DE69937369T2

DE69937369T2 - CCR5 Antikörper PA14

Info

Publication number: DE69937369T2
Application number: DE69937369T
Authority: DE
Inventors: William C. Ossining OLSON; Paul J. Scarsdale Maddon
Original assignee: Progenics Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Progenics Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1998-12-16
Filing date: 1999-12-16
Publication date: 2008-07-24
Anticipated expiration: 2019-12-17
Also published as: EP2088158A2; EP1144006B1; ATE375802T1; EP1144006A2; HK1041207B; DE69937369D1; AU2199600A; AU2004205164A1; PT1144006E; WO2000035409A2; MXPA01006097A; ES2296416T3; JP2002538771A; HK1041207A1; AU2004205165A1; EP1144006A4; EP2088158A3; CA2355607A1; DK1144006T3; CY1107858T1

Description

Hintergrund der Erfindung
Das Humane Immundefizienz-Virus Typ 1 (HIV-1) induziert eine Fusion des Virus an die Zellmembran, um in Targetzellen eindringen zu können (8, 15, 66). Die erste Wechselwirkung mit hoher Affinität zwischen dem Virion und der Zelloberfläche ist die Bindung des viralen Oberflächenglykoproteins gp120 an das CD4-Antigen (13, 30, 41, 42). Dies wiederum induziert konformative Veränderungen in gp120, welche dieses in die Lage versetzen, mit einem der verschiedenen Chemokinrezeptoren (4, 5, 21, 36) zu interagieren. Der CC-Chemokinrezeptor CCR5 ist der bedeutendste Co-Rezeptor für makrophagentrope (R5) Stämme und spielt eine entscheidende Rolle bei der sexuellen Übertragung von HIV-1 (4, 5, 21, 36). T-Zelllinien-trope (X4) Viren verwenden CXCR4, um in die Targetzellen einzudringen und entstehen für gewöhnlich, aber nicht immer, in einem späten Stadium des Krankheitsverlaufs oder als eine Folge der Viruspropagation in Gewebekultur (4, 5, 21, 36). Einige primäre HIV-1-Isolate sind dualtrop (R5X4), da sie beide Co-Rezeptoren verwenden können, wenn auch nicht immer mit der gleichen Effizienz (11, 57). Mutagenesestudien gekoppelt mit der Auflösung der Kristallstruktur des Kerns von gp120 zeigten, dass die Co-Rezeptorbindestelle auf gp120 mehrere konservierte Reste umfasst (32, 53, 65).
Es wurde gezeigt, dass Tyrosine und negativ geladene Reste in der aminoterminalen Domäne (Nt) von CCR5 essentiell für die Bindung von gp120 an den Co-Rezeptor und für die Fusion und den Eintritt von HIV-1 sind (6, 18, 20, 22, 28, 31, 52, 54). Reste in den extrazellulären Schleifen (ECL) 1–3 von CCR5 waren zwar für die Co-Rezeptorfunktion entbehrlich, doch musste die Inter-Domän-Konfiguration von CCR5 zur optimalen Fusion und Eintritt des Virus aufrechterhalten werden (24). Dies führte zu der Schlussfolgerung, dass entweder gp120 Wechselwirkungen mit einer diffusen Oberfläche auf den ECLs eingeht, oder dass die Nt durch Bindungen mit Resten in den ECLs in einer funktionalen Konformation aufrechterhalten wird. Studien mit chimären Co-Rezeptoren und monoklonalen anti-CCR5 Antikörpern zeigten ebenfalls die Bedeutung der extrazellulären Schleifen für den Eintritt des Virus (5, 54, 64).
Moleküle, die spezifisch an CCR5 und CXCR4 binden und Wechselwirkungen mit deren Liganden blockieren, sind ein wirksames Instrument, um das Struktur/Funktion-Verhältnis der Co-Rezeptoren weiter zu erforschen. Das Charakterisieren solcher Verbindungen könnte ebenso dabei behilflich sein, wirksame therapeutische Wirkstoffe zu entwerfen, die genau auf die Co-Rezeptor-vermittelten Schritte des viralen Eintritts abzielen. Bisher identifizierte Inhibitoren der Co-Rezeptorfunktion von CCR5 oder CXCR4 sind unterschiedlicher Natur und schließen kleine Moleküle, Peptide, Chemokine und deren Derivate sowie monoklonale Antikörper (mAbs) ein. Die Aktionsmechanismen der kleinen Moleküle, die den Eintritt dadurch blockieren, dass sie in die Co-Rezeptorfunktion von CXCR4 eingreifen, sind noch nicht hinreichend verstanden (17, 49, 55, 68). Ein solcher Inhibitor, das anionische kleine Molekül AMD3100, benötigt Reste in ECL2 und der vierten Transmembran (TM)-Domäne von CXCR4, um den viralen Eintritt zu inhibieren; es ist jedoch nicht klar, ob es dies mittels Zerstörung der Bindung von gp120 an CXCR4 oder von Schritten nach der Bindung, welche zur Membranfusion führen, tut (16, 34, 55). Bis heute wurden noch keine kleinen Molekülen berichtet, die spezifisch den CCR5-vermittelten Eintritt von HIV-1 blockieren. Die Inhibierung des Eintritts von HIV-1 durch Chemokine wird von mindestens zwei unterschiedlichen Mechanismen vermittelt: Blockierung der gp120/Co-Rezeptor-Wechselwirkung und die Internalisierung des Chemokin/Rezeptorkomplexes (3, 26, 59, 63). Das variante AOP-RANTES inhibiert ebenfalls den Rückfluss von CCR5 an die Zelloberfläche (40, 56). Varianten wie beispielsweise RANTES 9–68 und Met-RANTES verhindern lediglich die 120/CCR5-Wechselwirkung und CCR5 und regulieren CCR5 nicht runter (67). SDF-1-Varianten agieren vermutlich durch einen ähnlichen Mechanismus, um den durch CXCR4 vermittelten viralen Eintritt zu blockieren (12, 27, 39). Bisher wurde nur ein anti-CXCR4-mAb, 12G5, hinsichtlich seiner antiviralen Eigenschaften charakterisiert. Es wurde berichtet, dass die Effizienz der 12G5-Inhibierung des viralen Eintritts sowohl von der Zelle als auch von dem Isolat abhängt (43, 58). Dieser mAb bindet an die ECL2 von CXCR4, aber der Mechanismus, durch den er den Eintritt inhibiert, ist nicht bekannt (7). Wenige der bisher charakterisierten anti-CCR5 mAbs verhindern effizient den HIV-1-Eintritt (28, 64). Interessanterweise inhibieren mAbs, deren Epitope in der Nt-Domäne von CCR5 liegen, welche die gp120-Bindestelle enthält, virale Fusion und Eintritt weniger effizient als mAb 2D7, dessen Epitop in ECL2 liegt. 2D7 wirkt ebenfalls der CC-Chemokinaktivität entgegen (64).
Eine Gruppe von sechs murinen mAbs, bezeichnet PA8, PA9, PA10, PA11, PA12 und PA14, wurden isoliert und charakterisiert. Alle sechs mAbs banden spezifisch an CCR5⁺-Zellen, jedoch mit unterschiedlichen Effizienzen, abhängig vom Zelltyp. Epitopkartierungs-Studien identifizierten die Reste, die wichtig für die mAb-Bindung sind, und gaben ebenfalls Aufschluss bezüglich der Faltung und Wechselwirkungen der extrazellulären CCR5-Domänen. Alle mAbs inhibierten HIV-1-Fusion und Eintritt, aber es lag jedoch keine Korrelation vor zwischen der Fähigkeit eines mAb, Fusion und Eintritt zu inhibieren, und seiner Fähigkeit, die Bindung von gp120/sCD4 an CCR5⁺-Zellen zu inhibieren.
Zusammenfassung der Erfindung:
Die vorliegende Erfindung stellt einen monoklonalen anti-CCR5-Chemokinrezeptor-Antikörper oder ein, wie in den angehängten Ansprüchen definiertes, Fragment davon bereit, ebenso wie die Verwendung des monoklonalen Antikörpers oder Fragments zur Herstellung einer Zusammensetzung zum Inhibieren der HIV-1-Fusion an und des viralen Eintritts in CD4⁺-Zellen.
Kurze Beschreibung der Figuren:
1: Bindung eines monoklonalen anti-CCR5-Antikörpers an CCR5⁺-Zellen:
Durchflusszytometrie wurde angewandt, um die CCR5-Proteinexpression auf der Oberfläche von L1.2-CCR5⁺-Zellen und frisch isolierten, PHA/IL-2-stimulierten PBMC zu detektieren. Die Zellen wurden mit sättigenden Konzentrationen eines jeden mAb inkubiert, die mittels eines PE-markierten anti-Maus IgG-Reporterantikörpers detektiert wurden. Ergebnisse aus einem repräsentativen Experiment sind dargestellt. Ergebnisse für jeden mAb sind sowohl in durchschnittlichen Fluoreszenzintensitäten (m.f.i.) als auch in % der gegateten Zellen angegeben. Da PA8-PA12 und PA14 alle der IgG1-Unterklasse angehören, sind ihre m.f.i. direkt miteinander vergleichbar. 2D7 ist ein IgG2a.
2: CI-Werte für unterschiedliche Kombinationen aus mAbs und viralen Inhibitoren:
Es wurden Experimente wie die in der Legende von 7 beschriebenen für verschiedene Kombinationen aus Inhibitoren des viralen Eintritts durchgeführt. Anti-CCR5 mAbs wurden getestet in Kombination miteinander, mit CC-Chemokinen und mit CD4-IgG2, welches die HIV-1-Anhaftung an Targetzellen inhibiert. Der Konzentrationsbereich von PA11 und PA12 betrug 0–250 μg/ml; der Konzentrationsbereich von 2D7 und PA14 betrug 0–25 μg/ml; der Konzentrationsbereich von RANTES betrug 0–250 ng/ml; der Konzentrationsbereich von CD4-IgG2 betrug 0–25 μg/ml. Die Konzentrationen von einzelnen Wirkstoffen oder deren Mischungen, die zum Bewirken von 50% und 90% Inhibierung der Fusion oder des Eintritts erforderlich sind, wurden in Form des sogenannten Kombinationsindex (CI) quantitativ miteinander verglichen.
3: IC₅₀-Werte für die Inhibierung von Zell-Zell-Fusion, viralem Eintritt und gp120/sCD4-Bindung durch anti-CCR5 mAbs:
Zum Vergleich haben wir die IC₅₀-Werte zusammengefasst, die in den verschiedenen Assays erhalten wurden, in denen die anti-CCR5 mAbs getestet wurden. Die IC₅₀-Werte wurden nur für solche mAbs berechnet, die > 90% der Fusion, des Eintritts oder der Bindung inhibieren konnten.
4: Epitopkartierung von anti-CCR5 mAbs:
Es wurde ein Zweifarben-Färbeprotokoll angewandt, um die Bindung von mAbs an mutierte CCR5-Proteine zu beurteilen, die am C-Terminus mit dem HA-Peptid-Tag versehen waren. CCR5-Punktmutanten exprimierende HeLa-Zellen wurden mit sättigenden Konzentrationen eines jeden mAb inkubiert, gefolgt von der Detektion mittels eines PE-markierten anti-Maus IgG. Die Co-Rezeptorexpression an der Zelloberfläche wurde mittels doppelter Färbung der Zellen mit einem FITC-markierten anti-HA mAb gemessen. Die vier Raster entsprechen den vier extrazellulären Domänen von CCR5. Die erste Reihe eines jeden Rasters zeigt die Aminosäuresequenz der entsprechenden extrazellulären CCR5-Domäne (SEQ ID NRn: 1–4). Die Bindung von anti-CCR5 mAbs an die Alaninmutante eines jeden Restes ist ausgedrückt als prozentualer Anteil der Bindung an Wildtyp-CCR5, wie in Materialien und Methoden beschrieben.
5: Inhibierung der Kalzium-Mobilisierung in CCR5⁺-Zellen durch anti-CCR5 mAbs:
L1.2-CCR5⁺-Zellen wurden mit Indo-1AM beladen und sequentiell mit einem anti-CCR5 mAb oder PBS, gefolgt von RANTES (a), stimuliert. Fluoreszenzveränderungen wurden mit einem Spektrofluorometer gemessen und die Aufzeichnungen stammen aus einem repräsentativen Experiment. Die Inhibierung des Kalziumflusses durch PA14 und 2D7 wurde für einen breiten Bereich an mAb-Konzentrationen getestet (b). Die Ergebnisse sind als % der Inhibierung des Kalziumeinstroms aufgezeichnet = [1–(relative Fluoreszenz in der Anwesenheit von mAb ÷ relative Fluoreszenz in der Abwesenheit von mAb)] × 100%, und stellen das Mittel der Werte aus drei unabhängigen Experimenten dar.
6: Inhibierung der CCR5-Co-Rezeptorfunktion durch anti-CCR5 mAbs:
Die Inhibierung der Zell-Zell-Fusion durch anti-CCR5 mAbs wurde in dem RET-Assay (a) getestet. Es wurden 0–250 μg/ml PA8-PA12 oder 0–25 μg/ml PA14 oder 2D7 zu einem Gemisch aus HeLa-Env_JR-FL ^– und PM1-Zellen hinzugegeben, die mit F18 beziehungsweise R18 markiert waren. Nach 4 Stunden Inkubation wurde Fluoreszenz-RET gemessen. Die Ergebnisse stellen Mittelwerte aus drei unabhängigen Experimenten dar und sind ausgedrückt als % Inhibierung der Fusion = [1 – (% RET in der Anwesenheit von mAb ÷ % RET in der Abwesenheit von mAb)] × 100%. Die Inhibierung des HIV-1-Eintritts durch anti-CCR5 mAbs wurde in einem einzigen Durchgang eines auf der Replikation von Luziferase basierenden Eintritts-Assays (b) getestet. Es wurden U87-CD4⁺CCR5⁺-Zellen mit einem NLluc⁺env^–-Reportervirus, welches die JR-FL-Hülle in der Anwesenheit von 0–250 μg/ml PA8-PA12 oder 0–25 μg/ml PA14 oder 2D7 trug, infiziert. Die Luziferaseaktivität (relative Lichteinheiten, r.l.u.) wurde 72 h nach Infektion in Zelllysaten gemessen. Die Ergebnisse stammen aus einem repräsentativen Experiment und sind ausgedrückt in % Inhibierung des Eintritts = [1 – (r.l.u. in der Anwesenheit von mAb ÷ r.l.u. in der Abwesenheit von mAb)] × 100%. Die Bindung von biotinylierten [b] gp120-, sCD4- und b-gp120-CD4-Komplexen an L1.2-CCR5⁺-Zellen (c). Es ist eine starke Bindung zu beobachten, wenn von dem R5-Virus HIV-1_JR-FL stammendes gp120 mit einer äquimolaren Menge an sCD4 komplexiert wird. In der Abwesenheit von sCD4 oder für von dem X4-Virus HIV-1_LAI stammendes gp120 ist keine Bindung zu beobachten. Die Hintergrundbindung an CCR5-L1.2-Zellen wurde von allen Kurven subtrahiert. Die Inhibierung der gp120/sCD4-Bindung an L1.2-CCR5⁺-Zellen wurde in der Anwesenheit verschiedener Konzentrationen eines jeden Antikörpers getestet (d). Die Zellen wurden in 96-Well-Platten mit einem anti-CCR5 Antikörper vorinkubiert, gefolgt von einer Inkubation mit einer sättigenden Konzentration von biotinyliertem gp120/sCD4. Schließlich wurde unter Verwendung eines Fluoreszenzplattenlesers die Bindung von mit PE-markiertem Streptavidin an Zellen gemessen. Die Ergebnisse stammen aus einem repräsentativen Experiment und sind ausgedrückt als % Inhibierung der gp120/sCD4-Bindung = [1 – (m.f.i. in der Anwesenheit von mAb ÷ m.f.i. in der Abwesenheit von mAb)] × 100%.
7: Synergistische Inhibierung der Zell-Zell-Fusion durch PA12 und 2D7:
Für die einzeln und in Kombination verwendeten mAbs wurden Dosis-Antwort-Kurven erhalten. Es wurden 0–50 μg/ml PA12, 0–25 μg/ml 2D7 oder eine Kombination aus den beiden in einem Verhältnis von 2:1 zu einem Gemisch aus HeLa-Env_JR-FL ⁺- und PM1-Zellen gegeben, welche mit R18 beziehungsweise F18 markiert waren. Nach 4 Stunden Inkubation wurde Fluoreszenz-RET gemessen. Die Ergebnisse sind als % Inhibierung der Fusion ausgedrückt und stellen die Mittel der Werte aus drei unabhängigen Experimenten dar. Die Daten wurden unter Verwendung des Prinzips des Median-Effekts analysiert, welches folgendermaßen dargestellt werden kann: f = 1/[1 + (K/c)m] (1),wobei f die betroffene/inhibierte Fraktion ist, c die Konzentration ist, K die Konzentration des zum Bewirken des Median-Effekts benötigten Agens ist, und m einen empirischen Koeffizienten darstellt, der die Form der Dosis-Antwort-Kurve beschreibt. Bei der Gleichung (1) handelt es sich um eine verallgemeinerte Form der Gleichungen, welche die Michaelis-Menten-Enzymkinetik, die Langmuir'sche Adsorptions-Isotherme und die Ionisierungs-Gleichgewichte nach Henderson-Hasselbalch beschreiben, für die m = 1 ist. Im vorliegenden Fall ist K gleich dem IC₅₀-Wert. K und m wurden mittels Angleichung der Dosis-Antwort-Kurven bestimmt und Gleichung (1) wurde umgestaltet, so dass sie die Berechnung von c für einen gegebenen Wert von f ermöglicht. Die best-fit-Parameter für K und c sind 8,8 μg/ml und 0,54 für PA12, 0,36 μg/ml und 0,68 für 2D7 und 0,11 μg/ml und 1,1 für deren Kombinationen. Diese Kurven sind gezeichnet und zeigen eine angemessene Anpassungsqualität zwischen dem Experiment und der Theorie an.
Detaillierte Beschreibung der Erfindung:
Die vorliegende Erfindung stellt einen monoklonalen anti-CCR5 Chemokinrezeptor Antikörper oder ein wie in den Ansprüchen definiertes Fragment davon bereit.
Die Offenbarung betrifft ebenfalls eine Zusammensetzung zum Inhibieren einer HIV-1-Infektion umfassend wenigstes zwei Verbindungen in synergistisch wirksamen Mengen zum Inhibieren einer HIV-1-Infektion, wobei wenigstens eine der Verbindungen über die produktiven Wechselwirkungen zwischen HIV-1 und einem HIV-1-Fusions-Co-Rezeptor verhindert.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "Zusammensetzung" ein Gemisch. Die Zusammensetzungen schließen solche ein, sind jedoch nicht auf diejenigen beschränkt, die zur oralen, rektalen, intravaginalen, topischen, nasalen, opthalmischen oder parenteralen Verabreichung an ein Subjekt geeignet sind. Wie hierin verwendet, schließt "parenteral" subkutane, intravenöse, intramuskuläre oder intrasternale Injektions- oder Infusionstechniken ein, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "HIV-1" das Humane Immundefizienzvirus des Typs 1. HIV-1 schließt extrazelluläre Viruspartikel und die Formen von HIV-1 ein, welche in mit HIV-1 infizierten Zellen zu finden sind, ist jedoch nicht auf diese beschränkt.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "HIV-Infektion" die Einführung von genetischer Information von HIV-1 in eine Targetzelle, wie beispielsweise durch die Fusion der Membran der Targetzelle mit HIV-1 oder einer HIV-1-Hüll-Glykoprotein⁺-Zelle. Bei der Targetzelle kann es sich um eine Körperzelle eines Subjekts handeln. In der bevorzugten Ausführungsform handelt es sich bei der Targetzelle um eine Körperzelle von einem humanen Subjekt.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "Inhibierung einer HIV-Infektion" die Reduktion der Menge der genetischen Information von HIV-1, welche in eine Population von Targetzellen eingebracht wird, im Vergleich zu der Menge, die ohne die besagte Zusammensetzung eingebracht werden würde.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "Verbindung" eine molekulare Einheit, welche Peptide, Polypeptide und andere organische oder anorganische Moleküle und Kombinationen davon einschließt, jedoch nicht auf diese beschränkt ist.
Wie hierin verwendet, bedeutet "synergistisch wirksam", dass die kombinierte Wirkung der Verbindungen, wenn sie in Kombination verwendet werden, größer ist als ihre additiven Wirkungen, wenn sie einzeln verwendet werden.
Wie hierin verwendet, bedeutet "produktive Interaktion", dass die Interaktion von HIV-1 und dem HIV-1-Co-Rezeptor zu einer Fusion der HIV-1 oder der HIV-1-Hüll-Glykoprotein⁺-Zelle und der den Co-Rezeptor tragenden Membran führen würde.
Wie hierin verwendet, bedeutet "Verhinderung der produktiven Interaktion", dass der Umfang der Wechselwirkung im Vergleich zu dem Umfang, der ohne die Verbindung gegeben wäre, reduziert wird. Die Wechselwirkungen können durch Maskieren oder Verändern der interaktiven Regionen auf dem Co-Rezeptor oder HIV-1 oder das Verändern des Expressions, Aggregations-, Konformations- oder Assoziationszustands des Co-Rezeptors verhindert werden.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "HIV-1-Fusions-Co-Rezeptor" einen zellulären Rezeptor, der die Fusion zwischen der den Rezeptor exprimierenden Targetzelle und HIV-1 oder einer HIV-1-Hüll-Glykoprotein⁺-Zelle vermittelt. HIV-1-Fusions-Co-Rezeptoren schließen CCR5, CXCR4 und andere Chemokinrezeptoren ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt.
Die vorliegende Erfindung stellt ebenfalls eine Zusammensetzung bereit, welche die Fusion von HIV-1 oder einer HIV-1-Hüll-Glykoprotein⁺-Zelle an eine Targetzelle verhindert, umfassend wenigstens zwei Verbindungen in synergistisch wirksamen Mengen zum Inhibieren der Fusion von HIV-1 oder einer HIV-1-Hüll-Glykoprotein⁺-Zelle an eine Targetzelle, wobei mindestens eine der Verbindungen die produktive Wechselwirkung zwischen HIV-1 und einem HIV-1-Fusions-Co-Rezeptor verhindert.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "Fusion" die Verbindung oder Vereinigung der Lipiddoppelschicht-Membranen, welche in Säugerzellen oder in Viren wie beispielsweise HIV-1 zu finden sind. Dieser Vorgang wird von der Anhaftung von HIV-1 an eine Targetzelle unterschieden. Die Anhaftung wird durch die Bindung des äußeren HIV-1-Glykoproteins an den humanen CD4-Rezeptor vermittelt, der kein Fusions-Co-Rezeptor ist.
Wie hierin verwendet, bedeutet "inhibieren", dass der Umfang im Vergleich zu dem Umfang, der ohne die Zusammensetzung gegeben wäre, reduziert wird.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "Targetzelle" eine Zelle, die dazu in der Lage ist, durch HIV-1 oder durch mit HIV-1 infizierte Zellen infiziert zu werden oder zu fusionieren.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "Chemokin" ein Zytokin, welches Leukozytenbewegung stimulieren kann. Sie können entweder als cys-cys oder als cys-X-cys charakterisiert werden, je nachdem, ob die beiden aminoterminalen Cysteinreste unmittelbar aneinander angrenzen oder durch eine Aminosäure getrennt sind. "Chemokin" schließt RANTES, MIP-1α, MIP-1β, SDF-1 oder ein anderes Chemokin, welches die HIV-1-Infektion blockiert ein, ist jedoch nicht darauf beschränkt.
In einer Ausführungsform der zuvor genannten Zusammensetzungen ist der Co-Rezeptor ein Chemokinrezeptor. In der bevorzugten Ausführungsform der zuvor genannten Zusammensetzungen ist der Chemokinrezeptor CCR5 oder CXCR4. Von einigen anderen Chemokin- und verwandten Rezeptoren ist bekannt, dass sie als HIV-Co-Rezeptoren funktionieren, einschließend, jedoch nicht beschränkt auf, CCR2, CCR3, CCR8, STRL33, GPR-15, CX3CR1 und APJ (69).
Wie hierin verwendet, bezeichnet "Chemokinrezeptor" ein Mitglied einer homologen Familie von Sieben-Transmembran-überspannenden Zelloberflächenproteinen, welche Chemokin binden.
Wie hierin verwendet, ist "CCR5" ein Chemokinrezeptor, der Mitglieder der C-C-Gruppe von Chemokinen bindet und dessen Aminosäuresequenz die unter der GenBank Zugangsnummer 1705896 bereitgestellte, sowie verwandte polymorphe Varianten umfasst.
Wie hierin verwendet, ist "CXCR4" ein Chemokinrezeptor, der Mitglieder der C-X-C-Gruppe von Chemokinen bindet und dessen Aminosäuresequenz die unter der GenBank Zugangsnummer 400654 bereitgestellte, sowie verwandte polymorphe Varianten umfasst.
In einer Ausführungsform der zuvor genannten Zusammensetzungen ist wenigstens eine der Verbindungen ein Nichtpeptidyl-Molekül. In einer Ausführungsform ist das Nichtpeptidyl-Molekül die Bicyclam-Verbindung AMD3100 (16).
Wie hierin verwendet, bezeichnet "Nichtpeptidyl-Molekül" ein Molekül, das in seiner Gesamtheit nicht aus einer linearen Sequenz von durch Peptidbindungen verbundene Aminosäuren besteht. Ein Nichtpeptidyl-Molekül kann jedoch eine oder mehrere Peptidbindungen enthalten.
Es wurden am 02. Dezember 1998 gemäß dem und in Erfüllung des Budapester Vertrags über die internationale Anerkennung der Hinterlegung von Mikroorganismen für die Zwecke von Patentverfahren murine Hybridome, welche die monoklonalen Antikörper PA8, PA9, PA10, PA11, PA12 beziehungsweise PA14 sekretieren, bei der American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110–2209 unter den nachfolgenden Zugangsrn. hinterlegt: ATCC-Zugangsnummer HB-12605 (PA8), ATCC-Zugangsnummer HB-12606 (PA9), ATCC-Zugangsnummer HB-12607 (orig.: Acession No. 12607) (PA10), ATCC-Zugangsnummer HB-12608 (PA11) (orig.: P11), ATCC-Zugangsnummer HB-12609 (PA12) und ATCC-Zugangsnummer HB-12610 (orig.: HB-126010) (PA14).
In einem weiteren Aspekt betrifft die Offenbarung eine Zusammensetzung zum Inhibieren einer HIV-1-Infektion, umfassend zwei oder mehrere Antikörper. Die Antikörper schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, PA8, PA9, PA10, PA11, PA12, PA14 und 2D7. In dieser Zusammensetzung liegen die Antikörper in einem geeigneten Verhältnis vor. Das Verhältnis reicht von 1:1 bis 50:1.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "Antikörper" ein Immunglobulinmolekül umfassend zwei schwere Ketten und zwei leichte Ketten, und welches ein Antigen erkennt. Das Immunglobulinmolekül kann aus einer beliebigen der allgemein bekannten Klassen stammen, einschließend, jedoch nicht beschränkt auf, IgA, sekretorisches IgA, IgG und IgM. IgG-Unterklassen sind dem Fachmann ebenfalls wohlbekannt und schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, humanes IgG, IgG2, IgG3 und IgG4. "Antikörper" bezeichnet beispielhaft sowohl natürlich vorkommende als auch nicht natürlich vorkommende Antikörper. Im Speziellen schließt "Antikörper" polyklonale und monoklonale Antikörper sowie monovalente und divalente Fragmente davon ein. Des Weiteren schließt "Antikörper" chimäre Antikörper, vollständig synthetische Antikörper, einzelkettige Antikörper sowie Fragmente davon ein. Ein Antikörper kann gegebenenfalls mit einem detektierbaren Marker versehen werden. Detektierbare Marker schließen zum Beispiel radioaktive oder fluoreszierende Marker ein. Der Antikörper kann ein humaner oder nicht-humaner Antikörper sein. Der nicht-humane Antikörper kann mittels rekombinanter Verfahren humanisiert werden, um seine Immunogenizität im Menschen zu reduzieren. Verfahren zur Humanisierung von Antikörpern sind dem Fachmann bekannt.
Wie hierin verwendet, wird "monoklonaler Antikörper", auch bezeichnet als mAb, dazu verwendet, Antikörpermoleküle zu beschreiben, deren primäre Sequenzen im Wesentlichen identisch sind und die die gleiche antigene Spezifität aufweisen. Monoklonale Antikörper können mittels Hybridom-, rekombinanter, transgener oder anderer dem Fachmann bekannten Techniken hergestellt werden.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "anti-Chemokinrezeptor-Antikörper" einen Antikörper, der ein Epitop auf einem Chemokinrezeptor erkennt und daran bindet. Wie hierin verwendet, bezeichnet "anti-CCR5-Antikörper" einen monoklonalen Antikörper, der ein Epitop auf dem CCR5-Chemokinrezeptor erkennt und daran bindet.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "geeignetes Verhältnis" Massen- oder molare Verhältnisse, bei denen die Verbindungen synergistisch wirksam sind.
In einer Ausführungsform der zuvor genannten Zusammensetzungen ist wenigstens eine Verbindung ein Chemokin oder ein Chemokinderivat. Die Chemokine schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, RANTES, MIP-1α, MIP-1β, SDF-1 oder eine Kombination davon. In dieser Zusammensetzung liegen die Verbindungen in einem geeigneten Verhältnis vor. Die Chemokinderivate schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Met-RANTES, AOP-RANTES, RANTES 9–68 oder eine Kombination davon.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "Chemokinderivat" ein chemisch modifiziertes Chemokin. Die chemischen Modifikationen schließen ein, sind jedoch nicht beschränkt auf, Aminosäuresubstitutionen, -additionen oder -deletionen sowie Nichtpeptidyl-Additionen oder -Oxidationen. Der Fachmann wird dazu in der Lage sein, solche Derivate herzustellen.
In einer weiteren Ausführungsform der zuvor genannten Zusammensetzungen ist wenigstens eine Verbindung ein Antikörper und wenigstens eine Verbindung ist ein Chemokin oder Chemokinderivat. In dieser Zusammensetzung liegen die Verbindungen in einem geeigneten Verhältnis vor. Dieses Verhältnis erstreckt sich von 100:1 bis 1.000:1.
In einer weiteren Ausführungsform der zuvor genannten Zusammensetzungen bindet wenigstens eine Verbindung an die gp41-Untereinheit des HIV-1-Hüllen-Glykoproteins. In einer Ausführungsform ist wenigstens eine Verbindung der T-20-Peptid-Inhibitor des HIV-1-Eintritts (70).
In einer weiteren Ausführungsform der zuvor genannten Zusammensetzungen inhibiert wenigstens eine der Verbindungen die Anhaftung von HIV-1 an eine Targetzelle. In einer Ausführungsform ist wenigstens eine Verbindung CD4. In einer Ausführungsform ist wenigstens eine Verbindung ein HIV-1-Hüll-Glykoprotein. In einer Ausführungsform ist wenigstens eine Verbindung ein anti-CD4-Antikörper. In einer Ausführungsform bindet wenigstens eine Verbindung an das HIV-1-Hüllen-Glykoprotein. In einer Ausführungsform ist wenigstens eine Verbindung ein Antikörper gegen das HIV-1-Hüll-Glykoprotein. In einer Ausführungsform ist wenigstens eine Verbindung ein auf CD4 basierendes Protein. In einer Ausführungsform ist wenigstens eine Verbindung CD4-IgG2.
In einer weiteren Ausführungsform der zuvor genannten Zusammensetzungen ist wenigstens eine Verbindung ein Antikörper und wenigstens eine Verbindung bindet an ein HIV-1-Hüllen-Glykoprotein. In einer Ausführungsform ist die Verbindung ein auf CD4 basierendes Protein. In einer Ausführungsform ist die Verbindung CD4-IgG2. In dieser Zusammensetzung liegen die Verbindungen in einem geeigneten Verhältnis vor. Dieses Verhältnis erstreckt sich von 1:1 bis 10:1.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "Anhaftung" den Vorgang, der durch die Bindung des HIV-1-Hüllen-Glykoproteins an den humanen CD4-Rezeptor, der kein Fusions-Co-Rezeptor ist, vermittelt wird.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "CD4" das reife, native, membrangebundene CD4-Protein, umfassend eine zytoplasmatische Domäne, eine hydrophobe Transmembran-Domäne sowie eine extrazelluläre Domäne, welche an das HIV-1-gp120-Hüllen-Glykoprotein bindet.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "HIV-1-Hüll-Glykoprotein" das HIV-1-kodierte Protein, welches das gp120-Oberflächenprotein, das gp41 Transmembran-Protein sowie Oligomere und Vorläufer davon umfasst.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "auf CD4 basierendes Protein" jedes beliebige Protein, das wenigstens eine Sequenz von Aminosäureresten umfasst, die dem Abschnitt von CD4 entspricht, welcher dafür erforderlich ist, dass CD4 einen Komplex mit dem HIV-1-gp120-Hüll-Glykoprotein bildet.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "CD4-IgG2" ein heterotetrameres Fusionsprotein aus CD4 und humanem IgG2, welches durch die Expressionsvektoren kodiert wird, die unter den ATCC-Zugangsnummern 75193 und 75194 hinterlegt sind.
In einer Ausführungsform der zuvor genannten Zusammensetzungen umfasst wenigstens eine der Verbindungen ein Polypeptid, das an ein CCR5-Epitop bindet. In einer Ausführungsform liegt das Epitop im N-Terminus, einer der drei extrazellulären Schleifenregionen oder einer Kombination davon. In einer Ausführungsform liegt das Epitop im N-Terminus. Das Epitop kann N13 und Y15 im N-Terminus umfassen. Das Epitop kann Q4 im N-Terminus umfassen. In einer weiteren Ausführungsform schließt das Epitop Reste im N-Terminus und in der zweiten extrazellulären Schleife ein. Das Epitop kann D2, Y3, Q4, S7, P8 und N13 im N-Terminus sowie Y176 und T177 in der zweiten extrazellulären Schleife umfassen. Das Epitop kann D2, Y3, Q4, P8 und N13 im N-Terminus sowie Y176 und T177 in der zweiten extrazellulären Schleife umfassen. Das Epitop kann D2 im N-Terminus sowie R168 und Y176 in der zweiten extrazellulären Schleife umfassen. In einer Ausführungsform liegt das Epitop in der zweiten extrazellulären Schleife. Das Epitop kann Q170 und K171 in der zweiten extrazellulären Schleife umfassen. Das Epitop kann Q170 und E172 in der zweiten extrazellulären Schleife umfassen.

Wie hierin verwendet, werden die nachfolgenden Standardabkürzungen in der gesamten Beschreibung verwendet, um spezifische Aminosäuren zu bezeichnen:

A = ala = Alanin	R = arg = Arginin
N = asn = Asparagin	D = asp = Asparaginsäure
C = cys = Cystein	Q = gln = Glutamin
E = glu = Glutaminsäure	G = gly = Glycin
H = his = Histidin	I = ile = Isoleucin
L = leu = Leucin	K = lys = Lysin
M = met = Methionin	F = phe = Phenylalanin
P = pro = Prolin	S = ser = Serin
T = thr = Threonin	W = trp = Tryptophan
Y = tyr = Tyrosin	V = val = Valin

Wie hierin verwendet, bezeichnet "Polypeptid" eine oder mehrere Aminosäuren, die durch eine Peptidbindung verbunden sind.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "Epitop" einen Abschnitt eines Moleküls oder mehrerer Moleküle, der eine Oberfläche für die Bindung von Antikörpern oder anderen Verbindungen ausbildet. Das Epitop kann zusammenhängende oder nicht zusammenhängende Aminosäuren, Kohlehydrate oder andere Nichtpeptidylreste oder oligomerspezifische Oberflächen umfassen.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "N-Terminus" die Sequenz von Aminosäuren, die sich über das initiierende Methionin und die erste Transmembran-Region hinweg erstreckt.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "zweite extrazelluläre Schleife" die Sequenz von Aminosäuren, welche die vierte und die fünfte Transmembran-Region überspannen und auf der Oberfläche präsentiert werden.
In einer Ausführungsform der zuvor genannten Zusammensetzungen umfasst wenigstens eine der Verbindungen eine leichte Kette eines Antikörpers. In einer weiteren Ausführungsform der zuvor genannten Zusammensetzungen umfasst wenigstens eine der Verbindungen eine schwere Kette eines Antikörpers. In einer weiteren Ausführungsform der zuvor genannten Zusammensetzungen umfasst wenigstens eine der Verbindungen den Fab-Anteil eines Antikörpers. In einer weiteren Ausführungsform der zuvor genannten Zusammensetzungen umfasst wenigstens eine der Verbindungen die variable Domäne eines Antikörpers. In einer weiteren Ausführungsform wird der Antikörper als ein einzelnes Polypeptid oder "einzelkettiger" Antikörper produziert, welcher die variablen Domänen der schweren und der leichten Kette umfasst, die über eine intervenierende Sequenz von Aminosäuren genetisch miteinander verknüpft sind. In einer weiteren Ausführungsform der zuvor genannten Zusammensetzungen umfasst wenigstens eine der Verbindungen einen oder mehrere CDR-Anteile eines Antikörpers.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "schwere Kette" das größere Peptid eines Antikörpermoleküls, das aus einer variablen Domäne (VH) sowie drei oder vier konstanten Domänen (CH1, CH2, CH3 und CH4) oder Fragmenten davon besteht.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "leichte Kette" das kleinere Polypeptid eines Antikörpermoleküls, das aus einer variablen Domäne (VL) und einer konstanten Domäne (CL) oder Fragmenten davon besteht.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "Fab" ein monovalentes Antigen-bindendes Fragment eines Immunglobulins, das aus einer leichten Kette und einem Teil einer schweren Kette besteht. Es kann mittels eines kurzen Papainverdaus oder mittels rekombinanter Verfahren erhalten werden.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "F(ab')2-Fragment" ein bivalentes Antigen-bindendes Fragment eines Immunglobulins, das aus den beiden leichten Ketten und einem Teil der beiden schweren Ketten besteht. Es kann mittels eines kurzen Pepsinverdaus oder mittels rekombinanter Verfahren erhalten werden.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "CDR" oder "komplementaritätsbestimmende Region" eine in höchstem Maße variable Sequenz von Aminosäuren in der variablen Domäne eines Antikörpers.
Die vorliegende Offenbarung betrifft die zuvor genannten Zusammensetzungen sowie einen pharmazeutisch verträglichen Träger. Pharmazeutisch verträgliche Träger sind dem Fachmann wohlbekannt. Solche pharmazeutisch verträglichen Träger können einschließen, sind jedoch nicht beschränkt auf, wässrige oder nicht-wässrige Lösungen, Suspensionen und Emulsionen. Beispiele für nicht-wässrige Lösungsmittel sind Propylenglykol, Polyethylenglykol, Pflanzenöle wie beispielsweise Olivenöl und injizierbare organische Ester wie beispielsweise Ethyloleat. Wässrige Träger schließen ein: Wasser, alkoholische/wässrige Lösungen, Emulsionen oder Suspensionen, salzhaltige und gepufferte Medien. Parenterale Vehikel schließen ein: Natriumchloridlösung, Ringer-Dextrose, Dextrose und Natriumchlorid, Ringer-Laktat oder fixierte Öle. Intravenöse Vehikel schließen ein: Fluid- und Nährstoff-Replenisher, Elektrolyt-Replenisher wie beispielsweise die auf Ringer-Dextrose basierenden und dergleichen. Es können ebenfalls Konservierungsmittel und andere Zusatzstoffe anwesend sein, wie beispielsweise antimikrobielle Substanzen, Antioxidantien, Chelatbildner, inerte Gase und dergleichen.
Die vorliegende Offenbarung betrifft ein Verfahren zur Behandlung eines von HIV-1 betroffenen Subjekts, umfassend das Verabreichen einer wirksamen Dosis der zuvor genannten Zusammensetzungen an das Subjekt.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "Subjekt" jedes beliebige Tier oder künstlich modifizierte Tier, das dazu in der Lage ist, sich mit HIV zu infizieren. Künstlich modifizierte Tiere schließen SCID-Mäuse mit humanen Immunsystemen ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. Die Tiere schließen Mäuse, Ratten, Hunde, Meerschweinchen, Frettchen, Kaninchen und Primaten ein, sind jedoch nicht auf diese beschränkt. In der bevorzugten Ausführungsform ist das Subjekt ein Mensch.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "behandeln" entweder das Verlangsamen, Stoppen oder Umkehren des Fortschreitens einer HIV-1-Erkrankung. In der bevorzugten Ausführungsform bedeutet "behandeln" ein Umkehren des Fortschreitens bis hin zur Eliminierung der Erkrankung. Wie hierin verwendet, bedeutet "behandeln" ebenfalls die Reduktion der Anzahl der viralen Infektionen, die Reduktion der Anzahl der infektiösen viralen Partikeln, die Reduktion der Anzahl der viral infizierten Zellen oder die Besserung von mit HIV-1 assoziierten Symptomen.
Wie hierin verwendet, bedeutet "von HIV-1 betroffen", dass das Subjekt wenigstens eine Zelle aufweist, die mit HIV-1 infiziert wurde.
Wie hierin verwendet, kann "Verabreichen" unter Verwendung eines beliebigen dem Fachmann bekannten Verfahrens erfolgen bzw. durchgeführt werden. Die Verfahren können intravenöse, intramuskuläre oder subkutane Mittel umfassen.
Die Dosis der erfindungsgemäße Zusammensetzung wird in Abhängigkeit von dem Subjekt und von dem speziellen verwendeten Verabreichungsweg variieren. Dosierungen können sich erstrecken von 0,1 bis 100.000 μg/kg. Je nach der Zusammensetzung kann die Dosis kontinuierlich, wie beispielsweise durch eine kontinuierliche Pumpe, oder in periodischen Intervallen verabreicht werden. Zum Beispiel zu einem oder mehreren separaten Gelegenheiten. Die gewünschten Zeitintervalle für multiple Dosen einer speziellen Zusammensetzung können vom Fachmann ohne unzumutbares Experimentieren bestimmt werden.
Wie hierin verwendet, bezeichnet "wirksame Dosis" eine Menge, die dazu ausreicht, das Subjekt entweder zu behandeln oder es davor zu bewahren, mit HIV-1 infiziert zu werden. Der durchschnittliche Fachmann ist dazu in der Lage, einfache Titrationsexperimente durchzuführen, um die Menge zu bestimmen, die zur Behandlung des Subjekts erforderlich ist.
Die vorliegende Offenbarung betrifft ein Verfahren, zum Verhindern, dass sich ein Subjekt HIV-1 zuzieht, umfassend die Verabreichung einer wirksamen Dosis der zuvor genannten Zusammensetzungen an das Subjekt.
Wie hierin verwendet, bedeutet "sich HIV-1 zuziehen", mit HIV-1 infiziert zu werden, dessen genetische Information sich in den Wirtszellen repliziert und/oder in diese integriert.
Die vorliegende Erfindung stellt einen monoklonalen anti-CCR5 Antikörper bereit. Der Antikörper schließt einen Antikörper ein, der von einem der nachfolgend aufgeführten Hybridome produziert wird, ist jedoch nicht auf diesen beschränkt: PA8 (ATCC-Zugangsnummer HB-12605), PA9 (ATCC-Zugangsnummer HB-12606), PA10 (ATCC-Zugangsnummer HB-12607), PA11 (ATCC-Zugangsnummer HB-12608), PA12 (ATCC-Zugangsnummer HB-12609) und PA14 (ATCC-Zugangsnummer HB-12610).
Die vorliegende Erfindung stellt humanisierte Formen der zuvor genannten Antikörper bereit.
Wie hierin verwendet, beschreibt "humanisiert" Antikörper, in denen einige, die meisten oder alle außerhalb der CDR-Regionen liegenden Aminosäuren durch entsprechende Aminosäuren ersetzt werden, die von humanen Immunglobulinmolekülen stammen. In einer Ausführungsform der humanisierten Form der Antikörper wurden einige, die meisten oder alle außerhalb der CDR-Regionen liegenden Aminosäuren durch Aminosäuren aus den humanen Immunglobulinmolekülen ersetzt, wobei jedoch einige, die meisten oder alle innerhalb einer oder mehrerer CDR-Regionen liegenden Aminosäuren unverändert blieben. Kleine Additionen, Deletionen, Insertionen, Substitutionen oder Modifikationen der Aminosäuren sind gestattet, vorausgesetzt dass sie die Fähigkeit des Antikörpers, an ein gegebenes Antigen zu binden, nicht aufheben. Geeignete humane Immunglobulinmoleküle würden IgG1-, IgG2-, IgG3-, IgG4-, IgA- sowie IgM-Moleküle einschließen. Ein "humanisierter" Antikörper würde eine ähnliche antigene Spezifität beibehalten wie der ursprüngliche Antikörper, d. h. – in der vorliegenden Erfindung – die Fähigkeit, CCR5 zu binden.
Die vorliegende Offenbarung betrifft isolierte Nukleinsäuremoleküle, welche diese monoklonalen anti-CCR5 Antikörper oder deren humanisierte Versionen kodieren. Die Nukleinsäuremoleküle können RNA, DNA oder cDNA sein. In einer Ausführungsform kodiert das Nukleinsäuremolekül die leichte Kette. In einer Ausführungsform kodiert das Nukleinsäuremolekül die schwere Kette. In einer Ausführungsform kodiert die Nukleinsäure sowohl die schweren als auch die leichten Ketten. In einer Ausführungsform kodieren ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle den Fab-Anteil. In einer Ausführungsform kodieren ein oder mehrere Nukleinsäuremoleküle die CDR-Anteile. In einer Ausführungsform kodiert das Nukleinsäuremolekül die variable Domäne.
Die vorliegende Erfindung wird anhand der nachfolgenden experimentellen Details besser verstanden werden. Der Fachmann wird jedoch ohne weiteres erkennen, dass die besprochenen spezifischen Verfahren und Ergebnisse lediglich der Veranschaulichung der vorliegenden Erfindung dienen, die in den angehängten Ansprüchen ausführlicher beschrieben wird.
Experimentelle Details:
A. Materialien und Methoden
1) Reagenzien
MAb 2D7 wurde von Pharmingen (San Diego, CA) bezogen und CC- sowie CXC-Chemokine wurden von R&D Systems (Minneapolis, MN) bezogen. CD4-IgG2 (1), lösliches (s) CD4 (2) und rekombinantes HIV-1_JR-FL-gp120 wurden von Progenics Pharmaceuticals, Inc., hergestellt (59).
2) Isolation und Aufreinigung von anti-CCR5 mAbs
L1.2-CCR5⁺-Zellen (63) wurden für 16 h in der Anwesenheit von 5 mM Natriumbutyrat inkubiert, welches die Transkription vom Cytomegalovirus (CMV)-Promotor aus aktiviert, der die CCR5-Expression steuert, was zu einer 10-fachen Zunahme der Co-Rezeptordichte an der Zelloberfläche führt. Weibliche Balb/c-Mäuse wurden in Intervallen von drei Wochen intraperitoneal mit 10⁷ L1.2-CCR5⁺-Zellen immunisiert und es wurde ihnen drei Tage vor einer Milzentnahme ein intravenöser Boost von 10⁷ L1.2-CCR5⁺-Zellen verabreicht. Die Splenozyten wurden mit der Sp2/0-Zelllinie fusioniert. In einem primären Screening wurden Überstände von zehntausend Hybridomkulturen getestet; einhundertzwanzig von diesen inhibierten die durch die HIV-1-Hülle vermittelte Fusion zwischen PM1-Zellen (10), welche auf natürlichem Wege CCR5 und CD4 exprimieren, und HeLa-Env_JR-FL ⁺-Zellen in einem Resonanzenergietransfer (RET)-Assay, wie bereits beschrieben wurde (19, 38). Die Hybridome, welche die inhibitorisch wirksamsten Überstände produzierten und welche ebenfalls CCR5⁺-Zellen färbten, wurden mittels limitierender Verdünnung subkloniert. Ascites-Fluida wurden von Harlan Bioproducts for Science, Inc., (Indianapolis, IN) aus Balb/c-Mäusen hergestellt, welche mit Hybridomen injiziert wurden, welche die anti-CCR5 mAbs PA8, PA9, PA10, PA11, PA12 und PA14 produzierten. Die mAbs wurden mittels Präzipitation mit Ammoniumsulfat gefolgt von einer Protein A-Chromatographie individuell bis zu einer Homogenität von > 95% aufgereinigt. Alle mAbs wurden in phosphatgepufferter Salzlösung (PBS) bei einer Endkonzentration von 5 mg/ml resuspendiert.
3) Fluoreszenzaktivierte Zellsortierungs (FACS)-Analyse und Epitopkartierung von anti-CCR5 mAbs
Es wurde Durchflusszytometrie angewandt, um die Zelloberflächen-Reaktivität der mAbs PA8–PA12 und PA14 mit CCR5 zu detektieren. Mit Natriumbutyrat behandelte L1.2-CCR5⁺-Zellen (10⁶) wurden mit 0,25 μg Antikörper für 20 min bei 4°C in 0,1% Natriumazid (NaN₃) in 50 μl Dulbecco-PBS (DPBS) inkubiert. Der CCR5 mAb 2D7 wurde als eine Positivkontrolle verwendet, ein nicht-spezifisches murines IgG1 wurde als eine Negativkontrolle verwendet. Die Zellen wurden herunterzentrifugiert, gewaschen und mit Phycoerythrin (PE)-markiertem Ziege-anti-Maus IgG (Caltag, Burlingame, CA) 1:100 verdünnt, inkubiert unter den gleichen Bedingungen wie bei der ersten Antikörperinkubation. Schließlich wurden die Zellen mittels Durchflusszytometrie analysiert. PBMC wurden wie bereits beschrieben (60) isoliert und stimuliert und unter Verwendung ähnlicher Verfahren gefärbt.
Es wurde ein ähnliches Verfahren zur Epitopkartierung der anti-CCR5 mAbs angewandt. Ein Panel mit siebzig CCR5-Punktmutanten wurde bereits beschrieben (20, 24, 52). Die kodierenden Sequenzen dieser Proteine werden in den pcDNA3.1-Vektor (Stratagene) subkloniert, von dem aus die Transkription mittels eines 5'-T7-Polymerasepromotors gesteuert werden kann. Die CCR5-Mutanten tragen zur Detektion von Protein in Zelllysaten oder über Durchflusszytometrie einen 9 Reste umfassenden Hemagglutinin (HA)-Tag am C-Terminus. HeLa-Zellen (2 × 10⁶) wurden für 5 h mit 20 μg/ml Lipofectin und eine gleichen Menge an Wildtyp- oder mutantem CCR5-exprimierendem Plasmid in OPTI-MEM (Life Technologies, Gaithersburg, MD) inkubiert. Die Zellen wurden dann für 12 h mit 2 × 107 p.f.u. an vTF7 (23) infiziert, um die CCR5-Expression zu erhöhen, mit 2 mM Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA) in PBS abgelöst und einmal mit Bindungspuffer (1% BSA, 0,05% NaN₃ in DPBS) gewaschen. Zellen (1 × 10⁶) wurden, wie im vorherigen Absatz beschrieben, mit mAbs oberflächenmarkiert, einmal mit dem Inkubationspuffer gewaschen und für 30 min bei Raumtemperatur in 1 ml 1 × FACS-Lyse in Wasser (Becton Dickinson) resuspendiert, um die Zellmembranen zu permeabilisieren. Die Zellen wurden dann herunterzentrifugiert, mit dem Inkubationspuffer gewaschen und für 1 h bei 37°C mit 4 μg/ml eines mit Fluoresceinisothiocyanat (FITC) markierten Maus-anti-HA mAb (BabCo, Richmond, CA) zur intrazellulären Markierung inkubiert. Schließlich wurden die Zellen einmal mit Bindungspuffer und einmal mit DPBS gewaschen, in 1% Formaldehyd in PBS resuspendiert und mittels Durchflusszytometrie analysiert. Das Ausmaß der Bindung von mAb an mutantes CCR5 wurde mittels der Gleichung bestimmt: (mutantes CCR5 PE m.f.i./wt CCR5 PE m.f.i.)/(mutantes CCR5 FITC m.f.i./wt CCR5 FITC m.f.i.) × 100%. Das normiert die Bindung von mAb für mutante Co-Rezeptor-Expressionsniveaus.
4) gp120/sCD4-Bindungsassay
Es wurde gp120 unter Verwendung von NHS-Biotin (Pierce, Rockford, IL) gemäß den Angaben des Herstellers biotinyliert und ungekoppeltes Biotin wurde mittels Diafiltration entfernt. Mit Natriumbutyrat behandelte L1.2-CCR5⁺-Zellen wurden mit unterschiedlichen Verdünnungen eines äquimolaren Gemischs aus sCD4 und biotinyliertem gp120, oder 1,25 μg/ml sCD4 und 2,5 μg/ml biotinyliertem gp120 in der Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen der anti-CCR5 mAbs PA8–PA12, PA14, 2D7 oder eines nicht-spezifischen murinen IgG1 für 1 h bei Raumtemperatur in 0,1% NaN₃ in DPBS inkubiert. Die Zellen wurden mit dem Inkubationspuffer gewaschen und mit 1:50 verdünntem Streptavidin-PE (Becton Dickinson) für 1 h bei Raumtemperatur inkubiert. Schließlich wurden die Zellen mit Bindungspuffer gewaschen und unter Verwendung eines Fluoreszenzplattenlesers (Perspective Biosystems, Framingham, MA) analysiert.
5) Inhibierung von Hüll-vermittelter Zell-Zell-Fusion und HIV-1-Eintritt durch anti-CCR5 mAbs
Die durch die Hülle von HIV-1 vermittelte Fusion zwischen HeLa-Env_JR-FL ⁺- und PM1-Zellen wurde unter Verwendung des RET-Assays detektiert. Es wurden identische Anzahlen (2 × 10⁴) von mit Fluoresceinoktadecylester (F18) markierten Hüll-exprimierenden Zellen und mit Oktadecylrhodamin (R18) markierten PM1-Zellen in 96-Wells-Platten in 15% fötalem Kälberserum in DPBS plattiert und in der Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen der anti-CCR5 mAbs PA8–PA12, PA14, 2D7 oder einem nicht-spezifischen murinen IgG1 für 4 h bei 37°C inkubiert. Fluoreszenz-RET wurde mittels eines Cytofluor-Plattenlesegeräts (PerSeptive Biosystems) gemessen und die % RET wurden wie zuvor beschrieben (38) bestimmt.
Es wurden wie zuvor beschrieben (20) in trans durch Hüll-glykoproteine aus JR-FL oder Gun-1 komplementierte NLluc⁺env^–-Viren hergestellt. U87MG-CD4⁺CCR5⁺-Zellen (14) wurden mit chimären Reporterviren enthaltend 50–100 ng/ml p24 in der Anwesenheit von verschiedenen Konzentrationen der einzelnen mAbs infiziert. Nach 2 h bei 37°C wurden die Viren-enthaltenden Medien durch frische mAb-enthaltende Medien ersetzt. Frische Medien ohne Antikörper wurden nach 12 h erneut zugegeben. Nach einer Gesamtzeit von 72 h wurden 100 μl Lysispuffer (Promega) zu den Zellen zugegeben und wie beschrieben (20) die Luziferaseaktivität (r.l.u.) gemessen. Die % der Inhibierung der HIV-1-Infektion wird definiert als: [ 1 – (r.l.u. in der Anwesenheit von Antikörper/r.l.u. in der Abwesenheit von Antikörper)] × 100%.
6) Kalzium-Signaling-Assays
Es wurde das Fluorochrom Indo-1AM (Molecular Probes, Eugene, OR) in einer Endkonzentration von 5 μM zu mit Natriumbutyrat behandelten L1.2-CCR5⁺-Zellen gegeben. Nach der Inkubation für 30 min bei 37°C wurden die Zellen einmal gewaschen und in Hank's gepufferter Salzlösung resuspendiert. Zellen (10⁶) wurden sequentiell mit einem anti-CCR5 mAb oder PBS stimuliert, 60 s später gefolgt von RANTES. Die MAbs PA8–PA12 sowie PA14 wurden in einer Konzentration von 100 μg/ml verwendet, 2D7 bei 20 μg/ml und RANTES bei 250 ng/ml. Es wurde ebenfalls die Inhibierung des Kalziumflusses durch PA14 und 2D7 für einen breiten Bereich an mAb-Konzentrationen, reichend von 0–100 μg/ml, getestet. Die intrazellulären Kalziumspiegel wurden unter Verwendung eines Perkin-Elmer LS-50S Fluoreszenzspektrophotometers überwacht, indem das Verhältnis der Fluoreszenzemissionen bei 402 nm (gebundener Farbstoff) und 486 nm (freier Farbstoff) im Anschluss an die Anregung bei 358 nm gemessen wurde.
B. Erlebnisse und Diskussion
1) Isolation der monoklonalen anti-CCR5 Antikörper PA8, PA9, PA10, PA11, PA12 und PA14
Es wurde gefunden, dass Peptide, die den extrazellulären Domänen von CCR5 entsprechen, im Hervorrufen spezifischer Hochtiter-Antikörperantworten gegen den nativen Zelloberflächen-Rezeptor (50) nicht wirksam sind. Es wurden daher Balb/c-Mäuse mit L1.2-CCR5⁺-Zellen immunisiert und es wurden Hybridom-Kulturüberstände in dem RET-Assay auf ihre Fähigkeit getestet, die JR-FL-Hüll-vermittelte Membranfusion mit CD4⁺CCR5⁺-PM1-Zellen zu inhibieren (19, 38). Obwohl gut über hundert Überstände die Zell-Zell-Fusion um > 50% inhibierten, färbten nur sechs – bezeichnet PA8, PA9, PA10, PA11, PA12 und PA14 – spezifisch und intensiv die L1.2-CCR5⁺-Zellen, nicht jedoch die parentalen L1.2-Zellen, wie mittels Durchflusszytometrie gezeigt (Daten nicht gezeigt). Basierend auf früherer Erfahrung wurde davon ausgegangen, dass die anderen mAbs, welche zur Inhibierung der Zell-Zell-Fusion in der Lage sind, wahrscheinlich gegen Zelloberflächenadhäsionsmoleküle wie beispielsweise LFA-1 gerichtet waren (37). Von den Hybridomen PA8–PA12 sowie PA14 wurde mittels eines Isotypisierungs-ELISA (Cappell, Durham, NC) festgestellt, dass sie IgG1-mAbs sekretieren. Es wurden Ascites-Fluida aus Balb/c-Mäusen hergestellt, welche mit den sechs Hybridomen injiziert worden waren, und die IgG1-Fraktionen wurden aufgereinigt. PA8, PA9, PA11, PA12 sowie PA14 zeigten deutliche isoelektrische Fokussierungsprofile, wohingegen PA10 ein Profil aufwies, das dem von PA9 sehr ähnlich war, und es sich daher um ein zweites Isolat desselben mAbs handeln könnte (Daten nicht gezeigt).
2) MAb-Bindung an CCR5⁺-Zellen
Keiner der aufgereinigten anti-CCR5-mAbs färbte die parentale L1.2-Zelllinie (Daten nicht gezeigt). Es färbten jedoch die mAbs PA9–PA12 sowie PA14 > 90% und PA8 färbte ~70% der L1.2-CCR5⁺-Zellen, wie über Durchflusszytometrie bestimmt wurde, was zeigt, dass sie CCR5 erkannten (1). Der anti-CCR5 mAb 2D7, der in unseren Experimenten eine Positivkontrolle war, färbte ebenfalls > 90% der L1.2-CCR5⁺-Zellen. PA8–PA12 sowie PA14 sind alle IgG1 und reagieren gleichermaßen gut mit einem Ziege-anti-Maus IgG, wohingegen 2D7 ein IgG2a ist, der unterschiedlich mit dem Reporterantikörper reagieren kann. Nur durchschnittliche Fluoreszenzintensitäten (m.f.i.), die mit den mAbs PA8–PA12 sowie PA14 gemessen wurden, sind daher direkt miteinander vergleichbar. Die Rangfolge der durchschnittlichen Fluoreszenzintensitäten (m.f.i.) war PA12 ~ PA11 > (2D7 =) PA14 ~ PA10 ~ PA9 > PA8. Die Differenz zwischen der m.f.i. von PA12 und der m.f.i. von PA8 betrug das Dreifache. Die Differenzen der Färbungsintensität zwischen PA8 und den anderen mAbs blieb über einen breiten Bereich an Konzentrationen konstant (Daten nicht gezeigt) und entsprechen möglicherweise nicht den Differenzen der Affinität der mAbs für CCR5. Dies deutet darauf hin, dass PA8 nur mit einem Unterset von CCR5-Molekülen, welche auf der Oberfläche von L1.2-CCR5⁺-Zellen anwesend sind, wechselwirkt.
Im Vergleich zu L1.2-CCR5⁺-Zellen wiesen mitogenstimulierte PBMC unterschiedliche Muster der Färbung durch die anti-CCR5 mAbs auf. 2D7 und PA14 färbten > 20%, PA11 und PA12 färbten ~10%, PA8, PA9 und PA10 färbten < 5% der PBMC (1). Die durchschnittlichen Fluoreszenzintensitäten der gefärbten PBMC waren in etwa um das Zehnfache niedriger als die mit L1.2-CCR5⁺-Zellen für jeden mAb erhaltenen; Ihre Rangfolge war (2D7 >) PA14 > PA12 ~ PA11 ~ PA10 ~ PA9 ~ PA8. Dies wich wiederum etwas von der Folge der bei CCR5-Transfektanten beobachteten Reaktivitäten ab. Die Differenz zwischen der m.f.i. von PA9 und der m.f.i. von PA14 betrug das Siebenfache. Andere Gruppen beobachteten ähnliche Differenzen hinsichtlich der Fähigkeit der anti-CCR5 mAbs, stabile CCR5⁺-Zelllinien versus PBMC zu färben (28). Dies könnte an den zellspezifischen Unterschieden in der Konformation, posttranslationalen Modifikation oder Oligomerisation von CCR5 liegen. Alternativ dazu kann die Assoziation mit anderen Zelloberflächenmolekülen sich zwischen den Zellen unterscheiden. Da das CD4-Zelloberflächenantigen, welches in L1.2-CCR5⁺-Zellen nicht vorkommt und in PBMCs anwesend ist, eine naheliegende Wahl für ein solches Molekül wäre, testeten wir ebenfalls die Fähigkeit von PA8–PA12, PA14 sowie 2D7, HeLa-Zellen zu färben, welche transient entweder CCR5 alleine oder zusammen mit CD4 exprimieren. Hinsichtlich der Fähigkeit einer der mAbs, Zelloberflächen-CCR5 in der Anwesenheit von CD4 zu färben, wurden keine Unterschiede beobachtet (Daten nicht gezeigt). Wenn es eine Assoziation zwischen diesen beiden Proteinen gibt, so schließt dieser keine Epitope ein, welche von den uns zur Verfügung stehenden anti-CCR5 mAbs erkannt werden. Alternativ dazu könnte eine Assoziation zwischen CCR5 und CD4 nur auf primären Lymphozyten vorkommen.
3) Epitopkartierung der mAbs unter Verwendung von CCR5-Alanin-Mutanten
Keiner der Antikörper war in der Lage, mittels Western Blotting reduziertes und denaturiertes CCR5-Protein zu detektieren, was darauf hindeutet, dass die Antikörper konformationell sensitive Epitope erkennen (Daten nicht gezeigt). Unter Verwendung eines Panels von siebzig Alanin-Punktmutanten von Resten in der Nt und ECLs von CCR5 wurden mAb-Epitopkartierungs-Studien durchgeführt. HeLa-Zellen wurden mit mutanten- oder Wildtyp-CCR5-kodierenden Sequenzen lipofiziert, welche mit C-terminalen HA-Tags versehen waren, und mit vTF7 (23) infiziert, um die Co-Rezeptor-Expression zu fördern. Die Zellen wurden dann mit den anti-CCR5 mAbs inkubiert und ihre Bindung wurde mittels eines mit PE-markierten Ziege-anti-Maus-IgG deutlich gemacht. Eine zweite, intrazelluläre Färbung wurde mit einem mit FITC-markierten anti-HA-mAb (BabCo) durchgeführt. Diese interne Kontrolle gestattete es uns, die Färbung durch die anti-CCR5 mAbs direkt für mutante Co-Rezeptor-Expressionslevel auf der Zelloberfläche zu normieren. Daher wird die mAb-Bindung an jede Mutation als ein Prozentwert der Bindung an Wildtyp-CCR5 ausgedrückt (4). Gewisse Punktmutationen reduzierten die Bindung von allen Antikörpern an CCR5 um > 50%. Im Allgemeinen waren PA8–PA12 am stärksten und PA14 sowie 2D7 am wenigsten von dieser Klasse von Mutanten betroffen, welche das Cysteinpaar C101A und C178A, die Nt-Mutanten Y10A, D11A, K25A, die ECL1-Mutante D95A, die ECL2-Mutanten K171A/E172A, Q188A, K191A/N192A sowie die ECL3-Mutanten F263A und F264A einschlossen (4). Es ist eine Interpretation, dass diese Reste per se nicht Teil der mAb-Epitope sind, dass jedoch ihr Austausch gegen Alanin konformationelle Störungen verursacht, die eine gemeinsame Auswirkung auf die Bindung aller mAbs haben. Wir gingen davon aus, dass, wenn eine Mutation die Bindung eines einzelnen mAb um > 75% und nicht ebenfalls die Bindung der meisten anderen mAbs verringerte, der Rest möglicherweise ein direkter Beitragender war an dem durch den mAb erkannten Epitop. Unter Anwendung dieser stringenten Richtlinien wurde die Schlussfolgerung gezogen, dass die sieben anti-CCR5 mAbs überlappende aber verschiedene Epitope erkennen (4). Die Bindung von mAb PA8 an CCR5 war abhängig von N13 und Y15 in der Nt. Die mAbs PA9 und PA10 benötigten D2, Y3, Q4, P8 und N13 in der Nt sowie Y176 und T177 in ECL2. Der mAb PA9 benötigte ebenfalls S7 in der Nt. Die Bindung von mAb PA11 und PA12 war abhängig von Q4 in der Nt. PA14 benötigte D2 in der Nt sowie R168 und Y176 in ECL2. Schließlich benötigte mAb 2D7 Q170 und K171/E172 in ECL2, um an CCR5 zu binden.
4) Chemokin-Signalling in der Anwesenheit von anti-CCR5 mAbs
Chemokinrezeptor-bindende Agenzien können Antagonisten oder, in selteneren Fällen, Agonisten des rezeptorvermittelten intrazellulären Signalling sein. Alternativ können sie auch keine Auswirkung auf das Signalling haben. CCR5 ist in der Lage, drei CC-Chemokine, RANTES, MIP-1α (orig.: MIP-1•) und MIP-1β (orig.: MIP-1•) zu binden und ein Signal zu übermitteln, welches die zytosolischen Kalziumspiegel moduliert. Wir testeten daher die Agonist/Antagonist-Aktivität von verschiedenen Konzentrationen der mAbs PA8–PA12, PA14 sowie 2D7. In mit Indo-1 beladenen L1.2-CCR5⁺-Zellen wurden Veränderungen der intrazellulären Kalziumkonzentrationen, (Ca²⁺)i, gemessen. Keiner der mAbs stimulierte eine Veränderung der (Ca²⁺)i, was darauf hindeutete, dass sie keine Agonisten für CCR5 sind. PA8–PA12 waren ebenfalls nicht in der Lage, durch RANTES induzierte Ca²⁺-Ströme zu inhibieren (5A und nicht gezeigte Daten), sogar bei so hohen Konzentrationen wie 100 μg/ml (orig.: 100•g/ml), was darauf hindeutet, dass sie ebenfalls keine Antagonisten sind. Diese Konzentrationen sorgen für eine sättigende Bindung der mAbs an L1.2-CCR5⁺-Zellen, wie mittels Durchflusszytometrie und des gp120/CCR5-Bindungsassays gezeigt wurde (6D und nicht gezeigte Daten). Die mAbs PA14 und 2D7 dagegen blockierten die durch RANTES induzierte Kalziummobilisierung, wenn auch mit unterschiedlicher Stärke (5A, B). Der IC₅₀ für die Inhibierung des Kalziumeinstroms durch P14 betrug 50 μg/ml (orig.: 50•g/ml), was in etwa achtfach höher als der IC₅₀ für 2D7 war (5B). Durch RANTES, MIP-1α (orig.: MIP-1•) und MIP-1β (orig.: MIP-1•) induzierte Kalziumströme wurden jeweils durch ähnliche Konzentrationen von PA14 inhibiert (Daten nicht gezeigt). Keiner der mAbs beeinflusste die SDF-1-induziere Kalziummobilisierung in L1.2-CCR5⁺-Zellen, welche CXCR4 endogen exprimieren (Daten nicht gezeigt). Schließlich beeinflussten weder mAbs noch CC-Chemokine die zytosolischen Kalziumspiegel in parentalen L1.2-Zellen (Daten nicht gezeigt).
5) Inhibierung der CCR5-Co-Rezeptor-Funktion durch die mAbs
Die mAbs PA8–PA12 und PA14 wurden zu Anfang ausgewählt auf der Basis ihrer Fähigkeit, die HIV-1-Hüll-vermittelte Zell-Zell-Fusion zu inhibieren. Diese Aktivität wurde für die aufgereinigten mAbs bestätigt und quantifiziert. Wie erwartet blockierten alle sechs mAbs, ebenso wie mAb 2D7, die Fusion zwischen CD4⁺CCR5⁺-PM1-Zellen und HeLa-Env_JR-FL ⁺-Zellen im RET-Assay. Die Rangfolge der Wirksamkeit war 2D7 PA14 > PA12 > PA11 > PA10 ~ PA9 ~ PA8 (6A). Die IC₅₀-Werte für PA14 und 2D7 betrugen 1,7 μg/ml (orig.: 1.7•g/ml) beziehungsweise 1,6 μg/ml (orig.: 1.6•g/ml), für PA11 und PA12 betrugen sie 25,5 μg/ml (orig.: 25.5•g/ml) beziehungsweise 10,0 μg/ml (orig.: 10.0•g/ml) (3). PA8, PA9 und PA10 inhibierten die Fusion lediglich um 10–15% bei 300 μg/ml (orig.: 300•g/ml). Keiner der mAbs beeinflusste die Fusion zwischen PM1-Zellen und HeLa-Env_LAI ⁺-Zellen, welche das Volllängen-Hüll-Protein aus einem X4-Virus exprimieren (Daten nicht gezeigt).
Die Fähigkeit der unterschiedlichen anti-CCR5 mAbs, den Eintritt eines prototypischen R5-Virus, von JR-FL und eines R5X4-Virus, Gun-1, in einem einzigen Replikationsdurchgang eines auf Luziferase basierenden Eintrittsassays zu inhibieren, wurde ebenfalls getestet. Die Rangfolge der Wirksamkeit in diesem Eintrittsassay war ähnlich derjenigen, die in dem Zell-Zell-Fusionsassay bestimmt wurde (6B). Mit PA8–PA11 konnte keine Inhibierung des Eintritts von JR-FL oder Gun-1 > 50% erhalten werden. Der IC₅₀-Wert für PA12 betrug 2,5 μg/ml (orig.: 2.5•g/ml). Es konnte jedoch mit diesem mAb keine Inhibierung des Eintritts > 60% erhalten werden. Die IC₅₀-Werte für die Inhibierung des Eintritts von JR-FL durch PA14 und 2D7 wurden als 0,024 beziehungsweise 0,026 μg/ml (orig.: 0.026•g/ml) bestimmt (3) und waren 60-fach niedriger als die im Fusionsassay Erhaltenen. Der Eintritt von dual-tropem Gun-1 war 2–3-fach sensitiver für die Inhibierung durch anti-CCR5 mAbs als der Eintritt von JR-FL (Daten nicht gezeigt).
Anti-Co-Rezeptor mAbs könnten die Hüll-vermittelte Fusion entweder dadurch inhibieren, dass sie die gp120/CCR5-Wechselwirkung direkt beeinträchtigen, oder durch Behindern der an der Bildung eines aktiven Fusionskomplexes beteiligten Schritte im Anschluss an die Bindung. Um den Mechanismus der Inhibierung der viralen Fusion und des Eintritts durch PA8–PA12 und PA14 zu bestimmen, wurde die Fähigkeit der verschiedenen mAbs getestet, die gp120/CCR5-Wechselwirkung zu blockieren. Für diesen Assay, der die Bindung von biotinyliertem HIV-1_JR-FL an L1.2-CCR5⁺-Zellen detektiert, wurde mit sCD4 komplexiertes gp120 verwendet. In der Abwesenheit von sCD4 oder CCR5 oder bei der Verwendung von HIV-1_LAI-gp120 wurde keine Bindung von biotinyliertem gp120 beobachtet (6C).
Mit Ausnahme von PA8 setzten alle mAbs die gp120/sCD4-Bindung an L1.2-CCR5⁺ außer Kraft (6D). Die Inhibierung durch PA8 erreichte bei 40% ihre Sättigung, was in der Hinsicht mit den Daten der Durchflusszytometrie (1) übereinstimmt, dass es darauf hindeutet, dass dieser mAb nur an ein Unterset von CCR5-Molekülen auf L1.2-CCR5⁺-Zellen bindet. Die mAbs PA9, PA10, PA11 und PA12 inhibierten eine Bindung mit IC₅₀-Werten von 0,24, 0,13, 0,33, beziehungsweise 0,24 μg/ml (3). Überraschenderweise waren die mAbs PA14 und 2D7 die beiden am wenigsten wirksamen Inhibitoren der gp120/sCD4-Bindung, mit IC₅₀-Werten von 1,58 beziehungsweise 1,38 μg/ml (orig.: 1.38•g/ml) (3). Es lag daher keine Korrelation vor zwischen der Fähigkeit eines mAb, die gp120/CD4/CCR5-vermittelte Membranfusion und den Eintritt zu inhibieren, und seine Fähigkeit, gp120/sCD4-Bindung an den Co-Rezeptor zu blockieren.
6) Synergistische Inhibierung der HIV-1-Fusion mittels Kombinationen von anti-CCR5 mAbs und anderen Inhibitoren des viralen Eintritts
Co-Rezeptor-spezifische Agenzien können in multiplen Stadien des Eintrittsprozesses agieren und nicht-additive Wirkungen zeigen, wenn sie in Kombination verwendet werden. Vom klinischen Standpunkt aus gesehen ist es wichtig, die Wechselwirkungen der in Frage kommenden Co-Rezeptor-spezifischen Wirkstoffe mit endogenen Chemokinen zu bestimmen, die ein gewisses Maß an Schutz gegen ein Fortschreiten der Krankheit bieten können. Es wurden daher CCR5 mAbs getestet in Kombination miteinander oder in Kombination mit RANTES oder mit CD4-IgG2, welches an HIV-1-gp120 bindet, um die Anhaftung an Targetzellen zu inhibieren. In Assays zur viralen Fusion und zum Eintritt wurden für die einzeln und in Kombination verwendeten Agenzien Dosis-Antwort-Kurven erhalten. Die Daten wurden unter Anwendung des Median-Effekt-Prinzips analysiert (9). Die Konzentrationen der einzelnen Agenzien oder deren Mischungen, welche zur Erzeugung einer gegebenen Wirkung erforderlich sind, wurden in einem unter der Bezeichnung Kombinationsindex (CI) bekannten Term quantitativ miteinander verglichen. Ein CI-Wert größer als 1 zeigt Antagonismus an, CI ~ 1 zeigt eine additive Wirkung an und CI < 1 zeigt eine synergistische Wirkung an, wobei die Anwesenheit eines Agens die Wirkung eines anderen verstärkt.
Kombinationen von PA12 und 2D7 waren die am stärksten synergistischen mit CI-Werten in einem Bereich zwischen 0,02 und 0,29, in Abhängigkeit von dem Verhältnis der Antikörper (7 und 2). Es ist bekannt, dass der Grad an Synergie mit der Stöchiometrie der Agenzien variiert. Im Allgemeinen waren die Ergebnisse aus den Assays zum viralen Eintritt und zur Fusion übereinstimmend hinsichtlich der Identifikation von in höchstem Maße synergistischen mAb-Kombinationen, PA12 und 2D7; moderat synergistischen, PA12 und PA14; additiven PA11 und PA12; sowie schwach antagonistischen, PA14 und 2D7. Die fehlende Synergie zwischen PA14 und 2D7 ist nicht überraschend aufgrund der Tatsache, dass diese mAbs um die Bindung an CCR5⁺-Zellen kreuzkompetieren, wie mittels Durchflusszytometrie bestimmt wurde (Daten nicht gezeigt). Die Beobachtung einer additiven Wirkung von PA11 und PA12 kann ein Hinweis darauf sein, dass diese mAbs an leicht unterschiedliche Epitope in CCR5 binden, während sie beide eine Abhängigkeit von dem Rest Q4 in der Nt aufweisen.
Die Fähigkeit der mAbs PA12, PA14 und 2D7, mit RANTES beim Blockieren der Zell-Zell-Fusion synergistisch zu wirken, wurde ebenfalls getestet. Kombinationen von PA12 und RANTES zeigten eine moderate Synergie (2). PA14 und 2D7 zeigten keine Synergie mit RANTES, was mit der Tatsache in Übereinstimmung ist, dass diese mAbs inhibitorisch für RANTES-Bindung und -Signalling sind (5A, B). Schließlich testeten wir die Synergie zwischen den mAbs PA12, PA14, 2D7 und CD4-IgG2, das mit gp120 wechselwirkt. Wir beobachteten eine moderate Synergie zwischen PA12 und CD4-IgG2, jedoch keine Synergie zwischen PA14 oder 2D7 und CD4-IgG2 (2).
Experimentelle Diskussion
Sechs murine anti-CCR5-IgG1 mAbs wurden isoliert und charakterisiert. Während PA8, PA9, PA11, PA12 und PA14 verschiedene molekulare Spezies darstellen, sind PA9 und PA10 nicht durch die Analysen zu unterscheiden und daher möglicherweise der gleiche mAb. Alle mAbs, die isoliert wurden, erkennen komplexe konformationelle Epitope, wie es bei mAbs, die gegen native Zelloberflächenproteine gezüchtet wurden, oft der Fall ist. Unter Verwendung eines Panels von CCR5-Alanin-Punktmutanten wurde für alle mAbs eine Epitopkartierung durchgeführt. Es wurde davon ausgegangen, dass Reste, welche die Bindung aller mAbs in ähnlicher Weise beeinträchtigten, konformationelle Störungen im Co-Rezeptor hervorrufen und keinen Teil der mAb-Epitope darstellen. Nur von zwei dieser Reste, Y10 und D11, wurde gezeigt, dass sie den Eintritt von HIV-1 beeinträchtigen (20, 52). Die PA8-, PA11- und PA12- Epitope sind ausschließlich in der Nt-Domäne gelegen. In Übereinstimmung mit diesem Ergebnis war PA8 in der Lage, in einem ELISA ein biotinyliertes Nt-Peptid zu binden, das die Reste D2 bis R31 enthält (Daten nicht gezeigt). PA11 und PA12 dagegen, deren Bindung stark von ausschließlich Q4 abhängig war, banden das Nt-Peptid in Lösung nicht (Daten nicht gezeigt). Eine Möglichkeit ist, dass das Nt-Peptid nicht die zur Erkennung durch PA11 und PA12 geeignete Konformation annimmt, wohingegen die Bindung von PA8 weniger abhängig von der Konformation sein kann. Alternativ können PA11 und PA12 mit Resten Wechselwirken, die von uns nicht mutiert wurden, oder schwache Bindungen mit in anderen Domänen von CCR5 gelegenen Aminosäuren bilden, oder Atome des Peptidrückgrats binden, deren Präsentation möglicherweise nicht von der Mutagenese verändert ist. Die Antikörper PA9, PA10 und PA14 erkannten Epitope, die Reste sowohl in den Nt- als auch in ECL2-Domänen von CCR5 einschlossen, wohingegen das 2D7-Epitop ausschließlich in ECL2 gelegen war.
Das PA14-Epitop umfasst sowohl D2 in der Nt als auch R168 in ECL2, was darauf hindeutet, dass diese beiden Reste innerhalb des Rahmens eines mAb-Footprints proximal zueinander gelegen sind. Sie können sogar durch ihre gegensätzlichen Ladungen direkt miteinander Wechselwirken.
Die mAbs PA8–PA12 sowie PA14 färbten CCR5⁺-Zellen in unterschiedlichen Intensitäten und in einer Zelltyp-abhängigen Art und Weise. Alle mAbs außer PA8 färbten > 90% L1.2-CCR5⁺-Zellen, wobei die höchste durchschnittliche Fluoreszenzintensität mit PA11 und PA12 zu beobachten war. PA14 und 2D7 färbten jedoch den höchsten prozentualen Anteil von PBMC und führten auch zu den höchsten durchschnittlichen Fluoreszenzintensitäten auf diesen Zellen. Hill et al. (28) charakterisierten vor kurzem ein Panel von anti-CCR5 mAbs, welche transfizierte Zellen in ähnlicher Weise färbten; jedoch nur zwei von acht färben PBMC und keiner färbte primäre Monozyten. Eine niedrige Affinität für CCR5 war wahrscheinlich verantwortlich für die Unreaktivität von zwei der mAbs mit primären Zellen, doch es war unwahrscheinlich, dass dies die Erklärung dafür war, dass die anderen vier nicht reagierten. In unserem mAb-Panel beobachten wir die intensivste Färbung von PBMC durch die mAbs 2D7 und PA14, welche Epitope aufweisen, die ganz oder teilweise innerhalb der ersten zehn Reste von ECL2 liegen. Hill et al. berichten jedoch, dass für Nt und ECL1 spezifische mAbs PBMCs färben, während mAbs gegen ECL2 und ECL3 PBMC nicht färben; demnach wurde bisher kein übereinstimmendes Muster der Reaktivität identifiziert. Es wäre eine Erklärung für eine zelltypspezifische Färbung durch mAbs, dass aktivierte PBMCs (und Monozyten) CC-Chemokine sekretieren, welche an Zelloberflächen-CCR5 binden und so einige mAb-Epitope maskieren. Man würde jedoch erwarten, dass dies speziell auf PA14 und 2D7 zutrifft, die Antagonisten der Chemokin-induzierten Kalziummobilisierung sind und vermutlich mit CC-Chemokinen um eine Bindung an CCR5 konkurrieren. Und doch färben diese mAbs PBMC am intensivsten. Alternativ kann die differentielle CCR5-Epitop-Exponierung die zelltypspezifische Rezeptor-Oligomerisation, die Assoziation mit anderen Zelloberflächenmolekülen oder verschiedene posttranslationale Modifikationen wie beispielsweise Glykosylierung widerspiegeln. Wir haben gezeigt, dass Unterschiede in der mAb-Bindung aller Wahrscheinlichkeit nach nicht die zelltypspezifischen Unterschiede bezüglich der CD4/CCR5-Interaktionen widerspiegeln.
Die mAbs PA8–PA12 inhibierten weder die CC-Chemokin-induzierte Kalziummobilisierung in CCR5⁺-Zellen, noch vermittelten sie ein Signalling durch CCR5. Die mAbs 2D7 und PA14 waren Inhibitoren der CC-Chemokin-induzierten Kalziummobilisierung, doch 2D7 war beinahe um eine Zehnerpotenz wirksamer als PA14. Dies kann daran liegen, dass das PA14-Epitop weniger mit der CC-Chemokin-Bindedomäne auf CCR5 überlappt als das 2D7-Epitop. Alle der mAbs blockierten ebenfalls den HIV-1-Eintritt sowie die Hüll-vermittelte Membranfusion, jedoch erforderte die Inhibierung der Zell-Zell-Fusion in manchen Fällen beinahe zwei Zehnerpotenzen mehr Antikörper als benötigt wurden, um den viralen Eintritt zu blockieren. Vermutlich werden mehr gp120/CD4/CCR5-Wechselwirkungen ebenso wie Wechselwirkungen zwischen Adhäsionsmolekülen etabliert und wirken während der Zell-Zell-Fusion kooperativ, im Vergleich zur Virus-Zell-Fusion, was die Inhibierung erschwert. Dies wird bei Antikörpern gegen LFA-1 oder gegen das HIV-1-Hüllenglykoprotein (45, 51) im Allgemeinen beobachtet. PA8, PA9 und PA10 waren nicht in der Lage, die Zell-Zell-Fusion um > 15% und den viralen Eintritt um > 40% zu blockieren, nicht einmal bei den höchsten Anitkörper-Konzentrationen. Es konnte jedoch mit PA11, PA12 und PA14 eine Inhibierung der Fusion um > 90% erreicht werden; und mit PA14 konnte eine Inhibition des Eintritts um > 90% erreicht werden. Der am meisten wirksame der sechs mAbs bei der Blockierung der Fusion und des Eintritts war PA14, der ebenso wirksam war wie 2D7. Überraschenderweise gehörten PA14 und 2D7 zu den am wenigsten wirksamen Inhibitoren der gp120/sCD4-Bindung an L1.2-CCR5⁺-Zellen, wobei PA9–PA12 mit ähnlichen Wirksamkeiten blockierten und PA8 nicht in der Lage war, > 40% der gp120/sCD4-Bindung zu blockieren. Diese Beobachtungen werfen Fragen bezüglich der Natur der auf verschiedenen Zellen präsentierten CCR5-Moleküle und bezüglich des Mechanismus der Inhibierung der viralen Fusion und des Eintritts auf. Es kann sein, dass CCR5 auf in den mAb- und gp120-Bindeassays verwendeten L1.2-Zellen keine identische Konformation zu CCR5 auf im mAb-Bindeassay verwendeten PBMC oder zu CCR5 auf in den Fusions- und Eintrittsassays verwendeten PM1- und U87MG-Zellen darstellt.
Die geringe Färbung von PBMC und die partielle Inhibierung von Fusion und Eintritt durch einige unserer mAbs deutet darauf hin, dass diese lediglich in der Lage sind, an ein Unterset von CCR5-Molekülen zu binden, welche auf primären Lymphozyten, PM1 und U87MG-CD4⁺CCR5⁺-Zelllinien exprimiert werden. Und doch sind mit Ausnahme von PA8 alle mAbs dazu in der Lage, > 90% L1.2-CCR5⁺-Zellen zu färben und die Bindung des gp120/sCD4-Komplexes an diese Zellen vollständig zu blockieren. Wenigstens ein Unterschied zwischen L1.2-CCR5⁺ und den anderen von uns verwendeten Zellen besteht in der Dichte von Co-Rezeptor-Protein auf der Zelloberfläche. Tatsächlich schätzen wir, dass die L1.2-CCR5⁺-Zellen 10- bis 100-fach mehr Zelloberflächen-Co-Rezeptor exprimieren als PM1 und U87MG-CD4⁺CCR5⁺-Zellen. Werden jedoch HeLa-Zellen dahingehend genetisch verändert, dass sie transient genauso viel Co-Rezeptor transient exprimieren wie die L1.2-CCR5⁺-Zelllinie, können wir noch immer keine gp120/sCD4-Bindung an diese detektieren (Daten nicht gezeigt). Eine Überexpression von CCR5 auf L1.2, neben anderen zellspezifischen Faktoren dafür, könnte eine Co-Rezeptor-Konformation begünstigen, welche die Nt prominent exponiert, wodurch sie sowohl für mAbs als auch für gp120 besser zugänglich wird. Eine solche Konformation könnte durch Rezeptor-Oligomerisation, durch verminderte oder veränderte Assoziationen mit Zelloberflächenproteinen oder durch Rezeptorwechselwirkungen mit G-Proteinen induziert werden (25, 62). Besteht eine Koexistenz von multiplen Konformationen von CCR5 auf der Zelloberfläche und lassen diese alle den viralen Eintritt zu? Die Muster der mAb-Reaktivität würden dies nahelegen, da es, wenn auch auf verringerten Niveaus, in der Anwesenheit von mAb-Konzentrationen, welche die für die Bindung von gp120 an L1.2-CCR5⁺-Zellen erforderlichen Epitope sättigen, zum Eintritt und zur Fusion von HIV-1 kommen kann. Wir bevorzugen die Hypothese, dass die auf den L1.2-CCR5⁺-Zellen vorhandenen Co-Rezeptor-Moleküle eine für den HIV-1-Eintritt kompetente Konformation aufweisen, während CCR5-Moleküle auf PBMC, PM1 und CCR5⁺ U87MG in multiplen eintrittskompetenten Stadien vorliegen, welche unterschiedliche mAb-Reaktivitäten aufweisen. Während PA14 und 2D7 alle Konformationen erkennen könnten, können andere mAbs das nicht. Der Grund dafür, dass L1.2-Zellen förderlich für eine bestimmte fusionskompetente Konformation sind, muss erst noch bestimmt werden.
Es wurde vor kurzem gezeigt, dass die gp120-Bindedomäne innerhalb der ersten zwanzig Reste der CCR5-Nt-Domäne liegt. MAbs gegen gp120-Bindedomäne auf CCR5 blockieren diese Interaktion wirksam, sind jedoch nicht annähernd so effizient beim Inhibieren der HIV-1-Fusion und des Eintritts in Targetzellen wie PA14 und 2D7, deren Epitope außerhalb dieser Region liegen. PA14 erkennt die Spitze von der Nt sowie Reste in ECL2, während das 2D7-Epitop ausschließlich in ECL2 gelegen ist. Über den Aktionsmechanismus dieser mAbs kann bisher nur spekuliert werden. Es kann sein, dass ihre Bindung an die ersten paar Reste von ECL2 konformationelle Veränderungen im Co-Rezeptor induziert, welche die Membranfusion "verhindern. Alternativ könnte eine Behinderung von ECL2-Epitopen die Co-Rezeptor-Oligomerisation und die Bildung eines fusionskompetenten Proteinkomplexes behindern. Eine weitere Möglichkeit ist, dass Reste in ECL2 der Innenseite der Fusionspore zugewandt sind und eine Bindung der mAbs gp41 daran hindert, das Fusionspeptid in die Plasmamembran zu insertieren. Im Gegensatz dazu inhibieren die mAbs PA8–PA12 möglicherweise die Fusion und den Eintritt nur dadurch, dass sie direkt um die Bindung mit gp120/CD4-Komplexen konkurrieren. Es ist uns nicht bekannt, ob andere Parameter als Epitopexposition und Affinität für CCR5 die Wirksamkeit der Inhibieren des viralen Eintritts durch diese mAbs bestimmen. Es ist nicht klar, warum im Anschluss an die gp120/Co-Rezeptor-Wechselwirkung stattfindende inhibierende Schritte wirksamer sein sollten als die direkte Blockierung dieser Wechselwirkung. Eine Möglichkeit, diesen Umstand zu erklären, wäre anzunehmen, dass der "Off'-Anteil der Bindung von gp120 an CCR5 wesentlich niedriger ist als der "On"-Anteil der mAb-Bindung an CCR5. Daher wird ein mAb jedes Mal, wenn er sich von einem Co-Rezeptor-Molekül löst, in einer quasi irreversiblen Art und Weise durch ein virionassoziiertes gp120-Molekül ersetzt, da diese Wechselwirkung zur Membranfusion führt.
Eine Synergie zwischen Kombinationen von anti-CCR5 mAbs ist möglicherweise ein Ergebnis aus deren Wechselwirkungen mit verschiedenen Epitopen, die an den voneinander abhängigen konsekutiven Schritten des HIV-1-Eintritts beteiligt sind. Der Grad der Synergie, der zwischen PA12 und 2D7 beobachtet wurde (CI < 0,1 unter vielen Umständen), ist außergewöhnlich, da für Kombinationen aus anti-HIV-1-Antikörpern (33, 35, 61), Reverse Transkriptase-Inhibitoren (29) oder Protease-Inhibitoren (44) CI-Werte < 0,2 nur selten beobachtet werden. Aufgrund ihrer Wirksamkeit wurde die Kombination PA12:2D7 in multiplen Assayformaten und Konzentrationsverhältnissen untersucht, bei denen beständig hohe Synergieniveaus beobachtet wurden. Für PA12 in Kombination mit PA14 wurde eine moderate Synergie beobachtet. Zwischen PA12 und CD4-IgG2 beobachteten wir ebenfalls eine moderate Synergie. Der CD4/gp120-Komplex ist metastabil und zerfällt in einen nicht-fusogenen Zustand, wenn er nicht in der Lage ist, mit einem Co-Rezeptor wechselzuwirken (45–48). Da PA12 die gp120-Bindestelle auf CCR5 direkt blockiert, kann seine Anwesenheit das Gleichgewicht in Richtung der Inaktivierung des gp120/CD4-Komplexes verschieben. Dieser Umstand würde erklären, warum wir hinsichtlich der Inhibierung der Fusion und des Eintritts eine Synergie zwischen CD4-IgG2 und mAb PA12 beobachten. Die fehlende Synergie zwischen mAb PA14 und CD4-IgG2 deutet darauf hin, dass sie auf zwei nicht konsekutive und voneinander unabhängige Schritte des viralen Eintritts wirken. Es wir eine Kombination weiterer Studien nötig sein, um die genauen Mechanismen der Synergie der verschiedenen Verbindungen hinsichtlich der Inhibierung der viralen Fusion und des Eintritts zu bestimmen.
Die zuvor erwähnten Ergebnisse stimmen mit einem Modell überein, in dem der HIV-1-Eintritt in drei unterschiedlichen Schritten erfolgt, die Rezeptorbindung, Co-Rezeptor-Bindung und Co-Rezeptor-vermittelte Membranfusion einschließen. Das Fehlen einer Korrelation zwischen den Fähigkeiten der monoklonalen Antikörper, die gp120-Bindung und die HIV-1-Fusion/Eintritt zu blockieren, deutet auf separate Co-Rezeptor-Binde- und Fusionsereignisse hin. Die zeitliche Abfolge der Ereignisse während der Fusion wird des Weiteren durch die Muster der beobachteten Synergien angezeigt. Agenzien, wie beispielsweise PA12, die den mittleren Schritt des Prozesses, nämlich die gp120-Bindung wirksam inhibieren, wirken synergistisch mit Inhibitoren der vorhergehenden und nachfolgenden Schritte zusammen.
REFERENZEN

1. Allaway, G. P., K. L. Davis-Bruno, B. A. Beaudry, E. B. Garcia, E. L. Wong, A. M. Ryder, K. W. Hasel, M. C. Gauduin, R. A. Koup, J. S. McDougal und P. J. Maddon. 1995. Expression and characterization of CD4-IgG2, a novel heterotetramer that neutralizes primary HIV type 1 isolates. AIDS Res Hum Retroviruses 11: 533–539.
2. Allaway, G. P., A. M. Ryder, G. A. Beaudry und P. J. Maddon. 1993. Synergistic inhibition of HIV-1 envelope mediated cell fusion by CD4-based molecules in combination with antibodies to gp120 or gp41. AIDS Res Hum Retroviruses 9: 581–587.
3. Amara, A., S. L. Gall, O. Schwartz, J. Salamero, M. Montes, P. Loetscher, M. Baggiolini, J. L. Virelizier und F. Arenzana-Seisdedos. 1997. HIV coreceptor downregulation as antiviral principle: SDF-1a-dependent internalization of the chemokine receptor CXCR4 contributes to inhibition of HIV replication. J. Exp. Med. 186: 139–146.
4. Berger, E. A. 1997. HIV entry and tropism: the Chemokine receptor connection. AIDS 11 (suppl A): S3–S16.
5. Bieniasz, P. D. und B. R. Cullen. 1998. Chemokine receptors and human immunodeficiency virus infection. Frontiers in Bioscience 3: d44–58.
6. Bieniasz, P. D., R. A. Fridell, I. Aramori, S. S. G. Ferguson, M. C. Caron und B. R. Cullen. 1997. HIV-1 induced cell fusion is mediated by multiple regions within both the viral envelope and the CCR5 co receptor. EMBO 16: 2599–2609.
7. Brelot, A., N. Heveker, O. Pleskoff, N. Sol und M. Alizon. 1997. Role of the first and third extracellular domains of CXCR4 in human immunodeficiency virus coreceptor activity. J. Virol. 71: 4744–4751.
8. Chan, D. C. und P. S. Kim. 1998. HIV entry and its inhibition. Cell 93: 681–684.
9. Chou, T. C. und D. C. Rideout. Synergism and antagonism in chemotherapy. New York: Academic Press, 1991
10. Cocchi, F., A. L. DeVico, A. Garzino-Demo, S. K. Arya, R. C. Gallo und P. Lusso. 1995. Identification of RANTES, MIP-1a and MIP-1 as the major HIV-suppressive factors produced by CD8 T-cells. Science 270: 1811–1815.
11. Connor, R. I., K. E. Sheridan, D. Ceradini, S. Choe und N. R. Landau. 1997. Change in co-receptor use correlates with disease progression in HIV-1 infected individuals. J. Exp. Med. 185: 621–628.
12. Crump, M. P., J. H. Gong, P. Loetscher, K. Rajarathnam, A. Amara, F. Arenzana-Seisdedos, J. L. Virelizier, M. Baggiolini, B. D. Sykes und I. Clark-Lewis. 1997. Solution structure and basis for functional activity of stromal-cell derived factor-1; disassociation of CXCR4 activation from binding and inhibition of HIV-1. EMBO 16: 6996–7007.
13. Dalgleish, A. G., P. C. L. Beverly, P. R. Clapham, D. H. Crawford, M. F. Greaves und R. A. Weiss. 1984. The CD4 (T4) antigen is an essential component of the receptor for the AIDS retrovirus. Nature 312: 763–766.
14. Deng, H. K., R. Liu, W. Ellmeier, S. Choe, D. Unutmaz, M. Burkhart, P. DiMarizio, S. Marmon, R. E. Sutton, C. M. Hill, S. C. Peiper, T. J. Schall, D. R. Littman und N. R. Landau. 1996. Identification of a major co-receptor for primary isolates of HIV-1. Nature 381: 661–666.
15. Dimitrov, D. S. 1997. How do viruses enter cells? The HIV Co-receptors teach us a lesson of complexity. Cell 91: 721–730.
16. Donzella, G. A., D. Schols, S. W. Lin, K. A. Nagashima, P. J. Maddon, G. P. Allaway, T. P. Sakmar, E. D. Clercq und J. P. Moore. 1998. JM3100, a small molecule that interacts with the CXCR4 co-receptor to prevent HIV-1 entry. Nat. Med. 4: 72–77.
17. Doranz, B. J., K. Grovit-Ferbas, M. P. Sharron, S. H. Mao, M. B. Goetz, E. S. Daar, R. W. Doms und W. A. O'Brien. 1997. A small molecule inhibitor directed against the chemokine receptor CXCR4 prevents its use as an HIV-1 co-receptor. J. Ex. Med. 186: 1395–1400.
18. Doranz, B. J., Z.-H. Lu, J. Rucker, T.-Y. Zhang, M. Sharron, Y.-H. Cen, Z.-X. Wang, H.-H. Guo, J.-G. Du, M. A. Accavitti, R. W. Doms und S. C. Peiper. 1997. Two distinct CCR5 domains can mediate co-receptor usage by human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 71: 6305–6314.
19. Dragic, T., V. Litwin, G. P. Allaway, S. R. Martin, Y. Huanh, K. A. Nagashima, C. Cayanan, P. J. Maddon, R. A. Koup, J. P. Moore und W. A. Paxton. 1996. HIV-1 entry into CD4+ cells is mediated by the chemokine receptor CC-CKR-5. Nature 381: 667–673.
20. Dragic, T., A. Trkola, X. W. Lin, K. A. Nagashima, F. Kajumo, L. Zhao, W. C. Olson, L. Wu, C. R. Mackay, G. P. Allaway, T. P. Sakmar, J. P. Moore und P. J. Maddon. 1998. Amino terminal substitutions in the CCR5 co-receptor impair gp120 binding and human immunodeficiency virus type 1 entry. J. Virol. 72: 279–285.
21. Dragic, T., A. Trkola und J. P. Moore. 1997. HIV co receptors: Gateways to the cell. Advances in Research and Therapy 7: 2–13.
22. Farzan, M.-, H. Choe, L. Vaca, K. Martin, Y. Sun, E. Desjardins, N. Ruffing, L. Wu, R. Wyatt, N. Gerard, C. Gerard und J. Sodroski. 1998. A tyrosine-rich region in the N-terminus of CCR5 is important for human immunodeficiency virus type 1 entry and mediates an association between gp120 and CCR5. J. Virol. 72: 1160 1164.
23. Fuerst, T. R., E. G. Niles, F. W. Studier und B. Moss. 1986. Eukaryotic transientexpression system based on recombinant vaccinia virus that synthesizes bacteriophage T7 RNA polymerase. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 83: 8122–8126.
24. Genoud, S., F. Kajumo, Y. Guo, D. A. D. Thompson und T. Dragic. CCR5-mediated human immunodeficiency virus entry depends on an amino-terminal domain gp120- binding site and on the conformational integrity of all four extracellular domains. J. Virol. submitted.
25. Gether, U. und B. K. Kobilka. 1998. G protein-coupled receptors. J. Biol. Chem 273: 17979–17982.
26. Gordon, C., M. Muesing, A. E. I. Proudfoot, C. A. Power, J. P. Moore und A. Trkola. 1998. Enhancement of human immunodeficiency virus type 1 infection by the CC chemokine RANTES is independent of the mechanism of virus-cell fusion. J. Virol. in press.
27. Heveker, N., M. Montes, L. Germeroth, A. Amara, A. Trautmann, M. Alizon und J. Schneider-Mergener. 1998. Dissociation of the signaling and antiviral properties of SDF-1-derived small peptides. Current Biology 8: 369–376.
28. Hill, C. M., D. Kwon, M. Jones, C. B. Davis, S. Marmon, B. L. Daugherty, J. A. DeMartino, M. S. Springer, D. Unutmaz und D. R. Littman. 1998. The amino terminus of human CCR5 is required for its function as a receptor for diverse human and simian immunodeficiency virus envelope glycoproteins. Virology 248: 357–371.
29. Johnson, V. A., D. P. Merrill, J. A. Videler, T. C. Chou, R. E. Byington, J. J. Eron, R. T. D'Aquila und M. S. Hirsch. 1991. Two-drug combinations of zidovudine, didanosine, and recombinant interferon-alpha A inhibit replication of zidovudineresistant human immunodeficiency virus type 1 synergistically in vitro. J Infect Dis 164: 646–655.
30. Klatzmann, D., E. Champagne, S. Chamaret, J. M. Gruest, D. Guetard, T. Hercend, J. C. Gluckman und L. Montagnier. 1984. P-lymphocyte T4 molecule behaves as the receptor for human retrovirus LAV. Nature 312: 382 385.
31. Kuhmann, K. E., E. J. Platt, S. L. Kozak und D. Kabat. 1997. Polymorphism in the CCR5 genes of African green monkeys and mice implicate specific amino acids in infections by simian and human immunodeficiency viruses. J. Virol. 71: 8642–8656.
32. Kwong, P. D., R. Wyatt, J. Robinson, R. W. Sweet, J. Sodroski und W. A. Hendrickson. 1998. Structure of an HIV gp120 envelope glycoprotein in complex with the CD4 receptor and a neutralizing human antibody. Nature 393: 648–659.
33. Laal, S., S. Burda, M. K. Gorny, S. Karwowska, A. Buchbinder und S. Zolla-Pazner. 1994. Synergistic neutralization of human immunodeficiency virus type 1 by combinations of human monoclonal antibodies. J. Virol. 68: 4001–4008.
34. Labrosse, B., A. Brelot, N. Heveker, N. Sol, D. Schols, E. D. Clercq und M. Alizon. 1998. Determinants for sensitivity of human immunodeficiency virus co-receptor CXCR4 to the bicyclam AMD3100. J. Virol. 72: 6381–6388.
35. Li, A., H. Katinger, M. R. Posner, L. Cavacini, S. Zolla-Pazner, M. K. Gorny, J. Sodroski, T. C. Chou, T. W. Baba und R. M. Ruprecht. 1998. Synergistic neutralization of simian-human immunodeficiency virus SHIV-vpu+ by triple and quadruple combinations of human monoclonal antibodies and high-titer anti-human immunodeficiency virus type 1 immunoglobulins. J. Virol. 72: 3235–3240.
36. Littman, D. R. 1998. Chemokine receptors: keys to AIDS pathogenesis. Cell 93: 677–680.
37. Litwin, V. unpublished results.
38. Litwin, V., K. Nagashima, A. M. Ryder, C. H. Chang, J. M. Carver, W. C. Olson, M. Alizon, K. W. Hasel, P. J. Maddon und G. 2. Allaway. 1996. Human immunodeficiency virus type 1 membrane fusion mediated by a laboratory-adapted strain and a primary isolate analyzed by resonance energy transfer. J. Virol. 70: 6437–6441.
39. Loetscher, P., J. H. Gong, B. Dewald, M. Baggioloni und I. Clark-Lewis. 1998. N-terminal peptides of stromal cell derived factor-1 with CXC chemokine receptor 4 agonist and antagonist activities. J. Biol. Chem. 273: 22279–22283.
40. Mack, M'., B. Luckow, P. J. Nelson, J. Cihak, G. Simmons, P. R. Clapham, N. Signoret, M. Marsh, M. Stangassinger, F. Borlat, T. N. C. Wells, D. Schlondorff und A. E. I. Proudfoot. 1998. Aminooxypentane-RANTES induces CCR5 internalization but inhibits recycling: a novel inhibitory mechanisms of HIV infectivity. J. Ex. Med. 187: 1215–1224.
41. Maddon, P. J., A. G. Dalgleish, J. S. McDougal, P. R. Clapham, R. A. Weiss und R. Axel. 1986. The T4 gene encodes the AIDS virus receptor and is expressed in the immune system and the brain. Cell 47: 333–348.
42. McDougal, J. S., M. S. Kennedy, J. M. Sligh, S. P. Cort, A. Mawle und J. K. A. Nicholson. 1986. Binding of HTLVIII/LAV to T4+ T cells by a complex of the 110K viral protein and the T4 molecule. Science 231: 382–385.
43. McKnight, A., D. Wilkinson, G. Simmons, S. Talbot, L. Picard, M. Ahuja, M. Marsh, J. A. Hoxie und P. R. Clapham. 1997. Inhibition of human immunodeficiency virus fusion by a monoclonal antibody to a co-receptor (CXCR4) is both cell type and virus strain dependent. J. Virol. 71: 1692–1696.
44. Merrill, D. P., D. J. Manion, T. C. Chou und M. S. Hirsch. 1997. Antagonism between human immunodeficiency virus type 1 protease inhibitors indinavir and saquinavir in vitro. J Infect Dis 176: 265–268.
45. Moore, J. P., Y. Cao, L. Qing, Q. J. Sattentau, J. Pyati, R. Koduri, J. Robinson, C. F. Barbas, D. R. Burton und D. D. Ho. 1995. Primary isolates of human immunodeficiency virus type 1 are relatively resistant to neutralization by monoclonal antibodies to gp120 and their neutralization is not predicted by studies with monomeric gp120. J. Virol. 69: 101–109.
46. Moore, J. P., B. A. Jameson, R. A. Weiss und Q. J. Sattentau. The HIV-cell fusion reaction. Boca Raton: CRC Press Inc., 1993 (J. Bentz, ed. Viral Fusion Mechanisms)
47. Moore, J. P., J. A. McKeating, Y. Huang, A. Ashkenazi und D. D. Ho. 1992. Virions of primary human immunodeficiency virus type 1 isolates resistant to soluble CD4 (sCD4) neutralization differ in sCD4 binding and glycoprotein gp120 retention from sCD4 sensitive isolates. J. Virol. 66: 235–243.
48. Moore, J. P. und R. W. Sweet. 1993. The HIV gp120-CD4 interaction: a target for pharmacological and immunological intervention. Prospect in Drug Discovery and Design 1: 235–250.
49. Murakami, T., T. Nakajima, Y. Koyanagi, K. Tachibana, N. Fujii, H. Tamamura, N. Yoshida, M. Waki, A. Matsumoto, O. Yoshie, T. Kishimoto, N. Yamamoto und T. Nagasawa. 1997. A small molecule CXCR4 inhibitor that blocks T cell line-tropic HIV-1 infection. J. Ex. Med. 186: 1389–1393.
50. Olson, W. C. unpublished results.
51. Pantaleo, G., G. Poli, L. Butini, C. Fox, A. I. Dayton und A. S. Fauci. 1991. Dissociation between syncytia formation and HIV spreading. Suppression of syncytia does not necessarily reflect inhibition of HIV infection. Eur. J. Immunol. 21: 1771–1774.
52. Rabut, G. E. E., J. A. Konner, F. Kajumo, J. P. Moore und T. Dragic. 1998. Alanine substitutions of polar and non-polar residues in the amino-terminal domain of CCR5 differently impair entry of macrophage-and dual-tropic isolates of the human immunodeficiency virus type 1. J. Virol. 72: 3464–3468.
53. Rizzuto, C., R. Wyatt, N. Hernandez-Ramos, Y. Sun, P. Kwong, W. Hendrickson und J. Sodroski. 1998. Identification of a conserved human immunodeficiency virus gp120 glycoprotein structure important for chemokine receptor binding: Science 280: 1949–1953.
54. Rucker, J., M. Samson, B. J. Doranz, F. Libert, J. F. Berson, Y. Yi, R. J. Smyth, R. G. Collman, C. C. Broder, G. Vassart, R. W. Doms und M. Parmentier. 1996. Region in the (3-chemokine receptors CCR-5 and CCR-2b that determine HIV-1 cofactor specificity. Cell 87: 437–446.
55. Schols, D., S. Struyf, J. V. Damme, J. A. Este, G. Henson und E. D. Clercq. 1997. Inhibition of T-tropic HIV strains by selective antagonization of the Chemokine receptor CXCR4. J. Ex. Med. 186: 1383–1388.
56. Simmons, G., P. R. Clapham, L. Picard, R. E. Offord, M. M. Rosenkilde, T. W. Schwartz, R. Buser, T. N. C. Wells und A. E. I. Proudfoot. 1997. Potent inhibition of HIV-1 infectivity in macrophages and lymphocytes by a novel CCR5 antagonist. Science 276: 276–279.
57. Simmons, G., D. Wilkinson, J. D. Reeves, M. T. Dittmar, S. Beddows, J. Weber, G. Carnegie, U. Desselberger, P. W. Gray, R. A. Weiss und P. R. Clapham. 1996. Primary, syncytium-inducing human immunodeficiency virus type-1 isolates are dualtropic and most can use either LESTR or CCR5 as co-receptor for virus entry. J. Virol. 70: 8355–8360.
58. Strizki, J. M., J. Davis-Turner, R. G. Collman, J. Hoxie und F. Gonzalez-Scarano. 1997. A monoclonal antibody (12G5) directed against CXCR4 inhibits infection with the dual-tropic human immunodeficiency virus type 1 isolate HIV-1 89.6 but not the P-tropic isolate HIV-1 HxB. J. Virol. 71: 5678–5683.
59. Trkola, A., T. Dragic, J. Arthos, J. Binley, W. C. Olson, G. P. Allaway, C. Cheng-Mayer, J. Robinson, P. J. Maddon und J. P. Moore. 1996. CD4-dependent, antibody sensitive interactions between HIV-1 and its co receptor CCR-5. Nature 384: 184–187.
60. Trkola, A., W. A. Paxton, S. P. Monard, J. A. Hoxie, M. A. Siani, D. A. Thompson, L. Wu, C. R. Mackay, R. Horuk und J. P. Moore. 1997. Genetic subtype-independent inhibition of human immunodeficiency virus type-1 replication by CC-and CXC chemokines. J. Virol. 72: 396–404.
61. Vijh-Warrier, S., A. Pinter, W. J. Honnen und S. A. Tilley. 1996. Synergistic neutralization of human immunodeficiency virus type 1 by a chimpanzee monoclonal antibody against the V2 domain of gp120 in combination with monoclonal antibodies against the V3 loop and the CD4-binding site. J. Virol. 70: 4466–4473.
62. Ward, S. G., K. bacon und J. Westwick. 1998. Chemokines and lymphocytes: more than an attraction. Immunity 9: 1–11.
63. Wu, L., N. P. Gerard, R. Wyatt, H. Choe, C. Parolin, N. Ruffing, A. Borsetti, A. A. Cardoso, E. Desjardin, W. Newman, C. Gerard und J. Sodroski. 1996. CD4-induced interaction of primary HIV-1 gp120 glycoproteins with the chemokine receptor CCR- 5. Nature 384: 179–183.
64. Wu, L., G. LaRosa, N. Kassam, C. J. Gordon, H. Heath, N. Ruffing, H. Chef, J. Humblias, M. Samson, M. Parmentier, J. P. Moore und C. R. Mackay. 1997. Interaction of chemokine receptor CCR5 with its ligands: multiple domains for HIV-1 gp120 binding and a single domain for chemokine binding. J. Exp. Med. 186: 1373–1381.
65. Wyatt, R., P. D. Kwong, E. Desjardins, R. Sweet, J. Robinson, W. Hendrickson und J. Sodroski. 1998. The antigenic structure of the human immunodeficiency virus gp120 envelope glycoprotein. Nature 393: 705–711.
66. Wyatt, R. und J. Sodroski. 1998. The HIV-1 envelope glycoproteins: fusogens, antigens and immunogens. Science 280: 1884–1888.
67. Ylisas~igui, L., J. J. Vizzavona, E. Drakopoulou, P. Paindavoine, C. F. Calvo, M. Parmentier, J. C. Gluckman, C. Vita und A. Benjouad. 1998. Synthetic full length and truncated RANTES inhibit HIV-1 infection of primary macrophages. AIDS 12: 977–984.
68. Zhang, J. L., H. Choe, B. J. Dezube, M. Farzan, P. L. Sharma, X. C. Zhou, L. B. Chef, M. Ono, S. Gillies, Y. Wu, J. G. Sodroski und C. S. Crumpacker. 1998. The bis azo compound FP-21399 inhibits HIV-1 replication by preventing viral entry. Virology 244: 530–541.
69. Cairns, J. S., D'Souza. M. P., 1998. Chemokines and HIV-1 second receptors: the therapeutic connection. Nature Medicine. 1998. Vol 4, No. 5: 563.
70. Kilby, J. Michael, et al. 1998. Potent suppression of HIV-1 replication in humans by T-20, a peptide inhibitor of gp41-medicated virus entry. Nature Medicine. Vol. 3, No. 11: 1302.

SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Ein monoklonaler Anti-CCR5-Chemokinrezeptor-Antikörper oder ein Fragment davon, wobei der Antikörper oder das Fragment davon an das gleiche Epitop bindet, an das der monoklonale Antikörper PA14 bindet, wobei PA14 der monoklonale Antikörper ist, der von einer Hybridomzelllinie produziert wird, die unter der ATCC Zugangsnr. HB-12610 hinterlegt ist und als PA14 bezeichnet wird.
Der monoklonale Anti-CCR5-Chemokinrezeptor-Antikörper nach Anspruch 1.
Das Fragment des monoklonalen Anti-CCR5-Chemokinrezeptor-Antikörpers nach Anspruch 1.
Der Antikörper oder das Fragment nach einem der Ansprüche 1–3, wobei der Antikörper humanisiert ist.
Der Antikörper oder das Fragment nach einem der Ansprüche 1–4, umfassend Komplementaritätsbestimmende Regionen (CDRs), die von dem monoklonalen Antikörper PA14 oder dem Hybridom abgeleitet sind.
Der Antikörper nach Anspruch 4, wobei der Antikörper ein Gerüst umfasst, das von einem humanen Immunglobulinmolekül abgeleitet ist.
Der Antikörper nach Anspruch 6, wobei das humane Immunglobulinmolekül ausgewählt ist aus der Gruppe bestehend aus IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA und IgM.
Der Antikörper nach Anspruch 7, wobei das humane Immunglobulinmolekül IgG4 ist.
Der Antikörper nach Anspruch 7, wobei das humane Immunglobulinmolekül IgG2 ist.
Der Antikörper oder das Fragment nach den Ansprüchen 1–3, wobei der Antikörper ein chimärer Antikörper ist.
Das Fragment des monoklonalen Antikörpers nach Anspruch 3, wobei das Fragment ein monovalentes Fragment ist.
Der monoklonale Anti-CCR5-Chemokinrezeptor-Antikörper nach Anspruch 2, bezeichnet als PA14.
Der humanisierte monoklonale Anti-CCR5-Chemokinrezeptor-Antikörper nach den Ansprüchen 4–9, wobei der Antikörper ein humanisierter Antikörper ist, der von dem als PA14 bezeichneten monoklonalen Antikörper abgeleitet ist.
Der monoklonale Antikörper oder das Fragment nach einem der Ansprüche 1–13, der/das spezifisch an CCR5⁺-Zellen bindet.
Verwendung des monoklonalen Antikörpers oder Fragments nach einem der Ansprüche 1–14 für die Herstellung einer Zusammensetzung zum Inhibieren der HIV-1-Fusion an und des Eintritts des Virus in CD4⁺-Zellen.