MXPA01006097A - Inhibicion sinergistica de la fusion y union de vih-1, composiciones y anticuerpos en la misma. - Google Patents

Abstract

La presente invencion proporciona una composicion para inhibir la infeccion de VIH-1 que comprende por lo menos dos compuestos en cantidades sinergisticamente efectivas para inhibir la infeccion de VIH-1, en donde por lo menos uno de los compuestos evita la interaccion productiva entre VIH-1 y un co-receptor de fusion VIH-1. La presente invencion tambien proporciona una composicion la cual inhibe la fusion de VIH-1 o de una glicoproteina+ de VIH-1 en una cubierta de celula a una celula objetivo, comprendiendo por lo menos dos compuestos en cantidades sinergisticamente efectivas para inhibir la fusion de VIH-1 o de una glicoproteina+ de VIH-1 en una cubierta de celula a una celula objetivo, en donde por lo menos uno de los compuestos evita la interaccion productiva entre VIH-1 y un co-receptor de fusion VIH-1. La presente invencion tambien proporciona un metodo para tratar a un sujeto que padece de VIH-1, en donde el metodo comprende la administracion al sujeto de una dosis efectiva de dichas composiciones. La presente invencion tambien proporciona un metodo para prevenir que un sujeto contraiga VIH-1, en donde el metodo comprende la administracion al sujeto de una dosis efectiva de dichas composiciones. La presente invencion tambien proporciona un anticuerpo monoclonal anti- CCR5 seleccionado del grupo que consiste de PA8, PA9, PA10, PA11. PA12 y PA14.

Description

INHIBICIÓN SINERGISTICA DE LA FUSIÓN Y UNION DE VIH-1, COMPOSICIONES Y ANTICUERPOS EN LA MISMA -*" Antecedentes del Invento 5 El virus de inmunodeficiencia humana tipo 1 (VIH- 1) causa fusión del virus a la membrana celular para tener acceso a las células objetivo (8, 15, 66) . La primera interacción de alta afinidad entre el virion y la superficie de la célula, es el enlace de la 10 glicoproteina de superficie viral gpl20 al antigeno CD4 (13, 30, 41, 42) . Éste a su vez, causa cambios de conformación en gpl20, los cuales lo habilitan para interactuar con uno de varios receptores de quimosina (4, 5, 21, 36) . El receptor de quimosina-CC CCR5 es el 15 principal co-receptor para cepas de macrófago-trópico (R5), y juega un papel crucial en la transmisión sexual del VIH-1 (4, 5, 21, 36) . Los viruses de linea trópica de la célula T (X4) utilizan CXCR4 para entrar en las células objetivo, y usualmente, aunque no 20 siempre, surgen posteriormente en la progresión de la enfermedad o como una consecuencia de la propagación del virus en cultivo de tejido (4, 5, 21, 36) . Algunos aislamientos de VIH-1 primario son trópicos-duales (R5X4) dado que pueden utilizar ambos co-receptores, 25 aunque no siempre con la misma eficiencia (11, 57) .

Los estudios de mutagénesis acoplados con la resolución de la estructura de cristal de núcleo gpl20, demostraron que el sitio de enlace del coreceptor en gpl20 comprende varios residuos conservados (32, 53, 65) . Se ha demostrado que las tirosinas y los residuos cargados negativamente en el campo de la terminal-a ino (Nt) de CCR5, son esenciales para el enlace gpl20 al co-receptor, y para la fusión y entrada de VIH-1 (6, 18, 20, 22, 28, 31, 52, 54). Los residuos en los espirales extracelulares (ECL) 1-3 de CCR5 fueron prescindibles para la función del co-receptor, sin embargo la configuración de intercampo de CCR5 tuvo que ser mantenida para fusión y entrada viral óptima (24) . Esto condujo a la conclusión de que, ya sea que gpl20 forme interacciones con una superficie difusa en los ECLs, o que el Nt sea mantenido en una conformación funcional mediante enlaces con residuos en los ECLs. Los estudios con co-receptores quiméricos y anticuerpos monoclonales anti-CCR5, también han mostrado la importancia de los espirales extracelulares para la entrada viral (5, 54, 64) . Las moléculas que se enlazan especificamente a CCR5 y CXCR , y que bloquean las interacciones con sus ligantes son una herramienta poderosa para pruebas posteriores de las relaciones estructura/función de los co-receptores. Caracterizando tales compuestos, también se podria ayudar en la designación de agentes terapéuticos efectivos que se dirigen a pasos de entrada viral mediados por co-receptores. Los inhibidores de función del co-receptor CCR5 ó CXCR4 identificados hasta la fecha, son diversos en la naturaleza e incluyen moléculas pequeñas, péptidos, quimosinas, y sus derivados, y anticuerpos monoclonales (mAbs) . Los mecanismos de acción de las moléculas pequeñas que bloquean la entrada interfiriendo con la función del co-receptor CXCR4 , no son bien conocidos (17, 49, 55, 68) . Dicho inhibidor, la molécula aniónica pequeña ADM3100, depende de residuos en ECL2 y el cuarto campo transmembrana (TM) de CXCR4 para inhibir la entrada viral, aunque esto no queda claro si se realiza interrumpiendo el enlace gpl20 al CXCR4 o enlazando posteriormente los pasos que conducen a la fusión de membrana (16, 34, 55) . A la fecha, no se han reportado moléculas pequeñas que bloqueen especificamente la entrada de VIH-1 transmitido por CCR5. La inhibición de la entrada de VIH-1 mediante quimosinas es transmitida mediante por lo menos dos mecanismos diferentes: bloqueo de la interacción gpl20/co-receptor e internalización del complejo quimosina/receptor (3, 26, 59, 63). La variante AOP-RANTES, también inhibe el reciclado de CCR5 a la superficie de la célula (40, 56) . Variantes tales como RANTES 9-68 y Met-RANTES sólo evitan la interacción gpl20/CCR5 y no regulan en forma descendente CCR5 (67). Las variantes SDF-1, presumiblemente, actúan a través de un mecanismo similar para bloquear la entrada viral transmitida mediante CXCR4 (12, 27, 39) . Sólo un mAb anti-CXCR4, 12G5, se ha caracterizado por sus propiedades antivirales. La eficiencia de la inhibición de entrada viral 12G5 ha sido reportada para ser dependiente tanto de la célula como del aislamiento (43, 58) . Este mAb se enlaza al ECL2 de CXCR4, aunque se desconoce el mecanismo mediante el cual, éste inhibe la entrada (2) . Algunos de los mAbs anti-CCR5 caracterizados hasta la fecha, evitan en forma eficiente la entrada de VIH-1 (28, 64). Sorprendentemente, los mAbs cuyos epitopes permanecen en el campo Nt de CCR5, los cuales contienen el sitio de enlace gpl20, inhiben en forma menos eficiente la fusión y entrada viral que mAb 2D7, cuyo epitope permanece en ECL2. 2D7 también antagoniza la actividad de quimosina-CC (64) . Un panel de seis mAbs de múrido, designados como PA8, PA9, PA10, PA11, PA12 y PA14 ha sido aislado y caracterizado. Los seis mAbs enlazan especificamente a células CCR5+, aunque con diferentes eficiencias que dependieron del tipo celular. Los estudios de mapeo del epitope, identificaron los residuos que son importantes para enlace mAb y también revelaron información sobre los pliegues e interacciones del campo extracelular CCR5. Todos los mAbs inhibieron la fusión y entrada de VIH-1, aunque no existe correlación entre la capacidad de un mAb para inhibir la fusión y la entrada, y su capacidad para inhibir enlace de gpl20/CD4s a células CCR5+.

Sumario del Invento La presente invención, proporciona una composición para inhibir la infección de VIH-1 que comprende por lo menos dos compuestos en cantidades sinergisticamente efectivas para inhibir la infección de VIH-1, en donde por lo menos uno de los compuestos evita la interacción productiva entre VIH-1 y un co-receptor de fusión VIH-1. La presente invención también proporciona una composición, la cual inhibe la fusión de VIH-1 o de una glicoproteinat de VIH-1 en una cubierta de célula a una célula objetivo, comprendiendo por lo menos dos compuestos en cantidades sinergisticamente efectivas para inhibir la fusión de VIH-1 o de una glicoproteinat de VIH-1 en una cubierta de célula a una célula objetivo, en donde por lo menos uno de los compuestos evita la interacción productiva entre VIH-1 y un co-receptor de fusión VIH-1. La presente invención, también proporciona un método para dar tratamiento a un sujeto que padece de VIH-1, en donde el método comprende la administración al sujeto de una dosis efectiva de dichas composiciones . La presente invención, también proporciona un método para prevenir que un sujeto contraiga VIH-1, en donde el método comprende la administración al sujeto de una dosis efectiva de dichas composiciones. La presente invención, también proporciona un anticuerpo monoclonal anti-CCR5, seleccionado del grupo que consiste de PA8 , PA9, PA10, PA11, PA12, y PA14.

Breve Descripción de las Figuras Figura 1 : Enlace de anticuerpos monoclonales de anti-CCR5 a las células CCR5+: Se utilizó la citometria de flujo para detectar expresión de proteina CCR5 en las superficies celulares Ll.2-CCR5+ y aisladas recientemente, PBMC estimulado por PHA/IL-2. Las células fueron incubadas en concentraciones de saturación de cada mAb, las cuales fueron detectadas con un anticuerpo reportador IgG anti-ratón etiquetado por PE. Se muestran los resultados de un experimento representativo. Los resultados de cada mAb están expresados tanto en intensidades de flourescencia promedio (m.f.i.) como en % celulares enviadas. Ya que, PA8 a PA12 y PA14 son todos de la subclase IgGl, sus m.f.i. son comparables en forma directa. 2D7 es un IgG2a. Figura 2 : Valores Cl para diferentes combinaciones de inhibidores mAbs y virales: Los experimentos parecidos a los descritos en la descripción de la Figura 7, se llevaron a cabo para diferentes combinaciones de inhibidores de entrada viral. Los mAbs anti-CCR5 fueron probados en combinación uno con el otro, las quimosinas-CC, y CD4-IgG2, las cuales inhiben la unión de VIH-1 a células objetivo. El rango de concentración PA11 y PA12 fue de 0-250µg/ml; el rango de concentración de 2D7 y PA14 fue de 0-25µg/ml; el rango de concentración de RANTES fue de 0-250ng/ml; el rango de concentración de CD4-IgG2 fue de 0-25µg/ml. Las concentraciones de agentes simples o sus mezclas requeridas para producir 50% y 90% de inhibición de fusión o entrada, fueron comparadas cuantitativamente en un término conocido como el índice de Combinación (Cl) . Figura 3: Valores IC50 para inhibición de fusión célula a célula, entrada viral y enlace gpl20/CD4s mediante mAbs anti-CCR5: Para propósitos comparativos, hemos sintetizado los valores IC50 obtenidos en los diferentes ensayos en que fueron probados los mAbs anti-CCR5. Solo fueron calculados los valores para mAbs que podrían inhibir >90% de fusión, entrada o enlace. Figura 4 : Mapeo de epítope de mAbs anti-CCR5: Se utilizó un protocolo de marcado de dos colores para evaluar el enlace de mAbs a las proteínas mutantes CCR5, etiquetadas en la terminal-C con el péptido HA. Las células HeLa que expresan mutantes de puntos CCR5, fueron incubadas con concentraciones de saturación de cada mAb, seguidas por detección con un IgG anti-ratón etiquetado con PE. La expresión del coreceptor de superficie celular fue medida mediante doble marcado de las células con un mAb anti-HA etiquetado con FITC. Las cuatro rejillas corresponden a las cuatro áreas extracelulares de CCR5. La primera fila de cada rejilla, indica la secuencia de aminoácido del campo extracelular CCR5 correspondiente. El enlace de mAbs anti-CCR5 al mutante de alanina de cada residuo es expresado como un porcentaje de enlace a CCR5 del tipo natural, como se describe en la sección de Materiales y Métodos. Figura 5: Inhibición de la movilización de calcio en células CCR5+ mediante mAbs anti-CCR5. Las células L1.2-CCR5+ fueron cargadas con Indo-1AM y estimuladas en forma secuencial con un mAb anti-CCR5 o PBS, seguido con RANTES (a) . Los cambios de fluorescencia fueron medidos con un espectrofluorómetro y los rastreos provienen de un experimento representativo. Se probó la inhibición del flujo de calcio mediante PA14 y 2D7 para un amplio rango de concentraciones mAb (b) . Los resultados son ploteados como % de inhibición de influjo de calcio = [1- (fluorescencia relativa en la presencia de mAb -fluorescencia relativa en la ausencia de mAb)] x 100%, y son promedios de valores de tres experimentos independientes . Figura 6: Inhibición de función del co-receptor CCR5 mediante mAbs anti-CCR5. La inhibición de fusión célula a célula mediante mAbs anti-CCR5 fue probada en el ensayo RET (a) . Se agregaron 0-250µg/ml de PA8 a PA12, ó 0-25µg/ml de PA14 ó 2D7 a un mezcla de células HeLa-EnvJR_FL y PM1, etiquetadas con F18 y R18, respectivamente. Se midieron las RET de fluorescencia después de 4 horas de incubación. Los resultados son valores promedio de tres experimentos independientes y están expresados como % de inhibición de fusión = [ 1 - (% RET en la presencia de mAb % RET en la ausencia de mAb)] x 100%. La inhibición de entrada de VIH-1 mediante mAbs anti-CCR5, fue probada en una sola vuelta de ensayo de entrada, con base en réplica de luciferasa (b) . las células U87-CD4+CCR5+ fueron infectadas con virus reportador NLluc+env~ que transporta la cubierta JR-FL en la presencia de 0-250µg/ml de PA8 a PA12, ó 0-25µg/ml de PA14 o 2D7. La actividad de luciferasa (unidades de luz relativas, r.l.u.) se midió en lisatos celulares, 72 horas posteriores a la infección. Los resultados provienen de un experimento representativo y están expresados como % de inhibición de entrada = [1- (r.l.u. en la presencia de mAb H-r.l.u. en la ausencia de mAb)] x 100%. El enlace de gpl20 biotinilado [b] , CD4s y complejos b-gpl20-CD4 a las células L1.2-CCR5+ (c) . Se observa un enlace fuerte cuando gpl20 derivado de virus VIH-1JR-FL R5 se vuelve complejo con una cantidad equimolar de CD4s. No se observó enlace en la ausencia de CD4s o para gpl20 derivado de virus VIH-ILAI 4. El enlace de fondo para células CCR5- L1.2 se ha deducido de todas las curvas. La inhibición de enlace gpl20/CD4s a células L1.2-CCR5+, fue probada en la presencia de concentraciones variadas de cada anticuerpo (d) . Las células fueron incubadas previamente en placas de 96 depósitos con un mAb anti-CCR5 seguido por una incubación con una concentración de saturación de gpl20/CD4s biotinilado. Finalmente, el enlace de estreptavidín etiquetado con PE a las células, fue medido utilizando un lector de placa fluorescente. Los resultados provienen de un experimento representativo y están expresados como % de inhibición de enlace gpl20/CD4s = [1- (m.f.i. en la presencia de mAb -H m.f.i. en la ausencia de mAb)] x 100%. Figura 7 : Inhibición sinergística de fusión célula a célula mediante PA12 y 2D7 : Se obtuvieron curvas de respuesta por dosificación para las mAbs utilizadas individualmente y en combinación. Se agregaron 0-50µg/ml de PA12, 0- 25µg/ml de 2D7, o una combinación de las dos en una proporción de 2:1, a un mezcla de células HeLa-EnvJR-FL+ y células PM1, etiquetadas con R18 y F18, respectivamente. La RET de fluorescencia fue medida después de 4 horas de incubación. Los resultados son expresados como % de inhibición de fusión y son los promedios de los valores de tres experimentos independientes. Los datos fueron analizados utilizando el principio de efecto de media, el cual puede escribirse de la siguiente manera: f = 1/[1 + (K/c)m] (1) en donde f es la fracción afectada/inhibida, c es la concentración, K es la concentración del agente requerido para producir el efecto de media, y m es un coeficiente empírico, que describe la forma de la curva de respuesta por dosificación. La ecuación (1) es una forma generalizada de las ecuaciones que describen la cinética de enzima de Michaelis-Menton, la absorción isotérmica de Langmuir, y el equilibrio de ionización de Henderson-Hasselbalch, para los cuales, m = 1. En el caso actual, K es igual al valor de IC5o. K y m se determinaron mediante ajuste por curva de las curvas de respuesta de dosificación, y la ecuación (1) fue arreglada nuevamente para permitir el cálculo de c para una f determinada. Los parámetros mejor ajustados para K y c son 8.8µg/ml y 0.54 para PA12, 0.36µg/ml y 0.68 para 2D7, y O.llµg/ml y 1.1 para sus combinaciones. Estás curvas están trazadas e indican un ajuste razonablemente benéfico entre el experimento y la teoría.

Descripción Detallada del Invento La presente invención, proporciona una composición para inhibir la infección de VIH-1, en donde la composición comprende por lo menos dos compuestos en cantidades sinergísticamente efectivas para inhibir la infección de VIH-1, en donde por lo menos uno de los compuestos evita la interacción productiva entre VIH-1 y un co-receptor de fusión VIH-1. Tal y como se utiliza en la presente descripción, el término "composición" significa una mezcla. Las composiciones incluyen, pero no se limitan a aquellas adecuadas para administración a un sujeto en forma oral, rectal, intravaginal, tópica, nasal, oftálmica o parenteral. Tal y como se utiliza en la presente descripción, el término "parenteral" incluye, pero no se limita a inyecciones subcutáneas, intravenosas, intramusculares, o intraesternales , o técnicas de infusión . Tal y como se utiliza en la presente descripción, el término "VIH-1", significa virus de inmunodeficiencia humana tipo-1. El VIH-1 incluye, pero no se limita a, partículas de virus extracelulares y las formas de VIH-1 encontradas en las células infectadas con VIH-1. Tal y como se utiliza en la presente descripción, el término "infección de VIH-1" significa la introducción de información genética VIH-1 en una célula objetivo, tal como mediante la fusión de la membrana de la célula objetivo con VIH-1 o una célula de glicoproteína+ de VIH-1 de cubierta. La célula objetivo puede ser una célula corporal de un sujeto.

En la modalidad preferida, la célula objetivo es una célula corporal de un sujeto humano. Tal y como se utiliza en la presente descripción, la frase "inhibición de infección VIH-1", significa la reducción de la cantidad de la información genética de VIH-1 introducida en una población de células objetivo, comparada con la cantidad que podría ser introducida sin dicha composición. Tal y como se utiliza en la presente descripción, el término "compuesto", significa una entidad molecular, que incluye pero no se limita a péptidos, polipéptidos y otras moléculas orgánicas o inorgánicas y combinaciones de las mismas. Tal y como se utiliza en la presente descripción, la frase "sinergísticamente efectiva" significa el efecto combinado de los compuestos cuando se utilizan en combinación, siendo mayor que sus efectos aditivos cuando se utilizan en forma individual. Tal y como se utiliza en la presente descripción, la frase "interacción productiva", significa que la interacción de VIH-1 y el co-receptor VIH-1 podrían conducir a la fusión de dicho VIH-1 o de una glicoproteína+ de VIH-1 en una cubierta de célula y la membrana que soporta al co-receptor. Tal y como se utiliza en la presente descripción, la frase "evita la interacción productiva", significa que la cantidad de interacción es reducida en comparación con la cantidad que podría surgir sin el compuesto. Las interacciones se pueden evitar cubriendo o alterando las regiones interactivas en el co-receptor o VIH-1 o alterando la expresión, agregación, conformación o el estado de asociación del co-receptor . Tal y como se utiliza en la presente descripción, la frase "co-receptor de fusión VIH-1", significa un receptor celular que media la fusión entre la célula objetivo que expresa el receptor y VIH-1 o de una glicoproteína+ de VIH-1 en una cubierta de célula. Los co-receptores de fusión VIH-1 incluyen pero no se limitan a CCR5, CXCR4 y otros receptores de quimosina. La presente invención también proporciona una composición la cual inhibe la fusión de VIH-1 o de una glicoproteína+ de VIH-1 en una cubierta de célula a una célula objetivo, en donde la composición comprende por lo menos dos compuestos en cantidades sinergísticamente efectivas para inhibir la fusión de VIH-1 o de una glicoproteína+ de VIH-1 en una cubierta de célula a una célula objetivo, en donde por lo menos uno de los compuestos evita la interacción productiva entre VIH-1 y el co-receptor de fusión VIH-1. Tal y como se utiliza en la presente descripción, el término "fusión", significa el acoplamiento o unión de membranas bicapa de lípido encontradas en células de mamífero o viruses tales como VIH-1. Este proceso se distingue de la unión de VIH-1 a una célula objetivo. La unión es transmitida por el enlace de la glicoproteína exterior de VIH-1 al receptor CD4 humano, el cual no es un co-receptor de fusión. Tal y como se utiliza en la presente descripción, el término "inhibe", significa que la cantidad es reducida en comparación con la cantidad que podría surgir sin la composición. Tal y como se utiliza en la presente descripción, la frase "célula objetivo", significa una célula que tiene la capacidad de ser infectada por o fusionada con VIH-1 o células infectadas con VIH-1. Tal y como se utiliza en la presente descripción, el término "quimosina", significa una citoquina que puede estimular el movimiento de leucocitos. Éstos pueden ser caracterizados ya sea como cis-cis o como cis-X-cis dependiendo de si los dos residuos de cisteína de terminal amino están inmediatamente adyacentes o separados mediante un aminoácido. Esto incluye, pero no se limita a RANTES, MlP-la, MlP-lß, SDF-1 u otra quimosina, la cual bloquea la infección de VIH-1. En una modalidad de las composiciones anteriores, el co-receptor es un receptor de quimosina. En la modalidad preferida de las composiciones anteriores, el receptor de quimosina es un CCR5 o CXCR . Se conocen otros varios receptores de quimosina y receptores relacionados para funcionar como co-receptores VIH, que incluyen, pero no se limitan a CCR2, CCR3, CCR8, STRL33, GPR-15, CX3CR1 y APJ (69) .

Tal y como se utiliza en la presente descripción, la frase "receptor de quimosina" significa un elemento de una familia homologa de proteínas de superficie celular de extensión de siete transmembranas que se enlazan a quimosinas. Tal y como se utiliza en la presente descripción, el término "CCR5", es un receptor de quimosinas el cual enlaza elementos del grupo C-C de quimosinas y cuyas secuencias de aminoácidos comprenden las que se proporcionan en el Número de Acceso Genbank 1705896 y se relacionan con variantes polimórficas. Tal y como se utiliza en la presente descripción, el término "CXCR4", es un receptor de quimosina el cual enlaza miembros del grupo CXC de quimosinas, y cuya secuencia de aminoácidos comprende la que se proporciona en el Número de Acceso Genbank 400654 y se relaciona con variantes polimórficas. En una modalidad de las composiciones anteriores, por lo menos uno de los compuestos es una molécula sin peptidilo. En una modalidad la molécula sin peptidilo es el compuesto biciclam AMD3100 (16) . Tal y como se utiliza en la presente descripción, la frase "molécula sin peptidilo", significa una molécula que no consiste en su totalidad de una secuencia lineal de aminoácidos enlazada mediante enlaces de péptido. Una molécula sin peptidilo puede, sin embargo, contener uno o más enlaces de péptido. En una modalidad de las composiciones anteriores, por lo menos uno de los compuestos es un anticuerpo. En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal. En otra modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo de receptor anti-quimosina . En una modalidad, el anticuerpo es un anticuerpo anti-CXCR4. En una modalidad adicional, el anticuerpo anti-CXCR4 es 12G5. (43) . En una modalidad preferida, el anticuerpo es un anticuerpo anti-CCR5. El anticuerpo anti-CCR5 incluye, pero no se limita a PA8 , PA9, PA10, PA11, PA12, PA14 Y 2D7. En esta composición, los compuestos están en una proporción adecuada. La proporción fluctúa desde 1:1 hasta 1000:1. Los anticuerpos monoclonales, PA8 , PA9, PA10, PA11, PA12 y PA14, fueron depositados consecuentemente con y para satisfacer, los requerimientos del Tratado de Budapest en el Reconocimiento Internacional del Depósito de Microorganismos para los Propósitos de Procedimientos de Patentes con la Recolección de Cultivo Tipo Americano (ATCC) , 10801 University Boulevard, Manassas, Virginia 20110-2209 en Diciembre 2 de 1998 bajo los siguientes Números de Acceso: No. de Acceso ATCC. HB-12605 ( PA8 ) , No. de Acceso ATCC.

HB-12606 (PA9), No. de Acceso ATCC HB-12607 (PA10), No. de Acceso ATCC. HB-12608 (Pll), No. de Acceso ATCC HB-12609 (PA12), No. de Acceso ATCC HB-12610 (PA14). En otra modalidad de las composiciones anteriores, dos o más de los compuestos son anticuerpos. En una modalidad de la presente invención, los anticuerpos incluyen, pero no se limitan a PA8 , PA9, PA10, PA11, PA12, PA14 y 2D7. En esta composición, los anticuerpos están en un proporción adecuada. La proporción fluctúa desde 1:1 hasta 50:1. Tal y como se utiliza en la presente descripción, el término "anticuerpo", significa una molécula de inmunoglobulina que comprende dos cadenas pesadas y dos cadenas ligeras y la cual reconoce un antígeno. La molécula de inmunoglobulina puede derivar de cualquiera de las clases comúnmente conocidas, incluyendo, pero sin limitarse a IgA, IgA secretorio, IgG e IgM. Las subclases IgG también son bien conocidas para los expertos en la materia e incluyen, pero no se limitan a IgGl, IgG2, IgG3 e IgG4 de humano. Esto incluye a manera de ejemplo, tanto los anticuerpos que surgen de manera natural como los que no surgen de manera natural. Específicamente, el término "anticuerpo", incluye anticuerpos policlonales y monoclonales, y fragmentos monovalentes y divalentes de los mismos. Adicionalmente el término "anticuerpo", incluye anticuerpos quiméricos, anticuerpos totalmente sintéticos, anticuerpos de cadena sencilla, y fragmentos de los mismos. Opcionalmente, un anticuerpo puede ser etiquetado con un marcador detectable. Los marcadores detectables incluyen, por ejemplo, marcadores radioactivos o fluorescentes. El anticuerpo puede ser un anticuerpo humano o no humano. El anticuerpo no humano puede ser humanizado mediante métodos recombinantes para reducir su inmunogenicidad en el hombre. Los métodos para humanización de anticuerpos son conocidos para los expertos en la materia . Tal y como se utiliza en la presente descripción, la frase "anticuerpo monoclonal", también designado como mAb, se utiliza para describir moléculas de anticuerpo cuyas secuencias primarias son esencialmente idénticas y las cuales exhiben la misma especificidad antigénica. Los anticuerpos monoclonales pueden ser producidos mediante hibridoma, técnicas recombinantes, transgénicas u otras conocidas para los expertos en la materia. Tal y como se utiliza en la presente descripción, la frase "anticuerpo receptor de anti-quimosina" , significa un anticuerpo el cual reconoce y se enlaza a un epítope en un receptor de quimosina. Tal y como se utiliza en la presente descripción, la frase "anticuerpo anti-CCR5", significa un anticuerpo monoclonal el cual reconoce y se enlaza a un epítope en el receptor de quimosina CCR5. Tal y como se utiliza en la presente descripción, la frase "proporción adecuada", significa proporciones de masa o molares en donde los compuestos son sinergísticamente efectivos. En una modalidad de las composiciones anteriores, por lo menos un compuesto es una quimosina o derivado de quimosina. Las quimosinas incluyen, pero no se limitan a RANTES, MlP-la, MlP-lß, SDF-1 o una combinación de los mismos. En esta composición, los compuestos están en una proporción adecuada. Los derivados de quimosina incluyen, pero no se limitan a Met-RANTES, AOP-RANTES, RANTES 9-68, o una combinación de los mismos. Tal y como se utiliza en la presente descripción, la frase "derivado de quimosina", significa una quimosina modificada químicamente. Las modificaciones químicas incluyen, pero no se limitan a substituciones de aminoácidos, adiciones o eliminaciones, adiciones u oxidaciones sin peptidilo. Un experto en la materia tendrá la capacidad de producir dichos derivados. En otra modalidad de las composiciones anteriores, por lo menos un compuesto es un anticuerpo y por lo menos un compuesto es una quimosina o derivado de quimosina. En esta composición, los compuestos están en una proporción adecuada. La proporción fluctúa desde 100:1 hasta 1000:1. En otra modalidad de las composiciones anteriores, por lo menos un compuesto se enlaza a la subunidad gp41 de la glicoproteína de VIH-lde cubierta. En una modalidad, por lo menos un compuesto es un inhibidor de péptido T-20 de entrada VIH-1 (70) .

En otra modalidad de las composiciones anteriores, por lo menos uno de los compuestos inhiben la unión de VIH-1 a una célula objetivo. En una modalidad, por lo menos un compuesto enlaza CD4. En una modalidad, por lo menos un compuesto es una glicoproteína de cubierta. En una modalidad, por lo menos un compuesto es un anticuerpo anti-CD4. En una modalidad, por lo menos un compuesto se enlaza a la glicoproteína de VIH-1 de cubierta. En una modalidad, por lo menos un compuesto es un anticuerpo para la glicoproteína de VIH-1 de cubierta. En una modalidad, por lo menos un compuesto es CD4-IgG2.

En otra modalidad de las composiciones anteriores, por lo menos un compuesto es un anticuerpo y por lo menos un compuesto se enlaza a una glicoproteína de VIH-1 de cubierta. En una modalidad, el compuesto es una proteína basada en CD4. En una modalidad, el compuesto es CD4-IgG2. En esta composición, los compuestos se encuentran en una proporción adecuada. La proporción fluctúa desde 1:1 hasta 10:1. Tal y como se utiliza en la presente descripción, el término "unión", significa el proceso que es transmitido por el enlace de la glicoproteína de VIH-1 de cubierta al receptor CD4 de humano, el cual no es un co-receptor de fusión. Tal y como se utiliza en la presente descripción, el término "CD4", significa proteína CD4 enlazada por membrana madura, nativa que comprende un campo citoplásmico, un campo de transmembrama hidrofóbica, y un campo extracelular, el cual se enlaza a la glicoproteína de gpl20 VIH-1 de cubierta. Tal y como se utiliza en la presente descripción, la frase "glicoproteína de VIH-1 de cubierta", significa la proteína codificada VIH-1 la cual comprende la proteína de superficie gpl20, la proteína de transmembrana gp41 y los oligómeros y precursores de los mismos . Tal y como se utiliza en la presente descripción, la frase "proteína basada en CD4", significa cualquier proteína que comprenda por lo menos una secuencia de residuos de aminoácidos correspondientes a la porción de CD4, la cual se requiere para que CD4 forme un complejo con la glicoproteína de gpl20 VIH-1 de cubierta . Tal y como se utiliza en la presente descripción, el término "CD4-IgG2", significa una proteína de fusión IgG2 CD4-humano heterotetramérica codificada por vectores de expresión depositados bajo los Números de Acceso ATCC 75193 y 75194. En una modalidad de las composiciones anteriores, por lo menos uno de los compuestos comprende un polipéptido, el cual se enlaza a un epítope CCR5. En una modalidad, el epítope está ubicado en la terminal-N, una de las tres regiones de espiral extracelular o una combinación de las mismas. En una modalidad, el epítope está ubicado en la terminal-N. El epítope puede comprender N13 y Y15 en la terminal-N. El epítope puede comprender Q4 en la terminal-N. En otra modalidad, el epítope incluye residuos en la terminal-N y el segundo espiral extracelular. El epítope puede comprender D2, Y3, Q4 , S7, P8 y N13 en la terminal-N, y Y176 y T177 en el segundo espiral extracelular. El epítope puede comprender D2 , Y3, Q4, P8 y N13 en la terminal-N, y Y176 y T177 en el segundo espiral extracelular. El epítope puede comprender D2 en la terminal-N y R168 y Y176 en el segundo espiral extracelular. En una modalidad, el epítope está ubicado en el segundo espiral extracelular. El epítope puede comprender Q170 y K171 en el segundo espiral extracelular. El epítope puede comprender Q170 y E172 en el segundo espiral extracelular. Tal y como se utiliza en la presente descripción, las abreviaturas estándar que se encuentran a continuación se utilizan a lo largo de la especificación para indicar aminoácidos específicos: A=ala=alanina R=arg=arginina N=asn=asparagina D=asp=ácido aspártico C=cis=cisteína Q=gln=glutamina E=glu=ácido glutámico G=gly=glicina H=his=histidina I=ile=isoleucina L=leu=leucina K=lys=lisina M=met=metionina F=phe=fenilalanina P=pro=prolina S=ser=serina T=thr=treonina =trp=triptofano Y=tyr=tirosina V=val=valina Tal como se utiliza en la presente descripción, el término "polipétido" significa dos o más aminoácidos enlazados por una unión de péptido. Tal y como se utiliza en la presente descripción, el término "epítope", significa una porción de una molécula o moléculas que forman una superficie para enlazar anticuerpos u otros compuestos. El epítope puede comprender aminoácidos contiguos o no contiguos, carbohidratos u otras porciones sin peptidilo o superficies específicas de oligómero. Tal y como se utiliza en la presente descripción, el término "teminal-N", significa la secuencia de aminoácidos que extienden la metionina y la primera región de transmembrana. Tal y como se utiliza en la presente descripción, la frase "segundo espiral extracelular", significa la secuencia de aminoácidos que expanden la cuarta y quinta regiones de transmembrana y están presentadas en la superificie. En una modalidad de las composiciones anteriores, por lo menos uno de los compuestos comprende una cadena ligera de un anticuerpo. En otra modalidad de las composiciones anteriores, por lo menos uno de los compuestos comprende una cadena pesada de un anticuerpo. En otra modalidad de las composiciones anteriores, por lo menos uno de los compuestos comprende la porción Fab de un anticuerpo. En otra modalidad de las composiciones anteriores, por lo menos uno de los compuestos comprende el campo variable de un anticuerpo. En otra modalidad, el anticuerpo es producido como un solo polipéptido o anticuerpo de "cadena sencilla" el cual comprende el campo variable de cadena pesada y ligera enlazada genéticamente por medio de una secuencia que interviene de aminoácidos. En otra modalidad de las composiciones anteriores por lo menos uno de los compuestos comprende una o más porciones CDR de un anticuerpo . Tal y como se utiliza en la presente descripción, la frase "cadena pesada", significa un polipéptido mayor de una molécula de aminoácido compuesta de campo variable (VH) y tres o cuatro campos constantes (CH1, CH2, CH3 y CH4), o fragmentos del mismos. Tal y como se utiliza en la presente descripción, la frase "cadena ligera" significa un polipéptido de una molécula de anticuerpo compuesta de un campo variable (VL) y un campo constante (CL), o fragmentos de los mismos. Tal y como se utiliza en la presente descripción, el término "Fab", significa un antígeno monovalente que enlaza el fragmento de una inmunoglobulina, que consiste de una cadena ligera y parte de una cadena pesada. Puede ser obtenido mediante digestión breve de papaína o mediante métodos recombinantes . Tal y como se utiliza en la presente descripción, la frase "fragmento F(ab')2", significa un antígeno bivalente que enlaza fragmento de una inmunoglobulina que consiste tanto de cadenas ligeras como parte de ambas cadenas pesadas. Estas se pueden obtener mediante digestión breve de pepsina o métodos recombinantes . Tal y como se utiliza en la presente descripción, el término "CDR", o la frase "región determinante complementaria", significa una secuencia altamente variable de aminoácidos en el campo variable de un anticuerpo . La presente invención, proporciona las composiciones anteriores y un transportador farmacéuticamente aceptable. Los transportadores farmacéuticamente aceptables son bien conocidos por los expertos en la materia. Tales transportadores farmacéuticamente aceptables pueden incluir, pero no están limitados a soluciones acuosas o no acuosas, suspensiones y emulsiones. Los ejemplos de solventes no acuosos son propilénglicol , polietilénglicol, aceites vegetales tales como aceite de oliva, y esteres orgánicos inyectables, tales como oleato etílico. Los transportadores acuosos incluyen agua, soluciones alcohólicas/acuosas, emulsiones o suspensiones, medios salinos y amortiguados. Los vehículos parenterales incluyen solución de cloruro sodio, dextrosa de Ringer, cloruro de dextrosa y sodio, aceites lactados o fijados de Ringer. Los vehículos intravenosos incluyen reestructuradores de fluidos y nutrientes, reestructuradores de electrolitos tales como aquellos basados en dextrosa de Ringer, y similares. Pueden estar presentes conservadores u otros aditivos, tales como, por ejemplo, agentes antimicrobianos, antioxidantes, de quelación, gases inertes y similares. La presente invención, proporciona un método para tratar a un sujeto que padece VIH-1, en donde el método comprende la administración al sujeto de una dosis efectiva de las composiciones anteriores. Tal y como se utiliza en la presente descripción, el término "sujeto", significa cualquier animal o animal modificado en forma artificial, con la capacidad de ser infectado con VIH. Los animales modificados en forma artificial incluyen, pero no se limitan a, ratones SCID con sistemas inmunológicos de humano. Los animales incluyen, pero no se limitan a ratones, ratas, perros, conejillos de indias, hurones, conejos y primates. En la modalidad preferida, el sujeto es un humano. Tal y como se utiliza en la presente descripción, el término "tratar", significa ya sea, retrasar, detener o revertir la progresión de un desorden VIH-1. En la modalidad preferida, el término "tratar", significa revertir la progresión del desorden hasta el punto de eliminarlo. Tal y como se utiliza en la presente descripción, el término "tratar", también significa la reducción de una cantidad de infecciones virales, reducción de un número de partículas virales infecciosas, reducción del número de células infectadas en forma viral, o la disminución de síntomas asociados con VIH-1. Tal y como se utiliza en la presente descripción, la frase "que padece VIH-1", significa que el sujeto tiene por lo menos una célula, la cual ha sido infectada por VIH-1. Tal y como se utiliza en la presente descripción, el proceso de "administración", puede ser efectuado o llevado a cabo utilizando cualquiera de los métodos conocidos por los expertos en la materia. Los métodos pueden comprender medios intravenosos, intramusculares o subcutáneos . La dosis de la composición de la presente invención, variará dependiendo del sujeto y de la ruta particular que se utilice para la administración. La dosificación puede estar dentro del rango desde 0.1 hasta 100 , OOOµg/kg . Basándose en la composición, la dosis puede ser administrada continuamente, tal como, por bombeo continuo, o en intervalos periódicos. Por ejemplo, en una o más ocasiones separadas. Los intervalos deseados de tiempo de dosis múltiples de una composición en particular, se pueden determinar sin la experimentación indebida por parte de un experto en la materia. Tal y como se utiliza en la presente descripción, la frase "dosis efectiva", significa una dosis en cantidades suficientes, ya sea para tratar o para evitar que el sujeto se infecte con VIH-1. Un experto en la materia puede llevar a cabo experimentos simples de titulación para determinar qué cantidad se requiere para tratar al sujeto. La presente invención proporciona un método para evitar que un sujeto contraiga VIH-1, en donde el método comprende la administración al sujeto de una dosis efectiva de las composiciones anteriores.

Tal y como se utiliza en la presente descripción, la frase "contraer VIH-1", significa infectarse con VIH-1, cuya información genética se copia y/o se incorpora en las células huésped. La presente invención proporciona un anticuerpo monoclonal anti-CCR5. El anticuerpo incluye, pero no se limita a lo siguiente: PA8 (No. de Acceso ATCC HB- 12605), P9 (No. de Acceso ATCC HB-12606), PA10 (No. de Acceso ATCC HB-12607), PA11 (No. de Acceso ATCC HB- 12608), PA12 (No. de Acceso ATCC HB-12609), y PA14 (No. de Acceso ATCC HB-12610) . La presente invención proporciona formas humanizadas de los anticuerpos anteriores. Tal y como se utiliza en la presente descripción, el término "humanizadas", describe anticuerpos en donde algunos, la mayoría o todos los aminoácidos exteriores de las regiones CDR son reemplazados con los aminoácidos correspondientes derivados de moléculas de inmunoglobulina de humano. En una modalidad de las formas humanizadas de los anticuerpos, algunos, la mayor parte o todos los aminoácidos exteriores de las regiones CDR han sido reemplazados con aminoácidos de moléculas de inmunoglobulina humana pero en donde algunos, la mayoría o todos los aminoácidos dentro de una o más regiones CDR fueron iguales. Pequeñas adiciones, eliminaciones, inserciones, substituciones o modificaciones de aminoácidos son permisibles siempre y cuando no invaliden la capacidad del anticuerpo para enlazar a un antígeno determinado. Las moléculas de inmunoglobulina de humano adecuadas podrían incluir moléculas IgGl, IgG2, IgG3, IgG4, IgA e IgM. Un anticuerpo humanizado podría retener una especificidad antigénica similar a la del anticuerpo original, por ejemplo, en la presente invención, la capacidad de enlazar a CCR5. La presente invención proporciona moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican estos anticuerpos monoclonales anti-CCR5 o sus versiones humanizadas. La molécula de ácido nucleico puede ser ARN, ADN ó cADN. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico codifica la cadena ligera. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico codifica la cadena pesada. En una modalidad, el ácido nucleico codifica tanto la cadena pesada como la cadena ligera. En una modalidad, una o más moléculas de ácido nucleico codifican la porción Fab. En una modalidad, una o más moléculas de ácido nucleico codifican las porciones CDR. En una modalidad, la molécula de ácido nucleico codifica el campo variable.

La presente invención será mejor comprendida a partir de la sección de Detalles Experimentales que se explicarán a continuación. Sin embargo, un experto en la materia apreciará fácilmente que los métodos específicos y resultados argumentados, son meramente ilustrativos de la presente invención tal como se describen en las reivindicaciones que se encuentran más adelante.

Detalles Experimentales A. Materiales y Métodos 1) Reactivos Se adquirió mAb 2D7 de Pharmingen (San Diego, CA) y se obtuvieron quimosinas CC y CXC de R&D Systems (Minneapolis, MN). CD4-IgG2 (1), CD4 soluble (s) (2) y gpl20 VIH-ljR-FL recombinante, fueron producidos por Progenies Pharmaceuticals, Inc. (59). 2) Aislamiento y Purificación de mAbs anti-CCR5. Las células L1.2-CCR5+ (63) fueron incubadas durante 16 horas en la presencia de butirato de sodio 5mM, el cual activa la transcripción desde el promotor de citomegalovirus (CMV) que controla la expresión CCR5, dando como resultado un incremento de 10 pliegues en la densidad del co-receptor de superficie de la célula. Se inmunizaron ratones hembra Balb/c intraperitonealmente con 107 de células L1.2-CCR5+ en intervalos de tres semanas, y se les administró estímulo intravenoso de células 107 L1.2 CCR5+ durante tres días antes de la esplenectomía. Se derritieron los esplenocitos con la línea celular Sp2/0. En un clasificador primario, se probaron los sobrenadantes provenientes de diez mil cultivos de hibridoma; ciento veinte de éstos, inhibidos por fusión transmitida por cubierta VIH-1 entre células PM1 (10), las cuales expresan de forma natural CCR4 y CD4, y células HeLa-EnvJR_FL en un ensayo de transferencia de energía de resonancia (RET), como se describió anteriormente (19, 38) . Los hibridomas que produjeron la mayoría de los sobrenadantes potencialmente inhibitorios y aquellos que también marcaron las células CCR5+ fueron subclonados mediante disolución de límite. Los fluidos de ascitis fueron preparados por Harían Bioproducts for Science, Inc. ( Indianapolis , IN) a partir de ratones Balb/c que fueron inyectados con hibridomas que producen los mAbs anti-CCR5 PA8 , PA9, PA10, PAll, PA12 y PA14. Los mAbs fueron purificados individualmente a >95% de homogeneidad mediante precipitación con sulfato de amonio seguido por cromatografía de proteína A. Todos los mAbs fueron resuspendidos en solución salina amortiguada con fosfato (PBS) a una concentración final de 5mg/ml. 3) Análisis de clasificación celular activada por fluorescencia (FACS) y mapeo de epítope de mAbs anti-CCR5. Se utilizó citometría de flujo para detectar reactividad de mAbs PA8 a PA12 y PA14 de la superficie de las células con CCR5. Las células L1.2-CCR5+ (106) tratadas con butirato de sodio fueron incubadas con 0.25µg de anticuerpo, durante 20 minutos a una temperatura de 4°C en ázida de sodio al 0.1% (NaN3) en 50µl de PBS de Dulbecco (DPBS). El 2D7 mAb CCR5 ' se utilizó como un control positivo, un IgGl de múrido no específico fue utilizado como control negativo. Las células fueron centrifugadas en forma descendente, lavadas e incubadas con IgG anti-ratón de cabra etiquetadas con ficoeritrín (PE) (Caltag, Burlingame, CA) diluidas en una proporción de 1:100, bajo las mismas condiciones que la primera incubación del anticuerpo. Finalmente, las células fueron analizadas mediante citometría de flujo. Se aislaron las PBMCs y se estimularon tal y como se describió anteriormente (60) y se marcaron utilizando métodos similares. Se utilizó un procedimiento similar para el mapeo del epítope de los mAbs anti-CCR5. Se ha descrito un panel de setenta mutantes de puntos CCR5 (20, 24, 52) . Las secuencias de codificación de estas proteínas están subclonadas dentro del vector pcADN3.1 (Stratagene) a partir de cuya transcripción, pueden ser conducidas por un promotor 5' T7-polimerasa . Los mutantes CCR5 transportan una etiqueta de hemaglutinina (HA) de 9 residuos a la terminal-C para detección de proteína en lisatos celular o mediante citometría de flujo. Las células HeLa (2xl06) fueron incubadas durante 5 horas con 20µg/ml de lipefectina y una cantidad igual de plásmido que expresa CCR5 del tipo natural o mutante en OPTI-MEM (Life Technologies, Gaithersburg, MD) . Las células, posteriormente fueron infectadas durante 12 horas con 2xl07 p.f.u. de vTF7 (23) para estimular la expresión CCR5, desprendido con 2mM de ácido tetracético de etilenodiamina (EDTA) en PBS y lavadas una vez con amortiguador de enlace (1% BSA, 0.05% NaN3 en DPBS). Las células (lxlO6) fueron etiquetadas en la superficie con mAbs como se describe en el párrafo anterior, lavadas una vez con amortiguador de incubación y resuspendidas en lml de lx FACSlyse en agua (Becton Dicknson) durante 30 minutos a temperatura ambiente, para permeabilizar las membranas celulares. Posteriormente, las células fueron centrifugadas en forma descendente, lavadas con el amortiguador de incubación e incubadas durante una hora a una temperatura de 37 °C, 4µg/ml de un mAb anti-HA de ratón de etiquetado con isotiocianato de fluorescina (FITC) (BabCo, Richmond, CA) para etiquetado intracelular. Finalmente, las células fueron lavadas una vez con amortiguador de enlace y una vez con DPBS, resuspendidas en 1% de formaldehido en PBS y analizadas mediante citometría de flujo. La amplitud de enlace de un mAb a CCR5 mutante se determinó mediante la ecuación (CCR5 PE m.f.i. de Mutante/peso CCR5 PE m. f . i . ) / (CCR5 FITC m.f.i. de mutante/peso CCR5 FITC m.f.i.) x 100%. Esto normaliza el mAb de enlace para niveles de expresión de coreceptor de mutante. 4) Ensayo de enlace gpl20/CD4s gpl20 fue biotinilado utilizando NHS-biotina (Pierce, Rockford, IL) de acuerdo con las instrucciones del fabricante, y se removió la biotina no acoplada mediante diafiltración . Las células L1.2-CCR5+ tratadas por butirato de sodio, fueron incubadas con disoluciones variantes de una mezcla equimolar de CD4s y gpl20 biotinilado, o 1.25µg/ml de CD4s y 2.5µg/ml de gpl20 biotinilado en la presencia de concentraciones variantes de mAbs anti-CCR5 PA8 a PA12, PA14, 2D7 ó IgGl de múrido no específico, durante 1 hora a temperatura ambiente en 0.1% de NaN3 en DPBS. Las células fueron lavadas con el regulador de incubación e incubadas con streptavidín-PE (Becton Dickinson) diluido a 1:50, durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, las células fueron lavadas con amortiguador de enlace y analizadas utilizando un lector de placa de fluorescencia (Perspective Biosystems, Framingham, MA) . 5) Inhibición de fusión célula a célula transmitida por cubierta y entrada de VIH-1 mediante mAbs anti-CCR5. La fusión mediada por cubierta VIH-1 entre células HeLa-EnvJR_FL+ y PM1 fue detectada utilizando el ensayo RET. Números iguales (2xl04) de células que expresan cubierta éster octadecilo de fluorescina etiquetado (F18) y células de PM1 etiquetadas con rodamina octadecilo (R18) fueron plaqueadas en placas de 96 depósitos en 15% de suero fetal de becerro en DPBS e incubadas durante 4 horas a una temperatura de 37°C en la presencia de concentraciones variables de mAbs anti-CCR5, PA8 a PA12, PA14, 2D7 o IgGl de múrido no específico. La RET de fluorescencia fue medida con un lector de placa Citofluor (PerSeptive Biosystems) y el % RET se determinó tal y como se describió anteriormente (38) .

Los viruses NLluc+env~ complementados en trans mediante glicoproteínas de cubierta a partir de JR-FL o Gun-1, se produjeron tal y como se describió anteriormente (20). Las células U87MG-CD4+CCR5+ (14) fueron infectadas con viruses reportadors quiméricos que contienen de 50-100ng/ml p24 en la presencia de concentraciones variables de los mAbs individuales. Después de 2 horas a una temperatura de 37°C, los medios que contienen virus fueron reemplazados por medios que contienen mAb reciente. Los medios recientes, sin anticuerpos, fueron agregados nuevamente después de 12 horas. Después de un total de 72 horas, lOOµl de regulador lisis (Promega) fueron agregados a las células y se midió la actividad de luciferasa (r.l.u.) tal y como se describió anteriormente (20) . El porcentaje de inhibición de infección VIH-1 está definido como [1- (r.l.u. en la presencia de anticuerpo/r .1. u . en la ausencia de anticuerpo)] x 100%. 6) Ensayos de señalización de calcio. Se agregó el fluorocromo Indo-IAM (Molecular Probes, Eugene, OR) a las células L1.2-CCR5+ tratadas con butirato de sodio a una concentración final de 5 µm. Después de la incubación a una temperatura de 37 °C durante 30 minutos, se lavaron las células una vez y fueron suspendidas nuevamente en solución salina amortiguada de Hank. Las células (106) fueron estimuladas secuencialmente con un mAb anti-CCR5 o PBS, seguidas de 60s posteriores con RANTES. Se utilizaron mAbs PA8 a PA12 y PA14 en una concentración de lOOµg/ml, 2D7 a 20µg/ml y RANTES a 250ng/ml. También fue probada la inhibición de flujo de calcio mediante PA14 y 2D7 para un amplio rango de concentraciones mAb, que abarcan desde 0-100µg/ml. Los niveles de calcio extracelular fueron monitoreados utilizando un espectrómetro de fluorescencia Perkin-Elmer LS-50S midiendo la proporción de emisiones de fluorescencia a 402nm (tinta de enlace) y 486 nm (tinta libre) después de la excitación a 358nm. B. Resultados y Argumento 1) Aislamiento de anticuerpos monoclonales anti-CCR5 PA8, PA9, PA10, PAll, PA12 y PA14. Se descubrió, los péptidos que corresponden a los campos extracelulares de CCR5 son ineficientes en elevar respuestas del anticuerpos específicos, de alta titulación de substancia contra el receptor de superficie celular nativo (50) . Los ratones Balb/C fueron inmunizados, por consiguiente, con células L1.2-CCR5+ y los sobrenadantes de cultivo de hibridoma fueron probados en su capacidad para inhibir fusión de membrana transmitida por cubierta JR-FL con células CD4+CCR5+ PM1 en el ensayo RET (19, 38) . Incluso, aunque aproximadamente cien sobrenadantes inhibieron la fusión célula a célula por >50%, sólo seis designados como PA8, PA9, PA10, PAll, PA12 y PA14-marcaron específica e intensamente L1.2-CCR5+ aunque no a las células L1.2 parentales, como se demostró mediante la citometría de flujo (información no mostrada) . Con base en la experiencia previa, se dedujo que los otros mAbs con capacidad para inhibir la fusión célula a célula fueron probablemente dirigidos, contra las moléculas de unión de la superficie celular, tal como, LFA-1 (37) . Los hibridomas PA8 a PA12 y PA14 fueron determinados por isodactilografía ELISA (Cappell, Durham, NC) para secretar mAbs IgGl. Los fluidos de ascitis fueron preparados a partir de ratones Balb/C que fueron inyectados con seis hibridomas y las fracciones IgGl fueron purificadas. PA8 , PA9, PAll, PA12 y PA14 exhibieron diferentes perfiles de enfoque isoeléctrico, mientras que PA10 tuvo un perfil muy similar al de PA9 y por consiguiente, puede ser un segundo aislamiento del mismo mAb (información no mostrada ) . 2) Enlace mAb a células CCR5+ Ninguno de los mAbs anti-CCR5 purificados, marcaron la línea celular L1.2 parental (información no mostrada) . Sin embargo, los mAbs PA9 a PA12 y PA14 marcaron >90%, y PA8 marcó ~70%, de células L1.2-CCR5+ como se determinó mediante la citometría de flujo, mostrando que reconocieron el CCR5 (Tabla 1) . El mAb anti-CCR5 2D7, el cual tiene un control positivo en nuestros experimentos, también marcó >90% de células L1.2-CCR5+. De PA8 a PA12 y PA14 son todos IgGl, y reaccionan igualmente bien con un IgG anti-ratón de cabra, mientras que 2D7 es un IgG2a y puede reaccionar en forma diferente con el anticuerpo reportador. Por lo tanto, sólo las intensidades de fluorescencia promedio (m.f.i.) medidas con mAbs PA8 a PA12 y PA14, son comparables directamente. El orden de clasificación de intensidades de fluorescencia promedio (m.f.i.) fue PA12~ PA11> (2d7=) PA14- PA10~ PA9> PA8. La diferencia entre las m.f.i. de PA12 y las m.f.i. de PA8 fue de tres pliegues. Las diferencias en intensidad de marcado entre PA8 y los otros mAbs se mantuvieron constantes sobre un amplio rango de concentraciones (información no mostrada) y probablemente no corresponden a diferencias en afinidades mAb para CCR5. Esto implica que PA8 interactúa sólo con un subgrupo de moléculas CCR5 presentes en la superficie de las células L1.2-CCR5+. Comparado con células L1.2-CCR5+, PBMC el estimulado por mitógeno exhibió diferentes patrones de marcado mediante los mAbs anti-CCR5. 2D7 y PA14 marcaron >20%, PAll y PA12 marcaron ~10%, PA8 , PA9 y PA10 marcaron <5% de PBMC (Tabla 1). Las intensidades de fluorescencia promedio del PBMC marcado fueron aproximadamente de diez pliegues menos que las obtenidas con células 11.2-CCR5+ para cada mAb; su orden de categoría fue (2D7>) PA14> PA12~ PAll" PA10~ PA9~ PA8. Una vez más, esto difirió de alguna manera del orden las reactividades observadas en transfectantes CCR5. Esta diferencia entre las m.f.i. de PA9 y las m.f.i. de PA14 fue de siete pliegues. Otros grupos han observado diferencias similares en la capacidad de los mAbs anti-CCR5 para marcar las líneas celulares CCR5+ estables contra PBMC (28). Esto se puede deber a las diferencias específicas de las células en la conformación de CCR5, modificación post-translacional u oligomerización. Alternativamente, la asociación con otras moléculas de superficie celular puede diferir entre células. Ya que una elección obvia para dicha molécula podría ser el antígeno de superficie celular CD4, el cual está ausente de las células Ll.2-CCR5+ y está presente en las PBMCs, también probamos la habilidad de PA8 a PA12, PA14 y 2D7 para marcar célula? HeLa que expresan temporalmente CCR5 solo o con CD4. No se observaron diferencias en la capacidad de los mAbs para marcar el CCR5 de la superficie celular en la presencia de CD4 (información no mostrada) . Si existe una asociación entre estas dos proteínas, no involucra epítopes reconocidos mediante los mAbs anti-CCR5 de los que disponemos. Alternativamente, una asociación entre CCR5 y CD4 sólo puede ocurrir en linfocitos primarios. 3) Mapeo del epítope de los mAbs utilizando mutantes de alanina CCR5. Ninguno de los anticuerpos tuvieron la capacidad para detectar proteína CCR5 reducida y desnaturalizada mediante marcado Western, indicando que reconocen los epítopes conformacionalmente sensibles (información no mostrada) . Los estudios del mapeo de epítope mAb fueron llevados a cabo utilizando un panel de setenta mutantes de puntos de alanina de residuos en el Nt y ECLs de CCR5. Las células HeLa fueron lipofectadas con CCR5 tipo mutante o natural codificando secuencias que se adjuntaron con etiquetas HA terminal-C, se infectaron con vTF7 (23) para estimular la expresión del co-receptor. Posteriormente, las células fueron incubadas con los mAbs anti-CCR5 y su enlace fue revelado mediante un IgG anti-ratón de cabra etiquetado con PE. Un segundo marcado intracelular, se llevó a cabo con un mAb anti-HA etiquetado con FITC (BabCo) . Este control interno nos permitió normalizar directamente el marcado mediante los mAbs anti-CCR5 para niveles de expresión de co-receptor mutante en la superficie celular. Por lo tanto, el enlace mAb para cada mutante, está expresado como un porcentaje de enlace al CCR5 de tipo natural (Figura 1) . Ciertas mutaciones de punto redujeron el enlace de todos los anticuerpos al CCR5 en un >50%. En general, PA8-PA12 fueron los más afectados, PA14 y 2D7 los menos afectados por este tipo de mutantes, los cuales incluyeron el par de cisteína C101A y C178A, los mutantes Nt Y10A, D11A, K25A, el mutante D95A de ECL1, los K171A/E172A, Q188A, K191A/N192A de mutantes ECL2, y F263A y F264A de mutante ECL3 (Figura' 1) . Una interpretación es que estos residuos no son parte de epítopes mAp per se, aunque al cambiarlos por alaninas originan perturbaciones conformacionales que tienen un efecto común en el enlace de todos los mAbs. Hemos asumido que si una mutación de enlace reducido de un mAb individual en >75%, y tampoco de enlace inferior de la mayoría de los otros anticuerpos, el residuo sería probablemente un contribuyente directo para el epítope reconocido por el mAb. Utilizando estos estrictos lineamientos, se concluyó que los siete mAbs anti-CCR5 reconocen el traslape, pero distintos epítopes (Figura 1). El mAb PA8 enlaza al CCR5 dependiendo de N13 y Y15 en el Nt . Los mAbs PA9 y PA10 requerieron D2 , Y3, Q4, P8 y N13 en el Nt, y Y176 y T177 en ECL2. También mAb PA9 requirió S7 en el Nt . El enlace mAb PAll y PA12 dependió de Q4 en el Nt . PA14 requirió D2 en el Nt, y R168 y Y176 en ECL2. Finalmente, mAb 2D7 requirió Q170 y K171/E172 en ECL2 con el objeto de enlazar a CCR5. 4) Señalización de quimosina en la presencia de mAbs anti-CCR5. Los agentes de enlace-receptor de quimosina pueden ser antagonistas, o menos frecuentemente, agonistas de señalización intracelular transportada por receptor. Alternativamente, podrían no tener efecto en la señalización. CCR5 tiene la capacidad para enlazar tres quimosinas-CC, RANTES, MlP-la y MIP-lß, y transducir una señal que modula los niveles de calcio citosólicos. Por consiguiente, probamos la actividad agonista/antagonista de varias concentraciones de mAbs PA8 a PA12, PA14 y 2D7. Los cambios en las concentraciones de calcio intracelular, (Ca2+)i, se midieron en células L1.2-CCR5 cargadas con Indo-1. Ninguno de los mAbs estimularon un cambio en (Ca2+)i, indicando que no son agonistas para CCR5. PA8 a PA12, tampoco tuvieron la capacidad de inhibir flujos Ca2+ inducidos mediante RANTES (Figura 2a e información no mostrada), incluso en concentraciones tan altas como lOOµg/ml, mostrando que tampoco son antagonistas. Estas concentraciones proporcionan enlace de saturación de los mAbs a las células L1.2-CCR5+, como se muestra mediante citometría de flujo y el ensayo de enlace gpl20/CCR5 (Figura 3d e información no mostrada) . Sin embargo, los mAbs PA14 y 2D7, bloquearon la movilización de calcio inducida mediante RANTES, aunque con diferentes potencias (Figura 2a, b) . El IC50 para inhibición de influjo de calcio de PA14 fue de 50µg/ml, el cual fue aproximadamente 8 pliegues mayor que el IC50 para 2D7 (Figura 2b) . Los flujos de calcio inducidos por RANTES, MlP-la, y MlP-lß, fueron inhibidos cada uno mediante concentraciones similares de PA14 (información no mostrada) . Ninguno de los mAbs afectó la movilización de calcio SDF-1 inducida por las células L1.2-CCR5"1", las cuales expresan endógenamente CXCR4 (información no mostrada) . Finalmente, ni los mAbs, ni las quimosinas-CC afectaron los niveles de calcio citosólico en células L1.2 parentales (información no mostrada) . 5) Inhibición de función de co-receptor CCR5 mediante mAbs. Los mAbs PA8 a PA12 y PA14 fueron seleccionados inicialmente sobre la base de su capacidad para inhibir fusión célula a célula transmitida por cubierta VIH-1. Esta actividad fue confirmada y cuantificada por los mAbs purificados. Como se esperaba, los seis mAbs, así como también mAb 2D7, bloquearon la fusión entre células CD4+CCR5+ PMl y células HeLa-EnvJR_FL+ en el ensayo RET. El orden de clasificación de potencia fue 2D7~ PA14> PA12> PA11> PA10~ PA9~ PA8 (Figura 3a) . Los valores IC50 para PA14 y 2D7 fueron 1.7µg/ml y 1.6µg/ml respectivamente, para PAll y PA12 éstos fueron 25.5µg/ml y lO.Oµg/ml respectivamente (Tabla 3) . PA8, PA9 y PA10 inhibieron la fusión únicamente del 10 al 15% en 300µg/ml. Ninguno de los mAbs afectaron la fusión entre células PMl y células HeLa-EnvLAI+, las cuales expresan la longitud total de proteína de cubierta de un virus X4 (información no mostrada). La capacidad que tienen los diferentes mAbs anti-CCR5 para inhibir la entrada de un virus R5 prototípico, JR-FL, y un virus R5X4, Gun-1, en una sola vuelta de réplica, también se probó el ensayo de entrada basado en luciferasa. El orden de clasificación de potencia en el ensayo de entrada fue similar al determinado en el ensayo de fusión célula a célula (Figura 3b) . No fue posible obtener una inhibición >50% de entrada JR-FL o Gun-1 con PA8 a PAll. El valor IC50 para PA12 fue 2.5µg/ml. Sin embargo, no se pudo obtener la inhibición de entrada de >60% con este mAb. Los valores IC50 para inhibición PA14 y 2D7 de entrada JR-FL fueron determinados para ser 0.024 y 0.026 µg/ml respectivamente (Tabla 3), y fueron 60 pliegues menores que los que se obtuvieron en el ensayo de fusión. La entrada de Gun-1 dual trópico fue de 2 a 3 pliegues más sensible a la inhibición mediante mAbs anti-CCR5 que la entrada JR-FL (información no mostrada) . Los mAb de anti-co-receptor pueden inhibir la fusión transmitida por cubierta ya sea afectando directamente la interacción gpl20/CCR5 o impidiendo los pasos posteriores al enlace, involucrados en la formación de un complejo de fusión activo. Para determinar el mecanismo de inhibición de fusión viral y entrada por PA8 a PA12 y PA14, se probó la habilidad de diferentes mAbs para bloquear la interacción gpl20/CCR5. Para esto, se utilizó un ensayo que detecta el enlace a células L1.2-CCR5+ de VIH-1JR_FL gpl20 biotinilado que se hizo complejo con CD4s. No se observó ningún enlace de gpl20 biotinilado en la ausencia de CD4s o CCR5, o cuando se utilizó VIH-1LAI gpl20 (Figura 3c) . Con la excepción de PA8, todos los mAbs invalidaron el enlace a gpl20/CD4s a L1.2-CCR5+ (Figura 3d) . La inhibición mediante PA8 saturado en ~40%, la cual concuerda con la información de la citometría de flujo (Tabla 1), dando a entender que este mAb sólo enlaza con un subgrupo de moléculas CCR5 en células L1.2-CCR5+. Los mAbs PA9, PA10, PAll y PA12 inhibieron el enlace con valores IC50 de 0.24, 0.13, 0.33, 0.24µg/ml respectivamente (Tabla 3). Sorprendentemente, los mAbs PA14 y 2D7 fueron los dos inhibidores menos eficientes del enlace gpl20/CD4s, con valores IC50 de 1.58 y 1.38µg/ml respectivamente (Tabla 3) . Por consiguiente, no hubo correlación entre la capacidad de un mAb para inhibir fusión y entrada de membrana transmitida por gpl20/CD4 /CCR5 y su capacidad para bloquear el enlace gpl20/CD4s al coreceptor . 6) inhibición sinergística de fusión VIH-1 mediante combinaciones de mAbs anti-CCR5 y otros inhibidores de entrada viral.

Los agentes específicos de co-receptor pueden actuar en etapas múltiples del proceso de entrada y exhibir efectos no aditivos cuando se utilizan en combinación. Desde una perspectiva clínica, es importante determinar las interacciones de los candidatos a medicamentos específicos de co-receptores con quimosinas endógenas, las cuales pueden producir algún nivel de protección contra la progresión de la enfermedad. Por consiguiente, los mAbs CCR5 fueron probados, en combinación unos con otros o con RANTES, o con CD4-IgG2, los cuales enlazan gpl20 de VIH-1 para inhibir la unión a células objetivo. Las curvas de respuesta de dosificación fueron obtenidas para agentes utilizados individualmente y en combinación en ensayos de fusión y entrada viral. La información fue analizada utilizando el principio de efecto medio (9) . Las concentraciones de agentes simples o sus mezclas requeridas para producir un efecto determinado, fueron comparadas cuantitativamente en un término conocido como el índice de Combinación (Cl) . Un valor Cl mayor a 1 indica antagonismo, Cl ~1 indica un efecto aditivo, y CK1 indica un efecto sinergístico, en donde la presencia de un agente incrementa el efecto de otro.

Las combinaciones de PA12 y 2D7 fueron sinergísticamente las más potentes, con valores Cl que fluctúan entre 0.02 y 0.29, dependiendo en la proporción de anticuerpos (Figura 4 y Tabla 2) . El grado de sinergia es conocido por variar con la estequiometría de los agentes . Los ensayos de entrada y fusión viral fueron consistentes generalmente en la identificación de combinaciones mAb que son altamente sinergísiticas , PA12 y 2D7; moderadamente sinergísticas, PA12 y PA14; aditivas, PAll y PA12; y débilmente antagonísticas , PA14 y 2D7. La falta de sinergia entre PA14 y 2D7 no es sorpresivo, dado que estos mAbs compiten en forma transversal para enlazar a células CCR5+ como se determinó mediante citometría de flujo (información no mostrada) . La observación de un efecto aditivo de PAll y PA12 puede ser un indicador de que estos mAbs enlazan a epítopes ligeramente diferentes en CCR5, mientras que comparten una dependencia del residuo Q4 en la Nt . También, se probó la capacidad de los mAbs PA12, PA14 y 2D7 para sinergizar con RANTES en el bloqueo de fusión de célula a célula. Las combinaciones de PA12 y RANTES exhibieron sinergia moderada (Tabla 2). PA14 y 2D7 no exhibieron sinergia con RANTES, lo cual es consistente con estos mAbs que son inhibidores de enlace y señalización de RANTES (Figura 2a, b) . Finalmente, probamos la sinergia entre los mAbs PA12, PA14, 2D7 y CD4-IgG2, los cuales interactúan con gpl20. Observamos sinergia moderada entre PA12 y CD4- IgG2 pero ninguna sinergia entre PA14 ó 2D7 y CD4-IgG2 (Tabla 2) . Argumento Experimental Seis mAbs de múrido anti-CCR5 IgGl fueron aislados y caracterizados. Mientras que PA8, PA9, PAll, PA12 y PA14 son distintas especies moleculares, PA9 y PA10 son imposibles de distinguir por medio del análisis y por lo tanto, son probablemente el mismo mAb. Todos los mAbs que fueron aislados reconocen el complejo que conforma a los epítopes, como es frecuentemente el caso con mAbs elevados contra proteínas de superficie celular nativa. El mapeo del epítope fue realizado para todos los mAbs utilizando un panel de mutantes de punto de alanina CCR5. Los residuos que afectaron de manera similar el enlace de todos los mAbs, fueron asumidos como la causa de las perturbaciones en la conformación del co-receptor y no como parte constitutiva de los epítopes mAb. Se ha mostrado que únicamente dos de dichos residuos, el Y10 y el Dll, afectan la entrada del VIH-1 (20, 52) . Los epítopes PA8 , PAll y PA12 están localizados exclusivamente en el campo Nt . En consistencia con este resultado, PA8 fue capaz de enlazar a un péptido Nt biotinilado, conteniendo los residuos del D2 al R31, en un ELISA (Información no mostrada) . Sin embargo, el PAll y PA12, cuyo enlace sólo dependió fuertemente de Q4, no enlazó al péptido Nt en la solución (información no mostrada) . Una posibilidad es que el péptido Nt no asume la conformación apropiada para ser reconocido por el PAll y el PA12, mientras que, el enlace del PA8 puede ser menos dependiente de la conformación. Alternativamente, el PAll y el PA12 podrían interactuar con residuos que no hemos mutado, o formar uniones débiles con aminoácidos localizados en otros campos de CCR5, o enlazar los átomos de la estructura del péptido cuya presentación puede ser inalterable por medio de mutagénesis. Los anticuerpos PA9, PA10 y PA14 reconocieron epítopes que incluían residuos tanto en el campo Nt como en el ECL2 de CCR5, mientras que el epítope 2D7 fue localizado exclusivamente en el ECL2. El epítope PA14 comprende tanto el D2 en el Nt como el R168 en el ECL2 indicando que estos dos residuos están próximos el uno al otro dentro del contexto de una huella mAb. Ellos, incluso pueden interactuar directamente con una de sus otras cargas opuestas . Los mAbs del PA8 al PA12 y el PA14 marcaron las células CCR5+ con diferentes intensidades y en una forma dependiente del tipo de la célula. Todos los mAbs excepto el PA8 , marcaron en >90% las células L1.2-CCR5+, el promedio más alto de intensidad fluorescente se observó con el PAll y el PA12. Sin embargo, el PA14 y el 2D7 marcaron el porcentaje más alto de PBMC y además produjeron el promedio más alto de intensidad fluorescente en estas células. Hill y Asociados (28) han caracterizado recientemente un panel de mAbs anti-CCR5 que marcan de manera similar a las células transfectadas, pero únicamente dos de las ocho marcaron la PBMC, y ninguna marcó a los monocitos primarios. Probablemente se tomó en cuenta una baja afinidad para CCR5 para la no reactividad de dos de los mAbs con las células primarias, aunque es poco probable que ésta sea la explicación de la falla de los otros cuatro para reaccionar. En nuestro panel de mAb, observamos el marcado más intenso de PBMC mediante los mAbs 2D7 y PA14 que tienen epítopes localizados completa o parcialmente en los primeros diez residuos de ECL2. Sin embargo Hill y Asociados reportaron, que los mAbs específicos para Nt y SLl marcan los PBMCs, mientras que los mAbs para SL2 y SL3 no marcan PBMC. De modo que, no se ha identificado como un patrón de reactividad consistente. Una explicación para el marcado específico para un tipo de célula mediante mAbs, sería que los PBMC activados (y monocitos) secretan los quimosina-CC que enlazan a la superficie de las células CCR5, ocultando algunos epítopes mAb. No obstante, uno esperaría que esto fuera especialmente verdadero para los PA14 y 2D7, los cuales son antagonistas de la movilización de calcio inducida por quimosina y compiten presumiblemente con las quimosinas-CC para enlazar al CCR5. Aún estos mAbs marcan las PBMC con mayor intensidad. Alternativamente, la exposición diferencial de los epítopes CCR5 puede reflejar la oligomerización del receptor específico de un tipo de célula, la asociación con otras moléculas de la superficie celular, o diferentes modificaciones post-translacionales tales como glicosilación. Hemos mostrado que las diferencias en los enlaces del mAb probablemente no reflejan las diferencias específicas de un tipo de célula en las interacciones de CD4/CCR5.

Los mAbs del PA8 al PA12 no inhibieron la movilización de calcio inducida por quimosina-CC en las células CCR5+ ni transmitieron la señalización a través de CCR5. Los mAbs 2D7 y PA14 fueron inhibidores de la movilización de calcio inducida por quimosina- CC, aunque el 2D7 fue casi un orden de magnitud más potente que el PA14. Esto puede ser debido a que el epítope PA14 traslapa menos con el campo de enlace de quimosina-CC en CCR5 que el epítope 2D7. También, todos los mAbs bloquearon la entrada del VIH-1 y la fusión de membrana transmitida por cubierta, pero la inhibición de la fusión de célula a célula requirió en algunos casos casi dos órdenes de magnitud mas de anticuerpos que la que se necesitó para bloquear la entrada viral. Presumiblemente, se establecen más interacciones gpl20/CD4/CCR5, así como interacciones entre las moléculas de la unión y actúan cooperativamente durante la fusión célula a célula, comparadas con la fusión virus a célula, haciéndolo más difícil de inhibir. Esto es observado comúnmente con anticuerpos para LFA-1 o para la glicoproteína de VIH-1 de cubierta (45, 51) . Los PA8 , PA9 y PA10 fueron incapaces de bloquear la fusión célula a célula en >15% y la entrada viral en >40%, incluso en las concentraciones más altas de anticuerpos. Sin embargo, se podría lograr >90% de inhibición de la fusión con PAll, PA12 y PA14 y >90% de inhibición de entrada podría lograrse con PA14. El más potente de los seis mAbs en bloquear la fusión y la entrada fue el PA14, el cual fue tan efectivo como el 2D7. Sorpresivamente, el PA14 y el 2D7 están entre los inhibidores menos potentes del enlace gpl20/SCD4 a células L1.2-CCR5+, mientras que, del PA9 al PA12 bloquearon con potencias similares, y el PA8 fue incapaz de bloquear en >40% del enlace gpl20/CD4s. Estas observaciones aumentaron las preguntas acerca de la naturaleza de las moléculas CCR5 presentadas en diferentes células y acerca de los mecanismos de inhibición de la fusión y la entrada viral. Puede ser que CCR5 en células L1.2, utilizadas en los ensayos de enlaces de mAb y gpl20, no sean de una conformación idéntica a la del CCR5 en PBMC, utilizados en los ensayos de enlace mAb, o los CCR5 en PMl y células U87MG utilizados en los ensayos de fusión y entrada. El bajo marcado de PBMC y la inhibición parcial de la fusión y entrada de algunos de nuestros mAbs indica que ellos son los únicos con la capacidad de enlazar al subgrupo de las moléculas CCR5 expresadas en los linfocitos. primarios, en las PMl y en las líneas celulares U87MG-CD4+CCR5+ . Aunque diferente a PA8 , todos los mAbs tienen la capacidad de marcar >90% de las células Ll.2-CCR5+ y bloquear completamente el enlace del complejo gpl20/CD4s a estas células. Por lo menos una diferencia entre las L1.2-CCR5+ y las otras células que hemos utilizado es la densidad de la proteína co-receptora en la superficie celular. Realmente, estimamos que las células L1.2-CCR5+ expresan de 10 a 100 pliegues más en el co-receptor de superficie celular que las células PMl y U87MG-CD4+CCR5+. Aunque, cuando las células HeLa son creadas para expresar en forma temporal tal coreceptor como la línea celular Ll.2-CCR5+, todavía no se tiene la capacidad de detectar el enlace gpl20/CD4s a éstas (información no mostrada) . La sobreexpresión de las CCR5 sobre las L1.2, junto con otros factores específicos de la célula, podrían favorecer la conformación del co-receptor que expone de manera prominente el Nt, haciéndolo más accesible tanto a los mAb como al gpl20. Dicha conformación podría ser inducida por la oligomerización del receptor, mediante asociaciones disminuidas o alteradas con las proteínas de la superficie celular o mediante de interacciones del receptor con las proteínas G (25, 62) . ¿Las conformaciones múltiples de CCR5 co-existen en la superficie celular y, se permiten todas para entrada viral?. Los patrones de la reactividad mAb sugerirían que, ya que la entrada y fusión VIH-1 pueden ocurrir, si bien en niveles reducidos, en presencia de concentraciones mAbs que saturan los epítopes requeridos para el enlace de los gpl20 a las células L1.2-CCR5+. Estamos a favor de la hipótesis de que las moléculas del co-receptor presentes en las células L1.2-CCR5+ poseen una conformación competente para la entrada del VIH-1 mientras que las moléculas CCR5 en las PBMC, las PMl y las CCR5+ U87MG existen en estados múltiples, de entrada competente que despliegan diferentes reactividades mAb. Mientras que, el PA14 y el 2D7 pueden reconocer todas las conformaciones, otros mAbs no pueden hacerlo. Por qué las células L1.2 que son propicias para una conformación particular de una fusión competente, permanecen para ser determinadas . Recientemente se ha demostrado que el campo del enlace gpl20 descansa en los primeros veinte residuos del campo Nt CCR5. Los mAbs para el campo de enlace gpl20 en CCR5 bloquean potentemente esta interacción, pero no son ni con mucho, tan eficientes en la inhibición de la fusión y entrada del VIH-1 en células objetivo como los PA14 y los 2D7, cuyos epítopes descansan fuera de esta región. Los PA14 reconocen la punta del Nt y los residuos en ECL2, mientras que el epítope 2D7 está localizado exclusivamente en ECL2. El mecanismo de acción de estos mAbs, únicamente puede ser especulado.

Puede ser que sus enlaces a los primeros pocos residuos y ECL2 induce a cambios de conformación en el co-receptor que evita la membrana fusión. Alternativamente, la obstrucción de los epítopes ECL2 podría dificultar la oligomerización del co-receptor y la formación de un complejo proteínico de una fusión competente. Aún otra posibilidad es que los residuos en ECL2 que se orientan al interior del poro de fusión y enlace de los mAbs impiden que gp41 se inserte en el péptido de fusión dentro de la membrana del plasma. En contraste, los mAbs PA8 a PA12 probablemente inhiben la fusión y entrada únicamente por competencia directa para el enlace con los complejos gpl20/CD4. No sabemos si los parámetros diferentes a los de la exposición y afinidad del epítope para CCR5 determinan la eficacia de la inhibición de la entrada viral mediante estos mAbs. No está claro por qué la inhibición de los pasos subsecuentes a la interacción de gpl20/co-receptor sería más eficiente que el bloqueo directo de dicha interacción. Una manera de explicar esto sería asumir que la tasa de porcentaje del enlace gpl20 a CCR5 es mucho más baja que rango de enlace de mAbs a CCR5. De este modo, cada vez que un mAb se separa así mismo de una molécula co-receptora, una molécula gpl20 asociada por virion, la reemplaza de una manera quasi- irreversible ya que esta interacción conduce a la fusión de la membrana. La sinergia entre las combinaciones de los mAbs anti-CCR5 es probablemente un resultado de sus interacciones con distintos epítopes que están involucrados en los pasos consecutivos interdependientes de la entrada del VIH-1. El grado de sinergia observada entre el PA12 y el 2D7 (CK0.1 bajo muchas circunstancias) es extraordinaria ya que los valores Cl <0.2 son raramente observados para combinaciones de los anticuerpos del anti-VIH-1 (33, 35, 61), inhibidores de transcriptasa inversa (29) o inhibidores de proteasa (44) . Debido a su potencia, la combinación del PA12:2D7 fue examinada en múltiples formatos de ensayo y proporciones de concentración, para los cuales fueron observados niveles consistentemente altos de sinergia. Sinergia moderada fue observada para el PA12 combinado con el PA14. También observamos sinergia moderada entre el PA12 y el CD4-IgG2. El complejo CD4/gpl20 es metaestable y si este es incapaz de interactuar con un co-receptor, se descompone en un estado no fusogénico (45 a 48) . Ya que el PA12 bloquea directamente el sitio de enlace gpl20 en CCR5, su presencia puede cambiar el equilibrio hacia la inactivación del complejo gpl20/CD4. Esto explicaría el por qué observamos sinergia entre el CD4-IgG2 y el mAb PA12 con respecto a la inhibición de fusión y entrada. La falta de sinergia entre el mAb PA14 y el CD4-IgG2 sugiere que ellos actúan en dos pasos no consecutivos e independientes de la entrada viral. Una combinación de estudios posteriores será requerida para determinar los mecanismos precisos de sinergia de los diferentes compuestos con respecto a la inhibición de la fusión y entrada viral. Los resultados anteriores son consistentes con un modelo en el que la entrada del VIH-1 ocurre en tres pasos distintos involucrando el enlace del receptor, el enlace del co-receptor y fusión de membrana transmitida por el co-receptor. Los eventos de enlace y fusión del co-receptor separados se sugieren por la falta de correlación entre las capacidades de los anticuerpos monoclonales para bloquear el enlace gpl20 y la entrada/fusión del VIH-1. La cronología de los eventos durante la fusión es sugerida posteriormente por los patrones de las sinergias observadas. Agentes tales como el PA12, que inhibe potencialmente el paso medio del proceso, denominado enlace gpl20, actúa sinergísticamente con los inhibidores de los pasos previos y subsecuentes .

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Claims (1)

1. NOVEDAD DE LA INVENCIÓN Habiendo descrito la presente invención se considera como novedad y por lo tanto, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes: REIVINDICACIONES 1. Una composición para inhibir la infección de VIH-1, que comprende por lo menos dos compuestos en cantidades sinergísticamente efectivas para inhibir la infección VIH-1, en donde por lo menos uno de los compuestos evita la interacción productiva entre VIH-1 y es co-receptor de fusión VIH-1. 2. Una composición la cual inhibe la fusión de VIH- 1 o de una glicoproteína+ de VIH-1 en una cubierta de célula a una célula objetivo, en donde la composición comprende por lo menos dos compuestos en cantidades sinergísticamente efectivas para inhibir la fusión de VIH-1 o de una glicoproteína+ de VIH-1 en una cubierta de célula a una célula objetivo, en donde por lo menos uno de los compuestos evita la interacción productiva entre VIH-1 o y un co-receptor de fusión VIH-1. composición de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, en donde el coreceptor es un receptor de quimosina. composición de conformidad con la reivindicación 3, en donde el receptor de quimosina es CCR5 o CXCR4. composición de conformidad con la reivindicación 1 ó 2, en donde por lo menos uno de los compuestos es un anticuerpo. composición de conformidad con la reivindicación 5, en donde el anticuerpo es un anticuerpo monoclonal . composición de conformidad con la reivindicación 5, en donde el anticuerpo es un anticuerpo de receptor anti-quimosina . composición de conformidad con la reivindicación 7, en donde el anticuerpo es un anticuerpo anti-CCR5. composición de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, en donde dos o más compuestos son anticuerpos. composición de conformidad con la reivindicación 8, en donde el anticuerpo es PA8, PA9, PA10, PAll, PA12, PA14, 2D7 o una combinación de los mismos. composición de conformidad con la reivindicación 10, en donde los anticuerpos están en una proporción adecuada. composición de conformidad con la reivindicación 11, en donde la proporción fluctúa desde 1:1 hasta 50:1. composición de conformidad con la reivindicación 9, en donde el anticuerpo es PA8, PA9, PA10, PAll, PA12, PA14, 2D7 o una combinación de los mismos. composición de conformidad con la reivindicación 13, en donde los anticuerpos están en una proporción adecuada. composición de conformidad con la reivindicación 14, en donde la proporción fluctúa desde 1:1 hasta 50:1. composición de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, en donde por lo menos un compuesto es una quimosina o un derivado de quimosina. composición de conformidad con la reivindicación 16, en donde la quimosina es RANTES, MlP-la, MlP-lß, SDF-1 o una combinación de los mismos. 18. La composición de conformidad con la reivindicación 16, en donde el derivado de quimosina es Met-RANTES, AOP-RANTES o RANTES 9-68 o una combinación de los 5 mismos . 19. La composición de conformidad con la reivindicación 16, en donde los compuestos están en una proporción adecuada. 20. La composición de conformidad con la 10 reivindicación 5, en donde por lo menos un compuesto es una quimosina o derivado de quimosina . 21. La composición de conformidad con la reivindicación 20, en donde la quimosina es 15 RANTES, MlP-la, MlP-lß, SDF-1 o una combinación de los mismos. 22. La composición de conformidad con la reivindicación 20, en donde el derivado de quimosina es Met-RANTES, AOP-RANTES o 20 RANTES 9-68 o una combinación de los mismos . 23. La composición de conformidad con la reivindicación 20, en donde los compuestos están en una proporción adecuada. 24. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, en donde por lo menos uno de los compuestos es una molécula sin peptidilo. 25. La composición de conformidad con la reivindicación 24, en donde la molécula sin peptidilo es el biciclam AMD3100. 26. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, en donde por lo menos uno de los compuestos inhiben la unión de VIH-1 a una célula objetivo. 27. La composición de conformidad con la reivindicación 26, en donde por lo menos uno de los compuestos enlaza CD4. 28. La composición de conformidad con la reivindicación 27, en donde por lo menos uno de los compuestos es una glicoproteína de VIH-1 de cubierta. 29. La composición de conformidad con la reivindicación 27, en donde por lo menos uno de los compuestos es un anticuerpo anti-CD4. 30. La composición de conformidad con la reivindicación 26, en donde por lo menos uno de los compuestos enlaza a la glicoproteína de VIH-1 de cubierta. 31. La composición de conformidad con la reivindicación 26, en donde por lo menos uno de los compuestos es una proteína basada en CD4. 32. La composición de conformidad con la reivindicación 31, en donde por lo menos uno de los compuestos es CD4-IgG2. 33. La composición de conformidad con la reivindicación 26, en donde por lo menos uno de los compuestos es un anticuerpo para una glicoproteína de VIH-1 de cubierta. 34. La composición de conformidad con la reivindicación 26, en donde los compuestos están en una proporción adecuada. 35. La composición de conformidad con la reivindicación 34, en donde la proporción fluctúa desde 1:1 hasta 10:1. 36. La composición de conformidad con la reivindicación 5, en donde por lo menos uno de los compuestos inhibe la unión de VIH-1 a una célula objetivo. 37. La composición de conformidad con la reivindicación 36, en donde por lo menos uno de los compuestos enlaza CD4. 38. La composición de conformidad con la reivindicación 37, en donde por lo menos uno de los compuestos es una gl'icoproteína de VIH-1 de cubierta. 39. La composición de conformidad con la reivindicación 37, en donde por lo menos uno de los compuestos es un anticuerpo anti-CD4. 40. La composición de conformidad con la reivindicación 36, en donde por lo menos uno de los compuestos enlaza a la glicoproteína de VIH-1 de cubierta. 41. La composición de conformidad con la reivindicación 36, en donde por lo menos uno de los compuestos es una proteína con base en CD4. 42. La composición de conformidad con la reivindicación 41, en donde por lo menos uno de los compuestos es CD4-IgG2. 43. La composición de conformidad con la reivindicación 36, en donde por lo menos uno de los compuestos es un anticuerpo para una glicoproteína de VIH-1 de cubierta. 44. La composición de conformidad con la reivindicación 36, en donde los compuestos están en proporciones adecuadas . 45. La composición de conformidad con la reivindicación 44, en donde la proporción fluctúa desde 1:1 hasta 10:1. 46. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, en donde por lo menos uno de los compuestos comprende un polipéptido el cual enlaza a un epítope CCR5. 47. La composición de conformidad con la reivindicación 46, en donde el epítope está localizado en la terminal-N. 48. La composición de conformidad con la reivindicación 46, en donde el compuesto es un polipéptido 49. La composición de conformidad con la reivindicación 47, en donde el epítope comprende N13 y Y15 en la terminal-N. 50. La composición de conformidad con la reivindicación 46, en donde el epítope incluye residuos en la terminal-N y en el segundo espiral extracelular. 51. La composición de conformidad con la reivindicación 50, en donde el epítope comprende D2, Y3, Q4 , S7, P8 y N13 en la terminal-N, y Y176 y T177 en el segundo espiral extracelular. 52. La composición de conformidad con la reivindicación 50, en donde el epítope comprende D2 , Y3, Q4, P8 y N13 en la terminal-N, y Y176 y T177 en el segundo espiral extracelular. 53. La composición de conformidad con la reivindicación 47, en donde el epítope comprende Q4 en la terminal-N. 54. La composición de conformidad con la reivindicación 50, en donde el epítope comprende D2 en la terminal-N y R168 y Y176 en el segundo espiral extracelular. 55. La composición de conformidad con la reivindicación 46, en donde el epítope está localizado en el segundo espiral extracelular . 56. La composición de conformidad con la reivindicación 55, en donde el epítope comprende Q170 y K171 en el segundo espiral extracelular. 57. La composición de conformidad con la reivindicación 55, en donde el epítope comprende Q170 y E172 en el segundo espiral extracelular . 58. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, en donde por lo menos uno de los compuestos comprende una cadena ligera de un anticuerpo. 59. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, en donde por lo menos uno de los compuestos comprende una cadena pesada de un anticuerpo. 60. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, en donde por lo menos uno de los compuestos comprende la porción Fab de un anticuerpo. 61. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, en donde al menos uno de los compuestos comprende el campo variable de un anticuerpo. 62. La composición de conformidad con las reivindicaciones 1 ó 2, en donde por lo menos uno de los compuestos comprende una o más porciones de CDR de un anticuerpo. método para tratar a un sujeto que padece de VIH-1 en donde el método comprende la administración al sujeto de una dosis efectiva de las composiciones de la reivindicación 1 ó 2. método para evitar que un sujeto contraiga VIH-1 en donde el método comprende la administración al sujeto de una dosis efectiva de las composiciones de las reivindicaciones 1 ó 2. anticuerpo monoclonal anti-CCR5 seleccionado del grupo que consiste de PA8 (No. de Acceso ATCC. HB-12605), PA9 (No. de Acceso ATCC. HB-12606), PA10 (No. de Acceso ATCC HB-12607), PAll (No. de Acceso ATCC. HB-12608), PA12 (No. de Acceso ATCC HB-12609), y PA14 (No. de Acceso ATCC HB-12610) . a forma humanizada del anticuerpo de conformidad con la reivindicación 65. anticuerpo de conformidad con la reivindicación 66, en donde algunos, la mayoría o todos los aminoácidos exteriores de las regiones CDR, han sido reemplazados con aminoácidos de moléculas de inmunoglobulina humana, aunque algunos, la mayoría o todos los aminoácidos dentro de una o más regiones CDR no fueron modificados . 68. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena ligera del anticuerpo monoclonal de conformidad con las reivindicaciones 65, 66 ó 67. 69. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 68, en donde la molécula de ácido nucleico es una molécula de ARN, una molécula de ADN o una molécula cADN. 70. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica la cadena pesada del anticuerpo monoclonal de conformidad con las reivindicaciones 65, 66, ó 67. 71. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 70, en donde la molécula de ácido nucleico es una molécula ARN, una molécula ADN o una molécula cADN . 72. Una o más moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican la porción Fab del anticuerpo monoclonal de conformidad con las reivindicaciones 65, 66 ó 67. 73. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 72, en donde la molécula de ácido nucleico es una molécula de ARN, una molécula de ADN o una molécula cADN. 74. Una molécula de ácido nucleico aislada que codifica una o más regiones CDR del anticuerpo monoclonal de conformidad con las reivindicaciones 65, 66 ó 67. 75. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 74, en donde la molécula de ácido nucleico es una molécula ARN, una molécula ADN o una molécula cADN . 76. Una o más moléculas de ácido nucleico aisladas que codifican el campo variable de un anticuerpo monoclonal de conformidad con las reivindicaciones 65, 66 ó 67. 77. La molécula de ácido nucleico de conformidad con la reivindicación 76, en donde las moléculas de ácido nucleico son una molécula de ARN, molécula de ADN o molécula de cADN. RESUMEN La presente invención proporciona una composición para inhibir la infección de VIH-1 que comprende por lo menos dos compuestos en cantidades sinergísticamente efectivas para inhibir la infección de VIH-1, en donde por lo menos uno de los compuestos evita la interacción productiva entre VIH-1 y un coreceptor de fusión VIH-1. La presente invención también proporciona una composición la cual inhibe la fusión de VIH-1 o de una glicoproteína+ de VIH-1 en una cubierta de célula a una célula objetivo, comprendiendo por lo menos dos compuestos en cantidades sinergísticamente efectivas para inhibir la fusión de VIH-1 o de una glicoproteína+ de VIH-1 en una cubierta de célula a una célula objetivo, en donde por lo menos uno de los compuestos evita la interacción productiva entre VIH-1 y un co-receptor de fusión VIH-1. La presente invención también proporciona un método para tratar a un sujeto que padece de VIH-1, en donde el método comprende la administración al sujeto de una dosis efectiva de dichas composiciones. La presente invención también proporciona un método para prevenir que un sujeto contraiga VIH-1, en donde el método comprende ' la administración al sujeto de una dosis efectiva de dichas composiciones. La presente invención también proporciona un anticuerpo monoclonal anti-CCR5 seleccionado del grupo que consiste de PA8 , PA9, PAlO, PAll, PA12 y PA14.