ES2296416T3 - Anticuerpo pa14 frente a ccr5. - Google Patents

Abstract

Un anticuerpo monoclonal anti-receptor CCR5 para quimioquinas o uno de sus fragmentos, en el que el anticuerpo o su fragmento se une al mismo epítopo al que se une el anticuerpo monoclonal PA14, siendo PA14 el anticuerpo monoclonal producido por una línea de células de hibridoma depositada en la ATCC, Núm. de Registro HB-12610 y denominada PA14.

Description

Anticuerpo PA14 frente a CCR5.

Antecedentes de la invención

El virus de tipo 1 de la inmunodeficiencia humana (HIV-1) induce la fusión de membranas virus-célula para conseguir entrar en las células diana (8, 15, 66). La primera interacción de alta afinidad entre el virión y la superficie celular es la unión de la glicoproteína gp120 de la superficie viral al antígeno CD4 (13, 30, 41, 42). Ésta a su vez induce cambios conformacionales en gp120, que la permiten interaccionar con uno de los varios receptores para quimioquinas (4, 5, 21, 36). El receptor CCR5 para quimioquinas CC es el correceptor principal para las cepas macrófago-trópicas (R5) y desempeña un papel crucial en la transmisión sexual de HIV-1 (4, 5, 21, 36). Los virus trópicos hacia las líneas de células T (X4) usan CXCR4 para entrar en las células diana y normalmente, pero no siempre, aparecen de manera tardía en la progresión de la enfermedad o como consecuencia de la propagación del virus en cultivo de tejidos (4, 5, 21, 36). Algunos cultivos aislados primarios de HIV-1 tienen un tropismo dual (R5X4) ya que pueden usar ambos correceptores, aunque no siempre con la misma eficiencia (11, 57). Estudios de mutagénesis unidos a la resolución de la estructura cristalina de la zona central de gp120 demostraron que el sitio de unión al correceptor en gp120 comprende varios residuos conservados (32, 53, 65).

Se ha demostrado que las tirosinas y los residuos con carga negativa del dominio amino-terminal (Nt) de CCR5 son esenciales para la unión de gp120 al correceptor y para la fusión y entrada de HIV-1 (6, 18, 20, 22, 28, 31, 52, 54). Los residuos de los lazos extracelulares (ECL) 1-3 eran prescindibles para la función del correceptor, aunque la configuración interdominios tenía que mantenerse para la fusión y entrada óptimas del virus (24). Esto llevó a la conclusión de que, o gp120 forma interacciones con una superficie difusa sobre los ECL, o que el dominio Nt es mantenido en una conformación funcional por medio de enlaces con residuos de los ECL. Estudios realizados con correceptores quiméricos y con anticuerpos monoclonales anti-CCR5 han revelado también la importancia de los enlaces extracelulares para la entrada viral (5, 54, 64).

Las moléculas que se unen específicamente a CCR5 y CXCR4 y que bloquean las interacciones con sus ligandos son una herramienta poderosa para investigar a fondo las relaciones entre estructura/función de los correceptores. La caracterización de esos compuestos puede ayudar también a diseñar agentes terapéuticos efectivos que dirijan las etapas de la entrada viral mediadas por correceptor. Los inhibidores de la función del correceptor CCR5 o CXCR4, identificados hasta la fecha, son de diversa naturaleza e incluyen moléculas pequeñas, péptidos, quimioquinas y sus derivados, y anticuerpos monoclonales (mAb). Los mecanismos de acción de las moléculas pequeñas que bloquean la entrada interfiriendo con la función del correceptor CXCR4 no se conocen bien (17, 49, 55, 68). Uno de esos inhibidores, la pequeña molécula aniónica AMD3100, depende de residuos situados en ECL2 y en el cuarto dominio transmembrana (TM) de CXCR4 para inhibir la entrada viral, pero no está claro si lo hace alterando la unión de gp120 a CXCR4 o las etapas posteriores a la unión que conducen a la fusión de las membranas (16, 34, 55). Hasta la fecha, no se ha informado sobre la existencia de moléculas pequeñas que bloqueen de manera específica la entrada de HIV-1 mediada por CCR5. La inhibición de la entrada de HIV-1 por acción de quimioquinas está mediada por al menos dos mecanismos diferentes: el bloqueo de la interacción gp120/correceptor y la internalización del complejo quimioquina/receptor (3, 26, 59, 63). La variante APO-RANTES también inhibe el reprocesamiento de CCR5 hacia la superficie celular (40, 56). Variantes tales como la RANTES 9-68 y Met-RANTES solamente impiden la interacción gp120/CCR5 y no regulan CCR5 por disminución (67). Las variantes de SDF-1 presumiblemente actúan a través de un mecanismo similar para bloquear la entrada viral mediada por CXCR4 (12, 27, 39). Sólo un mAb anti-CXCR4, el mAb 12G5, ha sido caracterizado por sus propiedades antivirales. Se ha informado que la eficiencia de la inhibición de la entrada viral por acción de 12G5 depende tanto de la célula como del virus aislado (43, 58). Este mAb se une al ECL2 de CXCR4, pero se desconoce el mecanismo mediante el que inhibe la entrada (7). Sólo unos cuantos de los mAb anti-CCR5 caracterizados hasta la fecha impiden eficientemente la entrada de HIV-1 (28,64). Curiosamente, los mAb cuyos epítopos se encuentran situados en el dominio Nt de CCR5, que contiene el sitio de unión para gp120, inhiben la fusión y la entrada virales menos eficientemente que el mAb 2D7, cuyo epítopo se encuentra situado en el ECL2. El mAb 2D7 también antagoniza la actividad de las quimioquinas CC (64).

Se han aislado y caracterizado un panel de seis mAb murinos, denominados PA8, PA9, PA10, PA11, PA12 y PA14. Los seis mAb se unieron específicamente a células CCR5^{+} pero con eficiencias diferentes que fueron dependientes del tipo de célula. Estudios sobre mapeo de epítopos identificaron los residuos que son importantes para la unión de los mAb y también revelaron información sobre el plegamiento y las interacciones de los dominios extracelulares de CCR5. Todos los mAb inhibieron la fusión y la entrada de HIV-1 pero no hubo correlación entre la capacidad de un mAb para inhibir la fusión y la entrada, y su capacidad para inhibir la unión de gp120/sCD4 a células CCR5^{+}.

Esta invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti-receptor CCR5 para quimioquinas o uno de sus fragmentos según se definen en las reivindicaciones adjuntas, así como el uso de dicho anticuerpo monoclonal o de dicho fragmento para la preparación de una composición para inhibir la fusión de HIV-1 a células CD4^{+} y la entrada viral en dichas células.

Breve descripción de las figuras Figura 1 Unión de anticuerpos monoclonales anti-CCR5 a células CCR5^{+}

Se usó una citometría de flujo para detectar la expresión de la proteína CCR5 sobre la superficie de células L1.2-CCR5^{+} y de PBMC recién aisladas y estimuladas con PHA/IL-2. Las células se incubaron con concentraciones saturantes de cada uno de los mAb, que fueron detectados con un anticuerpo de reporte IgG anti-ratón, marcado con PE. Se muestran los resultados de un experimento representativo. Los resultados obtenidos para cada uno de los mAb están expresados tanto en forma de las intensidades de fluorescencia medias (m.f.i.), como en forma del % de las células seleccionadas. Debido a que PA8, PA12 y PA14 son todos ellos de la subclase IgG1, sus m.f.i. son directamente comparables. 2D7 es una IgG2a.

Figura 2 Valores de CI de diferentes combinaciones de mAb y e inhibidores virales

Se llevaron a cabo experimentos similares a los descritos en la leyenda de la Fig. 7 con diferentes combinaciones de inhibidores de la entrada viral. Los mAb anti-CCR5 se ensayaron combinados unos con otros, combinados con quimioquinas CC y combinados con CD4-IgG2, que inhibe la adhesión de HIV-1 a las células diana. El intervalo de concentraciones de PA11 y PA12 fue de 0 \mug/ml - 250 \mug/ml; el intervalo de concentraciones de 2D7 y PA14 fue de 0 \mug/ml - 25 \mug/ml; el intervalo de concentraciones de RANTES fue de 0 ng/ml - 250 ng/ml; el intervalo de concentraciones CD4-IgG2 de 0 \mug/ml - 25 \mug/ml. Las concentraciones de los agentes individuales, o de sus mezclas, requeridas para producir una inhibición de la fusión o entrada del 50% y del 90% se compararon cuantitativamente con un parámetro conocido como Índice de Combinación (CI).

Figura 3 Valores de IC_{50} correspondientes a la inhibición de la fusión célula-célula, de la entrada viral y de la unión de gp120/sCD4 por acción de los mAb anti-CCR5

Con fines comparativos, se han resumido los valores de IC_{50} obtenidos en los diferentes ensayos en los que se ensayaron los mAb anti-CCR5. Los valores de IC_{50} se calcularon solamente para los mAb que pudieron ejercer una inhibición >90% de la fusión, entrada o unión.

Figura 4 Mapeo de epítopos de los mAb anti-CCR5

Se usó un protocolo de tinción con dos colores para evaluar la unión de los mAb a proteínas CCR5 mutantes, identificadas en el extremo C-terminal con el péptido HA. Células HeLa que expresan mutantes puntuales de CCR5, se incubaron con concentraciones saturantes de cada uno de los mAb, seguido de detección con una IgG anti-ratón, marcada con PE. La expresión de correceptores de superficie celular se midió mediante doble tinción de las células con un mAb anti-HA, marcado con FITC. Las cuatro cuadrículas corresponden a los cuatro dominios extracelulares de CCR5. La primera fila de cada cuadrícula indica la secuencia de aminoácidos del correspondiente dominio extracelular de CCR5 (SEQ ID NOs: 1 - 4). La unión de los mAb anti-CCR5 al mutante que porta alanina de cada residuo se expresa como porcentaje de la unión a la CCR5 de tipo salvaje, según se describe en Materiales y Métodos.

Figura 5 Inhibición de la movilización de calcio hacia el interior de las células CCR5^{+} por acción de los mAb anti-CCR5

Células L1.2-CCR5 se cargaron con Indo-1AM y se estimularon secuencialmente con un mAb anti-CCR5 o con PBS, y seguidamente con RANTES (a). Los cambios en la fluorescencia se midieron con un espectrofluorómetro y los registros corresponden a un experimento representativo. Se realizaron ensayos de la inhibición del flujo de calcio por acción de PA14 y 2D7 para un amplio intervalo de concentraciones de los mAb (b). Los resultados están representados gráficamente en forma del % de inhibición del flujo de entrada de calcio = [1- (fluorescencia relativa en presencia del mAb \textdiv fluorescencia relativa en ausencia del mAb)] x 100%, y son las medias de los valores de tres experimentos diferentes.

Figura 6 Inhibición de la función del correceptor CCR5 por acción de los mAb anti-CCR5

La inhibición de la fusión célula-célula por acción de los mAb anti-CCR5 se determinó mediante el ensayo de RET (a). Se añadieron 0 \mug/ml - 250 \mug/ml de PA8 - PA12 ó 0 \mug/ml - 25 \mug/ml de PA14 ó 2D7 a una mezcla de células HeLa-EnV_{JR-FL} y células PM1, marcadas con F18 y R18 respectivamente. La RET por fluorescencia se midió después de 4 h de incubación. Los resultados son valores medios de tres experimentos independientes y se expresan en forma del % de inhibición de la fusión = [1 -(% RET en presencia del mAb \textdiv % RET en ausencia del mAb)] x 100%. La inhibición de la entrada de HIV-1 por acción de los mAb anti-CCR5 se determinó mediante una única ronda de un ensayo de entrada basado en la replicación y en la actividad de luciferasa (b). Células U87-CD4^{+}CCR5^{+} se infectaron con un virus de reporte NLluc^{+}env^{-} que porta la envoltura de JR-FL, en presencia de PA8 - PA12 en concentraciones de 0 \mug/ml - 250 \mug/ml, o en presencia de PA14 ó 2D7 en concentraciones de 0 \mug/ml - 25 \mug/ml. La actividad de luciferasa (unidades relativas de luz, r.l.u.) se midió en los lisados celulares 72 h después de la infección. Los resultados son los de un experimento representativo y están expresados en forma del % de inhibición de la entrada = [1 - (r.l.u. en presencia de mAb \textdiv r.l.u. en ausencia de mAb)] x 100%. Unión de gp120 biotinilada [b], de sCD4 y de complejos b-gp120-CD4 a células L1.2-CCR5^{+} (c). Se observa una fuerte unión cuando la gp120 derivada del virus HIV-1_{JRFL} de tipo R5 forma un complejo con una cantidad equimolar de sCD4. No se observa unión en ausencia de sCD4 o en el caso de la gp120 derivada del virus HIV-1_{LAI} de tipo X4. La unión de fondo a las células L1.2-CCR5 se ha sustraído en todas las curvas. La inhibición de la unión de gp120/sCD4 a células L1.2-CCR5^{+} se ensayó en presencia de concentraciones variables de cada uno de los anticuerpos (d). Las células se preincubaron en placas de 96 pocillos con un mAb anti-CCR5 y seguidamente se incubaron con una concentración saturante de gp120 biotinilada/sCD4. Por último, se midió la unión de estreptavidina marcada con PE a las células usando un lector de fluorescencia para placas. Los resultados corresponden a un experimento representativo y están expresados en forma del % de inhibición de la unión de gp120/sCD4 = [1 -(m.f.i. en presencia de mAb \textdiv m.f.i. en ausencia de mAb)] x 100%.

Figura 7 Inhibición sinérgica de la fusión célula-célula por acción de PA12 y 2D7

Se obtuvieron curvas de dosis-respuesta para los mAb usados de manera individual y en combinación. Se añadieron 0 \mug/ml - 50 \mug/ml de PA12, 0 \mug/ml - 25 \mug/ml de 2D7, o una combinación de ambos en proporción 2:1, a una mezcla de células HeLa-Env_{JR-FL}^{+} y células PM1, marcadas con R18 y F18 respectivamente. Se midió la RET por fluorescencia después de 4 horas de incubación. Los resultados están expresados en forma del % de inhibición de la fusión y son las medias de los valores de tres experimentos independientes. Los datos se analizaron usando el principio del efecto intermedio, que se puede escribir como:

(1)f = 1/[1 + (K/c)^{m}]

en donde f es la fracción afectada/inhibida, c es una concentración, K es la concentración de agente requerida para producir el efecto intermedio y m es un coeficiente empírico que describe la forma de la curva de dosis respuesta. La Ecuación (1) es una forma generalizada de las ecuaciones que describen la cinética enzimática de Michaelis-Menten, las isotermas de adsorción de Langmuir y los equilibrios de ionización de Henderson-Hasselbalch, en la que m = 1. En el presente caso, K es igual al valor de la IC_{50}. K y m se determinaron ajuste de curvas dosis-respuesta y la Ecuación (1) se reordenó para permitir el cálculo de c para un f dado. Los parámetros mejor ajustados para K y c son 8,8 \mug/ml y 0,54 \mug/ml en el caso de PA12, 0,36 \mug/ml y 0,68 en el caso de 2D7, y 0,ll y 1,1 en el caso de la combinación de los mismos. Estas curvas están representadas gráficamente e indican una bondad de ajuste razonable entre el experimento y la teoría.

Descripción detallada de la invención

Esta invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti-receptor CCR5 para quimioquinas o uno de sus fragmentos según se define en las reivindicaciones.

La descripción también se refiere a una composición para inhibir una infección por HIV-1, que comprende al menos dos compuestos en cantidades sinérgicamente efectivas para inhibir la infección por HIV-1, en la que al menos uno de los compuestos previene la interacción productiva entre HIV-1 y un correceptor de la fusión con HIV-1.

Según aquí se usa, "composición" significa una mezcla. Las composiciones incluyen, pero no se limitan a, aquellas composiciones adecuadas para su administración a un individuo por vía oral, rectal, intravaginal, tópica, nasal, oftálmica o parenteral. Según aquí se usa, "parenteral" incluye, pero no se limita a, inyecciones subcutáneas, intravenosas, intramusculares o intraesternales, o técnicas de infusión.

Según aquí se usa, "HIV-1" se refiere al virus tipo-1 de la inmunodeficiencia humana. HIV-1 incluye, pero no se limita a, partículas virales extracelulares y las formas de HIV-1 encontradas en las células infectadas por HIV-1.

Según aquí se usa, "infección por HIV-1" significa la introducción de información genética de HIV-1 en una célula diana, tal como mediante fusión de la membrana de la célula diana con HIV-1 o con una célula glicoproteína^{+} que porta la glicoproteína de la envoltura de HIV-1. La célula diana puede ser una célula corporal de un individuo. En la realización preferida, la célula diana es una célula corporal de un individuo humano.

Según aquí se usa, "inhibir una infección por HIV-1" significa la disminución de la cantidad de información genética de HIV-1 introducida en una población de células diana, en comparación con la cantidad que estaría introducida en ausencia de dicha composición.

Según aquí se usa, "compuesto" significa una entidad molecular, que incluye, pero que no se limita a, péptidos, polipéptidos y otras moléculas orgánicas o inorgánicas y sus combinaciones.

Según aquí se usa, "sinérgicamente efectivos" significa que el efecto combinado de los compuestos cuando se usan de manera combinada es mayor que sus efectos aditivos cuando se usan de manera individual.

Según aquí se usa, "interacción productiva" significa que la interacción de HIV-1 y del correceptor para HIV-1 conduciría a la fusión de dicho HIV-1 o de una célula glicoproteína^{+} que porta la glicoproteína de la envoltura de HIV-1, y la membrana que porta el correceptor.

Según aquí se usa, "previene la interacción productiva" significa que la cantidad de interacción disminuye en comparación con la que tendría lugar sin el compuesto. Las interacciones se pueden prevenir ocultando o alterando regiones interactivas presentes en el correceptor o en HIV-1, o alterando la expresión, agregación, conformación o el estado de asociación del correceptor.

Según aquí se usa, "correceptor de la fusión con HIV-1" significa un receptor celular que media en la fusión entre la célula diana que expresa el receptor y el HIV-1 o una célula que porta la glicoproteína de la envoltura de HIV-1. Los correceptores de la fusión con HIV-1 incluyen, pero no se limitan a, CCR5, CXCR4 y otros receptores para quimioquinas.

Esta invención también proporciona una composición que inhibe la fusión de HIV-1 o de una célula glicoproteína^{+} que porta la glicoproteína de la envoltura de HIV-1 a una célula diana, que comprende al menos dos compuestos en cantidades sinérgicamente efectivas para inhibir la fusión de HIV-1 o de una célula glicoproteína^{+} que porta la glicoproteína de la envoltura de HIV-1 a una célula diana, en la que al menos uno de los componentes previene la interacción productiva entre HIV-1 y un correceptor de la fusión con HIV-1.

Según aquí se usa, "fusión" significa la anexión o unión de las membranas de la bicapa lipídica encontradas en células de mamíferos o en virus tales como el HIV-1. Este proceso se distingue de la adhesión de HIV-1 a una célula diana. La adhesión está mediada por la unión de la glicoproteína exterior de HIV-1 al receptor CD4 de seres humanos, que no es un correceptor de fusión.

Según aquí se usa, "inhibe" significa que la cantidad disminuye en comparación con la cantidad que habría en ausencia de la composición.

Según aquí se usa, "célula diana" significa una célula capaz de ser infectada por, o de fusionarse con, HIV-1 o células infectadas por HIV-1.

Según aquí se usa, "quimioquina" significa una citoquina que tiene capacidad para estimular el movimiento leucocitario. Las quimioquinas se pueden clasificar como cys-cys o cys-X-cys dependiendo de si los dos residuos de cisteína amino terminales se encuentran inmediatamente adyacentes o si están separados por un aminoácido. Este término incluye, pero no se limita a, RANTES, MIP-1\alpha, MIP-l\beta, SDF-1 u otras quimioquinas que bloquean la infección por HIV-1.

En una de las realizaciones de las composiciones anteriormente mencionadas, el correceptor es un receptor para quimioquinas. En le realización preferida de las composiciones anteriormente mencionadas, el receptor para quimioquinas es CCR5 o CXCR4. Se conocen otros varios receptores para quimioquinas y receptores relacionados que actúan como correceptores para HIV-1 y que incluyen, pero no se limitan a, CCR2, CCR3, CCR8, STRL33, GPR-15, CX3CR1 y APJ (69).

Según aquí se usa, "receptor para quimioquina" significa un miembro de una familia homóloga de siete proteínas de superficie celular que se extienden a lo largo de la región transmembrana y que se unen a quimioquinas.

Según aquí se usa, "CCR5" es un receptor para quimioquinas que se une a miembros del grupo C-C de quimioquinas y cuya secuencia de aminoácidos comprende la secuencia que se proporciona en Genbank, Número de Registro 1705896, y las variantes polimórficas relacionadas.

Según aquí se usa, "CXCR4" es un receptor para quimioquinas que se une a miembros del grupo de quimioquinas C-X-C y cuya secuencia de aminoácidos comprende la secuencia que se proporciona en Genbank, Número de Registro 400654, y las variantes polimórficas relacionadas.

En una de las realizaciones de las composiciones anteriormente mencionadas, al menos uno de los compuestos es una molécula no peptídica. En una de las realizaciones, la molécula no peptídica es el compuesto bicyclam AMD3100. (16).

Según aquí se usa, "molécula no peptídica" significa una molécula que no consiste en su totalidad en una secuencia lineal de aminoácidos unidos por enlaces peptídicos. Una molécula no peptídica puede sin embargo contener uno o más enlaces peptídicos.

En una realización preferida, el anticuerpo es un anticuerpo anti-CCR5. El anticuerpo anti-CCR5 incluye, pero no se limita a, PA14.

Hibridomas murinos que secretan los anticuerpos monoclonales PA8, PA9, PA10, PA11, PA12 y PA14 respectivamente, fueron depositados de conformidad con, y en cumplimiento de, los requerimientos del Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes, en la American Type Culture Collection (ATCC), 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110- 2209, el 2 de Diciembre de 1998, con los siguientes Números de Registro: ATCC, Núm. de Registro HB-12605 (PA8), ATCC, Núm. de Registro HB-12606 (PA9), ATCC, Núm. de Registro HB-12607 (PA10), ATCC, Núm. de Registro HB-12608 (P11), ATCC, Núm. de Registro HB-12609 (PA12) y ATCC, Núm. de Registro HB-12610 (PA14).

En otro aspecto la descripción se refiere a composiciones para inhibir una infección por HIV-1, que comprenden dos o más anticuerpos. Los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a, PA8, PA9, PA10, PA11, PA12, PA14 y 2D7. En esta composición los anticuerpos están en una proporción adecuada. La proporción varía desde 1:1 hasta 50:1.

Según aquí se usa, "anticuerpo" significa una molécula de inmunoglobulina que comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras y que reconoce un antígeno. La molécula de inmunoglobulina puede derivar de cualquiera de las clases comúnmente conocidas, que incluyen, pero que no se limitan a, IgA, IgA secretora, IgG e IgM. Las subclases de IgG son también muy conocidas por los que trabajan en la técnica e incluyen, pero no limitan a, IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4 humanas. Este término incluye, a modo de ejemplo, tanto anticuerpos presentes en la naturaleza como anticuerpos no presentes en la naturaleza. De manera específica, "anticuerpo" incluye anticuerpos policlonales y anticuerpos monoclonales, y sus fragmentos monovalentes y divalentes. Además, "anticuerpo" incluye anticuerpos quiméricos, anticuerpos totalmente sintéticos, anticuerpos monocatenarios y sus fragmentos. De manera opcional, un anticuerpo puede estar marcado con un marcador detectable. Los marcadores detectables incluyen, por ejemplo, marcadores radiactivos o marcadores fluorescentes. El anticuerpo puede ser un anticuerpo de origen humano o un anticuerpo de origen no humano. El anticuerpo de origen no humano se puede humanizar mediante métodos recombinantes para disminuir su inmunogenicidad en el hombre. Métodos para humanizar anticuerpos son conocidos por los expertos en la técnica.

Según aquí se usa, "anticuerpo monoclonal", también denominado mAb, se usa para describir moléculas de anticuerpo cuyas secuencias primarias son esencialmente idénticas y que exhiben la misma especificidad antigénica. Los anticuerpos monoclonales se pueden producir mediante técnicas que utilizan hibridomas, técnicas recombinantes, transgénicas u otras técnicas conocidas por el experto en la técnica.

Según aquí se usa, "anticuerpo anti-receptor para quimioquinas" significa un anticuerpo que reconoce y se une a un epítopo de un receptor para quimioquinas. Según aquí se usa, "anticuerpo anti-CCR5" significa un anticuerpo monoclonal que reconoce y se une a un epítopo del receptor CCR5 para quimioquinas.

Según aquí se usa, "proporción adecuada" se refiere a las proporciones en masa o las proporciones en moles en las que los compuestos son sinérgicamente efectivos.

En una de las realizaciones de las composiciones anteriormente mencionadas, al menos uno de los compuestos es una quimioquina o un derivado de quimioquinas. Las quimioquinas incluyen, pero no se limitan a, RANTES, MIP-1\alpha, MIP-1\beta, SDF-1 o una de sus combinaciones. En esta composición, los compuestos están en una proporción adecuada. Los derivados de quimioquinas incluyen, pero no se limitan a, Met-RANTES, AOP-RANTES, RANTES 9-68 o una de sus combinaciones.

Según aquí se usa, "derivado de quimioquinas" significa una quimioquina químicamente modificada. Las modificaciones químicas incluyen, pero no se limitan a, sustituciones, adiciones o deleciones, adiciones no peptídicas u oxidaciones. El experto en la técnica será capaz de preparar esos derivados.

En otra de las realizaciones de las composiciones anteriormente mencionadas, al menos uno de los compuestos es un anticuerpo y al menos otro de los compuestos es una quimioquina o un derivado de quimioquinas. En esta composición, los compuestos se encuentran en una proporción adecuada. La proporción varía desde 100:1 hasta 1.000:1.

En otra de las realizaciones de las composiciones anteriormente mencionadas, al menos uno de los compuestos se une a la subunidad gp41 de la glicoproteína de la envoltura de HIV-1. En una de las realizaciones, al menos uno de los compuestos es el péptido T20 inhibidor de la entrada de HIV-1 (70).

En otra de las realizaciones de las composiciones anteriormente mencionadas, al menos uno de los compuestos inhibe la adhesión de HIV-1 a una célula diana. En una de las realizaciones, al menos uno de los compuestos se une a CD4. En una de las realizaciones, al menos uno de los compuestos es una glicoproteína de la envoltura de HIV-1. En una de las realizaciones, al menos uno de los compuestos es un anticuerpo anti-CD4. En una de las realizaciones, al menos uno de los compuestos se une a la glicoproteína de la envoltura de HIV-1. En una de las realizaciones, al menos uno de los compuestos es un anticuerpo dirigido contra la glicoproteína de la envoltura de HIV-1. En una de las realizaciones, al menos uno de los compuestos es una proteína basada en CD4. En una de las realizaciones, al menos uno de los compuestos es CD4-IgG2.

En otra de las realizaciones de las composiciones anteriormente mencionadas, al menos uno de los compuestos es un anticuerpo y al menos otro de los compuestos se une a una glicoproteína de la envoltura de HIV-1. En una de las realizaciones, el compuesto está basado en CD4. En una de las realizaciones, el compuesto es CD4-IgG2. En esta composición, los compuestos están en una proporción adecuada. La proporción varía desde 1:1 hasta 10:1.

Según aquí se usa, "adhesión" significa el procedimiento que está mediado por la unión de la glicoproteína de la envoltura de HIV-1 al receptor CD4 de seres humanos, que no es un correceptor de la fusión.

Según aquí se usa, "CD4" significa la proteína CD4 unida a membrana, natural y madura, que comprende un dominio citoplasmático, un dominio transmembrana hidrófobo y un dominio extracelular que se une a la glicoproteína gpl20 de la envoltura de HIV-1.

Según aquí se usa, "glicoproteína de la envoltura de HIV-1" significa la proteína codificada por HIV-1, que comprende la proteína gp120 de superficie, la proteína gp41 de transmembrana y sus oligómeros y precursores.

Según aquí se usa, "proteína basada en CD4" significa toda proteína que comprende al menos una secuencia de residuos de aminoácidos que corresponden a la porción de CD4 que se requiere para que CD4 forme un complejo con la glicoproteína gpl20 de la envoltura de HIV-1.

Según aquí se usa, "CD4-IgG2" significa una proteína de fusión constituida por CD4 heterotetramérico-IgG2 de seres humanos, codificada por los vectores de fusión depositados en la ATCC con los Números de Registro 75.193 y 75.194.

En una de las realizaciones de las composiciones anteriormente mencionadas, al menos uno de los compuestos comprende un polipéptido que se une a un epítopo de CCR5. En una de las realizaciones, el epítopo está situado en el extremo N-terminal, una de las tres regiones de bucles extracelulares, o una de sus combinaciones. En una de las realizaciones, el epítopo está situado en el extremo N-terminal. El epítopo puede comprender N13 e Y15 en el extremo N-terminal. El epítopo puede comprender Q4 en el extremo N-terminal. En otra de las realizaciones, el epítopo incluye residuos del extremo N-terminal y del segundo bucle extracelular. El epítopo puede comprender D2, Y3, Q4, S7, P8 y N13 del extremo N-terminal, e Y176 y T177 del segundo bucle extracelular. El epítopo puede comprender D2, Y3, Q4, P8 y N13 del extremo N-terminal, e Y176 y T177 del segundo bucle extracelular. El epítopo puede comprender D2 del extremo N-terminal, y R168 e Y176 del segundo bucle extracelular. En una de las realizaciones, el epítopo está situado en el segundo bucle extracelular. El epítopo puede comprender Q170 y K171 del segundo bucle extracelular. El epítopo puede comprender Q170 y E172 del segundo bucle extracelular.

Según aquí se usan, las siguientes abreviaturas estándar se usan a lo largo de toda la memoria descriptiva para indicar aminoácidos concretos:

A = ala = alanina

R = arg = arginina

N = asn = asparagina

D = asp= ácido áspartico

C = cys = cisteína

Q = gln = glutamina

E = glu = ácido glutámico

G = gly = glicina

H = His = histidina

I = ile = isoleucina

L = leu = leucina

K = lis = lisina

M = met = metionina

F = phe = fenilalanina

P = pro = prolina

S = ser = serina

T = thr = treonina

W = trp = triptófano

Y = tyr = tirosina

V = val = valina

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Según aquí se usa, "polipéptido" significa dos o más aminoácidos unidos por un enlace peptídico.

Según aquí se usa, "epítopo" significa una porción de una molécula o moléculas, que forma una superficie para la unión de anticuerpos u otros compuestos. El epítopo puede comprender aminoácidos contiguos o no contiguos, carbohidratos u otros restos no peptídicos o superficies específicas de oligómeros.

Según aquí se usa, "extremo N-terminal" significa la secuencia de aminoácidos que abarca la metionina inicial y la primera región transmembrana.

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Según aquí se usa, "segundo bucle extracelular" significa la secuencia de los aminoácidos que abarcan las regiones transmembrana cuarta y quinta y que se encuentran presentes sobre la superficie.

En una de las realizaciones de las composiciones anteriormente mencionadas, al menos uno de los compuestos comprende una cadena ligera de un anticuerpo. En otra de las realizaciones de las composiciones anteriormente mencionadas, al menos uno de los compuestos comprende una cadena pesada de un anticuerpo. En otra de las realizaciones de las composiciones anteriormente mencionadas, al menos uno de los compuestos comprende la porción Fab de un anticuerpo. En otra de las realizaciones de las composiciones anteriormente mencionadas, al menos uno de los compuestos comprende el dominio variable de un anticuerpo. En otra de las realizaciones, el anticuerpo se produce en forma de un polipéptido único o anticuerpo "monocatenario" que comprende los dominios variables de cadena pesada y de cadena ligera genéticamente unidos ligados a través de una secuencia de aminoácidos interpuesta. En otra de las realizaciones de las composiciones anteriormente mencionadas, al menos uno de los compuestos comprende una o más porciones de CDR de un anticuerpo.

Según aquí se usa, "cadena pesada" significa el polipéptido más grande de una molécula de anticuerpo, compuesta por un dominio variable (VH) y tres o cuatro dominios constantes (CH1, CH2, CH3 y CH4), o sus fragmentos.

Según aquí se usa, "cadena ligera" significa el polipéptido más pequeño de una molécula de anticuerpo, compuesta por un dominio variable (VL) y por un dominio constante (CL), o sus fragmentos.

Según aquí se usa, "Fab" significa un fragmento monovalente de unión a antígeno, de una inmunoglobulina, que consiste en una cadena ligera y parte de una cadena pesada. Se puede obtener mediante una digestión corta con papaína o mediante métodos recombinantes.

Según aquí se usa, "fragmento F(ab')2" significa un fragmento bivalente de unión a antígeno, de una inmunoglobulina, que consiste en ambas cadenas ligeras y en parte de ambas cadenas pesadas. Se puede obtener mediante una digestión corta con pepsina o mediante métodos recombinantes.

Según aquí se usa, "CDR" o ``región determinante de la complementariedad significa una secuencia de aminoácidos altamente variable, del dominio variable de un anticuerpo.

Esta descripción de refiere a las composiciones anteriormente mencionadas y a un vehículo farmacéuticamente aceptable. Los vehículos farmacéuticamente aceptables son muy conocidos por los expertos en la técnica. Esos vehículos farmacéuticamente aceptables pueden incluir, pero no se limitan a, disoluciones acuosas o no acuosas, suspensiones y emulsiones. Ejemplos de disolventes no acuosos son propilenglicol, polietilenglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y ésteres orgánicos inyectables tales como el oleato de etilo. Los vehículos acuosos incluyen agua, disoluciones de alcohol/agua, emulsiones o suspensiones, disolución salina y medios tamponados. Los vehículos parenterales incluyen disolución de cloruro sódico, dextrosa en Ringer, dextrosa y cloruro sódico, Ringer con lactato o aceites no volátiles. Los vehículos intravenosos incluyen agentes de reposición de fluidos y nutrientes, agentes de reposición de electrolitos tales como los basados en dextrosa en Ringer, y vehículos similares. También pueden encontrarse presentes conservantes y otros aditivos, tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, agentes quelantes, gases inertes y agentes similares.

Esta descripción se refiere a un método para tratar a un individuo afectado por HIV-1, que comprende administrar al individuo una dosis efectiva de las composiciones anteriormente mencionadas.

Según aquí se usa, "individuo" significa cualquier animal o cualquier animal artificialmente modificado, capaz de infectarse con HIV-1. Los animales artificialmente modificados incluyen, pero no se limitan a, ratones SCID con sistemas inmunológicos de seres humanos. Los animales incluyen, pero no se limitan a: ratones, ratas, perros, cobayas, hurones, conejos y primates. En la realización preferida, el individuo es un ser humano.

Según aquí se usa, "tratar" significa o retrasar o detener o revertir la progresión de un trastorno producido por HIV-1. En la realización preferida, "tratar" significa revertir la progresión hasta el punto de eliminar el trastorno. Según aquí se usa, "tratar" significa también la disminución del número de infecciones virales, la disminución del número de partículas virales infecciosas, la disminución del número de células infectadas por virus, o la mejoría de los síntomas asociados con HIV-1.

Según aquí se usa, "afectado por HIV-1" significa que el individuo tiene al menos una célula que ha sido infectada por HIV-1.

Según aquí se usa, la "administración" se puede efectuar o realizar usando cualquiera de los métodos conocidos por el experto en la técnica. Los métodos pueden comprender medios intravenosos, intramusculares o subcutáneos.

La dosis de la composición de la invención variará dependiendo del individuo y de la vía de administración concreta que se use. Las dosificaciones pueden variar desde 0,1 \mug/kg hasta 100.000 \mug/kg. Dependiendo de la composición, la dosis se puede suministrar de manera continua, tal como mediante una bomba continua, o a intervalos periódicos. Por ejemplo, en una o más ocasiones distintas. Los intervalos de tiempo convenientes entre dosis múltiples de una composición particular se pueden determinar sin necesidad de una experimentación excesiva por parte de un experto en la técnica.

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Según aquí se usa, "dosis efectiva" significa una cantidad en cuantías suficientes para tratar al individuo o para prevenir al individuo de que se infecte con HIV-1. Una persona con una experiencia ordinaria en la técnica puede realizar experimentos de titulación sencillos para determinar cuál es la cantidad que se requiere para tratar al individuo.

Esta descripción se refiere a un método para prevenir que un individuo contraiga el HIV-1, que comprende administrar al individuo una dosis efectiva de las composiciones anteriormente mencionadas.

Según aquí se usa, "que contraiga HIV-1" significa que se infecte con HIV-1, cuya información genética se replica y/o se incorpora en las células hospedadoras.

Esta invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti-CCR5. El anticuerpo incluye, pero no se limita a, un anticuerpo producido por uno de los siguientes hibridomas: PA8 (ATCC, Núm. de Registro: HB-12605), PA9 (ATCC, Núm. de Registro: HB-12606), PA10 (ATCC, Núm. de Registro: 12607), PA11 (ATCC, Núm. de Registro: HB-12608), PA12 (ATCC, Núm. de Registro: HB-12609) y PA14 (ATCC, Núm. de Registro: HB-12610).

Esta invención proporciona formas humanizadas de los anticuerpos anteriormente mencionados.

Según aquí se usa, "humanizados" describe a los anticuerpos en los que algunos, la mayoría o la totalidad de los aminoácidos situados fuera de las regiones CDR están reemplazados con los correspondientes aminoácidos derivados de moléculas de inmunoglobulinas humanas. En una de las realizaciones de las formas humanizadas de los anticuerpos, algunos, la mayoría o la totalidad de los aminoácidos situados fuera de las regiones CDR están reemplazados con aminoácidos derivados de moléculas de inmunoglobulinas humanas, pero en los que algunos, la mayoría o la totalidad de los aminoácidos incluidos en una o más regiones CDR no han sido cambiados. Son permisibles pequeñas adiciones, deleciones, inserciones, sustituciones o modificaciones de aminoácidos siempre y cuando no anulen la capacidad del anticuerpo para unirse a un antígeno determinado. Las moléculas adecuadas de inmunoglobulinas humanas incluirían moléculas de IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgM. Un anticuerpo "humanizado" conservaría una especificidad antigénica similar a la del anticuerpo original, es decir, en la presente invención, la capacidad para unirse a CCR5.

Esta descripción se refiere a moléculas de ácido nucleico aisladas, que codifican estos anticuerpos monoclonales anti-CCR5 o sus versiones humanizadas. La molécula de ácido nucleico puede ser RNA, DNA o cDNA. En una de las realizaciones, la molécula de ácido nucleico codifica la cadena ligera. En una de las realizaciones, la molécula de ácido nucleico codifica la cadena pesada. En una de las realizaciones, la molécula de ácido nucleico codifica ambas cadenas ligera y pesada. En una de las realizaciones, una o más moléculas de ácido nucleico codifican la porción Fab. En una de las realizaciones, una o más moléculas de ácido nucleico codifican porciones de CDR. En una de las realizaciones, la molécula de ácido nucleico codifica el dominio variable.

Esta invención se comprenderá mejor a partir de los Detalles Experimentales que siguen a continuación. Sin embargo, un experto en la técnica apreciará enseguida que los métodos específicos y los resultados analizados en la Discusión son meramente ilustrativos de la invención según ésta se describe de manera más completa en las reivindicaciones que siguen posteriormente.

Detalles experimentales A. Materiales y Métodos 1) Reactivos

El Mab 2D7 se adquirió procedente de Pharmingen (San Diego, CA) y las quimioquinas CC y quimioquinas CXC se obtuvieron procedentes de R&D Systems (Minneapolis, MN). El CD4-IgG2 (1), el CD4 soluble (s) (2) y la gp120 recombinante procedente de HIV-1_{JR-FL}, fueron producidos por Progenics Pharmaceuticals, Inc. (59).

2) Aislamiento y purificación de los mAb anti-CCR5

Células L1.2-CCR5^{+} (63) se incubaron durante 16 h en presencia de butirato de sodio 5 mM, el cual activa la transcripción desde el promotor de citomegalovirus (CMV) que controla la expresión de CCR5, dando como resultado un incremento de 10 veces en la densidad del correceptor en la superficie celular. Ratones hembras Balb/c se inmunizaron por vía intraperitoneal con 10^{7} células L1.2-CCR5^{+} a intervalos de 3 semanas, y se les administró una dosis de refuerzo intravenosa de 10^{7} células L1.2- CCR5^{+} tres días antes de la esplenoctomía. Los esplenocitos se fusionaron con la línea celular Sp2/0. En un primer escrutinio, se sometieron a ensayo los sobrenadantes procedentes de diez mil cultivos de hibridomas; ciento veinte de estos sobrenadantes inhibieron la fusión mediada por la envoltura de HIV-1, entre células PM1 (10), que expresan CCR5 y CD4 de manera natural, y células HeLa-Env_{JRFL}^{+}, en un ensayo de transferencia de energía de resonancia (RET), según se ha descrito previamente (19, 38). Los hibridomas que produjeron los sobrenadantes inhibidores más potentes y que también tiñeron las células CCR5^{+}, se subclonaron mediante dilución límite. Los fluidos ascíticos fueron preparados por Harlan Bioproducts for Science, Inc. (Indianapolis, IN) procedentes de ratones Balb/c a los que se había inyectado hibridomas que producían los mAb anti-CCR5 PA8, PA9, PA10, PA11, PA12 y PA14. Los mAb se purificaron individualmente hasta obtener una homogeneidad de >95% mediante precipitación con sulfato amónico, seguida de cromatografía en presencia de Proteína A. Todos los mAb se
resuspendieron en disolución salina tamponada con fosfato (PBS) hasta alcanzar una concentración final de 5 mg/ml.

3) Análisis de clasificación de células activadas por fluorescencia (FACS) (del inglés, "Fluorescence Activated Cell Sorting") y mapeo de epítopos de los mAb anti-CCR5

Se usó una citometría de flujo para detectar la reactividad sobre la superficie celular de los mAb PA8-PA12 y PA14 con CCR5. Células L1.2-CCR5^{+} (10^{6}) tratadas con butirato de sodio se incubaron con 0,25 \mug de anticuerpo durante 20 min a 4ºC en azida sódica (NaN_{3}) al 0,1% en 50 \mul de PBS de Dulbecco (DPBS). El mAb 2D7 anti-CCR5 se usó como control positivo y una IgG1 murina inespecífica se usó como control negativo. Las células se sedimentaron mediante centrifugación, se lavaron y se incubaron con IgG anti-ratón, procedente de cabra, marcada con ficoeritrina (PE) (del inglés, "Phycoerythrin") (Caltag, Burlingame, CA), diluida en proporción 1:100, en las mismas condiciones que la incubación con el primer anticuerpo. Finalmente, las células se analizaron mediante citometría de flujo. Las PBMC se aislaron y se estimularon de la manera previamente descrita (60) y se tiñeron usando métodos similares.

Un procedimiento similar se usó para el mapeo de los epítopos de los mAb anti-CCR5. Se ha descrito un panel de setenta mutantes puntuales de CCR5 (20, 24, 52). Las secuencias codificadoras de estas proteínas se encuentran subclonadas en el vector pcDNA3.1 (Stratagene), en el que se puede dirigir la transcripción con un promotor 5' de la polimerasa de T7. Los mutantes de CCR5 portan una secuencia identificadora de 9 residuos de hemaglutinina (HA) en el extremo C-terminal para detectar la proteína en lisados celulares o mediante citometría de flujo. Células HeLa (2 x 10^{6}) se incubaron durante 5 h con lipofectina, 20 \mug/ml, y con una cantidad igual de un plásmido que expresa la CCR5 de tipo salvaje o una CCR5 mutante en OPTI-MEM (Life Technologies, Gaithersburg, MD). Las células se infectaron luego durante 12 h con 2 x 10^{7} p.f.u. de vTF7 (23) para estimular la expresión de CCR5, se desprendieron con ácido etilendiaminotetraacético (EDTA) 2 mM en PBS y se lavaron una vez con el tampón de unión (BSA al 1%, NaN_{3} al 0,05% en DPBS). Las células (l x 10^{6}) se marcaron en su superficie con los mAb según se describe en los párrafos anteriores, se lavaron una vez con el tampón de incubación y se resuspendieron en 1 ml de FACSlyse 1X en agua (Becton Dickinson) durante 30 min a temperatura ambiente, para permeabilizar las membranas celulares. Las células a continuación se sedimentaron mediante centrifugación, se lavaron con el tampón de incubación y se incubaron durante 1 h a 37ºC con una concentración de 4 \mug/ml de un mAb anti-HA de ratón, marcado con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (BabCo, Richmond, CA) para marcaje intracelular. Finalmente, las células se lavaron una vez con el tampón de unión y una vez con PBS, se resuspendieron en formaldehído al 1% en PBS y se analizaron mediante citometría de flujo. El grado de la unión de un mAb a una CCR5 mutante se determinó mediante la ecuación: (m.f.i. de PE de CCR5 mutante / m.f.i. de PE de CCR5 de tipo salvaje) / (m.f.i. de FITC de CCR5 mutante / m.f.i. de FITC de CCR5 de tipo salvaje) x 100%. Esta ecuación normaliza la unión de los mAb para los niveles de expresión de los correceptores mutantes.

4) Ensayo de unión gpl20/sCD4

La gpl20 se biotiniló usando NHS-biotina (Pierce, Rockford, IL) conforme a las instrucciones del fabricante, y la biotina no unida se retiró mediante diafiltración. Células L1.2-CCR5^{+} tratadas con butirato de sodio se incubaron con diferentes diluciones de una mezcla equimolar de sCD4 y gpl20 biotinilada, o de una concentración de 1,25 \mug/ml de sCD4 y una concentración de 2,5 \mug/ml de gpl20 biotinilada, en presencia de diferentes concentraciones de los mAb anti-CCR5 PA8-PA12, PA14, 2D7 o de una IgG1 murina inespecífica, durante 1 h a temperatura ambiente, en NaN_{3} al 0,1% en DPBS. Las células se lavaron con el tampón de incubación y se incubaron con estreptavidina-PE (Becton Dickinson) diluida en proporción 1:50, durante 1 h a temperatura ambiente. Finalmente, las células se lavaron con el tampón de unión y se analizaron usando un lector de fluorescencia para placas (Perspective Biosystems, Framingham, MA).

5) Inhibición de la fusión célula-célula mediada por la envoltura y de la entrada de HIV-1 por acción de los mAb anti-CCR5

La fusión mediada por la envoltura de HIV-1 entre células HeLa-Env_{JRFL}^{+} y células PM1 se detectó usando un ensayo de RET. Cantidades iguales (2 x 10^{4}) de células que expresan la envoltura, marcadas con el octadeciléster de fluoresceína (F18) y de células PM1 marcadas con octadecil-rodamina (R18) se sembraron en placas de 96 pocillos, en suero de ternera fetal al 15% en DPBS y se incubaron durante 4 h a 37ºC, en presencia de diferentes concentraciones de los mAb anti-CCR5 PA8-PA12, PA14, 2D7 o de una IgG1 murina inespecífica. La RET por fluorescencia se midió con un lector de placas Cytofluor (PerSeptive Biosystems) y el % de RET se determinó según se ha descrito anteriormente (38). Virus NLluc^{+}env^{-} complementados en trans por glicoproteínas de la envoltura procedentes de JR-FL o Gun-1, se produjeron según se ha descrito previamente (20). Células U87MG-CD4^{+}CCR5^{+} (14) se infectaron con virus de reporte quiméricos que contenían una concentración de 50 ng/ml - 100 ng/ml de p24 en presencia de diferentes concentraciones de los mAb individuales. Después de 2 h a 37ºC, los medios que contenían los virus se reemplazaron por medios recién preparados que contenían mAb. Medios recién preparados que no contenían anticuerpos, se añadieron de nuevo después de 12 h. Después de un total de 72 h, a las células se añadieron 100 \mul de tampón de lisis (Promega) y se midió la actividad de luciferasa (r.l.u.) de la manera que se encuentra descrita (20). El % de inhibición de la infección por HIV-1 se define como [1 - (r.l.u. en presencia de anticuerpo / r.l.u. en ausencia de anticuerpo)] x 100%.

6) Ensayos de señalización por calcio

El fluorocromo Indo-lAM (Molecular Probes, Eugene, OR) se añadió a células L1.2-CCR5^{+} tratadas con butirato de sodio, hasta una concentración final 5 \muM. Después de una incubación a 37ºC durante 30 min, las células se lavaron una vez y se resuspendieron en disolución salina tamponada de Hank. Las células (10^{6}) se estimularon de manera secuencial con un mAb anti-CCR5 o con PBS, y 60 s después con RANTES. Los mAb PA8-PA12 y PA14 se usaron a una concentración de 100 \mug/ml, 2D7 se usó a 20 \mug/ml y RANTES se usó a 250 ng/ml. La inhibición del flujo de calcio por acción de PA14 y 2D7 se ensayó también para un intervalo amplio de concentraciones de los mAb, que variaban de 0 \mug/ml - 100 \mug/ml. Los niveles intracelulares de calcio se detectaron usando un espectrofotómetro de fluorescencia Perkin-Elmer LS-50S y midiendo la relación de las emisiones de fluorescencia a 402 nm (colorante unido) y a 486 nm (colorante libre) después de una excitación a 358 nm.

B. Resultados y Discusión 1) Aislamiento de los anticuerpos monoclonales anti-CCR5 PA8, PA9, PA10, PA11, PA12 y PA14

Se encontró que los péptidos que correspondían a los dominios extracelulares de CCR5 eran ineficaces en inducir la aparición de respuestas de anticuerpos específicas y con título alto frente al receptor de superficie celular natural (50). Por consiguiente, ratones Balb/c se inmunizaron con células L1.2-CCR5^{+} y los sobrenadantes de los cultivos de los hibridomas se ensayaron con respecto a su capacidad para inhibir la fusión de membranas, mediada por la envoltura de JR-FL, con células PM1 CD4^{+}CCR5^{+} mediante el ensayo de RET (19, 38). Aún cuando muchos más de cien sobrenadantes inhibieron la fusión célula-célula en >50%, sólo seis sobrenadantes, los denominados PA8, PA9, PA10, PA11, PA12 y PA14, tiñeron específicamente y con intensidad las células L1.2-CCR5^{+} pero no las células L1.2 parentales, como se demuestra mediante citometría de flujo (datos no mostrados). Sobre la base de la experiencia previa, se dio por supuesto que los demás mAb capaces de inhibir la fusión célula-célula probablemente se dirigían contra moléculas de adhesión de la superficie celular tales como LFA-1 (37). Mediante un ensayo ELISA de determinación de isotipos (Cappell, Durham, NC) se determinó que los hibridomas PA8-PA12 y PA14 secretaban mAb de tipo IgG1. Se prepararon fluidos ascíticos procedentes de ratones Balb/C a los que se habían inyectado los seis hibridomas, y se purificaron las fracciones correspondientes a IgG1. PA8, PA9, PA11, PA12 y PA14 exhibieron diferentes perfiles de isoelectroenfoque, mientras que PA10 presentó un perfil muy similar al de PA9 y por lo tanto puede corresponder a un segundo material aislado del mismo mAb (datos no mostrados).

2) Unión de los mAb a células CCR5^{+}

Ninguno de los mAb anti-CCR5 purificados tiñeron la línea celular L1.2 parental (datos no mostrados). Sin embargo, los mAb PA9-PA12 y PA14 tiñeron >90%, y PA8 tiñó \sim70%, de las células L1.2-CCR5^{+}, según se determinó mediante citometría de flujo, demostrando que reconocían a CCR5 (Fig. 1). El mAb 2D7 anti-CCR5, que fue un control positivo en estos experimentos, también tiñó >90% de las células L1.2-CCR5^{+}. Los PA8-PA12 y PA14 son todos ellos una IgG1, y reaccionan igual de bien con una IgG anti-ratón procedente de cabra, mientras que 2D7 es una IgG2a y puede reaccionar de manera diferente con el anticuerpo de reporte. Sólo las intensidades de fluorescencia medias (m.f.i.) medidas con los mAb PA8-PA12 y PA14 son por lo tanto directamente comparables. El orden de importancia de las intensidades de fluorescencia medias (m.f.i.) fue PA12 - PA11 > (2D7 =) PA14 \sim PA10 - PA9 > PA8. La diferencia entre la m.f.i. de PA12 y la m.f.i. de PA8 fue de tres veces. Las diferencias en la intensidad de tinción entre PA8 y los demás mAb permaneció constante a lo largo de un amplio intervalo de concentraciones (datos no mostrados) y probablemente no correspondan a diferencias en las afinidades de los mAb por CCR5. Esto implica que PA8 interacciona solamente con un subgrupo de moléculas de CCR5 presentes sobre la superficie de las células L1.2-CCR5^{+}.

Comparados con las células L1.2-CCR5^{+}, las PBMC estimuladas por mitógeno exhibieron diferentes patrones de tinción con los mAb anti-CCR5. 2D7 y PA14 tiñeron >20%, PA11 y PA12 tiñeron \sim10%, y PA8, PA9 y PA10 tiñeron <5% de las PBMC (Fig. 1). Las intensidades de fluorescencia medias de las PBMC teñidas fueron aproximadamente diez veces más bajas que las obtenidas con las células L1.2-CCR5^{+} para cada uno de los mAb; Su orden de importancia fue (2D7 >) PA14 > PA12 - PA11 \sim PA10 \sim PA9 - PA8. También esta vez, este orden difiere algo del orden de las reactividades observadas en los transfectantes de CCR5. La diferencia entre la m.f.i. de PA9 y la m.f.i. de PA14 fue de siete veces. Otros grupos han observado diferencias similares en la capacidad de los mAb anti-CCR5 para teñir líneas celulares CCR5^{+} estables frente a PBMC (28). Esto puede ser debido a diferencias específicas de las células en la conformación del CCR5, en la modificación post-traduccional o en la oligomerización. Como alternativa, la asociación con otras moléculas de superficie celular puede diferir entre las células. Dado que una elección obvia de este tipo de molécula sería el antígeno CD4 de superficie celular, que está ausente en las células L1.2-CCR5^{+} y presente en las PBMC, se ensayó también la capacidad de PA8-PA12, PA14 y 2D7 para teñir células HeLa que expresan de manera transitoria CCR5 solo o con CD4. No se observaron diferencias en la capacidad de ninguno de los mAb para teñir el CCR5 de superficie celular en presencia de CD4 (datos no mostrados). Si existe una asociación entre estas dos proteínas, ésta no implica epítopos reconocidos por los mAb anti-CCR5 de los que disponen los autores de la invención. Como alternativa, una asociación entre CCR5 y CD4 pudiera solamente tener lugar en linfocitos primarios.

3) Mapeo de epítopos de los mAb usando mutantes de CCR5 que portan alanina

Ninguno de los anticuerpos fue capaz de detectar la proteína CCR5 reducida o desnaturalizada mediante transferencia Western lo que indica que reconocen epítopos conformacionalmente sensibles (datos no mostrados). Se realizaron estudios sobre el mapeo de epítopos de mAb usando un panel de setenta mutantes puntuales que portan alanina, de residuos situados en el Nt y en los ECL de CCR5. Células HeLa se sometieron a lipofección con secuencias codificadoras de CCR5 mutante o de CCR5 de tipo salvaje anexionadas a secuencias identificadoras HA C-terminales, y se infectaron con vTF7 (23) para estimular la expresión del correceptor. Las células se incubaron luego con los mAb anti-CCR5 y su unión se puso de manifiesto por medio de una IgG anti-ratón, procedente de cabra, marcada con PE. Se llevó a cabo una segunda tinción intracelular con un mAb anti-HA, marcado con FITC (BabCo). Este control interno permitió normalizar directamente la tinción por los mAb anti-CCR5 con respecto a los niveles de expresión del correceptor mutante sobre la superficie de la célula. Por ello, la unión de los mAb a cada mutante se expresa en forma de porcentaje de la unión al CCR5 de tipo salvaje (Figura 4).

Determinadas mutaciones puntuales disminuyeron la unión de todos los anticuerpos a CCR5 en >50%. En general, PA8-PA12 fueron los más afectados, PA14 y 2D7 fueron los menos afectados por esta clase de mutantes, que incluían el par de cisteínas C101A y C178A, los mutantes en el Nt Y10A, D11A, K25A, el mutante en el ECL1 D95A, los mutantes en el ECL2 K171A/E172A, Q188A, K191A/N192A, y los mutantes en el ECL3 F263A y F264A (Fig. 4). Una de las interpretaciones es que estos residuos no son parte per se de los residuos de los epítopos de los mAb, pero que cambiándolos a alaninas se producen perturbaciones conformacionales que tienen un efecto común sobre la unión de todos los mAb. Los autores de la invención dieron por supuesto que si una mutación disminuía la unión de un mAb individual en >75%, y además no disminuía la unión de la mayoría de los otros anticuerpos, probablemente ese residuo contribuía directamente al epítopo reconocido por el mAb. Usando estas directrices restrictivas, se llegó a la conclusión de que los siete mAb anti-CCR5 reconocen epítopos solapantes aunque distintos (Fig. 4). La unión del mAb PA8 a CCR5 dependió de N13 e Y15 en el Nt. Los mAb PA9 y PA10 requirieron D2, Y3, Q4, P8 y N13 en el Nt, e Y176 y T177 en el ECL2. El mAb PA9 también requirió S7 en el Nt. La unión de los mAb PA11 y PA12 dependió de Q4 en el Nt. PA14 requirió D2 en el Nt, y R168 e Y176 en el ECL2. Por último, el mAb 2D7 requirió Q170 y K171/E172 en el ECL2 para unirse a CCR5.

4) Señalización por quimioquinas en presencia de los mAb anti-CCR5

Los agentes que se unen a receptores para quimioquinas pueden ser antagonistas o, más raramente agonistas, de la señalización intracelular mediada por receptores. Como alternativa, estos agentes pudieran no tener ningún efecto sobre la señalización. CCR5 es capaz de unir a tres quimioquinas CC: RANTES, MIP-l\alpha y MIP-l\beta, y de transducir una señal que modula los niveles del calcio citosólico. Por lo tanto, se han realizado ensayos de la actividad de agonista/antagonista de diferentes concentraciones de los mAb PA8-PA12, PA14 y 2D7. Los cambios en las concentraciones del calcio intracelular, (Ca^{2+})i, se midieron en células L1.2-CCR5^{+} cargadas con Indo-1. Ninguno de los mAb estimuló un cambio en el (Ca^{2+})i, lo que indica que no son agonistas de CCR5. PA8-PA12 tampoco fueron capaces de inhibir los flujos de Ca^{2+} inducidos por RANTES (Fig. 5A y datos no mostrados), incluso a concentraciones altas como de 100 \mug/ml, lo que demuestra que tampoco son antagonistas. Estas concentraciones proporcionan una unión saturante de los mAb a las células L1.2-CCR5^{+}, como se demuestra mediante citometría de flujo y el ensayo de unión de gpl20/CCR5 (Fig. 6D y datos no mostrados). Los mAb PA14 y 2D7, sin embargo, bloquearon la movilización de calcio inducida por RANTES, aunque con diferentes potencias (Fig. 5A, B). La IC_{50} en el caso de la inhibición del flujo de entrada de calcio por acción de PA14 fue de 50 \mug/ml, que era aproximadamente 8 veces más alta que la IC_{50} de 2D7 (Fig. 5B). Los flujos de calcio inducidos por RANTES, MIP-1\alpha y MIP-1\beta, fueron inhibidos cada uno de ellos por concentraciones similares de PA14 (datos no mostrados). Ninguno de los mAb tuvo efecto sobre la movilización de calcio inducida por SDF-1 en células L1.2-CCR5^{+}, que expresan CXCR4 de manera endógena (datos no mostrados). Por último, ni los mAb ni las quimioquinas CC tuvieron efecto sobre los niveles del calcio citosólico en las células L1.2 parentales (datos no mostrados).

5) Inhibición de la función del correceptor CCR5 por acción de los mAb

Los mAbs PA8-PA12 y PA14 se seleccionaron inicialmente por su capacidad para inhibir la fusión célula-célula mediada por la envoltura de HIV-1. Esta actividad se confirmó y se cuantificó para los mAb purificados. Como era de esperar, los seis mAb, así como el mAb 2D7, bloquearon la fusión entre las células PM1 CD4^{+}CCR5^{+} y las células HeLa-Env_{JR-FL}^{+} en el ensayo de RET. El orden de importancia de la potencia fue 2D7-PA14 > PA12 > PA11 > PA10 \sim PA9 - PA8 (Fig. 6A). Los valores de IC_{50} de PA14 y 2D7 fueron 1,7 \mug/ml y 1,6 \mug/ml respectivamente, para PA11 y PA12 estos valores fueron 25,5 \mug/ml y 10,0 \mug/ml respectivamente (Fig. 3). PA8, PA9 y PA10 inhibieron la fusión en solamente el 10% - 15% a 300 \mug/ml. Ninguno de los mAb tuvo efecto sobre la fusión entre células PM1 y células HeLa-Env_{LAI}^{+}, que expresan la proteína de la envoltura de longitud completa de un virus X4 (datos no mostrados).

También se ensayó la capacidad de los diferentes mAb anti-CCR5 para inhibir la entrada de un virus R5 prototípico, el JR-FL, y de un virus R5X4, el Gun-1, en un ensayo de entrada basado en la actividad de luciferasa y en una única ronda de replicación. El orden de importancia de la potencia en el ensayo de entrada fue similar al determinado en el ensayo de fusión célula-célula (Fig. 6B). No pudo obtenerse una inhibición >50% de la entrada de JR-FL o de Gun-1 con PA8-PA11. El valor de IC_{50} de PA12 fue 2,5 \mug/ml. Sin embargo, no se pudo obtener una inhibición de la entrada de >60% con este mAb. Los valores de IC_{50} para la inhibición de la entrada de JR-FL por acción de PA14 y 2D7 se determinó que eran 0,024 \mug/ml y 0,026 \mug/ml respectivamente (Fig. 3), y fueron 60 veces inferiores a los obtenidos en el ensayo de fusión. La entrada del virus dual-trópico Gun-1 fue 2-3 veces más sensible a la inhibición por acción de los mAb anti-CCR5 que la entrada de JR-FL (datos no mostrados).

Los mAb anti-correceptor pudieran inhibir la fusión mediada por la envoltura ya sea afectando directamente a la interacción de gpl20/CCR5 o impidiendo las etapas posteriores a la unión, implicadas en la formación de un complejo de fusión activo. Para determinar el mecanismo de inhibición de la fusión y entrada virales por acción de PA8 - PA12 y PA14, se ensayó la capacidad de los diferentes mAb para bloquear la interacción de gpl20/CCR5. Para ello se usó un ensayo que detecta la unión de la gp120 biotinilada de HIV-1_{JR-FL} en forma de complejo con sCD4, a células L1.2-CCR5^{+}. No se observó unión de la gpl20 biotinilada en ausencia de sCD4 o de CCR5, o cuando se usó la gp120 de HIV-1_{LAI} (Fig. 6C).

Con la excepción del PA8, todos los mAbs abolieron la unión de gpl20/sCD4 a las células L1.2-CCR5^{+} (Fig. 6D). La inhibición producida por PA8 se saturó a -40%, que coincide con los datos de la citometría de flujo (Fig. 1) en sugerir que este mAb se une solamente a un subgrupo de las moléculas CCR5 dispuestas sobre las células L1.2-CCR5^{+}. Los mAb PA9, PA10, PA11 y PA12 inhibieron la unión con valores de IC_{50} 0,24, 0,13, 0,33, 0,24 \mug/ml respectivamente (Fig. 3). Sorprendentemente, los mAb PA14 y 2D7 fueron los dos inhibidores menos eficientes de la unión de gpl20/sCD4, con valores de IC_{50} de 1,58 \mug/ml y 1,38 \mug/ml respectivamente (Fig. 3). Por lo tanto, no existía ninguna correlación entre la capacidad de un mAb para inhibir la fusión de membranas y la entrada, mediadas por gpl20/CD4/CCR5, y su capacidad para bloquear la unión de gpl20/sCD4 al correceptor.

6) Inhibición sinérgica de la fusión de HIV-1 producida por combinaciones de los mAb anti-CCR5 y otros inhibidores de la entrada viral

Agentes específicos para correceptores pueden actuar en múltiples etapas del proceso de entrada y exhiben efectos no aditivos cuando se usan en combinación. Desde una perspectiva clínica, es importante determinar las interacciones de fármacos candidatos, específicos para correceptores, con las quimioquinas endógenas, que pueden proporcionar cierto nivel de protección frente a la progresión de la enfermedad. Los mAb anti-CCR5 se ensayaron por lo tanto combinados unos con otros, o con RANTES, o con CD4-IgG2, que se une a la gpl20 de HIV-1 para inhibir su anexión a las células diana. Se obtuvieron curvas de dosis-respuesta correspondientes a los agentes usados de manera individual o usados en combinación, en ensayos de determinación de la fusión y entrada viral. Los datos se analizaron usando el principio del efecto intermedio (9). Las concentraciones de los agentes individuales o de sus mezclas, requeridas para producir un efecto determinado, se compararon cuantitativamente con una expresión conocida como Índice de Combinación (CI). Un valor de CI mayor que 1 indica antagonismo, CI - 1 indica un efecto aditivo y CI < 1 indica un efecto sinérgico en el que la presencia de uno de los agentes potencia el efecto de otro.

Las combinaciones de PA12 y 2D7 fueron las de mayor poder sinérgico, con valores de CI que variaron entre 0,02 y 0,29, dependiendo de la proporción de los anticuerpos (Fig. 7 y Fig. 2). Se sabe que el grado de sinergia varía con la estequiometría de los agentes. Los ensayos de entrada y fusión virales coincidieron de modo general en identificar las combinaciones de los mAb que eran altamente sinérgicas: PA12 y 2D7; moderadamente sinérgicas: PA12 y PA14; aditivas: PA11 y PA12; y débilmente antagónicas: PA14 y 2D7. La falta de sinergia entre PA14 y 2D7 no es sorprendente dado que estos mAb compiten de manera cruzada en su unión a células CCR5^{+} según se determina mediante citometría de flujo (datos no mostrados). La observación de un efecto aditivo de PA11 y PA12 puede ser una indicación de que estos mAb se unen a epítopos ligeramente diferentes del CCR5, mientras que comparten su dependencia del residuo Q4 del Nt.

También se ensayó la capacidad de los mAb PA12, PA14 y 2D7 para presentar un efecto sinérgico con RANTES en cuanto a bloquear la fusión célula-célula. Las combinaciones de PA12 y RANTES exhibieron una sinergia moderada (Fig. 2). PA14 y 2D7 no exhibieron sinergia con RANTES, lo cual está de acuerdo con que estos mAbs son inhibidores de la unión y señalización por RANTES (Fig. 5A, B). Por último, se ensayó la sinergia entre los mAb PA12, PA14, 2D7 y CD4-IgG2, que interacciona con gpl20. Se observó una sinergia moderada entre PA12 y CD4-IgG2 pero no se observó sinergia entre PA14 ó 2D7 y CD4-IgG2 (Fig. 2).

Discusión experimental

Se aislaron y caracterizaron seis mAb IgG1 murinos anti-CCR5. Mientras que PA8, PA9, PA11, PA12 y PA14 son especies moleculares diferentes, PA9 y PA10 son indistinguibles en los análisis y por lo tanto probablemente son el mismo mAb. La totalidad de los mAbs que se aislaron reconocen epítopos conformacionales complejos, como suele ser lo que sucede con los mAb inducidos frente a proteínas naturales de superficie celular. Se realizó el mapeo de epítopos de todos los mAb usando un panel de mutantes puntuales de CCR5 que portan alanina. Los residuos que afectaron a la unión de todos los mAbs de manera similar, se supuso que producían perturbaciones conformacionales en el correceptor y que no constituían parte de los epítopos de los mAb. Sólo dos de estos residuos, Y10 y D11, se ha demostrado que afectan a la entrada de HIV-1 (20, 52). Los epítopos de PA8, PA11 y PA12 se localizan exclusivamente en el dominio Nt. En acuerdo con estos resultados, PA8 fue capaz de unirse a un péptido Nt biotinilado, que contenía los residuos desde D2 hasta R31, en un ensayo ELISA (datos no mostrados). Sin embargo, PA11 y PA12, cuya unión depende fuertemente sólo de Q4, no se unieron al péptido Nt en disolución (datos no mostrados). Una de las posibilidades es que es que el péptido Nt no adopte la conformación correcta para su reconocimiento por PA11 y PA12, mientras que la unión de PA8 quizá sea menos dependiente de la conformación. Como alternativa, PA11 y PA12 pudieran interaccionar con residuos que no se han mutado, o formar uniones débiles con aminoácidos situados en otros dominios de CCR5, o unirse a átomos de la cadena principal del péptido cuya presentación no se puede cambiar mediante mutagénesis. Los anticuerpos PA9, PA10 y PA14 reconocieron epítopos que incluían residuos tanto en el
dominio Nt como en el dominio ECL2 de CCR5, mientras que el epítopo de 2D7 se localizó exclusivamente en ECL2.

El epítopo de PA14 comprende tanto el residuo D2 de Nt como el residuo R168 de ECL2, lo que indica que estos dos residuos se encuentran próximos el uno del otro dentro del contexto de una marca característica del mAb. Pueden incluso interaccionar directamente entre sí a través de sus cargas opuestas.

Los mAb PA8-PA12 y PA14 tiñeron las células CCR5^{+} con intensidades diferentes y de una manera dependiente del tipo de células. Todos los mAb excepto PA8 tiñeron las células L1.2-CCR5^{+} en >90%, observándose la intensidad de fluorescencia media más alta con PA11 y PA12. Sin embargo, PA14 y 2D7 tiñeron el porcentaje más alto de PBMC y también produjeron las intensidades de fluorescencia medias más altas en estas células. Hill y col. (28) recientemente han caracterizado un panel de mAb anti-CCR5 que teñían de manera similar células transfectadas, pero solamente dos de ocho mAb tiñeron PBMC, y ninguno de ellos tiñó monocitos primarios. Una baja afinidad por CCR5 explicaba probablemente la ausencia de reactividad de dos de los mAb con las células primarias, pero ésta no es probable que sea la explicación de la ineficacia de los otros cuatro mAb para reaccionar. En el panel de mAb de los autores de la invención, se observa que la tinción más intensa de las PBMC la producen los mAbs 2D7 y PA14 que tienen epítopos localizados de manera parcial o completa en los primeros diez residuos de ECL2. Hill y col. informan sin embargo que los mAb específicos para Nt y ECL1 tiñen las PBMC, mientras que los mAb específicos para ECL2 y ECL3 no tiñen las PBMC, de manera que no se ha identificado un patrón de reactividad consistente. Una de las explicaciones para la tinción específica de célula que producen los mAb sería que las PBMC (y los monocitos) activados secretan quimioquinas CC que se unen al CCR5 de la superficie celular, ocultando algunos epítopos para los mAb. Sin embargo, sería de esperar que esto fuera especialmente cierto en los casos de PA14 y 2D7, que son antagonistas de la movilización de calcio inducida por quimioquinas y que presumiblemente compiten con las quimioquinas CC en su unión a CCR5. Aún así estos mAb son los que tiñen las PBMC más intensamente. Como alternativa, una exposición diferencial de epítopos de CCR5 puede reflejar una oligomerización del receptor específica del tipo de célula, una asociación con otras moléculas de superficie celular, o diferentes modificaciones post-traduccionales tales como glicosilación. Los autores de la invención han demostrado que las diferencias encontradas en la unión de los mAb es probable que no reflejen diferencias específicas del tipo de célula en las interacciones CD4/CCR5.

Los mAb PA8-PA12 no inhibieron la movilización de calcio inducida por quimioquinas CC en células CCR5^{+}, ni mediaron en la señalización a través de CCR5. Los mAb 2D7 y PA14 fueron inhibidores de la movilización de calcio inducida por quimioquinas CC, pero 2D7 fue casi un orden de magnitud más potente que PA14. Esto puede ser debido a que el epítopo para PA14 solapa menos con el dominio de unión a quimioquinas CC sobre CCR5 que el epítopo para 2D7. Todos los mAb bloquearon también la entrada de HIV-1 y la fusión de membranas mediada por la envoltura, pero la inhibición de la fusión célula-célula requirió en algunos casos una cantidad de anticuerpo de casi dos órdenes de magnitud más que la que fue necesaria para bloquear la entrada viral. Presumiblemente, se establecen más interacciones gpl20/CD4/CCR5 así como interacciones entre moléculas de adhesión, y actúan de manera cooperativa durante la fusión célula-célula en comparación con la fusión célula-virus, haciéndola más difícil de inhibir. Esto se observa normalmente con anticuerpos dirigidos contra LFA-1 o contra la glicoproteína de la envoltura de HIV-1 (45, 51). PA8, PA9 y PA10 fueron incapaces de bloquear la fusión célula-célula en >15% y la entrada viral en >40%, incluso a las concentraciones más altas de los anticuerpos. Sin embargo, una inhibición de la fusión >90% se pudo alcanzar con PA11, PA12 y PA14, y una inhibición de la entrada >90% se pudo alcanzar con PA14. El más potente de los seis mAb en bloquear la fusión y la entrada fue PA14, que fue igual de efectivo que 2D7. Sorprendentemente, PA14 y 2D7 estuvieron entre los inhibidores menos potentes de la unión de gpl20/sCD4 a las células L1.2-CCR5^{+}, mientras que PA9-PA12 bloquearon con potencias similares, y PA8 fue incapaz de bloquear >40% la unión de gpl20/sCD4. Estas observaciones suscitan preguntas sobre la naturaleza de las moléculas CCR5 presentadas sobre diferentes células y sobre los mecanismos de inhibición de la fusión y entrada virales. Puede ser que el CCR5 que se encuentra sobre células L1.2, usadas en los ensayos de unión de los mAb y de gpl20, no esté en una conformación idéntica a la del CCR5 que se encuentra sobre las PBMC, usadas en el ensayo de unión de los mAb, ni a la del CCR5 que se encuentra sobre las células PM1 y U87MG usadas en los ensayos de fusión y entrada.

La baja tinción de las PBMC y la inhibición parcial de la fusión y entrada por parte de algunos de los mAb utilizados por los autores de la invención indican que estos mAb son solamente capaces de unirse a un subgrupo de las moléculas CCR5 expresadas sobre linfocitos primarios y sobre las líneas celulares PM1 y U87MG-CD4^{+}CCR5^{+}. Sin embargo, excepto PA8, todos los mAb son capaces de teñir las células L1.2-CCR5^{+} en >90% y de bloquear por completo la unión del complejo gpl20/sCD4 a estas células. Al menos una de las diferencias entre las células L1.2-CCR5^{+} y las demás células utilizadas es la densidad de la proteína correceptora presente sobre la superficie celular. De hecho, se estima que las células L1.2-CCR5^{+} expresan de 10 a 100 veces más correceptor en la superficie celular que las células PM1 y U87MG-CD4^{+}CCR5^{+}. Pero cuando las células HeLa se manipulan mediante ingeniería genética para que expresen de manera transitoria la misma cantidad de correceptor que la línea celular L1.2-CCR5^{+}, tampoco se pudo detectar la unión de gpl20/sCD4 a ellas (datos no mostrados). La sobre-expresión de CCR5 sobre L1.2, junto con otros factores específicos, podría sin embargo favorecer una conformación del correceptor que expusiera de manera destacada el Nt, haciéndolo más accesible tanto a los mAb como a gpl20. Esa conformación pudiera ser inducida por una oligomerización del receptor, por asociaciones disminuidas o alteradas con proteínas de superficie celular o por interacciones del receptor con proteínas G (25, 62). ¿Coexisten múltiples conformaciones de CCR5 sobre la superficie celular y permiten todas ellas la entrada viral? Los patrones de reactividad de los mAb así lo sugerirían, ya que la fusión y la entrada de HIV-1 pueden tener lugar, aunque a niveles reducidos, en presencia de concentraciones de mAb que saturan los epítopos requeridos para la unión de gpl20 a las células L1.2-CCR5^{+}. Los autores de la invención están a favor de la hipótesis de que las moléculas del correceptor presentes sobre las células L1.2-CCR5^{+} poseen una conformación apta para la entrada de HIV-1, mientras que las moléculas de CCR5 presentes sobre las PBMC, PM1 y U87MG-CCR5^{+} existen en múltiples estados aptos para la entrada, que presentan diferentes reactividades frente a los mAb. Mientras que PA14 y 2D7 pueden reconocer todas las conformaciones, otros mAb no pueden. Queda por determinar porqué las células L1.2 son conducentes a una conformación particular apta para la fusión.

Recientemente se ha demostrado que el dominio de unión a gp120 se encuentra en los primeros veinte residuos de aminoácidos del dominio Nt de CCR5. Los mAb dirigidos contra el dominio de unión a gpl20 en CCR5 bloquean potentemente esta interacción pero no son ni de cerca tan eficientes en cuanto a inhibir la fusión y entrada de HIV-1 en las células diana como PA14 y 2D7, cuyos epítopos se encuentran fuera de esta región. PA14 reconoce la punta del Nt y los residuos de ECL2, mientras que el epítopo para 2D7 se localiza exclusivamente en ECL2. Solamente se pueden hacer especulaciones sobre el mecanismo de acción de estos mAb. Puede ser que su unión a los primeros residuos de ECL2 induzca cambios conformacionales en el correceptor que impiden la fusión de las membranas. Como alternativa, la obstrucción de los epítopos de ECL2 pudiera impedir la oligomerización del correceptor y la formación de un complejo de proteínas apto para la fusión. Otra posibilidad más es que los residuos de ECL2 estén orientados hacia el interior del poro de fusión y que la unión de los mAb impida que gp41 introduzca el péptido de fusión en la membrana plasmática. En cambio, los mAb PA8-PA12 probablemente inhiben la fusión y la entrada nada más que compitiendo directamente por unirse con los complejos gpl20/CD4. No se sabe si otros parámetros además de la exposición de los epítopos y la afinidad por CCR5 determinan la eficacia de la inhibición de la entrada viral por parte de estos mAb. No está claro porqué la inhibición de las etapas posteriores a la interacción gpl20/correceptor sería más eficiente que bloquear directamente esa interacción. Una de las maneras de explicar esto sería suponer que la velocidad de disociación de la unión de gpl20 a CCR5 es mucho menor que la velocidad de asociación de la unión de los mAb a CCR5. Por lo tanto, cada vez que un mAb se desprende de una molécula de correceptor, una molécula gpl20 asociada a un virión lo sustituye de una manera casi irreversible debido a que esta interacción conduce a la fusión de las membranas.

La sinergia entre las combinaciones de los mAb anti-CCR5 probablemente es el resultado de sus interacciones con distintos epítopos que están implicados en etapas consecutivas e interdependientes de la entrada de HIV-1. El grado de sinergia observado entre PA12 y 2D7 (CI < 0,1 en muchas circunstancias) es extraordinario ya que valores de CI < 0,2 son raras veces observados en el caso de las combinaciones de anticuerpos anti-HIV-1 (33, 35, 61), de inhibidores de la transcriptasa inversa (29), o de inhibidores de proteasas (44). Debido a su potencia, la combinación de PA12:2D7 se estudió con múltiples formatos de ensayos y proporciones de las concentraciones, para los que se observaron niveles de sinergia sistemáticamente muy altos. Se observó una sinergia moderada en el caso de PA12 combinado con PA14. También se observó una sinergia moderada entre PA12 y CD4-IgG2. El complejo CD4/gpl20 es metastable y si no es capaz de interaccionar con un correceptor, decae hacia un estado no fusogénico (45-48). Debido a que PA12 bloquea directamente el sitio de unión a gpl20 sobre CCR5, su presencia puede desplazar el equilibrio hacia la inactivación del complejo gpl20/CD4. Esto explicaría porqué se observa sinergia entre CD4-IgG2 y el mAb PA12 con respecto a la inhibición de la fusión y entrada. La falta de sinergia entre el mAb PA14 y CD4-IgG2 sugiere que ambos actúan sobre dos etapas independientes y no consecutivas de la entrada viral. Se necesitará una combinación de estudios adicionales para determinar los mecanismos precisos de la sinergia de los diferentes compuestos con respecto a la inhibición de la entrada y fusión virales.

Los anteriores resultados están de acuerdo con un modelo en el que la entrada de HIV-1 tiene lugar en tres etapas distintas que implican la unión al receptor, la unión al correceptor y la fusión de membranas mediada por el correceptor. Se sugiere la existencia de eventos independientes de unión al correceptor y de fusión, por la falta de correlación entre las capacidades de los anticuerpos monoclonales para bloquear la unión de gpl20 y la fusión/entrada de HIV-1. La cronología de eventos durante la fusión es además sugerida por los patrones de sinergias observados. Agentes, tales como PA12, que inhiben potentemente la etapa media del procedimiento, concretamente la unión de gp120, actúan sinérgicamente con inhibidores de etapas anteriores y posteriores.

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<110> Progenics Pharmaceuticals, Inc.

\hskip1cm OLSON, WILLIAM C.

\hskip1cm MADDON, PAUL J.

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<120> INHIBICIÓN SINÉRGICA DE LA FUSIÓN Y ADHESIÓN DE HIV-1, COMPOSICIONES Y ANTICUERPOS PARA REALIZARLA

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\vskip0.400000\baselineskip

<130> 57906-PCT-EPO

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\vskip0.400000\baselineskip

<140> PCT/US99/30345

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<141> 16-12-1999

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 09/212.793

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<151> 16-12-1998

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\vskip0.400000\baselineskip

<150> US 60/112.532

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<151> 16-12-1998

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<160> 4

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<211> 31

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<212> PRT

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<213> HUMANA

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<400> 1

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1

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<210> 2

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> HUMANA

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<400> 2

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\sa{His Tyr Ala Ala Ala Gln Trp Asp Phe Gly Asn Thr Met Cys Gln}

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<210> 3

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<211> 27

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<212> PRT

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<213> HUMANA

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<400> 3

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2

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<210> 4

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> HUMANA

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<400> 4

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\sa{Gln Glu Phe Phe Gly Leu Asn Asn Cys Ser Ser Ser Asn Arg Leu Asp}

\sac{Gln}

Claims (15)

1. Un anticuerpo monoclonal anti-receptor CCR5 para quimioquinas o uno de sus fragmentos, en el que el anticuerpo o su fragmento se une al mismo epítopo al que se une el anticuerpo monoclonal PA14, siendo PA14 el anticuerpo monoclonal producido por una línea de células de hibridoma depositada en la ATCC, Núm. de Registro HB-12610 y denominada PA14.

2. El anticuerpo monoclonal anti-receptor CCR5 para quimioquinas de la reivindicación 1.

3. El fragmento del anticuerpo monoclonal anti-receptor CCR5 para quimioquinas de la reivindicación 1.

4. El anticuerpo o fragmento de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado.

5. El anticuerpo o fragmento de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 4, que comprende regiones determinantes de la complementariedad (CDR) derivadas del anticuerpo monoclonal o hibridoma PA14.

6. El anticuerpo de la reivindicación 4, en el que el anticuerpo comprende una región estructural derivada de una molécula de inmunoglobulina humana.

7. El anticuerpo de la reivindicación 6, en el que la molécula de inmunoglobulina humana se selecciona entre el grupo que consiste en IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgM.

8. El anticuerpo de la reivindicación 7, en el que la molécula de inmunoglobulina humana es IgG4.

9. El anticuerpo de la reivindicación 7, en el que la molécula de inmunoglobulina humana es IgG2.

10. El anticuerpo o fragmento de las reivindicaciones 1 - 3, en el que el anticuerpo es un anticuerpo quimérico.

11. El fragmento de anticuerpo monoclonal de la reivindicación 3, en el que el fragmento es un fragmento monovalente.

12. El anticuerpo monoclonal anti-receptor CCR5 para quimioquinas de la reivindicación 2, denominado PA14.

13. El anticuerpo monoclonal humanizado, anti-receptor CCR5 para quimioquinas, de las reivindicaciones 4 - 9, en el que el anticuerpo es un anticuerpo humanizado derivado del anticuerpo monoclonal denominado PA14.

14. El anticuerpo monoclonal o fragmento de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 13, que se une específicamente a células CCR5^{+}.

15. Uso del anticuerpo monoclonal o fragmento de cualquiera de las reivindicaciones 1 - 14, para la preparación de una composición para inhibir la fusión de HIV-1 a células CD4+ y la entrada viral en dichas células.