DE60203324T2

DE60203324T2 - Einzelne und duale anti-cd4-rantes chemokin/zytokin konstrukte

Info

Publication number: DE60203324T2
Application number: DE60203324T
Authority: DE
Inventors: Matthias Mack; Detlef Schloendorff
Original assignee: Micromet GmbH
Current assignee: Amgen Research Munich GmbH
Priority date: 2001-12-21
Filing date: 2002-12-20
Publication date: 2006-04-06
Anticipated expiration: 2022-12-21
Also published as: EP1456241A2; WO2003054017A2; AU2002360073A1; US20060078537A1; WO2003054017A3; CA2471136A1; EP1456241B1; ZA200404831B; DE60203324D1; ATE291035T1

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Chemokinkonstrukt, umfassend ein Anti-CD4-scFv und ein RANTES-Chemokin oder ein funktionelles Fragment davon, wobei das Chemokinkonstrukt die folgende Strukturdomänenform besitzt: (a) RANTES-Linker-(VH) Anti-CD4-Linker-(VL) Anti-CD4; oder (b) (VL) Anti-CD4-Linker-(VH) Anti-CD4-Linker-RANTES; oder (c) (VH) Anti-CD4-Linker-(VL) Anti-CD4-Linker-RANTES, wobei in den Alternativen (b) und (c) der Linker zwischen (VH) Anti-CD4 und RANTES oder zwischen (VL) Anti-CD4 und RANTES am Ende, direkt angrenzend an die erste Aminosäure von RANTES, kein Methionin, Lysin oder Isoleucin umfasst. Darüber hinaus werden Polynucleotide offenbart, die diese Chemokinkonstrukte codieren, sowie auch Vektoren, die diese Polynucleotide umfassen. Die Erfindung betrifft auch spezifische Verwendungen dieser Konstrukte und Arzneistoffe.
Das menschliche Immunschwächevirus Typ-1 (HIV-1), die häufigste Ursache von AIDS, hat mehr als 50 Millionen Menschen (einschließlich jener, die gestorben sind) infiziert und die Rate der Neuinfektionen wird auf fast 6 Millionen pro Jahr geschätzt (AIDS Epidemie Update: Dezember 1999 (UNAIDS, Genf, 1999), www.unaids.org). Ebenso beunruhigend sind die Ungewissheiten der bevorstehenden Epidemie. Obwohl Schwarzafrika das globale Epizentrum bleibt, haben die Infektionsraten in letzter Zeit in der früheren Sowjetunion und in Teilen von Süd- und Südostasien, einschließlich Indien und China, zugenommen, wo im wahrsten Sinne des Wortes möglicherweise hunderte Millionen von Menschen gefährdet sind. In den Vereinigten Staaten wurden neue Infektionswellen in Frauen, Minderheiten und jüngeren Generationen von homosexuellen Männern beobachtet. Anti-retrovirale Kombinationstherapie hat vielen Menschen klinische Erleichterung ermöglicht, aber die Kosten und die Toxizitäten der Behandlung sind erheblich und eine HIV-1 Infektion bleibt eine tödliche Krankheit. Darüber hinaus hat die überwältigende Mehrheit der weltweit infizierten Menschen keinen Zugang zu diesen Wirkstoffen.
Folglich, obwohl sich die Demographie (und in manchen Fällen die Naturgeschichte) von AIDS geändert hat, ist die Epidemie alles andere als vorbei; stattdessen ändert sie sich, breitet sich aus und stellt immer größere Herausforderungen.
Das menschliche Immunschwächevirus (HIV) kann nicht in menschliche Zellen eindringen, außer es bindet an zwei Schlüsselmoleküle auf der Zelloberfläche, CD4 und einen Hilfsrezeptor. Der Hilfsrezeptor, der zu Beginn erkannt wird, ist CCR5, später im Lebenszyklus des Virus wird ein anderer Chemokinrezeptor, CXCR4, der Hilfsrezeptor für HIV-1 (D'Souza & Harden, Nature Med. 2, 1293–1300 (1996); Premack & Schall, Nature Med. 2, 1174–1178; Fauci, Nature 384, 529–534 (1996)). Die HIV-1-Stämme, die die meisten Übertragungen von Viren durch sexuellen Kontakt verursachen, werden M-tropische Viren genannt. Diese HIV-1-Stämme (auch als NSI-primäre Viren bekannt) können in primären CD4+-T-Zellen und Macrophagen replizieren und verwenden den Chomokinrezeptor CCR5 (und seltener CCR3) als ihren Hilfsrezeptor. Die T-tropischen Viren (manchmal SI-primär genannt) können auch in primären CD4+-T-Zellen replizieren, können aber zusätzlich auch etablierte CD4+-T-Zelllinien in vitro infizieren, was sie über den Chemokinrezeptor CXCR4 (Fusin) bewerkstelligen. Viele dieser T-tropischen Stämme können CCR5 zusätzlich zu CXCR4 verwenden und manche können, zumindest unter bestimmten in vitro-Bedingungen, über CCR5 in Macrophagen eindringen (D'Souza & Harden, Nature Med. 2, 1293–1300 (1996); Premack & Schall, Nature Med. 2, 1174–1178; Fauci, Nature 384, 529–534 (1996)). Ob auch andere Hilfsrezeptoren zur HIV-1 Pathogenese beitragen, ist nicht geklärt, aber aus in vitro-Studien kann auf die Existenz eines anderen Hilfsrezeptors für einige T-tropische Stämme geschlossen werden. Da M-tropische HIV-1-Stämme zu etwa 90% an den sexuellen Übertragungen von HIV beteiligt sind, ist CCR5 der vorherrschende Hilfsrezeptor für das Virus in Patienten; die Übertragung (oder die systemische Etablierung) von (T-tropischen) Stämmen, die CXCR4 verwenden, ist selten (D'Souza & Harden, Nature Med. 2, 1293–1300 (1996); Premack & Schall, Nature Med. 2, 1174–1178; Fauci, Nature 384, 529–534 (1996); Paxton et. al., Nature Med. 2, 412–417 (1996); Liu et al., Cell 86, 367–377 (1996); Samson et. al., Nature 382, 722–725 (1996); Dean et. al., Science 273, 1856–1862 (1996); Huang et.al., Nature Med. 2, 1240–1243 (1996)). Wenn sich SI-Viren jedoch einmal in vivo entwickeln (oder wenn sie übertragen werden), sind sie besonders virulent und bewirken ein schnelleres Fortschreiten der Krankheit (D'Souza & Harden, Nature Med. 2, 1293–1300 (1996); Premack & Schall, Nature Med. 2, 1174–1178; Fauci, Nature 384, 529–534 (1996); Schuitemaker et al., J. Virol. 66, 1354–1360 (1992); Connor et al., J. Virol. 67, 1772–1777 (1993); Richman & Bozzette, J. Infect. Dis. 169, 968–974 (1994); Connor et al., J. Exp. Med. 185, 621– 628 (1997); Trkola et al., Nature 384, 184–187 (1996)).
Kurz gefasst verwendet das menschliche Immunschwächevirus Typ-1 (HIV-1) gemeinsam mit CD4 einen Hilfsrezeptor, um in CD4+-Zielzellen einzudringen. Die Chemokinrezeptoren CXCR4 und CCR5 wurden als die Haupt-Hilfsrezeptoren für T-Zelllinien-tropische bzw. Macrophagen-tropische HIV-1-Stämme erkannt. Die zellulären Rezeptoren sind CCR5 für RANTES und CXCR4 für SDF-1. CCR5 wird auf CD4+-Gedächtnis-Zellen und CD8+-T-Zellen exprimiert. CCR5 wird auch auf aktivierten Monocyten und Macrophagen exprimiert. Der Mechanismus des Eintretens des Virus basiert auf der Wechselwirkung des Hüll-Glycoproteins von HIV-1, gp120, mit CD4 und einem Hilfsrezeptor, was zu einer Membranfusions-Reaktion zwischen viraler Hülle und der Plasmamembran der Zielzelle führt. Das Blockieren der Bindung von gp120 an CD4 und einen Hilfsrezeptor stellt eine geeignete Strategie dar, die HIV-1 Infektion von CD4+-T-Zellen zu verhindern.
Der Chemokinrezeptor CCR5 hat eine wichtige Funktion in der Chemotaxis von Lymphocyten, Monocyten und dentritischen Zellen. Die Bindung von RANTES an CCR5 kann zwei verschiedene Arten von Signalwegen induzieren. Signalübertragung durch CCR5 induziert transienten Kalzium-Einstrom, Zellpolarisierung und Chemotaxis und dadurch eine entzündungsfördernde Reaktion. Vermehrte RANTES-Expression ist mit entzündlichen Fehlsteuerungen assoziiert. Eine niedrige lokale Toleranz ist mit seiner entzündungsfördernden Aktivität assoziiert, wie durch eine starke entzündliche Reaktion nach intradermaler Injektion (geschätzte lokale Konzentration von ~ 1 μM) von hRANTES in Hunden gezeigt wird (Meurer et al., 1993, J Exp Med 178, 1913–1921).
CCR5 ist auch ein Haupt-Hilfsrezeptor in den meisten Macrophagen-tropischen HIV-1-Infektionen, welcher hauptsächlich in der frühen Phase der Infektion verwendet wird. Die Bindung von RANTES an CCR5 vermittelt die Unterdrückung einer HIV-Infektion, für diesen unterdrückenden Effekt scheint die CCR5-Signalübertragung jedoch nicht nötig zu sein (Alkhatib et al., 1997, Virology 234, 340–348; Bacon et al., 1995, Science 269, 1727–1730; Oravecz et al., 1996, J Immunol 157, 1329–1332).
Der HIV-unterdrückende Effekt von RANTES könnte stattdessen aus einer Blockierung der gp120-Bindungsstelle von HIV oder einer Herunterregulation von CCR5 auf der Zelloberfläche resultieren.
Als eine Alternative zu CCR5 (Deng et al., 1996, Nature 381, 661–666; Dragic et al., 1996, Nature 381, 667–673) kann HIV-1 (T-tropische Stämme; X4-Stämme; SI: Syncytium-induzierend) auch CXCR4 (Fusin) als Hilfsrezeptor verwenden (Feng et al., 1996, Science 272, 872–877). Ähnlich zu RANTES/CCR5 kann eine HIV-1-Infektion durch CXCR4 mittels SDF-1 blockiert werden (Bleul et al., 1996, Nature 382, 829–833; Oberlin et al., 1996, Nature 382, 833–835).
Während des klinischen Fortschreitens verändern sich die Viren von nicht Syncytiuminduzierenden zu Syncytium-induzierendem Phänotyp und verlieren parallel dazu ihre Sensitivität gegenüber Beta-Chemokinen (Jansson et al., 1996, Proc Natl Acad Sci USA 93, 15382–15387). Es wurde gezeigt, dass eine Blockade eines Hilfsrezeptors eine Veränderung in der Rezeptorspezifität einer Viruspopulation induzieren kann (Este et al., 1999, J Virol 73, 5577–5585). Nachdem X4-Stämme pathogener sind als R5-Stämme, kann die Blockierung von CCR5 alleine daher zu einer Veränderung der Rezeptorspezifität und in der Folge zu einer stärkeren Pathogenität führen. Tatsächlich hemmt eine Kombination von AOP-RANTES (CCR5-Antagonist) mit Met-SDF-1 (CXCR4-Antagonist) gemischte Infektionen mit R5- und X4-Viren zu >95%, wogegen einzelne Chemokine nur zu 32–61% inhibierten (Rusconi et al., 2000, J Virol 74, 9328–9332).
Die Chemokinrezeptoren CXCR4 und CCR5 werden von den T-Zell-tropischen bzw. Macrophagen-tropischen HIV-1-Stämmen als Hilfsrezeptoren für das Eintreten in ihre Wirtszellen verwendet. Das Eintreten von Viren kann durch die natürlichen Liganden für CXCR4, das CXC-Chemokin SDF-1, und für CCR5, die CC-Chemokine RANTES, MIP-1alpha, MIP-1beta, LD78beta und MCP-2, gehemmt werden. Kleinmolekulare CXCR4-Antagonisten sind entwickelt worden. Das Bicyclam-Derivat AMD3100 hat sich als hochspezifischer CXCR4-Antagonist erwiesen, der den Auswuchs aller T-Zell-tropischen und zweifach-tropischen HIV-Varianten, welche CXCR4 zum Eindringen in die Zelle benützen, durchwegs blockiert (Donzella et al., 1998, Nat Med 4, 72–77; Este et al., 1999 J Virol 73, 5577–5585; Schols et al., 1997, Antiviral Res 35, 147–156; Schols et al., 1997, J Exp Med 186, 1383–1388). AMD3100 wurde als klinischer Arzneistoffekandidat ausgewählt, welcher nach anfänglichen Phase I (Sicherheits)-Studien in Phase II (Wirksamkeits)-Studien fortgeschritten ist. Die erste nicht-peptidische Verbindung, die mit CCR5 und nicht mit CXCR4 interagiert, ist ein quaternäres Ammoniumderivat, TAK-779 genannt, welches auch starke, aber veränderliche anti-HIV-Wirksamkeit aufweist (Bab et al., 1999, Proc Natl Acad Sci USA 96, 5698–5703). Außerdem ist SCH-C ein oral verabreichbarer kleinmolekularer CCR5-Antagonist und ein wirksamer Inhibitor der HIV-1-Infektion (Strizki et al., 2001, Proc Natl Acad Sci USA 98: 12718–12723). HIV-Eindringen/Fusionsinhibitoren sind viel versprechende neue antivirale Stoffe zur Bekämpfung von AIDS. Für beste therapeutische Effekte werden sie jedoch in Kombinationen mit anderen antiviralen Stoffen verwendet werden müssen, welche auf den HIV-Replikationszyclus abzielen, wie zum Beispiel reverse Transkriptase und Protease (zusammengefasst in De Clercq & Schols, 2001, Antivir. Chem. Chemother; 12 Suppl 1, 19–31).
Von natürlich vorkommenden Antikörper, die gegen CCR5-Hilfsrezeptoren für HIV-1 gerichtet sind und die aus normalen menschlichen IgG isoliert wurden, wurde gezeigt, dass sie die Bindung von RANTES an Macrophagen inhibieren (Bouhlal et al., 2001, J. Immunol., 166 7606–7611). Affinitätsgereinigter Anti-CCR5-Ig inhibierte die Infektion von Lymphocyten und Monocyten/Macrophagen mit primären, laboradaptierten Stämmen von HIV-1 weiter, aber inhibierte die Infektion mit X4-tropischem HIV nicht. Die Bindung von HIV-gp120 an CD4 kann durch anti-CD4-Antikörper blockiert werden (Leu3a und OKT4A), Immunsuppression durch Depletion von CD4+-Zellen ergibt sich jedoch als eine Nebenwirkung. US5871732 (Prioritätsdatum: 27.11.1991, veröffentlicht US: 16.2.1999) beansprucht einen Anti-CD4-Antikörper (5A8) ohne immunsupressive Nebenwirkungen.
MT413 wurde als wirksam in der Inhibierung zellulärer Infektionen mit HIV-1 beschrieben, sogar nach der Anheftung des Virus an die Zellmembran (Davis et al., 1992, Nature 358, 76–79; Rieber et al., 1992, Proc Natl Acad Sci USA 89, 10792–10796; Rieber et al., 1990, Lancet 336, 1007–1008) und seine Sequenz wurde veröffentlicht (Weissenhorn et al., 1996, Hybridoma 15, 117–124) (GenBank X65093 & X65086; hinterlegt 26.2.1997).
Zusätzlich dazu, dass RANTES durch CCR5 und andere Chemokinrezeptoren Signalübertragung ausüben kann, kann er dabei auch über Signalisieren durch TCR- Komponenten und Protein-Tyrosinkinasen, was zu einem anhaltenden Kalziumeinstrom führt, als starker Antigen-unabhängiger Aktivator von T-Zellen wirken (Bacon et al., 1995, Science 269, 1727–1730; Dairaghi et al., 1998, J Immunol 160, 426–433). Diese Art von Signalübertragung kommt nur bei hohen Konzentrationen von RANTES (> 100 nM – 1 μM) vor. Bei so hohen Konzentrationen kann RANTES eine HIV-Infektion tatsächlich verstärken. Beide Aktivitäten sind in entscheidender Weise von der Tendenz von RANTES abhängig, selbst in größere, schlecht definierte Oligomere zu aggregieren. Es wurden jedoch experimentelle Bedingungen beschrieben, bei denen RANTES, sogar bei höheren Konzentrationen, Dimere gebildet hat (Chung et al., 1995, Biochemistry, 34: 9307–14; Wilken et al., 1999, Chem Biol., 6: 43–51) RANTES mit mutiertem Glu26 und Glu66 hat eine verminderte Tendenz zu aggregieren (< Tetramer, Dodecamere), aktiviert Leukocyten nicht oder steigert HIV-Infektion nicht, behält aber seine Rezeptorbindungsaktivität und CCR-vermittelte biologische Aktivität bei (Appay et al., 1999, J Biol Chem 274, 27505–27512; Czaplwski et al., 1999, J Biol Chem 247, 16077–16084; Graham et al., 1994, J Biol Chem 269, 4974–4978).
Zur Behandlung von HIV-Infektionen wäre ein RANTES-Antagonist mit verminderter CCR5-Signalisierungsaktivität (und dabei reduzierter entzündungsfördernder Aktivität), aber intakter HIV-suppressiver Aktivität und CCR5-Bindungsaffinität bevorzugt. Mehrere Antagonisten sind beschrieben worden, die aus chemischen Änderungen, Verlängerungen, Deletionen oder Mutationen des N-Terminus von RANTES resultieren.
APO-RANTES hat durch gesteigerte Rezeptor-Internalisierung einen verstärkten antiviralen Effekt, behält aber Signalisierungsfunktionen bei (Mack et al., 1998, J Exp Med 187, 1215–1224; Oppermann et al., 1999, J Biol Chem 247, 8875–8885; Simmons et al., 1997, Science 276, 226–27). US 6168784 , und WO 9911666 beanspruchen verschiedene Arten von RANTES, einschließlich NNY-RANTES (Mosier et al., 1999, J Virol 73, 3544–3550). Met-RANTES ist ein kompletter RANTES-Antagonist und ist bei der HIV-Suppression weniger effektiv als RANTES (Simmons et al., 1997, Science 276, (5310), 276–279). Leu-RANTES hat einen 2–3 fach höheren antiviralen Effekt und bindet stabiler an CCR5 als der RANTES-Wildtyp. Dieses Molekül ist ein sehr schwacher Agonist, aber ein wirksamer Antagonist (Polo et al., 2000, Eur J Immunol 30, 3190–3198). C1C5-RANTES hat einen etwa 5fach höheren antiviralen Effekt, aber andere Mutanten haben einen viel niedrigeren antiviralen Effekt (C1-RANTES, A3-RANTES, R6-RANTES). C1C5-RANTES ist auch ein schwacher Agonist und ein wirksamer Antagonist (Polo et al., 2000, Eur J Immunol 30, 3190–3198). RANTES (9–68) weist schwache chemotaktische- und schwächere antivirale Wirksamkeit als der RANTES-Wildtyp auf. Dieses Molekül scheint einfach ein schwächerer Binder an CCR-Chemokinrezeptoren zu sein (Gong et al., 1996, J Biol Chem 271, 10521–10527; Polo et al., 2000 Eur J Immunol 30, 3190–3198). Challita-Eid et al. (1998, AIDS Res Hum Retroviruses 14, 1617–1624) konstruierte mit dem Ziel die HIV-Infektion zu hemmen auch ein RANTES-IgG-Fusionsprotein. Darüber hinaus beschrieben Brühl et al. ein RANTES-Toxin (PE)-Fusionsprotein zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen und HIV (Brühl et al., 2001, J Immunol 166, 2420–2426).
Vor kurzem wurde ein chimäres Molekül beschrieben, das aus den acht aminoterminalen Resten von MIP-1alpha vorangehend dem CC-Motiv, gefolgt von der verbleibenden Sequenz von RANTES besteht (Blanpain et al., 2001, Leukoc Biol, 977–85), welches in der Lage war Chemotaxis von menschlichen Monocyten zu induzieren. MIP/RANTES hat nicht an CCR3 gebunden, wies aber äquivalente Affinität für die CCR5-Bindung auf, mit einem EC(50) von 1,12 nM. MIP/RANTES induzierte Endocytose von CCR5 in PBMC in einer gleich starken Art und Weise wie RANTES und war unter Verwendung von HIV-1-Stämmen im Stande CCR5 zu inhibieren. Diese Daten legen nahe, dass der N-Terminus von RANTES an der Bindung von CCR5 nicht beteiligt ist, für CCR1 und CCR3 aber unerlässlich ist.
Das Trafficking von entzündlichen T-Zellen in das zentrale Nervensystem (ZNS) spielt eine wichtige Rolle in der Pathogenese von multipler Sklerose. Die gerichtete Migrationsfähigkeit von peripheren T-Zellen wird mit Interaktionen von Chemokinen mit ihren auf T-Zellen exprimierten Rezeptoren in Verbindung gebracht. Es wurde gezeigt, dass abweichende Migration in Richtung RANTES und MIP-1alpha von T-Zellen, die von multipler Sklerose abgeleitet waren, aus einer Überexpression ihrer Rezeptoren (CCR5) resultierte und durch anti-CCR5-Antikörper blockiert werden konnte (Zang et al., 2000, Brain 123, 1874–82).
Vor kurzem wurde die Rolle von RANTES für den Knorpelabbau beschrieben. Normale Chondrocyten produzieren RANTES und exprimieren RANTES-Rezeptoren.
RANTES und CCR5 waren in osteoarthritischem Knorpel und nach in vitro Behandlung normaler Chondrocyten mit IL-1 merklich erhöht. Chondrocytenaktivierung und Knorpelabbau wurden als neue biologische und pathogene Aktivitäten dieses Chemokins identifiziert (Alaaeddine et al., 2001, Arthritis Rheum, 44, 1633–43).
Neueste Untersuchungen legen nahe, dass Chemokine an der Bildung von nicht neoplastischen leukocytären Infiltraten bei der Hodgkin-Krankheit (HD) beteiligt sind (Buri et al., 2001, Blood, 97, 1543–8). Die Expression von RANTES, MCP-1, MIP-1 alpha und MIP-1 beta war merklich gesteigert, aber RANTES wurde fast ausschließlich von T-Zellen exprimiert, während die Expression von MCP-1, MIP-1alpha und MIP-1beta größtenteils auf Macrophagen beschränkt war. Verglichen mit Kontrollen wurden CCR3 und CCR5 in T-Zellen stark exprimiert. In HD-Lymphknoten wurden CCR3 und CCR5 auch in B-Zellen exprimiert, welche diese Rezeptoren normalerweise nicht exprimieren.
In einer HIV-Infektion kann die Ausbreitung des Virus durch Blockierung des Eintretens von HIV-1 über zelluläre Rezeptoren wie CD4 und CCR5 verhindert werden. Es gibt verschiedene Ansätze Chemokinrezeptor-Liganden oder Antikörper, die gegen diese Rezeptormoleküle gerichtet sind, zu verwenden. RANTES als ein Ligand von CCR5 und monoclonale Anti-CD4-Antikörper haben sich in der Blockierung des Eintretens von HIV-1 in CD4+-T-Zellen als wirksam erwiesen, aber beide Verbindungen zeigten schwere Nebenwirkungen. CD4-spezifische Antikörper können eine Depletion der CD4+-T-Zellen induzieren (Rep et al., J Clin Invest., 1997, 99, 2225–2231; van der Lubbe et al., J. Autoimmun., 1997, 10, 87–97; Knox et al., Blood 1996, 87, 893–899; Moreland et al., Arthritis Rheum., 1995, 38, 1581–8; Moreland et al., Arthritis Rheum., 1994, 37, 834–838) und unterscheiden nicht zwischen Subpopulation der CD4+-T-Zellen. Von der Verwendung von RANTES oder Modifikationen davon wird geschildert, dass sie entzündliche Prozesse auslösten (besprochen in Ward & Westwick, 1998, Biochem J 333, 457–470; Appay & Rowland-Jones, 2001, Trends Immunol 22, 83–87). Die Anwendung von RANTES in vivo kann auch die Funktion von CCR5 paralysieren und dadurch eine Immunsuppression auslösen. Als Folge werden die Subpopulationen von Gedächtnis-CD4+-T-Zellen und cytotoxischen CD8+-Zellen, die auch für CCR5 positiv sind, reduziert, was zu einer verminderten zellulären Immunantwort führt.
Diese schädliche Wirkung auf die T-Zellen-Aktivität ist ein Kennzeichen von therapeutischen Ansätzen, die RANTES und monoclonale Anti-CD4-Antikörper zur Blockierung des Eintretens von HIV-1 verwenden.
Die Verwendung von Antikörpern oder Antikörperfragmenten gegen CCR5 in Verbindung mit Antikörpern gegen CD4, wie unter anderem in WO 01/43779 beschrieben, hat den großen Nachteil, dass Antikörper oder Antikörperfragmente gegen CCR5, verglichen mit den Chemokinen RANTES, MIP-1alpha oder MIP-1beta (eigene Daten), nur schwache Inhibitoren der HIV-Infektion sind. Außerdem sind CCR5-Antikörper nicht in der Lage CCR5 von der Oberfläche von PBMC zu internalisieren, während die Chemokine RANTES, MIP-1alpha oder MIP-1beta die Internalisierung von CCR5 sehr wirksam induzieren. Neue CCR5-Antikörper wurden auf ihre Fähigkeit getestet CCR5 von der Oberfläche von PBMC zu internalisieren und es wurde festgestellt, dass nur ein CCR5-Antikörper (MC-1, wie in den beigefügten Beispielen dokumentiert) eine sehr schwache Internalisierung von CCR5 auf PBMC zeigte. Außerdem konnte dieser CCR5-Antikörper, MC1, CCR5 nur als bivalenter (intakter) Antikörper internalisieren und hat CCR5 als F(ab)-Fragment oder scFv-Fragment nicht internalisiert. Die Internalisierung von CCR5 hat den Vorteil, dass CCR5 von der Zelloberfläche verschwindet und als Hilfsrezeptor für HIV-1 nicht länger verfügbar ist. Im Gegensatz dazu, hängt eine reine Blockade von CCR5, z.B. durch CCR5-Antikörper, von einer räumlichen Behinderung ab, welche die Bindung von HIV-1 an CCR5 verhindert. Die räumliche Behinderung ist nur gegen einige M-tropische Viren wirksam, während Internalisierung von CCR5 eine HIV-Infektion mit allen HIV-Stämmen, die CCR5 verwenden, blockieren kann (Mack et al. J. Exp. Med. 1998; 187: 1215–24).
Gleichermaßen gibt es Patienten, die an entzündlichen- oder Autoimmunerkrankungen leiden und die nicht auf gegenwärtig erhältliche Behandlungen reagieren. In anderen Fällen muss die herkömmliche Behandlung aufgrund unerträglicher Nebenwirkungen beendet werden.
In vielen Erkrankungen wie Arthritis, entzündlichen- und Autoimmunerkrankungen, z.B. entzündlichem Nierenleiden, entzündlichem Darmleiden, multipler Sklerose und Transplantatabstoßung, haben gegenwärtige Behandlungsverfahren viele Einschränkungen. Zum Beispiel schließen Stoffe, die in entzündlichen- und Autoimmunerkrankungen verwendet werden, entzündungshemmende und allgemein immunsuppressive Stoffe wie Azathioprin, Cyclophosphamid, Glucocorticoide wie Prednison und Corticosteroide; Immunsuppressiva wie Cyclosporin A, Tacrolimus (FK506), Sirolimus (Rapamycin); und Protein-Arzneistoffe wie Calcineurin, Beta-Interferon, monoclonale Anti-TNF-alpha-Antikörper (Remicade) ein. Diese Stoffe zeigen im Allgemeinen immunverändernde Wirkungen und daher können Wirksamkeits- und Nebenwirkungsprofile den Behandlungsmöglichkeiten schwerwiegende Einschränkungen auferlegen (Harrison's Principles of Internal Medicine, Herausgeber Fauci et al., 14. Auflage, McGraw-Hill Verleger).
Daher war das technische Problem, welches der vorliegenden Erfindung zu Grunde lag, verbesserte Mittel und Verfahren zur medizinischen Intervention in entzündlichen Krankheiten, Autoimmunerkrankungen und/oder viralen Infektionen der Immunzellen, z.B. HIV-Infektionen, bereitzustellen.
Die Lösung zu diesem technischen Problem wird durch die in den Ansprüchen charakterisierten Ausführungsformen bereitgestellt.
Folglich betrifft die vorliegende Erfindung ein Chemokinkonstrukt, umfassend ein Anti-CD4-scFv und ein RANTES-Chemokin (oder ein funktionelles Fragment davon), wobei das Chemokinkonstrukt die folgende Strukturdomänenform besitzt: (a) RANTES-Linker-(VH) Anti-CD4-Linker-(VL) Anti-CD4; oder (b) (VL) Anti-CD4-Linker-(VH) Anti-CD4-Linker-RANTES, oder (c) (VH) Anti-CD4-Linker-(VL) Anti-CD4-Linker-RANTES, wobei in den Alternativen (b) und (c) der Linker zwischen (VH) Anti-CD4 und RANTES oder zwischen (VL) Anti-CD4 und RANTES nicht an einem Ende an Methionin, ein Lysin oder ein Isoleucin direkt angrenzend an die erste Aminosäure von RANTES umfasst.
Der Begriff „RANTES", wie hierin vorstehend verwendet, betrifft ein funktionelles RANTES, wobei die Funktion die Bindung an CCR5 umfasst. Daher umfasst der Begriff auch Fragmente von RANTES und/oder Derivate von RANTES, welche die vorstehend beschriebenen Bedingungen erfüllen und im Stande sind CCR5 zu binden. RANTES sowie Fragmente von RANTES und RANTES-Derivate sind im Fachgebiet bekannt und werden hierin nachstehend sowie in den angefügten Beispielen erklärt. Funktionelle Fragmente von RANTES sind hierin nachstehend definiert und umfassen unter anderem die RANTES-Fragmente „delta2" oder „delta3", welchen 2 beziehungsweise 3 Aminosäuren in ihrem N-terminalen Teil fehlen. Wie vorstehend besprochen, umfasst der Begriff RANTES und RANTES-Konstrukte, wie hierin angewandt, keine RANTES-Modifikationen in der Form von „Met-RANTES" oder „AOP-RANTES".
Der Begriff „Anti-CD4-scFv" betrifft, wie hierin nachstehend weiter festgelegt, ein einkettiges Konstrukt, umfassend zumindest (VL) und (VH). Die Herstellung solcher einkettiger Konstrukte ist im Fachgebiet bekannt und darüber hinaus in den angefügten Beispielen erklärt. Die wie hierin zum Einsatz gelangten scFv-Teile sind gegen das CD4-Antigen gerichtet und/oder interagieren damit und umfassen VL- und VH-Domänen eines Antikörpers, spezifisch für das CD4-Antigen, und/oder davon abgeleitete Epitope, wobei VH und VL die variablen Regionen der schweren bzw. leichten Kette des Antikörpers betreffen. Nützliche Anti-CD4-Antikörper gemäß dieser Erfindung sind im Besonderen, aber nicht einschränkend, Antikörper, die gegen CD4 gerichtet sind, welche im Stande sind mit dem viralen gp120-Molekül um die Interaktion/Bindung mit/an CD4, einem Adhesionsmolekül, das an Klasse-II-Moleküle bindet, zu konkurrieren.
Der Begriff „Strukturdomänenform", wie hierin verwendet und beschrieben, betrifft ein Konstrukt, das verschiedene strukturelle und funktionelle Teile wie den RANTES-Teil, den Anti-CD4-scFv-Teil oder den hierin beschriebenen Linker-Anteil umfasst und die strukturelle Form der Konstrukte dieser Erfindung zeigen soll. Dadurch betrifft die hierin festgelegte Form Konstrukte, worin der erste Teil der N-terminate-Teil ist und der letzte Teil der C-terminale-Teil ist. Demgemäß befindet sich in den hierin vorstehend beschriebenen Konstrukten (a), (b) und (c) die strukturelle Form des erfinderischen Konstruktes (a) RANTES am N-Terminus und die (VL) des Anti-CD4 am C-Terminus. Für das erfinderische Konstrukt (b) und (c) ist RANTES C-terminal angeordnet und (VL) von Anti-CD4 bzw. (VH) von Anti-CD4, befinden sich am N-Terminus. Wie nachstehend hierin im Detail erklärt werden wird, müssen sich weder RANTES noch (VH) oder (VL) am extremen N- oder C-terminalen Teil des Konstruktes der Erfindung befinden. Es ist z.B. vorgesehen, dass weitere Teile mit dem N- oder C-Terminus verbunden sind. Diese zusätzlichen Teile können unter anderem Markierungen für weitere funktionelle Domänen wie weitere Cytokine/Chemokine sein.
Der gemäß dieser Erfindung angewandte Begriff „Linker" umfasst im Besonderen Peptidlinker. Wie in den angefügten Beispielen beispielhaft erläutert, sind besonders wertvolle „Linker/Linkerdomänen" gemäß dieser Erfindung Abschnitte von Glycin- und Serinresten, zum Beispiel Gly-Gly-Gly-Gly-Ser (SEQ ID NR: 51) und Multimere davon wie, unter anderem, Gly₄SerGly₄SerGly₄ (SEQ ID NR: 52) oder Gly₄SerGly₄Ser (SEQ ID NR: 53). Wie hierin nachstehend genau beschrieben werden wird, wird es bevorzugt, dass der Linker zwischen RANTES (oder seinem funktionellen Fragment) und dem Anti-CD4-scFv Gly₄SerGly₄Ser (SEQ ID NR: 53) ist und auf Nucleinsäureebene des Konstruktes eine BspE1 und BamH1 Restriktionsstelle umfassen kann. Die Linkerregion zwischen den (VH) und (VL)-Teilen der scFv-Domäne des Konstruktes kann GlyaSerGly₄SerGly₄ (SEQ ID NR: 52) umfassen.
Wie hierin vorstehend beschrieben, umfasst der Linker zwischen (VH) Anti-CD4 und RANTES oder zwischen (VL) Anti-CD4 und RANTES in den Chemokinkonstrukten, wie in den Alternativen (b) und (c) gezeigt, endständig kein Methionin (Met), kein Lysin (Lys) oder kein Isoleucin (Ile), direkt neben der ersten Aminosäure von RANTES. Darüber hinaus wird bevorzugt, dass diese letzte Aminosäure des Linkers direkt neben RANTES oder seinem funktionellen Fragment weder eine basische Aminosäure wie Arginin (Arg) oder Histidin (His) noch eine große Aminosäure wie die aromatischen Aminosäuren Phenylalanin (Phe), Tryptophan (Trp) oder Tyrosin (Tyr) umfasst. Außerdem ist eine weniger bevorzugte Aminosäure an dieser Position Prolin (Pro). Im Gegensatz dazu sind bevorzugte Aminosäuren an der letzten Position des Linkers, direkt neben RANTES oder seinem funktionellem Fragment, Glycin (Gly), Glutaminsäure (Glu), Glutamin (Gln) oder Leucin (Leu).
Der Begriff „terminal" oder „endständig" oder „an einem Ende", wie hierin vorstehend angewandt, bedeutet, dass auf die letzte C-terminate Aminosäure des Linkers direkt eine N-terminate Aminosäure einer bestimmten RANTES-Sequenz folgt. Vorzugsweise betrifft der Begriff die Tatsache, dass die „terminale" oder „endständige" Aminosäuresequenz des Linkers oder die Aminosäure des Linkers „an einem Ende" direkt neben der ersten Aminosäuresequenz von der RANTES-Sequenz liegt. Besonders bevorzugt, aber nicht einschränkend, ist die „terminale" Aminosäure des Linkers direkt mit RANTES verbunden und keine weitere(n) Aminosäure(n), die nicht zu der Aminosäuresequenz des Linkers oder der RANTES- Sequenz gehören, sind zwischen dem Linker und RANTES enthalten. Das Merkmal „terminal" oder „endständig" oder „an einem Ende", wie hierin angewandt, bedeutet auch, dass die letzte Aminosäure des C-Terminus des Linkers, welcher direkt neben der RANTES-Sequenz liegt, kein Methionin, kein Lysin oder kein Isoleucin ist.
Dennoch ist es gemäß der vorliegenden Erfindung vorgesehen, dass das erfinderische Chemokinkonstrukt ein Anti-CD4-scFv und ein RANTES-Chemokin (oder ein funktionelles Fragment davon) umfasst, wobei das Chemokinkonstrukt die Strukturdomänenform von (a) RANTES-Linker-(VH) Anti-CD4-Linker-(VL) Anti-CD4; oder (b) (VL) Anti-CD4-Linker-(VH) Anti-CD4-Linker-RANTES oder (c) (VH) Anti-CD4-Linker-(VL) Anti-CD4-Linker-RANTES hat, wobei in den Alternativen (b) und (c) der Linker zwischen (VH) Anti-CD4 und RANTES oder zwischen (VL) Anti-CD4 und RANTES kein Methionin, kein Lysin oder kein Isoleucin direkt neben der ersten Aminosäure von RANTES umfasst.
Überraschenderweise wurde gemäß dieser Erfindung herausgefunden, dass spezifische Chemokinkonstrukte, wie definiert, zu einer spezifischen und effizienten Internalisierung von CCR5 führen, ohne den unerwünschten Effekt, dass eine Reduktion an T-Zellenaktivität stattfindet. Dieses überraschende Ergebnis, ermöglicht es dem Fachmann jetzt, spezielle Behandlungs- und/oder Verhütungsverfahren für Erkrankungen und Störungen bereitzustellen, an denen CCR5 beteiligt ist oder es exprimiert oder sogar überexprimiert wird. Solche Erkrankungen umfassen HIV-Infektionen/AIDS sowie auch entzündliche und Autoimmunerkrankungen wie multiple Sklerose, reumatoide Arthritis, allergische Reaktionen, entzündliches Nierenleiden, entzündliches Darmleiden, Hautleiden oder Transplantatabstoßungen. Wie hierin nachstehend genau beschrieben, sind die Konstrukte der Erfindung nützlich, wenn ein geringer immunsuppressiver Effekt erwünscht ist. Folglich werden in Störungen wie Autoimmunerkrankungen, Transplantatabstoßungen und Entzündungen therapeutische Ansätze mit den Konstrukten der Erfindung besonders in therapeutischen Situationen zusammen mit weiteren Arzneistoffen vorgesehen.
Wie hierin in den angefügten Beispielen genau beschrieben und erklärt, wurde überraschenderweise herausgefunden, dass nicht alle RANTES-Anti-CD4-Konstrukte im Stande sind eine Internalisierung von CCR5 zu vermitteln. Ein Chemokinkonstrukt, umfassend die Strukturdomänenform RANTES-Linker-(VL) Anti- CD4-Linker-(VH) Anti-CD4 ist z.B. nicht im Stande an CD4 und/oder CCR5 zu binden und/oder CCR5 zu internalisieren. Wie hierin besprochen, umfassen besonders bevorzugte Chemokinkonstrukte die Strukturdomänenform RANTES-Linker-(VH) Anti-CD4-Linker-(VL) Anti-CD4; oder (b) (VL) Anti-CD4-Linker-(VH) Anti-CD4-Linker-RANTES oder (c) (VH) Anti-CD4-Linker-(VL) Anti-CD4-Linker-RANTES, wobei das Konstrukt von Alternative (a) auch als „RM" bezeichnet wird und das Konstrukt der Alternative (b) auch als „MR" bezeichnet wird. Die angefügten Beispiele belegen, dass unter anderem beobachtet wurde, dass die Konstrukte der Erfindung wie RM spezifisch für CD4+-T-Zellen und viel effektiver als RANTES alleine sind, wenn die Internalisierung von CCR5 bewertet wird. Das wurde unter anderem belegt, als Internalisierungstests für CCR5 durchgeführt wurden, welche die Vor-Inkubation, von PBMCs mit RANTES oder Konstrukten der Erfindung auf Eis umfassen, gefolgt durch Auswaschen von RANTES oder der erfinderischen Konstrukte und weiterer Inkubation der Zellen bei 37°C, um Internalisierung zu induzieren; siehe angefügte Beispiele und Figuren. Dieses Experiment ahmt die in vivo-Situation nach: ungebundene Konstrukte wurden gemäß ihrer Plasma-Halbwertszeiten entfernt und nur die Konstrukte, die an die Zellen gebunden waren, waren noch immer vorhanden. Die erfinderischen Konstrukte sind für eine anhaltende Zeitspanne auf CD4+-T-Zellen vorhanden und sind im Stande die Internalisierung von CCR5-Molekülen, die in die Nähe der erfinderischen an CD4 gebundenen Konstrukte kommen, zu induzieren. Daher induzieren die erfinderischen Konstrukte vorzugsweise die Internalisierung von CCR5-Molekülen, die sich in naher Umgebung von CD4-Molekülen befinden, während CCR5-Moleküle, die nicht in der Nähe von CD4 sind, nicht betroffen sind. Da unter anderem auch HIV-1 für die Infektion von der nahen Umgebung von CD4 und CCR5 abhängt, behindert die gleichzeitige Inhibierung von CD4 und CCR5 durch die erfinderischen Konstrukte die HIV-Rezeptoren selektiv. In der Tat wurde gezeigt, dass die Konstrukte der Erfindung, umfassend RANTES und Anti-CD4 deutlich mehr Wirksamkeit in der Blockierung der HIV-Infektion hatten, als die Kombination von RANTES und CD4scFv. Demgemäß sind die wichtigsten Vorteile der vorliegenden Erfindung, dass die Subpopulation der Gedächtnis-T-Zellen intakt bleibt, keine unselektive Blockierung aller CCR5+-T-Zellen vorkommt, Internalisierung von CCR5 vorzugsweise in CD4+-Zellen, die CCR5 in der nahen Umgebung zu dem CD4-Molekül exprimieren, induziert wird und die cytotoxische Aktivität von CD8+-T-Zellen nicht beeinflusst wird.
Die RANTES-Anti-CD4-Konstrukte der Erfindung binden spezifisch an CCR5- und CD4-Rezeptoren auf T-Zellen, was zu einer Internalisierung von CCR5 von der Zelloberfläche führt. Die Internalisierung von CCR5 auf CD4+-T-Zellen war, im Vergleich mit RANTES alleine, unter Verwendung der erfinderischen Konstrukte viel wirksamer. Zum Beispiel induzieren die erfinderischen Konstrukte die Internalisierung von CCR5-Molekülen, die sich nahe CD4-Molekülenbefinden, während CCR5-Moleküle, die sich nicht in der Nähe von CD4 befinden, weniger betroffen sind. Aufgrund dieser Fähigkeit ist die cytotoxische Aktivität nicht betroffen. Dies ist unter anderem in den angefügten Beispielen belegt. Es wird gezeigt, dass die gemischte Lymphocyten Kultur (MLR) durch den monoclonalen Anti-CD4-Antikörper MT413 blockiert wird, aber nicht durch die erfinderischen Konstrukte wie „RM" oder „MR". Die CCR5-Internalisierung, die durch diese Konstrukte induziert wird, führt zu einer Blockierung der Infektion von CCR5+/CD4+-T-Zellen mit Macrophagen tropischen HIV-1 Stämmen, aber induziert die Apoptose dieser T-Zellen nicht. Die erfinderischen Konstrukte interagieren, wie hierin vorstehend besprochen, gleichzeitig mit CD4 und CCR5 und sind im Stande die Internalisierung von CCR5 von der Zelloberfläche von CD4+-T-Zellen zu induzieren, in Zellen, die kein CD4 exprimieren (z.B. CD8+-T-Zellen), erfolgt jedoch nur eine schwache Internalisierung von CCR5. Dadurch wird vorzugsweise in der CD4+-CCR5+-Zellpopulation, welche das Ziel für M-tropische HIV-1-Stämme ist, die CCR5-Oberflächenexpression reduziert. Durch Anwendung der erfinderischen Konstrukte werden daher die immunsuppressiven Effekte einer umfassenden und unselektiven Entfernung von CCR5 von der Oberfläche von allen CCR5+-Zellen verhindert. Außerdem enthalten die erfinderischen Konstrukte keinen Immunoglobulin Fc-Anteil, von welchem angenommen wird, dass er nach der Anwendung von CD4-mAk für die Depletion von CD4+-T-Zellen in vivo verantwortlich ist.
Soweit die Wirksamkeit der erfinderischen Konstrukte in der Behandlung oder Co-Behandlung einer HIV-Infektion/AIDS oder in der Behandlung oder Co-Behandlung einer immunologischen Erkrankung und Störung, wie hierin beschrieben, betroffen ist, wurde überraschenderweise beobachtet, dass Antikörper gegen CCR5 nicht in der Lage sind, eine signifikante CCR5-Internalisierung auf PBMC zu induzieren. Die erfinderischen Konstrukte, umfassend ein Antikörperfragment gegen CD4 und das Chemokin RANTES, sind jedoch in der CCR5-Internalisierung höchst effizient.
Überraschenderweise haben die erfinderischen Konstrukte im Vergleich mit RANTES alleine eine höhere Wirksamkeit bei der Internalisierung von CCR5 auf CD4+-T-Zellen, eine verlängerte Wirksamkeit verglichen mit der kurzen Halbwertszeit von RANTES, eine höhere Selektivität für CCR5 auf CD4+-T-Zellen, da diese mit beiden Molekülen, CCR5 und CD4, interagieren und unter anderem einen stärkeren Blockierungseffekt auf die HIV-Infektion, im Vergleich mit RANTES alleine, aufweisen. Wenn man zum Beispiel die Wirksamkeit der Inhibierung der HIV-Infektion (BAL-Isolat) durch Bestimmung der relativen reversen Transkriptaseaktivität (RT) mit verschiedenen Molekülen (20 nM) in Betracht zieht, wurden die folgenden Resultate erhalten: erfinderisches Konstrukt RANTES-AntiCD4 (RM): 0,012; erfinderisches Konstrukt AntiCD4-RANTES (MR): < 0,0076. RANTES alleine zeigte in diesem Test jedoch eine relative RT-Aktivität von 0,05 und ein AntiCD4-mAk (MT413) alleine von 0,46. Ähnlich dazu führt ein überprüftes Anti-CD4-scFv-Konstrukt zu einer RT-Aktivität von 0,55. Hierbei sollte zur Kenntnis genommen werden, dass höhere RT-Werte auf eine höhere Produktion von HIV-1 hindeuten. Bei dem SF162-Isolate wurden die folgenden relativen reverse Transkriptase-Aktivitätswerte mit verschiedenen Molekülen bei 20 nM gemessen: erfinderisches Konstrukt RANTES-AntiCD4 (RM): 0,013; erfinderisches Konstrukt AntiCD4-RANTES (MR): 0,010; RANTES alleine: 0.31, MT413-mAk: 0,41 und ein Anti-CD4-scFv: 0,85.
Weitere ins Auge gefasste Vorteile der Chemokinkonstrukte der vorliegenden Erfindung sind, dass keine Resistenz gegenüber HIV-1-Stämmen erzeugt wird, wie das von der Behandlung mit RT (reverse Transkriptase)-Inhibitoren bekannt ist, da die erfinderischen Konstrukte CD4 blockieren, welches ein essentieller Rezeptor für alle HIV-1-Stämme ist, wobei die erfinderischen Konstrukte im Vergleich mit chemisch verbundenen Antikörpern ohne Umstände und einfach erzeugt werden können.
Wie hierin vorstehend besprochen, können nicht alle RANTES-Anti-CD4-Konstrukte die vorteilhaften Eigenschaften der erfinderischen Konstrukte bereitstellen. Chemokinkonstrukte der vorliegenden Erfindung, die funktionell sind, können leicht, wie hierin vorstehend oder in den angefügten Beispielen beschrieben, durch Tests überprüft werden. Weitere Untersuchungen umfassen unter anderem Bindungstests, welche unter Anwendung von im Fachgebiet bekannten Verfahren durchgeführt werden können. Zum Beispiel wenn die Bindung der erfinderischen Konstrukte an CD4 ausgewertet wird, werden die folgenden, nicht einschränkenden Verfahren angewandt. FACS-Analyse kann durchgeführt werden: PBMC werden mit den erfinderischen Konstrukten in verschiedenen Konzentrationen inkubiert. Nach (einem) Waschschritten) kann die Bindung der erfinderischen Konstrukte mit einem Antikörper gegen eine vorzugsweise eingeführte Markierung oder gegen RANTES ermittelt werden, gefolgt von einem sekundären markierten Antikörper. Eine ELISA-Analyse ist vorgesehen: lösliches CD4 kann als antigenes Ziel verwendet werden, welches direkt mit einer festen Matrix oder Stütze oder über einen Fang-Antikörper gegen CD4 gekoppelt ist. Nach Inkubation mit einem erfinderischen Konstrukt, das untersucht werden soll, kann der Nachweis mit einem sekundären markierten Antikörper gegen RANTES oder der möglicherweise eingeführten Markierung, durchgeführt werden. RIA (Radioimmunotest)-Tests mit: radioaktiv-markiertem löslichem CD4 können zum Nachweis der Bindungsaktivität der erfinderischen Konstrukte verwendet werden. Kompetitionstests können angewandt werden: PBMC werden mit den erfinderischen Konstrukten in unterschiedlichen Konzentrationen inkubiert. Die Zellen werden ohne Waschen mit markiertem löslichem CD4 (z.B. FITC) inkubiert. Je niedriger das erhaltene Signal mit markiertem CD4, desto höher ist die Menge an RM und MR, die an CD4+-Zellen gebunden ist. Dieser Test kann auch mittels ELISA, FACS oder ähnlichen im Fachgebiet bekannten Tests durchgeführt werden. Die Untersuchungen die angewandt werden, um die Funktionalität der erfinderischen Konstrukte zu testen, können jedoch auch die Bestimmung der Bindung der erfinderischen Konstrukte an CCR5 umfassen. Solche Untersuchungen umfassen, sind aber nicht beschränkt auf, Internalisierungstest, die nachstehend und in den angefügten Beispielen eingehend beschrieben sind, Liganden-Kompetitionstests, Calciumfluss-Tests, Migrationsstudien, cAMP-Tests, GTP-Bindungsstudien, Actin-Polymerisationsstudien oder Transkriptionsfaktor-Aktivierungstudien. Die Tests sind dem Fachmann bekannt und werden, unter anderem wie nachstehend hierin dokumentiert, durchgeführt.
Ein Internalisierungstest für CCR5 kann durch Inkubation von CCR5 exprimierenden Zellen mit den erfinderischen Konstrukten in unterschiedlichen Konzentrationen durchgeführt werden und die Zelloberflächenexpression von CCR5 wird durch FACS unter Verwendung von markiertem Antikörper gegen CCR5 durchgeführt. Auf ähnliche Weise kann ein Liganden-Kompetitionstest die Inkubation von CCR5- exprimierenden Zellen (vorzugsweise auf Eis) mit den erfinderischen Konstrukten und radioaktiv markiertem RANTES umfassen. Die Zellen werden dann gewaschen und gebundene Radioaktivität wird gemessen. Nachweis eines niedrigen radioaktiven Signals ist folglich eine Diagnose für eine starke Bindung des erfinderischen Konstruktes. Calciumflusstests umfassen die Bindung der erfinderischen Konstrukte an CCR5 exprimierende Zellen und die Messungen des induzierten Kalziumflusses durch im Fachgebiet bekannte Verfahren. In Migrationsstudien werden die erfinderischen Konstrukte auf ihre Fähigkeit überprüft, die Migration von CCR5 exprimierenden Zellen zu induzieren. Dieser Test kann in einem Boyden-Hammer-Test oder im Transwell-System durchgeführt werden. Darüber hinaus kann in cAMP-Tests die erhöhte Konzentration von intrazellulärem cAMP nach erfolgreicher Bindung der erfinderischen Konstrukte gemessen werden. Die vorstehend erwähnten GTP-Bindungsstudien umfassen die Messung von an CCR5 gebundenem GTP, da in Betracht gezogen wird, dass die Bindung der erfinderischen Konstrukte zu einer erhöhten Bindung von GTP führt. Actin-Polymerisationstests können die Messung der Polymerisation von Actin durch im Fachgebiet bekannte in vitro-Verfahren umfassen. Es ist bekannt, dass die Bindung von RANTES an CCR5 die Polymerisation von Actinmolekülen induziert, welche unter anderem durch spezifische Antikörper gegen die polymerisierte Form von Actin nachgewiesen werden könnten. Es wird angenommen, dass die erfolgreiche Bindung eines erfinderischen Konstruktes zu einem ähnlichen Actin-Polymerisations-Effekt führt. Wie hierin vorstehend erwähnt, kann auch ein Transkriptionsfaktor-Aktivierungstest angewandt werden, um die erfinderischen Konstrukte zu untersuchen. Die erfinderischen Konstrukte können eine erhöhte Expression von MAP-Kinase induzieren und zu einer Aktivierung von Transkriptionsfaktoren führen. Dieser Anstieg kann durch ELISA auf dem Proteinniveau, oder durch Array-Technologie auf dem mRNA-Niveau gemessen werden.
Darüber hinaus können die Konstrukte der Erfindung z.B. auf Blockierung der HIV-Infektion unter Verwendung von in vivo-Experimenten, vorzugsweise in Säugern, z.B. in Mäusen oder in Schimpansen, untersucht werden. Verschiedene Gewebe oder Körperflüssigkeiten können verwendet werden z.B. Blut, Serum, Milz, Lymphknoten oder Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit. Ein Beispiel eines in vivo-Tests, der für die vorliegende Erfindung angepasst werden kann, ist in Shultz et al. (2000) J Immunol. 164: 2496–507) beschrieben.
Neben den vorstehend besprochenen Testsystemen können die erfinderischen Konstrukte durch weitere im Fachgebiet beschriebene Verfahren oder durch Verfahren, die in den angefügten Beispielen erklärt und beispielhaft erläutert werden, auf ihre Bindungsfähigkeiten und/oder auf ihr Potential die CCR5-Internalisierung zu induzieren bewertet werden.
In einer bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Chemokin, wie hierin vorstehend festgelegt, worin das Anti-CD4-scFv von einem monoclonalen Anti-CD4-Antikörper abgeleitet ist. Monoclonale Antikörper, die gegen CD4 gerichtet sind, sind im Fachgebiet bekannt und unter anderem in Weissenhorn et al. (1996) Hybridoma 15, 117–124 beschrieben, in Riethmüller et al. (1992) Immunol. Rev. 129, 81–104 im Überblick besprochen.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform ist ein solcher monoclonaler Antikörper der Antikörper MT413, wie von Weissenhorn et al. (1996) Hybridoma 15, 117–124 beschrieben. Die entsprechenden Sequenzen dieses Antikörpers sind unter den GenBank-Zugangsnummern X65093 und X65086 offenbart. MT413 ist bekannt dafür, in der Inhibierung von zellulären Infektionen mit HIV-1 sogar nach der viralen Anhaftung an die Zellmembran effizient zu sein (Davis et al., 1992, Nature 358, 76–79; Rieber et al., 1992 Proc Natl Acad Sci USA 89, 10792–10796; Rieber et al., 1990, Lancet 336, 1007–1008). Dennoch und wie auch in den angefügten Beispielen erklärt, können auch Änderungen der veröffentlichten Sequenzen von MT413 im Rahmen dieser Erfindung angewandt werden. Zum Beispiel ist auch vorgesehen, dass eine Nucleotidsequenz verwendet wird, die einen Anti-CD4 (VH)-Teil codiert, welche die folgende Codierungssequenz umfasst:
und welche eine Aminosäuresequenz wie folgt codiert:
Die DNA, welche eine geänderte (VL) von MT413 codiert und die in den angefügten Beispielen erläuternd verwendet wird, umfasst die folgende Nucleotidsequenz:
Diese DNA codiert eine Aminosäuresequenz, wie hierin nachstehend gezeigt:
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform der vorliegenden Erfindung ist das Chemokinkonstrukt ein Konstrukt, worin (VH) Anti-CD4 mindestens eine CDR3 besitzt, umfassend die Aminosäuresequenz:
Lys Gly Glu Asn Gly Asn Ser Leu Ala Phe Ala Tyr (SEQ ID NR. 2)
mindesten eine CDR2 besitzt, umfassend die Aminosäuresequenz:
Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Tyr Asn Glu Asn Leu Lys Asp (SEQ ID NR. 4)
und/oder mindestens eine CDR1 besitzt, umfassend die Aminosäuresequenz:
Asp Tyr Val Ile Asn (SEQ ID NR. 6).
Vorzugsweise besitzt die DNA-Sequenz, die (VH) anti-CD4 codiert, mindestens eine CDR3, umfassend die Nucleinsäuresequenz:
aag ggg gag aat ggt aac tcc ctg gcg ttt gct tac (SEQ ID NR. 1),
besitzt mindestens eine CDR2, umfassend die Nucleinsäuresequenz:
gag att tat cct gga agt ggt agt gat tac tat aat gag aac ctc aag gac (SEQ ID NR. 3)
und/oder besitzt mindestens eine CDR1, umfassend die Nucleinsäuresequenz:
gac tat gtt ata aat (SEQ ID NR. 5).
Darüber hinaus stellt die vorliegende Erfindung ein Chemokin bereit, worin (VL) Anti-CD4, wie hierin festgelegt, mindestens eine CDR3 besitzt, umfassend die Aminosäuresequenz:
Gln Gln Ser Ile Gln Asp Pro Cys Thr (SEQ ID NR. 8),
mindestens eine CDR2 besitzt, umfassend die Aminosäuresequenz:
Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser (SEQ ID NR. 10)
und/oder mindestens eine CDR1 besitzt, umfassend die Aminosäuresequenz:
Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn (SEQ ID NR. 12).
Vorzugsweise besitzt die wie hierin vorstehend festgelegte DNA-Sequenz, welche (VL) Anti-CD4 codiert, mindestens eine CDR3, umfassend die Nucleinsäuresequenz: cag caa agt att cag gat ccg tgc acg (SEQ ID NR. 7),
besitzt mindestens eine CDR2, umfassend die Nucleinsäuresequenz:
gct gca tcc aat cta gaa tct (SEQ ID NR. 9)
und/oder besitzt mindestens eine CDR1, umfassend die Nucleinsäuresequenz:
caa agt gtt gat tat gat ggt gat agt tat atg aac (SEQ ID NR. 11).
Besonders bevorzugt umfasst der Anti-CD4-scFv-Teil des Chemokinkonstruktes der vorliegenden Erfindung nicht nur mindestens eine der wie vorstehend hierin festgelegten CDRs, sondern umfasst zwei und noch mehr bevorzugt drei CDRs, d.h. die dazugehörigen CDRs1,CDRs2 und CDRs3.
Besonders bevorzugt betrifft die Erfindung ein Chemokinkonstrukt, wie hierin vorstehend festgelegt, worin das RANTES oder RANTES-Fragment ein RANTES ist, umfassend die Aminosäuresequenz
(SEQ ID NR. 14; Wildtyp-RANTES);
eine Aminosäurensequenz
(SEQ ID NR. 16; RANTES, umfassend einen Aminosäureaustausch von Glutaminsäure zu Glutamin an Position 66);
eine Aminosäuresequenz
(SEQ ID NR. 22; funktionelles RANTES-Fragment, wobei die ersten zwei Aminosäuren entfernt worden sind);
oder eine Aminosäuresequenz
(SEQ ID NR. 24; RANTES, umfassend einen Aminosäureaustausch von Glutaminsäure zu Glutamin an Position 66 und umfassend eine Deletion von zwei Aminosäuren am N-Terminus).
Vorzugsweise ist das RANTES, welches als funktioneller Teil in dem Chemokinkonstrukt der vorliegenden Erfindung angewandt werden soll, durch eine DNA codiert, umfassend die Nucleinsäuresequenz
die Nucleinsäuresequenz:
die Nucleinsäuresequenz:
oder die Nucleinsäuresequenz:
Wie in den angefügten Beispielen erklärt, sind die Chemokinkonstrukte, die geändertes und/oder mutiertes RANTES umfassen, in Übereinstimmung mit dieser Erfindung noch funktionell. Zum Beispiel kann RANTES, das eine N-terminate Deletion von zwei Aminosäuren umfasst, angewandt werden. Doch sogar eine Deletion von drei Aminosäuren im RANTES-Teil führt zu einem funktionellen, erfinderischen Chemokinkonstrukt. Die Konstrukte der Erfindung sowie die geänderten Konstrukte, die unter anderem funktionelle Fragmente von RANTES umfassen, können durch hierin vorstehend und in den angefügten Beispielen beschriebene Tests auf Funktionalität untersucht werden. Darüber hinaus kann ein Chemokinkonstrukt der vorliegenden Erfindung ein geändertes RANTES-Molekül umfassen, wie das Leu-RANTES (Polo et al., 2000, Eur. J. Immunol. 30, 3190–3198).
Der Linker, der in den Chemokinkonstrukten der Erfindung verwendet werden soll, ist vorstehend beschrieben worden. Vorzugsweise betrifft die Erfindung ein Chemokinkonstrukt, in dem der Linker zwischen (VH) Anti-CD4 oder (VL) Anti-CD4 und RANTES zwischen 3 und 30 Aminosäuren und stärker bevorzugt zwischen 5 und 15 Aminosäuren umfasst. Der Polypeptidlinker zwischen (VH) Anti-CD4 und (VL) Anti-CD4 umfasst vorzugsweise zwischen 5 und 30 Aminosäuren, vorzugsweise zwischen 7 und 20 Aminosäuren, stärker bevorzugt zwischen 8 und 20 Aminosäuren, stärker bevorzugt zwischen und stärker bevorzugt zwischen 8 und 18 Aminosäuren und am meisten bevorzugt zwischen 13 und 17 Aminosäuren. Vorzugsweise kann ein hydrophiler, flexibler Peptidlinker in dem Chemokinkonstrukt der Erfindung angewandt werden. In diesem Zusammenhang sind die bevorzugten Aminosäuren: Gly, Ser, Thr und Val.
Anzuwendende Linker in den Chemokinkonstrukten umfassen vorzugsweise die Aminosäuresequenz Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NR.: 51). Wie hierin vorstehend besprochen und wie in den angefügten Beispielen erklärt, können die Linker jedoch auch Multimere der Gly/Ser-Sequenz umfassen, wie (Gly₄Ser)₂ (SEQ ID NR.: 53).
In Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung können die erfinderischen Chemokinkonstrukte auch (weiters) eine Markierung umfassen. Diese Markierungen sind in Reinigungsverfahren nach der Synthese der erfinderischen Konstrukte besonders nützlich oder können als Marker zum Einsatz gelangen. Solche Markierungen umfassen Myc-Markierungen, FLAG-Markierungen, HA-Markierungen, HIS-Markierungen und ähnliche. Vorzugsweise haben diese Markierungen eine Aminosäurelänge im Bereich von einer bis 30 Aminosäuren.
In einer am meisten bevorzugten Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung ein Chemokinkonstrukt, umfassend eine Aminosäuresequenz
Vorzugsweise ist das erfinderische Chemokinkonstrukt durch eine Nucleinsäuresequenz codiert

oder durch ein Nucleinsäuremolekül, umfassend die folgende Nucleinsäuresequenz:
Die Erfindung stellt auch Chemokinkonstrukt bereit, worin das Chemokinkonstrukt, wie hierin vorstehend festgelegt, weiters ein zusätzliches Cytokin oder Chemokin umfasst, welches mit dem Anti-CD4-scFv-Teil verbunden ist. In diesem Zusammenhang sind unter anderem Chemokine bevorzugt, die im Stande sind, an HIV-Hilfsrezeptoren wie CXCR4 oder CMV-US 28 zu binden. Die meisten primären klinischen Isolate von Immunschwächeviren von Primaten verwenden CCR5 zum Eintreten (Feng et al., Science 272, 872–877 (1996); Choe et al., Cell 85, 1135–1148 (1996); Deng et al, Nature 381, 661–666 (1996); Dragic et al., Nature 381, 667–673 (1996); Doranz et al., Cell 85, 1149–1158 (1996); Alkhatib et al., Science 272, 1955–1958 (1996)). Für die meisten HIV-1-Isolate, die übertragen werden und die während der frühen Jahre der Infektion vorherrschen, ist CCR5 ein obligater Hilfsrezeptor und wenige Personen, die in der CCR5-Expression genetisch defizient sind, sind relativ resistent gegen die HIV-1-Infektion (Connor et al., J. Exp. Med. 185, 621–628 (1997); Zhang et al., Nature 383, 768 (1996); Björndal et al., J. Virol. 71, 7478–7487 (1997); Dean et al., Science 273, 1856–1862 (1996); Liu et al., Cell 86, 367–377 (1996); Paxton et al., Nature Med. 2, 412–417 (1996); Samson et al., Nature 382, 722–725 (1996)). HIV-1-Isolate, die sich später im Laufe der Infektion entwickeln, verwenden oft andere Chemokinrezeptoren, oft CXCR4 zusätzlich zu CCR5. Spezifische weitere Hilfsrezeptoren gemäß der vorliegenden Erfindung umfassen, aber sind nicht limitiert auf, CXCR3, CXCR4, CXCR5, CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR5, CCR6, CCR7, CCR8, CCR9, XCR1, CCR10 und CX3CR1. Chemokine und/oder Chemokinliganden, die an die Rezeptoren binden, sind im Fachgebiet wohlbekannt und dargestellt, unter anderem offenbart in Murphy et al., (2000), Pharm. Reviews 52, 145–176. Die Chemokine/Liganden sind vorzugsweise von Primaten, stärker bevorzugt menschliche Chemokine/Liganden.
Demgemäß umfassen diese Chemokine oder „Rezeptorliganden", z.B. für CCR2, die Chemokine MIP1alpha, MCP-1 und MCP-2, für CCR3 die Chemokine MCP-2, Eotaxin, Eotaxin3, Eotaxin4, LKN1, MPIF-2 und LD78beta, für CCR5 die Chemokine RANTES, MIP1alpha, MIP1beta, MCP-2 und LD78beta, für CCR8 die Chemokine I-309, MIPbeta und TARC, für CXCR6 den Ligand CXCL16, für CX3CR1 das Fractalkin und für CMV-US28 das MCP-1, MIP-1alpha und MIP-1beta. Jedoch ist auch vorhergesehen, dass ein weiters RANTES oder ein funktionelles Fragment davon mit dem Anti-DC4-scFv-Teil der vorliegenden Erfindung verbunden werden kann. In Übereinstimmung mit dieser Erfindung können auch verkürzte oder veränderte Versionen dieser Liganden/Chemokine, in dem hierin beschriebenen erfinderischen „doppeltem Chemokinkonstrukt" verwendet werden. Ein besonders bevorzugtes zusätzliches Chemokin, das mit dem Anti-CD4-scFv-Teil verbunden werden soll, ist SDF-1 oder ein funktionelles Fragment davon. SDF-1 ist der Ligand, der im Stande ist, an den HIV-Hilfsrezeptor CXCR4 zu binden, der von T-tropischen HIV-1-Stämmen verwendet wird. SDF-1 ist in verschiedenen Formen vorhanden, einer Alpha- und einer Beta-Form, welche beiden in Übereinstimmung mit der vorliegenden Erfindung angewandt werden können.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung darüber hinaus ein Chemokinkonstrukt bereit, welches die Strukturdomänenform von (a) RANTES-Linker-(VH) Anti-CD4-Linker-(VL) Anti-CD4-Linker-SDF-1; (b) SDF-1-Linker-(VL) Anti-CD4-Linker-(VH)-Anti-CD4-Linker-RANTES oder (c) SDF-1-Linker-(VH) Anti-CD4-Linker-(VL) Anti-CD4-Linker-RANTES hat.
Die Erfindung betrifft auch ein Polynucleotid, welches nach Expression ein wie hierin festgelegtes Chemokinkonstrukt codiert. Vorzugsweise ist dieses Polynucleotid (a) ein Polynucleotid, umfassend das Nucleinsäuremolekül, welches im Besonderen das wie in SEQ ID NR: 18, SEQ ID NR: 20 oder SEQ ID NR: 30 dargestellte Polypeptid codiert; (b) ein Polynucleotid, umfassend das Nucleinsäuremolekül, wie in SEQ ID NR: 17, SEQ ID NR: 19 oder SEQ ID NR: 29 dargestellt; oder (c) ein Polynucleotid, welches unter stringenten Bedingungen mit dem komplementären Strang eines Polynucleotids von (a) oder (b) hybridisiert.
Hinsichtlich der Polynucleotide/Nucleotidsequenzen, die unter (c) vorstehend charakterisiert sind, versteht sich der Begriff „Hybridisieren" in diesem Zusammenhang als Bezug nehmend auf konventionelle Hybridisierungsbedingungen, vorzugsweise solche wie Hybridisierung in 50% Formamid/6 × SSC/0,1%SDS und 100 μg/ml ssDNA, wobei die Temperaturen für die Hybridisierung über 37°C liegen und die Temperaturen für das Waschen in 0,1 × SSC/0,1%SDS über 55°C liegen. Besonders bevorzugt bezieht sich der Begriff „Hybridisieren" auf stringente Hybridisierungsbedingungen zum Beispiel solche wie in Sambrook et al., „Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York, 1989, beschrieben. Es ist vorgesehen, dass die vorstehend unter (c) charakterisierten Polynucleotide höchst homolog zu den Polynucleotiden sind, wie sie in (a) und/oder (b) festgelegt sind und eine Homologie von mindestens 95%, stärker bevorzugt von mindestens 97% und am meisten bevorzugt 99% mit den Polynucleotiden von (a) und/oder (b) aufweisen.
Polynucleotide, wie sie unter (c) definiert und charakterisiert sind, können daher Polypeptide codieren, die zu den Polypeptiden, wie sie in (a) und (b) definiert sind, hoch homolog sind. Der Fachmann kann das Vermögen solcher homologer Polypeptide CCR5 zu internalisieren leicht überprüfen, zum Beispiel bei Zellen, die mit einem Immunschwächevirus von Primaten infiziert sind, wie HIV-1, oder bei Zielzellen, die an immunologischen Erkrankungen oder, wie sie hierin offengelegt sind, beteiligt sind. Der Fachmann kann leicht die in vitro-, in vivo- und ex vivo-Experimente der angefügten Beispiele einsetzen, um die Bindungs- und/oder Depletionseigenschaften solcher Konstrukte zu bestätigen.
Darüber hinaus können die Polynucleotide/Nucleinsäuremoleküle zum Beispiel Schwefelesterbindungen und/oder Nucleotidanaloge enthalten. Diese Änderungen können zur Stabilisierung der Nucleinsäuremoleküle gegen Endo- und/oder Exonucleasen in der Zelle nützlich sein. Die Nucleinsäuremoleküle können durch einen entsprechenden Vektor transkribiert werden, welcher ein chimäres Gen enthält, das die Transkription des Nucleinsäuremoleküls in der Zelle erlaubt.
Das Polynucleotid/Nucleinsäuremolekül in der Zusammensetzung der vorliegenden Erfindung kann ein rekombinant hergestelltes chimäres Nucleinsäuremolekül sein, das jede der zuvor erwähnten Nucleinsäuremoleküle, entweder allein oder in Kombination, umfasst.
Gemäß einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung Polynucleotide, die mit geeigneten, im Fachgebiet bekannten Kontrollsequenzen der Expression fusioniert sind, um eine ordentliche Transkription und Translation der Polypeptide sicherzustellen. Die Polypeptide können z.B. DNA, cDNA, RNA oder synthetisch hergestellte DNA oder RNA oder auf rekombinante Weise hergestellte chimäre Nucleinsäuremoleküle sein, die jedwede dieser Polynucleotide, entweder allein oder in Kombination, umfassen. Vorzugsweise ist das Polynucleotid Teil eines Vektors.
Eine bevorzugte Ausführungsform der Erfindung betrifft einen Vektor, umfassend die zuvor erwähnten Polynucleotide.
Der Begriff „Vektor" definiert gemäß der im Fachgebiet bekannten Definition ein Vehikel, durch welches ein fremdes Nucleotid in einen Organismus transferiert werden kann.
Vorzugsweise sind die Vektoren Expressionsvektoren, welche die Expression eines Peptids, welches durch das Polynucleotid codiert wird, ermöglichen.
Solche Vektoren können weitere Gene wie zum Beispiel Markergene umfassen, welche die Selektion des Vektors in einer geeigneten Wirtszelle und unter geeigneten Bedingungen erlauben. Vorzugsweise ist das Polynucleotid der Erfindung funktionell mit Kontrollsequenzen der Expression verbunden, um dadurch eine Expression in prokaryontischen oder eukaryontischen Zellen zu ermöglichen. Die Expression des Polynucleotids umfasst die Transkription des Polynucleotids in eine mRNA, die translatiert werden kann. Regulatorische Elemente, welche die Expression in eukaryontischen Zellen, vorzugsweise Säugerzellen, garantieren, sind dem Fachmann gut bekannt. Sie umfassen normalerweise regulatorische Sequenzen, welche die Transkriptionsinitiation garantieren und wahlweise Poly-(A)-Signale, welche die Termination der Transkription und Stabilisierung des Transkripts garantieren. Zusätzliche regulatorische Elemente können Enhancer der Transkription sowie auch der Translation und/oder normalerweise damit verbundene oder heterologe Promotorregionen einschließen. Mögliche regulatorische Elemente, die die Expression in prokaryontischen Wirtszellen erlauben, umfassen z.B. in E. coli den PL-, lac-, trp- oder tac-Promotor und Beispiele für regulatorische Elemente, die die Expression in eukaryontischen Wirtszellen erlauben, sind der AOX1- oder GAL1-Promotor in Hefe oder der CMV-, SV40,- RSV-Promotor (Rous-Sarcoma-Virus), CMV-Enhancer, SV40-Enhancer oder ein Globin-Intron in Säuger- und anderen tierischen Zellen. Neben Elementen, die für die Initiation der Transkription verantwortlich sind, können solche regulatorischen Elemente auch Transkriptions-Terminationssignale, wie zum Beispiel die SV40-poly-A-Stelle oder die tk-poly-A-Stelle stromabwärts vom Polynucleotid umfassen. Darüber hinaus, abhängig davon welches Expressionssystem verwendet wird, können Leader-Sequenzen zu der codierenden Sequenz des Polypeptid/Chemokinkonstruktes der Erfindung hinzugefügt werden, die im Stande sind, das Polypeptid in ein zelluläres Kompartiment zu lenken oder in das Medium auszuscheiden, und diese sind im Fachgebiet gut bekannt, siehe auch z.B. die angefügten Beispiele. Die Leader-Sequenz(en) ist (sind) in geeigneter Phase mit Translations-, Initiations- und Terminations-Sequenzen zusammengebaut und vorzugsweise ist eine Leader-Sequenz im Stande die Sekretion des translatierten Proteins oder eines Teils davon in den periplasmatischen Raum oder ein extrazelluläres Medium zu lenken. Wahlweise kann die heterologe Sequenz ein Fusionsprotein, einschließlich eines N-terminalen Identifikationspeptids codieren, welches geeignete Eigenschaften vermittelt, z.B. Stabilisierung oder vereinfachte Reinigung des exprimierten rekombinanten Produkts; siehe vorstehend. In diesem Zusammenhang sind im Fachgebiet geeignete Expressionsvektoren bekannt, wie zum Beispiel der Okayama-Berg-cDNA-Expressionsvektor pcDV1 (Pharmacia), pCDM8, pRc/CMV, pcDNA1, pcDNA3 (Invitrogen) oder pSPORT1 (GIBCO BRL).
Vorzugsweise werden die Kontrollsequenzen der Expression eukaryontische Promotorsysteme in Vektoren sein, die im Stande sind eukaryontische Wirtszellen zu transformieren oder transfizieren, aber Kontrollsequenzen für prokaryontische Wirte können auch verwendet werden. Wurde der Vektor erst einmal in einen geeigneten Wirt inkorporiert, wird der Wirt unter entsprechenden Bedingungen gehalten, die für einen hohen Expressionsgrad der Nucleotidsequenz geeignet sind, und wie erwünscht kann die Gewinnung und Reinigung des Polypeptids/Chemokinkonstruktes der Erfindung folgen; siehe z.B. die angefügten Beispiele.
Wie vorstehend beschrieben, kann das Polynucleotid, welches das Polypeptid/Chemokinkonstrukt der Erfindung codiert, alleine oder als Teil eines Vektors verwendet werden, um das Polypeptid der Erfindung in Zellen zu exprimieren, für z.B. Gentherapie, um mit HIV-Infektion verwandte Erkrankungen zu behandeln. Die Polynucleotide oder Vektoren, welche die DNA-Sequenzen) enthalten, die eine beliebige der vorstehend beschriebenen Polypeptide codiert (codieren), werden in die Zellen eingeführt, welche wiederum das Polypeptid von Interesse produzieren. Gentherapie, die darauf basiert therapeutische Gene durch ex vivo- oder in vivo-Verfahren in Zellen einzuführen, ist eine der wichtigsten Anwendungen von Gentransfer. Passende Vektoren, Verfahren oder Gentransfer- Systeme für in vitro- oder in vivo-Gentherapie werden in der Literatur beschrieben und sind dem Fachmann bekannt; siehe z.B. Giordano et al., Nature Medicine 2 (1996), 534–539; Schaper & Ito, Circ. Res. 79 (1996), 911–919; Anderson, Science 256 (1992), 808–813; Verma, Nature 389 (1994), 239; Isner et al., Lancet 348 (1996), 370–374; Muhlhauser et al., Circ. Res. 77 (1995), 1077–1086; Onodera et al., Blood 91 (1998), 30–36; Verma et al., Gene Ther. 5 (1998), 692–699; Nabel et al., Ann. N. Y. Acad. Sci. 811 (1997), 289–292; Verzeletti et al., Hum Gene Ther. 9 (1998), 2243–51; Wang & Finer, Nature Medicine 2 (1996), 714–716; WO 94/29469; WO 97/00957, US 5,580,859; US 5,589,466; oder Schaper & Ito, Current Opinion in Biotechnology 7 (1996), 635–640 und darin zitierte Referenzen. Die Polynucleotide und Vektoren der Erfindung können für die direkte Einführung oder für die Einführung durch Liposomen oder viralen Vektoren (z.B. adenoviral, retroviral) in die Zelle ausgelegt sein. Vorzugsweise ist die Zelle eine Keimbahnzelle, embryonische Zelle oder Eizelle oder davon abgeleitet, besonders bevorzugt ist die Zelle eine Stammzelle. Ein Beispiel für eine embryonische Stammzelle kann unter anderem eine Stammzelle sein, wie sie in Nagy et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90 (1993), 8424–8428, beschrieben ist.
In Übereinstimmung mit dem vorstehend Erwähnten betrifft die vorliegende Erfindung Vektoren, im Besonderen Plasmide, Cosmide, Viren und Bacteriophagen, die herkömmlich in der Gentechnik verwendet werden und welche ein Polynucleotid umfassen, das ein Polypeptid/Chemokinkonstrukt der Erfindung codiert. Vorzugsweise ist der Vektor ein Expressionsvektor und/oder ein Gentransfer- oder Targeting-Vektor. Expressionsvektoren, die von Viren wie zum Beispiel Retroviren, Vaccinia-Virus, Adeno-assoziiertem Virus, Herpesviren oder Rinder-Papillomvirus abgeleitet werden, können für den Transfer der Polynucleotide oder Vektoren der Erfindung in angesteuerte Zellpopulationen verwendet werden. Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, können verwendet werden, um rekombinante Vektoren zu konstruieren; siehe zum Beispiel die Verfahren, die in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory (1989) N. Y. und Ausubel, Current Protocolls in Molecularbioloy, Green Publishing Assosiates and Wiley Interscience, N. Y. (1989), beschrieben sind. Wahlweise können die Polynucleotide und Vektoren der Erfindung, zum Transfer in Zielzellen in Liposomen rekonstituiert werden. Die Vektoren, welche die Polynucleotide der Erfindung enthalten, können durch wohl bekannte Verfahren, welche je nach Art des zellulären Wirtes variieren, in eine Wirtszelle transferiert werden. Zum Beispiel wird Calciumchlorid-Transfektion herkömmlicherweise für prokaryontische Zellen benützt, wohingegen eine Calciumphosphat-Behandlung oder Elektroporation für andere zelluläre Wirte verwendet werden kann; siehe Sambrook et. al. vorstehend. Sobald sie exprimiert sind, können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung gemäß den Standardverfahren des Fachgebietes, einschließlich Ammoniumsulfat-Fällung, Affinitätssäulen, Säulenchromatography, Gel-Elektrophorese und ähnlichem, gereinigt werden; siehe Scopes, „Protein Purification", Springer-Verlag, N. Y. (1982). Im Wesentlichen reine Polypeptide von mindestens etwa 90 bis 95% Homogenität werden bevorzugt und eine Homogenität von 98 bis 99% oder mehr wird für pharmazeutische Verwendungen am meisten bevorzugt. Sobald sie gereinigt sind, teilweise oder bis zur Homogenität, wie gewünscht, können die Polypeptide dann therapeutisch (einschließlich extrakorporal) oder in der Entwicklung und Durchführung von Testverfahren verwendet werden.
In einer noch weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung eine Zelle, die das vorstehend beschriebene Polynucleotid oder den vorstehend beschriebenen Vektor enthält. Demgemäß betrifft eine besonders bevorzugte Ausführungsform der Erfindung eine Zelle, die mit dem zuvor erwähnten Polynucleotid transfiziert ist. Vorzugsweise ist die Zelle eukaryontisch, besonders bevorzugt eine Säugerzelle, wenn unter anderem therapeutische Verwendungen des Polypeptides vorgesehen sind. Besonders bevorzugte Zellen sind CHO-Zellen wie CHO DHFR^–-Zellen, CHO K1-Zellen, X63- oder HEK 293-Zellen. Andere Zellen als Säugerzellen wie Insektenzellen, z.B. SP-2-Zellen, können jedoch angewandt werden. Natürlich können auch Hefe und andere weniger bevorzugte prokaryontische, z.B. bakterielle Zellen, Verwendung finden, besonders wenn das produzierte Polypeptid als ein Forschungsinstrument verwendet wird.
Das Polynucleotid oder der Vektor der Erfindung, der in der Wirtszelle vorhanden ist, kann entweder im Genom der Wirtszelle integriert sein, oder es/er kann extrachromosomal beibehalten werden.
Der Begriff „prokaryontisch" soll alle Bakterien einschließen, die mit DNA- oder RNA-Molekülen zur Expression eines Polypepeptides der Erfindung transformiert oder transfiziert werden können. Prokaryontische Wirte können Gram-negative sowie auch Gram-positive Bakterien wie zum Beispiel E. coli, S. typhimurium, Serratia marcescens und Bacillus subtilis einschließen. Der Begriff „eukaryontisch" soll Hefe, höhere Pflanzen, Insekten- und vorzugsweise Säugerzellen einschließen. Abhängig vom in einem rekombinanten Herstellungsverfahren zum Einsatz gelangten Wirt können die Polypeptide der vorliegenden Erfindung glykosyliert oder nicht glycosyliert sein. Polypeptide der Erfindung können auch am Anfang einen Methionin-Aminosäurerest einschließen. Ein Polynucleotid, welches ein Polypeptid der Erfindung codiert, kann verwendet werden, um den Wirt unter Verwendung eines beliebigen Verfahrens, das einem Durchschnittsfachmann allgemein bekannt ist, zu transformieren oder transfizieren. Ganz besonders bevorzugt ist die Verwendung eines Plasmids, eines Vektors oder eines Virus, welches(r) die codierende Sequenz des Polynucleotids der Erfindung enthält, und damit genetisch verbunden ist eine N-terminale FLAG-Markierung und/oder C-terminate His-Markierung. Vorzugsweise beträgt die Länge der FLAG-Markierung etwa 4 bis 8 Aminosäuren, besonders bevorzugt 8 Aminosäuren. Verfahren zur Herstellung von fusionierten, funktionell verknüpften Genen und deren Expression in z.B. Säugerzellen und Bakterien, sind im Fachgebiet gut bekannt (Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, N. Y., 1989). Die darin beschriebenen genetischen Konstrukte und Verfahren können zur Expression des Polypeptids der Erfindung in eukaryontischen oder prokaryontischen Wirten verwendet werden. Im Allgemeinen werden Expressionsvektoren, die Promotorsequenzen enthalten, welche die effiziente Transkription des inserierten Polynucleotids erleichtern, in Verbindung mit dem Wirt verwendet. Der Expressionsvektor enthält üblicherweise einen Replikationsursprung, einen Promotor und einen Terminator sowie auch spezifische Gene, die im Stande sind, eine phänotypische Selektion der transformierten Zellen bereitzustellen. Darüber hinaus können transgene Tiere, vorzugsweise Säuger, die Zellen der Erfindung umfassen, zur Massenproduktion des Polypeptids der Erfindung verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung daher ein Verfahren zur Erzeugung des vorstehend beschriebenen Chemokinkonstruktes, umfassend die Züchtung einer vorstehend beschriebenen Zelle der Erfindung unter Bedingungen, die zur Expression des Polypeptids geeignet sind, und die Isolierung des Konstruktes von der Zelle oder dem Kulturmedium.
Der transformierte Wirt kann in Fermentern gezüchtet werden und gemäß den im Fachgebiet bekannten Verfahren kultiviert werden, um optimales Zellwachstum zu erzielen. Die Polypeptide der Erfindung können dann vom Wachstumsmedium, zellulären Lysaten oder zellulären Membranfraktionen isoliert werden. Die Isolierung und Reinigung der z.B. (mikrobiell) exprimierten Polypeptide/Chemokinkonstrukte der Erfindung kann durch jedwede herkömmliche Mittel erfolgen, wie zum Beispiel präparative chromatographische Trennungen und immunologische Trennungen wie zum Beispiel jene, die die Verwendung von monoclonalen oder polyclonalen Antikörpern einschließen, die z.B. gegen eine Markierung des Polypeptid/Chemokinkonstruktes der Erfindung gerichtet sind oder, wie in den angefügten Beispielen beschrieben, sind.
Folglich erlaubt die vorliegende Erfindung die rekombinante Herstellung von Polypeptid/Chemokinkonstrukten, umfassend Bindungsstellen, die Affinität und Spezifität für ein Epitop des CD4- bzw. CCR5-Antigens (Rezeptor für RANTES) und wahlweise eine weitere Funktion aufweisen.
Abhängig von der Wirtszelle können Renaturierungs-Verfahren benötigt werden, um eine ordentliche Konformation zu erlangen. Falls nötig, können im Erstreben, die Bindung zu optimieren, Punkt-Substitutionen unter Verwendung herkömmlicher Kasetten-Mutagenese oder anderer Proteinmanipulations-Methodik, wie sie hierin offenbart ist, gemacht werden. Die Erzeugung der Polypeptide der Erfindung kann auch vom Wissen um die Aminosäuresequenz (oder korrespondierende DNA- oder RNA-Sequenz) von bioaktiven Proteinen wie zum Beispiel Enzymen, Toxinen, Wachstumsfaktoren, Zelldifferenzierungsfaktoren, Rezeptoren, anti-Metaboliten, Hormonen oder verschiedenen Cytokinen oder Lymphokinen abhängen. Solche Sequenzen sind in der Literatur dokumentiert und über computerisierte Datenbanken erhältlich.
Darüber hinaus können die Konstrukte der Erfindung, wie in den angefügten Beispielen dokumentiert, in der Behandlung von immunologischen Erkrankungen, insbesondere Autoimmunerkrankungen, allergischen Erkrankungen, entzündlichen Erkrankungen und AIDS (HIV-Infektion) verwendet werden.
Demgemäß stellt die vorliegende Erfindung Zusammensetzungen bereit, umfassend die/das zuvor erwähnte(n) Polypeptid(e)/Chemokinkonstrukt(e), die Polynucleotide oder die Vektoren der Erfindung.
Der Begriff Zusammensetzung im Zusammenhang mit dieser Erfindung umfasst mindestens ein Polynucleotid, einen Vektor, Wirt, ein Antikörperkonstrukt und/oder Chemokinkonstrukt, wie hierin beschrieben. Die Zusammensetzung umfasst wahlweise weiterhin andere Moleküle entweder alleine oder in Kombination, wie z.B. Moleküle, die im Stande sind das Immunsystem zu modulieren und/oder zu beeinträchtigen. Die Zusammensetzung kann in fester, flüssiger oder gasförmiger Form vorliegen und kann unter anderem in Form eines Pulvers oder von Pulvern, einer Tablette oder von Tabletten, einer Lösung oder von Lösungen oder eines Aerosols oder von Aerosolen vorliegen. In einer bevorzugten Ausführungsform umfasst die Zusammensetzung mindestens zwei, vorzugsweise drei, stärker bevorzugt vier, am meisten bevorzugt Verbindungen, wie in der Erfindung beschrieben.
Vorzugsweise ist diese Zusammensetzung ein Arzneistoffe, wahlweise weiterhin umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff, ein pharmazeutisch verträgliches Verdünnungsmittel und/oder einen pharmazeutisch verträglichen Excipienten.
Der Begriff „Arzneistoffe", wie gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet, umfasst mindestens die wie hierin identifizierte Verbindung wie zum Beispiel ein Polypeptid/Chemokinkonstrukt, wahlweise weitere Moleküle, entweder alleine oder in Kombinaltion, z.B. Moleküle wie Cytokine, Chemokine, Immunoglobuline oder Lymphokine und wahlweise Hilfsmittel.
Beispiele von geeigneten pharmazeutischen Trägerstoffen sind im Fachgebiet gut bekannt und schließen phosphatgepufferte Salzlösungen, Wasser, Emulsionen wie zum Beispiel Öl/Wasser Emulsionen, verschiede Arten von Benetzungsmittel, sterile Lösungen usw. ein. Zusammensetzungen, die solche Trägerstoffe umfassen, können durch wohlbekannte herkömmliche Verfahren formuliert werden. Diese Arzneistoffe können dem Individuum in einer geeigneten Dosis verabreicht werden. Die Verabreichung von geeigneten Zusammensetzungen kann über verschiedene Wege, z.B. durch intravenöse, intraperitoneale, subcutane, intramuskuläre, topische oder intradermale Verabreichung, durchgeführt werden. Intravenöse Verabreichung ist besonders bevorzugt. Der Dosierungsplan wird durch den behandelnden Arzt und klinische Faktoren bestimmt sein. Wie im medizinischen Fachgebiet gut bekannt ist, häng: die Dosierung jedes einzelnen Patienten von vielen Faktoren ab, einschließlich der Größe des Patienten, Körperoberfläche, dem Alter, der jeweiligen zu verabreichenden Verbindung, dem Geschlecht, der Zeit und dem Weg der Verabreichung, der generellen Gesundheit und anderen Arzneimitteln, die gleichzeitig verabreicht werden. Im Allgemeinen sollte der Dosierungsplan als eine regelmäßige Verabreichung des Arzneistoffes im Bereich von 1 μg bis 10 mg Einheiten pro Tag sein. Wenn der Dosierplan eine kontinuierliche Infusion vorsieht, sollte auch sie jeweils im Bereich von 1 μg bis 10 mg Einheiten pro Kilogramm des Körpergewichts pro Minute sein. Eine mehr bevorzugte Dosis für kontinuierliche Infusion könnte aber im Bereich von 0,01 μg bis 10 mg Einheiten pro Kilogramm des Körpergewichts pro Stunde sein. Besonders bevorzugte Dosierungen werden hierin nachstehend vorgetragen. Der Fortschritt kann durch periodische Bewertungen überwacht werden. Die Dosierungen werden variieren, aber eine bevorzugte Dosierung für intravenöse Verabreichung von DNA sind ungefähr 10⁶ bis 10¹² Kopien des DNA-Moleküls. Die Zusammensetzungen der Erfindung können lokal oder systemisch verabreicht werden. Die Verabreichung wird generell parenteral, z.B. intravenös, sein; eine externe Verabreichung wird jedoch auch vorhergesehen. DNA kann auch direkt an die Zielstelle verabreicht werden, z.B. durch biolitischen Transfer in eine interne oder externe Zielstelle oder mittels Katheder an eine Stelle in einer Arterie. Präparate für parenterale Verabreichungen schließen sterile wässrige und nicht wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen ein. Beispiele von nicht wässrigen Lösungsmitteln sind Propylenglycol, Polyethylenglycol, pflanzliche Öle wie zum Beispiel Olivenöl und injizierbare organische Ester wie zum Beispiel Ethyloleat. Wässrige Trägerstoffe schließen Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, einschließlich Salzlösungen und gepufferte Medien, ein. Parenterale Vehikel schließen Natriumchloridlösungen, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, lactathaltige Ringer-Lösung oder fette Öle ein. Intravenöse Vehikel schließen Flüssigkeits- und Nährstoffergänzungen, Elektrolytergänzungen (wie jene, die auf Ringer-Dextrose aufgebaut sind) und ähnliche ein. Konservierungsmittel und andere Zusatzmittel wie zum Beispiel Bakteriostatika, Antioxidantien, chelatierende Stoffe und inerte Gase und ähnliche können auch vorhanden sein. Außerdem kann das Arzneistoffe der vorliegenden Erfindung proteinartige Trägerstoffe wie zum Beispiel Serumalbumin oder Immunoglobuline vorzugsweise menschlichen Ursprungs, umfassen. Darüber hinaus wird vorgesehen, dass das Arzneistoffe der Erfindung, abhängig von der vorgesehenen Verwendung des Arzneistoffes, weitere biologisch aktiven Stoffe umfassen kann. Solche Stoffe können Arzneistoffe sein, die auf das Immunsystem wirken, Arzneistoffe, verwendet für antivirale Behandlung, im Besonderen in der HIV-Behandlung (zum Beispiel HAART) und AIDS-Behandlung, und/oder entzündungshemmende Arzneistoffe. Es wird zum Beispiel vorgesehen, dass Patienten so früh wie möglich mit HAART behandelt werden, bis die virale Belastung für mehrere Wochen bis Monate unter das Erkennungsniveau gefallen ist. Frühe Behandlung von infizierten Patienten mit HAART verhindert die Transition der viralen Stämme von der Verwendung von CCR5 auf andere Chemokine wie CXCR4 (Connor et al., (1997) J. Exp. Med. 185 621–628). Konstrukte, wie in der vorliegenden Erfindung offenbart, können zusätzlich zu HAART intravenös, subkutan und/oder in die Gehirn-Rückenmarksflüssigkeit verabreicht werden. Andere Stoffe zur Kombination mit den erfinderischen Konstrukten könnten unter anderem bispezifische Antikörper umfassen, wie in Brühl et al. (J. Immunol 2001, 166, 2420–2426) beschrieben.
Es wird bei der vorliegenden Erfindung vorgesehen, dass die verschiedenen Polynucleotide und Vektoren der Erfindung entweder alleine oder in jedweder Kombination unter Verwendung von Standardvektoren und/oder Gentransfer-Systemen und wahlweise zusammen mit einem pharmazeutisch verträglichen Trägerstoff oder Excipient, verabreicht werden. Im Anschluss an die Verabreichung können die Polynucleotide oder Vektoren stabil in das Genom der Testperson integriert werden. Vorzugsweise ist diese Testperson ein Mensch.
Andererseits können virale Vektoren verwendet werden, die spezifisch für bestimme Zellen oder Gewebe sind und in den Zellen bestehen bleiben. Geeignete pharmazeutische Trägerstoffe und Excipienten sind im Fachgebiet gut bekannt. Die gemäß der Erfindung erzeugten Arzneistoffe können zur Vorbeugung oder Behandlung oder Verzögerung verschiedener Arten von immunologischen Erkrankungen verwendet werden, welche mit Entzündungen im Zusammenhang stehen, im Besonderen entzündlichem Darmleiden, entzündlichem Nierenleiden, entzündlichen Gelenkserkrankungen, wie (chronische) Arthritis. Darüber hinaus kann das Arzneistoffe der vorliegenden Erfindung angewandt werden, um Zellen zu eliminieren, die latent mit einem Virus infiziert sind, vorzugsweise mit einem Immunschwächevirus von Primaten, stärker bevorzugt mit HIV-1. Diese HIV-Infektionen umfassen bestimmte Infektionen von T-Zell-topischen und dual-topischen Varianten von HIV.
Eine therapeutisch effektive Dosis bezieht sich auf die Menge einer Verbindung, welche die Symptome oder Bedingungen verbessert. Die therapeutische Wirksamkeit und Toxizität solcher Verbindungen kann durch pharmazeutische Standardverfahren in Zellkulturen oder Testtieren bestimmt werden, z.B. ED₅₀ (die Dosis, die therapeutisch in 50% der Population effektiv ist) und LD₅₀ (die Dosis, die in 50% der Population letal ist). Das Dosis-Verhältnis zwischen therapeutischem und toxischem Effekt ist der therapeutische Index und kann als das Verhältnis LD₅₀/ED₅₀ ausgedrückt werden.
Darüber hinaus ist es möglich das Polynucleotid oder den Vektor der Erfindung zur Erzeugung von Zusammensetzungen für Gentherapie zu verwenden.
Geeignete Gentransfer-Systeme können unter anderem Liposomen, Rezeptorvermittelte Transfersysteme, nackte DNA und virale Vektoren wie zum Beispiel Herpesviren, Retroviren, Adenoviren und Adeno-assoziierte Viren einschließen. Der Transfer von Nucleinsäuren für Gentherapie zu einer spezifischen Stelle im Körper kann unter Verwendung von biolistischen Transfersystemen wie zum Beispiel dem von Williams und Kollegen beschriebenen (Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88 (1991), 2726–2729) durchgeführt werden. Weitere Verfahren für den Transfer von Nucleinsäuren umfassen Partikel-vermittelten Gentransfer, wie z.B. in Verma et al., Gene Ther. 15 (1998), 692–699 beschrieben.
Es sollte klar sein, dass die eingeführten Polynucleotide und Vektoren das Genprodukt nach Einführung in die Zelle exprimieren und vorzugsweise während der Lebenszeit der Zelle in diesem Zustand verbleiben. Zum Beispiel können Zelllinien, die Polynucleotide unter der Kontrolle geeigneter regulatorischer Sequenzen stabil exprimieren, gemäß Verfahren, die dem Fachmann gut bekannt sind, hergestellt werden. Anstatt Expressionsvektoren zu verwenden, die einen viralen Replikationsursprung enthalten, können Wirtszellen mit Polynucleotiden der Erfindung und einem selektierbaren Marker, entweder auf dem selben oder auf verschiedenen Plasmiden, transformiert werden. Gefolgt von der Einführung von Fremd-DNA, kann den veränderten Zellen erlaubt werden, für 1–2 Tage in einem angereicherten Medium zu wachsen, und dann werden sie auf selektives Medium umgestellt. Der Marker im rekombinanten Plasmid, auf den selektiert werden kann, verleiht Resistenz gegen die Selektion und gestattet die Selektion von Zellen, die ein stabil integriertes Plasmid in ihren Chromosomen haben und wachsen, um Foci zu bilden, die dann cloniert und zu Zelllinien ausgeweitet werden können.
Etliche Selektionsysteme können verwendet werden, einschließlich, aber nicht darauf beschränkt, die Herpes-Simplex-Virus-Thymidinkinase (Wigler et al., Cell 11 (1977), 223–232), Hypoxanthin-Guanin-Phosphoribosyltranferase (Szybalska, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 48 (1962), 2026) und Adenin-Phosphoribosyltransferase (Lowy et al, Cell 22 (1980), 817–823), jeweils in tk^–-, hgprt^–- bzw. aprt^–-Zellen. Ferner kann Antimetaboliten-Resistenz verwendet werden, als die Basis der Selektion von dhfr, die Methotrexat-Resistenz verleiht (Wigler et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 77 (1980), 3567–3570; O'Hare et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 1527–1531), gpt, das Mycophenolsäure-Resistenz verleiht (Mulligan & Berg, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 78 (1981), 2072–2076); neo, das gegen das Aminoglycosid G-418 Resistenz verleiht (Colbere-Garapin et al., J. Mol. Biol. 150 (1981), 1–14); hygro, das Hygromycin-Resistenz verleiht (Santerre et al., Gene 30 (1984), 147–156); oder Puromycin (pat, Puromycin-N-Acetyl-Transferase). Weitere Gene, auf die selektiert werden kann, sind beschrieben worden, zum Beispiel trpB, das den Zellen erlaubt Indol anstatt von Tryptophan zu verwenden, hisD, das den Zellen erlaubt Histinol anstatt von Histidin zu verwenden (Hartman & Mulligan, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85 (1988), 8047–8051); und ODC (Ornithin-Decarboxylase), die gegen das Ornithin-Decarboxylase-Inhibitor 2-(Difluoromethyl)DL.Ornithin, DMFO, Resistenz verleiht, (McCologue, 1987, In: Current Communications in Molecular Biology, Cold Spring Harbor Laboratory, Herausgeber).
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Chemokinkonstruktes, eines Polynucleotids oder eines Vektors der Erfindung zur Erzeugung eines Arzneistoffes für die Behandlung einer HIV-Infektion oder von AIDS.
Die anti-HIV-Behandlung kann HAART umfassen. HAART-Therapie besteht aus einem Cocktail von drei Klassen antiviraler Arzneistoffe. Diese Klassen sind nucleosidale reverse Transkriptaseinhibitoren (NRTI), nicht-nucleosidale reverse Transkriptaseinhibitoren (NNRTI) und Proteaseinhibitoren (PI). Üblicherweise werden 2 bis 4 Arzneistoffe aus vorzugsweise mehr als einer Klasse kombiniert, um die Virusbelastung auf fast nicht mehr nachweisbare Werte zu vermindern.
Die Behandlung von immunologischen Erkrankungen kann entzündungshemmende Stoffe und immunsuppressive Stoffe umfassen. Entzündungshemmende Stoffe können aus der Gruppe, bestehend aus Azathioprin, Cyclophosphamid, Glucocorticoide wie Prednison und Corticosteroide, ausgewählt werden. Immunsuppressive Stoffe können Cyclosporin A, Tacrolimus (FK506), Sirolimus (Rapamycin) umfassen. Protein-Arzneistoffe können Calcineurin, Beta-Interferon, monoclonale Anti-TNF-alpha-Antikörper (Remicad) umfassen. Dosierung und Verwendung von entzündungshemmenden Stoffen und immunsuppressiven Stoffen werden unter anderem in Fauci et al., sic, beschrieben. Weitere Behandlungsmöglichkeiten sind dem Fachmann bekannt und unter anderem vorstehend hierin beschrieben.
In einer weiteren Ausführungsform betrifft die vorliegende Erfindung die Verwendung eines Chemokinkonstruktes, eines Polynucleotids oder eines Vektors der Erfindung für die Erzeugung eines Arzneistoffes zur Behandlung entzündlicher Erkrankungen und/oder Autoimmunerkrankungen, welche umfassen, aber nicht beschränkt sind auf: entzündliches Nierenleiden, entzündliches Darmleiden, multiple Sklerose, Hauterkrankungen, allergische Reaktionen, Diabetes, Transplantatabstoßungen und Arthritis.
Die Erfindung betrifft auch ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneistoffes, umfassend die Formulierung des Polypeptid/Chemokinkonstruktes, eines Polynucleotids oder eines Vektors der Erfindung in einer pharmazeutisch verträglichen Form. Darüber hinaus ist vorgesehen, dass das Polypeptid/Chemokinkonstrukt durch Peptidomimetika modifiziert sein kann. Verfahren für die Herstellung und Verwendung von peptidomimetischen kombinatorischen Banken sind im Stand der Technik beschrieben, zum Beispiel Ostresh et al., Methods in Enzymology 267 (1996), 210–234, Dorner et al., Bioorg. Med. Chem. 4 (1996), 709–715, Beeley, Trends Biotechnol. 12 (1994), 213–216, oder al-Obeidi et al., Mol. Biotechnol. 9 (1998), 205–223.
Das Arzneistoffe der Erfindung kann einem Patienten durch jedes für die spezielle Verbindung geeignete Verfahren, z.B. oral, intravenös, parenteral, transdermal, transmucosal oder durch einen chirurgischen Eingriff oder Implantation (z.B. mit der Verbindung in Form einer festen oder halbfesten biologisch kompatiblen und resorbierbaren Matrix) auf oder in der Nähe der Stelle verabreicht werden wo der Effekt der Verbindung erwünscht ist. Therapeutische Dosen werden von einem Fachmann als geeignet festgelegt, siehe vorstehend.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Änderung einer Verbindung, die durch das Verfahren der Erfindung als eine Hauptverbindung identifiziert wurde, um zu erreichen (i) geänderte Wirkungsstelle, geändertes Spektrum der Aktivität, geänderte Organspezifität und/oder (ii) verbesserte Wirksamkeit und/oder (iii) verminderte Toxizität (verbesserter therapeutischer Index) und/oder (iv) verminderte Nebenwirkungen und/oder (v) geänderter Beginn der therapeutischen Aktivität, geänderte Dauer des Effekts und/oder (vi) geänderte pharmakokinetische Parameter (Resorption, Verteilung, Metabolismus und Ausscheidung) und/oder (vii) geänderte physikalisch-chemische Parameter (Löslichkeit, Hygroskopizität, Farbe, Geschmack, Geruch, Stabilität, Zustand) und/oder (viii) verbesserte generelle Spezifität, Organ/Gewebespezifität und/oder (ix) verbesserte Anwendungsform und verbesserter Anwendungsweg, durch (i) Veresterung von Carboxylgruppen oder (ii) Veresterung von Hydroxylgruppen mit Kohlensäuren oder (iii) Veresterung von Hydroxylgruppen in z.B. Phosphate, Pyrophosphate oder Sulfate oder Halb-Succinate oder (iv) Bildung von pharmazeutisch verträglichen Salzen oder (v) Bildung von pharmazeutisch verträglichen Komplexen oder (vi) Synthese von pharmazeutisch aktiven Polymeren oder (vii) Einführung von hydrophilen Resten oder (viii) Einführung/Austausch von Substituenten auf Aromaten oder Seitenketten, Veränderung von Substituenten-Mustern oder (ix) Veränderung durch Einführung von isosterischen oder bioisosterischen Resten oder (x) Synthese homologer Verbindungen oder (xi) Einführung verzweigter Seitenketten oder (xii) Umformung von Alkyl-Substituenten in cyclische Analoge.
Die verschiedenen vorstehend aufgezählten Schritte sind im Fachgebiet generell bekannt. Sie schließen ein oder beruhen auf quantitativer Struktur-Aktivitäts-Beziehungs (QSAR)-Analysen (Kubinyi, „Hausch-Analysis and Related Approaches", VCH Verlag, Weinheim, 1992) kombinatorische Biochemie, klassische Chemie und andere (siehe zum Beispiel Holzgrabe und Bechtold, Deutsche Apotheker Zeitung 140 (8), 813–823, 2000).
Darüber hinaus betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung eines Arzneistoffes, umfassend die Schritte der Formulierung des Polypeptid/Chemokinkonstruktes, eines Polynucleotids oder eines Vektors der Erfindung oder verbessert gemäß des hierin vorstehend festgelegten Verfahrens mit einem pharmazeutisch verträglichem Trägerstoff und/oder Verdünnungsmittel.
Die Figuren zeigen
1: MC-1 MAk induziert CCR5 Endocytose in CHO-Zellen
CCR5 exprimierende CHO-Zellen wurden mit MC-1 und MC-4 für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden auf Eis gelegt, mit 15 μg MC-1 oder MC-4 inkubiert, mit kaltem PBS gewaschen und mit FITC-konjugiertem Anti-Maus-Ig-Antikörper gefärbt. Nach dem Waschen wurden die Zellen mittels Durchflusscytometrie analysiert. Die Zelloberflächenexpression von CCR5 wurde mittels Durchflusscytometrie unter Verwendung einer sättigenden Konzentration von beiden Antikörpern für RANTES-induzierte CCR5-Modulation nach unten nachgewiesen. MC-1 induzierte auf CHO-Zellen, ähnlich zu RANTES, eine 50% Verminderung des Zelloberflächen-CCR5 (siehe 3), hatte aber nur einen schwachen Effekt auf PBMC (nicht gezeigt). Die Ergebnisse wurden für die Fluoreszenz von unstimulierten Zellen (100%) und für die Hintergrundfluoreszenz (0%) normalisiert. Alle Experimente wurden mindestens zweimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.
2: Dimerisierung wird für die von MC-1 induzierte Endocytose von CCR5 benötigt
CCR5 exprimierende CHO-Zellen wurden mit scFv-MC-1 (3 μg/ml) für 45 Minuten bei 4°C oder 37°C inkubiert, zweimal mit kaltem PBS gewaschen und mit anti-His- Antikörper bei 4°C oder 37°C, wie angezeigt, inkubiert. Die Oberflächenexpression von CCR5 wurde mittels Durchflusscytometrie mit PE-markiertem Anti-Maus-Antikörper gemessen. Die Fluoreszenz wurde für Zellen, die jeweils bei 4°C mit scFv MC-1 und Anti-His-Antikörper inkubiert wurden (100%) und für die Hintergrundfluoreszenz (0%) normalisiert.
3: MC-4 hemmt die durch Chemokine vermittelte CCR5-Endocytose
CCR5 exprimierende CHO-Zellen wurden mit Medium (0 μg/ml) oder MC-4 (15 μg/ml oder 1,5 μg/ml) für 20 Minuten auf Eis vorinkubiert und dann mit RANTES oder AOP-RANTES für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Oberflächenexpression von CCR5 wurde mittels Durchflusscytometrie unter Verwendung des Antikörpers MC-4 (15 μg/ml auf Eis) und FITC-konjugierten sekundären Antikörpern gemessen. Die Fluoreszenz wurde als 100% in der Abwesenheit von Chemokinen und 0% für die Hintergrundsfluoreszenz normalisiert. Alle Experimente wurden mindestens zweimal wiederholt.
4: Schema der RM- und MR-Konstrukte
Moleküle, die ein scFv-Anti-CD4 und RANTES in N- oder C-terminaler Position vereinen.
5: Bindung von RM und MR an CCR5, wie durch Liganden-Kompetitionstests gezeigt
Mit CCR5 oder CXCR4 stabil transfizierte CHO-Zellen wurden für 4 Stunden auf Eis mit einem von mehreren Inhibitoren (RM, MR, RANTES oder CD4-scFV) und 1 nM ¹²⁵I-RANTES co-inkubiert. Die relative Bindung von ¹²⁵I-RANTES wird als (spezifische Bindung [Inhibitor]/spezifische Bindung [Medium]) berechnet. Alle Inkubationen wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt. Fehlerleisten zeigen die Standardabweichung an.
6: Bindung von RM und MR an CD4 auf T-Zellen
PBMC wurden für 1 Stunde auf Eis mit den Konstrukten RM und MR in verschiedenen Konzentrationen inkubiert. FACS-Analyse wurde mit anti-6 × His-Antikörper (Dianova) oder einem Antikörper gegen RANTES (VL-1) durchgeführt, gefolgt von einer Inkubation mit PE-markiertem Kaninchen-Anti-Maus-F(ab)- Fragmenten. Die konzentrationsabhängige Bindung von RM und MR an CD4+-T-Zellen wird in 6B gezeigt.
7: Gleichzeitige Bindung von RM und MR an CCR5 und CD4 auf menschlichen T-Zellen
Von RM und MR induzierte Internalisierung von CCR5 auf T-Zellen wird in 7A bzw. 7B gezeigt. Menschliche PBMC wurden für 30 Minuten bei 37°C mit verschiedenen Konzentration von RM (7A), MR (7B) und RANTES inkubiert und auf Eis für 1 Stunde mit einer Kombination von direkt-konjugierten Antikörpern gegen CCR5, CD8 und CD4 gefärbt. Mittelkanal-Fluoreszenz (MCF) von CCR5 wurde auf CD4 und CD8 positiven T-Zellen durch FACS-Analyse quantifiziert. Die relative Oberflächenexpression von CCR5 wurde als [MCF(exprimiert)-MCF(negative Kontrolle)]/[(MCF(Medium)-MCF negative Kontrolle)].
8: Bindung von RM und MR an CD4 auf T-Zellen – Blockierung der Anti-CD4-mAk-Bindung
Die Hemmung der CD4-FITC-mAk-Bindung an CD4+-T-Zellen durch RM oder MR wird in 8A gezeigt. PBMC wurden mit verschiedenen Konzentrationen an RM, MR oder RANTES (RANTES nicht gezeigt) für 1 Stunde auf Eis vorinkubiert. Ohne die Zellen zu waschen, wurden CD4-FITC-Antikörper (Immunotech) hinzugefügt und die Bindung von CD4-FITC wurde mittels FACS-Analyse nachgewiesen. Die Mittelkanal-Fluoreszenz (MCF) der CD4-FITC-Bindung wurde quantifiziert. Die relative Bindung von CD4-FITC wurde als [MCF(Inhibitor)-MCF negative Kontrolle)]/[MCF(Medium)-MCF negative Kontrolle)] berechnet (8A). Konzentrationsabhängige Blockierung von CD4 durch RM und MR wird in 8B gezeigt.
9: Modulation der CCR5-Expression auf CHO-Zellen nach unten, induziert durch RM
CHO-Zellen, die CCR5 oder beides, CCR5 und CD4, exprimierten, wurden für 30 Minuten bei 37°C mit verschiedenen Konzentrationen von RANTES (10 nM oder 15 nM) oder RM (5 nM, 1,6 nM oder 0,6 nM) oder Medium als Kontrolle inkubiert. Die Oberflächenexpression von CCR5 wurde mittels FACS-Analyse durch Färbung der Zellen mit Kaninchen-Antiserum gegen CCR5 und FITC-markiertem Ziege-Anti- Kaninchen-Antikörper gemessen. Prä-Immunserum wurde als negative Kontrolle verwendet.
10: Bindung von RM und MR an CCR5, wie durch die Internalisierung von CCR5 gezeigt
Die Internalisierung von CCR5 auf Monocyten und auf CD8+-T-Zellen wird in 10A bzw. 10B gezeigt. Menschliche PBMC werden über Nacht gezüchtet, um die Expression von CCR5 auf Monocyten zu induzieren. Die Zellen wurden für 30 Minuten auf 37°C mit verschiedenen Konzentrationen von RM, MR und RANTES inkubiert und die Oberflächenexpression von CCR5 wurde dann mittels FACS-Analyse unter Verwendung des MC-1-Antikörpers (5 μg/ml), gefolgt von PE-konjugiertem Kaninchen-Anti-Maus-F(ab)2-Fragmenten, quantifiziert. Die Zellen wurden mit direkt-konjugiertem CD8-Cychrom- und CD14-APC-Antikörpern (Immunotech) gefärbt. Monocyten und CD8+-T-Zellen wurden durch Expression von CD14 und CD8 sowie durch ihre Lichtstreuungseigenschaften identifiziert.
11: Internalisierung von CCR5 auf menschlichen PBMC nach dem Auswaschen der Chemokinkonstrukte und RANTES
PBMC wurden für 30 Minuten auf Eis mit verschiedenen Konzentrationen von RANTES, RM und Medium als Kontrolle vorinkubiert und dann dreimal bei 4°C gewaschen. Die Zellen werden auf 37°C aufgewärmt und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Oberflächenexpression von CCR5 wurde auf CD4+- und CD8+-T-Zellen mittels FACS-Analyse durch Färbung der Zellen mit MC-1 oder IgG1-Isotop-Kontrolle und FITC-markiertem mAk gegen Maus-IgG1 quantifiziert. Nach dem Waschen wurden die Zellen durch mit Phycoerythrin-Cyanin5 markiertem CD8 und mit Allo-Phycocyanin markierten CD3-Antikörpern gefärbt. Lymphocyten wurden durch ihre Vorwärts- und Seitwärts-Lichtstreulichteigenschaften kontrolliert. CD8+-T-Zellen wurden durch Expression von CD8 und CD3 identifiziert. CD4+-T-Zellen wurden durch Expression von CD3 und der Abwesenheit von CD8 identifiziert.
12: Blockierung der Infektion mit M-tropischen HIV-1 Stämmen durch das RM-Konstrukt, das MR-Konstrukt und ein Gemisch aus MR, RANTES und Anti-CD4-scFv
Isolierte PBMC wurden über Nacht mit 20 E/ml IL-2 gezüchtet. Zellen wurden mit RANTES oder RM oder MR bei Konzentrationen von 20 nM (12A), 4 nM (12B) oder PBS als Kontrolle vorinkubiert. Nach 3 Std. wurde HIV-1-Virus hinzugefügt. Zwei M-tropische Stämme, SF162 und BAL, wurden verwendet sowie ein T-tropischer Stamm IIIB. RT-Aktivität wurde nach 8 Tagen der Infektion gemessen. RT-Aktivität von PBMC, die nicht mit HIV-1 infiziert waren, wurde gemessen, um einen negativen Kontrollwert zu erhalten. Die relative RT-Aktivität wurde als [RT(Inhibitor)-RT-(negative Kontrolle)] : [RT(PBS-Kontrolle) – RT(negative Kontrolle)] berechnet. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an.
Die HIV-Infektions-Blockierungsaktivität der MR- und RM-Konstrukte wurde mit der HIV-Infektions-Blockierungsaktivität der Kombination aus RANTES und Anti-CD4-scFv (12C) verglichen. PBMC wurden vom Gesamtblut gesunder Spender durch Ficoll-Dichtezentrifugation isoliert und über Nacht mit 20E/ml IL-2 gezüchtet. Die Zellen wurden mit Inhibitoren bei Konzentrationen von jeweils 20 nM vorinkubiert. Nach 3 Std. wurde der M-topische HIV-1-Virus SF 162 hinzugefügt. Nach Inkubation für 9 Tage wurde die RT-Aktivität mit einem handelsüblichen Kit gemäß den Empfehlungen des Herstellers gemessen. Alle Inkubationen wurden in vierfacher Ausführung durchgeführt. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an.
13: RM und MR inhibieren MLR nicht
PBMC von zwei verschiedenen Spendern wurden für 14 Tage entweder in Medium alleine oder in Medium, das RM (10 nM) oder MR (10 nM) enthielt, co-inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen und mit einer Kombination von direkt-konjugierten Antikörpern (CD3-FITC, CD25-PE, CD3-Tricolor, CD3-FITC, HLA-DR-PE, CD3-Tricolor) gefärbt und mittels FACS analysiert.
14: RM und MR induzieren keine Apoptose von menschlichen PBMC
PBMC wurden für 24 Std. in Medium alleine oder in Medium, das RM (10 nM) oder MR (10 nM) enthielt, inkubiert. Die Zellen wurden mit Annexin V-FITC und Propidium-Jodid gefärbt und mittels FACS analysiert. Die Anzahl an apoptotischen Zellen (Annexin V FITC positiv und Propidium-Jodid negativ) wurde mittels Cell-Quest-Analyse-Software quantifiziert.
Die Beispiele veranschaulichen die Erfindung:
Beispiel 1
Ein neuer Satz an Anti-CCR5-mAks und ihre funktionellen Eigenschaften wurden bestimmt. Die Fähigkeit der mAks Rezeptoraktivierung zu vermitteln sowie ihr Einfluss auf Rezeptor-Trafficking wurde untersucht. MC-1 induzierte eine dosisabhängige Regulation des CCR5-Zelloberflächen-Rezeptors auf CHO-Zellen nach unten (1). Im Gegensatz zu CHO-Zellen induzierte MC-1 nur sehr schwache Endocytose des CCR5-Rezeptors auf PBMC (nicht gezeigt). Im Besonderen war für die Internalisierung von CCR5 mit MC-1-Antikörper Dimerisierung von CCR5 notwendig.
Herstellung und Epitopkartierung von Anti-CCR5-mAks
Mäuse wurden mit CHO-Zellen immunisiert, die menschlichen CCR5 exprimierten. Zwei CCR5 spezifische mAks (MC-1 und MC-4) wurden isoliert und weiter charakterisiert (Mack et al. 1998). Wie durch Durchflusscytometrie gezeigt, banden beide Antikörper mit hoher Affinität an CCR5. Beide mAks färbten CCR5 auf monocytären und lymphocytären Populationen von frisch isolierten menschlichen PBMCs.
MC-1 fördert die Rezeptorendocytose durch CCR5-Dimerisierung
Die Fähigkeit der hierin vorstehend beschriebenen monoclonalen Antikörper, CCR5-Internalisierung in CHO-Zellen zu induzieren, wurde mittels FACS-Analyse untersucht. 5 × 10⁵ CHO-Zellen, die CCR5 exprimierten, wurden für 30 Minuten bei 37°C mit Chemokinen oder mAks inkubiert. Die Zellen wurden dann auf Eis gestellt, mit 15 μg MC-1 oder MC-4 für 1 Stunde inkubiert, mit kaltem PBS gewaschen und mit FITC-konjugiertem Anti-Maus-Ig-Ak (F313, Dako) gefärbt. Die Zellen wurden gewaschen und auf einem FACSCalibur (Becton Dickinson) analysiert. Wie in 1 gezeigt wird, induzierte MC-1 eine dosisabhängige Modulation des Zelloberflächenrezeptors nach unten. Wie mittels FACS-Analyse gemessen, induzierten 5 μg/ml MC-1 eine 50% Verminderung des Zelloberflächen-CCR5, ähnlich zum Grad der Modulation nach unten, der mit 100 nM RANTES erhalten wird. Keine maßgebliche Endocytose wurde beobachtet, wenn Zellen mit MC-1 auf Eis inkubiert wurden (Daten nicht gezeigt). Die Inkubation von Zellen mit MC-4 bei 37°C hatte keinen Effekt (1).
Um zu testen, ob die Rezeptorendocytose, die durch MC-1 gefördert wird, die Auswirkung der von MC-1 induzierten Dimerisation ist, wurden die funktionellen Eigenschaften einer monovalenten Version von MC-1 mittels Durchflusscytometrie untersucht. Die leichte und schwere variable Domäne von MC-1 wurden durch PCR-Amplifizierung unter Verwendung von Pfu-Polymerase (Orlandi et al., 1989) cloniert. Wie vorher beschrieben, wurden die zwei Domänen durch einen Linker verbunden, der (Gly4Ser)3 (SEQ ID NR.: 54) codierte und ein C-terminales Ende, das 6 Histidine codierte, wurde hinzugefügt, um die Reinigung zu erleichtern. Das einkettige Fragment wurde in den periplasmatischen Raum von E. coli exprimiert und durch Ni-NTA (Qiagen), wie beschrieben (Mack et al., 1995), gereinigt. Ein einkettiges, mit Poly-Histidin markiertes Fragment von MC-1 (scFv-MC-1) band CCR5 weiterhin mit hoher Affinität (Daten nicht gezeigt). Die durch scFv-MC-1 geförderte CCR5-Internalisierung wurde mittels FACS-Analyse quantifiziert. CCR5+-CHO-Zellen wurden für 45 Minuten mit 3 μg/ml an scFV-MC-1, wie angegeben, auf Eis oder bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden zweimal mit kaltem PBS gewaschen und mit 4 μg/ml Anti-His-Ak (Dianova) für 45 Minuten, wie angegeben, auf Eis oder bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden wieder mit kaltem PBS gewaschen und mit PE-markiertem Kaninchen-Anti-Maus-F(ab)₂ (Dako) gefärbt und auf einem FACSCalibur unter Verwendung von CellQuest-Software analysiert. Die CCR5-Oberflächenexpression von Zellen, die auf Eis mit beiden, scFv-MC-1 und anti-His mAk, inkubiert worden waren, wurde als Kontrolle (100% Fluoreszenz) verwendet. Wie in 2 gezeigt, hat die Inkubation der Zellen mit scFv-MC-1 bei 37°C, gefolgt von Anti-His-Antikörper auf Eis, die Oberflächenexpression von CCR5 nicht maßgeblich reduziert; das weist darauf hin, dass monovalenter MC-1 die CCR5-Modulation nach unten nicht induzieren konnte. Wenn scFv-MC-1 und Anti-His-mAk jedoch beide bei 37°C inkubiert wurden, verminderte sich die CCR5-Oberflächenfluoreszenz um 50%, ein Indikation dafür, dass Querverknüopfung von scFv-MC-1 den Effekt der parentalen divalenten Antikörper wiederherstellen kann. Zusammengenommen zeigen diese Ergebnisse, dass die durch MC-1 induzierte Rezeptor-Dimerisation für die CCR5-Internalisierung nötig ist.
MC-4 inhibiert CCR5-Endocytose
Es wurde untersucht, ob CCR5-spezifische Antikörper die durch Chemokine vermittelte Internalisierung von CCR5 hemmen könnten. Zellen wurden mit MC-4 vorinkubiert, dann mit Chemokinen bei 37°C und die Oberflächenexpression von CCR5 wurde mittels Durchflusscytometrie gemessen. CCR5-exprimierende CHO-Zellen wurden auf Eis mit Medium oder MC-4 für 20 Minuten inkubiert. Die Zellen wurden dann mit RANTES oder AOP-RANTES für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Zellen wurden gewaschen, mit 15 μg/ml MC-4, gefolgt von FITC-konjugiertem Anti-Maus Ig-Ak (F313, Dako), inkubiert. Wie beschrieben, war AOP-RANTES in der Vermittlung der CCR5-Internalisierung wirksamer als RANTES (3) und induzierte 50% oder 90% Rezeptor-Modulation nach unten bei 1 bzw. 100 nM. MC-4 hemmte die RANTES (100 nM)-induzierte CCR5-Endocytose um mehr als 75% (3). In der Anwesenheit von MC-4 (1,5 μg/ml) wurde eine 10-fach höhere Konzentration von AOP-RANTES benötigt, um 50% Rezeptor-Modulation nach unten zu induzieren (3). Ein stärkerer Effekt wurde beobachtet, wenn eine höhere MC-4-Konzentration verwendet wurde.
Beispiel 2: Konstruktion von bifunktionalen Chemokinkonstrukten (4)
RNA wurde vom Hybridom MT-413 isoliert und unter Verwendung von Oligohexameren (Roche) und Superscript reverse Transcriptase (Gibco) revers in cDNA transkribiert. Die VH-Domäne von MT-413 wurde unter Verwendung der Primer 1 (SEQ ID NR.: 31) und Primer 2 (SEQ ID NR.: 32) durch PCR, mit Pfu-Polymerase (Stratagene) amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde unter Verwendung des PCR-Script-Amp-Clonierungs-Kits (Stratagene) in den PCR-Script-Vektor subcloniert. Sequenz 1 (SEQ ID NR.: 33) wurde erhalten. Die VL-Domäne von MT-413 wurde unter Verwendung des Primers 3 (SEQ ID NR.: 34) und Primers 4 (SEQ ID NR.: 35) durch PCR mit Pfu-Polymerase (Stratagene) amplifiziert. Das PCR-Produkt wurde in den PCR-Script-Vektor unter Verwendung des PCR-Script-Amp-Clonierungs-Kits (Stratagene) subcloniert. Sequenz 2 (SEQ ID NR.: 36) wurde erhalten. Ein einkettiges Fv-Fragment wurde vom Antikörper MT-413 in der Reihenfolge von VL-VH durch Fusions-PCR hergestellt: zu diesem Zweck wurde die VL-Domäne (Sequenz 2) (SEQ ID NR.: 36) mit dem Primer 5 (SEQ ID NR.: 37) und Primer 6 (SEQ ID NR.: 38) amplifiziert und die VH-Domäne (Sequenz 1) wurde mit dem Primer 7 (SEQ ID NR.: 39) und Primer 8 (SEQ ID NR.: 40) amplifiziert. Anschließend wurde mit beiden PCR-Produkten eine Fusions-PCR-Reaktion durchgeführt und im Leserahmen mit EcoRV und Sal1 in einen periplasmatischen Expressionsvektor subcloniert, welcher schon die OmpA-Signalsequenz, gefolgt von einer FLAG-Sequenz und einer EcoRV-Restriktionsstelle, enthielt. Sequenz 3 (SEQ ID NR: 41) wurde erhalten. Das MR-Konstrukt wurde durch Fusions-PCR hergestellt. Zu diesem Zweck wurde das MT-413-VL-VH- scFv mit dem Primer 5 (SEQ ID NR.: 37) und Primer 9 (SEQ ID NR.: 42) amplifiziert und eine RANTES-cDNA (SEQ ID NR.: 13) wurde mit dem Primer 10 (SEQ ID NR.: 43) und Primer 11 (SEQ ID NR.: 44) amplifiziert. Anschließend wurde mit beiden PCR-Produkten eine Fusions-PCR-Reaktion durchgeführt und im Leserahmen mit EcoRV und Sal1 in einen periplasmatischen Expressionsvektor subcloniert, welcher schon die OmpA-Signalsequenz, gefolgt von einer FLAG-Sequenz und einer EcoRV-Restriktionsstelle, enthielt. Das MR-Konstrukt (SEQ ID NR.: 19) wurde erhalten und im periplasmatischen Raum von E. coli exprimiert.
Ein einkettiges Fv-Fragment vom Antikörper MT-413 in der Reihenfolge VH-VL wurde durch Fusions-PCR erzeugt: für diesen Zweck wurde die VH-Domäne (Sequenz 1) (SEQ ID NR.: 33) mit dem Primer 12 (SEQ ID NR.: 45) und Primer 9 (SEQ ID NR.: 42) amplifiziert und die VL-Domäne (Sequenz 2) (SEQ ID NR.: 36) wurde mit dem Primer 13 (SEQ ID NR.: 46) und Primer 14 (SEQ ID NR.: 47) amplifiziert. Anschließend wurde mit beiden PCR-Produkten eine Fusions-PCR-Reaktion durchgeführt und im Leserahmen mit EcoRV und Sal1 in einen periplasmatischen Expressionsvektor subcloniert, welcher schon die OmpA-Signalsequenz, gefolgt von einer FLAG-Sequenz und einer EcoRV-Restriktionsstelle, enthielt.
Für die Herstellung des RM-Konstruktes wurde eine PCR-Fragment von RANTES-cDNA (SEQ ID NR.: 13) mit dem Primer 15 (SEQ ID NR.: 48) und Primer 16 (SEQ ID NR.: 49) hergestellt. Das PCR-Produkt wurde im Leserahmen mit FspI und BspE1 in einen periplasmatischen Expressionsvektor subcloniert, welcher bereits eine OmpA-Signalsequenz mit einer FspI Restriktionsstelle enthielt. Ein PCR-Fragment, hergestellt von (MT-413-scFv-VH-VL), siehe vorstehend, mit dem Primer 17 (SEQ ID NR.: 50) und Primer 14 (SEQ ID NR.: 47), wurde in diesen Vektor mit BspE1 und Sal1 subcloniert, resultierend in dem RM-Konstrukt (SEQ ID NR.: 17), und im periplasmatischen Raum von E. coli exprimiert.
Diese Konstrukte wurden auch in Säuger-CHO-Zellen produziert, was zu funktionellen RM- und MR-Molekülen führte. Weitere Zelllinien sind vorgesehen (CHO K1, HEK293, X63, SP2-Zellen, Hefe).
Die Konstrukte wurden durch Affinitätschromatographie unter Verwendung der Bindung von His-Markierung an immobilisierte 2⁺-Metallionen wie zum Beispiel Ni²⁺ gereinigt. Liste der Primer:
Sequenz 1 (SEQ ID NR.: 33)
Nucleotide 1–59 = Leader Sequenz 2 (SEQ ID NR.: 36)
Sequenz 3 (SEQ ID NR.: 41)
Nucleotide 1–24 = Flag-Epitop
Beispiel 3: Bindung von RM und MR an CCR5, wie durch Liganden-Kompetitionstest gezeigt
CHO-Zellen, die mit CCR5 oder CXCR4 stabil transfiziert worden waren, wurden für 4 Stunden auf Eis mit einem von mehreren Inhibitoren (RM, MR, RANTES oder CD4-scFv) und 1 nM ¹²⁵I-RANTES co-inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurde die an Zellen gebundene Radioaktivität mit einem Gamma-Zähler gemessen. Die an Zellen gebundene Radioaktivität auf CXCR4+-CHO-Zellen wurde von der an Zellen gebundenen Radioaktivität auf CCR5+-CHO-Zellen für jede Konzentration des Inhibitors, subtrahiert. Die relative Bindung von ¹²⁵I-RANTES wird als (spezifische Bindung [Inhibitor]/spezifische Bindung [Medium]) berechnet. Alle Inkubationen wurden in dreifacher Ausführung durchgeführt. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an (5).
Beispiel 4: Spezifische Bindung der Chemokinkonstrukte RM und MR an CD4 auf T-Zellen
PBMC wurden für 1 Std. auf Eis mit den Konstrukten RM und MR in verschiedenen Konzentrationen inkubiert. Nach dem Waschen mit PBS wurden die zell-gebundenen Konstrukte mit einem Antikörper gegen 6 × His (Dianova) oder einem Antikörper gegen RANTES (VL-1) gefolgt von Inkubation mit PE-markiertem Kaninchen-Anti-Maus-F(ab)-Fragmenten (Dako R439) nachgewiesen. Die Bindung von RM und MR an CD4 auf T-Zellen wurde mittels FACS-Analyse nachgewiesen (6A). Die konzentrationsabhängige Bindung von RM und MR an CD4+-T-Zellen wird in 6B gezeigt.
Beispiel 5: Gleichzeitige Bindung von RM und MR an CCR5 und CD4 auf menschlichen T-Zellen
Menschliche PBMC wurden für 30 Minuten bei 37°C mit verschiedenen Konzentrationen von RM (7A), MR (7B) und RANTES inkubiert. Die Zellen wurden auf Eis für 1 Std. mit einer Kombination von direkt konjugierten Antikörpern gegen CCR5, CD8 und CD4 (CCR5-PE, Pharmigen, CD8-Cychrome, Immunotech, and CD4-APC, Immunotech) gefärbt. CD4+- und CD8+-T-Zellen wurden durch Expression von CD4 und CD8 sowie auch durch ihre Lichtstreuungseigenschaften identifiziert. Mittelkanal-Fluoreszenz (MCF) von CCR5 wurde auf CD4 und CD8 positiven T-Zellen mittels FACS-Analyse quantifiziert. Die relative Oberflächenexpression von CCR5 wurde als [MCF(exprimiert)-MCF negative Kontrolle)]/[MCF(Medium)-MCF(negative Kontrolle)] berechnet.
Beispiel 6: Blockierung der Bindung von Anti-CD4 Antikörpern durch Chemokinkonstrukte
PBMC wurden mit verschiedenen Konzentrationen von RM, MR oder RANTES für 1 Std. auf Eis vorinkubiert. Ohne die Zellen zu waschen, wurden CD4-FITC-Antikörper (Immunotech) in einer Verdünnung von 1:20 hinzugefügt und für 1 Stunde auf Eis inkubiert. Bindung von CD4-FITC wurde mittels FACS-Analyse nachgewiesen und die Mittelkanal-Fluoreszenz (MCF) der CD4-FITC-Bindung wurde quantifiziert. Relative Bindung von CD4-FITC wurde als [MCF(Inhibitor)-MCF(negative Kontrolle)]/[MCF(Medium)-MCF(negative Kontrolle)] (8A) berechnet. Konzentrations-abhängige Blockade von CD4 durch RM und MR wird in 8B gezeigt.
Beispiel 7: Modulation der CCR5-Expression auf CHO-Zellen, induziert durch Chemokinkonstrukte, nach unten
CHO-Zellen, die CCR5 oder beide, CCR5 und CD4, exprimierten, wurden für 30 Minuten bei 37°C mit verschiedenen Konzentrationen von RANTES oder RM (RANTES-Anti-CD4) oder Medium als Kontrolle inkubiert. Die Oberflächenexpression von CCR5 wurde mittels FACS-Analyse gemessen. Zu diesem Zweck wurden die Zellen mit einem Antiserum gegen CCR5, das in Kaninchen hergestellt wurde, gefärbt, gefolgt durch FITC-markierten Ziege-Anti-Kaninchen-Antikörper. Als negative Kontrolle wurden Zellen, statt dem Antiserum, mit Prä-Immunserum gefärbt. CCR5-Oberflächenexpression wurde, wie beschrieben, berechnet (Mack M, Schloendorff, Methods Mol. Biol. 2000; 138, 191–195) (9).
Beispiel 8: Internalisierung von CCR5 auf menschlichen PBMC, induziert durch Chemokinkonstrukte
Menschliche PBMC wurden über Nacht gezüchtet, um die Expression von CCR5 auf Monocyten zu induzieren. Die Zellen wurden für 30 Minuten bei 37°C mit verschiedenen Konzentrationen von RM, MR und RANTES inkubiert. Die Oberflächenexpression von CCR5 wurde dann mittels FACS-Analyse (10) quantifiziert. Zu diesem Zweck wurden die Zellen auf Eis mit dem Antikörper MC-1 (5 μg/ml) gefärbt, gefolgt von PE-konjugiertem Kaninchen-Anti-Maus-F(ab)₂-Fragmenten. Nach Inkubation für 10 Minuten mit Mausserum (10%) wurden die Zellen mit direkt konjugiertem CD8-Cychrome- und CD14-APC-Antikörpern (Immunotech) gefärbt. Monocyten und CD8+-T-Zellen wurden durch Expression von CD14 und CD8 sowie auch durch ihre Lichtstreuungseigenschaften identifiziert.
Beispiel 9: Internalisierung von CCR5 auf menschlichen PBMC nach dem Auswaschen der Chemokinkonstrukte und RANTES
PBMC wurden für 30 Minuten auf Eis mit verschiedenen Konzentrationen von RANTES, RM und Medium als Kontrolle vorinkubiert und dann dreimal bei 4°C gewaschen. Die Zellen wurden auf 37°C erwärmt und für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Die Oberflächenexpression von CCR5 wurde auf CD4+- und CD8+-T- Zellen mittels FACS-Analyse quantifiziert. Zu diesem Zweck wurden Zellen mit dem CCR5-Antikörper MC-1 (10 μg/ml) oder IgG1-Isotyp-Kontrolle für 1 Std. auf Eis gefärbt, gefolgt von einem FITC-markierten mAk gegen Maus-IgG für 1 Std. auf Eis. Nach dem Waschen wurden die Zellen mit Phycoerythrin-Cyanin5-markierten CD8- und Allo-Phycocyanin-markierten CD3-Antikörpern gefärbt. Die Analyse wurde auf einem FACScalibur mit CellQuest-Software durchgeführt (11). Lymphocyten wurden durch ihre Vorwärts- und Seitwärts-Lichtstreuungseigenschaften kontrolliert. CD8-T-Zellen wurden durch Expression von CD8 und CD3 identifiziert. CD4+-T-Zellen wurden durch Expression von CD3 und Abwesenheit von CD8 identifiziert. Die CCR5-Oberflächenexpression wurde, wie beschrieben, berechnet (Mack M, Schloendorff D. Downmodulation and Recycling of Chemokine receptors. Methods Mol Biol 2000; 138, 191–195).
Beispiel 10: Blockierung der Infektion mit M-tropischen HIV-1-Stämmen durch das RM-Konstrukt, MR-Konstrukt und eine Mischung aus RANTES und Anti-CD4-scFv
PBMC wurden von Gesamtblut eines gesunden Spenders durch Ficoll-Dichtezentrifugation isoliert und über Nacht mit 20E/ml IL-2 gezüchtet. Die Zellen wurden mit Inhibitoren bei Konzentrationen von 20 nM (12A) oder 4 nM (12B) gezüchtet. Nach 3 Std. wurde HIV-1-Virus hinzugefügt. Zwei M-tropische Stämme, SF162 und BAL, wurden verwendet, sowie auch ein T-tropischer Stamm, IIIB. Nach Inkubation für 8 Tage wurde die RT-Aktivität mit einem handelsüblichen Kit gemäß den Empfehlungen des Herstellers gemessen. Alle Inkubationen wurden in vierfacher Ausführung durchgeführt und zumindest dreimal wiederholt. Die relative RT-Aktivität wurde, wie in 12 beschrieben, berechnet. Fehlerbalken zeigen die Standardabweichung an.
Die HIV-Infektion-blokierende Aktivität der MR- und RM-Konstrukte wurde mit der HIV-Infektion-blockierenden Aktivität des Gemisches von RANTES und Anti-CD4-scFv (12C) verglichen. PBMC wurden aus Gesamtblut von gesunden Spendern durch Ficoll-Dichtezentrifugation isoliert und über Nacht mit 20 E/ml IL-2 gezüchtet. Die Zellen wurden mit Inhibitoren bei Konzentrationen von jeweils 20 nM vorinkubiert. Nach 3 Std. wurden der M-tropische HIV-1-Virus SF 162 hinzugefügt. Nach Inkubation für 9 Tage wurde die RT-Aktivität mit einem handelsüblichen Kit gemäß den Empfehlungen des Herstellers gemessen. Alle Inkubationen wurden in vierfacher Ausführung durchgeführt.
Überraschenderweise waren die Fusionsproteine MR und RM wesentlich wirksamer in der Blockierung der M-tropischen HIV-1-Infektion als die Kombination aus RANTES und Anti-CD4-scFv. Das beweist, dass die räumliche Nähe von RANTES und anti-CD4-scFv für die Verbesserung der HIV-Blockierung wichtig ist.
Beispiel 11: RM- und MR-Konstrukte inhibieren MLR nicht
PBMC wurden durch Ficoll-Dichtezentrifugation von Leukocytenmanschetten gesunder Spender erhalten. PBMC von zwei verschiedenen Spendern wurden für 14 Tage entweder in Medium alleine (RPMI 1640 mit 10% durch Hitzeinaktiviertes FCS und Pen/Strep) oder in Medium, das RM (10 nM) oder MR (10 nM) enthielt, coinkubiert. Die Zellen wurden gewonnen, einmal gewaschen und mit einer Kombination aus direkt konjugierten Antikörpern gefärbt. Diese waren entweder CD3-FITC (Becton-Dickinson), CD25-PE (Becton-Dickinson) und CD3-Tricolor (Caltag) oder CD3-FITC (Becton-Dickinson), HLA-DR-PE (Becton-Dickinson) und CD3-Tricolor (Caltag). Die Zellen wurden mittels Durchflusscytometrie unter Verwendung von CellQuest-Analyse-Software analysiert (13).
Beispiel 12: RM und MR induzieren die Apoptose von menschlichen PBMC nicht
PBMC wurden für 24 Std. in Medium alleine (RPMI 1640 mit 10% durch Hitze inaktiviertes FCS und Pen/Strep) oder in Medium, das RM (10 nM) oder MR (10 nM) enthielt, inkubiert. Die Zellen wurden gewonnen und mit Annexin V-FITC und Propidium-Jodid gefärbt. Die Zellen wurden mittels Durchflusscytometrie analysiert und die Zahl an apoptotischen Zellen (Annexin V-FITC positiv, Propidium-Jodid negativ) wurde durch CellQuest-Analyse-Software quantifiziert (14).
Beispiel 13: Ein in vivo-Test zur Analyse der Blockierung der HIV-Infektion
Für diesen veranschaulichenden Test werden SCID-Mäuse (Mäuse mit schwerem kombiniertem Immunodefekt) ausgewählt, die für die Einpflanzung von menschlichen hämatolymphoiden Zellen geeignet sind (z.B. NOD/LtSz-Rag1null- oder NOD/LtSz-scid-Mäuse, beschrieben in Shultz et al. (2000) J Immunol. 164: 2496–507). Die Mäuse werden 2–3 Wochen nach der Einpflanzung von menschlichen PBMC durch i.p. Injektion mit H1-Virus infiziert. Ein paar Stunden vor der HIV-Infektion oder nach der Infektion werden die Inhibitoren RANTES-AntiCD4 (RM), AntiCD4-RANTES (MR), RANTES alleine, Anti-CD4 alleine oder eine Kombination von RANTES und Anti-CD4-scFv i.p. oder i.v. in verschiedenen Zeitintervallen (von zweimal täglich bis zu jedem dritten Tag) und verschiedene Mengen (von 1 μg bis zu 500 μg pro Maus) bis zum Ende des Experimentes injiziert. Drei, vier oder acht Wochen nach der HIV-1-Infektion werden die Mäuse getötet und Blut- und Milzproben werden gesammelt. Die Proben werden mittels Durchflusscytometrie auf den Prozentanteil an menschlichen CD45+-Zellen und durch PCR auf die Anwesenheit von HIV-1-DNA und -RNA analysiert. Aliquote von 200 μl Plasma werden bei –80°C für anschließende quantitative HIV-1-RNA-Analyse unter Verwendung von Amplicor-RNA-PCR-Kits (Roche Diagnostic Systems) eingefroren. Proben von 100 μl Gesamtblut und Milzzellen werden für DNA wiederaufbereitet und bei –80°C eingefroren. Diese Proben werden später quantitativ (Milz) oder qualitativ (Blut) unter Verwendung des Amplicor-PCR-Assay-Systems für DNA analysiert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Chemokinkonstrukt, umfassend ein Anti-CD4-scFv und ein RANTES-Chemokin oder ein funktionelles Fragment davon, wobei das Chemokinkonstrukt die folgende Strukturdomänenform besitzt: (a) RANTES-Linker-(VH) Anti-CD4-Linker-(VL) Anti-CD4; oder (b) (VL) Anti-CD4-Linker-(VH) Anti-CD4-Linker-RANTES, oder (c) (VH) Anti-CD4-Linker-(VL) Anti-CD4-Linker-RANTES, wobei in den Alternativen (b) und (c) der Linker zwischen (VH) Anti-CD4 und RANTES oder zwischen (VL) Anti-CD4 und RANTES nicht an einem Ende ein Methionin, ein Lysin oder ein Isoleucin direkt angrenzend an die erste Aminosäure von RANTES umfasst.
Chemokinkonstrukt nach Anspruch 1, wobei das Anti-CD4-scFv abgeleitet ist von einem monclonalen Anti-CD4-Antikörper.
Chemokinkonstrukt nach Anspruch 1 oder 2, wobei der Anti-CD4-scFv abgeleitet ist von einem monoclonalen Antikörper MT413, umfassend SEQ ID NR: 28.
Chemokinkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, wobei die (VH) Anti-CD4 mindestens eine CDR3 besitzt, bestehend aus der Aminosäuresequenz: Lys Gly Glu Asn Gly Asn Ser Leu Ala Phe Ala Tyr (SEQ ID NR: 2).
Chemokinkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die (VH) Anti-CD4 mindestens eine CDR2 besitzt, bestehend aus der Aminosäuresequenz: Glu Ile Tyr Pro Gly Ser Gly Ser Asp Tyr Tyr Asn Glu Asn Leu Lys Asp (SEQ ID NR: 4).
Chemokinkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die (VH) Anti-CD4 mindestens eine CDR1 besitzt, bestehend aus der Aminosäuresequenz: Asp Tyr Val Ile Asn (SEQ ID NR: 6).
Chemokinkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die DNA-Sequenz, die (VH) Anti-CD4 codiert, mindestens eine CDR3 besitzt, bestehend aus der Nucleinsäuresequenz: aag ggg gag aat ggt aac tcc ctg gcg ttt gct tac (SEQ ID NR: 1).
Chemokinkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die DNA-Sequenz, die (VH) Anti-CD4 codiert, mindestens eine CDR2 besitzt, bestehend aus der Nucleinsäuresequenz: gag att tat cct gga agt ggt agt gat tac tat aat gag aac ctc aag gac (SEQ ID NR: 3).
Chemokinkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die DNA-Sequenz, die (VH) Anti-CD4 codiert, mindestens eine CDR1 besitzt, bestehend aus der Nucleinsäuresequenz: gac tat gtt ata aat (SEQ ID NR: 5).
Chemokinkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die (VL) Anti-CD4 mindestens eine CDR3 besitzt, bestehend aus der Aminosäuresequenz: Gln Gln Ser Ile Gln Asp Pro Cys Thr (SEQ ID R: 8).
Chemokinkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die (VL) Anti-CD4 mindestens eine CDR2 besitzt, bestehend aus der Aminosäuresequenz: Ala Ala Ser Asn Leu Glu Ser (SEQ ID NR: 10).
Chemokinkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die (VL) Anti-CD4 mindestens eine CDR1 besitzt, bestehend aus der Aminosäuresequenz: Gln Ser Val Asp Tyr Asp Gly Asp Ser Tyr Met Asn (SEQ ID NR: 12).
Chemokinkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die DNA-Sequenz, die (VL) Anti-CD4 codiert, mindestens eine CDR3 besitzt, bestehend aus der Nucleinsäuresequenz: cag caa agt att cag gat ccg tgc acg (SEQ ID NR: 7).
Chemokinkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die DNA-Sequenz, die (VL) Anti-CD4 codiert, mindestens eine CDR2 besitzt, bestehend aus der Nucleinsäuresequenz: gct gca tcc aat cta gaa tct (SEQ ID NR: 9).
Chemokinkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei die DNA-Sequenz, die (VL) Anti-CD4 codiert, mindestens eine CDR1 besitzt, bestehend aus der Nucleinsäuresequenz: caa agt gtt gat tat gat ggt gat agt tat atg aac (SEQ ID NR: 11).
Chemokinkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 15, wobei das RANTES oder RANTES-Fragmente ein RANTES ist, (a) umfassend eine Aminosäuresequenz
eine Aminosäuresequenz
eine Aminosäuresequenz
eine Aminosäuresequenz
(b) welches codiert wird durch eine DNA, umfassend die Nucleinsäuresequenz
die Nucleinsäuresequenz
die Nucleinsäuresequenz:
die Nucleinsäuresequenz
Chemokinkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der Linker zwischen (VH) Anti-CD4 oder (VL) Anti-CD4 und RANTES zwischen 3 und 30 Aminosäuren umfasst.
Chemokinkonstrukt nach Anspruch 17, wobei der Linker zwischen 5 und 15 Aminosäuren umfasst.
Chemokinkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 16, wobei der Linker zwischen (VH) Anti-CD4 und (VL) Anti-CD4 zwischen 8 und 20 Aminosäuren umfasst.
Chemokinkonstrukt nach Anspruch 19, wobei der Linker zwischen 13 und 17 Aminosäuren umfasst.
Chemokinkonstrukt nach einem der Ansprüche 17 und 20, wobei der Linker die Aminosäuresequenz Gly Gly Gly Gly Ser (SEQ ID NR: 51) umfasst.
Chemokinkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei das Chemokinkonstrukt darüber hinaus eine Markierung umfasst.
Chemokinkonstrukt nach Anspruch 22, wobei die Markierung eine FLAG-Markierung oder eine HIS-Markierung ist.
Chemokinkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 23, wobei das RANTES-Linker-(VH) Anti-CD4-Linker-(VL) Anti-CD4-Konstrukt eine Aminosäuresequenz umfasst
wobei das (VL) Anti-CD4-Linker-(VH) Anti-CD4-Linker-RANTES-Konstrukt eine Aminosäuresequenz umfasst

wobei das (VL) Anti-CD4-Linker-(VH) Anti-CD4-Linker-RANTES-Konstrukt eine Aminosäuresequenz umfasst
oder wobei das RANTES-Linker-(VH) Anti-CD4-Linker-(VL) Anti-CD4-Konstrukt codiert wird durch eine Nucleinsäuresequenz

wobei das (VL) Anti-CD4-Linker-(VH) Anti-CD4-Linker-RANTES-Konstrukt codiert wird durch eine Nucleinsäuresequenz
wobei das (VL) Anti-CD4-Linker-(VH) Anti-CD4-Linker-RANTES-Konstrukt codiert ist durch eine Nucleinsäuresequenz
Chemokinkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 24, wobei das Chemokinkonstrukt darüber hinaus ein weiteres Cytokin oder Chemokin umfasst, verbunden mit dem Anti-CD4-scFv-Teil.
Chemokinkonstrukt nach Anspruch 25, wobei das Chemokin Stromal-cell derived factor 1 (SDF-1) ist.
Chemokinkonstrukt nach Anspruch 26, wobei das Konstrukt folgende Strukturdomänenform besitzt (a) RANTES-Linker-(VH) Anti-CD4-Linker-(VL) Anti-CD4-Linker-SDF-1; oder (b) SDF-1-Linker-(VL) Anti-CD4-Linker-(VH) Anti-CD4-Linker-RANTES, oder (c) SDF-1-Linker-(VH) Anti-CD4-Linker-(VL) Anti-CD4-Linker-RANTES.
Polynucleotid, welches bei Expression ein Chemokinkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 27 codiert.
Polynucleotid nach Anspruch 28, wobei das Polynucleotid (a) ein Polynucleotid ist, umfassend das Nucleinsäuremolekül, welches insbesondere das Polypeptid wie dargestellt in SEQ ID NR: 18, SEQ ID NR: 20 oder SEQ ID NR: 30 codiert; (b) ein Polynucleotid ist, umfassend das Nucleinsäuremolekül wie dargestellt in SEQ ID NR: 17, SEQ ID NR: 19 oder SEQ ID NR: 29; oder (c) ein Polynucleotid ist, welches unter stringenten Bedingungen mit dem komplementären Strang eines Polynucleotids nach (a) oder (b) hybridisiert.
Vektor umfassend das Polynucleotid nach Anspruch 28.
Zelle, transfiziert mit dem Polynucleotid nach Anspruch 28 oder dem Vektor nach Anspruch 30.
Verfahren zur Herstellung des Chemokinkonstrukts nach einem der Ansprüche 1 bis 27, umfassend das Züchten einer Zelle nach Anspruch 31 und das Isolieren des Konstruktes aus der Kultur.
Zusammensetzung, umfassend das Chemokinkonstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 27, das Polynucleotid nach Anspruch 28 oder den Vektor nach Anspruch 30.
Zusammensetzung nach Anspruch 33, welche ein Arzneimittel ist, gegebenenfalls darüber hinaus umfassend einen pharmazeutisch verträglichen Träger.
Verwendung des Polynucleotids nach Anspruch 28 oder des Vektors nach Anspruch 30 zur Herstellung von Zusammensetzungen zur Gentherapie.
Verwendung eines Chemokinkonstrukts nach einem der Ansprüche 1 bis 27, eines Polynucleotids nach Anspruch 28 oder eines Vektors nach Anspruch 30 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung einer HIV-Infektion oder von AIDS.
Verwendung eines Chemokinkonstrukts nach einem der Ansprüche 1 bis 27, eines Polynucleotids nach Anspruch 28 oder eines Vektors nach Anspruch 30 für die Herstellung eines Arzneimittels zur Behandlung von entzündlichen Erkrankungen und/oder Autoimmunerkrankungen.