BRPI0717512A2 - Anticorpos contra ccr5 e usos dos mesmos - Google Patents

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para "ANTICOR- POS CONTRA CCR5 E USOS DOS MESMOS".

A presente invenção refere-se aos anticorpos contra CCR5, mé- todos para sua produção, composições farmacêuticas contendo os ditos an- ticorpos e usos dos mesmos.

Há alguns anos atrás, surgiu um entendimento crescente dos mecanismos específicos de que se utiliza o HIV-1 para entrar nas células- alvo. Isso facilitou os esforços no desenvolvimento de fármacos que se des- tinam às etapas separadas neste processo. O primeiro fármaco que alveja a 10 entrada foi recentemente aprovado para uso clínico (enfuvirtide, T20; Lazza- rin, A., e outros, N. Engl. J. Med. 348 (2003) 2186-2195). Enfuvirtide é um fármaco de peptídeo que bloqueia a fusão em um estágio subsequente à ligação do receptor de quimiocina.

A infecção por HIV-1 é iniciada por interações entre a glicoprote- ína do envoltório virótico (Env) e um complexo de receptor celular compre- endido de CD4 mais um receptor de quimiocina (Pierson, T.C. e Doms, R. W., Immuno. Lett. 85 (2003) 113-118; Kilby, J.M. e Eron, JJ., N. Engl. J. Med. 348 (2003) 2228-2238). Env possui duas subunidades: a glicoproteína de superfície gp 120 que interage com o receptor CD4 celular e que se as- socia não-covalentemente à subunidade gp 41 da transmembrana do vírus. Gp 41 ancora gp 120 à membrana virótica e é também responsável pela fu- são. A ligação da gp 120 ao CD4 nas células desencadeia uma alteração conformacional que expõe ou cria um sítio de ligação que permite que a gp 120 interaja com um receptor de quimiocina da superfície celular, o "corre- ceptor". Os receptores de quimiocina são sete receptores acoplados à prote- ína g da transmembrana (7 TM GPCRs) que normalmente transmitem sinais em resposta às quimiocinas, pequenas citocinas com funções quimiotáticas, inflamatórias e outras.

Uma grande proporção de fármacos de uso clínico se dirige a outras 7 TM GPRs e assim o alvejamento dessas moléculas para bloquear a entrada do vírus em uma extensão do tipo de maior sucesso de programas de desenvolvimento de fármaco do passado. Os isolados de HIV-1 requerem CD4 e um correceptor para entrar e infectar as células. O receptor da quimi- ocina CC humana, CCR5, é um correceptor para cepas de macrófago- trópico (R5) e desempenha um papel importante na transmissão sexual do HIV-1 (Berger, E.A., AIDS 11 (Suppl. A) (1997) 3-16; Bieniasz, P.D. and Cul- 5 len, B. R., Frontiers in Bioscience 3 (1998) d44-d58; Littman, D.R., Cell 93 (1998)677-680).

O CCR5 humano (também denominado como "CCR5") é em- pregado pela maioria dos isolados primários de HIV-1 e é importante para o estabelecimento e manutenção da infecção. Além disso, a função de CCR5 10 é dispensável para saúde humana. Um alelo de CCR5 mutante, "CCR5 Δ 32", codifica uma proteína não funcional, truncada (Samson, M., e outros, Nature 382 (1996) 722-725; Dean, M., e outros, Science 273 (1996) 1856- 1862). Indivíduos homozigotos para a mutação não possuem expressão de CCR5 e são fortemente protegidos da infecção por HIV-1. Eles não demons- 15 tram não conseqüência de fenótipo e são altamente resistentes à infecção por HIV trópico M, considerando-se que os indivíduos heterozigotos apre- sentam progressão retardada da doença (Schwarz, Μ. K. e Wells, T.N., Nat. Rev. Drug Discov. 1 (2002) 347-358). A falta de CCR5 não aparenta conse- qüências adversas, provavelmente porque CCR5 faz parte de uma rede de 20 quimiocina altamente redundante como receptor para as α quimiocinas MIP- 1α, ΜΙΡ-1β e RANTES, que compartilham muitas funções de sobreposição e a maior parte das mesmas possuem receptores alternativos (Rossi, D. e Zlotnik, A., Annu. Rev. Immunol. 18 (2000) 217-242). A identificação de C- CR5 como um correceptor de HIV-1 teve como base a capacidade de seus 25 ligantes, MIP-1a, ΜΙΡ-1β e RANTES de bloquear a infecção por R5, porém os não-isolados R5X4 ou X4 (Cocchi, F., e outros, Science 270 (1995) 1811- 1815).

CCR5 é também um receptor de quimiocinas "em grupo" que são produzidas primariamente durante as respostas inflamatórias e contro- Iam o recrutamento dos neutrófilos, macrófagos e subconjuntos de células T (células T auxiliares, Th1 e Th2). As respostas de Th1 são tipicamente aque- las envolvendo imunidade mediada por célula eficaz contra vírus e tumores, por exemplo, considerando-se que se acredita que as respostas de Th2 es- tejam envolvidas em alergias. Portanto, os inibidores desses receptores de quimiocina podem ser úteis como imunomoduladores. Para respostas de Th1, as respostas superativas são amortecidas, por exemplo, na autoimuni- 5 dade incluindo artrite reumatóide ou para respostas de Th2, ataques de as- ma ou respostas alérgicas incluindo dermatite atópica são diminuídos (vide, por exemplo, Schols1 D., Curr. Top. Med. Chem. 4 (2004) 883-893; Mueller, A. e Strange, P.G., Int. J. Biochem. Cell Biol. 36 (2004) 35-38; Kazmierski, W.M., e outros, Curr. Drug Targets Infect. Disord. 2 (2002) 265-278; Lehner, 10 T., Trends Immunol. 23 (2002) 347-351).

Anticorpos contra CCR5 são, por exemplo, PRO 140 (Olson, W.C., e outros, J. Virol. 73 (1999) 4145-4155) e 2D7 (Samson, M., e outros, J. Biol. Chem. 272 (1997) 24934-24941). Anticorpos adicionais são mencio- nados na WO 2006/103100, US 2004/0043033, US 6.610.834, US 15 2003/0228306, US 2003/0195348, US 2003/0166870, US 2003/0166024, US 2003/0165988, US 2003/0152913, US 2003/0100058, US 2003/0099645, US 2003/0049251, US 2003/0044411, US 2003/0003440, US 6.528.625, US 2002/0147147, US 2002/0146415, US 2002/0106374, US 2002/0061834, US 2002/0048786, US 2001/0000241, EP 1 322 332, EP 1 263 791, EP 1 207 20 202, EP 1 161 456, EP 1 144 006, WO 2003/072766, WO 2003/066830, WO 2003/033666, WO 2002/083172, WO 02/22077, WO 01/58916, WO 01/58915, WO 01/43779, WO 01/42308.

O objetivo da invenção é prover novos anticorpos contra CCR5 que são usados primariamente como um agente terapêutico para AIDS.

Sumário da Invenção

A invenção compreende um anticorpo que se liga ao CCR5, ca- racterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada compreen- de uma seqüência de aminoácido de fórmula:

GIn-VaI-GIn-Leu-XOI-X02-Ser-Gly-Pro-Gly-Leu-Val-X03-Pro- Ser-Gln-Ser-Leu-Ser-Ile-Thr-Cys-Thr-Val-Ser-Gly-Phe-Pro-Leu-Gly-Ala-Phe- Gly-Val-His-Trp-Val-Arg-Gln-Ser-Pro-Gly-Lys-Gly-X04-Glu-Trp-Leu-Gly-Val- lle-Trp-Lys-Gly-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Asn-Ala-Ala-Phe-X05-Ser-Arg-Leu-Arg- Ile-Thr-Lys-Asp-Asn-Ser-Lys-Ser-Gln-Val-Phe-Phe-Arg-Met-Asn-Ser-Leu- Gln-Thr-Asp-Asp-Thr-Ala-X06-Tyr-Tyr-Cys-Ala-Lys-Val-Asn-Leu-Ala-Asp- Ala-Met-Asp-Tyr-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-X07-Val-X08-Val-Ser-Ser, em que:

X01 é Lys ou Gln1

X02 é Gln ou Glu,

X03 é Arg ou Lys,

X04 é Leu ou Pro,

X05 é Met ou Lys1 X06 é He ou Thr1

X07 é Ser ou Thr1 X08 é He ou Thr (SEQ ID N0:1).

Preferivelmente o anticorpo é caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia leve do dito anticorpo, compreende uma seqüên- cia de aminoácido de fórmula:

Asp-Ile-Gln-Met-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ser-Leu-Ser-Ala-Ser-Val- Gly-Glu-Thr-Val- Thr-Ile-Thr-Cys-Arg-Ala-Ser-Gly-Asn-XIO-His-GIy-Tyr-Leu- Ala-T rp-XII-Gln-Gln-Lys-X12-Gly-Lys-X13-Pro-X14-Leu-Leu-XI5-T yr-Asn-Thr- 20 Lys-Thr-Leu-Ala-Glu-Gly-Val-Pro-Ser-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly-Thr- X16-Phe-X17-X18-X19-lle-X20-Ser-X21 -Gln-Pro-Glu-Asp-Phe-X22-X23-Tyr- Tyr-Cys-Gln-His-His-Tyr-Asp-Leu-Pro-Arg-Thr-Phe-Gly-Gly-Gly-Thr-Ls-X24- Glu-lle-Lys,

em que:

X10 é Ile ou Ala,

X11 é Phe ou Tyr,

X12 é Gln ou Pro,

X13 is Serou Ala,

X14 é Gln ou Lys,

X15 é Val ou lie,

X16 é Gln ou Asp,

X17 é Ser ou Thr, Χ18 é Leu ou Ala,

X19 é Lys ou Thr,

X20 é Asn ou Ser,

X21 é Leu ou Ala,

X22 é Gly ou Ala,

X23 é Asn ou Thr,

X24 é Leu ou Val (SEQ ID NO: 2).

Preferivelmente o anticorpo é caracterizado por ser do isotipo lgG4 humano ou do isotipo IgGI humano, dito isotipo IgGI sendo opcional- mente modificado na região de articulação na posição 216-240 do aminoáci- do entre Ch1 e Ch2 e/ou na segunda região de interdomínio, na posição 327- 331 do aminoácido entre Ch2 e CH3.

Uma modalidade preferida da invenção é uma composição far- macêutica compreendendo um anticorpo de acordo com a invenção.

Uma modalidade preferida da invenção é o uso de um anticorpo de acordo com a invenção para a fabricação de uma composição farmacêu- tica.

Uma modalidade preferida da invenção é um método para a fa- bricação de uma composição farmacêutica compreendendo um anticorpo de acordo com a invenção.

Uma modalidade preferida da invenção é um ácido nucleico co- dificando um polipeptídeo capaz de se reunir com um segundo polipeptídeo, pelo que o dito segundo polipeptídeo compreende um polipeptídeo selecio- 25 nado do grupo de polipeptídeos das SEQ ID NO: 2, 5 e considerando-se que o dito polipeptídeo compreende uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 1, 6, 7 ou 8.

Uma modalidade preferida da invenção é um método para o tra- tamento de um paciente que sofre de uma doença imunosupressora, carac- terizada pela administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamen- te eficaz de um anticorpo de acordo com a invenção.

O anticorpo de acordo com a invenção é preferivelmente carac- terizado pelo fato de que o dito anticorpo se liga ao CCR5 e compreende um domínio de cadeia pesada ou leve variável selecionado do grupo de domí- nios variáveis compreendendo domínios variáveis de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 6, 7, 8, domínios variáveis de cadeia leve das SEQ ID NO: 9, 5 10 ou um fragmento de ligação de CCR5 do mesmo.

O anticorpo de acordo com a invenção é preferivelmente carac- terizado por conter como domínio variável de cadeia pesada, um domínio variável de cadeia pesada selecionado do grupo de domínios variáveis de cadeia pesada da SEQ ID NO: 6, 7 ou 8, ou um fragmento de ligação de 10 CCR5 do mesmo e por conter como domínio variável de cadeia leve um do- mínio variável de cadeia leve selecionado do grupo de domínios variáveis de cadeia leve da SEQ ID NO: 9 ou 10, ou um fragmento de ligação de CCR5 do mesmo, onde os ditos domínios variáveis de cadeia pesada e leve são selecionados independentemente.

O anticorpo de acordo com a invenção é preferivelmente carac-

terizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada compreende uma seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo nas se- qüências de aminoácido de domínio variável de cadeia pesada das SEQ ID NOs: 6, 7, 8, para sermos mais precisos o anticorpo compreende uma se- 20 quência de aminoácido selecionada dos domínios variáveis de cadeia pesa- da da SEQ ID NO: 6, 7 ou 8, ou um fragmento de ligação de CCR5 do mes- mo.

O anticorpo de acordo com a invenção é preferivelmente carac- terizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia leve compreende uma 25 seqüência de aminoácido selecionada do grupo consistindo nas seqüências de aminoácido do domínio variável de cadeia leve das SEQ ID NOs: 9, 10, para sermos mais precisos, o anticorpo compreende uma seqüência de ami- noácido selecionada dos domínios variáveis de cadeia leve da SEQ ID NO: 9 ou 10, ou um fragmento de ligação de CCR5 do mesmo.

O anticorpo de acordo com a invenção é preferivelmente carac-

terizado pelo fato de que as regiões constantes (cadeias leves ou pesadas) são de origem humana. Tais regiões constantes (cadeias) são bem- conhecidas no estado da técnica e são descritas, por exemplo, por Kabat (vide, por exemplo, Johnson, G. e Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218). Por exemplo, uma região constante de cadeia pesada humana útil compreende uma seqüência de aminoácido independentemente selecionada 5 do grupo consistindo nas SEQ ID NOs: 3, 4. Por exemplo, uma região cons- tante de cadeia leve humana útil compreende uma seqüência de aminoácido de uma região constante de cadeia leve capa da SEQ ID NO: 5. É adicio- nalmente preferido que o anticorpo seja originário de camundongo e com- preenda um quadro de seqüência variável de anticorpo de um anticorpo de 10 camundongo de acordo com Kabat (vide, por exemplo, Johnson, G. e Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218).

Os anticorpos inibem uma ou mais funções do CCR5 humano, tais como, Iigante unindo ao CCR5, atividade de sinalização (por exemplo, ativação de uma proteína G de mamífero, indução de um aumento rápido e 15 transitório na concentração de Ca2+ livre citossólico e/ou estímulo de uma resposta celular (por exemplo, estimulação da quimiotaxia, exocitose ou libe- ração de mediador inflamatório por leucócitos, ativação da integrina)). Os anticorpos inibem a ligação de RANTES, MIP-1 alfa, MIP-1 beta, e/ou HIV ao CCR5 humano e inibem funções mediadas por CCR5 humano, tais como, 20 tráfego de leucócito, entrada de HIV na célula, ativação da célula T, libera- ção do mediador inflamatório e/ou desgranulação de leucócito.

O anticorpo de acordo com a invenção se liga especificamente ao CCR5 humano e inibe a fusão de HIV com uma célula-alvo em um ensaio compreendendo contato das ditas células-alvo com o anticorpo, na presença 25 do vírus com uma concentração de anticorpos eficaz para inibir fusão da membrana entre o vírus e a dita célula com um valor de IC50 de 4,0 pg/mL ou menor.

O anticorpo de acordo com a invenção se liga especificamente ao CCR5 e inibe a fusão da membrana entre uma primeira célula coexpres- sando CCR5 e polipeptídeos CD4 e uma segunda célula expressando uma proteína ENV do HIV com um valor de IC50 de 1,5 Mg/mL ou menor, preferi- velmente 0,3 Mg/mL ou menor. O anticorpo de acordo com a invenção se liga especificamente ao CCR5 e inibe a estimulação de uma resposta celular em uma célula-alvo, preferivelmente inibe a migração, em um ensaio compreendendo contato da dita célula-alvo com o anticorpo na presença de RANTES, MIP-1 alfa, e/ou 5 MIP-1 beta com um valor de IC50 de 1,5 Mg/mL ou menor.

Um anticorpo de acordo com a invenção preferivelmente não i- nibe a ligação da quimiocina em um ensaio de ligação ao CCR1, CCR2, CCR3, CCR4, CCR6 e CXCR4 em uma concentração de anticorpos de até 100 Mg/mL.

Um anticorpo de acordo com a invenção preferivelmente não es-

timula o aumento intracelular de Ca2+, detectado nas células CHO expres- sando CCR5 e Galfa 16 em uma concentração de anticorpos de até 50 Mg/mL.

O anticorpo de acordo com a invenção é preferivelmente do iso- tipo IgGI, lgG2, lgG3, ou lgG4 humano, pelo que IgGI ou lgG4 são os pre- feridos.

O anticorpo de acordo com a invenção é preferivelmente do iso- tipo lgG4. O anticorpo de acordo com a invenção é preferivelmente do isoti- po IgGI. O anticorpo de acordo com a invenção é preferivelmente do isotipo 20 lgG4 com mutação S228P. O anticorpo de acordo com a invenção, isto é, a região constante de cadeia pesada e leve, é do isotipo IgGI ou lgG4 modifi- cado na região de articulação por volta da posição 216-240 do aminoácido, preferivelmente por volta da posição 220-240 do aminoácido entre Ch 1 e Ch2 (Angal, S., e outros, Mol. Immunol. 30 (1993) 105-108), e/ou na segun- 25 da região de interdomínio por volta da posição 327-331 do aminoácido entre Ch2 e Ch3 (numeração de acordo com Kabat, vide, por exemplo, Johnson, G. e Wu, T.T., Nucleic Acids Res. 28 (2000) 214-218). Tais modificações reduzem ou evitam a função efetora (ADCC e/ou CDC). A comutação da classe de IgG pode ser realizada por troca da região constante de cadeia 30 pesada e domínio constante de cadeia leve do anticorpo por aqueles de um anticorpo da classe desejada, tal como, mutantes de IgGI ou lgG4. Tais mé- todos são bem-conhecidos no estado da técnica. O anticorpo de acordo com a invenção é preferivelmente carac- terizado por ser da subclasse IgGI humana, contendo pelo menos uma mu- tação em L234 (leucina na posição 234 do aminoácido), L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331, e/ou P329 (numeração de acordo com o índice 5 EU). Preferivelmente o anticorpo é do isotipo IgGI humano compreendendo mutações L234A (alanina ao invés de leucina na posição 234 do aminoáci- do) e L235A. O anticorpo de acordo com a invenção é preferivelmente carac- terizado por ser do isotipo lgG4 humano contendo uma mutação na posição S228.

A invenção se refere, portanto, em um aspecto, aos anticorpos,

caracterizada pelo fato de que o ditos anticorpos que se ligam ao CCR5, contêm uma parte Fc de origem humana e não se ligam ao fator de comple- mento humano C1q e/ou fator de complemento ativo C3. Preferivelmente os anticorpos mostram uma ligação reduzida ou não se ligam ao receptor Fcy humano.

A invenção compreende, adicionalmente, uma molécula de áci- do nucleico codificando uma cadeia de anticorpo, um domínio variável ou uma CDR do mesmo, de acordo com a invenção. Os polipeptídeos codifica- dos são capazes de se reunir com outra respectiva cadeia de anticorpos pa- 20 ra resultar em uma molécula de anticorpo contra CCR5 de acordo com a invenção.

A invenção provê, adicionalmente, vetores de expressão con- tendo o dito ácido nucleico de acordo com a invenção capazes de expressar o dito ácido nucleico em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica e células hospedeiras contendo tais vetores para a produção recombinante de tal anticorpo.

A invenção compreende, adicionalmente, uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica compreendendo um vetor de acordo com a inven- ção.

A invenção compreende, adicionalmente, um método para a

produção de um anticorpo humano ou humanizado recombinante de acordo com a invenção, caracterizado por expressar um ácido nucleico de acordo com a invenção em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica e re- cuperação do dito anticorpo da dita célula ou sobrenadante de cultura de célula. A invenção compreende, adicionalmente, o anticorpo obtido de tal método recombinante.

5 Os anticorpos de acordo com a invenção mostram benefícios

para os pacientes que precisam da terapia de alvejamento de CCR5. Os an- ticorpos de acordo com a invenção possuem propriedades novas e inventi- vas que causam benefício ao paciente que sofre de tal doença, especial- mente que sofrem de imunossupressão, especialmente de infecção por HIV. A invenção provê, adicionalmente, um método para tratamento

de um paciente que sofre de imunossupressão, especialmente de infecção por HIV, compreendendo administração a um paciente diagnosticado como sofrendo de tal doença (e, portanto, necessitando de tal terapia) de uma quantidade eficaz de um anticorpo que se liga ao CCR5 de acordo com a 15 invenção. O anticorpo é administrado preferivelmente em uma composição farmacêutica.

A invenção compreende, adicionalmente, o emprego de um an- ticorpo de acordo com a invenção como um fármaco, para o tratamento de uma doença imunosupressora, preferivelmente para o tratamento de infec- 20 ção por HIV, para o tratamento de um paciente que sofre de imunossupres- são e para a fabricação de uma composição farmacêutica de acordo com a invenção. Além disso, a invenção compreende um método para a fabricação de uma composição farmacêutica de acordo com a invenção.

A invenção compreende, adicionalmente, uma composição far- macêutica contendo um anticorpo de acordo com a invenção em uma quan- tidade farmaceuticamente eficaz, opcionalmente em conjunto com um tam- pão e/ou um adjuvante útil para a formulação de anticorpos para fins farma- cêuticos.

A invenção provê, adicionalmente, composições farmacêuticas compreendendo tais anticorpos em um veículo farmaceuticamente aceitável. Em uma modalidade, a composição farmacêutica pode estar incluída em um artigo de fabricação ou kit. Portanto, um aspecto da presente invenção é um anticorpo de acordo com a invenção para emprego como um fármaco. Outro aspecto da invenção é um anticorpo de acordo com a invenção para emprego no trata- mento de uma doença imunosupressora. Também um aspecto é o uso de 5 um anticorpo de acordo com a invenção para a fabricação de um fármaco para o tratamento de uma doença imunosupressora.

Descrição Detalhada da Invenção

O termo "anticorpo" engloba as várias formas das estruturas de anticorpo incluindo, porém não limitado aos anticorpos inteiros e fragmentos 10 de anticorpo. O anticorpo de acordo com a invenção é preferivelmente um anticorpo humanizado, anticorpo quimérico, ou adicionalmente anticorpo construído geneticamente, à medida que as propriedades características da invenção sejam mantidas.

"Fragmentos de anticorpo" compreendem uma porção de um anticorpo de comprimento pleno, preferivelmente o domínio variável do mesmo ou pelo menos o sítio de ligação de antígeno do mesmo. Exemplos de fragmentos de anticorpo incluem diacorpos, moléculas de anticorpo de cadeia simples, imunotoxinas e anticorpos multiespecíficos formados de fragmentos de anticorpo. Anticorpos scFv são descritos, por exemplo, em Huston, J.S., Methods in Enzymol. 203 (1991) 46-88. Além disso, os frag- mentos de anticorpo compreendem polipeptídeos de cadeia simples possu- indo as características de um domínio VH, a saber, são capazes de se reuni- rem a um domínio Vl ou a um domínio Vl que se liga ao CCR5, a saber, são capazes de se reunirem a um domínio VH, a um sítio de ligação de antígeno funcional e, pelo que, provendo a propriedade de inibição da fusão da mem- brana ou fusão de HIV com uma célula-alvo.

Os termos "anticorpo monoclonal" ou "composição de anticorpo monoclonal" conforme usados aqui, se referem a uma preparação de molé- culas de anticorpo de uma composição de aminoácido simples. O termo "an- 30 ticorpo quimérico" se refere a um anticorpo monoclonal compreendendo um domínio variável, isto é, região de ligação de um camundongo e pelo menos uma porção de uma região constante derivada de uma fonte ou espécies diferentes, geralmente preparadas por técnicas de DNA recombinante. Os anticorpos quiméricos compreendendo um domínio variável de camundongo e região constante humana são especificamente preferidos. Tais anticorpos quiméricos de camundongo/seres humanos são produtos dos genes da imu- noglobulina expressos compreendendo segmentos de DNA codificando do- mínios variáveis de imunoglobulina de camundongo e segmentos de DNA codificando regiões constantes de imunoglobulina humana. Outras formas de "anticorpos quiméricos" englobadas pela presente invenção são aquelas nas quais a classe ou subclasse foi modificada ou alterada daquela do anti- corpo original. Tais anticorpos "quiméricos" são também referidos como "an- ticorpos de classe comutada". Os métodos para produção dos anticorpos quiméricos envolvem técnicas convencionais de DNA recombinante e de transfecção genética bem-conhecidas na técnica. Vide, por exemplo, Morri- son, S.L., e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 81 (1984) 6851-6855; Paten- tes US números 5.202.238 e 5.204.244.

O termo "anticorpo humanizado" se refere aos anticorpos nos quais a estrutura e/ou "regiões de determinação de complementaridade" (C- DR) foram modificadas para compreenderem a CDR de uma imunoglobulina de diferentes espécies em comparação aquelas da imunoglobulina de ori- 20 gem. Em uma modalidade preferida, uma CDR de camundongo é enxertada na região de estrutura de um anticorpo humano para preparar o "anticorpo humanizado". Vide, por exemplo, Riechmann, L, e outros, Nature 332 (1988) 323-327; e Neuberger, M.S., e outros, Nature 314 (1985) 268-270. CDRs especificamente preferidas correspondem aquelas representando sequên- 25 cias reconhecendo os antígenos observados acima para anticorpos quiméri- cos e bifuncionais.

O termo "que se liga ao CCR5" conforme usado aqui, significa ligação do anticorpo ao CCR5 em uma célula com base no ensaio ELISA in vitro (células expressando CCR5, por exemplo, células CHO transformadas, 30 células L1.2). A ligação é obtida se o anticorpo causar uma taxa de S/N (si- nal/transmissão) de 5 ou mais, preferivelmente de 10 ou mais, em uma con- centração de anticorpos de 100 ng/mL. O termo "estrutura de quimiocina de sete transmembranas" con- forme empregado nesse documento se refere à estrutura natural que CCR5 mostra quando é posicionado na bicamada da membrana celular (vide, por exemplo, Oppermann, M., Cell. Sig. 16 (2004) 1201-1210). Como outros re- 5 ceptores acoplados à proteína G (por exemplo, receptor 1 b acoplado à pro- teína G), CCR5 é composto de um domínio de terminal N extracelular, um domínio de transmembrana e um domínio de terminal C citoplasmático. O domínio de transmembrana consiste em sete segmentos de transmembrana hidrófobos, ligados por três segmentos citoplasmáticos e três segmentos 10 extracelulares. O anticorpo de acordo com a invenção se liga ao CCR5 em sua estrutura de quimiocina de sete transmembranas.

O termo "epítopo" indica um determinante de proteína capaz de se ligar especificamente a um anticorpo. Os epítopos geralmente consistem em grupamentos de superfície quimicamente ativos de moléculas, tais como, 15 aminoácidos ou cadeias laterais de açúcar e geralmente os epítopos possu- em características de estrutura tridimensional, bem como características de carga específica. Epítopos conformacionais e não-conformacionais são dis- tinguidos pelo fato de que a ligação ao anterior, porém não ao último se per- de na presença de solventes desnaturantes. Preferivelmente, um anticorpo 20 de acordo com a invenção se liga especificamente ao CCR5 nativo, porém não-desnaturado.

O termo "fusão de membrana" se refere à fusão entre uma pri- meira célula coexpressando CCR5 e polipeptídeos de CD4 e uma segunda célula expressando uma proteína ENV do HIV. A fusão da membrana é de- terminada por ensaio gênico de repórter de luciferase.

O termo "inibição de fusão de HIV com uma célula-alvo" se refe- re à inibição da fusão de HIV com uma célula-alvo medida em um ensaio compreendendo contato da célula-alvo com o anticorpo na presença do dito vírus com uma concentração de anticorpos eficazes para inibir a fusão da 30 membrana entre o vírus e a dita célula e a medição da atividade gênica do repórter de luciferase.

O "domínio variável" (domino variável de uma cadeia leve (VL), domínio variável de uma cadeia pesada (Hv)1 conforme usado aqui, indica que cada par dos domínios de cadeia leve e pesada está envolvido direta- mente na ligação do anticorpo ao antígeno. Os domínios de cadeia leve e pesada variáveis possuem a mesma estrutura geral e cada domínio compre- ende quatro regiões de estrutura (FR), cujas seqüências são amplamente conservadas, conectadas por três "regiões hipervariáveis" (ou regiões de determinação de complementaridade, CDRs). As regiões de estrutura ado- tam uma conformação de folha-β e as CDRs podem formar laços conectan- do à estrutura de folha-β. As CDRs em cada cadeia são mantidas em sua estrutura tridimensional pelas regiões de estrutura e constituem, em conjunto com as CDRs da outra cadeia, o sítio de ligação de antígeno. As regiões de CDR3 de cadeia pesada e leve do anticorpo desempenham um papel espe- cificamente importante na especificidade/afinidade de ligação dos anticorpos de acordo com a invenção e, portanto, fornecem um objetivo adicional da invenção.

O anticorpo de acordo com a invenção é preferivelmente carac- terizado pelo fato de que o dito anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada e um domínio variável de cadeia leve selecionado do gru- po de combinações consistindo em:

a) o domínio variável de cadeia pesada definido pela seqüência

de aminoácido da SEQ ID NO: 6 e o domínio variável de cadeia leve definido pela seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 9;

b) o domínio variável de cadeia pesada definido pela seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 6 e o domínio variável de cadeia leve definido

pela seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 10;

c) o domínio variável de cadeia pesada definido pela seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 7 e o domínio variável de cadeia leve definido pela seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 9;

d) o domínio variável de cadeia pesada definido pela seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 7 e o domínio variável de cadeia leve definido

pela seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 10;

e) o domínio variável de cadeia pesada definido pela seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 8 e o domínio variável de cadeia leve definido pela seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 9;

f) o domínio variável de cadeia pesada definido pela seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 8 e o domínio variável de cadeia leve definido 5 pela seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 10.

O termo "porção de ligação de antígeno de um anticorpo" quan- do usado nesse documento, se refere aos resíduos de aminoácido de um anticorpo que são sensíveis à ligação do antígeno. A porção de ligação de antígeno de um anticorpo compreende resíduos de aminoácido das "regiões de determinação de complementaridade" ou "CDRs". Regiões de "estrutura" ou "FR" são aquelas regiões de domínio variável que os resíduos de região hipervariável conforme definido aqui neste documento. Portanto, os domí- nios variáveis de cadeia leve e pesada de um anticorpo compreendem dos domínios de terminal N a C, FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 e FR4. Especificamente, CDR3 de cadeia leve é a região que contribui mais para a ligação do antígeno e define as propriedades do anticorpo. As regiões CDR e FR são determinadas de acordo com a definição padrão de Kabat e outros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edição, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, Publicação número 91- 3242 (1991) e/ou aqueles resíduos de um "laço hipervariável".

Os termos "ácido nucleico" ou "molécula de ácido nucleico" con- forme empregados aqui se destinam a incluir moléculas de DNA e moléculas de RNA. Uma molécula de ácido nucleico pode ser de filamento simples ou filamento duplo, porém preferivelmente é um DNA de filamento duplo.

O termo "aminoácido" conforme usado neste pedido indica o

grupo de carbóxi α-aminoácidos ocorrendo naturalmente compreendendo alanina (código de três letras: ala, código de uma letra: A), arginina (arg, R), asparagina (asn, N), ácido aspártico (asp, D), cisteína (cys, C), glutamina (gin, Q), ácido glutâmico (glu, E), glicina (gly, G), histidina (his, H), isoleucina 30 (ile, I), leucina (leu, L), Iisina (lys, K), metionina (met, M), fenilalanina (phe, F), prolina (pro, P), serina (ser, S), treonina (thr, T), triptofano (trp, W), tirosi- na (try, Y) e valina (Vai, V). Um ácido nucleico é "ligado operavelmente" quando ele é colo- cado em uma relação funcional com outro ácido nucleico. Por exemplo, DNA para uma pré-sequência ou líder secretor é operavelmente ligado ao DNA para um polipeptídeo, se este for expresso como uma pré-proteína que par- 5 ticipa na secreção do polipeptídeo; um promotor ou melhorador é operativa- mente ligado a uma seqüência de codificação se este afetar a transcrição da seqüência; ou um sítio de ligação de ribossomo é operativamente ligado a uma seqüência de codificação, se este for posicionado de modo a facilitar a tradução. Geralmente, "ligada operativamente" significa que as seqüências 10 de DNA sendo ligadas são colineares e, no caso de um líder secretor, contí- nuas e na leitura do quadro. Contudo, os melhoradores não precisam ser contínuos. A ligação é realizada por ligação em sítios de restrição conveni- entes. Caso esses sítios não existam, os adaptadores de oligonucleotídeos sintéticos ou Iigantes são usados de acordo com a prática convencional.

Conforme usado aqui, as expressões "célula", "linhagem de cé-

lula" e "cultura de célula" são usadas intercambiavelmente e todas tais de- signações incluem progênie. Assim, as palavras "transformantes" e "células transformadas" incluem a célula primária do indivíduo e culturas derivadas da mesma, sem considerar o número de transferências. É também entendi- 20 do que toda a progênie pode não ser precisamente idêntica ao teor de DNA, em razão das mutações deliberadas ou inadvertidas. São incluídas progê- nies variantes que possuem a mesma função ou atividade biológica confor- me classificada na célula originalmente transformada.

A "parte Fe" de um anticorpo não está envolvida diretamente na 25 ligação de um anticorpo a um antígeno, porém exibe várias funções efetoras. Dependendo da seqüência de aminoácido da região constante de suas ca- deias pesadas, os anticorpos ou imunoglobulinas são divididos nas classes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM e várias dessas podem ser adicionalmente divididas em subclasses (isotipos), por exemplo, IgG em IgGI, lgG2, lgG3 e lgG4, IgA 30 em IgAI e lgA2. De acordo com as regiões constantes de cadeia pesada, as diferentes classes de imunoglobulinas são denominadas, α, δ, ε, γ e μ, res- pectivamente. Os anticorpos de acordo com a invenção são preferivelmente do tipo IgG.

Conforme usado aqui, o termo "parte Fc derivada de origem humana" indica uma parte Fc que é tanto uma parte Fc de anticorpo humano da subclasse lgG4 ou uma parte Fc de um anticorpo humano da subclasse 5 IgGI, lgG2, ou lgG3, incluindo as formas mutadas das mesmas. Preferivel- mente, a parte Fc de um anticorpo humano da subclasse IgGI, lgG2 ou lgG3 é modificada, de modo que uma ligação reduzida ou sem receptor Fcy (FcyR, isto é, FcYRIIIa) e/ou uma ligação reduzida ou sem-C1q conforme definida a seguir pode ser detectada com relação à parte Fc não-modificada. 10 Uma "parte Fc de um anticorpo" é um termo bem-conhecido dos versados na técnica e definida com base na clivagem da papaína dos anticorpos. Os anticorpos de acordo com a invenção contêm como parte Fc uma parte Fc derivada de origem humana e preferivelmente todas as outras partes da re- gião constante humana. Preferivelmente, a parte Fc é uma parte Fc humana 15 e especialmente preferido tanto de subclasse lgG4 humana quanto subclas- se IgGI humana, ou uma parte Fc mutada da subclasse IgGI humana. Mais preferidas são as partes Fc e região de constante de cadeia pesada mostra- da nas SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 3 com mutações L234A e L235A, SEQ ID NO: 4 com mutação S228P.

Embora lgG4 mostre ligação de receptor de Fcy reduzida

(FcYRIIIa), os anticorpos de outra subclasse de IgG mostram ligações fortes. Contudo, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (perda de carboidrato de Fe), Pro329, Leu234, Leu235, Gly236, Gly237, Ile253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 e His435 são reduzidos que, se alterados, fornecem tam- 25 bém ligação do receptor de Fc reduzida (Shields, R.L., e outros, J. Biol. Chem. 276 (2001) 6591- 6604; Lund, J., e outros, FASEB J. 9 (1995) 115- 119; Morgan, A., e outros, Immunology 86 (1995) 319-324; EP 0 307 434). Preferivelmente um anticorpo de acordo com a invenção é considerado para ligação do receptor Fcy da subclasse lgG4, ou uma subclasse IgGI ou lgG2, 30 com uma mutação em S228, L234A, L235A, L235E, e/ou D265 e/ou PVA236 (PVA236 significa que a seqüência de aminoácido ELLG (fornecida em um código de aminoácido de uma letra) da posição 233 a 236 do aminoácido de IgGI ou EFLG de lgG4 sendo substituída por PVA). Especialmente preferi- das são as mutações S228P de lgG4 e L234A, L235A de IgGI.

A parte Fc de um anticorpo está diretamente envolvida na ADCC (citotoxicidade mediada por célula dependente de anticorpo) e CDC (citotoxicidade dependente de complemento). A ativação de complemento (CDC) é iniciada por ligação do fator de complemento C1q à parte Fc da maioria das subclasses de anticorpo IgG. A ligação de C1q a um anticorpo é causada por interações proteína-proteína definidas no assim chamado sítio de ligação. Tais sítios de ligação da parte Fc são conhecidos no estado da técnica e descritos por Lukas1 T.J. , e outros, J. Immunol. 127 (1981) 2555- 2560; Brunhouse, R. and Cebra, J.J., Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917; Bur- ton, D.R., e outros, Nature 288 (1980) 338-344; Thommesen, J.E., e outros, Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004; Idusogie, E.E., e outros, J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184; Hezareh, M., e outros, J. Virol. 75 (2001) 12161-12168; Morgan, A., e outros, Immunology 86 (1995) 319-324; e EP 0 307 434. Tais sítios de ligação da parte Fc são, por exemplo, caracterizados pelos aminoá- cidos L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 e P329 (numeração de acordo com o índice EU de Kabat). Anticorpos das subclasses IgGI, lgG2 e lgG3 geralmente mostram ativação de complemento incluindo ligação de C1q e C3 considerando-se que lgG4 não ativa o sistema complemento e não liga C1q e C3.

Isto é, nos casos onde ADCC e/ou CDC é/são necessárias, uma parte Fc da subclasse IgGI é preferida, nos casos onde ADCC reduzida ou nenhuma ADCC e/ou CDC é/são necessárias, uma parte Fc da subclasse 25 lgG4 ou subclasse IgGI modificada/mutada é preferida. A presente invenção se refere em um aspecto a um anticorpo que se liga ao CCR5 e mostra liga- ção reduzida ou não mostra ligação ao receptor de Fcy e/ou fator de com- plemento C1q. Um anticorpo anti-CCR5 que não se liga ao receptor de Fc e/ou fator de complemento C1q não promove a citotoxicidade celular depen- 30 dente de anticorpo (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC), considerando-se que, um anticorpo anti-CCR5, que mostra ligação reduzida ao receptor de Fc e/ou fator de complemento C1q, mostra uma ADCC e/ou CDC reduzida. Preferivelmente, tal anticorpo é caracterizado pelo fato de que ele se liga ao CCR5, contém uma parte Fc derivada de ori- gem humana e não se liga ou mostra uma ligação reduzida de receptores Fc e/ou fator de complemento C1q. Mais preferivelmente, esse anticorpo é um 5 anticorpo humano ou humanizado ou um anticorpo isento de antígeno de célula T. A ligação C1q pode ser medida de acordo com Idusogie, E.E., e outros, J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184. Nenhuma "ligação C1q" é encon- trada se em tal ensaio a densidade óptica (OD) a 492-405 nm for para o an- ticorpo de teste inferior a 15% do valor da ligação de C1q humana da parte 10 de Fc de anticorpo do tipo selvagem não modificado, a uma concentração de anticorpos de 8 Mg/ml_. "Ligação C1q" reduzida está na faixa de 15% a 30% do valor para ligação C19 humana da parte Fc de anticorpo do tipo selvagem não modificado nas mesmas condições. ADCC pode ser medida como liga- ção do anticorpo à FcYRIIa humana nas células NK humanas. A ligação é 15 determinada em uma concentração de anticorpos de 20 pg/mL. "Nenhuma ligação de receptor Fcy" ou "nenhuma ADCC" significa uma ligação de até 30% ao FcylIIa humano nas células NK humanas em uma concentração de anticorpos de 20 pg/mL em comparação à ligação do mesmo anticorpo com IgGI humana (SEQ ID NO: 3). "Ligação de receptor Fcy reduzida" ou "ADCC 20 reduzida" significa uma ligação de 30% até 60% do FcYllla humano nas cé- lulas NK humanas em comparação à ligação do mesmo anticorpo como IgGI humana (SEQ ID NO:3).

Outro aspecto da presente invenção é um anticorpo que se liga a CCR5 e também se liga ao receptor Fcy e/ou fator complemento C1q. Um 25 anticorpo anti-CCR5 que se liga ao receptor de Fc e/ou fator de complemen- to C1q não promove citotoxicidade celular dependente de anticorpo (ADCC) e/ou citotoxicidade dependente de complemento (CDC). Preferivelmente, esse anticorpo é caracterizado pelo fato de que ele se liga ao CCR5, contém uma parte Fc derivada de origem humana e também se liga aos receptores 30 de Fc e/ou fator de complemento C1q. Mais preferivelmente, esse anticorpo é um anticorpo humano ou humanizado ou um antígeno isento de antígeno de célula T. A ligação de C1q pode ser medida de acordo com Idusogie, E.E., e outros, J. Immunol. 164 (2000) 4178-4184. ADCC pode também ser medida como ligação do anticorpo ao FcYRIIIa humano nas células NK hu- manas. A libação é determinada em uma concentração de anticorpo de 20 Mg/mL.

5 Os anticorpos de acordo com a invenção incluem, além disso,

anticorpos possuindo "modificações de seqüência conservadora" (anticorpos variantes), modificações de nucleotídeo e seqüência de aminoácido, que não afetam ou alteram as características mencionadas acima do anticorpo de acordo com a invenção. As modificações podem ser introduzidas por técni- 10 cas-padrão conhecidas na técnica, tais como, mutagênese direcionada ao sítio e mutagênese mediada por PCR. Substituições de aminoácido conser- vadoras incluem aquelas nas quais o resíduo de aminoácido é substituído com um resíduo de aminoácido possuindo uma cadeia lateral similar. Famí- lias de resíduos de aminoácido possuindo cadeias laterais similares foram 15 definidas na técnica. Essas famílias incluem aminoácidos com cadeias late- rais básicas, (por exemplo, lisina, arginina, histidina), cadeias laterais ácidas (por exemplo, ácido aspártico, ácido glutâmico), cadeias laterais polares não-carregadas (por exemplo, glicina, asparagina, glutamina, serina, treoni- na, tirosina, cisteína, triptofano), cadeias laterais não polares (por exemplo, 20 alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadeias laterais ramificadas beta (por exemplo, treonina, valina, isoleucina) e cadeias laterais aromáticas (por exemplo, tirosina, fenilalanina, triptofano, histidina). Assim um resíduo de aminoácido não-essencial previsto em um anticorpo anti-CCR5 humano pode ser preferivelmente substituído por outro resíduo 25 de aminoácido a partir da mesma família de cadeia lateral. Um anticorpo an- ti-CCR5 "variante" se refere, nesse documento, a uma molécula que difere na seqüência de aminoácido de uma seqüência de aminoácido de anticorpo anti-CCR5 "de origem" em até dez, preferivelmente de cerca de duas a cer- ca de cinco, adições, deleções e/ou substituições em uma ou mais regiões 30 variáveis do anticorpo de origem. Substituições de aminoácido podem ser realizadas por mutagênese com base na modelagem molecular, conforme descrito por Riechmann, L., e outros, Nature 332 (1988) 323-327 e Queen, C1 e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) 10029-10033.

Uma modalidade adicional da invenção é um método para a produção de um anticorpo contra CCR5 que não se liga ou mostra uma liga- ção reduzida ao receptor de Fcy e/ou C1q, caracterizado pelo fato de que a 5 seqüência de um ácido nucleico codificando a cadeia pesada de um anticor- po do tipo IgGI humano que se liga ao CCR5 é modificada de modo que o dito anticorpo modificado não se liga ou mostra uma ligação reduzida de C1q e/ou receptor Fcy, dito ácido nucleico modificado e o ácido nucleico codifi- cando a cadeia leve do anticorpo sendo inseridos em um vetor de expres- 10 são, o vetor sendo inserido em uma célula hospedeira eucariótica, a proteína codificada é expressa e recuperada da célula hospedeira ou do sobrenadan- te. Preferivelmente, o anticorpo é modificado por "comutação de classe" isto é, alteração ou mutação da parte de Fc (por exemplo, mutação de IgGI em lgG4, e/ou IgGI/lgG4) preferivelmente definida como IgGIv1 (PVA-236; 15 GLPSS331), lgGlv2 (L234A; L235A), lgGlv3 (S228P; L235E), IgGIx (S228P), lgG4v1 (PVA- 236). GLPSS331 significa as mutações E233P, L234V, L235A, delta G236, A327G, A330S, P331S.

A identidade ou homologia com relação à seqüência é definida nesse documento como a porcentagem dos resíduos de aminoácido na se- 20 quência candidata, que são idênticos à seqüência de origem, após alinha- mento das seqüências e introdução de fendas, caso necessário, para obter a porcentagem máxima de identidade de seqüência. Nenhuma das extensões de terminal N, terminal C ou extensões internas, deleções ou inserções na seqüência de anticorpo devem ser tidas como afetando a identidade ou ho- 25 mologia da seqüência. A variante mantém a capacidade de se ligar ao CCR5 humano e preferivelmente possui propriedades, que são superiores as do anticorpo de origem. Por exemplo, a variante pode ter efeitos colaterais re- duzidos durante o tratamento.

O anticorpo "de origem" nesse documento é um que é codifica- do por uma seqüência de aminoácido usada para a preparação da variante. Preferivelmente, o anticorpo de origem possui uma região de estrutura hu- mana e, caso presente, possui uma região constante de anticorpo humano ou domínios constantes de anticorpo humano. Por exemplo, o anticorpo de origem pode ser um anticorpo humanizado ou humano.

Os anticorpos de acordo com a invenção são produzidos, prefe- rivelmente, por meios recombinantes. Tais métodos são amplamente conhe- 5 cidos no estado da técnica e compreendem expressão de proteína nas célu- las procarióticas e eucarióticas com isolamento subsequente do polipeptídeo de anticorpo e geralmente purificação a uma pureza farmaceuticamente a- ceitável. Para a expressão da proteína, os ácidos nucleicos codificando ca- deias leves e pesadas ou fragmentos das mesmas são inseridos nos vetores 10 de expressão por métodos padrão. A expressão é realizada nas células hos- pedeiras procarióticas ou eucarióticas apropriadas, tais como, células CHO,células BHK, células PER.C6®, células NSO, células SP2/0, células HEK293, células COS, levedura ou células E.coli e o anticorpo é recuperado das células (a partir do sobrenadante ou após Iise celular).

A produção recombinante dos anticorpos é bem-conhecida no

estado da técnica e descrita, por exemplo, nos artigos revistos de Makrides,

S. C, Protein Expr. Purif. 17 (1999) 183-202; Geisse, S., e outros, Protein Expr. Purif. 8 (1996) 271-282; Kaufman, R.J., Mol. Biotechnol. 16 (2000) 151-160; Werner, R.G., Arzneimittelforschung-Drug Res. 48 (1998) 870-880. Os anticorpos podem estar presentes nas células integrais, em

um Iisado de células ou na forma parcialmente purificada ou substancialmen- te pura. A purificação é realizada a fim de eliminar outros componentes celu- lares ou outros contaminantes, por exemplo, outros ácidos nucleicos celula- res ou proteínas, por técnicas-padrão, incluindo tratamento com alcali- 25 no/SDS, associando CsCI, cromatografia de coluna, eletroforese de gel aga- rose e outros bem-conhecidos na técnica. Vide, Ausubel, F., e outros, (ed.) Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Inters- cience, New York (1987).

A expressão nas células NSO é descrita, por exemplo, em Bar- nes, L.M., e outros, Cytotechnology 32 (2000) 109-123; Barnes, L.M., e ou- tros, Biotech. Bioeng. 73 (2001) 261-270. A expressão transitória é descrita, por exemplo, em Durocher, Y., e outros, Nucl. Acids. Res. 30 (2002) E9. A clonagem de domínios variáveis é descrita por Orlandi1 R., e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 86 (1989) 3833-3837; Carter, P., e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 89 (1992) 4285-4289; Norderhaug, L., e outros, J. Immunol. Methods 204 (1997) 77-87. Um sistema de expressão transitória preferida 5 (HEK 293) é descrito por Schlaeger, E.-J. e Christensen, K., em Cytotechno- Iogy 30 (1999) 71-83 e by Schlaeger, E.-J., em J. Immunol. Methods 194 (1996) 191-199.

Os anticorpos monoclonais são apropriadamente separados do meio de cultura por procedimentos de purificação de imunoglobulina con- 10 vencionais, tais como, por exemplo, proteína A-Sefarose, cromatografia de hidroxiapatita, eletroforese de gel, diálise ou cromatografia de afinidade. DNA e RNA codificando os anticorpos monoclonais são prontamente isola- dos e sequenciados usando procedimentos convencionais. As células de hibridoma podem servir como uma fonte de tal DNA e RNA. Uma vez isola- 15 do, o DNA pode ser inserido nos vetores de expressão, que são então trans- fectados para dentro das células hospedeiras, tais como, células HEK 293, células CHO ou células de mieloma que de outra forma não produzem a pro- teína da imunoglobulina, para obter a síntese dos anticorpos monoclonais recombinantes nas células hospedeiras.

As variantes da seqüência de aminoácido do anticorpo CCR5

humano são preparadas por introdução de alterações de nucleotídeo apro- priadas dentro do anticorpo codificando DNA ou por síntese de peptídeo. Tais modificações podem ser realizadas, contudo, apenas em uma faixa muito limitada, por exemplo, conforme descrito acima. Por exemplo, as modi- 25 ficações não alteram as características do anticorpo mencionado anterior- mente, tais como, ligação do isotipo e epítopo de IgG, porém podem aperfei- çoar o rendimento da produção recombinante, estabilidade da proteína ou facilitar a purificação.

Qualquer resíduo de cisteína não-envolvido na manutenção da conformação apropriada do anticorpo anti-CCR5 pode também ser substituí- do, geralmente com serina, para aperfeiçoar a estabilidade oxidativa da mo- lécula e para impedir reticulação aberrante. De modo contrário, a(s) liga- ção(ões) de cisteína pode(m) ser adicionada(s) ao anticorpo para aperfeiço- ar sua estabilidade (especificamente quando o anticorpo for um fragmento de anticorpo, tal como um fragmento de Fe).

Outro tipo de variante de aminoácido do anticorpo altera o pa- drão de glicosilação original do anticorpo. "Altera" significa a remoção de uma ou mais frações de carboidrato encontradas no anticorpo e/ou adição de um ou mais sítios de glicosilação que não estão presentes no anticorpo. A glicosilação dos anticorpos é tipicamente ligada em N. O termo "ligado em N" se refere à anexação da fração de carboidrato à cadeia lateral de um re- síduo de asparagina. As seqüências de tripeptídeo asparagina-X-serina e asparagina-X-treonina, onde X é qualquer aminoácido, exceto prolina, são as seqüências de reconhecimento para anexação enzimática da fração de carboidrato à cadeia lateral de asparagina. Assim, a presença de cada uma dessas seqüências de tripeptídeo em um polipeptídeo cria um sítio de glico- silação em potencial. A adição dos sítios de glicosilação ao anticorpo é con- venientemente realizada por alteração da seqüência de aminoácido, tal que ela contém uma ou mais das seqüências de tripeptídeo descritas acima (pa- ra os sítios de glicosilação ligados em N).

Moléculas de ácido nucleico codificando variantes de seqüência 20 de aminoácido do anticorpo anti-CCR5 são preparadas por vários métodos conhecidos na técnica. Esses métodos incluem, porém não estão limitados ao isolamento de uma fonte natural (no caso de variantes da seqüência de aminoácido ocorrendo naturalmente) ou preparação por mutagênese media- da por oligonucleotídeo (ou direcionada ao sítio), mutagênese de PCR e mu- 25 tagênese de cassete de uma variante preparada anteriormente ou uma ver- são não-variante do anticorpo anti-CCR5 humanizado.

Outro tipo de modificação covalente envolve glicosídeos que se acoplam química ou enzimaticamente ao anticorpo. Esses procedimentos são vatanjosos pelo fato de que eles não requerem a produção do anticorpo 30 em uma célula hospedeira que é capaz de glicosilação ligada em N ou O. Dependendo do modo de acoplamento usado, o(s) açúcar(es) pode(m) ser anexado(s) à (a) arginina e/ou histidina, (b) grupos carboxila livres, (c) gru- pos sulfidrila livres, tais como, aqueles da cisteína, (d) grupos hidroxila livres, tais como aqueles da serina, treonina ou hidroxiprolina, (e) resíduos aromáti- cos, tais como aqueles da fenilalanina, tirosina ou triptofano ou (f) o grupo amida da glutamina. Esses métodos são descritos na WO 87/05330 e em Aplin, J.D. e Wriston, J.C. Jr., CRC Crit. Rev. Biochem. 10 (1981) 259-306.

A remoção de quaisquer frações de carboidrato presentes no anticorpo podem ser realizadas química ou enzimaticamente. A desglicosila- ção química requer exposição do anticorpo ao composto ácido triflúor meta- nossulfônico ou um composto equivalente. Esse tratamento resulta na cliva- 10 gem da maioria ou de todos os açúcares com exceção do açúcar de ligação (N-acetilglicosamina ou N-acetil galactosamina), enquanto deixando o anti- corpo intacto. Desglicosilação química conforme descrito por Sojar, H.T. e Bahl, O.P., Arch. Biochem. Biophys. 259 (1987) 52-57; Edge, A.S., e outros Anal. Biochem. 118 (1981) 131-137. A clivagem enzimática das frações de 15 carboidrato nos anticorpos pode ser obtida por emprego de uma variedade de endo e exoglicosidases, conforme descrito por Thotakura, N.R. e Bahl,

O.P., Meth. Enzymol. 138 (1987) 350-359.

Outro tipo de modificação covalente do anticorpo compreende a ligação do anticorpo a um dos vários polímeros não-proteináceos, por exem- pio, polietileno glicol, polipropileno glicol ou polioxialquilenos, do modo esta- belecido nas Patentes US números 4.640.835; 4.496.689; 4.301.144; 4.670.417; 4.791.192; 4.179.337.

Os domínios variáveis de cadeia pesada e leve de acordo com a invenção são combinados com seqüências do promotor, início da tradução, 25 região constante, região 3' não-traduzida, poliadenilação e terminação de transcrição para formar construções de vetor de expressão. As construções de expressão de cadeia leve e pesada podem ser combinadas em um vetor simples, cotransfectado, transfectado em série ou transfectado separada- mente dentro das células hospedeiras que são então fundidas de modo a 30 formar uma célula hospedeira simples expressando ambas as cadeias.

A invenção compreende, adicionalmente, o uso de um anticorpo de acordo com a invenção para o diagnóstico da suscetibilidade à AIDS in vitro, preferivelmente por um ensaio imunológico determinando a ligação entre CCR5 solúvel de uma amostra de plasma humano (Tsimanis, T., Im- munology Letters 96 (2005) 55-61) e o anticorpo de acordo com a invenção. A expressão de CCR5 possui uma correlação com a progressão da doença 5 e pode ser usada para identificar indivíduos com risco alto ou baixo com re- lação à suscetibilidade à AIDS. Para fins de diagnóstico, os fragmentos de ligação dos anticorpos ou antígenos podem ser marcados ou não-marcados. Tipicamente, os ensaios de diagnóstico detectam a formação de um comple- xo resultante da ligação de um fragmento de anticorpo ou anticorpo ao C- 10 CR5.

Em outro aspecto, a presente invenção provê uma composição, por exemplo, uma composição farmacêutica, contendo um ou uma combina- ção de anticorpos monoclonais ou a porção de ligação de antígeno dos mesmos, da presente invenção, formulada em conjunto com um veículo far- maceuticamente aceitável.

Conforme usado aqui, "veículo farmaceuticamente aceitável" in- clui qualquer e todos os solventes, meios de dispersão, revestimentos, agen- tes antibacterianos e antifúngicos, agentes isotônicos e de absorção/reab- sorção e similares que são fisiologicamente compatíveis. Preferivelmente, o veículo é apropriado para injeção ou infusão.

A composição da presente invenção pode ser administrada por vários métodos conhecidos na técnica. Conforme será apreciado pelos ver- sados na técnica, a via e/ou modo de administração variará dependendo dos resultados desejados.

Veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem soluções aquo-

sas estéreis ou dispersões e pós estéreis para a preparação de soluções injetáveis ou dispersão. O uso de tais meios e agentes para substâncias farmaceuticamente ativas é conhecido na técnica. Além da água, o veículo pode se, por exemplo, uma solução de salmoura tamponada isotônica.

Independente da via de administração selecionada, os compos-

tos da presente invenção que podem ser usados em uma forma hidratada apropriada e/ou as composições farmacêuticas da presente invenção são formuladas em formas de dosagem farmaceuticamente aceitáveis por méto- dos convencionais conhecidos dos versados na técnica.

Níveis de dosagem reais dos ingredientes ativos nas composi- ções farmacêuticas da presente invenção podem variar de modo a se obter uma quantidade de ingrediente ativo que seja eficaz para obter a resposta terapêutica desejada para um paciente específico, composição e modo de administração, sem ser tóxicos ao paciente (quantidade eficaz). O nível de dosagem selecionado dependerá de vários fatores farmacocinéticos incluin- do a atividade das composições específicas da presente invenção emprega- das, ou do éster, sal ou amida das mesmas, a via de administração, o tempo de administração, a taxa de excreção do composto específico sendo empre- gado, outros fármacos, compostos e/ou materiais usados em combinação com as composições específicas empregadas, a idade, sexo, peso, condi- ção, saúde geral e histórico médico anterior do paciente sendo tratado e fa- tores similares bem-conhecidos das técnicas médicas.

A invenção compreende o uso dos anticorpos de acordo com a invenção para o tratamento de um paciente que sofre de imunossupressão, tal como imunossupressão em um paciente com síndromes de imunodefici- ência, tal como, AIDS, em um paciente sofrendo terapia por radiação, quimi- 20 oterapia, terapia para doença autoimune ou outra terapia medicamentosa (por exemplo, terapia com corticosteróide), que causa imunossupressão ou para o tratamento de um paciente que sofre de GvHD ou HvGD (por exem- plo, após transplante). A invenção compreende também um método para o tratamento de um paciente que sofre de tal imunossupressão.

A invenção provê, adicionalmente, um método para a fabricação

de uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade eficaz de um anticorpo, de acordo com a invenção, em conjunto com um veículo far- maceuticamente aceitável e o uso do anticorpo de acordo com a invenção para um tal método. A invenção também provê um anticorpo de acordo com 30 a invenção para uso como um fármaco. Também é fornecido um anticorpo de acordo com a invenção para o tratamento de uma doença imunosupres- sora. A invenção provê, adicionalmente, o emprego de um anticorpo de acordo com a invenção em uma quantidade eficaz para a fabricação de um agente farmacêutico, preferivelmente em conjunto com um veículo far- maceuticamente aceitável, para o tratamento de um paciente que sofre de imunossupressão.

A invenção também provê o emprego de um anticorpo de acor- do com a invenção em uma quantidade eficaz para a fabricação de um a- gente farmacêutico, preferivelmente em conjunto com um veículo farmaceu- ticamente aceitável, para o tratamento de um paciente que sofre de Iibera- ção de mediador inflamatório mediada por CCR5.

Os exemplos que se seguem e a listagem de seqüências são fornecidos para auxiliar no entendimento da presente invenção, o escopo verdadeiro da mesma sendo estabelecido nas reivindicações apensas. Fica entendido que modificações podem ser feitas nos procedimentos estabeleci- dos, sem com isto fugir do espírito da invenção.

Descrição das Seqüências

SEQ ID NO: 1 Fórmula I, cadeia pesada, domínio variável SEQ ID NO: 2 Fórmula II, cadeia pesada, domínio variável SEQ ID NO: 3 γ1 região constante de cadeia pesada SEQ ID NO: 4 γ4 região constante de cadeia pesada

SEQ ID NO: 5 κ região constante de cadeia leve SEQ ID NO: 6 domínio variável de cadeia pesada SEQ ID NO: 7 domínio variável de cadeia pesada SEQ ID NO: 8 domínio variável de cadeia pesada SEQ ID NO: 9 domínio variável de cadeia leve

SEQ ID NO: 10 domínio variável de cadeia leve

Exemplo 1

Produção de anticorpos recombinantes

Vetores para a expressão de anticorpos de acordo com a inven- ção foram construídos como se segue. Um vetor de expressão de cadeia pesada foi construído por ligação de um domínio variável de cadeia pesada à região constante de IgGI humano (SEQ ID NO: 3) no vetor de expressão pSVgpt. Um vetor de expressão de cadeia pesada foi construído por ligação de um domínio variável de cadeia leve à região constante de cadeia leve capa humana (SEQ ID NO: 5) no vetor de expressão pSVhyg. A seqüência de flanqueamento 5' incluindo o peptídeo de sinal líder, íntron líder e promo- 5 tor de imunoglobulina de murino e a seqüência de flanqueamento 3' incluin- do o sítio de Splice e seqüência de íntron foram introduzidas usando os veto- res VH-PCR1 e VK-PCR1 como gabaritos. Os vetores de expressão de ca- deia pesada e leve foram cotransfectados dentro das células NSO (ECACC número 85110503, uma não-imunoglobulina que produz mieloma de camun- 10 dongo). Clones de células transfectadas foram classificados quanto à produ- ção de anticorpo humano por ELISA para IgG humana.

Exemplo 2

Construção de plasmídeos de expressão para anticorpos anti-CCR5 mutan- tes (variantes)

Plasmídeos de expressão codificando cadeias leves e pesadas

de anticorpo anti-CCR mutante foram criadas por mutagênese direcionada ao sítio dos plasmídeos de expressão empregando o kit de mutagênese di- recionado ao sítio QuickChange® (Stratagene) e são descritos na tabela 1. Os aminoácidos são numerados de acordo com a numeração EU (Edelman, 20 G.M., e outros, Proc. Natl. Acad. Sei. USA 63 (1969) 78-85; Kabat, E.A., e outros, Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., National Institutes of Health, Bethesda, MD, Publicação número 91-3242 (1991)).

A tabela 1 mostra mutantes de cadeias constantes (Fe).

Tabela 1:

Isotipo Abreviatura Mutações Descrição Igd lgG1v2 L234A; A seqüência de aminoácido Leu234Leu235 da cadeia L235A pesada γ1 humana é substituída pela seqüência de aminoácido Ala234Ala235. Explicação das mutações: L234A significa que a leucina na po-

sição 234 de Kabat do aminoácido é alterada para alanina.

Exemplo 3

Ensaio de fusão célula-a-célula

No dia 1, células HeLa expressando gp160 (2 x 104 células/50 pL/eavidade) foram semeadas em uma placa de microtitulação de 96 cavi- dades branca em meio DMEM suplementado com FCS a 10% (v/v) e 2 Mg/mL de doxiciclina. No dia 2, 100 μΙ de amostra de sobrenadante ou con- trole de anticorpo por cavidade foram adicionados em uma placa de microti- tulação de 96 cavidades limpa. Então 100 pL contendo células de suspen- 5 são 8x104 CEM-NKr-Luc em meio foram adicionados e incubados por 30 minutos a 37°C. O meio de cultura da célula HeLa foi aspirado da placa de 96 cavidades, 100 pL da mistura de 200 μΙ de anticorpo/CEM-NKr-Luc foram adicionados e incubados por toda a noite a 37°C. No dia 3, 100 pL/cavidade de substrato de ensaio de luciferase Bright-GIo® (1,4-ditiotreitol e ditionitrato 10 de sódio; Promega Corp., USA) foram adicionados e a luminescência foi medida após um mínimo de 15 minutos de incubação a temperatura ambien- te.

Materiais:

Células Hela-R5-16 (linhagem de célula para expressar HIV gp160 mediante indução de doxiciclina) são cultivadas em meio DMEM con- tendo nutrientes e FCS a 10% (v/v) com 400 pg/mL de G418 e 200 μg/mL de Higromicina B.

CEM.NKR-CCR5-Luc (número do catálogo: 5198) é uma linha- gem de célula T disponível na NIH AIDS Research & Reference Reagent Program McKesson BioServices Corporation Germantown, MD 20874, USA. Tipo de célula: CEM.NKR-CCR5 (número cat. 4376) foi transfectada (eletro- poração)para expressar o gene de luciferase sob o controle transcricional de HIV-2 LTR e propagada em RPMI 1640 contendo soro bovino fetal a 10%, 4 mM de glutamina, penicilina/estreptomicina e 0,8 mg/mL de sulfato de gene- ticina (G418). Características de crescimento: células linfóides redondas, morfologia não muito variável. As células cresceram em suspensão como células simples, que podem formar pequenos grumos. Divisão 1:10 duas vezes por semana. Características especiais: expressão atividade de lucife- rase após transativação de HIV-2 LTR. Apropriadas para infecção com iso- lados de HIV primários, para ensaios de neutralização e sensibilidade ao fármaco (Spenlehauer, C, e outros, Virology 280 (2001) 292-300; Trkola, A., e outros, J. Vírol. 73 (1999) 8966- 8974). A linhagem de célula foi obtida a- través do NIH AIDS Research and Reference Reagent Program, NIAID, NIH pelos Drs. John Moore e Catherine Spenlehauer.

Tampão para ensaio de luciferase Bright-GIo® (Promega Corp., USA, número da peça E2264B)

Substrato para ensaio de luciferase Bright-GIo® (Promega Corp.,

USA, número da peça EE26B)

Resultados:

Os resultados são apresentados na tabela 2. Os valores IC50 es- tão entre 46 e 399 ng/mL. A região constante do anticorpo é uma IgGI mu- tada (lgG1v2).

Tabela 2:

Domínio Variável de Cadeia Pesada Domínio Variável de Cadeia Leve IC50 [ng/mL] SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 9 108 SEQ ID NO: 6 SEQ ID NO: 10 399 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 9 46 SEQ ID NO: 7 SEQ ID NO: 10 152 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 9 132 SEQ ID NO: 8 SEQ ID NO: 10 76 Exemplo 4

Ensaio antivirótico com vírus vivo

PBMCs foram preparadas de revestimento tamponado isolado 15 por centrifugação de gradiente-densidade usando Lymphoprep® (Nycomed Pharma AG, Oslo, Noruega). As células de quatro doadores diferentes foram misturadas, estimuladas por 1 dia com PHA e subsequentemente cultivadas em meio RPMI contendo 1% (peso/volume) de penicilina/estreptomicina, GlutaMAX® a 1% (Invitrogen Corp., USA, Cat. número 35050-038), piruvato 20 de sódio a 1%, aminoácidos não-essenciais a 1% (peso/volume) e FBS a 10%, para dois dias na presença de 5 U/mL IL-2 (interleucina-2).

100.000 PBMCs (células mononucleares de sangue periférico) em 50 pL foram adicionadas a 100 pL de uma solução de anticorpo (diluição em série entre 0,006-17,5 pg/mL, no meio RPMI suplementado e infectado 25 com 250 TCID50 (dose infecciosa em cultura de tecido mediana) de NLBaI (cepa NL4.3 (Adachi, A., e outros, J. Virol. 59 (1986) 284- 291) com o envol- tório de BaL (gpl20)) ou alternativamente JRCSF (0'Brien, W.A., e outros, Nature 348 (1990) 69-73) em um volume de 50 pL. A mistura foi incubada por 6 dias a 37°C em um incubador de CO2. 0 sobrenadante foi colhido e subsequentemente diluído 1:50 5 U/mL de meio RPMI suplementado com IL-

2.

A medição de p24 foi realizada por um ELISA HIV-1 p24 (Per- kin-Elmer, USA). As amostras foram então neutralizadas e transferidas para as cavidades da microplaca que foram revestidas com um anticorpo mono- clonal de camundongo altamente específico para HIV-1 p24. O anticorpo monoclonal imobilizado captura HIV-1 p24. As amostras de cultura de célula não requerem interrupção e foram adicionadas diretamente às cavidades da microplaca revestidas com anticorpo monoclonal. O antígeno capturado é complexado com anticorpo policlonal biotinilado para HIV-1 p24, seguido por um conjugado de estreptavidina-HRP (peroxidase de raiz forte). O complexo resultante foi detectado por incubação com orto-fenilenodiamina-HCI (OPD) que produz uma cor amarela que é diretamente proporcional à quantidade de HIV-1 p24 capturado. A absorvência de cada cavidade da microplaca foi determinada usando um leitor de microplaca e calibrada contra a absorvên- cia de um antígeno de HIV-1 p24 padrão ou curva padrão.

Resultados:

Para a inibição do crescimento de HIV em PBMC humano, os 20 valores de IC50 na faixa de 2,27 ng/mL a 14,21 ng/mL para os anticorpos anti-CCR5 compreendendo as diferentes combinações de domínios variá- veis de cadeia pesada (SEQ ID NO:6, 7, 8) e leve (SEQ ID NO:9, 10) e de um isotipo IgGI foram determinados. Para essas combinações os valores de IC90 estão na faixa de 9,77 ng/mL a 74,06 ng/mL.

Para anticorpos anti-CCR5 compreendendo uma região cons-

tante IgGI mutada (lgG1v2), os valores de IC50 das diferentes combinações de domínios variáveis de cadeia pesada e leve foram determinados como estando na faixa de 8,22 ng/mL a 43,11 ng/mL, considerando-se que os va- lores de IC90 foram determinados como estando na faixa de 51,95 ng/mL a 311,38 ng/mL.

Exemplo 5

ELISA em Célula de CCR5 20.000 células CHO expressando CCR5 recombinantemente fo- ram semeadas por placas de 96 cavidades e incubada por toda noite a 37°C. Após isso, o meio foi aspirado e 40 pL de meio fresco foram adiciona- dos. 10 pL do primeiro anticorpo em meio diluído foram adicionados e incu- 5 bados por duas horas a 4°C. O meio foi aspirado, 100 pL de glutardialdeído (c = 0,05% em salmoura tamponada em fosfato (PBS)) foram adicionados e incubados por 10 minutos a temperatura ambiente. Após lavagem três vezes com 200 pL de PBS, 50 pL de anticorpo de detecção (1:1.000 a 1:2.000 dilu- ído em tampão de bloqueio de ELISA) foram adicionados e incubados por 10 duas horas a temperatura ambiente. 50 pL de 3,3',5,5'-tetrametilbenzidina (TMB) foram adicionados e a região foi parada após 7 minutos. A densidade óptica foi medida a 450 nm (versus 620 nm).

Primeiro anticorpo: anticorpo a ser examinado

Segundo anticorpo (de detecção): anticorpo conjugado de pero- xidase especifica de IgG-gama-anti-humano de carneiro (The Binding site cat número AP004) 1:2.000 (6 pl/12 mL) diluído em tampão de bloqueio de PBS a 10%.

Meio: HAM's F-12 ou GIBCO com GlutaMAX®, 10% FCS, 200 pg/mL Higromicina (Roche Diagnostics GmbH, Alemanha)

Bloqueio de ELISA: Roche Diagnostics GmbH, Alemanha, nú-

mero 1112589, solução em água a 10% (volume/volume). 1:10 diluída em PBS

TMB: Roche Diagnostics GmbH, Alemanha, número 1432559, solução para uso.

Resultados:

Os resultados do ELISA em célula de CCR5 mostra que a liga- ção ao CCR5 humano dos anticorpos anti-CCR5 compreendendo as diferen- tes combinações de domínios variáveis de cadeia pesada (SEQ ID NO: 6, 7, 8) e leve (SEQ ID NO:9, 10) está na faixa de 2,71 a 3,13 (OD 450/620) a uma concentração de 1.000 ng/mL.

Exemplo 6

Potencial dos MAbs de CCR5 em se ligarem ao FcyRI IIA nas células NK Para determinar a capacidade dos anticorpos da invenção de se ligarem ao FcYRIIIa (CD16) nas células exterminadoras naturais (NK)1 célu- las mononucleares do sangue periférico (PBMCs) são isoladas e incubadas com 20 Mg/mL de anticorpo e anticorpos de controle na presença ou ausên- 5 cia de 20 pg/mL de anticorpo de bloqueio de camundongo para FcYRIIIa (an- ti-CD16, clone 3G8, RDI1 Flanders, NJ), para verificara ligação via FcYRIIIa. São empregados, como controles negativos, lgG2 e lgG4 humanos (The Binding Site), que não se ligam ao FcYRIIIa. IGgI e lgG3 humanos (The Bin- ding Site) são incluídos como controles positivos para ligação ao FcYRIIIa. 10 Os anticorpos ligados às células NK são detectados por análise FACS usan- do um anticorpo CD56 anti-humano de camundongo marcado com PE (mar- cador de superfície de célula NK) (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, USA) em combinação com um anticorpo IgG(Fc) anti-humano F(ab)2 de ca- bra marcado com FITC (Protos Immunoresearch, Burlingame, USA). Ligação 15 máxima (Bmax) é determinada em uma concentração de anticorpo de 20 pg/mL. Anticorpo de controle (lgG4 humano) mostra até 30% de Bmax em comparação a 100% de Bmax para IgGI humano. Portanto, "nenhuma ligação de FcyRIIIa ou nenhum ADCC" significa uma concentração de anticorpo de 20 pg/mL, um valor de Bmax de até 30% em comparação ao IgGI humano.

Exemplo 7

Ensaio de quimiotaxia de CCR5

Células L1.2hCCR5 foram cultivadas em RPMI 1640 contendo soro fetal bovino a 10%, 1 x penicilina/estreptomicina, 1 x glutamina, 1 x pi- ruvato de sódio, 1 x β-mercaptoetanol e 250 pg/mL de G418 (todos da Invi- 25 trogen Inc., USA). Imediatamente antes de estabelecer o ensaio de quimio- taxia, as células foram rotacionadas e ressuspensas no Tampão de Quimio- taxia (Solução de Salmoura Equilibrada de Hank1S HBSS (Invitrogen) con- tendo BSA a 0,1% e 10 mM de HEPES). As células foram usadas no ensaio de quimiotaxia em uma concentração final de 5 x 106 células/mL. Os Iigantes 30 de CCR5, MIPIa humano, MIP1 β ou RANTES humanos (R&D Systems, USA) foram diluídos no Tampão de Quimiotaxia e usados em uma concen- tração final de 20 nM. Os anticorpos de teste ou os anticorpos de controle de isotipo apropriados foram diluídos em HBSS. O ensaio de quimiotaxia foi estabelecido no sistema ChemoTx® de 96 cavidades com 0,5 μιτι de poro (Neuroprobe Inc., USA). Cada anticorpo foi misturado com um dos Iigantes de CCR5 e 30 μΙ_ dessa mistura foram colocados no fundo da cavidade do 5 sistema ChemoTx®. A tela de filtro foi colocada na parte superior do fundo das cavidades. Cada anticorpo foi misturado com as células L1.2hCCR5 e 20 μι. dessa mistura foram colocadas no filtro. As placas foram então colo- cadas em uma câmara umidificada e incubadas a 37°C e CO2 a 5% por três horas. Após incubação, as células foram raspadas do filtro e as placas foram 10 giradas em uma centrífuga de bancada a 2.000 rpm por 10 minutos. O filtro foi então removido e a densidade das células que haviam migrado para o fundo das cavidades, foi detectada usando kit de ensaio de proliferação Cy- Quant® (Invitrogen) e o leitor de placa Spectra MAX GeminiXS (Molecular Devices, Wokingham, Reino Unido) de acordo com as instruções do fabri- 15 cante. Os valores de IC5o foram calculados usando Prism 4 (GraphPad Inc., USA).

Os valores de IC50 para MIP-Ia humano, MIP-1 β humano e RANTES humano para as diferentes combinações de domínios variáveis de cadeia pesada e domínios variáveis de cadeia leve com uma região constan- te de isotipo IgGI estão na faixa de 0,80 nM a 0,91 nM, de 0,72 nM a 1,08 nM e de 0,85 nM a 2,69 nM, respectivamente.

No caso de um isotipo de IgGI mutado (lgG1v2) os valores de IC50 para MIP-Ia humano, MIP-1 β humano e RANTES humano estão na faixa de 2,21 nM a 6,28 nM, de 2,16 nM a 6,87 nM e de 3,59 nM a 5,03 nM, respectivamente.

Claims (21)

1. Anticorpo que se liga ao CCR5 caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia pesada compreende uma seqüência de amino- ácido da SEQ ID NO: 1 GIn-VaI-GIn-Leu-XOI -X02-Ser-Gly-Pro-Gly-Leu-Val-X03-Pro- Ser-Gln-Ser-Leu-Ser-Ile-Thr-Cys-Thr-Val-Ser-Gly-Phe-Pro-Leu-Gly-Ala-Phe- Gly-Val-His-Trp-Val-Arg-Gln-Ser-Pro-Gly-Lys-Gly-X04-Glu-Trp-Leu-Gly-Val- lle-Trp-Lys-Gly-Gly-Asn-Thr-Asp-Tyr-Asn-Ala-Ala-Phe-X05-Ser-Arg-Leu-Arg- Ile-Thr-Lys-Asp-Asn-Ser-Lys-Ser-Gln-Val-Phe-Phe-Arg-Met-Asn-Ser-Leu- Gln-Thr-Asp-Asp-Thr-Ala-X06-Tyr-Tyr-Cys-Ala-Lys-Val-Asn-Leu-Ala-Asp- Ala-Met-Asp-Tyr-Trp-Gly-Gln-Gly-Thr-X07-Val-X08-Val-Ser-Ser, em que X01 é Lys ou Gln1 X02 é Gln ou Glu1 X03 é Arg ou Lys, X04 é Leu ou Pro, X05 é Met ou Lys, X06 é Ile ou Thr, X07 é Ser ou Thr, X08 é Ile ou Thr.

2. Anticorpo que se liga ao CCR5 de acordo com a reivindicação 1,caracterizado pelo fato de que o domínio variável de cadeia leve compre- ende uma seqüência de aminoácido da SEQ ID NO: 2 Asp-Ile-Gln-Met-Thr-Gln-Ser-Pro-Ala-Ser-Leu-Ser-Ala-Ser-Val- Gly-Glu-Thr-Val-Thr-Ile-Thr-Cys-Arg-Ala-Ser-Gly-Asn-XIO-His-GIy-Tyr-Leu- Ala-Trp-Xl 1 -GIn-GIn-Lys-XI 2-Gly-Lys-X13-Pro-X14-Leu-Leu-X15-Tyr-Asn- Thr-Lys-Thr-Leu-Ala-Glu-Gly-Val-Pro-Ser-Arg-Phe-Ser-Gly-Ser-Gly-Ser-Gly- Thr-Xl 6-Phe-X17-X18-X19-lle-X20-Ser-X21 -Gln-Pro-Glu-Asp-Phe-X22-X23- Tyr-Tyr-Cys-Gln-His-His-Tyr-Asp-Leu-Pro-Arg-Thr-Phe-Gly-Gly-Gly-Thr-Lys- X24-Glu-lle-Lys, em que X10 é Ile ou Ala, X11 é Phe ou Tyr, X12 é Gln ou Pro, X13 é Serou Ala, X14 é Gln ou Lys, X15 é Val ou lie, X16 é Gln ou Asp, X17 é Ser ou Thr, X18 é Leu ou Ala, X19 é Lys ou Thr, X20 é Asn ou Ser, X21 é Leu ou Ala, X22 é Gly ou Ala, X23 é Asn ou Thr, X24 é Leu ou Vai.

3. Anticorpo que se liga ao CCR5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo compreende um domínio variável de cadeia pesada selecionado dos domí- nios variáveis de cadeia pesada da SEQ ID NO: 6, 7 ou 8 ou um fragmento de ligação de CCR5 dos mesmos.

4. Anticorpo que se liga ao CCR5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo compreende um domínio variável de cadeia leve selecionado dos domínios variáveis de cadeia leve da SEQ ID NO: 9 ou 10, ou um fragmento de liga- ção de CCR5 dos mesmos.

5. Anticorpo que se liga ao CCR5 de acordo com a reivindicação 3 ou 4, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo compreende um do- mínio variável de cadeia pesada selecionado da SEQ ID NO: 6, 7 ou 8, ou um fragmento de ligação de CCR5 do mesmo e compreendendo um domínio variável de cadeia leve selecionado da SEQ ID NO: 9 ou 10, ou um fragmen- to de ligação de CCR5 do mesmo, onde os ditos domínios variáveis de ca- deia pesada e leve são selecionados de modo independente.

6. Anticorpo que se liga ao CCR5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 5, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo compreende regiões constantes de origem humana.

7. Anticorpo que se liga ao CCR5 de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que a dita região constante de cadeia pesada é do isotipo lgG4 humano ou é do isotipo IgGI humano modificado na região de articulação na posição 216-240 do aminoácido entre Cr1 e Ch2, e/ou na segunda região de interdomínio na posição 327-331 do aminoácido entre Ch2 e Ch3.

8. Anticorpo que se liga ao CCR5 de acordo com a reivindicação 6, caracterizado pelo fato de que o dito anticorpo compreende uma região constante de cadeia pesada da SEQ ID NO: 3 ou 4 e compreende uma regi- ão constante de cadeia leve da SEQ ID NO: 5.

9. Anticorpo que se liga ao CCR5 de acordo com qualquer uma das reivindicações 6 a 8, caracterizado pelo fato de que o anticorpo é do iso- tipo IgGI humano e compreende as mutações L234A e L235A ou o anticor- po é do isotipo lgG4 humano compreendendo a mutação S228P.

10. Composição farmacêutica compreendendo um anticorpo como definido na reivindicação 1 ou 2, em uma quantidade farmacêutica- mente eficaz.

11. Método para a fabricação de uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um anticorpo como definido na reivindicação 1 ou 2.

12. Uso de um anticorpo como definido na reivindicação 1 ou 2, para a fabricação de uma composição farmacêutica.

13. Anticorpo como definido na reivindicação 1 ou 2, para uso como um fármaco.

14. Anticorpo como definido na reivindicação 1 ou 2, para uso no tratamento de uma doença imunossupressora.

15.Uso de um anticorpo como definido na reivindicação 1 ou 2, para a fabricação de um fármaco para o tratamento de uma doença imunos- supressora.

16. Método para o tratamento de um paciente que sofre de uma doença imunossupressora, caracterizado pela administração ao paciente de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um anticorpo, como definido na reivindicação 1 ou 2.

17. Ácido nucleico codificando um polipeptídeo capaz de se re- unir com um segundo polipeptídeo, pelo que dito segundo polipeptídeo com- preende um polipeptídeo selecionado do grupo de polipeptídeos das SEQ ID NOs: 2, 5 e pelo que dito polipeptídeo compreende uma seqüência de ami- noácido da SEQ ID NO: 1, 6, 7 ou 8.

18. Ácido nucleico codificando uma cadeia de um anticorpo que se liga ao CCR5, caracterizado pelo fato de que a dita cadeia codificada é capaz de se reunir com outra respectiva cadeia de anticorpo, resultando em uma molécula de anticorpo se ligando ao CCR5 como definido na reivindica- ção 1 ou 2.

19. Ácido nucleico codificando um anticorpo que se liga ao C- CR5 como definido na reivindicação 1 ou 2.

20. Célula eucariótica compreendendo um ácido nucleico de a- cordo com a reivindicação 19.

21. Método para a produção de um anticorpo recombinante hu- mano ou anticorpo humanizado como definido na reivindicação 1 ou 2, ca- racterizado pelo fato de que um ácido nucleico de acordo com a reivindica- ção 19 é expresso em uma célula hospedeira procariótica ou eucariótica e o dito anticorpo recombinante é recuperado da dita célula ou do sobrenadante de cultura da célula.