JP2011518126A - IKKi阻害剤の処置方法およびスクリーニング方法、ならびに関連するIKKi診断方法 - Google Patents

IKKi阻害剤の処置方法およびスクリーニング方法、ならびに関連するIKKi診断方法 Download PDF

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Abstract

本発明は、肥満症、インスリン抵抗性、糖尿病、体重減少、および関連する疾患に関する診断方法、スクリーニング方法、および処置方法を提供する。特に、本発明は、このような健康状態をIKKi阻害剤によって処置する方法、このような健康状態をIKKiの状態に基づいて診断する方法、およびIKKi阻害剤の候補物をスクリーニングする方法を提供する。

Description

発明の詳細な説明
この発明は、国立衛生研究所によって授与された付与番号第5R01DK060591-03号の下に、政府の支援を受けてなされたものである。政府は、本発明における所定の権利を有している。
〔関連出願の相互参照〕
本願は、2008年3月25日に出願された、係属中の米国仮特許出願第61/039,295号に対する優先権を主張する。当該出願の引用によって、その全体が本願に援用される。
〔発明の分野〕
本発明は、肥満症、インスリン抵抗性、糖尿病、体重減少、および関連する障害に対する診断方法、スクリーニング方法、および処置方法に関する。特に、本発明は、このような健康状態をIKKi阻害剤を用いて処置する方法、このような健康状態をIKKiの状態に基づいて診断する方法、およびIKKi阻害剤の候補物をスクリーニングする方法を提供する。
〔背景〕
一般的には、肥満とは、脂肪組織の過剰として定義される。臨床的には、肥満とは、健康状態に害を与える量の脂肪過多として定義される。標準的な身長−体重表に基づく望ましい体重を20%超過した軽度の肥満でさえも、疾患および早死にの危険性を増大させ得る。肥満症および糖尿病の病因は、完全には重複していないが、現在では、肥満症および糖尿病は、明らかな生化学的および生理学的な成因を共有していることが、十分に明らかにされている。
糖尿病および肥満症の代謝異常の発生率は、異常発生のレベルに達している。推計では、1億2千万を超えるアメリカ人が臨床的に体重を超過しており、毎年、1千万以上のアメリカ人が糖尿病と診断されている。さらに、肥満症および糖尿病は、他の疾患および異常(例えば、循環器疾患、脳卒中高血圧症および腎不全)の進行を引き起こすか、もしくはこれらの進行に寄与するか、またはこれらの処置に少なくとも悪影響を及ぼし得る。糖尿病および肥満症、ならびにこれらの疾患に関連する合併症の経済的負担を合わせると、年に1千億ドルを超えると推定されている。肥満症および糖尿病は、人間の健康に大きな影響を与えると共に、世界中の国々の保健医療制度にも多大な影響を与えている。
近年発売された減量用の薬剤は、効き目がないか、またはわずかな効能しかなく有害な副作用が示されている。同様に、大きな医療上のニーズにもかかわらず、製薬業界は、糖尿病を管理する処置薬の開発にわずかな成功しか修めていない。最も一般的な処置薬(スルホニル尿素)は、有効ではなく、最も有望な新薬(チアゾリジンジオン)は、稀ではあるが致命的な副作用が実証されている。従って、肥満症および糖尿病の分子レベルにおけるより包括的な理解、これらの異常に対する素因の早期検出を可能にする診断テスト、およびこれらの疾患を予防および処置する、有害な副作用のないより効果的な医薬品に対する火急の必要性がある。
〔発明の概要〕
本発明は、肥満症、インスリン抵抗性、糖尿病、体重減少および関連する障害に関する診断方法、スクリーニング方法ならびに処置方法を提供する。特に、本発明は、このような健康状態をIKKi阻害剤を用いて処理する方法、このような健康状態をIKKiの状態に基づいて診断する方法、およびIKKi阻害剤の候補物をスクリーニングする方法を提供する。
いくつかの実施形態において、本発明は、インスリン受容体シグナル伝達の異常に関連する健康状態を生じている対象にIKKi阻害剤を投与するステップを包含している、処置方法を提供する。ここで、投与する上記ステップによって、この健康状態の1つ以上の症状が軽減される。
特定の形態では、インスリン受容体シグナル伝達の異常は、対象の脂肪細胞、または脂肪組織マクロファージ、肝細胞または筋細胞に生じている。特定の形態では、インスリン受容体シグナル伝達の異常は、グルコース代謝障害を対象に起こさせる。さらなる実施形態では、投与する上記ステップは、対象の含脂肪細胞および脂肪組織マクロファージによるグルコース代謝の増大を引き起こす。いくつかの実施形態では、グルコース代謝の増大は、インスリンに応答してインスリン受容体シグナル伝達が増大することによって引き起こされる。特定の実施形態では、投与する上記ステップは、対象の体脂肪を減少させる(例えば、対象の含脂肪細胞のサイズが小さくなる)。特定の実施形態では、投与する上記ステップは、患者に、少なくとも10ポンド(例えば、10ポンド、15ポンド、20ポンド、35ポンド、60ポンド、100ポンド、200ポンドまたはそれ以上)減量させる。いくつかの実施形態では、投与する上記ステップは、患者の体重の少なくとも5%の減少(例えば、少なくとも7%、10%、20%、30%、50%、75%の減少、またはそれ以上の減少)を引き起こす。
いくつかの実施形態では、処置される健康状態は肥満症である。他の実施形態では、処置される健康状態は糖尿病(例えば、I型、II型または両方(I型およびII型))である。さらなる実施形態では、処置される健康状態はインスリン抵抗性である。特定の実施形態では、対象は、I型またはII型の糖尿病に罹っていない。特定の実施形態では、IKKi阻害剤は、IKKiのインスリン受容体リン酸化活性を阻害する。さらなる実施形態では、IKKi阻害剤は、ヒトインスリン受容体配列VKTVNES(配列番号15)におけるセリン、または例えば配列の整列化の実施によって位置決定され得る、他の種(例えば、ハツカマウス、ネコ、イヌ、ラット、ウマ、ウシ等)のインスリン受容体配列における対応するセリンにおける、IKKiのインスリン受容体リン酸化活性を阻害する。さらなる実施形態では、IKKi阻害剤は、ヒトインスリン受容体配列VKTVNES(配列番号15)または関連する種のセリンにおける、IKKiのインスリン受容体リン酸化活性を阻害するが、IKKiの1つ以上の他の活性(例えば、1つ以上のIkBタンパク質のリン酸化)を阻害しない。さらなる実施形態では、IKKi阻害剤は、グルコースまたは脂質の恒常性の調節異常に対して直接的または間接的に寄与する他のタンパク質のリン酸化を阻害する。
いくつかの実施形態では、IKKi阻害剤は、ベンズイミダゾール置換されたチオフェン誘導体を含んでいる。さらなる実施形態では、IKKi阻害剤は、RNA干渉を介して作用する。特定の実施形態では、IKKi阻害剤は、siRNAまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態では、IKKi阻害剤は、抗IKKi抗体(例えば、モノクローナル抗体または抗体断片)である。特定の実施形態では、IKKi阻害剤は、IKKiのTLR4によるリン酸化形態に対して特異的な抗IKKi抗体である。
特定の実施形態では、本発明は、対象の体脂肪を減少させる方法を提供する。この方法は、対象の体脂肪の減少が生じるような条件下において、対象にIKKi阻害剤を投与するステップを包含している。さらなる実施形態では、体脂肪の減少は、IKKi阻害剤によるグルコース代謝の増大の結果として生じる。いくつかの実施形態では、体脂肪の減少は、インスリン受容体シグナル伝達の増大によって生じる。
特定の実施形態では、本発明は、a)対象からの試料におけるIKKiタンパク質またはmRNAの発現量を測定するステップと、b)対象が、インスリン受容体シグナル伝達の異常に関連する健康状態を生じているか、または当該健康状態を生じるおそれが高いか否かを決定するステップとを包含している、診断方法を提供する。ここで、IKKiタンパク質またはmRNAの高い発現量は、対象が上記健康状態を生じているか、または当該健康状態を生じるおそれが高いことを示す。
いくつかの実施形態では、試料は、対象からの含脂肪細胞、脂肪組織マクロファージ、または脂肪組織を含んでいる。さらなる実施形態では、測定する上記ステップは、抗IKKi抗体または抗体断片の使用を含んでいる。特定の実施形態では、測定する上記ステップは、IKKi核酸プローブ(例えば、配列番号13の少なくとも一部)の使用を含んでいる。さらなる実施形態では、診断される健康状態は、肥満症または肥満に対する素因である。さらなる実施形態では、診断される健康状態は、I型の糖尿病、II型の糖尿病、またはその両方(I型およびII型の糖尿病)である。いくつかの実施形態では、診断される健康状態はインスリン抵抗性である。
さらなる実施形態では、本発明は、対象からの試料におけるインスリン受容体のリン酸化レベルを決定するステップと、b)対象が、インスリン受容体シグナル伝達の異常に関連する健康状態を生じているか、または当該健康状態を生じるおそれが高いか否かを決定するステップとを包含している、診断方法を提供する。ここで、試料におけるインスリン受容体の高いリン酸化のレベルは、対象がこの健康状態を生じているか、または当該健康状態を生じるおそれが高いことを示す。
いくつかの実施形態において、インスリン受容体のリン酸化レベルが、基準と比較される。ここで、当該基準は、上記健康状態と関連することが知られているか、または当該健康状態を生じていない健康な個体からのものである。特定の実施形態では、試料は、対象からの含脂肪細胞、脂肪組織マクロファージまたは脂肪組織が含まれている。さらなる実施形態では、診断される健康状態は肥満症である。さらなる実施形態では、診断される健康状態は、I型の糖尿病、II型の糖尿病、または両方(I型およびII型の糖尿病)である。いくつかの実施形態では、診断される健康状態はインスリン抵抗性である。
特定の実施形態では、本発明は、a)対象からの試料におけるTRL4媒介性のIKKiリン酸化のレベルを決定するステップと、b)対象が、インスリン受容体シグナル伝達の異常に関連する健康状態を生じているか、または当該健康状態を生じるおそれが高いかを決定するステップとを包含している、診断方法を提供する。ここで、試料におけるIKKiのTRL4媒介性のIKKiリン酸化の高いレベルは、対象が、上記健康状態を生じているか、または当該健康状態を生じるおそれが高いことを示している。
特定の実施形態では、本発明は、薬剤の候補物をスクリーニングする無細胞法を提供する。この方法は、a)IKKi(例えば、完全なタンパク質または活性ペプチドの断片)、インスリン受容体、標識された3価のリン元素、およびIKKi阻害剤の候補物を、IKKiが、IKKi阻害剤の候補物によって阻害されない場合に、標識された3価のリン元素をインスリン受容体に受け渡し得る条件下において混合するステップと、b)IKKi阻害剤の候補物が、IKKiによるインスリン受容体のリン酸化を阻害するか否かを決定するステップとを包含している。
特定の実施形態では、決定する上記ステップは、IKKi阻害剤の候補物によって、IKKiが、配列VKTVNES(配列番号15)内のインスリン受容体内のセリンをリン酸化するか、または関連する非ヒトインスリン配列内のセリンにおいてリン酸化することが阻害される否かを評価するステップを包含している。さらなる実施形態では、この方法は、c)IKKi阻害剤の候補物を動物に投与するステップと、IKKi阻害剤が動物におけるグルコース代謝を促進する否かを決定するステップとをさらに包含している。いくつかの実施形態では、動物は、肥満症、糖尿病またはインスリン抵抗性のモデルである。他の実施形態では、決定する上記ステップは、処置の前および後に、動物の体重を測定するステップを包含している。
いくつかの実施形態では、IKKi阻害剤は、ベンズイミダゾール置換されたチオフェン誘導体を含んでいる。さらなる実施形態では、IKKi阻害剤は、RNA干渉を介して作用する。他の実施形態では、IKKi阻害剤は、siRNAまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。特定の実施形態では、IKKi阻害剤は、抗IKKi抗体(例えば、モノクローナル抗体または抗体断片)である。特定の実施形態では、IKKi阻害剤は、IKKiのTLR4リン酸化形態に対して特異的な抗IKKi抗体である。
特定の実施形態では、本発明は、薬剤の候補物をスクリーニングする方法であって、a)インスリン受容体を含んでいる細胞(例えば、含脂肪細胞、マクロファージ、もしくは3T3−L1線維芽細胞、または他の含脂肪細胞培養株)をIKKi阻害剤の候補物に接触させるステップと、b)IKKi阻害剤の候補物が、細胞内のインスリン受容体のリン酸化を阻害するか、または当該リン酸化のレベルを低下させる否かを決定するステップとを包含している方法を提供する。いくつかの実施形態では、この方法は、決定する上記ステップの前に、細胞を溶解させて細胞溶解物を生成するステップをさらに包含している。さらなる実施形態では、決定する上記ステップは、インスリン受容体配列VKTVNES(配列番号15)のセリンにおけるリン酸化のレベルを試験するステップを包含している。特定の実施形態では、細胞は、含脂肪細胞または脂肪組織マクロファージである。
いくつかの実施形態では、決定する上記ステップは、インスリン受容体のリン酸化形態または非リン酸化形態を認識する抗体または抗体断片の使用を含んでいる。さらなる実施形態では、決定する上記ステップは、インスリン受容体配列VKTVNES(配列番号15)のセリン、または非ヒトインスリン受容体配列の対応するセリンにおいて、インスリン受容体のリン酸化形態を認識する抗体または抗体断片の使用を含んでいる。他の実施形態では、決定する上記ステップは、インスリン受容体配列VKTVNES(配列番号15)のセリン、または非ヒトインスリン受容体配列内の対応するセリンにおいて、インスリン受容体の非リン酸化形態を認識する抗体または抗体断片の使用を含んでいる。
いくつかの実施形態では、上記方法は、c)IKKi阻害剤の候補物を動物に投与するステップと、IKKi阻害剤が動物におけるグルコース代謝を促進する否かを決定するステップとをさらに包含している。特定の実施形態では、動物は、肥満症、糖尿病またはインスリン抵抗性のモデルである。さらなる実施形態では、決定する上記ステップは、処置の前および後に、動物の体重を測定するステップを包含している。
特定の実施形態では、IKKi阻害剤の候補物は、ベンズイミダゾール置換されたチオフェン誘導体を含んでいる。さらなる実施形態では、IKKi阻害剤の候補物は、RNA干渉を介して作用する。他の実施形態では、IKKi阻害剤は、siRNAまたはアンチセンスオリゴヌクレオチドである。さらなる実施形態では、IKKi阻害剤の候補物は、抗IKKi抗体である。いくつかの実施形態では、接触させる上記ステップの前に、IKKi誘導因子を用いて細胞を処理する。さらなる実施形態では、IKKi誘導因子は、腫瘍壊死因子(TNF)、リポ多糖類(LPS)、インターロイキン−1(IL−1)、インターロイキン−6(IL−6)、インターフェロンγ、およびミリスチン酸ホルボールから成る群から選択される。
いくつかの実施形態では、本発明は、薬剤の候補物をスクリーニングする方法であって、a)活性化されたIKKiタンパク質を含んでいる含脂肪細胞または脂肪組織マクロファージである細胞を、IKKi阻害剤の候補物に接触させるステップと、b)IKKi阻害剤が、細胞内のグルコース代謝を促進する否かを決定するステップとを包含している方法を提供する。特定の実施形態では、接触させる上記ステップの前に、細胞をIKKi誘導因子にまず接触させる。他の実施形態では、IKKi誘導因子は、LPS、IL−1、IL−6、インターフェロンγおよびミリスチン酸ホルボールから成る群から選択される。
いくつかの実施形態では、IKKi阻害剤が細胞内のグルコース代謝を促進する否かを決定する上記ステップは、細胞によるグルコース取込みを測定するステップを包含している。特定の実施形態では、IKKi阻害剤が細胞内のグルコース代謝を促進する否かを決定する上記ステップは、細胞内のインスリン受容体のリン酸化の状態を測定するステップを包含している。さらなる実施形態では、IKKi阻害剤が細胞内のグルコース代謝を促進する否かを決定する上記ステップは、Aps、Cbl、およびTC10から成る群から選択されるタンパク質のリン酸化の状態を測定するステップを包含している。
さらなる実施形態では、IKKi阻害剤が細胞内のグルコース代謝を促進する否かを決定する上記ステップは、GLUT4のグルコース輸送能を測定するステップを包含している。さらなる実施形態では、IKKi阻害剤が細胞内のグルコース代謝を促進する否かを決定する上記ステップは、対照細胞と比較した細胞の大きさを測定するステップを包含している。特定の実施形態では、本方法は、c)IKKi阻害剤の候補物を動物に投与するステップと、IKKi阻害剤が動物におけるグルコース代謝を促進する否かを決定するステップとをさらに包含している。いくつかの実施形態では、動物は、肥満症、糖尿病またはインスリン抵抗性のモデルである。特定の実施形態では、決定する上記ステップは、処置の前および後に、動物の体重を測定するステップを包含している。
いくつかの実施形態では、本発明は、インスリンの異常に関連する健康状態を処置する方法を提供する。この方法は、インスリンシグナル伝達の異常を生じているか、またはインスリンシグナル伝達の異常を生じるおそれがある対象を用意するステップと、IKKiを阻害する薬剤の治療有効量を当該対象に投与するステップとを包含しており、ここで、この投与するステップが、対象のインスリンシグナル伝達の改善をもたらす。いくつかの実施形態では、インスリンシグナル伝達の異常は、例えば、含脂肪細胞、脂肪組織マクロファージ細胞、脂肪組織、肝臓細胞および肝臓組織において生じる。いくつかの実施形態では、対象は、肥満症、糖尿病、およびインスリン抵抗性といった健康状態を生じているか、または当該健康状態を生じるおそれがある。いくつかの実施形態では、IKKiを阻害する薬剤の投与は、グルコース代謝の増大、体脂肪の減少、体脂肪が増加しないこと、インスリン受容体シグナル伝達の増大、インスリン受容体のリン酸化レベルの低下、肝臓の慢性的な炎症の軽減もしくは予防、脂肪組織の慢性的な炎症の軽減もしくは予防、肝脂肪症の軽減もしくは予防、代謝エネルギー消費の促進、循環する遊離脂肪酸の低減および/またはコレステロールの減少といった転帰をもたらす。いくつかの実施形態では、インスリン受容体のリン酸化レベルの低下は、インスリン受容体配列VKTVNES(配列番号15)のセリン残基に生じる。いくつかの実施形態では、対象のIKKiに媒介されるIκBのリン酸化は、IKKiを阻害する薬剤によって影響を受けない。いくつかの実施形態では、IKKi阻害剤は、ベンズイミダゾール置換されたチオフェン誘導体、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、非リン酸化型特異的抗IKKi抗体およびリン酸化型特異的抗IKKi抗体といった薬剤を含んでいる。
いくつかの実施形態では、本発明は、対象の体脂肪を減少させるか、または体脂肪の増加を防止する方法を提供する。この方法は、体重超過または肥満体の身体組成を生じているか、またはそれらのいずれかを生じるおそれがある対象を用意するステップと、当該対象に、治療有効量のIKKiを阻害する薬剤を投与するステップとを包含しており、ここで、この投与するステップが、対象の体脂肪の減少または体脂肪の増加の防止をもたらす。いくつかの実施形態では、対象は、糖尿病およびインスリン抵抗性といった健康状態を生じているか、または当該健康状態を生じるおそれがある。いくつかの実施形態では、IKKiを阻害する薬剤の投与は、グルコース代謝の増大、インスリン受容体シグナル伝達の増大、インスリン受容体のリン酸化レベルの低下、肝臓の慢性的な炎症の軽減もしくは予防、脂肪組織の慢性的な炎症の軽減もしくは予防、肝脂肪症の軽減もしくは予防、代謝エネルギー消費の促進、循環する遊離脂肪酸の減少および/またはコレステロールの減少といった転帰をもたらす。いくつかの実施形態では、インスリン受容体のリン酸化レベルの低下は、インスリン受容体配列VKTVNES(配列番号15)のSerに生じる。いくつかの実施形態では、対象のIKKiに媒介されるIkBのリン酸化は、IKKiを阻害する薬剤によって影響を受けない。いくつかの実施形態では、IKKi阻害剤は、ベンズイミダゾール置換されたチオフェン誘導体、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、非リン酸化型特異的抗IKKi抗体、およびリン酸化型特異的抗IKKi抗体といった薬剤を含んでいる。
いくつかの実施形態では、本発明は診断方法を提供する。この方法は、対象からの試料を用意するステップと、IKKiタンパク質、IKKi転写物、リン酸化されたインスリン受容体、およびリン酸化されたIKKiといった分子の、当該試料におけるレベルを測定するステップと、対象がインスリン受容体シグナル伝達の異常に関連する健康状態を生じているか、または当該健康状態を生じるおそれが高いか否かを決定するステップを包含している。ここで、IKKiのリン酸化は、TLR4によって媒介され、上述の分子の高いレベルは、当該対象が、インスリン受容体シグナル伝達の異常に関連する健康状態を生じているか、または当該健康状態を生じるおそれが高いことを示す。いくつかの実施形態では、試料は、含脂肪細胞、脂肪組織マクロファージ、脂肪組織、肝臓細胞または肝臓組織を含んでいる。いくつかの実施形態では、測定する上記ステップは、上記分子に特異的な薬剤の使用を含んでいる。この薬剤は、核酸プローブ、非リン酸化型特異的抗体および/またはリン酸化型特異的抗体を含み得る。いくつかの実施形態では、分子のレベルを基準と比較する。ここで、基準は、この健康状態と関連することが知られている基準、またはこの健康状態を生じていない健康な個体からの基準もしくは対象の以前の期間からの基準である。いくつかの実施形態では、健康状態は、肥満症、糖尿病および/またはインスリン抵抗性である。
いくつかの実施形態では、本発明は、IKKiを含んでいるポリペプチド、インスリン受容体を含んでいるポリペプチド、標識された3価のリン元素およびIKKi阻害剤の候補物を、阻害剤の候補物の非存在下においてIKKiポリペプチドによってインスリン受容体のリン酸化が十分に促進される条件において、混合するステップと、インスリン受容体のリン酸化に対するIKKiポリペプチドの活性を決定するステップとを包含している、IKKiを阻害する薬剤を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、インスリン受容体のリン酸化レベルの低下は、インスリン受容体配列VKTVNES(配列番号15)のセリン残基において生じる。いくつかの実施形態は、IKKi阻害剤の候補物を動物に投与して、IKKi阻害剤の候補物が、動物におけるグルコース代謝を促進する否かを決定するステップをさらに包含している。
いくつかの実施形態では、本発明は、インスリン受容体を含んでいる細胞または細胞の溶解物を用意するステップと、上記細胞をIKKi阻害剤の候補物に接触させるステップと、IKKi阻害剤の候補物が、グルコース代謝率、および/または上記インスリン受容体のリン酸化のレベルといった特性に影響を与える否かを決定するステップを包含している、IKKiを阻害する薬剤を同定する方法を提供する。いくつかの実施形態では、IKKi阻害剤がグルコース代謝率に影響を与える否かを決定するステップは、細胞によるグルコース取込み、インスリン受容体のリン酸化状態、APSのリン酸化状態、Cblのリン酸化状態、TC10のリン酸化状態、GLUT4のグルコース輸送能、GLUT4の原形質膜への移動、および/または対照細胞と比較した上記細胞の大きさといった特徴を測定するステップを包含している。いくつかの実施形態では、IKKi阻害剤は、ベンズイミダゾール置換されたチオフェン誘導体、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、非リン酸化型特異的抗IKKi抗体、およびリン酸化型特異的抗IKKi抗体といった薬剤を含んでいる。いくつかの実施形態では、上記接触するステップの前に、細胞をIKKi誘導因子を用いて処理する。いくつかの実施形態は、IKKi阻害剤の候補物を動物に投与するステップと、IKKi阻害剤の候補物が動物におけるグルコース代謝を促進する否かを決定するステップとをさらに包含している。
本発明の方法および組成物によって処置され得る健康状態および疾患状態としては、真性糖尿病、I型糖尿病、II型糖尿病、妊娠性糖尿病、代謝症状群、代謝症状群X、症状群X、インスリン抵抗性症状群、リーベン(Reaven)症状群、CHAOS、および栄養不良関連糖尿病が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の方法および組成物を用いて処置され得るな脂質代謝症および疾患状態としては、リポジストロフィ、先天性全身性リポジストロフィ(ベラルディネリ・セイプ症状群)、家族性部分型リポジストロフィ、後天性部分型リポジストロフィ(バラッケ・サイモン症状群)、後天性全身性リポジストロフィ、腹壁遠心性のリポジストロフィ(小児腹壁遠心性脂肪萎縮病)、リポアトロフィア アニュラリス(lipoatrophia annularis)(フェレイラ−マルクス リポアトロフィア(Ferreira-Marques lipoatrophia))、限局性リポジストロフィ、HIV関連のリポジストロフィ、高コレステロール血症、高脂質血症、肥満症、高グリセリド血症が挙げられるが、これらに限定されない。脂質代謝症は、血管疾患、高血圧、アテローム性動脈硬化症、動脈硬化症、末梢血管疾患(PVD)、末梢動脈疾患(末梢動脈障害またはPADとして知られる)、跛行、間欠性跛行、血管疾患、末梢動脈閉塞性疾患(PAOD)、冠動脈疾患(CAD)、循環器疾患、肥満症、代謝症状群、および重篤な肢虚血といった健康状態とともに発症し得るか、または当該健康状態の非存在において発症し得る。
本発明の方法および処置は、全コレステロールが高い場合(高コレステロール血症)の処置における用途が分かっている。高コレステロール血症の根本的な原因としては、高脂肪食、喫煙もしくは煙草製品の使用、甲状腺機能低下、腎疾患、肝臓疾患、プロゲスチンの使用、同化ステロイドホルモンの使用、およびグルココルチコイドの使用が挙げられるが、これらに限定されない。高コレステロール血症は、多遺伝子性または家族性であり得る。既知の家族性高コレステロール血症として、家族性リガンド欠損アポB−100(FLDB)および常染色体劣性高コレステロール血症が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明の方法および組成物は、脂肪性肝疾患とも呼ばれる肝脂肪症疾患の処置における用途が分かっている。脂肪性肝疾患は、単なる脂肪肝(脂肪症)から、炎症(脂肪性肝炎)と関連する脂肪肝まで多岐にわたる。この健康状態は、アルコールの摂取によって起こり得る(アルコールと関連する脂肪肝)、またはアルコールを摂取しなくとも起こり得る(非アルコール性脂肪性肝疾患[NAFLD])。脂肪性肝疾患に導き得る他の要因としては、薬物(例えば、アミオダロン、タモキシフェン、メトトレキサート)、アルコール、代謝系の異常(例えば、ガラクトース血症、グリコーゲン貯蔵症、ホモシスチン尿症、チロシナーゼ)、栄養状態(例えば、栄養過多、栄養失調、完全静脈栄養[TPN]、飢餓療法)、または他の健康上の問題(例えば、セリアック病、ウィルソン病)が挙げられるが、これらに限定されない。遺伝的に脂肪性肝疾患に罹りやすい個体は、通常または低体重の身体組成を示し得る。
本発明は、体重超過および肥満症の処置または予防における用途が分かっている。最も広く受け入れられている肥満症の臨床的定義は、BMIに基づいた世界保健機関(WHO)の基準である。この規定によれば、大人では、グレード1の体重超過(一般には単に体重超過と呼ばれる)のBMIは、25〜29.9kg/mである。グレード2の体重超過(一般には肥満と呼ばれる)のBMIは、30〜39.9kg/mである。グレード3の体重超過(一般には、重度の肥満または病的肥満と呼ばれる)のBMIは、40kg/m以上である。外科の文献では、特に重度の肥満を識別するために異なる分類をしばしば用いる。この文献には、40kg/mを超えるBMIは重度の肥満として記載され、40〜50kg/mのBMIは病的肥満と呼ばれ、50kg/mを超えるBMIは超肥満と呼ばれている。子供の肥満の定義は、年齢適合および性別適合の管理対象に関して、(一般には、体重超過を定義するために用いられる)85の百分位数、または(一般には、肥満を定義するために用いられる)95の百分位数を超えるBMIをそれぞれ含んでいる。肥満の他の原因としては、甲状腺機能低下、クッシング症状群、インスリノーマ、視床下部性肥満症、多嚢胞性卵巣症状群、遺伝的症状群(例えば、プラダーウィリ症状群、アルストレム症状群、バルデー−ビードル症状群、コーエン症状群、ベルエソン・フォルスマン−レーマン症状群、フレーリッヒ症状群)、成長ホルモン欠損症、経口避妊薬の使用、薬剤誘導性肥満(例えば、フェノチアジン、バルプロ酸ナトリウム、カルバマゼピン、三環系抗鬱薬、リチウム、糖質コルチコイド、酢酸メゲストロール、チアゾリジンジオン、スルホニル尿素、インスリン、アドレナリン拮抗薬、セロトニン拮抗薬[特に、シプロヘプタジン])、摂食障害(特に過食障害、多食症、夜摂食障害)、生殖腺機能低下、偽性副甲状腺機能低下、および経管食物摂取に関する肥満が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物は、上述の1つ以上の疾患または健康状態を生じているが、以下の疾患または健康状態:喘息、気管支炎、肺炎、骨関節炎、若年性関節炎、関節リウマチ、脊椎関節症(spondylo arthopathies)、痛風性関節炎、慢性肉芽腫症(例えば、結核、ハンセン病、類肉腫症、および珪粉症)、腎炎、アミロイド症、強直性脊椎炎、慢性気管支炎、強皮症、全身性紅斑性狼瘡、多発性筋炎、虫垂炎、炎症性大腸炎、クローン病、胃炎、過敏性腸症状群、潰瘍性大腸炎、結腸直腸癌、シェーグレン症状群、ライター症状群、乾癬、骨盤内炎症性疾患、眼窩炎症、血栓症、月経痛、腱炎、滑液包炎、乾癬、湿疹、bums、環境刺激(ツタウルシ、花粉、虫刺され、および特定の食物など)に対する皮膚炎および不適切なアレルギー性反応(アトピー性皮膚炎および接触性皮膚炎を含む)、片頭痛、結節性動脈周囲炎、甲状腺炎、再生不良性貧血、ホジキン病、スクレロドーマ、リウマチ熱、重症筋無力症、類肉腫症、ネフローゼ症状群、ベーチェット症状群、多発性筋炎、歯肉炎、過敏症、結膜炎、怪我の後にできる腫物、リポ多糖類誘導性敗血症性ショック、組織再生、神経変性病(例えば、アルツハイマー病)、組織拒絶反応、骨粗しょう症、悪液質、並びに、神経変性のうちの少なくとも1つを生じていない対象の処置に使用される。いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物は、組織再生の必要が無い対象の処置に使用される。いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物は、細胞増殖性疾患に罹っていない対象の処置に使用される。細胞増殖性疾患の例としては、良性前立腺肥大、家族性腺腫症、ポリープ症、神経線維腫症、乾癬、肺線維症、および関節炎糸球体腎炎(arthritis glomerulonephritis)が挙げられる。
いくつかの実施形態では、本発明の方法および組成物は、以下の腫瘍:癌腫(膀胱癌、乳癌、結腸癌、腎癌、肝臓癌、肺癌(小細胞肺癌が挙げられる)、食道癌、胆嚢癌、卵巣癌、膵臓癌、胃癌、子宮頚癌、甲状腺癌、前立腺癌および皮膚癌(扁平上皮癌が挙げられる))、リンパ系の造血器腫瘍(白血病、急性リンパ性白血病、リンパ芽球性白血病、B細胞リンパ腫、T−細胞−リンパ腫、ホジキンリンパ腫、非ホジキンリンパ腫、有毛細胞リンパ腫およびバーケットリンパ腫が挙げられる)、骨髄細胞系列の造血器腫瘍(急性および慢性の骨髄性白血病、骨髄異形成症状群および前骨髄球性白血病が挙げられる)、間葉由来の腫瘍(線維肉腫および横紋筋肉腫が挙げられる)、中枢神経系および末梢神経系の腫瘍(星細胞腫、神経芽細胞腫、神経膠腫および神経鞘腫が挙げられる)、他の腫瘍(黒色腫、精上皮腫、奇形癌、骨肉腫、色素性乾皮症、角化棘細胞腫、甲状腺濾胞腺癌およびカポジ肉腫が挙げられる)のうちの少なくとも1つに罹っていない対象の処置に使用される。
いくつかの実施形態では、本発明の方法は、疾患または健康状態(例えば、インスリンシグナル伝達の異常、肥満症、糖尿病、インスリン抵抗性、高コレステロール、代謝症候群、肝臓狭窄、肝臓の慢性的な炎症、および脂肪組織の慢性的な炎症)について対象を検査した後に、IKKiを阻害する薬剤を投与することを包含している。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、IKKiを阻害する薬剤を対象に投与した後に、疾患または健康状態(例えば、インスリンシグナル伝達の異常、肥満症、糖尿病、インスリン抵抗性、高コレステロール、代謝症状群、肝臓狭窄、肝臓の慢性的な炎症および脂肪組織の慢性的な炎症)について対象を検査することを包含している。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、疾患または健康状態(例えば、インスリンシグナル伝達の異常、肥満症、糖尿病、インスリン抵抗性、高コレステロール、代謝症状群、肝臓狭窄、肝臓の慢性的な炎症および脂肪組織の慢性的な炎症)について対象を検査した後に、IKKiを阻害する薬剤を投与し、その後、(例えば、処置の効果を監視するために、)疾患または健康状態(例えば、インスリンシグナル伝達の異常、肥満症、糖尿病、インスリン抵抗性、高コレステロール、代謝症状群、肝臓狭窄、肝臓の慢性的な炎症、および脂肪組織の慢性的な炎症)について2回目の検査を行うことを包含している。いくつかの実施形態では、本発明の方法は、疾患または健康状態(例えば、インスリンシグナル伝達の異常、肥満症、糖尿病、インスリン抵抗性、高コレステロール、代謝症状群、肝臓狭窄、肝臓の慢性的な炎症および脂肪組織の慢性的な炎症)について対象を検査した後に、IKKiを阻害する薬剤を投与し、その後、疾患または健康状態(例えば、インスリンシグナル伝達の異常、肥満症、糖尿病、インスリン抵抗性、高コレステロール、代謝症状群、肝臓狭窄、肝臓の慢性的な炎症、および脂肪組織の慢性的な炎症)について2回目の検査を行うと共に、IKKiを阻害する薬剤の2回目の投与を行う。この2回目の投与は、先の検査の結果に応じて、用量、期間、頻度または投与経路について変更されている。
いくつかの実施形態では、本発明は、健康状態(例えば、インスリンシグナル伝達の異常、肥満症、糖尿病、インスリン抵抗性、高コレステロール、代謝症状群、肝臓狭窄、肝臓の慢性的な炎症、および脂肪組織の慢性的な炎症など)を処置する医薬品の製造における、IKKiを阻害する薬剤の使用を含んでいる。
〔図面の簡単な説明〕
図1は、3T3L1含脂肪細胞におけるインスリン刺激性のグルコース取込みをLPSが阻害することを示す図である。LPSありまたはLPSなしにおいて、含脂肪細胞を前処理し、その後、インスリンを用いてで処置し、図に示すように2−デオキシグルコース取込みを複数回にわたって評価した。
図2は、インスリン刺激によるグルコース輸送担体Glut4の移動を、LPSが阻害することを示す図である。Glut4−eGFP/Mycレポーター遺伝子を細胞にトランスフェクトして、インスリンに応答して上記タンパク質が細胞表面に移動することをモニターした。LPSを用いた前培養によってインスリンの作用が低下した。
図3は、LPSの作用におけるIKKアイソフォームの役割を示す図である。図3Aは、LPSが、IKKアイソフォームα、βおよびiのリン酸化を増大させることを示している。図3Bは、siRNAによるIKKアイソフォームのノックダウンが、インスリンによるAktの活性化に影響しないことを示している。
図4は、LPSによるインスリン刺激性のグルコース取込みの阻害が、Ikkiのノックダウンによって阻害されることを示す図である。図に示されるsiRNAオリゴを3T3L1含脂肪細胞にトランスフェクトし、インスリン刺激性のグルコース輸送に対するLPSの影響を評価した。
図5は、ドミナントネガティブIkkiの過剰発現が、LPSの阻害作用を阻害することを示す図である。野生型またはキナーゼ不活化のIkkiを3T3L1含脂肪細胞にトランスフェクトし、インスリン刺激性のグルコース取込みに対するLPSの阻害作用を評価した。
図6aは、IKKi阻害剤5−(5,6−ジメトキシ−1H−ベンズイミダゾール−1−イル)−3−[[2−(メチルスルホニル)フェニル]メトキシ]−2−チオフェンカルボニトリルを示す図である。図6bは、IKKi阻害剤が、インスリン刺激性のグルコース取込みにおけるLPSの減少を阻害することを示す図である。特に、LPSおよびインスリンを用いて3T3L1含脂肪細胞を処理する前に、50nMの5−(5,6−ジメトキシ−1H−ベンズイミダゾール−1−yl)−3−[[2−(メチルスルホニル)フェニル]メトキシ]−2−チオフェンカルボニトリルを用いて処理した。
図7は、抗ホスホチロシン免疫ブロット法によって検出されたように、含脂肪細胞をLPSを用いた処理がインスリン受容体(InsR)またはIRS−1のインスリン刺激性のチロシンリン酸化に作用しなかったこと(図7A)、ならびにインスリン刺激の後に、IRS−1を用いて免疫共沈降させたPI−3’キナーゼの量が減少しなかったことを示している(図7B)。
図8は、実施例1からのウエスタンブロットを示す図であり、インスリンによるタンパク質キナーゼAktの活性化が、細胞のLPS前処理によって影響されなかったことを示している。
図9は、LPSがアダプタータンパク質APSおよびCblのインスリン刺激性のチロシンのリン酸化を低減させることを示す図である。インスリンを用いて処理する前に、LPSを用いて3T3L1含脂肪細胞を前処理した。細胞を溶解し、APSおよびC−Cblによるチロシンのリン酸化を、この図に示されるようにウエスタンブロッティング法によって評価した。
図10は、実施例1からのウエスタンブロットを示す図であり、LPS処理がインスリンによるTC10の活性化を弱めることを示している。
図11は、LPSが、IKKiの活性化によって、インスリン受容体のリン酸化を刺激することを示す図である。図11a:3T3L1細胞を、32P−オルトリン酸とともに培養し、LPSありまたはLPSなしにおいて刺激した。InsRおよびAPSを免疫沈降させて、オートラジオグラフィーに供した。図11b:32Pによる標識化および免疫沈降の前に、図示されるIkki siRNAオリゴを用いて細胞をノックダウンした。
図12は、既知のIKKiコンセンサス部位に基づいて予測される、インスリン受容体上にあるIKKiによるリン酸化部位を示す図である。この図には、次の配列が示されている。InsR:VKTVNES1035AS(配列番号9);p65:VFTDLAS468VD(配列番号7)、およびSTAT1:IKTELIS711VS(配列番号8)。インスリン受容体の1035位におけるリン酸化されたセリンは、インスリン受容体の他のスプライスされた異形(図26に示される)、1062位であることに留意されたい。
図13は、キナーゼ不活性のIKKiの過剰発現が、インスリン受容体のAPSへの結合を増進させることを示す図である。COS細胞に、野生型またはキナーゼ不活性のIKKiをトランスフェクトした。細胞を、インスリンありまたはインスリンなしを用いて刺激し、溶解し、GST−APS SH2ドメインを用いて溶解物をプルダウンした。
図14は、インスリン受容体におけるセリン1035の突然変異が、インスリン刺激性のグルコース取込みに対するLPSの阻害作用を阻害することを示す図である。3T3L1含脂肪細胞のインスリン受容体をsiRNAノックダウンし、その後、野生型またはセリン1035Ala変異型の受容体を含んでいるベクターを当該含脂肪細胞にトランスフェクトした。細胞を、LPSを用いて前処理した後、インスリンを用いて処理して、A)32P取り込みによるインスリン受容体リン酸化、またはB)グルコース輸送を分析した。
図15は、マウスに高脂肪の食事を与えた後に、IKKiが脂肪組織において上方調節されることを示す図である。普通食もしくは高脂肪食を8週間にわたってマウスに与え、脂肪組織を摘出し、分画遠心分離を行い、脂肪組織マクロファージ(ATM)含んでいる間質血管細胞、および含脂肪細胞の画分を分離した。細胞を溶解させて、抗IKKi抗体を用いたウエスタンブロッティング法を行った。
図16は、Ikki遺伝子の除去が、高脂肪食に関する体重増加を防止することを示す図である。左側にはIKKiKoマウスが示されており、右側には野生型マウスが示されている。
図17は、IKKiノックアウトマウス(IKKiKO)の体重の増加が、高脂肪食および普通食を与えた野生型の同腹子のマウスよりも、有意に少なかったことを示している。ここで、このデータの定量化によって、この低下した体重増加が統計上の有意差(P<0.01)を有していたことを示している。
図18は、IKKiの遺伝子除去が、高脂肪を摂取させた後の脂肪組織の拡大を防止することを示している。8週間にわたって高脂肪食を与えた野生型マウス(左)またはIKKiKO(右)マウスから、副睾丸脂肪体を摘出した。
図19は、IKKi KOマウスの体重の減少が、小型脂肪細胞に起因していたことを示す図である。
図20は、IKKiの遺伝子除去が、マウスの呼吸を増進させることを示す図である。
図21は、IKKiの遺伝子除去が、マウスの呼吸を増進させることを示す図である。
図22は、IKKiKoマウスが、高脂肪食に対してグルコース耐性を維持していることを示す図である。
図23は、3ヶ月にわたって高脂肪食を与えた後のIKKiノックアウトマウスのインスリン抵抗性を示す図である。
図24Aは、マウスIKKiのアミノ酸配列(配列番号10)のコンセンサス配列を示す図であり、図24Bは、マウスIkkiの核酸配列のコンセンサス配列を示す図である。
図25Aは、ヒトIKKiのアミノ酸配列(配列番号10)のコンセンサス配列を示す図であり、図25Bは、ヒトIkkiの核酸配列のコンセンサス配列を示す図である。
図26は、ヒトインスリン受容体(配列番号14)の他の2つのスプライシング型のうちの一方のコンセンサスアミノ酸配列を示す図であり、この図の下線部は、VKTVNES(配列番号15)である。(太字で示される)本配列内のセリンは、インスリン受容体の、IKKiによるリン酸化部位である。
図27は、高脂肪を与えたマウスに由来する脂肪組織において、IKKi酵素活性が対照マウスと比べて著しく増加していることを示す図である。
図28は、高脂肪食(HFD)が脂肪組織内のNFκB活性を増大させることを示す図である。NFκB活性は、マウス生体内のインビボ生物発光法によって測定された。A,普通食(ND)およびHFDを与えた雄のHLLマウスを、ルシフェリンの注射後に、生物発光について評価した。腹腔の全体にわたって収集された発光の定量化が、NDマウスおよびHFD HLLマウスについて示されている(各グループにつきn=7)。*p−値<0.05。B,HLLマウスから組織を切除し、エクスビボにおいて発光について評価した。HLLマウスに由来する全組織の発光の定量化。各グループにつきn=7匹のマウス。切除後にデータを連続的に収集して、発光シグナルの平坦域を確認した。
図29は、肥満マウスの脂肪組織マクロファージ(ATM)クラスタ内のNFκB発現の誘導を示す図である。NDもしくはHFDを与えた雄のC57Bl/6マウスからの副睾丸脂肪体を、p65/RelAの発現について、免疫蛍光によって分析した。免疫蛍光は、ATMクラスタにおける最大のシグナルおよびATMの核におけるp65の局在化(TOPRO3 共染色)を示している。
図30は、高脂肪食が、白色脂肪組織および肝臓におけるIKKiの発現を増大させることを示している。A,IKKファミリーメンバーをコードしている遺伝子の、肝臓および白色脂肪組織における発現に関する定量qPCR分析。白い棒、野生型マウス、普通食(ND)(n=6);灰色の棒、野生型マウス、4ヶ月間にわたる高脂肪食(HFD)(n=6)。全てのデータは、Rplp0発現に関して標準化された平均±SEMとして、示されている。ND値の平均を1と設定した。B,単離された含脂肪細胞および間質血管細胞の画分における、IKKファミリーメンバーをコードしている遺伝子の発現に関する定量qPCR分析。白い棒、ND(n=6);灰色の棒、4ヶ月間にわたるHFD(n=6)。
図31は、白色脂肪組織および肝臓における高脂肪食誘導性のIKKi発現の増加に関するさらなる分析を示す図である。A,NDもしくはHFDを与えた、野生型(WT)マウスおよびIKKiノックアウトマウス(IKKi KO)の肝臓および白色脂肪組織(WAT)からの溶解物を、図示されるようなIKKiに対する抗体によって免疫沈降させた。同じIKKiに対する抗体用いた免疫ブロッティングによって、IKKiの発現量を測定した。B,NDもしくはHFDを与えた、WTおよびIKKi KOの肝臓およびWATからの溶解物を、IKKiに対する抗体によって免疫沈降させ(IP)、基質としてのミエリン塩基性タンパク質(MBP)に対するキナーゼ活性について測定した。同じIKKiに対する抗体を用いて免疫ブロッティングによって、IPしたIKKiの発現量を測定した。、Rab5Bおよびカベオリン1に対する抗体を負荷対照として用いて、IPした溶解物を免疫ブロットした。
図32は、IKKi KOマウスが、エネルギー消費の増加によって、食事による体重増加から保護されていることを示す図である。A,HFDを与えたWTマウスおよびKOマウスから得られたの、カベオリンを染色した副睾丸脂肪組織を示す代表的な共焦点像。バーは100μmを表す。B,3〜4匹の個々のマウスに由来する500未満の含脂肪細胞から得られた含脂肪細胞の面積のウィスカープロット。*p<0.0001において平均の含脂肪細胞の面積を比較している。
図33は、IKKi KOマウスが、エネルギー消費の増加よって、食事による体重増加から保護されていることを表す、さらなる分析を示す図である。A,HFDを与えたWTマウス(灰色の棒)およびIKKi KOマウス(黒色の棒)の脂肪体における含脂肪細胞の数。各遺伝子型につきn=5匹のマウス。*,p−値<0.005。B,図示されるようにNDもしくはHFDを与えたWT(灰色の棒)マウスおよびKO(黒い棒)マウスからの血清における(左)アディポネクチン量。(右)体重に関して標準化された血清アディポネクチン。各グループにつきn=12匹のマウス。*,p−値<0.05;**,p−値<0.01。C,示されるようにNDもしくはHFDを与えたWT(灰色の棒)マウスおよびKO(黒色の棒)マウスからの血清におけるレプチンレベル。各グループにつきn=12匹のマウス。*,p−値<0.05。D,示されるようにNDもしくはHFDを与えたWT(灰色の棒)マウスおよびKO(黒色の棒)マウスの食糧摂取量を測定した。各グループにつきn=8匹のマウス。*,p−値<0.05。
図34は、IKKi KOマウスが、エネルギー消費の増加によって、食事による体重増加から保護されていることを表す、さらなる分析を示す図である。A,(上部)WAT内のUCP−1およびUCP−2をコードしている遺伝子の発現に関する定量qPCR分析。灰色の棒、示されるようにNDもしくはHFDを与えた野生型マウス(n=6);黒色の棒、示されるようにNDもしくはHFDを与えたIKKi KOマウス(n=6)。データは、Rplp0発現に関して標準化された平均±SEMとして示されている。*,p−値<0.05。NDを与えたWTの平均値を1に設定した。(下部)示されるようにHFDを与えたWTマウスおよびIKKi KOマウス(各グループにつき5匹のマウス)からのWAT溶解物を用いて免疫ブロットすることによって測定された、WATにおけるUCP−1のタンパク質発現。内部負荷対照としてRab5を用いた。B,NDを与えたWTおよびKOのマウス(3ヶ月齢)、またはHFDを与えたWTおよびKOのマウス(5ヶ月齢、2ヶ月間にわたって当該食事を与えた)の直腸温を測定した。各グループにつきn=10。*,p−値<0.05;**,p−値<0.01。
図35は、IKKi KOマウスが、グルコースおよび脂質の恒常性の改善を示すことを示している。A,示されるようにNDもしくはHFDを与えたWTマウス(灰色の棒)およびKOマウス(黒色の棒)を18時間にわたって絶食させて測定した、血中グルコース濃度および血清インスリン濃度。各グループにつきn=12匹のマウス。B,示されるようにNDもしくはHFDを与えたWTマウス(灰色の棒)およびKO(黒色の棒)マウスを18時間にわたって絶食させて測定した、血清NEFAトリグリセリドおよび全コレステロール値。各グループにつきn=12匹のマウス。全てのデータは、平均±SEMとして示されている(*,p−値<0.05;**,p−値<0.01)。
図36は、IKKi KOマウスが、グルコースおよび脂質の恒常性の改善を示すを表す、さらなるデータを示している。A,ND(左のパネル)またはHFD(右のパネル)を与えたWTマウス(灰色)およびKOマウス(黒色)を12時間にわたって絶食させて測定した、グルコース耐性試験(GTT)。各グループにつきn=12匹のマウス。B,GTTの間に測定したマウスの血清インスリン値であり、注射後0、30、60、および180分の時点(C)における値が示されている。全てのデータは、平均±SEMとして示されている。(*,p−値<0.05;**,p−値<0.01)。
図37は、IKKi KOマウスが、グルコースおよび脂質の恒常性の改善を示すを表す、さらなるデータを示す図である。HFDを与えたWT(灰色)マウスおよびKO(黒色)マウスを12時間にわたって絶食させて測定した、ピルビン酸塩耐性試験(PTT)。各グループにつきn=12匹のマウス。全てのデータは、平均±SEMとして示されている。(*,p−値<0.05;**,p−値<0.01)。
図38は、IKKiノックアウトが、高脂肪食を与えたマウスの肝細胞および脂肪細胞において、インスリンシグナル伝達およびインスリン感受性を保護することを示す図である。(A−C)18時間にわたって絶食させたマウスにインスリン(5mU/g)または生理食塩水をIP注射した。ND(上部)またはHFD(下部)を与えたWTマウス(各グループにつき2匹)またはIKKi KOマウス(各グループにつき3匹)の肝臓(A)、WAT(B)、および腓腹筋(C)からの溶解物を、示される抗体を用いて免疫ブロットした。
図39は、IKKiノックアウトが、高脂肪食を与えたマウスの肝臓および脂肪細胞において、インスリンシグナル伝達およびインスリン感受性を保護することを表す、さらなるデータを示す図である。(A−B)示されるようにNDもしくはHFDを与えたWTマウスおよびIKKi KOマウスの肝臓における、PDK4(A)およびグルコキナーゼ(B)をコードしている遺伝子の発現に関する定量qPCR分析である。灰色の棒、野生型マウス(n=6);黒色の棒、IKKi KOマウス(n=6)。(C−D)示されるようにNDもしくはHFDを与えたWTマウスおよびIKKiKOマウスのWATにおける、アディポネクチン(C)およびPPARγ(D、上部)をコードしている遺伝子の発現に関する定量qPCR分析である。灰色の棒、野生型マウス(n=6);黒色の棒、IKKi KOマウス(n=6)。(D,下部)示されるようにHFDを与えたWTマウスおよびIKKi KOマウス(各グループにつき5匹のマウス)からのWAT溶解物を用いて免疫ブロットすることによって測定した、WATにおけるPPARγのタンパク質の発現である。内部負荷対照としてRab5を用いた。全てのデータは、平均±SEMとして示されている。(*,p−値<0.05;**,p−値<0.01)。
図40は、IKKiノックアウトが、高脂肪食を与えたマウスの肝臓および脂肪細胞において、インスリンシグナル伝達およびインスリン感受性を保護することを表す、さらなるデータを示す図である。(上部)PPARγをコードしている遺伝子の発現に関する定量qPCR分析は、示されるようにNDもしくはHFDを与えたWTマウスおよびIKKi KOマウスのWATにおけるCD36、CAP、GLUT4を標的としている。灰色の棒、野生型マウス(n=6);黒色の棒、IKKi KOマウス(n=6)。(下部)示されるようにNDもしくはHFDを与えたWTマウス(各グループにつき2匹のマウス)およびIKKi KOマウス(各グループにつき3匹のマウス)からのWAT溶解物を用いた免疫ブロットによって測定された、WAT内のCD36、CAPおよびGLUT4のタンパク質発現。内部負荷対照としてRab5を用いた。全てのデータは、平均±SEMとして示されている。(*,p−値<0.05;**,p−値<0.01)。
図41は、IKKiノックアウトが、高脂肪食を与えたマウスの肝臓および脂肪細胞において、インスリンシグナル伝達およびインスリン感受性を保護することを表す、さらなるデータを示す図である。(左)示されるようにNDもしくはHFDを与えたWTマウスおよびIKKi KOマウスのWATにおける、リピン1をコードしている遺伝子の発現に関するqPCR分析。灰色の棒、野生型マウス(n=6);黒色の棒、IKKi KOマウス(n=6)。(右)示されるようにNDもしくはHFDを与えたWTマウス(各グループにつき2匹のマウス)およびIKKi KOマウス(各グループにつき3匹のマウス)からのWAT溶解物を用いて免疫ブロットすることによって測定した、WAT内のリピン1のタンパク質発現。内部負荷対照としてRab5を用いた。全てのデータは、平均±SEMとして示されている。(*,p−値<0.05;**,p−値<0.01)。
図42は、IKKiノックアウトが、高脂肪食を与えたマウスの肝臓および脂肪細胞において、インスリンシグナル伝達およびインスリン感受性を保護することを表す、さらなるデータを示す図である。A,示されるようにNDもしくはHFDを与えたWTマウスおよびKOマウスから単離された含脂肪細胞における脂質への、エクスビにこえるボインスリン刺激性のグルコース取込み。未処理である(白い棒)か、またはインスリンを用いて30分間にわたって細胞を処理した(影付きの棒)。各条件につきn=3匹のマウス。B,3T3−L1含脂肪細胞におけるインスリン刺激性のグルコース取込み。ベクター対照(白い棒)、IKKi WT(灰色の棒)、またはIKKiキナーゼデッド(kinase-dead)型(K38A)(黒色の棒)の突然変異体を発現する構造体を用いて、分化した含脂肪細胞エレクトロポレーションした。細胞は、未処理である(基準)か、またはインスリンを用いて30分間にわたって処理した(インスリン)。細胞における14C−2DGの取込み量を、タンパク質の全量を用いて標準化した。各条件につきn=3。全てのデータは、平均±SEMとして示されている。(*,p−値<0.05;**,p−値<0.01)。
図43は、IKKiノックアウトマウスが食事誘導性の肝脂肪症から保護されていることを示す図である。A,示されるようにNDもしくはHFDを与えたWTマウス(灰色の棒)およびIKKi KOマウス(黒色の棒)から、体重を用いて標準化した肝重量を測定した。各グループにつきn=8。B,示されるようにNDもしくはHFDを与えたWTマウスおよびKOマウスからの肝臓を示す画像。
図44は、IKKiノックアウトマウスが食事誘導性の肝脂肪症から保護されていることを表す、さらなるデータを示す図である。A,示されるように、満腹状態または空腹状態におけるNDもしくはHFDを与えたWTマウス(灰色の棒)およびIKKi KOマウス(黒色の棒)の、肝重量を用いて標準化した肝臓トリグリセリドを測定した。各グループにつきn=8(*,p<0.05)。B,2ヶ月間にわたってHFDを与えたWTマウスまたはKOマウスの空腹状態の肝臓の、ヘマトキシリンおよびエオシンを用いて染色した切片を示す画像。矢印は、中心静脈を示している。
図45は、IKKiノックアウトマウスが食事誘導性の肝脂肪症から保護されていることを表す、さらなるデータを示す図である。A,(左)示されるようにNDもしくはHFDを与えたWTマウスおよびIKKi KOマウスの肝臓における、リピン1をコードしている遺伝子の発現に関する定量qPCR分析。灰色の棒、野生型マウス(n=6);黒色の棒、IKKi KOマウス(n=6)。(右)示されるようにNDもしくはHFDを与えたWTマウス(各グループにつき2匹のマウス)およびIKKi KOマウス(各グループにつき3匹のマウス)からの肝臓溶解物を免疫ブロットすることによって測定された、肝臓におけるリピン1のタンパク質発現。内部負荷対照としてRab5を用いた。B,示されるようにNDもしくはHFDを与えたWTマウスおよびIKKi KOマウスの肝臓における、CD36、FABP4、PPARγをコードしている遺伝子の発現に関するqPCR分析。灰色の棒、野生型マウス(n=6);黒色の棒、IKKiKOマウス(n=6)。
図46は、IKKiノックアウトマウスが食事誘導性の肝脂肪症から保護されていることを表す、さらなるデータを示す図である。(上部)H2.35肝がん細胞における、IKKi WTおよびそのキナーゼデッド型突然変異体(K38A)の過剰発現量を検出するための、抗FLAG抗体による免疫ブロット。(下部)示された遺伝子の発現に関するqPCR分析。ベクター対照(白い棒)、IKKi WT(灰色の棒)またはIKKiキナーゼデッド型(K38A)の突然変異体(黒色の棒)を発現する構造体をトランスフェクトした細胞から、遺伝子発現を測定した。
図47は、IKKi KOマウスにおいて、肥満誘導性の炎症が軽減されることを示す図である。A,示されるようにNDもしくはHFDを与えたWTマウス(灰色の棒)およびIKKi KOマウス(黒色の棒)において、血清前炎症性サイトカインMCP−1、TNFα、およびランテスの分泌を測定した。n=8。(**,p−値<0.01)。B,共焦点像を用いて、F4/80の王冠様構造の定量化。王冠様構造の割合を定量化した。各遺伝子型につき3〜4匹のマウスの、3〜5の低出力の領域を分析した(各遺伝子型に付き1000未満の含脂肪細胞、*p値<0.001)。全てのデータは、平均±SEMとして示されている。
図48は、IKKi KOマウスにおいて、肥満誘導性の炎症が軽減されることを表す、さらなるデータを示す図である。示されるようにNDもしくはHFDを与えたWTマウスおよびIKKi KOマウスのWATにおける、TNFα、ランテス、MIP−1α、IP−10およびMCP−1をコードしている遺伝子の発現に関するqPCR分析が示されている。灰色の棒、野生型マウス(n=6);黒色の棒、IKKi KOマウス(n=6)。全てのデータは、平均±SEMとして示されている。(*,p−値<0.05;**,p−値<0.01)。
図49は、IKKi KOマウスにおいて、肥満誘導性の炎症が軽減されることを表す、さらなるデータを示す図である。示されるようにNDもしくはHFDを与えたWTマウスおよびIKKi KOマウスの肝臓における、TNFα、MCP−1、MIP−1α、IP−10、ランテスまたはiNOSをコードしている遺伝子の発現に関するqPCR分析が示されている。灰色の棒、野生型マウス(n=6);黒色の棒、IKKi KOマウス(n=6)。全てのデータは、平均±SEMとして示されている。(*,p−値<0.05;**,p−値<0.01)。
図50は、IKKi KOマウスにおいて、肥満誘導性炎症が軽減されることを表す、さらなるデータを示す図である。示されるようにNDもしくはHFDを与えたWTマウス(各グループにつき2匹のマウス)およびIKKi KOマウス(各グループにつき3匹のマウス)の肝臓、腓腹筋、およびWATからの溶解物を免疫ブロットすることによって測定されたホスホJNK、JNK、IκBのタンパク質レベルが示されている。Rab5およびカベオリン1を内部負荷対照として用いた。
図51は、IKKi KOマウスにおいて、肥満誘導性炎症が軽減されることを表す、さらなるデータを示す図である。(上部)示されるように生理食塩水またはLPSを注射したWTマウス(灰色の棒)およびIKKi KOマウス(黒色の棒)における血清前炎症性サイトカインMCP−1およびランテスの分泌を、2.5時間にわたって測定した。n=8。(下部)ホスホIKKβ,pIκB(セリン32またはセリン32/36)のタンパク質レベルを、示されるように2.5時間にわたって生理食塩水またはLPSを注射したWTマウスおよびIKKi KOマウスの肝臓およびWATからの溶解物を用いて免疫ブロットすることによって、測定した。Rab5およびカベオリン1を内部負荷対照として用いた。全てのデータは、平均±SEMとして示されている。(*,p−値<0.05;**,p−値<0.01)。
図52は、HFDを与えたHLLマウスのルシフェラーゼトランス遺伝子の活性化を示す図である。A,ルシフェラーゼ活性の定量化は、組織重量について補正した。*,p−値<0.05;**,p値<0.01。B,HFDがNFκBの準最大の活性化を導く。NDおよびHFDを与えたHLLマウスからのデータを、リポ多糖類(LPS)をIP注射した3時間後に得られた組織発光と比較した。
図53は、本発明が完成するまでに行われた実験において用いた抗IKKi抗体の特性を示す図である。FLAG−IKKi WT(レーン2)、キナーゼデッド型(K38A)(レーン3)、およびFLAG−TBK1 WT(レーン4)、キナーゼデッド型(K38A)(レーン5)のコンストラクトを、Cos細胞にトランスフェクトした。抗FLAG、抗IKKi、および抗TBK1抗体を用いて溶解物を免疫ブロットした。
図54は、普通食もしくは高脂肪食を与えたWTマウスおよびIKKi KOマウスの組織重量の測定値を示す図である。(上部)示されるようにNDもしくはHFDを与えたWTマウス(灰色の棒)およびIKKi KOマウス(黒色の棒)からの肝臓、腓腹筋、大腿四頭筋および生殖腺WATの、体重を用いて標準化した組織重量を測定した(*,p−値<0.05)。(下部)示されるようにNDもしくはHFDを与えたWTマウスおよびKOマウスを示す画像。
図55は、普通食もしくは高脂肪食を与えたWTマウスおよびIKKi KOマウスの褐色脂肪組織における産熱遺伝子発現を示す図である。A,(左)示されるようにNDもしくはHFDを与えたWTマウスおよびIKKi KOマウスの褐色脂肪組織(BAT)における、UCP−1,PGC−1α、およびPPARγをコードしている遺伝子の発現のqPCR分析。灰色の棒、野生型マウス(n=6);黒色の棒、IKKi KOマウス(n=6)。(右)HFDを与えたWTマウス(n=5)およびIKKi KOマウス(n=5)のBATからの溶解物を免疫ブロットすることによって、UCP−1のタンパク質レベルを測定した。B,NDもしくはHFDを与えたWTマウスおよびKOマウスの腓腹筋、WAT、およびBATからの溶解物を、抗OXOPHOSカクテル抗体を用いて免疫ブロットして、OXPHOS複合体のサブユニットのタンパク質レベルを測定した。
図56は、普通食もしくは高脂肪食を与えたWTマウスおよびIKKi KOマウスの肝臓における、グルコース代謝関連遺伝子の発現を示す図である。示されるようにNDもしくはHFDを与えたWTマウスおよびIKKi KOマウスの肝臓における、ピルビン酸塩キナーゼ、PEPCK、G6Paseをコードしているグルコース代謝関連遺伝子の発現に関するqPCR分析が示されている。灰色の棒、野生型マウス(n=6);黒色の棒、IKKi KOマウス(n=6)。
図57は、普通食もしくは高脂肪食を与えたWTマウスおよびIKKi KOマウスの肝臓における、脂質代謝関連遺伝子の発現を示す図である。A,示されるようにNDもしくはHFDを与えたWTマウスおよびIKKi KOマウスの肝臓における、FAS、ACC1およびSCD1をコードしている脂肪酸合成遺伝子の発現に関するqPCR分析。灰色の棒、野生型マウス(n=6);黒色の棒、IKKi KOマウス(n=6)。B,示されるようにNDもしくはHFDを与えたWTマウスおよびIKKi KOマウスの肝臓における、Acox1、CPT1、MCAD、およびAcad1をコードしているβ−酸化遺伝子の発現に関するqPCR分析。灰色の棒、野生型マウス(n=6);黒色の棒、IKKi KOマウス(n=6)。
図58は、普通食もしくは高脂肪食を与えたWTマウスおよびIKKi KOマウスから単離された含脂肪細胞およびSVFにおける、炎症性シグナル伝達タンパク質の発現を示す図である。示されるようにHFDを与えたWTマウス(各グループにつき3匹のマウス)およびIKKi KOマウス(各グループにつき3匹のマウス)の単離された含脂肪細胞およびSVFからの溶解物を用いて免疫ブロットすることによって、ホスホJNK、JNK、IκBのタンパク質レベルを測定した。Rab5およびカベオリン1を内部負荷対照として用いた。
〔定義〕
本発明の理解を容易にするために、以下に、多くの用語について定義する。
本明細書に使用される場合、「IKKi阻害剤」という用語は、IKKiの酵素活性または発現を特異的に阻害する任意の成分(例えば、化合物、核酸配列、抗体など)を指す。
本明細書に使用される場合、「検出する」、「検出すること」または「検出」という用語は、発見もしくは識別という一般的な行為、または検出可能に標識された組成物の特異的観察のいずれかを説明し得る。
「RNA干渉」または「RNAi」という用語は、siNA(例えば、「低分子干渉RNA」、「siRNA」、「低分子干渉核酸分子」、「低分子干渉オリゴヌクレオチド分子」または「化学修飾された低分子干渉核酸分子」)による、遺伝子発現のサイレンシングまたは低減を指す。これは、動物および植物における配列特異的な転写後の遺伝子サイレンシングのプロセスであり、サイレンシングを受ける遺伝子の配列に対して、siNAの二重鎖領域において相同であるsiNAによって開始される。遺伝子(例えばIKKi)は、生体にとって内在性または外来性であり得、染色体に組み込まれて存在し得るか、またはゲノムに組み込まれていないトランスフェクションベクターに存在し得る。遺伝子の発現は完全または部分的に阻害される。また、RNAiは、標的RNAの機能を阻害すると考えられ得る。すなわち、標的RNAの機能は、完全または部分的であり得る。
本明細書に使用される場合、「低分子干渉核酸」、「siNA」、「低分子干渉RNA」、「siRNA」、「低分子干渉核酸分子」、「低分子干渉オリゴヌクレオチド分子」、または「化学修飾された低分子干渉核酸分子」という用語は、例えばRNA干渉「RNAi」または配列特異的に遺伝子サイレンシングを媒介することによって、遺伝子発現またはウイルス複製を阻害または下方制御することが可能な任意の核酸分子を指す(例えば、Bass, 2001, Nature, 411, 428-429、Elbashir et al., 2001, Nature, 411, 494-498、およびKreutzer et al., PCT国際公報番号WO 00/44895、Zernicka-Goetz et al., PCT国際公報番号WO 01/36646、Fire, PCT国際公報番号WO 99/32619、Plaetinck et al., PCT国際公報番号WO 00/01846、Mello and Fire, PCT国際公報番号WO 01/29058、Deschamps-Depaillette, PCT国際公報番号WO 99/07409、およびLi et al., PCT国際公報番号WO 00/44914、Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819、Volpe et al., 2002, Science, 297, 1833-1837、Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218、およびHall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237、Hutvagner and Zamore, 2002, Science, 297, 2056-60、McManus et al., 2002, RNA, 8, 842-850、Reinhart et al., 2002, Gene & Dev., 16, 1616-1626、およびReinhart & Bartel, 2002, Science, 297, 1831を参照すればよく、これらの文献は、その全体が引用によって本明細書に援用される)。いくつかの実施形態では、siNAは、自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を含んでいる二本鎖ポリヌクレオチド分子であり得る。ここで、アンチセンス領域は、標的の核酸分子におけるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列またはその一部を含んでおり、センス領域は、標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列またはその一部を含んでいる。siNAは、2つの別々のオリゴヌクレオチドから構成され得る。ここで、一方の鎖はセンス鎖であり、他方の鎖はアンチセンス鎖であり、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、自己相補的である(すなわち、各鎖は、他方の鎖内のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含んでおり、例えばここでは、アンチセンス鎖およびセンス鎖は、二重鎖または二本鎖構造を形成し、例えば、この二本鎖領域は約19塩基対である)。ここで、アンチセンス鎖は、標的の核酸分子におけるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列またはその一部を含んでおり、センス鎖は、標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列またはその一部を含んでいる。代替的に、siNAは、単一のオリゴヌクレオチドから構成されている。ここで、siNAの自己相補的センス領域およびアンチセンス領域は、核酸塩基リンカーまたは非核酸塩基リンカーによって、連結されている。siNAは、二重鎖二次構造、非対称の二重鎖二次構造、ヘアピン二次構造、または非対称のヘアピン二次構造を有しているポリヌクレオチドであり得、自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を含んでいる。ここで、アンチセンス領域は、別の標的の核酸分子におけるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列またはその一部を含んでおり、センス領域は、標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列またはその一部を含んでいる。siNAは、環状の一本鎖ポリヌクレオチドであり得、自己相補的なセンス領域およびアンチセンス領域を含んでいるステムおよび2つ以上のループ構造を含んでいる。ここで、アンチセンス領域は、標的の核酸分子におけるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列またはその一部を含んでおり、センス領域は、標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列またはその一部を含んでいる。そして、この環状のポリヌクレオチドは、インビボまたはインビトロにおいてプロセシングを受け、RNAiを媒介できる活性siNA分子を生じ得る。siNAはまた、一本鎖ポリヌクレオチドを含み得る。この一本鎖ポリヌクレオチドは、標的の核酸分子におけるヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列またはその一部を含んでおり(例えばここで、このようなsiNA分子は、siNA分子内に、標的核酸配列に対応するヌクレオチド配列またはその一部の存在を必要しない)、ここで、一本鎖ポリヌクレオチドは、末端リン酸基をさらに含み得る。末端リン酸基の例としては、5’−リン酸塩(例えば、Martinez et al., 2002, Cell., 110, 563-574、およびSchwarz et al., 2002, Molecular Cell, 10, 537-568を参照)または5’,3’−二リン酸塩が挙げられる。特定の実施形態では、本発明のsiNA分子は、複数のセンス配列およびアンチセンス配列、またはセンス領域およびアンチセンス領域を別々に含んでいる。ここで、センス領域およびアンチセンス領域は、(1)当該分野において公知のヌクレオチドリンカー分子もしくは非ヌクレオチドリンカー分子によって共有結合されているか、または(2)イオン相互作用、水素結合、ファンデルワールス相互作用、疎水的相互作用および/またはスタッキング相互作用によって非共有結合されている。特定の実施形態では、本発明のsiNA分子は、標的遺伝子(例えばIKKi)のヌクレオチド配列に対して相補的なヌクレオチド配列を含んでいる。他の一実施形態では、本発明のsiNA分子は、標的遺伝子のヌクレオチド配列と相互作用して、標的遺伝子の発現の阻害を引き起こす。本明細書に使用される場合、siNA分子は、RNAだけを含んでいるsiNA分子に限定される必要はなく、化学修飾されたヌクレオチドおよび非ヌクレオチドをさらに包含し得る。特定の実施形態では、本発明の低分子干渉核酸分子は、ヌクレオチドを含んでいる2’−ヒドロキシ(2’−OH)を欠失している。いくつかの実施形態では、siNA分子は、RNAiを媒介する2’−ヒドロキシ基を有しているヌクレオチドの存在を必要とせず、したがって、本発明の低分子干渉核酸分子は、必要に応じて、リボヌクレオチド(例えば、2’−OH基を有するヌクレオチド)まったく含んでいない。しかし、siNA分子内にRNAiを支持するリボヌクレオチドの存在が不要であるこのようなsiNA分子は、2’−OH基を有している1つ以上のヌクレオチドを含んでいる、1つ以上の結合したリンカー、または結合したかもしくは会合した基、部分もしくは鎖を有し得る。必要に応じて、siNA分子は、ヌクレオチド配列部位の約5、10、20、30、40、または50%の割合において、リボヌクレオチドを含み得る。本発明の修飾された低分子干渉核酸分子は、低分子干渉の修飾オリゴヌクレオチド「siMON」とも呼ばれ得る。本明細書に使用される場合、siNAという用語は、配列特異的なRNAiを媒介できる核酸分子を説明するために用いられる他の用語と同等であることを意味している。配列特異的なRNAiとしては、例えば、低分子干渉RNA(siRNA)、二本鎖RNA(dsRNA)、マイクロRNA(miRNA)、短ヘアピンRNA(shRNA)、低分子干渉オリゴヌクレオチド、低分子干渉核酸、低分子干渉修飾されたオリゴヌクレオチド、化学修飾されたsiRNA、転写後遺伝子サイレンシングRNA(ptgsRNA)などが挙げられる。さらに、本明細書に使用される場合、RNAiという用語は、配列特異的なRNA干渉を説明するために用いられる他の用語、例えば、転写後遺伝子サイレンシング、翻訳阻害または発生遺伝学と同等であることが意図される。例えば、本発明のsiNA分子は、転写後のレベルまたは転写前のレベルの両方において、遺伝子を発生遺伝学的に抑制するため使用可能である。非限定的な例では、本発明のsiNA分子による遺伝子発現の発生遺伝学的な制御は、染色質構造のsiNA媒介性の修飾に起因して、遺伝子発現を変化させ得る(例えば、Allshire, 2002, Science, 297, 1818-1819、Volpe et al, 2002, Science, 297, 1833-1837、Jenuwein, 2002, Science, 297, 2215-2218、およびHall et al., 2002, Science, 297, 2232-2237を参照すればよい)。
本明細書に使用される場合、「非対称ヘアピン」は、アンチセンス領域、ループ部およびセンス領域を含んでいる直鎖状のsiNA分子を意味している。当該ループ部は、ヌクレオチドまたは非ヌクレオチドを含み得る。当該センス領域は、当該アンチセンス領域より少数のヌクレオチドを含んでおり、その数は、アンチセンス領域との塩基対に対して相補的なヌクレオチドを十分に有しており、ループと二重鎖を形成する程度である。例えば、本発明の非対称ヘアピンsiNA分子は、細胞の系またはインビトロの系においてRNAiを十分に媒介する長さ(例えば、約19〜約22ヌクレオチド)を有しているアンチセンス領域、約4〜約8ヌクレオチドを含んでいるループ領域、およびアンチセンス領域に対して相補的な約3〜約18ヌクレオチドを有しているセンス領域を含み得る。この非対称ヘアピンsiNA分子は、化学修飾され得る5’−末端リン酸基を含み得る。非対称ヘアピンsiNA分のループ部は、ヌクレオチド、非ヌクレオチド、リンカー分子、または本明細書に記載のような共役分子を含み得る。
本明細書に使用される場合、「非対称二重鎖」は、センス領域とアンチセンス領域とを含んでいる2つの別々の鎖を有している、siNA分子を意味している。ここで、センス領域は、アンチセンス領域より少数のヌクレオチドを含んでおり、その数は、センス領域が、アンチセンス領域との塩基対に対して相補的なヌクレオチドを十分に有しており、二重鎖を形成する程度である。例えば、本発明の非対称二重鎖siNA分子は、細胞の系またはインビトロの系においてのRNAiを媒介するために十分な長さ(例えば、約19〜約22ヌクレオチド)を有しているアンチセンス領域、およびアンチセンス領域に対して相補的な約3〜約18ヌクレオチドを有しているセンス領域を含み得る。
本明細書に使用される場合、「核酸分子」という用語は、分子(DNAまたはRNAが挙げられるが、これらに限定されない)を含んでいる任意の核酸を指す。この用語は、DNAおよびRNAの公知の塩基類似体のいずれかを含んでいる配列を包含する。当該塩基類似体としては、4−アセチルシトシン、8−ヒドロキシ−N6−メチルアデノシン、アジリジニルシトシン、シュードイソシトシン、5−(カルボキシヒドロキシルメチル)ウラシル、5−フルオロウラシル、5−ブロモウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチル−2−チオウラシル、5−カルボキシメチルアミノメチルウラシル、ジヒドロウラシル、イノシン、N6−イソペンテニルアデニン、1−メチルアデニン、1−メチルシュードウラシル、1−メチルグアニン、1−メチルイノシン、2,2−ジメチルグアニン、2−メチルアデニン、2−メチルグアニン、3−メチルシトシン、5−メチルシトシン、N6−メチルアデニン、7−メチルグアニン、5−メチルアミノメチルウラシル、5−メトキシアミノメチル−2−チオウラシル、β−D−マンノシルキュエオシン、5’−メトキシカルボニルメチルウラシル、5−メトキシウラシル、2−メチルチオ−N6−イソペンテニルアデニン、ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸、オキシブトキソシン、シュードウラシル、キュエオシン、2−チオシトシン、5−メチル−2−チオウラシル、2−チオウラシル、4−チオウラシル、5−メチルウラシル、N−ウラシル−5−オキシ酢酸メチルエステル、ウラシル−5−オキシ酢酸、シュードウラシル、キュエオシン、2−チオシトシン、および2,6−ジアミノプリンが挙げられるが、これらに限定されない。
インスリン受容体などの遺伝子は、多数のRNA種を生成し得る。多数のRNA種は、一次RNA転写物の特異的スプライシング(differential splicing)によって生成される。同じ遺伝子のスプライスバリアントであるcDNAは、配列同一性もしくは完全な相同性の領域(両方のcDNA上における同じエクソンまたは同じエクソンの一部の存在を示す)、および完全に非一致の領域(例えば、cDNA1上にエクソン「A」が存在しており、代わりにcDNA2がエクソン「B」を含んでいることを示す)を有している。これらの2つのcDNAが、配列同一性の領域を含んでいるので、これらの2つのcDNAは、両方のcDNA上に見られる配列を含んでいる遺伝子の全体または一部に由来するプローブといずれもハイブリダイズする。従って、これら2つのスプライス変異は、このようなプローブとほぼ相同であり、互いにほぼ相同である。
本明細書に使用される場合、「プローブ」という用語は、精製された制限酵素消化物に天然に生じるオリゴヌクレオチド、または合成的に、組換え的に、もしくはPCR増幅によって生成されたオリゴヌクレオチド(すなわちヌクレオチドの配列)を指す。当該オリゴヌクレオチドは、所望の他のオリゴヌクレオチドの少なくとも一部をバイブリダイゼーション可能である。プローブは、一本鎖または二本鎖であり得る。プローブは、特定の遺伝子配列の検出、同定および単離に有用である。特定の実施形態では、本発明に用いられるプローブは、任意の検出系において検出可能であるように、「レポーター分子」を用いて標識される。この任意の検出システムには、酵素の系(例えば、ELISAおよび酵素を用いた組織化学的アッセイ)、蛍光の系、放射性の系、および発光の系が挙げられるが、これらに限定されない。本発明が、特定の任意の検出系または標識に限定されることは、意図されていない。
「単離された」という用語は、「単離されたオリゴヌクレオチド」または「単離されたポリヌクレオチド」のように、核酸と関連して用いられる場合、同定され、天然の供給源において通常に会合している成分または夾雑物から分離されている核酸配列を指す。このように、単離されている核酸は、天然に見られるものとは異なる形態または環境に存在している。これに対して、単離されていない核酸は、天然に存在する状態において見られるDNAおよびRNAといった核酸である。例えば、所定のDNA配列(例えば、1つの遺伝子)は、隣接する遺伝子に近接する宿主細胞の染色体上に存在している。すなわち、特定のタンパク質をコードしている特定のmRNA配列などのRNA配列が、多数のタンパク質をコードしている多数の他のmRNAとの混合物として細胞内に存在する。しかし、所定のタンパク質をコードしている単離されている核酸は、一例として、該所定のタンパク質を通常に発現する細胞において、このような核酸を含んでいる。ここで、当該核酸は、天然の細胞の染色体位置とは異なる染色体位置にあるか、またはそうでなければ、天然に存在する核酸配列とは異なる核酸配列に隣接している。単離されている核酸、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドは、一本鎖の形態または二本鎖の形態において形状に存在し得る。単離されている核酸、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドがタンパク質の発現に利用される場合、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、少なくとも、センス鎖またはコーディング鎖を含んでいる(すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、一本鎖であり得る)が、センス鎖およびアンチセンス鎖を含み得る(すなわち、オリゴヌクレオチドまたはポリヌクレオチドは、二本鎖であり得る)。
本明細書に使用される場合、「精製された」または「精製する」という用語は、試料から成分(例えば夾雑物)を除去することを指す。例えば、抗体は、混入している非免疫グロブリンタンパク質の除去によって精製される。また、抗体は、標的分子に結合しない免疫グロブリンの除去によって精製される。標的分子に結合しない免疫グロブリンおよび/または非免疫グロブリンタンパク質の除去によって、試料における反応性を有している標的の免疫グロブリンの割合が増大する。他の例では、細菌の宿主細胞において組換えポリペプチドを発現させて、宿主細胞のタンパク質の除去によって組換えポリペプチドを精製する。その結果、試料内の組み換えポリペプチドの割合が増加する。
本明細書に使用される場合、「対象」および「患者」という用語は、イヌ、ネコ、鳥、家畜、および好ましくはヒト(例えば、肥満、糖尿病、またはインスリン抵抗性などの疾患を有しているヒト)などの哺乳類といった任意の動物を指す。
本明細書に使用される場合、「抗体」という用語は、最も広い意味として用いられ、具体的に、モノクローナル抗体(モノクローナル抗体の全長が挙げられる)、ポリクローナル抗体多重特異性抗体(例えば二重特異性抗体)、および抗体断片(これらが所望の生物活性を示す限り)を包含する。
本明細書に使用される場合、「抗体断片」という用語は、完全な抗体の一部を指す。抗体断片の例としては、直鎖状の抗体断片、一本鎖の抗体分子断片、Fcペプチド断片またはFc’ペプチド断片、FabおよびFab断片、ならびに抗体断片から形成された多重特異性抗体が挙げられるが、これらに限定されない。好ましくは、抗体断片は、ヒンジ領域の少なくとも一部、および必要に応じてIgG重鎖のCH1領域を保持している。他の好ましい実施形態では、抗体断片は、CH2領域の少なくとも一部、またはCH2領域の全体を含んでいる。
本明細書に使用される場合、「毒性の」という用語は、同じ細胞または組織の毒物の投与前と比べて、対象、細胞または組織に与える好ましくない作用または有害な作用を指す。
本明細書に使用される場合、「有効量」という用語は、有益な結果または所望の結果を十分にもたらす、組成物(例えば、IKKiの阻害剤)の量を指す。有効量は、1以上の投与、適用または用量において投与され得る。有効量は、特定の剤形または投与経路に限定されることを意図していない。
本明細書に使用される場合、「投与」という用語は、対象(例えば、対象、またはインビボ、インビトロもしくはエクスビボの細胞、組織および器官)に、薬物、プロドラッグもしくは他の薬剤、または治療上の処置物(例えば本発明の組成物)を与える行為を指す。人体に投与する典型的な経路は、眼(経眼経路)、口(経口経路)、皮膚(経皮経路、局所性経路)、鼻(経鼻経路)、肺(吸入経路)、口腔粘膜(口腔経路)、耳を介した経路、および注射(例えば、静脈注射、皮下注射、腫瘍内注射、腹腔内注射)などによる経路などであり得る。
本明細書に使用される場合、「同時投与」という用語は、少なくとも2つの薬剤(例えば、IKKi siRNAまたは抗体、および1つ以上の他の薬剤)、または少なくとも2つの治療薬を対象に投与することを指す。いくつかの実施形態では、2つ以上の薬剤または治療薬の同時投与は、同一時点に行われる。他の実施形態では、第1の薬剤/治療薬が、第2の薬剤/治療薬の前に投与される。当業者は、用いられる様々な薬剤または治療薬の剤形および/または投与経路が変更可能であるを理解する。同時投与にとって適切な用量は、当業者によって容易に決定され得る。いくつかの実施形態では、薬剤または治療薬を同時投与する場合、薬剤または治療薬のそれぞれは、これらの単独投与に適した用量より、低い用量において投与される。従って同時投与は、薬剤または治療薬の同時投与が、潜在的に有害な(複数の)薬剤(例えば毒物)の必要な用量を減少させる実施形態において、特に望ましい。
本明細書に使用される場合、「薬学的組成物」という用語は、活性剤(例えば、IKKi抗体またはIKKiを阻害する薬剤)を、インビトロ、インビボまたはエクスビボにおける診断または治療の用途に特に適した組成物を生成するための不活性または活性な担体との組合せを指す。
本明細書に使用される場合、「薬学的に受容可能な」または「薬理学的に受容可能な」という用語は、対象に投与した時に、中毒反応、アレルギー反応、または免疫反応といった有害反応を実質的に生じない組成物を指す。
本明細書に使用される場合、「試料」という用語は、その最も広い意味に用いられる。1つの意味において、当該用語は、任意の供給源から得られた検体または培養物、ならびに生物試料および環境試料をも含むことが意図されている。生物試料は、動物(ヒトが挙げられる)から入手され得、液体、固体、組織および気体を包含する。生物試料としては、血漿、血清などといった血液製剤が挙げられる。環境試料としては、地表の物質(surface matter)、土壌、水、結晶および産業上の試料といった環境物質が挙げられる。しかし、このような例が本発明に適用可能な試料の種類を限定するものと解釈されるべきではない。
「相同性」という用語は、相補性の度合いを指す。部分的または完全な相同性(すなわち同一)が存在し得る。部分的に相補的な配列は、標的核酸に対する完全に相補的な配列のバイブリダイゼーションを少なくとも部分的に阻害する配列であり、機能的な用語「実質的に相同性の」を用いて呼ばれる。「結合の阻害」という用語は、核酸の結合にを指して用いられる場合、標的配列に結合するための相同性の配列の競合によって生じる結合の阻害を指す。標的配列に対する完全に相補的な配列のバイブリダイゼーションの阻害は、低いストリンジェンシーの条件において、ハイブリダイゼーションアッセイ(サザンブロットまたはノーザンブロット、溶液ハイブリダイゼーションなど)を用いて試験され得る。実質的に相同性の配列またはプローブは、低いストリンジェンシーの条件下において、標的に対する完全な相同物の結合(すなわちハイブリダイゼーション)と競合し、阻害する。低いストリンジェンシーの条件は、非特異結合が許容されることを意味しておらず、低いストリンジェンシーの条件は、互いに対する2つの配列の結合が、特異的(すなわち選択的)な相互作用であることを必要とする。非特異結合を生じないことは、相補性の部分的な度合い(例えば、約30%未満の同一性)さえ有していない第2の標的を使用して試験され得る。すなわち、非特異結合が生じないので、プローブは、第2の非相補的な標的にハイブリダイズしない。
当該技術では、多くの等価な条件を採用して、低いストリンジェンシーの条件を実現し得ることがよく知られている。すなわち、プローブ(DNA、RNA、塩基の組成物)の長さおよび性質、標的(溶液中に存在するか、または固定化されているDNA、RNA、塩基の組成物など)の性質、ならびに塩および他の成分(例えば、ホルムアミド、硫酸デキストラン、ポリエチレングリコールの存在および非存在)の濃度といった要因を考慮し、ハイブリダイゼーション溶液を変更して、上述の条件とは異なるが同等の低いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件を生じ得る。さらに、当該技術では、高いストリンジェンシーの条件においてハイブリダイゼーションを促進する条件が、知られている(例えば、ハイブリダイゼーションおよび/または洗浄のステップの温度を上昇させること、ハイブリダイゼーション溶液におけるホルムアミドの使用など)。
「実質的に相同性の」という用語は、二本鎖の核酸配列(例えば、cDNAまたはゲノムのクローン)に関して用いられる場合、上述のような低いストリンジェンシーの条件において、二本鎖の核酸配列の一方の鎖または両方の鎖にハイブリダイゼーションし得る任意のプローブを指す。
本明細書に使用される場合、「結合に関して競争する」という用語は、活性を有している第2のポリペプチドと同じ基質と結合する、活性を有している第1のポリペプチドに関連して用いられる。ここで、第2のポリペプチドは、第1のポリペプチドの変種であるか、または関連するポリペプチドもしくは異種のポリペプチドである。第1のポリペプチドによる結合の効率(例えば、反応速度論または熱力学)は、第2のポリペプチドによる基質結合の効率と同一であり得るか、これを超え得るか、またはこれを下回り得る。例えば、この基質に結合するための平衡結合定数(K)は、これら2つのポリペプチドにおいて異なり得る。本明細書に使用される場合、「K」という用語は、酵素のミカエリス−メンテン定数を指し、酵素触媒反応において、所定の酵素がその最大速度の半分の速度を生じる特定の基質の濃度と規定される。
本明細書に使用される場合、「ハイブリダイゼーション」という用語は、相補的な核酸の対合に関して用いられる。ハイブリダイゼーションおよびハイブリダイゼーションの強度(すなわち、核酸間の会合の強度)は、核酸間の相補性の度合い、関連する条件のストリンジェンシー、形成されたハイブリッドのT、および核酸内のG:C比といった要因に影響される。
本明細書に使用される場合、「T」という用語は、「融解温度」に関して用いられる。融解温度は、二本鎖の核酸分子の集団のうちの半分が一本差に解離した状態になる温度である。核酸のTを算出する方程式は、当該分野において公知である。標準的な文献に示されているように、核酸が1MのNaClの水性溶液内にある場合、T値の概算は、方程式:T=81.5+0.41(%G+C)によって算出され得る(例えば、Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization[1985]を参照)。他の文献には、Tを算出するために構造および配列の特性を考慮した、より精巧な演算処理が挙げられている。
本明細書に使用される場合、「ストリンジェンシー」という用語は、核酸ハイブリダイゼーションが行われる、温度、イオン強度、および他の化合物(例えば、有機溶媒)の存在という条件に関して用いられる。当業者であれば、「ストリンジェンシー」の条件が、上述のパラメータを個々または一斉に変えることによって、変更し得ること認識するであろう。「高いストリンジェンシー」の条件では、核酸塩基の対合が、相補的な塩基配列を高頻度に有している核酸断片の間においてのみ生じる(例えば「高いストリンジェンシーの」の条件におけるハイブリダイゼーションは、約85〜100%の同一性、好ましくは約70〜100%の同一性一を有している相同物間において生じ得る)。中程度のストリンジェンシーの条件では、核酸塩基の対合は、相補的な塩基配列を中程度の頻度に有している核酸間において生じる(例えば「中程度のストリンジェンシー」の条件におけるハイブリダイゼーションは、約50〜70%の同一性を有している相同物間において生じ得る)。従って、「弱い」または「低い」ストリンジェンシーの条件は、相補的な配列の頻度が一般的に低いような、遺伝的に異なる生物に由来する核酸に求められる場合が多い。
核酸のハイブリダイゼーションに関して用いられる時の「高いストリンジェンシーの条件」は、長さが約500ヌクレオチドのプローブを用いる場合に、5×SSPE(43.8g/lのNaCl、6.9g/lのNaHPOO、および1.85g/lのEDTA(pHがNaOHを用いて7.4に調節されている))、0.5%のSDS、5×デンハルト試薬および100ug/mlの変性されたサケの精子のDNAから成る溶液における42℃の結合またはハイブリダイゼーション(後の0.1×SSPE、1.0%のSDSを含んでいる溶液を用いた42℃における洗浄)と同じ条件を包含する。
核酸のハイブリダイゼーションに関して用いられる時の「中程度のストリンジェンシーの条件」は、長さが約500ヌクレオチドのプローブを用いる場合に、5×SSPE(43.8g/lのNaCl、6.9g/lのNaHPOO、および1.85g/lのEDTA(pHがNaOHを用いて7.4に調節されている))、0.5%のSDS、5×デンハルト試薬、および100μg/mlの変性されたサケの精子のDNAから成る溶液における42℃の結合またはハイブリダイゼーション(後の1.0×.SSPE、1.0%のSDSを含んでいる溶液を用いた42℃における洗浄)と同じ条件を包含する。
「低いストリンジェンシーの条件」は、長さが約500ヌクレオチドのプローブを用いる場合に、5×SSPE(43.8g/lのNaCl、6.9g/lのNaHPOO、および1.85g/lのEDTA(pHがNaOHを用いて7.4に調節されている))、0.1%のSDS、5×デンハルト試薬[50×デンハルト試薬は、500mlにつき、5gのFicoll(Type 400, Pharamcia社)、5gBSA(Fraction V; Sigma社)]、および100μg/mlの変性されたサケの精子のDNAから成る溶液における42℃の結合またはハイブリダイゼーション(後の5×SSPE、0.1%のSDSを含んでいる溶液を用いた42℃における洗浄)と同じ条件を包含する。
本発明は、長さが約500ヌクレオチドのプローブのバイブリダイゼーションに限定されない。本発明は、長さが約10ヌクレオチドから数千(例えば、少なくとも5000)ヌクレオチドまでの間のプローブの使用を想定している。当業者は、ストリンジェンシーの条件が、他の寸法のプローブのためにを変更され得ることを理解する(例えば、Anderson and Young, Quantitative Filter Hybridization, in Nucleic Acid Hybridization [1985]、およびSambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Press, NY[1989]を参照)。
次の、「基準配列」、「配列同一性」、「配列同一性の割合」、および「実質的に同一」という用語は、2つ以上のポリヌクレオチド間における配列の関連性を説明するために用いられる。「基準配列」は、配列比較用の基準として用いられる規定の配列である。すなわち、基準配列は、例えば配列表に記載の全長cDNA配列のセグメントとしての、より大きな配列のサブセットであり得るか、または完全な遺伝子配列を含み得る。一般的に、基準配列は、その長さが少なくとも20ヌクレオチド、一般的に少なくとも25ヌクレオチド、およびより一般的に少なくとも50ヌクレオチドである。2つのポリヌクレオチドのそれぞれが、(1)2つのポリヌクレオチド間において類似の配列(すなわち、完全なポリヌクレオチド配列の一部)を含み得、(2)2つのポリヌクレオチド間において異なる配列を含み得るので、2つ(またはそれ以上の)ポリヌクレオチド間の配列比較は、2つのポリヌクレオチドの配列を「比較ウィンド」にわたって比較して、配列相同性の局所的な領域を同定し、比較することによって典型的に行われる。本明細書に使用される場合、「比較ウィンド」とは、連続する少なくとも20のヌクレオチド位置の概念的なセグメントを指し、ここで、ポリヌクレオチド配列が、連続する少なくとも20のヌクレオチドの基準配列と比較され得、ポリヌクレオチド配列の比較ウィンドにおける部分は、2つの配列の最適な整列化とっての基準配列(付加または欠失を含んでいない)と比較して、20パーセント以下の付加または欠失(すなわちギャップ)を含み得る。比較ウィンドを整列化するための配列の最適な整列化は、(1)SmithおよびWatermanのローカル相同アルゴリズム[Smith and Waterman, Adv. Appl. Math. 2: 482 (1981)]、(2)NeedlemanおよびWunschの相同アラインメントアルゴリズム[Needleman and Wunsch, J. Mol. Biol. 48:443 (1970)]、(3)PearsonおよびLipmanの類似性に関する検索[Pearson and Lipman, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 85:2444 (1988)]、(4)コンピュータ化したこれらのアルゴリズム(GAP, BESTFIT, FASTA, and TFASTA in the Wisconsin Genetics Software Package Release 7.0, Genetics Computer Group, 575 Science Dr., Madison, Wis.)、または確認によって行われ、様々な方法によって生成される最適なアラインメント(すなわち、比較ウィンドにわたる相同性が最も高い割合になるアラインメント)が選択される。「配列同一性」という用語は、2つのポリヌクレオチド配列が、比較ウィンドにわたって同一(すなわち、ヌクレオチドの一対一の対応関係において)であることを意味している。「配列同一性の割合」という用語は、最適にアラインメントされた2つの配列の比較ウィンドにわたる比較、同一の核酸塩基(例えば、A、T、C、G、UまたはI)が両方の配列内に生じている位置の数を決定して、適合する位置の数の算出すること、適合する位置の数を比較ウィンド内の位置の全数(すなわち、ウィンドの寸法)によって割ること、およびこの結果を100倍して配列同一性の割合を出すことによって算出される。本明細書に使用される場合、「実質的に同一」という用語は、ポリヌクレオチド配列の特性を示している。ここで、ポリヌクレオチドは、少なくとも20ヌクレオチドの部分、一般的には少なくとも25〜50ヌクレオチドの部分の比較ウィンドにわたって基準配列と比べて、少なくとも85パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも90〜95パーセントの配列同一性、より一般的には少なくとも99パーセントの配列同一性を有する配列を含んでいる。ここで、配列同一性の割合は、比較ウィンド内の基準配列のうちの合計して20パーセント以下の欠失または付加を含んでいるポリヌクレオチド配列と基準配列を比較することによって算出される。基準配列は、より大きな配列のサブセットであり得、例えば、本発明において請求される組成物の全長配列(例えば、IKKiペプチドまたはその断片をコードしている核酸配列)のセグメントであり得る。
ポリペプチドに使用されるときに、「実質的に同一」という用語は、2つのペプチド配列が、例えば、デフォルトのギャップ荷重を用いたGAPまたはBESTFITといったプログラムによって最適にアラインメントされている場合に、少なくとも80パーセントの配列同一性、好ましくは少なくとも90パーセントの配列同一性、より好ましくは少なくとも95パーセントの配列同一性、またはそれ以上(例えば、99パーセントの配列同一性)を共有することを意味している。好ましくは、同一ではない残基の位置は、保存的なアミノ酸置換によって異なっている。保存的なアミノ酸置換とは、類似の側鎖を有している残基の交換可能性を指す。例えば、脂肪族側鎖を有しているアミノ酸のグループは、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、およびイソロイシンである。脂肪族ヒドロキシル側鎖を有しているアミノ酸のグループは、セリンおよびトレオニンである。アミド含有側鎖を有しているアミノ酸のグループは、アスパラギンおよびグルタミンである。芳香族を有しているアミノ酸のグループは、フェニルアラニン、チロシン、およびトリプトファンである。塩基側鎖を有しているアミノ酸のグループは、リジン、アルギニン、およびヒスチジンである。硫黄を含んでいる側鎖を有しているアミノ酸のグループは、システインおよびメチオニンである。好ましい保存的なアミノ酸置換基は、バリン−ロイシン−イソロイシン、フェニルアラニン−チロシン、リジン−アルギニン、アラニン−バリン、およびアスパラギン−グルタミンである。
本明細書に使用される場合、「IKKi」という用語は、B細胞におけるκ軽鎖ポリペプチド遺伝子エンハンサーのキナーゼイプシロンの阻害剤を指す。と共に、上記タンパク質およびこれをコードしている遺伝子を指して用いられるすべての他の用語としては、IカッパBキナーゼイプシロン、IkBKE、IKKE、IKK−E、IKK−イプシロン、IKKI、IKK−i、誘導性IカッパBキナーゼ、核因子カッパBキナーゼイプシロンサブユニットの阻害剤、核因子カッパBキナーゼサブユニットイプシロンの阻害剤、KIAA0151、MGC125294、MGC125295、MGC125297、AW558201、Ikke、IKKイプシロン、Ikki、IKK−i、誘導性IカッパBキナーゼ、核因子カッパBキナーゼイプシロンサブユニットの阻害剤、核因子カッパBキナーゼサブユニットイプシロンの阻害剤、IKK3、IKKε、およびIKKιが挙げられるが、これらに限定されない。
本明細書に使用される場合、「リン酸化特異的抗体」という用語は、共有結合性のリン酸の修飾を受けた抗原と当該修飾を受けていない抗原とを識別し得る抗体を指す。リン酸化特異的抗体は、抗原の非リン酸化形態に対して特異的であり得るか、またはリン酸化形態に対して特異的であり得る。いくつかの場合には、リン酸化型特異的抗体によって認識されるエピトープが知られている。いくつかの場合には、そうではない。リン酸化型特異的抗体の生成方法および使用については、当該分野において公知である(例えば、Taya et al, In: Tumor Suppressor Genes: Vol. 2 Regulation, Function, and Medicinal Applications, Methods Mol. Biol., 223, 17-26, 2003; 米国特許第. 6,309,863; 米国特許第. 6,924,361; Sykes etalcurrent Proteomics, 3, 113-117, 2006)。
〔詳細な説明〕
本発明は、肥満症、インスリン抵抗性、糖尿病、体重減少および関連する障害に関する診断方法、スクリーニング方法、および処置の方法を提供する。特に、本発明は、このような健康状態をIKKi阻害剤によって処置する方法、このような健康状態をIKKiの状態に基づいて診断する方法、およびIKKi阻害剤の候補物をスクリーニングする方法を提供する。
本発明の実施形態を完成させるまでに行われた研究は、活性化されたIKKiが、インスリン受容体をリン酸化し、これによって、インスリンシグナル伝達経路内のインスリン受容体の活性が阻止されることを実証した。従って、(例えばIKKi阻害剤を用いて)IKKiの活性化を妨げることは、体脂肪を減少させること、除脂肪体重の割合を増大させること、ならびに肥満、インスリン抵抗性、糖尿病および関連する障害などの疾患および健康状態の処置に有効である。本発明は、任意の特定の機序に限定されるものではなく、この機序の理解は本発明の実施に必須ではない。これと同時に、IKKiの阻害は、例えば、インスリンの天然の活性によってグルコース代謝を促進させ、これによって体脂肪を減少させ、糖尿病、肥満症および関連する障害を処置し得ると考えられる。従って、IKKiの活性のレベルを決定することは、肥満症、インスリン抵抗性および関連する障害などの健康状態を診断するためにも有効である。また、本発明は、任意の特定の機序に限定されないが、活性化されたIKKiの活性のレベルを決定することは、インスリン受容体がIKKによって阻害された否か、およびインスリン受容体が阻害された程度に関する情報を提供すると考えられる。これは、不適切なグルコース代謝に関連する特定の健康状態の診断になる。
インスリン抵抗性は、筋肉および脂肪におけるインスリン刺激性のグルコース輸送の異常、および肝臓におけるグルコース産生の、インスリンに依存する抑制の異常を特徴とする(Saltiel, 2001; Taniguchi et al., Nat. Rev. Mol. Cell Biol. 7, 85-96. 2006; Thirone et al., Trends Endocrinool. Metab. 17, 72-78, 2006)。長期にわたる多数の研究は、特に肥満の患者において、インスリン抵抗性が2型糖尿病の発症の最初のステップであることを示唆している。肥満は、前炎症性サイトカイン(TNFα、IL−6、IL−18、IL−1β、およびCRPが挙げられる)の血中濃度の増大と相関している(Hotamisligil, Nature, 444, 860-867,2006; Shoelson et al., Gastroentrol, 132, 2169-2180, 2007; Wellen et al., J. Clin. Invest., 115, 1111-1119, 2005)。これらのサイトカインの多くがインスリン作用を阻止し得、肥満と2型糖尿病との間に考えられる炎症性のつながりを示している(Schenk et al., J. Clin. Invest., 118, 2992-3002, 2008)。肥満の齧歯類およびヒトに由来する、肝臓および脂肪組織のどちらにおいても炎症が観察されている(Odegaard et al., Nat. Clin. Pract. Endocrinol. Metab. 11, 212-217, 2008; Schenk et al., J. Clin. Invest., 118, 2992-3002, 2008)。また、炎症プロセスに関わる遺伝子(CCR2(Tamura et al., Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 2195-2201, 2008; Weisberg et al., J. Clin. Invest., 112, 1796-1808, 2006)、MCP1(Kanda et al., J. Clin. Invest., 116, 1494-1505, 2006)、TNFα(Hotamisligil et al., Science, 259, 87-91, 1993; Moller, Trends Endocrinol. Metabl, 11, 212-217, 2000)、TLR4(Shi et al., J. Clin. Invest,, 116, 3015-3025, 2006)、JNK1(Hirosumi et al., Nature, 420, 333-336, 2002; Sabio et al., Science, 322, 1539-1543, 2008; Solinas etalcell Metab., 6, 386-397, 2007; Tuncman et al., PNAS, 103, 10741-10746, 2006)、CAP(Lesniewski et al., Nat. Med., 13, 455-462, 2007)、および他のもの(Franckhauser et al., Diabetologia, 51, 1306-1316, 2008; Odegaard et al., Nature, 447, 1116-1120, 2007; Wellen etalcell, 129, 537-548, 2007)が挙げられる)を標的として除去することによって、食餌性肥満または遺伝的肥満とインスリン抵抗性との間のつながりを分裂させると思われる。しかし、炎症状態の生成におけるこの最初のステップ、インスリン作用の障害に関連する一次シグナル、およびインスリン作用が障害を受けている組織は、明らかになっていない。
多数の研究が、肥満とインスリン抵抗性との関連性に関する、NFκBの重要な役割を示している(Tilg et al., Mol. Med., 14, 222-231, 2008; Wunderlich et al., PNAS, 105, 1297-1302, 2008)。この経路は、トール様受容体−4(TLR4)の下流を活性化し得る。これは、食餌性の脂肪酸との相互作用を原因としている(Kim etalcirc. Res., 100, 1589-1596, 2007、Tsukumo et al., Diabetes, 56, 1986-1998, 2007)か、または肥満に関連する低酸素症の結果として起こる(Schenk et al., J. Clin. Invest., 118, 2992-3002, 2008、Ye et al., Am. J. Physiol. Endocrinol., Metabl., 293, E1118-1128, 2007)。NFκBに関連している研究のほとんどが、阻害性のIκBタンパク質の上流にあるキナーゼIKKβの、標的化した欠失(Arkan et al., Nat. Med., 11, 191-198, 2005; Cai et al.,Nat. Med., 11, 183-190, 2005; Zhang etalcell, 135, 61-73, 2008)、または薬理学的な阻害(Yin et al., Nature, 396, 77-80, 1998; Yuan et al., Science, 293, 1673-1677, 2001)に基づいている。リン酸化が起こると、IκBは、プロテアソーム性の分解を受け、会合していたNFκB転写因子から放出されて、当該転写因子の核移行および多数の炎症遺伝子の転写を許容する(Akira et al., Nat. Rev. Immunol., 4, 499-511, 2004、Kawai et al., Trends Mol. Med., 13, 460-469, 2007)。高脂肪食を与えた肝細胞特異的なIKKβのノックアウトマウスは、肝臓インスリン感受性を維持しているが、脂肪および筋肉においてインスリン抵抗性を示す。これとは異なり、骨髄特異的なIKKβのノックアウトマウスは、食事による全身性インスリン抵抗性から保護されるが、肥満からは保護されない(Arkan et al., Nat. Med., 11, 191-198, 2005)。さらに、IKKβ活性を阻害する高用量のサリチル酸塩は、肥満マウスにおけるグルコース耐性を改善し(Kim etalcirc. Res., 100, 1589-1596, 2007; Yin et al., Nature, 396, 77-80, 1998)、2型糖尿病に罹っている患者におけるグルコース耐性を改善する(Fleischman et al., Diabetes Care, 31, 289-294, 2008; Grilli et al., Science, 274, 1383-1385, 1996; Kopp et al., Science, 265, 956-959, 1994; Koska et al., Diabetologia, 52, 385-393, 2008)。
タンパク質のIKK(IκBキナーゼ)ファミリーは、4つのメンバーであるIKKα、IKKβ、IKKi(またはε)、およびTBK1(TANK結合キナーゼ1)から構成されている(Hacker et al., Science STKE, 357, re13, , 2006; Kawai et al., Trends Mol. Med., 13, 460-469, 2007)。IKKαおよびIKKβは、標準的なNFκB経路を活性化するが、IKKiおよびTBK1の役割は、あまりよく理解されていない。IKKiの発現は、部分的にはNFκB活性化の結果として、炎症性刺激後の骨髄細胞において誘導される(Shimada et al., Int. Immunol., 11, 1357-1362, 1999)。その一方で、TBK1は、より遍在的に発現される(Pomerantz et al., EMBO J., 18, 6694-6704, 1999)。典型的ではないこれらIKKは、RelAのリン酸化によってNFκBの転写活性を向上させ得る(Adli et al., J. Biol. Chem., 281, 26976-26984, 2006、Buss et al., J. Biol. Chem., 279, 55633-55643, 2004)が、転写因子であるインターフェロン調整因子−3および7(IRF3およびIRF7)のリン酸化によって、転写を主に調節すると考えられる(Peters et al., Mol. Cell, 5, 513-522, 2000、Sharma et al., Science, 300, 1148-1151, 2003)。
肥満症と糖尿病との間の炎症性のつながりに関する有力な証拠があるのもかかわらず、炎症反応が生じる(複数の)主な部位は、未だに確定されていない。脂肪組織は、おそらく小胞体または酸化ストレスを生成することによって(Hotamisligil et al., Nat. Rev. Immunol., 8, 923-934, 2008; Wellen et al., J. Clin. Invest., 115, 1111-1119, 2005)、M1期に偏っている前炎症性マクロファージを脂肪組織に動員するサイトカインまたはケモカインを分泌することによって(Lumeng et al., Deabetes, 56, 16-23, 2007)、栄養過多に応答する。これらは次に、含脂肪細胞におけるインスリン作用を低下させるより多くのサイトカインを分泌し、その結果、脂肪分解および遊離脂肪酸の放出を引き起こす(Feingold et al., Endocrinol., 130, 10-16, 1992; Green et al., Endocrinol., 134, 2581-2588, 1994)。また、前炎症性サイトカインを分泌することによって、遺伝的肥満または食餌性肥満に起因する炎症性反応が、肝臓に生じることが証明されている(Ramadori et al., J. Physiol., Pharmacol., Suppl. 1, 107-117, 2008)。しかし、マクロファージの動員および活性化の基礎をなす分子の詳細、関与する亜型、筋肉細胞、脂肪細胞および肝細胞とのそれらの交差性、ならびにこれらによるエネルギーの消費および貯蔵の調節の様式は、明らかになっていない。本発明の実施形態を完成させるまでに行った実験は、高脂肪食が、肝臓および白色脂肪組織の両方において、IKKiの発現を誘導することを示しており、さらに、IKKiの標的除去を受けたマウスが、食餌性肥満、肝臓および脂肪炎症、肝脂肪症およびインスリン抵抗性から驚くほどに保護されており、肥満症および2型糖尿病に関する興味深い処置の標的を提供していることを示している。
I. インスリン/インスリン受容体シグナル伝達経路
(インスリン刺激性のグルコース輸送が、トランスポータGlut4によって媒介される)
先天性の、免疫反応、炎症およびインスリン抵抗性の間におけるつながりは、多数の機序によってインスリン感受性が調節されていることを示唆しており、インスリン作用の基本的な機序を理解することの重要性を高めている。グルコース輸送は、インスリンがグルコース貯蔵およびグルコース利用を増加させる律速段階であり、促進性のトランスポータGlut4によって媒介される。インスリンは、主に原形質膜におけるGlut4タンパク質の濃度を高めることによって、筋肉および脂肪におけるグルコース取込みを増大させる。これは、制御された再循環のプロセスであり、このプロセスにおいて、タンパク質のエンドサイトーシス、ソーティング、エクソサイトーシス、保持、結合および融合が厳密に調節される。インスリンの非存在下、またはインスリンの受容体の活性化後において、Glut4は、典型的なエンドサイトーシスのプロセスによって吸収される。含脂肪細胞では、これらの小胞は、細胞内の核周辺領域に保持され、インスリンに応答した保持、結合および融合のために、原形質膜における不連続な部位に輸送される。
(インスリン受容体からのシグナル伝達)
インスリン受容体(IR)は、ヘテロ四量体の二機能性複合体であり、インスリンと結合する2つの細胞外αサブユニット、およびチロシンキナーゼ活性を有している2つの膜貫通βサブユニットから成る。αサブユニットと結合しているインスリンは、活性化ループにおける特定のチロシン残基に対する、他方のβサブユニットによる一方のβサブユニットのリン酸転移を刺激し、キナーゼの触媒活性の増大を生じさせて、膜近傍領域および細胞内の尾部の他のチロシン残基における自己リン酸化を増大させる。その後、活性化されたIRは、細胞内の基質(インスリン受容体基質ファミリー(IRS1−4)、APSのファミリーおよびCblのファミリーのメンバーが挙げられる)をリン酸化する。これらのタンパク質のいくつか(例えばIRS−1)は、NPXYモチーフを含んでいる受容体内の膜近傍領域に集められ、その一方で、APSおよびIRS−2は、活性化ループと直接的に結合する。リン酸化が起こると、IR基質は、Src相同2(SH2)ドメインを有している、一連のエフェクタ分子またはアダプタ分子と相互作用する。SH2ドメインは、異なるホスホチロシンモチーフを特異的に認識する。
(PI3−キナーゼ経路およびグルコース取込み)
タンパク質のIRSファミリーは、最も性質決定がなされている受容体基質である。IRS−1−ノックアウトマウスは、グルコース耐性が低下した末梢組織において、インスリン抵抗性である。IRS−2ノックアウトマウスは、末梢組織および肝臓のどちらにおいてもインスリン抵抗性であり、β細胞の機能低下とともにインスリン抵抗性に起因する2型糖尿病を発症する。
チロシンのリン酸化が起こると、IRSタンパク質は、PI3−キナーゼのp85調節サブユニットと相互作用し、酵素の活性化および酵素の原形質膜に対する標的化を導く。酵素は、脂質産物であるホスファチジルイノシトール3,4,5−トリスリン酸塩(PIP)を生成する。PIPは、多数のタンパク質の局在化および活性を調節する。薬理学的阻害剤を用いた酵素の遮断によって、グルコース取込みの刺激が完全に阻害される。PI3−キナーゼのドミナント阻害形態の過剰発現は、グルコース取込みを遮断し、恒常的な活性形態の過剰発現は、インスリン作用を部分的に模倣する。マウスのp85PI3−キナーゼ調節サブユニットの標的化した欠失によって、インスリン感受性が増大して、PIキナーゼ活性の増大におそらく起因してグルコースの取込みおよび処理が促進される。逆に言えば、触媒サブユニットの遺伝子ノックアウトは、糖耐性の異常およびインスリン抵抗性をもたらす。
インスリン刺激によるPIP増加は、プレクストリン相同(PH)ドメインを含んでいるタンパク質(様々な酵素、それらの基質、アダプタ分子、および細胞骨格タンパク質が挙げられる)の集合をもたらす。PDK1は、これらのうちの1つであり、キナーゼAkt1−3、PKCζ/λおよびSGKをリン酸化する。調節タンパク質Rictorと複合体化されたタンパク質キナーゼmTORは、PDK2と同定されている。PIPは、リン酸化のためにAktの原形質膜への移行を、そのPHドメインを介して媒介する。3T3L1含脂肪細胞における膜結合型のAktの過剰発現は、Glut4の原形質膜への局在化を増進させる。インスリン刺激性のGlut4の移行は、ドミナント阻害のAkt突然変異体の発現によって阻害され、Aktのノックダウンまたはノックアウトは、インスリン作用を遮断する。
PI3−キナーゼ経路に関する重要な役割を支持する証拠があるにもかかわらず、この酵素の活性化は、インスリン刺激性のグルコース輸送にとって十分ではない。PDGFまたはインターロイキン4によるPI3−キナーゼ活性の刺激は、グルコース取込みを増大させない。多数のインスリン受容体の突然変異体が同定されており、グルコース取込みおよびPI−キナーゼの刺激は、これらの突然変異体によって、異なる制御を受けている。IRS1 PTBドメインの過剰発現は、IRS1に関連するPI3キナーゼ活性を低下させるが、インスリン刺激性のグルコース取込みには影響しなかった。さらに、PIPの膜透過型の類似物の添加によって、インスリンの非存在下におけるグルコース取込みは刺激されなかった。これと一致して、恒常的に活性なPI3−キナーゼ突然変異体の過剰発現は、インスリン刺激性のGlut4の原形質膜への移行を完全に模倣しなかった。総合すると、これらのデータは、PI3−キナーゼの活性化が、グルコース取込みの刺激とって十分ではないことを示唆している。
(脂質ラフトからのインスリンシグナル伝達)
いくつかの研究は、別々のインスリンシグナル伝達経路が、脂質ラフトの微小ドメインに局在化されていることを示している。脂質ラフトの微小ドメインは、コレステロール、スフィンゴ脂質、糖脂質、GPI−結合タンパク質、および脂質修飾されたシグナル伝達タンパク質に富む原形質膜の特別な領域である。少なくともいくつかのインスリン受容体が、ラフトタンパク質のカベオリンとの相互作用をおそらく介して、これらの微小ドメイン内に存在していることが示されている。これらの原形質膜サブドメインにおけるインスリン受容体の活性化は、プロトオンコジーンc−CblおよびCbl−bのチロシンリン酸化を刺激する。このリン酸化ステップは、アダプタータンパク質APSに対するCblの集合を必要とする(以下を参照)。APSは、受容体に結合すると、C−末端のチロシンにおいてリン酸化され、APSのSH2ドメインを介してCblの集合をもたらす。続いて、Cblは、3つのチロシンにおいてリン酸化を受ける。
Cbl関連タンパク質(CAP)は、Cblと共に、インスリン受容体であるAPS複合体に集められる。CAPは、腸のペプチドであるソルビンと類似のアミノ末端領域(ソルビン相同(SoHo)ドメインと呼ばれる)、および3つのSH3ドメインを有している二機能性のアダプタータンパク質である。CAPは、インスリン感受性の組織に見られ、発現は、PPARγ(インスリン増感薬のチアゾリジンジオン類にとっての受容体)の活性化によって増加する。
CAPのカルボキシル末端SH3ドメインは、Cbl内のPXXPモチーフと会合して、これらのタンパク質が恒常的に会合される。CAPは、インスリン受容体に集められると、そのSoHoドメインを介して、脂質ラフトドメインタンパク質のフロチリンと相互作用する。Cblまたはフロチリンと結合しないドミナント阻害型のCAP突然変異体の過剰発現は、リン酸化されたCblの脂質ラフトへの移行を阻害し、インスリン刺激性のグルコース取込みおよびGlut4の移行も妨げる。
チロシンのリン酸化を受けると、Cblは、SH2/SH3を含んでいるアダプタータンパク質であるタンパク質CrkIIと相互作用する。CrkIIは、そのSH2ドメインを介してCblを結合し、そのSH3ドメインを介して、ヌクレオチド交換因子C3Gと恒常的に会合する。従って、インスリンは、CrkIIおよびC3Gの両方の、脂質ラフトへの移行を刺激する。このホルモンの作用は、細胞をCAPΔSH3またはCAPΔSoHoを用いた細胞のトランスフェクションによって遮断され得る。その移行が起こると、C3Gは、小RhoファミリーGタンパク質である、TC10αおよびTC10βの活性化を触媒する。SiRNA媒介性のノックダウンの研究は、TC10βではなくTC10αの活性化が、インスリンによるグルコース取込みの刺激に必要であることを示している。総合すると、これらのデータは、CAP/Cbl/TC10経路が、PI3−キナーゼシグナル伝達カスケードと、平行して、かつ独立して、インスリン刺激性グルコース取込みに必要であることを示している。さらに、多数の研究は、肥満およびインスリン抵抗性の状態において、CAP/Cbl/TC10経路が変化することを実証している。
II. IKKi
IKKiは、IKKαおよびIKKβに関連するキナーゼである(Shimada et al., Int. Immunol., 11: 1357-1362 (1999))。IKKiは、IKKαおよびIKKβと相同であるが、キナーゼドメインにおけるIKKiとIKKβとの間のアミノ酸の同一性は、24%に過ぎない。IKKiの過剰発現は、NFκBを活性化する。IKKiは、免疫細胞において優先的に発現し、LPSまたは炎症性サイトカインに応答して誘導される。キナーゼ活性は、IKKiの発現量によって調節され得る(Shimada et al.)。IKKiは、NFκBの活性を阻害する複合体のIkBタンパク質をリン酸化する。これらのIkBタンパク質のリン酸化が、当該タンパク質を分解させ、これによって、NFκBは活性になる。
上述のように、本発明を完成させるまでに、IKKiが、インスリン受容体のリン酸化を担っており、これによって、適切なグルコース代謝におけるインスリンの役割を阻害していることが判明した。IKKiは、誘導性IカッパBキナーゼ、ならびにIKKεおよびIKK3としても知られている。栄養過多の状態では、炎症性のマクロファージが、脂肪組織に侵入し、インスリン作用を低下させるサイトカインを分泌して、特に、ホルモンの抗脂肪分解作用を阻止する。その結果、脂肪分解および脂肪酸の産生が増大する。分泌されたこれらのサイトカインおよび脂肪酸が、マクロファージおよび含脂肪細胞の両方において、NFκB経路を活性化し得る。誘導性のIカッパBキナーゼ(IKKi)は、この経路に存在するタンパク質キナーゼであり、脂肪酸およびサイトカイン(例えば、TNFaおよびIL−6)の両方によって誘導される。言い換えると、誘導性IカッパBキナーゼ(IKKi)は、炎症性の経路を開始させる。後述の実施例において説明するように、IKKiは、活性化すると、インスリン受容体のリン酸化を触媒することによって、インスリン抵抗性を誘導し、これによって、インスリン作用を低下させる過程において、基質との相互作用、および基質のチロシンのリン酸化を阻害する。対照食を与えたマウスからの含脂肪細胞および脂肪組織マクロファージと比べると、IKKiは、高脂肪食を与えたマウスに由来する含脂肪細胞および脂肪組織マクロファージの両方において誘導される。後述の実施例において説明するように、IKKi遺伝子を除去されたマウスは、高脂肪食の影響に対して耐性を示した。これらのマウスは、それらの対照同腹子とは異なり、高脂肪の食餌を与え続けても、肥満、またはインスリン抵抗性にならない。図24には、マウスのIKKiのコンセンサスアミノ酸配列および核酸配列が示されており、図25には、ヒトのIKKiのコンセンサスアミノ酸配列および核酸配列が示されている。
III. IKKi阻害剤
本発明は、肥満症、糖尿病、インスリン抵抗性、グルコース代謝異常および疾患の治療上の処置、ならびに体脂肪を減少させ、除脂肪体重の割合を増大させる処置に用いられるIKKi阻害剤の種類によって限定されない。例示的な化合物について、以下に説明する。さらなるIKKi阻害剤が、IV.に記載のスクリーニング法によって同定され得る。好ましい実施形態では、IKKi阻害剤は、IKKiのインスリン受容体のリン酸化活性を阻害する。特定の実施形態では、IKKi阻害剤は、インスリン受容体配列VKTVNES(配列番号15)のセリン、または非ヒトインスリン受容体配列(該配列は、例えば、配列アラインメントを用いて同定され得る)の対応するセリンにおいて、IKKiのインスリン受容体のリン酸化活性を阻害する。いくつかの実施形態では、IKKi阻害剤は、IKKiのインスリン受容体リン酸化活性を阻害するが、IKKiの他の活性(他のキナーゼ活性が挙げられる)を阻害しない。
IKKiの発現または活性を阻害する例示的な薬剤としては、低分子干渉RNA(siRNA)、リボザイム、アンチセンス核酸、キナーゼ阻害剤、抗IKKi抗体、小分子、ペプチド、および突然変異体のIKKiポリペプチドなどが挙げられる。いくつかの実施形態では、IKKi阻害剤は、IKKi RNAの機能を阻害し得る核酸配列である(例えば、図24および図25に示される配列)。IKKi RNAの機能を阻害し得る核酸は、IKKi遺伝子のコード領域および非コード領域から生成され得る。しかし、IKKi RNAの機能を阻害し得る核酸は、コード領域の5’末端の近傍の配列に相補的であるものとして一般的に選択される。従って、いくつかの実施形態では、IKKi RNAの機能を阻害し得る核酸は、配列番号11(マウス)または配列番号13(ヒト)の5’末端の近傍の配列に相補的であり得る。他の実施形態では、IKKi RNAの機能を阻害し得る核酸は、他の種(例えば、マウス、ラット、ネコ、イヌ、ヤギ、豚、またはサルのIKKi RNA)に由来する。
IKKi RNAの機能を阻害し得る核酸配列は、配列番号11もしくは13の選択された領域、または非常に類似している配列に、100%相補的である必要はない。その代わり、IKKi RNAの機能を阻害し得る核酸の配列におけるいくつかの変異が、許容される。これは、機能が、以下に記載するスクリーニングアッセイにおいて決定され得るからである。例えば、ヒトIKKi RNAの機能を阻害し得る核酸は、マウスまたはラットのIKKi遺伝子産物をコードしている核酸に対して相補的であり得る。マウスIKKi遺伝子産物をコードしている核酸は、例えば、NCBIデータベース内の、GenBankアクセッション番号AB016589、NM019777、NT0399180、およびCCDS15269.1に見出され得る。すなわち、マウスIKKiポリペプチド配列は、GenBankアクセッション番号NP062751またはCCDS15269.1を有しており、ラットIKKi cDNAは、GenBankアクセッション番号XM344139を有している。
さらに、中程度のストリンジェンシーまたは高いストリンジェンシーのハイブリダイゼーション条件下においてハイブリダイズし得る核酸は、IKK RNAの機能を阻害する程度に十分に相補的であり、本発明の組成物に利用可能である。概して、ストリンジェントなハイブリダイゼーション条件は、あるイオン強度およびpHにおいて、特定の配列にとっての熱融点(Tm)よりも、約5℃低く選択される。しかし、ストリンジェントな条件は、本明細書において他に条件づけしたように、所望のストリンジェンシーの程度に応じて、選択された配列の熱融点よりも約1℃〜約20℃低い範囲の温度を包含する。いくつかの実施形態では、IKKi RNAの機能を阻害し得る核酸は、生理学的な温度および塩濃度といった生理学的条件において、IKKi RNAにハイブリダイズし得る。
従って、IKKi RNAを阻害し得る核酸と、IKKi RNAの相補的なコード配列との間における二重鎖の形成の実現に、厳密な相補性は必要ない。IKKiコード配列に厳密に相補的な例えば2、3、4、5またはそれ以上の長さの連続するヌクレオチドを含んでいる阻害性の核酸分子は、IKKi mRNAの機能を阻害し得る。阻害性の当該核酸分子のそれぞれは、隣接するIKKiコード配列に相補的ではない、連続する長さのヌクレオチドによって分離されている。
一般的に、連続するヌクレオチドのそれぞれの長さは、少なくとも4、5、6、7、8またはそれ以上のヌクレオチド長である。非相補的な介在配列は、好ましくは、1、2、3または4ヌクレオチド長である。当業者は、センス核酸にハイブリダイズされた核酸の計算された融解点を使用して、特定のIKKi RNAの発現を阻害するための特定の核酸の間において許容される不整合の度合いを評価し得る。
いくつかの実施形態では、内在性のIKKi RNAの機能を阻害し得る核酸は、アンチセンスオリゴヌクレオチドである。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、IKKi遺伝子配列のコード配列(例えば、配列番号11または13)の少なくとも一部と相補的である。このようなアンチセンスオリゴヌクレオチドは、一般的に、少なくとも6ヌクレオチド長であるが、約8、12、15、20、25、30、35、40、45または50ヌクレオチド長であり得る。また、より長いオリゴヌクレオチドが使用され得る。IKKiアンチセンスオリゴヌクレオチドは、DNAコンストラクトまたは発現カセットに備えられ得、細胞分裂が抑制される細胞、例えばIKKiを発現する細胞(例えば、含脂肪細胞またはマクロファージ)に導入され得る。
本発明の一実施形態では、リボザイムを用いてIKKi遺伝子の発現を低減させる。リボザイムは、触媒活性を有しているRNA分子である(例えば、Cech, 1987, Science 236: 1532-1539、Cech, 1990, Ann. Rev. Biochem. 59: 543-568、Cech, 1992, Curr. Opin. Struct. Biol. 2: 605-609、およびCouture and Stinchcomb, 1996, Trends Genet. 12: 510-515を参照すればよい)。当該技術において公知のように、RNA配列の切断によって遺伝子機能を阻害するために、リボザイムを利用し得る(例えば、Haseloff et al., 米国特許第5,641,673号を参照)。
IKKI配列(例えば、配列番号11または13)に相補的なIKKi核酸を用いて、IKKi遺伝子から転写されるmRNAと特異的に結合するリボザイムを生成し得る。当該技術において、トランス型の他のRNA分子を高い配列特異性を有して切断し得るリボザイムを設計および構成する方法が、開発および記載されている(Haseloff et al. (1988), Nature 334: 585-591を参照)。例えば、リボザイムの切断活性は、別々の「ハイブリダイゼーション」領域をリボザイムに設計することによって、特定のRNAに対して標的化され得る。ハイブリダイゼーション領域は、標的のRNAに相補的な配列を含んでおり、従って標的と特異的にハイブリダイズする。標的の配列は、ヌクレオチド配列(例えば、配列番号11または13)から選択された約10、12、15、20または50の連続するヌクレオチドの断片であり得る。より長い相補配列を用いて、標的化するハイブリダイゼーション配列の親和性を増大させ得る。リボザイムのハイブリダイズ領域および切断領域は、一体的に関連し得る。従って、相補的な領域を介して標的RNAにハイブリダイズすることによって、リボザイムの触媒領域は、標的を切断し得る。
RNA干渉(RNAi)は、dsRNAの直接導入によって導入された、転写後遺伝子サイレンシング(PTGS)に関する。低分子干渉RNA(siRNA)は、一般的に、転写後遺伝子サイレンシングを媒介する21〜23ヌクレオチドRNAである。siRNAの導入は、哺乳類の細胞における転写後遺伝子サイレンシングを誘導し得る。siRNAは、直接導入されたか、またはトランス遺伝子もしくはウイルスを介して導入されたdsRNAの切断によって、インビボにおいて製造され得る。いくつかの生体において、RNA依存性のRNAポリメラーゼによる増幅が生じ得る。siRNAは、RNA誘導性のサイレンシング複合体に組み込まれ、相同性を有している内在性のmRNAに当該複合体導き、当該複合体は転写物を切断する。
siRNAを設計する基準は、当該分野において公知である(例えば、引用によって本明細書に援用されるElbashir et al., 2001, Nature 411: 494-498; J. Harborth, S.を参照すればよい)。従って、IKKi配列内の標的部位を選択することによって、有効なsiRNAが作製され得る。IKKi配列は、例えば、センスsiRNA鎖およびアンチセンスsiRNA鎖の両方にまたがっている3’UUを有しており、約50%のG/C含量を有しており、AAに始まる配列番号11または13が挙げられる。いくつかの実施形態では、siRNAは、以下の配列:
AAUUACCUGU GGCACACAGA UU (配列番号14)
AAGGCCCGCA ACAAGAAAUC CUU (配列番号15)
AACAAGAAAU CCGGAGAGCU GUU (配列番号16)
AAAUCCGGAG AGCUGGUUGC UU (配列番号17)
AAGGUCUUCA ACACUACCAG CU (配列番号18)
のうちの1つを有している二本鎖RNAであり得る。
いくつかの実施形態では、IKKi阻害剤は、以下の配列:5’−GUGAAGGUCUUCAACACUACC−3’(配列番号19)および5’−UAGUGUUGAAGACCUUCACAG−3’(配列番号20)のうちの1つを有している低分子干渉RNAである。
特定の実施形態では、IKKi阻害剤は小分子である。例えば、特定の実施形態では、IKKi阻害剤は、5−(5,6−ジメトキシ−1H−ベンズイミダゾール−1−イル)−3−[[2−(メチルスルホニル)フェニル]メトキシ]−2−チオフェンカルボニトリルである。特定の実施形態では、IKKi阻害剤は、WO2005/075465(引用によってその全体が本明細書に援用される)に記載のベンズイミダゾール置換されたチオフェン誘導体である。例示的なIKKi阻害剤は、以下の式:
Figure 2011518126
(ここで、nは、0、1、2、3または4であり;
同じか、または異なるRはそれぞれ独立して、H、ハロゲンまたは基(X)a(Y)bZを表し;
Xは、−O−または−CONH−を表し;
aは、0または1であり;
Yは、−C1−6アルキレン−を表し;
bは、0または1であり;
Zは、ヒドロキシ、C1−6アルキル、C1−6ハロアルキル、C5−7ヘテロシクリル、C1−6アルコキシアルキル、C1−6ハロアルコキシアルキルをを表し;
は、基−(X)c(Y)dZをを表し;
ここで、Xは、−C1−12アルキレン−を表し;
cは、0または1であり;
Y1は、−O−を表し;
dは、0または1であり、
0Zは、H、アリールまたはヘテロアリールを表し、当該アリールまたはヘテロアリールのそれぞれが、5〜14の環を構成する原子、C5−7ヘテロシクリル、C5−7シクロアルキル、C5−7シクロアルケニルを含んでおり(これらのアリール、ヘテロアリール、ヘテロシクリル、シクロアルキル、シクロアルケニルのそれぞれが、独立してC1−6アルキル、C1−6ハロアルキル、ハロゲン、C1−6アルコキシ、C1−6ハロアルコキシ、S0、C1−6ヒドロキシアルキルから選択される1つ以上の置換基によって任意に置換されている)
は、HまたはC1−6アルキルを表す)
によって表される物質、または薬学的に受容可能な塩、媒和物もしくはその生理学的誘導体である。
他の実施形態では、IKKi阻害剤は、以下の表1に示される化合物から選択される。
Figure 2011518126
特定の実施形態では、IKKi阻害剤は、抗体または抗体断片(ポリクローナル抗体およびモノクローナル抗体が挙げられる)である。当該分野において公知の様々な手順を、IKKiに対するポリクローナル抗体の生成に用い得る。抗体を生成するためには、様々な宿主動物が、IKKiエピトープに対応するペプチドを注射することによって免疫化され得る。当該宿主動物としては、ウサギ、マウス、ラット、ヒツジ、ヤギなどが挙げられるが、これらに限定されない。好ましい一実施形態では、ペプチドは、免疫原性担体(例えば、ジフテリアトキソイド、ウシ血清アルブミン(BSA)、またはキーホールリンペットヘモシアニン(KLH))に接合される。宿主動物種によっては、様々なアジュバントを用いて、免疫応答を増大させ得る。様々なアジュバントとしては、フロインドのアジュバント(完全および不完全)、ミネラルゲル(例えば水酸化アルミニウム)、界面活性物質(例えばリゾレシチン、プルロニックポリオール、多価陰イオン、ペプチド、油乳濁液、キーホールリンペットヘモシアニン、ジニトロフェノール、および潜在的に有用なヒトアジュバント(例えば、BCG(カルメット・ゲラン桿菌)およびコリネバクテリウム・パルヴム))が挙げられるが、これらに限定されない。
IKKiに対するモノクローナル抗体の調製のための、培養における継代的な細胞株を用いて抗体分子の生成を提供する任意の技術について、本発明をともなう用途が見出されると考えられる(例えば、Harlow and Lane, Atibodies. A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, NYを参照)。これらの技術には、KohlerおよびMilsteinによって最初に開発されたハイブリドーマ技術(Kohler and Milstein, Nature 256: 495-497 [1975])、トリマー技術、ヒトB細胞ハイブリドーマ技術(例えば、Kozbor et al., Immunol. Tod., 4: 72 [1983]を参照)、およびヒトモノクローナル抗体を生成するためのEBV−ハイブリッドマ技術(Cole et al., in Monoclonal Antibodies and Cancer 処置法, Alan R. Liss, Inc., 頁77-96 [1985])が挙げられるが、これらに限定されない。
市販の様々な抗IKKi抗体を、本発明の方法および組成物と共に使用し得る。典型的な抗体としては、Abcamからのマウスモノクローナル抗体107A1458、Abcamからのマウスモノクローナル抗体72B587、Abnova Corporationからのマウス抗ヒトモノクローナル抗体1F7、2B6、2F1、および3D11、ABR-Affinity BioReagentsからのマウス抗ヒトモノクローナル抗体72B587、Calbiochem社からのウサギ抗ヒトポリクローナル抗体701−716、およびImgenixからのマウスモノクローナル抗体107A1458が挙げられるが、これらに限定されない。
IV. IKKi阻害剤スクリーニング方法
本発明は、体脂肪の低下、除脂肪体重の割合の増加、ならびに疾患(例えば、肥満、インスリン抵抗性、糖尿病および関連する障害)の処置に有効なIKKi阻害剤を同定するためのスクリーニング方法を提供する。また、当該阻害剤は、研究および診断への適用に用途を見出される。好ましい実施形態では、同定されたIKKi阻害剤は、IKKiのインスリン受容体のリン酸化活性を阻害する。特定の実施形態では、同定されたIKKi阻害剤は、配列番号14(コンセンサスヒト配列)において下線が付されてる配列番号15(VKTVNES)のセリン、または(例えば、配列アラインメントを用いて同定され得る)対応するヒトもしくは非ヒト配列内の対応するセリンにおける、IKKiのインスリン受容体のリン酸化活性を阻害する。いくつかの実施形態では、同定されたIKKi阻害剤は、IKKiのインスリン受容体のリン酸化活性を阻害するが、IKKiの他の1つ以上の活性(例えば他のキナーゼ活性)を阻害しない。
本発明は、IKKiのインスリン受容体のリン酸化活性を阻害し得る薬剤を同定するスクリーニング方法を提供する。例えば、特定の実施形態では、無細胞アッセイを行う。この分析法では、IKKi、IR(インスリン受容体)、32P−γ−標識ヌクレオチドおよび薬剤の候補物は、IKKiがヌクレオチドからインスリン受容体に(例えば、配列番号14の1062位のセリン、および図26の太字によって示されるセリンに)32Pを転移させ得る条件において、混合される。その後、IRのリン酸化のレベルを算出して、薬剤の候補物が、薬剤の候補物と接触させなかった対照と比べて、IKKiの活性を減少(または増加)させている否かを決定し得る。IKKiのキナーゼ活性を決定する所定の方法は、当該分野において公知であり、Shimada et al., Internat. Immunol, 11:1357-1362, 1990、および国際公開第2004/097009号において示されていることに留意されたい。これらの文献は、引用によってその全体が本明細書に援用される。
IKKiのインスリン受容体のリン酸化活性を阻害し得る薬剤を同定するために、細胞に基づいたアッセイを利用し得る。例えば、試験細胞を、薬剤の候補物と接触させ、その後、細胞を溶解させて、細胞溶解物を生成し得る。この細胞溶解物におけるIKKi IRキナーゼ活性を、インビトロキナーゼアッセイによって評価し、薬剤の候補物が、細胞内のIKKi IRキナーゼ活性を増大させるか、または低減させるかを決定し得る。特定の実施形態では、(例えば、IR内の配列VKTVNES(配列番号15)のセリンにおける)IRのリン酸化を決定する。他の実施形態では、IRから下流のタンパク質(Aps、Cbl、およびTC10が挙げられる)のリン酸化状態を決定する。特定の実施形態では、試験細胞は、含脂肪細胞または脂肪組織マクロファージである。薬剤の候補物が、細胞内のIKKiの活性(例えば、IRキナーゼ活性)を低下させるが否かを決定するために、抗体を使用し得る。これは、例えば、(例えば1035/1065位のセリンにおいて)リン酸化されているIR(またはAps、CblもしくはTC10)を認識する抗体の入手、およびリン酸化されていないIR(またはAps、CblもしくはTC10)を認識する他の抗体の入手によってなされ得る。このような抗体は、例えば、配列番号15に示されるペプチドを用いて免疫することによって生成され得る。この場合、この配列におけるセリンは、リン酸化されており、リン酸化されていない。本方法に従って、薬剤の候補物に細胞を接触させる。接触されられたこの細胞から、溶解物を調製する。その後、溶解物は、リン酸化形態または非リン酸化形態のIR(またはAps、Cbl、もしくはTC10)を認識する抗体を用いてアッセイされる。その後、IRのリン酸化形態および非リン酸化形態に結合する抗体の量を、薬剤の候補物に接触させなかった対照細胞から調製された溶解物におけるIRのリン酸化形態および非リン酸化形態に結合する抗体の量と比較する。リン酸化されているIRとリン酸化されていないIRとの割合が、対照細胞よりも、処理された細胞において小さい場合に、薬剤の候補物がIKKi IRキナーゼ活性を阻害していることを示しいてる。いくつかの実施形態では、リン酸化されているIR(またはAps、CblもしくはTC10)のレベルは、フローサイトメトリーアッセイ(例えば、Luminex(登録商標)xMAP(登録商標)アッセイなどのビーズを用いたアッセイ)を用いて検出される。いくつかの実施形態では、リン酸化されていないIR(またはAps、CblもしくはTC10)に対するリン酸化されているIR(またはAps、CblもしくはTC10)を定量化するビーズを用いたアッセイにおいて、リン酸化型の特異的抗体を用いる。ビーズを用いたフローサイトメトリー定量アッセイは、当該分野において公知であり、例えば、米国特許第5,981,180号、および米国特許第7,049,151号に教示されている。これらの文献は、引用によって本明細書に援用される。
また、IKKiのキナーゼ活性を低減させる、薬剤の候補物の性能は、インビトロキナーゼアッセイを用いて評価され得る。例えば、細胞溶解物が調製され得る。細胞溶解物の一部を薬剤の候補物と接触させて、接触させられた溶解物を生成し得る。その後、接触させられた溶解物におけるIKKiのIRキナーゼ活性を、薬剤の候補物に接触させなかった溶解物におけるIKKiのIRキナーゼ活性と比較して、薬剤の候補物がIKKi IRキナーゼ活性を低減させたが否かを決定し得る。IKKiを用いてインビトロキナーゼアッセイが実施され得る条件は、本明細書に記載されていおり、当該分野において公知である(引用によって本明細書に援用されるShimada et al., Internat. Immunol, 11: 1357-1362 (1999))。
細胞および細胞溶解物を用いたアッセイの特定の実施形態では、細胞は、IKKiを活性化する化合物を用いて処理される。このようなIKKi誘導因子としては、腫瘍壊死因子(TNF)、リポ多糖類(LPS)、インターロイキン−1(IL−1)、インターロイキン−6(IL−6)、インターフェロンγ、ミリスチン酸ホルボール、および類似の薬剤が挙げられるが、これらに限定されない。特定の実施形態では、このようなIKKi誘導因子は、TLR4を活性化する化合物である。TLR4が活性化されるため、TLR4がIKKiをキナーゼ化し、IKKiを活性化する。
特定の実施形態では、本発明は、活性化されたIKKiを含んでいる含脂肪細胞または脂肪組織マクロファージを用いて、IKKi阻害剤を同定するスクリーニング方法を提供する。特定の実施形態では、IKKiを活性化するために、含脂肪細胞またはマクロファージを、IKKi誘導因子(例えば、LPS、IL−1、IL−6、インターフェロンγもしくはミリスチン酸ホルボール、または他の薬剤)に接触させる。このような活性化は、IKKiを活性化するTLR4の活性化によって行われ得る。上述のように、活性化されたIKKiは、インスリン受容体をリン酸化して、これによって、インスリン受容体がインスリンと相互作用することを阻害する(これによって、グルコース代謝が阻害される)。その後、活性化された含脂肪細胞およびマクロファージを、IKKi阻害剤の候補物に接触させ(そして、対照はIKKi阻害剤の候補物とは接触させない)、阻害剤の作用を測定する。特定の実施形態では、グルコース取込みをモニターする(例えば、図1に示されるように、2−デオキシグルコースを用いて取込みを測定する)。他の実施形態では、インスリン受容体のリン酸化の量または状態(例えば、配列番号15内のセリンのリン酸化)を決定する。さらなる実施形態では、Aps、CblまたはTC10のリン酸化の量または状態を決定する。さらなる実施形態では、GLUT4のグルコース輸送能を測定する(例えば、後述の実施例に示されるように、標識GLUT4を用いて原形質膜におけるGLUT4の量を決定する)。さらなる実施形態では、後述の実施例において、IKKiの阻害が含脂肪細胞を縮小させることが示されているように(図19参照)、含脂肪細胞またはマクロファージの大きさを測定する。
特定の実施形態では、本発明は、薬剤の候補物がIKKi阻害剤であることを同定または確認するための、動物を用いたスクリーニング方法を提供する。このようなスクリーニング方法は、単独にか、または上記の無細胞法および細胞に基づいた方法と組み合わせて、使用され得る。例えば、候補化合物、またはIKKi活性(例えばIRキナーゼ活性)を阻害することが知られている化合物を、非ヒトの対象に投与して、該対象の徐脂肪体重、脂肪体重または無脂肪体重を、対照対象(例えば、試験化合物を投与していない対応する非ヒト対象、または当該対象の基準脂肪体重)と比較し得る。好適な非ヒト対象としては、例えば、齧歯類(例えば、ラットおよびマウス、ウサギ、テンジクネズミ)、家畜(例えば、豚、七面鳥、ウシ、羊、ヤギ、または鶏)またはペット類(例えば、イヌまたはネコ)が挙げられる。特定の実施形態では、動物に高カロリー食を与える。他の実施形態では、使用される動物は、肥満、糖尿病、またはインスリン抵抗性の動物モデルである。
薬剤の候補物を、任意の経路を介して対象に投与し得る。任意の経路としては、経口投与経路、または非経口投与経路が挙げられるが、これらに限定されない。非経口投与経路の例としては、静脈内投与、筋内投与、腹腔内投与、皮下投与、くも膜下投与、動脈内投与、経鼻投与、または経肺投与が挙げられる。試験化合物を、例えば、特定の投与経路に適した薬学的に受容可能な担体または賦形剤を含んでいる溶液、懸濁液、または乳剤として、調製し得る。担体または賦形剤としては、滅菌された水性の担体または非水性の担体が挙げれる。水性の担体としては、水、アルコール、生理食塩水および緩衝液が挙げられるが、これらに限定されない。非水性の担体の例としては、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油および注射可能な有機エステルが挙げられるが、これらに限定されない。防腐剤、香味料、砂糖および他の添加剤(例えば、抗菌剤、酸化防止剤、キレート剤および不活性ガスなど)が存在し得る。
経口投与の場合、薬学的に受容可能な賦形剤を用いた従来の手段によって、錠剤またはカプセルを調製し得る。薬学的に受容可能な賦形剤の例としては、接着剤(例えば、予めゼラチン化したトウモロコシデンプン、ポリビニルピロリドンまたはヒドロキシプロピルメチルセルロース)、充填剤(例えば、乳糖、微晶質のセルロースまたはリン酸水素カルシウム)、潤滑剤(例えば、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはシリカ)、崩壊剤(例えば、ジャガイモデンプンまたはデンプングリコール酸ナトリウム)または侵潤剤(例えば、ラウリル硫酸ナトリウム)などが挙げられる。当該分野において公知の方法を用いて、錠剤をコーティングし得る。また、化合物が徐放性を示すように、経口投与用の調合剤を調剤し得る。点鼻剤は、液体の形態または乾燥製品として提供され得る。霧状した水性の懸濁液または溶液は、pHおよび/または毒性を調整する担体または賦形剤を含み得る。
薬剤の候補物が非ヒト対象に与える作用は、様々な方法を用いて評価され得る。脂肪体重および/または徐脂肪体重は、例えば、DEXAヒドロデンシトメトリー計量法(すなわち水中計量法)、人体計測法(すなわち、例えばキャリパを用いた皮下測定)、近赤外相互作用(NIR)、磁気共鳴映像法(MRI)、全身電気伝導度(total body electrical conductivity)(TOBEC)、排気(air displacement)(BOD POD)、生体電気インピーダンス(BIA)、またはコンピュータ断層撮影を用いて算出され得る。体脂肪および骨強度が異なる任意の動物において変化し得るので、試験化合物が対象の身体活動度に与える作用を監視して、「運動」の変化および初期のエネルギー消費を知り得る。また、代謝に関連する他の特性に対する試験化合物の影響が決定され得る。これらの特性としては、例えば、食糧摂取に関する特性(例えば、食欲、味覚/嗅覚、摂食時の痛み、飽食、非経口的栄養法および経腸栄養法)、胃腸管の消化に関する特性(例えば、消化管の絨毛表面、消化管の酵素または胆汁塩の分析)、吸収に関する特性、カロリー必要量の変化、養分損失に関する特性(例えば、排出物、出血、尿、瘻孔を介した損失、または障壁(例えば、胃腸管、肌、または肺)を介した損失)が挙げられる。また。エネルギー消費が監視され得る。例えば、Mini Mitter社の装置(Bend、OR)を用いて、多方向性の運動が監視され得る。エネルギー消費に関する、監視可能な他の特性としては、歩行運動、心拍数、呼吸、酸素の使用および二酸化炭素の排出、フォトビームモニタリング、ならびに身体活動度のチャートが挙げられる。
本発明の薬剤の候補物は、当該分野において公知の組合せのライブラリー法における多数の手法のうちのいずれかを用いて入手し得る。組合せのライブラリー法としては、生物学的ライブラリ、ペプトイドライブラリ(ペプチドの機能を有しているが、新規の非ペプチド骨格を有している分子のライブラリであって、酵素分解に対して耐性を示すが、それにもかかわらず、生物活性を保持している;例えば、Zuckennann et al., J. Med. Chem. 37: 2678-85[1994]を参照)、空間的に接触可能な並列固相ライブラリまたは並列液相ライブラリ、逆重畳積分を必要とする合成ライブラリ法、「ワン−ビーズ・ワン−化合物」ライブラリ法、および親和性クロマトグラフィースクリーニングを用いた合成ライブラリ法が挙げられる。生物学的ライブラリおよびペプトイドライブラリの手法がペプチドライブラリの使用にとって好ましく、一方、他の4つの手法は、化合物のペプチドライブラリ、非ペプチドオリゴマーライブラリまたは小分子ライブラリに利用可能である(Lam (1997)Anticanser Drug Des. 12:145)。
分子ライブラリの合成のための方法の例は、例えば、DeWitt et al., Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 90:6909 [1993]、Erb et al., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 91:11422 [1994]、Zuckermann et al., J. Med. Chem. 37:2678 [1994]、Cho et al., Science 261:1303 [1993]、Carrell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33.2059 [1994]、Carell et al., Angew. Chem. Int. Ed. Engl. 33:2061 [1994]、およびGallop et al., J. Med. Chem. 37:1233 [1994]において、当該技術に見出され得る。
化合物のライブラリは、溶液中に(例えば、Houghten, Biotechniques 13:412-421 [1992])、またはビーズ上に(Lam, Nature 354:82-84 [1991])、チップ上に(Fodor, Nature 364:555-556 [1993])、細菌または胞子上に(引用によって本明細書に援用される米国特許第5,223,409号)、プラスミド上に(Cull et al., Proc. Nad. Acad. Sci. USA 89:18651869 [1992])、またはファージ上に(Scott and Smith, Science 249:386-390 [1990]、Devlin Science 249:404-406 [1990]、Cwirla et al., Proc. NatI. Acad. Sci. 87:6378-6382 [1990]、Felici, J. Mol. Biol. 222:301 [1991])提供され得る。
V. 処置法
様々な疾患および健康状態、特に、不適切なインスリンシグナル伝達−インスリン受容体シグナル伝達に関する疾患および健康状態(例えば、IKKiによってインスリン受容体のリン酸化が増進して起こる、正常なグルコース代謝にとっての当該受容体に対するインスリンの結合能の低下によって生じる疾患および健康状態)の処置にIKKi阻害剤を用い得る。特定の実施形態では、対象の体脂肪の減少または徐脂肪体重の増加のために、対象にIKKi阻害剤を投与する。他の実施形態では、対象にIKKi阻害剤を投与して、肥満症、インスリン抵抗性、糖尿病および関連する疾患の症状を軽減する(またはこれらの症状を取り除く)。いくつかの実施形態では、IKKi阻害剤を投与して、対象のコレステロールまたは脂質を減少させるか、または対象のコレステロールまたは脂質の増加を妨げる。好ましい実施形態では、IKKi阻害剤を用いて、肥満または2型糖尿病の症状を処置する。
1型および2型真性糖尿病はいずれも、インスリンの不適切な作用および/または分泌のために異常な調節を受けたエネルギー代謝の疾患である。2型の方がより一般的であるが、両方の型において糖尿病の患者にはインスリン抵抗性が現れる。このインスリン抵抗性は、筋肉および脂肪におけるインスリン刺激性のグルコース輸送の異常、および肝臓におけるグルコース産生の抑制に起因する。肥満は、多くの場合、2型糖尿病の発症における重要な決定要因であり、前炎症性サイトカイン(例えば、TNFα、IL−6、IL−18、IL−1βおよびCRP)の血中濃度の増大に関連する。前炎症性サイトカインは、グルコース耐性を低下させる。体重減少は、これらのサイトカインの血中濃度を減少させ、これは、全身性炎症において脂肪組織が直接的な役割を有していることを示唆している。NFκB活性化を導く炎症性シグナル伝達系は、肥満の動物モデルにおけるインスリン抵抗性の発生の原因である。IκBキナーゼ−β(IKKβ)のハプロ不全は、高脂肪食に誘導されるインスリン抵抗性からマウスを保護するが、肥満を保護しない。IKKβ活性を阻害する高用量のサリチル酸塩は、肥満マウスのグルコース耐性を改善する。
本発明は、IKKi阻害剤が、単独にか、または少なくとも1つの他の薬剤(例えば安定化化合物など)と組み合わせて含まれている薬学的組成物をさらに提供する。本発明は、生体適合性の滅菌された任意の薬学的担体とともに投与され得る。該薬学的担体としては、生理食塩水、緩衝生理食塩水、デキストローズおよび水が挙げられるが、これらに限定されない。
医療技術において公知のように、任意の患者の用量は、多くの要因に依存している。これらの要因としては、患者の身体の大きさ、体表面積、年齢、投与される特定の化合物、性別、投与の回数および経路、一般的な健康状態、ならびに同時に投与される他の薬物との相互作用が挙げられる。
これらの薬学的組成物は、処置される健康状態に応じて調剤され、全身または局所的に投与され得る。調剤および投与の技術は、「Remington’s Pharmaceutical Sciences」 (Mack Publishing Co, Easton Pa.)の最新版に見出され得る。好適な経路としては、例えば、経口投与または経粘膜投与、および非経口投与が挙げられ得る。非経口投与としては、筋内投与、皮下投与、骨髄内投与、くも膜下投与、脳室内投与、静脈内投与、腹腔内投与、または鼻腔内投与が挙げられる。また、処置用のタンパク質または核酸配列(例えば、siRNA配列、アンチセンス配列など)を発現するための発現ベクターの投与が実施され得る。
注射の場合、本発明の薬学的組成物は、水溶液として、好ましくは、ハンクス液、リンゲル液などの生理学的に適合可能な緩衝剤、または生理学的に緩衝化された食塩水として調剤し得る。組織または細胞に投与する場合、特定の障壁に対する浸透に適した浸透剤を、調剤に際して用いる。一般的にこのような浸透剤は、当該分野において公知である。
他の実施形態では、当該分野に公知の薬学的に受容可能な担体の、経口投与に適した用量を用いて、本発明の薬学的組成物を調剤し得る。このような担体は、薬学的組成物を錠剤、丸薬、カプセル、液体、ゲル、シロップ、スラリー、懸濁液などとして調剤して、処置される患者によって経口摂取または鼻孔摂取され得る。
本発明における使用に適した薬学的組成物は、意図される目的を実現する有効量の有効成分が含有されている組成物を含んでいる。例えば、IKKi阻害剤の有効量は、正常の(疾患に罹っていない)インスリン媒介性のグルコース代謝率を回復させる量であり得る。有効量の決定は、特に本明細書において提供される開示内容を参照すれば、十分に当業者の能力の範囲にある。
有効成分に加えて、これらの薬学的組成物は、薬学的に受容可能な好適な担体を含有し得る。これらの担体としては、医薬に用いられ得る調合剤への、活性な化合物の加工を容易にする賦形剤および助剤が挙げられる。経口投与のために調剤された調合剤は、錠剤、糖衣錠、カプセルまたは溶液の形態であり得る。本発明の薬学的組成物は、それ自体が公知の方法において(例えば、従来の混合プロセス、溶解プロセス、造粒プロセス、糖衣錠製造プロセス、均質混合物にするプロセス、乳化プロセス、カプセル化プロセス、封入プロセスまたは凍結乾燥プロセスによって)、製造され得る。
非経口投与のための製薬の剤形としては、水溶性の形態において活性な化合物の水溶液が挙げられる。さらに、活性な化合物の懸濁液を、好適な油性の懸濁注射液として調製し得る。好適な親油性溶媒または媒介物としては、脂肪油(例えばごま油)、合成脂肪酸エステル(オレイン酸エチルまたはトリグリセリド)またはリポソームが挙げられる。水性の懸濁注射液は、懸濁液の粘性を増大させる物質を含み得る。この物質の例としては、カルボキシメチルセルロースナトリウム塩、ソルビトールまたはデキストランなどが挙げられる。懸濁液は、化合物の可溶性を向上させて高濃度の溶液を調製し得る好適な安定剤または薬剤を必要に応じて含有し得る。
経口使用のための医薬品は、活性な化合物を固体賦形剤との混合によって入手され得、必要に応じて生成される混合物の粉砕、および必要に応じて好適な助剤の添加の後における、錠剤または糖衣錠のコアを得るための顆粒の混合物の加工によって入手され得る。好適な賦形剤は、炭水化物の充填剤またはタンパク質の充填剤である。この充填剤の例としては、砂糖(乳糖、蔗糖、マンニトール、またはソルビトールが挙げられる)、デンプン(とうもろこし、小麦、米、ジャガイモなどに由来するデンプン)、セルロース(例えば、メチルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロースまたはカルボキシメチルセルロースナトリウム塩)、ゴム(アラビアゴムおよびトラガカントゴムが挙げられる)、およびタンパク質(例えば、ゼラチンおよびコラーゲン)が挙げられる。崩壊剤または可溶化剤が、必要に応じて添加され得る。崩壊剤または可溶化剤の例としては、架橋ポリビニルピロリドン、寒天、アルギン酸またはそれらの塩(例えばアルギン酸ナトリウム)が挙げられる。
糖衣錠のコアには、濃縮された砂糖溶液といった好適なコーティングが施されている。また、コーティング剤は、アラビアゴム、タルク、ポリビニルピロリドン、カルボポルゲル、ポリエチレングリコールおよび/または二酸化チタン、ラッカー溶液ならびに好適な有機溶媒または溶媒混合物を含有し得る。色素または顔料は、製品の識別のためにか、または活性な化合物の量(すなわち用量)を決定するために、錠剤または糖衣錠のコーティング剤に添加され得る。
経口的に使用し得る医薬品としては、ゼラチンから生成された押し込み式カプセル、またはゼラチンとコーティング剤(例えばグリセロールまたはソルビトール)とから生成されている密閉された軟カプセル剤が挙げられる。押し込み式カプセルは、充填剤または結合剤(例えば乳糖またはデンプン)、潤滑剤(例えばタルクまたはステアリン酸マグネシウム)および必要に応じて安定剤と混合されている有効成分を含み得る。軟カプセル剤において、活性な化合物が、好適な液体(例えば安定剤を含んでいるか、または含んでいない脂肪油、流動パラフィンまたは液体ポリエチレングリコール)に溶解され得るか、または懸濁され得る。
薬学的に受容可能な担体を用いて調剤された本発明の化合物を含んでいる組成物は、調製され、適切な容器内に収められ、目的とする健康状態の処置のためにラベルが付され得る。目的とする健康状態としては、肥満症、糖尿病、インスリン抵抗性、または体重減少の処置が挙げられる。
薬学的組成物は、塩として提供され得、多くの酸(塩酸、硫酸、酢酸、乳酸、酒石酸、リンゴ酸、琥珀酸などが挙げられるが、これらに限定されない)を用いて生成され得る。塩は、水性溶媒、または対応する遊離塩基の形態である他のプロトン性溶媒に対して、より可溶性が高い傾向にある。他の場合、好ましい調合剤は、1mM〜50mMのヒスチジン、0.1%〜2%のスクロース、2%〜7%マンニトール(4.5〜5.5のpH範囲)における凍結乾燥された粉末であり得、該粉末は、使用前に緩衝剤と混合される。
本発明の方法において使用される任意の化合物とっての治療有効量は、まず細胞培養物のアッセイから算出され得る。好ましくは、用量は、その後に動物モデル(特にマウスのモデル)において決定される。治療有効量とは、疾患状態または望ましくない健康状態の症状を改善するIKKi阻害剤の量を指す。このような化合物の毒性および処置効力は、例えばLD50(母集団の50%が致死する量)およびED50(母集団の50%に処置効果のある量)を決定する、細胞培養物または実験動物における標準的な製薬の手法によって決定され得る。毒性と処置効果との間の用量の比が、治療指数であり、比率LD50/ED50と表わされ得る。より大きな治療指数を示す化合物が好ましい。
ヒトに使用するための用量の範囲を決定する際に、これらの細胞培養物のアッセイおよびさらなる動物実験から得られたデータが使用され得る。このような化合物の用量は、ほとんどまたは全く毒性を示さないED50を含む血中濃度の範囲内にあることが好ましい。用量は、採用された投与形態、患者の感度、および投与経路に応じて、この範囲内において変動する。
厳密な用量は、処置される患者に合わせて個々の医師によって選択される。用量および投与は、活性成分の十分なレベルを提供するためにか、または所望の効果を維持するために調節される。考慮され得るさらなる要因としては、疾患状態の重篤性;患者の年齢、体重および性別;食事、投与時間、投与頻度、薬物の組合せ、処置法に対する反応感受性、処置法に対する耐性/応答が挙げられる。長期間にわたって作用する薬学的組成物は、3〜4日、一週間または二週間おきに投与され得る。これは、特定の剤形の半減期およびクリアランス速度に応じて決定される。
通常の用量は、投与経路に応じて、0.1〜100000マイクログラムから、約1gの総要領まで変動し得る。特定の用量および送達方法に関する説明は、文献に記載されている(引用によって本明細書に援用される米国特許第4,657,760号、第5,206,344号、第5,225,212号、国際公開第2004/097009号、または国際公開第2005/075465号を参照すればよい)。
いくつかの実施形態では、IKKiの阻害剤を含む組成物は、抗癌剤(例えば、化学療法薬)と併用される。本発明は、併用される抗癌剤の種類によって限定されるものではない。実際に、様々な抗癌剤が、本発明において有効であると考えられる。当該抗癌剤としては、アシビシン、アクラルビシン、塩酸アコダゾール、アクロニン、アドゼレシン、アドリアマイシン、アルデスロイキン、アリトレチノイン、アロプリノールナトリウム、アルトレタミン、アンボマイシン、酢酸アメタントロン、アミノグルテチミド、アムサクリン、アナストロゾール、バンレイシ科アセトゲニンス(Annonaceous Acetogenins)、アントラマイシン、アシミシン、アスパラギナーゼ、アスペルリン、アザシチジン、アゼテパ、アゾトマイシン、バチマスタット、ベンゾデパ、ベキサロテン、ビカルタミド、塩酸ビサントレン、ビスナフィドジメシラート(Bisnafide Dimesylate)、ビセレシン、硫酸ブレオマイシン、ブレキナールナトリウム、ブロピリミン、ブラタシン、ブスルファン、カベルゴリン、カクチノマイシン、カルステロン、カルセミド、カルベチマー、カルボプラチン、カルムスチン、塩酸カルビシン、カルゼルシン、セデフィンゴール、セレコクシブ、クロラムブシル、シロレマイシン、シスプラチン、クラドリビン、メシル酸クリスナトール、シクロホスファミド、シタラビン、ダカルバジン、DACA(N−[2−(ジメチル−アミノ)エチル]アクリジン−4−カルボキサミド)、ダクチノマイシン、塩酸ダウノルビシン、ダウノマイシン、デシタビン、デニロイキンディフティトックス(Denileukin Diftitox)、デキソルマプラチン、デザグアニン、メシル酸デザグアニン、ジアジクオン、ドセタキセル、ドキソルビシン、塩酸ドキソルビシン、ドロロキシフェン、クエン酸ドロロキシフェン、プロピオン酸ドロモスタノロン、ズアゾマイシン、エダトレキサート、塩酸エフロルニチン、エルサミトルシン、エンロプラチン、エンプロメート、エピプロピジン、塩酸エピルビシン、エルブロゾール、塩酸エソルビシン、エストラムスチン、エストラムスチンリン酸ナトリウム、エタニダゾール、エチオ化オイルI131、エトポシド、リン酸エトポシド、エトプリン、塩酸ファドロゾール、ファザラビン、フェンレチニド、フロクスウリジン、リン酸フルダラビン、フルオロウラシル、5−FdUMP、フルロシタビン、ホスキドン、ホストリエシンナトリウム、FK−317、FK−973、FR−66979、FR−900482、ゲムシタビン、塩酸ゲムシタビン(Geimcitabine Hydrochloride)、ゲムツズマブオゾガマイシン、金Au198、酢酸ゴゼレリン、グアナコン、ヒドロキシウレア、塩酸イダルビシン、イホスファミド、イルモホシン、インターフェロンα−2a、インターフェロンα−2b、インターフェロンα−n1、インターフェロンα−n3、インターフェロンβ−1a、インターフェロンγ−1b、イプロプラチン、イリノテカン塩酸、酢酸ランレオチド、レトロゾール、酢酸ロイプロリド、塩酸リアロゾール、ロメトレキソールナトリウム、ロムスチン、塩酸ロソキサントロン、マソプロコール、メイタンシン、塩酸メクロレタミン、酢酸メゲストロール、酢酸メレンゲストロール、メルファラン、メノガリル、メルカプトプリン、メトトレキサート、メトトレキサートナトリウム、メトキサレン、メトプリン、メツレデパ(Meturedepa)、ミチンドミド、ミトカルシン、ミトクロミン、ミトジリン、マイトマルシン、マイトマイシン(Mitomycin)、マイトマイシンC(Mytomycin C)、ミトスペル、ミトタン、塩酸ミトザントロン、マイコフェノール酸、ノコダゾール、ノガラマイシン、オプレルベキン、オルマプラチン、オキスラン(Oxisuran)、パクリタキセル、パミドロネート二ナトリウム、ペガスパルガーゼ、ペリコマイシン、ペンタムスチン、硫酸ペプロマイシン、ペルホスファミド、ピポブロマン、ピポスルファン、塩酸ピロキサントロン、プリカマイシン、プロメスタン、ポルフィメルナトリウム、ポルフィロマイシン、プレドニムスチン、塩酸プロカルバジン、ピューロマイシン、塩酸ピューロマイシン、ピラゾフリン、リボプリン、リツキシマブ、ログレチミド、ロリニアスタチン、サフィンゴール、塩酸サフィンゴール、サマリウム/レキシドロナム、セムスチン、シムトラゼン、スパルホサートナトリウム、スパルソマイシン、塩酸スピロゲルマニウム、スピロムスチン、スピロプラチン、スクアモシン、スクアモタシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、塩化ストロンチウムSr89、スロフェヌル(Sulofenur)、タリソマイシン、タキサン、タキソイド、テコガランナトリウム、テガフール、塩酸テロキサントロン、テモポルフィン、テニポシド、テロキシロン、テストラクトン、チアミプリン、チオグアニン、チオテパ、チミタック(Thymitaq)、チアゾフリン、チラパザミン、トムデックス、TOP−53、塩酸トポテカン、クエン酸トレミフェン、トラスツマブ、酢酸トレストロン、リン酸トリシリビン、トリメトレキサート、グルクロン酸トリメトレキサート、トリプトレリン、塩酸ツブロゾール、ウラシルマスタード、ウレデーパ(Uredepa)、バルルビシン、バプレオチド、ベルテポルフィン、ビンブラスチン、硫酸ビンブラスチン、ビンクリスチン、硫酸ビンクリスチン、ビンデシン、硫酸ビンデシン、硫酸ベネピジン、硫酸ビングリシネード、硫酸ビンロイロシン、酒石酸ビノレルビン、硫酸ビンロシジン、硫酸ビンゾリジン、ボロゾール、ゼニプラチン、ジノスタチン、塩酸ゾルビシン、2−クロロデオキシアデノシン、2’−デオキシホルマイシン、9−アミノカンプトセシン、ラルチトレキシド、N−プロパルギル−5,8−ジデアザ葉酸(dideazafolic acid)、2−クロロ−2’−アラビノ−フルオロ−2’−デオキシアデノシン、2−クロロ−2’−デオキシアデノシン、アニソマイシン、トリコスタチンA、hPRL−G129R、CEP−751、リノミド、サルファマスタード、ナイトロジェンマスタード(メクロレタミン)、シクロホスファミド、メルファラン、クロラムブシル、イホスファミド、ブスルファン、N−メチル−N−ニトロソウレア(MNU)、N,N’−ビス(2−クロロエチル)−N−ニトロソウレア(BCNU)、N−(2−クロロエチル)−N’−シクロヘキシル−N−ニトロソウレア(CCNU)、N−(2−クロロエチル)−N’−(トランス−4−メチルシクロヘキシル−N−−ニトロソウレア(MeCCNU)、N−(2−クロロエチル)−N’−(ジエチル)エチルホスホネート−N−ニトロソウレア(ホテムスチン)、ストレプトゾトシン、ジアカルバジン(DTIC)、ミトゾロミド、テモゾロマイド、チオテパ、マイトマイシンC、AZQ、アドゼレシン、シスプラチン、カルボプラチン、オルマプラチン、オキサリプラチン、C1−973、DWA2114R、JM216、JM335、ビス(白金)、トムデックス、アザシチジンン、シタラビン、ゲムシタビン、6−メルカプトプリン、6−チオグアニン、ヒポキサンチン、テニポシド、9−アミノカンプトセシン、トポテカン、CPT−11、ドキソルビシン、ダウノマイシン、エピルビシン、ダルビシン、ミトキサントロン、ロソキサントロン、ダクチノマイシン(アクチノマイシンD)、アムサクリン、ピラゾロアクリジン、オールトランスレチノール、14−ヒドロキシ−レトロ−レチノール、オールトランスレチノイン酸、N−(4−ヒドロキシフェニル)レチナミド、13−シスレチノイン酸、3−メチルTTNEB、9−シスレチノイン酸、フルダラビン(2−F−ara−AMP)、および2−クロロデオキシアデノシン(2−Cda)が挙げられるが、これらに限定されない。
他の抗癌剤としては、抗増殖剤(例えば、プリトレキシムイセチオネート)、抗前立腺肥大剤(例えば、シトグルシド)、良性前立腺肥大症の処置薬(例えば、塩酸タムスロシン)、前立腺肥大阻害剤(例えば、ペントモン)、および放射性医薬品:フィブリノゲン1 125、フルデオキシグルコースF 18、フルオロドーパF 18、インスリンI 125、インスリンI 131、イオベングアンI 123、ヨージパミドナトリウムI 131、ヨードアンチピリンI 131、ヨードコレステロールI 131、ヨード馬尿酸ナトリウムI 123、ヨード馬尿酸ナトリウムI 125、ヨード馬尿酸ナトリウムI 131、ヨードピラセートI 125、ヨードピラセートI 131、イオフェタミン塩酸塩I 123、ヨーメチンI 125、ヨーメチンI 131、ヨータラム酸ナトリウムI 125、ヨータラム酸ナトリウムI 131、イオチロシンI 131、リオチロニンI 125、リオチロニンI 131、メリソプロールアセテートHg 197、メリソプロールアセテートHg 203、メリソプロールHg 197、セレノメチオニンSe 75、テクネチウムTc 99m 三硫化アンチモンコロイド、テクネチウムTc 99m ビシセート、テクネチウムTc 99m ジソフェニン、テクネチウムTc 99m エチドロネート、テクネチウムTc 99m エキサメタジム、テクネチウムTc 99m フリホスミン、テクネチウムTc 99m グルセプテート、テクネチウムTc 99m リドフェニン、テクネチウムTc 99m メブロフェニン、テクネチウムTc 99m メドロネート、テクネチウムTc 99m メドロネート二ナトリウム、テクネチウムTc 99m メリチアチド、テクネチウムTc 99m オキシドロネート、テクネチウムTc 99m ペンテテート、テクネチウムTc 99m ペンテテートカルシウム三ナトリウム、テクネチウムTc 99m セスタミビ、テクネチウムTc 99m シボロキシム(Siboroxime)、テクネチウムTc 99m サクシマー、テクネチウムTc 99m 硫黄コロイド、テクネチウムTc 99m テボロキシム、テクネチウムTc 99m テトロホスミン、テクネチウムTc 99m チアチド、チロキシンI 125、チロキシン I131、トルポビドン I 131、トリオレインI 125、トリオレイン I 131が挙げられる。
他の種類の抗癌剤は、抗癌性補助増強剤(三環系抗うつ剤(例えば、イミプラミン、デシプラミン、アミトリプチリン、クロミプラミン、トリミプラミン、ドクサピン、ノルトリプチリン、プロトリプチリン、アモキサピン、およびマプロチリン)、非三環系抗うつ剤(例えば、セルトラリン、トラゾドン、およびシタロプラム)、Ca++アンタゴニスト(例えば、ベラパミル、ニフェジピン、ニトレンジピン、およびカロベリン)、カルモデュリン阻害剤(例えば、プレニラミン、トリフルオロペラジン、およびクロミプラミン)、アンフォテリシンB、トリパラノール類縁物質(例えば、タモキシフェン)、抗不整脈薬(例えば、キニジン)、抗高血圧薬(例えば、レセルピン)、チオール欠損(例えば、ブチオニンおよびスルホキシミン)および多剤耐性を低減する薬剤(例えば、クレマホール(Cremaphor)EL)が挙げられる)である。
さらに他の抗癌剤は、バンレイシ科アセトゲニン、アシミシン、ロリニアスタチン、グアナコン、スクアモシン、ブラタシン、スクアモタシン、タキサン、パクリタキセル、ゲムシタビン、メトトレキサートFR−900482、FK−973、FR−66979、FK−317、5−FU、FUDR、FdUMP、ヒドロキシウレア、ドセタキセル、ジスコデルモリド、エポチロン、ビンクリスチン、ビンブラスチン、ビノレルビン、meta-pac、イリノテカン、SN−38、10−OHカンプト、トポテカン、エトポシド、アドリアマイシン、フラボピリドール、Cis−Pt、カルボ−Pt、ブレオマイシン、マイトマイシンC、ミトラマイシン、カペシタビン、シタラビン、2−C1−2’デオキシアデノシン、フルダラビン−PO、ミトキサントロン、ミトゾロミド、ペントスタチン、およびトムデックスから成る群から選択された抗癌剤である。
特に好ましい1つの分類の抗癌剤は、タキサン(例えば、パクリタキセルおよびドセタキセル)である。他の重要な種類の抗癌剤は、バンレイシ科のアセトゲニンである。他の癌療法としては、ホルモン療法が挙げられる。いくつかの実施形態では、抗癌剤は、タモキシフェンまたはアロマターゼ阻害剤アリミデックス(すなわちアナストロゾル)である。
いくつかの実施形態では、IKKiの阻害剤を含んでいる組成物は、抗ウイルス剤と同時投与される。本発明は、併用される抗ウイルス剤の種類によって限定されるものではない。実際に、様々な抗ウイルス剤が、本発明において有効であると考えられる。該抗ウイルス剤としては、ザナミビル、オセルタミビル、アマンタジン、リマンタジン、アシクロビル、バラシクロビル、ファムシクロビル、ネビラピン[Viramune(登録商標)]m デラビルジン[Rescriptor(登録商標)]、エファビレンツ[Sustiva(登録商標)およびStocrin(登録商標)]、ジドブジン[AZT、ZDV、アジドチミジン、レトロビル(登録商標)]、ディダノシン[ddI、Videx(登録商標) Videx EC(登録商標)]、ザルシタビン[ddC、デオキシシチジン、Hivid(登録商標)]、スタブジン[d4T、Zerit(登録商標)、Zerit XR(登録商標)]、ラミブジン[3TC、エピビル(Epivir)(登録商標)]、アバカビル[ABC、Ziagen(登録商標)]、エムトリシタビン[FTC、Emtriva(登録商標)、コビラシル(Coviracil)])、アンプレナビル[Agenerase]、ホスアンプレナビル[Lexiva]、インディナビル[Crixivan]、ロピナビル(Iopinavir)/リトナビル[Kaletra]、リトナビル[Norvir]、サクイナビル[Fortovase]、ネルフィナビル[ビラセプト]、テノホビル[フマル酸テノホビルジソプロキシル、Viread(登録商標)]、アデホビル[bis-POM PMPA、Preveon(登録商標)、およびHepsera(登録商標)])、デナビル(Denavir)、エファビレンツ、エピビル、ファムビル、フォートベイズ、インビラーゼ、ネビラピン、ノルビル(Norvir)、オセルタミビル、ペンシクロビル、プレベオン、リレンザ、レスクリプター、レトロビル、サクイナビル、ススチバ(Sustiva)、シマジン(Symadine)、シンメトレル、タミフル、バラシクロビル、バルトレックス、ビラセプト、ビラミューン、ザナミビル、ジアゲン(Ziagen)、およびゾビラックスが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、IKKiの阻害剤を含んでいる組成物は、抗生物質と同時投与される。抗生物質の例としては、ペニシリン、アミノグリコシド剤、マクロライド、モノバクタム、リファマイシン、テトラサイクリン、クロラムフェニコール、クリンダマイシン、リンコマイシン、イミペネム、フシジン酸、ノボビオシン、ホスホマイシン、フシジン酸ナトリウム、ネオマイシン、ポリミキシン、カプレオマイシン、コリスチメタート、コリスチン、グラミシジン、ミノサイクリン、ドキシサイクリン、バンコマイシン(vanomycin)、バシトラシン、カナマイシン、ゲンタマイシン、エリスロマイシン、およびセファロスポリンが挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、IKKiの阻害剤を含む組成物は、抗真菌薬と同時投与されれる。抗真菌薬の実施例としては、アゾール(例えば、Fluconazole(登録商標)、Itraconazole(登録商標)、Ketoconazole(登録商標)、Miconazole(登録商標)、Clortrimazole(登録商標)、Voriconazole(登録商標)、Posaconazole(登録商標)、Rovuconazole(登録商標)など)、ポリエン(例えば、ナタマイシン、ルセンソマイシン、ナイスタチン、アンフォテリシンBなど)、エキノカンジン(例えば、Cancidas(登録商標))、プラジミシン(例えば、beanomicins、ニコマイシン、ソルダリン(sordarins)、アリルアミンなど)ならびにそれらの誘導体および類似物が挙げられるが、これらに限定されない。
いくつかの実施形態では、IKKiの阻害剤を含んでいる組成物は、コレステロール降下薬および/または脂質低下薬と同時投与される。コレステロール降下薬の例としては、HMG CoA還元酵素阻害剤、スクアレン合成酵素阻害剤、フィブリン酸誘導体、プロブコール、胆汁酸金属イオン封鎖剤、ニコチン酸およびネオマイシンが挙げられるが、これらに限定されない。HMG CoA還元酵素阻害剤の例としては、プラバスタチン、ロバスタチン、シンバスタチン、アトルバスタチン、フルバスタチンおよびセリバスタチンが挙げられるが、これらに限定されない。フィブリン酸誘導体としては、ゲムフィブロジル、フェノフィブラー、クロフィブレート、ベザフィブラート、シプロフィブラートおよびクリノフィブラートが挙げられるが、これらに限定されない。他の薬剤としては、デキストロチロキシンまたはそのナトリウム塩、コレスチポールまたはその塩酸塩、コレスチラミン、ニコチン酸、ネオマイシン、p-アミノサリチル酸またはアスピリンが挙げられるが、これらに限定されない。代表的な脂質低下薬は、「The Medical Letter on Drugs and Therapeutics, vol. 43, issue 1105, 頁43-48, 2001年5月28日」(当該文献は引用によって本明細書に援用される)に見出され得る。
VI. IKKi診断
本発明は、健康状態(例えば糖尿病、肥満症、インスリン抵抗性および関連する障害)を診断するためのIKKiに関する診断アッセイを提供する。例えば、患者からの組織または血液におけるKKiのタンパク質および核酸の濃度および活性の測定は、これらの致命的な疾患に対する感受性を明らかにする。
特定の実施形態では、IKKi活性のレベルを1つの診断として測定する。例えば、患者からの試料(例えば、生検標本、血液試料または他の生体液体)を分析して、(例えば、配列番号15の配列VKTVNESのセリンにおける)インスリン受容体のリン酸化レベルを決定する。インスリン受容体のリン酸化の状態を検出する方法については、すでに述べられている。他の実施形態では、IKKiの活性レベルを評価するために、患者からの試料におけるAps、CblまたはTC10のリン酸化状態を決定する。
特定の実施形態では、診断分析は、IKKi自体のリン酸化のレベルを決定することによって、IKKiの活性レベルを検出することを含んでいる。上述のように、TRL4タンパク質はIKKiをリン酸化する。これによって、IKKiが活性化され、IKKiがインスリン受容体をリン酸化する(これによって、インスリン受容体はインスリンに対する作用の阻害を受ける)。したがって、特定の実施形態では、患者の試料におけるIKKiのリン酸化状態の検出によって、健康状態(例えば、肥満症、糖尿病、インスリン抵抗性および関連する障害)が診断される。
A. IKKiタンパク質の検出
患者の試料におけるIKKiの発現のレベルは、当業者に公知の様々な技術(タンパク質配列決定および免疫学的アッセイが挙げられるが、これらに限定されない)を用いて検出され得る。
1. 配列決定
タンパク質配列決定技術の非限定的な具体例としては、質量分析法およびエドマン分解法が挙げられるが、これらに限定されない。
質量分析法は、原理上は、任意の大きさのタンパク質を配列決定し得るが、その大きさが増大すると算出がより困難になる。タンパク質は、内在性のプロテアーゼによって消化され、生成された溶液が高圧の液体クロマトグラフィーのカラムを通される。この溶液は、該カラムの端部において、高い陽電位に荷電された細いノズルから噴出され、質量分析計に入る。液滴における電荷にしたがって、単一のイオンが残るまで断片化される。その後、ペプチドを断片化して、断片の質量対電荷の比率を測定する。質量スペクトルをコンピュータによって分析し、多くの場合、それまでに配列決定されたタンパク質のデータベースと比較して、断片の配列を決定する。その後、このプロセスが別の消化酵素を用いて繰り返され、重複する配列が、当該タンパク質用の配列を構成するために使用される。
エドマン分析の反応では、配列決定されるペプチドを、固体の表面(例えば、ポリブレンでコーティングされたガラス繊維)に吸着させる。吸着されたペプチドに、エドマン試薬のフェニルイソチオシアネート(PTC)を、弱塩基性の12%のトリメチルアミンの緩衝溶液と共に添加して、N−末端アミノ酸のアミン基と反応させる。その後、無水の酸を添加することによって、末端アミノ酸誘導体を選択的に分離し得る。この誘導体は異性化され、置換されたフェニルチオヒダントインを生じる。この置換されたフェニルチオヒダントインは、洗浄を受け、クロマトグラフィーによって同定され得、ここで、このサイクルが繰り返されえ得る。各ステップの効率は約98%であり、これによって、約50のアミノ酸を信頼性を有して決定できる。
2. 免疫学的検定法
免疫学的検定の非限定的な具体例としては、免疫沈降法、ウエスタンブロット法、ELISA法、免疫組織化学法、免疫細胞化学法、フローサイトメトリー法および免疫PCR法が挙げられるが、これらに限定されない。当業者に公知の様々な技術(例えば、比色試験、蛍光分析、化学発光分析または放射性分析)を用いて検出可能に標識されたポリクローナル抗体またはモノクローナル抗体が、免疫学的検定法における使用に適している。
免疫沈降法は、溶液から抗原を沈降させる技術であり、当該抗原に特異的な抗体を用いて行われる。このプロセスを用いて、細胞抽出物中に存在するタンパク質複合体を識別することが可能である。これは、該複合体内にあると考えられるタンパク質を標的化することによって行われる。最初にバクテリアから単離された不溶性抗体結合タンパク質、例えばタンパク質Aおよびタンパク質Gによって、溶液から複合体を取り出す。抗体を、溶液から容易に単離され得るセファロースビーズに結合させてもよい。洗浄の後、沈降物を質量分析法、ウエスタンブロッティング法、または複合体内の構成物質を識別するための他の多数の方法を用いて、分析することが可能である。
ウエスタンブロッティング法または免疫ブロッティング法は、所定の組織ホモジネートまたは抽出物の試料内のタンパク質を検出するための方法である。この方法は、変性タンパク質を質量で分離するために、ゲル電気泳動を用いる。その後、タンパク質を、ゲルから転移させて、典型的には、ポリビニリデン化合物またはニトロセルロースの膜の上まで転移させる。ここで、タンパク質を、当該タンパク質に特異的な抗体を用いて精査する。結果的に、調査者は、所定の試料内のタンパク質の量を検査して、いくつかのグループ間のレベルを比較することが可能である。
酵素結合免疫吸着検定法の略であるELISAは、試料内の抗体または抗原の存在を検出するための生化学的技術である。この方法は、最低限2つの抗体を利用する。2つの抗体の一方は、抗原に対して特異的であり、他方は、酵素に結合されている。この第2の抗体は、発色性基質または蛍光発生基質に、シグナルを発生させる。ELISAの変形例には、サンドイッチELISA、競合ELISA、およびELISPOTが含まれる。試料における、抗原の存在または抗体の存在のいずれかを評価するために、ELISAを実施可能であるため、ELISAは、血清抗体の濃度を算出すること、および抗原の存在を検出することの両方にとって、有効な手段である。
免疫組織化学法および免疫細胞化学法とは、それぞれ、組織切片または細胞におけるタンパク質の位置を、それらの各抗体に結合している組織または細胞内の抗原の原理を介して、特定するプロセスを指す。抗体を発色タグまたは蛍光タグでタギングすることによって、視覚化することが可能である。カラータグの典型的な実施例には、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼおよびアルカリホスファターゼが挙げられるが、これらに限定されない。フルオロフォアタグの典型的な実施例には、イソチオシアン酸フルオレスセイン(FITC)またはフィコエリトリン(PE)が挙げられるが、これらに限定されない。
フローサイトメトリー法は、流体の流れの中で懸濁された微細粒子を数える、検査する、および区分するための技術である。フローサイトメトリーは、光学的/電子的検出装置を通って流れる単細胞の物理的特性および/または化学的特性の多様性解析を、同時に行うことが可能である。単一周波数または単色の光のビーム(例えばレーザー)を、流体力学的に焦点を当てた流体の流れに向ける。多数の検出器が、流れが光ビームを通過する点に向けられている。すなわち、1つの検出器(前方散乱(Forward Scatter)、FSC)は、光ビームの進行方向上にあり、他のいくつかの検出器(側方散乱(Side Scatter)(SSC)および1つ以上の蛍光検出器)は光ビームに対して直角になっている。光を通って流れる、懸濁された各粒子は、何らかの方法で光を散乱し、粒子内の蛍光化学物質は、励起されて、光源よりも低い周波数で光を放射する。各蛍光発光ピークに1つずつ、散光と蛍光との組み合わせが、検出器によって、および各検出器における輝度の変動を分析することによって、取り出される。各個別粒子の物理的構造および化学的構造に関する様々な要因を推測することが可能である。FSCは細胞体積と関連があり、SSCは、粒子の濃度または内部複雑性(例えば、核の形状、細胞質顆粒の量および種類、または膜の粗度)と関連がある。
免疫ポリメラーゼ連鎖反応法(IPCR)は、抗体ベースの免疫学的検定においてシグナル発生を増大させるために、核酸増幅技術を利用する。PCRと等しいタンパク質が存在しないため、すなわち、タンパク質は、核酸がPCRの間に複製されるようには、複製され得ないので、検出感度を増大させる唯一の方法は、シグナル増幅による方法である。標的タンパク質を、オリゴヌクレオチドに直接的または間接的に接合された抗体に結合させる。結合されていない抗体は洗い流され、残った結合抗体は、そのオリゴヌクレオチドを増幅させる。タンパク質検出は、増幅されたオリゴヌクレオチドを標準的な核酸検出法を用いて検出することによって、引き起こされる。標準的な核酸検出法には、実時間法が含まれる。
B. DNAおよびRNAの検出
IKKi mRNAのレベルも、当業者に公知の様々な核酸技術を用いて検出することが可能である。これらの核酸技術には、核酸配列決定法、核酸ハイブリダイゼーション法、および核酸増幅法が挙げられるが、これらに限定されない。マウスおよびヒトのIkki核酸の配列が、図24Bおよび図25Bに提供されている。これは、IKKi核酸を検出するためのプライマーおよびプローブの設計の説明を提供するためである。
1. 配列決定法
核酸配列決定技術の限定されない具体的な実施例には、鎖ターミネータ(サンガー)配列決定法および色素ターミネータ配列決定法が挙げられるが、これらに限定されない。RNAは、細胞においてそれほど安定しておらず、ヌクレアーゼアタックをより起こし易いため、通常、実験用のRNAは、配列決定の前にDNAに逆転写することを、当業者は認識するであろう。
鎖ターミネータ配列決定法は、修飾されたヌクレオチド基質を用いた、DNA合成反応の配列特異的なターミネーションを使用する。テンプレートDNA上の特殊部位において、拡張が開始される。これは、当該領域におけるテンプレートに相補的な、放射性ショートプライマー、または他の標識オリゴヌクレオチドプライマーを用いることによって、行われる。オリゴヌクレオチドプライマーは、DNAポリメラーゼ、標準的には4つのデオキシヌクレオチド塩基、および1つの低濃度の鎖停止ヌクレオチド(最も一般的にはジ−デオキシヌクレオチド)を用いて、拡張される。この反応は、4つの別々のチューブにおいて繰り返し行われ、各上記塩基が、交替で、ジ−デオキシヌクレオチドを用いる。DNAポリメラーゼによる、鎖停止ヌクレオチドの制限された取り込みが、結果的に、この特定のジ−デオキシヌクレオチドが使用される位置においてのみ停止される、一連の関連するDNA断片を生じさせる。各反応チューブでは、スラブポリアクリルアミドゲルにおいて、または粘性ポリマーで充填された毛細管において電気泳動法を行うことによって、断片がサイズ毎に分けられる。ゲルの上部から底部までスキャンした時に、どのレーンが視覚化された印を生成しているかを、標識プライマーから読みとることによって、配列が特定される。
色素ターミネータ配列決定法は、ターミネータを選択的に標識する。各ジ−デオキシヌクレオチド鎖ターミネータを、異なる波長において蛍光を発する別々の蛍光色素で標識することによって、単一の反応内で、完全な配列決定を行うことが可能である。
2. ハイブリダイゼーション法
核酸ハイブリダイゼーション技術の限定されない具体的な実施例には、in situハイブリダイゼーション(ISH)、マイクロアレイ、およびサザンブロットまたはノーザンブロットが挙げられるが、これらに限定されない。
In situハイブリダイゼーション(ISH)は、ハイブリダイゼーションの1つの種類であり、相補的な標識DNAまたはRNA鎖をプローブとして用いて、組織(in situ)の一部または一区域内において、特異的DNAまたはRNA配列の位置を特定する技術であり、または組織が十分に小さいならば組織全体において、特異的DNAまたはRNA配列の位置を特定する技術である(ホールマウントISH)。DNA ISHを用いて、染色体の構造を決定することが可能である。RNA ISHを用いて、組織切片の内部またはホールマウントにおけるmRNAおよび他の転写物を測定および位置を特定することが可能である。通常、標的転写物を定位置に固定すると共にプローブへの接近が増大されようように、試料細胞および組織を処理する。プローブは、高い温度において、標的配列にハイブリダイズし、その後、過剰なプローブは洗い落とされる。組織内の、ラジオ標識、蛍光標識、または抗原標識された塩素で標識されたプローブを、それぞれ、オートラジオグラフィー法、蛍光顕微鏡検査法、または免疫組織化学法を用いて、位置を特定すると共に測量する。ISHはまた、2つ以上の転写物を同時に検出するために、放射性標識または他の非放射性標識で標識された2つ以上のプローブを用いてもよい。
2.1 FISH
いくつかの実施形態では、蛍光in situハイブリダイゼーション(FISH)を用いて、IKKi核酸を検出する。本発明にとって好ましいFISHアッセイは、細菌人工染色体(BAC)を利用したものである。細菌人工染色体は、ヒトゲノム配列決定プロジェクトにおいて、広範囲にわたって使用されており(Nature 409: 953-958 (2001)を参照)、多くの源、例えばNCBIを介して位置され得るクローンを含有する特異的BACが、配給業者を介して入手可能である。ヒトゲノムからの各BACクローンには、これを明らかに識別する参照名が与えられている。これらの参照名を用いて、対応するGenBank配列を見つけ、配給業者からのクローンのコピーを注文することが可能である。
本発明は、ヒト前立腺細胞、ヒト前立腺組織に、または該ヒト前立腺細胞またはヒト前立腺組織を包囲している流体に、FISHアッセイを行う方法をさらに提供する。
具体的な手順は、当該分野において公知であり、容易に本発明に適応させることが可能である。方法論に関する説明は、多くの参照文献から入手可能である。これらの参照文献には、In situ Hybridization: Medical Applications (eds. G. R. Coulton および J. de Belleroche), Kluwer Academic Publishers, Boston (1992)、In situ Hybridization: In Neurobiology; Advances in Methodology (eds. J. H. Eberwine, K. L. Valentino, および J. D. Barchas), Oxford University Press Inc., England (1994)、Kuo, et al., Am. J. Hum. Genet. 49:112-119 (1991)、Klinger, et al., Am. J. Hum. Genet. 51:55-65 (1992)、およびWard, et al., Am. J. Hum. Genet. 52:854-865 (1993))が含まれる。また、FISHアッセイを行うための手順を提供する市販のキットも存在している(例えば、Oncor, Inc., Gaithersburg, MDから入手可能である)。方法論に関する説明を提供している特許には、米国第5,225,326号、第5,545,524号、第6,121,489号、および第6,573,043号が含まれる。これら全ての文献を引用することによって、その全体を本願に含める。
2.2 マイクロアレイ
様々な種類の生物学的検定法が、マイクロアレイと呼ばれている。マイクロアレイには、DNAマイクロアレイ(例えば、cDNAマイクロアレイおよびオリゴヌクレオチドマイクロアレイ)、タンパク質マイクロアレイ、組織マイクロアレイ、トランスフェクションまたは細胞マイクロアレイ、化合物マイクロアレイ、および抗体マイクロアレイが挙げられるが、これらに限定されない。一般に遺伝子チップ、DNAチップ、またはバイオチップとして知られるDNAマイクロアレイは、個体表面(例えば、ガラスチップ、プラスチックチップ、またはシリコンチップ)に付着した微細なDNAスポットの収集体であり、数千の遺伝子を同時に発現プロファイリングするため、または数千の遺伝子の発現量を同時に監視するためのアレイを形成している。添加されたDNA断片は、プローブとして知られており、数千のプローブを、単一のDNAマイクロアレイ内で用いることが可能である。疾患細胞および正常細胞における遺伝子発現を比較することによって疾患遺伝子を特定するために、マイクロアレイを用いることが可能である。マイクロアレイは、様々な技術を用いて製造可能である。これらの技術には、先端が微細なピンでスライドガラスの上にプリントする技術、予め作成されたマスクを用いたフォトリソグラフィ技術、ダイナミックマイクロミラー装置を用いたフォトリソグラフィ技術、インクジェット印刷技術、または微小電極アレイ上での電気化学技術が挙げられるが、これらに限定されない。
サザンブロッティング法およびノーザンブロッティング法を用いて、特定のDNAまたはRNA配列を、それぞれ検出する。試料から抽出されたDNAまたはRNAを、寸断し、マトリクスゲル上で電気泳動的に取り出し、薄膜フィルタに移す。フィルタに結合されたDNAまたはRNAに、当該配列に相補的な標識プローブをハイブリダイズする。フィルタに結合され、ハイブリダイズされたプローブが検出される。この手法の1つの変形例は、逆ノーザンブロットである。この方法では、膜に添加された基質核酸は、単離されたDNA断片の収集体であり、プローブは、組織から抽出され、標識されたRNAである。
3. 増幅
IKKiゲノムDNAおよびmRNAを、検出の前または検出と同時に、増幅させてもよい。核酸増幅技術の限定されない具体的な実施例には、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)、逆転写ポリメラーゼ連鎖反応(RT−PCR)、転写−媒介性増幅(TMA)、リガーゼ連鎖反応(LCR)、鎖置換増幅(SDA)、および核酸配列ベース増幅(NASBA)が挙げられるが、これらに限定されない。特定の増幅技術(例えばPCR)では、増幅(例えばRT−PCR)の前に、RNAをDNAに逆転写させる必要があるが、他の増幅技術(例えばTMAおよびNASBA)では、RNAは直接増幅されることを、当業者は認識するであろう。
一般にPCRと呼ばれるポリメラーゼ連鎖反応(米国特許第4,683,195号、第4,683,202号、第4,800,159号、および第4,965,188号。これらの各文献の引用することによって、その全体を本願に含める)は、変性、プライマー対を逆鎖に対してアニーリングすること、およびプライマー伸長のステップを多数のサイクル行い、標的核酸配列のコピーの数を飛躍的に増大させる。RT−PCRと呼ばれる一変形例では、逆転写酵素(RT)を用いて、mRNAから相補DNA(cDNA)を生成し、その後、このcDNAをPCRによって増幅して、DNAの多数のコピーを生成する。PCRの他の様々な置換については、例えば、米国特許第4,683,195号、第4,683,202号、および第4,800,159号、Mullis et al., Meth. Enzymol. 155: 335 (1987)、およびMurakawa et al., DNA 7: 287 (1988)を参照されたい。これらの各文献を引用することによって、その全体を本願に含める。
一般にTMAと呼ばれる、転写媒介性増幅(米国特許第5,480,784号、および第5,399,491号。これらの各文献を引用することによって、その全体を本願に含める)は、実質的に一定の、温度、イオン強度、およびpHの条件下で、標的核酸配列の多数のコピーを、自己触媒的に合成する。ここで、標的配列の多数のRNAのコピーは、自己触媒的にさらなるコピーを生成する。例えば、米国特許第5,399,491号、および第5,824,518号を参照されたい。これらの各文献を引用することによって、その全体を本願に含める。米国公開第20060046265号(当該文献を引用することによって、その全体を本願に含める)に記載された一変形例では、TMAは、TMAプロセス感度および精度を改善するために、必要に応じて、阻止する構成要素、停止する構成要素、および他の変更する構成要素の使用を含んでいる。
一般にLCRと呼ばれるリガーゼ連鎖反応(Weiss, R., Science 254: 1292 (1991)。当該文献を引用することによって、その全体を本願に含める)は、標的核酸の隣接する領域にハイブリダイズする、2組の相補DNAオリゴヌクレオチドを使用する。これらのDNAオリゴヌクレオチドは、DNAリガーゼによって、熱変性、ハイブリダイゼーション、およびライゲーションのサイクルを繰り返し行うことによって共有結合され、検出可能なライゲートされた二本鎖オリゴヌクレオチド生成物を生成する。
一般にSDAと呼ばれる鎖置換増幅(Walker, G. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89: 392-396 (1992)、米国特許第5,270,184号および第5,455,166号。各当該文献を引用することによって、その全体を本願に含める)は、標的配列の逆鎖に対してプライマー配列対をアニーリングすること、二重鎖の半ホスホロチオエートされたプライマー伸長生成物するためにdNTPαSの存在下でプライマー伸長を行うこと、半修飾された制限エンドヌクレアーゼ認識部位のエンドヌクレアーゼ媒介性ニッキングすること、および既存の鎖を置き換えて、次の繰り返しのプライマーアニーリング用の鎖を生成するためのニックの3’末端からのポリメラーゼ媒介性プライマー伸長のサイクルを用いる。ニッキングおよび鎖置換は、結果的に、生成物の幾何学的増幅を行う。好熱性SDA(tSDA)は、ほぼ同じ方法において、好熱性エンドヌクレアーゼおよびポリメラーゼをより高い温度で用いる(欧州特許第0 684 315号)ものである。
他の増幅法には、例えば、一般にNASBAと呼ばれる核酸配列ベースの増幅(米国特許第5,130,238号。当該文献を引用することによって、その全体を本願に含める)、プローブ分子自体を増幅するためにRNAレプリカーゼを用いる、一般にQβレプリカーゼと呼ばれる方法(Lizardi et al., BioTechnol. 6: 1197 (1988)。当該文献を引用することによって、その全体を本願に含める)、転写ベースの増幅法(Kwoh et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:1173 (1989))、および自動継続的な配列複製(Guatelli et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87: 1874 (1990)。各当該文献を引用することによって、その全体を本願に含める)が含まれる。公知の増幅法についてのさらなる説明は、Persing, David H., “インビトロ Nucleic Acid Amplification Techniques” in Diagnostic Medical Microbiology: Principles and Applications (Persing et al., Eds.), pp. 51-87 (American Society for Microbiology, Washington, DC (1993))を参照されたい。
4. 検出法
増幅されていない核酸または増幅された核酸は、従来の任意の手段によって、検出可能である。例えば、IKKi核酸は、検出可能に標識されたプローブによるハイブリダイゼーション、および結果として生じるハイブリッドの測定によって、検出可能である。検出法の限定されない具体的な実施例について、以下に説明する。
具体的な一検出法である、ハイブリダイゼーションプロテクションアッセイ(HPA)法は、化学発光オリゴヌクレオチドプローブ(例えば、アクリジニウムエステル−標識(AE)プローブ)を、標的配列にハイブリダイズすること、ハイブリダイズされていないプローブ上に存在する化学発光性の標識を選択的に加水分解すること、および残りのプローブから生成された化学発光を照度計において測定することを含む。例えば、引用によってその全体が本明細書に援用される米国特許第5,283,174号およびNorman C. Nelson et al., Nonisotopic Probing, Blotting, and Sequencing, ch. 17 (Larry J. Kricka ed., 2ed ed. 1995を参照すればよい。
他の具体的な検出法は、実時間(リアルタイム)の増幅プロセスの定量的評価を提供する。「実時間」における増幅プロセスの評価は、増幅反応の間に、反応混合物中の単位複製配列の量を、連続的または周期的に算出すること、および算出された値を用いて、試料中に最初に存在した標的配列の量を計算することを含む。実時間増幅に基づいて、試料中に存在する最初の標的配列の量を算出する様々な方法が、当該分野において公知である。これらの方法には、米国特許第6,303,305号および第6,541,205号に開示された方法が含まれる。各当該文献を引用することによって、その全体を本願に含める。試料中に最初に存在する標的配列の量を算出する方法であるが、実時間増幅には基づいていない他の方法が、引用によってその全体が本明細書に援用される米国特許第5,710,029号に開示されている。
様々な自己−ハイブリダイズプローブを使用することによって、増幅産物を実時間において検出可能である。自己−ハイブリダイズプローブのほとんどは、幹−ループ構造を有している。このような自己ハイブリダイズプローブは、プローブが、自己ハイブリダイズした状態であるか、または標的配列へのハイブリダイゼーションによって改変された状態であるかに応じて、異なって検出可能なシグナルを放射するように、標識されている。限定されない一実施例では、「分子トーチ」が、自己相補性の異なる領域(「標的束縛ドメイン」および「標的閉鎖ドメイン」)を含む一種の自己−ハイブリダイズプローブである。これらの領域は、結合領域(例えば、非ヌクレオチドリンカー)によって接続されており、所定のハイブリダイゼーションアッセイの条件下で互いにハイブリダイズし合う。好ましい一実施形態では、分子トーチは、標的束縛ドメイン内に、一本鎖塩基領域を含む。これらの一本鎖塩基領域は、1〜約20塩基長であり、鎖置換条件下での増幅反応において存在する標的配列へのハイブリダイゼーションのために接近可能である。鎖置換条件下では、完全相補的または部分相補的であり得る、分子トーチのこれら2つの相補的な領域のハイブリダイゼーションが好ましい。これは、標的束縛ドメイン内に存在する一本鎖領域に結合し、標的閉鎖ドメインの全体または一部を置き換える標的配列が存在している場合を除いて有効である。分子トーチの標的束縛ドメインおよび標的閉鎖ドメインは、検出可能な標識または一対の相互作用標識(例えば、蛍光/クエンチャー)を含む。これらの標識は、分子トーチが自己ハイブリダイズされる時に、分子トーチが標的配列にハイブリダイズされる時とは異なるシグナルが生成されるように配置されており、これによって、ハイブリダイズされていない分子トーチの存在下での検査試料において、プローブ(すなわち標的二重鎖)の検出が可能である。分子トーチおよび様々な種類の相互作用標識対については、引用によってその全体が本明細書に援用される米国特許第6,534,274号に開示されている。
自己相補性を有する検出プローブの他の一実施例は、「分子指標」である。分子指標は、標的相補配列を有する核酸分子と、増幅反応において存在する標的配列が無い場合に、閉鎖型立体構造中のプローブを支える親和性の対(または核酸アーム)と、プローブが閉鎖型立体構造にある時に相互作用する標識対とを含む。標的配列および標的相補配列のハイブリダイゼーションは、親和性の対のメンバーを分離させ、その結果、プローブを開放型立体構造に移行させる。この開放型立体構造への移行は、標識対の相互作用が低減するために、検出可能である。標識対は、例えば、フルオロフォアおよびクエンチャーである(例えば、DABCYLおよびEDANS)である。分子指標は、引用によってその全体が本明細書に援用される米国特許第5,925,517号および第6,150,097号に開示されている。
当業者には、他の自己−ハイブリダイズプローブも知られている。限定されない実施例では、米国特許第5,928,862号(当該文献を引用することによって、その全体を本願に含める)に開示されたような、相互作用標識を有するプローブ結合対が、本発明における使用に適用可能である。さらなる検出システムには、米国公開第20050042638号に開示されているような「分子スイッチ」が含まれる。当該文献を引用することによって、その全体を本願に含める。他にも、層間色素、および/または蛍光色素を含むプローブが、本発明における増幅産物の検出には有効である。例えば、引用によってその全体が本明細書に援用される米国特許第5,814,447号を参照すればよい。
実施例
特定の好ましい実施形態および本発明の態様を実証すると共にさらに説明するために、以下の実施例を提供する。これらの実施例は、本発明の範囲を限定するものと解釈されるべきものではない。
(実施例1)
〔IKKiの活性化がインスリン受容体のリン酸化を媒介する。〕
本実施例は、インスリン受容体のリン酸化を引き起こす酵素としてのIKKiを識別して、これによって、インスリン受容体を阻害することについて説明するものである。結果的に、IKKiの活性化が、肥満症、糖尿病、インスリン抵抗性、および関連する疾患と関連付けられるインスリンの活性を軽減することを発見した。
[方法]
<材料および試薬>
他に記載がない限り、全ての化学物質は、Sigma-Aldrich社から入手したものである。S. Minnesota R595(Re)(Calbiochem社)、E.coli 55:B5および0111:B4(Sigma社)由来のLPSを、リン酸緩衝生理食塩水中に溶解し、不透明になるまで緩やかな超音波処理を施し、均一なミセル乳剤を生成した。溶解された10ug/uLのLPSを、1000倍の原液として使用する前に、4℃で最大1週間貯蔵した。GE Health社から、2−デオキシ−D−[14C]グルコース、および[32P]オルトリン酸(aq)を入手した。Stealth(商標)二重鎖siRNAを、Invitrogen社から入手した。これは、(ヒトには保存されていない)マウスInsRに対する5’−UGC CAG UGA UGU GUU UCC AUC UUC U(配列番号1)、マウスIKKαに対する5’−CCU CUU CUG GCA AUG GAG UAC UGU U (配列番号2)、マウスIKKβに対する5’−UGG CAC CCA AUG AUU UGC CAC UGC U(配列番号3)、マウスIKKiに対する5’CAG CUC UGA CUU AGA GUC CUC ACU A(配列番号4)を用いたものである。Invitrogen社のBlock-IT(商標)プログラムを用いて、プライマーを消化し、対照として、該プログラムによって示唆されたスクランブルプライマーを用いた。
<抗体>
InsRβ、IRS−1、p110、APS、GST、およびCblに対する抗体は、Santa Cruz社からのものである。Akt、IKKα/β、およびIκBαのT308およびS473に対するリン酸化型特異的抗体、並びに、AktおよびIKKαに対する抗体は、Cell Signaling社から入手した。4G10およびIKKβはUpstate社から、カベオリン−1はTransduction laboratories社から、IKKiはImGenex社から、そして、Flag抗体はSigma社からのものである。
<プラスミドおよび突然変異生成>
IKKi発現プラスミドは全て、Dr.HiscottおよびDr.Maniatisから快く提供されたものである(Fitzgerald et al., Nature Immunol, 2003, 4 (5): 491-496、およびSharma et al., Science 2003年5月16日;300(5622):1148-51。(2003年4月17日に電子公開)。これらの両文献は参照として本明細書に組み込まれる)。GLUT4の第1の外表面のループ内にmyc−タグを含むmyc−GLUT4増強緑色蛍光タンパク質(myc−GLUT4−eGFP)を発現するレトロウイルスコンストラクトは、Dr. Lodishからの親切な贈り物であった(Bogan, et al. Mol Cell Biol. 2001 7月21日(14):4785-806。当該文献は参照として本明細書に組み込まれる)。ヒトInsR発現プラスミドは、Dr. Pessin(SUNY Stony Brook, NY, USA)から快く提供されたものである。突然変異InsRは、Stratagene Quick Change(商標)の突然変異生成キットを、製造業者の取扱説明書に従い、5’−CTC TCG GAG ACT GGC TGC CTC GTT GAC CGT (配列番号5)および5’−ACG GTC AAC GAG GCA GCC AGT CTC CGA GAG(配列番号6)を変異プライマーとして用いて、作製した。
<細胞培養およびトランスフェクション>
3T3−L1線維芽細胞(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション)を上述のように培養し分化させた(Reed & Lane, Proc Natl Acad Sci U S A. 1980年1月,77(1):285-9。当該文献は参照として本明細書に組み込まれる)。この分化プロセスが完了した後、細胞を規定通りに7日以内に用いた。ここでは、95%を超える細胞が含脂肪細胞の形態を示している培養物だけを用いた。CHO−IR細胞およびCOS−1細胞を、10%のウシ胎児血清を含むダルベッコ変法イーグル培地(Gibco)中に保持した。CHO−IR細胞および3T3−L1細胞に、規定通りに、上述のエレクトロポレーションによって、プラスミドおよびsiRNAをトランスフェクトした(Inoue, M., et al., (2006) Mol Biol. Cell 17, 2303, Baumann, et al.,(2000) Nature 407, 202。これらの両文献は参照として本明細書に組み込まれる)。Cos−1細胞に、FuGene6(Roche Diagnostics社)を、製造業者の取扱説明書に従ってトランスフェクトした。
<動物および動物の管理>
8週齢の雄のC57BL/6マウスに、脂肪からのカロリーを45%含有する高脂肪食(D 12451 Research Diets Inc.社)を20週間与えることによって、インスリン抵抗性にした。対照マウスに、脂肪を4.5%含有する標準食(5002 LabDiet)を与えた。動物を、特別の無菌施設に収容し、12時間の明期/12時間の暗期のサイクルで、食べ物と水を自由にとることができるようにした。全ての動物の使用は、実験動物研究協会(Institute of Laboratory Animal Research)の実験動物の管理および使用に関する指針(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)に準拠しており、ミシガン大学の動物の使用および管理に関する大学委員会(University Committee on Use and Care of Animals)によって承認された。
<SVFおよび初代含脂肪細胞の単離>
普通食または高脂肪食を与えた雄のC57BL/6マウスからの副睾丸脂肪体を切除し、塩化カルシウムおよび0.5%BSAを含むPBSにおいて、細かく刻んだ。組織懸濁液を500gにおいて5分間、遠心分離し、赤血球および遊離白血球を取り除いた。コラゲナーゼ(Sigma-Aldrich社)を1mg/ml添加し、20分間振りながら、37℃で培養した。細胞懸濁液を100μmのフィルターを通して濾過し、その後、300gにおいて5分間回転させ、浮遊した含脂肪細胞をSVF沈殿物から分離させた。単離が適切になされたことを確実にするために、含脂肪細胞分画を顕微鏡で調べた。
<グルコース取込み分析>
12穴のウェルプレート内に成長させた3T3−L1含脂肪細胞について、上述のグルコース取込みアッセイを、0.075uCi/ウェルの2−デオキシ−D−[14C]グルコース(GE Health社)を用いて行った(Van den Berghe et al., Mol Cell Biol. 1994年4月;14(4):2372-7。当該文献は参照として本明細書に組み込まれる)。試料を、LS6500多目的シンチレーションカウンター(Beckman Coulter社)において、BCS Biodegradable Counting Scintillant(GE Health社)を用いて、計測した。
<Glut4転位>
レトロウイルスのmyc−GLUT4−eGFPに感染した3T3−L1線維芽細胞を、フローサイトメトリーを用いてGFP強度によって選択し、上述のように含脂肪細胞に分化させた。このアッセイは、[Bogan et al., Mol Cell Biol. 2001年7月;21(14):4785-806。当該文献は参照として本明細書に組み込まれる]に記載された方法にわずかな変更を加えて行った。簡単にいえば、細胞を、96穴のウェルプレートに播種し、示されるように処理した。その後、細胞を、10%の中性緩衝ホルマリン(VWR International社)において、室温で10分間固定させた。全mycシグナルを測定するために、1つのウェルを、0.5%トリトン−X100で透明化処理した。細胞を洗浄して、50mMグリシンを含むリン酸緩衝生理食塩水(pH7.4)を用いて固定化を抑えた後、細胞を、リン酸緩衝生理食塩水(pH7.4)に1%ヤギ血清および1%ウシ血清アルブミンを含有するブロッキング緩衝液において、一晩培養した。細胞を、ブロッキング緩衝液中で1時間、抗mycモノクローナル抗体とともに培養した。その後、細胞をブロッキング緩衝液中で半時間、Alexa594ヤギ−抗マウス抗体とともに培養した。リン酸緩衝生理食塩水で広範に洗浄した後、蛍光を、fluorostar Optima プレートリーダー(BMG Labtech Inc.社., Durham, NC)によって、適切なフィルターセットを用いて測定した。それぞれの条件について、原形質膜におけるGLUT4の割合を計算した。各ウェル内の細胞濃度における差異を補正するために、GFP蛍光を用いた。これらの細胞の画像は、FV300走査型レーザー共焦点顕微鏡(Olympus America Inc.社、Center Valley, PA)を用いて、撮像した。
<免疫沈降および免疫ブロット法>
放射性免疫沈降では、細胞を、無リン酸塩のダルベッコ変法イーグル培地(Gibco)を用いて、16時間培養し、その後、1mCi/プレートの[32P]オルトリン酸で3時間培養した。刺激を加えた後、細胞を、氷冷したリン酸緩衝生理食塩水で2回洗浄し、プロテアーゼ阻害剤(Roche Dignostics社)の存在下で、1mMのNaVO、1mMのEGTA、1mMのEDTA、50mMのトリス−HCl(pH7.4)、1%のNonidetP-40、0.5%のデオキシコール酸ナトリウム、150mMのNaCl、5mMのNaFを含有する緩衝液を用いて、4℃において30分間溶解した。テーブルトップ遠心分離機において、14,000×gにおいて4℃で10分間回転させ、その後、上清を、Millex−HA 0.45umフィルター(Millipore社)に押し通すことによって、細胞溶解物から、細胞残屑を除去した。各免疫沈降につき、1mgの溶解物に5ugの抗体を用いた免疫沈降を、4℃において1.5時間施した。ProtA/ProtGビーズ(Roche Dignostics社)とともに4℃において1.5時間培養することによって、免疫複合体を採取した。試料を、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)試料緩衝液において可溶化される前に、溶解緩衝液で広範に洗浄した。結合タンパク質を、SDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動(Invitrogen社)によって分離し、ニトロセルロース膜(BioRad社)に転写させた。個々のタンパク質を特異的抗体によって検出し、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼに結合した二次抗体(Santa Cruz社)およびWestern Lightning Enhanced Chemoluminescence(Perkin Elmer Life Sciences社)を用いて、可視化した。
<インビトロプルダウンアッセイ>
BL21 E.coliにおいて、APSのSH2ドメインを含有するGST融合タンパク質を発現させ、上述のように精製した(Liu et al., (2002) Mol. Cell. Biol. 22, 3599)。CHO−IR細胞に、野生型またはキナーゼ−デッド型IKKiをトランスフェクトした。免疫沈降のために、全ての細胞溶解物を、上述のように、50mMのトリス−HCl(pH8)、135mMのNaCl、1%のトリトンX−100、1mMのEDTA、1mMのオルトリン酸ナトリウム、10mMのNaF、およびプロテアーゼ阻害剤(Roche Diagnostics社)を含有する緩衝液を用いて調製した。細胞をGSTまたはGST−APS−SH2で4℃において1時間培養した。複合体を、グルタチオン−セファロースビーズ(GE Health社)で4℃において1時間採取し、広範な洗浄を行った後、複合体を免疫ブロット法によって分離した。
<エネルギー消費および呼吸商>
酸素消費量(VO)、二酸化炭素産生量(VCO)、自発運動量、および食糧摂取量を、包括的実験室監視システム(Comprehensive Laboratory Monitoring System)(CLAMS, Columbus Instruments社)、光ビーム活性監視システムが装備された内蔵開路熱量計を用いて測定した。各測定前に、マウスの体重を測定し、各マウスを、午後4:30〜5:00に、密閉室(7.9”x4”x5”)内に置いた。動物は、実際の測定が始まる前に、新しい環境に適用するために、少なくとも12〜24時間この測定室に滞在できるようにしてある。この測定を、連続的に24〜48時間行った。この時間の間、動物には、測定室の内側に装備された餌供給および飲み物供給装置を介して、食べ物および水を与えられた。各動物が消費した食べ物の量を、測定室の下に取り付けられた精密天秤を介して監視した。実験の前にはいつも、このシステムを、規定通りに、標準ガス(N2中の20.5%のOおよび0.5%のCO)を用いて調整した。各測定室内のVOおよびVCOを、10分間の間隔をおいて、5秒間、連続的にサンプリングし、運動量を各秒毎に記録した。測定室内を通る気流速度を、静止状態における酸素の差異を約0.3%に保持するレベルに調節した。VCOのVOに対する比率として、呼吸商(RQ)を計算した。エネルギー消費および基質酸化率も、VO値、VCO値、および尿窒素排出から算出されたタンパク分解の値に基づいて計算可能である。
[結果]
〔リポ多糖類(LPS)が、含脂肪細胞におけるインスリン作用を軽減する〕
脂肪組織における肥満と関連付けられる分子変化をモデル化するために、トール様受容体4(TLR4)の活性化の影響を、3T3L1含脂肪細胞内のリポ多糖類(LPS)によって検査した。培養された含脂肪細胞を、TLR4を活性化させることが知られている濃度のLPSによって前処理し、インスリン刺激性2−デオキシグルコース取込みを算出した(図1)。LPSは、インスリンによって刺激されたグルコース取込みを30〜40%低減させたが、その一方で、定常の輸送をわずかに上昇させた。
インスリン刺激性グルコース取込みは、促進性グルコース輸送体Glut4によって媒介される。インスリンは、Glut4の細胞内貯蔵所から細胞表面までの転位を刺激することによって、グルコース取込みを増加させる。LPSがインスリン作用を軽減する手段を算出するために、3T3L1含脂肪細胞に、増強緑色蛍光タンパク質およびmycエピトープタグ(Myc−Glut4−eGFP)と融合したGlut4を含有するコンストラクトをトランスフェクトし、これによって、インスリンに依存した、タンパク質(GFPシグナル)の転位および膜内挿入(Myc)が上昇するようになった。図2に示すように、LPSは、両方のプロセスにおけるインスリンの作用を阻止した。
〔LPSによるインスリン作用の阻害が、IKKiの活性化によって媒介される〕
TLR4に結合するLPSは、4つのメンバーであるα、β、ι(またはε)およびTBK1を含んで成るIKKのクラスとして知られる、タンパク質キナーゼのクラスを活性化させる。LPSによるインスリン作用を軽減させるためにはどのIKK−アイソフォームが必要であるかを判別するために、LPSによる処理後の3T3L1含脂肪細胞において、IKK活性化を分析した。IKKβおよびiには、LPSの処理の後、(32Pの取り込みによって示されるように)活性化が生じたが、TBK1およびIKKαには、影響がなかった(図3a)。これらのうちのどれが、LPSの阻害作用に関連しているかを判別するために、グルコース取込みのアッセイを行う前に、各IKKアイソフォームをsiRNAによってノックダウンした。
全てのIKKアイソフォームのタンパク質レベルは、siRNA処理によって効率よく低減されたが、インスリン刺激性Aktリン酸化には、影響がなかった(図3b)。この図は、ノックダウンが、インスリン受容体の活性化またはシグナル伝達に与える非特異的影響はないことを示している。その後、これらの細胞について、インスリン刺激性グルコース取込みを阻止するLPSの性能を測定した。IKKαおよびIKKβのノックダウンは、LPSのインスリン刺激性グルコース取込みに与える阻害作用を変化させなかったが、IKKιのノックダウンは、LPSの逆作用を妨げた(図4)。この図は、LPSが含脂肪細胞内のインスリン作用に影響を与えるためには、このアイソフォームが必要であることを示している。
この作用をさらに評価するために、野生型IKKi、またはキナーゼ不活性のドミナントネガティブIKKi突然変異体を、3T3L1含脂肪細胞において、異所的に発現させた(図5)。野生型IKKiの異所性過剰発現にもかかわらず、LPSは、インスリン刺激性グルコース取込みを低減するが、キナーゼ−デッド型IKKi突然変異体の過剰発現は、LPSの逆作用を完全に妨げる。LPSがインスリン作用に与える悪影響におけるIKKiの重要性を評価する最後の方法として、LPSおよびインスリンによる処理の前に、細胞を特異的IKKi阻害剤によって処理した。3T3L1含脂肪細胞を、50nMのIKKi阻害剤5−(5,6−ジメトキシ−1H−ベンズイミダゾール−1−イル)−3−[[2−(メチルスルホニル)フェニル]メトキシ]−2−チオフェンカルボニトリルを用いて処理し(図6a)、その後、LPSによって処理し、続いて、インスリンによって処理した(図6b)。IKKi阻害剤は、LPSのインスリン刺激性グルコース取込みに与える阻害作用を妨げるが、インスリン刺激性または定常の輸送に与える直接的な影響はわずかである。
〔LPSが、インスリン刺激性APSおよびCblチロシンリン酸化を阻害する〕
急性のLPS処理が、含脂肪細胞におけるインスリン刺激性のGlut4の転位を干渉することが証明されると、シグナル伝達経路のどこで、インスリン作用がLPS誘導性のTLR4活性化によって悪影響を受けているのかが分かる。LPSによる含脂肪細胞の処理では、抗ホスホチロシン免疫ブロット法によって検出されたように、インスリン受容体(InsR)またはIRS−1のインスリン刺激性チロシンリン酸化には何の影響も与えない(図7A)し、インスリン刺激の後にIRS−1と免疫共沈降されたPI−3’キナーゼの量も低減しない(図7B)。同様に、インスリンによるタンパク質キナーゼAktの活性化は、細胞のLPS前処理によっては影響されなかった(図8)。さらに、LPSは、Erk−1/2またはPKCλのインスリン刺激性活性化に、またはカベオリンのチロシンリン酸化にも影響を与えなかった。しかし、APSおよびCblの両方のインスリン刺激性チロシンリン酸化はLPS処理によって著しく低減された(図9)。これらの観察に一致して、LPSは、APS/Cblの下流エフェクターであるTC10の、インスリン誘導性の活性化も低減した(図10)。
〔IKKiが、インスリン受容体のリン酸化を触媒し、シグナル伝達経路を選択的に阻止する〕
LPSが、APSのインスリン刺激性チロシンリン酸化を低減するため、TLR4活性化が、インスリン受容体−APSシグナル伝達ノードにおけるインスリンシグナル伝達に影響すると仮定した。LPS活性化の後のIKKiの標的を同定するために、LPS処理された含脂肪細胞のインビボオルトリン酸標識化を行い、その後、受容体またはAPSの免疫沈降を行った。LPSが、放射性リン酸塩のInsRへの取り込みを刺激したが、放射性リン酸塩のAPSへの取り込みは刺激しなかった。これは、IKKiが、InsRの直接のリン酸化を触媒していることを示唆している(図11a)。LPS刺激された放射性リン酸塩のInsRへの取り込みは、IKKi(他のIKKアイソフォームの何れかではなく)がsiRNAに依存して低減することによって、完全に阻止された(図11b)。
InsRの一次配列を、p65およびSTAT1などの既知のIKKi標的の一次アミノ酸配列と比較した(図12)。本発明を実施するためには必ずしも理解する必要はないが、InsRの配列VKTVNES1035AS(配列番号9)におけるSer1035を、潜在的IKKiリン酸化部位として同定した。Ser1035は、インスリン受容体チロシンキナーゼドメインの結晶構造において、完全に溶媒に曝されており(Hubbard et al., EMBO J. 1997 Sep 15;16(18):5572-81)、既知のIKKι標的配列:p65におけるVFTDLAS468VD(配列番号7)(Mattioli et al., J Biol Chem. 2006 Mar 10;281(10):6175-83)、およびSTAT1におけるIKTELIS711VS(配列番号8)(TenOever et al., Science. 2007 Mar 2;315(5816):1274-8)に似ている。これがIKKi触媒リン酸化部位であるという仮定を検査するために、Ser1035とアラニンとを置き換えることによって、ヒトInsR突然変異体を作製し、これを、COS細胞において、野生型IKKiと共に異所的に発現させた。これらの細胞からの溶解物について、GST−APS融合タンパク質を用いたプルダウンアッセイを行った(図13)。野生型InsRを発現する細胞では、IKKi過剰発現によって、受容体とGST−APSとの相互作用を低減した。一方、Ser1035AlaInsR突然変異体では、受容体とGST−APSとの相互作用にIKKiが与える負の影響に耐性を示した。さらに、Ser1035Ala置換は、IKKiが共発現すると、放射性リン酸塩の野生型受容体への取り込みを阻止した(図14A)。
Ser1035が、インスリン作用の負の制御にとって生理学的に重要な部位である否かを定めるために、3T3L1含脂肪細胞において、内在性マウスインスリン受容体を、siRNAを用いてノックダウンし、続いて、LPS耐性、siRNA耐性のヒトSer1035Ala突然変異体を異所的に発現させ、インスリン刺激性グルコース取込みを測定した。マウスのInsRノックダウンを行った細胞は、インスリンに反応しなかったが、野生型またはSer1035Ala突然変異体のヒト受容体の再発現によって、反応性が回復した。興味深いことに、LPSの阻害作用は、変異受容体を発現する細胞において、排除された。これは、この部位のリン酸化が、IKKiの阻害作用に関与していたことを裏付けている(図14B)。
〔IKKiの発現は、高脂肪の食事を与えた後の脂肪組織において増大する〕
肥満症および糖尿病におけるIKKiの役割を評価するために、通常または高脂肪の食事を与えたマウスにおけるIKKiの発現を評価した。高脂肪食を与えて8週間後、雄のマウスを屠殺して、副睾丸脂肪体を切除し、遠心分離機にかけて、含脂肪細胞を、脂肪組織マクロファージにおいて著しく凝縮されている間質血管細胞群から分離した。細胞を溶解し、IKKiのレベルをウエスタンブロッティング法によって測定した(図15)。高脂肪の食事を与えることによって、含脂肪細胞および脂肪組織マクロファージにおけるIKKiのレベルが増大した。
〔IKKiの遺伝子欠失が、肥満症およびインスリン抵抗性を防止する〕
相同組み換え(Tenoever et al., Science, 2007 Mar 2;315(5816):1274-8)によって、マウスのIKKi遺伝子を欠失させた。8週間にわたって、マウスに高脂肪または普通食を与えた。図16に示されるように、IKKiノックアウトマウス(IKKiKO)では、同じ食事を与えたそれらの野生型同腹子よりも、極めてわずかしか体重が増加しなかった。このデータを定量化したところ、体重増加の減少は統計上有意であり、P<0.01であることが明らかになった(図17)。図18に示されるように、体重における減少のほとんどが、著しく小さな脂肪蓄積に起因していた。さらなる調査により、この差異は、より小さな脂肪細胞が原因であったことが明らかになった(図19)。
IKKiKOマウスの体重増加の低減の基礎をなす機構を検討するために、食糧摂取量、エネルギー消費、および呼吸商を算出した。KOマウスとWTマウスとの間の食糧摂取量に著しい違いは存在しなかったが、IKKiKOマウスでは、明期と暗期とのサイクルにおいて、VO(図20)およびVCO(図21)が増大していたことが示された。これは、エネルギー消費が増大したことを示している。
エネルギー代謝の変化が、グルコース恒常性に与える影響を検討するために、高脂肪食事を与えた後の野生型マウスおよびIKKiノックアウトマウスに対して、グルコース耐性試験およびインスリン耐性試験を行った。高脂肪食を与えて8週間後、野生型マウスおよびIKKiKOマウスを一晩絶食させ、グルコースをボーラス投与した。30分ごとに血液をサンプリングし、血中グルコース値およびインスリン値を測定した(図22)。野生型マウスは、グルコース不耐性であったが、IKKiKOマウスは、大幅に改善されたグルコース耐性を示しており、曲線の下方の領域においておよそ25%の低減を有していた。インスリン耐性についても、同じマウスにおいて、3時間にわたって絶食させた後に測定した。高脂肪食を与えた野生型マウスは、インスリンの作用に対して耐性を示したが、IKKiKOマウスは、インスリン感受性の状態を維持した(図23)。
〔高脂肪食を与えたマウスにおいて、IKKi酵素活性が著しく増大する〕
高脂肪食が脂肪組織内のIKKiの酵素活性に与える作用を決定するために、普通食を与えたマウスまたは高脂肪食を与えたマウスから、脂肪組織を切除し、溶解し、IKKiに対する抗体で免疫沈降させた。免疫沈降の後、ミエリン塩基性タンパク質および32P−ATPとともに培養することによって、IKKi活性のアッセイを行った。酵素活性を、SDSポリアクリルアミドゲル電気泳動の後に、オートラジオグラフィーを行うことによって決定した。図27に示す結果は、高脂肪食を与えたマウスにおいて、IKKi活性が著しく増大したことを示している。
(実施例2)
〔IKKiが、肥満マウスのエネルギー消費、インスリン感受性、および慢性的な炎症を制御する〕
本実施例は、高脂肪食が、マウスのNFκB活性化を増大させ得ることを示すものである。NFκB活性化が増大することによって、肝臓、含脂肪細胞、および脂肪組織マクロファージにおける誘導性IκBキナーゼ(IKKi)レベルが、継続して上昇する。本発明の実施形態を開発する経過において行われた実験では、IKKiノックアウトマウスが、高脂肪食によって誘導された肥満症、肝臓および脂肪における慢性的な炎症、肝脂肪症、並びに全身インスリン抵抗性から保護されることが示された。これらのマウスは、高脂肪食において、エネルギー消費および産熱が、野生型マウスと比べて高いことを示している。これらのマウスは、肥満と関連付けられた前炎症性JNK経路を活性化させずに、肝臓および脂肪においてインスリン感受性を維持している。遺伝子発現分析では、IKKiの標的の欠失が、脱共役タンパク質UCP1の発現を増大させ、炎症性サイトカインの発現を低減させ、グルコース代謝および脂質代謝に関与する特定の調節タンパク質および酵素の発現を変化させることを示している。従って、IKKiは、肥満症、インスリン抵抗性、糖尿病、およびこれらの疾患に関連付けられた他の合併症のための、予期しなかった新規の処置標的である。
[方法]
<試薬>
全ての化学物質は、他に記載が無い限り、Sigma-Aldrich社から入手したものである。抗IKKi、抗TBK1、抗ホスホIKKβ、抗ERK、抗Akt、抗ホスホAkt(ser473)、抗ホスホJNK、抗JNK、抗IKB、抗リンIKB(ser32)、抗リンIKB(ser32/36)は、Cell Signaling社から購入した。抗Irβ、抗NFκB(p65)、および抗Rab5Bは、Santa Cruz Biotechnology社から入手した。抗MGL1抗体は、eBioscience社から購入した。抗F4/80抗体は、Abcam社からのものである。Isolectin-Alexa 568、抗Akt1抗カベオリン3および抗カベオリン1抗体は、BD Biosciences社から購入した。抗ルシフェラーゼ抗体は、Cortex Biochem社からである。MBP、抗IRS1モノクローナル抗体、CAPポリクローナル、およびホスホチロシン(4G10)抗体は、Upstate Biotechnology社から購入した。抗GLUT4および抗UCP−1は、Alpha Diagnosticから購入した。抗アクチンおよび抗FLAGは、Sigma社から購入した。全ての齧歯類OXPHOS抗体は、MitoSciences社から購入した。抗リピン1は、バージニア大学のDr. Thurl Harrisが快く提供してくれたものである。Enhanced chemiluminesence (ECL)試薬は、NEN, Inc社から購入した。EDTA−freeプロテアーゼ阻害剤錠剤は、Roche, Inc社から購入した。
<プラスミドおよび突然変異生成>
IKKiを発現する全てのプラスミドについては、既に説明した(Fitzgerald et al., Nat. Immunol., 4, 491-496, 2003; Sharma et al., Science, 300, 1148-1151, 2003)。
<動物および動物の管理>
8週齢の雄の野生型またはIKKiノックアウトC57BL/6マウスに、脂肪からのカロリーを45%含有する高脂肪食(D12451 Research Diets Inc.社)を14〜18週間にわたって与えた。対照マウスには、脂肪を4.5%含有する標準食(5002 Lab Diet)を与えた。図の説明文に記載していない限り、ほとんどの実験は、食べ物を与えることを中止した6時間後に行った。動物を、特別の無菌の施設に収容し、12時間の明期と12時間の暗期のサイクルで、食べ物および水を自由に取れるようにした。全ての動物の使用は、実験動物研究協会(Institute of Laboratory Animal Research)の実験動物の管理および使用に関する指針(Guide for the Care and Use of Laboratory Animals)に準拠しており、ミシガン大学の動物の使用および管理に関する大学委員会(University Committee on Use and Care of Animals)によって承認された。
<エネルギー消費および呼吸商>
NDおよびHFDの16週間後の両方について、WTおよびIKKiノックアウトマウス(各遺伝子型につきN=8)を、標準代謝飼育カゴの中に置いた。身体組成を、ミシガン大学のAnimal Metabolic Phenotyping Coreによって行われたNMR分析によって測定した。飼料消費、飼育カゴにおける自発的な活動量、VO、VCO、およびRERを、3日連続して(3つの暗期および2つの明期のサイクル)測定した。分析では、明期と暗期とのサイクルの平均値を用いた。
酸素消費量(VO2)、二酸化炭素産生量(VCO2)、自発運動量、および食糧摂取量を、包括的実験室監視システム(CLAMS, Columbus Instruments社)、光ビーム活性監視システムが装備された内蔵開路熱量計(Lesniewski et al., Nat. Med., 13, 455-462, 2007)を用いて測定した。これらの研究は、ミシガン大学のAnimal Metabolic Phenotyping Coreによって行われた。VCOのVOに対する比率として、呼吸商(RQ)を計算した。エネルギー消費および基質酸化率についても、VO値、VCO値、および尿窒素排出から算出されたタンパク分解の値に基づいて計算可能である。
<直腸温測定>
直腸温の記録は、正午頃に、YSI 4600精密温度計(YSI, Inc.社, Yellow Springs, OH)で測定した。
<全血および血漿の測定>
全血をヘパリンチューブの中に収集した。血漿インスリン濃度をインスリンELISAキット(Crystalchem Inc.社.)によって測定した。血中グルコースをOneTouch Ultra Glucometerによって測定した。NEFAおよびコレステロールを比色試験(Wako)によって測定した。トリグリセリド値を、Sigma社から購入したトリグリセリド試薬キットによって測定した。アディポネクチン、およびレプチン濃度を、Cayman Chem Inc.社から購入したELISAキットによって測定した。血漿MCP−1、TNFa、ランテスおよびIL−6を、R&D Systems社から購入したELISAキットによって測定した。
<グルコース耐性試験、ピルビン酸塩耐性試験、およびインスリン耐性試験>
グルコースまたはピルビン酸塩耐性試験のために、マウスを12時間にわたって絶食させた後、1.5mgのグルコース/g体重、または2mgのピルビン酸ナトリウム/g体重を、マウスに腹腔内注射した。尻尾の血液からの血中グルコースを、基点、15、30、45、60、90、120、および180分の時点でOne Touch Ultra glucometer(Lifescan社)を用いて測定した。インスリン耐性試験のために、3時間にわたって絶食させた後、マウスに、0.75単位インスリン/kg体重を腹腔内投与した。血中グルコース濃度を上述のように測定した。
<初代含脂肪細胞およびSVFの単離>
各遺伝子型に付き3〜5匹の雄のマウスを、解剖の前に、12時間にわたって絶食させた。副睾丸脂肪体を収集して、はさみで細かく刻んだ。その後、脂肪体を、KRBH緩衝液(10mMのHepes、ph7.4、15mMのNaHCO、120mMのNaCl、4mMのKHPO、1mMのMgSO、1mMのCaCl、および2mMのピルビン酸ナトリウム)において、1mg/mgのII型コラゲナーゼで、37°Cにおいて10分間激しく攪拌しながら消化した。細胞懸濁液を70μmのフィルターを通して濾過させ、その後、300gで5分間回転させ、浮遊している含脂肪細胞を、SVF沈殿物から分離した。単離が適切になされたことを確実にするために、含脂肪細胞分画を顕微鏡によって検査した。単離された細胞を、RNAまたはタンパク質分析のために、適切な緩衝液中に再懸濁させた。
<RNA抽出およびリアルタイムRT−PCR分析>
マウス組織を単離し、リン酸緩衝生理食塩水(PBS)中でリンスし、液体窒素中で凍結させ、抽出を行うまで−80Cで貯蔵した。DNase消化ステップを包含しているRNeasy Lipid Tissueキット(Qiagen社)を製造業者の取扱説明書に従って用いて、全RNAを組織から抽出した。全RNAを初代含脂肪細胞およびSVFから、DNaseステップを包含しているRNeasyキット(Qiagen社)を用いて抽出した。逆転写のために、RT−PCR用のSuperscript First-Strand Synthesis System(Invitrogen社)を、ランダムプライマーと共に用いた。Applied Biosystems 7900HT Fast Real-time PCR Systemによって、Power SYBR Green PCR Master Mix (Applied Biosystems社)を用いて、試料についてcDNAのリアルタイムPCR増幅を3回繰り返し行った。候補となるいくつかの遺伝子をスクリーニングした後の標準化のための内部対照として、Rplp0を選択した。すなわち、その発現は、実験の条件によっては、著しい影響は受けなかった。この研究において用いた全てのプライマーの配列は、補足的に図8に挙げた。データを、2−ΔΔCT法(Livak and Schmittgen, 2001)を用いて分析し、1匹のマウスに付き1つの平均試料値について独立異分散スチューデントt検定を用いて、統計的有意性を決定した。組織試料におけるqPCRでは、NDを与えたWTを1と設定した。
<免疫沈降>
組織を、溶解緩衝液(50mMのトリス、pH7.5、5mMのEDTA、250mMのショ糖、1%のNP40、2mMのDTT、1mMのバナジウム酸ナトリウム、100mMのNaF、10mMのNa、および添加したてのプロテアーゼ阻害剤錠剤)中に再懸濁させ、粉砕して、低温室において1時間振とうした(Li et al., 2006)。その後、粗溶解物を14,000xgで15分間の遠心分離を2回行い、タンパク質濃度を、BioRad社のタンパク質アッセイ試薬(Protein Assay Reagent)を用いて決定した。示された量の溶解物について免疫沈降を行った。上清を5μgのポリクローナル抗体で一晩培養し、その後、さらに4°Cで1時間、Protein Aビーズとともに培養した。試料を、ドデシル硫酸ナトリウム(SDS)試料緩衝液に溶解する前に、溶解緩衝液で広範に洗浄した。結合タンパク質をSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜(BioRad社)の上に転写した。個々のタンパク質を特異的抗体によって検出し、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼに結合した二次抗体(BioRad社)およびWestern Lightning Enhanced Chemoluminescence (Perkin Elmer Life Sciences社)を用いて、可視化した。
<インスリンシグナル伝達分析>
基礎的状態にあるマウス、またはインスリンのIP注射(0.85U/kg)をしてから10分後のマウスから、副睾丸脂肪組織、肝臓組織、および大腿四頭筋組織を収集して、直ちに液体窒素中で凍結させた。凍結組織を溶解緩衝液において氷上でホモジナイズし、粉砕し、低温室において、1時間振とうした。40μgのタンパク質を、4〜12%または4〜20%のSDS−ポリアクリルアミドゲル電気泳動によって分離し、ニトロセルロース膜(BioRad社)に転写した。個々のタンパク質を特異的抗体によって検出し、ホースラディシュ・ペルオキシダーゼに結合した二次抗体(BioRad社)およびWestern Lightning Enhanced Chemoluminescence(Perkin Elmer Life Sciences社)を用いて、可視化した。
<免疫組織化学法および共焦点顕微鏡>
IHCおよび共焦点顕微鏡観察を上述のように(Lumeng et al., 2007a; Lumeng et al., 2008)行った。カベオリン着色された脂肪組織の画像(150〜200の含脂肪細胞/マウス、3マウス/遺伝子型)における含脂肪細胞の断面積を、CellProfiler画像分析ソフトウェアを用いて計算した。定量のために、F4/80免疫染色法によって、王冠様の構造を同定した。含脂肪細胞の直径から、含脂肪細胞の数を、既存の公式(Hirsch etalclin. Endrocrinol. Metab., 5, 299-311, 1976)を用いて算出した。
<インビボ生物発光>
Xenogen IVIS System 100による撮像の前に、HLLマウスの毛を剃って皮膚を露出させ、鎮静下で、150mg/kgルシフェリンを含むIPを注射した。連続写真を撮像し、シグナルの安定期(注射の後15〜20分間まで)において発光を定量した。ルシフェリン注射の後、組織を採取し、蛍光シグナルの安定期において撮像した。
<エクスビボ脂質生成アッセイ>
遺伝子型に付き3〜5匹の雄のマウスを、解剖の前に3時間にわたって絶食させた。副睾丸脂肪体を収集し、はさみで細かく刻んだ。その後、脂肪体を、KRBH緩衝液(10mMのHepes(H7.4)、15mMのNaHCO、120mMのNaCl、4mMのKHPO、1mMのMgSO、1mMのCaCl、および2mMのピルビン酸ナトリウム)において、1mg/mgのI型コラゲナーゼで、37度で10分間、激しく攪拌しながら消化した。前含脂肪細胞、マクロファージ、および赤血球を含有する上清を、2分間の200rpmによる遠心分離によって除去することによって、含脂肪細胞を単離させた。単離された細胞を1.5mlのKRBH緩衝液中に再懸濁させた。インスリンの非存在下または様々な濃度のインスリン存在下で、50μlの細胞を1μCiの14C−グルコースおよび950μlのKRBHと混合させ、その後、37度で1時間攪拌した。シンチレーションバイアルにおいて、各試料からの500μlの懸濁液を、500μlのPBSおよび5mlの非水性のシンチラント(scintillant) Ecoscint O(National Diagnistics社)と混合した。全ての実験は、4μMグルコースのグルコース濃度において行った。この濃度は、グルコース取込みが、本アッセイに対して律速である濃度であり、単離された含脂肪細胞におけるグルコース取込みを効率よく測定する濃度である。バイアルを激しくボルテックスし、分離のために沈下させた。非水性画分から14C−グルコースを完全に分離するために、この分離手順を3回繰り返した。計測のため、非水性画分を新たなバイアルに移した。実験を3回行い、タンパク質の量および細胞の数の両方に対して標準化を行った。標準化とは関係なく結果は類似していたが、データは、タンパク質の量に対して標準化したものとして示されている。グループ間の比較をスチューデントのt検定の分析を用いて行った。
<細胞培養およびトランスフェクション>
3T3−L1線維芽細胞(アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション)を上述のように培養し分化させた(Reed and Lane, PNAS, 77, 285-289, 1980)。この分化プロセスが完了した後、細胞を規定通りに7日以内に用いた。ここでは、95%を超える細胞が含脂肪細胞の形態を示している培養物だけを用いた。3T3−L1含脂肪細胞は、上述のエレクトロポレーション法によってトランスフェクトされた(Min et al., Mol. Cell, 3, 751-760, 1999)。Cos−1細胞およびH2.35ヘパトーマ細胞に、Lipofectamine 2000(Invitrogen社)を製造業者の取扱説明書に従って用いてトランスフェクトした。
<3T3−L1含脂肪細胞におけるグルコース取込み>
インスリン刺激性グルコース取込みを、既に説明したように行った(Baumann et al., Nature, 407, 202-207, 2000)。
〔結果〕
〔高脂肪食が、遺伝子組み換えマウスにおけるNFkBの活性化をもたらす〕
NFκBの活性化は、従来、肥満に関与していたが、この活性化に関連する組織の範囲については、分かっていない。生きている動物におけるNFκB活性化を肥満がインビボでどのように制御するかを評価するために、食餌性肥満が、改変された遺伝子組み換えマウスに与える影響を、NFκB応答性プロモーター(HLLマウス)(Sadikot et al., Am. J. Respir. Crit. Care. Med., 164, 873-878, 2001)によって駆動するルシフェラーゼコンストラクトによって分析した。ルシフェリン基質を注射した後、高脂肪食を与えたHLLマウスは、普通食を与えた対照体と比べて、腹部の発光がおよそ2倍の増加を示していた(図28)。この増大されたシグナルに関与しているのはどの組織かを評価するために、臓器を切除し、個々に撮像した(図28)。高脂肪食の後、内蔵脂肪組織において、ルシフェラーゼレポーターがおよそ5倍に活性化された。この活性化は、組織重量を補正した後も維持されていた(図28および図52)。肝臓、腎臓、および大腿四頭筋において、導入遺伝子の顕著な活性化は、ほとんど見られなかった。
肥満誘導性炎症は、慢性疾患であり、他の炎症性刺激と比べて低悪性度の疾患であるといわれている(Hotamisligil, Nature, 444, 860-867, 2006; Shoelson et al., Gastroenterol., 132, 2169-2180, 2007; Wellen et al., J. Clin. Invest., 115, 1111-1119, 2005)。これを評価するために、普通食を与えたHLLマウスおよび高脂肪食を与えたHLLマウスにおけるNFκB活性化の度合いを、リポ多糖類(LPS)を注射する前および注射した後で比較した(図52)。検査した全ての組織(筋肉以外)では、LPS注射が、導入遺伝子を、定常レベルよりも著しく活性化させた。本発明は、特定の任意の機構に限定されるものではなく、本発明を実施するために該機構を理解することは必要ないが、これは、肥満において、NFκB活性化を導くシグナル伝達経路が、準最大ではあるが慢性的に活性化されているという意見を支持するものである。
NFκBが活性化される、脂肪組織内の細胞種を特定するために、対照食を与えたHLLマウス、および高脂肪食を与えたHLLマウスの脂肪組織について、免疫組織化学的分析を行った。ルシフェラーゼレポーターは、高脂肪を与えたマウスからの副睾丸脂肪体の脂肪組織マクロファージ(ATM)クラスタおよび含脂肪細胞において特異的に豊富であったが、対照食を与えたマウスからの上記細胞においては、特異的な豊富はみられなかった。高脂肪食を与えたC57Bl/6マウスにおける免疫蛍光法によれば、NFκB発現(RelA/p65)も、F4/80ATMクラスタにおいて、より集中していた(図29)。
〔高脂肪食が、白色脂肪組織および肝臓におけるIKKiの発現を増加させる〕
高脂肪食によるNFκB活性化の機構および結果を調べるために、肝臓および白色脂肪組織における、IKKファミリーメンバーをコードしている遺伝子の発現を、リアルタイムPCRによって測定した。図30に示すように、高脂肪食を与えることによって、肝臓におけるIKKα、β、およびTBK1の発現が、わずかではあるが無視できない程度に増加した。しかしながら、IKKiをコードしているmRNAは、高脂肪食を与えたマウスでは、対照食を与えたマウスと比べて、2.6倍増加していた。白色脂肪組織(WAT)では、IKKαは影響を受けなかったが、IKKβの発現は、高脂肪食によって1.7倍増加した。興味深いことに、IKKiおよびTBK1は、それぞれ、12倍および9倍増加した。これらの変化に関連する脂肪組織の細胞種を特定するために、含脂肪細胞を、遠心分離によって、SVFから分離した。高脂肪食を与えたマウスでは、含脂肪細胞内のIKKα、IKKβ、およびTBK1 mRNAの発現において、対照マウスと比べて2〜3倍の増加を示し、その一方で、IKKiの発現は、対照マウスと比べて28倍にまで増加した(図30)。しかしながら、高脂肪食を与えた後、これらのマウスからの脂肪組織内のマクロファージの数も著しく増加したものの(Weisberg et al., J. Clin. Invest., 112, 1796-1808, 2003; Xu et al., 糖尿病, 55, 3429-3438, 2003)、IKK遺伝子のうち、IKKiの発現だけが、白色脂肪組織から単離されたSVFにおいて上方制御(1.5倍)された。このため、IKKiは広範囲にわたって全体的に増加した。
対照食を与えたマウスおよび高脂肪食を与えたマウスからの白色脂肪組織における、IKKiタンパク質発現の細胞種特異性を決定するために、共焦点顕微鏡による免疫組織化学法(Lumeng et al., Diabetes, 56, 16-23, 2007)を、抗体に対して特異的なIKKiを用いて行った。既に報告されているように、高脂肪食は、含脂肪細胞の寸法を増大させた。対照食を与えたマウスからの脂肪組織は、M2極性化されたMGL1脂肪組織マクロファージ(ATM)の存在を示した(Lumeng et al., J. Clin. Invest., 117, 175-184, 2007)。一方、高脂肪食は、王冠様の構造に検出された、M1極性化されたマクロファージの増大された侵潤を生成した。IKKiは、対照食を与えたマウスからの脂肪組織において検出されたに過ぎず、その一方で、タンパク質は、高脂肪食を与えたマウスからの脂肪組織内の含脂肪細胞およびMGL、F4/80ATMの両方において観察されたが、MGL細胞においては観察されなかった。これらのデータは、高脂肪食によるIKKiの誘導が、主にM1極性化されたATM細胞において生じ、M2極性化された細胞においては検出されないことを示している。
また、IKKiタンパク質レベルをウエスタンブロッティング法によって観察した(図31)。マウスに対照食または高脂肪食を与え、副睾丸脂肪組織および肝臓を除去し、溶解し、抗IKKi抗体を用いて免疫ブロットした。対照として、IKKiノックアウトマウス(Tenoever et al., Science, 315, 1274-1278, 2007。当該文献は参照として本明細書に組み込まれる)も検査した。IKKiの発現は、普通食を与えた野生型マウスからの肝臓または白色脂肪組織においては低かったが、高脂肪食を与えたマウスからの肝臓または白色脂肪組織においては、著しく増加していた。これは、図30において報告されたRNAレベルとよく相関している。対照的に、ノックアウトマウスからの組織においては、IKKiは見られなかった。興味深いことには、IKKiノックアウトマウスでは、他のIKKアイソフォームのいずれも上方調制御されていなかった。これは、補償作用が生じなかったことを示唆している(表2)。
Figure 2011518126
高脂肪食によるIKKiの誘導により、対照食を与えたマウスおよび高脂肪食を与えたマウスからの組織におけるIKKiタンパク質キナーゼ活性の増大が促進した。本発明を開発する間に行われた実験において、IKKiのインビトロ免疫複合体キナーゼアッセイを開発した。抗体がIKKiに対しては特異的であるが、それに関連するタンパク質TBK1に対しては特異的でないことを確認するために、FLAG−タグ付きIKKiおよびTBK1を、Cos細胞においてそれぞれ発現させ、抗IKKi抗体または抗FLAG抗体によってタンパク質を検出した。図53に示されるように、抗FLAG抗体は、溶解物において両方のタンパク質の同様の発現を検出した。抗TBK1抗体は、FLAG−TBK1を特異的に検出した。その一方で、抗IKKi抗体は、FLAG−TBK1と交差反応せずに、FLAG−IKKiを特異的に検出した。普通食を与えたマウス、または高脂肪食を与えたマウスの脂肪組織および肝臓の両方から調製された溶解物から免疫沈降させたIKKiのキナーゼ活性に関する比較を行った。IKKiキナーゼ活性は、高脂肪食を与えたマウスからの肝臓およびWATでは、対照食を与えたマウスに対して、3.7倍および1.5倍増加していたが、酵素の比活性の増加は明らかではなかった(図31)。
〔IKKiノックアウトマウスは、高脂肪食において、体重増加が減少し、エネルギー消費が増加したことを示す〕
本発明は、任意の特定の機構に限定されるものでなく、本発明を実施するためにはこの機構を理解する必要はないが、高脂肪食を与えた後にIKKi遺伝子およびタンパク質の発現が著しく増大することは、このタンパク質が、肥満とインスリン抵抗性との間のつながりを示しているという考えを導く。エネルギーバランスの調整におけるIKKiの役割を、IKKi遺伝子が標的除去されたマウス(Tenoever et al., Science, 315, 1274-1278, 2007。当該文献は参照として本明細書に組み込まれる)を評価することによって調査した。普通食を与えている場合、IKKiノックアウトマウスは、それらの野生型の対照体とそれほど相違しなかった(表3)。これらのマウスの体重は、同様であり、これらのマウスの、グルコース、インスリン、および非エステル化脂肪酸の血中濃度は、大体同じであった。しかしながらトリグリセリドについては、IKKiノックアウトマウスにおいて、わずかに低かった。しかし、3ヶ月間高脂肪食を与えた後、野生型の対照体は、20グラム近く重たくなっていたが、IKKiノックアウトマウスは、わずかしか増量していなかった(およそ12グラム)。これは、IKKiの欠損が、マウスを食餌性肥満から保護したことを意味している。
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次に、マウスの身体組成を、NMR分析装置を用いて検査した(表4)。除脂肪体重および脂肪体重の割合は、普通食を与えた野生型マウスとIKKiノックアウトマウスとの間では、類似していた。高脂肪食を3ヶ月間与えると、対照マウスおよびノックアウトマウスの両方において、脂肪体重の割合が増大し、除脂肪体重の割合が減少した。白色脂肪組織(WAT)および腓腹筋/大腿四頭筋の組織重量も測定した。図54に示されるように、普通食もしくは高脂肪食を与えた野生型マウスとノックアウトマウスとの間では、体重あたりの組織重量において、著しい差異は観察されなかった。これとは対照的に、高脂肪食により、対照マウスの肝重量が大幅に増大したが、この食事による増大は、ノックアウトマウスにおいては観察されなかった。
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次に、含脂肪細胞の寸法を、高脂肪食を与えた野生型対照マウスとノックアウトマウスとの間において、比較した。細胞の大きさを、部位間の寸法の差異を回避するために脂肪体の同じ区域からの白色脂肪区域において、可視化すると共に定量した。図32に示されるように、高脂肪食を与えた場合、IKKi KOマウスからの含脂肪細胞は、野生型マウスからの含脂肪細胞よりも著しく小さかった。興味深いことには、含脂肪細胞は、小さかったが、高脂肪食を与えたマウスからの副睾丸脂肪体内の細胞の数は、一貫して、10〜15%増加していた(図33)。
最初にアディポネクチンを確認して(図33)、血清アディポカイン量を測定した。普通食を与えたマウスでは、差異は検出されなかったが、高脂肪食を与えたノックアウトマウスにおいては、血清アディポネクチン量が野生型の対照体と比べて著しく高かった。既に報告されているように(Kadowaki et al., J. Clin. Invest., 116, 1784-1792, 2006)、体重あたりのアディポネクチンの量は、高脂肪食を与えた後の野生型マウスにおいて、およそ33%減少した。驚くべきことに、この高脂肪食に誘導された減少は、IKKiノックアウトマウスでは、ほぼ完全に妨げられていた。高脂肪食が、野生型マウスにおいて、血清レプチン値を8.5倍増加させた(図33)が、普通食もしくは高脂肪食を与えたIKKiノックアウトマウスのレプチン値は、野生型マウスと比べて、およそ40%低かった。これは、おそらく、含脂肪細胞の寸法が小さく、レプチン感度が高いことを反映している。
体重は、食糧摂取量およびエネルギー消費のネットバランスを示している。IKKiノックアウトマウスは、普通食もしくは高脂肪食を与えた野生型マウスよりも、体重あたりの日常食糧摂取量が高かった(図33)。本発明は、任意の特定の機構に限定されるものでなく、本発明を実施するためにこの機構を理解する必要はないが、これは、ノックアウトマウスのレプチンの血中濃度が低いことに関係している可能性がある。その後、エネルギー消費を間接熱量測定法によって検査した。72時間の実験の間、O消費量は、普通食を与えた野生型対照マウスおよびIKKiノックアウトマウスの両方において類似していた(図20)。高脂肪食では、野生型マウスでは、O消費量においてほとんど変化を示さなかったが、IKKiノックアウトマウスは、この条件下において著しい増加を示した。この違いは、明期と暗期とを通してずっと一貫しており、高脂肪食を与えたIKKiノックアウトマウスのエネルギー消費の増加を示していた。燃料分配パターンの測定値としての、呼吸商(RQ=VCO/VO)も比較した。RQは、両遺伝子型で、普通食を与えたマウスにおいて、0.85と1.0との間で変動し、高脂肪食を与えたマウスにおいて、0.8と0.9との間において変動した。普通食もしくは高脂肪食を与えたWTマウスとKOマウスとの間では、呼吸商の違いは見つからなかった(図20および図21)。総合すると、これらのデータは、IKKi KOマウスが、おそらくエネルギー消費が増加したことによって、食餌性肥満から保護されていたことを示唆している。
IKKiノックアウトがRQに影響を与えないことは、炭水化物と脂質との間の燃料選択に差異がないことを示唆している。この示唆によって、我々は、エネルギー消費の増加が、産熱の増加に対して二次的に生じるか否かを調べた。このため、普通食もしくは高脂肪食を与えた野生型およびIKKiノックアウトマウスからの白色脂肪組織において、脱共役タンパク質の発現を評価した(図34)。普通食を与えたマウスでは、UCP1mRNAが、野生型およびIKKiノックアウトマウスの両方のWATにおいて、わずかに検出可能であった。高脂肪食により、野生型マウスでは、UCP1 mRNAがおよそ2倍に増加したが、IKKiノックアウトマウスでは、10倍に増加した。UCP2 mRNAの発現は、変化しなかった。UCP1 mRNAのレベルおよびタンパク質レベルを、これらの動物からの褐色脂肪においても評価した。IKKiノックアウトマウスでは、対照動物と比較して、認識可能な差異は検出されなかった(図55)。白色脂肪組織におけるUCP1の発現増加による生理学的作用を特定するために、これらのマウスの直腸温を測定した(図34)。普通食および高脂肪食を与えたいずれの場合にも、IKKiノックアウトマウスにおいて、対照マウスと比べて、体温の著しい増加が見られた。IKKiノックアウトマウスは、高脂肪食を与えたそれらの野生型対照体よりも1.5℃高く、普通食を与えたマウスと比較すると上昇はより小さく、0.5C高かった。しかし、OXPHOS複合体サブユニットのウエスタンブロッティングによれば、IKKiノックアウトマウスの筋肉、WAT、またはBATにおいて、ミトコンドリア生合成の明らかな増加はなかった(図55)。
〔IKKiの遺伝子除去が、グルコースおよび脂質ホメオスタシスを改善する〕
IKKiノックアウトマウスは、食餌性肥満から保護されていたので、この遺伝子が、グルコース恒常性において何らかの役割を果たしているか否かを検討した。空腹時の血中グルコース値およびインスリン値を検査した。上述のように、空腹時の血中グルコース値およびインスリン値は、普通食を与えた野生型マウスとIKKiノックアウトマウスとの間では類似していた。高脂肪食を慢性的に与えることにより、野生型マウスの、空腹時の血中グルコース値およびインスリン値が増加した(図35)。これとは対照的に、高脂肪食を与えた場合の、IKKiノックアウトマウスの血中グルコース値およびインスリン値は、野生型マウスと比べてわずかに減少した。
肥満は、通常、高脂質血症と関連している。高脂肪食は、野生型マウスにおいて、全コレステロール値を大幅に増大させ、同時にトリグリセリドをわずかに増加させた。IKKiノックアウトマウスは、高脂肪食を与えた場合に、野生型マウスと比べて、空腹時の血清遊離脂肪酸のレベルの低減を示した(図35)が、空腹時の血清トリグリセリド値は、野生型と類似していた。IKKiの欠損が、結果的に、高脂肪食を与えたマウスのコレステロール値も著しく低減させたことは、予期していなかったと共に驚きであった。
IKKiが全身性グルコース恒常性に与える影響をより詳細に分析するために、普通食もしくは高脂肪食を3ヶ月間与えた後、腹腔内(IP)グルコース耐性試験およびインスリン耐性試験(GTT)を行った(図36)。野生型マウスおよびノックアウトマウスのどちらも、普通食において、通常のグルコース耐性を示した。高脂肪食では、野生型マウスが、耐糖能異常を示したが、IKKiノックアウトマウスは、通常のグルコース耐性を維持した。インスリン値も、GTTの間に、0、30、60、および180分の時点で検査した。インスリン値は、どの時点でも、野生型の対照体と比べて、IKKiノックアウトマウスにおいて低かった(図36)。インスリン耐性試験もまた、マウス間の差異を明らかにした(図23)。普通食を与えた遺伝子型の間では、差異は検出されなかったが、高脂肪を与えたIKKiノックアウトマウスは、野生型の対照体と比べて、インスリンのIP注射に、より感受性があった。
3ヶ月間高脂肪食を与えた後のこれらのマウスに、ピルビン酸塩耐性試験(PTT)も行った(図37)。ピルビン酸塩は、インスリンによって抑制されるプロセスであるグルコース新生の前駆物質である。ピルビン酸塩のIP投与をした後のいくつかの時点で、高脂肪食を与えた野生型マウスおよびIKKiノックアウトマウスの血中グルコースを測定した。血中グルコース値は、高脂肪食を与えたIKKiノックアウトマウスにおいて、野生型の対照体よりも著しく低かった。本発明は、任意の特定の機構に限定されるものでなく、本発明を実施するためにこの機構を理解する必要はないが、総合すると、これらの結果は、IKKiの欠損が、マウスを高脂肪食に誘導される耐糖能異常およびピルビン酸塩不耐性並びにインスリン抵抗性から保護したことを示している。
〔IKKiノックアウトは、高脂肪食を与えたマウスの肝臓細胞および脂肪細胞におけるインスリンシグナル伝達を保持する〕
IKKi遺伝子の標的破壊が高脂肪食を与えることの悪影響からマウスを保護することによる機構を調査するために、肝臓、脂肪、および筋肉のエクスビボのインスリンシグナル伝達経路を調査した。普通食もしくは高脂肪食を与えた野生型マウスおよびIKKiノックアウトマウスに、インスリンまたは生理食塩水を含むIPを注射した。10分後、肝臓、骨格筋、および脂肪組織を除去した。これは、ホスホAkt抗体を用いた免疫ブロットによって、インスリン刺激性リン酸化の事象を分析するためである。普通食を与えた野生型マウスおよびIKKiノックアウトマウスの両方からの肝臓において、インスリン注射が、Aktリン酸化を刺激した(図38)。既に報告されているように(Khamzina et al., Endocrinol., 146, 1473-1481, 2005)、マウスに高脂肪食を与えることは、野生型マウスにおいてインスリン反応を鈍くさせたが、IKKiノックアウトマウスは、通常のインスリン刺激性Aktリン酸化を示した。インスリン刺激性Aktリン酸化は、同様に、野生型マウスでは、高脂肪を与えた後の白色脂肪組織において減少したが、IKKiノックアウトマウスでは、減少しなかった(図38)。これらの違いにもかかわらず、インスリン刺激性Aktリン酸化は、対照食を与えたマウス、または高脂肪食を与えたマウスの筋肉では、遺伝子型間において類似していた(図38)。本発明は、任意の特定の機構に限定されるものでなく、本発明を実施するためにこの機構を理解する必要はないが、これらのデータは、IKKiが、局所性のインスリンシグナル伝達の負の調節因子であり得ることを示唆している。実際、筋肉において見られるIKKiのレベルは、極めて低く、高脂肪食は、筋肉におけるIKKiの発現に何の影響も与えていない。
次に、IKKiノックアウトマウスからの肝臓においてインスリン感受性を増大させる原因となり得る下流経路を評価するために、肝臓の遺伝子発現を、マイクロアレイによって検査し、変化をリアルタイムPCRによって確認した。肝臓mRNAを、2つのグループの空腹のマウス、すなわち、高脂肪食を与えた野生型マウスおよびIKKiノックアウトマウスから調製し、これらについてマイクロアレイ分析を行った。結果を表5に示した。これらの研究は、高脂肪食を与えたIKKiノックアウトと野生型対照体との間では、いくつかのタンパク質をコードしているmRNAのレベルにおいて有意な差異があることを明らかにした。際立った変化には、グルコース恒常性、ピルビン酸塩デヒドロゲナーゼキナーゼアイソフォーム4(PDK4)、およびグルコキナーゼに関連する2つの遺伝子が含まれ、小さな変化には、フルクトース1,6ビスホスファターゼ、およびリンゴ酸塩デヒドロゲナーゼに関連する遺伝子が含まれる。興味深いことには、ピルビン酸塩キナーゼ、PEPCK、またはグルコース−6−ホスファターゼmRNAにおいて何らかの変化が観察されたとしても、それはわずかであった。これらの遺伝子の影響がないことは、RT−PCRによって証明された。これについては、図56に示した。リアルタイムPCRデータは、IKKiノックアウトマウスにおいて、PDK4mRNA発現が、対照体と比べて66%低減されたことを確認した(図39)。PDK4は、ピルビン酸塩のデカルボキシル化に触媒作用を及ぼすピルビン酸塩デヒドロゲナーゼ複合体(PDC)をリン酸化すると共にその活性を阻害し、これによって、解糖作用を、TCA回路および脂肪酸合成にむすび付ける(Sugden et al., Am. J. Physiol. Endocrinol. Metab. 284, E855-862, 2003)。PDC活性の増大により、酸化に利用され得る基質が増加するが、グルコース新生のための基質が制限される。これは、PDK4活性の低減が、グルコースおよび脂肪酸酸化を増大させ、その一方で、グルコース新生を妨げることを示唆している。さらに、インスリンは、骨格筋およびヘパトーマ細胞におけるPDK4の発現を抑制し(Kwon et al., 糖尿病, 53, 899-910, 2004)、PDK4ノックアウトマウスは、血中グルコースがより低いが、循環する遊離脂肪酸のレベルおよびトリグリセリド値(Jeoung et al., Biochem. J. 397, 417-425, 2006)はより高くなる。肝臓グルコキナーゼは、グルコースをグルコース−6−リン酸塩に変換する。肝臓グルコキナーゼは、解糖作用を制御する律速酵素である。リアルタイムPCRデータは、グルコキナーゼmRNAの発現が、高脂肪食を与えたIKKiノックアウトマウスにおいて2倍に増大したことを確認した(図39)。従って、PDK4が低減し、グルコキナーゼが増大することが、解糖作用によるグルコースの流量を増大させ、ピルビン酸塩耐性の改善、およびIKKi KOマウスにおいて観察される遊離脂肪酸のレベルの低下の原因となる。
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肝臓の遺伝子発現に与える直接的な影響に加えて、IKKiノックアウトマウスの肝臓のインスリン感受性が増大することは、部分的に、アディポネクチンの血中濃度が増大することに対して二次的に起こり得る。このアディポカインは、主に、含脂肪細胞によって生成され、高濃度で血清中を循環する。すなわち、その含脂肪細胞におけるmRNA発現は、インスリン抵抗性と逆の相関がある(Kadowaki et al., J. Clin. Invest., 116, 1784-1792, 2006)。上述のように、このアディポカインの血中濃度は、高脂肪食を与えた場合では、野生型マウスよりも、IKKiノックアウトマウスにおいて高かった(図33)。白色脂肪組織におけるアディポネクチンmRNA発現を、リアルタイムPCRによって検査した。図39に示されるように、アディポネクチンmRNAの発現は、高脂肪食を与えた野生型マウスに由来する白色脂肪組織において低かった。野生型の対照体とは異なり、この低下は、IKKiノックアウトマウスにおいて妨げられた。これは、アディポネクチンの血中濃度と極めて相関している(図33)。
アディポネクチンは、PPARγの活性によって制御される(Semple et al., J. Clin. Invest., 116, 581-589, 2006)ので、PPARγの発現がIKKiの非存在下において誘導されるかを決定するために、PPARγの発現を特定した。白色脂肪組織におけるPPARγmRNAのレベルは、高脂肪食を与えた後にも低減し、野生型の対照体と比べて、IKKiノックアウトマウスにおいて増加した(図39)。PPARγによって制御される遺伝子CD36、CAP、およびGLUT4も、エンコードされたタンパク質(図40)において示されるように、これらのマウスからの含脂肪細胞において上方制御された。これは、さらに、PPARγ活性がこれらのマウスからの脂肪組織において、増大したことを示している。最近の研究は、リピン1が、直接、PPARγと相互作用し、その転写活性を増加させることを示している(Koh et al., J. Biol. Chem., 283, 34896-34906, 2008)。3T3−L1細胞におけるリピン1の過剰発現は、C/EBPα、PPARγ、GLUT4、およびaP2を含む脂肪生成遺伝子のmRNAレベルを増加させた。さらに、マウスにおけるリピン1の突然変異(fld)が、リポジストロフィの表現型およびインスリン抵抗性を生成する。これは、インスリン感受性の維持におけるリピン1の欠くことのできない役割を示唆している(Koh et al., J. Biol. Chem., 283, 34896-34906, 2008; Phan et al., J. Biol. Chem., 279, 29558-29564, 2004)。高脂肪食を与えた場合では、IKKiノックアウトマウスは、対照マウスと比べて、ほぼ2倍のレベルのリピン1mRNAおよびタンパク質を示した(図41)。これは、高脂肪食を与えたノックアウトマウスの脂肪組織ではインスリン反応が通常であることの手がかりを提供している。
インビトロで単離された含脂肪細胞のインスリン感受性を、グルコース輸送の代理として、グルコース濃度が低い状態での脂質の生成速度を分析すること(Lesniewski et al., Nat. Med., 13, 455-462, 2007)によって、測定した。対象食または高脂肪食を与えた後に、野生型マウスおよびノックアウトマウスから、副睾丸脂肪体の含脂肪細胞を分離した。インスリンの存在下または非存在下で、細胞を[14C]グルコースとともに培養し、溶媒抽出後に、脂質内への取り込みを決定した。図42に示されるように、対照食を与えた野生型マウスに由来する含脂肪細胞は、インスリンに反応し、脂質生成を2倍に増加させた。しかし、高脂肪食を与えた野生型マウスに由来する含脂肪細胞は、インスリンにほとんど完全に反応しなかった。一方、高脂肪食を与えたIKKiノックアウトマウスから単離された含脂肪細胞において測定されたインスリン刺激性脂質生成は、インスリン反応を維持していた。これは、インスリンを用いて処理した後にほぼ2倍の刺激を示している。
高脂肪食が与える悪影響に対するIKKiノックアウトマウスにおける抵抗が、細胞自律的であるかを決定するために、高脂肪食によって生成されるIKKiの発現増加を、3T3−L1含脂肪細胞において酵素を過剰発現させることによって、模倣することを試みた。細胞に、エレクトロポレーションによって、野生型IKKiまたはIKKiのキナーゼ不活性型突然変異体を発現するコンストラクトをトランスフェクトし、その後、インスリン刺激性グルコース取込みを分析した(Min et al., Mol. Cell, 3, 751-760, 1999)(図42)。インスリン処理は、これらの細胞におけるグルコース輸送を10倍増加させた。キナーゼ−デッド型IKKi突然変異体のトランスフェクションは、何の影響も及ぼさなかった。一方、野生型IKKiの発現は、インスリン刺激性グルコース取込みを50%低減し、同時に、定常活性をわずかに増大させた。本発明は、任意の特定の機構に限定されるものでなく、本発明を実施するためにこの機構を理解する必要はないが、これらのデータは、インビボにおけるCAPの発現変化(Ribon et al., PNAS, 95, 14751-14756, 1998)およびGLUT4(Armoni et al., J. Biol. Chem., 281, 19881-19891, 2006)の発現変化と共に、含脂肪細胞におけるIKKiの発現増加がインスリン感受性を直接的且つ細胞自律的に低減させることを示唆している。
〔IKKiノックアウトマウスは、食事誘導性の肝脂肪症から保護される〕
マウスに高脂肪食を慢性的に与えると、肝重の拡大および脂質の蓄積を引き起こし、脂肪肝(脂肪症)を導く(Bradbury, Am. J. Physiol. Gastrointest. Liver Physiol., 290, G194-198, 2006; Postic et al., J. Clin. Invest., 118, 829-838, 2008)。IKKiノックアウトによってマウスが高脂肪食誘導性の脂肪症から保護され得るかを決定するために、分析を行った。図43に示されるように、高脂肪食は、野生型の対照体の肝重を増大させた。予期していなかったことに、IKKi KOマウスの肝重は、高脂肪食を与えた野生型マウスの肝重よりも著しく少なかった。IKKi KOマウスが脂肪症に罹らなかったことは、肝臓の検査から明らかであった。この肝臓は、野生型の対照体の肝臓よりも著しく黒かった(図43)。高脂肪食を与えた野生型マウスおよびIKKiノックアウトマウスの肝臓における、トリグリセリド蓄積を評価し、H−E染色によって、形態を検査した。IKKiノックアウトマウスの肝臓のトリグリセリド含有量は、満腹時または空腹時において高脂肪食を与えた後では、野生型マウスの肝臓のトリグリセリド含有量よりも著しく低かった(図44)。普通食を与えた野生型マウスとノックアウトマウスとの間では、肝臓トリグリセリドに違いは見られなかった。さらに、H−E染色によって可視化されたように、高脂肪食は、野生型の肝臓において多数のマクロ脂肪症を引き起こした。これに対して、IKKiノックアウトの肝臓は、肝細胞内に極めてわずかの脂質しか蓄積しなかった(図44)。これは、肝臓のトリグリセリドの減少と極めて相関している。本発明は、任意の特定の機構に限定されるものでなく、本発明を実施するためにこの機構を理解する必要はないが、これらのデータは、IKKiノックアウトマウスが、食事誘導性の肝脂肪症から保護されていることを示唆している。
最近の研究は、肝脂肪症とインスリン抵抗性との間の相互関係を示している(Postic et al., J. Clin. Invest., 118, 829-838, 2008; Sanyal, Nat. Clin. Pract. Gastroenterol. Hepatol., 2, 46-53, 2005)。肝臓における過多の脂肪蓄積は、脂肪送達の増大、合成の増大、酸化の低減、および/またはVLDLの形態での脂肪の運び出しの低減の結果として生じ得る(Postic et al., J. Clin. Invest., 118, 829-838, 2008)。脂肪症の発現に対するIKKi KOマウスの耐性の基底にあるこの機構をより詳細に説明するために、脂質代謝に関連がある肝臓の遺伝子の発現を調査した。興味深いことには、野生型マウスとノックアウトマウスとの間では、FAS、ACC1、およびScd1を含む脂質合成酵素の発現において、またはAcox1、Acad1、CPT1a、およびMCADを含むβ酸化に関連する酵素の発現において、大きな違いは検出されなかった(これらの遺伝子は全て、高脂肪食に対して予期される反応を示したが)(図57)。リピン1の発現は、肝臓からのVLDL−トリグリセリドの放出を低減し(Chen et al.,Arterioscler. Thromb. Vasc. Biol. 28, 1738-1744, 2008)、VLDL−トリグリセリドの欠損は、脂肪肝およびインスリン抵抗性と関連している(Xu et al., Deabetis, 55, 3429-3438, 2006)。興味深いことに、リピン1のmRNAレベルおよびタンパク質レベルは、対照食を与えたIKKiノックアウトマウス、および高脂肪食を与えたIKKiノックアウトマウスにおいて増大した(図45)。
CD36は、原形質膜脂肪酸トランスポータである(Ibrahimi etalcurr. Opin. Clin. Nutr. Metab. Care, 5, 139-145, 2002)。最近の研究では、LXRαの活性化がCD36の発現を誘導でき、これにより、肝脂肪症の原因となり得ることが示されている一方、CD36ノックアウトマウスにおいてはLXRα誘導性の脂肪症がなくなっていることが示されている(Zhou et al., Gastroenterol., 134, 556-567, 2008)。CD36の発現は、野生型マウスにおいては、高脂肪食を与えることに応じて増大する。普通食および高脂肪食を与えたIKKiノックアウトマウスにおいては、このmRNAの発現は、野生型マウスと比べて大幅に低減された(図45)。さらに、高脂肪食に誘導された肝臓のFABP4およびPPARγの発現の増加が、IKKiノックアウトマウスにおいて、部分的に阻止された(図45)。従って、脂質蓄積の低減に対して、どの影響が一次的であるか、二次的であるかを特定することは不可能であり、本発明は任意の特定の機構に限定されるものでなく、本発明を実施するためにこの機構を理解する必要はないが、IKKiノックアウトマウスは、CD36、PPARγおよびFABP4発現の直接的な阻害、ならびにリピン1の発現の増大が部分的には要因となり、食事誘導性の肝脂肪症から保護されたことは想定可能である。
肝細胞におけるIKKiのレベルの増大によって、高脂肪食が遺伝子発現に与える影響を細胞自律的に再現可能であるかを決定するために、H2−35ヘパトーマ細胞に、野生型またはキナーゼ不活性のIKKiをトランスフェクトし、その後、選択された遺伝子のmRNAレベルの分析をRT−PCRによって行った。これらの細胞では、野生型およびキナーゼ−デッド型IKKiの両方において、およそ20%の効率で、およそ3倍の過剰発現が得られた(図46)。興味深いことには、野生型キナーゼの発現により、PDK4の発現がおよそ2倍増大し、ランテスmRNAの発現が5倍増大した。これに対して、キナーゼ−デッド型酵素の過剰発現は何の影響も与えなかった。これらのデータは、肝臓の遺伝子発現におけるIKKiに依存した変化が、直接的且つ細胞自律的であり得ることを示唆している。
〔IKKiノックアウトマウスは、慢性的な炎症、食事誘導性炎症から保護されるが急性炎症からは保護されない〕
最近の研究は、肥満が、前炎症性のM1極性化マクロファージの脂肪組織内への侵潤によって(Lumeng et al., J. Clin. Invest., 117, 175-184, 2007)、およびこれら脂肪組織マクロファージから分泌されたTNFα,MIP−1αおよびIL−6といった前炎症性サイトカインのレベルの上昇によって(Hotamisligil et al., Nat. Rev. Immunol., 8, 923-964, 2008; Wellen et al., J. Clin. Invest., 115, 1111-1119, 2005)特徴付けられる、慢性的且つ低悪性度の炎症の状態と関連することを示している。慢性的に高脂肪食を与えることによる先天性免疫応答におけるIKKiの役割を調査するために、野生型マウスおよびノックアウトマウスの血清サイトカインのレベルを、ELISAによって測定した。図47に示されるように、TNFα、MCP−1、およびランテスの血中濃度は、普通食を与えた野生型の対照マウスとノックアウトマウスとの間では、類似していた。野生型マウスに高脂肪食を与えると、これら3つの前炎症性サイトカイン全ての分泌が増大する。TNFαは最大3倍に増加し、MCP−1は3.7倍に増加し、ランテスのレベルは最大2.2倍に増加した。興味深いことには、IKKiノックアウトマウスでは、これら3つのサイトカイン全ての血中濃度は、標準レベルに近かった。
脂肪組織におけるマクロファージ侵潤を細胞表面マーカー(Lumeng et al., Diabetes, 56, 16-23, 2007)で検査した。対照食を与えた、および高脂肪食を与えた、野生型マウスおよびIKKiノックアウトマウスからの脂肪組織切片において、免疫蛍光染色を行った。F4/80抗体で検出されたように(図)、高脂肪食を与えたIKKiノックアウトマウスからの脂肪組織は、野生型の対照マウスと比べて、極めてわずかなATM侵潤しか示さなかった。抗体で陽性に染色されたマクロファージの定量により、IKKiノックアウト脂肪組織において、ATM侵潤が90%弱まったことが示された(図47)。脂肪組織における、ケモカインおよびサイトカインmRNA発現もまた大幅に減少した。これは、ATM侵潤が低減したことに極めて相関がある(図48)。TNFα、ランテス、およびMIP1αをコードしているmRNAのレベルは、高脂肪食を与えた場合、野生型マウスと比較してIKKiノックアウトマウスにおいて大幅に減少した。しかし、MCP−1αおよびIP−10のmRNAのレベルは、影響を受けなかった。
肥満が、脂肪組織における炎症を誘導し得ることは明らかである一方、炎症は、肝臓においても同様に生じ得る(Sanyal, Nat. Clin. Pract. Gastroenterol. Hepatol., 2, 46-53, 2005; Schwabe et al. Am. J. Gastrointest. Liver Physiol., 290, G583-589, 2006)。RNAを、肝臓から単離して、リアルタイムPCRを行い、サイトカインをコードしているmRNAおよび他の炎症遺伝子レベルを測定した(図49)。慢性的な高脂肪食は、野生型の対照体の肝臓のTNFα、MCP−1、MIP−1αランテス、およびIP−10のmRNAレベルを増加させた。これら前炎症性タンパク質全てのmRNAにおける食事誘導による発現の増加は、野生型の対照体と比べてIKKiノックアウトマウスの肝臓において著しく減少していた。炎症の他のマーカーとして、iNOSの発現を、これらのマウスからの肝臓において検査した(図49)。INOSの発現は、野生型マウスに高脂肪食を与えたときに著しく増加し、この増加は、IKKiノックアウトマウスの肝臓においては、ほぼ完全に阻止された。
IKKiノックアウトマウスにおいては炎症が減少していると思われるため、慢性的な炎症に関連があると思われる肝臓、WATおよび筋肉組織内のシグナル伝達経路を分析した。多数の研究は、高脂肪食がJNK経路の活性を刺激すること(Hirosumi et al., Nature, 420, 333-336, 2002; Todoric et al., Diabetologia, 49, 2109-2119, 2006; Tuncman et al., PNAS, 103, 10741-10746, 2006)を示しており、これは、肥満をインスリン抵抗性に結びつけることに重要な役割を果たしている(Nakatani et al., J. Biol., Chem., 279, 45803-45809, 2004; Singh et al., Hepatology, 49, 87-96, 2009; Solinas et al., Cell Metab., 6, 386-397, 2007)と思われる。高脂肪の食事が与える悪影響に対するIKKiノックアウトマウスの抵抗において、この経路が果たす役割を判断するために、キナーゼの活性化をアッセイする代理として、普通食または高脂肪食を与えた野生型マウスおよびIKKiノックアウトマウスからの溶解物を免疫ブロットし、ホスホJNK抗体を用いて分析した。図50に示されるように、野生型マウスに慢性的に高脂肪食を与えると、JNKリン酸化が増大した。この増大は、肝臓、腓腹筋筋肉、および白色脂肪組織において見られた。興味深いことには、IKKiノックアウトマウスでは、3つ全ての組織において、JNKリン酸化レベルの低減を示した。これは、対照食を与えた野生型マウスに匹敵する。単離された含脂肪細胞およびSVFに由来する細胞におけるJNKリン酸化に関しても、同様の結果が観察された。これは、IKKiの欠損が、両方の細胞種における炎症反応に影響していることを示唆している(図58)。しかし、様々な細胞株におけるIKKiの過剰発現は、JNKのリン酸化を増大させなかった。これは、ノックアウトマウスのこの経路における低減が、脂肪蓄積が低減されたことに対して二次的に生じたものである可能性が高く、JNK経路は、IKKiの直接的な標的ではないという結論を導くことを示唆している。さらに、本発明は、任意の特定の機構に限定されるものでなく、本発明を実施するためにこの機構を理解する必要はないが、これらの組織におけるIκBのレベルは、IKKiの欠損によっては、変化しなかった。これは、IKKiが、IκBの安定性を維持することにおいて重要な役割を果たしてはいないことを示している。
総合すると、本発明は、任意の特定の機構に限定されるものでなく、本発明を実施するためにこの機構を理解する必要はないが、これらのデータは、IKKi遺伝子を標的除去することが、高脂肪食を与えることに応答した、低悪性炎症の発現を阻止することを示唆している。IKKiは、特定の炎症遺伝子の発現を直接制御することに関連しているIRF3およびIRF7のリン酸化を触媒することが知られているので、IKKiノックアウトマウスは、急性炎症性シグナルにも反応しないという仮説が考えられる。内毒素は、その細菌細胞壁成分であるリポ多糖類(LPS)のために、TLR4活性化を介して、強力な宿主免疫反応を刺激し、TNFα、MCP−1、ランテス、およびIL−6といった前炎症性サイトカインを誘導する。急性炎症反応におけるIKKiの役割を試験するために、野生型マウスおよびIKKiノックアウトマウスにLPS注射をした。LPS注射は、野生型マウスおよびノックアウトマウスの肝臓およびWATにおいて、IKKβおよびIκBのリン酸化を刺激し、2.5時間以内に、MCP−1およびランテスの血中濃度を著しく増大させた(図51)。しかし、IKKiノックアウトマウスでは、これらのサイトカインのレベルは、野生型の対照マウスと比べて変化しなかった。これらのデータは、以前の発見と一致している(Tenoever et al., Science, 315, 1274-1278, 2007。当該文献は参照として本明細書に組み込まれる)。本発明は、任意の特定の機構に限定されるものでなく、本発明を実施するためにこの機構を理解する必要はないが、これは、IKKiが、急性免疫反応には関与していないが、肥満症における慢性且つ低悪性炎症の状態を持続することにおいて役割を果たしていることを示唆している。
本明細書において言及した全ての公開文献および特許文献は参照として本明細書に組み込まれる。本発明は、特定の実施形態に関連して記載したものであるが、特許請求の範囲に記載した発明は、この特定の実施形態に不当に限定されるものではないことに留意されたい。実際、これらの本発明を実施するための記載された形態の、当該技術分野の当業者には明らかな様々な変更は、次の特許請求の範囲内にあることが意図されている。
3T3L1含脂肪細胞におけるインスリン刺激性のグルコース取込みをLPSが阻害することを示す図である。 インスリン刺激によるグルコース輸送担体Glut4の移動を、LPSが阻害することを示す図である。 LPSの作用におけるIKKアイソフォームの役割を示す図である。 LPSによるインスリン刺激性のグルコース取込みの阻害が、Ikkiのノックダウンによって阻害されることを示す図である。 ドミナントネガティブIkkiの過剰発現が、LPSの阻害作用を阻害することを示す図である。 (a)は、IKKi阻害剤5−(5,6−ジメトキシ−1H−ベンズイミダゾール−1−イル)−3−[[2−(メチルスルホニル)フェニル]メトキシ]−2−チオフェンカルボニトリルを示す図であり、(b)は、IKKi阻害剤が、インスリン刺激性のグルコース取込みにおけるLPSの減少を阻害することを示す図である。 含脂肪細胞をLPSを用いた処理がインスリン受容体(InsR)またはIRS−1のインスリン刺激性のチロシンリン酸化に作用しなかったこと、ならびにインスリン刺激の後に、IRS−1を用いて免疫共沈降させたPI−3’キナーゼの量が減少しなかったことを示す図である。 実施例1からのウエスタンブロットを示す図である。 LPSがアダプタータンパク質APSおよびCblのインスリン刺激性のチロシンのリン酸化を低減させることを示す図である。 実施例1から得られたウエスタンブロットを示す図である。 LPSが、IKKiの活性化によって、インスリン受容体のリン酸化を刺激することを示す図である。 既知のIKKiコンセンサス部位に基づいて予測される、インスリン受容体上にあるIKKiによるリン酸化部位を示す図である。 キナーゼ不活性のIKKiの過剰発現が、インスリン受容体のAPSへの結合を増進させることを示す図である。 インスリン受容体におけるセリン1035の突然変異が、インスリン刺激性のグルコース取込みに対するLPSの阻害作用を阻害することを示す図である。 マウスに高脂肪の食事を与えた後に、IKKiが脂肪組織において上方調節されることを示す図である。 Ikki遺伝子の除去が、高脂肪食に関する体重増加を防止することを示す図である。 IKKiノックアウトマウス(IKKiKO)の体重の増加が、高脂肪食および普通食を与えた野生型の同腹子のマウスよりも、有意に少なかったことを示す図である。 IKKiの遺伝子除去が、高脂肪を摂取させた後の脂肪組織の拡大を防止することを示す図である。 IKKi KOマウスの体重の減少が、小型脂肪細胞に起因していたことを示す図である。 IKKiの遺伝子除去が、マウスの呼吸を増進させることを示す図である。 IKKiの遺伝子除去が、マウスの呼吸を増進させることを示す図である。 IKKiKoマウスが、高脂肪食に対してグルコース耐性を維持していることを示す図である。 3ヶ月にわたって高脂肪食を与えた後のIKKiノックアウトマウスのインスリン抵抗性を示す図である。 (A)は、マウスIKKiのアミノ酸配列(配列番号10)のコンセンサス配列を示す図であり、(B)は、マウスIkkiの核酸配列のコンセンサス配列を示す図である。 (A)は、ヒトIKKiのアミノ酸配列(配列番号10)のコンセンサス配列を示す図であり、(B)は、ヒトIkkiの核酸配列のコンセンサス配列を示す図である。 ヒトインスリン受容体(配列番号14)の他の2つのスプライシング型のうちの一方のコンセンサスアミノ酸配列を示す図である。 高脂肪を与えたマウスに由来する脂肪組織において、IKKi酵素活性が対照マウスと比べて著しく増加していることを示す図である。 高脂肪食(HFD)が脂肪組織内のNFκB活性を増大させることを示す図である。 肥満マウスの脂肪組織マクロファージ(ATM)クラスタ内のNFκB発現の誘導を示す図である。 高脂肪食が、白色脂肪組織および肝臓におけるIKKiの発現を増大させることを示す図である。 白色脂肪組織および肝臓における高脂肪食誘導性のIKKi発現の増加に関するさらなる分析を示す図である。 IKKi KOマウスが、エネルギー消費の増加によって、食事による体重増加から保護されていることを示す図である。 IKKi KOマウスが、エネルギー消費の増加よって、食事による体重増加から保護されていることを表す、さらなる分析を示す図である。 IKKi KOマウスが、エネルギー消費の増加によって、食事による体重増加から保護されていることを表す、さらなる分析を示す図である。 IKKi KOマウスが、グルコースおよび脂質の恒常性の改善を示すことを示す図である。 IKKi KOマウスが、グルコースおよび脂質の恒常性の改善を示すを表す、さらなるデータを示す図である。 IKKi KOマウスが、グルコースおよび脂質の恒常性の改善を示すを表す、さらなるデータを示す図である。 IKKiノックアウトが、高脂肪食を与えたマウスの肝細胞および脂肪細胞において、インスリンシグナル伝達およびインスリン感受性を保護することを示す図である。 IKKiノックアウトが、高脂肪食を与えたマウスの肝臓および脂肪細胞において、インスリンシグナル伝達およびインスリン感受性を保護することを表す、さらなるデータを示す図である。 IKKiノックアウトが、高脂肪食を与えたマウスの肝臓および脂肪細胞において、インスリンシグナル伝達およびインスリン感受性を保護することを表す、さらなるデータを示す図である。 IKKiノックアウトが、高脂肪食を与えたマウスの肝臓および脂肪細胞において、インスリンシグナル伝達およびインスリン感受性を保護することを表す、さらなるデータを示す図である。 IKKiノックアウトが、高脂肪食を与えたマウスの肝臓および脂肪細胞において、インスリンシグナル伝達およびインスリン感受性を保護することを表す、さらなるデータを示す図である。 IKKiノックアウトマウスが食事誘導性の肝脂肪症から保護されていることを示す図である。 IKKiノックアウトマウスが食事誘導性の肝脂肪症から保護されていることを表す、さらなるデータを示す図である。 IKKiノックアウトマウスが食事誘導性の肝脂肪症から保護されていることを表す、さらなるデータを示す図である。 IKKiノックアウトマウスが食事誘導性の肝脂肪症から保護されていることを表す、さらなるデータを示す図である。 IKKi KOマウスにおいて、肥満誘導性の炎症が軽減されることを示す図である。 IKKi KOマウスにおいて、肥満誘導性の炎症が軽減されることを表す、さらなるデータを示す図である。 IKKi KOマウスにおいて、肥満誘導性の炎症が軽減されることを表す、さらなるデータを示す図である。 IKKi KOマウスにおいて、肥満誘導性炎症が軽減されることを表す、さらなるデータを示す図である。 IKKi KOマウスにおいて、肥満誘導性炎症が軽減されることを表す、さらなるデータを示す図である。 HFDを与えたHLLマウスのルシフェラーゼトランス遺伝子の活性化を示す図である。 本発明が完成するまでに行われた実験において用いた抗IKKi抗体の特性を示す図である。 普通食もしくは高脂肪食を与えたWTマウスおよびIKKi KOマウスの組織重量の測定値を示す図である。 普通食もしくは高脂肪食を与えたWTマウスおよびIKKi KOマウスの褐色脂肪組織における産熱遺伝子発現を示す図である。 普通食もしくは高脂肪食を与えたWTマウスおよびIKKi KOマウスの肝臓における、グルコース代謝関連遺伝子の発現を示す図である。 普通食もしくは高脂肪食を与えたWTマウスおよびIKKi KOマウスの肝臓における、脂質代謝関連遺伝子の発現を示す図である。 普通食もしくは高脂肪食を与えたWTマウスおよびIKKi KOマウスから単離された含脂肪細胞およびSVFにおける、炎症性シグナル伝達タンパク質の発現を示す図である。

Claims (16)

  1. インスリンシグナル伝達の異常を処置する方法であって、
    a)インスリンシグナル伝達の異常を生じているか、または当該異常を生じるおそれがある対象を用意するステップと、
    b)IKKiを阻害する薬剤の治療有効量を上記対象に投与するステップとを包含しており、
    投与する上記ステップが、上記対象におけるインスリンシグナル伝達の改善をもたらす、方法。
  2. 対象における体脂肪を減少させるか、または体脂肪の増加を予防する方法であって、
    a)体重超過または肥満体の身体組成を生じているか、またはそれらのいずれかを生じるおそれがある対象を用意するステップと、
    b)IKKiを阻害する薬剤の治療有効量を上記対象に投与するステップとを包含しており、
    投与する上記ステップが、上記対象における体脂肪の減少、または体脂肪の増加の防止をもたらす、方法。
  3. 診断方法であって、
    a)対象から試料を用意するステップと、
    b)IKKiタンパク質、IKKi転写物、リン酸化を受けているインスリン受容体、およびTLR4によって媒介されるリン酸化を受けているIKKiから成る群から選択される分子の、上記試料におけるレベルを測定するステップと、
    c)上記対象がインスリン受容体シグナル伝達の異常に関連する健康状態を生じているか、または当該健康状態を生じるおそれが高いか否かを決定するステップであって、上記対象が上記健康状態を生じているか、または当該健康状態を生じるおそれが高いことは、ステップb)において測定される上記分子のレベルが高いことによって示されるステップとを包含している、方法。
  4. 測定する上記ステップは、上記分子に特異的な薬剤の使用を含んでおり、当該薬剤が、核酸プローブ、非リン酸化型特異的抗体およびリン酸化型特異的抗体から成る群から選択される、請求項3に記載の方法。
  5. 上記分子の上記レベルが、上記健康状態と関連することが知られている基準、または上記健康状態を生じていない健康な個体からの基準と比較される、請求項3に記載の方法。
  6. IKKiを阻害する薬剤を同定する方法であって、
    a)IKKiを含んでいるポリペプチド、インスリン受容体を含んでいるポリペプチド、標識された3価のリン元素、およびIKKiを阻害する薬剤の候補物を、阻害剤の上記候補物の非存在下において上記IKKiポリペプチドよって上記インスリン受容体のリン酸化を促進するために十分な条件において、混合するステップと、
    b)上記インスリン受容体のリン酸化についての、上記IKKiポリペプチドの活性を決定するステップとを包含している、方法。
  7. IKKiを阻害する薬剤を同定する方法であって、
    a)インスリン受容体を含んでいる細胞または細胞の溶解物を用意するステップと、
    b)IKKi阻害剤の候補物に上記細胞を接触させるステップと、
    c)IKKi阻害剤の上記候補物が、上記インスリン受容体のリン酸化レベルおよびグルコースの代謝速度から成る群から選択される特性に影響を与えたか否かを決定するステップとを包含している、方法。
  8. 上記IKKi阻害剤がグルコースの上記代謝速度に影響を与えるか否かを決定する上記ステップは、上記細胞によるグルコース取込み、インスリン受容体のリン酸化状態、APSのリン酸化状態、Cblのリン酸化状態、TC10のリン酸化状態、GLUT4のグルコース輸送能、GLUT4の原形質膜への移動、および対照細胞に対する上記細胞の大きさから成る群から選択される特徴を測定することを包含している、請求項7に記載の方法。
  9. 上記細胞が、接触させる上記ステップの前にIKKi誘導剤を用いて処理される、請求項7に記載の方法。
  10. インスリンシグナル伝達の上記異常が、含脂肪細胞、脂肪組織のマクロファージ、脂肪組織、肝細胞および肝組織から成る群から選択される部位に生じる、請求項1、2または3に記載の方法。
  11. 上記対象は、肥満症、糖尿病およびインスリン抵抗性から成る群から選択される健康状態を生じているか、または当該健康状態を生じるおそれがある、請求項1、2または3に記載の方法。
  12. 投与する上記ステップは、グルコース代謝の増大、体脂肪の減少、体脂肪が増加していないこと、インスリン受容体シグナル伝達の促進、インスリン受容体のリン酸化レベルの低下、肝臓の慢性的な炎症の軽減もしくは予防、脂肪組織の慢性的な炎症の軽減もしくは予防、肝脂肪症の軽減もしくは予防、代謝エネルギー消費の促進、循環する遊離脂肪酸の低減、およびコレステロールの減少から成る群から選択される転帰をもたらす、請求項1または2に記載の方法。
  13. 上記インスリン受容体のリン酸化レベルの低下は、インスリン受容体の配列VKTVNES(配列番号15)のセリン残基に生じる、請求項3、6または7に記載の方法。
  14. 上記対象におけるIKKiに媒介されるIκBのリン酸化は、IKKiを阻害する上記薬剤によって影響を受けない、請求項1または2に記載の方法。
  15. 上記IKKi阻害剤は、ベンズイミダゾール置換されたチオフェン誘導体、siRNA、アンチセンスオリゴヌクレオチド、非リン酸化型に特異的な抗IKKi抗体、およびリン酸化型に特異的な抗IKKi抗体から成る群から選択された薬剤を含んでいる、請求項1、2、6または7に記載の方法。
  16. IKKi阻害剤の上記候補物を動物に投与するステップと、IKKi阻害剤の当該候補物が、当該動物におけるグルコース代謝を促進するか否かを決定するステップとをさらに包含している、請求項6または7に記載の方法。
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