세포는, 비당뇨병 피험체 집단 유래의 조혈 줄기 세포보다도 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 150% 이상 또는 200% 이상 높은 CD34의 mRNA 발현량에 의해 특징지어질 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시가 대상으로 하는 이상 줄기 세포는, 조혈 줄기 세포인 것에 의해 특징지어질 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 인간 조혈 줄기 세포인 것은, CD34 양성 Thy-1 양성이거나, 또는 Lineage 음성 CD34 양성 CD38 음성 CD90 양성 CD45RA 음성인 것에 의해서도 특징지어질 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 마우스 조혈 줄기 세포는, c-kit 양성 Sca-1 양성 계통 마커 음성(KSL)인 것에 의해 특징지어질 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 조혈 줄기 세포인 것은, Hoechest 33342 색소로 염색한 골수 세포를, 자외광(350nm)으로 여기하여, Hoechst blue 및 Hoechst red의 2종류의 광학 필터로 전개했을 경우에 양쪽 모두 음성인 것에 의해서도 특징지어질 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시가 대상으로 하는 이상 줄기 세포는, 조혈 줄기 세포의 세포 단계에 의해 특징지어질 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 이상 줄기 세포는, 단기 조혈 줄기 세포일 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 프로인슐린 및/또는 TNF-α는, 본 개시가 대상으로 하는 이상 줄기 세포가 골수에 국재하는 것을 나타내는 마커가 될 수 있다.
(치료 및/또는 예방의 기구)
발명자들이 당뇨병 발증에 관련된다고 동정한 골수 세포의 종류와, 그 대표적인 특징 및 당뇨병과의 관여를 모식적으로 도 36에 나타낸다. 일반적으로, TNF-α를 산생하는 세포는 혈액 유래의 세포이며, 장기의 주세포가 직접 산생하는 것은 생각하기 어렵다. TNF-α를 생산하는 이상 세포의 기원을 조사해 가면, 조혈 줄기 세포(HSC)가 TNF-α를 발현하고 있고, TNF-α는, 가장 미분화된 long term(LT)-HSC에서는 발현되지 않고, short term(ST)-HSC에서 발현되어 있고, ST-HSC의 CD106 양성 분획에 있어서 발현이 국한되어 있었다. 이 CD106 및 TNF-α를 발현하는 ST-HSC는, HDAC(HDAC3, 4, 8, 9 등)의 발현도 향상되어 있었다. CD106 및 TNF-α는 중요한 기능을 가진 정상 세포에서도 발현될 수 있기 때문에, HDAC의 저해가 유리할 수 있다. 이상 세포는, 통상 약물의 송달이 곤란한 골수 내의 특정한 니치에도 존재할 수 있기 때문에, 이상 세포를 골수로부터 유주시키는 것이 이상 세포의 근절에 유효할 수 있다.
어떤 이론에 속박되기를 바라는 것도 아니지만, 이상 세포가 2형 당뇨병을 발증시키는 메커니즘을 도 37에 모식적으로 나타낸다. STZ 마우스에서 보여진 CD106/TNF-α 양성의 이상한 조혈 줄기 세포는, 종류가 다른 2형 당뇨병 모델인 고지방식 마우스에서도 보여졌다. STZ 마우스이든 고지방식 마우스이든, 인슐린 감수성의 저하에 의해 인슐린 분비 장애가 생기고(1), 이것에 의해 고혈당이 생기고, 골수 내에서의 CD106/TNF-α 양성의 이상 줄기 세포의 생산을 촉진한다. 이상 줄기 세포에서는 히스톤 탈아세틸화 효소군의 발현 이상이 발생하고, 이것에 따라, 다양한 유전자 발현 이상이 발생한다고 생각된다. 그 하나로서, 프로인슐린(호르몬으로서의 작용을 갖지 않는 인슐린의 전구체)과 TNF-α를 동시에 발현하는 이상한 줄기 세포가 출현한다(2). 이 세포는, 흉선에도 유주하며, 거기에서 프로인슐린과 TNF-α를 동시에 항원 제시하는 이상한 자기 항원 제시 세포가 된다(3). 이에 따라, 흉선에 있어서의 TNF-α의 발현이 흉선의 위축을 초래하고, CD106/TNF-α/프로인슐린을 동시 발현하는 이상한 세포를 살상해야 하는 T세포는 네가티브 셀렉션에서 소거되고(4), 면역 관용을 받은 CD106/TNF-α/프로인슐린 양성의 이상 조혈 줄기 세포는 골수 내에서 증가하여, 전신으로 유주한다. 골수 내에서 일단 줄기 세포로서 정착한 이 이상은 반영구적으로 사라지지 않는다. 결과적으로, 이 이상 줄기 세포가, 골수로부터 췌도로 유주하고, 세포 융합을 통하여 CD106/TNF-α/프로인슐린 양성의 혈관 내피 세포를 췌도의 모세 혈관 내에 발생시키고(5), 거기에서 TNF-α이 발현됨으로써, β세포의 전구 세포가 상해되어, 더한층의 인슐린 분비 세포의 감소를 초래한다(6). 또한, 이상 줄기 세포가 다양한 장기로 유주하는 결과, 여러가지 장기 내에서 내피 세포의 기능 이상 및 TNF-α생산을 일으켜(7), 합병증의 발증과 진행으로 연결된다(8). 그리고, 골수 내의 이상 줄기 세포는, 2형 당뇨병의 기억을 유지하는 메모리로서 니치에 눌러앉아, 난치성의 병태를 만들어 낸다고 생각된다(2). 이러한 일련의 이상은, (A) 골수 내의 이상 줄기 세포를 제거하는 것과, (B) 새로운 이상 줄기 세포의 출현을 방지하기 위하여, 혈당값을 정상화할 수 있을 때까지 인슐린 분비 기능이 회복되기까지의 일정 기간, 외부로부터 인슐린을 투여하여 혈당값을 정상화함으로써 억제할 수 있어, 2형 당뇨병을 치유하는 것이 가능하다고 생각된다.
마찬가지로, 이상 세포가 1형 당뇨병을 발증시키는 메커니즘을 도 38에 모식적으로 나타낸다. 1형 당뇨병 마우스 모델(NOD 마우스)에서는 2형에서도 출현한 CD106/TNF-α 양성의 세포가 출현하고 있다. 또한, B세포 계열의 전구 세포로부터는 β세포를 상해하는 자기 항체를 산생하는 세포가 출현한다(1). 이 세포로부터 방출되는 자기 항체에 의해, β세포는 점차 감소한다(2). 또한 이 이상 B세포의 일부가 흉선으로 유주하고, 거기에서도 자기 항체를 산생하여, 프로인슐린이나 GAD등 췌도 자기 항원 제시 세포를 공격하여 소실시킨다(3). 이에 따라, 흉선은 췌도 공격형 T세포의 네가티브 셀렉션의 능력을 잃고, 이 T세포의 말초로의 유주를 허용하게 된다(4). 췌도 내로 유주한 자기 공격형 T세포는 β세포를 상해하고, 일거에 인슐린 분비를 고갈시켜 1형 당뇨병이 발증한다(5). 동시에, 이 T세포에 의해 골수 내에 존재하는 인슐린 mRNA를 발현하는 자기 항원 제시 세포의 전구 세포도 공격을 받아 완전히 소실되고(6), 프로인슐린이나 GAD를 제시하는 세포는 흉선으로 공급되지 않게 된다(7). 지속성 고혈당은 골수 내에서 ST-HSP 분획에 CD106/TNF-α 양성 세포를 폭발적으로 증가시키고(8), 흉선(9)이나 췌도(10)에 있어서는, 이 세포 유래의 이상한 혈관 내피의 증생과 β세포 전구 세포의 괴멸적인 조직 파괴(11)을 유도한다. 또한, 그 밖의 말초 장기 내에서도 2형과 마찬가지로 내피의 기능 부전(12)을 초래하고, 세포 융합(13) 등에 의해 당뇨병에 특이적인 여러가지 합병증이 진행된다고 생각된다. 이 1형 당뇨병과 2형 당뇨병의 결정적인 차이는 흉선 내와 췌도 내로부터 인슐린 혹은 프로인슐린의 단백질을 발현하는 세포가 철저하게 파괴되는 것이다. 이러한 일련의 이상은, (A) 골수 내의 이상 줄기 세포를 제거하는 것과, (B) 새로운 이상 줄기 세포의 출현을 방지하기 위하여, 혈당값을 정상화할 수 있을 때까지 인슐린 분비 기능이 회복되기까지의 일정 기간, 외부로부터 인슐린을 투여하여 혈당값을 정상화함으로써 억제할 수 있어, 1형 당뇨병을 치유하는 것이 가능하다고 생각된다. 여기에서, (A)의 이상 줄기 세포의 제거는, (C)출현하고 있는 유전자적으로 자기 항체를 발현하는 세포의 원인인 이상 조혈 줄기 세포의 제거도 초래하기 때문에, 2형 당뇨병과 동일한 치료로 1형 당뇨병의 관해를 유도할 수 있다고 생각된다.
(줄기 세포의 유주와 조합한 이상 줄기 세포를 표적으로 한 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방)
하나의 국면에 있어서, 본 개시는, 본 명세서에 기재된 특징을 가진 이상 줄기 세포를 유주시켜, 억제하는 것에 의한 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방을 제공한다. 이 치료 및/또는 예방은, 방법의 실시, 이 목적을 위한 조성물, 조합물, 키트, 또는 시스템의 제공 등, 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. 예를 들어 항체 등의 억제제를 사용하는 경우, 골수 중에 존재하는 세포에 대한 억제 효과는 한정적일 수 있다(예를 들어 실시예를 참조). 그 때문에, 본 개시와 같이, 이상 줄기 세포를 억제하기 전에, 이상 줄기 세포를 유주시킴으로써, 이상 줄기 세포의 억제 효과를 향상시킬 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 치료 및/또는 예방은, 본 명세서에 기재된 이상 줄기 세포의 적어도 하나의 특징을 가진 전세포를 유주시켜, 억제함으로써 실시될 수 있다. 즉, 이 실시 형태에 있어서, 유주하여 억제되는 세포는, 본 명세서에 기재된 이상 줄기 세포로 한정되지 않는다. 본 명세서에 기재된 이상 줄기 세포만을 유주·억제하는 것은 기술적으로 곤란할 수 있고, 이상 줄기 세포의 유주·억제에 의해 얻어지는 이익과, 그 밖의 세포의 유주·억제에 의한 영향을 고려하여 치료 및/또는 예방이 선택될 수 있다. 다른 한편으로, 본 명세서에 기재된 이상 줄기 세포 중의 일부 세포의 유주·억제에서는, 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방이 불충분해질 수 있기 때문에, 본 명세서에 기재된 이상 줄기 세포는 모두 유주·억제하는 것이 바람직할 수 있다. 본 개시의 치료 및/또는 예방에 있어서, 유주를 위하여 이용하는 이상 줄기 세포의 특징과, 억제를 위하여 이용하는 이상 줄기 세포의 특징은, 동일해도 되고, 상이해도 된다. 예를 들어 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 치료 및/또는 예방은, 이상 줄기 세포가 조혈 줄기 세포라고 하는 특징을 유주를 위하여 이용하고(예를 들어 CXCR4 길항약 및/또는 CXCR2 자극약을 사용하여), 이상 줄기 세포가 특정한 단백질(HDAC 등)을 비정상적으로 발현시킨다는 특징을 억제하기 위하여 이용해도 된다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 치료 및/또는 예방에 있어서의 유주는, 본 명세서에 기재된 임의의 특징을 가진 이상 줄기 세포를 유주시킴으로써 실시할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 이상 줄기 세포의 유주는, 조혈 줄기 세포를 유주시키는 처치에 의해 실시할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 조혈 줄기 세포를 유주시키는 처치에는, CXCR4의 저해(Future Oncol. 2007 Feb;3(1):19-27), 상피 성장 인자 수용체(EGFR)의 저해(Nature Medicine volume 16, pages 1141-1146(2010)), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 자극의 야기(Blood. 1995 Dec 15;86(12):4437-45), 및 CXCR2 자극의 야기(Cell. 2018 Jan 11; 172(1-2):191-204.e10) 등을 들 수 있지만, 이것들로 한정되지 않는다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 치료 및/또는 예방에 있어서의 유주는, 본 명세서에 기재된 임의의 특징을 가진 이상 줄기 세포의 유주제를 사용하여 실시될 수 있다. 당업자는, 본 개시의 치료 및/또는 예방에 있어서의 유주에서 사용할 수 있는 유주제를 적절히 선택할 수 있으며, 예를 들어 유주제의 투여 전후에, 실제로 골수 내 및/또는 혈액 중에 있어서의 줄기 세포(예를 들어 본 명세서에 기재된 특징을 가진 이상 줄기 세포)의 비율을 측정하여, 유주 효과를 조사함으로써, 본 개시의 치료 및/또는 예방에 이용 가능한 유주제를 선택할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 치료 및/또는 예방에 있어서의 유주는, 조혈 줄기 세포의 유주제를 사용하여 실시될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 조혈 줄기 세포의 유주제는, CXCR4의 저해(예를 들어 플레릭사포(AMD3100)), 상피 성장 인자 수용체(EGFR)의 저해(예를 들어 게피티닙, 에를로티닙, 아파티닙, 오시머티닙 등), 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF) 자극의 야기(예를 들어 필그라스팀, 나르토그라스팀, 레노그라스팀, 페그필그라스팀 등), 및 CXCR2 자극의 야기(예를 들어 GROβ(MIP2)) 등의 기능을 가진 것일 수 있지만, 이것들로 한정되지 않는다. 하나의 실시 형태에 있어서, 조혈 줄기 세포의 유주제는, 임의의 조합으로 사용할 수 있으며, 예를 들어 CXCR4의 저해제(예를 들어 플레릭사포(AMD3100)) 및 CXCR2 자극 야기제(예를 들어 GROβ(MIP2))의 조합일 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 이상 줄기 세포의 억제는, 본 명세서에 기재된 이상 줄기 세포의 임의의 특징을 표적으로 하고, 표적이 된 세포를 유주시켜, 억제함으로써 실시할 수 있다. 예를 들어 본 명세서에 기재된 이상 줄기 세포가 세포 표면에 발현되는 분자(CD106, CD34, TNF-α, 프로인슐린, c-Kit, Sca-1 등)를 표적으로 하는 경우, 세포 표면 발현 분자에 특이적으로 결합하는 분자(항체, T세포 수용체, 저분자 화합물 등)를 사용할 수 있다. 또한, 복수 종류의 분자를 동시 발현하는 세포를 표적으로 하는 경우, 예를 들어 다특이적 항체 등 복수 종류의 분자에 결합하는 분자를 사용하여 목적으로 하는 세포를 표적화 할 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 치료 및/또는 예방에 있어서의 억제는, CD106 이상 발현, 히스톤 탈아세틸화 효소(HDACs) 이상 발현, CD34 이상 발현, TNF-α 이상 발현, 및 프로인슐린 이상 발현 중의 적어도 하나를 특징으로 하는 이상 줄기 세포를 유주시켜, 억제함으로써 실시될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 치료 및/또는 예방에 있어서의 억제는, CD106 이상 발현을 특징으로 하는 이상 줄기 세포를 유주시켜, 억제함으로써 실시될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 치료 및/또는 예방에 있어서의 억제는, (a) CD106 이상 발현과, (b) 히스톤 탈아세틸화 효소(HDACs) 이상 발현, CD34 이상 발현, TNF-α 이상 발현, 및 프로인슐린 이상 발현 중의 적어도 하나를 특징으로 하는 이상 줄기 세포를 유주시켜, 억제함으로써 실시될 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 치료 및/또는 예방에 있어서의 억제는, 히스톤 탈아세틸화 효소(HDACs), CD106, CD34, TNF-α, 및 프로인슐린의 적어도 하나를 표적으로 하는 1개 또는 복수의 억제제를 사용하여 실시될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 치료 및/또는 예방에 있어서의 억제는, 히스톤 탈아세틸화 효소(HDACs)를 표적으로 하는 억제제를 사용하여 실시될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 치료 및/또는 예방에 있어서의 억제는, (a) 히스톤 탈아세틸화 효소(HDACs)와, (b) CD106, CD34, TNF-α, 및 프로인슐린 중의 적어도 하나를 표적으로 하는 1개 또는 복수의 억제제를 사용하여 실시될 수 있다. 억제제는 본 명세서에 기재된 임의의 억제제를 사용할 수 있으며, 예를 들어 상기 분자와 결합하는 항체이다. 하나의 실시 형태에 있어서, 히스톤 탈아세틸화 효소(HDACs)를 표적으로 하는 억제제는, HDAC 저해제일 수 있으며, 예를 들어 TSA(트리코스타틴 A), VPA(발프로산), 부티르산 나트륨(NaBu), SAHA(수베로일아닐리드히드록삼산 또는 보리노스탓), 나트륨페닐부티레이트, 뎁시펩티드(FR901228, FK228), 트라폭신(TPX), 환식 히드록삼산 함유 펩티드 1(CHAP1), MS-275, LBH589, 기비노스탓, 핑골리모드(FTY720) 및 PXD101 등을 들 수 있지만, 이것들로 한정되지 않는다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 치료 및/또는 예방은, 당뇨병의 치료 및/또는 예방일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 치료 및/또는 예방은, 당뇨병의 합병증, 예를 들어 신경 장애, 신증, 간장 장애, 망막증, 지방간, 위장 장애, 골절 치유 지연, 섭식 장애 또는 피부 장애의 치료 및/또는 예방일 수 있다.
본 개시의 치료 및/또는 예방은, 임의의 공지된 치료 및/또는 예방 처치 또는 수단(예를 들어 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방 처치 또는 수단)과 조합되어도 된다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 명세서에 기재되는 이상 조혈 줄기 세포의 제거는, 고혈당을 억제하는 처치와 조합될 수 있다. 본 명세서에 기재되는 방법에 의해 이상 조혈 줄기 세포를 제거한 직후에는, 췌장의 β세포(또는 추가로 β세포의 상해를 막는 흉선)가 아직 회복되어 있지 않을 경우가 있기 때문에, 혈당 제어가 불충분해져, 고혈당이 생길 수 있다. 본 명세서에 기재되는 바와 같이, 고혈당은 다시 이상 조혈 줄기 세포의 출현을 촉진할 수 있으므로, 췌장의 β세포(또는 추가로 β세포의 상해를 막는 흉선)가 회복될 때까지 고혈당을 억제하는 것이 유리할 수 있다. 고혈당을 억제하는 처치로서, 인슐린 투여, 식사 컨트롤 등을 들 수 있지만, 이것들로 한정되지 않는다. 고혈당을 억제하는 처치는, 본 명세서에 기재되는 이상 조혈 줄기 세포의 제거와 평행하게 이루어져도 되고, 이상 조혈 줄기 세포의 제거 후에 이루어져도 되고, 혈당의 자기 제어가 가능할 정도로 췌장의 β세포(또는 추가로 β세포의 상해를 막는 흉선)가 회복될 때까지 지속해도 된다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시는, 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상의 치유를 제공한다. 본 명세서에 기재되는 치료 방법은, 당뇨병의 지연뿐만 아니라, 치유도 가능하게 할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상의 치유는, 당해 질환, 장애 및/또는 증상이 처치 종료 후 적어도 1개월, 3개월, 6개월, 1년, 2년, 또는 5년간 진단되지 않는 상태를 가져온다. 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상의 치유는, 당뇨병의 진단 기준을 제공하고 있는 당 부하 시험에 의한 혈당값의 반응, 그리고 보조적 진단 가치를 가진 인슐린 분비 능력, 글루카곤 부하 시험에 의한 C-펩티드 분비 반응에 있어서 정상화가 초래되는 것에 기초하여 판단되어도 된다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 명세서에 기재되는 이상 조혈 줄기 세포의 제거는, 위축된 흉선을 회복시킬 수 있다. 흉선의 형태학적 변화는 흉부의 MRI 검사에 의해 관찰할 수 있고, 림프구의 서브셋 및 CD5 항원 양성의 백혈구를 측정함으로써, 흉선의 기능을 추계하는 것이 가능하기 때문에, 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상, 혹은 그 리스크의 평가를 위하여, 이러한 흉선에 대한 시험을 행해도 된다. 예를 들어 본 개시의 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상의 치료 후에, 예후 관찰의 항목으로서 이러한 흉선에 관한 시험을 행해도 된다.
(이상 줄기 세포의 존재, 유주 및/또는 잔류에 기초하는 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상, 혹은 그 리스크의 진단)
하나의 국면에 있어서, 본 개시는, 본 명세서에 기재된 이상 줄기 세포의 존재, 유주 및/또는 잔류에 기초하는 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상, 혹은 그 리스크의 진단을 제공한다. 이 진단은, 방법의 실시, 이 목적을 위한 조성물, 조합물, 키트, 또는 시스템의 제공 등, 임의의 수단에 의해 달성될 수 있다. 이상 줄기 세포의 존재, 유주 및/또는 잔류가 나타내어진 피험체는, 본 개시의 치료법의 적합한 대상일 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 진단은, 본 명세서에 기재된 이상 줄기 세포의 적어도 하나의 특징을 가진 적어도 일부의 세포 특정한 부위에 있어서의 존재 및/또는 존재량을 검출함으로써 실시될 수 있다. 본 명세서에 있어서, 특별히 언급하지 않는 한, 세포의 "존재량"이란, 세포의 수(또는 세포의 수를 나타내는 임의의 지표)뿐만 아니라, 세포 집단 중의 특정 세포의 비율(또는 특정 세포의 비율을 나타내는 임의의 지표)도 의미한다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 진단은, 본 명세서에 기재된 이상 줄기 세포의 골수 및/또는 골수의 니치에 있어서의 존재 및/또는 존재량을 검출함으로써 실시될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 진단은, 본 명세서에 기재된 이상 줄기 세포의 순환혈에 있어서의 존재 및/또는 존재량을 검출함으로써 실시될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 진단은, 본 명세서에 기재된 유주제를 투여한 피험체에 있어서의 이상 줄기 세포의 특정 부위에 있어서의 존재 및/또는 존재량을 검출함으로써 실시할 수 있으며, 예를 들어 유주제의 투여 전후에 있어서의 이상 줄기 세포의 특정 부위(예를 들어 골수)에 있어서의 존재 및/또는 존재량의 변화에 기초하여 실시될 수 있다. 이 실시 형태에 있어서, 예를 들어 유주제의 투여 후에 피험체의 골수에 있어서 이상 줄기 세포의 존재량이 저하되었을 경우, 피험체가, 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상, 혹은 그 리스크를 가진다고 진단해도 되고, 하나의 실시 형태에 있어서, 이 피험체는, 이 유주제를 사용한 본 개시의 치료 및/또는 예방 처치에 제공될 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 진단은, 본 명세서에 기재된 이상 줄기 세포의 적어도 하나의 특징의 정량적 지표(예를 들어 세포 표면 단백질 발현량, mRNA 발현량)에 기초하여 실시될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 피험체 유래의 시료(예를 들어 혈액 시료, 골수 시료) 또는 거기에 포함되는 조혈 줄기 세포(예를 들어 CD34 양성 세포)가 비당뇨병 피험체 집단의 대응되는 시료 또는 거기에 포함되는 조혈 줄기 세포(예를 들어 CD34 양성 세포)보다도 10% 이상, 20% 이상, 30% 이상, 40% 이상, 50% 이상, 60% 이상, 70% 이상, 80% 이상, 90% 이상, 100% 이상, 150% 이상 또는 200% 이상 높은 이상 줄기 세포 마커(CD106, HDAC, TNF-α 등)의 mRNA 발현량을 나타내는 경우에, 피험체는, 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상, 혹은 그 리스크를 가지거나, 혹은 본 개시의 이상 세포 유주 처치에 적합하다고 판단될 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 진단은, 본 명세서에 기재된 이상 줄기 세포의 적어도 하나의 특징(정량적 지표를 포함함)을 나타내는 세포의 비율에 기초하여 실시될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 진단은, 피험체의 조혈 줄기 세포 중의 정상이 아닌 레벨의 이상 줄기 세포 마커(CD106, HDAC, TNF-α 등) 발현을 나타내는 세포의 비율에 기초하여 실시할 수 있으며, 필요에 따라 비당뇨병 피험체 집단 또는 당뇨병 피험체 집단의 조혈 줄기 세포 중의 정상이 아닌 레벨의 CD106 발현을 나타내는 세포의 비율과 비교함으로써 실시될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 특정 부위(예를 들어 골수)에 있어서, 피험체의 조혈 줄기 세포 중의 정상이 아닌 레벨의 이상 줄기 세포 마커(CD106, HDAC, TNF-α 등) 발현을 나타내는 세포의 비율이, 비당뇨병 피험체 집단의 조혈 줄기 세포 중의 정상이 아닌 레벨의 이상 줄기 세포 마커(CD106, HDAC, TNF-α 등) 발현을 나타내는 세포 비율의 1.1배 이상, 1.2배 이상, 1.3배 이상, 1.4배 이상, 1.5배 이상, 1.6배 이상, 1.7배 이상, 1.8배 이상, 1.9배 이상, 2배 이상, 2.1배 이상, 2.2배 이상, 2.3배 이상, 2.4배 이상, 2.5배 이상, 2.6배 이상, 2.7배 이상, 2.8배 이상, 2.9배 이상, 3배 이상, 3.5배 이상, 4배 이상, 4.5배 이상, 또는 5배 이상인 경우에, 피험체는, 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상, 혹은 그 리스크를 가지거나, 혹은 본 개시의 이상 세포 유주 처치에 적합하다고 판단될 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 진단은, 본 명세서에 기재된 이상 줄기 세포의 임의의 특징을 검출함으로써 실시할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 진단은, CD106 이상 발현, CD34 이상 발현, TNF-α 이상 발현, 프로인슐린 이상 발현, 및 히스톤 탈아세틸화 효소(HDACs) 이상 발현 중의 적어도 하나의 특징을 가지며, 필요에 따라, 본 명세서에 기재된 이상 줄기 세포의 다른 특징(예를 들어 c-Kit 양성, Sca-1 양성, 조혈 줄기 세포의 계통 마커 음성, 상기 단기 조혈 줄기 세포의 특징(CD38 음성 등))을 더 갖는 세포를 검출함으로써 실시될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 진단은, CD106 이상 발현을 특징으로 하는 세포를 검출함으로써 실시될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 진단은, (a) CD106 이상 발현과, (b) 히스톤 탈아세틸화 효소(HDACs) 이상 발현, CD34 이상 발현, TNF-α 이상 발현, 및 프로인슐린 이상 발현 중의 적어도 하나를 특징으로 하며, 필요에 따라, 본 명세서에 기재된 이상 줄기 세포의 다른 특징(예를 들어 c-Kit 양성, Sca-1 양성, 조혈 줄기 세포의 계통 마커 음성, 상기 단기 조혈 줄기 세포의 특징(CD38 음성 등))을 더 갖는 세포를 검출함으로써 실시될 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 진단은, CD106, 히스톤 탈아세틸화 효소(HDACs), CD34, TNF-α, 및 프로인슐린 중 적어도 하나를 표적으로 하는 1개 또는 복수의 검출제를 사용하여 실시될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 진단은, CD106을 표적으로 하는 검출제를 사용하여 실시될 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 진단은, (a) CD106과, (b) 히스톤 탈아세틸화 효소(HDACs), CD34, TNF-α, 및 프로인슐린 중의 적어도 하나를 표적으로 하는 1개 또는 복수의 검출제를 사용하여 실시될 수 있다. 검출제는 본 명세서에 기재된 임의의 검출제를 사용할 수 있으며, 예를 들어 상기 분자와 결합하는 항체를 포함한다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 진단은, 피험체에 대한 검출제의 투여에 의해 실시해도 되고, 피험체 유래의 시료를 시험함으로써 실시해도 된다. 예를 들어 본 개시의 진단은, 피험체에 본 개시의 검출제를 투여하고, 골수(또는 그 특정 니치)에 있어서의 본 개시의 이상 줄기 세포의 존재 및/또는 존재량을 검출함으로써 실시될 수 있다. 예를 들어 본 개시의 진단은, 피험체의 세포를 포함하는 시료(예를 들어 혈액 시료, 골수 시료)를 취득하여, 본 개시의 이상 줄기 세포의 적어도 하나의 특징 및/또는 골수(또는 그 특정 니치)에 있어서의 존재를 나타내는 마커를 가진 세포가 존재하는지 여부를 확인함으로써 실시될 수 있다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 진단은, 당뇨병의 진단일 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 진단은, 당뇨병의 합병증, 예를 들어 신경 장애, 신증, 간장 장애, 망막증, 지방간, 위장 장애, 골절 치유 지연, 섭식 장애 또는 피부 장애, 혹은 그 리스크의 진단일 수 있다.
본 개시의 진단은, 임의의 공지된 진단(예를 들어 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상의 진단)과 조합되어도 된다.
하나의 실시 형태에 있어서, 본 개시의 치료 및/또는 예방은, 본 개시의 진단에 기초하여(예를 들어 본 개시의 진단 결과, 이상 줄기 세포가 골수에 존재하는 것이 예측된 피험체에 대하여) 실시될 수 있다.
본 명세서에 기재되는 바와 같이, 발명자들은, 이상 조혈 줄기 세포가 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상의 원인이 될 수 있다는 것을 발견했기 때문에, 이상 조혈 줄기 세포의 검출에 기초하여 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상을 치료하는 컴패니언 치료는, 본 개시에 있어서 기도되는 적합한 실시 형태의 하나이다. 마찬가지로, 본 개시는, 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상의 치료 또는 예방으로 연결시키기 위한, 이상 조혈 줄기 세포를 검출하는 약제를 포함하는 컴패니언 진단약도 제공한다. 이상 조혈 줄기 세포를 검출하기 위한 방법 및 약제의 상세에 대해서는 본 명세서의 다른 개소에 상세히 기술되지만, 그렇게 하여 이상 조혈 줄기 세포가 검출된 피험체는, 본 명세서에 기재되는 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상의 임의의 치료 또는 예방이 적합하게 실시되는 피험체일 수 있다. 치료 또는 예방의 상세한 것은, 이상 조혈 줄기 세포의 검출 레벨, 검출 부위, 그 밖의 피험체의 상태(당뇨병의 진행 레벨, 연령, 성별 등)에 따라 적절히 조정될 수 있다. 이와 같이, 이상 조혈 줄기 세포의 검출은, 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상의 치료 또는 예방의 방침을 좌우하는 중요한 요인일 수 있다.
본 개시의 치료, 예방 및/또는 진단은, 임의의 피험체에 있어서 실시할 수 있다. 하나의 실시 형태에 있어서, 피험체는, 포유 동물, 예를 들어 인간, 마우스, 기니피그, 햄스터, 래트, 쥐, 토끼, 돼지, 양, 염소, 소, 말, 고양이, 개, 마모셋, 원숭이, 또는 침팬지 등이다. 구체적인 실시 형태에 있어서, 피험체는, 인간이다.
(의약품, 제형 등)
본 명세서에 기재되는 이상 줄기 세포의 억제제, 유주제 및 이상 줄기 세포의 검출제는, 여러가지 형태의 조성물 또는 의약으로서 제공될 수 있다.
본 명세서에 기재되는 이상 줄기 세포의 억제제, 유주제 및 이상 줄기 세포의 검출제의 투여 경로는, 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상의 치료, 예방 또는 검출 시에 효과적인 것을 사용하는 것이 바람직하고, 예를 들어 정맥 내, 피하, 근육 내, 복강 내, 또는 경구 투여 등이어도 된다. 투여 형태로서는, 예를 들어 주사제, 캡슐제, 정제, 과립제 등이어도 된다. 주사용의 수용액은, 예를 들어 바이알, 또는 스테인리스 용기로 보존해도 된다. 또한 주사용의 수용액은, 예를 들어 생리 식염수, 당(예를 들어 트레할로오스), NaCl, 또는NaOH 등을 배합해도 된다. 또한 치료약은, 예를 들어 완충제(예를 들어 인산염 완충액), 안정제 등을 배합해도 된다.
일반적으로, 본 개시의 조성물, 의약, 억제제, 유주제, 검출제 등은, 치료 유효량의 유효 성분 또는 검출 가능량의 검출 수단, 및 약학적으로 허용할 수 있는 캐리어 혹은 부형제를 포함한다. 본 명세서에 있어서 "약학적으로 허용할 수 있는"은, 동물, 그리고 보다 상세하게는 인간에 있어서의 사용을 위하여, 정부의 감독 관청에 인가되었거나, 혹은 약전 또는 다른 일반적으로 인정되는 약전에 열거되어 있는 것을 의미한다. 본 명세서에서 사용되는 "캐리어"는, 치료제 또는 검출제를 함께 투여하는, 희석제, 아쥬반트, 부형제, 또는 비히클을 가리킨다. 이러한 캐리어는, 무균 액체, 예를 들어 물 및 기름인 것도 가능하며, 석유, 동물, 식물 또는 합성 기원의 것이 포함되며, 한정되는 것은 아니지만, 피넛 오일, 대두유, 미네랄 오일, 참깨유 등이 포함된다. 의약을 경구 투여하는 경우에는, 물이 바람직한 캐리어이다. 의약 조성물을 정맥 내 투여하는 경우에는, 생리 식염수 및 수성 덱스트로오스가 바람직한 캐리어이다. 바람직하게는, 생리 식염수 용액, 그리고 수성 덱스트로오스 및 글리세롤 용액이, 주사 가능 용액의 액체 캐리어로서 사용된다. 적절한 부형제에는, 경질 무수 규산, 결정 셀룰로오스, 만니톨, 전분, 글루코오스, 락토오스, 수크로오스, 젤라틴, 몰트, 쌀, 밀가루, 초크, 실리카겔, 스테아르산 나트륨, 모노스테아르산 글리세롤, 탈크, 염화 나트륨, 탈지 분유, 글리세롤, 프로필렌, 글리콜, 물, 에탄올, 카르멜로오스칼슘, 카르멜로오스나트륨, 히드록시프로필셀룰로오스, 히드록시프로필메틸셀룰로오스, 폴리비닐아세탈디에틸아미노아세테이트, 폴리비닐피롤리돈, 젤라틴, 중쇄 지방산 트리글리세라이드, 폴리옥시에틸렌 경화 피마자유 60, 백당, 카르복시메틸셀룰로오스, 콘스타치, 무기염 등이 포함된다. 조성물은, 바람직한 경우, 소량의 습윤제 또는 유화제, 혹은 pH 완충제도 또한 함유하는 것도 가능하다. 이러한 조성물은, 용액, 현탁물, 에멀션, 정제, 필, 캡슐, 분말, 지속 방출 배합물 등의 형태를 취하는 것도 가능하다. 전통적인 결합제 및 캐리어, 예를 들어 트리글리세리드를 사용하고, 조성물을 좌약으로서 배합하는 것도 가능하다. 경구 배합물은, 의약 등급의 만니톨, 락토오스, 전분, 스테아르산 마그네슘, 사카린·나트륨, 셀룰로오스, 탄산 마그네슘 등의 표준적 캐리어를 포함하는 것도 가능하다. 적절한 캐리어의 예는, E.W.Martin, Remington's Pharmaceutical Sciences(Mark Publishing Company, Easton, U.S.A)에 기재된다. 이러한 조성물은, 환자에게 적절하게 투여하는 형태를 제공하도록, 적절한 양의 캐리어와 함께, 치료 유효량의 요법제, 바람직하게는 정제형의 것을 함유한다. 배합물은, 투여 양식에 적합해야 한다. 이러한 것들 이외에, 예를 들어 계면 활성제, 부형제, 착색료, 착향료, 보존료, 안정제, 완충제, 현탁제, 등장화제, 결합제, 붕괴제, 활택제, 유동성 촉진제, 교미제 등을 포함하고 있어도 된다.
본 개시의 일 실시 형태에 있어서 "염"은, 예를 들어 임의의 산성(예를 들어 카르복실)기로 형성되는 음이온염, 또는 임의의 염기성(예를 들어 아미노)기로 형성되는 양이온염을 포함한다. 염류에는 무기염 또는 유기염을 포함하고, 예를 들어 Berge et al., J. Pharm. Sci., 1977, 66, 1-19에 기재되어 있는 염이 포함된다. 또한 예를 들어 금속염, 암모늄염, 유기 염기와의 염, 무기산과의 염, 유기산과의 염 등을 들 수 있다. 본 개시의 일 실시 형태에 있어서 "용매화물"은, 용질 및 용매에 의해 형성되는 화합물이다. 용매화물에 대하여는 예를 들어 J. Honig et al., The Van Nostrand Chemist's Dictionary P650(1953)을 참조할 수 있다. 용매가 물이라면 형성되는 용매화물은 수화물이다. 이 용매는, 용질의 생물 활성을 방해하지 않는 것이 바람직하다. 그러한 바람직한 용매의 예로서, 특별히 한정하는 것은 아니지만, 물, 또는 각종 버퍼를 들 수 있다.
본 개시에 있어서, 의약을 투여하는 경우, 여러가지 송달(딜리버리)계를 함께 사용할 수 있으며, 그리고 이러한 계를 사용하여, 본 개시의 억제제 및/또는 유주제를 적절한 부위에 투여하는 것도 가능하다. 이러한 계에는, 예를 들어 리포솜, 미소 입자, 및 미소 캡슐 중의 피포: 수용체가 중개하는 엔도사이토시스의 사용; 레트로바이러스 벡터 또는 다른 벡터의 일부로서의 요법 핵산의 구축 등이 있다. 도입법에는, 한정되는 것은 아니지만, 피 내, 근육 내, 복강 내, 정맥 내, 피하, 비 내, 경막 외, 및 경구 경로가 포함된다. 적합한 경로 어느 것에 의해, 예를 들어 주입에 의해, 볼러스(bolus) 주사에 의해, 상피 또는 피부 점막 라이닝 (예를 들어 구강, 직장 및 장 점막 등)을 통한 흡수에 의해, 의약을 투여하는 것도 가능하고, 필요에 따라 에어로졸화제를 사용하여 흡입기 또는 분무기를 사용할 수 있으며, 그리고 다른 생물학적 활성제와 함께 투여하는 것도 가능하다. 투여는 전신성 또는 국소인 것도 가능하다.
바람직한 실시 형태에 있어서, 공지된 방법에 따라, 인간에게의 투여에 적응시킨 의약 조성물로서, 조성물을 배합할 수 있다. 이러한 조성물은 주사에 의해 투여할 수 있다. 대표적으로는, 주사 투여를 위한 조성물은, 무균 등장 수성 완충제 중의 용액이다. 필요한 경우, 조성물은 또한, 가용화제 및 주사 부위에서의 동통을 완화시키는 리도카인 등의 국소 마취제도 포함하는 것도 가능하다. 일반적으로, 성분을 개별적으로 공급하거나, 또는 단위 투약형 중에서 함께 혼합하여 공급하며, 예를 들어 활성제의 양을 나타내는 앰플 또는 사셰 등의 밀봉 용기 중, 동결 건조 분말 또는 무수 농축물로서 공급할 수 있다. 조성물을 주입에 의해 투여하고자 하는 경우, 무균 약제 등급의 물 또는 생리 식염수를 함유하는 주입병을 사용하여, 분배하는 것도 가능하다. 조성물을 주사에 의해 투여하고자 하는 경우, 투여 전에, 성분을 혼합 가능하도록, 주사용의 무균화 또는 생리 식염수의 앰플을 제공하는 것도 가능하다.
본 개시의 조성물, 의약, 유주제, 억제제를 중성형 또는 염형 혹은 다른 프로드러그(예를 들어 에스테르 등)로 배합하는 것도 가능하다. 약학적으로 허용할 수 있는 염에는, 염산, 인산, 아세트산, 옥살산, 타르타르산 등에서 유래하는 유리형의 카르복실기와 함께 형성되는 것, 이소프로필아민, 트리에틸아민, 2-에틸아미노에탄올, 히스티딘, 프로카인 등에서 유래하는 것 등의 유리형의 아민기와 함께 형성되는 것, 그리고 나트륨, 칼륨, 암모늄, 칼슘, 및 수산화 제2철 등에서 유래하는 것이 포함된다.
본 개시의 억제제 및/또는 유주제의 양은, 장애 또는 상태의 성질에 따라 변동될 수 있지만, 당업자는 본 명세서의 기재에 기초하여 표준적 임상 기술에 의해 결정 가능하다. 또한, 경우에 따라, in vitro 어세이를 사용하여, 최적 투약량 범위를 동정하는 것을 보조하는 것도 가능하다. 배합물에 사용하고자 하는 정확한 용량은 또한, 투여 경로, 및 질환 또는 장애의 중대성에 따라서도 변동될 수 있기 때문에, 담당 의사의 판단 및 각 환자의 상황을 따라 결정해야 한다. 그러나, 투여량은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 1회당 0.001, 1, 5, 10, 15, 100, 또는 1000mg/kg 체중이어도 되고, 그것들 어느 2개의 값의 범위 내이어도 된다. 투여 간격은 특별히 한정되지 않지만, 예를 들어 1, 7, 14, 21, 또는 28일당 1 또는 2회 투여해도 되고, 그것들 어느 2개의 값의 범위당 1 또는 2회 투여해도 된다. 투여량, 투여 간격, 투여 방법은, 환자의 연령이나 체중, 증상, 대상 장기 등에 따라, 적절히 선택해도 된다. 또한 치료약은, 치료 유효량, 또는 목적으로 하는 작용을 발휘하는 유효량의 유효 성분을 포함하는 것이 바람직하다. 유효용량은, in vitro 또는 동물 모델 시험계로부터 얻어지는 용량-반응 곡선으로부터 추정 가능하다.
본 개시의 의약 조성물 또는 치료제 혹은 예방제는 키트로서 제공할 수 있다.
특정한 실시 형태에서는, 본 개시는, 본 개시의 조성물 또는 의약의 1이상의 성분이 충진된, 1이상의 용기를 포함하는, 약제 팩 또는 키트를 제공한다. 경우에 따라, 이러한 용기에 부수하여, 의약 또는 생물학적 제품의 제조, 사용 또는 판매를 규제하는 정부 기관에 의해 규정된 형태로, 정부 기관에 의한, 인간 투여를 위한 제조, 사용 또는 판매의 인가를 나타내는 정보를 나타내는 것도 가능하다.
본 개시의 치료약, 예방약 등의 의약 등으로서의 제제화 순서는, 당해 분야에 있어서 공지되어 있으며, 예를 들어 일본 약전, 미국 약전, 다른 나라의 약전 등에 기재되어 있다. 따라서, 당업자는, 본 명세서의 기재가 있으면, 과도한 실험을 하지 않고, 사용해야 할 양 등의 실시 형태를 결정할 수 있다.
본 명세서에 있어서 "또는"은, 문장 중에 열거되어 있는 사항의 "적어도 하나 이상"을 채용할 수 있을 때에 사용된다. "혹은"도 마찬가지이다. 본 명세서에 있어서 "2개의 값"의 "범위 내"라고 명기했을 경우, 그 범위에는 2개의 값 자체도 포함한다.
본 명세서에서 인용된, 과학 문헌, 특허, 특허 출원 등의 참고 문헌은, 그 전체가, 각각 구체적으로 기재된 것과 동일한 정도로 본 명세서에서 참고로서 원용된다.
이상, 본 개시를, 이해의 용이를 위하여 바람직한 실시 형태를 나타내어 설명해 왔다. 이하에, 실시예에 기초하여 본 개시를 설명하지만, 상술한 설명 및 이하의 실시예는, 예시의 목적만으로 제공되고, 본 개시를 한정할 목적으로 제공한 것은 아니다. 따라서, 본 개시의 범위는, 본 명세서에 구체적으로 기재된 실시 형태에도 실시예에도 한정되지 않고, 특허청구의 범위에 의해서만 한정된다.
실시예
필요한 경우, 이하의 실시예에서 사용하는 동물의 취급은, 시가 의과 대학의 동물 실험 가이드 라인에 따라 실시하였다. 시약류는 구체적으로는 실시예 중에 기재한 제품을 사용했지만, 타 메이커(Sigma-Aldrich, 와코준야쿠, 나카라이, R&D Systems, USCN Life Science INC 등)의 동등품으로도 대용 가능하다.
이하의 실시예에 있어서, 각각의 약어는 이하의 의미를 나타낸다.
DM 당뇨병
STZ-DM 스트렙토조토신 유도성 당뇨병
KSL 세포 c-Kit 양성 Sca-1 양성 Lineage(계통 마커) 음성 세포
SNCV 지각 신경 전달 속도
(실시예 1: 당뇨병에 관여하는 이상 줄기 세포의 특정)
당뇨병에 관여하는 이상 세포를 특정하기 위하여, 당뇨병 모델 마우스로부터 취득한 줄기 세포를 분석하였다.
방법
마우스 및 골수 세포의 취득
시험에는, C57BL/6J 마우스(야생형, 니혼 클레아, 오사카)를 사용하였다. 스트렙토조토신(STZ)(150mg/kg)(나카라이테스크, 교토)의 정맥 내 주사에 의해 당뇨병을 유도하여, 2형 당뇨병 모델(STZ 마우스)을 제작하였다. 8주령의 마우스로부터 골수 세포를 단리하였다.
FACS
Ficoll-Paque Plus(GE Healthcare Bio-Sciences AB, Uppsala, Sweden)를 사용하여 전골수로부터 단핵 세포를 단리하였다.
TNF-α 및 CD106의 발현을 평가하기 위하여, 단핵 세포를, PE-Cy7 콘주게이트화 스트렙타비딘 항체(BD Biosciences, San Jose, CA), 바이오틴 마우스 계통 패널 염색(BD Biosciences), APC 콘주게이트화 항c-kit 항체(BD Biosciences), APC-Cy7 콘주게이트화 항Ly6A/E 항체(Sca-1)(BD Biosciences), 플루오레세인이소티오시아네이트(FITC) 콘주게이트화 항CD106 항체(BD Biosciences) 및 피코에리트린(PE)콘주게이트화 항TNF-α 항체(eBiosciences)와 면역 반응시켰다.
프로인슐린 발현을 평가하기 위하여, 단핵 세포를, PE-Cy7 콘주게이트화 스트렙타비딘 항체, APC 콘주게이트화 항c-kit 항체, APC-Cy7 콘주게이트화 항Ly6A/E 항체(Sca-1), 및 바이오틴 마우스 계통 패널과 반응시킨 후, BD Cytofix/CytoPerm(BD Biosciences)으로 고정하였다. 이어서, 토끼 항인슐린 모노클로날 항체(Cell signaling technology) 및 PE 콘주게이트화 항토끼 IgG 항체(Cell signaling technology)를 단핵 세포에 적용하였다. 이 염색 전에, 사멸세포를 고갈시키기 위하여, LIVE/DEAD 고정 가능 사멸세포 블루 염색 키트(ThermoFisher Scientific Inc., 미국 매사추세츠주 월섬)를 사용하였다.
염색 4시간 후, FACS DIVA 소프트웨어(BD Biosciences)로 FACS Canto II를 사용하여 세포를 분석하였다.
결과
프로인슐린 양성 세포는 STZ-DM 마우스 유래의 단핵 세포 KSL 분획에서 발견되었지만, 비DM 마우스의 KSL 분획에서는 관찰되지 않았다(도 1). 마찬가지로, TNF-α 양성 세포도, STZ-DM 마우스 유래의 단핵 세포 KSL 분획에서 발견되었지만, 비DM 마우스의 KSL 분획에서는 관찰되지 않았다(도 2). CD106 양성 세포는 STZ-DM 마우스 및 비DM 마우스 양쪽의 단핵 세포 KSL 분획에서 발견되었지만, STZ-DM 마우스에서 보다 많이 발현되어 있었다(도 3).
당뇨병 마우스에서는, KSL 세포에 있어서, TNF-α 양성 세포, 및 프로인슐린 양성 세포가 존재하고, CD106 발현 세포가 증대되어 있고, 이러한 특징을 가진 조혈 줄기 세포가, 당뇨병의 만성 질환으로서의 특징을 출현시키는 원인이 되고 있다고 생각된다.
(실시예 2: 1형 당뇨병에 관여하는 이상 줄기 세포의 특정)
실시예 1과 마찬가지로, 1형 당뇨병 모델 마우스로부터 취득한 줄기 세포에 대해서도 당뇨병에 관여하는 이상 세포를 특징지었다.
방법
마우스 및 골수 세포의 취득
시험에는, ICR 마우스(니혼 클레아, 오사카) 및 NOD 마우스(니혼 클레아, 오사카)를 사용하였다. 실시예 1과 마찬가지로 단핵 세포를 단리하였다.
실시예 1과 마찬가지로, 단핵 세포를, TNF-α, CD106, c-kit, Sca-1, 및 마우스 계통(Lineage)에 대하여 염색하여, FACS 분석을 행하였다.
결과
ICR 마우스와 비교하여, NOD 마우스에서는, KSL 세포의 비율이 약 25%로 감소되어 있었다(도 4). KSL 세포 집단에 포함되는 TNF-α 양성 세포, 및 CD106 발현 세포의 비율은, ICR 마우스와 비교하여 NOD 마우스에서 현저하게 증대되어 있었다(도 5).
1형 당뇨병 마우스의 KSL 세포에 있어서도, TNF-α 양성 세포, 및 CD106 발현 세포가 증대되어 있고, 이러한 특징을 가진 조혈 줄기 세포가, 당뇨병의 만성 질환으로서의 특징을 출현시키는 원인이 되고 있다고 생각된다.
(실시예 3: 당뇨병에 관여하는 이상 줄기 세포의 세포 단계)
이상 줄기 세포가, 조혈 줄기 세포의 어느 단계의 세포인지를 시험하였다.
방법
KSL 세포의 사이드 포퓰레이션(SP)을 Goodell에 의해 보고된 방법에 따라 FACS에 의해 분석하였다(J Exp Med. 1996 Apr 1; 183(4): 1797-806; Nat Med. 1997 Dec; 3(12): 1337-45를 참조). Hoechest 33342 색소는 세포 투과성이 있어 DNA와 결합하는데, 조혈 줄기 세포에서는 이 색소가 효율적으로 세포 밖으로 배출될 수 있다. 이 성질을 사용하여, 이 색소로 염색한 골수 세포를, 자외광(350nm)으로 여기하여, Hoechst blue 및 Hoechst red의 2종류의 광학 필터로 전개했을 경우, 조혈 줄기 세포 분획이, 염색되어 있지 않은 세포 집단(SP 세포)에 포함되는 것으로 보고되어 있다. 전골수 세포를, 색소로서 Hoechest 33342(Sigma-Aldrich Japan K.K., 도쿄, 일본)를 사용하여 37℃에서 정확하게 90분간 염색하였다. 게이트 설정을 위하여 Hoechest 33342 양성 세포를 염산 베라파밀(Tocris bioscience, Bristol, UK)과 함께 인큐베이트하고, 단핵 세포를 Ficoll-Paque Plus에 의해 분리하였다. 이어서, 바이오틴 마우스 계통 패널 염색한 후, 이러한 세포를, PE-Cy7 콘주게이트화 스트렙타비딘, APC 콘주게이트화 항c-kit, APC-Cy7 콘주게이트화 항Ly6A/E(Sca-1), 및 PE 콘주게이트화 항TNF-α 또는 FITC 콘주게이트화 항CD106과 인큐베이트하였다. 사멸 세포 고갈을 위하여, 요오드화 프로피디움(Sigma-Aldrich)을 시료에 첨가하여 사멸 세포를 제거하고, FACS DIVA 소프트웨어(BD Biosciences)를 사용한 FACS Aria Fusion을 사용한 분석을 하였다. Hoechest 33342로 염색한 세포를 350nm의 자외광으로 여기하고, 450BP20(450/20nm 밴드 패스 필터)(Hoechst blue) 및 675EFLP(675nm 롱 패스 엣지 필터)(Hoechst red)의 2종류의 광학 필터를 사용하였다.
결과
비DM 마우스와 비교하여 STZ-DM 마우스에 있어서 KSL 세포 중의 SP 세포의 비율이 증대하고, 비SP 세포의 비율이 감소되어 있었다(도 6). 비DM 및 STZ-DM의 어느 마우스의 SP 세포에 있어서도 CD106 양성 세포도 TNF-α 양성 세포도 검출되지 않았다(도 7b, d). 다른 한편, 비SP 세포에 있어서는, 비DM 유래의 TNF-α 양성 세포는 검출되지 않았지만, STZ-DM 유래의 TNF-α 양성 세포가 검출되고, 비DM 마우스와 비교하여 STZ-DM 마우스에서 보다 많은 CD106 양성 세포가 관찰되었다(도 7a, c). 그 때문에, CD106 양성 세포 및 TNF-α 양성 세포는, STZ-DM 중의 KSL 세포의 비SP 분획에 존재한다.
조혈 줄기 세포의 이상을 특징짓는 CD106 양성 세포 및 TNF-α 양성 세포는, KSL 세포 중의 비SP 세포(단기 조혈 줄기 세포: ST-HSC)에 포함되어 있었지만, 보다 조기의 분화 단계에 있는 KSL 세포 중의 SP 세포(장기 조혈 줄기 세포: LT-HSC)에는 포함되어 있지 않았다. 이것은, 당뇨병에 있어서의 HSC의 이상은 줄기 세포 중에서도 전구 세포의 단계에 머물러, 소위 "줄기 세포 중의 줄기 세포"에는 이상이 생기지 않아, 전구 세포를 제거함으로써 당뇨병 및 그 관련 질환의 치료가 가능하다는 것을 시사할 수 있다. "줄기 세포 중의 줄기 세포"가 치료 대상이 되면, 골수 이식이 필요할 수 있지만, 전구 세포의 제거로 치료가 가능해지면, 약물 치료가 가능하다고 생각된다.
이와 같이, 당뇨병에 있어서 발견되는 이상 줄기 세포는 ST-HSC에 존재할 수 있다는 것이 명확해졌다.
(실시예 4: 이상 줄기 세포의 추가적인 특징 부여)
당뇨병에 관여하는 이상 줄기 세포의 추가적인 특징 부여를 행하였다.
방법
실시예 1과 동일한 비DM 및 STZ-DM 마우스의 FACS sort에 의해 얻어진 KSL 세포로부터 RNA를 추출하고, QT-PCR법을 사용하여 히스톤 탈아세틸화 효소 유전자군(Hdacs)의 유전자 발현을 해석하였다.
결과
결과를 도 8에 나타낸다. 비DM 마우스와 비교하여, STZ-DM 마우스에서는, Hdac3, Hdac4, Hdac8, 및 Hdac9의 mRNA 발현이 유의미하게 증가하고 있다는 것이 명확해졌다.
당뇨병의 KSL 세포에서는, 히스톤 수식 등에 의해 유전자 발현을 조절하는데 중요한 에피게놈 관련 유전자(Hdacs)의 발현이 증가되었으므로, 고혈당은 줄기 세포에 대하여 유전자 레벨에서 이상한 성질을 받은 것으로 생각되었다. 일과성의 고혈당에 폭로된 세포는 정상 혈당값의 환경 하로 복귀되어도, 고혈당으로 생긴 세포의 이상이 유지되는 것으로 보고되었지만(El-Osta et.al. J Exp Med. 2008 Sep 29; 205(10): 2409-17), 이것부터도, KSL 세포에서 생긴 히스톤 탈아세틸화 효소 유전자의 발현 증가가, CD106이나 TNF-α, 프로인슐린 양성 세포의 출현에 관여할 수 있다고 생각된다. 이것을 밝히기 위하여, Hdac 저해제(예를 들어 트리코스타틴 A)에 의해 치료가 가능한지 여부를 검토하는 것을 생각할 수 있다.
(실시예 5: 이상 줄기 세포에 의한 당뇨병 발증)
상기에서 발견된 이상 줄기 세포가, 당뇨병을 일으키는 원인이 되는지를 시험하였다.
방법
비DM 또는 STZ-DM KSL 세포를 정상 혈당 마우스에게 이식하는 시험의 개략을 도 9에 나타낸다. GFP-Tg 마우스(The Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME)에 대하여 실시예 1과 마찬가지로 STZ 처치(STZ-DM GFP), 또는 정맥 내 시트르산 완충액 주사의 대조 처치(비DM GFP)를 실시하였다. 3개월 후, 비DM 마우스 또는 STZ-DM 마우스의 각각으로부터 얻어진 KSL 세포를, 9Gy의 치사량의 방사선을 조사한 정상 혈당 야생형 C57BL/6J 마우스(크레아, 오사카)에게 이식하였다(각각, 비DM 유래 KSL-T 또는 STZ-DM 유래 KSL-T)(도 10, 좌측). 이식으로부터 3개월 후의 혈당값을 관찰하였다(비DM 유래 KSL-T(n=9), STZ-DM 유래 KSL-T(n=10)). 이식으로부터 3개월 후에 좌골 신경에 있어서의 SNCV를 측정하였다((비DM 유래 KSL-T(n=5), STZ-DM 유래 KSL-T(n=6)) (도 10, 우측). 이식으로부터 3개월 후에 각각의 마우스로부터 후근 신경절(DRG)을 취득하고, 핵, GFP, MAP2, 프로인슐린, 및 TNF-α(PE 콘주게이트화)에 대하여 면역 형광 염색을 행하였다(도 11, 도 12, 도 13).
상기의 SNCV 측정은 이하의 순서로 행하였다. 30℃ 내지 32℃에서 마취 하(펜토바르비탈나트륨, 5mg/kg i.p.)에 Medelec Sapphire EMG(Medelec, Woking, UK)를 사용하여, 마우스의 감각 신경 전도 시험을 행하였다. 대퇴부의 좌측 배면 표면으로부터 피부를 베어내어, 좌골 신경을 노출시켰다. 감각 신경 활동 전위(SNAP)를 기록하고, 감각 신경 전도 속도(SNCV)를 자극 부위로부터 기록 부위까지의 거리를 SNAP의 초기 잠복 시간으로 나눔으로써 산출하였다.
결과
STZ-DM 유래 KSL-T 마우스의 KSL 세포 분획 중에는 TNF-α나 프로인슐린 등 이상 줄기 세포의 특징이 발견되었지만, 비DM 유래 KSL-T 마우스의 KSL 세포 분획은 이상 줄기 세포의 특징은 발견되지 않았다.
당뇨병 마우스에서 발견된 이상한 KSL 세포를 정상 마우스에게 이식한 결과, 혈당값이 정상임에도 불구하고 당뇨병성 신경 장애 유사 증상을 보였다. 이것으로부터 당뇨병 마우스의 혈당값은 정상화되었을 경우이어도, 이상 줄기 세포는 소실되지 않는다는 것이 명확해졌다. 이것은 이상 세포가 이상한 채 골수 내에 정착된 즉, 병적 줄기 세포로서 정착한 것을 나타낸다. 또한, 그 이상 줄기 세포로부터 파생된 세포가 신경 조직에 유주하여, 신경 장애를 발증시켰다고 이해되므로, 이 줄기 세포가 남아있는 한, 당뇨병은 혈당 컨트롤을 행해도 낫지 않는다는 것이 밝혀졌다. 또한, 이 당뇨병 마우스의 이상 줄기 세포를 포함하는 골수를 정상 마우스에게 이식했더니, 내당능 장애가 관찰되어, 골수 이식에 의해 당뇨병의 본체인 당대사 이상도 재현되었다.
이것은, 고혈당을 개선해도 당뇨병 및 당뇨병 합병증이 낫지 않는다고 하는 임상 증상과 합치되는 것이며, 당뇨병의 궁극의 치료 표적은 이상한 조혈 줄기 세포라는 것을 시사한다. 이와 같이, 당뇨병의 조혈 줄기 세포를 정상 마우스에게 이식함으로써, 당대사 이상 그리고 당뇨병 신경 장애를 정상 마우스에게 재현시킬 수 있었다.
(실시예 6: 인간 당뇨병 환자에 있어서의 이상 줄기 세포의 특징)
시가 의과 대학 부속 병원 집중 치료실에 입실한 환자를 조사하였다. 시료를 취득한 피험자는, 당뇨병이라고 진단된 환자(3명)(남성 3/여성 0, 평균 연령 72.0±14.2), 및 건강한 피험자(4명)(남성 3/여성 1, 평균 연령 76.5±8.5)였다.
이들 피험자로부터 혈액 시료를 취득하고, 혈액 시료로부터 RNA를 추출하였다. 구체적으로는, 혈액을 1.5ml 채취하고, DNAse(Qiagen, Hilden, 독일)로 DNA를 분해한 후, QIAamp RNA blood mini kit(Qiagen, Hilden, 독일)를 사용하여 RNA를 추출하였다. 얻어진 RNA로부터 SuperScript(등록 상표) III First-Strand Synthesis System(Invitrogen/ThermoFisher scientific, MA, 미국)을 사용하여 cDNA를 제작하였다. Power SYBR Green PCR Master Mix in a real-time PCR system( Applied Biosystems/ThermoFisher scientific, MA, 미국)을 사용하여 정량적 PCR를 행하여, 발현되어 있는 mRNA를 정량화하였다. 2군간의 비교는 t검정으로 행하였다. 결과를 도 14에 나타낸다.
마우스의 결과와 마찬가지로, 인간에 있어서도, 당뇨병 환자에 있어서 인슐린, TNF-α, 및 CD106의 발현 상승 경향이 확인되었다. 또한, 당뇨병 환자에 있어서 CD34의 발현 상승 경향이 확인되었지만, 인간에 있어서 CD34는 줄기 세포의 특징을 나타내기 때문에, 마우스의 결과와 마찬가지로, 인간에 있어서도, 당뇨병 환자에 있어서 이상 줄기 세포가 존재한다는 것이 시사되었다.
(실시예 7: 인간 당뇨병 환자 골수에 있어서의 이상 세포)
인간 당뇨병 환자에 있어서도 골수에 이상 세포가 존재하는 것을 확인하였다.
시가 의과 대학에 입원한 2형 당뇨병(DM) 환자에 있어서, 2000년 1월 1일 내지 2010년 12월 31일 사이에 병리 해부한 예에 대하여, 골수에 있어서의 프로인슐린 양성 세포의 출현 유무를 검토하였다. 조직은, 시가 의과 대학 해부학 센터에서 파라핀에 포매하였다. 파라핀 포매 시료에 5㎛ 두께의 절편을 아비딘-바이오틴 페록시다아제 복합체(ABC)법 및 디아미노벤지딘(DAB)-니켈 반응을 사용하여 면역 조직 화학을 위하여 처리하였다. 크실렌 및 알코올 중에서 탈파라핀화한 후, 절편을 마이크로파(10mmol/L 시트르산 완충액 중, pH6.0, 0.5kW로 10분간)로 처리한 후, 프로인슐린에 대한 항체(마우스 모노클로날, Abcam, UK)를 0.3% Triton X-100(PBST)을 포함하는 0.1% PBS 중에서 1:1,000 희석한 것으로 밤새 인큐베이트한 후, 4℃에서 면역 조직 화학을 위한 처리를 행하였다. DAB-니켈 반응 후, 절편을 핵 패스트 레드(nuclear fast red) 용액으로 카운터 염색하였다.
결과를 도 15에 나타낸다. DM 없음의 환자 유래 골수 세포에서는 프로인슐린 발현은 관찰되지 않았지만, DM 있음의 환자 유래 골수 세포에서는 프로인슐린 발현이 관찰되었다. 마우스에 있어서 관찰된 이상 줄기 세포의 지견은 인간에 있어서도 적용 가능하다고 생각된다.
(실시예 8: STZ-DM 마우스의 골수 이식 치료)
골수 이식에 의해 STZ-DM 마우스(2형 당뇨병 모델)에 있어서의 당뇨병을 치료하였다.
처치의 개요를 도 16에 나타낸다. C57BL/6J 마우스(야생형, 니혼 클레아, 오사카)에 대하여 스트렙토조토신(150mg/kg)을 미정맥 투여하여 당뇨병을 발증시킨 마우스에 대하여 4주간 효과가 지속되는 인슐린 펠릿(LINSHIN CANADA, INC., CatNo: Pr-1-B) 투여에 의해 혈당값을 정상화시킨 후, 9Gy 방사선 조사를 행하였다. 이 마우스에게, 비당뇨병 마우스로부터 채취한 전골수 세포(4x106개/100ul), 또는 당뇨병 마우스로부터 채취한 전골수 세포(4x106개/100ul)를 이식하여 골수 이식 마우스를 제작하였다. 인슐린 펠릿 투여의 1주일 이내에 9Gy 방사선을 조사하고, 그 당일에 골수 이식을 하였다. 또한, 투여해도 고혈당이 유지된 채로 있는 블랭크 펠릿을 투여한 마우스에 대하여 9Gy 방사선 조사를 행하고, 비당뇨병 마우스로부터 채취한 전골수 세포(4x106개/100ul), 또는 당뇨병 마우스로부터 채취한 전골수 세포(4x106개/100ul)를 이식한 대조 골수 이식 마우스를 제작하였다. 인슐린 펠릿 및 블랭크 펠릿은, 골수 이식 전의 투여뿐이고, 추가 투여는 하지 않았다.
STZ 투여 전, 당뇨병 발증 후, 골수 이식 시와 그 이후 1주일마다 8주째까지 혈당값 및 체중을 측정하였다. 또한, 골수 이식 8주일 후의 마우스를 0.1M PB 중 4% PFA의 액으로 관류 고정하고, 채취한 췌장 조직을 0.1M PB 중 15% 수크로오스의 액에 밤새 침지한 후, 크라이오스탯으로 8um의 동결 절편을 제작하였다. 동결 절편을 PBS(-)로 10분간 3회 세정한 후, 절편의 내인성 페록시다아제를 불활성화하기 위하여 0.3% 과산화 수소액(PBS(-) 중 0.3% H2O2) 중에서 30분간 실온에서 반응시키고 PBS(-)로 5분간 3회 세정하였다. 그 후, 비특이 반응을 방지하기 위하여, 절편을 0.3% Triton X를 보충한 PBS(-) 중 5% 정상 염소 혈청과 반응시켜, 1시간 실온에서 블로킹하였다. 블로킹 후, 1차 항체(항인슐린 항체: CST사 또는 항글루카곤 항체: CST사))와 4℃에서 밤새 반응시켰다. 그 후, PBS(-)로 5분간 3회 세정하고, ImmPRESS reagent(Vector laboratory) 중에서 실온에서 30분간 반응시키고 추가로 세정하였다. 그 후, DAB 발색을 행하고, 대비 염색으로서, 헤마톡실린으로 핵 염색을 행한 후, 탈수·봉입을 행하였다. 제작한 절편을 현미경 하에서 관찰하고, 췌도를 랜덤하게 5 내지 8개 정도 선정하여, 췌도의 크기에 대한 인슐린 양성 세포의 비율을 Image J 소프트웨어로 산출하였다. 또한, 각 실험군의 마우스를 관류 고정 후, 해부하여, 흉선을 채취하였다.
인슐린 펠릿을 투여하여 비당뇨병 골수를 이식한 마우스에서는, 인슐린 펠릿의 효과가 감약한 후에도, 정상 혈당값을 계속하여 유지했지만, 인슐린 펠릿을 투여하여 당뇨병 골수를 이식한 마우스에서는, 이식 후 사망하는 개체가 3/5를 차지하고, 가령 생존해도, 인슐린 펠릿의 효과 감약 후에는 혈당값의 상승이 보여졌다(도 17). 또한, 인슐린 펠릿을 투여하여 당뇨병 골수를 이식한 마우스에서는, 혈당값이 높은 값에서 측정 불능인 예, 및 쇠약이 현저한 예에서는 동물 애호의 면에서 안락사를 선택하였다. 실험 기간 중에, 인슐린 펠릿 및 당뇨병 골수 이식군에 있어서 2마리의 마우스를 안락사시키고, 블랭크 펠릿 및 당뇨병 골수 이식군에 있어서 2마리의 마우스를 안락사시켰다. 또한, 블랭크 펠릿을 투여하여 골수 이식한 마우스에서는, 비당뇨병 골수 세포를 이식해도, 혈당값은 정상화되지 않고, 고혈당을 계속하여 유지하였다(도 17).
췌장의 인슐린 DAB 염색(도 18)의 결과, 인슐린 펠릿 투여한 비당뇨병 골수 이식군에서는, STZ 당뇨병군에 비하여 인슐린 양성 세포의 비율이 증가하여, 인슐린 산생이 개선되어 있다는 것이 시사되었다. 블랭크 펠릿 투여한 비당뇨병 골수 이식군, 인슐린 펠릿 투여한 당뇨병 골수 이식군, 블랭크 펠릿 투여한 당뇨병 골수 이식군은 모두 인슐린 산생의 개선을 나타내지 않았다.
췌장의 글루카곤 DAB 염색(도 19)의 결과, 인슐린 펠릿 투여한 비당뇨병 골수 이식군에서는, STZ 당뇨병군에 비하여 글루카곤 양성 세포의 비율이 감소하여, 글루카곤 산생이 비당뇨병 상태까지 개선되어 있었다. 블랭크 펠릿 투여한 비당뇨병 골수 이식군, 인슐린 펠릿 투여한 당뇨병 골수 이식군, 블랭크 펠릿 투여한 당뇨병 골수 이식군에서는, 모두 STZ 당뇨병의 글루카곤 양성 세포의 비율과 동등하고, 글루카곤 산생은 개선되어 있지 않았다.
채취한 흉선의 크기를 비교했더니(도 20), 당뇨병 마우스에서는 비당뇨병과 비교하여 흉선이 현저하게 위축되어 있었다. 한편, 인슐린 펠릿을 투여하여 비당뇨병 마우스의 골수를 이식한 것은 비당뇨병 마우스와 동등하게 흉선의 크기가 회복되고, 그 이외의 마우스에서는 개선이 보여지지 않았다.
(실시예 9: STZ-DM 마우스의 약물 치료)
줄기 세포 유주제 및 HDAC 저해제를 사용하여 STZ-DM 마우스에 있어서의 당뇨병을 치료하였다.
처치의 개요를 도 21에 나타낸다. 실시예 8과 마찬가지로 야생형 마우스에 대하여 스트렙토조토신(150mg/kg)을 미정맥 투여하여 당뇨병을 발증시킨 마우스에 대하여 인슐린 펠릿 투여에 의해 혈당값을 정상화시켰다. 그 후, 줄기 세포 유주제로서 플레릭사포(abcam, 제품 번호: ab120718)(5mg/kg)와 CXCL2 아고니스트(PEPROTECH, 제품 번호: 250-15)(0.1mg/kg)의 혼합액 100ul을 생리 식염수와 함께 피하 주사한 직후, 200ul의 트리코스타틴 A(TCI, 제품 번호: T2477)(1mg/kg)를 미정맥 투여하였다. 대조로서 블랭크 펠릿 투여로 고혈당이 지속된 상태에서 플레릭사포(5mg/kg) 및 CXCL2 아고니스트(0.1mg/kg)의 혼합액 100ul을 생리 식염수와 함께 피하 주사한 직후, 200ul의 트리코스타틴 A(1mg/kg)를 미정맥 투여하는 군과, 인슐린 펠릿 투여만으로 혈당값을 정상화하는 군을 제작하였다. 마우스에게의 투여는, 3일마다 실시하고, 그 때마다 혈당값과 체중을 측정하였다. 치료 개시 후 8주일 후에, 관류 고정을 실시하였다.
실시예 8과 마찬가지로, 혈당값 및 체중을 측정하고, 췌장 조직의 항체 염색을 행하고, 흉선을 채취하였다.
결과
도 22에 나타내는 바와 같이, 인슐린 펠릿을 투여하고, 줄기 세포 유주제 및 트리코스타틴으로 치료한 마우스에서는, 인슐린 펠릿의 효과가 감약한 후에도, 정상 혈당값을 계속하여 유지했지만, 인슐린 펠릿만을 투여한 군에서는, 효과의 감약과 동시에 혈당값이 상승하기 시작하고, 8주째에서는, 인슐린 펠릿을 투여하고, 줄기 세포 유주제 및 트리코스타틴으로 치료한 마우스의 혈당값은, 인슐린 펠릿만을 투여한 군의 혈당값과 비교하여, 유의미하게 낮아졌다. 또한, 블랭크 펠릿을 투여하고 트리코스타틴으로 치료한 마우스에서는, 혈당값이 높은 값에서 측정 불능인 예, 및 쇠약이 현저한 예에서는 동물 애호의 면에서 안락사를 선택하였다. 그 결과, 6주째 이후는, 블랭크 펠릿 및 트리코스타틴 처치군의 마우스는 1마리였다.
췌장의 인슐린 DAB 염색(도 23)의 결과, 인슐린 펠릿을 투여하고, 줄기 세포 유주제 및 트리코스타틴으로 치료한 군에서는, STZ 당뇨병군이나 인슐린 펠릿만의 투여군, 블랭크 펠릿을 투여하고, 줄기 세포 유주제 및 트리코스타틴 치료한 군과 비교하여, 유의미하게 인슐린 양성 세포의 비율이 증가하여, 인슐린 산생이 개선되어 있다는 것이 시사되었다. 인슐린 펠릿만의 투여군, 블랭크 펠릿을 투여하고, 줄기 세포 유주제 및 트리코스타틴으로 치료한 군은, STZ 투여군과 인슐린 양성 세포의 비율이 거의 다르지 않아, 개선은 보여지지 않았다.
췌장의 글루카곤 DAB 염색(도 24)의 결과, 인슐린 펠릿을 투여하고, 줄기 세포 유주제 및 트리코스타틴으로 치료한 군에서는, STZ 당뇨병군이나 인슐린 펠릿만의 투여군, 블랭크 펠릿을 투여하고, 줄기 세포 유주제 및 트리코스타틴으로 치료한 군과 비교하여, 유의미하게 글루카곤 양성 세포의 비율이 감소하여, 글루카곤 산생이 개선되어 있다는 것이 시사되었다. 인슐린 펠릿만의 투여군, 블랭크 펠릿을 투여하고, 줄기 세포 유주제 및 트리코스타틴으로 치료한 군은, 글루카곤 양성 세포의 비율이 STZ 당뇨병군과 거의 다르지 않아, 개선은 보여지지 않았다.
채취한 흉선의 크기를 비교했더니(도 25), 인슐린 펠릿만의 투여군, 블랭크 펠릿을 투여하고, 줄기 세포 유주제 및 트리코스타틴으로 치료한 군에서는 흉선이 현저하게 위축하어 있었지만, 인슐린 펠릿을 투여하고, 줄기 세포 유주제 및 트리코스타틴으로 치료한 군에서는 흉선의 크기가 회복되어 있었다.
(실시예 10: NOD 마우스의 골수 이식 치료)
골수 이식에 의해 NOD 마우스(1형 당뇨병 모델)에 있어서의 당뇨병을 치료한다.
처치의 개요를 도 26에 나타낸다. 고혈당을 보인 NOD 마우스에 대하여 인슐린 펠릿 투여에 의해 혈당값을 정상화시킨 후, 9Gy 방사선 조사를 행하고, 대조 마우스인 ICR 마우스로부터 채취한 전골수 세포(4x106개/100ul), 또는 상기와는 다른 고혈당을 보인 NOD 마우스로부터 채취한 전골수 세포(4x106개/100ul)를 이식하는 골수 이식 마우스를 제작한다. 또한, 블랭크 펠릿을 투여한 NOD 마우스에 대하여 9Gy 방사선 조사를 행하고, ICR 마우스로부터 채취한 전골수 세포(4x106개/100ul), 또는 고혈당을 보인 NOD 마우스로부터 채취한 전골수 세포(4x106개/100ul)를 이식하는 대조 골수 이식 마우스를 제작한다. 또한, 인슐린 펠릿 또는 블랭크 펠릿은, 골수 이식 전의 투여뿐이고, 추가 투여는 하지 않는다.
실시예 8과 마찬가지로, 혈당값 및 체중을 측정하고, 췌장 조직의 항체 염색을 행하고, 흉선을 채취한다.
혈당값의 변화도를 도 27에 나타낸다. 인슐린 펠릿 투여한 비당뇨병 골수 이식군에 있어서만, 인슐린 펠릿의 효과 종료 후에도 혈당값이 낮게 유지된다고 생각된다. 췌장 동결 절편의 인슐린 DAB 염색 결과(일부 실제의 화상)를 도 28에 나타내고, 글루카곤 DAB 염색의 결과를 도 29에 나타낸다. 인슐린 펠릿+비당뇨병 골수 이식의 처치군에 있어서만, 인슐린 또는 글루카곤 양성 세포의 비율이 비당뇨병과 마찬가지로 회복하는 경향이 관찰될 것으로 예상된다. 적출 흉선의 사이즈 비교를 도 30에 나타낸다. 당뇨병 미발증의 NOD 마우스에서는 흉선의 위축은 미미했지만, 당뇨병을 발증한 순간에 격렬한 위축이 보여졌다. 인슐린 펠릿+비당뇨병 골수 이식의 처치군만 비당뇨병과 마찬가지의 흉선 사이즈가 관찰될 것으로 예상된다.
인슐린 펠릿+비당뇨병 골수 이식의 처치에 의해 당뇨병이 치료될 것으로 예상된다.
(실시예 11: NOD 마우스에 있어서의 당뇨병 치료)
줄기 세포 유주제 및 HDAC 저해제를 사용하여 NOD 마우스에 있어서의 당뇨병을 치료한다.
처치의 개요를 도 31에 나타낸다. 고혈당을 보인 NOD 마우스에 대하여 인슐린 펠릿 투여에 의해 혈당값을 정상화시킨 후, 줄기 세포 유주제로서 플레릭사포(5mg/kg)와 CXCL2 아고니스트(0.1mg/kg)의 혼합액을 생리 식염수와 함께 100ul, 피하 주사한 직후, 200ul의 트리코스타틴 A(1mg/kg)를 미정맥 투여한다. 대조로서 블랭크 펠릿 투여로 고혈당이 지속된 상태에서 플레릭사포(5mg/kg)와 CXCL2 아고니스트(0.1mg/kg)의 혼합액을 생리 식염수와 함께 100ul, 피하 주사한 직후, 200ul의 트리코스타틴 A(1mg/kg)를 미정맥 투여하는 군과, 인슐린 펠릿 투여만으로 혈당값을 정상화하는 군을 작성하였다. 마우스에게의 투여는, 3일마다 실시하고, 그 때마다 혈당값과 체중을 측정한다. 치료 개시 후 8주일 후에, 관류 고정을 실시한다.
실시예 8과 마찬가지로, 혈당값 및 체중을 측정하고, 췌장 조직의 항체 염색을 행하고, 흉선을 채취한다.
혈당값의 변화도를 도 31에 나타낸다. 인슐린 펠릿을 투여하고, 줄기 세포 유주제 및 트리코스타틴으로 치료한 군에 있어서만, 인슐린 펠릿의 효과 종료 후에도 혈당값이 낮게 유지된다고 생각된다. 췌장 동결 절편의 인슐린 DAB 염색 결과(일부 실제의 화상)를 도 32에 나타내고, 글루카곤 DAB 염색의 결과를 도 33에 나타낸다. 인슐린 펠릿을 투여하고, 줄기 세포 유주제 및 트리코스타틴으로 치료한 군에 있어서만, 인슐린 또는 글루카곤 양성 세포의 비율이 비당뇨병과 마찬가지로 회복되는 경향이 관찰될 것으로 예상된다. 적출 흉선의 사이즈 비교를 도 35에 나타낸다. 인슐린 펠릿을 투여하고, 줄기 세포 유주제 및 트리코스타틴으로 치료한 군만 비당뇨병과 마찬가지의 흉선 사이즈가 관찰될 것으로 예상된다.
인슐린 펠릿+줄기 세포 유주제 및 HDAC 저해제의 처치에 의해 당뇨병이 치료될 것으로 예상된다.
(실시예 12: 인간에게의 적용)
인간 당뇨병 환자에 있어서 골수 유래 이상 조혈 줄기 세포를 동정하고, 그것을 표적으로 하여 당뇨병을 치료한다.
연구 계획 1. 당뇨병 환자에 있어서의 골수 유래 이상 조혈 줄기 세포의 동정
(대상)
비당뇨병군에 대하여는, 시가 의과 대학 및 부속 병원 직원이, 내당능 장애의 기왕이 없고, 현재도 당뇨병 치료를 받고 있지 않은 지원자를 모아, 수시 혈당값 및 HbA1c를 측정하고, 수시 혈당값<140mg/dl 그리고 HbA1c<6.0%를 충족한 사람을 비당뇨병이라고 정의하고, 컨트롤 군으로서 20명 등록한다. 당뇨병군에 대해서는, HbA1c가 6.5% 이상 혹은 당뇨병 치료 중이라고 정의하고, 시가 의과 대학 부속 병원 당뇨병 내분비 내과 외래 통원 환자 중에서 전자 카르테로부터 비당뇨병군과 성·연령을 매치시킨 리스트를 작성하고, 무작위로 80명(1형 당뇨병 40명, 2형 당뇨병 40명)을 등록한다.
(연구 방법)
피험자의 문진을 행하고, 신장, 체중을 측정하고, 혈액 검사, 뇨검사를 행하여, 당뇨병의 유무를 판정한다. 채취한 혈액으로부터 단핵 세포를 추출하고, CD34 표지 골수 전구 세포를 채취하여 고정하고, 면역 염색에 의해 형태나 발현 단백질을 동정한다. 또한, mRNA를 추출한 후, cDNA를 조제하고, 정량적 PCR에 의해 mRNA의 발현량을 정량한다. 구체적으로는, 말초혈 중의 CD34 양성 그리고 CD106 양성(CD34/CD106) 골수 전구 세포에 있어서, TNF-α mRNA 및 인슐린 mRNA의 발현량 등을 측정한다. 이러한 세포에 있어서의 단백질의 발현 유무도 측정한다. 또한, 당뇨병 환자에 있어서의 당뇨병 합병증의 유무와 혈당 컨트롤의 관련성을 분석한다. 대표적인 합병증인 당뇨병성 신경 장애, 망막증, 신증, 지방간, 지질 이상증의 유무 그리고 대혈관 장애를 알기 위하여, 신경 전도 속도 검사, 심전도 R-R 간격 검사, 안저 망막 검사, 요중 알부민 배출률, 복부 CT를 사용한 복강 내 지방량의 정량, 혈액 지질 검사, 심전도, 경동맥 에코 검사, 하지 동맥 에코 검사를 행한다.
(결과)
(1) 비당뇨병군 그리고 2형 당뇨병군에서는 말초혈 중의 CD34/CD106 골수 전구 세포에 있어서, TNF-α mRNA 및 인슐린 mRNA의 발현이 보여지지만, 2형 당뇨병군에서의 발현량이 증가한다. 한편, 1형 당뇨병군에서는 CD34/CD106 골수 전구 세포에 있어서, TNF-α mRNA의 발현은 비당뇨병에 비하여 증가하지만, 인슐린 mRNA는 전혀 발현되지 않는다.
(2) 비당뇨병군에서는 말초혈 중의 CD34/CD106 골수 전구 세포에 있어서, TNF-α 및 프로인슐린의 단백질을 발현시키고 있는 세포는 거의 없다. 이것에 비하여, 2형 당뇨병에서는 어느 쪽이든 발현되어 있는 세포가 증가한다. 한편, 1형 당뇨병에서는 TNF-α 단백질을 발현하는 세포는 증가하지만, 프로인슐린을 발현시키고 있는 세포는 전무하다.
(3) 1형 당뇨병 환자에 있어서, 대표적인 합병증인 당뇨병성 신경 장애, 망막증, 신증, 지방간, 지질 이상증의 발증은 말초혈 중의 CD34/CD106 골수 전구 세포에 있어서의 TNF-α 단백질 양성 세포의 증가와 관련된다. 한편, 2형 당뇨병 환자에 있어서는 당뇨병성 신경 장애, 망막증, 신증, 지방간, 지질 이상증의 발증은 말초혈 중의 CD3/CD106 골수 전구 세포에 있어서의 TNF-α 단백질 양성 세포의 증가 그리고 프로인슐린 양성 세포의 증가와 관련된다.
(고찰과 결론의 예상)
1) 비당뇨병에서는 약간이기는 하지만 혈 중에 인슐린 mRNA 및 TNF-α mRNA를 발현하는 CD34/CD106 골수 전구 세포가 존재한다. 이 세포는 췌도 및 흉선으로 호밍했을 때에 자기 항원을 제시하는 내피 세포로서 기능하고 있을 것으로 상정된다.
2) 2형 당뇨병에서는 고혈당에 의해 이 세포(인슐린 mRNA 및 TNF-αmRNA를 발현하는 CD34/CD106 골수 전구 세포)가 골수 내 및 혈 중에 있는 상태에서, 이미 프로인슐린 그리고 TNF-α 단백질을 발현함과 동시에, 이상한 기능을 가진 혈관 내피로서 분화하거나, 이상한 세포 융합능을 가짐으로써 인슐린 저항성이나 여러가지 합병증의 원인이 될 것으로 상정된다. 원래라면, 이 세포는 이상 세포이므로, 흉선 유래의 세포 장애성 T 세포에 이상 세포로서 인식되어, 파괴되는 운명에 있다. 그러나, 흉선으로 호밍한 프로인슐린 그리고 TNF-α 단백질을 동시에 발현하는 흉선 내피 세포의 활동으로, 이것을 공격할 것인 세포 장애성 T 세포는 음의 선택을 받고, 그 결과, 골수, 혈 중, 췌도, 추가로 여러가지 장기로 유주한 모든 프로인슐린 그리고 TNF-α 단백질을 발현하는 이상 세포는 자기 세포로서 인식되어, T 세포에 의한 파괴를 면하게 된다. 그 때문에, 이상 세포가 발현하는 TNF-α에 의해, 인슐린 분비 장애, 인슐린 저항성이 생기고, 합병증이 출현한다. 또한, CD34/CD106/TNF-α 혹은 CD34/CD106/프로인슐린 양성 세포는 골수 내에서 줄기 세포로서 계속하여 잔존하므로 당뇨병은 자연 관해되지는 않는 것이다.
3) 1형 당뇨병에서는 골수로부터 발생하는 B 세포의 기능 장애에 의해, 췌도 관련의 자기 항원에 대하여 자기 항체(항GAD 항체, 항IA-2 항체, 항인슐린 항체 등)가 생겼다. 이 자기 항체는 췌도를 공격할 뿐만 아니라, 흉선의 자기 항원 제시 세포도 공격하고 있다. 이 자기 항원 제시 세포란 조금 전에 언급한, 췌도 그리고 흉선의 혈관 내피 세포도 포함된다. 자기 항체에 의한 자기 세포의 공격은 만성적으로 지속하여 상해와 보수가 반복되어 있다. 그러나, 바이러스 감염증이나 여러가지 스트레스 등에 의해 급격한 염증이 야기되면, 항체에 의한 상해가 피크에 달하여, 흉선 내의 자기 항원 제시 세포가 완전히 파괴되어 버린다. 이 시점에서 자기 항원인 췌도 관련 항원에 반응하는 세포 장애성 T 세포의 공격에 의해 췌도는 급격하게 파괴되고, 인슐린 분비가 저하된다. 이것에 의해 혈당값이 상승한다. 이 혈당 상승에 의해 2형과 마찬가지로 골수 내에서는 CD34/CD106 양성 프로인슐린 그리고 TNF-α 양성 세포가 만들어진다. 그러나, 프로인슐린을 산생하는 이상 세포도 모조리 세포 장애성 T 세포에 파괴되게 되고, 인슐린, 프로인슐린을 산생하는 세포는 생체로부터 완전히 소실된다. 그러나, CD34/CD106/TNF-α 이상 조혈 줄기 세포는 골수 내에 계속하여 잔존하고, 흉선의 파괴, 췌도의 파괴는 영속되게 된다.
연구 계획 2. 골수 유래 이상 조혈 줄기 세포를 표적으로 한 당뇨병의 치료
(대상)
연구 계획 1에 따라, 시가 의과 대학 그리고 공동 연구 시설에 있어서, 당뇨병 환자 280명(1형 당뇨병 140명, 2형 당뇨병 140명)을 등록한다. 1형, 2형 어느 것에 있어서도 당뇨병은 일단 발증하면 치유되지 않는다고 여겨지고 있다. 그러나, 1형 당뇨병에 있어서는 인슐린을 사용한 엄중한 혈당 관리에 의해 일시적인 관해를 나타내는 허니문기가 출현하는 것으로 알려져 있다. 그 기간은 보고에 따라 다양하기는 하지만, 일반적으로는 1개월에서 13년(Wallensteen M, Dahlquist G, Persson B, Landin-OlssonM, Lernmark A, Sundkvist G, Thalme B(1988) Factors influencing the magnitude, duration, and rate off all of β-cell function in type 1(insulin-dependent) diabetic children followed for two years from their clinical diagnosis. Diabetologia 31: 664-669)이라는 보고가 있다. 따라서, 본 치료 계획을 시행함으로써, 허니문기가 발생한 것인지, 질환 자체가 치유된 것인지의 구별이 곤란해지는 것으로 생각된다. 또한, 2형 당뇨병에 있어서도, 엄격한 컨트롤에 의해 인슐린 저항성은 경도로 되는 것으로 보고되어 있다(H.E. Lebovitz( 2001) Insulin resistance: definition and consequences. Clin Endocrinol Diabetes 109 Suppl 2: S135-S148). 이에 따라, 인슐린이나 경구제 등의 치료약량, 그리고 내인성의 인슐린 분비 능력의 개선이 보여질 가능성이 있다. 따라서, 1형 및 2형의 어느 쪽에 있어서도, 이번의 치료 연구에서는, 인슐린 단독에 의해 치료하는 군과 신규 치료법을 하는 군을 제작하여, 비교 검토할 필요가 있다.
(연구 방법)
피험자의 문진을 행하고, 신장, 체중을 측정하고, 혈액 검사, 뇨검사를 행하여, 당뇨병의 유무를 판정한다. 채취한 혈액으로부터 단핵 세포를 추출하고, CD34 표지 골수 전구 세포를 채취하여 고정하고, 면역 염색에 의해 형태나 발현 단백질을 동정한다. 또한, mRNA를 추출한 후, cDNA를 조제하고, 정량적 PCR에 의해 mRNA의 발현량을 정량한다. 구체적으로는, 말초혈 중의 CD34 양성 그리고 CD106 양성 골수 전구 세포에 있어서, TNF-α mRNA 및 인슐린 mRNA의 발현량 등을 측정한다. 이러한 세포에 있어서의 단백질의 발현 유무도 측정한다. 또한, 당뇨병 환자에 있어서의 당뇨병 합병증의 유무와 혈당 컨트롤과의 관련성을 분석한다. 대표적인 합병증인 당뇨병성 신경 장애, 망막증, 신증, 지방간, 지질 이상증의 유무 그리고 대혈관 장애를 알기 위하여, 신경 전도 속도 검사, 심전도 R-R 간격 검사, 안저 망막 검사, 요중 알부민 배출률, 복부 CT를 사용한 복강 내 지방량의 정량, 혈액 지질 검사, 경동맥 에코 검사, 하지 동맥 에코 검사를 행한다.
1형 예를 무작위로 20예씩의 7군, 2형 예를 20예씩의 7군으로, 각각 분류한다. 1형 및 2형에 있어서, 각각 20예는 인슐린 치료만으로 3개월간 컨트롤하고(컨트롤군), 나머지의 120예 중 60예는 인슐린 치료를 개시함과 동시에 이하의 2종류의 치료를 각각 20예에 대하여 개시한다(유주제 없음의 치료군). 1) 항TNF-α 항체(아달리무맙 40mg 혹은 인플릭시맙 3mg/kg), 2) 트리코스타틴(0.5mg/kg)을 1주일에 1회 정맥 내 투여하고, 이것들을 12주일 계속한다. 나머지의 60예는 인슐린 치료를 개시함과 동시에 이하의 2종류의 치료를 각각 20예에 대하여 개시한다(유주제 있음의 치료군). 세포 유주제인 Groβ(100μg/kg)+플레릭사포(0.24mg/kg)와 함께, 1) 항TNF-α 항체(아달리무맙 40mg 혹은 인플릭시맙 3mg/kg), 2) 트리코스타틴(0.5mg/kg)을 1주일에 1회 정맥 내 투여하고, 이것들을 12주일 계속한다.
(치료 효과의 판정 방법)
환자는 1일 6회의 자기 혈당 측정을 행한다. 혈당 컨트롤의 목표는 인슐린 치료에 의해 식전 혈당값 140mg/dl 이하, 식후 2시간 혈당값 200mg/dl 이하로 한다. 컨트롤 기준을 충족하도록 적극적으로 인슐린량의 증감을 도모하고, 최종적으로 12주째에 있어서의 혈당 컨트롤을 위한 인슐린 필요량으로써, 치료 연구 기간을 종료한다. 치료 효과의 판정은, 치료 전, 치료 종료 시, 치료 종료 후 3, 6, 9, 12개월째에 있어서, 하기의 판정 항목을 치료 효과로서 추적 판정한다.
(판정 항목)
(A) 이상 조혈 줄기 세포를 소실시키는 효과
말초 혈액 중에 있는 CD34/CD106 골수 전구 세포 중에 있어서의 발현 단백질(CD34, 프로인슐린, TNF-α, CD106 등) 및 발현 유전자(CD34 mRNA, 인슐린 mRNA, TNF-α mRNA, CD106 mRNA 등)를 정량한다.
(B) 당뇨병을 치유시키는 효과
혈당값, HbA1c, 요중 CPR, 지질, 글루카곤 부하 시험을 사용한 인슐린 분비 능력을 치료 전후에서 행한다. 췌도 관련 항체의 측정 그리고 그 소실의 유무를 밝힌다.
(C) 합병증에 대한 치료 효과
대표적인 합병증으로서 당뇨병성 신경 장애, 망막증, 신증, 지방간, 지질 이상증, 대혈관 장애의 유무 그리고 변화를 치료 전후에서 비교 검토한다.
(결과)
1) 인슐린 단독으로의 치료에 의해 이하가 명확해진다.
(A) 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 모두, 이상 조혈 줄기 세포는 소실되지 않는다.
(B) 당뇨병을 치유시키는 효과는 보여지지 않는다.
(C) 합병증에 대한 치료 효과는 다소 보여지지만, 치유되지 않는다.
2) 세포 유주제의 유무에 관계없이 신규 치료에 의해 이하가 명확해진다.
(A) 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 모두 이상 조혈 줄기 세포가 소실된다.
(B) 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 모두 일단 치유된다.
(C) 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 모두 합병증의 진행이 정지되고, 명확한 치료 효과가 보여진다.
3) 세포 유주제를 첨가한 신규 치료에 의해 이하가 명확해진다.
(A) 유주제 없음에 비교하여 유주제를 첨가한 신규 치료에 의해, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 모두 이상 조혈 줄기 세포가 보다 조기에 소실된다.
(B) 유주제 없음에 비교하여 유주제를 첨가한 신규 치료에 의해, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 모두 치유율의 향상이 보여진다.
(C) 유주제 없음에 비교하여 유주제를 첨가한 신규 치료에 의해, 1형 당뇨병, 2형 당뇨병 모두 합병증의 치유율의 향상이 보여진다.
(고찰과 결론의 예상)
1) 1형에서는 인슐린 단독 치료이더라도, 혈당 컨트롤 효과에 의해 허니문기가 발생할 가능성이 있다. 그러나, 이 경우, 결국 다시 관해가 종료되고, 인슐린 분비능은 다시 결핍되게 된다.
2) 2형 당뇨병에서는 인슐린 단독 치료에 의해, 혈당 컨트롤이 좋아지고, 인슐린 치료가 필요없어질 가능성이 있지만, 이상 조혈 줄기 세포가 소실되지 않기 때문에, 당뇨병이 치유되지 않는다.
3) 세포 유주제를 첨가한 신규 치료에 의해, 1형 당뇨병이 치유되어도, 자기 항체를 산생하는 원인이 된 자기 면역이 재연되면, 가능성은 남아 있다. 그러나, 다시 세포 유주제를 첨가한 신규 치료를 행하면 된다.
4) 2형 당뇨병에서 세포 유주제를 첨가한 신규 치료에 의해 완전히 치유되어도, 에너지의 과잉 섭취나 운동 부족에 의해 다시 고혈당이 일어나게 되면 이상 조혈 줄기 세포가 출현되게 될 가능성이 있다. 이 경우도 세포 유주제를 첨가한 신규 치료를 다시 행하면 치료 가능하다.
(실시예 13: 그 밖의 요법)
상기의 이상 조혈 줄기 세포의 억제를 위하여 HDAC 저해제로서, 경구 투여가 가능한 기비노스탓을 1일 2회 복용에 의해 투여한다. 치료 기간은 진성 다혈증 및 듀시엔형 근이영양증의 치험에 준한다.
(실시예 14: 다른 HDAC 저해제의 사용)
상기 이상 조혈 줄기 세포의 억제를 위하여 HDAC 저해제로서, 경구 투여가 가능한 핑골리모드염산염을 1일 1회 복용에 의해 투여한다. 치료 기간은 다발성 경화증의 치험에 준한다. 또한, HDAC 저해제로서 핑골리모드염산염은, 면역 제어제로서 다발성 경화증의 적응이 취해지고 있다. 따라서, 투여량 그리고 치료 기간은 기초 연구의 진행에 의해 변경시킬 필요성이 생길 수 있다.
(주기)
이상과 같이, 본 개시의 바람직한 실시 형태를 사용하여 본 개시를 예시해 왔지만, 본 개시는, 특허청구의 범위에 의해서만 그 범위가 해석되어야 하는 것으로 이해된다. 본 명세서에 있어서 본 명세서에서 인용한 특허, 특허 출원, PCT/JP2020/039044(2020년 10월 16일 출원), PCT/JP2020/039045(2020년 10월 16일 출원) 및 다른 문헌은, 그 내용 자체가 구체적으로 본 명세서에 기재되어 있는 것과 마찬가지로 그 내용이 본 명세서에 대한 참고로서 원용되어야 하는 것으로 이해된다.
본 출원은, 2021년 2월 26일에 일본 특허청에 출원된 일본 특허 출원 2021-30812호에 대한 우선권의 이익을 주장하고, 그 내용 전체가 본 명세서에 인용된다.
본 개시는, 줄기 세포를 표적으로 하는 당뇨병 치료의 개선을 제공하고, 이 지견에 기초하여, 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상의 치료나 예방, 그리고 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상, 혹은 그 리스크의 진단을 행하기 위한 새로운 수법이 제공된다.

Claims (23)

  1. 이상 조혈 줄기 세포(HSC)의 억제제를 포함하는 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하기 위한 조성물로서, 해당 억제제는 히스톤 탈아세틸화 효소(HDAC) 저해제를 포함하고, 해당 조성물은 줄기 세포 유주제와 조합하여 투여되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  2. 제1항에 있어서, 상기 이상 HSC는, HDAC의 유전자 또는 단백질이 통상의 레벨에서 발현되지 않거나 및/또는 기능하고 있지 않은 것인, 조성물.
  3. 제2항에 있어서, 상기 통상의 레벨이 아닌 발현은 과잉 발현인, 조성물.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상을 치료하기 위한, 조성물.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 억제제는, 항CD106 항체, 항TNF-α 항체 또는 그 기능적 개변체로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 추가로 포함하는, 조성물.
  6. 제2항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 이상 HSC는, 추가로, 종양 괴사 인자 알파(TNF-α), CD106, 및 프로인슐린으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 유전자 또는 단백질이 통상의 레벨에서 발현되어 있지 않은 것인, 조성물.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환, 장애 및/또는 증상은, 당뇨병 합병증을 포함하는, 조성물.
  8. 제1항 내지 제6항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 질환, 장애 및/또는 증상은, 신경 장애, 신증, 간장 장애, 망막증, 지방간, 위장 장애, 골절 치유 지연, 섭식 장애, 및 피부 장애로 이루어지는 군으로부터 선택되는, 조성물.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기 세포 유주제는, 상기 이상 HSC를 니치로부터 유주시키는 능력을 가진, 조성물.
  10. 제1항 내지 제9항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기 세포 유주제는, CXCR4 길항제, CXCR2 자극제, 상피 성장 인자 수용체(EGFR) 저해제, 과립구 콜로니 자극 인자(G-CSF)제로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나의 약제를 포함하는, 조성물.
  11. 제1항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 줄기 세포 유주제는, 플레릭사포르, GROβ2(MIP2), 게피티닙, 에를로티닙, 아파티닙, 오시머티닙, 필그라스팀, 나르토그라스팀, 레노그라스팀, 페그필그라스팀으로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 조성물.
  12. 제1항 내지 제11항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 HDAC 저해제는, TSA(트리코스타틴 A), VPA(발프로산), 부티르산 나트륨(NaBu), SAHA(수베로일아닐리드히드록삼산 또는 보리노스탓), 나트륨페닐부티레이트, 뎁시펩티드(FR901228, FK228), 트라폭신(TPX), 환식 히드록삼산 함유 펩티드 1(CHAP1), MS-275, LBH589, 기비노스탓, 핑골리모드(FTY720) 및 PXD101로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 하나를 포함하는, 조성물.
  13. HDAC 저해제를 포함하는 이상 조혈 줄기 세포(HSC)의 억제제와, 줄기 세포 유주제의 조합을 포함하는 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하기 위한 의약.
  14. 줄기 세포 유주제를 포함하는 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하기 위한 조성물로서, 해당 줄기 세포 유주제는, HDAC 저해제를 포함하는 이상 조혈 줄기 세포(HSC)의 억제제와 조합하여 투여되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  15. HDAC의 검출제를 포함하는 이상 조혈 줄기 세포(HSC) 검출제를 포함하는 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상 혹은 그 리스크를 진단하기 위한 조성물.
  16. HDAC의 검출제를 포함하는 이상 조혈 줄기 세포(HSC)의 유주 및/또는 잔류를 검출하는 약제를 포함하는 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방을 위한 처치의 선택을 위한 조성물.
  17. 제16항에 있어서, 상기 유주 및/또는 잔류가, 골수의 니치로부터의 유주 및/또는 골수의 니치에 있어서의 잔류인, 조성물.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 상기 유주의 검출은, CD106 또는 기능적 등가물의 검출에 의해 달성되는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  19. 제15항 내지 제18항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 조성물의 사용에 의해 당뇨병 또는 그 리스크를 가진다고 진단된 피험체는, HDAC 저해제가 투여되어야 하는 것으로 나타내어지는 것을 특징으로 하는, 조성물.
  20. 피험체에 있어서 당뇨병 또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상을 치료 및/또는 예방하는 방법으로서, 해당 피험체에 대하여 HDAC 저해제를 포함하는 이상 조혈 줄기 세포(HSC)를 저감 또는 소실시키는 약제 및 줄기 세포 유주제를 유효량 투여하는 공정을 포함하는, 방법.
  21. 피험체에 있어서 당뇨병 또는 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상 혹은 그 리스크를 진단하는 방법으로서, 해당 피험체에 있어서의 이상 조혈 줄기 세포(HSC)를 HDAC의 유전자 또는 단백질의 발현에 기초하여 검출하는 공정을 포함하는, 방법.
  22. 이상 조혈 줄기 세포(HSC)의 유주 및/또는 잔류를, 피험체에 있어서 당뇨병 또는 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상의 치료 및/또는 예방을 위한 처치의 지표로 하는 방법으로서, 해당 피험체에 있어서의 이상 조혈 줄기 세포(HSC)의 유주 및/또는 잔류를 HDAC의 유전자 또는 단백질의 발현에 기초하여 검출하는 공정을 포함하는, 방법.
  23. 피험체에 있어서 당뇨병 및/또는 당뇨병과 관련되는 질환, 장애 및/또는 증상을 처치하는 방법으로서,
    해당 피험체에 있어서의 이상 조혈 줄기 세포(HSC)를 HDAC의 유전자 또는 단백질의 발현에 기초하여 검출하는 공정과
    이상 조혈 줄기 세포(HSC)가 검출된 피험체에, 제1항 내지 제12항 혹은 제14항에 기재된 조성물 또는 제13항에 기재된 의약의 유효량을 투여하는 공정
    을 포함하는, 방법.
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