JP2002538771A - Ｈｉｖ−１の融合及び付着の相乗的阻害、そのための組成物および抗体 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【課題】ＨＩＶ−１の融合及び付着の相乗的阻害、そのための組成物および抗体 【解決手段】本発明は、HIV-1感染を阻害するための組成物であって、HIV-1感染を阻害するために相乗的に有効な量の少なくとも二つの化合物を含有し、これら化合物の少なくとも一つは、HIV-1およびHIV-1融合の共同受容体の間の増殖的相互作用を阻害する組成物を提供する。本発明はまた、HIV-1またはHIV-1エンベロープ糖^＋タンパク質細胞の標的細胞への融合を阻害する組成物であって、HIV-1またはHIV-1エンベロープ糖タンパク質＋細胞の標的細胞への融合を阻害するために相乗的に有効な量の少なくとも二つの化合物を含有し、これら化合物の少なくとも一つは、HIV-1およびHIV-1融合の共同受容体の間の増殖的相互作用を阻害する組成物を提供する。本発明はまた、HIV-1に罹患した患者を治療する方法であって、前記患者に対して、前記組成物を投与することを含む方法を提供する。本発明はまた、患者がHIV-1に罹患するのを予防する方法であって、前記患者に対して、有効投与量の請求項１または２に記載の組成物を投与することを含む方法を提供する。本発明はまた、ＰＡ8、ＰＡ9、ＰＡ10、ＰＡ11、ＰＡ12、およびＰＡ14からなる群から選択される抗CCR5モノクローナル抗体を提供する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本願は、１９９８年１２月１６日に出願された米国出願第０９／２１２，７９
３号、及び１９９８年１２月１６日に出願された米国仮出願第６０／１１２，５
３２号の優先権を主張し、それらの内容を参考文献として本明細書に組み込む。

【０００２】 本出願を通じて、様々な文献がアラビア数字によって参照される。これらの文
献の完全な引用は、特許請求の直前にある明細書の末尾に記載されているであろ
う。本発明が属する技術分野をより完全に記載するために、これらの文献の開示
内容を参考文献として本明細書に組み込む。

【０００３】

【発明の背景】

ヒト免疫不全ウイルス１型（ＨＩＶ−１）は、ウイルス−細胞膜融合を誘導し
て、標的細胞の中に侵入する（８、１５、６６）。ビリオンと細胞表面との最初
の高親和性の相互作用は、ウイルス表面糖タンパク質ｇｐ１２０のＣＤ４抗原へ
の結合である（１３、３０、４１、４２）。続いて、これは、ｇｐ１２０の高次
構造の変化をもたらし、それにより、幾つかのケモカイン受容体のうちの１つと
相互作用することが可能となる（４、５、２１、３６）。ＣＣ−ケモカイン受容
体ＣＣＲ５は、主要なマクロファージ指向性（Ｒ５）の株に対する補助受容体（
ｃｏ−ｒｅｃｅｐｔｏｒ）であり、ＨＩＶ−１の性的伝染において決定的な役割
を果たしている（４、５、２１、３６）。Ｔ細胞系指向性（Ｘ４）ウイルスは、
ＣＸＣＲ４を使用して標的細胞に侵入し、通常（常にではない）、病状の進行し
た後期に出現するか、又は組織培養におけるウイルス増殖の結果として出現する
（４、５、２１、３６）。幾つかの一次ＨＩＶ−１分離株は、常に同じ効率とい
うわけではないが、両補助受容体を使用することができるので（１１、５７）、
二重指向性（Ｒ５Ｘ４）である。突然変異導入実験をｇｐ１２０コア結晶構造の
解析と組み合わせることによって、ｇｐ１２０上の補助受容体結合部位は、数個
の保存された残基を包含していることが実証された（３２、５３、６５）。

【０００４】 ＣＣＲ５のアミノ末端ドメイン（Ｎｔ）中のチロシン及び負に帯電した残基が
、ｇｐ１２０の補助受容体への結合、及びＨＩＶ−１の融合と侵入に不可欠であ
ることが実証されている（６、１８、２０、２２、２８、３１、５２、５４）。
ＣＣＲ５の細胞外ループ（ＥＣＬ；ｅｘｔｒａｃｅｌｌｕｌａｒ ｌｏｏｐ）１
〜３の中に存在する残基は、補助受容体の機能に不可欠というわけではないが、
ウイルスの融合と侵入を最適にするためには、ＣＣＲ５のドメイン間立体配置が
、保持される必要がある（２４）。これにより、ｇｐ１２０は、ＥＣＬ上の拡散
性表面との相互作用を形成するか、又はＥＣＬ中の残基との結合によって、Ｎｔ
の機能的な高次構造が維持されるという結論が導かれる。キメラ補助受容体と抗
ＣＣＲ５モノクローナル抗体を用いた研究も、ウイルスの侵入おける、細胞外ル
ープの重要性を示している（５、５４、６４）。

【０００５】 ＣＣＲ５及びＣＸＣＲ４に特異的に結合し、それらのリガンドとの相互作用を
遮断する分子は、補助受容体の構造機能相関をさらに探るための強力なツールで
ある。このような化合物を同定することは、補助受容体を介したウイルスの侵入
工程を標的とする効果的な治療剤をデザインするのにも役立ち得るであろう。こ
れまでに同定されたＣＣＲ５又はＣＸＣＲ４補助受容体機能の阻害剤は、実際に
は多岐にわたり、小分子、ペプチド、ケモカインとそれらの誘導体、及びモノク
ローナル抗体（ｍＡＢｓ）が含まれる。ＣＸＣＲ４補助受容体の機能を妨害する
ことによって、侵入を遮断する小分子の作用機序は、よく理解されていない（１
７、４９、５５、６８）。このような阻害剤の１つである、陰イオン性の小分子
ＡＭＤ３１００は、ＣＸＣＲ４のＥＣＬ２の中の残基及び第４膜貫通（ＴＭ；ｔ
ｒａｎｓ−ｍｅｍｂｒａｎｅ）ドメインに依存してウイルスの侵入を阻害するが
、ｇｐ１２０のＣＸＣＲ４への結合を破壊することによって、ウイルスの侵入を
阻止するのか、膜融合に至る結合後の段階を妨害することによって、ウイルスの
進入を阻止するのかは定かでない（１６、３４、５５）。これまでのところ、Ｃ
ＣＲ５を介したＨＩＶ１の侵入を特異的にブロックする小分子は報告されていな
い。ケモカインによるＨＩＶ−１の侵入の阻害は、ｇｐ１２０と補助受容体の相
互作用の妨害、及びケモカインと受容体の複合体の取り込みという少なくとも２
つの別個の機序によって媒介される（３、２６、５９、６３）。変異形ＡＯＰ−
ランテスは、ＣＣＲ５の細胞表面へのリサイクルも阻害する（４０、５６）。ラ
ンテス９−６８及びＭｅｔ−ランテスのような変異形は、ｇｐ１２０／ＣＣＲ５
相互作用を阻止するにすぎず、ＣＣＲ５をダウンレギュレートするわけではない
（６７）。ＳＤＦ−１変異形は、おそらく、同様の機序を介して作用し、ＣＸＣ
Ｒ４によって媒介されるウイルスの侵入をブロックする（１２、２７、３９）。
抗ウイルス特性を有する抗ＣＸＣＲ４ｍＡｂとしては、１２Ｇ５のみが同定され
ている。１２Ｇ５によるウイルスの侵入阻害効率は、細胞と分離株の両者に依存
すると報告されている（４３、５８）。このｍＡｂは、ＣＸＣＲ４のＥＣＬ２に
結合するが、侵入を阻害する機序は不明である（７）。これまでに同定された抗
ＣＣＲ５ｍＡｂには、ＨＩＶ−１の侵入を効率的に阻止するものは殆ど存在しな
い（２８、６４）。興味深いことに、ｇｐ１２０結合部位を含有するＣＣＲ５の
Ｎｔドメイン中にエピトープが存在するｍＡｂは、エピトープがＥＣＬ２に存在
するｍＡｂである２Ｄ７よりも、効率的に、ウイルスの融合と侵入を阻害できな
い。２Ｄ７は、ＣＣ−ケモカイン活性も拮抗する（６４）。

【０００６】 ＰＡ８、ＰＡ９、ＰＡ１０、ＰＡ１１、ＰＡ１２、及びＰＡ１４と表記される
一群の６つのマウスｍＡｂを単離し、それらの性質を決定した。６つのｍＡｂは
全て、異なる効率でＣＣＲ５^＋細胞に特異的に結合し、その効率は細胞の種類に
依存していた。エピトープマッピング研究によって、ｍＡｂの結合に重要な残基
が同定され、ＣＣＲ５細胞外ドメインの折り畳みと相互作用についての情報も明
らかとなった。全てのｍＡｂは、ＨＩＶ−１の融合と侵入を阻害したが、ｍＡｂ
が融合と侵入を阻害する能力と、ｇｐ１２０／ｓＣＤ４のＣＣＲ５^＋細胞への結
合を阻害する能力の間には、全く相関関係は存在しなかった。

【０００７】

【発明の概要】

本発明は、ＨＩＶ−１感染を阻害するための組成物であって、ＨＩＶ−１感染
を阻害するのに相乗的に有効な量の少なくとも２つの化合物を含み、前記化合物
のうちの少なくとも１つが、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−１融合補助受容体との増殖性
相互作用を妨げる組成物を提供する。

【０００８】 本発明は、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質^＋細胞の標的
細胞への融合を阻害する組成物であって、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−１エンベロー
プ糖タンパク質^＋細胞の標的細胞への融合を阻害するのに相乗的に有効な量の少
なくとも２つの化合物を含み、前記化合物のうちの少なくとも１つが、ＨＩＶ−
１とＨＩＶ−１融合補助受容体との増殖性相互作用を妨げる組成物も提供する。

【０００９】 本発明は、ＨＩＶ−１に罹患した患者を治療する方法であって、有効量の前記
組成物を前記患者に投与することを備えた方法も提供する。

【００１０】 本発明は、対象がＨＩＶ−１に罹患するのを予防する方法であって、有効量の
前記組成物を前記対象に投与することを備えた方法も提供する。

【００１１】 本発明は、ＰＡ８、ＰＡ９、ＰＡ１０、ＰＡ１１、ＰＡ１２、及びＰＡ１４か
らなる群から選択される抗ＣＣＲ５モノクローナル抗体も提供する。

【００１２】

【発明の詳細な記述】

本発明は、ＨＩＶ−１感染を阻害するための組成物であって、ＨＩＶ−１感染
を阻害するのに相乗的に有効な量の少なくとも２つの化合物を含み、前記化合物
のうちの少なくとも１つが、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−１融合補助受容体との増殖性
相互作用を妨げる組成物を提供する。

【００１３】 本明細書で使用する「組成物」とは、混合物を意味する。組成物には、患者へ
の経口、直腸、膣内、局所、鼻、眼、又は非経口投与に適したものが含まれるが
、それらに限定されない。本明細書で使用する「非経口」には、皮下、静脈内、
筋肉内、又は胸骨内注射又は注入手法が含まれるが、それらに限定されない。

【００１４】 本明細書で使用する「ＨＩＶ−１」とは、ヒト免疫不全ウイルス１型を意味す
る。ＨＩＶ−１には、ＨＩＶ−１に感染した細胞内に見出されるＨＩＶ−１の細
胞外ウイルス粒子及び形態が含まれるが、それらに限定されない。

【００１５】 本明細書で使用する「ＨＩＶ−１感染」とは、例えば、標的細胞膜のＨＩＶ−
１又はＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質^＋細胞との融合による、ＨＩＶ−１
遺伝情報の標的細胞中への導入を意味する。標的細胞は、患者の身体の細胞であ
り得る。好ましい態様では、前記標的細胞は、ヒト患者からの身体の細胞である
。

【００１６】 本明細書で使用する「ＨＩＶ−１感染を阻害する」とは、前記組成物がない場
合に導入されるであろう量と比べて、標的細胞集団に導入されたＨＩＶ−１の遺
伝情報の量が減少することを意味する。

【００１７】 本明細書で使用する「化合物」とは、ペプチド、ポリペプチド、及び他の有機
又は無機分子、及びそれらの組合せを含む（これらに限定されない）分子体（ｍ
ｏｌｅｃｕｌａｒ ｅｎｔｉｔｙ）を意味する。

【００１８】 本明細書で使用する「相乗的に有効な」とは、組み合わせて使用したときに、
化合物の総効果が、各別に使用したときのそれらの加算的効果よりも大きいこと
を意味する。

【００１９】 本明細書で使用する「増殖性相互作用（ｐｒｏｄｕｃｔｉｖｅ ｉｎｔｅｒａ
ｃｔｉｏｎ）」とは、ＨＩＶ−１とＨＩＶ−１補助受容体の相互作用が、前記Ｈ
ＩＶ−１又はＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質^＋細胞と補助受容体を有する
膜との融合をもたらすであろうということを意味する。

【００２０】 本明細書で使用する「増殖性相互作用を妨げる」とは、相互作用の量が、化合
物がない場合に生じるであろう量と比べて減少することを意味する。前記相互作
用は、補助受容体又はＨＩＶ−１上の相互作用領域をマスクし、若しくは変化さ
せることによって、又は補助受容体の発現、凝集、コンフォメーション、又は会
合状態を変化させることによって妨げられ得る。

【００２１】 本明細書で使用する「ＨＩＶ−１融合補助受容体」とは、前記受容体を発現す
る標的細胞とＨＩＶ−１又はＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質⁻細胞との融
合を媒介する細胞の受容体を意味する。ＨＩＶ−１融合補助受容体には、ＣＣＲ
５、ＣＸＣＲ４、及び他のケモカイン受容体が含まれるが、これらに限定されな
い。

【００２２】 本発明は、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質^＋細胞の標的
細胞への融合を阻害する組成物であって、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−１エンベロー
プ糖タンパク質^＋細胞の標的細胞への融合を阻害するのに相乗的に有効な量の少
なくとも２つの化合物を含み、前記化合物のうちの少なくとも１つが、ＨＩＶ−
１とＨＩＶ−１融合補助受容体との増殖性相互作用を妨げる組成物も提供する。

【００２３】 本明細書で使用する「融合」とは、哺乳動物の細胞又はＨＩＶ−１のようなウ
イルス上に存在する脂質二重膜の併合（ｊｏｉｎｉｎｇ）又は合体（ｕｎｉｏｎ
）を意味する。本工程は、ＨＩＶ−１の標的細胞への付着（ａｔｔａｃｈｍｅｎ
ｔ）とは異なる。付着は、ＨＩＶ−１外部糖タンパク質のヒトＣＤ４受容体（こ
れは、融合補助受容体ではない）への結合によって媒介される。

【００２４】 本明細書で使用する「阻害する」とは、阻害物がない場合に起こるであろう量
と比べて、量が減少することを意味する。

【００２５】 本明細書で使用する「標的細胞」とは、ＨＩＶ−１又はＨＩＶ−１感染細胞に
よって感染され得る、又はＨＩＶ−１又はＨＩＶ−１感染細胞と融合し得る細胞
を意味する。

【００２６】 本明細書で使用する「ケモカイン」とは、白血球の移動を刺激することができ
るサイトカインを意味する。それらは、アミノ末端の２つのシステイン残基が直
接隣接しているか、１つのアミノ酸によって隔てられているかに応じて、ｃｙｓ
−ｃｙｓ又はｃｙｓ−Ｘ−ｃｙｓの何れかと特定され得る。ランテス、ＭＩＰ−
１α、ＭＩＰ−１β、ＳＤＦ−１、又はＨＩＶ−１感染をブロックする他のケモ
カインが含まれるが、それらに限定されない。

【００２７】 上記組成物のある態様においては、前記補助受容体は、ケモカイン受容体であ
る。上記組成物の好ましい態様においては、前記ケモカイン受容体は、ＣＣＲ５
又はＣＸＣＲ４である。幾つかの他のケモカイン及び関連受容体は、ＣＣＲ２、
ＣＣＲ３、ＣＣＲ８、ＳＴＲＬ３３、ＧＰＲ−１５、ＣＸ３ＣＲ１、及びＡＰＪ
を含む（これらに限定されない）ＨＩＶ補助受容体として機能することが知られ
ている（６９）。

【００２８】 本明細書で使用する「ケモカイン受容体」とは、ケモカインを結合する７回膜
貫通細胞表面タンパク質の相同なファミリーのメンバーを意味する。

【００２９】 本明細書で使用する「ＣＣＲ５」とは、ケモカインのＣ−Ｃ基のメンバーを結
合し、そのアミノ酸配列が、Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号１７０５８９６に提供され
たアミノ酸配列を含むケモカイン受容体及び関連の多型変異種である。

【００３０】 本明細書で使用する「ＣＸＣＲ４」とは、ケモカインのＣ−Ｘ−Ｃ基のメンバ
ーを結合し、そのアミノ酸配列が、Ｇｅｎｂａｎｋ受付番号４００６５４に提供
されたアミノ酸配列を含むケモカイン受容体及び関連する多型変異種である。

【００３１】 上記組成物のある態様では、少なくとも１つの化合物は、非ペプチド分子であ
る。ある態様では、前記非ペプチド分子は、二環（ｂｉｃｙｃｌａｍ）化合物Ａ
ＭＤ３１００である（１６）。

【００３２】 本明細書で使用する「非ペプチド分子」とは、その全体が、ペプチド結合によ
って連結されたアミノ酸の直鎖配列からならない分子を意味する。しかしながら
、非ペプチド分子は、１以上のペプチド結合を含有してもよい。

【００３３】 上記組成物のある態様では、前記化合物のうちの少なくとも１つは、抗体であ
る。ある態様では、前記抗体は、モノクローナル抗体である。別の態様では、前
記抗体は、抗ケモカイン受容体抗体である。ある態様では、前記抗体は、抗ＣＸ
ＣＲ４抗体である。さらなる態様では、抗ＣＸＣＲ４抗体は、１２Ｇ５である（
４３）。好ましい態様では、前記抗体は、抗ＣＣＲ５抗体である。前記抗ＣＣＲ
５抗体には、ＰＡ８、ＰＡ９、ＰＡ１０、ＰＡ１１、ＰＡ１２、ＰＡ１４、及び
２Ｄ７が含まれるが、これらに限定されない。該組成物の中で、前記化合物は、
適切な比率である。前記比率は１：１〜１０００：１にわたる。

【００３４】 以下の受付番号：ＡＴＣＣ受付番号ＨＢ−１２６０５（ＰＡ８）、ＡＴＣＣ受
付番号ＨＢ−１２６０６（ＰＡ９）、ＡＴＣＣ受付番号ＨＢ−１２６０７（ＰＡ
１０）、ＡＴＣＣ受付番号ＨＢ−１２６０８（ＰＡ１１）、ＡＴＣＣ受付番号Ｈ
Ｂ１２６０９（ＰＡ１２）、ＡＴＣＣ受付番号ＨＢ−１２６１０（ＰＡ１４）で
、１９９８年１２月２日、バージニア州２０１１０−２２０９、マナサス、ユニ
バーシティー・ブルバード１０８０１のアメリカン・タイプ・カルチャー・コレ
クション（ＡＴＣＣ）に、特許手続上の微生物の寄託の国際的承認に関するブダ
ペスト条約の要件に従い、これを充足するために、モノクローナル抗体、ＰＡ８
、ＰＡ９、ＰＡ１０、ＰＡ１１、ＰＡ１２、及びＰＡ１４を寄託した。

【００３５】 上記組成物の別の態様では、２以上の上記化合物が抗体である。本発明のある
態様では、前記抗体には、ＰＡ８、ＰＡ９、ＰＡ１０、ＰＡ１１、ＰＡ１２、Ｐ
Ａ１４、及び２Ｄ７が含まれるが、これらに限定されない。該組成物では、前記
抗体は、適切な比率である。前記比率は１：１〜５０：１にわたる。

【００３６】 本明細書で使用する「抗体」とは、２つの重鎖と２つの軽鎖を備え、抗原を認
識する免疫グロブリン分子を意味する。免疫グロブリン分子は、ＩｇＡ、分泌型
ＩｇＡ、ＩｇＧ、及びＩｇＭを含む一般的に知られたクラスの何れに由来しても
よいが、それらに限定されない。ＩｇＧサブクラスも、当業者に周知であり、ヒ
トＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４が含まれるが、それらに限定さ
れない。例えば、天然の抗体と非天然の抗体の両者が含まれる。具体的には、「
抗体」には、ポリクローナルとモノクローナル抗体が含まれ、１価及び２価のそ
れらの断片が含まれる。さらに、「抗体」には、キメラ抗体、完全な合成抗体、
単鎖抗体、及びそれらの断片が含まれる。必要に応じて、抗体には、検出可能な
マーカーを標識してもよい。検出可能なマーカーには、例えば、放射性のマーカ
ー又は蛍光マーカーが含まれる。前記抗体は、ヒト又は非ヒト抗体であり得る。
前記非ヒト抗体は、ヒトでの免疫原性を減少させるために、組換法によってヒト
化してもよい。抗体をヒト化する方法は、当業者に公知である。

【００３７】 本明細書で使用する「モノクローナル抗体」は、ｍＡｂとも表記され、その一
次配列が、本質的に同一で、同一の抗原性特異性を示す抗体分子を表すために使
用される。モノクローナル抗体は、ハイブリドーマ、組換え、トランスジェニッ
ク、又は当業者に公知である他の手法によって作成され得る。

【００３８】 本明細書で使用する「抗ケモカイン受容体抗体」とは、ケモカイン受容体上の
エピトープを認識して結合する抗体を意味する。本明細書で使用する「抗ＣＣＲ
５抗体」とは、ＣＣＲ５ケモカイン受容体上のエピトープを認識して結合するモ
ノクローナル抗体を意味する。

【００３９】 本明細書で使用する「適切な比率」とは、前記化合物が、相乗的に有効である
重量又はモル比を意味する。

【００４０】 上記組成物のある態様では、少なくとも１つの化合物は、ケモカイン又はケモ
カイン誘導体である。ケモカインには、ランテス、ＭＩＰ−１α、ＭＩＰ−１β
、ＳＤＦ−１、又はそれらの組合せが含まれるが、それらに限定されない。本組
成物において、前記化合物は、適切な比率である。ケモカイン誘導体には、Ｍｅ
ｔ−ランテス、ＡＯＰ−ランテス、ランテス ９−６８、又はそれらの組合せが
含まれるが、それらに限定されない。

【００４１】 本明細書で使用する「ケモカイン誘導体」とは、化学的に修飾されたケモカイ
ンを意味する。化学的な修飾には、アミノ酸の置換、付加、又は欠失、非ペプチ
ド性付加、又は酸化が含まれるが、これらに限定されない。当業者であれば、こ
のような誘導体を作成することができるであろう。

【００４２】 上記組成物の別の態様では、少なくとも１つの抗体が抗体であり、少なくとも
１つの化合物がケモカイン又はケモカイン誘導体である。該組成物では、前記化
合物は、適切な比率である。前記比率は１００：１〜１０００：１にわたる。

【００４３】 上記組成物の別の態様では、少なくとも１つの化合物は、ＨＩＶ−１エンベロ
ープ糖タンパク質のｇｐ４１サブユニットに結合する。ある態様では、少なくと
も１つの化合物は、ＨＩＶ−１の侵入のＴ−２０ペプチド阻害剤である（７０）
。

【００４４】 上記組成物の別の態様では、少なくとも１つの化合物は、ＨＩＶ−１の標的細
胞への付着を阻害する。ある態様では、少なくとも１つの化合物は、ＣＤ４を結
合する。ある態様では、少なくとも１つの化合物は、ＨＩＶ−１エンベロープ糖
タンパク質である。ある態様では、少なくとも１つの化合物は、抗ＣＤ４抗体で
ある。ある態様では、少なくとも１つの化合物は、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タ
ンパク質に結合する。ある態様では、少なくとも１つの化合物は、ＨＩＶ−１エ
ンベロープ糖タンパク質に対する抗体である。ある態様では、少なくとも１つの
化合物は、ＣＤ４をベースとするタンパク質である。ある態様では、少なくとも
１つの化合物は、ＣＤ４−ＩｇＧ２である。

【００４５】 上記組成物の別の態様では、少なくとも１つの化合物は抗体であり、少なくと
も１つの化合物はＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質に結合する。ある態様で
は、前記化合物は、ＣＤ４をベースとするタンパク質である。ある態様では、前
記化合物は、ＣＤ４−ＩｇＧ２である。該組成物では、前記化合物は、適切な比
率である。前記比率は、１：１〜１０：１にわたる。

【００４６】 本明細書で使用する「付着」とは、ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質のヒ
トＣＤ４受容体（これは、融合補助受容体ではない）への結合によって媒介され
る過程を意味する。

【００４７】 本明細書で使用する「ＣＤ４」とは、細胞質ドメイン、疎水性膜貫通ドメイン
、及びＨＩＶ−１ ｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質に結合する細胞外ドメ
インを含む成熟した、ネイティブの、膜結合型ＣＤ４タンパク質を意味する。

【００４８】 本明細書で使用する「ＨＩＶ−１エンベロープ糖タンパク質」とは、ｇｐ１２
０表面タンパク質、ｇｐ４１膜貫通タンパク質、及びオリゴマー、並びにそれら
の前駆体を含む、ＨＩＶ−１によってコードされたタンパク質を意味する。

【００４９】 本明細書で使用する「ＣＤ４をベースとするタンパク質」とは、ＣＤ４がＨＩ
Ｖ−１ ｇｐ１２０エンベロープ糖タンパク質と複合体を形成するのに必要とさ
れるＣＤ４のその部分に対応する、少なくとも１つのアミノ酸残基の配列を備え
た任意のタンパク質を意味する。

【００５０】 本明細書で使用する「ＣＤ４−ＩｇＧ２」とは、ＡＴＣＣ受付番号７５１９３
及び７５１９４で寄託された発現ベクターによってコードされたヘテロ四量体の
ＣＤ４−ヒトＩｇＧ２融合タンパク質を意味する。

【００５１】 上記組成物のある態様では、少なくとも１つの前記化合物は、ＣＣＲ５エピト
ープに結合するポリペプチドを備える。ある態様では、前記エピトープは、Ｎ末
端、３つの細胞外ループ領域のうちの１つ、又はそれらの組合せの中に位置する
。ある態様では、前記エピトープは、Ｎ末端中に位置する。前記エピトープは、
Ｎ末端中にＮ１３とＹ１５を含み得る。前記エピトープは、Ｎ末端中にＱ４を含
み得る。別の態様では、前記エピトープは、Ｎ末端と第２細胞外ループに残基を
含む。前記エピトープは、Ｎ末端にＤ２、Ｙ３、Ｑ４、Ｓ７、Ｐ８、及びＮ１３
を、第２細胞外ループにＹ１７６及びＴ１７７を含み得る。前記エピトープは、
Ｎ末端にＤ２、Ｙ３、Ｑ４、Ｐ８、及びＮ１３を、第２細胞外ループにＹ１７６
とＴ１７７を含み得る。前記エピトープは、Ｎ末端中にＤ２を、第２細胞外ルー
プにＲ１６８とＹ１７６を含み得る。ある態様では、前記エピトープは、前記第
２細胞外ループ中に位置する。前記エピトープは、第２細胞外ループ中にＱ１７
０とＫ１７１を含み得る。前記エピトープは、第２細胞外ループ中にＱ１７０と
Ｅ１７２を含み得る。

【００５２】 本明細書を通じて、特定のアミノ酸を表記するために、以下の標準的な略号を
使用する。

【００５３】 Ａ＝ａｌａ＝アラニン Ｒ＝ａｒｇ＝アルギニン Ｎ＝ａｓｎ＝アスパラギン Ｄ＝ａｓｐ＝アスパラギン酸 Ｃ＝ｃｙｓ＝システイン Ｑ＝ｇｌｎ＝グルタミン Ｅ＝ｇｌｕ＝グルタミン酸 Ｇ＝ｇｌｙ＝グリシン Ｈ＝ｈｉｓ＝ヒスチジン Ｉ＝ｉｌｅ＝イソロイシン Ｌ＝ｌｅｕ＝ロイシン Ｋ＝ｌｙｓ＝リシン Ｍ＝ｍｅｔ＝メチオニン Ｆ＝ｐｈｅ＝フェニルアラニン Ｐ＝ｐｒｏ＝プロリン Ｓ＝ｓｅｒ＝セリン Ｔ＝Ｔｈｒ＝トレオニン Ｗ＝ｔｒｐ＝トリプトファン Ｙ＝ｔｙｒ＝チロシン Ｖ＝ｖａｌ＝バリン 本明細書で使用する「ポリペプチド」とは、ペプチド結合によって連結された
２以上のアミノ酸を意味する。

【００５４】 本明細書で使用する「エピトープ」とは、抗体又はその他の化合物を結合する
ための表面を形成する１又は複数の分子の部分を意味する。エピトープは、連続
した、若しくは連続していないアミノ酸、炭水化物、又は他の非ペプチド部分、
又はオリゴマー特異的な表面を有し得る。

【００５５】 本明細書で使用する「Ｎ末端」とは、開始メチオニンと第１膜貫通領域にわた
るアミノ酸の配列を意味する。

【００５６】 本明細書で使用する「第２細胞外ループ」とは、第４及び第５膜貫通領域にわ
たり、表面上に提示されるアミノ酸の配列を意味する。

【００５７】 上記組成物のある態様では、少なくとも１つの前記化合物は、抗体の軽鎖を備
える。上記組成物の別の態様では、少なくとも１つの前記化合物は、抗体の重鎖
を備える。上記組成物の別の態様では、少なくとも１つの前記化合物は、抗体の
Ｆａｂ部分を備える。上記組成物の別の態様では、少なくとも１つの前記化合物
は、抗体の可変ドメインを備える。別の態様では、前記抗体は、単一のポリペプ
チドとして、すなわち、介在するアミノ酸の配列を介して遺伝的に連結された重
鎖及び軽鎖可変ドメインを備えた「単鎖」抗体として作成される。上記組成物の
別の態様では、少なくとも１つの前記化合物は、抗体の１以上のＣＤＲ部分を備
える。

【００５８】 本明細書で使用する「重鎖」とは、１つの可変ドメイン（ＶＨ）及び３若しく
は４つの定常ドメイン（ＣＨ１、ＣＨ２、ＣＨ３、及びＣＨ４）又はそれらの断
片から構成される、抗体分子の大きい方のポリペプチドを意味する。

【００５９】 本明細書で使用する「軽鎖」とは、１つの可変ドメイン（ＶＬ）及び１つの定
常ドメイン（ＣＬ）、又はそれらの断片から構成される、抗体分子の小さい方の
ポリペプチドを意味する。

【００６０】 本明細書で使用する「Ｆａｂ」とは、１つの軽鎖と重鎖の一部からなる、抗原
を結合する免疫グロブリンの１価断片を意味する。これは、パパインで短時間消
化することによって、又は組換え法によって得ることができる。

【００６１】 本明細書で使用する「Ｆ（ａｂ’）２断片」とは、両軽鎖と両重鎖の一部から
なる、抗原を結合する免疫グロブリンの２価断片を意味する。これは、ペプシン
で短時間消化することによって、又は組換え法によって得ることができる。

【００６２】 本明細書で使用する「ＣＤＲ」又は「相補性決定領域」とは、抗体の可変ドメ
イン中に存在する高度に可変的なアミノ酸の配列を意味する。

【００６３】 本発明は、上記組成物と薬学的に許容される担体を提供する。薬学的に許容さ
れる担体は、当業者に周知である。このような薬学的に許容される担体には、水
性又は非水性溶液、懸濁物、及びエマルジョンが含まれ得るが、これらに限定さ
れない。非水性溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、
オリーブ油のような植物油、及びオレイン酸エチルのような注射可能な有機エス
テルである。水性担体には、水、アルコール／水溶液、エマルジョン、又は懸濁
物、生理的食塩水、及び緩衝化された溶媒が含まれる。非経口溶媒には、塩化ナ
トリウム溶液、リンゲルのデキストロース、デキストロースと塩化ナトリウム、
乳酸加リンゲル溶液、又は不揮発性油が含まれる。静脈内溶媒には、リンゲルの
デキストロースをベースとしたものなどの液体及び栄養素補給剤、電解質補給剤
が含まれる。例えば、抗菌剤、抗酸化剤、キレート剤、不活性ガスなどのような
他防腐剤及びその他の添加物が存在してもよい。

【００６４】 本発明は、ＨＩＶ−１に罹患した患者を治療する方法であって、有効量の上記
組成物を前記患者に投与することを備えた方法を提供する。

【００６５】 本明細書で使用する「患者」とは、ＨＩＶに感染し得る任意の動物又は人工的
に修飾を加えた動物を意味する。人工的に修飾を加えた動物には、ヒトの免疫系
を有するＳＣＩＤマウスが含まれるが、これに限定されない。前記動物には、マ
ウス、ラット、イヌ、モルモット、フェレット、ウサギ、及び霊長類が含まれる
が、これらに限定されない。好ましい態様では、患者はヒトである。

【００６６】 本明細書で使用する「治療する」とは、ＨＩＶ疾患の進行を遅くし、停止させ
、又は回復させることの何れかを意味する。好ましい態様では、「治療する」と
は、前記疾患がなくなる地点まで進行を回復させることを意味する。本明細書で
使用する「治療する」とは、ウイルスの感染数の減少、感染性ウイルス粒子の数
の減少、ウイルスに感染した細胞の数の減少、又はＨＩＶ−１に随伴する症状の
改善も意味する。

【００６７】 本明細書で使用する「ＨＩＶ−１に罹患した」とは、患者が、ＨＩＶ−１に感
染した細胞を少なくとも１つ有することを意味する。

【００６８】 本明細書で使用する「投与」は、当業者に公知である任意の方法を用いて、実
施又は実行し得る。該方法には、静脈内、筋肉内、又は皮下手段が含まれ得る。

【００６９】 本発明の組成物の用量は、患者、使用される投与経路に応じて、変動するであ
ろう。用量は、０．１〜１００，０００μｇ／ｋｇの範囲であり得る。前記組成
物に応じて、前記投与は、例えば連続ポンプによって連続的に与えてもよく、あ
るいは、例えば、１以上の間を置いた時点に、一定の間隔で与えてもよい。ある
組成物の複数回投与における所望の時間間隔は、当業者によって、過度の試行錯
誤なく決定できる。

【００７０】 本明細書で使用する「有効量」とは、患者を治療するか、又は患者がＨＩＶ−
１に感染するのを阻止するのに十分な量を意味する。当業者であれば、患者を治
療するのにどの程度の量が必要かを決定するために、簡易な滴定実験を行うこと
ができる。

【００７１】 本発明は、対象がＨＩＶ−１に罹患するのを予防する方法であって、有効量の
上記組成物を前記対象に投与することを備えた方法を提供する。

【００７２】 本明細書で使用する「ＨＩＶ−１に罹患する」とは、ＨＩＶ−１に感染し、そ
の遺伝情報が宿主細胞中で複製し、及び／又は宿主細胞中に取り込まれることを
意味する。

【００７３】 本発明は、抗ＣＣＲ５モノクローナル抗体を提供する。該抗体には、以下のも
の：ＰＡ８（ＡＴＣＣ受付番号ＨＢ−１２６０５）、ＰＡ９（ＡＴＣＣ受付番号
ＨＢ−１２６０６）、ＰＡ１０（ＡＴＣＣ受付番号ＨＢ−１２６０７）、ＰＡ１
１（ＡＴＣＣ受付番号ＨＢ−１２６０８）、ＰＡ１２（ＡＴＣＣ受付番号ＨＢ−
１２６０９）、及びＰＡ１４（ＡＴＣＣ受付番号ＨＢ−１２６１０）が含まれる
が、これらに限定されない。

【００７４】 本発明は、ヒト化された形態の上記抗体を提供する。

【００７５】 本明細書で使用する「ヒト化」とは、ＣＤＲ領域外のアミノ酸の幾つか、殆ど
、又は全てが、ヒト免疫グロブリン分子由来の対応するアミノ酸で置換された抗
体を記載する。ヒト化された形態の前記抗体のある態様では、ＣＤＲ領域外のア
ミノ酸の幾つか、殆ど、又は全てが、ヒト免疫グロブリン分子由来のアミノ酸で
置換されているが、１以上のＣＤＲ領域内の幾つか、殆ど、又は全てのアミノ酸
は、変化していない。ある抗原を結合する抗体の能力が失われなければ、アミノ
酸の些細な付加、欠失、挿入、置換又は修飾は差し支えない。適切なヒト免疫グ
ロブリン分子には、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ、および
ＩｇＭ分子が含まれるであろう。「ヒト化」抗体は、元の抗体、すなわち本発明
の抗体と、類似の抗原特異性、ＣＣＲ５結合能を保持しているであろう。

【００７６】 本発明は、これらの抗ＣＣＲ５モノクローナル抗体又はそれらのヒト化された
形態をコードする単離された核酸分子を提供する。核酸分子は、ＲＮＡ、ＤＮＡ
、又はｃＤＮＡであり得る。ある態様では、前記核酸分子は、軽鎖をコードする
。ある態様では、前記核酸分子は、重鎖をコードする。ある態様では、前記核酸
は、重鎖と軽鎖をともにコードする。ある態様では、１以上の核酸分子が、Ｆａ
ｂ部分をコードする。ある態様では、１以上の核酸分子は、ＣＤＲ部分をコード
する。ある態様では、核酸分子は、可変ドメインをコードする。

【００７７】 本発明は、以下に記載された実験の詳細によって、よりよく理解できるであろ
う。しかしながら、当業者であれば、記載されている具体的な方法と結果は、そ
の後に記載された特許請求の範囲で、より完全に記載される本発明を説明するも
のにすぎないことを容易に理解できるであろう。

【００７８】

【実験の詳細】

＜Ａ＞．方法と材料 １）試薬 ｍＡｂ ２Ｄ７はＰｈａｒｍｉｎｇｅｎ（Ｓａｎ Ｄｉｅｇｏ，ＣＡ）より購
入し、ＣＣ−及びＣＸＣ−ケモカインはＲ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ（Ｍｉｎｎｅａ
ｐｏｌｉｓ，ＭＮ）より得た。ＣＤ４−ＩｇＧ２（１）、可溶性ＣＤ４（２）、
及び組換えＨＩＶ−１_{ＪＲ−ＦＬ} ｇｐ１２０は、Ｐｒｏｇｅｎｉｃｓ Ｐｈａ
ｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ，Ｉｎｃ．によって産生された（５９）。

【００７９】 ２）抗ＣＣＲ５ ｍＡｂの単離及び精製 ５ｍＭの酪酸ナトリウム（ＣＣＲ５の発現を制御するサイトメガロウイルス（Ｃ
ＭＶ）プロモーターからの転写を活性化する）の存在下で、１６時間、Ｌ１．２
−ＣＣＲ５^＋細胞（６３）をインキュベートし、細胞表面の補助受容体の密度を
１０倍増加させた。雌のＢａｌｂ／ｃマウスの腹腔内に、３週間間隔で、１０^７ 個のＬ１．２−ＣＣＲ５^＋細胞を免疫し、脾摘出の３日前に、静脈内に１０^７個
のＬ１．２−ＣＣＲ５^＋細胞を追加免疫した。脾細胞をＳｐ２／０セルラインと
融合させた。一次スクリーニングでは、１０，０００のハイブリドーマ培養物の
上清を試験した。以前記載したように（１９，３８）、そのうち１２０が、共鳴
エネルギー移動（ＲＥＴ）アッセイにおける、ＨＩＶ−１エンベロープによって
媒介されるＰＭ１細胞（１０）（元来ＣＣＲ５とＣＤ４を発現している）とＨｅ
Ｌａ−Ｅｎｖ_{ＪＲ−ＦＬ} ^＋細胞との融合を阻害した。最も強力に阻害する上清を
産生するとともに、ＣＣＲ５^＋細胞を染色するハイブリドーマを、限界希釈法に
よってサブクローニングした。腹水液は、Ｈａｒｌａｎ Ｂｉｏｐｒｏｄｕｃｔ
ｓ ｆｏｒ Ｓｃｉｅｎｃｅ，Ｉｎｃ．（Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ，ＩＮ）が
、抗−ＣＣＲ５ ｍＡｂ（ＰＡ８、ＰＡ９、ＰＡ１０、ＰＡ１１、ＰＡ１２、及
びＰＡ１４）を産生するハイブリドーマを注射したＢａｌｂ／ｃマウスから調製
した。硫安沈殿の後、プロテインＡクロマトグラフィーによって、９５％を超え
る均一性になるように、前記ｍＡｂを各別に精製した。最終濃度が５ｍｇ／ｍＬ
になるように、リン酸緩衝生理的食塩水（ＰＢＳ）に全てのｍＡｂを再懸濁した
。

【００８０】 ３）抗−ＣＣＲ５ ｍＡｂの蛍光活性化セルソーター（ＦＡＣＳ）分析とエピト ープマッピング ｍＡｂ ＰＡ８〜ＰＡ１２及びＰＡ１４のＣＣＲ５との細胞表面反応性を検出
するために、フローサイトメトリーを用いた。５０μＬのＤｕｌｂｅｃｃｏ’ｓ
ＰＢＳ（ＤＰＢＳ）中の０．１％アジ化ナトリウム（ＮａＮ_３）の中で、４℃
で２０分間、酪酸ナトリウムで処理したＬ１．２−ＣＣＲ５^＋細胞（１０^６）を
、抗体０．２５μｇとともにインキュベートした。前記ＣＣＲ５ ｍＡｂ ２Ｄ
７をポジティブコントロールとして使用し、非特異的マウスＩｇＧ１をネガティ
ブコントロールとして使用した。前記細胞を遠心沈殿し、洗浄し、一次抗体のイ
ンキュベーションと同じ条件で、１：１００に希釈したフィコエリトリン（ＰＥ
）標識ヤギ抗マウスＩｇＧ（Ｃａｌｔａｇ，Ｂｕｒｌｉｎｇａｍｅ，ＣＡ）と、
インキュベートした。最後に、フローサイトメトリーによって、細胞を分析した
。末梢血単核球（ＰＢＭＣ）を単離し、以前記述したように刺激し（６０）、同
様の方法を用いて染色した。

【００８１】 前記抗ＣＣＲ５ ｍＡｂのエピトープマッピングに同様の手順を用いた。７０
のＣＣＲ５点変異体群が記載されている（２０，２４，５２）。ｐｃＤＮＡ３．
１ベクター（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ）（転写は、５’Ｔ７−ポリメラーゼプロモ
ーターによって、ここから誘導され得る）の中に、これらのタンパク質のコード
配列をサブクローニングする。前記ＣＣＲ５変異体は、細胞可溶化液中の、又は
フローサイトメトリーによるタンパク質の検出のために、Ｃ−末端に９残基のヘ
マグルチニン（ＨＡ）タグを有する。ＯＰＴＩ−ＭＥＭ（Ｌｉｆｅ Ｔｅｃｈｎ
ｏｌｏｇｉｅｓ，Ｇａｉｔｈｅｒｓｂｕｒｇ，ＭＤ）の中で、リポフェクチン２
０μｇ／ｍＬ及び、等量の野生型又は変異体ＣＣＲ５を発現するプラスミドとと
もに、ＨｅＬａ細胞（２ｘ１０^６）を５時間インキュベートした。その後、ＣＣ
Ｒ５の発現を強化するために、前記細胞を、２ｘ１０^７プラーク形成単位（ｐ．
ｆ．ｕ）のｖＴＦ７（２３）に１２時間感染させ、２ｍＭエチレンジアミン四酢
酸（ＥＤＴＡ）入りＰＢＳ中で剥離し、結合緩衝液（１％ ＢＳＡ、０．０５％ ＮａＮ_３入りＤＰＢＳ）で一度洗浄した。前パラグラフに記載したように、ｍ
Ａｂを用いて細胞（１ｘ１０^６）表面を標識し、前記インキュベーションバッフ
ァーで一度洗浄し、前記細胞膜を透過性にするために、１ｘＦＡＣＳｌｙｓｅ入
り水（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）１ｍＬ中に、３０分間、室温で再懸
濁した。その後、前記細胞を遠心沈殿し、前記インキュベーションバッファーで
洗浄し、細胞内標識のために、フルオレセイン イソチオシアネート（ＦＩＴＣ
）標識マウス抗−ＨＡ ｍＡｂ（ＢａｂＣｏ，Ｒｉｃｈｍｏｎｄ，ＣＡ）４μｇ
／ｍＬとともに、１時間３７℃でインキュベートした。最後に、結合バッファー
で一度、ＤＰＢＳで一度、細胞を洗浄し、１％ホルムアミド入りＰＢＳ中に再懸
濁し、フローサイトメトリーによって分析した。式（変異体ＣＣＲ５ ＰＥ ｍ
．ｆ．ｉ／ｗｔ ＣＣＲ５ ＰＥ ｍ．ｆ．ｉ）／（変異体ＣＣＲ５ ＦＩＴＣ ｍ．ｆ．ｉ．／ｗｔ ＣＣＲ５ ＦＩＴＣ ｍ．ｆ．ｉ）ｘ１００％によって
、変異体ＣＣＲ５へのｍＡｂの結合程度を決定した。これにより、ｍＡｂの結合
が、変異型補助受容体の発現レベルについて標準化される。

【００８２】 ４）ｇｐ１２０／ｓＣＤ４−結合アッセイ 製造業者の説明書に従って、ＮＨＳ−ビオチン（Ｐｉｅｒｃｅ，Ｒｏｃｋｆｏ
ｒｄ，ＩＬ）を用いて、ｇｐ１２０をビオチン化し、ダイアフィルトレーション
によって、結合していないビオチンを除去した。０．１％ＮａＮ_３入りＤＰＢＳ
中、様々な濃度の抗−ＣＣＲ５ ｍＡｂ ＰＡ８〜ＰＡ１２、ＰＡ１４、２Ｄ７
、又は非特異的マウスＩｇＧ１の存在下で、ｓＣＤ４及びビオチン化ｇｐ１２０
の等モル混合物、又は、１．２５μｇ／ｍＬのｓＣＤ４と２．５μｇ／ｍＬのビ
オチン化ｇｐ１２０を様々に希釈したものとともに、酪酸ナトリウム処理したＬ
１．２−ＣＣＲ５^＋細胞を１時間室温でインキュベートした。前記インキュベー
ションバッファーで細胞を洗浄し、１：５０に希釈したストレプトアビジン−Ｐ
Ｅ（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ）とともに、１時間室温でインキュベー
トした。最後に、結合バッファーで細胞を洗浄し、蛍光プレートリーダー（Ｐｅ
ｒｓｐｅｃｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ，Ｆｒａｍｉｎｇｈａｍ，ＭＡ）を
用いて分析した。

【００８３】 ５）抗−ＣＣＲ５ ｍＡｂによる、エンベロープによって媒介される細胞−細胞 融合及びＨＩＶ−１の侵入の阻害 ＨＩＶ−１のエンベロープによって媒介される、ＨｅＬａ−Ｅｎｖ_{ＪＲ−ＦＬ} ^＋ とＰＭ１細胞の融合を、前記ＲＥＴアッセイを用いて検出した。９６ウェルプ
レート中の１５％ウシ胎児血清入りＤＰＢＳに、フルオレセイン オクタデシル
エステル（Ｆ１８）で標識したエンベロープ発現細胞とオクタデシル ローダ
ミン（Ｒ１８）で標識したＰＭ１細胞とを、同数（２ｘ１０^４）播種し、様々な
濃度の抗−ＣＣＲ５ ｍＡｂ、ＰＡ８〜ＰＡ１２、ＰＡ１４、２Ｄ７、又は非特
異的マウスＩｇＧ１の存在下において、４時間、３７℃でインキュベートした。
Ｃｙｔｏｆｌｕｏｒプレートリーダー（ＰｅｒＳｅｐｔｉｖｅ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ）を用いて、蛍光ＲＥＴを測定し、以前記述されたように（３８）、％Ｒ
ＥＴを決定した。以前記述したように（２０）、ＪＲ−ＦＬ又はＧｕｎ−１のエ
ンベロープ糖タンパク質が、トランスで相補されたＮＬｌｕｃ^＋ｅｎｖ⁻ウイル
スを作成した。様々な濃度の前記各ｍＡｂの存在下で、Ｕ８７ＭＧ−ＣＤ４^＋Ｃ
ＣＲ５^＋細胞（１４）を、５０〜１００ｎｇ／ｍＬのｐ２４を含有するキメラの
レポーターウイルスに感染させた。３７℃で２時間後、ウイルス含有培地を、新
鮮なｍＡｂ含有培地と交換した。抗体を含有しない新鮮な培地を、１２時間後に
再び添加した。計７２時間後、溶解バッファー（Ｐｒｏｍｅｇａ）１００μｌを
前記細胞に添加し、記載したように（２０）、ルシフェラーゼ活性（ｒ．ｌ．ｕ
．）を測定した。ＨＩＶ−１感染の％阻害を、［１−（抗体存在下でのｒ．ｌ．
ｕ．／抗体非存在下でのｒ．ｌ．ｕ．）］ｘ１００％と定義する。

【００８４】 ６）カルシウムシグナル伝達アッセイ 酪酸ナトリウム処理したＬ１．２−ＣＣＲ５^＋細胞に、蛍光色素Ｉｎｄｏ−ｌ
ＡＭ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，ＯＲ）を、最終濃度
５μＭで添加した。３７℃で３０分間、インキュベートした後、前記細胞を一度
洗浄し、Ｈａｎｋの緩衝化した生理食塩水に再懸濁した。抗−ＣＣＲ５ ｍＡｂ
又はＰＢＳで、次に６０秒後ランテスで、順次細胞（１０^６）を刺激した。ｍＡ
ｂ ＰＡ８〜ＰＡ１２とＰＡ１４は１００μｇ／ｍＬ、２Ｄ７は２０μｇ／ｍＬ
、ランテスは２５０ｎｇ／ｍＬの濃度で使用した。（０〜１００μｇ／ｍＬにわ
たる）広範囲のｍＡｂ濃度で、ＰＡ１４と２Ｄ７によるカルシウム流動の阻害も
試験した。Ｐｅｒｋｉｎ−Ｅｌｍｅｒ ＬＳ−５０Ｓ蛍光分光光度計を用いて、
３５８ｎｍで励起した後、４０２ｎｍ（結合した色素）及び４８６ｎｍ（遊離の
色素）での蛍光放射の比を測定することによって、細胞内カルシウムレベルをモ
ニターした。

【００８５】 ＜Ｂ＞．結果と考察 １）抗ＣＣＲ５モノクローナル抗体 ＰＡ８、ＰＡ９、ＰＡ１０、ＰＡ１１、Ｐ Ａ１２、及びＰＡ１４の単離 ＣＣＲ５の細胞外ドメインに対応するペプチドは、ネイティブの細胞表面受容
体に対する、特異的な高力価の抗体応答を効率的に惹起できないことが明らかと
されている（５０）。それ故、Ｌ１．２−ＣＣＲ５^＋細胞で、Ｂａｌｂ／Ｃマウ
スを免疫し、ハイブリドーマ培養上清が、ＲＥＴアッセイで、ＪＲ−ＦＬのエン
ベロープによって媒介されるＣＤ４^＋ＣＣＲ５^＋ ＰＭ１細胞との膜の融合を阻
害する能力を調べた（１９，３８）。優に１００を超える上清が、細胞−細胞融
合を＞５０％阻害したにもかかわらず、フローサイトメトリーによる実証と同じ
く、特異的に、且つ強くＬ１．２−ＣＣＲ５^＋を染色したが、Ｌ１．２の親細胞
を染色しなかったのは、６つ（ＰＡ８、ＰＡ９、ＰＡ１０、ＰＡ１１、ＰＡ１２
、及びＰＡ１４と表記する）にすぎなかった（データは示さず）。従前の経験に
基づき、おそらく、ＬＦＡ−１のような細胞表面接着分子に対して、細胞−細胞
融合を阻害し得る他のｍＡｂが作られると仮定した（３７）。アイソタイピング
ＥＬＩＳＡ（Ｃａｐｐｅｌｌ，Ｄｕｒｈａｍ，ＮＣ）によって、ハイブリドーマ
ＰＡ８〜ＰＡ１２及びＰＡ１４が、ＩｇＧ１ ｍＡｂを分泌することが分かった
。前記６つのハイブリドーマを注射したＢａｌｂ／Ｃマウスから腹水液を調製し
、ＩｇＧ１画分を精製した。ＰＡ８、ＰＡ９、ＰＡ１１、ＰＡ１２、及びＰＡ１
４は、異なる等電点電気泳動のプロフィールを示したが、ＰＡ１０は、ＰＡ９の
プロフィールと極めて類似したプロフィールを有していたので、同一のｍＡｂを
別に単離したのかもしれない（データは示さず）。

【００８６】 ２）Ｒ５＋細胞へのｍＡｂの結合 精製された抗−ＣＣＲ５ ｍＡｂは何れも、Ｌ１．２の親細胞株を染色しなか
った（データは示さず）。しかしながら、フローサイトメトリーによる測定と同
じく、ｍＡｂ ＰＡ９〜ＰＡ１２およびＰＡ１４は、９０％を超えるＬ１．２−
ＣＣＲ５^＋細胞を染色し、ＰＡ８は約７０％のＬ１．２−ＣＣＲ５細胞を染色し
た。このことは、それらがＣＣＲ５を認識したことを示している（表１）。我々
の実験においてポジティブコントロールであった抗−ＣＣＲ５ ｍＡｂ ２Ｄ７
は、９０％を超えるＬ１．２−ＣＣＲ５^＋細胞も染色した。ＰＡ８〜ＰＡ１２及
びＰＡ１４は全てＩｇＧ１なので、ヤギ抗マウスＩｇＧと、同じように良好に反
応するのに対して、２Ｄ７はＩｇＧ２ａなので、レポーター抗体との反応性は異
なるかもしれない。それ故、ｍＡｂ ＰＡ８〜ＰＡ１２及びＰＡ１４を用いて測
定した平均蛍光強度（ｍ．ｆ．ｉ．；ｍｅａｎ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｅｎｃｅ
ｉｎｔｅｎｓｉｔｉｅｓ）のみを直接比較することができる。平均蛍光強度（
ｍ．ｆ．ｉ）は、ＰＡ１２~ ＰＡ１１＞ （２Ｄ７＝） ＰＡ１４〜 ＰＡ１
０~ ＰＡ９＞ ＰＡ８の順であった。ＰＡ１２ ｍ．ｆ．ｉ．とＰＡ８ ｍ．
ｆ．ｉの間には３倍の差があった。ＰＡ８とその他のｍＡｂ間の染色強度の差は
、広い範囲の濃度にわたって、一定であり（データは示さず）、おそらくは、ｍ
ＡｂのＣＣＲ５への親和性の差と一致しない。このことは、ＰＡ８が、Ｌ１．２
−ＣＣＲ５^＋細胞の表面上に存在するＣＣＲ５分子のサブセットのみと相互作用
することをする。

【００８７】 Ｌ１．２−ＣＣＲ５＋細胞と比較したところ、マイトジェンで刺激されたＰＢ
ＭＣは、前記抗−ＣＣＲ５ ｍＡｂによって、異なる染色パターンを示した。２
Ｄ７及びＰＡ１４は２０％を超えるＰＢＭＣを、ＰＡ１１及びＰＡ１２は約１０
％のＰＢＭＣを、ＰＡ８、ＰＡ９及びＰＡ１０は５％未満のＰＢＭＣを染色した
（表１）。各ｍＡｂとも、染色されたＰＢＭＣの平均蛍光強度は、Ｌ１．２−Ｃ
ＣＲ５^＋細胞で得られた平均蛍光強度より約１０倍低かった。それらの順番は、
（２Ｄ７＞） ＰＡ１４＞ ＰＡ１２~ ＰＡ１１~ ＰＡ１０~ ＰＡ９~ ＰＡ
８であった。この場合も、これは、ＣＣＲ５形質移入体で観察された反応性の順
序とは、多少相違していた。ＰＡ９のｍ．ｆ．ｉとＰＡ１４のｍ．ｆ．ｉには７
倍の差があった。他のグループも、抗−ＣＣＲ５ ｍＡｂが安定なＣＣＲ５^＋細
胞株とＰＭＢＣを染色する能力に同じような差があることを観察している（２８
）。これは、ＣＣＲ５の高次構造、翻訳後修飾、又はオリゴマー化における細胞
特異的な相違に起因するものかもしれない。あるいは、他の細胞表面分子との会
合が、細胞ごとに異なるのかもしれない。このような分子の候補としては、まず
ＣＤ４細胞表面抗原（Ｌ１．２−ＣＣＲ５^＋細胞にはなく、ＰＭＢＣ上には存在
する）が考えられるので、我々は、ＰＡ８〜ＰＡ１２、ＰＡ１４、及び２Ｄ７が
、一過性にＣＣＲ５のみ、又はＣＣＲ５とＣＤ４を発現するＨｅＬａ細胞を染色
する能力についても調べた。ＣＤ４の存在下で、任意の前記ｍＡｂが細胞表面Ｃ
ＣＲ５を染色する能力に差異は観察されなかった（データは示さず）。これらの
２つのタンパク質が会合するのであれば、我々が利用できる前記抗ＣＣＲ５ ｍ
Ａｂによって認識されたエピトープは関与していない。あるいは、ＣＣＲ５とＣ
Ｄ４との会合は、一次リンパ球上のみで起こるのかもしれない。

【００８８】 ３）ＣＣＲ５アラニン変異体を用いた前記ｍＡｂのエピトープマッピング ウェスタンブロッティングによって、何れの抗体も、還元され、変性されたＣ
ＣＲ５タンパク質を検出できなかったということは、これらの抗体が、高次構造
が壊れやすいエピトープを認識しているということを示している（データは示さ
ず）。ＣＣＲ５のＮｔとＥＣＬ中に存在する残基をアラニンで点変異した７０の
変異体群を用いて、ｍＡｂエピトープマッピング研究を行った。Ｃ−末端にＨＡ
タグを付加した配列をコードする変異体又は野生型ＣＣＲ５を、ＨｅＬａ細胞に
リポフェクションし、補助受容体の発現を強化するために、ｖＴＦ７（２３）に
感染させた。その後、前記細胞を前記抗−ＣＣＲ５ ｍＡｂとともにインキュベ
ートし、ＰＥで標識されたヤギ抗マウスＩｇＧによって、それらの結合を現出し
た。ＦＩＴＣで標識した抗ＨＡ ｍＡｂ（ＢａｂＣｏ）を用いて、第２の細胞内
染色を行った。この内部標準により、我々は、細胞表面上の変異型補助受容体の
発現レベルについて、前記抗ＣＣＲ５ ｍＡｂによる染色を直接標準化すること
が可能となった。このため、各変異体へのｍＡｂ結合は、野生型ＣＣＲ５への結
合パーセントとして表されている（表１）。

【００８９】 ある点変異は、前記全ての抗体のＣＣＲ５への結合を＞５０％減少させた。一
般的に、システイン対Ｃ１０１ＡとＣ１７８Ａ、Ｎｔ変異体 Ｙ１０Ａ、Ｄ１１
Ａ、Ｋ２５Ａ、ＥＣＬ１変異体 Ｄ９５Ａ、ＥＣＬ２変異体 Ｋ１７１Ａ／Ｅ１
７２Ａ、Ｑ１８８Ａ、Ｋ１９１Ａ／Ｎ１９２Ａ、及びＥＣＬ３変異体 Ｆ２６３
ＡとＦ２６４Ａを含むこのクラスの変異体によって、ＰＡ８〜ＰＡ１２が最も影
響を受け、ＰＡ１４と２Ｄ７は最も影響を受けなかった（図１）。一つの解釈と
しては、これらの残基は、それ自体はｍＡｂのエピトープの一部ではないが、そ
れらをアラニンに変えることにより、全てのｍＡｂの結合に対して共通の影響を
与える高次構造の擾乱が引き起こされるということが考えられる。我々は、ある
変異によって、各ｍＡｂの結合が７５％を超えて低下し、それ以外の多くの抗体
の結合が低下しないのであれば、おそらくは、その残基が、前記ｍＡｂによって
認識されるエピトープに直接寄与していると仮定した。これらの厳密なガイドラ
インを用いることによって、７つの抗ＣＣＲ５ ｍＡｂは、重複するが、異なる
エピトープを認識すると結論づけた（図１）。ｍＡｂ ＰＡ８のＣＣＲ５への結
合は、Ｎｔ中のＮ１３、及びＹ１５に依存していた。ｍＡｂ ＰＡ９及びＰＡ１
０は、Ｎｔ中のＤ２、Ｙ３、Ｑ４、Ｐ８及びＮ１３、並びにＥＣＬ２中のＹ１７
６及びＴ１７７を必要とした。ｍＡｂ９はＮｔ中のＳ７も必要とした。ｍＡｂ
ＰＡ１１及びＰＡ１２の結合は、Ｎｔ中のＱ４に依存した。ＰＡ１４は、Ｎｔ中
のＤ２、及びＥＣＬ２中のＲ１６８とＹ１７６を必要とした。最後に、ｍＡｂ
２Ｄ７は、ＣＣＲ５に結合するために、ＥＣＬ２中のＱ１７０とＫ１７１／Ｅ１
７２を必要とした。

【００９０】 ４）抗ＣＣＲ５ ｍＡｂ存在下でのケモカインシグナル伝達 ケモカイン受容体に結合する薬剤は、受容体によって媒介される細胞内シグナ
ル伝達のアンタゴニストとなり得、より可能性は少ないが、アゴニストともなり
得る。あるいは、それらは、シグナル伝達に対して何らの効果も有しないという
こともあり得る。ＣＣＲ５は、３つのＣＣ−ケモカイン、ランテス、ＭＩＰ−１
α、及びＭＩＰ−１βを結合することができ、細胞質のカルシウムレベルを調節
するシグナルを伝達することができる。それ故、我々は、様々な濃度のｍＡｂ
ＰＡ８〜ＰＡ１２、ＰＡ１４及び２Ｄ７のアゴニスト／アンタゴニスト活性を調
べた。細胞内カルシウム濃度（Ｃａ^２＋）ｉの変化を、Ｉｎｄｏ−ｌを与えたＬ
１．２−ＣＣＲ５^＋細胞中で測定した。前記ｍＡｂの何れも、（Ｃａ^２＋）ｉの
変化を刺激しなかったということは、それらがＣＣＲ５のアゴニストではないこ
とを示している。ＰＡ８〜ＰＡ１２が、１００μｇ／ｍＬという高い濃度でさえ
、ランテスによって誘導されたＣａ^２＋流動も阻害できなかった（図２ａ、及び
データは示さず）ということは、それらが、アンタゴニストでもないことを示し
ている。フローサイトメトリーとｇｐ１２０／ＣＣＲ５結合アッセイによって示
されたように（図３ｄ及びデータは示さず）、前記ｍＡｂのＬ１．２−ＣＣＲ５ ^＋ 細胞への結合は、これらの濃度で飽和する。しかしながら、効力が異なるとは
いえ、ｍＡｂ ＰＡ１４と２Ｄ７は、ランテスによって誘導されたカルシウムの
動員を遮断した（図２ａ，ｂ）。ＰＡ１４のカルシウム流動阻害のＩＣ_５０は５
０μｇ／ｍＬであり、２Ｄ７のＩＣ_５０より約８倍高かった（図２ｂ）。ランテ
ス、ＭＩＰ−１α、及びＭＩＰ−１βによって誘導されたカルシウムの流動は、
それぞれ、同様の濃度のＰＡ１４によって阻害された（データは示さず）。前記
ｍＡｂは何れも、Ｌ１．２−ＣＣＲ５^＋細胞（内在性ＣＸＣＲ４を発現する）中
での、ＳＤＦ−１によって誘導されるカルシウムの動員に影響を与えなかった（
データは示さず）。最後に、ｍＡｂとＣＣ−ケモカインの何れも、Ｌ１．２の親
細胞の細胞質カルシウムレベルに影響を与えなかった（データは示さず）。

【００９１】 ５）ｍＡｂによるＣＣＲ５補助受容体機能の阻害 まず、それらがＨＩＶ−１エンベロープによって媒介される細胞−細胞融合を
阻害する能力に基づいて、ｍＡｂ ＰＡ８〜ＰＡ１２及びＰＡ１４を選択した。
精製したｍＡｂについて、この活性を確認し、定量した。予想どおり、６つのｍ
Ａｂは全て、ｍＡｂ ２Ｄ７と同様、ＲＥＴアッセイで、ＣＤ４^＋ＣＣＲ５^＋Ｐ
Ｍ１細胞とＨｅＬａ−Ｅｎｖ_{ＪＲ−ＦＬ} ^＋細胞との融合をブロックした。効力は
、２Ｄ７~ ＰＡ１４＞ ＰＡ１２＞ ＰＡ１１＞ ＰＡ１０~ ＰＡ９~ ＰＡ
８の順であった（図３ａ）。ＰＡ１４と２Ｄ７のＩＣ_５０値は、それぞれ１．７
μｇ／ｍＬと１．６μｇ／ｍＬであり、ＰＡ１１とＰＡ１２では、それぞれ２５
．５μｇ／ｍＬと１０．０μｇ／ｍＬであった（表３）。ＰＡ８、ＰＡ９及びＰ
Ａ１０は、３００μｇ／ｍＬで、１０〜１５％しか融合を阻害しなかった。前記
ｍＡｂは何れも、ＰＭ１細胞とＨｅＬａ−Ｅｎｖ_ＬＡＩ ^＋細胞（Ｘ４ウイルスの
完全長エンベロープタンパク質を発現している）の融合に影響を与えなかった（
データは示さず）。

【００９２】 １回の複製、ルシフェラーゼベース侵入アッセイで、前記異なる抗ＣＣＲ５
ｍＡｂが、プロトタイプのＲ５ウイルス、ＪＲ−ＦＬ、及びＲ５Ｘ４ウイルス、
Ｇｕｎ−１の侵入を阻害する能力も調べた。侵入アッセイにおける効力の順序は
、前記細胞−細胞融合アッセイで測定したものと類似していた（図３ｂ）。ＰＡ
８〜ＰＡ１１では、５０％を超えてＪＲ−ＦＬ又はＧｕｎ−１の侵入を阻害する
ことはできなかった。ＰＡ１２のＩＣ_５０値は２．５μｇ／ｍＬであった。しか
しながら、該ｍＡｂは、６０％を超えて侵入を阻害することはできなかった。Ｐ
Ａ１４と２Ｄ７のＪＲ−ＦＬ侵入阻害のＩＣ_５０値は、それぞれ、０．０２４と
０．０２６μｇ／ｍＬであり（表３）、融合アッセイで得られた値よりも６０倍
低かった。二重指向性のＧｕｎ−１の侵入は、抗ＣＣＲ５ ｍＡｂによる阻害に
対して、ＪＲ−ＦＬの侵入より２〜３倍感度が高かった（データは示さず）。

【００９３】 抗補助受容体ｍＡｂは、直接前記ｇｐ１２０／ＣＣＲ５相互作用に影響を及ぼ
すか、又は活性な融合複合体の形成に関与する結合後の段階を妨害するかの何れ
かにより、エンベロープによって媒介される融合を阻害するのかもしれない。Ｐ
Ａ８〜ＰＡ１２及びＰＡ１４によるウイルスの融合と侵入を阻害する機序を決定
するために、種々のｍＡｂが前記ｇｐ１２０／ＣＣＲ５相互作用をブロックする
能力を調べた。このために、ｓＣＤ４と複合体を形成したビオチン化ＨＩＶ−１ _{ＪＲ−ＦＬ} ｇｐ１２０のＬ１．２−ＣＣＲ５^＋細胞への結合を検出するアッセイ
を用いた。ｓＣＤ４又はＣＣＲ５の非存在下か、又はＨＩＶ−１_ＬＡＩｇｐ１２
０を使用したときには、ビオチン化ｇｐ１２０の結合は観察されなかった（図３
ｃ）。

【００９４】 ＰＡ８を除く全てのｍＡｂは、ｇｐ１２０／ｓＣＤ４のＬ１．２−ＣＣＲ５^＋ への結合を阻害した（図３ｄ）。約４０％で飽和したＰＡ８による阻害は、フロ
ーサイトメトリーのデータ（表１）と一致し、このｍＡｂがＬ１．２−ＣＣＲ５ ^＋ 細胞上のＣＣＲ５分子のサブセットのみと結合することを示唆する。ｍＡｂ
ＰＡ９、ＰＡ１０、ＰＡ１１及びＰＡ１２は、それぞれ、０．２４、０．１３、
０．３３、０．２４μｇ／ｍＬのＩＣ_５０値で結合を阻害した（表３）。驚くべ
きことに、ｍＡｂ ＰＡ１４と２Ｄ７は、ＩＣ_５０値がそれぞれ１．５８、１．
３８μｇ／ｍＬで、これら２つは、ｇｐ１２０／ｓＣＤ４結合の阻害に最も効果
がなかった（表３）。それ故、ｍＡｂがｇｐ１２０／ＣＤ４／ＣＣＲ５によって
媒介される膜融合と侵入を阻害する能力とｇｐ１２０／ｓＣＤ４の補助受容体へ
の結合を遮断する能力の間には、相関はなかった。

【００９５】 ６）抗−ＣＣＲ５ ｍＡｂと他のウイルス侵入抑制剤の組み合わせによるＨＩＶ −１融合の相乗的な阻害 補助受容体に特異的な薬剤は、組み合わせて使用すると、侵入過程の複数の段
階で作用して、非相加的効果を示し得る。臨床的な展望から、補助受容体に特異
的な薬剤候補の内在性ケモカインとの相互作用を測定することは重要であり、そ
れにより、多少のレベル、疾病の進行が保護されるかもしれない。それ故、ＣＣ
Ｒ５ ｍＡｂどうしを組み合わせて、又はランテス、若しくはＣＤ４−ＩｇＧ２
（ＨＩＶ−１ ｇｐ１２０と結合し、標的細胞への付着を阻害する）と組み合わ
せて、ＣＣＲ５ ｍＡｂをテストした。ウイルス融合及び侵入アッセイにおいて
、前記薬剤を各別に、及び組み合わせて使用し、用量応答曲線を得た。５０％効
果則（９）を用いてデータを分析した。ある効果を生じるために必要な、単一薬
剤又はそれらの混合物の濃度を、組合せ指数（ＣＩ；Ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ
Ｉｎｄｅｘ）として知られている用語で、定量的に比較した。１より大きなＣＩ
値は拮抗作用を示し、約１のＣＩは相加的効果を示し、１より小さなＣＩは相乗
的効果（この場合、１つの薬剤の存在が他の効果を増強する）を示す。

【００９６】 ＰＡ１２と２Ｄ７の組合せは、相乗作用が最も強力であり、ＣＩ値は、抗体の
割合に応じて０．０２〜０．２９の範囲にあった（図４及び表２）。相乗効果の
程度は、前記薬剤の化学量論に応じて変動することが知られている。ウイルスの
侵入及び融合アッセイは、高度に相乗的なＰＡ１２と２Ｄ７；中程度に相乗的な
ＰＡ１２とＰＡ１４；相加的なＰＡ１１とＰＡ１２；若干拮抗的であるＰＡ１４
と２Ｄ７というｍＡＢの組合せの同定に概ね一致した。フローサイトメトリーに
よって決定されたように、これらのｍＡｂが、ＣＣＲ５^＋細胞への結合を交叉競
合するのであれば、ＰＡ１４と２Ｄ７の間に相乗効果がないことは驚くべきこと
ではない（データは示さず）。ＰＡ１１とＰＡ１２で相加的効果が観察されたと
いうことは、これらのｍＡｂがＣＣＲ５中の僅かに異なるエピトープに結合する
が、ともにＮｔ中に存在するＱ４残基に依存しているという証左であり得る。

【００９７】 細胞−細胞融合の遮断において、ｍＡｂ ＰＡ１２、ＰＡ１４、及び２Ｄ７が
ランテスと相乗的に共同し得る能力についても調べた。ＰＡ１２とランテスの組
合せは、中程度の相乗効果を示した（表２）。ＰＡ１４と２Ｄ７は、ランテスと
全く相乗効果を示さなかった。これは、これらのｍＡｂがランテスの結合とシグ
ナル伝達に対して抑制的に働くことと一致する（図２ａ、ｂ）。最後に、我々は
、ｍＡｂ ＰＡ１２、ＰＡ１４、２Ｄ７及びＣＤ４−ＩｇＧ２（ｇｐ１２０と相
互作用する）の間の相乗効果を調べた。我々は、ＰＡ１２とＣＤ４−ＩｇＧ２の
間で中程度の相乗効果を観察したが、ＰＡ１４又は２Ｄ７とＣＤ４−ＩｇＧ２の
間では相乗効果を観察しなかった（表２）。

【００９８】 ＜実験の考察＞ ６つのマウス抗ＣＣＲ５ ＩｇＧ１ ｍＡｂを単離し、性質決定した。ＰＡ８
、ＰＡ９、ＰＡ１１、ＰＡ１２及びＰＡ１４は、異なる分子種であるにもかかわ
らず、ＰＡ９とＰＡ１０は前記諸分析によって区別できないことから、おそらく
同一のｍＡｂである。単離されたｍＡｂは全て、ネイティブの細胞表面タンパク
質に対して産生されたｍＡｂによくみられるように、複雑な高次構造のエピトー
プを認識する。全てのｍＡｂについて、一群のＣＣＲ５アラニン点変異体を用い
て、エピトープマッピングを実施した。全てのｍＡｂの結合に対して同様に影響
を与える残基は、前記補助受容体中の高次構造に擾乱を引き起こし、前記ｍＡｂ
のエピトープの一部を構成しないと推測された。２つのこのような残基、Ｙ１０
とＤ１１のみが、ＨＩＶ−１の侵入に影響を与えることが示されている（２０，
５２）。前記ＰＡ８、ＰＡ１１及びＰＡ１２エピトープは、もっぱらＮｔドメイ
ン中に位置する。この結果に一致して、ＰＡ８は、ＥＬＩＳＡで、Ｄ２〜Ｒ３１
の残基を含むビオチン化Ｎｔペプチドを結合することが可能であった（データは
示さず）。しかしながら、ＰＡ１１とＰＡ１２（これらの結合は、Ｑ４のみに強
く依存する）は、溶液中では、Ｎｔペプチドを結合しなかった（データは示さず
）。一つの可能性としては、前記Ｎｔペプチドは、ＰＡ１１とＰＡ１２によって
認識される固有の高次構造を有しないのに対して、ＰＡ８の結合は高次構造に対
する依存度が少ないであろうということである。あるいは、ＰＡ１１とＰＡ１２
は、我々が変異させていない残基と相互作用するか、又はＣＣＲ５の他のドメイ
ン中に位置するアミノ酸と弱い結合を形成するか、又は突然変異誘発によってそ
の提示が変更されないかもしれないペプチド骨格の原子を結合するのかもしれな
い。抗体ＰＡ９、ＰＡ１０及びＰＡ１４は、ＣＣＲ５の前記ＮｔとＥＣＬ２ドメ
インの両者の中に存在する残基を含むエピトープを認識したのに対して、前記２
Ｄ７エピトープは、もっぱらＥＣＬ２の中に位置した。

【００９９】 前記ＰＡ１４エピトープは、Ｎｔ中のＤ２とＥＣＬ２中のＲ１６８をともに含
み、これら２つの残基が、ｍＡｂフットプリントに関して、互いに近接している
ことを示している。これらは、反対電荷を介して、互いに直接相互作用している
こともあり得る。

【０１００】 ｍＡｂ ＰＡ８〜ＰＡ１２とＰＡ１４は、細胞のタイプに依存的に、異なる強
度で、ＣＣＲ５^＋細胞を染色した。ＰＡ８を除く全てのｍＡｂは、９０％を超え
るＬ１．２−ＣＣＲ５^＋細胞を染色し、最も高い平均蛍光強度は、ＰＡ１１とＰ
Ａ１２で観察された。しかしながら、ＰＡ１４と２Ｄ７は、ＰＢＭＣを最も高い
パーセントで染色し、これらの細胞で最も高い平均蛍光強度が得られた。最近Ｈ
ｉｌｌら（２８）は、トランスフェクトされた細胞を同様に染色する一群の抗Ｃ
ＣＲ５ ｍＡｂの性質を決定したが、８つのうち２つのみがＰＢＭＣを染色し、
一次単球は何れも染色しなかった。おそらく、２つのｍＡｂが一次細胞と反応し
ないことは、ＣＣＲ５に対する低い親和性によって、説明されるが、これは、他
の４つが反応できなかったことに対する説明とはなり得ないであろう。我々のｍ
Ａｂ群では、エピトープがＥＣＬ２の最初の１０残基全体、又はその一部に位置
するｍＡｂ ２Ｄ７とＰＡ１４が、ＰＭＢＣを最も強く染色することが観察され
る。しかしながら、Ｈｉｌｌらは、前記Ｎｔ及びＥＣＬ１に特異的なｍＡｂはＰ
ＢＭＣを染色するが、ＥＣＬ２とＥＣＬ３に対するｍＡｂはＰＢＭＣを染色しな
いと報告しているので、一貫した反応パターンは同定されていない。ｍＡｂによ
って、細胞の種類に特異的な染色がなされることに対する１つの説明は、活性化
されたＰＢＭＣ（及び単球）が、細胞表面のＣＣＲ５に結合し、幾つかのｍＡｂ
エピトープを遮蔽するＣＣ−ケモカインを分泌することであり得る。しかしなが
ら、このことは、ケモカインによって誘導されるカルシウム動員のアンタゴニス
トであり、おそらくはＣＣＲ５への結合をＣＣ−ケモカインと競合するであろう
ＰＡ１４と２Ｄ７に、とりわけ当てはまるであろう。それにもかかわらず、これ
らのｍＡｂはＰＢＭＣを最も強く染色する。あるいは、ＣＣＲ５のエピトープの
露出が異なるのは、細胞のタイプに特異的な受容体のオリゴマー化、他の細胞表
面分子との会合、又はグリコシル化のような様々な翻訳後修飾を反映しているの
かもしれない。我々は、ｍＡｂ結合の差異が、おそらく細胞の種類に特異的なＣ
Ｄ４／ＣＣＲ５相互作用の差異を反映していないことを示した。

【０１０１】 ｍＡｂ ＰＡ８〜ＰＡ１２は、ＣＣＲ５^＋細胞中で、ＣＣ−ケモカインによっ
て誘導されるカルシウムの動員を阻害せず、ＣＣＲ５を介したシグナル伝達も媒
介しなかった。ｍＡｂ ２Ｄ７とＰＡ１４は、ＣＣ−ケモカインによって誘導さ
れるカルシウムの動員の阻害剤であるが、２Ｄ７は、ＰＡ１４と比べて、ほぼ１
桁強力であった。これは、前記ＰＡ１４のエピトープが、２Ｄ７のエピトープと
比べて、ＣＣＲ５上の前記ＣＣ−ケモカイン結合ドメインと重複する度合いが少
ないためかもしれない。全てのｍＡｂは、ＨＩＶ−１の侵入とエンベロープによ
って媒介される膜融合もブロックしたが、ある場合には、細胞−細胞融合の阻害
には、ウイルスの侵入をブロックするのに必要とされる量よりほぼ２桁多い抗体
が必要であった。おそらく、細胞と細胞の融合の間には、より多くのｇｐ１２０
／ＣＤ４／ＣＣＲ５の相互作用に加えて、接着分子間の相互作用が確立され、ウ
イルスと細胞の融合と比べて、協調的に作用しているために、阻害され難いので
あろう。このことは、ＬＦＡ−１又はＨＩＶ−１エンベロープ糖蛋白質に対する
抗体に共通して観察される（４５，５１）。ＰＡ８、ＰＡ９及びＰＡ１０は、抗
体濃度が最も高いときでさえ、細胞−細胞融合を１５％未満、ウイルスの侵入を
４０％未満しか遮断することができなかった。しかしながら、ＰＡ１１、ＰＡ１
２及びＰＡ１４を用いると、９０％を超える融合の阻害を達成し、ＰＡ１４を用
いると、９０％を超える侵入の阻害を達成することができる。６つのｍＡｂの中
で融合と侵入を最も強力に遮断するのはＰＡ１４であり、これは２Ｄ７と同程度
に有効であった。驚くべきことに、ＰＡ１４と２Ｄ７は、ｇｐ１２０／ｓＣＤ４
のＬ１．２−ＣＣＲ５^＋細胞への結合の阻害剤の中で最も効力が劣る阻害剤の１
つであったのに対して、ＰＡ９〜ＰＡ１２は同じ程度の効力で遮断し、ＰＡ８は
、４０％を超えてｇｐ１２０／ｓＣＤ４の結合を遮断することはできなかった。
これらの観察は、異なる細胞上に呈示されたＣＣＲ５分子の性質について、及び
ウイルスの融合と侵入の阻害機序についての問題を提起する。Ｌ１．２細胞上の
ＣＣＲ５（ｍＡｂとｇｐ１２０結合のアッセイで使用した）は、ＰＢＭＣ上のＣ
ＣＲ５（ｍＡｂ結合アッセイで使用した）と、又はＰＭ１及びＵ８７ＭＧ細胞上
のＣＣＲ５（前記融合及び侵入アッセイで使用した）と同一の高次構造ではない
かもしれない。

【０１０２】 我々のｍＡｂの中に、ＰＢＭＣの染色が不良で、融合及び侵入の阻害が不完全
なものがあるということは、それらが一次リンパ球（ＰＭ１及びＵ８７ＭＧ−Ｃ
Ｄ４^＋ＣＣＲ５^＋細胞株）上に発現したＣＣＲ５分子のサブセットだけに結合で
きることを示す。それにもかかわらず、ＰＡ８以外のｍＡｂは全て、９０％を超
えるＬ１．２−ＣＣＲ５^＋細胞を染色することができ、これらの細胞への前記ｇ
ｐ１２０／ｓＣＤ４複合体の結合を完全に遮断することができる。Ｌ１．２−Ｃ
ＣＲ５^＋細胞と、我々が用いた他の細胞との少なくとも１つの差異は、細胞表面
上の補助受容体タンパク質の密度である。実際、我々は、前記Ｌ１．２−ＣＣＲ
５^＋細胞が、ＰＭ１及びＵ８７ＭＧ−ＣＤ４^＋ＣＣＲ５^＋細胞より、細胞表面の
補助受容体を１０〜１００倍発現すると推定する。しかし、前記Ｌ１．２−ＣＣ
Ｒ５^＋細胞株と同程度の補助受容体を一過性に発現するように、ＨｅＬａ細胞を
加工しても、なおｇｐ１２０／ｓＣＤ４のそれらへの結合を検出することができ
ない（データは示さず）。それ故、他の細胞特異的な因子ともに、Ｌ１．２上の
ＣＣＲ５を過剰発現すると、補助受容体は、顕著にＮｔを露出する高次構造をと
りやすくなり、ｍＡｂとｇｐ１２０の両者により到達しやすくなるのかもしれな
い。このような高次構造は、受容体のオリゴマー化により、細胞表面タンパク質
との会合の減少又は変化により、又は受容体のＧタンパク質との相互作用により
、誘導され得る（２５，６２）。ＣＣＲ５の複数の高次構造が、前記細胞表面上
に共存し、それらは全てウイルスの侵入を許容するのであろうか？減少したレベ
ルにもかかわらず、ｇｐ１２０がＬ１．２−ＣＣＲ５^＋細胞に結合するのに必要
とされるエピトープを飽和するｍＡｂ濃度の存在下で、ＨＩＶ−１侵入と融合が
起こり得るので、全ｍＡｂ反応性のパターンは、これを示唆するであろう。Ｌ１
．２−ＣＣＲ５^＋細胞上に存在する前記補助受容体分子は、ＨＩＶ−１が侵入可
能な高次構造を１つ有するのに対して、ＰＢＭＣ、ＰＭ１及びＣＣＲ５^＋Ｕ８７
ＭＧ上のＣＣＲ５分子は、異なるｍＡｂ反応性を示す複数の侵入可能な状態で存
在するという仮説を我々は支持する。ＰＡ１４と２Ｄ７は全ての高次構造を認識
し得るのに対して、他のｍＡＢは認識し得ない。何故、Ｌ１．２細胞は、ある特
定の融合可能な高次構造になり得るのかということは、今後明らかにされねばな
らない。

【０１０３】 前記ｇｐ１２０結合ドメインは、前記ＣＣＲ５のＮｔドメインの最初の２０残
基中に存在することが最近実証された。ＣＣＲ５上のｇｐ１２０結合ドメインに
対するｍＡｂは、この相互作用を強力に遮断するが、エピトープがこの領域の外
側に存在するＰＡ１４と２Ｄ７とほぼ同一の効率で、標的細胞中へのＨＩＶ−１
の融合と侵入を阻害するわけではない。ＰＡ１４は、Ｎｔの先端とＥＣＬ２の残
基を認識するのに対して、２Ｄ７エピトープは、もっぱらＥＣＬ２の中に位置し
ている。これらのｍＡｂの作用機序は、推測の域を出ない。それらがＥＣＬ２の
最初の２〜３個の残基に結合することによって、膜の融合を阻止する、補助受容
体中の高次構造の変化が誘導されるのかもしれない。あるいは、ＥＣＬ２エピト
ープの閉塞は、補助受容体のオリゴマー化と融合可能なタンパク質複合体の形成
を妨げるのかもしれない。さらに別の可能性は、ＥＣＬ２中の残基は、融合孔の
内部に面し、ｍＡｂの結合は、ｇｐ４１が、形質膜の中に融合ペプチドを挿入す
るのを妨害することである。これに対して、ｍＡｂ ＰＡ８−ＰＡ１２は、おそ
らく、ｇｐ１２０／ＣＤ４複合体と直接結合を競合することのみによって、融合
と侵入を阻害する。エピトープの露出とＣＣＲ５に対する親和性以外のパラメー
ターが、これらのｍＡｂによるウイルスの侵入の阻害の効力を決定しているかど
う、我々は分からない。ｇｐ１２０／補助受容体相互作用に続く工程を阻害する
ことが、何故、当該相互作用を直接遮断することよりも効率的なのかは不明であ
る。これを説明する１つの方法は、ｇｐ１２０のＣＣＲ５への結合における解離
速度が、ｍＡｂのＣＣＲ５への結合における結合速度に比べてずっと小さいと仮
定することである。この相互作用は、膜の融合をもたらすので、このため、ｍＡ
ｂが補助受容体分子から解離するごとに、ビリオンに付随するｇｐ１２０分子は
、準不可逆的な態様でこれを置換する。抗ＣＣＲ５ｍＡｂを組み合わせたときの
相乗効果は、それらが、おそらく、相互依存的な、連続するＨＩＶ−１の侵入工
程に関与する別個のエピトープと相互作用する結果である。抗ＨＩＶ−１抗体（
３３、３５、６１）、逆転写酵素阻害剤（２９）、又はプロテアーゼ阻害剤（４
４）の組合せで、０．２未満のＣＩ値が観察されることは稀なので、ＰＡ１２と
２Ｄ７の間で観察された相乗効果の程度（多くの条件下でＣＩ＜０．１）は、尋
常ではない。その効力故に、ＰＡ１２と２Ｄ７の組合せは、複数のアッセイ形式
と濃度比で調べたが、一貫して、高レベルの相乗効果が観察された。ＰＡ１２を
ＰＡ１４と組み合わせると、中程度の相乗効果が観察された。ＰＡ１２とＣＤ４
−ＩｇＧ２の間でも、中程度の相乗効果が観察された。ＣＤ４／ｇｐ１２０複合
体は、準安定状態にあり、補助受容体と相互作用できなければ、非融合誘導状態
へと崩壊する（４５−４８）。ＰＡ１２は、ＣＣＲ５上のｇｐ１２０結合部位を
直接遮断するので、その存在によって、平衡は、ｇｐ１２０／ＣＤ４複合体の不
活性化の方向にシフトするかもしれない。このことは、何故、融合と侵入の阻害
に関して、ＣＤ４−ＩｇＧ２とｍＡｂ ＰＡ１２の間で相乗効果が観察されるか
を説明するであろう。ｍＡｂ ＰＡ１４とＣＤ４−ＩｇＧ２の間に相乗効果が存
しないことは、それらが、ウイルスの侵入における２つの非連続的且つ独立した
工程に作用することを示唆する。ウイルスの融合と侵入の阻害に関する、様々な
化合物の相乗効果の正確な機序を決定するには、さらなる複数の研究が必要とな
ろう。

【０１０４】 上記の結果は、ＨＩＶ−１の侵入が、受容体の結合、補助受容体の結合、及び
補助受容体を介した膜の融合を含む３つの異なる工程で起こるモデルと合致する
。モノクローナル抗体がｇｐ１２０の結合を遮断する能力とＨＩＶ−１の融合／
侵入を遮断する能力の間に相関が存在しないことは、別個の補助受容体結合及び
融合現象を示唆している。さらに、観察される相乗効果のパターンから、融合中
の現象の時間的な順序が示唆される。ＰＡ１２のような、中間段階（すなわちｇ
ｐ１２０の結合）を強力に阻害する物質は、前工程とその後の工程の阻害剤と相
乗的に作用する。

【０１０５】

【参照文献】

【図面の簡単な説明】

【図１】 抗ＣＣＲ５モノクローナル抗体のＣＣＲ５^＋細胞への結合： Ｌ１．２−ＣＣＲ５^＋細胞及びＰＨＡ／ＩＬ−２刺激を受けた単離直後のＰＢ
ＭＣの表面上でのＣＣＲ５タンパク質の発現を検出するためにフローサイトメト
リーを使用した。飽和濃度の各ｍＡｂとともに細胞をインキュベートし、ＰＥで
標識した抗マウスＩｇＧレポーター抗体を用いて検出した。代表的な実験で得ら
れた結果が示されている。各ｍＡｂについての結果は、平均蛍光強度（ｍ．ｆ．
ｉ．）とゲートを通過した細胞％の両者で表されている。ＰＡ８〜ＰＡ１２とＰ
Ａ１４は、全てＩｇＧ１サブクラスに属するので、それらのｍ．ｆ．ｉ．は直接
比較することができる。２Ｄ７は、ＩｇＧ２ａである。

【図２】 様々な組合せのｍＡｂとウイルス阻害剤のＣＩ値： 様々な組合せのウイルス侵入阻害剤について、図７の説明に記載されているよ
うな実験を行った。抗ＣＣＲ５ｍＡｂどうし、抗ＣＣＲ５ｍＡｂとＣＣ−ケモカ
イン、及びＣＤ４−ＩｇＧ２（ＨＩＶ−１の標的細胞への接着を阻害する）を組
み合わせて、抗ＣＣＲ５ ｍＡｂをテストした。ＰＡ１１とＰＡ１２の濃度範囲
は、０〜２５０μｇ／ｍＬであった；２Ｄ７とＰＡ１４の濃度範囲は、０〜２５
μｇ／ｍＬであった；ランテスの濃度範囲は、０〜２５０ｎｇ／ｍＬであった；
ＣＤ４−ＩｇＧ２の濃度範囲は、０〜２５μｇ／ｍＬであった。融合又は侵入を
５０％及び９０％阻害するのに必要とされる単一物質又はそれらの混合物の濃度
は、組合せ指数（ＣＩ；ｃｏｍｂｉｎａｔｉｏｎ ｉｎｄｅｘ）として知られる
用語で定量的に比較した。

【図３】 抗ＣＣＲ５ｍＡｂによる、細胞−細胞融合、ウイルスの侵入、及びｇｐ１２０ ／ｓＣＤ４結合の阻害に対するＩＣ_５０値 ： 比較のため、抗ＣＣＲ５ｍＡｂをテストした、異なるアッセイで得られたＩＣ _５０ 値をまとめた。ＩＣ_５０値は、９０％を超える融合、侵入、又は結合を阻害
することができたｍＡｂに対してのみ算出した。

【図４】 抗ＣＣＲ５ ｍＡｂｓのエピトープマッピング： Ｃ末端にＨＡペプチドが付加された変異ＣＣＲ５タンパク質へのｍＡｂの結合
を評価するために、２色染色プロトコールを使用した。飽和濃度の各ｍＡｂとと
もに、ＣＣＲ５点変異を発現しているＨｅＬａ細胞をインキュベートした後、Ｐ
Ｅ標識した抗マウスＩｇＧを用いて検出した。細胞表面の補助受容体の発現は、
ＦＩＴＣ標識した抗ＨＡ ｍＡｂを用いた細胞の二重染色によって測定した。４
つの枠は、ＣＣＲ５の４つの細胞外ドメインに対応している。各枠の第１列は、
対応するＣＣＲ５の細胞外ドメインのアミノ酸配列を示している。各残基がアラ
ニンに変異された変異体への抗ＣＣＲ５ｍＡｂの結合は、物質と方法に記載され
ているように、野生型ＣＣＲ５への結合のパーセントとして表されている。

【図５Ａ】 抗ＣＣＲ５ｍＡｂによるＣＣＲ５^＋細胞内へのカルシウム動員の阻害： Ｌ１．２−ＣＣＲ５^＋細胞にＩｎｄｏ−１ＡＭを与え、抗ＣＣＲ５ｍＡｂ又は
ＰＢＳの後にランテスで、順次刺激した（ａ）。蛍光分光測定機で蛍光の変化を
測定した。追跡データは、代表的な実験からのものである。

【図５Ｂ】 広範囲にわたるｍＡｂ濃度に対して、ＰＡ１４と２Ｄ７によるカルシウム流動
の阻害を調べた（ｂ）。結果は、カルシウム流動の％阻害＝［１−（ｍＡｂの存
在下での相対蛍光／ｍＡｂの非存在下での相対蛍光）×１００％としてプロット
されており、独立した３つの実験から得られた値の平均である。

【図６Ａ】 抗ＣＣＲ５ｍＡｂによるＣＣＲ５補助受容体機能の阻害： ＲＥＴアッセイで、抗ＣＣＲ５ｍＡｂによる細胞−細胞融合の阻害を調べた（
ａ）。それぞれＦ１８とＲ１８で標識されたＨｅｌａ−Ｅｎｖ_{ＪＲ−ＦＬ}とＰＭ
１細胞の混合物に、０〜２５０μｇ／ｍＬのＰＡ８−ＰＡ１２、又は０〜２５μ
ｇ／ｍＬのＰＡ１４若しくは２Ｄ７を加えた。４時間インキュベートしてから、
蛍光ＲＥＴを測定した。結果は、独立した３つの実験から得られた値の平均であ
り、融合の％阻害＝［１−（ｍＡｂの存在下での％ＲＥＴ／ｍＡｂの非存在下で
の％ＲＥＴ）×１００％として表されている。

【図６Ｂ】 １回複製、ルシフェラーゼベースの侵入アッセイで、抗ＣＣＲ５ｍＡｂによる
ＨＩＶ−１の侵入の阻害を調べた（ｂ）。０〜２５０μｇ／ｍＬのＰＡ８−ＰＡ
１２、又は０〜２５μｇ／ｍＬのＰＡ１４若しくは２Ｄ７の存在下で、Ｕ８７−
ＣＤ４⁻ＣＣＲ５^＋細胞を、ＪＲ−ＦＬエンベロープを有するＮＬｌｕｃ^＋ｅｎ
ｖ⁻レポーターウイルスに感染させた。感染から７２時間後に、細胞溶解物のル
シフェラーゼ活性（相対光ユニット、ｒ．ｌ．ｕ．；ｒｅｌａｔｉｖｅ ｌｉｇ
ｈｔ ｕｎｉｔｓ）を測定した。結果は、代表的な実験から得られたものであり
、侵入の阻害％＝［１−（ｍＡｂの存在下でのｒ．ｌ．ｕ．／ｍＡｂの非存在下
でのｒ．ｌ．ｕ．）×１００％として表されている。

【図６Ｃ】 ビオチン化された［ｂ］ｇｐ１２０、ｓＣＤ４、及びｂ−ｇｐ１２０−ＣＤ４
複合体のＬ１．２−ＣＣＲ５^＋細胞への結合（ｃ）。Ｒ５ウイルスＨＩＶ−１_{Ｊ Ｒ−ＦＬ} 由来のｇｐ１２０が、等量のｓＣＤ４と複合体を形成したときに、強い
結合が観察される。ｓＣＤ４の非存在下、又はＸ４ウイルスＨＩＶ−１_ＬＡＩ由
来のｇｐ１２０に対しては、結合は観察されない。全ての曲線からＣＣＲ５−Ｌ
１．２細胞へのバックグラウンド結合を差し引いた。

【図６Ｄ】 異なる濃度の各抗体の存在下で、Ｌ１．２−ＣＣＲ５^＋細胞へのｇｐ１２０／
ｓＣＤ４の結合の阻害を調べた（ｄ）。９６ウェルプレート中で、細胞を抗ＣＣ
Ｒ５ｍＡｂとプレインキュベートした後、飽和濃度のビオチン化ｇｐ１２０／ｓ
ＣＤ４とともにインキュベートした。最後に、蛍光プレートリーダーを用いて、
ＰＥ標識したストレプトアビジンの細胞への結合を測定した。結果は、代表的な
実験からのものであり、ｇｐ１２０／ｓＣＤ４結合の％阻害＝［１−（ｍＡｂ存
在下でのｍ．ｆ．ｉ．／ｍＡｂの非存在下でのｍ．ｆ．ｉ．）×１００％として
表されている。

【図７】 ＰＡ１２と２Ｄ７による細胞−細胞融合の相乗的阻害： 個別に使用したｍＡｂ、及び組み合わせて使用したｍＡＢに関して、用量応答
曲線を得た。ＨｅＬａ−Ｅｎｖ_{ＪＲ−ＦＬ} ^＋とＰＭ１細胞の混合物に、０〜５０
μｇ／ｍＬのＰＡ１２、０〜２５μｇ／ｍＬの２Ｄ７、又は２：１の比で両者を
組み合わせたものを加え、それぞれＲ１８とＦ１８で標識した。インキュベーシ
ョンから４時間後に蛍光ＲＥＴを測定した。結果は、融合の阻害％として表し、
独立した３つの実験から得られた値の平均である。ｆ＝１／［１＋（Ｋ／ｃ）^ｍ ］（１）（ここで、ｆは感染したもの／阻害されたものの割合であり、ｃは濃度
であり、Ｋは５０％の効果を得るために必要な物質の濃度であり、ｍは用量応答
曲線の形状を記述する経験的な係数である）と表すことができる５０％効果測を
用いて、データを分析した。式（１）は、ｍが１である、ミカエリス−メンテン
の酵素速度論、ラングミュイールの吸着等温、及びヘンダーソン−ハッセルバル
ヒのイオン化平衡を記述する式を一般化したものである。本ケースでは、Ｋは、
ＩＣ_５０値に等しい。用量応答曲線にカーブフィッティングを行うことによって
、Ｋとｍを決定し、あるｆに対してｃを計算できるように、式（１）を変形した
。Ｋとｃの最適パラメーターは、ＰＡ１２で８．８μｇ／ｍＬと０．５４、２Ｄ
７で０．３６μｇ／ｍＬと０．６８、それらを組み合わせたもので０．１１μｇ
／ｍＬと１．１である。これらの曲線をプロットすると、実験と理論の間でかな
り良好なフィットが示される。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ｃ０７Ｋ 16/28 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ｃ // Ｃ１２Ｐ 21/08 Ａ６１Ｋ 37/02 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，Ｊ Ｐ，ＭＸ Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA63 CA04 DA02 EA04 GA11 4B064 AG27 CA10 CA19 CA20 CC24 DA01 4C084 AA02 AA07 AA20 BA03 CA62 DC50 MA02 NA14 ZB332 ZC552 4C085 AA14 BB11 CC02 CC05 DD23 DD32 4H045 AA11 AA30 CA40 DA76 EA29 FA74

Claims (77)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 HIV-1感染を阻害するための組成物であって、HIV-1感染を阻
   害するために相乗的に有効な量の少なくとも二つの化合物を含有し、これら化合
   物の少なくとも一つは、HIV-1およびHIV-1融合の共同受容体の間の増殖的相互作
   用を阻害する組成物。
2. 【請求項２】 HIV-1またはHIV-1エンベロープ糖＋タンパク質細胞の標的細
   胞への融合を阻害する組成物であって、HIV-1またはHIV-1エンベロープ糖タンパ
   ク質^＋細胞の標的細胞への融合を阻害するために相乗的に有効な量の少なくとも
   二つの化合物を含有し、これら化合物の少なくとも一つは、HIV-1およびHIV-1融
   合の共同受容体の間の増殖的相互作用を阻害する組成物。
3. 【請求項３】 請求項１または２に記載の組成物であって、前記共受容体は
   ケモカイン受容体である組成物。
4. 【請求項４】 請求項３に記載の組成物であって、前記ケモカイン受容体は
   ＣＣＲ５またはＣＸＣＲ４である組成物。
5. 【請求項５】 請求項１または２に記載の組成物であって、前記化合物の少
   なくとも一つは抗体である組成物。
6. 【請求項６】 請求項５に記載の組成物であって、前記抗体はモノクローナ
   ル抗体である組成物。
7. 【請求項７】 請求項５に記載の組成物であって、前記抗体は坑ケモカイン
   受容体抗体である組成物。
8. 【請求項８】 請求項７に記載の組成物であって、前記抗体は坑ＣＣＲ５抗
   体である組成物。
9. 【請求項９】 請求項１または２に記載の組成物であって、二以上の化合物
   が抗体である組成物。
10. 【請求項１０】 請求項８に記載の組成物であって、前記抗体はＰＡ８、Ｐ
    Ａ９、ＰＡ１０、ＰＡ１１、ＰＡ１２、ＰＡ１４、２Ｄ７またはこれらの組合せ
    である組成物。
11. 【請求項１１】 請求項１０に記載の組成物であって、前記二以上の抗体は
    適切な比率である組成物。
12. 【請求項１２】 請求項１１に記載の組成物であって、前記比率は１：１か
    ら５０：１の範囲である組成物。
13. 【請求項１３】 請求項９に記載の組成物であって、前記抗体はＰＡ８、Ｐ
    Ａ９、ＰＡ１０、ＰＡ１１、ＰＡ１２、ＰＡ１４、２Ｄ７またはこれらの組合せ
    である組成物。
14. 【請求項１４】 請求項１３に記載の組成物であって、前記二以上の抗体は
    適切な比率である組成物．
15. 【請求項１５】 請求項１４に記載の組成物であって、前記比率は１：１か
    ら５０：１の範囲である組成物。
16. 【請求項１６】 請求項１または２に記載の組成物であって、少なくとも一
    つの化合物はケモカインまたはケモカイン誘導体である組成物。
17. 【請求項１７】 請求項１６に記載の組成物であって、前記ケモカインはRA
    NTES、MIP-1α、MIP-1β、SDF-1またはこれらの組合せである組成物。
18. 【請求項１８】 請求項１６に記載の組成物であって、前記ケモカイン誘導
    体はMet-PANTES、AOP-PANTES、またはPANTES 9-68またはこれらの組合せである
    組成物。
19. 【請求項１９】 請求項１６に記載の組成物であって、前記二以上の化合物
    は適切な比率である組成物。
20. 【請求項２０】 請求項５に記載の組成物であって、少なくとも一つの化合
    物はケモカインまたはケモカイン誘導体である組成物。
21. 【請求項２１】 請求項２０に記載の組成物であって、前記ケモカインはRA
    NTES、MIP-1α、MIP-1β、SDF-1またはこれらの組合せである組成物。
22. 【請求項２２】 請求項２０に記載の組成物であって、前記ケモカイン誘導
    体はMet-PANTES、AOP-PANTES、またはPANTES 9-68またはこれらの組合せである
    組成物。
23. 【請求項２３】 請求項２０に記載の組成物であって、前記化合物は適切な
    比率である組成物。
24. 【請求項２４】 請求項１または２に記載の組成物であって、前記化合物の
    少なくとも一つは非ペプチジル分子である組成物。
25. 【請求項２５】 請求項２４に記載の組成物であって、前記非ペプチジル分
    子はビシクラムAMD3100である組成物。
26. 【請求項２６】 請求項１または２に記載の組成物であって、前記化合物の
    少なくとも一つは、標的細胞へのHIV-1の付着を阻害する組成物。
27. 【請求項２７】 請求項２６に記載の組成物であって、前記化合物の少なく
    とも一つはCD4に結合する組成物。
28. 【請求項２８】 請求項２７に記載の化合物であって、前記化合物の少なく
    とも一つはHIV-1エンベロープ糖タンパク質である組成物。
29. 【請求項２９】 請求項２７に記載の組成物であって、前記化合物の少なく
    とも一つは坑CD4抗体である組成物。
30. 【請求項３０】 請求項２６に記載の組成物であって、前記化合物の少なく
    とも一つはHIV-1エンベロープ糖タンパク質に結合する組成物。
31. 【請求項３１】 請求項２６に記載の組成物であって、前記化合物の少なく
    とも一つはCD4ベースのタンパク質である組成物。
32. 【請求項３２】 請求項３１に記載の組成物であって、前記化合物の少なく
    とも一つは坑CD4−IgG2である組成物。
33. 【請求項３３】 請求項２６に記載の組成物であって、前記化合物の少なく
    とも一つはHIV-1エンベロープ糖タンパク質に対する抗体である組成物。
34. 【請求項３４】 請求項２６に記載の組成物であって、前記二以上の化合物
    は適切な比率である組成物。
35. 【請求項３５】 請求項３４に記載の組成物であって、前記比率は１：１か
    ら１０：１の範囲である組成物。
36. 【請求項３６】 請求項５に記載の組成物であって、前記化合物の少なくと
    も一つは、標的細胞経のHIV-1の付着を阻害する組成物。
37. 【請求項３７】 請求項３６に記載の組成物であって、前記化合物の少なく
    とも一つはCD4に結合する組成物。
38. 【請求項３８】 請求項３７に記載の組成物であって、前記化合物の少なく
    とも一つはHIV-1エンベロープ糖タンパク質である組成物。
39. 【請求項３９】 請求項３７に記載の組成物であって、前記化合物の少なく
    とも一つは坑CD4抗体である組成物。
40. 【請求項４０】 請求項３６に記載の組成物であって、前記化合物の少なく
    とも一つは、HIV-1エンベロープ等タンパク質に結合する組成物。
41. 【請求項４１】 請求項３６に記載の組成物であって、善意化合物の少なく
    とも一つはCD4ベースのタンパク質である組成物。
42. 【請求項４２】 請求項４１に記載の組成物であって、前記化合物の少なく
    とも一つはCD4−IgG2である組成物。
43. 【請求項４３】 請求項３６に記載の組成物であって、前記化合物の少なく
    とも一つは、HIV-1エンベロープ糖たんぱく質に対する抗体である組成物。
44. 【請求項４４】 請求項３６に記載の組成物であって、前記二以上の化合物
    が適切な比率である組成物。
45. 【請求項４５】 請求項４４に記載の組成物であって、前記比率は１：１〜
    １０：１の範囲である組成物
46. 【請求項４６】 請求項１または２に記載の組成物であって、前記化合物の
    少なくとも一つは、CCR5エピトープに結合するポリペプチドからなる組成物。
47. 【請求項４７】 請求項４６に記載の組成物であって、前記エピトープはＮ
    末端に位置する組成物。
48. 【請求項４８】 請求項４６に記載の組成物であって、前記化合物はポリペ
    プチドである組成物。
49. 【請求項４９】 請求項４７に記載の組成物であって、前記エピトープはＮ
    末端におけるＮ13およびＹ16からなる組成物。
50. 【請求項５０】 請求項４６に記載の組成物であって、前記エピトープはＮ
    末端および第二細胞外ループにおける残基を含む組成物。
51. 【請求項５１】 請求項５０に記載の組成物であって、前記エピトープはＮ
    末端におけるＤ2、Ｙ3、Ｑ4、Ｓ7、Ｐ8およびＮ13、並びに第二細胞外ループに
    おけるＹ176およびＴ177からなる組成物。
52. 【請求項５２】 請求項５０に記載の組成物であって、前記エピトープはＮ
    末端におけるＤ2、Ｙ3、Ｑ4、Ｐ8およびＮ13、並びに第二細胞外ループにおける
    Ｙ176およびＴ177からなる組成物。
53. 【請求項５３】 請求項４７に記載の組成物であって、前記エピトープはＮ
    末端におけるＱ4からなる組成物。
54. 【請求項５４】 請求項５０に記載の組成物であって、前記エピトープはＮ
    末端におけるＤ2、並びに第二細胞外ループにおけるＲ168およびＹ176からなる
    組成物。
55. 【請求項５５】 請求項４６に記載の組成物であって、前記エピトープは第
    二細胞外ループに位置する組成物。
56. 【請求項５６】 請求項５５に記載の組成物であって、前記エピトープは第
    二細胞外ループにおけるＱ170およびＫ171からなる組成物。
57. 【請求項５７】 請求項５５に記載の組成物であって、前記エピトープは第
    二細胞外ループにおけるＱ170およびＥ172からなる組成物。
58. 【請求項５８】 請求項５５に記載の組成物であって、前記化合物の少なく
    とも一つは、抗体の軽鎖からなる組成物。
59. 【請求項５９】 請求項１または２に記載の組成物であって、前記化合物の
    少なくとも一つは、抗体の重鎖からなる化合物。
60. 【請求項６０】 請求項１または２に記載の組成物であって、前記化合物の
    少なくとも一つは、抗体のＦab部分からなる組成物。
61. 【請求項６１】 請求項１または２に記載の組成物であって、前記化合物の
    少なくとも一つは、抗体の可変ドメインからなる組成物。
62. 【請求項６２】 請求項１または２に記載の組成物であって、前記化合物の
    少なくとも一つは、抗体の一以上のCDR部分からなる組成物。
63. 【請求項６３】 HIV-1に罹患した患者を治療する方法であって、前記患者
    に対して、有効投与量の請求項１または２に記載の組成物を投与することを含む
    方法。
64. 【請求項６４】 患者がHIV-1に罹患するのを予防する方法であって、前記
    患者に対して、有効投与量の請求項１または２に記載の組成物を投与することを
    含む方法。
65. 【請求項６５】 ＰＡ8（ATCC受付番号HB-12605）、ＰＡ9（ATCC受付番号HB
    -12606）、ＰＡ10（ATCC受付番号HB-12607）、ＰＡ11（ATCC受付番号HB-12608）
    、ＰＡ12（ATCC受付番号HB-12609）、およびＰＡ14（ATCC受付番号HB-12610）か
    らなる群から選択される抗CCR5モノクローナル抗体。
66. 【請求項６６】 ヒト化形態である請求項６５に記載の抗体。
67. 【請求項６７】 請求項６６に記載の抗体であって、CDR領域外のアミノ酸
    の幾つか、大部分または全部がヒト免疫グロブリン分子由来のアミノ酸で置換さ
    れているが、一以上のCDR領域内の幾つか、大部分または全部のアミノ酸は変化
    していない抗体。
68. 【請求項６８】 請求項６５、６６または６７のモノクローナル抗体の軽鎖
    をコードする単離された核酸分子。
69. 【請求項６９】 前記核酸分子はRNA分子、DNA分子、またはcDNA分子である
    請求項６８に記載の核酸分子。
70. 【請求項７０】 請求項６５、６６または６７のモノクローナル抗体の重鎖
    をコードする単離された核酸分子。
71. 【請求項７１】 前記核酸分子はRNA分子、DNA分子、またはcDNA分子である
    請求項７０に記載の核酸分子。
72. 【請求項７２】 請求項６５、６６または６７のモノクローナルク体のＦab
    部分をコードする一以上の単離された核酸分子。
73. 【請求項７３】 前記核酸分子はRNA分子、DNA分子、またはcDNA分子である
    請求項７２に記載の核酸分子。
74. 【請求項７４】 請求項６５、６６または６７のモノクローナル抗体の一以
    上のCDR領域をコードする単離された核酸分子。
75. 【請求項７５】 前記核酸分子はRNA分子、DNA分子、またはcDNA分子である
    請求項７４に記載の核酸分子。
76. 【請求項７６】 請求項６５、６６または６７のモノクローナル抗体の可変
    ドメインをコードする一以上の単離された核酸分子。
77. 【請求項７７】 前記核酸分子はRNA分子、DNA分子、またはcDNA分子である
    請求項７６に記載の核酸分子。