PT1144006E - Pa14: anticorpo contra o ccr5 - Google Patents

Description

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DESCRIÇÃO "PAI4: ANTICORPO CONTRA O CCR5"

Antecedentes da Invenção O vírus da imunodeficiência humana de tipo 1 (VIH-1) induz a fusão do vírus à membrana celular para conseguir entrar nas células alvo (8, 15, 66) . A primeira interacção de elevada afinidade entre o virião e a superfície da célula é a ligação da glicoproteína gpl20 da superfície virai ao antigénio CD4 (13, 30, 41, 42) . Isto, por sua vez, induz alterações conformacionais na gpl20, o que viabiliza a sua interacção com um de vários receptores de quimiocinas (4, 5, 21, 36) . O receptor de quimiocina-CC CCR5 é o co-receptor principal para estirpes de macrófagos-trópicos (R5), e desempenha um papel crucial na transmissão do VIH-1 por via sexual (4, 5, 21, 36). Os virus da linhagem trópica das células T (X4) utilizam o CXCR4 para entrar nas células alvo e, duma maneira geral, mas nem sempre, surgem numa fase tardia na progressão da doença ou como uma consequência da propagação do virus em cultura de tecido (4, 5, 21, 36) . Alguns isolados primários de VIH-1 são trópicos duplos (R5X4) uma vez que eles podem utilizar ambos os co-receptores, embora nem sempre com a mesma eficiência (11, 57) . Estudos de mutagénese acoplados à resolução da estrutura cristalina do núcleo da gpl20 demonstraram que o sitio de ligação do co-receptor na gpl20 compreende vários resíduos conservados (32, 53, 65) .

Foi demonstrado que as tirosinas e os resíduos carregados negativamente no domínio amino-terminal (Nt) do CCR5 são essenciais para a ligação da gpl20 ao co-receptor, e para a fusão e entrada do VIH-1 (6, 18, 20, 22, 28, 31, 52, 54) . 2

Os resíduos nas espirais extracelulares (ECL) 1-3 do CCR5 foram prescindíveis para a função co-receptora, contudo a configuração do interdomínio do CCR5 teve de ser mantida para fusão e entrada virai óptimas (24) . Isto levou à conclusão que a gpl20 estabelece interacções com uma superfície difusa nas ECLs ou que o Nt é mantido numa conformação funcional por ligações com resíduos nas ECLs. Estudos com co-receptores quiméricos e anticorpos monoclonais anti-CCR5 também demonstraram a importância das espirais extracelulares para a entrada virai (5, 54, 64).

As moléculas que se ligam especificamente aos CCR5 e CXCR4 e bloqueiam as interacções com os seus ligandos são uma ferramenta poderosa para sondar posteriormente as relações estrutura/função dos co-receptores. A caracterização de tais compostos também poderia ajudar na concepção de agentes terapêuticos eficazes orientados para passos de entrada virai mediados por co-receptor alvos. Os inibidores da função co-receptora do CCR5 ou CXCR4 identificados até à data são de natureza diversa e incluem moléculas pequenas, péptidos, quimiocinas e seus derivados, e anticorpos monoclonais (mAbs). Os mecanismos de acção das moléculas pequenas que bloqueiam a entrada interferindo com a função co-receptora do CXCR4 não são bem compreendidos (17, 49, 55, 68) . Um desses inibidores, a molécula pequena aniónica AMD3100, depende de resíduos na ECL2 e no quarto domínio transmembrana (TM) do CXCR4 para inibir a entrada virai, embora não seja claro se tal é conseguido interrompendo a ligação da gpl20 ao CXCR4 ou através de passos posteriores à ligação que conduzem à fusão de membrana (16, 34, 55). Até à data não foram descritas moléculas pequenas que bloqueiem especificamente a entrada de VIH-1 mediada pelo CCR5. A inibição da entrada do VIH-1 pelas quimiocinas é 3 mediada por pelo menos dois mecanismos diferentes: bloqueio da interacção gpl20/co-receptor e internalização do complexo quimiocina/receptor (3, 26, 59, 63). A variante AOP-RANTES também inibe a reciclagem do CCR5 para a superfície da célula (40, 56) . As variantes tais como RANTES 9-68 e Met-RANTES evitam apenas a interacção gpl20/CCR5 e não regulam negativamente o CCR5 (67). As variantes de SDF-1 actuam presumivelmente através de um mecanismo semelhante para bloquear a entrada virai mediada pelo CXCR4 (12, 27, 39) . Apenas um mAb anti-CXCR4, 12G5, foi caracterizado pelas suas propriedades antivirais. A eficiência da inibição da entrada virai pelo 12G5 foi referida como sendo dependente tanto da célula como do isolado (43, 58) . Este mAb liga-se à ECL2 do CXCR4, embora seja desconhecido o mecanismo pelo qual este inibe a entrada (7) . Alguns dos mAbs anti-CCR5 caracterizados até à data impedem de modo eficiente a entrada do VIH-1 (28, 64). De modo interessante, os mAbs cujos determinantes antigénicos se situam no domínio Nt do CCR5, os quais contêm o sítio de ligação do gpl20, inibem a fusão e a entrada virais de modo menos eficiente do que o mAb 2D7, cujo determinante antigénico se situa na ECL2. O 2D7 também antagoniza a actividade de quimiocina-CC (64).

Um painel de seis mAbs de murídeo, designados PA8, PA9, PAIO, PA11, PA12 e PA14 foi isolado e caracterizado. Todos os seis mAbs ligam-se especificamente às células CCR5+ mas com eficiências diferentes que foram dependentes do tipo de célula. Estudos de mapeamento do determinante antigénico identificaram os resíduos que são importantes para ligação do mAb e também revelaram informação sobre a dobragem e as interacções dos domínios extracelulares do CCR5. Todos os mAbs inibiram a fusão e entrada de VIH-1, mas não houve 4 qualquer correlação entre a capacidade de um mAb para inibir a fusão e entrada, e a sua capacidade para inibir a ligação de gpl20/sCD4 às células CCR5+.

Esta invenção proporciona um anticorpo monoclonal anti-receptor de quimiocina CCR5 ou um fragmento daquele como definido nas reivindicações apensas, bem como a utilização do referido anticorpo monoclonal ou fragmento na preparação de uma composição para inibir a fusão do VIH-1 e entrada virai nas células CD4+.

Breve Descrição das Figuras:

Figura 1:

Ligação de anticorpos monoclonais anti-CCR5 às células CCR5*:

Utilizou-se citometria de fluxo para detectar a expressão da proteína CCR5 na superfície de células L1.2-CCR5"1" e PBMC estimuladas com PHA/IL-2, isoladas de fresco. Incubou-se as células com concentrações de saturação de cada mAb, que foram detectadas com um anticorpo relator anti-IgG de ratinho marcado com PE. São mostrados os resultados de uma experiência representativa. Os resultados para cada mAb são exprimidos em intensidades médias de fluorescência (m.f.i.) e em % de células obturadas. Uma vez que os PA8-PA12 e PA14 são todos da subclasse de IgGl, as suas m.f.i. são directamente comparáveis. 0 2D7 é uma IgG2a.

Figura 2:

Valores de Cl para combinações diferentes de mAbs e inibidores virais:

Realizou-se experiências como as descritas na legenda da Fig. 7 para combinações diferentes de inibidores da entrada 5 virai. Avaliou-se mAbs anti-CCR5 em combinação uns com os outros, quimiocinas-CC e CD4-IgG2, o que inibe a ligação do VIH-1 às células alvo. A gama de concentração de PA11 e PA12 foi de 0-250 μg/mL; a gama de concentração de 2D7 e PAI4 foi de 0-25 μg/mL; a gama de concentração de RANTES foi de 0-250 ng/mL; a gama de concentração de CD4-IgG2 foi de 0-25 μg/mL. As concentrações de agentes individuais ou das suas misturas necessárias para produzir 50 % e 90 % de inibição da fusão ou entrada foram comparadas quantitativamente num termo conhecido como índice de Combinação (Cl) .

Figura 3

Valores de IC50 para a inibição da fusão célula-célula, entrada virai e ligação de gpl20/CD4 pelos mAbs anti-CCR5:

Para efeitos comparativos nós resumimos os valores de IC5o obtidos nos vários ensaios em que os mAbs anti-CCR5 foram testados. Os valores de IC5o foram calculados apenas para mAbs que poderiam inibir >90 % da fusão, entrada ou ligação.

Figura 4

Mapeamento do determinante antigénico dos mAbs anti-CCR5:

Utilizou-se um protocolo de revelação de duas cores para avaliar a ligação de mAbs às proteínas CCR5 mutantes, marcadas na extremidade C com o péptido HA. Incubou-se células HeLa que expressam mutantes pontuais de CCR5 com concentrações de saturação de cada mAb seguida de detecção com um anti-IgG de ratinho marcado com PE. A expressão do co-receptor da superfície celular foi medida por revelação dupla das células com um mAb anti-HA marcado com FITC. As quatro grelhas correspondem aos quatro domínios 6 extracelulares de CCR5. A primeira linha de cada grelha indica a sequência de aminoácidos do correspondente domínio extracelular do CCR5 (SEQ ID N° 1-4) . A ligação dos mAbs anti-CCR5 ao mutante de alanina de cada resíduo é exprimida como uma percentagem de ligação ao CCR5 natural, como se descreve em Materiais e Métodos.

Figura 5

Inibição da mobilização de cálcio para o interior das células CCR5+ pelos mAbs anti-CCR5:

Carregou-se células L1.2-CCR5"1" com Indo-IAM e estimulou-se sequencialmente com um mAb anti-CCR5 ou PBS, seguido de RANTES (a). Mediu-se as alterações na fluorescência com um espectrofluorímetro e os perfis são de uma experiência representativa. Avaliou-se a inibição do fluxo de cálcio pelos PA14 e 2D7 para uma gama lata de concentrações de mAb (b). Os resultados são representados como % da inibição do influxo de cálcio = [1- (fluorescência relativa na presença de mAb -f- fluorescência relativa na ausência de mAb) ] x 100 %, e são as médias dos valores de três experiências independentes.

Figura 6

Inibição da função co-receptora do CCR5 pelos mAbs anti-CCR5:

Avaliou-se a inibição da fusão célula-célula pelos mAbs anti-CCR5 no ensaio RET (a) . Adicionou-se 0-250pg/mL de PA8-PA12, ou 0-25pg/mL de PA14 ou 2D7 a uma mistura de células HeLa-EnVJR_FL e PM1, marcadas com F18 e R18 respectivamente. Mediu-se a fluorescência RET depois de 4h de incubação. Os resultados são valores médios de três experiências independentes e são exprimidos como % de 7 inibição da fusão = [ 1— ( % RET na presença de mAb -e % RET na ausência de mAb)] x 100 %. A inibição da entrada do VIH-1 pelos mAbs anti-CCR5 foi avaliada por um único ciclo de ensaio de entrada à base de luciferase de replicação (b) . Infectou-se células U87-CD4+CCR5+ com um vírus relator NLluc+env" portador do envelope JR-FL na presença de 0-250pg/mL de PA8-PA12 ou 0-25pg/mL de PAI 4 ou 2D7. Mediu-se a actividade luciferase (unidades relativas de luz, r.l.u.) nos lisados de células 72h após infecção. Os resultados são de uma experiência representativa e são exprimidos como % de inibição de entrada = [1-(r.l.u. na presença de mAb -r-r.l.u. na ausência de mAb)] x 100 %. Ligação de complexos biotinilados [b] de gpl20, sCD4 e b-gpl20-CD4 às células L1.2-CCR5+ (c) . Observa-se uma ligação forte quando a gpl20 proveniente do vírus R5 VIH-1JR-FL é complexada com uma quantidade equimolar de sCD4. Não se observa qualquer ligação na ausência de sCD4 ou para a gpl20 proveniente do vírus X4 VIH-Ilai· A ligação de fundo a células L1.2-CCR5 foi subtraída de todas as curvas. A inibição da ligação de gpl20/sCD4 às células L1.2-CCR5+ foi avaliada na presença de concentrações variáveis de cada anticorpo (d). As células foram pré-incubadas em placas de 96 poços com um mAb anti-CCR5 seguida de uma incubação com uma concentração de saturação de gpl20/sCD4 biotinilado. Finalmente, mediu-se a ligação de estreptavidina marcada com PE às células utilizando um leitor de placas por fluorescência. Os resultados são de uma experiência representativa e são exprimidos como % de inibição da ligação de gpl20/sCD4 = [l-(m.f.i. na presença de mAb e m.f.i. na ausência de mAb)] x 100 %.

Figura 7:

Inibição sinérgica da fusão célula-célula pelos PA12 e 2D7:

Obteve-se curvas dose-resposta para os mAbs utilizados individualmente e em associação. Adicionou-se 0-5C^g/mL de PA12, 0-25μς/ηι1 de 2D7 ou uma associação dos dois numa proporção de 2:1 a uma mistura de células HeLa-EnVjR-FL+ e PM1, marcadas com R18 e F18 respectivamente. Mediu-se a fluorescência RET após 4 horas de incubação. Os resultados são exprimidos como % de inibição da fusão e são os valores médios de três experiências independentes. Os dados foram analisados utilizando o princípio do efeito mediano, o qual pode ser escrito como f = 1/ [1 + (K/c)m] (1) em que f é a fracção afectada/inibida, c é a concentração, K é a concentração de agente necessária para produzir o efeito mediano e m é um coeficiente empírico que descreve a forma da curva dose-resposta. A equação (1) é uma forma generalizada das equações que descrevem a cinética enzimática de Michaelis-Menton, as isotérmicas de adsorção de Langmuir e os equilíbrios de ionização de Henderson-Hasselbalch, para os quais m = 1. No presente caso, K é igual ao valor de IC50. K e m são determinados ajustando as curvas dose-resposta e a Equação (1) foi rearranjada para permitir o cálculo de c para um dado f. Os parâmetros do melhor ajuste para K e c são 8,8μg/mL e 0,54 para ο PA12, 0,3βμρ/ιη1 e 0,68 para o 2D7, e 0,l^g/mL e 1,1 para a sua combinação. Estas curvas são representadas graficamente e indicam uma adequação do ajuste razoável entre a experiência e a teoria.

Descrição Pormenorizada da Invenção: 9

Esta invenção proporciona um anticorpo monoclonal anti-receptor de quimiocina CCR5 ou um seu fragmento como definido nas reivindicações. A descrição também relaciona-se com uma composição para inibir a infecção pelo VIH-1 compreendendo pelo menos dois compostos em quantidades sinergicamente eficazes para inibir a infecção pelo VIH-1, em que pelo menos um dos compostos impede a interacção produtiva entre VIH-1 e um co-receptor de fusão de VIH-1.

Como aqui utilizada, "composição" significa uma mistura. As composições incluem mas não se limitam àquelas adequadas para administração oral, rectal, intravaginal, tópica, nasal, oftálmica ou parentérica a um indivíduo. Como aqui utilizada, "parentérica" inclui mas não se limita às injecções subcutânea, intravenosa, intramuscular ou intra-esternal ou técnicas de infusão.

Como aqui utilizado, "VIH-1" significa vírus da imunodeficiência humana de tipo-1. VIH-1 inclui mas não se limita às partículas extracelulares de vírus e às formas de VIH-1 encontradas em células infectadas pelo VIH-1.

Como aqui utilizada, "infecção pelo VIH-1" significa a introdução de informação genética do VIH-1 numa célula alvo, tal como por fusão da membrana da célula alvo com o VIH-1 ou de uma célula de glicoproteína+ do envelope de VIH-1. A célula alvo pode ser uma célula do organismo de um indivíduo. Numa forma de realização preferida, a célula alvo é uma célula do organismo de um indivíduo humano. 10

Como aqui utilizada, "inibição da infecção pelo VIH-1" significa a redução da quantidade de informação genética de VIH-1 introduzida numa população de células alvo relativamente a quantidade que seria introduzida sem a referida composição.

Como aqui utilizado, "composto" significa uma entidade molecular, incluindo mas não se limitando aos péptidos, polipéptidos, e outras moléculas orgânicas ou inorgânicas e combinações destas.

Como aqui utilizado, "sinergicamente eficaz" significa que o efeito combinado dos compostos quando utilizados em associação é maior do que os seus efeitos aditivos quando utilizados individualmente.

Como aqui utilizada, "interacção produtiva" significa que a interacção do VIH-1 e do co-receptor do VIH-1 conduziria à fusão do referido VIH-1 ou célula de glicoproteína+ do envelope de VIH-1 e a membrana portadora do co-receptor.

Como aqui utilizado, "impede a interacção produtiva" significa que a quantidade de interacção é reduzida relativamente à quantidade que ocorreria sem o composto. As interacções podem ser impedidas mascarando ou alterando regiões interactivas no co-receptor ou VIH-1 ou alterando a expressão, agregação, conformação ou estado de associação do co-receptor.

Como aqui utilizado, "co-receptor de fusão de VIH-1" significa um receptor celular que medeia a fusão entre a célula alvo que expressa o receptor e o VIH-1 ou uma célula de glicoproteina do envelope de VIH-1. Os co-receptores de 11 fusão de VIH-1 incluem mas não se limitam aos CCR5, CXCR4 e outros receptores de quimiocinas.

Esta invenção também proporciona uma composição a qual inibe a fusão de VIH-1 ou de uma célula de glicoproteina"1" do envelope de VIH-1 com uma célula alvo, compreendendo pelo menos dois compostos em quantidades sinergicamente eficazes para inibir a fusão de VIH-1 ou de uma célula de glicoproteina"1" do envelope de VIH-1 com uma célula alvo, em que pelo menos um dos compostos impede a interacção produtiva entre o VIH-1 e um co-receptor de fusão de VIH-1.

Como aqui utilizada, "fusão" significa a junção ou união das membranas de bicamada lipidica presentes em células de mamífero ou vírus tal como VIH-1. Este processo distingue-se da ligação do VIH-1 a uma célula alvo. A fixação é mediada pela ligação da glicoproteina exterior do VIH-1 ao receptor CD4 humano, o qual não é um co-receptor de fusão.

Como aqui utilizado, "inibe" significa que a quantidade é reduzida relativamente à quantidade que ocorreria sem a composição.

Como aqui utilizada, "célula alvo" significa uma célula capaz de ser infectada pelo ou de se fundir com o VIH-1 ou com células infectadas pelo VIH-1.

Como aqui utilizado, "quimiocina" significa uma citocina que pode estimular o movimento de leucócitos. Elas podem ser caracterizadas como cys-cys ou cys-X-cys dependendo se os dois resíduos cisteína da extremidade amino estão imediatamente adjacentes ou separados por um aminoácido. Aquela inclui mas não se limita à RANTES, ΜΙΡ-Ια, ΜΙΡ-1β, 12 SDF-1 ou outra quimiocina que bloqueie a infecção pelo VIH- 1.

Numa forma de realização das composições anteriores, o co-receptor é um receptor de quimiocina. Numa forma de realização preferida das composições anteriores, o receptor de quimiocina é o CCR5 ou CXCR4. Conhece-se outros receptores de quimiocina e receptores relacionados que funcionam como co-receptores de VIH incluindo mas não se limitando aos CCR2, CCR3, CCR8, STRL33, GPR-15, CX3CR1 e APJ (69).

Como aqui utilizado, "receptor de quimiocina" significa um membro de uma família homóloga de sete proteínas da superfície celular que atravessam a membrana que ligam quimiocinas.

Como aqui utilizado, "CCR5" é um receptor de quimiocina que liga membros do grupo C-C de quimiocinas e cuja sequência de aminoácidos compreende a proporcionada no Número de

Acesso Genbank 1705896 e variantes polimórficas relacionadas.

Como aqui utilizado, "CXCR4" é um receptor de quimiocina que liga membros do grupo C-X-C de quimiocinas e cuja sequência de aminoácidos compreende a proporcionada no Número de Acesso Genbank 400654 e variantes polimórficas relacionadas.

Numa forma de realização das composições anteriores, pelo menos um dos compostos é uma molécula sem peptidilo. Numa forma de realização, a molécula sem peptidilo é o composto de biciclam AMD3100 (16). 13

Como aqui utilizado, "molécula sem peptidilo" significa uma molécula que não consiste na sua totalidade de uma sequência linear de aminoácidos ligados por ligações peptidicas. No entanto, a molécula sem peptidilo pode conter uma ou mais ligações peptidicas.

Numa forma de realização preferida, o anticorpo é um anticorpo anti-CCR5. 0 anticorpo anti-CCR5 inclui mas não se limita ao PAI4.

Hibridomas de murídeos que segregam os anticorpos monoclonais PA8, PA9, PAIO, PA11, PA12 e PAI4, respectivamente, foram depositados, seguindo e satisfazendo os requisitos do Tratado de Budapeste sobre o Reconhecimento Internacional do Depósito de Microrganismos para os Efeitos de Procedimento de Patente, na American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Virgínia 20110-2209 em 2 de Dezembro de 1998 com os seguintes N° de Acesso: N° de Acesso ATCC HB-12605 (PA8), N° de Acesso ATCC HB-12606 (PA9), N° de Acesso ATCC12607 (PAIO), N° de Acesso ATCC HB-12608 (Pll) , N° de Acesso ATCC HB-12609 (PA12) e N° de Acesso ATCC HB-126010 (PAI4).

Noutro aspecto a descrição refere-se a composições para inibir a infecção pelo VIH-1 compreendendo dois ou mais anticorpos. Os anticorpos incluem mas não se limitam aos PA8, PA9, PAIO, PA11, PA12, PA14 e 2D7. Nesta composição os anticorpos estão numa proporção apropriada. A proporção varia desde 1:1 até 50:1. 14

Como aqui utilizado, "anticorpo" significa uma molécula de imunoglobulina compreendendo duas cadeias pesadas e duas cadeias leves e a qual reconhece um antigénio. A molécula de imunoglobulina pode provir de qualquer uma das classes geralmente conhecidas, incluindo mas não se limitando às IgA, IgA secretora, IgG e IgM. As subclasses de IgG são também bem conhecidas dos especialistas na técnica e incluem mas não se limitam às IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas. Aquele inclui, a titulo de exemplo, anticorpos naturais e sintéticos. Especificamente, "anticorpo" inclui anticorpos policlonais e monoclonais, e fragmentos monovalentes e divalentes destes. Além disso, "anticorpo" inclui anticorpos quiméricos, anticorpos totalmente sintéticos, anticorpos de cadeia simples e seus fragmentos. Opcionalmente, um anticorpo pode ser marcado com um marcador detectável. Os marcadores detectáveis incluem, por exemplo, marcadores radioactivos ou fluorescentes. 0 anticorpo pode ser um anticorpo humano ou não humano. 0 anticorpo não humano pode ser humanizado por métodos recombinantes para reduzir a sua imunogenicidade em humanos. Os métodos para humanizar anticorpos são conhecidos dos especialistas na técnica.

Como aqui utilizado, "anticorpo monoclonal," também designado por mAb, é utilizado para descrever moléculas de anticorpo cujas sequências primárias são essencialmente idênticas e que exibem a mesma especificidade antigénica. Os anticorpos monoclonais podem ser produzidos por técnicas de hibridoma, recombinantes, transgénicas ou outras técnicas conhecidas do especialista na técnica.

Como aqui utilizado, "anticorpo anti-receptor de quimiocina" significa um anticorpo que reconhece e se liga 15 a um determinante antigénico num receptor de quimiocina. Como aqui utilizado, "anticorpo anti-CCR5" significa um anticorpo monoclonal que reconhece e se liga a um determinante antigénico no receptor de quimiocina CCR5.

Como aqui utilizada, "proporção adequada" significa proporções mássicas ou molares em que os compostos são sinergicamente eficazes.

Numa forma de realização das composições anteriores, pelo menos um composto é uma quimiocina ou um derivado de quimiocina. As quimiocinas incluem mas não se limitam à RANTES, ΜΙΡ-Ια, MIP-Ιβ, SDF-1 ou a uma combinação destas. Nesta composição, os compostos estão numa proporção apropriada. Os derivados de quimiocina incluem mas não se limitam à Met-RANTES, AOP-RANTES, RANTES 9—68, ou a uma combinação destas.

Como aqui utilizado, "derivado de quimiocina" significa uma quimiocina quimicamente modificada. As modificações químicas incluem mas não se limitam a substituições, adições ou delecções de aminoácidos, adições não peptídicas ou oxidações. Um especialista na técnica será capaz de preparar tais derivados.

Noutra forma de realização das composições anteriores, pelo menos um composto é um anticorpo e pelo menos um composto é uma quimiocina ou um derivado de quimiocina. Nesta composição, os compostos estão numa proporção apropriada. A proporção varia desde 100:1 até 1000:1.

Noutra forma de realização das composições anteriores, pelo menos um composto liga-se à subunidade gp41 da 16 glicoproteína do envelope de VIH-1. Numa forma de realização, pelo menos um composto é o péptido inibidor T-20 da entrada do VIH-1 (70).

Noutra forma de realização das composições anteriores, pelo menos um dos compostos inibe a ligação do VIH-1 a uma célula alvo. Numa forma de realização, pelo menos um composto liga o CD4 . Numa forma de realização, pelo menos um composto é uma glicoproteína do envelope de VIH-1. Numa forma de realização, pelo menos um composto é um anticorpo anti-CD4. Numa forma de realização, pelo menos um composto liga-se à glicoproteína do envelope de VIH-1. Numa forma de realização, pelo menos um composto é um anticorpo para a glicoproteína do envelope de VIH-1. Numa forma de realização, pelo menos um composto é uma proteína com base em CD4. Numa forma de realização, pelo menos um composto é CD4-IgG2.

Noutra forma de realização das composições anteriores, pelo menos um composto é um anticorpo e pelo menos um composto liga-se a uma glicoproteína do envelope de VIH-1. Numa forma de realização, o composto é uma proteína com base em CD4. Numa forma de realização, o composto é CD4-IgG2. Nesta composição, os compostos estão numa proporção apropriada. A proporção varia desde 1:1 até 10:1.

Como aqui utilizada, "ligação" significa o processo que é mediado pela ligação da glicoproteína do envelope de VIH-1 ao receptor CD4 humano, o qual não é um co-receptor de fusão.

Como aqui utilizado, "CD4" significa a proteína CD4 adulta, natural, ligada à membrana compreendendo um domínio 17 citoplasmático, um domínio transmembrana hidrófobo e um domínio extracelular o qual se liga à glicoproteína de envelope gpl20 do HIV-1.

Como aqui utilizada, "glicoproteína do envelope de VIH-1" significa a proteína codificada pelo VIH-1 que compreende a proteína de superfície gpl20, a proteína transmembrana gp41 e seus oligómeros e precursores.

Como aqui utilizada, "proteína com base em CD4" significa qualquer proteína compreendendo pelo menos uma sequência de resíduos de aminoácido correspondente à porção do CD4 que é necessária para o CD4 formar um complexo com a glicoproteína de envelope gpl20 do VIH-1.

Como aqui utilizada, "CD4-IgG2" significa uma proteína de fusão heterotetramérica CD4-IgG2 humana codificada pelos vectores de expressão depositados sob os Números de Acesso ATCC 75193 e 75194.

Numa forma de realização das composições anteriores pelo menos um dos compostos compreende um polipéptido o qual se liga a um determinante antigénico de CCR5. Numa forma de realização, o determinante antigénico está localizado na extremidade N, numa das três regiões de espirais extracelulares ou numa combinação destas. Numa forma de realização, o determinante antigénico está localizado na extremidade N. 0 determinante antigénico pode compreender N13 e Y15 na extremidade N. 0 determinante antigénico pode compreender Q4 na extremidade N. Noutra forma de realização, o determinante antigénico inclui resíduos na extremidade N e na segunda espiral extracelular. 0 determinante antigénico pode compreender D2, Y3, Q4, S7, P8 18 e N13 na extremidade N e Y176 e T177 na segunda espiral extracelular. 0 determinante antigénico pode compreender D2, Y3, Q4, P8 e N13 na extremidade N e Y176 e T177 na segunda espiral extracelular. 0 determinante antigénico pode compreender D2 na extremidade N e RI 68 e Y176 na segunda espiral extracelular. Numa forma de realização, o determinante antigénico está localizado na segunda espiral extracelular. 0 determinante antigénico pode compreender Q170 e K171 na segunda espiral extracelular. 0 determinante antigénico pode compreender Q170 e E172 na segunda espiral extracelular. as seguintes abreviaturas da especificação para

Como aqui utilizadas, são usadas ao longo aminoácidos específicos: A=ala=alanina N=asn=asparagina C=cys=cisteína E=glu=ácido glutâmico H=his=histidina L=leu=leucina M=met=metionina P=pro=prolina T=thr=treonina Y=tyr=tirosina correntes indicar R=arg=arginina D=asp=ácido aspártico Q=gln=glutamina G=gly=glicina I=ile=isoleucina K=lys=lisina F=phe=fenilalanina S=ser=serina W=trp=triptofano V=val=valina

Como aqui utilizado, "polipéptido" significa dois ou mais aminoácidos ligados por uma ligação peptídica.

Como aqui utilizado, "determinante antigénico" significa uma porção de uma molécula ou moléculas que forma uma superfície para ligar anticorpos ou outros compostos. 0 19 determinante antigénico pode compreender aminoácidos, hidratos de carbono ou outras unidades não peptidicas contíguos ou não contíguos ou superfícies específicas para oligómeros.

Como aqui utilizada, "extremidade N" significa a sequência de aminoácidos que se estende pela metionina iniciadora e primeira região transmembrana.

Como aqui utilizada, "segunda espiral extracelular" significa a sequência de aminoácidos que se estende pela quarta e quinta regiões transmembrana e que são apresentadas na superfície.

Numa forma de realização das composições anteriores pelo menos um dos compostos compreende uma cadeia leve de um anticorpo. Noutra forma de realização das composições anteriores pelo menos um dos compostos compreende uma cadeia pesada de um anticorpo. Noutra forma de realização das composições anteriores pelo menos um dos compostos compreende a porção Fab de um anticorpo. Noutra forma de realização das composições anteriores pelo menos um dos compostos compreende o domínio variável de um anticorpo. Noutra forma de realização, o anticorpo é produzido como um polipéptido único ou anticorpo de "cadeia simples" o qual compreende os domínios variáveis das cadeias pesada e leve geneticamente ligados via uma sequência intermediária de aminoácidos. Noutra forma de realização das composições anteriores pelo menos um dos compostos compreende uma ou mais porções CDR de um anticorpo.

Como aqui utilizada, "cadeia pesada" significa o polipéptido maior de uma molécula de anticorpo constituída 20 por um domínio variável (VH) e três ou quatro domínios constantes (CHI, CH2, CH3 e CH4), ou seus fragmentos.

Como aqui utilizada, "cadeia leve" significa o polipéptido mais pequeno de uma molécula de anticorpo constituída por um domínio variável (VL) e um domínio constante (CL), ou seus fragmentos.

Como aqui utilizado, "Fab" significa um fragmento monovalente de ligação ao antigénio de uma imunoglobulina que consiste de uma cadeia leve e parte de uma cadeia pesada. Ele pode ser obtido por digestão rápida com papaína ou por métodos recombinantes.

Como aqui utilizado, "fragmento F(ab')2" significa um fragmento bivalente de ligação ao antigénio de uma imunoglobulina que consiste de ambas as cadeias leves e parte de ambas as cadeias pesadas. Ele pode ser obtido por digestão rápida com pepsina ou por métodos recombinantes.

Como aqui utilizado, "CDR" ou "região determinante de complementaridade" significa uma sequência de aminoácidos extremamente variável no domínio variável de um anticorpo.

Esta descrição relaciona-se com as composições anteriores e um veículo farmaceuticamente aceitável. Os veículos farmaceuticamente aceitáveis são bem conhecidos dos especialistas na técnica. Tais veículos farmaceuticamente aceitáveis podem incluir mas não se limitam às soluções, suspensões e emulsões aquosas ou não aquosas. São exemplos de solventes não aquosos os propileno glicol, polietileno glicol, óleos vegetais tal como azeite e ésteres orgânicos injectáveis tal como oleato de etilo. Os veículos aquosos 21 incluem água, soluções, emulsões ou suspensões alcoólicas/aquosas, soro fisiológico e meios tamponados. Os veiculos parentéricos incluem solução de cloreto de sódio, dextrose de Ringer, dextrose e cloreto de sódio, Ringer com lactato ou óleos fixos. Os veiculos intravenosos incluem regeneradores de fluidos e nutrientes, regeneradores electrólitos tais como os baseados em dextrose de Ringer, e semelhantes. Também podem estar presentes conservantes e outros aditivos, tais como, por exemplo, antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes e semelhantes.

Esta divulgação relaciona-se com um método de tratamento de um indivíduo afectado pelo VIH-1 o qual compreende administrar ao indivíduo uma dose eficaz das composições anteriores.

Como aqui utilizado, "indivíduo" significa qualquer animal ou animal modificado artificialmente capaz de ficar infectado pelo VIH. Os animais modificados artificialmente incluem, mas não se limitam a ratinhos SCID com sistemas imunitários humanos. Os animais incluem mas não se limitam aos ratinhos, ratazanas, cães, porquinhos-da-índia, furões, coelhos e primatas. Numa forma de realização preferida, o indivíduo é um humano.

Como aqui utilizado, "tratar" significa abrandar, parar ou inverter a progressão de um distúrbio de VIH-1. Numa forma de realização preferida, "tratar" significa inverter a progressão até ao ponto de eliminar o distúrbio. Como aqui utilizado, "tratar" também significa a redução do número de infecções virais, redução do número de partículas virais 22 infecciosas, redução do número de células infectadas por vírus ou o melhoramento de sintomas associados ao VIH-1.

Como aqui utilizado, "afectado pelo VIH-1" significa que o indivíduo tem pelo menos uma célula que foi infectada pelo VIH-1.

Como aqui utilizada, a "administração" pode ser conseguida ou realizada utilizando qualquer um dos métodos conhecidos dos especialistas na técnica. Os métodos podem compreender meios intravenosos, intramusculares ou subcutâneos. A dose da composição da invenção variará dependendo do indivíduo e da via de administração particular utilizada. As dosagens podem variar desde 0,1 até 100.000 μς/ίςς. Com base na composição, a dose pode ser administrada de modo continuo, tal como por bomba contínua, ou em intervalos periódicos. Por exemplo, em uma ou mais ocasiões separadas. Os intervalos de tempo desejados das doses múltiplas de uma composição particular podem ser determinados sem experimentação excessiva por um especialista na técnica.

Como aqui utilizada, "dose eficaz" significa uma quantidade em quantidades suficientes para tratar o indivíduo ou para evitar que o indivíduo fique infectado pelo VIH-1. Um técnico médio na matéria pode realizar experiências de titulação simples para determinar qual é a quantidade necessária para tratar o indivíduo.

Esta descrição relaciona-se com um método para prevenir que um indivíduo contraia VIH-1 o qual compreende administrar ao indivíduo uma dose eficaz das composições anteriores. 23

Como aqui utilizado, "contrair VIH-1" significa tornar-se infectado pelo VIH-1, cuja informação genética se reproduz e/ou incorpora nas células hospedeiras.

Esta invenção proporciona um anticorpo monoclonal anti-CCR5. 0 anticorpo inclui mas não se limita a um anticorpo produzido por um dos hibridomas seguintes: PA8 (N° de Acesso ATCC HB-12605), PA9 (N° de Acesso ATCC HB-12606), PAIO (N° de Acesso ATCC 12607), PA11 (N° de Acesso ATCC HB-12608), PAI2 (N° de Acesso ATCC HB-12609) e PAI 4 (N° de Acesso ATCC HB-12610).

Esta invenção proporciona formas humanizadas dos anticorpos anteriores.

Como aqui utilizado, "humanizado" descreve anticorpos em que alguns, a maioria ou todos os aminoácidos fora das regiões CDR estão substituídos por aminoácidos correspondentes derivados das moléculas de imunoglobulina humana. Numa forma de realização das formas humanizadas dos anticorpos, alguns, a maioria ou todos os aminoácidos fora das regiões CDR foram substituídos por aminoácidos de moléculas de imunoglobulina humana mas em que alguns, a maioria ou todos os aminoácidos dentro de uma ou mais regiões CDR estão inalterados. São permitidas pequenas adições, delecções, inserções, substituições ou modificações de aminoácidos desde que elas não anulem a capacidade do anticorpo para ligar um dado antigénio. As moléculas de imunoglobulina humana adequadas incluiriam as moléculas de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgM. Um anticorpo "humanizado" reteria uma especificidade antigénica semelhante à do anticorpo original, isto é, na presente invenção, a capacidade de ligar CCR5. 24

Esta descrição relaciona-se com moléculas de ácido nucleico isoladas que codificam estes anticorpos monoclonais anti-CCR5 ou as suas versões humanizadas. A molécula de ácido nucleico pode ser ARN, ADN ou ADNc. Numa forma de realização, a molécula de ácido nucleico codifica a cadeia leve. Numa forma de realização, a molécula de ácido nucleico codifica a cadeia pesada. Numa forma de realização, o ácido nucleico codifica as cadeias pesada e leve. Numa forma de realização, uma ou mais moléculas de ácido nucleico codificam a porção Fab. Numa forma de realização, uma ou mais moléculas de ácido nucleico codificam porções de CDR. Numa forma de realização, a molécula de ácido nucleico codifica o dominio variável.

Esta invenção será melhor compreendida a partir dos Pormenores Experimentais que se seguem. No entanto, um especialista na técnica compreenderá rapidamente que os métodos e resultados específicos discutidos são meramente ilustrativos da invenção que está descrita de modo mais completo nas reivindicações que se lhes segue.

Pormenores Experimentais: A. Materiais e Métodos 1) Reagentes 0 mAb 2D7 foi adquirido de Pharmingen (San Diego, CA) e as quimiocinas CC e CXC foram obtidas de R&D Systems (Minneapolis, MN). 0 CD4-IgG2 (1), o(s) CD4 solúvel(eis) (2) e a gpl20 de VIH-Ijr-fl recombinante foram produzidos por Progenies Pharmaceuticals, Inc. (59). 2) Isolamento e purificação de mAbs anti-CCR5 25

Incubou-se células L1.2-CCR5+ (63) durante 16h na presença de butirato de sódio 5mM, o qual activa a transcrição do promotor do citomegalovírus (CMV) que controla a expressão do CCR5, resultando num aumento de 10 vezes na densidade do co-receptor na superfície celular. Imunizou-se ratinhos Balb/c fêmeas por via intraperitoneal com 107 células L1.2-CCR5+ em intervalos de 3 semanas, e administrou-se um reforço intravenoso de 107 células Ll.2-CCR5+ três dias antes da esplenectomia. Fundiu-se os esplenócitos com a linhagem de células Sp2/0. Numa primeira selecção, avaliou-se os sobrenadantes de dez mil culturas de hibridoma; cento e vinte destas inibiram a fusão entre as células PMl (10), as quais expressam naturalmente os CCR5 e CD4, e as células HeLa-EnVJR-FL+ mediada pelo envelope do VIH-1 num ensaio de transferência de energia de ressonância (RET), como anteriormente descrito (19, 38) . Os hibridomas que produziram os sobrenadantes mais potentemente inibidores e que também fixaram células CCR5+ foram subclonados por diluição limite. Os fluidos de ascites foram preparados por Harlan Bioproducts for Science, Inc. (Indianapolis, IN) a partir de ratinhos Balb/c que foram injectados com hibridomas que produzem os mAbs anti-CCR5 PA8, PA9, PAIO, PAll, PA12 e PA14. Os mAbs foram purificados individualmente até uma homogeneidade >95 % por precipitação com sulfato de amónio seguida de cromatografia em proteína-A. Todos os mAbs foram ressuspendidos em soro fisiológico tamponado com fosfato (PBS) a uma concentração final de 5mg/mL. 3) Análise de classificação celular activada por fluorescência (FACS) e mapeamento do determinante antigénico de mAbs anti-CCR5 26

Utilizou-se citometria de fluxo para detectar a reactividade dos mAbs PA8-PA12 e PA14 com o CCR5 na superfície de células. Incubou-se células L1.2-CCR5+ (106) tratadas com butirato de sódio com 0,25μς de anticorpo, durante 20min a 4°C em azida de sódio a 0,1 % (NaNs) em 50 μΐ de PBS de Dulbecco (DPBS). Utilizou-se o mAb contra o CCR5 2D7 como um controlo positivo e utilizou-se uma IgGl não específica de murídeo como um controlo negativo. Depositou-se as células por centrifugação, lavou-se e incubou-se com IgG anti-ratinho de cabra marcada com ficoeritrina (PE) (Caltag, Burlingame, CA) diluída a 1:100, nas mesmas condições que a primeira incubação de anticorpo. Finalmente, analisou-se as células por citometria de fluxo. Isolou-se as PBMC e estimulou-se como anteriormente descrito (60) e revelou-se utilizando métodos semelhantes.

Utilizou-se um procedimento semelhante para mapeamento do determinante antigénico dos mAbs anti-CCR5. Foi descrito um painel de setenta mutantes pontuais de CCR5 (20, 24, 52) . As sequências de codificação destas proteínas são subclonadas no vector pcDNA3.1 (Stratagene) cuja transcrição pode ser conduzida por um promotor 5' T7-polimerase. Os mutantes de CCR5 são portadores de uma etiqueta de hemaglutinina (HA) de 9 resíduos na extremidade C para detecção de proteína em lisados de células ou para citometria de fluxo. Incubou-se células HeLa (2xl06) durante 5h com 2C^g/mL de lipofectina e uma quantidade igual do plasmídeo natural ou mutante que expressa o CCR5 em OPTI-MEM (Life Technologies, Gaithersburg, MD) . Infectou-se depois as células durante 12h com 2xl07 p.f.u. de vTF7 (23) para incrementar a expressão de CCR5, desprendeu-se com ácido etilenodiaminotetracético 2mM 27 (EDTA) em PBS e lavou-se uma vez com tampão de ligação (1 % de BSA, 0,05 % de NaN3 em DPBS). Marcou-se células (lxlO1 2 3) na superfície com mAbs do modo descrito no parágrafo anterior, lavou-se uma vez com o tampão de incubação e ressuspendeu-se em lmL de lx FACSlyse em água (Becton Dickinson) durante 30min à temperatura ambiente, para permeabilizar as membranas das células. Depositou-se em seguida as células por centrifugação, lavou-se com o tampão de incubação e incubou-se durante lh a 37°C com 4μς/ηιΒ de um mAb anti-HA de ratinho marcado com isotiocianato de fluoresceina (FITC) (BabCo, Richmond, CA) para marcação intracelular. Finalmente, lavou-se as células uma vez com tampão de ligação e uma vez com DPBS, ressuspendeu-se em 1 % de formaldeido em PBS e analisou-se por citometria de fluxo. Determinou-se a extensão da ligação de um mAb ao CCR5 mutante através da equação (m.f.i. de CCR5 PE mutante/peso do m.f.i. de CCR5 PE)/(m.f.i. de CCR5 FITC mutante/peso do m.f.i. de CCR5 FITC) x 100 %. Isto normaliza a ligação do mAb para os níveis de expressão do co-receptor mutante. 1

Ensaio de ligação ao gpl20/sCD4 2 A gpl20 foi biotinilada utilizando NHS-biotina (Pierce, Rockford, IL) segundo as instruções do fabricante, e a biotina não acoplada foi eliminada por diafiltração. 3

Incubou-se células Ll.2-CCR5+ tratadas com butirato de sódio com várias diluições de uma mistura equimolar de sCD4 e gpl20 biotinilada, ou l,2b\aq/v\L de sCD4 e 2,5μρ/ιηΒ de gpl20 biotinilada na presença de concentrações variáveis dos mAbs anti-CCR5 PA8-PA12, PA14, 2D7 ou uma IgGl não específica de murídeo, durante lh à temperatura ambiente em 0,1 % de NaN3 em DPBS. Lavou-se as células com o tampão de 28 incubação e incubou-se com estreptavidina-PE (Becton Dickinson) diluida a 1:50, durante lh à temperatura ambiente. Finalmente, lavou-se as células com tampão de ligação e analisou-se utilizando um leitor de placas por fluorescência (Perspective Biosystems, Framingham, MA). 5) Inibição da fusão célula-célula mediada pelo envelope e entrada do VIH-1 pelos mAbs anti-CCR5 de inibição da infecção pelo VIH-1 é A fusão mediada pelo envelope do VIH-1 entre células HeLa-EnVJR-FL+ e PM1 foi detectada utilizando o ensaio RET. Aplicou-se um igual número (2xl04) de células que expressam o envelope marcadas com o éster octadecilo de fluoresceína (F18) e de células PM1 marcadas com octadecilo de rodamina (R18) em placas de 96 poços em soro fetal de vitelo a 15 % em DPBS e incubou-se durante 4h a 37°C na presença de concentrações variáveis dos mAbs anti-CCR5, PA8-PA12, PAI4, 2D7 ou uma IgGl não especifica de murideo. Mediu-se a fluorescência RET com um leitor de placas Cytofluor (PerSeptive Biosystems) e determinou-se a % de RET como descrito anteriormente (38) . Produziu-se vírus NLluc+env" complementados em trans com glicoproteínas de envelope a partir de JR-FL ou Gun-1 como descrito anteriormente (20) . Infectou-se células U87MG-CD4+CCR5+ (14) com vírus relatores, quiméricos contendo 50-100ng/mL de p24 na presença de concentrações variáveis dos mAbs individuais. Após 2h a 37°C, substituiu-se os meios contendo vírus por meios frescos contendo mAb. Adicionou-se novamente meios frescos, sem anticorpos, após 12 horas. Após um total de 72h, adicionou-se ΙΟΟμΙ de tampão de lise (Promega) às células e mediu-se a actividade luciferase (r.l.u.) como descrito (20) . A % 29 definida como [l-(r.l.u na presença de anticorpo/r.1.u na ausência de anticorpo)] x 100 %. 6) Ensaios de sinalização de cálcio

Adicionou-se o fluorocromo Indo-IAM (Molecular Probes, Eugene, OR) a células Ll.2-CCR5+ tratadas com butirato de sódio a uma concentração final de 5μΜ. Depois da incubação a 37°C durante 30min, lavou-se as células uma vez e ressuspendeu-se em soro fisiológico tamponado de Hank. Estimulou-se seguencialmente as células (106) com um mAb anti-CCR5 ou PBS, seguido 60 s depois de RANTES. Utilizou-se os mAbs PA8-PA12 e PA14 a uma concentração de 100μg/mL, 2D7 a 20μq/mL e RANTES a 250ng/mL. A inibição do fluxo de cálcio pelos PA14 e 2D7 foi também testada para uma gama lata de concentrações mAb, a variar de 0-100μg/mL. Os niveis intracelulares de cálcio foram monitorizados utilizando um espectrofotómetro de fluorescência Perkin-Elmer LS-50S medindo a relação das emissões de fluorescência a 402nm (corante ligado) e 486nm (corante livre) após excitação a 358nm. B. Resultados e Discussão 1) Isolamento dos anticorpos monoclonais anti-CCR5 PA8, PA9, PAIO, PA11, PA12 e PA14

Constatou-se que os péptidos correspondentes aos domínios extracelulares do CCR5 são ineficazes para aumentar as respostas específicas de elevado título do anticorpo contra o receptor nativo da superfície celular (50) . Por conseguinte, imunizou-se ratinhos Balb/C com células Ll.2-CCR5+ e avaliou-se os sobrenadantes de cultura de hibridoma quanto à sua capacidade para inibir a fusão da membrana 30 mediada pelo envelope JR-FL com células PM1 CD4+CCR5+ no ensaio RET (19, 38). Apesar de bem mais do que cem sobrenadantes inibirem a fusão célula-célula em >50 %, apenas seis - designados PA8, PA9, PAIO, PAll, PA12 e PA14 - revelaram especifica e intensamente as células L1.2-CCR5+ não tendo revelado as células L1.2 parentais, como se demonstrou por citometria de fluxo (dados não apresentados). Com base na experiência anterior, assumiu-se que os outros mAbs capazes de inibir a fusão célula-célula estavam provavelmente orientados contra moléculas de adesão da superfície celular tal como LFA-1 (37) . Determinou-se que os hibridomas PA8-PA12 e PA14 segregavam mAbs de igGl por ELISA de isotipos (Cappell, Durham, NC) . Preparou-se fluidos de ascites a partir de ratinhos Balb/C que foram injectados com os seis hibridomas e purificou-se as f racções de IgGl. Os PA8, PA9, PAll, PA12 e PA14 apresentaram perfis de focagem isoeléctrica distintos, enquanto o PAIO teve um perfil muito semelhante ao do PA9 e pode, desse modo, ser um segundo isolado do mesmo mAb (dados não apresentados). 2) Ligação do mAb às células CCR5+

Nenhum dos mAbs anti-CCR5 purificados revelou a linhagem parental de células L1.2 (dados não apresentados). No entanto, os mAbs PA9-PA12 e PA14 revelaram >90 % e ο PA8 revelou -70 %, das células L1.2-CCR5+ como determinado por citometria de fluxo, mostrando que eles reconheceram o CCR5 (Fig. 1). O mAb anti-CCR5 2D7, o qual foi utilizado como um controlo positivo nas nossas experiências, também revelou >90 % das células L1.2-CCR5+. Os PA8-PA12 e PA14 são todos IgGl e reagem igualmente bem com uma IgG anti-ratinho de cabra, enquanto o 2D7 é uma IgG2a e pode reagir de modo diferente com o anticorpo relator. Deste modo apenas as 31 intensidades médias de fluorescência (m.f.i.) medidas com os mAbs PA8-PA12 e PA14 são directamente comparáveis. A ordem de classificação das intensidades médias de fluorescência (m.f.i.) foi PAI2- PA11> (2D7=) PA14- PA10-PA9> PA8. A diferença entre a m.f.i. do PA12 e a m.f.i. do PA8 foi de três vezes. As diferenças na intensidade de revelação entre ο PA8 e os outros mAbs permaneceram constantes ao longo de uma gama alargada de concentrações (dados não apresentados) e provavelmente não correspondem a diferenças nas afinidades dos mAb para o CCR5. Isto implica que ο PA8 interage apenas com um subconjunto de moléculas de CCR5 presentes na superfície de células L1.2-CCR5"1".

Em comparação com as células L1.2-CCR5+, as PBMC estimuladas por mitogénio exibiram padrões diferentes de revelação pelos mAbs anti-CCR5. Os 2D7 e PA14 revelaram >20 %, os PA11 e PA12 revelaram ~10 %, os PA8, PA9 e PAIO revelaram <5 % de PBMC (Fig. 1) . As intensidades médias de fluorescência das PBMC reveladas foram cerca de dez vezes inferiores às obtidas com células L1.2-CCR5* para cada mAb; a sua ordem de classificação foi (2D7>) PA14> PAI2- PA11~ ΡΑΙΟ- PA9-PA8. Mais uma vez, isto diferiu algo da ordem de reactividades observada em transfectantes CCR5. A diferença entre a m.f.i. do PA9 e a m.f.i. do PA14 foi de sete vezes. Outros grupos experimentaram diferenças semelhantes na capacidade dos mAbs anti-CCR5 para revelar linhagens de células CCR5+ estáveis por oposição às PBMC (28). Isto pode ser devido a diferenças inerentes às células na conformação do CCR5, a modificação pós-tradução ou oligomerização. Alternativamente, a associação com outras moléculas da superfície da célula pode diferir entre células. Uma vez que uma escolha óbvia para uma tal molécula seria o antigénio da superfície celular CD4, o qual está ausente 32 nas células L1.2-CCR5+ e presente nas PBMCs, nós também avaliamos as capacidades dos PA8-PA12, PA14 e 2D7 para revelar as células HeLa que expressam transitoriamente o CCR5 sozinho ou com o CD4. Não foram observadas diferenças na capacidade de qualquer um dos mAbs para revelar o CCR5 da superfície celular na presença de CD4 (dados não apresentados). Se existe uma associação entre estas duas proteínas, ela não envolve determinantes antigénicos reconhecidos pelos mAbs anti-CCR5 que temos disponíveis. Alternativamente, uma associação entre o CCR5 e o CD4 só pode ocorrer em linfócitos primários. 3) Mapeamento do determinante antigénico dos mAbs utilizando mutantes de alanina do CCR5

Nenhum dos anticorpos foi capaz de detectar proteína CCR5 reduzida e desnaturada por transferência de Western indicando que eles reconhecem determinantes antigénicos conformacionalmente sensíveis (dados não apresentados). Os estudos de mapeamento do determinante antigénico do mAb foram realizados utilizando um painel de setenta mutantes pontuais de alanina de resíduos nas Nt e ECLs de CCR5. As células HeLa foram lipofectadas com CCR5 de tipo mutante ou natural que codifica sequências anexadas possuindo etiquetas HA C-terminais, e infectadas com vTF7 (23) para estimular a expressão do co-receptor. As células foram depois incubadas com os mAbs anti-CCR5 e a sua ligação foi revelada por uma IgG anti-ratinho de cabra marcada com PE. Realizou-se uma segunda revelação intracelular com um mAb anti-HA marcado com FITC (BabCo). Este controlo interno permitiu-nos normalizar directamente a revelação com os mAbs anti-CCR5 para os níveis de expressão do co-receptor mutante na superfície da célula. Assim, a ligação do mAb a 33 cada mutante é exprimida como uma percentagem da ligação ao CCR5 natural (Fig. 4).

Determinadas mutações pontuais reduziram a ligação de todos os anticorpos ao CCR5 em >50 %. Duma maneira geral, os PA8-PA12 foram os mais afectados, os PA14 e 2D7 os menos afectados por esta classe de mutantes, os quais incluíram o par de cisteínas C101A e C178A, os mutantes na Nt Y10A, D11A, K25A, o mutante na ECL1 D95A, os mutantes na ECL2 K171A/E172A, Q188A, K191A/N192A, e os mutantes na ECL3 F263A e F264A (Fig. 4) . Uma interpretação é que estes resíduos não fazem parte dos determinantes antigénicos do mAb per se, mas ao alterá-los para alaninas provoca perturbações conformacionais que têm um efeito comum na ligação de todos os mAbs. Nós assumimos que se uma mutação reduzia a ligação de um mAb individual em >75 % e não reduzia também a ligação da maior parte dos outros anticorpos, o resíduo era provavelmente um contribuidor directo para o determinante antigénico reconhecido pelo mAb. Utilizando estas directrizes rigorosas concluiu-se que os sete mAbs anti-CCR5 reconheciam determinantes antigénicos sobreponíveis mas distintos (Fig. 4). A ligação do mAb PA8 ao CCR5 dependia dos N13 e Y15 na Nt. A ligação dos mAb PA9 e PAIO requeriam os D2, Y3, Q4, P8 e N13 na Nt, e Y176 e T177 na ECL2. A ligação do mAb PA9 também requeria o S7 na Nt. A ligação dos mAb PA11 e PA12 dependiam do Q4 na Nt. Ο PA14 requeria o D2 na Nt, e os R168 e Y176 na ECL2. Finalmente, o mAb 2D7 requeria o Q170 e K171/E172 na ECL2 para se ligar ao CCR5. 4) Sinalização de quimiocina na presença de mAbs anti-CCR5

Os agentes de ligação ao receptor de quimiocina podem ser antagonistas ou, mais raramente, agonistas da sinalização 34 intracelular mediada pelo receptor. Alternativamente, eles poderiam não ter qualquer efeito na sinalização. 0 CCR5 é capaz de liqar três quimiocina-CC, RANTES, ΜΙΡ-Ια e ΜΙΡ-1β, e efectuar a transdução de um sinal que modula os níveis citosólicos de cálcio. Por conseguinte nós testamos a actividade agonista/antagonista de várias concentrações de mAbs PA8-PA12, PA14 e 2D7. As alterações nas concentrações intracelulares de cálcio, (Ca2+)i, foram medidas em células LI.2-CCR5+ carregadas com Indo-1. Nenhum dos mAbs estimulou uma alteração na (Ca2+)i, indicando que eles não são agonistas para o CCR5. Os PA8-PA12 foram também incapazes de inibir os fluxos de Ca2+ induzidos pela RANTES (Fig. 5A e dados não apresentados), até mesmo as concentrações tão elevadas quanto 100pg/mL, mostrando que eles também não são antagonistas. Estas concentrações proporcionam ligação de saturação dos mAbs às células Ll.2-CCR5+, como se demonstrou por citometria de fluxo e pelo ensaio de ligação gpl20/CCR5 (Fig. 6D e dados não apresentados). No entanto os mAbs PA14 e 2D7 bloquearam a mobilização de cálcio induzida pela RANTES, embora com potências diferentes (Fig. 5A, B) . A IC5o para inibição do influxo de cálcio pelo PA14 foi de 50pg/mL, a qual foi aproximadamente 8 vezes superior à lC5o para o 2D7 (Fig. 5B). Os fluxos de cálcio induzidos pelas RANTES, ΜΙΡ-Ια e MIP-Ιβ foram inibidos cada um por concentrações semelhantes de PA14 (dados não apresentados). Nenhum dos mAbs afectou a mobilização de cálcio induzida pela SDF-1 nas células L1.2-CCR5+, as quais expressam endogenamente o CXCR4 (dados não apresentados). Finalmente, nem os mAbs nem as quimiocina-CC afectaram os níveis citosólicos de cálcio nas células Ll.2 parentais (dados não apresentados). 35 5) Inibição da função co-receptora do CCR5 pelos mAbs

Os mAbs PA8-PA12 e PA14 foram inicialmente seleccionados com base na sua capacidade para inibir a fusão célula-célula mediada pelo envelope do VIH-1. Esta actividade foi confirmada e quantificada para os mAbs purificados. Como esperado, todos os seis mAbs, bem como o mAb 2D7, bloquearam a fusão entre as células PM1 CD4+CCR5+ e as células HeLa-EnVJR-FL+ no ensaio RET. A ordem de classificação da potência foi 2D7-PA14> PA12> PA11> PAIO" PA9- PA8 (Fig. 6A) . Os valores de IC50 para os PA14 e 2D7 foram de e l,6μq/mL respectivamente, para os PA11 e PA12 estes foram de 25,5μς/πΛ e ΙΟ,Ομρ/πΛ respectivamente (Fig. 3). Os PA8, PA9 e PAIO inibiram a fusão apenas em 10-15 % a 300μρ/πΛ. Nenhum dos mAbs afectou a fusão entre as células PMl e as células HeLa-EnvLAI, as quais expressam a proteína inteira do envelope de um vírus X4 (dados não apresentados) .

Também se avaliou a capacidade dos vários mAbs anti-CCR5 para inibir a entrada de um vírus R5 prototípico, JR-FL, e um vírus R5X4, Gun-1, num único ciclo de replicação, no ensaio de entrada à base de luciferase. A ordem de classificação da potência no ensaio de entrada foi semelhante à determinada no ensaio de fusão célula-célula (Fig. 6B) . Não se conseguiu obter uma inibição >50 % da entrada da JR-FL ou Gun-1 com os PA8-PA11. O valor de IC50 para ο PA12 foi de 2,5μρ/ιημ. No entanto não se conseguiu obter uma inibição de entrada >60 % com este mAb. Os valores de IC5o para a inibição da entrada da JR-FL pelos PA14 e 2D7 foram determinados como sendo de 0,024 e 0,026 \iq/mL respectivamente (Fig. 3), e foram 60 vezes inferiores aos obtidos no ensaio de fusão. A entrada da Gun-1 trópica 36 dupla foi 2-3 vezes mais sensível à inibição pelos mAbs anti-CCR5 do que a entrada da JR-FL (dados não apresentados).

Os mAbs anti-co-receptores podem inibir a fusão mediada pelo envelope quer afectando directamente a interacção gpl20/CCR5 quer impedindo os passos subsequentes à ligação na formação de um complexo de fusão activo. Para determinar o mecanismo de inibição da fusão e entrada virais pelos PA8-PA12 e PAI4, avaliou-se a capacidade dos vários mAbs para bloquear a interacção gpl20/CCR5. Para esta finalidade utilizou-se um ensaio que detecta a ligação de gpl20 de VIH-1 jr-fl biotinilada complexada com sCD4 às células L1.2-CCR5+. Não se observou qualquer ligação de gpl20 biotinilada na ausência de sCD4 ou CCR5, ou quando se utilizou gpl20m de VIH-Ilai (Fig. 6C) . À excepção do PA8, todos os mAbs anularam a ligação de gpl20/sCD4 às Ll.2-CCR5+ (Fig. 6D) . A inibição pelo PA8 saturou a -40 %, o que concorda com os dados de citometria de fluxo (Fig. 1) sugerindo que este mAb se liga apenas a um subconjunto de moléculas de CCR5 nas células L1.2-CCR5+. Os mAbs PA9, PAIO, PAll e PA12 inibiram a ligação com valores de IC50 de 0,24, 0,13, 0,33, 0,24pg/mL respectivamente (Fig. 3). Surpreendentemente, os mAbs PA14 e 2D7 foram os dois inibidores menos eficientes da ligação à gpl20/sCD4, com valores de IC50 de 1,58 e 1,38 pg/mL respectivamente (Fig. 3). Por conseguinte, não houve qualquer correlação entre a capacidade de um mAb para inibir a fusão da membrana e entrada mediada pelo gpl20/CD4/CCR5 e a sua capacidade para bloquear a ligação da gpl20/sCD4 ao co-receptor. 37 6) Inibição sinérgica da fusão do VIH-1 por combinações de mftbs anti-CCR5 e outros inibidores da entrada virai

Os agentes específicos para o co-receptor podem actuar em etapas múltiplas do processo de entrada e apresentar efeitos não aditivos quando utilizados em associação. De uma perspectiva clínica é importante determinar as interacções de candidatos farmacológicos específicos para o co-receptor com quimiocinas endógenas, as quais possam proporcionar algum nível de protecção contra a progressão da doença. Assim, avaliou-se os mAbs contra o CCR5 associados uns aos outros ou com RANTES, ou com CD4-IgG2, os quais se ligam à gpl20 do VIH-1 para inibir a ligação às células alvo. Obteve-se curvas dose-resposta para os agentes utilizados individualmente e associados em ensaios de fusão e entrada virai. Analisou-se os dados utilizando o princípio do efeito da mediana (9). Comparou-se quantitativamente as concentrações de agentes simples ou suas misturas necessárias para produzir um dado efeito num termo conhecido como o índice de Combinação (Cl). Um valor de Cl maior do que 1 indica antagonismo, Cl - 1 indica um efeito aditivo e Cl < 1 indica um efeito sinérgico em que a presença de um agente intensifica o efeito do outro.

As associações de PA12 e 2D7 foram as mais fortemente sinérgicas, com valores de Cl a variar entre 0,02 e 0,29, dependendo da proporção dos anticorpos (Fig. 7 e Fig. 2) . Sabe-se que o grau de sinergia varia com a estequiometria dos agentes. Os ensaios de entrada e fusão virai foram geralmente coerentes na identificação de associações de mAb que são extremamente sinérgicas, PA12 e 2D7; moderadamente sinérgicas, PA12 e PA14; aditivas, PAll e PA12; e fracamente antagonistas, PA14 e 2D7. A ausência de sinergia entre os PA14 e 2D7 não é surpreendente uma vez que estes 38 mAbs competem de forma cruzada para ligação às células CCR5+ como determinado por citometria de fluxo (dados não apresentados). A observação de um efeito aditivo dos PA11 e PA12 pode ser uma indicação que estes mAbs se ligam a determinantes antigénicos ligeiramente diferentes no CCR5, ao mesmo tempo que partilham uma dependência do resíduo Q4 na Nt.

Avaliou-se também a capacidade dos mAbs PAI2, PA14 e 2D7 para ter um efeito sinérgico com a RANTES no bloqueio da fusão célula-célula. As associações de PA12 e RANTES apresentaram uma sinergia moderada (Fig. 2) . Os PA14 e 2D7 não exibiram qualquer sinergia com a RANTES, o que é coerente com o facto de estes mAbs serem inibidores da ligação e sinalização da RANTES (Fig. 5A, B) . Finalmente, nós avaliamos a sinergia entre os mAbs PAI2, PAI4, 2D7 e CD4-IgG2, o qual interactua com a gpl20. Nós observamos uma sinergia moderada entre ο PA12 e CD4-IgG2 mas nenhuma sinergia entre ο PA14 ou 2D7 e CD4-IgG2 (Fig. 2).

Discussão Experimental

Isolou-se e caracterizou-se seis mAbs anti-CCR5 de IgGl de murídeo. Enquanto os PA8, PA9, PAll, PAI 2 e PA14 são espécies moleculares distintas, OS PA 9 e PAIO são indistinguíveis pelas análises e são, desse modo, provavelmente o mesmo mAb. Todos os mAbs que foram isolados reconhecem determinantes antigénicos conformacionais complexos, como é frequentemente o caso de mAbs gerados contra proteínas naturais da superfície celular. Efectuou-se o mapeamento do determinante antigénico para todos os mAbs utilizando um painel de mutantes pontuais de alanina do CCR5. Assumiu-se que os resíduos que afectam de modo semelhante a ligação de todos os mAbs provocam perturbações 39 conformacionais no co-receptor e não fazem parte dos determinantes antigénicos do mAb. Verificou-se que apenas dois desses resíduos, Y10 e Dll, afectam a entrada do VIH-1 (20, 52). Os determinantes antigénicos dos PA8, PAll e PA12 estão localizados exclusivamente no domínio Nt. Coerentemente com este resultado, ο PA8 foi capaz de ligar um péptido Nt biotinilado, contendo os resíduos D2 até R31, num ELISA (dados não apresentados). No entanto, os PAll e PAI2, cuja ligação depende fortemente apenas do Q4, não ligaram o péptido Nt em solução (dados não apresentados). Uma possibilidade é que o péptido Nt não assuma a conformação apropriada para reconhecimento pelos PAll e PAI2, enquanto a ligação do PA8 pode ser menos dependente da conformação. Alternativamente, os PAll e PA12 podem interagir com resíduos que nós não mutamos, ou formar ligações fracas com aminoácidos localizados noutros domínios do CCR5, ou ligar átomos do esqueleto do péptido cuja apresentação pode permanecer inalterada por mutagénese. Os anticorpos PA9, PAIO e PA14 reconheceram determinantes antigénicos que incluíam resíduos nos domínios Nt e ECL2 do CCR5, enquanto o determinante antigénico do 2D7 estava exclusivamente localizado na ECL2. O determinante antigénico do PA14 compreende o D2 na Nt e o R168 na ECL2 indicando que estes dois resíduos estão próximos um do outro no contexto de uma área útil de cobertura do mAb. Eles podem até mesmo interagir um com o outro através das suas cargas opostas.

Os mAbs PA8-PA12 e PA14 revelaram células CCR5+ com intensidades diferentes e de um modo dependente do tipo de célula. Todos os mAbs excepto ο PA8 revelaram >90 % das células L1.2-CCR5+, tendo-se observado a intensidade média 40 de fluorescência mais elevada para os PA11 e PA12. No entanto, os PA14 e 2D7 revelaram a percentagem mais elevada de PBMC e também produziram as intensidades médias de fluorescência mais elevadas nestas células. Hill et al. (28) caracterizaram recentemente um painel de mAbs anti-CCR5 que revelaram de modo semelhante células transfectadas, mas apenas dois em oito revelaram PBMC, e nenhum revelou monócitos primários. Uma afinidade baixa para o CCR5 contribuiu provavelmente para a não reactividade de dois dos mAbs com células primárias, mas é inverosímil que esta explique a incapacidade das outras quatro para reagir. No nosso painel de mAb, nós observamos a revelação mais intensa das PBMC pelos mAbs 2D7 e PA14 que têm determinantes antigénicos localizados total ou parcialmente nos primeiros dez resíduos da ECL2. No entanto, Hill et al. referem que os mAbs específicos para as Nt e ECL1 revelam as PBMCs, enquanto os mAbs para as ECL2 e ECL3 não revelam as PBMC, pelo que não foi identificado um padrão coerente de reactividade. Uma explicação para a revelação específica em relação ao tipo de célula pelos mAbs seria que as PBMCs (e monócitos) activadas segregam quimiocinas-CC que se ligam ao CCR5 da superfície celular, mascarando alguns determinantes antigénicos de mAb. No entanto, esperar-se-ia que isto fosse especialmente verdadeiro para os PA14 e 2D7, os quais são antagonistas da mobilização de cálcio induzida por quimiocinas e provavelmente competem com as quimiocinas-CC para ligação ao CCR5. Mesmo assim estes mAbs revelam as PBMC de modo muito intenso. Alternativamente, a exposição diferencial do determinante antigénico do CCR5 pode reflectir a oligomerizaçâo do receptor específica para o tipo de célula, a associação com outras moléculas da superfície celular ou modificações pós-tradução diferentes 41 tais como glicosilação. Nós demonstramos que as diferenças na ligação do mAb provavelmente não reflectem diferenças especificas ao tipo de célula nas interacções CD4/CCR5.

Os mAbs PA8-PA12 não inibiram a mobilização de cálcio induzida por quimiocina-CC nas células CCR5+, nem mediaram a sinalização através do CCR5. Os mAbs 2D7 e PA14 foram inibidores da mobilização de cálcio induzida por quimiocina-CC, mas o 2D7 foi quase uma ordem de grandeza mais potente do que o PAI4. Isto pode ser porque o determinante antigénico do PA14 sobrepõe-se menos ao domínio de ligação de quimiocina-CC no CCR5 do que o determinante antigénico do 2D7. Todos os mAbs também bloquearam a entrada do VIH-1 e a fusão da membrana mediada pelo envelope, mas a inibição da fusão célula-célula requereu em alguns casos quase duas ordens de grandeza mais anticorpo do que aquele que era necessário para bloquear a entrada virai. Presumivelmente são estabelecidas mais interacções gpl20/CD4/CCR5 assim como interacções entre moléculas de adesão que actuam cooperativamente durante a fusão célula-célula, relativamente à fusão vírus-célula, tornando-a mais difícil de inibir. Isto é geralmente observado com anticorpos para a LFA-1 ou para a glicoproteína do envelope de VIH-1 (45, 51) . Os PA8, PA9 e PAIO foram incapazes de bloquear a fusão célula-célula em >15 % e a entrada virai em >40 %, mesmo às concentrações mais elevadas de anticorpo. No entanto podia obter-se >90 % de inibição da fusão com os PA11, PA12 e PA14 e podia obter-se >90 % de inibição de entrada com o PAI4. O mais potente dos seis mAbs no bloqueamento da fusão e entrada foi ο PA14, o qual foi tão eficaz quanto o 2D7. Surpreendentemente, os PA14 e 2D7 estiveram entre os inibidores menos potentes da ligação de gpl20/sCD4 às 42 células L1.2-CCR5+, enquanto os PA9-PA12 bloquearam com potências semelhantes e ο PA8 foi incapaz de bloquear >40 % da ligação de gpl20/sCD4. Estas observações levantam questões sobre a natureza das moléculas de CCR5 apresentadas em células diferentes e sobre os mecanismos de inibição da fusão e entrada virai. Pode ser que o CCR5 nas células L1.2, utilizadas nos ensaios de ligação de mAb e gpl20, não esteja nas PBMC, utilizadas no ensaio de ligação ao mAb, numa conformação idêntica ao CCR5, ou ao CCR5 nas células PM1 e U87MG utilizadas nos ensaios de fusão e entrada. A revelação baixa das PBMC e a inibição parcial da fusão e entrada por alguns dos nossos mAbs indicam que eles são apenas capazes de se ligarem a um subconjunto de moléculas de CCR5 expressadas em linhagens de células de linfócitos primários, PM1 e U87MG-CD4+CCR5+. Mesmo assim, todos os mAbs, à excepção do PA8, são capazes de revelar >90 % das células Ll.2-CCR5+ e de bloquear completamente a ligação do complexo de gpl20/sCD4 a estas células. Pelo menos uma diferença entre as L1.2-CCR5+ e as outras células que nós utilizamos é a densidade da proteína do co-receptor na superfície da célula. De facto, nós estimamos que as células L1.2-CCR5+ expressam 10 a 100 vezes mais de co-receptor na superfície celular do que as células PM1 e U87MG-CD4+CCR5+. Mas quando são manipuladas células HeLa para expressar transitoriamente tanto co-receptor quanto a linhagem de células L1.2-CCR5"1", nós continuamos a ser incapazes de detectar a ligação de gpl20/sCD4 àquelas (dados não apresentados). A sobre-expressão de CCR5 nas Ll.2, juntamente com outros factores específicos da célula, pode favorecer uma conformação do co-receptor que exponha proeminentemente a Nt, tornando-a mais acessível tanto aos 43 mAbs como à gpl20. Uma tal conformação pode ser induzida por oligomerização do receptor, por associações diminuídas ou alteradas com as proteínas da superfície celular ou por interacções do receptor com proteínas G (25, 62). Coexistem conformações múltiplas de CCR5 na superfície celular, e são todas elas permissivas à entrada virai? Os padrões de reactividade do mAb sugerem que assim seja, uma vez que entrada e fusão do VIH-1 pode ocorrer, embora a níveis reduzidos, na presença de concentrações de mAb que saturam os determinantes antigénicos necessários para ligação da gpl20 às células L1.2-CCR5+. Nós favorecemos a hipótese de que as moléculas de co-receptor presentes nas células L1.2-CCR5+ possuem uma conformação competente à entrada do VIH-1 enquanto as moléculas de CCR5 nas PBMC, PM1 e U87MG CCR5+ existem em vários estados competentes à entrada que apresentam reactividades mAb diferentes. Apesar dos PAI4 e 2D7 puderem reconhecer todas as conformações, outros mAbs não podem. A razão pela qual as células L1.2 são favoráveis a uma conformação competente para a fusão particular permanece por esclarecer.

Foi demonstrado recentemente que o domínio de ligação da gpl20 se localiza nos primeiros vinte resíduos do domínio Nt do CCR5. Os mAbs para o domínio de ligação da gpl20 no CCR5 bloqueiam potentemente esta interacção mas não são de perto tão eficientes a inibir a fusão e entrada do VIH-1 nas células alvo quanto os PA14 e 2D7, cujos determinantes antigénicos se situam fora desta região. 0 PA14 reconhece a extremidade da Nt e resíduos na ECL2, enquanto o determinante antigénico do 2D7 se localiza exclusivamente na ECL2. 0 mecanismo de acçâo destes mAbs só pode ser especulado. Pode ser que a sua ligação aos primeiros resíduos da ECL2 induza alterações conformacionais no co- 44 receptor que impeça a fusão da membrana. Alternativamente, a obstrução dos determinantes antigénicos da ECL2 podem impedir a oligomerização do co-receptor e a formação de um complexo proteico competente para a fusão. Ainda uma outra possibilidade é que os resíduos na ECL2 fiquem virados para o interior do poro de fusão e a ligação dos mAbs impeça a gp41 de inserir o péptido de fusão na membrana do plasma. Pelo contrário, os mAbs PA8-PA12 inibem provavelmente a fusão e entrada apenas competindo directamente para a ligação com os complexos de gpl20/CD4. Nós não sabemos se existem outros parâmetros para além da exposição do determinante antigénico e a afinidade para o CCR5 que determinem a eficácia da inibição da entrada virai por estes mAbs. Não é evidente por que razão a inibição dos passos subsequentes à interacção gpl20/co-receptor seria mais eficiente do que o bloqueamento directo dessa interacção. Uma maneira de explicar isto consistiria em assumir que a velocidade de dissociação da ligação da gpl20 ao CCR5 é muito menor do que a velocidade de ligação do mAb ao CCR5. Deste modo, de cada vez que um mAb se dissocia de uma molécula do co-receptor, uma molécula de gpl20 associada a virião substituiu-o de um modo quase irreversível uma vez que esta interacção conduz à fusão da membrana. A sinergia entre associações de mAbs anti-CCR5 é provavelmente o resultado das suas interacções com determinantes antigénicos distintos que estão envolvidos em passos consecutivos, interdependentes na entrada do VIH-1. 0 grau de sinergia observado entre os PA12 e 2D7 (CI<0,1 em muitas circunstâncias) é extraordinário uma vez que valores de Cl <0,2 são raramente observados para associações de anticorpos anti-VIH-1 (33, 35, 61), inibidores da 45 transcriptase inversa (29) ou inibidores da protease (44). Devido à sua potência, a associação PA12:2D7 foi examinada em formatos de ensaio e proporções de concentração múltiplos, para os quais se observou consistentemente níveis elevados de sinergia. Observou-se uma sinergia moderada para ο PA12 associado a PA14. Nós também observamos uma sinergia moderada entre os PA12 e CD4-IgG2. 0 complexo CD4/gpl20 é metastável e se ele for incapaz de interactuar com um co-receptor, decai para um estado não fusogénico (45-48) . Uma vez que ο PA12 bloqueia directamente o sítio de ligação da gpl20 no CCR5, a sua presença pode deslocar o equilíbrio na direcção da inactivação do complexo de gpl20/CD4. Isto explicaria a razão por que nós observamos sinergia entre a CD4-IgG2 e o mAb PA12 relativamente à inibição da fusão e entrada. A ausência de sinergia entre o mAb PA14 e CD4-IgG2 sugere que eles actuam em dois passos não consecutivos e independentes da entrada virai. Será necessária uma combinação de estudos adicionais para determinar os mecanismos exactos de sinergia dos vários compostos relativamente à inibição da fusão e entrada virai.

Os resultados anteriores são coerentes com um modelo em que a entrada do VIH-1 ocorre em três passos distintos envolvendo ligação do receptor, ligação do co-receptor e fusão da membrana mediada pelo co-receptor. Eventos separados de ligação ao co-receptor e fusão são sugeridos pela falta de correlação entre as capacidades dos anticorpos monoclonais para bloquear a ligação da gpl20 e a fusão/entrada do VIH-1. A cronologia de eventos durante a fusão é ainda sugerida pelos padrões de sinergia observados. Os agentes, tal como o PAI2, que inibem de modo potente o passo central do processo, nomeadamente a ligação 46 da gp 120, actuam sinergicamente com os inibidores de passos precedentes e subsequentes.

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LISTAGEM DE SEQUÊNCIAS <110> Progénies Pharmaceuticals, Inc. OLSON, WILLIAM C. MADDON, PAUL J. 58

<12Ο> INIBIÇÃO SINÉRGICA DA FUSÃO E LIGAÇÃO DO VIH-1, COMPOSIÇÕES e ANTICORPOS PARA ESSE FIM 58Met Asp Tyr Gin vai ser ser Pro lie Tyr Asp ile Asn Tyr Tyr Thr 15 10 15Ser Glu Pro Cys Gin Lys ile Asn Lys Gin ile Ala Ala Ala Arg 20 25 30

<210> 2 <211> 15 <212> PRT <213> HUMANA <130> 57 90 6-PCT-EPO Λ O i—1 V PCT/US99/30345 <141> 1999-12-16 Λ O LO 1—1 V US 09/212 793 <151> 1998-12-16 Λ o LO 1—1 V US 60/112 532 <151> 1998-12-16 <16 0 > 4 <17 0> Patentln versão 3.1 <210> 1 <211> 31 <212> PRT <213> HUMANA <4 0 0 > 1 <400> 2 59

His Tyr Ala Ala Ala Gin Trp Asp Phe Gly Asn Thr Met Cys Gin 15 10 15

<210> 3 <211> 27 <212> PRT <213> HUMANA <400> 3

Arg Ser Gin Lys Glu Gly Leu His Tyr Thr Cys ser ser His Phe Pro 15 10 15

Tyr ser Gin Tyr Gin Phe Trp Lys Asn Phe Gin 20 25

<210> 4 <211> 17 <212> PRT <213> HUMANA <400> 4

Gin Glu Phe Phe Gly Leu Asn Asn Cys Ser Ser ser Asn Arg Leu Asp 15 10 15

Gin

Lisboa, 29 de Novembro de 2007

Claims (15)

1 REIVINDICAÇÕES 1. Anticorpo monoclonal anti-receptor de quimiocina CCR5 ou um seu fragmento, em que o anticorpo ou seu fragmento se liga ao mesmo determinante antigénico que aquele ao qual se liga o anticorpo monoclonal PAI4, sendo ο PA14 o anticorpo monoclonal produzido por uma linhagem de células hibridoma depositada sob o N° de Acesso ATCC HB-12610 e designado PA 14.

2. Anticorpo monoclonal anti-receptor de quimiocina CCR5 da reivindicação 1.

3. Fragmento de anticorpo monoclonal anti-receptor de quimiocina CCR5 da reivindicação 1.

4. Anticorpo ou fragmento de qualquer uma das reivindicações 1-3, em que o anticorpo é humanizado.

5. Anticorpo ou fragmento de qualquer uma das reivindicações 1-4 compreendendo regiões determinantes de complementaridade (CDRs) derivadas do anticorpo monoclonal PA14 ou hibridoma.

6. Anticorpo da reivindicação 4, em que o anticorpo compreende uma grelha derivada de uma molécula de imunoglobulina humana.

7. Anticorpo da reivindicação 6, em que a molécula de imunoglobulina humana é seleccionada do grupo consistindo de IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgM. 2

8. Anticorpo da reivindicação 7, em que a molécula de imunoglobulina humana é IgG4.

9. Anticorpo da reivindicação 7, em que a molécula de imunoglobulina humana é IgG2.

10. Anticorpo ou fragmento das reivindicações 1-3, em que o anticorpo é um anticorpo quimérico.

11. Fragmento de anticorpo monoclonal da reivindicação 3, em que o fragmento é um fragmento monovalente.

12. Anticorpo monoclonal anti-receptor de quimiocina CCR5 da reivindicação 2 designado PAI4.

13. Anticorpo monoclonal anti-receptor de quimiocina CCR5 humanizado das reivindicações 4-9, em que o anticorpo é um anticorpo humanizado derivado do anticorpo monoclonal designado PA14.

14. Anticorpo monoclonal ou fragmento de qualquer uma das reivindicações 1-13 o qual se liga especificamente às células CCR5+.

15. Utilização do anticorpo monoclonal ou fragmento de qualquer uma das reivindicações 1-14 para a preparação de uma composição para inibir a fusão do VIH-1 e a entrada virai nas células CD4+. Lisboa, 29 de Novembro de 2007