JP4191255B2 - ケモカイン類に結合する可溶性ワクシニアウイルスタンパク質 - Google Patents
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Description
ケモカイン類は、白血球類の転送(trafficking)機能とエフェクター機能を調節しかつ炎症および病原体に対する宿主の防衛に重要な役割を演じている小型の分泌ポリペプチド類のファミリーである(D′SouzaおよびHarden 1996年;Fauci 1996年;Howard外1996年;Murphy 1996年;PremackおよびSchall 1996年;Baggiolini外1997年)。30種を超えるケモカイン類が確認されており、保存システインの数と配置に基づいて少なくとも3種の構造グループに分類される。すなわちCC(β)ケモカイン類、例えばRANTES(for regulation-upon-activation, normal T cell expressed and secreted)およびマクロファージ炎症性タンパク質の(MIP)−1α;CXC(α)ケモカイン類、例えばインターロイキン−8(IL−8)および増殖関連癌遺伝子の(GRO)−α;ならびにCケモカインのリンホタクチン(C chemokine lymphotactin)である。これらの異なるケモカイン類は、放出されて特定の細胞型と作用する。すなわち、多くのCCケモカイン類は、単球または胸腺リンパ球に対する誘引物質であるが、多くのしかし全部ではないCXCケモカイン類は好中球に対する誘引物質である。しかし、ケモカインの構造および他のリンパ球サブタイプに対する細胞特異性について規則はない。例えばCケモカインのリホタクチンはT細胞に対して選択的であり、CCケモカインのエオタキシン(eotaxin)は好酸球に対して特異的であり、そしてCXCケモカイン類のIFN−γ誘導型タンパク質(IP−10)およびIFN−γによって誘発されるモノカイン(Mig)は活性化されたT細胞を誘引する。
ケモカインの受容体(CKR)は7膜貫通ドメインタンパク質であり、Gタンパク質と共役して信号を伝達する。大部分のCXCケモカイン類は、単一のCKRだけに高いアフィニティを有している(IL−8はCXCR1とCXCR2に結合する例外である)が、大部分のCCケモカイン類は2種以上のCKRに結合する(Baggiolini外1997年)。
ケモカイン類の活性は、疾患を起こす過大な炎症を防ぐため、強く調節されている。動物モデルの抗体を中和することによるケモカイン類の阻害(Sekido外1993年)またはマウスケモカイン遺伝子の破壊(Cook外1995年)によって、ウイルス感染または他のプロセスが仲介する炎症において、ケモカイン類が生体内で重大な役割を演じていることが確認されている。細胞外結合ドメインだけを含有するサイトカイン受容体の可溶性バージョンを産生させることは、いくつかのサイトカイン類の活性を封鎖する生理学的な治療戦略を示す(Rose-JohnおよびHeinrich 1994年)。しかし、CKR類の7膜貫通ドメイン構造は、可溶性の抑制性CKRの構築を困難にするので、突然変異ケモカインアンタゴニスト、阻止ペプチド(blocking peptide)もしくは阻止抗体が、ケモカイン類の別のインヒビターとして評価中である(D′SouzaおよびHarden 1996年;Howard外1996年)。
CKRは、ウイルスが侵入し感染するためにCD4とともに必要な補助因子として作用することによって、HIVの伝播と播種に重要な役割を演じている(D′SouzaおよびHarden 1996年;Fauci 1996年)。CXCR4のCKRは、T細胞系親和性HIV分離株に対する補助因子であるが、CCR5(およびCCR3)のCKRは、マクロファージ親和性HIV株による感染に関与している。生体内でCCR5が重要であることは、CCR5遺伝子の突然変異体に対してホモ接合性(homozygous)の個体がHIVの感染に対して耐性であるという知見によって裏付けられている。ケモカイン類または突然変異ケモカインアンタゴニスト類がCKRに結合すると、HIVの感染を阻害するが、このことは、HIV−CKRの相互作用を阻害することがHIVに対する予防および治療の戦略として可能性があることを示している(D′SouzaおよびHarden 1996年;Fauci 1996年)。
ポックスウイルスは、細胞の細胞質内で複製し、そして転写とDNA複製のためのそれら自身の酵素を多数コードする一群の大型DNAウイルスである(Moss 1996年)。ワクシニアウイルス(VV)は、最も集中的に研究されているポックスウイルスであり、天然痘を根絶するために使用された生ワクチンとして有名である(Fenner外1988年)。1982年以来、VVは、発現ベクターとして、およびワクチンの研究にも広く使用されている(Moss 1991年)。VV株Copenhagenのゲノムは配列が完全に決定されており、約200個の遺伝子を含有している(Goebel外1990年)。そのゲノムの中心に近い遺伝子は、ポックスウイルス類間で最も高度に保存されており、その多くは、ウイルスの複製に必須のものである。対照的に、ゲノムの両端の方に位置している遺伝子は、異なるウイルス間で一層可変性であり、かつウイルスが複製するのに必須のものでないことが多い(Johnson外1993年)。これらの非必須ウイルス遺伝子のサブセットは、宿主免疫システムの特定の成分を阻害するのに重要であり、かつ多くはウイルスの毒性に影響する。したがって、VVなどのポックスウイルス類は、インターフェロン類、補体、サイトカイン類、ケモカイン類、炎症および発熱の作用を阻害できるタンパク質を発現する(AlcamiおよびSmith 1995年a;McFadden外1995年;Smith 1996年;Spriggs 1996年;Smith外1997年c)。これらのタンパク質の多くは、感染した細胞から分泌されて、溶液中または細胞表面の宿主因子に結合する。多くの場合、上記ウイルスタンパク質と、特定のリガンドに対する細胞表面受容体の細胞外リガンド結合ドメインとの間にはアミノ酸の類似性がある。これらの場合、前記のウイルス遺伝子は進化中に、宿主から誘導されたようである。
可溶性ケモカイン結合タンパク質は、ポックスウイルス中に、すでに検出されている。第一に、粘液腫ウイルスT7タンパク質は、最初、可溶性IFN−γRとして確認されたが(Upton外1992年)、ヘパリン結合ドメインを通じてある範囲のケモカイン類に結合して、感染組織中への細胞の湿潤に影響する(Mossman外1996年;Lalani外1997年)。このタンパク質は、国際特許願公開第WO96/33730号に記載され、CBP−1と呼ばれている。対照的に、VVなどのオルトポックスウイルス類由来のIFN−γRはケモカイン類に結合しない(Alcami外1998年)。第二に、VV株Listerは、感染細胞から分泌され、そしてヘパリン結合ドメインと異なるドメインを通じて、多種類のCCケモカイン類と結合するが(Graham外1997年;Smith外1997年a;Smith外1997年b;Alcami外1998年)、CXCケモカイン類とは結合しない(Smith外1997年a;Smith外1997年b;Alcami外1998年)可溶性の35kDaのタンパク質を発現することが実証された。このタンパク質はvCKBPと呼称されている(Alcami外1998年)。また、このタンパク質は国際特許願公開第WO97/11714号にp35として記載されている。非常に似ているタンパク質が、いくつかのしかしすべてではないVV株、牛痘ウイルス、レポリポックスウイルス類、ショープ線維腫ウイルス(SFV)および粘液腫ウイルスによって産生され(T1タンパク質と呼ばれている)、ならびに痘瘡主要ウイルスによって、例えばインド1967年のタンパク質G5Rが産生されている(Shchelkunov外1994年)。他のVV遺伝子はvCKBPに対して一層遠縁のタンパク質をコードしている。VV株Copenhagenにおいて、これはA41Lと呼ばれ(Goebel外1990年)そしてVV株WRでは元来SalF4Lと呼ばれたが(Howard外1991年)、SalF3Lと改名された(Smith外1991年)。それは以後、A41Lと呼ぶ、8個のシステイン残基のコ−アラインメント(CO-alignment)を含むA41LとSFVT1の関連が報告された(Howard外1991年)。また、Howard外1991年の報告は、炭水化物がアスパラギン残基を通じて連結する可能性がある部位、およびそのタンパク質に、小胞体膜を横切ってその細胞からトランスロケートさせる推定信号ペプチド(putative signal peptide)も報告した。他の著者は、A41Lと、VV Listerの35kDaのタンパク質と、SFVT1タンパク質との間に類似性はないと主張した(Martinez-Pomares外1995年)。配列が決定されている痘瘡主要ウイルスのすべての三つの株には、Harvey株において16Lと呼ばれているVV WR A41Lタンパク質(Aguado外1992年)、バングラデシュ−1975年株のA44L(Massug外1994年)およびインド1967年株のA46L(Shchelkunov外1994年)と比べてアミノ酸が95%以上同一のオープンリーディングフレーム(ORF)がある。
A41LがvCKBPに類似していることは、A41Lタンパク質が、vCKBPの場合と同様にケモカイン類と結合できることを示唆している(Alcami外1998年)。しかし、Alcami外(1998年)は、前記35kDaのタンパク質をコードする遺伝子が欠失したVV WRまたはVV Listerに感染した細胞の上澄み液(Patel外1990年)が、MIP−1α,RANTES,IL−8またはGRO−αに対して架橋できるタンパク質を含有していないと報告した(Alcami外1998年)。
遺伝子A41Lが、VVの16株および牛痘ウイルスの2株を含む試験されたオルトポックスウイルスの全株に感染した細胞から分泌される30kDaのタンパク質をコードしていることが発見されたのである。その上に、前記タンパク質は、配列データが入手できる痘瘡主要ウイルスの3株すべてから発現されると予測されている(Aguado外1992年;Massug外1994年;Shchelkunov 1995年)。前記タンパク質は、O−およびN−連結の炭水化物を含有している。A41L遺伝子を欠いているVV WR欠失突然変異体が構築され、野生型ウイルスおよび復帰ウイルスと同じ力価まで、細胞培養で複製することが分かった。表面プラスモンレゾーナンス(surface plasmon resonance)(BIAcore)にて、組換えバキュロウイルスが産生したA41Lタンパク質を使用して、そのタンパク質が、CXCケモカイン類のMigとIP−10に結合するが、他のCXC,CCまたはCのケモカイン類とは結合しないことが発見されたのである。
この発明は、一つの側面で、A41Lタンパク質またはそのケモカイン結合フラグメントの有効量を、医薬として許容される担体とともに含有する医薬を提供するものである。
この発明は、特に、A41Lタンパク質またはそのケモカイン結合フラグメントの抗炎症薬としての使用に関する。A41Lタンパク質およびフラグメントは、ケモカイン類、特に、CXCケモカイン類とIFN−γ誘発ケモカイン類、例えばMigおよびIP−10が仲介する症状を治療するのに有用である。
また、この発明は、A41Lタンパク質またはケモカイン結合フラグメントの抗ウイルス薬としての使用に関する。A41Lタンパク質またはフラグメントは、細胞のケモカイン受容体を介して標的細胞の感染を仲介する、HIVなどの病原体の標的細胞に対する結合および/または標的細胞への感染を阻害する。
この明細書に記載する医薬は、治療および/または予防に有用である。
他の側面で、この発明は、遺伝子工学的に処理して、天然のA41Lタンパク質を発現できないようにした組換えポックスウイルスを提供するものである。
上記組換えポックスウイルスは、例えば、A41L遺伝子のすべてまたは実質的な部分が欠失していることによってケモカイン結合A41Lタンパク質を発現できないことが好ましい。その組換えポックスウイルスは、例えば遺伝子工学的に処理されたワクシニアウイルスでもよい。ワクシニアウイルスのMVAは、ワクチンに使用するため現在開発中であるが、この発明のこの側面に関連して特に重要である。ケモカイン結合A41Lタンパク質を発現できないように遺伝子工学的に処理されたMVAは、天然のA41Lタンパク質を発現する対抗物より安全でかつ免疫原性が低いという利点が予想される。
その外の側面で、この発明は、下記のステップ:
(a) A41Lタンパク質またはそのケモカイン結合フラグメントであるケモカイン結合分子を準備し;
(b) 前記ケモカイン結合分子を試料と接触させ;
(c) 前記ケモカイン結合分子と、試料中のケモカインとの相互作用を検出する;
ステップを含んでなる検出方法を提供するものである。
したがって、この発明は、生物試料中の1種以上のケモカイン類の存在を検出するのに使用できる。そのケモカイン結合分子は、固体支持体上に有用に固定化できる。
他の側面で、この発明は、試料を、A41Lタンパク質またはそのケモカイン結合フラグメントであるケモカイン結合分子の有効量と接触させることを含んでなる、試料中の1種以上のケモカイン類の活性を阻害する方法を提供するものである。
さらに別の側面で、この発明は、この明細書に記載されている方法または医薬に使用する精製A41Lタンパク質またはそのケモカイン結合フラグメント;およびこのような精製A41Lタンパク質またはフラグメントが入っているキットを提供するものである。
A41Lタンパク質のアミノ酸配列を図1に示す。図1に示したのは、VV WR A41Lタンパク質(受託番号D11079)の配列である。比較のため、VV Lister由来のvCKBPのアミノ酸配列(日本のDNAデータベース、受託番号D00612)も示してある。
この発明は、ワクシニアウイルス類および痘瘡主要ウイルス類を含むポックスウイルス類由来および他のウイルスまたは非ウイルスの起源由来のA41Lタンパク質(この明細書ではvCKBP−2とも呼称する)に関する。ウイルスA41Lタンパク質は、図1に示すA41Lのアミノ酸配列と約50%以上の同一性を有し、または図1に示すA41Lの配列と特に80%以上、もしくは90%以上、もしくは95%以上のアミノ酸同一性を有すると考えられる。同じか類似のケモカイン結合性能を有するA41Lタンパク質の細胞同族体は、図1に示す配列に対してアミノ酸の同一性がはるかに低く、例えば約25%であると考えられる。
異なる生物由来のA41Lタンパク質も、以下の共有特性によって確認できる。
− 分子内ジスルフィド結合を形成する、アミノ酸配列中の保存システイン残基。
− ケモカイン結合特性。
− 類似した大きさ。
− アミノ酸の同一性/類似性。アミノ酸が類似しているということは、アミノ酸残基の電荷および疎水性などの特性が類似していることを意味し、一つのアミノ酸が、他のアミノ酸の代わりに(そのタンパク質の構造に対して有意な影響を与えることなしに)保存的に置換されている場合、両者間に「類似性」がある。
− 酸性度;これらのタンパク質はすべて、適度に酸性である。このことはこれらタンパク質の機能と関連がある。というのはケモカイン類が塩基性タンパク質である傾向があるからである。VV WR由来のA41Lタンパク質の等電点は5.4である。
この発明に用いるA41Lタンパク質は、天然型または突然変異型で提供できる。公知の方法、特に遺伝子操作法を用いて、その天然タンパク質と比べ特性を変化させた該タンパク質の修飾バージョンを提供できる。所望の変化させる特性は、例えばケモカイン類に対する結合性を高めるため変化させる結合性能である。
また、この発明には、ケモカイン結合特性を有するA41Lタンパク質のフラグメントの使用も含まれる。これらフラグメントはA41Lタンパク質由来のペプチドである。このようなペプチドを使用することは、全タンパク質またはタンパク質の実質的部分を使用するより好ましい。というのは、例えば、ペプチドの免疫原性はタンパク質と比べて低いからである。このようなペプチドは、組換えDNA法および化学合成法を含む各種の方法で調製することができる。
この発明で使用するA41Lタンパク質は、特に組換えタンパク質として、各種の発現系で、各種の方法で調製できる。かような発現系としては、例えばポックスウイルスまたは非ポックスウイルスの発現系がある。バキュロウイルスの発現系または哺乳類細胞系の発現系などの標準系を使用できる。
図1は、VV WR A41Lタンパク質およびVV ListerのvCKBPの配列を示す。
図2は、VV株WR由来のA41LおよびVV株ListerのvCKBPのヒドロパシーのグラフを示す。
図3は、vΔA41Lおよび野生型ウイルスと復帰ウイルスの分析結果を示す。
図4は、A41Lを発現するバキュロウイルスに感染した細胞由来の上澄み液中に、組換えA41Lタンパク質が存在することを示す。
図5は、ウイルスに感染した細胞の上澄み液中にA41Lが存在していることを示す。
図6は、各種ポックスウイルスに感染した細胞の上澄み液中の抗A41L抗体によって認識されるタンパク質の存在を示す。
図7は、A41LおよびvCKBPの各種ケモカインとの結合を示すグラフである。
図8は、VV株WRのA41L遺伝子のヌクレオチド配列とフランキング配列を示す。
この発明を下記実施例でさらに説明するが、これら実施例はこの発明を例示することを目的とするものであり、あらゆる面でこの発明の範囲を限定するものではない。
実施例
材料と方法
細胞とウイルス
この試験に用いるオルトポックスウイルス株は外のところで述べられている(AlcamiおよびSmith 1995年b;Alcami外1998年)。10%ウシ胎仔血清(FBS)を補充したダルベッコの改良イーグル培地(DMEM)中のBS−C−1細胞内でVV株WRを増殖させ、次いでこれらの細胞上で、すでに報告されているようにして力価を測定した(Mackettら1985年)。D980RとCV−1の細胞は、10%のFBSを含有するDMEM中で増殖させた。
ケモカイン類
組換えヒトケモカイン類のIL−8、好中球活性化タンパク質(NAP)−2、GRO−α、血小板因子(PF)4、ストローマ由来因子(SDF)−1α、上皮好中球活性化タンパク質(ENA)−78、Mig、IP−10、RANTES、MIP−1α、MCP−1、MCP−2、エオタキシン(eotaxin)およびリンホタクチン(lymphotactin)はPeprotechから購入し、GRO−γとI−309はR&D Systemsから購入し、そしてアナフィラトキシンC5aはSigmaから購入した。
VV A41L欠失ウイルスとVV A41L復帰ウイルスの構築
A41L遺伝子を欠いているVV株WR突然変異体をトランジエント・ドミナント・セレクション(transient dominant selection)(FalknerおよびMoss 1990年)によって構築するのに適しているプラスミドを、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)とDNAクローン化によって組み立てた。A41L遺伝子の左側または右側に隣接するオリゴヌクレオチドを使用して、HindIIIとBamHI(左側)またはBamHIとEcoRI(右側)の制限酵素の末端部位を含有するPCR産物を生成させた。次に、これらのPCRフラグメントを、その末端で、適当な制限酵素によって消化し、次いで同じ酵素で切断されたプラスミドpSJH7中に逐次クローン化して(Hughes外1991年)、プラスミドpΔA41Lを生成させた。このプラスミドは、A41L ORF(コドン1〜201)の90%を欠いており、そしてA41L遺伝子を囲む配列に対して遠位のVVp7.5Kプロモーター(MackettおよびSmith 1982年)の制御下にあるエシェリキア・コリ(Escherichia coli)グアニルホスホリボシルトランスフェラーゼの遺伝子(Ecogpt)(BoyleおよびCoupar 1988年)を含有していた。このプラスミドのPCR誘導領域の配列の忠実度は、Applied Biosystems Inc.の373蛍光自動DNAシークェンサーを利用して、DNAの配列を決定することによって確認した。次に、0.05プラーク形成単位(pfu)/細胞で、VV株WRに感染させたCV−1細胞中に、プラスミドpΔA41Lをトランスフェクトした。2日後、その細胞中に存在するウイルスを収穫し、希釈し、用いて、報告されているように(FalknerおよびMoss1988年)、ミコフェノール酸(MPA)、キサンチンおよびヒポキサンチンの存在下、BS−C−1細胞の単層に感染させた。MPAの存在下でプラークが生成して、プラスミドpΔA41Lが、単一交差組換え事象によって組みこまれたためにEcogptを発現するウイルスを示した。MPAの存在下、BS−C−1細胞上で追加のプラーク精製を行った後、MPA耐性ウイルス分離株を用いて、報告されているように(KerrおよびSmith 1991年)、6−チオグアニン(6−TG)の存在下、D980R細胞の単層に感染させた。生成したプラークは、Ecogptカセットとプラスミドの配列が組換えによって失われた結果、野生型またはA41L失活突然変異体(ΔA41L)になったウイルス分離株を示した。これらのことは、A41L遺伝子に隣接するオリゴヌクレオチドを用いPCRによって識別した。プラークで精製した野生型ウイルス(vA41L)と、同じMPA耐性中間ウイルス由来の欠失突然変異体(vΔA41L)をプラークでさらに2回精製し、次に増幅し、次にさきに記載したように精製した(Mackett外1985年)。
A41L遺伝子がvΔA41L中に再挿入された復帰ウイルスを、プラスミドpA41Lを使用し、トランジエント・ドミナント・セレクション(FalknerおよびMoss1990年)で構築した。このプラスミドは、プラスミドpSJH7のSalI部位EcoRI部位の間にクローン化された完全なA41L遺伝子とフランキング配列を含有していた。pA41Lを、vΔA41Lを感染させたCV−1細胞中に、トランスフェクトし、次いで、上記のようにしてMPA耐性ウイルスを単離した。次に、このようなウイルスを6−TGの存在下、D980R細胞上にプレートし、次いで6−TG耐性ウイルスを、PCRによって(上記のようにして)、野生型A41Lゲノタイプについて検査した。さらにプラーク精製を行った後、このウイルスを増幅し精製してvA41L−revと呼称した。
ウイルス分離株のゲノム分析
ウイルスのvA41L、vΔA41LおよびvA41L−revをBS−C−1細胞内で増殖させ、次いでDNAを、先に述べたようにして精製されたウイルスコアから抽出した(Esposito外1981年)。次に、これらのDNA試料をPCRとサザーンブロッティング(Southern 1975年)によって分析した。PCR分析では、A41L遺伝子座に隣接するオリゴヌクレオチドを用いて、野生型と突然変異体のA41Lの対立遺伝子を識別した。サザーンブロット分析の場合、ウイルスDNAをEcoRVで消化し、0.8%アガロースゲルで電気泳動を行い、次いでナイロンフィルター(Hybond-N, Amersham)に移した。フィルターを、vΔA41Lから削除されたA41Lの領域内、またはその遺伝子の5′末端から左側隣接領域に延びる領域由来の、フルオレセインで標識されたDNAプローブとハイブリッドを形成させた。結合されたプローブを、ペルオキシダーゼ結合抗フルオレセイン抗体および強化化学発光(ECL)試薬(Amersham)で検出した。
組換えバキュロウイルスからのA41Lタンパク質の発現と精製
ORFの5′と3′それぞれに制限酵素部位HindIIIとXholを導入したA41L ORFを、オリゴヌクレオチドを用いてPCRによって増幅した。そのDNAフラグメントを、同じ酵素で消化し、次にHindIIIとXholで切断されたpBAC−1(R&D Systems)中にクローン化し、プラスミドpAcA41Lhisを生成させて、A41L ORFを、オートグラファ・カリフォルニカ(Autographa californica)核多角体病ウイルス(AcNPV)の多角体遺伝子プロモーターの下流に配置しそしてC末端において6個のヒスチジン残基に連結させた。プラスミドpAcA41Lhisを用いて、組換えバキュロウイルスを先に述べたようにして構築した(AlcamiおよびSmith 1992年;Alcami外1998年)。スポドプテラ・フルギペルダ(Spodoptera frugiperda)(Sf)細胞に、生産者の説明にしたがって、精製された線状AcNPV DNA(BacPAK6,Clontech)およびpAcA41Lhisをコトランスフェクトし(cotransfect)、次に組換えウイルスAcA41Lhisを単離した。AcA41Lhisの高力価のストック(108pfu/ml)を使用ストックから生成させて、10%FBSを含有するTC100培地内で10pfu/細胞にて、Sf21細胞に感染させた(プラスチックフラスコ中に2×105細胞/cm2で接種した)。3hr後、ウイルス接種物を除き、その細胞を洗い、次に血清なしのTC100で覆った。60hr後、上澄み液を集め、4℃で5分間、2000rpmで遠心分離にかけて(Beckman GPR遠心分離機のGH−3.7ローター)、細胞の破片を除き、0.2μmのフィルター(Nalgene)で濾過し、次いで、4℃で30分間、20000rpmで遠心分離にかけて(BeckmanL8−M超遠心分離機のSW28ローター)、ウイルス粒子をペレットにした。上澄み液を集め、20mM Tris−HCl(pH7.9)含有500mM NaClに対して透析し、次に、Ni2+キレートアフィニティークロマトグラフィーによって精製した。Ni2+を予め加えたニトリロ三酢酸(NTA)樹脂(Qiagen)を、結合緩衝剤(20mM Tris−HCl pH7.9,0.5M NaCl,5mMイミダゾール)中で平衡させた後、前記上澄み液と混合した。得られたスラリーを連続して3hr回転させ、結合緩衝剤50mlで洗浄し、続いて20mMのイミダゾール含有の結合緩衝剤50mlで洗浄し、次にカラムに注入した。そのカラムを、さらに、イミダゾールの濃度を50mMまで増大した結合緩衝剤を(0.2ml/minの流量で)用いて洗浄した後、結合されたA41Lhisタンパク質を、120mMイミダゾールで溶離させた。画分の一部を、10%ゲル上のドデシル硫酸ナトリウム−ポリアクリルアミドゲル電気泳動法(SDS−PAGE)(Laemmli 1970年)で分析し、次にクマシーブルーで染色することによって可視化した。溶出されたA41Lhisタンパク質を含有する画分を、プールし、50mM Tris−HCl pH7.0,20mM NaCl中に透析してイミダゾールを除いて、試料を調製し、mono−Qアニオン交換体(Pharmacia)を用いる高速タンパク質液体クロマトグラフィー(fast protein liquid chromatography)(FPLC)によってさらに精製し濃縮した。A41Lhisは、予想等電(pI)点が5.4であるので、pH7.0でmono−Qに容易に結合し、そして、20mM〜1MのNaClの勾配液10mlでカラムを洗浄すると400mM NaClで溶出した。画分のタンパク質濃度は、ブラッドフォード検定法と、SDS−PAGEでの既知濃度のBSA標準との比較によって測定した。
A41L単一特異性抗体を産生させるためのウサギの免疫感作
ニュージーランド白ウサギに、同容積のフロイントの完全アジュバントで乳化させた精製A41Lhisタンパク質80μgを筋肉内注射し、次にフロイントの不完全アジュバントに乳化させた同じ抗原200μgで、3週間の間隔をおいて3回、追加免疫を行った。免疫前血清と免疫血清の試料を、免疫感作前および最終免疫感作を行ってから2週間後に採取した。
イムノブロッティング
BS−C−1細胞を、37℃で1.5hr、10pfu/細胞にて、指定のオルトポックスウイルスに感染させ、未結合のウイルスを洗い流した後、その細胞を、血清を含有しない最少必須培地(MEM)内で16hr、インキュベートした。次に、感染させた細胞由来の上澄み液を、先に述べたようにして調製した(AlcamiおよびSmith 1995年b)。あるいは、Sf21細胞に、AcNPVまたはAcA41Lhisを、10pfu/細胞で感染させ、3日後、上澄み液を収穫し、遠心分離(2000xg、10分間、4℃)によって透明にした。試料はすべて、10%ゲルのSDS−PAGEによって分析した。タンパク質の電気泳動を行って、ニトロセルロース膜に移した後(Towbin外1979年)、そのブロットを、ウサギ抗A41L血清(1:2000の比率で希釈)、ヤギ抗ウサギペルオキシダーゼ接合体およびECL試薬(Amersham)とともに、すでに報告されているように(ParkinsonおよびSmith 1994年)および製造業者が指導しているようにして、逐次インキュベートした。
表面プラスモンレゾナンス(BIAcore分析)
BIAcoreのセンサーチップCM5のカルボキシメチル化デキストランの表面を、4個のフローセルのうち3個を通じて、前記チップ上、5μl/minの流量の、50mMのN−ヒドロキシスクシンイミド(NHS)と200mMのN−エチル−N′−(3−ジメチルアミノプロピル)カルボジイミド塩酸(EDC)で活性化した。その活性化されたチップの表面へのタンパク質のカップリングは、精製された、バキュロウイルス発現のA41Lhis(10ng/μl)と35Khis(10ng/μl)を含有する15mMアセテートpH4.0の35μlを、フローセル3と4それぞれを通じて、流量5μl/minで通過させることによって達成された。その次に、1Mエタノールアミン塩酸−NaOH pH8.5 35μlを、5μl/minの流量で、NHS/EDCで活性化されたフローセルを通じて通過させて、チップ表面を失活させた。各種の組換え化学誘引分子(例えば、アナフィラトキシンC5aおよびCXC,CCおよびCのファミリー由来のケモカイン類)を、0.005%のTween 20を含有するHEPES緩衝食塩水(HBS)(10mM HEPES、150mM NaCl、3mM EDTA)中1μMの濃度で、チップ表面にカップリングされるA41Hisまたは35KHisありまたはなしで、フローセル上を流量5μl/minで、CM5センサーチップ表面を横切って通過させた。前記化学誘引分子(分析対象物質)と表面にカップリングされたタンパク質(リガンド)との陽性の相互作用は、注入された分析対象物質がフローセルから溶出された後、最終ベースライン(応答単位)において増大することによって示された。分析対象物質を各々注入した後、センサーチップの表面を、5μl/minの流量の、0.1M HClの5μlパルスで再生させて、結合している分析対象物質を、チップ表面にカップリングされたリガンドから取り去り、次に注入される化学誘引分子に対するチップ表面を調製した。
ウサギの皮膚モデルにVVが誘発した傷害の組織学的な検査
VVのvA41L,vΔA41LおよびvA41L−revをPBSで希釈し、次いでこれらを、104,105または106pfu/部位で、雌のニュージーランドの白ウサギ(体重1.5kg)の左と右の側腹部にそって、皮下注射し、注射してから3日後にこれらのウサギを殺した。感染に使用したウイルス類の力価をプラーク検定法で確認した。注射の部位に生成した病変部由来の生検組織試料を、ドライアイス上のイソペンタンバス中のO. C. T. Tissue−Tek(Bayer Diagnostics)を用いて凍結して、凍結切片を作製した。その凍結切片(10μm厚)をスライドガラス(Horwell Superfrost)上に置いて、氷上で、2%(w/v)パラホルムアルデヒドで固定してPBC中の0.1%Triton−X100で膜透過性を与え、37℃で5分間クエンチし、0.2%(w/v)のグルコースおよび1mMアジ化ナトリウムを含有する0.1Mリン酸緩衝液(pH7.4)中のグルコースオキシダーゼ(0.5単位/ml)を用いて内因性ペルオキシダーゼを除き、PBS(0.1%Triton含有)で3回洗浄し、次に5%の正常ウマ血清(Sigma)で30分間ブロックした。その切片を、5%正常ウマ血清で1:100の比率で希釈したマウスの抗ウサギCD43抗体(Serotec)で(1hr)、免疫染色(immunostain)して湿潤しているリンパ球(特にTリンパ球、単球およびマクロファージ)を検出するか、または1:1000の希釈率で希釈したマウス抗14kモノクローナル抗体(MAb 5B4/2F2)(CzernyとMahnel 1990年)で(1hr)免疫染色して、切片中のVVの存在を検出する。これらの切片を、0.1%Tritonを含有するPBS内で洗浄し(3回)、続いて、1:100の比率で希釈したビオチニル化ウマ抗マウス二次抗体(Vector Laboratories)とともに30分間インキベートし、先に述べたのと同様にして洗浄し、次にVectastain Elite ABC Reagent(Vector Laboratories)で30分間処理した。5分間ずつ2回洗浄した後、免疫染色された切片を、色素原基質のジアミノベンジジンテトラヒドロクロリド(DAB)(Sigma)を、10mMイミダゾール中、0.5mg/mlの濃度で用いて可視化した。この基質は赤褐色の沈殿を生成し、続いて、(上記のようにして)さらに2回洗浄し次にPBSでもう一回洗浄した。その切片を、クレージルバイオレットアセテート(1%)で対比染色(counterstain)し、70%,80%,95%および無水のエタノールと濃度を上げたエタノールで脱水し、次いでDPX(BDH Merck)を用いてカバーガラスを取り付けた。これらの切片の組織学的検査を、Zeiss Axiophot写真用顕微鏡を用い明るいフィールド照明下で行った。
試験結果
A41Lタンパク質は、T1/35kDaタンパクのファミリーに関連している
A41L遺伝子は、219個のアミノ酸残基を有する25kDaのタンパク質をコードしていると予測されていた(Goebel外1990年;Howard外1991年)。コンピューターによる分析によって、このタンパク質はSFVT1タンパク質に関連していることが明らかにされた(Howard外1991年)。また上記A41L遺伝子の産物は、オルトポックスウイルス類およびListerを含むがWRを含まない各種のVV株によって発現される、最近報告されたケモカイン結合タンパク質のvCKBPと、25%のアミノ酸同一性を共有している(Graham外1997年;Smith外1997年a;Alcami外1998年)。これらの類似性を、VV WR A41Lタンパク質とVV ListerのvCKBP(Patel外1990年)を並べて、図1に示してある。またA41Lは、痘瘡ウイルス株バングラディシュ1975年由来のG5Rタンパク質(Massung外1994年)およびSFVT1タンパク質(Upton外1987年)にも関連している。VV株WRのA41Lタンパク質は、VV株コペンハーゲンのA41Lタンパク質(Goebel外1990年)と97.7%のアミノ酸同一性を有し、そして痘瘡ウイルス株Harveyの16Lタンパク質(Aguado外1992年)と97.7%のアミノ酸同一性を共有し、ならびに痘瘡ウイルス株バングラディシュ1975年由来のタンパク質A41L(Massung外1994年)および痘瘡ウイルス株インド1967年由来のタンパク質A46L(Shchelkunov外1994年)と類似の関連度を有している。8個のシステインの残基が保存されかつこれらのタンパク質の長さが類似していることに注目すべきである。A41L遺伝子の産物とvCKBPの両者は、データベースの他の非ウイルスタンパク質の配列と有意な類似性がない。また、VV A41Lタンパク質とvCKBPの間の関連は、これら二つのタンパク質の類似したヒドロパシィーのグラフ(図2)とそれらが酸性であること、pIがA41Lは5.4でvCKBPは4.3であることによって示されている。
A41L遺伝子は、細胞培養においてウイルスが複製するのに必須の遺伝子ではない
痘瘡ウイルス株Harvey、インド−1967年とバングラディシュ−1975年およびVV株のコペンハーゲンとWRのゲノムの配列分析結果は、VV WR A41Lタンパク質に均等のタンパク質が各ウイルス中に存在し、しかも高度に保存されていることを示した。このことは、A41Lタンパク質が、前記ウイルスに対して、重要な機能を持っている可能性があることを示唆している。このことをさらに探究するため、我々は、A41L遺伝子を欠いているVV欠失突然変異体を製造することを試みた。A41Lタンパク質は、VV Listerおよびいくつかの他のVV株のvCKBPに関連があるから(Alcami外1998年)、vCKBPは、機能的に、A41L遺伝子の喪失を補償する可能性があった。この起こりうる面倒なことを避けるため、VV株WRがvCKBPを発現しないのでこの株を選択した。A41Lは保存されているにもかかわらず、生存可能な欠失突然変異体が単離された。
vΔA41Lおよび野生型ウイルス(vA41L)と復帰ウイルス(vA41L−rev)のゲノムの分析結果は、これらが予想されたゲノム構造を有していることを示した(図3)。クローン化されていないWRウイルス、vA41LおよびvA41L−rev由来のEcoRVで消化したDNAは、1991bpのフラグメントを提供したが、このフラグメントは、遺伝子の5′領域から左のフランキング配列中に延びるプローブ、およびvΔA41Lから削除されている領域内の遺伝子の3′末端の近くからのプローブで検出された。予想通りに、この3′プローブは、vΔA41Lのいずれのフラグメントも検出せず、そして5′プローブは1391bpの小さいフラグメントを検出したが、これはA41LORFの大部分が喪失していることと一致している。ORFに隣接するオリゴヌクレオチドを用いてPCR分析を行うと、WR,vA41LおよびvA41L−revのウイルスの区別できない大きさのフラグメントおよびvΔA41Lの600ヌクレオチド小さいフラグメントが検出された(データは示されていない)。
細胞培養における、vA41L,vΔA41LおよびvA41L−revのウイルスの増殖は均等であった。各ウイルスによって、BS−C−1細胞に形成されたプラークは同じ大きさであり、そして1pfu/細胞でBS−C−1細胞に感染させた後24hr(24hpi)に産生された細胞内ウイルスの収量は各ウイルスについて区別できなかった(データは示していない)。
A41Lタンパク質の発現と精製
バキュロウイルスからA41Lタンパク質が発現されるのを実証するため、AcA41Lhisを感染させたSf21細胞の上澄み液中のタンパク質を、His(6)タグに対するモノクローナル抗体(Clontech)で免疫ブロットすることによって分析した(図4a)。この抗体は、AcA41Lhisが産生する30kDaのタンパク質を検出したが、AcNPVが産生する30kDaタンパク質を検出しなかった。このことは、A41Lタンパク質が、バキュロウイルスに感染した細胞から発現され分泌されたことを確証している。
A41Lhisタンパク質を、ニッケルアフィニティークロマトグラフィーによって、バキュロウイルスに感染させたSf21細胞の上澄み液から精製した(図4b)。A41Lhisは、クマシーブルーで染色することによって、細胞上澄み液中の支配的なタンパク質として検出された。A41Lhisタンパク質は、ニッケルカラムを、透明にした上澄み液を通過させることによって選択的に除去された。結合したA41Lhisタンパク質は、イミダゾールの濃度を上昇させるとカラムから溶出され、60mMのイミダゾールで大部分のA41Lhisタンパク質が溶出した。溶出されたタンパク質を、monoQカラムを使用するアニオン交換クロマトグラフィーとFPLCでさらに精製した。得られた精製タンパク質は、均質のようであるので(データは示していない)、ウサギの免疫化、および材料と方法の項で述べたBIAcore200の表面プラスモンレゾーナンス分析を行うために使用した。
A41Lタンパク質はVVに感染した細胞から分泌される
VVのA41Lタンパク質を確認して特性解析を行うため、ウサギを、精製されたA41Lhisタンパク質で免疫化することによって抗体を産生させ、その抗体を、イムノブロッティングに使用して、VVに感染させた細胞から産生されるA41Lタンパク質を検出した(図4)。30kDaのタンパク質は、WR,vA41LおよびvA41L−revに感染させた細胞の上澄み液中に検出されたがvΔA41Lに感染させた細胞の上澄み液中には検出されなかった(図5a)。感染中に、該タンパク質が産生されたことを確認するため、感染後、異なる時間に、または感染後にシトシンアラビノシド(araC)(ウイルスDNA複製の阻害剤であり、したがって中期および後期のタンパク質合成を阻害する)の存在下で、上澄み液を採取した(図5b)。A41Lタンパク質は、2hpiという初期に、araCの存在下で検出された。これは、このタンパク質が初期に発現されたことを示している。しかし、このタンパク質は、感染中、後期にも発現され、そのレベルは16hpiまで増加し続けた。その初期と後期の発現は、ポックスウイルスの発現ベクターとして広く使われている初期/後期のp7.5プロモーター(Smith 1991年)から発現されるvCKBPの発現に類似している。A41Lタンパク質は、ツニカマイシンまたはモネンシンの存在下で合成されると大きさが小さくなり、N−連結およびO−連結の炭水化物を含有している(図5c)。
A41Lタンパク質はオルトポックスウイルス中に保存されている
オルトポックスウイルスゲノムのDNA配列データは、A41L遺伝子が高度に保存されていることを示した。このことは、VVの16種の株および牛痘ウイルスの2種の株を感染させた細胞由来の上澄み液のイムノブロッティングによって、さらに検査した(図6)。そのデータは、これらのウイルスがすべて、類似した大きさのタンパク質を発現するが異なるレベルで発現することを示している。なおこのタンパク質は抗A41L抗体によって認識される。
A41Lタンパク質は、CXCケモカイン類のMigとIP−10に結合する
A41Lタンパク質がvCKBPに類似していることは、A41Lタンパク質が、vCKBPと同様に、ケモカイン類に結合できることを示唆している。しかし、VV WRに感染させた細胞由来の上澄み液は、ヒトCCケモカイン類のMIP−1αもしくはRANTESまたはヒトCXCケモカイン類のGRO−αおよびIL−8に結合するタンパク質を含有していないことを示した。A41Lタンパク質がその試験に含めなかった他のケモカイン類と結合するかどうかを確認するため、精製されたA41Lhisと35Khis(vCKBP)のタンパク質を、BIAcore200システム(Pharmacia)の別個のフローセル内の、NHSで活性化されたカルボキシメチル化セルロースCM5のバイオセンサーチップ上に、EDCを介して化学的に架橋結合させた。次に、そのチップ表面を、エタノールアミン塩酸を使用して失活させて、未結合のタンパク質を除去した。各種の組換えヒト化学誘引タンパク質(6種のCCケモカイン類、8種のCXCケモカイン類、Cケモカインのリンホタクチンおよび補体C5aアナフィラトキシンを含む)を、全フローセルのチップ表面を横切って逐次通過させた。各化学誘引タンパク質を、横切って通過させた後、塩酸(0.1M)を使用してチップ表面を再生させた。予想どおりに、CCケモカイン類のMIP−1αとMCP−1は、A41Lまたは対照と比較して、vCKBPに対し陽性の信号を与えた(図7b)。このことは、これらCCケモカインがvCKBPに結合するがA41Lには結合しないことを確証している。vCKBPまたはA41Lは、CXCケモカインのIL−8とNAP−2に対し非特異的な結合をすることが観察されたが、MigとIP−10はA41Lと特異的に結合した(図7a)。試験された他のケモカイン類:NAP−2,GRO−α,GRO−γ,PF4,SDF−1α,ENA−78,RANTES,MCP−2,エオタキシン,I−309,リンホタクチン,およびアナフィラトキシンC5aはすべて、A41Lが結合しなかった(データは示していない)。
A41Lタンパク質は、感染したウサギの皮膚中に細胞が湿潤するのを阻害する
A41Lタンパク質が、VVに感染する宿主の応答を左右するかどうかを確認するため、ウイルスのvA41L,vΔA41LおよびvA41L−rev(104pfu)をウサギの皮下に注射し、3日後に、その病変部を検査した。A41Lを発現しないウイルス(vΔA41L)によって誘発された病変部と、A41Lを発現するウイルス(vA41LとvA41L−rev)によって誘発される病変部の間に、細胞浸潤とウイルス抗原に明白な差があった。vΔA41Lを感染させた病変部を、抗ウサギCD43抗体を用いて免疫染色(immunostain)したところ、浸潤する細胞をほとんど示さなかったvA41LとvA41L−revと比べて、皮膚の下部血管領域のCD43+細胞の強い浸潤(赤褐色に染色された)が明らかになった。抗14kモノクローナル抗体による免疫染色によって明らかになった、真皮と表皮に存在するVV抗原の量は、vA41LおよびvA41L−revによって起こった病変部の方がvΔA41Lによる病変部より広範囲にわたっていた(赤褐色に染色された)。このことは、A41Lタンパク質が、生体内で抗ウイルス免疫応答中(恐らくIP−10やMigに結合して阻害することによって)、単球、マクロファージおよびTリンパ球の浸潤を下方調節できるので、皮膚の病変部を通じてウイルスを大きく散在させる(dissemination)ことができることを示している。これは、免疫浸潤に直面したときに、ウイルスが広がるのを減らすはたらきをしたvΔA41Lと対照的である。
考 察
ここで、我々は、VV遺伝子A41Lがコードするタンパク質の特性解析を行う。この遺伝子産物は、試験された18株のオルトポックスウイルスすべてが発現する30kDaの分泌糖タンパク質であり、またその遺伝子は3株の痘瘡ウイルス中に高度に保存されている。このように保存されているにもかかわらず、そのタンパク質はVVが複製するのに必要ではなく細胞培養中に広がる。それにもかかわらず、A41Lタンパク質はCXCケモカインのMigとIP−10に結合するが、他の15種のCCケモカインとCXCケモカインには結合しない。この点については、A41Lタンパク質は、新たに確認されたvCKBPよりケモカイン選択性がはるかに大きく、かつ試験されたすべてのCCケモカイン類に無差別に結合する構造の類似性をvCKBPと共有している(Alcami外1998年)。以後、A41Lタンパク質はvCKBP−2と呼び、VV株Listerの35kDaのタンパク質をvCKBP−1と呼ぶ。
IP−10とMigはCXCケモカイン類のサブグループの代表例である(総説についてはFarber 1997年を参照のこと)。これらのケモカインは、他のCXCケモカインより互いに一層密接に関連しており(アミノ酸の同一性は37%)、そして、角化細胞、内皮細胞、リンパ球、単球および好中球によるこれらケモカインの発現はIFN−γによって誘発される(LusterおよびRavetch 1987年b;LusterおよびRavetch 1987年a;Farber 1993年;Cassatella外1997年)。また、IP−10とMigは、好中球を誘引しないが、代わりに、単球と活性化されたTリンパ球の遊走を刺激するという点で、他のCXCケモカイン類と異なっている(Taub外1993年)。IP−10とMigをコードする遺伝子は、染色体4の、他のCXCケモカイン類遺伝子のクラスターから離れた遺伝子座に、近接して存在している(LeeおよびFarber 1996年)。IP−10とMigの両者には、7膜貫通Gタンパク質共役型受容体(CXCR3)が結合する。そして、この受容体は、いくつもの他のCKRより高い選択性を示してIP−10とMigを特異的に認識するが他のCXCとCCのケモカイン類を認識しない(Loetscher外1996年)。また、CXCR3は、T細胞が活性化された後にしか、T細胞で発現されないという点で選択性を示している(Loetscher外1996年)。この特異的発現は、選択的IFN−γ依存性漸増(selective IFN-γ-dependent recruitment)またはMigとIP−10によるエフェクターTリンパ球の浸潤を示唆している。これらのケモカイン類は、結核様らいの遅延型過敏症(DTH)の皮膚病変部におけるかような細胞の漸増(recruitment)(Kaplan外1987年);皮膚リーシュマニア症(Kaplan外1987年);及び乾癬のような自己免疫炎症疾患(Gottlieb外1988年;Gottlieb 1990年)に関与しているといわれており、これらの場合、IP−10の高い発現レベルが検出された。MigとIP−10は、ウイルスまたは原虫が感染した後の活性化T細胞の漸増に関与しており(Amichay外1996年;AsensioおよびCampbell 1997年;Cheret外1997年;Narumi外1997年)、そしていくつかの場合は、例えばC型肝炎ウイルスによる慢性感染症の病状に関与している(Narumi外1997年)。IP−10が疾患の原因になっていると思われる他の疾患は、成人型呼吸窮迫症候群(Abdullah外1997年);ライム病(Ebnet外1996年);アテローム性動脈硬化症と再狭窄(Wang外1996年);乳癌細胞の移動、浸潤および転移(Youngs外1997年);皮膚T細胞のリンパ腫(Sarris外1996年);および糸球体の疾患と関連がある尿細管間質性腎炎(Tang外1997年)である。また、IP−10とMigは、骨髄移植を行った後に有害になることがある造血前駆細胞の産生も抑制する(Schwartz外1997年)。
MigとIP−10の可溶性でかつ選択的な阻害剤として、vCKBP−2は、これらのケモカインが誘発する過大な炎症反応と組織の損傷を抑制する選択的薬剤として、薬学上重要な新規な化合物の代表的なものである。vCKBP−2またはこれから誘導される分子を投与することによって、これらケモカインが誘発する疾患を予防または軽減することができる。その上に、vCKBP−2がMigやIP−10と複合体を形成する両者の構造上の相互作用の研究は、これらケモカインと細胞受容体CXCR3との相互作用について価値ある情報を提供することができる。この情報は、MigやIP−10とCXCR3との相互作用を遮断する小さな阻害剤を設計するのに役立つであろう。CXCR3は膜に結合していて、かつケモカイン結合活性を保持する可溶性の誘導体分子を欠いているため、CXCR3を操作することによって上記の目的を達成することは容易ではない。
vCKBP−2の特異性は、このタンパク質を発現するVVなどのオルトポックスウイルスの生物学に関連して興味深い。また、いくつものオルトポックスウイルスは、CCケモカイン類に結合するタンパク質(vCKBP−1)を発現するので、CCケモカインによって誘引される単球などの細胞の漸増、例えばエオタキシンによって誘引される好酸球の漸増が制限される(Graham外1997年;Smith外1997年a;Alcami外1998年)。しかし、オルトポックスウイルスは、好中球の漸増を阻害する(MigやIP−10に特異的なcCKBP−2とは異なる)CXCケモカイン結合タンパク質を発現しない。このことは、活性化T細胞、単球およびマクロファージの漸増が、VVの感染の抑制と排除(clearance)を行うのに、好中球の漸増より重要であることを示唆していると考えられる。あるいは、VVが、好中球の正常な機能を遮断する別の機構をもっている可能性がある。
ここで、我々は、vCKBP−2が、ウサギの皮膚のVV感染部位に対する炎症細胞の漸増、およびウイルス抗原の量で示されるウイルスの複製と蔓延の程度に、大きく影響することを示す。このことは、VVの感染がMigやIP−10の発現を誘発する(Amichay外1996年)とか、組換えVVからのMigとIP−10の発現によってVVのビルレンス(virulence)が低下した(Ramshaw外1997年)という観察結果と一致している。また、A41L遺伝子を除くと、VV MVAのようなVV株の免疫原性と安全性を増大するようである。なお、このVV MVAは、各種の癌ならびにある範囲の病原体、例えばマラリア、ヒト乳頭腫ウイルス(HPV)およびヒト免疫不全ウイルス(HIV)に対する組換え治療用ワクチンとして開発されている安全な免疫原性VV株である。
要約すると、我々は、ポックスウイルスが発現する新規なタンパク質であって、CXCケモカインのMigとIP−10に結合して、感染に対する宿主の応答を妨害するタンパク質を確認したのである。vCKBP−2と呼ばれるこの分子は、過大なMigとIP−10の活性で誘発される疾病およびCXCR3に結合する病原体によって誘発される感染症の阻害剤としての治療力をもっている。この分子は、これらのケモカインを検出するために、キットに入れる有用な薬剤であり、コード遺伝子を操作することによって、一層免疫原性の高いポックスウイルスベースのワクチンを構築することができる。
参考文献
図面の説明文
図1.VV WR A41Lタンパク質(Smith外1991年)、および米国ウイスコンシン州所在のGenetics Computer Group Inc.のPILEUPおよびPRETTYPLOTのプログラム(Devereux外1984年)を使用して創製されたVV Lister由来のvCKBP(Patel外1990年)のアミノ酸配列の配列。箱枠内のアミノ酸は、上記の両タンパク質内に保存されている。N末端のシグナルペプチドの後の8個の保存されたシステイン残基は・印でマークしてある。
図2.VV WR A41L(Smith外1991年)、およびGCGパッケージ(Devereux外1984年)で創製されたvCKBPタンパク質(Patel外1990年)の疎水性のプロット。vCKBPの対の垂直線の間の領域は、A41Lタンパク質にはない領域を示す。
図3.組換えウイルスゲノムのサザーンブロット分析の結果。(a)ウイルスゲノムの予想構造を示す線図。異なるウイルスのA41L遺伝子に延びているEcoRVのフラグメントの大きさと、サザーンブロッティングに使われる二つのプローブの位置。(b)サザーンブロット。ウイルスDNAを制限エンドヌクレアーゼEcoRVで消化し、0.8%アガロースゲル上を泳動させ、ナイロンフィルターに移し、次いで、上記(a)に示した領域由来のフルオレセインで標識されたDNAプローブでプローブした。結合したプローブを、材料と方法の項で説明したようにして検出した。上記二つのプローブで検出されたヌクリオチドのバンドの大きさを示してある。
図4.A41Lタンパク質の発現と精製。(a)イムノブロット。AcA41Lhis(クローン1と2)を感染させたSf21細胞の上澄み液中のタンパク質を、SDS−PAGE(10%ゲル)によって分割し、ニトロセルロースに移し、次いでA41Lタンパク質に対するウサギ抗血清でプローブした。(b)ニッケル−キレートアフィニティークロマトグラフィーによるA41Lhisタンパク質の精製を示す、クマーシーで染色されたゲル。粗上澄み液中に存在するタンパク質を、ニッケルカラムに加えた後のフロースルー(flowthrough)中に存在するタンパク質およびイミダゾールの濃度を増大した際に溶出するタンパク質と比較している。タンパク質分子量のマーカーの大きさはkDaで示してある。
図5.VV WRが産生したA41Lタンパク質の特性解析結果を示すイムノブロット。(a)BS−C−1細胞に、指定のウイルスを10pfu/細胞で感染させるかまたはモック(mock)感染させて、上澄み液を16hpiで調製した。SDS−PAGE(10%ゲル)で分離してニトロセルロースに移した後、得られたブロットをA41Lタンパク質に対するウサギ抗血清とともにインキュベートし、結合した抗体を、材料と方法の項で説明したようにして検出した。(b)A41Lタンパク質は、感染中の初期と後期に産生される。細胞は、指定の期間、WRウイルスに感染させるか、または40μg/mlのaraCの存在下で感染させるかまたはモック感染をさせた。上澄み液を調製し、(a)のようにして分析した。(c)A41Lタンパク質はN−連結炭水化物とO−連結炭水化物を含有している。細胞は、モネンシン(1μM)またはツニカマイシン(1μg/ml)の存在下または非存在下で、16hr、WRウイルスに感染させた。上澄み液を調製して(a)のようにして分析した。タンパク質分子量のマーカーの大きさはkDaで示してある。
図6.A41Lタンパク質はオルトポックスウイルス中に保存されている。BS−C−1細胞に指定のウイルスを感染させるかまたはモック感染をさせ、次いで材料と方法の項に記載したようにして、上澄み液を16hpiで調製した。タンパク質をSDS−PAGE(10%ゲル)で分析し、ニトロセルロースに移し、次いでA41Lタンパク質に対するウサギ抗血清でプローブした。結合した抗体を材料と方法の項に記載したようにして検出した。タンパク質分子量のマーカーの大きさはkDaで示してある。
図7.BIAcore2000分析。精製されたA41Lhisタンパク質またはvCKBPタンパク質を別個のフローセルに固定化して、指定された被分析ケモカインの結合性を材料と方法の項に記載したようにして分析した。対照は、チップ表面にタンパク質が結合されていない第三のフローセルを示す。a)CXCケモカイン類。b)CCケモカイン類。センサーグラム(sensorgram)を示してある。
図8.VV株WR A41L遺伝子のヌクレオチド配列とフランキング配列(Smith外1991年)。A41L遺伝子のコード領域は、121位から始まり780位で終了している。
Claims (4)
- 天然のA41Lタンパク質を発現できないように遺伝子工学で処理されている組換えポックスウイルス。
- ケモカイン結合A41Lタンパク質を発現できない請求の範囲1に記載の組換えポックスウイルス。
- 遺伝子工学で処理されたワクシニアウイルスである請求の範囲1または2に記載の組換えポックスウイルス。
- 治療または予防に用いるため医薬として許容される担体とともに、請求の範囲1−3のいずれか一つに記載の組換えポックスウイルスを含有する医薬。
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