JP6442403B2 - 代謝調節のための方法および組成物 - Google Patents

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Description

関連出願
本出願は、合衆国法典第３５巻１１９条（ｅ）に基づき、２０１２年７月１１日付けで出願された米国仮出願第６１／６７０３４５号の利益を主張し、その内容は参照によりその全体が本明細書に組み入れられる。
政府の権利
本発明は、国立衛生研究所（Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ）によって付与されたＲ２１ ＣＡ１２７０９９のもとでの政府支援によりなされた。政府は本発明において一定の権利を有する。
発明の分野
本発明は、部分的に、代謝機能を調節するのに有用な方法および化合物に関する。
コシャペロンは、シャペロン、主としてヒートショックタンパク質（ＨＳＰ）の活性を、直接的に、または他のタンパク質の補充を介して間接的にのどちらかで調整する（Ｗａｌｓｈら、２００４、ＥＭＢＯ Ｒｅｐ ５、５６７〜５７１）。シャペロンの調節および役割は広範囲にわたり研究されているが、同定された多数のコシャペロンの機能についてはほとんどわかっていない。コシャペロンのＤｎａＪファミリーが最も大きく且つ最も多様であり、ヒトでは４９の種のメンバーが同定されている。このファミリーは、ＨＳＰ７０ファミリーメンバーのＡＴＰアーゼドメインに結合し、それらのＡＴＰアーゼ活性を促進するＨｉｓ−Ｐｒｏ−Ａｓｐモチーフを含有する高度に保存された７０アミノ酸のＪ−ドメインの存在を特徴とする（Ｗａｌｓｈら、２００４、ＥＭＢＯ Ｒｅｐ ５、５６７〜５７１；Ｍｉｔｒａら、２００９、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ２６、５５９〜５６７；Ｓｔｅｒｒｅｎｂｅｒｇら、２０１１、Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ ３１２、１２９〜１４２）。このファミリーのメンバーは、Ｊ−ドメイン以外の配列の存在および性質に従って３つのサブファミリー（ＤｎａＪＡ、ＤｎａＪＢ、およびＤｎａＪＣサブファミリー）に分類されている（Ｋａｍｐｉｎｇａら、２００９、Ｃｅｌｌ Ｓｔｒｅｓｓ Ｃｈａｐｅｒｏｎｅｓ １４、１０５〜１１１）。ＤｎａＪＡサブファミリーはＧｌｙ／Ｐｈｅ（Ｇ／Ｆ）リッチ領域とＣｙｓ反復領域とを含有し、一方でＤｎａＪＢサブファミリーはＧ／Ｆ領域を含有するがＣｙｓ−反復領域を欠失している。ＤｎａＪＣサブファミリーのメンバーは高い多様性を有する。それらはＧ／ＦとＣｙｓ−反復領域の両方を欠失しているが、それらのＪドメインは、タンパク質中のどこかの位置に配置されている可能性がある。しかしながら、ほとんどのＤｎａＪＣのメンバーにおいて、パートナーの結合および機能に関する特異性を与えるように見える非典型的なドメインはあまり特徴付けられていない。
ＤｎａＪコシャペロンは、ＤｎａＪ−ドメインとは独立した方式でＨＳＰ以外のタンパク質と相互作用して、特異的な機能を仲介する可能性がある（Ｓｔｅｒｒｅｎｂｅｒｇら、２０１１ Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ ３１２、１２９〜１４２）。しかしながら、ごくわずかな標的しか同定されていない。ミトコンドリア内では、ＤＮＡポリメラーゼガンマ（Ｐｏｌｇａ）がＴｉｄ１と相互作用することが示されており（Ｈａｙａｓｈｉら、２００６ Ｎａｔ Ｍｅｄ １２、１２８〜１３２）、より近年の研究では、可能性のある別の標的としてｐ５３も同定されている（Ａｈｎら、２０１０ Ｏｎｃｏｇｅｎｅ ２９、１１５５〜１１６６）。近年、ＤｎａＪＡ１も、Ｂ細胞中のアデノシン誘導デアミナーゼ（ＡＩＤ：Ａｄｅｎｏｓｉｎ Ｉｎｄｕｃｅｄ Ｄｅａｍｉｎａｓｅ）と相互作用して、クラススイッチ組換え中にその活性を調整することも見出されている（Ｏｒｔｈｗｅｉｎら、ＥＭＢＯ Ｊ ２０１１年１１月１５日；３１（３）：６７９〜９１）。癌におけるＤｎａＪコシャペロンの役割は、これらのタンパク質の機能面であり、主として細胞株においてではあるが調査が始まっている（Ｍｉｔｒａら、２００９、Ｃｌｉｎ Ｅｘｐ Ｍｅｔａｓｔａｓｉｓ ２６、５５９〜５６７）。加えてヒトＤｎａＪタンパク質のオーソログも、マウスではごくわずかしか同定されていない（例えば、ＤｎａＪＣ１０／ＥＲｄｊ５、ＤｎａＪＢ６／Ｍｒｊ、およびＤｎａＪＡ３／Ｔｉｄ１、ＤｎａＪＡ１／ＤｊＡ１）（Ｔｅｒａｄａら、２００５、ＥＭＢＯ Ｊ ２４、６１１〜６２２；Ｈｏｓｏｄａら、２０１０、Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｊ ４２５、１１７〜１２５；Ｌｏら、２００４、Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２４、２２２６〜２２３６；Ｈｕｎｔｅｒら、１９９９、Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ １２６、１２４７〜１２５８）。
公知のドメインがなく、特徴付けが不十分な非典型的なドメインしかないために、ほとんどのＤｎａＪＣファミリーメンバーの機能を特徴付けることは困難である。結果として、多数のＤｎａＪコシャペロンがヒトで同定されているにもかかわらず、正常状態および疾患状態におけるそれらの機能は大部分が依然として不明である。
本発明の一態様によれば、対象における代謝性疾患または状態を処置する方法が提供される。本方法は、このような処置が必要な対象に、ＭＣＪ調節化合物（ＭＣＪ−ｍｏｄｕｌａｔｉｎｇ ｃｏｍｐｏｕｎｄ）を、対象における代謝性疾患または状態を処置するのに有効な量で投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、ＭＣＪ調節化合物は、対象においてＭＣＪポリペプチド活性を減少させ、対象においてミトコンドリアの代謝活性を増加させる。いくつかの実施形態において、ＭＣＪポリペプチド活性を減少させることは、ＭＣＪポリペプチドのレベルまたは機能を減少させることを含む。いくつかの実施形態において、ＭＣＪ調節化合物は、対象においてＭＣＪポリペプチド活性を増加させ、対象においてミトコンドリアの代謝活性を減少させる。いくつかの実施形態において、ＭＣＪポリペプチド活性を増加させることは、ＭＣＪポリペプチドのレベルまたは機能を増加させることを含む。所定の実施形態において、本方法はまた、対象のカロリー摂取レベルを低減させるステップも含む。いくつかの実施形態において、対象へのＭＣＪ調節化合物の投与の前に、それと同時に、および／またはその後に、カロリー摂取レベルを低減させる。いくつかの実施形態において、代謝性疾患または状態は、過体重、体重増加、肥満症、非アルコール性脂肪性肝疾患、糖尿病、インスリン抵抗性、アルコール性脂肪性肝疾患、脂質代謝異常、脂肪変性（例えば、肝臓の脂肪変性、心臓の脂肪変性、腎臓の脂肪変性、筋肉の脂肪変性）、無β−リポタンパク血症、グリコーゲン蓄積症、ウェーバー−クリスチャン病、リポジストロフィー；肝疾患、肝臓の炎症、肝炎、脂肪性肝炎、Ｃ型肝炎、遺伝子型３のＣ型肝炎、アルファ１−アンチトリプシン欠損症、妊娠性急性脂肪肝、ウィルソン病；腎疾患；心疾患、高血圧、虚血、心不全、心筋症；中毒；ＨＩＶ；神経変性疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病；癌、または身体運動である。本発明のいくつかの実施形態において、代謝性疾患または状態は高コレステロールであり、ＭＣＪ活性を低減させることは、細胞、組織、または対象においてコレステロールを低減させるための方法において使用されうる。所定の実施形態において、代謝性疾患または状態は、摂食障害、食欲低下、飢餓、栄養不良、完全非経口栄養、重度の体重減少、低体重、再栄養症候群（ｒｅ−ｆｅｅｄｉｎｇ ｓｙｎｄｒｏｍｅ）；消化管手術が介在する代謝の変化、空腸回腸バイパス、胃バイパス；および炎症性／感染性の状態、細菌異常増殖を伴う空腸憩室症（ｊｕｊｕｎａｌ ｄｉｖｅｒｔｉｃｕｌｏｓｉｓ）、および炎症性腸疾患である。いくつかの実施形態において、対象は、絶食している対象である。いくつかの実施形態において、代謝性疾患または状態を処置することは、細胞傷害性Ｔ細胞の活性を強化または阻害することを含む。いくつかの実施形態において、ＭＣＪ調節化合物は、医薬組成物で投与される。所定の実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容される担体をさらに含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、標的化剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、標的化剤は、ミトコンドリア標的化剤（ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｔａｒｇｅｔｉｎｇ ａｇｅｎｔ）である。いくつかの実施形態において、ＭＣＪ調節化合物は、ＭＣＪ分子、抗ＭＣＪポリペプチド抗体もしくはその機能的なフラグメント、小分子ＭＣＪ阻害剤、または小分子ＭＣＪエンハンサーを含む。所定の実施形態において、ＭＣＪ分子は、ＭＣＪポリペプチドまたはＭＣＪポリペプチドをコードする核酸である。いくつかの実施形態において、対象は、癌を有さない。いくつかの実施形態において、代謝性疾患または状態は、癌ではない。所定の実施形態において、本方法はまた、対象のカロリー摂取レベルを増加させるステップも含む。いくつかの実施形態において、対象へのＭＣＪ調節化合物の投与の前に、それと同時に、および／またはその後に、カロリー摂取レベルを増加させる。
本発明の別の態様によれば、細胞中のミトコンドリア代謝を変更する方法が提供される。本方法は、細胞を、細胞中のミトコンドリア代謝を変更するのに有効な量の外因性ＭＣＪ調節化合物と接触させるステップを含み、ＭＣＪポリペプチド活性を増加させるＭＣＪ調節化合物は、細胞中のミトコンドリア代謝を減少させ、ＭＣＪポリペプチド活性を減少させるＭＣＪ調節化合物は、細胞中のミトコンドリア代謝を増加させる。いくつかの実施形態において、ＭＣＪポリペプチド活性を増加させることは、細胞中のＭＣＪポリペプチドのレベルまたは機能を増加させることを含む。所定の実施形態において、ＭＣＪポリペプチド活性を減少させることは、細胞中のＭＣＪポリペプチドのレベルまたは機能を減少させることを含む。いくつかの実施形態において、ミトコンドリア代謝は、ミトコンドリア呼吸を含む。いくつかの実施形態において、細胞は、インビトロである。いくつかの実施形態において、細胞は、インビボである。所定の実施形態において、細胞は対象中にあり、接触させるステップは、対象にＭＣＪ調節化合物を投与するステップを含む。いくつかの実施形態において、対象は、絶食している対象である。いくつかの実施形態において、対象は、カロリー摂取レベルが高い対象である。所定の実施形態において、ＭＣＪ調節化合物は、医薬組成物で投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容される担体も含む。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、標的化剤をさらに含む。いくつかの実施形態において、標的化剤は、ミトコンドリア標的化剤である。所定の実施形態において、ＭＣＪ調節化合物は、ＭＣＪ分子、抗ＭＣＪポリペプチド抗体もしくはその機能的なフラグメント、小分子ＭＣＪ阻害剤、または小分子ＭＣＪエンハンサーを含む。いくつかの実施形態において、ＭＣＪ分子は、ＭＣＪポリペプチドまたはＭＣＪポリペプチドをコードする核酸である。いくつかの実施形態において、ＭＣＪ調節化合物は、ミトコンドリア標的化剤を含む。所定の実施形態において、対象は、代謝性疾患または状態を有する。いくつかの実施形態において、代謝性疾患または状態は、過体重、体重増加、肥満症、非アルコール性脂肪性肝疾患、糖尿病、インスリン抵抗性、アルコール性脂肪性肝疾患、脂質代謝異常、脂肪変性（例えば、肝臓の脂肪変性、心臓の脂肪変性、腎臓の脂肪変性、筋肉の脂肪変性）、無β−リポタンパク血症、グリコーゲン蓄積症、ウェーバー−クリスチャン病、リポジストロフィー；肝疾患、肝臓の炎症、肝炎、脂肪性肝炎、Ｃ型肝炎、遺伝子型３のＣ型肝炎、アルファ１−アンチトリプシン欠損症、妊娠性急性脂肪肝、ウィルソン病；腎疾患；心疾患、高血圧、虚血、心不全、心筋症；中毒；ＨＩＶ；神経変性疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病；癌、または身体運動である。本発明のいくつかの実施形態において、代謝性疾患または状態は高コレステロールであり、ＭＣＪ活性を低減させることは、細胞、組織、または対象においてコレステロールを低減させるための方法において使用されうる。いくつかの実施形態において、代謝性疾患または状態は、摂食障害、食欲低下、飢餓、栄養不良、完全非経口栄養、重度の体重減少、低体重、再栄養症候群；消化管手術が介在する代謝の変化、空腸回腸バイパス、胃バイパス；炎症性／感染性の状態、細菌異常増殖を伴う空腸憩室症、または炎症性腸疾患である。所定の実施形態において、対象は、癌を有さない。いくつかの実施形態において、代謝性疾患または状態は、癌ではない。
本発明の別の態様によれば、対象における細胞傷害性Ｔ（ＣＤ８＋Ｔ）細胞の機能を調整する方法が提供される。本方法は、このような処置が必要な対象に、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＭＣＪポリペプチドの活性を増加または減少させるのに有効な量でＭＣＪ調節化合物を投与することを含み、ＭＣＪポリペプチド活性の増加は、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のミトコンドリア脱分極を増加させ、ＭＣＪポリペプチド活性の減少は、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のミトコンドリア脱分極を減少させ、ミトコンドリア脱分極の増加または減少は、対象における細胞傷害性Ｔ細胞の機能を調整する。いくつかの実施形態において、ＭＣＪポリペプチドの活性を増加させることは、細胞中のＭＣＪポリペプチドのレベルまたは機能を増加させることを含む。所定の実施形態において、ＭＣＪポリペプチドの活性を減少させることは、細胞中のＭＣＪポリペプチドのレベルまたは機能を減少させることを含む。いくつかの実施形態において、ＭＣＪ調節化合物は、医薬組成物で投与される。いくつかの実施形態において、医薬組成物は、薬学的に許容される担体も含む。所定の実施形態において、医薬組成物は、標的化剤も含む。いくつかの実施形態において、標的化剤は、ミトコンドリア標的化剤である。いくつかの実施形態において、ＭＣＪ調節化合物は、ＭＣＪ分子、抗ＭＣＪポリペプチド抗体もしくはその機能的なフラグメント、小分子ＭＣＪ阻害剤、または小分子ＭＣＪエンハンサーを含む。いくつかの実施形態において、ＭＣＪ分子は、ＭＣＪポリペプチドまたはＭＣＪポリペプチドをコードする核酸である。所定の実施形態において、対象は、癌を有さない。
本発明の別の態様によれば、ＭＣＪ調節化合物および薬学的に許容される担体を含む組成物が提供される。いくつかの実施形態において、本組成物は、ミトコンドリア標的化剤も含む。いくつかの実施形態において、ＭＣＪ調節化合物は、ＭＣＪ分子、抗ＭＣＪポリペプチド抗体もしくはその機能的なフラグメント、小分子ＭＣＪ阻害剤、または小分子ＭＣＪエンハンサーを含む。いくつかの実施形態において、ＭＣＪ分子は、ＭＣＪポリペプチドまたはＭＣＪポリペプチドをコードする核酸である。
本発明のさらに他の態様によれば、対象における代謝性疾患または状態の存在または非存在を決定する方法が提供される。本方法は、対象から生体サンプルを得るステップ；生体サンプル中のＭＣＪ分子のレベルを測定するステップ；および測定されたレベルを、ＭＣＪ分子の対照レベルと比較するステップを含み、対照レベルと比較して生体サンプル中のＭＣＪ分子のレベルが変更されていることが、対象における代謝性疾患または状態の存在または非存在の指標である。いくつかの実施形態において、ＭＣＪ分子は、ＭＣＪポリペプチドまたはＭＣＪポリペプチドをコードする核酸である。所定の実施形態において、生体サンプル中のＭＣＪ分子のレベルは、対照レベルと比較して低い。いくつかの実施形態において、生体サンプル中のＭＣＪ分子のレベルは、対照レベルと比較して高い。いくつかの実施形態において、ＭＣＪ分子のレベルを測定するステップは、ＭＣＪ分子の量および／または機能を測定するステップを含む。いくつかの実施形態において、本方法はまた、対象における代謝性疾患または状態の存在または非存在の決定に少なくとも部分的に基づいて、対象のための処置方針を選択するステップも含む。所定の実施形態において、処置方針は、対象に、代謝性疾患または状態に関する医薬品を投与すること、または行動処置を施すことを含む。いくつかの実施形態において、処置方針は、対象に代謝性疾患または状態に関する医薬品を投与することを止めること、または行動処置を施すことを止めることを含む。いくつかの実施形態において、代謝性疾患または状態は、過体重、体重増加、肥満症、非アルコール性脂肪性肝疾患、糖尿病、インスリン抵抗性、アルコール性脂肪性肝疾患、脂質代謝異常、脂肪変性（例えば、肝臓の脂肪変性、心臓の脂肪変性、腎臓の脂肪変性、筋肉の脂肪変性）、無β−リポタンパク血症、グリコーゲン蓄積症、ウェーバー−クリスチャン病、リポジストロフィー；肝疾患、肝臓の炎症、肝炎、脂肪性肝炎、Ｃ型肝炎、遺伝子型３のＣ型肝炎、アルファ１−アンチトリプシン欠損症、妊娠性急性脂肪肝、ウィルソン病；腎疾患；心疾患、高血圧、虚血、心不全、心筋症；中毒；ＨＩＶ；神経変性疾患、パーキンソン病、アルツハイマー病；癌、または身体運動である。本発明のいくつかの実施形態において、代謝性疾患または状態は、高コレステロールである。いくつかの実施形態において、代謝性疾患または状態は、摂食障害、食欲低下、飢餓、栄養不良、完全非経口栄養、重度の体重減少、低体重、再栄養症候群；消化管手術が介在する代謝の変化、空腸回腸バイパス、胃バイパス；および炎症性／感染性の状態、細菌異常増殖を伴う空腸憩室症、または炎症性腸疾患である。所定の実施形態において、本方法はまた、対象において存在することが決定された代謝性疾患または状態を処置するステップも含む。
本発明は、記載されたあらゆる本発明の目的または特色のうち１つまたは複数を必ず満たすシステムまたは方法に限定されないものとする。また本発明は、本明細書で説明される典型的または主要な実施形態に限定されないことに留意することも重要である。当業者による改変および置換は本発明の範囲内であるとみなされる。
配列の簡単な説明
配列番号１は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）登録番号ＡＡＤ３８５０６．１と表記されたヒトＤＮＡＪドメインを含有するタンパク質ＭＣＪのアミノ酸配列である。
配列番号２は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）登録番号ＡＦ１２６７４３．１と表記されたヒトＤＮＡＪドメインを含有するタンパク質ＭＣＪのｍＲＮＡ配列である。
配列番号３は、マウスＤＮＡＪドメインを含有するタンパク質のアミノ酸配列である。
配列番号４は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）登録番号ＡＡＨ９５４００．１と表記されたサブファミリーＣのヒトＤｎａＪ（Ｈｓｐ４０）同族体のアミノ酸配列である。
配列番号５は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）登録番号ＢＣ０９５４００．１と表記されたサブファミリーＣのヒトＤｎａＪ（ＨＳＰ４０）同族体のヌクレオチド配列である。
配列番号６は、ＭＣＪのイントロン１からの領域のためのフォワードプライマーである。
配列番号７は、ＭＣＪのイントロン１からの領域のためのリバースプライマーである。
配列番号８は、ＭＣＪのためのフォワードプライマーである。
配列番号９は、ＭＣＪのためのリバースプライマーである。
配列番号１０は、ＭＣＪのためのプローブである。
配列番号１１は、ＭＣＪのためのフォワードプライマーである。
配列番号１２は、ＭＣＪのためのリバースプライマーである。
マウスおよびヒトＭＣＪ／ＤｎａＪＣ１５のアミノ酸配列、ブロット画像、および特定の組織分布を例示するグラフを示す図である。図１Ａは、ヒトＭＣＪ／ＤｎａＪＣ１５（上の配列）である配列番号１、およびそのマウスのオーソログ（下の配列）である配列番号３のタンパク質配列のアライメントを示す。２つの配列のアミノ酸の差はアライメント比較で示される。図１Ｂは、特異的なマウスｍｃｊプローブを使用したマウス正常組織のポリＡのｍＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。図１Ｃは、特異的なヒトｍｃｊプローブを使用したヒト正常組織のポリＡのｍＲＮＡのノーザンブロット分析を示す。図１Ｄは、マウスＢ細胞、ＣＤ４Ｔ細胞、およびＣＤ８Ｔ細胞からのＲＮＡを使用したｍｃｊのリアルタイムＲＴ−ＰＣＲを使用して得られた相対的なＭＣＪ発現を示すグラフである。ｍＲＮＡレベルをβ−２ミクログロブリンに標準化した。図１Ｅは、ウェスタンブロット分析でマウスＭＣＪ発現（ＭＣＪ）に関して試験したマウスｍｃｊを発現するプラスミド（ｍＭＣＪ）または空のプラスミド（Ｃｏｎｔ）でトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞からの全細胞抽出物のブロットを示す。ローディング対照としてアクチンを試験した。図１Ｆは、ウェスタンブロット分析で試験した、マウス肝臓、心臓、腎臓、および肺における内因性ＭＣＪタンパク質発現を示すブロットを示す。ローディング対照としてアクチン発現を試験した。図１Ｇは、ウェスタンブロット分析で試験したマウスＣＤ４Ｔ細胞およびＣＤ８Ｔ細胞における内因性ＭＣＪタンパク質発現を示すブロットである。 内因性ＭＣＪがミトコンドリアに局在することを実証する顕微鏡写真の画像およびブロットを示す図である。図２ＡおよびＢは、野生型マウスからの精製されたＣＤ８Ｔ細胞（図２Ａ）および心臓（図２Ｂ）における内因性ＭＣＪの免疫電子顕微鏡分析の結果を示す。電子高密度の金粒子は、ＭＣＪを表す（矢印が代表的な免疫反応性を指し示す）。図２Ａおよび図２Ｂの小さい右側のパネルは、左側のパネル中の差し込み図の領域をより高倍率にしたものを表す。ｍはミトコンドリアであり、ｍｆは筋原線維である。倍率は２０，０００×である。バーは、２００ｎｍのスケールを表示する。図２Ｃは、ＭＣＪでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞におけるＭＣＪの免疫電子顕微鏡分析の結果を示す。電子高密度の金粒子は、ＭＣＪを表す。バーは、２００ｎｍのスケールを表示する。膨張したミトコンドリア（ｍ）が示される。さらに図２は、ＭＣＪでトランスフェクトされた２９３Ｔ細胞におけるＭＣＪ（図２Ｄ）およびｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒ（図２Ｅ）の共焦点顕微鏡分析の結果を示し、図２ＦはＭＣＪとｍｉｔｏｔｒａｃｋｅｒの両方の重ね合わせ図を示す。核をＴＯＰＲＯ（青色）で染色した。図２Ｇ〜Ｉは、ウェスタンブロット分析で試験した、（図２Ｇ）マウス心臓、（図２Ｈ）マウスＣＤ８Ｔ細胞、および（図２Ｉ）ヒトＭＣＦ７細胞からの、精製した細胞質（Ｃｙｔ）およびミトコンドリア（Ｍｉｔｏ）抽出物におけるＭＣＪ発現を示すブロットである。ＧＡＰＤＨを細胞質画分用のマーカーとして使用し、ＣｏｘＩＶをミトコンドリア画分用のマーカーとして使用した。 ＭＣＪがミトコンドリアを脱分極させてＡＴＰレベルを減少させることを示すグラフを示す図である。図３Ａは、培地中でインキュベートされたＭＣＦ７細胞およびＭＣＦ７／ｓｉＭＣＪ細胞（１０４個の細胞）における細胞内ＡＴＰレベルを示すグラフである。図３Ｂは、培地またはロテノン（Ｒｏｔｅｎ）（１０μＭ）中でインキュベート（４時間）した後のＭＣＦ７／ｓｉＭＣＪ細胞における細胞内ＡＴＰレベルを示すグラフである。図３Ｃは、ＭＣＪを発現するコンストラクト（ＭＣＪ）または対照（Ｃｏｎｔ）でトランスフェクト（１６時間）された２９３Ｔ細胞における細胞内ＡＴＰレベルを示すグラフである。図３Ｄは、ＭＣＪを発現するコンストラクト（第一、陰影なしで示される）または対照（第二、斜線付きで示される）コンストラクトでトランスフェクト（１６時間）された２９３Ｔ細胞のテトラメチルローダミン、エチルエステル、過塩素酸塩（ＴＭＲＥ）染色およびフローサイトメトリー分析によって決定された膜電位を示すグラフである。図３Ｅは、ＴＭＲＥでの染色およびフローサイトメトリー分析によって決定された新たに単離されたＷＴ ＣＤ８Ｔ細胞（塗り潰されたヒストグラム）およびＷＴ ＣＤ４Ｔ細胞（実線のヒストグラム）におけるＭＭＰの結果を示すグラフである。図３Ｆは、ＭｉｔｏＳｏｘ（登録商標）−レッドでの染色およびフローサイトメトリー分析によって決定された新たに単離されたＷＴ ＣＤ８Ｔ細胞（塗り潰されたヒストグラム）およびＷＴ ＣＤ４Ｔ細胞（実線のヒストグラム）におけるｍＲＯＳの結果を示すグラフである。図３Ｇは、図３Ｅと同様にして決定された新たに単離されたＷＴ ＣＤ８Ｔ細胞（塗り潰されたヒストグラム）およびＭＣＪ ＫＯのＣＤ８Ｔ細胞（実線のヒストグラム）におけるＭＭＰの結果を示すグラフである。図３Ｈは、図３Ｆと同様にして決定された新たに単離されたＷＴ ＣＤ８Ｔ細胞（塗り潰されたヒストグラム）およびＭＣＪ ＫＯのＣＤ８Ｔ細胞（実線のヒストグラム）におけるｍＲＯＳの結果を示すグラフである。図３Ｉは、新たに単離されたＷＴ ＣＤ４Ｔ細胞（塗り潰されたヒストグラム）およびＭＣＪ ＫＯのＣＤ４Ｔ細胞（実線のヒストグラム）におけるＭＭＰの結果を示すグラフである。図３Ｊは、新たに単離されたＷＴ ＣＤ４Ｔ細胞（塗り潰されたヒストグラム）およびＭＣＪ ＫＯのＣＤ４Ｔ細胞（実線のヒストグラム）におけるｍＲＯＳの結果を上記と同様にして決定したことを示すグラフである。データは、３回の独立した実験のうち代表的なものである。 野生型（＋／＋）、ヘテロ接合体（＋／−）およびＭＣＪ ＫＯ（−／−）マウス中のＭＣＪ標的化（約１１Ｋｂ）および野生型（約１６Ｋｂ）対立遺伝子を示すサザンブロット分析の結果（図４Ａ）を示すブロットの画像を示す図である。図４Ｂは、野生型（ＷＴ：ｗｉｌｄ ｔｙｐｅ）およびＭＣＪノックアウト（ＫＯ：ｋｎｏｃｋｏｕｔ）マウスからの肝臓、心臓、ＣＤ４、およびＣＤ８Ｔ細胞からの全細胞抽出物中のＭＣＪに関するウェスタンブロット分析からのブロットを示す。ローディング対照としてアクチンを分析した。図４Ｃは、ＷＴ、ＭＣＪ ＫＯ、およびＭＣＪヘテロ接合体マウスから単離されたＣＤ８Ｔ細胞からのＲＮＡを使用した、ＭＣＪに関するＲＴ−ＰＣＲを使用して得られたブロットを示す。対照としてヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）の発現を試験した。 野生型（ＷＴ）およびＭＣＪノックアウト（ＫＯ）マウスからのリンパ節中のＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞分布をフローサイトメトリーで分析したことを示す図５Ａにおけるプロットを示す図である。数値は、４分割された各集団中の細胞の相対的なパーセンテージを表示する。図５Ｂは、フローサイトメトリー分析でＵＶ−ブルー色素を使用した、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８Ａｂでの活性化後（３日間）における野生型（ＷＴ）（太線）およびＭＣＪノックアウト（ＫＯ）（細線）ＣＤ８Ｔ細胞の生存率を示すグラフである。 ＭＣＪの喪失が、休止状態のエフェクターＣＤ８Ｔ細胞中の高いミトコンドリア代謝を維持することを実証するグラフを示す図である。図６Ａは、３Ｈ−チミジンの取り込みによって決定された、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８Ａｂに応答した野生型（ＷＴ）およびＭＣＪノックアウト（ＫＯ）マウスから精製されたＣＤ８Ｔ細胞の増殖を示すグラフである。図６Ｂは、ＴＭＲＥ染色によって決定された、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８Ａｂで１日間（左）または２日間（右）活性化した後におけるＷＴ ＣＤ８Ｔ細胞（細線）、ＭＣＪ ＫＯのＣＤ８Ｔ細胞（実線）、およびＷＴ ＣＤ４Ｔ細胞（塗り潰されたヒストグラム）中のＭＭＰのグラフを示す。図６ＣおよびＤは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８Ａｂで２日間活性化し、洗浄し、培地単独で０時間（左のパネル）、２４時間（中央のパネル）または４８時間（右のパネル）インキュベートしたＷＴ ＣＤ８Ｔ細胞（塗り潰されたヒストグラム）およびＭＣＪ ＫＯのＣＤ８Ｔ細胞（実線）からの結果を示すグラフである。図３で説明したように、ＭＭＰ（図６Ｃ）およびｍＲＯＳ（図６Ｄ）を試験した。図６Ｅは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８Ａｂで活性化し（２日）、洗浄し、計数し、培地中で１２時間インキュベートした野生型（ＷＴ）およびＭＣＪノックアウト（ＫＯ）ＣＤ８Ｔ細胞を示すグラフである。１０４個の細胞中の細胞内ＡＴＰレベルを決定した。図６Ｆは、野生型（ＷＴ）およびＭＣＪノックアウト（ＫＯ）ＣＤ８Ｔ細胞を２日間活性化し、洗浄し、等しい数の細胞を培地単独で０、２４または４８時間インキュベートした結果を示すグラフである。細胞生存は、２日目に平板培養した細胞の数と比較した、培地中で異なる期間の後に回収された生細胞の数によって決定した。図６Ｇは、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８Ａｂで２日間活性化し、ＩＬ−２（２５Ｕ／ｍｌ）の存在下でさらに２日間増殖させたＴｈｙ１．１＋ ＯＴ−１（ＷＴ）およびＭＣＪ ＫＯ Ｔｈｙ１．１／１．２＋ ＯＴ−Ｉ（ＫＯ）マウスからのＣＤ８Ｔ細胞の結果を示すグラフである。等しい数の細胞を混合し、Ｔｈｙ１．２＋野生型マウスに移植した。１５日後、リンパ節（ＬＮ）および脾臓を採取し、ドナー細胞の頻度をフローサイトメトリーによって決定した。対応するドナー細胞中の大細胞のパーセンテージを示す。記号は、個々のマウスを表す。＊は、ｐ＜０．０５であることを表示する。ＷＴおよびＫＯリンパ節（ＬＮ）間またはＷＴおよびＫＯ脾臓間の統計的有意性をスチューデントのｔ検定によって決定した。ここでデータは、少なくとも２または３回の独立した実験のうち代表的なものを示す。 ＭｉｔｏＳｏｘ（登録商標）レッド染色によって決定された、抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８Ａｂで１日間（左）または２日間（右）活性化した後における野生型（ＷＴ）ＣＤ８Ｔ細胞（細線）、ＭＣＪノックアウト（ＫＯ）ＣＤ８Ｔ細胞（実線）およびＷＴ ＣＤ４Ｔ細胞（塗り潰されたヒストグラム）におけるｍＲＯＳからの結果を示すグラフを示す図である。 ＭＣＪの欠損が絶食中の肝臓の脂質代謝を強化することを実証する顕微鏡写真の画像およびグラフを示す図である。図８Ａは、正常または絶食（３６時間）条件における野生型（ＷＴ）およびＭＣＪノックアウト（ＫＯ）マウスからのＨ＆Ｅ染色による肝臓組織構造の画像を示す。バーは、２００μｍ（正常条件、倍率１００×）、１００μｍ（正常条件、倍率２００×）、１００μｍ（絶食条件、倍率１００×）および５０μｍ（絶食条件、倍率２００×）を表示する。図８Ｂは、脂質を検出するためにオイルレッドＯで染色した絶食（３６時間）野生型（ＷＴ）およびＭＣＪノックアウト（ＫＯ）マウスの凍結した肝臓からの顕微鏡切片を示す。暗色の含有物は脂質を表示し、ＫＯサンプルよりもＷＯでより高いレベルが観察された。図８ＣおよびＤは、絶食ＷＴおよびＭＣＪ ＫＯマウス（ｎ＝４）における血清中のトリグリセリドレベル（図８Ｃ）およびＦＦＡ（図８Ｄ）を示すグラフである。＊は、ｐ＜０．０５であることを表示する。統計的有意性をスチューデントのｔ検定によって決定した。 正常に給餌を受けた野生型およびＭＣＪノックアウト（ＫＯ）マウスにおける褐色脂肪の写真および顕微鏡写真の画像を示す図である。図９Ａは、野生型およびＭＣＪ ＫＯマウスにおける褐色脂肪（矢印）の画像を示し、図９Ｂは、正常な給餌条件下での野生型およびＭＣＪ ＫＯマウスにおける褐色脂肪の組織構造を示す。バーは、１００μｍのスケールを表示する。 ３６時間絶食した絶食野生型およびＭＣＪノックアウト（ＫＯ）マウスにおける褐色脂肪の写真および顕微鏡写真の画像を示す図である。図１０Ａは、野生型およびＭＣＪ ＫＯマウスにおける褐色脂肪（矢印）の画像を示し、図１０Ｂは、野生型およびＭＣＪ ＫＯマウスにおける褐色脂肪の組織構造を示す。バーは、１００μｍのスケールを表示する。 絶食中にＭＣＪの欠損が糖新生を促進することを示すグラフおよび切片の顕微鏡写真を示す図である。図１１Ａは、野生型（ＷＴ）およびＭＣＪノックアウト（ＫＯ）マウス（ｎ＝３）の最初の体重と比較した、絶食３６時間後における全体重の減少量のパーセンテージを示す。図１１Ｂは、絶食前のＷＴおよびＭＣＪ ＫＯマウスにおける全体重を示す。図１１Ｃは、絶食から１２時間後におけるＷＴおよびＭＣＪ ＫＯマウスの血液におけるグルコースレベルの比較を示す。図１１Ｄは、絶食前および絶食中の血液中におけるＷＴおよびＭＣＪ ＫＯのグルコースレベルの比較を示す。図１１Ｅは、絶食後（３６時間）のＷＴおよびＭＣＪ ＫＯマウスからの肝臓抽出物中のＡＴＰ濃度の比較を示す。図１１Ｆは、絶食後のＷＴおよびＭＣＪ ＫＯマウスからの肝臓切片におけるＰＡＳ染色を示す。図１１Ｇは、絶食後（３６時間）または正常な給餌後のＷＴおよびＭＣＪ ＫＯマウス（ｎ＝３）からの肝臓抽出物中のグリコーゲン含量の比較を示す。図１１Ｈは、絶食後（３６時間）または正常な給餌後のＷＴおよびＭＣＪ ＫＯマウスにおける全体重に対する肝臓重量のパーセンテージを示す。図１１Ｉは、正常に給餌を受けた後（Ｃｏｎｔ）または３６時間絶食した後（Ｆａｓｔ）のＷＴおよびＭＣＪ ＫＯマウスからの肝臓中のグリコーゲン合成酵素（ＧＳ）およびＰＥＰＣＫのウェスタンブロット分析を示す。絶食条件については２匹のマウスからの肝臓を示す。図１１Ｊは、高コレステロールの食物を４週間与えた後のＷＴおよびＭＣＪ ＫＯマウス（ｎ＝５）の肝臓中のコレステロール含量を示す。図１１Ｋは、正常な食物が給餌されたＷＴおよびＭＣＪ ＫＯマウス（ｎ＝４）の肝臓中のコレステロール含量を示す。＊はＰ＜０．０５である。統計的有意性をスチューデントのｔ検定によって決定した。エラーバーは標準偏差を表示する。 ＭＣＪ欠損マウスにおける乳癌増殖の遅延を実証するブロット、顕微鏡写真の画像、およびグラフを示す図である。図１２Ａは、全細胞抽出物を使用してウェスタンブロット分析で試験した野生型（ＷＴ）雌マウスからの正常な乳腺（Ｎ）、または２匹のＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウス（Ｔ１およびＴ２）から単離された乳癌におけるＭＣＪ発現を示すブロットである。図１２Ｂは、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ腫瘍からの全細胞抽出物（ＷＥ）、細胞質抽出物（Ｃｙｔ）、およびミトコンドリア抽出物（Ｍｉｔｏ）を使用したウェスタンブロット分析で試験したＭＣＪ発現の結果を示すブロットである。ＣｏｘＩＶおよびＧＡＰＤＨも試験した。図１２Ｃは、全細胞抽出物を使用したウェスタンブロット分析で試験した正常な乳房組織（Ｎ）からの、またはＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ腫瘍（Ｔ）からの、ミトコンドリア抽出物中のＭＣＪ発現の結果を示すブロットである。図１２Ｄは、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ野生型（ＷＴ）およびＭＣＪ ＫＯ ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ［ＭＣＪノックアウト（ＫＯ）］マウス（ｎ＝８）のカプランマイヤー生存曲線である。統計的有意性をログランク検定によって決定した。図１２Ｅは、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴおよびＭＣＪ ＫＯ ＭＭＴＶＰｙＭＴマウスからの乳癌の組織構造（Ｈ＆Ｅ）を示す顕微鏡写真の画像を示す。図１２Ｆは、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ野生型（ＷＴ）マウス（ｎ＝５）およびＭＣＪＭＭＴＶ−ＰｙＭＴノックアウト（ＫＯ）マウス（ｎ＝６）の腫瘍からの細胞質抽出物中のＡＴＰレベルに対する、ミトコンドリア抽出物中のＡＴＰレベルの比率を示すグラフである。＊は、ｐ＜０．０５であることを表示する。統計的有意性をスチューデントのｔ検定によって決定した。 ＭＣＪがミトコンドリア呼吸鎖の複合体Ｉ活性のリプレッサーであることを実証する結果のブロットおよびグラフを示す図である。図１３Ａは、ＷＴおよびＭＣＪ ＫＯの心臓から生成したミトコンドリア抽出物からの複合体Ｉの免疫沈降物中のＭＣＪ、ＮＤＵＦＡ９、およびＮＤＵＦＳ３の存在をウェスタンブロット分析で試験したことを示すブロットである。図１３Ｂは、野生型（ＷＴ）およびＭＣＪノックアウト（ＫＯ）マウスの心臓からのミトコンドリア抽出物（１０μｇ）における相対的な複合体Ｉ活性を示すグラフである。図１３Ｃは、ウェスタンブロット分析で試験した野生型（ＷＴ）およびＭＣＪノックアウト（ＫＯ）マウスからの心臓のミトコンドリア抽出物におけるＮＤＵＦＡ９およびＭＣＪの発現を示すブロットである。図１３Ｄは、新たに単離された野生型（ＷＴ）ＣＤ４、野生型（ＷＴ）ＣＤ８およびＭＣＪノックアウト（ＫＯ）ＣＤ８Ｔ細胞からのミトコンドリア抽出物（５μｇ）における相対的な複合体Ｉ活性を示すグラフである。図１３Ｅは、ウェスタンブロット分析で試験した野生型（ＷＴ）ＣＤ４、野生型（ＷＴ）ＣＤ８、およびＭＣＪノックアウト（ＫＯ）ＣＤ８Ｔ細胞からのミトコンドリア抽出物中のＭＣＪ、ＮＤＵＦＡ９、ＮＤＵＦＳ３、およびアクチンの発現を示すブロットである。図１３Ｆは、ウェスタンブロット分析で試験したＭＣＦ７細胞およびＭＣＦ７／ｓｉＭＣＪ細胞（ｓｉＭＣＪ）からのミトコンドリア抽出物中のＮＤＵＦＡ９およびＭＣＪの発現を示すブロットである。図１３Ｇは、ＭＣＦ７およびＭＣＦ７／ｓｉＭＣＪ細胞から精製されたミトコンドリア抽出物における相対的な複合体Ｉ活性を示すグラフである。
ここで、ＭＣＪポリペプチド活性を調整する方法および化合物は、代謝の異常調節を特徴とする疾患および状態を処置するのに有用であることが発見された。ＭＣＪ／ＤｎａＪＣ１５は、ミトコンドリア呼吸鎖の複合体ＩおよびＡＴＰ生産を負に調節する固有なミトコンドリアのコシャペロンとして機能する。またこの負のフィードバックは、代謝的な選択圧への応答としてミトコンドリア呼吸を弱めることも決定された。したがって、ＭＣＪの欠損は、絶食に応答して起こる代謝の減速を妨害し、さらにＭＣＪの欠損は、ミトコンドリアの脂質酸化を強化することにより、肝臓における脂質の蓄積の減少と脂肪変性からの保護とをもたらす。またＭＣＪの欠損によって引き起こされたミトコンドリア呼吸の増加は、乳癌増殖を遅延させることも示された。
コシャペロンのＤｎａＪファミリーは最も大きく、ヒトで４９より多くのメンバーが同定された。ＤｎａＪドメインは進化の過程で高度に保存されているが、このファミリーのメンバーは、非保存的ドメイン、それらの組織発現、および細胞局在性において多様である。ほとんどの脊椎動物のＤｎａＪメンバーの一次組織における機能は未だ解明されていない。この研究において、ヒトＭＣＪのマウスのオーソログ（ＤｎａＪＣ１５）および２種間で保存されるその特異的な組織分布が、初めて説明される。ここで、ＭＣＪが、複合体Ｉ活性に干渉することによりミトコンドリア呼吸鎖およびＡＴＰ生産への負のフィードバックを付与することが実証された。より重要なことに、結果から、ＭＣＪは、インビボでの代謝の切り替えの主要な調節因子であり、これまでＤｎａＪファミリーの他のいずれのメンバーに関しても報告されていない新規の機能を有することが示される。細胞局在性は、ＤｎａＪファミリーのメンバーの特異的な機能に影響を与える。ここで、様々な一次組織および細胞でイムノ−ＥＭおよび生化学的分析を使用することにより、ＭＣＪはミトコンドリアの内膜近傍に局在することが示された。
メチル化制御Ｊタンパク質（ＭＣＪ）／ＤｎａＪＣ１５は、コシャペロンのＤｎａＪＣサブファミリーのメンバーである。ＭＣＪは、１５０アミノ酸の小タンパク質であり、ＤｎａＪＣファミリー固有のメンバーである。ＭＣＪは、共通のＮ末端位置とは対照的にＣ末端に位置するＪ−ドメインを含有し、そのＮ末端領域は、他のいずれの公知のタンパク質とも相同性を有さない。加えてＭＣＪは膜貫通ドメインも含有し、一方でほとんどのＤｎａＪタンパク質は可溶性である。系統発生学的な研究から、ＭＣＪは脊椎動物にだけ存在し、そこでは高度に保存されていることが示された（Ｈａｔｌｅら、２００７）。ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）登録番号ＡＡＤ３８５０６．１のヒトＤＮＡＪドメインを含有するタンパク質ＭＣＪのアミノ酸配列は、本明細書では配列番号１として記載される。配列番号２は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）登録番号ＡＦ１２６７４３．１として記載されるヒトＤＮＡＪドメインを含有するタンパク質ＭＣＪのｍＲＮＡ配列である。
ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）登録番号ＡＡＨ９５４００．１は、サブファミリーＣのヒトＤｎａＪ（Ｈｓｐ４０）同族体のアミノ酸配列を示し、これは、本明細書では配列番号４と示される。配列番号５は、ＧＥＮＢＡＮＫ（登録商標）登録番号ＢＣ０９５４００．１として記載されたサブファミリーＣのヒトＤｎａＪ（ＨＳＰ４０）同族体のヌクレオチド配列である。
ＭＣＪ／ＤｎａＪＣ１５は、ヒトおよびマウスの両方においてミトコンドリア中に存在することが示された最初のＤｎａＪ膜貫通メンバーである。さらにここで、ＭＣＪの機能の１つは、必要な場合その活性を弱めるために複合体Ｉへの負のフィードバックを付与することであると示された。したがって、ＭＣＪの非存在下では複合体Ｉ活性の有意な増加が起こる。複合体Ｉを完全に活性化するのに必要な多数の関連タンパク質が同定され（ＭｃＫｅｎｚｉｅおよびＲｙａｎ、２０１０ ＩＵＢＭＢ Ｌｉｆｅ ６２、４９７〜５０２）、ＭＣＪは、その活性を抑制する数少ない分子の１つである。興味深いことに、進化中の複合体Ｉの有意な変化は、脊椎動物では不活性型および活性型の両方の獲得であったが、原核生物では活性型のみが同定されている（Ｃｌａｓｏｎら、２００９ Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １６９、８１〜８８；Ｏｈｎｉｓｈｉら、１９９８ Ｂｉｏｃｈｉｍ Ｂｉｏｐｈｙｓ Ａｃｔａ １３６５、３０１〜３０８）。したがって、哺乳動物の複合体Ｉは、活性型および不活性型の両方の混合物である。両方の形態間のバランスを調節するメカニズムは未だ不明である。ＭＣＪは脊椎動物に由来し、複合体Ｉ活性を抑制するために、ＭＣＪは複合体Ｉの活性型と不活性型との間のバランスを調節するとの仮説が立てられる。
いくつかある発見のなかでも、ここで、（１）ＭＣＪ／ＤｎａＪＣ１５は、ミトコンドリアの複合体Ｉの新規な内因性の負の調節因子であり；（２）ＭＣＪの欠損は、ミトコンドリア呼吸およびＡＴＰ生産の強化をもたらし；（３）ＭＣＪの欠損は、肝臓で脂質代謝を促進し、脂肪変性の発生を予防し；（４）ＭＣＪによるミトコンドリアの酸化的リン酸化の負の調節は癌の進行に影響を与えることが示された。
本発明は、部分的に、細胞、組織、臓器、および対象において代謝活性を調節するために、ＭＣＪ／ＤｎａＪＣ１５（また本明細書ではＭＣＪポリペプチドともいう）の活性（例えば、レベルおよび／または機能）を調整することに関する。本発明の組成物、化合物、および方法は、ＭＣＪ活性の異常なレベルまたはＭＣＪポリペプチド活性の望ましくないレベルで特徴付けることができる代謝性疾患または状態を有する対象、または代謝性疾患もしくは状態を有するリスクがある対象を処置するのに使用できる。また本発明は、部分的に、異常なＭＣＪポリペプチド活性で特徴付けることができる代謝性疾患および状態の状況を診断および判定する方法にも関する。したがって、本発明の方法および化合物は、対象においてこのような代謝性疾患および状態を処置および判定するのに有用である。また本発明は、部分的に、対象における最初の活性レベルから、代謝性疾患もしくは状態の症状を低減させる、もしくはそれらを除去する、および／または代謝性疾患もしくは状態の症状の発症を予防するのに効果的な活性レベルに、ＭＣＪポリペプチド活性を調整することにも関する。
対象は、本明細書で使用される場合、ヒトまたは脊椎動物の哺乳動物、例えば、これらに限定されないが、イヌ、ネコ、ウマ、ヤギ、および霊長類、例えばサルなどを意味するものとする。したがって、本発明は、ヒトおよびヒト以外の対象において疾患または状態を処置するのに使用できる。例えば、本発明の方法および組成物は、ヒトの予防および処置レジメンの場合と同様に獣医学的用途にも使用できる。本発明のいくつかの実施形態において、対象はヒトである。本発明のいくつかの実施形態において、対象は、癌を有さない。本発明の所定の実施形態において、対象は、癌を有する。所定の実施形態において、対象は、カロリー制限を受けており、例えば絶食している。本明細書で使用される用語「絶食」は、カロリー摂取の低減を意味し、この低減は、予め決められた期間にわたり、所定の対象の正常なカロリー摂取の最大５％、最大１０％、最大２０％、最大３０％、最大４０％、最大５０％、最大６０％、最大７０％、最大８０％、最大９０％、またはそれより大きい低減を含み得る。本発明のいくつかの実施形態において、予め決められた期間は、１日、２日、３日、４日、５日、６日、７日もしくはそれより長い日数；１週、２週、３週、４週もしくはそれより長い週数；１月、２月、３月、４月、５月、６月、７月、８月、９月、１０月、１１月、１２月、もしくはそれより長い月数；および／または１年、２年、３年、４年、５年、もしくはそれより長い年数であってもよい。当業者であれば、当業界公知の基準および推奨、例えば身長／体重表などを使用して所定の対象ごとの正常なカロリー摂取のレベルおよび低減されたカロリー摂取のレベルを判定できる。絶食は、本明細書で使用される場合、異常なＭＣＪポリペプチド活性を特徴とする代謝性疾患または状態に関する行動処置とみなされる場合がある。
本発明が適用できる対象の非限定的な例は、代謝性疾患もしくは状態と診断される対象、代謝性疾患もしくは状態を有する疑いがある対象、または代謝性疾患もしくは状態を有するリスクがある対象である。本発明の方法は、処置の時点で代謝性疾患もしくは状態を有すると診断された対象、または代謝性疾患もしくは状態を有するかまたはそれを発症するリスクがあるとみなされる対象に適用されてもよい。
本発明のいくつかの態様において、代謝性疾患または状態を有する対象は、正常な対照と比較して代謝において検出可能な異常を有する対象である。本発明の所定の態様において、対象は、正常な対照と比較して有意差を有さなくてもよいが、本明細書で示される方法を使用して対象の代謝活性を変更することが望ましい。例えば、対象は、糖尿病または脂肪性肝疾患を有さない正常な対照と比較して、対象の代謝活性における異常と関連する代謝性疾患（例えば糖尿病または脂肪性肝疾患など）を有していてもよい。他の例において、対象は、例えば運動の増加など、対象において代謝を増加させることが望ましい代謝の状態を有していてもよい。
本発明のいくつかの態様において、対象は、代謝性疾患または状態を有するか、またはそれを発症するリスクがある。代謝性疾患または状態を発症するリスクがある対象とは、代謝性疾患または状態を発症する対照のリスクと比較してそのような疾患または状態を発症する確率が高い対象である。本発明のいくつかの実施形態において、リスクのレベルは、リスクの対照レベルと比較して統計学的に有意なレベルであり得る。リスクのある対象としては、例えば、その存在が代謝性疾患または状態を発症するより高い可能性と相関することが実証された遺伝学的異常を有する対象；代謝性疾患または状態の家族歴および／または個人の病歴を有する対象；例えば化学毒素などの物質、または活性に曝露された対象；および／またはこれまでに代謝性疾患または状態に関して処置がなされたが一見寛解状態にある対象が挙げられる。
いくつかの代謝性疾患または状態において、細胞、組織、または対象におけるＭＣＪポリペプチド活性は、代謝性疾患または状態を有さない細胞、組織、または対象におけるＭＣＪポリペプチド活性よりも高くてもよい。したがって、本発明の方法および化合物で処置が可能ないくつかの疾患および状態において、正常よりも高いＭＣＪポリペプチド活性は、代謝性疾患または状態の特徴でありえ、代謝性疾患または状態の診断にも役立ちうる。所定の代謝性疾患または状態は、細胞、組織、または対象において正常よりも高いＭＣＪ活性レベルを特徴としないものもあるが、所定の対象においてはＭＣＪポリペプチド活性を減少させることにより処置が可能である。例えば、対象は、代謝性疾患または状態を有さないサンプル、組織、または対象からの対照レベルと比較して正常なＭＣＪポリペプチド活性レベルを有しうるが、対象においてレベルを減少させることが、その対象における代謝性疾患または状態を処置しうる。
したがって、本発明のいくつかの実施形態は、細胞、組織または対象に、疾患または状態の処置として細胞、組織、または対象中のＭＣＪポリペプチド活性を減少させるのに有効な量で化合物を投与する方法を含む。例えば過体重、体重増加、肥満症、非アルコール性脂肪性肝疾患、糖尿病、インスリン抵抗性、アルコール性脂肪性肝疾患、脂質代謝異常、脂肪変性（例えば、肝臓の脂肪変性、心臓の脂肪変性、腎臓の脂肪変性、筋肉の脂肪変性）、無β−リポタンパク血症、グリコーゲン蓄積症、ウェーバー−クリスチャン病、リポジストロフィー；肝疾患、例えば、これらに限定されないが：肝臓の炎症、肝炎、脂肪性肝炎、Ｃ型肝炎、遺伝子型３のＣ型肝炎、アルファ１−アンチトリプシン欠損症、妊娠性急性脂肪肝、およびウィルソン病；腎疾患；心疾患：例えば、これらに限定されないが、高血圧、虚血、心不全、心筋症；中毒；ＨＩＶ；神経変性疾患：例えば、これらに限定されないが、パーキンソン病、アルツハイマー病；身体運動；ならびに癌などの代謝性疾患および状態は、細胞、組織、または対象におけるＭＣＪ−ポリペプチド活性を減少させることによって処置されうる。
いくつかの代謝性疾患または状態において、細胞、組織、または対象におけるＭＣＪポリペプチド活性は、代謝性疾患または状態を有さない細胞、組織、または対象におけるＭＣＪポリペプチド活性より低くてもよい。したがって、本発明の方法および化合物で処置が可能ないくつかの疾患および状態において、正常よりも低いＭＣＪポリペプチド活性は、代謝性疾患または状態の特徴でありえ、代謝性疾患または状態の診断にも役立ちうる。所定の代謝性疾患または状態は、細胞、組織、または対象において正常よりも低いＭＣＪ活性レベルを特徴としないものもあるが、所定の対象においてはＭＣＪポリペプチド活性を増加させることにより処置が可能である。例えば、対象は、代謝性疾患または状態を有さないサンプル、組織、または対象からの対照レベルと比較してＭＣＪポリペプチド活性の正常なレベルを有しうるが、対象においてレベルを増加させることが、その対象において代謝性疾患または状態を処置しうる。
したがって、本発明のいくつかの実施形態は、細胞、組織または対象に、疾患または状態の処置として細胞、組織、または対象中のＭＣＪポリペプチド活性を増加させるのに有効な量で化合物を投与する方法を包含する。例えば摂食障害：例えば、これらに限定されないが、食欲低下、飢餓、栄養不良、完全非経口栄養、重度の体重減少、低体重、再栄養症候群；消化管手術が介在する代謝の変化：例えば、これらに限定されないが：空腸回腸バイパス、胃バイパス；ならびに炎症性／感染性の状態：例えば、これらに限定されないが、細菌異常増殖を伴う空腸憩室症、および炎症性腸疾患などの代謝性疾患および状態は、細胞、組織、または対象におけるＭＣＪ−ポリペプチド活性を増加させることによって処置されうる。
ＭＣＪポリペプチド活性（例えば、ＭＣＪポリペプチドレベルおよび／またはＭＣＪポリペプチドの機能）を決定して、本発明に係るＭＣＪポリペプチド活性の対照値と比較してもよい。対照は予め決められた値であってもよく、このような値は様々な形態をとり得る。対照は、例えば中央値または平均などの単一のカットオフ値であってもよい。対照は、比較グループに基づいて確立してもよいし、例えばＭＣＪポリペプチド活性の正常な量を有するグループおよびＭＣＪポリペプチド活性の異常な量を有するグループで確立してもよい。比較グループの他の例は、代謝性疾患もしくは状態の１つまたは複数の症状を有するか、または代謝性疾患もしくは状態と診断されたグループであってもよいし、代謝性疾患もしくは状態の１つまたは複数の症状を有さないか、または代謝性疾患もしくは状態と診断されないグループであってもよい。他の比較グループは、代謝性疾患または状態の家族歴を有するグループであってもよいし、このような家族歴を有さないグループであってもよい。予め決められた値を分類してもよく、その場合、例えば、検査された集団は、例えば低いリスクを有するグループ、中程度のリスクを有するグループ、および高いリスクを有するグループなどのグループに均等に（もしくは不均等に）分割されるか、または四分位数もしくは五分位数に均等に（もしくは不均等に）分割され、ここで最下位の四分位数または五分位数は、最小の（例えば代謝性疾患または状態の）リスクと最小量のＭＣＪポリペプチド活性とを有する個体であり、最上位の四分位数または五分位数は、最大の（例えば代謝性疾患または状態の）リスクと最大量のＭＣＪポリペプチド活性とを有する個体である。
予め決められた値は、当然ながら、選択された特定の集団に依存するであろう。例えば外見上健康な集団は、異常なＭＣＪタンパク質発現または存在に関する状態を有することがわかっている集団が有するであろう範囲とは異なる「正常な」範囲を有するとであろう。したがって、選択された予め決められた値は、個体または細胞が属する分類上の区分を考慮に入れてもよい。適切な範囲および分類上の区分は、当業者により慣例的な実験だけで選択できる。「異常」とは、本明細書で使用される場合、正常な対照と比較して有意に異なることを意味する。異常に高いＭＣＪポリペプチド活性は、選択された対照に対して高いことを意味し、例えば、対象または細胞において、正常な対照におけるレベルと比較して、少なくとも０．１％、０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、１５０％、２００％の、またはそれより大きい活性の増加が挙げられる。異常に低いＭＣＪポリペプチド活性は、選択された正常な対照に対して低いことを意味し、例えば、対象または細胞において、正常な対照におけるレベルと比較して少なくとも０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％の減少が挙げられる。典型的には、対照は、適切な年齢層の外見上健康な正常個体または外見上健康な細胞に基づくであろう。
本発明のいくつかの態様において、ある対象に関して決定されたＭＣＪポリペプチド活性の値は、その同じ対象におけるその後のＭＣＪポリペプチド活性の決定のための対照値として役立つ可能性があり、したがって対象における「ベースライン」のＭＣＪポリペプチド活性からの変化の判定を可能にする。したがって、ある対象において最初のＭＣＪポリペプチド活性レベルを決定して、本発明の方法および化合物を使用してその対象におけるＭＣＪポリペプチド活性のレベルを減少させてもよく、この場合、最初のレベルはその対象の対照レベルとして役立つ。本発明の方法および化合物を使用することにより、対象における代謝性疾患または状態のための処置として、対象におけるＭＣＪポリペプチド活性を、最初のレベルと比較して少なくとも０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、またはそれより大きく減少させてもよい。同様に、ある対象において最初のＭＣＪポリペプチド活性レベルを決定して、本発明の方法および化合物を使用してその対象におけるＭＣＪポリペプチド活性のレベルを増加させてもよく、この場合、最初のレベルはその対象の対照レベルとして機能する。本発明の方法および化合物を使用することにより、対象における代謝性疾患または状態のための処置として、対象におけるＭＣＪポリペプチド活性を、最初のレベルと比較して少なくとも０．５％、１％、５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、６０％、７０％、８０％、９０％、１００％、またはそれより大きく増加させてもよい。
本発明に係る対照は、予め決められた値に加えて、実験材料と並行して検査される材料のサンプルであってもよいことが理解されよう。その例としては、実験サンプルと並行して検査するための製造過程で作製された対照集団または対照サンプルからのサンプルが挙げられる。
ここで、細胞のミトコンドリア中のＭＣＪポリペプチド活性のレベルが、代謝性疾患または状態の存在または非存在と相関すること、およびＭＣＪポリペプチド活性の量の増加は、対象における代謝性疾患または状態のリスクの増加に相当することが決定された。ここでもまた、対象中の細胞のミトコンドリア中のＭＣＪポリペプチド活性のより低いレベルは、対象の細胞がより高いＭＣＪポリペプチド活性のレベルを有する場合の予後よりも対象にとって肯定的な予後を有することとも相関が示された。例えば、限定を意図するつもりはないが、ＭＣＪポリペプチド活性のより低いレベルは、肝臓における脂質代謝速度を増加させ、脂肪変性発症を予防することにより、ＭＣＪポリペプチド活性のレベルがより高い場合よりも対象にとってよりよい予後をもたらす。したがって、細胞におけるＭＣＪの発現および機能のより高いレベルは、対象における代謝性疾患および異常のより高い出現率およびより悪い予後と関連する。当業者であれば、より高い、より低い、低減、増加という用語は、対照レベルまたは対照値と比較した相対的なレベルまたは値を表す場合があることを理解するであろう。
何らかの特定の理論に縛られる意図はないが、ＭＣＪはミトコンドリア中に存在し、そこでＭＣＪはミトコンドリア呼吸鎖の複合体Ｉの負の調節因子として役立つと考えられる。ＭＣＪの喪失により、複合体Ｉ活性の増加、ミトコンドリアの過分極、およびＡＴＰ生成の増加が起こる。ＭＣＪの非存在下におけるエネルギー源としてのミトコンドリアの酸化的リン酸化の強化は、脂肪酸の酸化を促進し、飢餓中の肝臓における脂質の蓄積を予防する。加えて、ＭＣＪの欠損はさらに、ミトコンドリアの機能を弱めることができないことと相関する乳癌増殖を遅延させることも見出された。
加えて、何らかの特定の理論に縛られる意図はないが、ＭＣＪポリペプチド活性を調整することはまた、細胞、組織、および対象中の細胞傷害性Ｔ（ＣＤ８＋Ｔ）細胞の機能を調整することとも相関すると考えられる。いくつかの実施形態において、本発明の方法は、このような処置が必要な対象に、ＭＣＪ調節化合物を、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のＭＣＪポリペプチドの活性を増加または減少させるのに有効な量で投与することを含み得る。ＭＣＪポリペプチド活性の増加は、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のミトコンドリア脱分極を増加させることが見出され、ＭＣＪポリペプチド活性の減少は、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のミトコンドリア脱分極を減少させることが見出された。したがって、ＭＣＪポリペプチド活性を調整する化合物を投与することは、ミトコンドリア脱分極を増加または減少させることにより、対象における細胞傷害性Ｔ細胞の機能を調整するのに使用できる。
処置
いくつかの態様において、本発明は、細胞、組織、および／または対象においてＭＣＪポリペプチド活性を調整する方法に関する。用語「調整」は、本明細書で使用される場合、細胞中のＭＣＪポリペプチド活性のレベル（例えば、ＭＣＪポリペプチドのレベルおよび／または機能）を変化させることを意味する。本発明のいくつかの実施形態において、ＭＣＪポリペプチド活性を変化させることは、細胞または組織中のＭＣＪポリペプチドのレベルを変化させることを含む。したがって、細胞中のＭＣＪポリペプチドの活性を増加させることは、細胞中のＭＣＪポリペプチドのレベル（例えば量）を増加させることを含み得る。同様に、細胞中のＭＣＪポリペプチドの活性を減少させることは、細胞中のＭＣＪポリペプチドのレベル（例えば量）を減少させることを含み得る。本発明のいくつかの実施形態において、ＭＣＪポリペプチドのレベルは、ＭＣＪポリペプチドの発現を増加させることにより変化させたりまたは調整させたりできる。したがって、本発明の方法のいくつかの実施形態は、細胞、組織、または対象中のＭＣＪポリペプチドをコードする核酸のレベルを増加または減少させることを含んでいてもよく、それにより、細胞、組織、または対象中のＭＣＪポリペプチドの活性を増加させることができる。本発明の方法の所定の実施形態は、異常なＭＣＪポリペプチド活性を特徴とする代謝性疾患または状態を処置するために、例えば細胞、組織または対象にＭＣＪポリペプチドを送達することによって、細胞、組織、または対象中のＭＣＪポリペプチドのレベルを直接的に増加または減少させることを含み得る。本明細書の他所に記載されるように、本発明のいくつかの実施形態において、本発明の方法で処置することによりＭＣＪポリペプチドまたはその活性のレベルを増加または減少させることができる細胞としては、これらに限定されないが、肝細胞（ｌｉｖｅｒ ｃｅｌｌ）、筋細胞、心臓細胞、循環器系の細胞、ニューロン性細胞、グリア細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、造血細胞、上皮細胞、精液、卵母細胞、筋細胞、脂肪細胞、腎細胞、肝実質細胞（ｈｅｐａｔｏｃｙｔｅｓ）、または膵臓細胞などが挙げられる。本発明のいくつかの実施形態において、細胞は癌細胞であり、その例は、腫瘍細胞であり得る。
本明細書で使用される場合、用語「処置」、「処置された」、または「処置すること」は、例えば異常なＭＣＪポリペプチド活性で特徴付けることができる代謝性疾患または状態などの障害に関して使用される場合、対象が疾患または状態を発症させる可能性を減少させる予防的処置を指す場合があり、さらには、疾患または状態のレベルを除去したりまたは低減させたりするため、疾患または状態がさらに進行しないようにするため（例えばより重症にならないようにするため）、および／または治療を行わない場合と比較して疾患の進行を遅くするための、対象が疾患または状態を発症した後の処置を指す場合もある。
本発明の所定の実施形態において、ＭＣＪポリペプチド活性を変化させることは、細胞、組織、または対象におけるＭＣＪポリペプチドの機能化を増加または減少させることを含む。いくつかのこのような実施形態において、ＭＣＪポリペプチドのレベルは変化しないが、細胞中の１種または複数のＭＣＪポリペプチドの機能が変更される可能性があり、例えば増加されるかまたは減少されるかのいずれかである。ＭＣＪポリペプチドの機能を変更できる方法の例としては、これに限定されないが、ＭＣＪポリペプチドを、ＭＣＪポリペプチドに結合する抗体またはその機能的なフラグメントと接触させて、その機能を変更することなどが挙げられる。例えば、本発明のいくつかの実施形態において、ＭＣＪの機能を阻害する抗体は、処置レジメンの一部として細胞に送達されてもよい。同様に、本発明のいくつかの実施形態において、ＭＣＪの機能を強化または阻害する化合物を細胞または対象に投与して、ＭＣＪポリペプチド活性を調整してもよい。本明細書では、ＭＣＪポリペプチドの機能を強化もしくは阻害する化合物、および／またはＭＣＪポリペプチドのレベルを強化もしくは阻害する化合物をＭＣＪ調節化合物と称する場合がある。
本発明のいくつかの実施形態において、ＭＣＪ調節化合物は、ＭＣＪ分子、抗ＭＣＪポリペプチド抗体もしくはその機能的なフラグメント、小分子ＭＣＪ阻害剤、または小分子ＭＣＪエンハンサーを含み得る。ＭＣＪ分子の例としては、ＭＣＪポリペプチドまたはＭＣＪポリペプチドをコードする核酸が挙げられる。ＭＣＪ調節化合物は、本明細書で使用される場合、細胞、組織、および／または対象においてＭＣＪポリペプチド活性を調整する（例えば、増加または減少させる）化合物であってもよい。ＭＣＪポリペプチド活性を減少または低減させるＭＣＪ調節化合物は、ＭＣＪ阻害剤化合物と称する場合もあり、ＭＣＪポリペプチド活性を増加させるかまたは強化するＭＣＪ調節化合物は、ＭＣＪエンハンサー化合物と称する場合もある。
したがって、代謝性疾患または状態の処置が必要な対象に、ＭＣＪポリペプチド活性を増加または減少させる化合物を有効な量で投与してもよい。対象にＭＣＪポリペプチド活性を増加させる化合物またはＭＣＪポリペプチド活性を減少させる化合物を投与することは、対象における代謝性疾患または状態を低減させうる。
本発明の処置および／または化合物を使用してＭＣＪポリペプチド活性を低減させることが望ましい所定の代謝性疾患および／または状態において、ＭＣＪ阻害化合物が投与されてもよい。このような代謝性疾患または状態の非限定的な例としては、これらに限定されないが、過体重、体重増加、肥満症、非アルコール性脂肪性肝疾患、糖尿病、インスリン抵抗性、アルコール性脂肪性肝疾患、脂質代謝異常、脂肪変性（例えば、肝臓の脂肪変性、心臓の脂肪変性、腎臓の脂肪変性、筋肉の脂肪変性）、無β−リポタンパク血症、グリコーゲン蓄積症、ウェーバー−クリスチャン病、リポジストロフィー；肝疾患、例えば、これらに限定されないが：肝臓の炎症、肝炎、脂肪性肝炎、Ｃ型肝炎、遺伝子型３のＣ型肝炎、アルファ１−アンチトリプシン欠損症、妊娠性急性脂肪肝、およびウィルソン病；腎疾患；心疾患：例えば、これらに限定されないが、高血圧、虚血、心不全、心筋症；中毒；ＨＩＶ；神経変性疾患：例えば、これらに限定されないが、パーキンソン病、アルツハイマー病；身体運動；および癌が挙げられる。本発明のいくつかの実施形態において、代謝性疾患または状態は高コレステロールであり、本発明のＭＣＪ活性を低減させる方法を使用して、細胞、組織、または対象においてコレステロールを低減させることができる。
本発明の処置および／または化合物を使用してＭＣＪポリペプチド活性を増加させることが望ましい所定の代謝性の状態において、ＭＣＪを強化する化合物を投与してもよい。このような代謝性疾患または状態の非限定的な例としては、これらに限定されないが：摂食障害：例えば、これらに限定されないが、食欲低下、飢餓、栄養不良、完全非経口栄養、重度の体重減少、低体重、再栄養症候群；消化管手術が介在する代謝の変化：例えば、これらに限定されないが：空腸回腸バイパス、胃バイパス；ならびに炎症性／感染性の状態：例えば、これらに限定されないが、細菌異常増殖を伴う空腸憩室症、および炎症性腸疾患が挙げられる。
ＭＣＪポリペプチド活性を変更または調整することが望ましい代謝性疾患または状態を処置するのに有用な化合物は、本発明のいくつかの実施形態において、ＭＣＪポリペプチドまたはＭＣＪポリペプチドをコードする核酸であり得る。したがって、本発明の方法は、対象に、外因性ＭＣＪポリペプチドまたは外因性ＭＣＪポリペプチドをコードする核酸を投与することを含み得る。
用語「タンパク質」および「ポリペプチド」は、本明細書で使用される場合、同義的に使用され、したがってポリペプチドという用語は全長タンパク質を指すのに使用される場合もあるし、全長タンパク質フラグメントを指すのにも使用される場合もある。用語「外因性」は、本明細書でポリペプチド、タンパク質、またはそれらのフラグメント、およびこのようなポリペプチドをコードする核酸に関して使用される場合、細胞または対象中に自然に存在しない化合物が細胞または対象に投与されることを意味する。外因性ＭＣＪポリペプチドまたはＭＣＪポリペプチドをコードする核酸はそれぞれ、細胞または対象に投与されたこと以外は、その配列に関して、内因性ＭＣＪポリペプチドまたはＭＣＪポリペプチドをコードする核酸と同一であってもよいことが理解されよう。
本発明のいくつかの態様によれば、本発明の方法において、全長ＭＣＪポリペプチドまたは全長ＭＣＪポリペプチドのフラグメントが投与されてもよい。本発明のフラグメントは、ポリペプチドの別個の機能的な能力を保持するフラグメントであってもよい。フラグメント中に保持できる機能的な性能としては、抗体との相互作用、および他のポリペプチドまたはそれらのフラグメントとの相互作用が挙げられる。ポリペプチドフラグメントは、天然フラグメントであってもよいし、または当業界公知の方法を使用して合成して、本明細書で例示された方法を使用して機能に関して検査してもよい。本発明の方法および組成物において有用な全長ＭＣＪおよびＭＣＪのフラグメントは、組換えポリペプチドであってもよい。
全長ＭＣＪポリペプチドのフラグメントは、野生型ＭＣＪポリペプチドまたは本明細書で説明されているような改変されたＭＣＪポリペプチド配列中に見出される連続配列を有する、少なくとも全長ＭＣＪポリペプチドの最大ｎ−１の連続したアミノ酸を含んでいてもよい（ここで「ｎ」は、全長ＭＣＪポリペプチド中のアミノ酸の数に等しい）。したがって、例えば、長さが１５０アミノ酸のＭＣＪポリペプチドのフラグメントは、１５０アミノ酸のＭＣＪポリペプチドの、少なくとも４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８、１９、２０、２５、３０、３５、４０、４５、５０、５５、６０、６５、７０、７５、８０、８５、９０、９５、１００、１１０、１２０、１３０、１４０、または１４９個（その間の各整数も含めて）の連続したアミノ酸であろう。いくつかの実施形態において、フラグメントは、ＭＣＪポリペプチドのＣ末端領域を含む。このような全長ＭＣＪポリペプチドのフラグメントであるＭＣＪポリペプチドは、ＭＣＪ調節化合物として投与すること、および合成および天然ＭＣＪポリペプチドに特異的に結合する例えば抗体などのＭＣＪ調節化合物を調製することなどの様々な目的にとって有用でありうる。
「改変された」野生型または突然変異体全長ＭＣＪポリペプチドまたはそれらのフラグメントであるポリペプチドは、欠失、点突然変異、トランケーション、アミノ酸置換、および／またはアミノ酸または非アミノ酸部分の付加を含んでいてもよい。本発明のポリペプチドの改変は、ポリペプチドをコードする核酸の改変によってなされてもよいし、またあるいは、改変は、例えば切断、リンカー分子の付加、例えば蛍光標識などの検出可能な部分の付加などによってポリペプチドに直接なされてもよい。また改変は、ポリペプチドのアミノ酸配列の全部または一部を含む融合タンパク質も含む。
一般的に、改変されたポリペプチド（例えば改変されたＭＣＪ野生型または突然変異体ポリペプチド）は、その生理学的活性に関係しないポリペプチドの機能が変更されるように特異的に改変されたポリペプチドを含み得る。例えばシステイン残基を置換したりまたは欠失させたりすることにより、不要なジスルフィド結合を防ぐことができる。ポリペプチドのＮまたはＣ末端に残基が付加されてもよく、例えば、ＭＣＪポリペプチドの最も外側のＣ末端にシステイン（Ｃ）または他のアミノ酸残基が付加されてもよい。ＭＣＪポリペプチドは、改変と共に合成してもよいし、および／またはアミノ酸置換、欠失、または付加を選択してそれを導入することにより、ＭＣＪポリペプチド中に改変を作製してもよい。次いで改変されたポリペプチドを１種または複数の活性（例えば、細胞または対象中のＭＣＪポリペプチド活性の調整、代謝性疾患または状態の処置、ミトコンドリア膜の脱分極を変更することなど）に関して検査して、どの改変が望ましい特性を有する改変されたポリペプチドを提供するかを決定してもよい。
当業者であれば、本発明の処置方法において、機能的に同等なポリペプチド、すなわち未改変のＭＣＪポリペプチドの機能的な能力を保持する改変されたＭＣＪポリペプチドを提供するために、ポリペプチドに保存的アミノ酸置換がなされてもよいことも理解するであろう。「保存的アミノ酸置換」は、本明細書で使用される場合、アミノ酸置換がなされるポリペプチドの相対的な電荷またはサイズの特徴を変更しないアミノ酸置換を指す。改変されたＭＣＪポリペプチドは、このような分野の当業者に公知のポリペプチド配列を変更する方法に従って調製できる。典型的な機能的に同等なＭＣＪポリペプチドは、ＭＣＪポリペプチド、またはそれらのフラグメント、例えば改変されたＭＣＪポリペプチドなどの保存的アミノ酸置換を含む。保存的アミノ酸置換は、以下のグループ内のアミノ酸の間で、すなわち（ａ）Ｍ、Ｉ、Ｌ、Ｖ；（ｂ）Ｆ、Ｙ、Ｗ；（ｃ）Ｋ、Ｒ、Ｈ；（ｄ）Ａ、Ｇ；（ｅ）Ｓ、Ｔ；（ｆ）Ｑ、Ｎ；および（ｇ）Ｅ、Ｄの間でなされた置換を含む。
ＭＣＪポリペプチド中の保存的アミノ酸置換は、典型的には、ポリペプチドをコードする核酸の変更によって行われる。このような置換は、様々な当業者に公知の方法によって行ってもよい。例えば、アミノ酸置換は、ＰＣＲ誘導突然変異（ＰＣＲ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ ｍｕｔａｔｉｏｎ）、部位特異的突然変異誘発によって行ってもよいし、またはＭＣＪポリペプチドをコードする遺伝子の化学合成によって行ってもよい。ポリペプチドの小さいフラグメントにアミノ酸置換が行われる場合、置換は、ポリペプチドを直接合成することによって行ってもよい。ＭＣＪポリペプチドの機能的に同等なフラグメントの活性は、変更されたポリペプチドをコードする遺伝子を細菌または哺乳動物の発現ベクターにクローニングし、ベクターを適切な宿主細胞に導入し、変更されたポリペプチドを発現させ、本明細書で開示されたようにポリペプチドの機能的な能力に関して検査することにより検査できる。
本発明のいくつかの実施形態において、ＭＣＪポリペプチドのレベルまたは機能は、細胞および／またはミトコンドリアにＭＣＪポリペプチドを遺伝学的に導入することによって調整が可能であり、ＭＣＪポリペプチドの遺伝学的に標的化された発現のための試薬および方法が提供される。遺伝学的な標的化を使用して、特定の細胞型に、特定の細胞サブタイプに、生物内の特定の空間的領域に、および細胞内の細胞内領域にＭＣＪポリペプチドを送達できる。また遺伝学的な標的化は、発現されたＭＣＪポリペプチドの量、および発現のタイミングの制御にも関する。本発明のいくつかの実施形態は、遺伝学的に標的化されたＭＣＪポリペプチドの発現のための試薬を含み、ここで本試薬は、ＭＣＪポリペプチドをコードする、またはＭＣＪポリペプチドの機能的なフラグメントをコードする核酸を含有するベクターを含む。
用語「ベクター」は、本明細書で使用される場合、機能するように結合される他の核酸を異なる遺伝学的環境間で輸送が可能な核酸分子を指す。また用語「ベクター」は、ウイルスまたは核酸分子を輸送できる生物も指す。一つのタイプのベクターは、エピソーム、すなわち染色体外の複製が可能な核酸分子である。いくつかの有用なベクターは、自律増殖および／またはそれらが連結する核酸の発現が可能なベクターである。それらが機能するように結合する遺伝子を発現させるよう仕向けることができるベクターは、本明細書では「発現ベクター」と称される。他の有用なベクターとしては、これらに限定されないが、例えばレンチウイルス、レトロウイルス、アデノウイルス、およびファージなどのウイルスが挙げられる。本発明のいくつかの方法において有用なベクターは、分裂細胞および非分裂細胞にＭＣＪポリペプチドを遺伝学的に挿入してもよいし、インビボ、インビトロ、またはエクスビボの細胞である細胞にＭＣＪポリペプチドを挿入してもよい。
本発明の方法において有用なベクターは、追加の配列を含んでいてもよく、このような追加の配列としては、これらに限定されないが、１つまたは複数のシグナル配列および／もしくはプロモーター配列、またはそれらの組み合わせなどが挙げられる。発現ベクターおよびそれらの使用方法は当業界周知である。本発明の所定の実施形態において、ベクターは、本発明のＭＣＪポリペプチドまたはそれらの変異体をコードする核酸または遺伝子を含むレンチウイルスであってもよい。安定な細胞株を作るのに使用できるベクターの非限定的な例は、レンチウイルスである。用語「細胞株」は、本明細書で使用される場合、適切な培地が与えられると増殖し続けるであろう樹立細胞の培養物である。
本発明の方法およびベクターで使用できるプロモーターとしては、これらに限定されないが、細胞特異的プロモーターまたは汎用のプロモーターなどが挙げられる。細胞特異的プロモーターおよび汎用のプロモーターを選択および使用する方法は当業界周知である。多種多様の細胞型においてＭＣＪポリペプチドの発現を可能にする用途の広いプロモーター、すなわち様々な細胞型で広く発現される遺伝子、例えば「ハウスキーピング遺伝子」のためのプロモーターの非限定的な例を使用して、様々な細胞型でＭＣＪポリペプチドを発現させることができる。汎用のプロモーターの非限定的な例は本明細書の他所で示され、好適な代替のプロモーターは当業界周知である。本発明の所定の実施形態において、プロモーターは誘導性プロモーターであってもよく、その例としては、これらに限定されないが、テトラサイクリン−オン（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｏｎ）またはテトラサイクリン−オフ（ｔｅｔｒａｃｙｃｌｉｎｅ−ｏｆｆ）などが挙げられる。
本発明の所定の態様は、ＭＣＪポリペプチド活性を変更するために、例えばＭＣＪポリペプチド活性を減少させるために、ＭＣＪポリペプチドに特異的に結合する抗体またはそれらの抗原結合フラグメントを投与する方法を含む。本発明のいくつかの実施形態において、このような抗体またはそれらの抗原結合フラグメントを細胞および／または対象に投与して、細胞および／または対象中のＭＣＪポリペプチド活性を阻害できる。抗体の「抗原結合フラグメント」という用語は、本明細書で使用される場合、抗原（例えばＭＣＪポリペプチド）に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の部分を指す。当業界公知の方法および慣例的な手法を使用して、本発明の方法で使用するためのＭＣＪを調整する抗体の抗原結合フラグメントを調製し検査することが可能である。本発明のいくつかの実施形態において、抗体は、組換え抗体、ポリクローナル抗体、モノクローナル抗体、ヒト化抗体もしくはキメラ抗体、またはこれらの混合物である。
本明細書では配列番号１として記載されるＭＣＪポリペプチドと特異的に結合することが公知の抗体の例としては、これらに限定されないが、モノクローナル抗体のｉ）ＷＮ．Ｆ３（ＡＴＣＣ番号＃ＰＴＡ−８１３５で寄託されたハイブリドーマＮ−ＭＣＪ ３Ｃ１．３Ｆ３から作製）；ｉｉ）ＷＮ．Ａ１２（ＡＴＣＣ番号＃ＰＴＡ−８１３３で寄託されたハイブリドーマ細胞株Ｎ−ＭＣＪ ３Ｃ１．５Ａ１２から作製）；およびｉｉｉ）ＷＮ．Ｅ４（ＡＴＣＣ番号＃ＰＴＡ−８１３４で寄託されたハイブリドーマ細胞株Ｎ−ＭＣＪ２Ａ２．５Ｅ４から作製）などが挙げられる。（参照により本明細書に組み入れられる２０１０年５月２７日に公開された米国特許公報第２０１００１２９９３１号を参照）。ＷＮ．Ｆ３、ＷＮ．Ａ１２、およびＷＮ．Ｅ４抗体は、本発明の方法でＭＣＪ調節化合物として使用されうる抗体の例である。本発明の方法で使用するための追加の抗体は、本明細書に記載された開示および米国特許公報第２０１００１２９９３１号に記載された開示と併せて当業界公知の方法を使用して生産し検査することが可能である。
本発明の処置方法で投与されてもよい追加の化合物としては、ＭＣＪポリペプチド活性を阻害する小分子または化学物質、およびＭＣＪポリペプチド活性を強化する小分子または化学物質が挙げられる。このような小分子および化学物質を同定および検査する方法としては、本明細書で提供される教示と共に、当業界公知のライブラリーをスクリーニングおよび検査する手法の使用が挙げられる。
本発明のＭＣＪポリペプチドを調整する化合物は、単独で投与されてもよいし、または１つまたは複数の追加の化合物と組み合わせてされてもよい。いくつかの実施形態において、本発明の化合物は、１種または複数の他の治療剤または処置と相乗的な方式で作用して、１種または複数の治療剤または活性の有効性を高めることもできる。したがって、例えばＭＣＪポリペプチド活性を阻害する化合物の投与とカロリー制限処置との併用は、カロリー制限処置の有効性を強化しうる。したがって、ＭＣＪ阻害剤化合物は、相乗的に作用して、代謝性疾患または状態を処置するために投与できる１種または複数の物質または処置の有効性を高めうる。
本発明の方法において、追加のＭＣＪ調節化合物を同定して使用してもよいことが理解されよう。例えば、候補化合物は、本明細書で示されたアッセイおよび方法を使用して、ＭＣＪポリペプチドの活性（レベルおよび／または機能）を増加させるそれらの能力、および代謝性疾患または状態を処置するそれらの能力に関して検査してもよい。
本明細書で説明される本発明のＭＣＪ調節化合物（例えばＭＣＪ分子、抗ＭＣＪポリペプチド抗体もしくはその機能的なフラグメント、小分子ＭＣＪ阻害剤、または小分子ＭＣＪエンハンサーなどを含む化合物）は、本発明の処置方法において、単独で使用してもよいし、または例えば標的化剤、標識化剤、および／もしくは細胞毒性物質などの他の分子とのコンジュゲートで使用してもよい。
本発明の方法に係る有用な標的化剤は、例えば肝細胞、筋細胞、心臓細胞、循環器系の細胞、ニューロン性細胞、グリア細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、造血細胞、上皮細胞、精液、卵母細胞、筋細胞、脂肪細胞、腎細胞、肝実質細胞、または膵臓細胞などの処置しようとする特定の細胞型に、または例えばミトコンドリアなどの細胞器官に本発明の化合物を向かわせる標的化剤である。選ばれる標的化化合物は、代謝性疾患または状態の性質によって決まるであろう。いくつかの場合において、標的化剤を骨格筋、心筋、腎臓、肝臓、脳などに方向付けることが望ましい。当業者であれば、本発明の方法で使用するのに好適な標的化剤について認識しており、それらを選択して使用することが可能であろう。ミトコンドリア用の標的化剤の非限定的な例は、グラミシジンＳベースのミトコンドリア標的化剤、カルニチン−アシルカルニチントランスロカーゼ系、シトクロム、リンゴ酸デヒドロゲナーゼを利用する物質である。本発明のいくつかの実施形態において使用されうる標的化シグナルの例は、参照により本明細書に組み入れられるＤｉｅｋｅｒｔ，Ｋ．ら、ＰＮＡＳ（１９９９）９６巻、２１号、１１７５２〜１１７５７；Ａｄｄｙａ，Ｓ．ら、Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ、（１９９７）１３９巻、３号、５８９〜５９９；Ｄｅｌ Ｇａｉｚｏ、Ｖ．ら、（２００３）Ｍｏｌ．Ｇｅｎ．ａｎｄ Ｍｅｔａｂｏｌ．８０巻、１７０〜１８０に記載される。
本発明の方法で標識化剤を使用して、細胞および組織中のＭＣＪポリペプチドの位置を決定することが可能であり、また標識化剤を使用して、投与された処置化合物の細胞、組織、または細胞器官の位置を判定することも可能である。例えば酵素標識、色素、放射標識などの標識化剤を付着させてそれを利用する手法は当業界周知である。
本発明の組成物、化合物、および方法は、代謝性疾患または状態を処置する他の手法と組み合わせて利用されることにより強化されうる。いくつかの場合において、処置の手順は、例えば医薬品および／または行動処置、カロリーの制限、外科手術などの他の治療剤または処置の投与を含んでいてもよい。したがって、本発明のいくつかの実施形態において、本発明の化合物の投与（例えば、抗ＭＣＪ抗体もしくはその機能的なフラグメント、ＭＣＪポリペプチドをコードする核酸、ＭＣＪポリペプチド、または小分子ＭＣＪエンハンサーもしくは阻害剤の投与）は、例えばカロリーの制限、身体活動の増加、外科手術などの代謝性疾患または状態を処置するための療法と共に行ってもよい。ＭＣＪ調節化合物の投与を含む本発明の処置方法は、代謝性疾患もしくは状態の前のあらゆる段階で使用してもよいし、または代謝性疾患もしくは状態がそれより後の段階にある場合、例えば、これらに限定されないが、代謝性疾患もしくは状態の初期段階、中間の段階、および後期段階にある場合に（これらの段階のいずれかの前および後の全ての時間を含む）使用してもよい。また本発明の方法は、対象において代謝性疾患または障害の進行を減速または停止させることに成功しなかった、最低限の成功しか達成されなかった、および／またはそれまで通り成功しなくなってきた１種または複数の他の医薬品または行動治療法でこれまでに処置された対象にも使用できる。
処置に有効な量
本発明のＭＣＪ調節化合物（例えば、抗ＭＣＪ抗体もしくはその機能的なフラグメント、ＭＣＪポリペプチドをコードする核酸、ＭＣＪポリペプチド、または小分子ＭＣＪエンハンサーもしくは阻害剤など）は、代謝性疾患または状態を処置するのに有効な量で対象に投与される。「代謝性疾患または状態を処置するのに有効な量」は、望ましい生物学的な作用を達成するのに必要な量または十分な量である。例えば、本発明の化合物の有効な量は、（ｉ）疾患または状態の進行を遅延または停止させる；または（ｉｉ）代謝性疾患または状態の１つまたは複数の症状を逆行させるのに必要な量であり得る。本発明のいくつかの態様によれば、有効な量は、代謝性疾患または状態において、代謝性疾患または状態の予防または処置のいずれかにおいて、組み合わせてもしくは共に投与されると、または単独で投与されると治療的応答が生じる本発明の化合物の単独の量、または他の医薬品もしくは処置と組み合わせた本発明の化合物の量である。生物学的作用は、代謝性疾患または状態に起因する症状の改善および／または完全な除去であり得る。他の実施形態において、生物学的作用は、例えば対象が疾患または状態を有さないことを示す診断検査によって証明されるような代謝性疾患または状態の完全な排除である。
典型的には、ＭＣＪポリペプチド活性を増加させる化合物もしくは薬物またはＭＣＪポリペプチドを減少させる化合物もしくは薬物の有効な量は、盲検試験で対照集団に対する被験集団のための有効量を確立する臨床試験で決定されるであろう。いくつかの実施形態において、有効な量は、望ましい応答が生じる量、例えば代謝性疾患または状態を有する対象における細胞または組織中の代謝性疾患または状態を軽減する量であろう。したがって、ＭＣＪポリペプチド活性の低減を特徴とする代謝性疾患もしくは状態、および／またはＭＣＪポリペプチド活性を増加させることが望ましい代謝性疾患もしくは状態を処置するのに有効な量は、投与されると、本組成物が投与されない対象または組織において生じるであろうＭＣＪポリペプチド活性の量よりも多い量に、対象においてＭＣＪポリペプチド活性の量を増加させる量であり得る。同様に、ＭＣＪポリペプチド活性の増加を特徴とする代謝性疾患もしくは状態、および／またはＭＣＪポリペプチド活性を減少させることが望ましい代謝性疾患もしくは状態を処置するのに有効な量は、投与されると、化合物または薬物が投与されない対象または組織において生じるであろうＭＣＪポリペプチド活性の量よりも少ない量に、細胞、組織、および／または対象においてＭＣＪポリペプチド活性を減少させる量であり得る。代謝性疾患または状態を処置する場合において、望ましい応答は、細胞、組織、および／または対象において代謝性疾患または状態の１つまたは複数の症状を低減または除去することであり得る。低減または除去は一時的であってもよいし、または永続的であってもよい。代謝性疾患または状態の状況は、ＭＣＪポリペプチド活性またはＭＣＪポリペプチドをコードする核酸のレベルなどを決定する方法を使用してモニターできる。本発明のいくつかの態様において、代謝性疾患または状態の処置に対する望ましい応答はまた、発症を遅らせることであってもよいし、またはさらに代謝性疾患または状態の発症を予防することであってもよい。
またＭＣＪポリペプチド活性を調整する（増加または減少させる）化合物（また本明細書では、医薬化合物ともいう）の有効な量は、例えば投与後の代謝性疾患または状態の減少などの、細胞または対象における投与の生理学的効果を判定することによっても決定できる。本発明の医薬化合物の有効性を決定するのに好適なアッセイは、当業者に公知であろうし、処置に対する応答レベルを測定するために採用してもよく、さらに少なくとも部分的にこのような測定に基づいて、対象に投与される医薬化合物の量を改変してもよい。処置の量は、例えば治療用組成物の量を増加または減少させること、投与される治療用組成物を変化させること、投与経路を変化させること、投薬のタイミングを変化させること等によって変更してもよい。有効な量は、処置される具体的な状態、処置される対象の年齢および身体的な状態；状態の重症度、処置の持続時間、同時に行われる療法の性質（存在する場合）、具体的な投与経路、ならびに保健専門家の知見および経験の範囲内の追加の要因に応じて変更されるであろう。例えば、有効な量は、個体が有するＭＣＪポリペプチド活性の異常に低いもしくは異常に高いレベルの度合い、および／または代謝性疾患もしくは状態を処置するのに効果的な、達成しようとするＭＣＪポリペプチド活性の望ましいレベルによって決まる場合がある。
代謝性疾患もしくは状態の処置における、または代謝性疾患もしくは状態を発症するリスクの低減における本発明の化合物の有効な量は、使用される具体的な化合物、化合物の送達様式、およびそれが単独で使用されるのか、または組み合わせて使用されるのかに応じて変動し得る。いずれかの特定の適用のための有効な量はまた、処置される代謝性疾患または状態、投与される具体的な化合物、対象の大きさ、または代謝性疾患もしくは状態の重症度のような要因に応じて変更してもよい。当業者であれば、必要以上の実験を行わないで経験的に本発明の特定の化合物の有効な量を決定してもよい。本明細書で示された教示と組み合わせて、様々な活性化合物のなかから選び、例えば効力、相対的生物学的利用率、患者の体重、有害な副作用の重症度、および好ましい投与様式などの要因を検討することにより、特定の対象を処置するのに実質的な毒性を引き起こさず全体として効果的な有効な予防的または治療的処置レジメンを計画できる。
医薬化合物の投薬は、特に何らかの合併症がある場合には、個人の健康管理提供者または獣医師によって適合させてもよい。治療的に有効な量は、１日または数日にわたり、１日１回または複数回の用量投与で、典型的には０．０１ｍｇ／ｋｇから約１０００ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇから約２００ｍｇ／ｋｇ、または約０．２ｍｇ／ｋｇから約２０ｍｇ／ｋｇの範囲で変動する。絶対量は、例えば併用療法、投与回数、ならびに年齢、身体的な状態、大きさ、および体重などの個々の対象のパラメーターなどの様々な要因によって決まるであろう。これらは当業者に周知の要因であり、慣例的な実験だけで検討してもよい。いくつかの実施形態において、最大用量、すなわち確実な医療的判断に従って最大限安全な用量を使用してもよい。
また本発明の化合物の複数回の用量も考慮される。いくつかの場合において、本発明の化合物（例えば、抗ＭＣＪ抗体もしくはその機能的なフラグメント、ＭＣＪポリペプチドをコードする核酸、ＭＣＪポリペプチド、または小分子ＭＣＪエンハンサーもしくは阻害剤など）は、少なくとも毎日、１日おき、週１回、１週間おき、毎月などで投与してもよい。用量は、１日１回、または１日１回より多くで投与してもよく、例えば２４時間の１期間中に２回、３回、４回、５回、またはそれより多くの回数で投与してもよい。
本発明の医薬化合物は、単独で投与してもよいし、互いに組み合わせて投与してもよいし、および／または代謝性疾患もしくは状態を有する対象に投与される他の薬物療法もしくは他の処置レジメンと組み合わせて投与してもよい。前述の方法で使用される医薬組成物は、好ましくは滅菌されており、対象への投与に好適な重量または体積の単位で望ましい応答を生産するのに十分なレベルにＭＣＪポリペプチド活性を調整するであろう有効な量の治療的化合物を含有する。
対象に投与されるＭＣＪポリペプチドの活性を調整するための組成物の用量は、様々なパラメーターに従って、特に使用される投与様式および対象の状態に従って選ぶことができる。他の要因としては、望ましい処置期間が挙げられる。適用された初回用量で対象における応答が不十分な場合、患者の耐性が許容する程度に、それよりも高い用量（または異なるより局所的な送達経路でのより効果的に高い用量）を採用してもよい。
投与方法
ＭＣＪ調節化合物の様々な投与経路が利用可能である。選択される特定の送達様式は、当然ながら処置される特定の状態と治療効果をもたらすのに必要な投薬量とによって決まるであろう。一般的に言えば、本発明の方法は、医学上許容できるあらゆる投与様式（これは、臨床的に許容できない有害作用を引き起こすことなく有効なレベルの保護をもたらすあらゆる様式を意味する）を使用して実施が可能である。本発明のいくつかの実施形態において、本発明の化合物は、経口、経腸、経粘膜、経皮、および／または非経口経路で投与が可能である。用語「非経口」は、皮下、静脈内、筋肉内、腹膜内、および胸骨内注射または点滴技術を含む。他の経路としては、これらに限定されないが、鼻（例えば経鼻胃管を介して）、皮膚、膣、直腸、および舌下が挙げられる。本発明の送達経路は、髄腔内、心室内、または頭蓋内を含み得る。本発明のいくつかの実施形態において、本発明の化合物を遅延放出マトリックス内に入れて、このマトリックスを対象中に留置することにより投与してもよい。本発明のいくつかの態様において、化合物（例えば抗ＭＣＪ抗体もしくはその機能的なフラグメント、ＭＣＪポリペプチドをコードする核酸、ＭＣＪポリペプチド、または小分子ＭＣＪエンハンサーもしくは阻害剤など）は、特定の細胞または細胞器官を標的化する送達物質でコーティングされたナノ粒子を使用して対象細胞に送達されてもよく、このような細胞または細胞器官の非限定的な例は、ミトコンドリアである。
本発明の化合物は、配合物中で投与されてもよく、このような配合物は、薬学的に許容される溶液中で投与されてもよく、このような溶液は、慣例的に、薬学的に許容される濃度の塩、緩衝剤、保存剤、適合性担体、アジュバント、および場合により他の治療用成分を含有してもよい。本発明の方法によれば、化合物は、医薬組成物中で投与されてもよい。一般的に、医薬組成物は、本発明の化合物および薬学的に許容される担体を含む。薬学的に許容される担体は当業者に周知である。薬学的に許容される担体は、本明細書で使用される場合、活性成分の生物活性の有効性、例えば、抗ＭＣＪ抗体もしくはその機能的なフラグメント、ＭＣＪポリペプチドをコードする核酸、ＭＣＪポリペプチド、または小分子ＭＣＪエンハンサーもしくは阻害剤などの化合物の、代謝性疾患または状態を処置する能力に干渉しない非毒性の材料を意味する。
薬学的に許容される担体としては、希釈剤、充填剤、塩、緩衝液、安定剤、可溶化剤、および当業界周知の他の材料が挙げられる。典型的な薬学的に許容される担体は、米国特許第５，２１１，６５７号で説明されており、他のものは当業者に公知である。このような調製物は、慣例的に、塩、緩衝剤、保存剤、適合性担体、および場合により他の治療剤を含有してもよい。医薬で使用される場合、塩は薬学的に許容されるものであるべきであるが、医薬的に許容される塩以外のものも、それらの薬学的に許容される塩を調製するのに都合よく使用される可能性もあり、本発明の範囲から排除されない。このような薬理学的および薬学的に許容される塩としては、これらに限定されないが、以下の酸：塩化水素酸、臭化水素酸、硫酸、硝酸、リン酸、マレイン酸、酢酸、サリチル酸、クエン酸、ギ酸、マロン酸、コハク酸などから調製された塩が挙げられる。また薬学的に許容される塩は、アルカリ金属塩またはアルカリ土類塩、例えばナトリウム塩、カリウム塩またはカルシウム塩などとしても調製できる。
本発明の化合物は、組織に直接投与されてもよい。いくつかの実施形態において、本化合物が投与される組織は、代謝性疾患または状態が発生する可能性が高い組織である。組織への直接投与は、直接注射によって達成してもよい。化合物は、１回で投与してもよいし、またあるいは化合物は、複数回の投与で投与してもよい。複数回投与される場合、化合物は、異なる経路を介して投与してもよい。例えば、最初の（または最初の数回の）投与を罹患組織に直接行い、その後の投与を全身に行ってもよい。
全身に本化合物を送達することが望ましい場合、本化合物を、注射による、例えばボーラス注射または連続点滴による非経口投与用に製剤化してもよい。注射用配合物は、１回投与量で、例えばアンプルまたは複数回投与用容器中に、保存剤を添加して、または保存剤を添加しないで供されてもよい。本組成物は、油性または水性基剤中の懸濁液、溶液またはエマルジョンのような形態をとってもよいし、例えば懸濁化剤、安定化剤、および／または分散剤などの成形剤を含有してもよい。
非経口投与用の調製物としては、滅菌水性または非水溶液、懸濁液、およびエマルジョンが挙げられる。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、例えばオリーブ油などの植物油、および例えばオレイン酸エチルなどの注射用有機エステルである。水性担体としては、水、アルコール性溶液／水溶液、エマルジョンまたは懸濁液、例えば食塩水および緩衝化培地が挙げられる。非経口用の基剤としては、塩化ナトリウム溶液、デキストロース含有リンゲル液、デキストロースおよび塩化ナトリウム、乳酸加リンゲル液、または不揮発性油が挙げられる。静脈内用の基剤としては、流体および栄養素の補充液、電解質の補充液（例えばデキストロース含有リンゲル液をベースとするもの）などが挙げられる。また例えば抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、および不活性ガスなどの保存剤および他の添加剤も存在し得る。より低い用量は、例えば静脈内投与などの他の投与形態の場合に生じることがあろう。適用された初回用量で対象における応答が不十分な場合、患者の耐性が許容する程度に、それよりも高い用量（または異なるより局所的な送達経路でのより効果的に高い用量）を採用してもよい。化合物の適切な全身性または局所レベルを達成するために、必要に応じて１日複数回の用量を使用してもよい。
さらに他の実施形態において、送達手段は、哺乳動物のレシピエントへの埋め込みに好適な生体適合性の微粒子またはインプラントである。本方法に従って有用な典型的な生体内分解性のインプラントはＰＣＴ公報ＷＯ９５／２４９２９号（参照により本明細書に組み入れられる）で説明され、これは、生物学的な高分子を含有させるための生体適合性、生分解性の高分子マトリックスを説明する。このような送達手段は当業界周知であり、対象中での本発明の化合物の持続放出を達成するのに使用が可能であり、分解するのではなく拡散により長期間にわたり放出されるように選択されてもよい。
対象に本発明の化合物を送達するのに、非生分解性および生分解性高分子マトリックスのどちらを使用してもよい。いくつかの実施形態において、マトリックスは生分解性であってもよい。マトリックスポリマーは、天然ポリマーであってもよいし、または合成ポリマーであってもよい。ポリマーは、一般的には数時間程度から１年またはそれより長い期間の、放出されることが望ましい期間に基づいて選択してもよい。典型的には、数時間から３〜１２ヶ月の範囲の期間にわたる放出が使用できる。ポリマーは、場合によりその重量の最大約９０％まで吸水できるヒドロゲルの形態であり、さらに場合により多価イオンまたは他のポリマーで架橋される。
一般的に、本発明の化合物は、生体内分解性のインプラントを使用して、拡散の方式で、またはポリマーマトリックスの分解により送達できる。このような使用のための典型的な合成ポリマーは当業界周知である。生分解性ポリマーおよび非生分解性ポリマーは、当業界公知の方法を使用して本発明の化合物の送達に使用できる。また例えば生体内分解性のヒドロゲルなどの生体接着性ポリマー（その教示が、本明細書に取り入れられるＨ．Ｓ．Ｓａｗｈｎｅｙ、Ｃ．Ｐ．ＰａｔｈａｋおよびＪ．Ａ．Ｈｕｂｅｌｌ ｉｎ Ｍａｃｒｏｍｏｌｅｃｕｌｅｓ、１９９３、２６、５８１〜５８７を参照）を使用しても、処置のための本発明の化合物を送達できる。追加の好適な送達系としては、徐放性、遅延放出または持続放出性送達系が挙げられる。このような系は、化合物の繰り返しの投与を回避することで、対象および医師への利便性を高めることができる。多くのタイプの放出性送達系が利用可能であり当業者に公知である。（例えば：米国特許第５，０７５，１０９号；４，４５２，７７５号；４，６７５，１８９号；５，７３６，１５２号；３，８５４，４８０号；５，１３３，９７４号；および５，４０７，６８６号を参照（これらそれぞれの教示は参照により本明細書に組み入れられる））。加えて、ポンプをベースとするハードウェアの送達系も使用でき、そのうちいくつかは埋め込みに適している。
長期持続放出性インプラントの使用が、再発性の代謝性疾患または状態を発症する対象、および再発性の代謝性疾患または状態を発症するリスクがある対象の予防的処置に特に好適でありうる。長期放出は、本明細書で使用される場合、少なくとも３０日、６０日、９０日またはそれより長く治療的なレベルの活性成分が送達されるようにインプラントが構築され配置されることを意味する。長期持続放出性インプラントは当業者に周知であり、上記で説明した放出系のうちいくつかを含む。
本発明の化合物の治療的配合物は、望ましい純度を有する化合物を任意選択の薬学的に許容される担体、賦形剤または安定剤と混合することによって、凍結乾燥製剤または水溶液の形態で貯蔵用に調製してもよい［Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ ２１版（２００６）］。許容できる担体、賦形剤、または安定剤は、採用される投与量および濃度でレシピエントに対して非毒性であり、このようなものとしては、緩衝液、例えばリン酸緩衝液、クエン酸緩衝液、および他の有機酸の緩衝液；抗酸化剤、例えばアスコルビン酸およびメチオニン；保存剤（例えば、オクタデシルジメチルベンジルアンモニウムクロリド；塩化ヘキサメトニウム；塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム；フェノール、ブチルもしくはベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えばメチルもしくはプロピルパラベンなど；カテコール；レソルシノール；シクロヘキサノール；３−ペンタノール；およびｍ−クレゾールなど）；低分子量（約１０残基未満）のポリペプチド；タンパク質、例えば血清アルブミン、ゼラチン、もしくは免疫グロブリンなど；親水性ポリマー、例えばポリビニルピロリドンなど；アミノ酸、例えばグリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニン、もしくはリシンなど；単糖、二糖類、および他の炭水化物、例えばグルコース、マンノース、もしくはデキストリンなど；キレート剤、例えばＥＤＴＡなど；糖、例えばスクロース、マンニトール、トレハロースもしくはソルビトールなど；塩を形成する対イオン、例えばナトリウムなど；金属複合体（例えば、Ｚｎ−タンパク質複合体）；ならびに／または非イオン界面活性剤、例えばＴＷＥＥＮ（登録商標）、ＰＬＵＲＯＮＩＣＳ（登録商標）もしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などが挙げられる。
検出アッセイおよび診断法
本発明の所定の態様は、異常なＭＣＪポリペプチド活性を特徴とする代謝性疾患または状態の状況を判定する方法を含む。このような方法は、ＭＣＪポリペプチドのレベルまたは機能を決定すること、および決定されたレベルまたは機能を対照のレベルまたは機能と比較することを含み得る。本発明のいくつかの実施形態において、方法は、細胞および／または対象中のＭＣＪポリペプチド、またはＭＣＪポリペプチドをコードする核酸のレベルを検出するためのアッセイにおけるＭＣＪポリペプチドと特異的に結合する抗体または抗原結合フラグメントの使用を含む。このようなアッセイは、対象から生体サンプルを得ること、生体サンプル中のＭＣＪ分子のレベルを決定すること、およびそのレベルを対照レベルと比較することを含み得る。生体サンプルは、本明細書で使用される場合、インビトロでの生体サンプルであってもよいし、またはインビボで検出される（例えば得られる）サンプルであってもよい。生体サンプルは、本明細書で使用される場合、細胞サンプル、組織サンプル、血液サンプル、体液サンプル、細胞内サンプルなどであってもよい。生体サンプルとしては、細胞、組織、または細胞器官が挙げられ、さらに、これらに限定されないが：肝細胞、筋細胞、心臓細胞、循環器系の細胞、ニューロン性細胞、グリア細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、造血細胞、上皮細胞、精液、卵母細胞、筋細胞、脂肪細胞、腎細胞、肝実質細胞、膵臓細胞などの細胞型も挙げられる。本発明のいくつかの実施形態において、生体サンプルは、１種または複数の癌細胞を含んでいてもよい。本発明の所定の実施形態において、生体サンプルは、癌細胞を含まない。
異常なＭＣＪポリペプチド活性を特徴とする代謝性疾患または状態を判定するアッセイとしては、これらに限定されないが、（１）対象における代謝性疾患または状態の処置に対するＭＣＪポリペプチド活性の影響を特徴付けること；（２）対象においてＭＣＪポリペプチド活性（例えば、レベルおよび／または機能）を変更する処置を評価すること；（３）少なくとも部分的に対象の細胞中で決定されたＭＣＪポリペプチド活性に基づいて、代謝性疾患または状態のための処置を選択すること；および（４）対象における代謝性疾患または状態の状況を決定することなどが挙げられる。したがって、本発明の方法の実施形態を使用して、対象を特徴付け、処置レジメンをモニターし、処置を選択して、疾患の状況をよりよく理解することが可能である。例えば、本発明の抗体またはそれらの抗原結合フラグメントおよび本発明の他の方法は、細胞および／または対象中のＭＣＪポリペプチド活性を測定または決定することにおいて有用であり、このようなＭＣＪポリペプチド活性は、細胞および／または対象における代謝性疾患または状態の直接的なインジケーターでありうる。
いくつかの態様において、本発明は、ＭＣＪポリペプチドの活性を決定する様々なアッセイを含む。細胞、組織、対象、およびサンプル（例えば、対象からの、培養中の、など）中のＭＣＪポリペプチドの活性（ＭＣＪポリペプチドのレベルおよび／または機能）を決定するのに有用な本発明の方法としては、これらに限定されないが：結合アッセイ、例えばＭＣＪポリペプチドに特異的に結合する抗体またはそれらの抗原結合フラグメントを使用する結合アッセイ；ゲル電気泳動；マススペクトロメトリー；ＮＭＲ；などが挙げられる。イムノアッセイが本発明に従って使用でき、このようなアッセイとしては、これらに限定されないが、サンドイッチタイプのアッセイ、競合結合アッセイ、一段階の直接的な検査および二段階の検査、例えば当業界で慣例的に使用されるものなどがある。またＭＣＪポリペプチドと特異的に結合する抗体の結合の判定を、インビボで、すなわち生きた対象で、当業界公知の検出可能な標識および好適なインビボの方法を使用して行ってもよい。
本発明の方法およびアッセイ（例えば結合アッセイ、ゲル電気泳動；マススペクトロメトリー；ＮＭＲ；など）を使用して、対象または細胞サンプル（例えば、細胞培養物）におけるＭＣＪポリペプチド活性の変化を経時的に決定してもよい。これは、代謝性疾患または状態のための処置を受けるべき対象におけるＭＣＪポリペプチド活性をモニターすることを可能にし、さらにその時点で代謝性疾患または状態のための療法を受けている対象においてモニターすることも可能にする。したがって、本発明の方法は、対象における代謝性疾患または状態を診断または判定するのに使用されてもよく、さらに様々なタイムポイントで対象におけるＭＣＪポリペプチドの活性を判定するために代謝性疾患または状態の治療的処置の有効性を判定するのにも使用されてもよい。例えば、治療レジメン（代謝性疾患または状態の予防、または代謝性疾患もしくは状態の処置としてのいずれか）の開始の前に、処置レジメンの間に、および／または処置レジメンの後に対象のＭＣＪポリペプチド活性を決定してもよく、そのようにして対象における代謝性疾患または状態の状況に関する情報が提供される。
また細胞または組織中のＭＣＪポリペプチドをコードする核酸またはＭＣＪポリペプチドの発現を増加または減少させることに関する候補ＭＣＪ調節化合物の有効性の判定は、培養物からの細胞に本発明のアッセイを使用すれば、例えばＭＣＪポリペプチド活性を調整することに関して候補ＭＣＪ調節化合物を判定するスクリーニングアッセイとしても行うことができる。細胞、組織、または対象においてＭＣＪポリペプチド活性を変更するＭＣＪ調節化合物は、代謝性疾患もしくは状態の処置で、または代謝性疾患もしくは状態のための前処置として（例えば、それに続く処置のための細胞または対象を調製するために）使用されてもよい。
治療レジメンは、対象における代謝性疾患または状態の予防または処置のどちらでもよいことが理解されよう。いくつかの態様において、本発明は、対象に提供された代謝性疾患または状態のための予防的療法および／または処置に対する対象の応答をモニターするのに使用できる方法を提供する。また本発明の方法（例えば結合アッセイ、ゲル電気泳動；マススペクトロメトリー；ＮＭＲ；など）は、代謝性疾患または状態を発症するリスクがある対象における代謝性疾患または状態の発症、進行、または軽減をモニターするのにも有用であり得る。ＭＣＪポリペプチド活性は、別々の時間に対象から得られた２つ、３つ、４つ、またはそれより多くの生体サンプルで決定してもよい。サンプル中で決定されたＭＣＪポリペプチド活性を比較し、経時的な活性の変化を使用して、対象（もしくは細胞もしくは組織サンプル）における代謝性疾患または状態の状況および段階、および／または対象（もしくは細胞もしくは組織サンプル）における代謝性疾患または状態に対する処置方針の作用を判定してもよい。ＭＣＪポリペプチドと特異的に結合する抗体またはそれらのフラグメントを使用して、代謝性疾患または状態のインジケーターを得ることにより有用な予後の情報を得ることもでき、さらに、対象のための療法を選択すること、例えば薬物療法、行動療法、外科療法などを選択することにも使用できる。
本明細書で説明されるアッセイは、ＭＣＪポリペプチド活性を決定することを含んでいてもよく、このような決定としては、これらに限定されないが、細胞、組織、および対象中のＭＣＪポリペプチドをコードする核酸のレベルを決定すること、および／ＭＣＪポリペプチドのレベルを決定することなどが挙げられる。本発明の様々な方法を実行する場合、ＭＣＪポリペプチドをコードする核酸およびポリペプチドのレベルは多数の方式で決定できる。本発明のいくつかの実施形態において、ＭＣＪポリペプチドをコードする核酸またはポリペプチドのレベルは、それぞれ細胞、組織、または対象において、ＭＣＪポリペプチドをコードする核酸またはポリペプチドの対照レベルと比較して測定される。ＭＣＪポリペプチドをコードする核酸またはポリペプチドのレベルの考えられる１つの測定は、ＭＣＪポリペプチドをコードする核酸またはポリペプチドの絶対レベルの測定である。これは、例えば細胞または組織１単位あたりのＭＣＪポリペプチドをコードする核酸またはポリペプチドで示してもよい。ＭＣＪポリペプチドをコードする核酸またはポリペプチドのレベルの他の測定は、経時的なＭＣＪポリペプチドをコードする核酸またはポリペプチドのレベルの変化の測定である。これは、絶対量で示してもよいし、または経時的な増加もしくは減少のパーセンテージに関して示してもよい。診断方法において、ＭＣＪポリペプチドまたはＭＣＪポリペプチドをコードする核酸と特異的に結合する抗体もしくは抗原結合フラグメントまたは他の化合物を、単独で使用してもよいし、またはすでに当業界公知の所定の抗体または結合化合物と共に使用してもよい。公知の抗体としては、代謝性疾患もしくは状態と関連がある他のタンパク質、または細胞１単位あたりのＭＣＪポリペプチドをコードする核酸もしくはポリペプチドのレベルを定量するのに使用できる他の細胞マーカータンパク質に特異的に結合する抗体などが挙げられる。
上述したように、経時的にＭＣＪポリペプチド活性の変化をモニターすることにより、本発明の化合物（例えば、抗ＭＣＪ抗体もしくはその機能的なフラグメント、ＭＣＪポリペプチドをコードする核酸、ＭＣＪポリペプチド、または小分子ＭＣＪエンハンサーもしくは阻害剤など）を、ＭＣＪポリペプチド活性を特徴付けるのに使用することも可能である。例えば、所定の代謝性疾患および状態では、ＭＣＪポリペプチド活性の増加は、細胞および／または組織における代謝性疾患または状態の可能性の増加と相関し、所定の代謝性疾患および状態では、ＭＣＪポリペプチド活性の減少は、細胞および／または組織における代謝性疾患または状態の可能性の増加と相関する。加えて、所定の代謝性疾患および状態は、異常なＭＣＪポリペプチド活性で直接特徴付けられない場合もあるが、ＭＣＪポリペプチド活性を調整すること（ある場合では増加させること、他の場合では減少させること）によって処置が可能である。各タイプの代謝性疾患または状態において、処置した細胞、組織、または対象におけるＭＣＪポリペプチド活性を判定することが望ましい場合がある。
したがって、経時的にＭＣＪポリペプチド活性レベルをモニターすることにより、対象または細胞培養における代謝性疾患または状態の状況に変化があるかどうかを決定することが可能である。ＭＣＪポリペプチド活性の変化、例えばベースラインの活性レベル、前の活性レベル、または対照の活性レベルの０．１％よりも大きいＭＣＪポリペプチド活性の増加または減少は、それぞれＭＣＪポリペプチド活性を減少または増加させるのに本発明の処置が有効であるかどうか、または本発明の処置が必要かどうかのインジケーターとなり得る。
本発明のいくつかの実施形態において、細胞または組織中のＭＣＪポリペプチド活性の増加は、対象における前のＭＣＪポリペプチド活性の０．２％より大きい増加、０．５％より大きい増加、１．０％より大きい増加、２．０％の増加、３．０％の増加、４．０％の増加、５．０％の増加、７．０％の増加、１０％の増加、１５％の増加、２０％の増加、２５％の増加、３０％の増加、４０％の増加、５０％の増加、またはそれより大きい増加であり得る。本発明のいくつかの実施形態において、細胞または組織中のＭＣＪポリペプチド活性レベルの減少は、０．２％より大きい減少、０．５％より大きい減少、１．０％より大きい減少、２．０％の減少、３．０％の減少、４．０％の減少、５．０％の減少、７．０％の減少、１０％の減少、１５％の減少、２０％の減少、２５％の減少、３０％の減少、４０％の減少、５０％の減少、またはそれより大きい減少であり得る。ＭＣＪポリペプチド活性の増加または減少の経時的な決定は、サンプルもしくは対象中の代謝性疾患もしくは状態の状況の変化、代謝性疾患もしくは状態の処置の有効性、または代謝性疾患もしくは状態における望ましいＭＣＪポリペプチド活性レベルの達成の指標となり得る。
代謝性疾患または状態の状況の決定として、本発明の方法を使用して、異なる時間に取られた２つ以上のサンプルでＭＣＪポリペプチド活性を決定し、その決定を、互いに、および／または対照のＭＣＪポリペプチド活性レベルと比較してもよい。このような比較を使用して、対象における代謝性疾患または状態の状況を決定して、代謝性疾患または状態の処置を評価してもよい。対象から異なる時間および／または異なる日に得られた生体サンプルで測定された対象のＭＣＪポリペプチド活性の比較は、対象における代謝性疾患または状態のあらゆる処置の有効性の尺度として使用できる。当業者であれば、細胞と、代謝性疾患または状態を処置するための候補物質と、またはＭＣＪポリペプチド活性を調整するための候補物質との接触に応答して起こる細胞のＭＣＪポリペプチド活性のあらゆる変化を判定することによって、インビトロで処置方法および候補治療剤の有効性を検査できることを認識するであろう。
当業者には理解されるであろうが、処置の評価も、代謝性疾患または状態の症状または臨床的な評価項目の評価に基づいてもよく、このような評価は、本発明の方法と共に、代謝性疾患もしくは状態の状況および／または代謝性疾患もしくは状態の処置の有効性を判定するのに使用できる。
キット
本発明の組成物および使用説明書を含むキットも本発明の範囲内である。本発明のキットは、例えば抗ＭＣＪ抗体もしくはその機能的なフラグメント、ＭＣＪポリペプチドをコードする核酸、ＭＣＪポリペプチド、または小分子ＭＣＪエンハンサーもしくは阻害剤などの１種または複数の化合物を含んでもよく、このようなキットは、代謝性疾患または状態を処置するのに使用でき、または本発明のいくつかの態様では代謝性疾患または状態を診断またはモニターするのに使用できる。例えば抗ＭＣＪ抗体もしくはその機能的なフラグメント、ＭＣＪポリペプチドをコードする核酸、ＭＣＪポリペプチド、または小分子ＭＣＪエンハンサーもしくは阻害剤などの化合物を含有するキットは、あらゆる好適な組織学的方法、細胞学的方法、血清学的方法または他の方法を使用した、細胞、組織、ならびに／または対象中のＭＣＪポリペプチド活性の処置方法、インビトロでの診断、予後予測、および／もしくはそのレベルのモニターのために調製が可能である。本発明のキットの構成要素は、水性培地中に、または凍結乾燥形態でのいずれかでパッケージ化されてもよい。本発明のキットは、例えば試験管、バイアル、フラスコ、ボトル、注射器、または同種のものなどの１つもしくは複数の容器手段もしくは一連の容器手段を厳重な管理下で受け入れるための区画に分けられた担体を含んでいてもよい。第一の容器手段または一連の容器手段は、１種または複数の化合物、例えば抗ＭＣＪ抗体もしくはその機能的なフラグメント、ＭＣＪポリペプチドをコードする核酸、ＭＣＪポリペプチド、または小分子ＭＣＪエンハンサーもしくは阻害剤などの化合物を含有してもよい。第二の容器手段または一連の容器手段は、化合物を細胞または組織に送達することが可能な標的化用標識またはリンカー−標識中間体を含有してもよい。
また本発明のキットは説明書を含んでもよい。説明書は、典型的には書面の形態であり、本キットによって実践されるアッセイまたは処置を行うための指針、さらにはそのアッセイまたは処置に基づいて決定をなすための指針を提供するであろう。
候補化合物を同定する方法
本発明の所定の態様は、細胞、組織、および／または対象においてＭＣＪポリペプチド活性を調整する候補物質を同定および／またはスクリーニングする方法を含む。方法は、候補物質を細胞または組織と、または対象中で混合することを含み、候補物質との接触の前およびその後のＭＣＪポリペプチド活性を決定できる。好適な対照と比較してＭＣＪポリペプチド活性の量が高いことは、物質がＭＣＪレベルを増加させることができることの指標である。好適な対照と比較してＭＣＪポリペプチド活性の量が低いことは、物質がＭＣＪレベルを減少させることができることの指標である。
代謝性疾患または障害のための候補となる処置を判定するのに有用なアッセイ用の混合物は、候補物質を含む。候補物質は、抗体、小さい有機化合物、小分子、ポリペプチド、核酸などであってもよく、したがってコンビナトリアル抗体ライブラリー、コンビナトリアルタンパク質ライブラリー、有機小分子ライブラリー、または他のあらゆる好適な源から選択できる。典型的には、複数の反応混合物を異なる物質濃度で並行して流すことにより、様々な濃度に対する異なる応答を得る。典型的には、これらの濃度の１つは、すなわち物質濃度ゼロで、またはアッセイ検出限界未満の物質濃度で陰性対照として役立つ。
候補物質がＭＣＪポリペプチド活性を調整するのに有用であり得るかどうか、および代謝性疾患または状態を処置するのに有用であり得るかどうかを決定するために検査が可能な候補物質としては、多数の化学物質のクラス、核酸、タンパク質などが挙げられる。本発明のいくつかの実施形態において、候補物質は、小さい有機化合物、すなわち５０より高く、約２５００未満、好ましくは約１０００未満、より好ましくは約５００未満の分子量を有する有機化合物である。候補物質は、ポリペプチドおよび／または核酸との構造的な相互作用に必要な機能的な化学基を含み、典型的には、少なくともアミン、カルボニル、ヒドロキシル、またはカルボキシル基を含み、好ましくは少なくとも２つの機能的な化学基、より好ましくは少なくとも３つの機能的な化学基を含む。候補物質は、１つまたは複数の上記で特定された官能基で置換された、環式炭素もしくは複素環式構造、および／または芳香族もしくは多環芳香族構造を含んでもよい。また候補物質は、例えばポリペプチド、糖類、脂肪酸、ステロール、イソプレノイド、プリン、ピリミジン、上記のものの誘導体もしくは構造的類似体、またはそれらの組み合わせなどの生体分子であってもよい。
候補物質は、例えば合成または天然化合物のライブラリーなどの多種多様の源から得られる。例えば、多種多様の有機化合物および生体分子のランダム合成および指向性の合成のために多数の手段が利用可能であり、このような手段としては、ランダム化オリゴヌクレオチドの発現、合成有機コンビナトリアルライブラリー、ランダムまたは非ランダムなポリペプチドのファージディスプレイライブラリー、タンパク質または抗体のコンビナトリアルライブラリーなどが挙げられる。あるいは、細菌、真菌、植物、および動物抽出物の形態の天然化合物のライブラリーも利用可能であり、または容易に生産される。加えて、天然および合成的に生産されたライブラリーおよび化合物は、従来の化学的、物理的、および生化学的な手段により容易に改変できる。さらに、公知の物質を例えばアシル化、アルキル化、エステル化、アミド化（ａｍｉｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）などの指向性のまたはランダムな化学修飾で処理して、その物質の構造的類似体を生産してもよい。
また様々な他の試薬も、候補化合物を検査するためのアッセイ用混合物に含まれてもいてもよい。このような試薬としては、例えば塩、緩衝液、中性タンパク質（例えば、アルブミン）、洗浄剤などの試薬が挙げられ、これらは、最適なタンパク質−タンパク質および／またはタンパク質−物質の結合を容易にするのに使用できる。またこのような試薬は、反応成分の非特異的なまたはバックグラウンドの相互作用を低減させうる。例えばプロテアーゼ阻害剤、ヌクレアーゼ阻害剤、抗菌剤などのアッセイ効率を向上させる他の試薬も使用が可能である。成分の添加順、インキュベート温度、インキュベート時間、および他のアッセイのパラメーターは、容易に決定できる。このような実験は単にアッセイのパラメーターの最適化に関与するものであって、アッセイの基本的な組み立てには関与しない。インキュベート温度は、典型的には４℃から４０℃の間である。インキュベート時間は、迅速なハイスループットスクリーニングが容易になるようにできる限り短くてもよく、典型的には０．１から１０時間の間である。インキュベート後、使用者が利用可能なあらゆる便利な方法で、例えばＭＣＪポリペプチドおよびＭＣＪポリペプチド活性の存在または非存在などの可変値を検出してもよい。例えば、ＭＣＪポリペプチド活性は、標準的方法を使用して、且つ本明細書で説明されているようにして検出可能な標識の測定により決定できる。
以下の実施例は、本発明の実施の具体的な例を例示するのに示されたものであり、本発明の範囲を限定する意図はない。当業者には明らかであるように、本発明は、様々な組成物および方法で用途が見出されよう。
実施例１
方法
マウス
Ｃ５７Ｂｌ／６ＪマウスをＪａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ）から購入した。ＭＣＪ標的化胚幹細胞（ＲＲＮ２２６）をＢａｙｇｅｎｏｍｉｃｓ［カリフォルニア大学サンフランシスコ校（ＵＣＳＦ：Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ）、Ｓａｎ Ｆｒａｎｃｉｓｃｏ、ＣＡ］から得た。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｅｒｍｏｎｔ Ｔｒａｎｓｇｅｎｉｃ Ｍｏｕｓｅ Ｆａｃｉｌｉｔｙで、遺伝子を捕獲したＥＳ細胞をＣ５７Ｂｌ／６Ｊの胚盤胞に注射し、偽妊娠した雌に移植した。６匹の雄キメラを得て、そのうち５匹が９５％より高いキメリズムを示した。キメラをＣ５７Ｂｌ／６Ｊ雌と交雑したところ、それらの全てが生殖細胞系伝達を起こした（１００％）。マウスをさらにＣ５７Ｂｌ／６と少なくとも７世代戻し交配した。ＭＣＪホモ接合体ノックアウト作製のためにヘテロ接合体の雄および雌を交雑した。ＭＣＪ ＫＯマウスをさらに、これまでに説明されたＯＴ−Ｉ ＴＣＲトランスジェニックマウス（Ｈｏｇｑｕｉｓｔら、１９９４ Ｃｅｌｌ ７６、１７〜２７）およびＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウス（Ｇｕｙら、１９９２ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２、９５４〜９６１）とも交雑した。マウスを１０から１４週齢の間で使用した。飢餓の研究のために、マウスを、食物を与えずに水で３６時間維持した。血液、肝臓、腎臓、および褐色脂肪を採取した。肝臓のコレステロール蓄積の研究のために、説明されているようにして（２０１２年１０月１７日に電子出版された、Ｐｌａｖｉｎｓｋａｙａ，Ｔ．ら、Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ．Ｅｆｆｅｃｔｓ ｏｆ ａｃｕｔｅ ａｎｄ ｃｈｒｏｎｉｃ ｌｏｗ ｄｅｎｓｉｔｙ ｌｉｐｏｐｒｏｔｅｉｎ ｅｘｐｏｓｕｒｅ ｏｎ ｎｅｕｔｒｏｐｈｉｌ ｆｕｎｃｔｉｏｎを参照）、マウスを高コレステロールの餌（Ｈａｒｌａｎ Ｋｅｋｌａｄ ＴＤ．９０２２２１）で４週間維持した。Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｅｒｍｏｎｔの動物保護施設で、全てのマウスを滅菌条件下で飼育した。この手法は、Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ Ｖｅｒｍｏｎｔ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅで承認された。
細胞調製物、培養条件、増殖、および試薬
ＣＤ８Ｔ細胞およびＣＤ４Ｔ細胞を、これまで説明されたようにして脾臓およびリンパ節から負の選択により（Ａｕｐｈａｎら、１９９８ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ １６０、４８１０〜４８２１；Ｃｏｎｚｅら、２００２ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９５、８１１〜８２３）、さらにＭＡＣＳシステムを製造元（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）が推奨した通りに使用して正の選択により精製した。精製されたＴ細胞を、プレートに結合させた抗ＣＤ３（２Ｃ１１）（５μｇ／ｍｌ）および可溶性抗ＣＤ２８（１μｇ／ｍｌ）（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）ｍＡｂで刺激した。これまで説明されたようにして（Ｃｏｎｚｅら、２００２ Ｊ Ｅｘｐ Ｍｅｄ １９５、８１１〜８２３）抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８で活性化され、［３Ｈ］−チミジンで標識された精製ＣＤ８Ｔ細胞（１０５個の細胞／ウェル）を使用して増殖アッセイを行った。ＭＣＦ７、ＭＣＦ７／ｓｉＭＣＪ、および２９３Ｔ細胞株を、これまで説明されたようにして（Ｈａｔｌｅら、２００７ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２７、２９５２〜２９６６）維持した。ロテノン（１０μＭで使用）をＳｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ（Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）から購入した。リン酸カルシウムによる２９３Ｔ細胞トランスフェクションをこれまで説明されたようにして（Ｈａｔｌｅら、２００７ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２７、２９５２〜２９６６）行った。
ノーザンブロット分析
ヒトおよびマウスの複数の組織のノーザンブロット（ＭＴＮ）をＣｌｏｎｔｅｃｈ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ，Ｉｎｃ．（Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）から購入し、異なる組織からのレベルを標準化したポリＡのＲＮＡを入れた。マウスおよびヒトＭＣＪプローブ両方の放射標識を、説明されているようにして（Ｒｉｎｃｏｎら、１９８８ Ｅｕｒ Ｊ Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｎｏｖ；１８（１１）：１７９１〜６）行い、ノーザンブロット分析を製造元の説明書の通りに行った。
サザンブロット分析
ＮｃｏＩで消化した１０μｇの尾部のゲノムＤＮＡを使用した。ＤＮＡフラグメントをアガロースゲルで分離し、Ｈｙｂｏｎｄ（商標）ナイロンメンブレンに移し、ＭＣＪのイントロン１からＰＣＲで増幅した領域［５’−ｇｔｇｇｇ ｇｇｔｇｔｃｔｇｔｇａａｇｔａｇｔｔｔ−３’（配列番号６）および５’−ｃｔｇｇｇａｔｔｔａａｇｇａｇｔｔｃａｃａａ−３’（配列番号７）］を用いて放射標識したプローブを付けた。
ＲＮＡの単離およびＲＴ−ＰＣＲ
Ｑｉａｇｅｎのｍｉｎｉ ＲＮｅａｓｙ（登録商標）キットを製造元（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖａｌｅｎｃｉａ、ＣＡ）が推奨する通りに使用してトータルＲＮＡを単離した。上述したように（Ｈａｔｌｅら、２００７ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２７、２９５２〜２９６６）逆転写することによって第一の鎖のｃＤＮＡを得た。ｃＤＮＡを使用して、従来のＰＣＲまたはリアルタイムＲＴ−ＰＣＲによりマウスＨＰＲＴ、ＭＣＪ、ベータ２ミクログロブリンを検出した。リアルタイムＲＴ−ＰＣＲ分析（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（商標）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）のために、以下のプライマー／プローブの設計されたセットをマウスＭＣＪに使用した［フォワード５’−ｃｃｇ ａａｔ ａｃｃ ｔｇｃ ｃｔｃ ｃｔｔ ｃｔｇ−３’（配列番号８）、リバース５’−ａｃａ ｃａｇ ｃｇｇ ｇｇａ ｇａａ ｇｇｔ ｔ−３’（配列番号９）、プローブ５’−ｃｃａ ａａｇ ｇｔｃ ｇｇａ ｃｇｃ ｃｇａ ｃａｔ ｃ−３’（配列番号１０）］。ハウスキーピング遺伝子としてヒポキサンチンホスホリボシルトランスフェラーゼ（ＨＰＲＴ）またはβ２−ミクログロブリンを使用した比較用ＣＴ分析法によって、相対値を決定した。以下のプライマーを使用してＭＣＪの従来のＲＴ−ＰＣＲ増幅を行った［５’−ａａｇ ｔａａ ｔｃａ ｃｇｇ ｃａａ ｃａｇ ｃａａ ｇｇ−３’（配列番号１１）および５’−ａａｔ ａａａ ａｇｃ ｃｔｇ ｇｃａ ｇｃｃ ｔｔｇ ｃ−３’（配列番号１２）］。
ウェスタンブロット分析
全細胞抽出物を、これまで説明されたようにして（Ｈａｔｌｅら、２００７ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２７、２９５２〜２９６６）トリトン溶解緩衝液中で調製した。ミトコンドリア抽出物および細胞質抽出物を、ＣＤ８Ｔ細胞およびＭＣＦ７細胞にはＣｅｌｌ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ Ｋｉｔ Ｓｔａｎｄａｒｄ（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）または心臓、腫瘍、および他の組織にはＭｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ Ｆｒａｃｔｉｏｎａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（Ａｃｔｉｖｅ Ｍｏｔｉｆ（登録商標）、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して精製した。特に指定される場合、ラウリルマルトシド（１％）またはジギトニン（２％）のいずれかを用いてミトコンドリア抽出物を可溶化した。これまで説明されたようにして（Ｄａ Ｃｒｕｚ、Ｓ．ら、２００３ Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７８：４１５６６〜４１５７１を参照）、心臓からの精製ミトコンドリア抽出物を使用してミトコンドリア内膜画分の単離を行った。これまで説明されたようにして（Ｈａｔｌｅら、２００７ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２７、２９５２〜２９６６）、ウェスタンブロット分析を行った。親和性免疫精製（Ｃｏｃａｌｉｃｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．（商標）、Ｒｅａｍｓｔｏｗｎ、ＰＡ）後にマウスＭＣＪのＮ末端ペプチド（３５ａａ）で免疫化することにより抗マウスＭＣＪウサギポリクローナルを作製した。抗ヒトＭＣＪマウスモノクローナルＡｂはすでに説明されている（Ｈａｔｌｅら、２００７ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２７、２９５２〜２９６６）。使用される他の抗体は：抗アクチン、抗グリセルアルデヒド−３−リン酸デヒドロゲナーゼ（抗ＧＡＰＤＨ）、抗ウサギＩｇＧ、抗ヤギＩｇＧ、抗マウスＩｇＧ（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ、ＣＡ）、抗ＣｏｘＩＶ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）、抗ＮＤＵＦＡ９および抗ＮＤＵＦＳ３（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）、ならびに複合体ＩＩＩコア１タンパク質（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）；抗グリコーゲン合成酵素（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標））；抗ホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（抗ＰＥＰＣＫ）（Ｓａｎｔａ Ｃｒｕｚ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、Ｄａｌｌａｓ、ＴＸ）；カルレチクリン（Ｅｎｚｏ Ｌｉｆｅ Ｓｃｉｅｎｃｅ、Ｆａｒｍｉｎｇｄａｌｅ、ＮＹ）；ならびにシンタキシン（ｓｉｎｔａｘｉｎ）１１（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ、Ｓａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）であった。ＬｕｍｉＧＬＯ（登録商標）化学発光基質システム（ＫＰＬ、Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ、ＭＤ）を使用して、タンパク質を可視化した。上記で説明したようにして作製されたミトコンドリア抽出物と複合体Ｉ免疫捕獲モノクローナル抗体（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）とを製造元（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）が推奨する通りに使用して複合体Ｉの免疫沈降を行った。上記で説明したようにして作製されたミトコンドリア抽出物を使用して複合体Ｉおよび複合体ＩＩＩの免疫沈降を行い、洗浄剤としてマルトシド（１％）と複合体Ｉまたは複合体ＩＩＩ免疫捕獲モノクローナル抗体（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）とを製造元が推奨する通りに使用して可溶化した。次いでＭＣＪの存在については免疫沈降物を試験するか、または複合体Ｉ、ＩＩＩ、もしくはＩＶサブユニットについては特異的なサブユニットをウェスタンブロッティングで試験した。次いでＭＣＪならびに複合体ＩおよびＩＩＩサブユニットの存在について免疫沈降物をウェスタンブロット分析で試験した。
フローサイトメトリー分析
ＣＤ４、ＣＤ８、Ｔｈｙ１．１、Ｔｈｙ１．２、Ｖα２に対する直接標識された抗体［ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ（Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）およびＢｉｏＬｅｇｅｎｄ（登録商標）（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ、ＣＡ）］を使用して細胞表面の染色を行った。ＵＶ−ブルー色素［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標），Ｉｎｃ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）］を製造元が推奨する通りに使用して細胞生存率に関する染色を行った。テトラメチルローダミン、エチルエステル、過塩素酸塩（ＴＭＲＥ）［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）、Ｉｎｃ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）］（１０μＭ）を用いて３７℃で２０分、製造元が推奨する通りに染色することによりミトコンドリア膜電位分析を行った。Ｍｉｔｏ−ＳＯＸ（商標）−レッド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）（２．５μＭ）を用いて３７℃で１０分、製造元が推奨する通りに染色することによりミトコンドリアＲＯＳ分析を行った。ＬＳＲＩＩフローサイトメーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）およびＦＬＯＷＪＯ（登録商標）ソフトウェア（Ｆｌｏｗｊｏ、Ａｓｈｌａｎｄ、ＯＲ）を使用したフローサイトメトリー分析で全てのサンプルを試験した。
ＭＣＪ発現に関する末梢ＣＤ４Ｔ細胞、ＣＤ８Ｔ細胞、およびＢ細胞の細胞分別による精製を、ＣＤ４、ＣＤ８、およびＢ２２０（Ｂ細胞マーカー）に関するＡｂでの染色と、Ａｒｉａフローセルソーター（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓｐａｒｋｓ、ＭＤ）とを用いて行った。
共焦点顕微鏡分析
本発明者らがこれまでに述べたようにして（Ｈａｔｌｅら、２００７ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２７、２９５２〜２９６６）、共焦点顕微鏡分析のための細胞の調製およびトランスフェクトした２９３Ｔ細胞の免疫染色を行った。ミトコンドリアおよび核それぞれのマーカーとして、Ｍｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）およびＴＯ−ＰＲＯ（登録商標）［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）］を使用した。ＨＡでタグ付けされたＭＣＪ、それに続いて抗ウサギ二次Ａｂ［Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ（登録商標）、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、（Ｂｅｖｅｒｌｙ、ＭＡ）］）を検出するために、抗ＨＡタグＡｂ（Ｃｅｌｌ Ｓｉｇｎａｌｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（登録商標）、Ｄａｎｖｅｒｓ、ＭＡ）を使用した。Ｚｅｉｓｓ ＬＳＭ５１０ ＭＥＴＡ共焦点レーザー走査イメージングシステム（Ｃａｒｌ Ｚｅｉｓｓ Ｍｉｃｒｏｉｍａｇｉｎｇ、Ｔｈｏｒｎｗｏｏｄ、ＮＹ）を使用した共焦点顕微鏡法によりサンプルを試験した。
免疫電子顕微鏡分析
本発明者らがこれまでに述べたようにして（Ｈａｔｌｅら、２００７ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２７、２９５２〜２９６６）、ＭＣＪでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞、新たに単離されたＣＤ８Ｔ細胞または心臓組織の固定された埋め込み型調製物を使用してＭＣＪに関して免疫電子顕微鏡分析を行った。ＭＣＪの検出には、抗マウスＭＣＪウサギポリクローナルＡｂを使用した。
組織学的分析および血清生化学分析
組織学的分析のために、肝臓、腎臓、褐色脂肪、および乳癌を採取し、ホルマリン中で固定し、パラフィンに埋め込んだ。パラフィン包埋ブロックからの組織切片を慣例的な手法に従ってＨ＆Ｅで染色した。Ｏｐｔｒｏｎｉｃｓ（登録商標）（Ｇｏｌｅｔａ、ＣＡ）製のＭａｇｎａｆｉｒｅ（登録商標）デジタルカメラを備えた、またはＥＶＯＳ（登録商標）ＸＬ Ｃｏｒｅ顕微鏡（ＡＭＧ、Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ、Ｇｒａｎｄ Ｉｓｌａｎｄ、ＮＹ）を備えたＯｌｙｍｐｕｓ（登録商標）ＢＸ５０光学顕微鏡によって画像を得た。肝臓における脂質蓄積を分析するために、新たに採取した肝臓をＯＣＴ中で凍結させ、凍結断片をオイルレッドＯで染色した。グリコーゲンの組織学的分析のために、パラフィン包埋肝臓および腎臓断片で過ヨウ素酸シッフ（ＰＡＳ：ｐｅｒｉｏｄｉｃ ａｃｉｄ−Ｓｃｈｉｆｆ）染色を行った。グルコース（ＨＫ）アッセイキットを製造元（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ）が推奨する通りに使用して、肝臓抽出物中のグリコーゲンレベル（１ｍｇに相当）を決定した。トリグリセリド比色キット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ、Ｍｉｌｐｉｔａｓ、ＣＡ）およびケトン体キット（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）を製造元が推奨する通りに使用して、血清中のトリグリセリドレベルを決定した。遊離脂肪酸定量化キット（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（登録商標）、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）および／または遊離脂肪酸定量化キット（ＢｉｏＶｉｓｉｏｎ、Ｍｉｌｐｉｔａｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を製造元が推奨する通りに使用して、血清中および肝臓抽出物中の遊離脂肪酸（ＦＦＡ：ｆｒｅｅ ｆａｔｔｙ ａｃｉｄ）レベルを決定した。Ａｂｃａｍキット（Ａｂｃａｍ、Ｃａｍｂｒｉｄｇｅ、ＭＡ）を使用して、肝臓抽出物中のコレステロールレベル（１ｍｇに相当）を決定した。グルコース−モニタリングシステム（ＬｉｆｅＳｃａｎ、Ｍｉｌｐｉｔａｓ、Ｃａｌｉｆｏｒｎｉａ）を使用して、血液中のグルコースレベルを決定した。
複合体Ｉ活性
複合体Ｉの精製のためのプロトコールに従って作製されたミトコンドリア抽出物（ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を使用して、複合体Ｉ活性の分析を行った。活性アッセイは、ＭｉｔｏＳｃｉｅｎｃｅｓ（登録商標）（Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）製の複合体Ｉ酵素活性マイクロプレートアッセイキットおよび製造元が推奨するプロトコールを使用した。ミトコンドリア抽出物をサンプル間で標準化し、合計で１μｇ（心臓）、５〜２０μｇ（ＭＣＦ７およびＭＣＦ７／ｓｉＭＣＪ細胞）、または１．８μｇ（Ｔ細胞）をアッセイに使用した。
細胞内ＡＴＰレベルの決定
サンプル１つあたり１０４個の細胞（ＣＤ８Ｔ細胞、ＭＣＦ７細胞、２９３Ｔ細胞）、および製造元からの推奨に従ってＡＴＰｌｉｔｅ（登録商標）発光ＡＴＰ検出アッセイシステム（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標）、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）、およびＴＤ−２０／２０ルミノメーター（Ｔｕｒｎｅｒ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ、Ｐｒｏｍｅｇａ（登録商標）、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）を使用して、細胞内ＡＴＰレベルを決定した。乳癌組織中のＡＴＰレベルを分析するために、細胞質およびミトコンドリア抽出物を上記で説明したようにして作製し、ＡＴＰｌｉｔｅ（登録商標）キット（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ（登録商標）、Ｗａｌｔｈａｍ、ＭＡ）を使用してタンパク質１０μｇに等しい量をＡＴＰ含量に関してアッセイした。
ここで、ＭＣＪはミトコンドリア中に存在し、そこでＭＣＪはミトコンドリア呼吸鎖の複合体Ｉの負の調節因子として役立つことが示された。ＭＣＪの喪失により、複合体Ｉ活性の増加、ミトコンドリアの過分極、およびＡＴＰ生成の増加が起こる。ＭＣＪの非存在下におけるエネルギー源としてのミトコンドリアの酸化的リン酸化の強化は、脂肪酸の酸化を促進し、飢餓中の肝臓における脂質の蓄積を予防する。加えて、ＭＣＪの欠損はまた、ミトコンドリアの機能を弱めることができないことと相関して、乳癌増殖も遅延させた。したがって、ＭＣＪは、ミトコンドリア代謝の重要な負の調節因子である。
結果
マウスＭＣＪ／ＤｎａＪＣ１５の同定は、ヒトオーソログでの保存された組織発現パターンを解明する
これまでにＭＣＪ／ＤｎａＪＣ１５の発現は、ヒト卵巣および乳癌細胞で試験されてきた（Ｈａｔｌｅら、２００７ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２７、２９５２〜２９６６；Ｌｉｎｄｓｅｙら、２００５ Ｉｎｔ Ｊ．Ｃａｎｃｅｒ Ｊａｎ １５；１１８（２）：３４６〜５２．；Ｓｈｒｉｄｈａｒら、２００１ Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ ６１、４２５８〜４２６５；Ｓｔｒａｔｈｄｅｅら、２００４ Ｃａｒｃｉｎｏｇｅｎｅｓｉｓ ２５、６９３〜７０１）。これまでに、ＭＣＪは脊椎動物に由来しており、脊椎動物においてＭＣＪは高度に保存されることが報告されたが（Ｈａｔｌｅら、２００７ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２７、２９５２〜２９６６）、マウスにおいてそれに相当するものを報告する研究はなかった。ヒトおよびマウスＭＣＪタンパク質配列の比較分析から、ほぼ同一な膜貫通およびＣ末端ＤｎａＪドメイン領域、同様に高度に保存された（５７％）Ｎ末端領域（１〜３５アミノ酸）と共に全体的に７５％の同一性（図１Ａ）が示された。マウスのＭＣＪ遺伝子の組織発現パターンを同定するために、上記で概説した方法を使用してノーザンブロット分析を行った。ＭＣＪのｍＲＮＡは心臓で極めて豊富であり、それに続いて肝臓および腎臓で豊富であった（図１Ｂ）。ＭＣＪはいくつかのヒト癌細胞で発現されるが、正常なヒト組織における特異的なＭＣＪ発現分布はいまだ不明である。良性のヒト組織のノーザンブロット分析から、ヒトのｍｃｊ遺伝子発現の分布はマウスのｍｃｊ遺伝子に類似することが示された（図１Ｃ）。ＣＤ８Ｔ細胞を使用して行われた以前のマイクロアレイ分析から、ＭＣＪはこの免疫細胞型にも存在することが示された（データ示さず）。免疫系の異なる集団におけるＭＣＪ発現をさらに調査するために、マウス脾臓およびリンパ節からＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞、加えてＢ細胞を単離し、リアルタイム逆転写酵素（ＲＴ）ＰＣＲを行った。興味深いことに、ＣＤ８Ｔ細胞ではｍｃｊ遺伝子発現は極めて高かったが、ＣＤ４Ｔ細胞およびＢ細胞ではほとんど検出不可能であった（図１Ｄ）。
マウスのＭＣＪでトランスフェクトした２９３Ｔ細胞のウェスタンブロット分析で確認されたように、マウスＭＣＪのＮ末端領域を特異的に認識する抗体（Ａｂ）を作製した（図１Ｅ）。このＡｂを使用して、マウス組織における内因性ＭＣＪタンパク質の発現をウェスタンブロット分析で試験した。ｍＲＮＡ発現分析と一致して、ＭＣＪタンパク質は心臓、肝臓、および腎臓に存在したが、肺ではほとんど検出不可能であった（図１Ｆ）。またＭＣＪタンパク質はＣＤ８Ｔ細胞では豊富であったが、ＣＤ４Ｔ細胞では少なかった（図１Ｇ）。したがって、ＭＣＪ／ＤｎａＪＣ１５は限定的な組織および細胞分布を有することが確認された。
ＭＣＪ／ＤｎａＪＣ１５は、新規のミトコンドリア内在性コシャペロンである
系統発生的分析から、ＭＣＪの祖先は酵母に存在するＴｉｍ１４であることが示された（Ｍｏｋｒａｎｊａｃら、２００３ Ｅｍｂｏ Ｊ ２２、４９４５〜４９５６）。Ｔｉｍ１４はミトコンドリア内膜に局所しており、ＴＩＭ２３トランスロカーゼの構成要素である（Ｍｏｋｒａｎｊａｃら、２００５ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ ２８０、３１６０８〜３１６１４）。これまでに、（内因性ＭＣＪを発現しない）２９３Ｔ細胞でのＭＣＪの過剰発現分析、および共焦点顕微鏡法を使用したＭｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）染色（Ｈａｔｌｅら、２００７ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２７、２９５２〜２９６６）に基づいてＭＣＪはミトコンドリア中に局在しないことが報告された。加えて、トランスフェクトした２９３Ｔ細胞において、免疫電子顕微鏡法（ＩＥＭ）では輪郭のはっきりしたミトコンドリアでＭＣＪの免疫染色は見出されなかったが、未同定の他の電子密度の高い小胞／細胞器官でＭＣＪの免疫反応性が観察された（Ｈａｔｌｅら、２００７ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２７、２９５２〜２９６６）。正常組織でＭＣＪの可能性のある機能をより厳密に調べるために、生理学的条件下で、ＩＥＭによって心臓における内因性ＭＣＪの局在化を試験した。ほとんどのＭＣＪの免疫反応性が、輪郭のはっきりしたミトコンドリアで、内膜において優勢に見出された（図２Ａ）。さらに精製ＣＤ８Ｔ細胞でもＩＥＭによりＭＣＪ発現を試験した。結果から、ほとんど例外なくＭＣＪはＣＤ８Ｔ細胞のミトコンドリアに局在することが示された（図２Ｂ）。２４時間にわたるＭＣＪを過剰発現する２９３Ｔ細胞における、ＩＥＭによるＭＣＪのより詳細な分析から、内膜に形成されたクリスタが失われ分解を受けた、不明瞭な、膨張したミトコンドリアである可能性がある未同定の細胞器官中に、ＭＣＪの免疫反応性が存在することが解明された（図２Ｃ）。ＭＣＪでトランスフェクト（２４時間）した２９３Ｔ細胞中のＭＣＪおよびＭｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）に関する共焦点顕微鏡分析から、非トランスフェクト細胞ではＭｉｔｏ Ｔｒａｃｋｅｒ（登録商標）染色によりミトコンドリアが明示されたが、ＭＣＪを過剰発現する細胞ではミトコンドリア染色はほとんど検出不可能であったことが示された（図２Ｄ〜Ｆ）。したがって、ＭＣＪは、生理学的条件下ではミトコンドリアに局在するが、この細胞器官においてＭＣＪが長期的に過剰発現されると明らかな構造的損傷をもたらすことが見出された。
内因性ＭＣＪのミトコンドリアにおける局在化をさらに実証するために、マウス心臓のミトコンドリアおよび細胞質画分でＭＣＪのウェスタンブロット分析を行った。ミトコンドリア画分では高レベルのＭＣＪが見出されたが、細胞質画分ではほとんど検出不可能であった（図２Ｇ）。画分の純度を、ミトコンドリアのマーカーとして呼吸鎖の複合体ＩＶ（ＣｏｘＩＶ）の発現、および細胞質画分のマーカーとしてＧＡＰＤＨの発現によって決定した（図２Ｇ）。ＭＣＪは、ほとんど例外なく精製ＣＤ８Ｔ細胞のミトコンドリア画分中にも存在した（図２Ｈ）。核画分ではＭＣＪを検出できなかった（データ示さず）。さらに、乳癌ＭＣＦ７細胞株における内因性ヒトＭＣＪのウェスタンブロット分析からも、主としてミトコンドリア中でＭＣＪの存在が示された（図２Ｉ）。したがって、内因性ＭＣＪは選択的にミトコンドリアに局在し、ミトコンドリア内部において内因性ＭＣＪはクリスタの内膜に固定されるようである。
ＭＣＪはミトコンドリア膜電位およびＡＴＰ生産の負の調節因子として機能する
ミトコンドリアの主要な機能は、酸化的リン酸化を介して細胞にエネルギー源としてＡＴＰを供給することである。電子の移動に加えて、ミトコンドリア電子移動鎖（ＥＴＣ：ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａ ｅｌｅｃｔｒｏｎ ｔｒａｎｓｆｅｒ ｃｈａｉｎ）の複合体Ｉ、ＩＩＩ、およびＩＶは、ミトコンドリアのマトリックスから膜間腔への膜を介したＨ＋輸送を促進することによりミトコンドリア膜電位（ＭＭＰ：ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｍｅｍｂｒａｎｅ ｐｏｔｅｎｔｉａｌ）の確立に寄与する。複合体Ｖ（ＡＴＰシンターゼ）は、ミトコンドリアのマトリックスへのＨ＋の還流により生成したエネルギーを使用して、ＡＴＰを生成する。ＭＣＪがミトコンドリアの機能を調整できるのかどうかを決定するために、ＭＣＪを発現することが公知の（Ｈａｔｌｅら、２００７ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２７、２９５２〜２９６６）ＭＣＦ７乳癌細胞中のＡＴＰレベルを、ＭＣＦ７／ｓｉＭＣＪ細胞中のレベルと比較した（ここでＭＣＦ７細胞は、ＭＣＪのｓｈＲＮＡによりＭＣＪ発現がノックダウンされていた）（Ｈａｔｌｅら、２００７ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２７、２９５２〜２９６６）。興味深いことに、ＭＣＦ７／ｓｉＭＣＪ細胞中のＡＴＰレベルは、ＭＣＦ７細胞よりも著しく高かった（図３Ａ）。ＭＣＦ７／ｓｉＭＣＪ細胞におけるＡＴＰ量の上昇は、主としてミトコンドリアに起因するものであり、これはなぜなら、ロテノンによるＥＴＣ複合体Ｉの阻害によりＡＴＰレベルが低減されたためである（図３Ｂ）。これらの結果から、ＭＣＪは、ミトコンドリアのＡＴＰ合成の負の調節因子であることが示唆された。これらの結果をさらに確認するために、ＭＣＪ発現後、２９３Ｔ細胞中のＡＴＰレベルを試験した。２９３Ｔ細胞をわずか１６時間でトランスフェクトすることにより、２４時間後に観察されるミトコンドリアの損傷を回避した（図２）。プラスミド対照細胞と比べてＭＣＪを発現する細胞ではＡＴＰレベルが高度に低減されたことから（図３Ｃ）、ＭＣＪがＡＴＰ生産を負に調節することがさらに実証された。
ＭＣＪはミトコンドリア内膜に局在するため、ミトコンドリアのＡＴＰ合成を制限するメカニズムとしてＭＣＪがＭＭＰを損なう可能性があるかどうかを調査した。２９３Ｔ細胞をＭＣＪまたは対照プラスミドでトランスフェクトし（１６時間）、ＭＭＰをＴＭＲＥ染色とフローサイトメトリー分析で試験した。より低いＴＭＲＥ強度で決定されたように（図３Ｄ）、ＭＣＪ発現は明らかにミトコンドリアを脱分極させたことから、ＭＣＪ発現はＭＭＰを消失させる可能性があることが示された。長期的なミトコンドリア脱分極は、より長い期間でトランスフェクトした２９３Ｔ細胞で観察されたミトコンドリア損傷（図２）の原因である可能性がある。ＭＣＪは、ＣＤ４Ｔ細胞と比較してＣＤ８では豊富に発現されるため（図２）、新たに野生型マウスから単離された２つの細胞型間のＭＭＰの差も分析した。興味深いことに、ＣＤ８Ｔ細胞でＭＣＪが選択的に存在することと相関して、ＣＤ４Ｔ細胞中のミトコンドリアと比較して、ほとんどのＣＤ８Ｔ細胞でミトコンドリアは脱分極した（図３Ｅ）。またＥＴＣは、主として複合体ＩＩＩからの電子の逸散によるミトコンドリアの活性酸素種（ｍＲＯＳ：ｍｉｔｏｃｈｏｎｄｒｉａｌ ｒｅａｃｔｉｖｅ ｏｘｙｇｅｎ ｓｐｅｃｉｅｓ）の生成にも寄与する可能性がある（ＨａｍａｎａｋａおよびＣｈａｎｄｅｌ、２０１０ Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｃｈｅｍ Ｓｃｉ ３５、５０５〜５１３）。ＭＭＰとは異なり、ＭｉｔｏＳｏｘ（登録商標）−レッドでの染色とフローサイトメトリーによるミトコンドリアＲＯＳ（ｍＲＯＳ）の分析から、ＣＤ４Ｔ細胞とＣＤ８Ｔ細胞との間でｍＲＯＳのレベルに差がないことが示された（図３Ｆ）。ミトコンドリアの機能におけるＭＣＪの役割をさらに詳細に調べて、ＣＤ８Ｔ細胞の脱分極した状態がＭＣＪの存在によって引き起こされるのかどうかを決定するために、ＭＣＪ欠損マウスを作製した。
ＭＣＪ欠損マウスの遺伝子型をサザンブロット分析で確認した（図４Ａ）。ＭＣＪ発現の喪失を確認するために、ウェスタンブロット分析により異なる組織で内因性ＭＣＪタンパク質レベルを試験した。ＭＣＪは野生型マウスからの心臓および肝臓で検出されたが、ＭＣＪノックアウト（ＫＯ）マウスでは検出されなかった（図４Ｂ）。ＭＣＪ ＫＯマウスからのＣＤ８Ｔ細胞では、ＭＣＪ発現も無効になった（図４Ｂ）。野生型またはＭＣＪ ＫＯマウスのどちらからのＣＤ４Ｔ細胞でもＭＣＪは検出できなかった（図４Ｂ）。加えて、ＭＣＪ標的化マウスではＭＣＪのｍＲＮＡも検出できなかったことから、ＭＣＪ発現の喪失が確認された（図４Ｃ）。さらにヘテロ接合体マウスでもＭＣＪのｍＲＮＡレベルが野生型ＣＤ８Ｔ細胞と比較して低減したことから（図４Ｃ）、ＣＤ８Ｔ細胞におけるＭＣＪ発現は対立遺伝子のコピー数に依存することが示唆される。ＭＣＪ発現の破壊は、試験した年齢（およそ１歳）まではマウスの生存率に影響を与えなかった。雄および雌ＭＣＪ欠損マウスは両方とも妊娠可能であり、いかなる明白な奇形または行動異常も示さなかった（データ示さず）。したがって、ＭＣＪは、生理学的条件下において発達および／または正常な臓器の機能に必須ではない。ＭＣＪが、ミトコンドリアが脱分極した状態を維持するのに寄与することを実証するために、野生型およびＭＣＪ ＫＯマウスから単離されたＣＤ８Ｔ細胞でＭＭＰを試験した。野生型ＣＤ８Ｔ細胞と比べて、ＭＣＪ ＫＯマウスからのＣＤ８Ｔ細胞は、野生型ＣＤ４Ｔ細胞に匹敵するレベルにまで過分極化した（図３Ｇ）。野生型ＣＤ８Ｔ細胞とＭＣＪ ＫＯのＣＤ８Ｔ細胞との間でｍＲＯＳの差は観察できなかった（図３Ｈ）。予想通りに、野生型およびＭＣＪ ＫＯマウスからのＣＤ４Ｔ細胞の分析から、ＭＭＰ（図３Ｉ）またはｍＲＯＳ（図３Ｊ）に差がないことが示され、これは、ＣＤ４Ｔ細胞におけるＭＣＪの低い発現と一致する。
総合すると、結果から、ＭＣＪは、ミトコンドリア電子移動鎖の負の調節因子であり、ＭＣＪの存在は、ミトコンドリアが脱分極した状態を維持しミトコンドリアによるＡＴＰ生成を制限するのに役立つことが実証された。したがって、ＭＣＪの喪失により、ミトコンドリアの過分極が生じる。
ＭＣＪは、エフェクターＣＤ８Ｔ細胞の収縮期中にミトコンドリア代謝を弱める
野生型ＣＤ８Ｔ細胞に対するＭＣＪ ＫＯのＣＤ８Ｔ細胞におけるミトコンドリアの過分極がそれらの発達に影響を与える可能性があるかどうかを試験した。ＭＣＪノックアウトマウスでは、リンパ節（図５Ａ）および脾臓（データ示さず）中のＣＤ８Ｔ細胞のパーセンテージおよび数は影響を受けなかった。同様に、ＭＣＪ ＫＯマウスにおいて、胸腺細胞集団の差も観察されなかった（データ示さず）。したがって、ＭＣＪは、末梢免疫系におけるＣＤ８Ｔ細胞の発達またはホメオスタシスにとって必須ではないようである。さらにＭＣＪの喪失がＣＤ８Ｔ細胞の増殖応答に与える可能性がある作用も試験した。精製ＣＤ８Ｔ細胞を抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８抗体で活性化した。［３Ｈ］−チミジンの取り込みにより増殖を測定した。ＭＣＪ ＫＯマウスと対照野生型マウスとの間でＣＤ８Ｔ細胞の増殖応答における実質的な差は観察されなかった（図６Ａ）。加えて、ミトコンドリア中のＭＣＪが存在するにもかかわらず、ＭＣＪ欠損マウスからのＣＤ８Ｔ細胞は、活性化中にそれほど速く細胞死に至らなかった（図５Ｂ）。また活性化中の野生型ＣＤ８Ｔ細胞とＭＣＪ ＫＯのＣＤ８Ｔ細胞との間の活性化マーカー（例えばＣＤ６９、ＣＤ４４、ＣＤ２５）の発現も同等であった（データ示さず）。したがって、ＭＣＪは、ＣＤ８Ｔ細胞の活性化またはクローン増殖には必要ではないようである。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８ＡｂによるＣＤ８Ｔ細胞の活性化中のＭＭＰの調節をさらに試験した。野生型ＣＤ８Ｔ細胞では、活性化中にＭＭＰが次第に増加した（図６Ｂ）。ＭＣＪ ＫＯのＣＤ８Ｔ細胞および野生型ＣＤ４Ｔ細胞でも活性化に伴いＭＭＰはわずかに増加したが、活性化前にすでに高度に過分極化した段階であったためその作用はそれほど顕著なものではなかった（図６Ｂ）。２日後、野生型ＣＤ８Ｔ細胞中のＭＭＰレベルは、活性化されたＭＣＪ ＫＯのＣＤ８Ｔ細胞および野生型ＣＤ４Ｔ細胞のＭＭＰレベルと同様のレベルに達した（図４Ｂ）。またｍＲＯＳレベルも、活性化から２日後、野生型ＣＤ８Ｔ細胞とＭＣＪ ＫＯのＣＤ８Ｔ細胞との間で同等であった（図７）。
免疫応答の収縮期中に、ほとんどのエフェクターＣＤ８Ｔ細胞が死滅するが、生き残って最終的にメモリー細胞になる細胞は、非活性化ナイーブＣＤ８Ｔ細胞で見出される基礎レベルまでそれらの代謝を回復させるような変化を経る。ＣＤ８Ｔ細胞の休止段階にエフェクターが移行する間のＭＭＰ調節を試験した。抗ＣＤ３および抗ＣＤ２８Ａｂで活性化してから２日後に、野生型およびＭＣＪ ＫＯのＣＤ８Ｔ細胞を洗浄し、培地単独で２４時間または４８時間インキュベートした。２４時間後、野生型およびＭＣＪ ＫＯのＣＤ８Ｔ細胞は両方とも過分極化したままであったが、ＭＣＪ ＫＯのＣＤ８Ｔ細胞ではＭＭＰがそれよりもわずかに高いままであった（図６Ｃ）。しかしながら、興味深いことに、４８時間後、野生型ＣＤ８Ｔ細胞の大部分がすでにナイーブＣＤ８Ｔ細胞で見出されるレベルまで脱分極した状態になったが、ほとんどのＭＣＪ ＫＯのＣＤ８Ｔ細胞は過分極化したままであった（図６Ｃ）。したがって、エフェクターＣＤ８Ｔ細胞の休止段階中、ＭＣＪはミトコンドリア脱分極に必要であり、ナイーブ細胞でみられる低いレベルにＭＭＰを回復させることが見出された。またｍＲＯＳのレベルも経時的に減少したが、野生型ＣＤ８Ｔ細胞とＭＣＪ ＫＯのＣＤ８Ｔ細胞との間に著しい差はなかった（図６Ｄ）。また、休止期間中に、野生型ＣＤ８Ｔ細胞は、それらのサイズをナイーブ細胞に匹敵するサイズにまで低減させたが、ＭＣＪ ＫＯのＣＤ８Ｔ細胞はより大きいままであったことも観察され（データ示さず）、これは、ＭＣＪの欠損により誘導されたミトコンドリア代謝を維持することにより、活性な細胞代謝の維持が起こることを示唆する。この活性な代謝の維持を裏付けるものとして、休止期間中、ＭＣＪ欠損におけるＡＴＰレベルは、野生型＼ＣＤ８Ｔ細胞におけるＡＴＰレベルよりもより高いままであった（図６Ｅ）。代謝に対するＭＣＪの欠損の作用がインビトロでの細胞生存に影響を与える可能性があるかどうかを決定するために、生細胞の回復を測定した。インビトロで２日の休止期間後、野生型ＣＤ８Ｔ細胞の生存は最低であったことが見出されたが、ＭＣＪ ＫＯのＣＤ８Ｔ細胞はほぼ１００％生存したままであり（図６Ｆ）、これは、活性化の際のＣＤ８Ｔ細胞集団の収縮にＭＣＪが寄与することを示す。
インビボでエフェクターが休止段階に移行する間の抗原特異的なＣＤ８Ｔ細胞の代謝におけるＭＣＪの役割にさらに検討するために、ＭＣＪ ＫＯマウスを、オバルブミンを認識するＴＣＲを発現するＯＴ−Ｉ ＴＣＲトランスジェニックマウス（Ｈｏｇｑｕｉｓｔら、１９９４ Ｃｅｌｌ ７６、１７〜２７）と交雑し、モノクローナルＴ細胞集団を作製した。野生型およびＭＣＪ ＫＯから精製したＯＴ−Ｉ ＣＤ８Ｔ細胞を活性化し、インビトロで増殖させた。等数の各細胞型を混合して共に野生型宿主マウスに移植した。１５日後、Ｔｈｙ１．１およびＴｈｙ１．２マーカーを使用したフローサイトメトリー分析によって宿主マウスからのリンパ節および脾臓中のドナー細胞の存在を試験し、同様に細胞のサイズを決定するためにサイズのばらつきも試験した。両方のドナーの回収のパーセンテージは同等であったが（データ示さず）、ほとんどの野生型ドナーＯＴ−１ ＣＤ８Ｔ細胞（Ｔｈｙ１．１＋）は予想通りに小さく、一方でかなりの割合のＭＣＪ ＫＯのＯＴ−１ ＣＤ８Ｔ細胞（Ｔｈｙ１．１＋Ｔｈｙ１．２＋）は大きいサイズを示した（図６Ｇ）。したがって、結果から、インビボで、抗原の非存在下において、ＭＣＪの欠損は、エフェクターＣＤ８Ｔ細胞の長期にわたる活性な代謝状態を引き起こすことが示され、これは、ＭＣＪは、ＣＤ８Ｔ細胞の休止段階にエフェクターが移行する間のミトコンドリア代謝を弱めることに寄与することを示す。
ＭＣＪの喪失によるミトコンドリア代謝の強化は飢餓中の肝臓の脂肪変性を予防する
ミトコンドリア代謝を弱めるＭＣＪの役割は、基礎（生理学的な）条件下でＭＣＪ欠損マウスの異常な表現型がないことと相関する。しかしながら、エフェクターＣＤ８Ｔ細胞の休止期の誘導と同様に、ＭＣＪの欠損は、代謝バランスが破壊されている状況で作用を有する可能性がある。絶食は強烈な代謝の変化を引き起こすが、これはなぜなら、十分なグルコースがないことにより、脂肪組織中に保存されたトリグリセリドが遊離脂肪酸（ＦＦＡ）に加水分解し始め、そのＦＦＡが血漿に動員されて肝臓に輸送されるためである。肝臓において、ＦＦＡはミトコンドリアのβ−酸化に取り込まれてエネルギー源として使用される。ＭＣＪは肝臓で高度に発現されるため、ＭＣＪの非存在下におけるミトコンドリア代謝の増加／維持は、ＦＦＡのβ−酸化を促進して、それらの肝臓での蓄積を最小化する可能性があるとの仮説が立てられた。絶食時代謝中のＭＣＪの役割を試験した。正常な（給餌）条件下での肝臓の組織像的分析から、野生型マウスとＭＣＪ欠損マウスとの間に検出可能な差がないことが示された（図８Ａ）。３６時間絶食した野生型マウスの肝臓は、小胞が豊富な細胞の存在によって決定したところ明らかな脂肪変性の徴候を示した（図８Ａ）。それに対して、絶食したＭＣＪ ＫＯマウスからの肝臓では最小の徴候しか検出されなかった（図８Ａ）。オイルレッドＯ染色による肝臓の凍結断片における脂質の蓄積の分析からさらに、絶食した野生型マウスにおいて大量の脂質の存在が確認されたが、ＭＣＪ ＫＯマウスの肝臓では低いレベルでしか存在しなかった（図８Ｂ）。これらの結果から、ＭＣＪ ＫＯマウスにおけるミトコンドリアのＦＦＡ酸化の維持は、肝臓における脂質の蓄積を最小化することが示唆された。トリグリセリドおよびＦＦＡの血清レベルも試験した。絶食したＭＣＪ ＫＯマウスにおいて、トリグリセリド（図８Ｃ）およびＦＦＡ（図８Ｄ）の両方のレベルが野生型マウスと比較して低減されたことから、保存された脂質の消費が促進されたことがさらに実証される。一貫して、絶食したＭＣＪ ＫＯマウスでは最小の白色脂肪量が維持されることが観察された（データ示さず）。加えて、野生型マウスとＭＣＪ ＫＯマウスとの間に正常条件（給餌）での褐色脂肪には明白な差が見出されなかった（図９Ａおよび９Ｂ）にもかかわらず、絶食後の褐色脂肪のグロス分析（図１０Ａ）および組織学的分析（図１０Ｂ）では、ＭＣＪ ＫＯマウスにおいて褐色脂肪がほぼ完全に存在しないことが解明された。したがって、結果から、ＭＣＪは、ミトコンドリアの機能の負の調節因子として、絶食中の代謝調節において役割を果たすことが示された。
ＭＣＪの喪失は、代謝の変化に応答した肝臓における脂質の蓄積および脂肪変性を予防する
絶食中のマウスで代謝の促進が確認されたが、ＭＣＪ ＫＯマウス（ｎｉｃｅ）において絶食によって引き起こされる体重減少は、野生型マウスにおける体重減少とは、最初の体重は２つのグループで同等であったとしても（図１１Ｂ）統計学的に異なっていなかった（図１１Ａ）。加えて、絶食中の血中グルコースレベルの分析から、最初のグルコース低下（１２時間）（図１１Ｃ）または回復（図１１Ｄ）のいずれかの間、ＭＣＪ ＫＯマウスと野生型マウスとの間に統計学的に有意差はなかったことが示された。これらの結果から、ＭＣＪの非存在下で肝臓における脂質代謝促進のバランスをとるメカニズムの存在が示唆された。肝臓でのミトコンドリアによる遊離脂肪酸（ＦＦＡ）β−酸化の増加は、（β−酸化を介した）ＡＴＰレベルの増加、加えて脂質の破壊の結果生じるグリセロールレベルの増加に繋がる可能性がある。ＡＴＰおよびグリセロールの蓄積は、糖生成（多大なエネルギーを要するプロセス）を開始させて過剰なエネルギーを保存するためのシグナルとして肝臓で感知できる。絶食後の肝臓中のＡＴＰレベルの分析を行い、野生型マウスの肝臓に対するＭＣＪ ＫＯマウスの肝臓におけるＡＴＰレベルの増加を確認した（図１１Ｅ）。肝臓中のグリコーゲンレベルをＰＡＳ染色で試験した。予想通りに、絶食した野生型マウスの肝臓においてグリコーゲンはほとんど検出不可能であった（図１１Ｆ）。しかしながら、絶食したＭＣＪ ＫＯマウスの肝臓には高レベルのグリコーゲンが蓄積した（図１１Ｆ）。肝臓に加えて、糖生成は、それほどではないが腎皮質でも起こる可能性がある。絶食したＭＣＪ ＫＯマウスにおいて、グリコーゲンの蓄積は、ＰＡＳ染色により腎臓のいくつかの領域でも見出される場合がある。肝臓抽出物中のグリコーゲンの生化学的分析からさらに、絶食したＭＣＪ ＫＯマウスにおけるグリコーゲンの選択的な蓄積が実証された（図１１Ｇ）。絶食していない野生型マウスの肝臓中のグリコーゲンの基礎レベルと絶食していないＭＣＪ ＫＯマウスとの間に差は見出されなかった（図１１Ｇ）。絶食したＭＣＪ ＫＯマウスの肝臓において脂質の代わりにグリコーゲンが蓄積されたことは、肝臓と体重との比率が野生型マウスと比べて増加したことと相関していた（図１１Ｈ）。グリコーゲンは、基質としてＵＤＰ−グルコースを使用してグリコーゲン合成酵素により合成される。絶食したＭＣＪ ＫＯマウスからの肝臓では、野生型マウスに比べてグリコーゲン合成酵素のレベルがアップレギュレートされた（図１１Ｉ）。それに対して、ピルベートからのグルコース合成において必須の糖新生酵素であるホスホエノールピルビン酸カルボキシキナーゼ（ＰＥＰＣＫ）のレベルは、絶食したＷＴおよびＭＣＪ ＫＯマウスで同等であり（図１１Ｉ）、これは、ＭＣＪ ＫＯマウスの肝臓に存在するグリコーゲンは、トリグリセリドの加水分解によって生じたグルコースと一緒に生成した可能性があることを示唆する。
ミトコンドリア呼吸におけるその負の役割に従って、これらの結果から、ＭＣＪは、絶食中の肝臓（ｌｅｖｅｒ）の代謝の必須の調節因子であること、さらにＭＣＪの非存在は肝臓での脂質分解および糖生成において有利であることが示される。ＭＣＪはさらに、他の変更された食事条件にも応答して代謝調節において役割を果たす可能性があるかどうかを検討するために、高コレステロールの食物に応答するその作用も調査した。高コレステロールは、世界的に主要な健康問題である。野生型およびＭＣＪ ＫＯマウスに高コレステロールの食物を４週間与えた［Ｐｌａｖｉｎｓｋａｙａ、Ｔ．ら、Ｐｕｌｍ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ Ｔｈｅｒ．２０１３年８月；２６（４）：４０５〜１１．ｄｏｉ：１０．１０１６／ｊ．ｐｕｐｔ．２０１２．１０．００２．２０１２年１０月１７日に電子出版；Ｔｅｒａｔａｎｉ、Ｔ．ら、Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ．２０１２年１月；１４２（１）：１５２〜１６４（２０１１年１０月１０日に電子出版）を参照］。高コレステロールの食物が与えられた野生型マウスの肝臓には、高レベルのコレステロールが蓄積した（図１１Ｊ）。同様に低いレベルのコレステロールが、正常な食物が給餌された野生型およびＭＣＪ ＫＯマウスからの肝臓中に存在した（図１１Ｋ）。したがって、結果から、ＭＣＪは、様々な代謝性疾患によって引き起こされる作用を調整することが示された。
ＭＣＪの欠損は腫瘍増殖を遅延させる
ミトコンドリア呼吸はＡＴＰを生成する最も効率的なメカニズムであるが、ある種の環境では、細胞は、それより効率が低いにもかかわらず解糖を選択する。したがって、癌細胞は、腫瘍増殖に有利な好気条件下でさえも、ミトコンドリアの酸化を介するよりも解糖からそれらのＡＴＰを生成する。この現象はワールブルク効果として知られており、ミトコンドリアの酸化的リン酸化が損なわれたことに起因する癌細胞の代謝的な適応のようである（Ｃａｉｒｎｓら、２０１１ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ １１、８５〜９５；Ｋｏｐｐｅｎｏｌら、２０１１ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ １１、３２５〜３３７；Ｗａｒｂｕｒｇ、１９５６ Ｊ Ｍｏｌ Ｂｉｏｌ ２７２、４７７〜４８３）。ＭＣＪはＭＭＰおよびＡＴＰの負の調節因子であることから、ＭＣＪの欠損がインビボで腫瘍の進行に影響を与えることができるかどうかを検討した。乳房上皮細胞中での特異的な発現を駆動させるＭＭＴＶ（マウス乳癌ウイルス）プロモーター／エンハンサーの制御下でポリオーマウイルスの中型Ｔ（ＭＴ）抗原が発現されるＭＭＴＶＰｙＭＴトランスジェニックマウスからの腫瘍で、ＭＣＪ発現を試験した（Ｇｕｙら、１９９２ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２、９５４〜９６１）。正常な乳腺と乳癌の両方でＭＣＪが発現されたが、レベルは腫瘍のほうがわずかに高いようであった（図１２Ａ）。ウェスタンブロット分析によるＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ腫瘍におけるＭＣＪ細胞局在性の分析で、乳癌におけるミトコンドリアのＭＣＪ局在化がさらに確認された（図１２Ｂ）。正常な乳腺および乳癌からのミトコンドリア抽出物におけるＭＣＪの分析からも、腫瘍からのミトコンドリアにおけるＭＣＪ発現が、正常な乳腺のミトコンドリアと比較して増加したことが確認された（図１２Ｃ）。ＭＣＪ ＫＯマウスをＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウスと交雑し、それに続いて乳癌を発生させた。興味深いことに、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ／ＭＣＪ ＫＯマウスは腫瘍を発生させたが、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ同腹子と比較してその速度は遅かった。以前の研究と一致して（Ｇｕｙら、１９９２ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １２、９５４〜９６１）、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ同腹子では１０〜１２週齢までに腫瘍を明確に検出できたが、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ／ＭＣＪ ＫＯマウスでは、１８〜２０週間よりも前に明確な腫瘍は触診で確認できなかった。腫瘍サイズが大きくなったためにマウスを安楽死させなければならなかったマウスの年齢を使用して生存曲線を確立した。生存曲線から、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ／ＭＣＪ ＫＯマウスにおいて、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウスと比較して腫瘍増殖の有意な遅延が示された（図１２Ｄ）。組織学的分析から、ＭＭＴＶ−ＰｙＭＴマウスとＭＭＴＶ−ＰｙＭＴ／ＭＣＪ ＫＯマウスからの類似のサイズの腫瘍との間に明白な差は示されなかった（図１２Ｅ）。腫瘍増殖の遅延が、エネルギー源としての細胞質の解糖に対するミトコンドリア呼吸のバランスの変化に関連するかどうかを検討するために、野生型およびＭＣＪ ＫＯの腫瘍から生成した細胞質およびミトコンドリア抽出物でＡＴＰレベルを試験した。野生型マウスからの腫瘍の比率と比較した、ＭＣＪ ＫＯマウスからの腫瘍におけるミトコンドリア／細胞質のＡＴＰレベルの相対的な比率において有意な増加がみられた（図１２Ｆ）。したがって、ＭＣＪの非存在下で見出されるミトコンドリア代謝の強化は、乳癌増殖の減少と相関していた。
ＭＣＪは、ミトコンドリア電子移動鎖における複合体Ｉの内因性阻害剤である
ＭＣＪがミトコンドリア膜電位を調節できる分子メカニズムを調査して、可能性のある関連タンパク質を発見するために、ベイトとしてＭＣＪのＮ末端領域を使用してファージディスプレイスクリーニングを行った。スクリーニングの結果から、可能性のあるＭＣＪと相互作用するタンパク質としてミトコンドリアＥＴＣ内の複合体Ｉの１つのサブユニット（ＮＤＵＦｖ１）が解明された（データ示さず）。哺乳動物の複合体Ｉ（ＮＡＤＨ−ユビキノンオキシドレダクターゼ）は、４９個の同定されたサブユニット、フラボモノヌクレオチド（ＦＭＮ）グループ、および８つのＦｅ−Ｓクラスターを含有する（Ｃｌａｓｏｎら、２００９ Ｊ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ １６９、８１〜８８）。ＭＣＪは、複合体Ｉの実際に存在するサブユニットとして説明されていないが、ＭＣＪは複合体Ｉと相互作用してその活性を調節する可能性があると考えられた。ＭＣＪが複合体Ｉと結合するかどうかを決定するために、野生型およびＭＣＪ ＫＯマウスの心臓のミトコンドリア抽出物から複合体Ｉを免疫沈降した。免疫沈降物中のＭＣＪの存在をウェスタンブロット分析で試験した。野生型からの複合体Ｉの免疫沈降物中にＭＣＪの分子量に相当するバンドが存在したが、ＭＣＪ ＫＯマウスからの複合体Ｉの免疫沈降物中には存在しなかった（図１３Ａ）。この免疫沈降の対照として、複合体Ｉの２つのよく特徴付けられたサブユニットであるＮＤＵＦＡ９およびＮＤＵＦＳ３の発現（図１３Ａ）を試験した。したがって、ＭＣＪは、ミトコンドリアの複合体Ｉと結合する。
ＭＣＪは複合体Ｉの調節因子であり得るのかどうかを決定するために、野生型およびＭＣＪ欠損マウスからの心臓のミトコンドリア抽出物中の複合体Ｉ活性を試験した。ＭＣＪ欠損の心臓において、野生型の心臓と比較してより高い複合体Ｉ活性が検出された（図１３Ｂ）。しかしながら、ＮＤＵＦＡ９のウェスタンブロット分析で決定したところ、ＭＣＪの欠損は、ミトコンドリア中の複合体Ｉの総量には影響しなかった（図１３Ｃ）。またＣＤ４Ｔ細胞に対してＣＤ８Ｔ細胞においてＭＣＪが選択的に存在することも、これらの細胞型間の複合体Ｉ活性において差がある可能性を示唆した。実際に、新たに単離されたＣＤ８およびＣＤ４Ｔ細胞から得られたミトコンドリア抽出物中の複合体Ｉ活性の分析から、ＣＤ８Ｔ細胞において実質的により低い複合体Ｉ活性が明らかになった（図１３Ｄ）。ミトコンドリア抽出物中のＮＤＵＦＡ９およびＮＤＵＦＳ３のレベルは、ＣＤ４Ｔ細胞とＣＤ８Ｔ細胞との間で同等であった（図１３Ｅ）。より重要なことに、ＭＣＪ ＫＯのＣＤ８Ｔ細胞における複合体Ｉ活性の分析から、野生型ＣＤ８Ｔ細胞と比較して複合体の活性の増加が示された（図１３Ｄ）。ミトコンドリア中のＮＤＵＦＡ９またはＮＤＵＦＳ３のレベルの差は、野生型のＣＤ８Ｔ細胞とＭＣＪ ＫＯのＣＤ８Ｔ細胞との間で検出できなかった（図１３Ｅ）。したがって、ＣＤ４Ｔ細胞に対して、ＣＤ８Ｔ細胞における複合体Ｉの不活性化およびミトコンドリア脱分極は、ＣＤ８Ｔ細胞中のＭＣＪの存在が介在する。ヒトＭＣＦ７細胞において、複合体Ｉ活性におけるＭＣＪの欠損の作用も試験した。両方の細胞型でミトコンドリア中の複合体Ｉのレベルは同等であったが（図１３Ｆ）、ＭＣＦ７／ｓｉＭＣＪ細胞（ＭＣＪ欠失）では、ＭＣＦ７細胞と比較してより高いレベルの複合体Ｉ活性が存在した（図１３Ｇ）。総合すると、これらの結果から、ＭＣＪは、ミトコンドリア呼吸鎖の複合体Ｉの内因性の負の調節因子であることが示された。
本明細書に記載された研究は、ＭＣＪ／ＤｎａＪＣ１５コシャペロンの複合体Ｉの負の調節因子としての新規の役割を明らかにする。ここで、ＭＣＪ／ＤｎａＪＣ１５は、ミトコンドリア代謝を弱めることにおいて役割を有し、ＭＣＪの喪失は、異なる組織でインビボでの代謝の切り替えを変更することが初めて示された。それゆえにＭＣＪは、細胞のエネルギーバランスを調整する標的となり得る。
ここで、本明細書の上記で部分的に概説されたように、ＭＣＪは、物理的に複合体Ｉと結合することが示された。ＭＣＪと複合体Ｉとの結合は動的な結合の可能性があり、ミトコンドリア代謝活性を低減させる必要がある状況において（例えば飢餓、ストレスなど）、ミトコンドリア呼吸を迅速に調整するメカニズムの可能性がある。この複合体Ｉに関する不活性化メカニズムは、例えば心臓などの、ミトコンドリアがエネルギー源として必須の役割を果たす組織において役割を果たしうる。
複合体Ｉ活性におけるＭＣＪの阻害的な役割と一致して、ここで、ＭＣＪの喪失は、ミトコンドリア膜電位の増加およびＡＴＰレベルの増加をもたらすことが実証された。ミトコンドリア代謝の相対的な増加は、生理学的条件下においては有意な作用はないであろう。これに関して、生理学的条件下で、ＭＣＪ欠損マウスは、変更された表現型を示さない。しかしながら、ＭＣＪの非存在下におけるミトコンドリア代謝の強化は、ストレス／病理学的状況下で代謝の切り替えに影響を与えて、正常な応答の経過に影響を与える可能性がある。ここで、本明細書に記載された実験によって、ＭＣＪの欠損は、絶食条件下で代謝を変更し、肝臓における脂質の蓄積を低減させ、脂肪変性を予防することが実証された。いかなる特定のメカニズムにも縛られるつもりはないが、肝臓における脂質の蓄積の低減および脂肪変性の予防は、脂質のβ−酸化の強化によって引き起こされる可能性がある。脂肪分解の促進と相関して、絶食後、ＭＣＪ欠損マウスにおいて、白色脂肪含量が少なくわずかな褐色脂肪しか残っていないことが観察された。したがって、絶食初期において、ＭＣＪの喪失によって引き起こされるミトコンドリア代謝の強化は有益でありうる。しかしながら、利用可能「燃料」の急速な消費のために、より長い絶食期間は、ＭＣＪの非存在下では極めて有害である可能性があると考えられる。進化上の脊椎動物におけるＭＣＪの獲得は、不十分な食物摂取に応答して複合体Ｉ活性を阻害することによりミトコンドリア呼吸を減速させて、予備の脂質エネルギーを長持ちさせるための適応現象であった可能性がある。
また代謝は、Ｔ細胞の生存および／または機能に影響を与えることができる重要な因子としても出現する。脂肪酸の酸化および代謝率は、メモリーＣＤ８Ｔ細胞の生存に影響する（Ａｒａｋｉら、２００９ Ｎａｔｕｒｅ ４６０、１０８〜１１２；Ｍａｉｎｅｓら、２００９ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３２５、４８４〜４８７；ＦｉｎｌａｙおよびＣａｎｔｒｅｌｌ、２０１０ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｉｍｍｕｎｏｌ １１、１０９〜１１７）。加えて、近年の研究から、メモリーＣＤ８Ｔ細胞の周知の生存因子であるＩＬ−１５は、ミトコンドリアの生物発生を強化することによりメモリー細胞におけるミトコンドリアの酸化的代謝およびＡＴＰ生産を促進することが示された（ｖａｎ ｄｅｒ Ｗｉｎｄｔら、２０１２ Ｉｍｍｕｎｉｔｙ ３６、６８〜７８）。ミトコンドリアによる脂肪酸の酸化の増加は、メモリーＣＤ８Ｔ細胞の生存および機能の向上と相関する。ここで本発明者らは、ＭＣＪは複合体Ｉの不活性化に寄与し、その結果としてＣＤ８Ｔ細胞中のミトコンドリア脱分極に寄与することを示す。より重要なことに、ここで、インビトロおよびインビボで、エフェクターＣＤ８Ｔ細胞の休止期間中のＭＣＪの非存在がこれらの細胞における活性なミトコンドリア代謝を維持することが示された。したがって、ＭＣＪはまた、メモリーＣＤ８Ｔ細胞の機能も調節しうる。歴史的にＣＤ４およびＣＤ８Ｔ細胞は、活性化前、互いに極めて類似しているとみなされていた。本明細書で示された研究から、ＣＤ４Ｔ細胞に対してＣＤ８Ｔ細胞でのＭＣＪの優勢な発現、およびＣＤ８Ｔ細胞における強いミトコンドリア脱分極は、これらの細胞におけるＭＣＪの存在により維持されることが初めて示される。これらの示唆に富む発見から、ミトコンドリア代謝に関してＣＤ４Ｔ細胞とＣＤ８Ｔ細胞との間で明確な解離があることが実証される。
生理学的条件下ではほとんどの細胞がＡＴＰを生成するメカニズムとしてミトコンドリア呼吸を使用するが、解糖はワールブルク効果として知られるそれより効率が低い現象であるにもかかわらず、腫瘍細胞ではＡＴＰを得るメカニズムとして解糖に切り替えられる。ワールブルクは、癌細胞における解糖への代謝の切り替えは、ミトコンドリア呼吸の損傷に起因する可能性があると仮説を立てたが、実際のメカニズムは不明瞭なままである。近年、ワールブルク効果は、基礎研究と臨床研究からの結果に基づき広く再考されてきた（Ｃａｉｒｎｓら、２０１１ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ １１、８５〜９５；Ｋｏｐｐｅｎｏｌら、２０１１ Ｎａｔ Ｒｅｖ Ｃａｎｃｅｒ １１、３２５〜３３７；ＬｅｖｉｎｅおよびＰｕｚｉｏ−Ｋｕｔｅｒ、２０１０ Ｓｃｉｅｎｃｅ ３３０、１３４０〜１３４４）。したがって、ミトコンドリア呼吸の強化または延長は多くの細胞にとって有益な可能性がある一方で、腫瘍増殖に干渉する可能性もある。ここで、エネルギー源としてのミトコンドリア呼吸へのバランスの改変と相関して、ＭＣＪの欠損はインビボで乳癌増殖を遅延させることが示される。多数のインビトロの研究および／または異種移植片研究で、癌におけるコシャペロン（例えばＴｉｄ１、ＭＲＪ、ＨＬＡＪ１）の役割を検討したところ、このようなコシャペロンは、細胞の浸潤、移動、および／または転移に干渉することにより優勢な腫瘍サプレッサー機能を有することが特定された（Ｓｔｅｒｒｅｎｂｅｒｇら、２０１１ Ｃａｎｃｅｒ Ｌｅｔｔ ３１２、１２９〜１４２）。これらのコシャペロンはどれも、腫瘍細胞の代謝の状態における変化に関与しなかった。本明細書で説明された作業は、インビボでの代謝の状態の変化に起因する腫瘍進行に対するコシャペロンの作用を示す最初の研究を含む。これまでに、ＭＣＪの喪失は、乳癌および卵巣癌における化学療法抵抗と関連することが示されている（Ｈａｔｌｅら、２００７ Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ ２７、２９５２〜２９６６；Ｓｔｒａｔｈｄｅｅら、２００５ Ｇｙｎｅｃｏｌ Ｏｎｃｏｌ ９７、８９８〜９０３）。本明細書で説明される発見に基づけば、ＭＣＪの非存在下における複合体Ｉ活性およびミトコンドリア代謝の強化は、特定の抗癌剤に対する耐性も付与する可能性もありそうである。
本明細書において本発明の数々の実施形態を説明し例示したが、当業者であれば、本明細書で説明された機能を果たすため、および／または本明細書で説明された結果および／または１つまたは複数の利点を得るための様々な他の手段および／または構造を容易に想像するであろうし、このようなバリエーションおよび／または改変はそれぞれ、本発明の範囲内であるとみなされる。より一般的には、当業者であれば、本明細書で説明される全てのパラメーター、寸法、材料、および立体配置は、典型例であることを意味し、さらに実際のパラメーター、寸法、材料、および／または立体配置は、本発明の教示が使用される具体的な１つまたは複数の適用に応じて決まることを容易に理解するであろう。当業者であれば、本明細書で説明される本発明の具体的な実施形態の多くの等価体を認識するか、または慣例的な実験のみを使用してそれらを確認することが可能であろう。それゆえに、前述の実施形態は一例として示されたに過ぎず、添付の特許請求およびその等価体の範囲内で、本発明は、具体的に説明され特許請求された以外の方法で実施することが可能であることが理解されるものとする。本発明は、本明細書で説明されるそれぞれ個々の特色、システム、物品、材料、および／または方法を対象とする。加えて、このような特色、システム、物品、材料、および／または方法の２つ以上のあらゆる組み合わせは、このような特色、システム、物品、材料、および／または方法が互いに矛盾しないのであれば、本発明の範囲内に包含される。
本明細書で定義され使用された全ての定義は、辞書の定義、参照により組み入れられた文書に記載の定義、および／または定義された用語の通常の意味よりも優先されると理解されるものとする。
不定冠詞「ａ」および「ａｎ」は、本明細書および特許請求の範囲で使用される場合、明確にそうではないと示されない限り、「少なくとも１つの」を意味すると理解されるものとする。
成句「および／または」は、本明細書および特許請求の範囲で使用される場合は、それによって接続された要素の「いずれかまたは両方」を意味し、すなわち、あるケースでは要素が接続的に存在し、他のケースでは離接的に存在することを意味すると理解されるものとする。明確にそうではないと示されない限り、「および／または」という節で具体的に指定された要素以外の他の要素が、その具体的に指定された要素に関連するかまたは関連しないかにかかわらず、場合により存在してもよい。
本出願で引用または言及される全ての参考文献、特許および特許出願、ならびに出版物は、参照により本明細書にそれらの全体が取り入れられる。

Claims (28)

  1. 対象における代謝性疾患または状態を処置するための医薬組成物であって、ＭＣＪ調節化合物を対象における代謝性疾患または状態を処置するのに有効な量で含み、代謝性疾患または状態が肝臓の糖代謝性疾患または肝臓の脂質代謝性疾患であり、癌ではなく；ここでＭＣＪ調節化合物は、抗ＭＣＪポリペプチド抗体もしくはその機能的なフラグメントまたはＭＣＪ ｓｉＲＮＡを含み、ＭＣＪ調節化合物は、ＭＣＪポリペプチド活性を減少させ、ＭＣＪポリペプチド活性を減少させることは、ＭＣＪポリペプチドのレベルまたは機能を減少させることを含む、前記医薬組成物。
  2. ＭＣＪ調節化合物が、対象においてＭＣＪポリペプチド活性を減少させ、対象においてミトコンドリアの代謝活性を増加させる、請求項１に記載の医薬組成物。
  3. 対象が、カロリー摂取レベルを低減させる処置を受ける、請求項１に記載の医薬組成物。
  4. 対象へのＭＣＪ調節化合物の投与の前に、それと同時に、および／またはその後に、カロリー摂取レベルを低減させる、請求項３に記載の医薬組成物。
  5. 代謝性疾患または状態が、非アルコール性脂肪性肝疾患、アルコール性脂肪性肝疾患、肝臓の脂肪変性、肝疾患、肝臓の炎症、Ｃ型肝炎、または妊娠性急性脂肪肝である、請求項１に記載の医薬組成物。
  6. 対象が、絶食している対象である、請求項１に記載の医薬組成物。
  7. 代謝性疾患または状態を処置することが、細胞傷害性Ｔ細胞の活性を強化または阻害することを含む、請求項１に記載の医薬組成物。
  8. 医薬組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１から７のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  9. 対象が、癌を有さない、請求項１から８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  10. 対象が、カロリー摂取レベルを増加させる処置を受ける、請求項１に記載の医薬組成物。
  11. 対象へのＭＣＪ調節化合物の投与の前に、それと同時に、および／またはその後に、カロリー摂取レベルを増加させる、請求項１０に記載の医薬組成物。
  12. 細胞中のミトコンドリア代謝を変更するための医薬組成物であって、細胞中のミトコンドリア代謝を変更するのに有効な量のＭＣＪ調節化合物を含み、ＭＣＪ調節化合物は、抗ＭＣＪポリペプチド抗体もしくはその機能的なフラグメントまたはＭＣＪ ｓｉＲＮＡを含み、ＭＣＪ調節化合物は、ＭＣＪポリペプチド活性を減少させ、細胞中のミトコンドリア代謝を増加させ、ここで細胞は対象中にあり、対象は癌を有さず、ここでＭＣＪポリペプチド活性を減少させることは、細胞中のＭＣＪポリペプチドのレベルまたは機能を減少させることを含む、前記医薬組成物。
  13. ミトコンドリア代謝が、ミトコンドリア呼吸である、請求項１２に記載の医薬組成物。
  14. 細胞が、インビボである、請求項１２または１３に記載の医薬組成物。
  15. ＭＣＪ調節化合物が当該対象に投与される、請求項１４に記載の医薬組成物。
  16. 対象が、絶食している対象である、請求項１５に記載の医薬組成物。
  17. 対象が、カロリー摂取レベルが高い対象である、請求項１５に記載の医薬組成物。
  18. 医薬組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項１５または１６に記載の医薬組成物。
  19. 対象が、代謝性疾患または状態を有し、ここで該代謝性疾患または状態が肝臓の糖代謝性疾患または肝臓の脂質代謝性疾患である、請求項１５から１８のいずれか一項に記載の医薬組成物。
  20. 代謝性疾患または状態が、非アルコール性脂肪性肝疾患、アルコール性脂肪性肝疾患、肝臓の脂肪変性、肝疾患、肝臓の炎症、Ｃ型肝炎、または妊娠性急性脂肪肝である、請求項１９に記載の医薬組成物。
  21. 代謝性疾患または状態が、癌ではない、請求項２０に記載の医薬組成物。
  22. 対象における細胞傷害性Ｔ（ＣＤ８＋Ｔ）細胞の機能を増加させるための医薬組成物であって、ＭＣＪ調節化合物をＣＤ８＋Ｔ細胞中のＭＣＪポリペプチドの活性を減少させるのに有効な量で含み、ここで該ＭＣＪ調節化合物は、抗ＭＣＪポリペプチド抗体もしくはその機能的なフラグメントまたはＭＣＪ ｓｉＲＮＡを含み、ここで該ＭＣＪポリペプチド活性の減少は、ＣＤ８＋Ｔ細胞中のミトコンドリア脱分極を減少させ、対象における細胞傷害性Ｔ細胞の機能を増加させ、ここでＭＣＪポリペプチドの活性を減少させることは、細胞中のＭＣＪポリペプチドのレベルまたは機能を減少させることを含む、前記医薬組成物。
  23. 医薬組成物が、薬学的に許容される担体をさらに含む、請求項２２に記載の医薬組成物。
  24. 対象が、癌を有さない、請求項２２または２３に記載の医薬組成物。
  25. 対象における代謝性疾患または状態の存在または非存在の決定を補助する方法であって、該方法は、
    対象からの生体サンプル中のＭＣＪ分子のレベルを測定するステップ、ここで生体サンプルは癌細胞を含まない；および
    測定されたレベルを、ＭＣＪ分子の対照レベルと比較するステップ
    を含み、対照レベルと比較して生体サンプル中のＭＣＪ分子のレベルが増加していることが、対象における肝臓の糖代謝性疾患または肝臓の脂質代謝性疾患の存在の指標である、方法。
  26. ＭＣＪ分子が、ＭＣＪポリペプチドまたはＭＣＪポリペプチドをコードする核酸である、請求項２５に記載の方法。
  27. ＭＣＪ分子のレベルを測定するステップが、ＭＣＪ分子の量および／または機能を測定するステップを含む、請求項２５に記載の方法。
  28. 代謝性疾患または状態が、非アルコール性脂肪性肝疾患、アルコール性脂肪性肝疾患、肝臓の脂肪変性、肝疾患、肝臓の炎症、Ｃ型肝炎、または妊娠性急性脂肪肝である、請求項２５に記載の方法。
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