ES2433916T3 - Anticuerpos anti-OX40L - Google Patents

Abstract

Anticuerpo de unión a OX40L humano, caracterizado porque el anticuerpo comprende CDR de entre las CDR de cadena ligera (VL) de secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1 y las CDR variables de cadena pesada (VH) de SEC ID nº 2.

Description

Anticuerpos anti-OX40L

La presente invención se refiere de manera general a anticuerpos anti-OX40L y, en particular, a anticuerpos anti-OX40L que no se unen al factor del complemento C1q, y a composiciones farmacéuticas y usos de los mismos. Preferentemente, dichos anticuerpos son anticuerpos humanos o humanizados.

OX40L humano (gp34, SwissProt nº P23510) se expresa sobre células B activadas y células dendríticas tras la unión de CD40/CD40L, y sobre células endoteliales en tejidos inflamatorios (Revisión: Weinberg A.D., Trends Immunol. 23:102-109, 2002). Se ha aislado en primer lugar a partir de células leucémicas humanas infectadas por VLTH-1 (inmortalización de estas células T mediante la generación de un bucle autocrino con OX40). Se menciona OX40L y los anticuerpos contra el mismo en, por ejemplo, los documentos WO nº 95/12673, nº 95/21915, nº 99/15200; Baum

P.R.

et al., EMBO J. 13:3992-4001, 1994; Imura A. et al., Blood 89:2951-2958, 1997; Imura A. et al., J. Exp. Med. 183:2185-2195, 1996; Kjaergaard J. et al., J. Immunol. 167:6669-6677, 2001; Lane P., J. Exp. Med. 191:201-206, 2000; Mallett S. y Barclay A.N., Immunol. Today 12:220-223, 1991; Mallett S., et al., EMBO J. 9:1063-1068, 1990; Ndhlovu L.C. et al., J. Immunol. 167:2991-2999, 2001; Ohshima Y. et al., J. Immunol. 159:3838-3848, 1997; Rogers

P.R.

et al., Immunity 15:445-455, 2001; Stüber E. y Strober W., J. Exp. Med. 183:979-989, 1996; Stüber E. et al., Gastroenterology 115:1205-1215, 1998; Takahashi Y. et al., J. Virol. 75:6748-6757, 2001; Takasawa N. et al., Jpn. J. Cancer Res. 92:377-382, 2001; Taylor L. y Schwarz H., J. Immunol. Meth. 255:67-72, 2001; Weinberg A.D. et al., Nature Medicine 2:183-189, 1996; Weinberg A.D. et al., Semin. lmmunol. 10:471-480, 1998; Weinberg A.D., Trends Immunol. 23:102-109, 2002; Wu T. et al. , Transplant. Proc. 33:217-218, 2001; Higgins L.M. et al. , J. Immunol. 162:486-493, 1999; y Yoshioka T. et al., Eur. J. Immunol. 30:2815-2823, 2000. OX40L humano es el ligando para OX40 humano (CD134) que se expresa transitoriamente sobre las células T CD4+ activadas. La unión de OX40 a su ligando conduce a una señal de coestimulación para la activación de las células T. Se ha descrito que la interacción OX40/OX40L crea una señal bidireccional (Matsumura Y. et al., J. Immunol. 163:3007-3011, 1999; Kotani A. et al., Immunol. Lett. 84:1-7, 2002). Además, la interacción OX40/OX40L media en la adhesión de las células T activadas a las células endoteliales en tejidos inflamatorios. Debido a que OX40L sólo se expresa transitoriamente sobre células B activadas, CD y endoteliales, los anticuerpos de OX40L deberían bloquear selectivamente la activación de las células T y la adhesión de las células endoteliales durante una respuesta inflamatoria, pero sin afectar a las células T periféricas no activadas. Yoshioka A. et al. (Eur. J. Immunol. 30:2815-2823, 2000) han demostrado el potencial terapéutico de un mAb anti-mOX40L neutralizante en un modelo de ratón de la artritis reumatoide. La administración del mismo mejoró drásticamente la severidad de la enfermedad. Este anticuerpo mostró actividades similares en otros modelos de enfermedad relacionados, por ejemplo, en la enfermedad inflamatoria de la piel, la enfermedad autoinmunológica experimental (EAE), la EICH, la enfermedad intestinal inflamatoria murina (Yoshioka A. et al., Eur.

J.

Immunol. 30:2815-2823, 1999; Salek-Ardakani S. et al., J. Exp. Med. 198:315-324, 2003; Burgess J.K. et al., J. Allergy Clin. Immunol. 113:683-689, 2004; Hoshino A. et al., Eur. J. Immunol. 33:861-869, 2003; Arestides R.S. et al., Eur. J. Immunol. 32:2874-2880, 2002; Nohara C. et al., J. Immunol. 166:2108-2115, 2001; Weinberg A.D. et al., J. Immunol. 162:1818-1826, 1999; Higgins L.M. et al., J. Immunol. 162:486-493, 1999; Humphreys I.R. et al., J. Exp. Med. 198:1237-1242, 2003; Akiba H. et al., J. Exp. Med. 191:375-380, 2000; Ishii N. et al., Eur. J. Immunol. 33:23722381, 2003; Blazar B.R. et al., Blood 101:3741-3748, 2003; Tsukada N. et al., Blood 95:2434-2439, 2000; Akiba H. et al., Biochem. Biophys. Res. Commun. 251:131-136, 1998.

Los anticuerpos contra OX40L han sido investigados por sus efectos antiinflamatorios en diversos modelos de enfermedad (Sugamura K. et al., Nat. Rev. Immunol. 4:420-431, 2004).

Tanaka Y. et al, Int. J. Cancer 36:549-555, 1985; Tozawa H. et al., Int. J. Cancer 41:231-238, 1988; y Miura S. et al., Mol. Cell. Biol. 11:1313-1325, 1991, describen anticuerpos monoclonales de ratón denominados TARM-34 y TAG34 que reaccionan con antígenos de superficie de líneas de linfocitos humanos que portan un virus de tipo I de la leucemia de células T humanas (VLTH1). El anticuerpo TAG-34 se encuentra disponible comercialmente de MBL International Corporation. TAG-34 se une también a OX40L.

Descripción resumida de la invención

La invención se refiere a un anticuerpo, preferentemente a un anticuerpo monoclonal, caracterizado porque dicho anticuerpo se une a OX40L, contiene una parte Fc de origen humano y no se une al factor del complemento humano C1q y/o al receptor de Fcy humano sobre las células NK.

La invención se refiere además a un anticuerpo, preferentemente a un anticuerpo monoclonal, caracterizado porque dicho anticuerpo contiene una parte Fc de origen humano, se une a OX40L y a OX40L desnaturalizado (en una transferencia western) a una concentración de anticuerpos de 100 ng. Dicho anticuerpo se une al mismo epítopo del polipéptido OX40L que el epítopo al que se une el anticuerpo monoclonal LC.001. Dichos anticuerpos son, por ejemplo, LC.001, LC.033 y LC.060. Estos anticuerpos son preferentemente de tipo IgG1 humano (tipo salvaje) o no

se unen al factor del complemento C1q humano y/o al receptor de Fcy humano sobre las células NK.

Se da a conocer además en la presente memoria un anticuerpo que se une a OX40L caracterizado porque comprende una cadena ligera variable y una cadena pesada variable, caracterizado porque la cadena pesada variable comprende CDR1, CDR2 y CDR3, caracterizado porque CDR3 se selecciona de entre SEC ID nº 33-38. Resulta especialmente preferente que CDR1 se seleccione de entre SEC ID nº 21 y 25, CDR2 se selecciona de entre SEC ID nº 26 y 32, y CDR3 se selecciona de entre SEC ID nº 33 y 38.

Se da a conocer en la presente memoria un anticuerpo caracterizado porque comprende una cadena ligera variable y una cadena pesada variable, caracterizado porque la cadena ligera variable comprende CDR1, CDR2 y CDR3, caracterizado porque CDR3 se selecciona de entre SEC ID nº 51-57. Resulta especialmente preferente que CDR1 se seleccione de entre SEC ID nº 39 y 44, CDR2 se selecciona de entre SEC ID nº 45 y 50, y CDR3 se selecciona de entre SEC ID nº 51 y 57.

Se da a conocer en la presente memoria un anticuerpo caracterizado porque comprende una cadena pesada variable y una cadena ligera variable, caracterizado porque la cadena pesada variable comprende CDR1, CDR2 y CDR3, caracterizado porque CDR3 de la cadena pesada se selecciona de entre SEC ID nº 33 y 38, y CDR3 de la cadena ligera se selecciona de entre SEC ID nº 51 y 57. Resulta especialmente preferente que la cadena pesada variable comprenda CDR1 seleccionado de entre SEC ID nº 21 y 25, CDR2 se selecciona de entre SEC ID nº 26 y 32, y CDR3 se selecciona de entre SEC ID nº 33 y 38, y la cadena ligera variable comprende CDR1 seleccionado de entre SEC ID nº 39 y 44, CDR2 se selecciona de entre SEC ID nº 45 y 50, y CDR3 se selecciona de entre SEC ID nº 51 y 57.

Todas las CDR se seleccionan independientemente unas de otras, aunque de manera que por norma el anticuerpo se una a OX40L. Por lo tanto, las CDR de las cadenas ligeras y pesadas del mismo anticuerpo LC pueden combinarse o las CDR de cadena ligera de LC.001 con las CDR de cadena pesada de LC.001, LC.059 ó LC.063. Las CDR en cada cadena se encuentran separadas por aminoácidos de marco.

El anticuerpo según la invención preferentemente está caracterizado porque el anticuerpo comprende CDR seleccionadas independientemente de entre el grupo que consiste de:

a) las CDR variables de cadena ligera (VL) de secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1 y las CDR variables de cadena pesada (VH) de SEC ID nº 2, o un fragmento de unión a OX40L de las mismas.

El anticuerpo según la invención preferentemente está caracterizado porque dicho anticuerpo comprende una región variable seleccionada independientemente de entre el grupo que consiste de:

a) el dominio variable de cadena ligera (VL) definido por la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1 y el dominio variable de cadena pesada (VH) definido por SEC ID nº 2,

o un fragmento de unión a OX40L de los mismos

El anticuerpo según la invención preferentemente está caracterizado porque la región variable de cadena ligera humana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada independientemente de entre el grupo que consiste de la SEC ID nº 1.

El anticuerpo según la invención preferentemente está caracterizado porque la región variable de cadena pesada humana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada independientemente de entre el grupo que consiste de la SEC ID nº 2.

El anticuerpo según la invención preferentemente está caracterizado porque el anticuerpo comprende el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácidos SEC ID nº y el dominio variable de cadena pesada definido por SEC ID nº 2.

El anticuerpo según la invención preferentemente está caracterizado porque la región constante de cadena pesada humana comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada independientemente de entre el grupo que consiste de la SEC ID nº 14. El anticuerpo según la invención preferentemente está caracterizado porque el anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera K de SEC ID nº 13 ó la región constante de cadena ligera de SEC ID nº 61.

Preferentemente, un anticuerpo según la invención se caracteriza por la unión a OX40L y por ser de la clase IgG1 humana (tipo salvaje) y comprende como la cadena pesada y, la SEC ID nº 58. Resulta especialmente preferente un anticuerpo que comprende como a), la cadena pesada y SEC ID nº 58 y como cadena ligera kappa SEC ID nº 61.

Una realización adicional de la invención es un anticuerpo de unión a OX40L, caracterizado porque es producido por la línea celular hu-mAb<hOX40L>LC.001.

El anticuerpo según la invención preferentemente es un anticuerpo quimérico, humano o humanizado.

El anticuerpo según la invención preferentemente se caracteriza por la unión a OX40L con un valor de KD inferior a 10-8 M (10-12 a 10-8 M), más preferentemente por un intervalo de KD de entre 10-12 y 10-9 M en un ensayo BIAcore.

El anticuerpo según la invención preferentemente inhibe la interacción de OX40L con OX40 en un ELISA utilizando OX40L inmovilizado (preferentemente OX40L biotinilado inmovilizado sobre una superficie con estreptavidina) a una concentración de recubrimiento de 0,5 mg/ml con un valor de IC50 no superior a 4 nM. Más preferentemente el valor de IC50 se encuentra comprendido en el intervalo de entre 1 y 4 nM.

El anticuerpo según la invención preferentemente se caracteriza porque la no unión del anticuerpo al factor de complemento C1q se refiere a una medición en ensayo ELISA en la que la unión máxima (Bmax) del anticuerpo a una concentración de 10 mg/ml a C1q es de 30% o inferior, preferentemente de 20% o inferior en comparación con la Bmax del anticuerpo LC.001.

Preferentemente, el anticuerpo no se une a FcyRI, FcyRIIA y/o FcyRIIIA humanos. Resulta especialmente preferente que el anticuerpo no se une al receptor de Fcy humano sobre las células efectoras NK.

El anticuerpo según la invención preferentemente se caracteriza porque la no unión del anticuerpo al receptor de Fcy sobre las células NK se refiere a un ensayo en el que la unión máxima (Bmax) del anticuerpo a una concentración de 20 mg/ml a las células NK es de 20% o inferior, preferentemente de 10% o inferior en comparación con la Bmax del anticuerpo LC.001.

El anticuerpo según la invención preferentemente se caracteriza porque no se une a FcyRI. Lo anterior significa que el anticuerpo se caracteriza por un valor de EC50 que es cinco veces o más, preferentemente siete veces o más, tal como ocho veces o más, el valor EC50 de LC.001, medido en un ensayo que analiza la unión del anticuerpo a una concentración comprendida entre 0,078 y 10 mg/ml a una célula de linfoma de células B que no presenta FcyRIIA ni FcyIIB, pero que expresa FcyRI recombinante.

El anticuerpo según la invención preferentemente se caracteriza por ser un anticuerpo IgG4 ó un anticuerpo IgG1 que comprende por lo menos una mutación de aminoácido, preferentemente en la parte Fc humana, que causa la no unión al factor del complemento C1q y/o la no unión al receptor de Fcy humano sobre las células NK.

El anticuerpo según la invención preferentemente se caracteriza porque no activa el factor del complemento C3.

El anticuerpo según la invención preferentemente se caracteriza por ser de la subclase IgG4 humana. En una realización preferente adicional de la invención, el anticuerpo se caracteriza por ser de cualquier clase de IgG, siendo preferentemente IgG1 ó IgG4, conteniendo por lo menos una mutación en E233, L234, L235, G236, D270, N297, E318, K320, K322, A327, A330, P331 y/o P329 (numeración según el índice EU). Resultan especialmente preferentes las mutaciones de IgG1 PVA236, L234A/L235A y/o GLPSS331, así como la mutación de IgG4 L235E. Resulta adicionalmente preferente que el anticuerpo de subclase IgG4 contenga la mutación S228P o las mutaciones S228P y L235E (Angal S. et al., Mol. Immunol. 30:105-108, 1993).

Por lo tanto, el anticuerpo según la invención preferentemente es un anticuerpo de subclase IgG1 humana, que contiene una o más mutaciones de entre PVA236, GLPSS331 y/o L234A/L235A (numeración según el índice EU).

Preferentemente, el anticuerpo según la invención se caracteriza por la unión a OX40L, por ser de clase IgG1 que contiene la mutación L234A/L235A y que comprende como cadena pesada y, la SEC ID nº 59.

Resulta especialmente preferente un anticuerpo que comprende como

a) cadena pesada y, SEC ID nº 59, y como cadena ligera kappa, SEC ID nº 61,

Preferentemente, el anticuerpo según la invención se caracteriza por ser de clase IgG4, que contiene la mutación S228P y que comprende como cadena pesada y, la SEC ID nº 60.

Resulta especialmente preferente un anticuerpo que comprende como a) cadena pesada y, SEC ID nº 60, y como cadena ligera kappa, SEC ID nº 61,

El anticuerpo según la invención preferentemente se caracteriza porque no induce citotoxicidad dependiente del complemento (CDC).

El anticuerpo según la invención preferentemente se caracteriza preferentemente porque no induce citotoxicidad celular dependiente del complemento (ADCC).

Por lo tanto, la invención comprende anticuerpos anti-OX40L o cadenas pesadas o ligeras individuales caracterizadas por sus CDR, regiones variables, secuencias de aminoácidos completas o hibridomas, y que no comprende ninguna parte Fc o ningún tipo de parte Fc, preferentemente Fc de IgG1 humana o Fc de IgG4 humana, no modificada de origen humano o modificada con las mutaciones anteriormente indicadas.

Por lo tanto, la invención comprende además anticuerpos, preferentemente anticuerpos monoclonales, caracterizada porque dichos anticuerpos se unen a OX40L, contiene una parte Fc de origen humano y no se une al factor del complemento humano C1q y/o al receptor de Fcy humano sobre las células NK, siendo de tipo IgG4 humano o de tipo IgG1 humano o tipo IgG4 humano, ambos modificados con las mutaciones anteriormente indicadas.

Por lo tanto, la invención comprende además anticuerpos, preferentemente anticuerpos monoclonales, caracterizado porque dichos anticuerpos se unen a OX40L y a OX40L desnaturalizado (en una transferencia western) a una concentración de anticuerpo de 100 ng. Dicho anticuerpo se une al mismo epítopo del polipéptido OX40L que el epítopo al que se une el anticuerpo monoclonal LC.001. Los anticuerpos no comprenden ninguna parte Fc ni cualquier tipo de parte Fc, preferentemente IgG1 humana o IgG4 humana, de tipo salvaje o modificada con las mutaciones anteriormente indicadas.

Los anticuerpos según la invención presentan nuevas e inventivas propiedades que causan un beneficio para el paciente que necesita una terapia con anticuerpos contra OX40L, especialmente para un paciente que sufre trastornos inflamatorios, especialmente artritis reumatoide, asma alérgica y EICH durante el trasplante (ver también Sugamura K. et al., Nat. Rev. Immunol. 4:420-431, 2004).

Una realización adicional de la invención es una molécula de ácidos nucleicos codificante de una molécula de anticuerpo, una cadena variable o un dominio CDR de la misma según la invención.

En una realización preferente de la invención, el anticuerpo es un Fab, F(ab')2 o un fragmento de cadena sencilla.

Una realización adicional de la invención es un vector que comprende la molécula de ácidos nucleicos según la invención.

Una realización adicional de la invención es una célula huésped que comprende el vector según la invención.

Una realización adicional de la invención es un método para la preparación de un anticuerpo según la invención, que comprende cultivar la célula huésped según la invención bajo condiciones que permitan la síntesis de dicha molécula de anticuerpo y la recuperación de dicha molécula de anticuerpo a partir de dicho cultivo.

Una realización adicional de la invención es una composición, preferentemente una composición farmacéutica o diagnóstica del anticuerpo según la invención.

Una realización adicional de la invención es una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según la invención y por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

Una realización adicional de la invención es un método para el tratamiento de un paciente que necesita terapia, caracterizada por la administración en el paciente de una cantidad terapéuticamente eficaz de un anticuerpo según la invención.

Una realización adicional de la invención es la utilización de un anticuerpo según la invención para la terapia, preferentemente para el tratamiento de enfermedades inflamatorias, especialmente para el tratamiento y/o la prevención de la artritis reumatoide, el asma y la EICH (enfermedad del injerto contra el huésped).

Una realización adicional de la invención es la utilización de un anticuerpo según la invención para la preparación de un medicamento para la profilaxis y/o tratamiento de enfermedades inflamatorias, preferentemente para el tratamiento de la artritis reumatoide, el asma y la EICH.

Una realización adicional de la invención es un kit diagnóstico que comprende un anticuerpo según la invención, una molécula de ácidos nucleicos según la invención, un vector según la invención o una célula huésped según la invención.

Además, se dan a conocer los ítems siguientes:

1.

Un anticuerpo de unión a OX40L, caracterizado porque el anticuerpo comprende CDR de la cadena ligera (VL), CDR variables de secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1 y las CDR de la cadena pesada variable (VH) de SEC ID nº 2.

2.

El anticuerpo según el ítem 1, caracterizado porque comprende el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1 y el dominio variable de cadena pesada definido en SEC ID nº 2.

3.

El anticuerpo según cualquiera de los ítems 1 a 2, caracterizado porque el anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera kappa definido en SEC ID nº 13 ó la región constante de cadena ligera de SEC ID nº

61.

4.

El anticuerpo según cualquiera de los ítems 1 a 3, caracterizado porque el anticuerpo comprende una región constante de cadena pesada definida en SEC ID nº 14 ó SEC ID nº 58, nº 59 ó nº 60.

5.

El anticuerpo según cualquiera de los ítems 1 a 4, caracterizado porque la región constante de cadena ligera kappa se define en SEC ID nº 61, su región constante pesada se define en SEC ID nº 58, nº 59 ó nº 60.

6.

El anticuerpo según el ítem 1, caracterizado porque es producido por la línea celular humAb<hOX40L>LC.001.

7.

El anticuerpo según cualquiera de los ítems 1 a 5, caracterizado porque el anticuerpo es un fragmento Fab, F(ab')2 o un fragmento de cadena sencilla.

8.

Una molécula de ácidos nucleicos codificante de una molécula de anticuerpo según cualquiera de los ítems 1 a 7.

9.

Un vector que comprende la molécula de ácidos nucleicos del ítem 8.

10.

Una célula huésped que comprende el vector del ítem 9.

11.

Un método para la preparación de una molécula de anticuerpos según cualquiera de los ítems 1 a 7, que comprende cultivar la célula huésped del ítem 10 bajo condiciones que permitan la síntesis de dicha molécula de anticuerpos y recuperar dicha molécula de anticuerpo a partir de dicho cultivo.

12.

Una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según cualquiera de los ítems 1 a 7 y por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

13.

Un anticuerpo según se define en cualquiera de los ítems 1 a 7 para la utilización en la profilaxis y el tratamiento de los trastornos inflamatorios.

14.

La utilización de un anticuerpo según se define en cualquiera de los ítems 1 a 7 para la preparación de un medicamento para la profilaxis y el tratamiento de los trastornos inflamatorios.

Descripción detallada de la invención

El término "OX40L" se refiere a una proteína membranal de tipo II perteneciente a la familia de ligandos de TNF. Son otros nombres, receptor ACT-4, CD134L, gp34 ó TNF4_Humano. Presenta un peso molecular de 34 kDa y se encuentra almacenado en SwissProt con el número de acceso P23510.

El término "OX40" se refiere al receptor que se une a OX40L. Es una proteína membranal de tipo I perteneciente a la familia de receptores de TNF. Son otros nombres, ACT4, receptor de OX40L, antígeno CD134, antígeno ACT35 y TNR4_Humano. Presenta un peso molecular de 50 kDa y se encuentra almacenado en SwissProt con el número de acceso P43489.

El término "anticuerpo" comprende las diversas formas de los anticuerpos, preferentemente anticuerpos monoclonales, incluyendo, aunque sin limitarse a ellos, anticuerpos completos,

fragmentos de anticuerpos, anticuerpos humanos, anticuerpos quiméricos, anticuerpos humanizados y anticuerpos genéticamente manipulados (anticuerpos variantes o mutantes), con la condición de que se conserven las propiedades características según la invención. Resultan especialmente preferente los anticuerpos monoclonales humanos o humanizados, especialmente como anticuerpos humanos recombinantes.

Las expresiones “anticuerpo monoclonal” o “composición de anticuerpos monoclonales” tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a una preparación de moléculas de anticuerpo de una única composición de aminoácidos.

La expresión “anticuerpo quimérico” se refiere a un anticuerpo monoclonal que comprende una región variable, es decir una región de unión, de una procedencia o especie y por lo menos una parte de una región constante derivada de una fuente o especie diferente, habitualmente preparada mediante técnicas de ADN recombinante. Los anticuerpos quiméricos que comprenden una región variable murina y una región constante humana resultan preferentes. Otras formas preferentes de “anticuerpos quiméricos” comprendidas dentro de la presente invención son aquéllas en las que la región constante ha sido adicionalmente modificada o cambiada respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades según la invención, especialmente con respecto a la unión de C1q y/o a la unión del receptor de Fc (FcR). Dichos anticuerpos quiméricos también se denominan “anticuerpos de cambio de clase”. Los anticuerpos quiméricos son el producto de genes de inmunoglobulina expresados que comprenden segmentos de ADN codificantes de regiones variables de inmunoglobulina y segmentos de ADN codificantes de regiones constantes de inmunoglobulina. Los métodos para producir anticuerpos quiméricos implican técnicas convencionales de ADN recombinante y de transfección génica son bien conocidas de la técnica Ver, por ejemplo, Morrison S.L. et al. , Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:6851-6855, 1984; patentes US nº 5.202.238 y nº

5.204.244.

La expresión “anticuerpo humanizado” se refiere a anticuerpos en los que el marco o las “regiones determinantes de complementariedad” (CDR) han sido modificadas para que comprendan la CDR de una inmunoglobulina de especificidad diferente de la de la inmunoglobulina parental. En una realización preferente, se injerta una CDR murina en la región marco de un anticuerpo humano para preparar un “anticuerpo humanizado”. Ver, por ejemplo, Riechmann L. et al., Nature 332:323-327, 1988, y Neuberger M.S. et al. , Nature 314:268-270, 1985. Son CDR particularmente preferentes las que representan secuencias que reconocen los antígenos indicados anteriormente para los anticuerpos quiméricos y bifuncionales. Otras formas de “anticuerpos humanizados” comprendidas dentro de la presente invención son aquéllas en las que la región constante ha sido adicionalmente modificada o cambiada respecto a la del anticuerpo original para generar las propiedades según la invención, especialmente con respecto a la unión de C1q y/o a la del receptor de Fc (FcR).

La expresión “anticuerpo humano”, tal como se utiliza en la presente memoria, pretende incluir anticuerpos que presentan regiones variables y constantes derivadas de secuencias de inmunoglobulina de la línea germinal humana. Los anticuerpos humanos son bien conocidos del estado de la técnica (van Dijk, M.A. y van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5:368-374, 2001). También pueden producirse anticuerpos humanos en animales transgénicos (por ejemplo ratones) que sean capaces, tras la inmunización, de producir un repertorio completo o una selección de anticuerpos humanos en ausencia de producción endógena de inmunoglobulinas. La transferencia de la serie de genes de inmunoglobulina de la línea germinal humana en dichos ratones mutantes de línea germinal resultará en la producción de anticuerpos humanos tras el reto de antígeno (ver, por ejemplo, Jakobovits A. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:2551-2555, 1993; Jakobovits A. et al., Nature 362:255-258, 1993; Brueggemann M. et al., Year Immunol. 7:33-40, 1993). También pueden producirse anticuerpos humanos en bibliotecas de expresión fágica (Hoogenboom H.R. y Winter G.J., Mol. Biol. 227:381-388, 1992; Marks J.D. et al., J. Mol. 222:581-597, 1991). Las técnicas de Cole et al. y de Boerner et al. también se encuentran disponibles para la preparación de anticuerpos monoclonales humanos (Cole et al., Monoclonal Antibodies and Cancer Therapy, Alan R. Liss, página 77, 1985; y Boerner P. et al. , J. Immunol. 147:86-95, 1991). Tal como ya se ha indicado para los anticuerpos quiméricos y humanizados según la invención, la expresión “anticuerpo humano” tal como se utiliza en la presente memoria también comprende los anticuerpos que se han modificado en la región constante para generar las propiedades según la invención, especialmente con respecto a la unión de C1q y/o la unión de FcR, por ejemplo mediante “intercambio de clase”, es decir, el cambio o mutación de partes Fc (por ejemplo de IgG1 a IgG4 y/o la mutación IgG1/IgG4). Además, la invención comprende anticuerpos monoclonales humanos contra OX40L que se unen a C1q y/o a FcR. Dichos anticuerpos humanos se caracterizan por una elevada selectividad para OX40L humano vs. OX40L de ratón (>30 veces menos unión a OX40L de ratón que a OX40L humano) y no muestran unión no específica a TNFa o a CD40L hasta una concentración de 500 nM. Dichos anticuerpos resultan útiles para la generación de anticuerpos que no se unen a C1q y/o a FcR.

La expresión “anticuerpo humano recombinante”, tal como se utiliza en la presente memoria, pretende incluir todos los anticuerpos humanos que se preparan, se expresan, se crean o se aíslan por medios recombinantes, tales como anticuerpos aislados a partir de una célula huésped, tal como una célula NS0 o CHO, o de un animal (por ejemplo un ratón) que es transgénico para genes de inmunoglobulina humana o para anticuerpos expresados utilizando un vector de expresión recombinante transfectado en una célula huésped. Dichos anticuerpos recombinantes humanos presentan regiones variables y constantes en una forma reorganizada. Los anticuerpos recombinantes humanos según la invención han sido sometidos a hipermutación somática in vivo . De esta manera, las secuencias de aminoácidos de las regiones VH y VL de los anticuerpos recombinantes son secuencias que, aunque derivadas y relacionadas con secuencias VH y VL de la línea germinal humana, pueden no existir naturalmente en el repertorio in vivo de anticuerpos de la línea germinal humana.

La expresión “región variable” (región variable de una cadena ligera (VL), región variable de una cadena pesada (VH)) tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a cada uno de la pareja de cadena ligera y cadena pesada que participa directamente en la unión del anticuerpo con el antígeno. Los dominios de cadenas ligera y pesada variables presentan la misma estructura general y cada dominio comprende cuatro regiones marco (FR) cuyas secuencias se encuentran ampliamente conservadas, conectadas mediante tres “regiones hipervariables” (o regiones determinantes de complementariedad, CDR). Las regiones marco adoptan una conformación de láminas � y las CDR pueden formar bucles que conectan la estructura de láminas �. Las CDR en cada cadena son mantenidas en su estructura tridimensional por las regiones de marco y forman conjuntamente con las CDR de la otra cadena el sitio de unión de antígeno. Las regiones CDR3 de las cadenas pesada y ligera del anticuerpo desempeñan un papel particularmente importante en la especificidad/afinidad de los anticuerpos según la invención y por lo tanto proporcionan un objetivo adicional de la invención.

Las expresiones "región hipervariable" o “parte de unión a antígeno del anticuerpo” tal como se utilizan en la presente memoria se refieren a los residuos aminoácidos de un anticuerpo que son responsables de la unión al antígeno. La región hipervariable comprende residuos aminoácidos de las "regiones determinantes de complementariedad" o "CDR". Las regiones “de marco” o “FR” son aquellas regiones de dominio variable diferentes de los residuos de la región hipervariable tal como se definen en la presente memoria. Por lo tanto, las cadenas ligera y pesada de un anticuerpo comprenden, de extremo N-terminal a extremo C-terminal, los dominios FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3 y FR4. Las CDR en cada cadena se encuentran separadas por aminoácidos de marco. Especialmente, la CDR3 de la cadena pesada es la región que contribuye más a la unión de antígeno. Las regiones CDR y FR se determinan según la definición estándar de Kabat et al. , Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991.

Las expresiones “ácido nucleico o molécula de ácido nucleico”, tal como se utilizan en la presente memoria, pretenden incluir moléculas de ADN y moléculas de ARN. Una molécula de ácidos nucleicos puede ser monocatenaria o bicatenaria, pero preferentemente es de ADN bicatenario.

Un ácido nucleico se encuentra “operablemente ligado” en el caso de que se sitúe en una relación funcional con otra secuencia de ácidos nucleicos. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder secretorio se encuentra operablemente ligado a ADN para un polipéptido en el caso de que se exprese como preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que afecte a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión ribosómica se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que se sitúe de manera que facilite la traducción. Generalmente, “operablemente ligado” se refiere a que las secuencias de ADN que e ligan son contiguas, y, en el caso de un líder secretorio, son contiguos y se encuentran en el mismo marco de lectura. Sin embargo, los intensificadores no son necesariamente contiguos. La unión se lleva a cabo mediante ligación en sitios de restricción apropiados. En el caso de que dichos sitios no existan, se utilizan adaptadores oligonucleótidos sintéticos o línker según la práctica convencional.

Tal como se utilizan en la presente memoria, las expresiones “célula”, “línea celular” y “cultivo celular” se utilizan intercambiablemente y la totalidad de dichas expresiones incluye la progenie. De esta manera, las expresiones “transformantes” y “células transformadas” incluyen la célula sujeto primaria y los cultivos derivados de la misma, con independencia del número de transferencias. También debe interpretarse que toda la progenie puede no ser exactamente idéntica en su contenido de ADN, debido a mutaciones deliberadas o naturales. Se encuentra incluida la progenie variante que presenta la misma función o actividad biológica según el cribado realizado en la célula originalmente transformada. Resultará claro a partir del contexto se se pretenden utilizar denominaciones diferenciadas.

Los "dominios constantes" no participan directamente en la unión de un anticuerpo a un antígeno sino que muestran diversas funciones efectoras. Dependiendo de la secuencia de aminoácidos de la región constante de sus cadenas pesadas, los anticuerpos o las inmunoglobulinas se dividen las clases siguientes: IgA, IgD, IgE, IgG e IgM, y algunas de ellas pueden dividirse adicionalmente en subclases (isotipos), por ejemplo IgG1, IgG2, IgG3 e IgG4, IgA1 e IgA2. Las regiones constantes de cadena pesada que corresponden a las diferentes clases de inmunoglobulinas se denominan a, E, y y m, respectivamente. Los anticuerpos según la invención preferentemente son del tipo IgG.

Los anticuerpos según la invención contienen como parte Fc, preferentemente una parte Fc derivada de origen humano y preferentemente todas las demás partes de las regiones constantes humanas. La parte Fc de un anticuerpo participa directamente en la activación del complemento, la unión de C1q, la activación de C3 y la unión del receptor de Fc. Aunque la influencia de un anticuerpo sobre el sistema del complemento depende de determinadas condiciones, la unión a C1q está cauada por sitios de unión definidos en la parte Fc. Dichos sitios de unión son conocidos del estado de la técnica y se describen en, por ejemplo, Lukas T.J. et al., J. Immunol. 127:25552560, 1981; Brunhouse R. y Cebra J.J., Mol. Immunol. 16:907-917, 1979; Burton D.R. et al., Nature 288:338-344, 1980; Thommesen J.E. et al., Mol. Immunol. 37:995-1004, 2000; Idusogie E.E. et al., J. Immunol. 164:4178-4184, 2000; Hezareh M. et al., J. Virology 75:12161-12168, 2001; Morgan A. et al., Immunology 86:319-324, 1995 y la patente EP nº 0307434. Dichos sitios de unión son, por ejemplo, L234, L235, D270, N297, E318, K320, K322, P331 y P329 (la numeración es según el índice EU de Kabat, ver posteriormente). Los anticuerpos de las subclases IgG1, IgG2 e IgG3 habitualmente muestran activación del complemento, unión de C1q y activación de C3, mientras que IgG4 no activa el sistema del complemento, no se une a C1q y no activa C3. Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión "parte Fc derivada de origen humano y no se une al factor del complemento humano C1q y/o al receptor humano hFc sobre las células NK" se refiere a una parte Fc que es una parte Fc de un anticuerpo humano de la subclase IgG4 ó una parte Fc de un anticuerpo humano de la subclase IgG1, IgG2 ó IgG3 que se ha modificado de manera que no puede detectarse unión de C1q, activación de C3 y/o unión de FcR tal como se define posteriormente. Una “parte Fc de un anticuerpo” es una expresión bien conocida por el experto en la materia y se define basándose en el corte con papaína de los anticuerpos. Preferentemente, la parte Fc es una parte Fc humana y resulta especialmente preferente de la subclase IgG4 humana, preferentemente mutada en la región bisagra (por ejemplo S228P y/o L235E) o una parte Fc mutada de la subclase IgG1 humana. Resultan más preferentes las partes Fc que comprenden regiones constantes de cadena pesada seleccionadas de entre las regiones mostradas en SEC ID nº 14 y nº 15 ó incluidas en SEC ID nº 58, nº 59, nº 60, SEC ID nº 14 con las mutaciones L234A y L235A o la SEC ID nº 15 con la mutación S228P o las mutaciones S228P y L235E.

La presente invención se refiere a un anticuerpo que se une a OX40L y no se une al factor del complemento C1q, y/o al receptor de Fc. En una realización preferente de la invención, dichos anticuerpos no inducen citotoxicidad dependiente del complemento (CDC) y/o citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Preferentemente, dicho anticuerpo se caracteriza porque se une a OX40L, contiene una parte Fc derivada de origen humano y no se une al factor del complemento C1q. Más preferentemente, dicho anticuerpo es un anticuerpo monoclonal humano o humanizado.

Las funciones efectoras mediadas por la parte Fc de la región Fc de anticuerpo se refieren a funciones efectoras que operan tras la unión de un anticuerpo a un antígeno (estas funciones implican la activación de la cascada del complemento y/o la activación celular por un receptor de Fc).

La función de la cascada del complemento puede evaluarse mediante el ensayo de CH50. Los glóbulos rojos de oveja sensibilizados con anticuerpos anti-glóbulo rojo (EA) se añadieron a suero de ensayo para activar la ruta clásica, resultando en hemólisis. El volumen de suero necesario para lisar el 50% de los glóbulos rojos determina la unidad CH50. La AP-CH50 mide las rutas alternativa y terminal. El procedimiento es similar excepto en que se utilizan glóbulos rojos de conejo. La ruta alternativa resulta activada al añadir el suero de ensayo.

C1q y dos serina proteasas, C1r y C1s, forman el complejo C1, el primer componente de la ruta de citotoxicidad dependiente del complemento (CDC). Para activar la cascada del complemento, C1q se une a por lo menos dos moléculas de IgG1 ó a una molécula de IgM, unidas a la diana antigénica (Ward E.S. y Ghetie V., Ther. Immunol. 2:77-94, 1995). Burton D.R. (Mol. Immunol. 22:161-206, 1985) indicó que la región de cadena pesada que comprendía los residuos aminoácidos 318 a 337 participaba en la fijación del complemento. Duncan A.R. y Winter G. (Nature 332:738-740, 1988) utilizando mutagénesis sitio-dirigida informó de que Glu318, Lys320 y Lys322 forman el sitio de unión a C1q. El papel de los residuos Glu318, Lys320 y Lys322 en la unión de C1q se confirmó a partir de la capacidad de un péptido sintético corto que contenía dichos residuos de inhibir la lisis mediada por el complemento.

La expresión "citotoxicidad dependiente del complemento (CDC)" se refiere a la lisis de células endoteliales humanas que expresan OX40L por el anticuerpo según la invención en presencia del complemento. La CDC se mide preferentemente mediante el tratamiento de las células endoteliales humanas que expresan OX40L con un anticuerpo según la invención en presencia del complemento. Las células preferentemente se marcan con calceína. Se observa CDC en el caso de que el anticuerpo induzca la lisis de 20% o más de las células diana a una concentración de 30 mg/ml. Los inventores han encontrado que, para las propiedades de los anticuerpos según la invención, resulta esencial la unión reducida al factor del complemento C1q en un ensayo ELISA. En dicho ensayo en principio se recubre una placa ELISA con intervalos de concentración del anticuerpo, al que se añade C1q humano purificado o suero humano. La unión de C1q se detecta con un anticuerpo dirigido contra C1q, seguido de un conjugado marcado con peroxidasa. La detección de la unión (Bmax, unión máxima) se mide como la densidad óptica a 405 nm (DO405) para el sustrato de peroxidasa ABTS® (2,2'-azino-di[3-etilbenzotiazolín-6-sulfonato (6)]. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la presente invención se refiere a un anticuerpo caracterizado porque la no unión del anticuerpo al factor de complemento C1q se refiere a una medición en ensayo ELISA en la que la unión máxima (Bmax) de C1q a un anticuerpo según la invención a una concentración de 10 mg/ml del anticuerpo es 20% o menos de la Bmax observada con el anticuerpo LC.001, preferentemente 10% o menos .

Resulta adicionalmente preferente que un anticuerpo según la invención muestre una activación reducida del factor del complemento C3 en un ensayo ELISA. El ensayo se lleva a cabo de la misma manera que el ensayo de C1q. En dicho ensayo en principio una placa de ELISA se recubre con intervalos de concentración del anticuerpo, al que se añade suero humano. La unión de C3 se detecta con un anticuerpo dirigido contra C3 seguido de un conjugado marcado con peroxidasa. La detección de la unión (Bmax, unión máxima) se mide a partir de la densidad óptica a 405 nm (DO405) para el sustrato de peroxidasa ABTS®. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la presente invención se refiere a un anticuerpo, caracterizado porque la no unión del anticuerpo al factor del complemento C3 se refiere a una medición en ensayo ELISA en el que la unión máxima (Bmax) de C3 al anticuerpo a una concentración de 10 mg/ml del anticuerpo es 10% de la Bmax del anticuerpo LC.001, preferentemente 5% o menos.

La expresión “citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC)” se una función mediada por la unión de receptores de Fc y se refiere a la lisis de células diana que expresan OX40L según la invención en presencia de células efectoras. La ADCC se mide preferentemente mediante el tratamiento de una preparación de células eritroides expresantes de OX40L (por ejemplo células K562 que expresan OX40L humano recombinante) con un anticuerpo según la invención en presencia de células efectoras, tales como PBMC recién aisladas (células mononucleares de sangre periférica) o células efectoras purificadas a partir de capas leucocitarias, por ejemplo monocitos o células NK (asesinas naturales). Las células diana se marcan con 51Cr y posteriormente se incuban con los anticuerpos. Las células marcadas se incuban con células efectoras y el sobrenadante se analiza para el 51Cr liberado. Entre los controles se incluyen la incubación de las células endoteliales diana con células efectoras, aunque sin el anticuerpo. La capacidad de los anticuerpos de inducir las etapas iniciales que median en la ADCC fue investigada mediante la medición de su unión a células expresantes de receptores de Fcy, tales como células que expresan recombinantemente FcyRI y/o RcyRIIA o células NK (que expresan esencialmente FcyRIIIA). Preferentemente se mide la unión a FcyR sobre las células NK.

Las funciones efectoras de unión a receptores de Fc pueden encontrarse mediadas por la interacción de la región Fc de un anticuerpo con receptores de Fc (FcR), los cuales son receptores especializados de superficie celular sobre las células hematopoyéticas. Los receptores de Fc pertenecen a la superfamilia de las inmunoglobulinas y se ha demostrado que median tanto en la eliminación de los patógenos recubiertos de anticuerpos mediante fagocitosis de los complejos inmunológicos como en la lisis de los eritrocitos y diversas otras dianas celulares (por ejemplo células tumorales) recubiertas con el anticuerpo correspondiente, mediante citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC). Van de Winkel, J.G., and Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49:511-524, 1991). Los FcR se definen a partir de su especificidad para isotipos de inmunoglobulina; los receptores de Fc para los anticuerpos IgG se denominan FcyR; para IgE, FcER; para IgA, FcaR, etc. La unión de receptores de Fc se describe en, por ejemplo, Ravetch J.V. y Kinet J.P., Annu. Rev. Immunol. 9:457-492, 1991; Capel P.J. et al., Immunomethods 4:25-34, 1994; de Haas M. et al., J. Lab. Clin. Med. 126:330-341, 1995; y Gessner J.E. et al., Ann. Hematol. 76:231-248, 1998.

La reticulación de receptores para el dominio Fc de los anticuerpos IgG (FcyR) induce una amplia diversidad de funciones efectoras, incluyendo la fagocitosis, la citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos y la liberación de mediadores inflamatorios, así como la eliminación de complejos inmunológicos y la regulación de la producción de anticuerpos. En el ser humano se han caracterizado tres clases de FcyR, que son:

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FcyRI (CD64) se une a IgG monomérico con alta afinidad y se expresa sobre macrófagos, monocitos, neutrófilos y eosinófilos. La modificación en IgG de por lo menos uno de entre E233-G236, P238, D265, N297, A327 y P329 reduce la unión a FcyRI. Los residuos IgG2 en las posiciones 233 a 236, sustituidos en IgG1 e IgG4, redujeron la unión a FcyRI en 103 veces y eliminaron la respuesta de monocitos humanos a los glóbulos rojos sensibilizados por anticuerpos (Armour K.L. et al., Eur. J. Immunol. 29:2613-2624, 1999).

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FcyRII (CD32) se une a IgG acomplejado con una afinidad intermedia a baja y se expresa ampliamente. Estos receptores pueden clasificarse en dos tipos importantes: FcyRIIA y FcyRIIB. Se encuentra FcyRIIA sobre muchas células que participan en la eliminación (por ejemplo macrófagos, monocitos y neutrófilos) y aparentemente activa el proceso de eliminación. FcyRIIB aparentemente desempeña un papel en procesos de inhibición y se encuentra sobre las células B, los macrófagos y sobre los mastocitos y eosinófilos. Sobre las células B aparentemente funciona suprimiendo la producción adicional de inmunoglobulinas y el cambio de isotipo a, por ejemplo, la clase IgE. Sobre los macrófagos, FcyRIIB actúa inhibiendo la fagocitosis mediada por FcyRIIA. Sobre los eosinófilos y los mastocitos, la forma b podría ayudar a suprimir la activación de estas células mediante la unión de IgE a su receptor independiente. La unión reducida a FcyRIIA se encuentra, por ejemplo, para la mutación IgG de por lo menos uno de entre E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, R292 y K414.

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FcyRIII (CD16) se une a IgG con una afinidad intermedia a baja y existe en forma de dos tipos. FcyRIIIA se

encuentra sobre las células NK, los macrófagos, los eosinófilos y algunos monocitos y células T y media en la ADCC. FcyRIIIB se expresa a nivel elevado sobre los neutrófilos. La unión reducida a FcyRIIIA se encuentra, por ejemplo, para la mutación de por lo menos uno de entre E233-G236, P238, D265, N297, A327, P329, D270, Q295, A327, S239, E269, Y296, V303, A327, K338 y D376.

El mapeado de los sitios de unión sobre la IgG1 humano para los receptores de Fc, los sitios de mutación anteriormente indicados y los métodos para medir la unión a FcyRI y a FcyRIIA se describen en Shields R.L. et al., JBC 276:6591-6604, 2001.

La expresión "receptor de Fc" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a receptores de activación caracterizados por la presencia de una secuencia ITAM citoplasmática asociada al receptor (ver, por ejemplo, Ravetch J.V. y Bolland S., Annu. Rev. Immunol. 19:275-290, 2001). Dichos receptores son FcyRI, FcyRIIA y FcyRIIIA. Los anticuerpos según la invención preferentemente muestran una unión reducida a receptores de Fcy, preferentemente a FcyIIIA. Preferentemente, la expresión "sin unión a FcyR" se refiere a que a una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml, la unión de un anticuerpo según la invención a células NK es 10% o menos de la unión observada para el anticuerpo LC.001.

Aunque IgG4 muestra una unión reducida a FcR, los anticuerpos de otras subclases de IgG muestran un nivel de unión fuerte. Sin embargo, Pro238, Asp265, Asp270, Asn297 (pérdida del carbohidrato de Fc), Pro329 y 234, 235, 236 y 237 Ile 253, Ser254, Lys288, Thr307, Gln311, Asn434 e His435 son residuos que, en caso de alterarse, también proporcionan un nivel reducido de unión de FcR (Shields R.L. et al., J. Biol. Chem. 276:6591-6604, 2001; Lund, J. et al., FASEB J. 9:115-119, 1995; Morgan, A. et al., Immunology 86:319-324, 1995; patente EP nº 0 307 434). Preferentemente, un anticuerpo según la invención de la subclase IgG1 ó IgG2 comprende la mutación PVA236, GLPSS331 y/o L234A/L235A. Un anticuerpo según la invención de la subclase IgG4 comprende preferentemente la mutación L235E. Son mutaciones de IgG4 adicionalmente preferentes, S228P ó L235E y S228P (ver la Tabla 1).

La expresión "unión a OX40L" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la unión del anticuerpo a OX40L humano en un ensayo BIAcore (Pharmacia Biosensor AB, Uppsala, Suecia). Para confirmarlo adicionalmente, la unión a OX40L también puede determinarse en un ELISA en el que se utiliza OX40L purificado para recubrir las placas de microtitulación, o en un ensayo FACS en el que se une anticuerpo marcado directa o indirectamente a células K562 que expresan OX40L.

En el ensayo BIAcore, el anticuerpo se une a una superficie y se mide la unión de OX40L mediante resonancia de plasmón superficial (SPR). La afinidad de la unión está definida por los términos ka (constante de velocidad para la asociación del anticuerpo con el antígeno), kd (constante de velocidad de disociación) y KD (kd/ka). Los anticuerpos según la invención muestran una KD de 10-8 o menos, preferentemente de entre aproximadamente 10-12 y 10-9 M (ver Ejemplos). De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la presente invención se refiere a un anticuerpo tal como se ha indicado anteriormente, en el que el anticuerpo se une a OX40L con un valor de KD inferior a 10-8 M en un ensayo BIAcore, preferentemente en el que el intervalo de KD es de entre 10-12 y 10-9 M.

En el ELISA de unión específico para OX40L, se utiliza OX40L para recubrir placas de microtitulación y se detecta la unión del anticuerpo a OX40L con un anticuerpo anti-IgG humana conjugado con HRP y las etapas habituales de una ELISA. Los valores de EC50 en dicho ensayo preferentemente se encuentran comprendidos en el intervalo de entre 3 y 8 nM.

La expresión "que inhibe la unión de OX40 a OX40L" tal como se utiliza en la presente memoria se refiere a la unión del anticuerpo indicado en la presente invención a OX40L humano, inhibiendo de esta manera la interacción OX40/OX40L e inhibiendo de esta manera la transducción de señales inducida por OX40L.

Los anticuerpos de la presente invención inhiben la interacción hOX40L/OX40 preferentemente

i) al nivel in vitro mostrado por un ensayo ELISA mediante el bloqueo de la interacción de OX40L inmovilizado biotinilado con OX40 soluble por el anticuerpo a una concentración de recubrimiento (de la fase sólida) de 0,5 mg/ml de OX40L biotinilado con un valor de IC50 comprendido en el intervalo de entre 1 y 4 nM; i) al nivel in vitro mostrado por un ensayo Biacore mediante el bloqueo de la interacción de OX40 inmovilizado con OX40 soluble (10 nM, preferentemente en forma de hOX40L-His) por el anticuerpo a una concentración de anticuerpo de entre 0,78 y 100 nM con un valor de IC50 comprendido en el intervalo de entre 1 y 10 nM. iii) al nivel celular mostrado por un ensayo FACS en el que el anticuerpo bloquea la interacción de las células K562 que expresan OX40L (K562_OX40L) a una densidad de 2x105 células/muestra con OX40 con un valor de IC50 comprendido en el intervalo de entre 4 y 20 nM, iv) mediante un ensayo de transducción de señales de OX40 en el que el anticuerpo bloquea la transducción de señales de OX40 inducida por K562_OX40L en 3x104 células HeLa que expresan OX40 por cada muestra, lo que resulta en un bloqueo de la activación de NFKB con un valor de IC50 comprendido en el intervalo de entre 1 y 5 nM; v) mediante un ensayo de activación de las células T, en el que el anticuerpo bloquea la activación de las células T activada por OX40L por K562_OX40L a una densidad de 1,5x105 células/muestra y a una concentración de PHA de 0,75 mg/ml con un valor de IC50 comprendido en el intervalo de entre 1 y 10 nM, y/o vi) mediante un ensayo de activación de las células T, en el que el anticuerpo bloquea la activación de las células T inducida por OX40L por parte de las células B activadas o las células dendríticas (ensayo del tétanos) a una concentración de anticuerpo de 10 mg/ml, se obtuvo una inhibición de 40% a 60%.

Resultan preferentes los anticuerpos que muestran en un ensayo ELISA la inhibición mediante bloqueo de la interacción de OX40L inmovilizado por OX40 soluble a una concentración de recubrimiento de 0,5 mg/ml de OX40L con un valor de IC50 comprendido en el intervalo de entre 1 y 4 nM.

De acuerdo con lo anteriormente expuesto, una realización preferente adicional de la presente invención se refiere a un anticuerpo, caracterizado porque dicho anticuerpo de esta manera inhibe la interacción OX40/OX40L y de esta manera inhibe la transducción de señales inducida por OX40L.

Resulta adicionalmente preferente que un anticuerpo según la invención no muestre unión no específica a TNF-a y a CD40L hasta una concentración de 500 nM de TNF-a o de CD40L.

Resulta adicionalmente preferente que un anticuerpo según la invención muestre una unión por lo menos 30 veces más baja a OX40L de ratón que a OX40L humano.

Resulta adicionalmente preferente que un anticuerpo según la invención a una concentración de 10 mg/ml no induzca la regulación negativa de la expresión de OX40L sobre las células HUVEC.

En una realización preferente adicional, los anticuerpos de la presente invención se caracterizan porque comprenden una combinación de dominio variable seleccionada independientemente de entre el grupo que consiste de las combinaciones:

a) el dominio variable de cadena ligera del anticuerpo LC.001 definido por la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1 y el dominio variable de cadena pesada del anticuerpo LC.001 definido por SEC ID nº 2,

b) el dominio variable de cadena ligera (VL) definido por la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1 y el dominio variable de cadena pesada (VH) definido por SEC ID nº 17,

c) el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1 y el dominio variable de cadena pesada definido por SEC ID nº 20.

En una realización preferente adicional, los anticuerpos de la presente invención se caracterizan porque comprenden una región constante seleccionada independientemente de entre el grupo que consiste de:

k) la cadena ligera/kappa definida por la secuencia SEC ID nº 13, l) la cadena pesada/gamma del isotipo IgG1 SEC ID nº 14 con una o más mutaciones seleccionadas de entre L234A y L235A, PVA236 ó GLPSS331, m) la cadena pesada/gamma del isotipo IgG4 SEC ID nº 15, n) la cadena pesada/gamma del isotipo IgG4 SEC ID nº 15 con la mutación S228P o las mutaciones S228P y L235E. o) la cadena constante ligera incluida en SEC ID nº 61, 65 ó 69, p) la cadena constante pesada incluida en SEC ID nº 58, 59, 60, 62, 63, 64, 66, 67 ó 68.

Resultan adicionalmente preferentes todas las combinaciones de cada combinación de dominio variable de anticuerpo a) - c) conjuntamente con una cadena gamma l), m), n) o p) y preferentemente con una cadena kappa k) u o). Resultan especialmente preferentes los anticuerpos que comprenden las cadenas variables del anticuerpo LC.001, cada una con cadena kappa definida por la secuencia SEC ID nº 13 ó la cadena constante ligera incluida en SEC ID nº 61, 65 ó 69 y la cadena pesada/gamma de isotipo IgG1 SEC ID nº 14 con las mutaciones L234A y L235A ó la cadena constante pesada incluida en SEC ID nº 59, nº 63 ó nº 67; anticuerpos que comprende las cadenas variables del anticuerpo LC.001, cada una con la cadena kappa definida por la secuencia SEC ID nº 13 ó la cadena constante pesada incluida en SEC ID nº 59, nº 63 ó nº 67 y la cadena pesada/gamma de isotipo IgG4 SEC ID nº 15 ó la cadena constante pesada incluida en SEC ID nº 60, nº 65 ó nº 68, la totalidad de las tres sin mutación S228P; anticuerpos que comprenden las cadenas variables del anticuerpo LC.001, cada una con la cadena kappa definida por la secuencia SEC ID nº 13 ó la cadena constante ligera incluida en SEC ID nº 61, nº 65 ó nº 69 y la cadena pesada/gamma de isotipo IgG4 SEC ID nº 15 con la mutación S228P ó la cadena constante pesada incluida en SEC ID nº 60, nº 64 ó nº 68.

Preferentemente, los anticuerpos comprenden la CDR variable de cadena ligera de secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1 y la CDR variable de cadena pesada o la CDR variable de cadena ligera de secuencia de aminoácidos y la CDR variable de cadena pesada.

Los anticuerpos preferentes se caracterizan porque los anticuerpos son de la subclase IgG4 humana o de otra subclase humana (preferentemente IgG1), comprendiendo por lo menos una mutación de aminoácido causante de la no unión al factor del complemento C1q y/o la pérdida de la unión de FCR. Dichos anticuerpos variantes preferentes comprenden, por ejemplo, la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 14 con las mutaciones L234A y L235A ó la SEC ID nº 15 con o sin mutación S228P.

Los anticuerpos preferentes según la invención son los anticuerpos definidos como IgG1v1 (PHA-236; GLPSS331 especificado por E233P; L234V; L235A; delta G236; A327G; A330S; P331S), IgG1v2 (L234A; L235A) e IgG4v1 (S228P; L235E) e IgG4x (S228P)

La línea celular de hibridoma hu-mAb<hOX40L>LC.001 según la invención se ha depositado, bajo el Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes, en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Alemania, el 27 de julio de 2004 bajo el nº de depósito DSM ACC 2672.

Las líneas celulares de hibridoma hu-mAb<hOX40L>LC.005 (DSM ACC 2685), hu-mAb<hOX40L>LC.010 (DSM ACC 2686), hu-mAb<hOX40L>LC.019, hu-mAb<hOX40L>LC.029 (DSM ACC 2688) y hu-mAb<hOX40L>LC.033 (DSM ACC 2689) según la invención se depositaron, bajo el Tratado de Budapest sobre el reconocimiento internacional del depósito de microorganismos a los fines del procedimiento en materia de patentes, en el Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH (DSMZ), Alemania, el 2 de septiembre de 2004.

Los anticuerpos obtenibles a partir de dichas líneas celulares son realizaciones preferentes de la invención y resultan especialmente útiles como sustancias intermedias para la generación de anticuerpos según la invención que no se unen al factor del complemento C1q y/o que no se unen a receptores de Fcy humano.

Son realizaciones preferentes adicionales de la invención los anticuerpos anti-OX40L aislados que se unen a OX40L y que se unen al mismo epítopo de OX40L.

Una realización adicional de la invención es un método para la producción de un anticuerpo contra OX40L que no se une al factor del complemento humano C1q y/o a receptores de Fcy humanos, caracterizado porque la secuencia de un ácido nucleico codificante de la cadena pesada de un anticuerpo de unión a OX40L con un valor de KD inferior a 10-8 M se modifica de manera que dicho anticuerpo modificado no se una al factor del complemento C1q y/o a receptores de Fcy humano sobre las células NK, insertando dicho ácido nucleico modificado y el ácido nucleico codificante de la cadena ligera de dicho anticuerpo, en un vector de expresión, e insertando este vector en una célula huésped procariótica o eucariótica, expresando la proteína codificada y recuperándola a partir de la célula huésped o del sobrenadante.

Una realización adicional de la invención es un método para la producción de un anticuerpo según la invención que no se une al factor del complemento C1q y/o que no se une al receptor de Fcy humano, caracterizado porque un anticuerpo obtenible a partir de una de dichas líneas celulares se modifica mediante "cambio de clase", es decir, el cambio o mutación de la parte Fc (por ejemplo de IgG1 a IgG4 y/o la mutación IgG1/IgG4), preferentemente definida como IgG1v1 (PVA-236; GLPSS331 especificado por E233P; L234V; L235A; delta G236; A327G; A330S; P331S), IgG1v2 (L234A, L235A) e IgG4v1 (S228P, L235E) e IgG4x (S228P).

En una realización preferente adicional, dichos anticuerpos comprenden además fragmentos de anticuerpo seleccionados de entre el grupo que consiste de Fab, F(ab')2 y fragmentos de cadena sencilla.

Por lo tanto, un anticuerpo anti-OX40L "variante" se refiere en la presente memoria a una molécula que difiere en su secuencia de aminoácidos de una secuencia de aminoácidos de anticuerpo anti-OX40L "parental" en virtud de la adición, deleción y/o sustitución de uno o más residuos aminoácidos en la secuencia del anticuerpo parental. En la realización preferente, la variante comprende una o más sustituciones de aminoácidos en una o más regiones constantes o variables del anticuerpo parental, preferentemente en la región constante. Por ejemplo, la variante puede comprender por lo menos uno, por ejemplo entre aproximadamente uno y aproximadamente diez, y preferentemente entre aproximadamente dos y aproximadamente cinco, sustituciones en una o más regiones variables del anticuerpo parental. Habitualmente, la variante presentará una secuencia de aminoácidos con una identidad de secuencia de aminoácidos de por lo menos 90% respecto a las secuencias de dominio constante y/o variable del anticuerpo parental, más preferentemente de por lo menos 95%, y todavía más preferentemente de por lo menos 99%.

También se da a conocer un método para modificar la secuencia de aminoácidos inicial de una CDR de cadena pesada del anticuerpo parental seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 21 a 38 y/o una CDR de cadena ligera de anticuerpo seleccionada de entre el grupo que consiste de SEC ID nº 44, nº 46 y nº 52, caracterizada porque proporciona un ácido nucleico codificante de dicha secuencia inicial de aminoácidos, modificando dicho ácido nucleico en un aminoácido de la CDR1 de cadena pesada, en 1-2 aminoácidos de la CDR2 de cadena pesada, en 1-2 aminoácidos de la CDR3 de cadena pesada, en 1-3 aminoácidos de la CDR1 de cadena ligera, en 1-3 aminoácidos de la CDR2 de cadena ligera y/o en 1-3 aminoácidos de la CDR3 de cadena ligera, expresándose dicha secuencia de aminoácidos de CDR modificada en una estructura de anticuerpo, midiendo si dicho anticuerpo se une a OX40L con una KD inferior a 10-8 M y seleccionando dicha CDR modificada en el caso de que el anticuerpo se una a OX40L con una KD inferior a 10-8 M. Preferentemente, dichas modificaciones son modificaciones de secuencia conservadoras.

La identidad u homología con respecto a la secuencia se define en la presente memoria como el porcentaje de residuos aminoácidos en la secuencia candidata que son idénticos a los residuos del anticuerpo parental, tras alinear las secuencias e introducir huecos, en caso necesario, para alcanzar el máximo porcentaje de identidad de secuencia. Ninguna de las extensiones, deleciones o inserciones N-terminales, C-terminales o internas en la secuencia del anticuerpo debe interpretarse que afecta a la identidad o a la homología de secuencia. La variante conserva la capacidad de unirse a OX40L humano y preferentemente presenta propiedades que son superiores a las del anticuerpo parental. Por ejemplo, la variante puede presentar menos efectos secundarios durante el tratamiento de la artritis reumatoide y el asma ya que OX40L no sólo se expresa transitoriamente sobre células B, células dendríticas y macrófagos, sino también sobre las células endoteliales (Kotani A. et al., Immunol. Lett. 84:1-7, 2002), células de músculo liso de las vías respiratorias (MSVR) (Burgess J.K., J. Allergy Clin. Immunol 113:683-689, 2004) y células microgliales (Weinberg A.D. et al., J. Immunol. 162:1818-1826, 1999). La unión de los anticuerpos contra OX40L a las células endoteliales, a MSVR y a células microgliales puede resultar en daños celulares; a células endoteliales: fugas vasculares, a células MSVR: destrucción de pulmón; a células microgliales: daños a la microglia.

El anticuerpo "parental" en la presente memoria es uno codificado por una secuencia de aminoácidos utilizada para la preparación de la variante. Preferentemente, el anticuerpo parental presenta una región marco humana y, en caso de encontrarse presente, una o más regiones constantes de anticuerpo humano. Por ejemplo, el anticuerpo parental puede ser un anticuerpo humanizado o un anticuerpo humano, preferentemente del tipo IgG1.

Los anticuerpos según la invención incluyen, además, anticuerpos que presentan “modificaciones conservadoras de la secuencia” (anticuerpos variantes), modificaciones de la secuencia de nucleótidos y de aminoácidos que no afectan o alteran las características anteriormente indicadas del anticuerpo según la invención. Pueden introducirse modificaciones mediante técnicas estándares conocidas de la técnica, tales como la mutagénesis dirigida a sitio y la mutagénesis mediada por PCR. Entre las sustituciones conservadoras de aminoácidos se incluyen aquéllas en las que se sustituye un residuo aminoácido por un residuo aminoácido que presenta una cadena lateral similar. Se han definido en la técnica las familias de residuos aminoácidos que presentan cadenas laterales similares. Entre estas familias se incluyen los aminoácidos con cadenas laterales básicas (por ejemplo lisina, arginina, histidina), cadenas laterales ácidas (por ejemplo ácido aspártico, ácido glutámico), cadenas laterales polares no cargadas (por ejemplo glicina, asparagina, glutamina, serina, treonina, tirosina, cisteína, triptófano), cadenas laterales no polares (por ejemplo alanina, valina, leucina, isoleucina, prolina, fenilalanina, metionina), cadenas laterales beta-ramificadas (por ejemplo treonina, valina, isoleucina) y cadenas laterales aromáticas (por ejemplo tirosina, fenilalanina, triptófano, histidina). De esta manera, un residuo aminoácido no esencial predicho en un anticuerpo anti-OX40L humano puede sustituirse preferentemente por otro residuo aminoácido de la misma familia de cadena lateral.

Pueden llevarse a cabo sustituciones de aminoácidos mediante mutagénesis basándose en el modelaje molecular, tal como describen Riechmann L. et al., Nature 332:323-327, 1988, y Queen C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033, 1989.

La invención comprende además un método para la producción de un anticuerpo, caracterizado porque la secuencia de un primer ácido nucleico codificante de la cadena pesada de un anticuerpo de unión a OX40L con un valor de KD inferior a 10-8 M se modifica de manera que dicho anticuerpo modificado no se una al factor del complemento C1q y/o a receptores de Fcy humano sobre las células NK, insertando dicho primer ácido nucleico modificado y un segundo ácido nucleico codificante de la cadena ligera de dicho anticuerpo, en un vector de expresión, e insertando dicho vector en una célula huésped procariótica o eucariótica, cultivando dicha célula huésped bajo condiciones que permitan la síntesis de dicho anticuerpo y la recuperación del mismo a partir de dicho cultivo.

La invención comprende además un método para la producción de un anticuerpo según la invención y comprende una parte Fc derivada de origen humano, comprendiendo dicho método las etapas de: a) transformar una célula huésped con una primera secuencia de ácidos nucleicos codificante de una cadena ligera de un anticuerpo humano parental según la invención y una segunda secuencia de ADN codificante de una cadena pesada de dicho anticuerpo humano parental, en el que la parte Fc se modifica en que dicha parte Fc no se une al factor del complemento C1q y/o a receptores de Fc, b) expresar dicha primera y segunda secuencias de ADN de manera que se produzcan dichas cadenas pesada y ligera de anticuerpo, y c) recuperar dicho anticuerpo a partir de la célula huésped o del cultivo de células huésped.

La presente invención comprende además moléculas de ácidos nucleicos codificantes de un anticuerpo indicado anteriormente, comprendiendo los vectores correspondientes dichos ácidos nucleicos y la célula huésped correspondiente para dichos vectores. La invención comprende un método para la preparación de los anticuerpos, que comprende cultivar las células huésped correspondientes bajo condiciones que permitan la síntesis de dichas moléculas de anticuerpo y recuperar dichos anticuerpos a partir de dicho cultivo, por ejemplo mediante la expresión de un ácido nucleico codificante de una cadena pesada y un ácido nucleico codificante de una cadena ligera en una célula huésped procariótica o eucariótica y recuperar dicho polipéptido a partir de dicha célula.

Se encuentran contemplados los usos diagnósticos y terapéuticos del anticuerpo. En una aplicación diagnóstica, la invención proporciona un método para determinar la presencia de la proteína OX40L, que comprende exponer una muestra que se sospecha que contiene OX40L al anticuerpo anti-OX40L y determinar la unión del anticuerpo a la muestra. La proteína OX40L puede insertarse en la membrana celular de las células expresantes de OX40L mediante su dominio transmembranal o puede encontrarse en forma de dominio extracelular soluble en líquidos corporales liberados por mecanismos tales como la escisión o la liberación proteolítica. Para este uso, la invención proporciona un kit que comprende el anticuerpo e instrucciones para utilizar el anticuerpo para detectar la proteína OX40L.

Los anticuerpos de la presente invención resultan útiles para la prevención y/o el tratamiento de enfermedades inflamatorias en un mamífero, preferentemente en un paciente que se sospecha que presenta o que sufre dicha enfermedad. Entre dichas enfermedades se incluyen reacciones alérgicas tales como el asma. Otras aplicaciones son el tratamiento de enfermedades autoinmunológicas, incluyendo la artritis reumatoide.

La invención proporciona además un método para tratar un mamífero que sufre de los trastornos inflamatorios anteriormente indicados, especialmente de asma y artritis reumatoide.

Preferentemente, los anticuerpos de la presente invención pueden utilizarse para el tratamiento de asma persistente severa en pacientes cuyos síntomas no son adecuadamente controlados con corticoesteroides inhalados. La población de pacientes incluye adultos y adolescentes (12 años de edad y mayores) con asma persistente severa inadecuadamente controlada. El anticuerpo se administra preferentemente por vía subcutánea una o dos veces al mes. El criterio de valoración principal preferentemente es la reducción de las exacerbaciones agudas. Entre otros criterios de valoración se incluyen el flujo máximo, los síntomas diurnos de asma, las interrupciones del sueño nocturno, la calidad de vida, las visitas a una sala de emergencias, el número de días sin asma, la utilización de agonistas beta-2, la reducción o escalonado de los esteroides y el efecto sobre la hiperrreactividad.

Resulta adicionalmente preferente utilizar los anticuerpos según la invención para la monoterapia o en combinación con metotrexato u otros FAME (fármacos antirreumáticos modificadores de enfermedad) para el tratamiento de adultos con artritis reumatoide activa moderada a severa. Se administra en forma de inyección subcutánea cada 2 ó 4 semanas. Es terapia crónica en pacientes en los que han fracasado uno o más FAME. Entre los criterios de valoración se incluyen la reducción de los signos y síntomas y la inhibición de la progresión del daño estructural en pacientes adultos con artritis reumatoide activa. Prevención de discapacidad, mejora de los signos y síntomas medida siguiendo criterios de la ACR (ACR20 >60%, ACR50> 35%, ACR70 > 15%; índice del American College of Rheumatology; www.rheumatology.com).

Una realización adicional de la invención es la utilización de los anticuerpos según la invención para la preparación de medicamentos destinados al tratamiento de dichas enfermedades.

La invención se refiere además a la utilización de los anticuerpos definidos anteriormente para la preparación de una composición farmacéutica y comprende una composición farmacéutica que contiene un anticuerpo según la invención en una cantidad farmacéuticamente efectiva, opcionalmente con un tampón y/o un adyuvante útil para la formulación de anticuerpos con fines farmacéuticos.

La invención proporciona además composiciones farmacéuticas que comprenden dichos anticuerpos en un portador farmacéuticamente aceptable. En una realización, la composición farmacéutica puede incluirse en un artículo manufacturado o kit.

Los anticuerpos según la invención preferentemente se producen por medios recombinantes. Dichos métodos son ampliamente conocidos del estado de la técnica y comprenden la expresión de proteínas en células procarióticas y eucarióticas con el posterior aislamiento del polipéptido anticuerpo y habitualmente la purificación hasta una pureza farmacéuticamente aceptable. Para la expresión de proteínas, se insertan ácidos nucleicos codificantes de cadenas ligeras y pesadas o fragmentos de las mismas en vectores de expresión mediante métodos estándares. La expresión se lleva a cabo en células huésped procarióticas o eucarióticas apropiadas, tales como células CHO, células NS0, células SP2/0, células HEK293, células COS, levaduras o células de E. coli, y el anticuerpo se recupera de las células (del sobrenadante o de las células tras la lisis).

La producción recombinante de anticuerpos es bien conocida del estado de la técnica y se describe, por ejemplo, en los artículos de revisión de Makrides S.C., Protein Expr. Purif. 17:183-202, 1999; Geisse S. et al., Protein Expr. Purif. 8:271-282, 1996; Kaufman R.J., Mol. Biotechnol. 16:151-161, 2000; Werner R.G. et al. , Arzneimittelforschung 48:870-880, 1998.

Los anticuerpos pueden encontrarse presentes en células completas, en un lisado celular o en una forma parcialmente purificada o sustancialmente pura. Se lleva a cabo la purificación con el fin de eliminar otros componentes celulares u otros contaminantes, por ejemplo otros ácidos nucleicos o proteínas celulares, mediante técnicas estándares, incluyendo el tratamiento alcalino/SDS, la cromatografía de columna y otras bien conocidas de la técnica. Ver Ausubel F. et al. , editor, Current Protocols in Molecular Biology, Greene Publishing and Wiley Interscience, New York, 1987.

La expresión en células NS0 se describe en, por ejemplo, Barnes L.M. et al., Cytotechnology 32:109-123, 2000, y en Barnes, L.M. et al. , Biotech. Bioeng. 73:261-270, 2001. La expresión transitoria se describe en, por ejemplo, Durocher, Y. et al., Nucl. Acids Res. 30:E9, 2002. La clonación de dominios variables se describe en Orlandi, R. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:3833-3837, 1989; Carter, P. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89:4285-4289, 1992, y en Norderhaug, L. et al., J. Immunol. Methods 204:77-87, 1997. Un sistema de expresión transitoria preferente (HEK293) se describe en Schlaeger, E.-J. y Christensen, K., Cytotechnology 30:71-83, 1999, y en Schlaeger, E.-J.,

J. Immunol. Methods 194:191-199, 1996.

Entre las secuencias de control que resultan adecuadas para los procariotas se incluyen, por ejemplo, un promotor, opcionalmente una secuencia de operador, y un sitio de unión ribosómica. Es conocido que las células eucarióticas utilizan promotores, intensificadores y señales de poliadenilación.

Un ácido nucleico se encuentra “operablemente ligado” en el caso de que se sitúe en una relación funcional con otra secuencia de ácido nucleico. Por ejemplo, el ADN de una presecuencia o líder secretorio se encuentra operablemente ligado a ADN para un polipéptido en el caso de que se exprese como preproteína que participa en la secreción del polipéptido; un promotor o intensificador se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que afecte a la transcripción de la secuencia; o un sitio de unión ribosómica se encuentra operablemente ligado a una secuencia codificante en el caso de que se sitúe de manera que facilite la traducción. Generalmente, la expresión “operablemente ligado” se refiere a que las secuencias de ADN que se unen son contiguas y, en el caso de un líder secretorio, contiguas y en el mismo marco de lectura. Sin embargo, los intensificadores no son necesariamente contiguos. La unión se lleva a cabo mediante ligación en sitios de restricción apropiados. En el caso de que dichos sitios no existan, se utilizan adaptadores oligonucleótidos sintéticos o línker según la práctica convencional.

Se preparan convenientemente anticuerpos monoclonales a partir del medio de cultivo mediante procedimientos convencionales de purificación de inmunoglobulinas tales como, por ejemplo, proteína A-sefarosa, cromatografía en hidroxilapatito, electroforesis en gel, diálisis o cromatografía de afinidad. El ADN y ARN codificante de los anticuerpos monoclonales se aísla y se secuencia fácilmente mediante procedimientos convencionales. Las células de hibridoma pueden servir como fuente de dicho ADN y ARN. Tras el aislamiento, el ADN puede insertarse en vectores de expresión, que seguidamente se transfectan en células huésped, tales como células HEK 293, células CHO o células de mieloma que de otra manera no producirían proteína inmunoglobulina, para obtener la síntesis de anticuerpos monoclonales recombinantes en las células huésped.

Las variantes (o mutantes) de la secuencia de aminoácidos de un anticuerpo de OX40L humano se preparan mediante la introducción de cambios nucleótidos apropiados en el ADN del anticuerpo, o mediante síntesis de nucleótidos. Sin embargo, estas modificaciones únicamente pueden llevarse a cabo bajo condiciones muy limitadas, por ejemplo tal como se ha indicado anteriormente. Por ejemplo, las modificaciones no alteran las características anteriormente indicadas del anticuerpo, tales como el isotipo de IgG y la unión de epítopos, pero pueden mejorar el rendimiento de la producción recombinante, la estabilidad de la proteína o facilitar la purificación.

También puede sustituirse cualquier residuo cisteína no implicado en el mantenimiento de la conformación correcta del anticuerpo anti-OX40L, generalmente con serina, para mejorar la estabilidad oxidativa de la molécula y evitar entrecruzamientos aberrantes. A la inversa, pueden añadirse uno o más enlaces de cisteína al anticuerpo para mejorar su estabilidad (particularmente en el caso de que el anticuerpo sea un fragmento de anticuerpo, tal como un fragmento Fv).

Las moléculas de ácido nucleico codificantes de variantes de secuencia de aminoácidos del anticuerpo anti-OX40L se preparan mediante una diversidad de métodos conocidos de la técnica. Entre estos métodos se incluyen, aunque sin limitarse a ellos, el aislamiento a partir de una fuente natural (en el caso de las variantes de secuencia de aminoácidos naturales) o la preparación mediante mutágenesis mediada por oligonucleótidos (o dirigida a sitio), la mutagénesis mediante PCR y la mutagénesis por inserción de casete de una variante previamente preparada o de una versión no variante de anticuerpo anti-OX40L humanizado.

La invención se refiere además a inmunoconjugados que comprenden el anticuerpo según la invención conjugado con un agente citotóxico, tal como un agente quimioterapéutico, toxina (por ejemplo una toxina enzimáticamente activa de origen bacteriano, fúngico, vegetal o animal, o fragmentos de la misma), un isótopo radioactivo (por ejemplo un conjugado radioactivo). Los conjugados de anticuerpo y agente citotóxico se preparan utilizando una diversidad de agentes de acoplamiento de proteína bifuncional, tales como propionato de N-succinimidil-3-(2piridilditiol) (SPDP), iminotiolano (IT), derivados bifuncionales de imidoésteres (tales como HCl de adipimidato de dimetilo), ésteres activos (tales como suberato de disuccinimidilo), aldehídos (tales como glutaraldehído), compuestos bis-azido (tales como bis(p-azidobenzoil)hexanodiamina), derivados bis-diazonio (tales como bis-(pdiazoniobenzoil)-etilendiatnina), diisocianatos (tales como 2,6-diisocianato de tolieno) y compuestos de flúor bisactivos (tales como 1,5-difluoro-2,4-dinitrobenceno). Por ejemplo, puede prepararse una inmunotoxina de ricina tal como se describe en Vitetta E.S. et al., Science 238:1098-1104, 1987. El ácido 1-isotiocianatobencil-3-metildietiléntriaminapentaacético marcado (MX-DT-PA) marcado con carbono-14 es un agente quelante ejemplar para la conjugación de radionucleótido con el anticuerpo. Ver el documento WO nº 94/11026.

Otro tipo de modificación covalente del anticuerpo comprende unir el anticuerpo a uno de entre una diversidad de polímeros no proteicos, por ejemplo polietilenglicol, polipropilenglicol o polioxialquilenos, de la manera indicada en las patentes US nº 4.640.835, 4.496.689, 4.301.144, 4.670.417, 4.791.192 ó 4.179.337.

En todavía otro aspecto, la invención proporciona células B aisladas de un animal no humano transgénico, por ejemplo de un ratón transgénico, que expresa los anticuerpos anti-OX40L humanos (por ejemplo los anticuerpos parentales producidos por una línea celular seleccionada de entre el grupo que consiste de células de hibridoma productoras de anticuerpos según la invención). Preferentemente, las células B aisladas se obtienen de un animal no humano transgénico, por ejemplo de un ratón transgénico, que ha sido inmunizado con una forma purificada o recombinante de antígeno OX40L y/o células que expresan OX40L. Preferentemente, el animal no humano transgénico, por ejemplo un ratón transgénico, presenta un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera humana codificante de la totalidad o de una parte de un anticuerpo de la invención. Las células B aisladas seguidamente se inmortalizan para proporcionar una fuente (por ejemplo un hibridoma) de anticuerpos anti-OX40L humanos. De acuerdo con lo anteriormente expuesto, la presente invención proporciona además un hibridoma capaz de producir anticuerpos monoclonales humanos según la invención. En una realización, el hibridoma incluye una célula B obtenida de un animal no humano transgénico, por ejemplo de un ratón transgénico, que presenta un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera humana codificantes de la totalidad o de una parte de un anticuerpo de la invención, fusionados con una célula inmortalizada.

En una realización particular, el animal no humano transgénico es un ratón transgénico que presenta un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera humana codificante de la totalidad o de una parte de un anticuerpo de la invención. El animal no humano transgénico puede inmunizarse con una preparación purificada o enriquecida de antígeno OX40L y/o células que expresan OX40L. Preferentemente, el animal no humano transgénico, por ejemplo el ratón transgénico, es capaz de producir isotipos de anticuerpos monoclonales humanos contra OX40L.

Los anticuerpos monoclonales humanos según la invención pueden producirse mediante la inmunización de un animal no humano transgénico, por ejemplo un ratón transgéncio, que presenta un genoma que comprende un transgén de cadena pesada humana y un transgén de cadena ligera humana codificantes de la totalidad o de una parte de un anticuerpo de la invención, con una preparación purificada o enriquecida en antígeno OX40L y/o en células que expresan OX40L. A continuación, se obtienen las células B (por ejemplo las células B esplénicas) del animal y se fusionan con células de mieloma para formar células de hibridoma inmortales que secretan anticuerpos monoclonales humano contra OX40L.

En una realización preferente, pueden generarse anticuerpos monoclonales humanos dirigidos contra OX40L utilizando ratones transgénicos portadores de partes del sistema inmunológico humano en lugar del sistema de ratón. Estos ratones transgénicos, denominados en la presente memoria ratones "HumAb", contienen miniloci génicos de inmunoglobulina humana que codifican genes no reorganizados de inmunoglobulina humana que incluyen la cadena pesada (m y y) y ligera K (genes de región constante), conjuntamente con mutaciones dirigidas que inactivan la K endógena y los loci de cadena K (Lonberg N. et al., Nature 368:856-859, 1994). De acuerdo con lo anteriormente expuesto, los ratones muestran una expresión reducida de IgM o K de ratón, y en respuesta a la inmunización, los transgenes de cadenas pesada y ligera humanas introducidas experimentan cambio de clase y mutación somática, generando anticuerpos monoclonales IgG humanos de elevada afinidad (Lonberg, N., et al. , Nature 368:856-859, 1994; revisión en Lonberg, N., Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101, 1994; Lonberg, N., and Huszar, D., Intern. Rev. Immunol. 25:65-93, 1995, y Harding, F. y Lonberg, N., Ann. N. Acad. Sci. 764:536-546, 1995). La preparación de los ratones HumAb se describe en Taylor L. et al. , Nucleic Acids Res. 20:6287-6295, 1992; Chen J. et al., Int. Immunol. 5:647-656, 1993; Tuaillon N. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:3720-3724, 1993; Choi T.K. et al. , Nat. Genet. 4:117-123, 1993; Chen J. et al., EMBO J. 12:821-830, 1993; Tuaillon N. et al. , J. Immunol. 152:2912-2920, 1994; Lonberg N. et al. , Nature 368:856-859, 1994; Lonberg N., Handbook of Experimental Pharmacology 113:49-101, 1994; Taylor L. et al., Int. Immunol. 6:579-591, 1994; Lonberg

N. y Huszar D., Intern. Rev. Immunol. 25:65-93, 1995; Harding F. y Lonberg N., Ann. N. Acad. Sci. 764:536-546, 1995; Fishwild D.M. et al., Nat. Biotechnol. 14:845-851, 1996. Ver adicionalmente las patentes US nº 5.545.806, nº 5.569.825, nº 5.625.126, nº 5.633.425, nº 5.789.650, nº 5.877.397, nº 5.661.016, nº 5.814.318, nº 5.874.299, nº 5.545.807, nº 5.770.429; documentos WO nº 98/24884, nº 94/25585, nº 93/1227, nº 92/22645 y nº 92/03918.

Para generar anticuerpos monoclonales totalmente humanos contra OX40L, los ratones HumAb pueden inmunizarse con una preparación purificada o enriquecida de antígeno OX40L y/o células que expresan OX40L según el método general, tal como describen Lonberg N. et al. , Nature 368:856-859, 1994; Fishwild D.M. et al. , Nat. Biotechnol. 14:845-851, 1996, y documento WO nº 98/24884. Preferentemente, los ratones serán de 6 a 16 semanas de edad en la primera inmunización. Por ejemplo, puede utilizarse una preparación purificada o enriquecida en antígeno OX40L soluble (por ejemplo purificada a partir de células expresantes de OX40L) acoplado con KLH o en PBS para inmunizar los ratones HumAb por vía intraperitoneal. Lo anterior puede combinarse con la inmunización alternativa con la proteína OX40L aislada y con células que expresan OX40L, por ejemplo una línea celular tumoral, para estimular respuestas inmunológicas. La experiencia acumulada con diversos antígenos ha demostrado que los ratones transgénicos HumAb responden mejor al inmunizarlos inicialmente por vía intraperitoneal (i.p.) con antígeno en adyuvante completo de Freund, seguido de inmunizaciones i.p. cada dos semanas (por ejemplo hasta un total de 6) con antígeno en adyuvante incompleto de Freund. Puede realizarse un seguimiento de la respuesta inmunológica durante el curso del protocolo de inmunización obteniendo las muestras de plasma de sangrados retroorbitales. El plasma puede cribarse mediante ELISA, y pueden utilizarse ratones con suficientes títulos de inmunoglobulina anti-OX40L humana para la inmortalización de las células B correspondientes. Los ratones pueden recibir refuerzos intravenosos con antígeno 3 a 4 días antes del sacrificio y tras la extirpación del bazo y los nódulos linfáticos. Se inmunizan varios ratones para cada antígeno. Por ejemplo, puede inmunizarse un total de doce ratones HumAb de las cepas HCo7 y HCo12.

Los ratones HCo7 presentan una interrupción JKD en sus genes de cadena ligera endógena (kappa) (tal como se describe en Chen J. et al., EMBO J. 12:821-830, 1993), una interrupción CMD en sus genes de cadena pesada endógena (tal como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO nº 01/14424), un transgén KCo5 de cadena ligera kappa humana (tal como se describe en Fishwild D.M. et al., Nat. Biotechnol. 14:845-851, 1996) y un transgén HCo7 de cadena pesada humana (tal como se describe en la patente US nº 5.770.429).

Los ratones HCo12 presentan una interrupción JKD en sus genes de cadena ligera endógena (kappa) (tal como se describe en Chen J. et al., EMBO J. 12:821-830, 1993), una interrupción CMD en sus genes de cadena pesada endógena (tal como se describe en el Ejemplo 1 del documento WO nº 01/14424), un transgén KCo5 de cadena ligera kappa humana (tal como se describe en Fishwild D.M. et al., Nat. Biotechnol. 14:845-851, 1996) y un transgén HCo12 de cadena pesada humana (tal como se describe en el Ejemplo 2 del documento WO nº 01/14424). Los linfocitos de ratón pueden aislarse y fusionarse con una línea celular de mieloma de ratón utilizando PEG basándose en protocolos estándares para generar hibridomas. A continuación, los hibridomas resultantes se criban para la producción de anticuerpos específicos de antígeno. Por ejemplo, se fusionan suspensiones de células individuales de linfocitos esplénicos y derivados de nódulos linfáticos procedentes de ratones inmunizados, con un número un sexto menor de células de mieloma de ratón no secretoras SP 2/0 (ATCC nº CRL 1581) con PEG al 50%. Las células se siembran a razón de aproximadamente 2x105 en una placa de microtitulación de fondo plano, seguido de una incubación durante aproximadamente dos semanas en medio selectivo.

A continuación se cribaron los pocillos individuales mediante ELISA para anticuerpos monoclonales IgM e IgG anti-OX40L humanos. Tras producirse el crecimiento extensivo del hibridoma, se analiza el medio, habitualmente tras 10 a 14 días. Los hibridomas secretores de anticuerpos se siembran en placa nuevamente, se criban nuevamente y, en caso de que todavía sean positivos para IgG humana, pueden subclonarse anticuerpos monoclonales anti-OX40L por lo menos dos veces mediante dilución limitante. A continuación, se cultivan los subclones estables para producir anticuerpos en medio de cultivo de tejidos para la caracterización.

El árbol de ensayo está compuesto principalmente de un ensayo no específico en IgG ("ELISA de IgG") seguido de un ELISA específico y un ensayo de FACS aparente para la determinación de la unión de antígeno a proteína OX40L purificada o a células expresantes de OX40L. La etapa siguiente comprende ensayos funcionales en los que se determina la competición del anticuerpo anti-OX40L con su pareja de interacción natural, por ejemplo OX40 purificado soluble para OX40L o OX40L purificado expresado sobre las células, por ejemplo en ELISA o FACS de competición. La etapa siguiente comprende un ensayo funcional en el que se determina la capacidad de bloquear la transducción de señales de OX40 del anticuerpo anti-OX40L, por ejemplo la activación de NFKB (="ensayo de NFKB"). La etapa siguiente comprende ensayos funcionales en los que se determina la capacidad de activar las células T del anticuerpo anti-OX40L ("ensayo de activación de las células T" y "ensayo TT").

Debido a que las secuencias de CDR son responsables de las interacciones de anticuerpo-antígeno, resulta posible expresar anticuerpos recombinantes según la invención mediante la construcción de vectores de expresión que incluyen las secuencias de CDR según la invención en secuencias de marco de un anticuerpo humano diferente (ver, por ejemplo, Riechmann L. et al., Nature 332:323-327, 1998; Jones P. et al. , Nature 321:522-525, 1986, y Queen C. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 86:10029-10033, 1989). Dichas secuencias de marco pueden obtenerse de bases de datos de ADN públicas que incluyen secuencias génicas de anticuerpo humano de línea germinal. Estas secuencias de línea germinal difieren de las secuencias génicas de los anticuerpos maduros en que no incluyen genes variables ensamblados por completo, los cuales se forman mediante unión de V(D)J durante la maduración de las células B. Las secuencias génicas de línea germinal también difieren de las secuencias de un anticuerpo de repertorio secundario de alta afinidad en sitios individuales situados uniformemente a lo largo de la región variable.

La invención comprende además la utilización de un anticuerpo según la invención para el diagnóstico de OX40L in vitro, preferentemente mediante un ensayo inmunológico que determina la unión entre OX40L (soluble o unido a membrana) de una muestra y el anticuerpo según la invención.

En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición, por ejemplo una composición farmacéutica, que contiene un anticuerpo monoclonal o una combinación de anticuerpos monoclonales humanos, o la porción ligante de antígeno del mismo, de la presente invención, formulados conjuntamente con un portador farmacéuticamente aceptable. Más concretamente, la composición es una composición farmacéutica o diagnóstica, y todavía más concretamente, la composición farmacéutica comprende un anticuerpo tal como se ha definido anteriormente y por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable. La composición debe ser estéril y líquida en grado suficiente para que la composición resulte administrable mediante jeringa.

Tal como se utiliza en la presente memoria, la expresión “portador farmacéuticamente aceptable” incluye cualquiera y la totalidad de los solventes, medios de dispersión, recubrimientos, agentes antibacterianos y antifúngicos, agentes isotónicos y de retraso de la absorción y similares que son fisiológicamente compatibles. Preferentemente, el portador resulta adecuado para la administración intravenosa, intramuscular, subcutánea, parenteral, espinal o epidérmica (por ejemplo mediante inyección o infusión). Preferentemente, dicho portador es una solución acuosa de pH tamponado (por ejemplo acetato, citrato, fosfato o histidina), preferentemente isotónica, preferentemente que contiene además una sal inorgánica, azúcar, poliol y/o un surfactante. Los portadores farmacéuticamente aceptables también son algunos tales como los indicados en Remington’s Pharmaceutical Sciences, 16a edición, Osol A., editor, 1980.

La concentración de anticuerpos es preferentemente de entre 0,1 y 50 mg/ml. Preferentemente, el valor de pH de la solución tamponada se encuentra comprendida entre 4,0 y 8,0 a una concentración de tampón de entre 1 y 200 mM. Las sales preferentes son cloruro sódico y/o fosfato sódico en el intervalo de entre 1 y 200 mM. Los azúcares preferentes son sacarosa y/o trehalosa en el intervalo de entre 1% y 15% (p/v). Los polioles preferentes son glicerol, propilenglicol, polietilenglicol líquido y/o similares en el intervalo de entre 1% y 15% (p/v). El surfactante preferentemente es un polisorbato (por ejemplo polisorbato 20 ó 80) y/o poloxámero en el intervalo de entre 0,001% y 0,5% (p/v). Una composición farmacéutica preferente contiene anticuerpo a una concentración de entre 0,1 y 50 mg/ml y solución salina tamponada con fosfato 1 mM a 200 mM, pH 4,0 a 8,0.

Puede administrarse una composición de la presente invención mediante una diversidad de métodos conocidos de la técnica en un paciente que necesita de la misma. Tal como apreciará el experto en la materia, la vía y/o el modo de administración variarán dependiendo de los resultados deseados.

Entre los excipientes o portadores farmacéuticamente aceptables se incluyen soluciones acuosas estériles o polvos estériles para la preparación extemporánea de soluciones o dispersiones inyectables estériles. La utilización de dichos medios y agentes para sustancias farmacéuticamente activas es conocida de la técnica.

Las expresiones “administración parenteral” y “administrado parenteralmente” tal como se utilizan en la presente memoria se refieren a modos de administración diferentes de la administración entérica y tópica, habitualmente mediante inyección, e incluyen, sin limitarse a las mismas, las inyecciones e infusiones intravenosa, intramuscular, intraarterial, intratecal, intracapsular, intraorbital, intracardíaca, intradérmica, intraperitoneal, transtraqueal,

subcutánea, subcuticular, intraarticular, subcapsular, subaracnoidea, intraespinal, epidural e intraesternal

Los niveles reales de las dosis de los ingredientes activos en las composiciones farmacéuticas de la presente invención pueden modificarse de manera que se obtenga una cantidad del ingrediente activo que resulte efectiva para conseguir la respuesta terapéutica deseada para un paciente, composición y modo de administración particulares, sin resultar tóxicos para el paciente. El nivel de dosis seleccionado dependerá de una diversidad de factores farmacocinéticos, incluyendo la actividad de las composiciones particulares de la presente invención utilizadas, o el éster, sal o amida de las mismas, la vía de administración, el momento de la administración, la tasa de excreción del compuesto particular utilizado, la duración del tratamiento, otros fármacos, compuestos y/o materiales utilizados en combinación con las composiciones particulares utilizadas, la edad, el sexo, el peso, la condición, el estado general de salud y la historia médica anterior del paciente bajo tratamiento, y factores similares bien conocidos de las técnicas médicas. Una dosis semanal típica puede encontrarse comprendida entre aproximadamente 0,1 mg/kg y aproximadamente 20 mg/kg o más, dependiendo de los factores mencionados anteriormente.

Los ejemplos, referencias, listado de secuencias y figuras siguientes se proporcionan con el fin de ayudar a la comprensión de la presente invención, el alcance real de la cual se proporciona en las reivindicaciones adjuntas. Debe entenderse que resulta posible llevar a cabo modificaciones de los procedimientos indicados sin apartarse de la invención.

Breve descripción de los dibujos

Fig. 1a: muestra un "ELISA de unión" para TAG-34, LC.001, LC.005, LC.010, LC.019, LC.029, LC.033. Fig. 1b: muestra un "ELISA de bloqueo" + datos de IC50 para TAG-34, LC.001, LC.005, LC.010, LC.019, LC.029, LC.033. Fig. 2: muestra "FACS de bloqueo" para TAG-34, LC.001, LC.005. Fig. 3: muestra un "ensayo de NFKB" para TAG-34, LC.001, LC.019 y LC.024 (anticuerpo no ligante). Figs. 4 y 5: muestra un "ensayo de activación de células T" y valores de IC50 para TAG-34, LC.001 y LC.005 (fig. 4: liberación de IL-2, fig. 5: Inhibición). Fig. 6: muestra datos de "ensayo TT" para TAG-34, LC.001 y LC.033. Fig. 7: muestra la reactividad cruzada de los anticuerpos de la invención con OX40L de ratón. A) control de expresión de hOX40L sobre células transfectadas y WT, B) unión de los anticuerpos a células K562 expresantes de hOX40L, C) control de la expresión de mOX40L sobre células transfectadas y WT, D) unión de los anticuerpos a células K562 expresantes de mOX40l, y E) unión de los anticuerpos a células K562 WT (n=3). Fig. 8: muestra la capacidad de los anticuerpos de la invención de unirse a C1q (n=3). Fig. 9: muestra la capacidad de los anticuerpos de la invención de activar C3c (n=3). Fig.10: muestra la capacidad de los anticuerpos de la invención de unirse a FcyRI (n=4), FcyRIIa (n=4) y FcyRIIb (n=4). Fig. 11: muestra la capacidad de los anticuerpos de la invención de unirse a FcyRIIIa (CD16) sobre las células NK (media ± SEM de 6 donantes). Fig.12: transferencia western; carriles 1, 4, 7: marcador; carriles 2, 5, 8: 100 ng de OX40L; carriles 3, 6, 9: 40 ng de OX40L.

Descripción del listado de secuencias

SEC ID nº 1 cadena ligera kappa, región variable de LC.001 SEC ID nº 2 región variable de cadena pesada y de LC.001 SEC ID nº 3 cadena ligera kappa, región variable de LC.005 SEC ID nº 4 región variable de cadena pesada y de LC.005 SEC ID nº 5 cadena ligera kappa, región variable de LC.010 SEC ID nº 6 región variable de cadena pesada y de LC.010 SEC ID nº 7 cadena ligera kappa, región variable de LC.029 SEC ID nº 8 región variable de cadena pesada y de LC.029 SEC ID nº 9 cadena ligera kappa, región variable de LC.019 SEC ID nº 10 región variable de cadena pesada y de LC.019 SEC ID nº 11 cadena ligera kappa, región variable de LC.033 SEC ID nº 12 región variable de cadena pesada y de LC.033 SEC ID nº 13 región constante de cadena ligera kappa SEC ID nº 14 región constante de cadena pesada y1 SEC ID nº 15 región constante de cadena pesada y4

SEC ID nº 16 cadena ligera kappa, región variable mutante de LC.033 SEC ID nº 1 cadena ligera kappa, región variable de LC.059 SEC ID nº 7 región variable de cadena pesada y de LC.059 SEC ID nº 18 cadena ligera kappa, región variable de LC.060 SEC ID nº 19 región variable de cadena pesada y de LC.060 SEC ID nº 1 cadena ligera kappa, región variable de LC.063 SEC ID nº 20 región variable de cadena pesada y de LC.063 SEC ID nº 21-57 secuencias de CDR SEC ID nº 58 cadena pesada y de LC.001 (de tipo IgG1 humana) SEC ID nº 59 cadena pesada de LC.001 (mutante L234A, L235A de IgG1 humana) SEC ID nº 60 cadena pesada y de LC.001 (mutante S228P de IgG4 humana) SEC ID nº 61 cadena ligera kappa de LC.001 SEC ID nº 62 cadena pesada y de LC.005 (de tipo IgG1 humana) SEC ID nº 63 cadena pesada y de LC.005 (mutante de IgG1 humana L234A, L235A) SEC ID nº 64 cadena pesada y de LC.005 (mutante de IgG4 humana S228P) SEC ID nº 65 cadena ligera kappa de LC.005 SEC ID nº 66 cadena pesada y de LC.060 (de tipo IgG1 humana) SEC ID nº 67 cadena pesada y de LC.060 (mutante de IgG1 humana L234A, L235A) SEC ID nº 68 cadena pesada y de LC.060 (mutante de IgG4 humana S228P) SEC ID nº 69 cadena ligera kappa de LC.060

Abreviaturas:

Los aminoácidos se abrevian en el código de tres letras (Leu) o de una letra (L). S228P se refiere a un intercambio de serina a prolina en la posición 228 de la cadena pesada de IgG4. L234 se refiere al aminoácido leucina en la posición 234 según la numeración EU (Kabat). L234 se refiere a que el aminoácido leucina en la posición 234 se cambia por alanina. L235A se refiere a que el aminoácido leucina en la posición 235 se cambia por alanina. PVA236 se refiere a que en la región 236 ELLG de IgG1 ó EFLG de IgG4 se cambia por PVA. GLPSS331 se refiere a que en la región 331 ALPAP de IgG1 ó GLPAP de IgG2 se cambia por GLPSS. Delta G236 se refiere a que el aminoácido en la posición 236 se deleciona. IgG4x se refiere a la mutación S228P en IgG4. LC2010-001 es un sinónimo de LC.001 Fcg es sinónimo de Fc-gamma (Fcy)

Otros cambios de secuencia de los anticuerpos se denominan de manera análoga.

OX40L humano soluble recombinante fusionado con una hOX40L-His etiqueta histidina OX40L murino soluble recombinante fusionado con una

mOX40L-His

etiqueta histidina OX40L humano soluble recombinante fusionado con una hOX40L-Flag etiqueta Flag OX40L murino soluble recombinante fusionado con una

mOX40L-Flag etiqueta Flag

OX40 humano soluble recombinante fusionado con Fcy hOX40 -hFc Anticuerpo monoclonal de conejo anti-Fcy murino Anti-mFc Anticuerpo monoclonal de cabra anti-Fcy humano Anti-hFc

Anticuerpo monoclonal murino anti-histidina Anti-His OX40 humano soluble recombinante fusionado con Fcy

hOX40 -mFc

murino Anticuerpo monoclonal murino anti-TNFa Anti-TNFa Anticuerpo monoclonal murino anti-CD40L Anti-CD40L Factor a de necrosis tumoral TNFa Ligando CD40 CD40L Anticuerpo monoclonal de rata anti-OX40L humano TAG34

LC.001, LC.005, LC.010, LC.019, LC.029, LC.033,

Anticuerpos monoclonales humanos anti-OX40L humano

LC. 059, LC.060, LC.063

fitohemaglutinina PHA

EJEMPLOS

Ejemplo 1

Generación de una línea celular de hibridoma productora de anticuerpos anti-OX40L

Cultivo de hibridomas

Se cultivaron hibridomas de HumAb en IMDM (Cambrex), suero fetal bovino de clon 1 (Perbio Science), origen: factor de clonación de hibridoma (Igen), piruvato sódico, penicilina/estreptomicina, 2-mercaptoetanol, HAT (Sigma-Aldrich) y canamicina (Invitrogen) a 37ºC y en 5% de CO2.

Procedimiento de inmunización de los ratones transgénicos

LC2010-001: seis HCo7 (2 machos y 4 hembras), cepa GG2201 (Medarex, San José, CA, USA) y 4 HCo12 (4 machos), cepa GG2198 (Medarex, San José, CA, USA) se inmunizaron alternativamente con 1x106 células HEK293, transfectadas transitoriamente con un vector de expresión de OX40L humano (hOX40L) y 20 mg de dominio extracelular soluble de hOX40L. Se llevaron a cabo ocho inmunizaciones en total, cuatro inmunizaciones intraperitoneales (i.p.) con las células expresantes de hOX40L y cuatro inmunizaciones subcutáneas (s.c.) en la base de la cola con proteína recombinante. Para la primera inmunización, se mezclaron 100 ml de 1x106 células HEK293hOX40L con 100 ml de adyuvante de Freund completo (ACF, Difco Laboratories, Detroit, USA). Para todas las demas inmunizaciones, se utilizaron 100 ml de células en PBS o se mezcló proteína recombinante con 100 ml de adyuvante de Freund incompleto (AFI; Difco).

Tras observar que los títulos séricos de anti-hOX40L eran suficientes, los ratones recibieron dos refuerzos adicionales de 15 mg de dominio extracelular de hOX40L en 200 ml de PBS por vía intravenosa (i.v.) 4 y 3 días antes de la fusión.

LC2010-001, LC.059, LC.060 y LC.063 se derivaron de ratones HCo12.

LC2010-005, -010, -019, -029 y -033: se inmunizaron cinco HCo7 (4 machos y 1 hembra), cepa GG2201 (Medarex, San José, CA, USA) con 20 mg de dominio extracelular soluble de hOX40L. Se llevaron a cabo siete inmunizaciones en total, cuatro intraperitoneales (i.p.) y tres subcutáneas (s.c.) en la base de la cola. Para la primera inmunización, se mezclaron 100 ml de proteína recombinante con 100 ml de adyuvante de Freund completo (ACF, Difco Laboratories, Detroit, USA). Para todas las demás inmunizaciones, se mezclaron 100 ml de proteína recombinante con 100 ml de adyuvante de Freund incompleto (AFI; Difco).

Tras observar que los títulos séricos de anti-hOX40L eran suficientes, los ratones recibieron dos refuerzos adicionales de 15 mg de dominio extracelular de hOX40L en 200 ml de PBS por vía intravenosa (i.v.) 4 y 3 días antes de la fusión.

Generación de hibridomas

Se sacrificaron los ratones y se recogieron el bazo y los nódulos linfáticos flanqueantes de la aorta abdominal y la vena cava. Se llevó a cabo la fusión de esplenocitos y células de nódulo linfático con las células SP 2.0 de pareja de fusión siguiendo procedimientos operativos estándares.

ELISA específico de antígeno

Se determinaron los títulos de anti-OX40L en sueros de ratones inmunizados mediante ELISA específico de antígeno. Se recubrió una placa (placa ELISA de 96 pocillos de fondo redondo, Greiner) con 0,1 mg/ml de OX40L purificado disuelto en PBS y se recubrió durante la noche a temperatura ambiente. A continuación, se bloquearon los pocillos con PBSTC (PBS que contenía Tween-20 al 0,05% (Sigma-Aldrich Chemie BV) y suero de pollo al 2% (Gibco)) durante 1 hora a temperatura ambiente.

Las muestras de suero analizadas se diluyeron 1:50 en PBSTC y se añadieron a los pocillos. El suero obtenido de los ratones antes de la inmunización se disolvió 1:100 en PBSTC y se utilizó a modo de control negativo. Un anticuerpo de ratón dirigido contra OX40L humano se disolvió 1:50 en PBSTC y se utilizó a modo de control positivo. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron dos veces utilizando PBST (PBS que contenía Tween-20 al 0,05%). Se diluyó Gt-a-hulgG-HRP (Jackson) 1:5000 en PBSTC y se añadió a los pocillos que contenían las muestras analizadas y el control negativo. Se diluyó Rb-a-mIgG (Jackson) 1:3000 en PBSTC y se añadió a los pocillos que contenían el control positivo. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, las placas se lavaron tres veces con PBST y se revelaron con solución ABTSa recién preparada (1 mg/ml) (ABTS: 2,2'-azino-bis(ácido 3-etilbenzotiazolín-6-sulfónico) durante 30 minutos a temperatura ambiente (TA) en la oscuridad. Se midió la absorbancia a 405 nm.

ELISA kappa

Para determinar si los hibridomas resultantes de la fusión generan anticuerpos humanos, se llevó a cabo un ELISA kappa. Se recubrieron placas de ELISA con anticuerpo de rata anti-cadena ligera kappa de IgG humana (DAKO) diluido 1/10.000 en PBS mediante la incubación durante la noche a 4ºC. Tras descartar los pocillos, las placas se bloquearon mediante incubación con PBSTC (PBSC, suplementado con Tween-20 al 0,05% (PBSTC)) durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, los pocillos se incubaron con sobrenadante de cultivo de hibridoma, diluido 1/2 en PBSTC. Se utilizó medio de cultivo diluido 1/2 en PBSTC a modo de control negativo, sirvió a modo de control positivo suero de ratón positivo para cadena ligera kappa diluido 1/100 en PBSTC. A continuación, se lavaron tres veces los pocillos y se incubaron con F(ab')2 de rata anti-IgG humana conjugado con HRP (DAKO), diluido 1/2.000 en PBSTC durante 1 h a 37ºC. Los pocillos se lavaron tres veces y se revelaron los ensayos con solución de ABTS® recién preparada (1 mg/ml) durante 30 minutos a temperatura ambiente (TA) en la oscuridad. Se midió la absorbancia a 405 nm en un lector de placas de ELISA.

Ejemplo 2

Clonación y análisis de secuencias de dominios variables de HumAb anti-OX40L

(cadenas ligera kappa y pesada y1)

Las secuencias de nucleótidos codificantes de la región variable de cadena ligera VL y la región variable de cadena pesada VH de los HumAb OX40L se aislaron mediante un procedimiento estándar de síntesis de ADNc/PCR.

Se preparó ARN total a partir de 1x106-1x107 células de hibridoma utilizando el kit GeneRacerTM (Invitrogen). Se utilizó ARN derivado de hibridoma como molde para la síntesis de ADNc de primera cadena y la ligación del cebador oligo-dT GeneRacerTM. Se llevaron a cabo síntesis de ADNc de 2a cadena y amplificación adicional por PCR de los fragmentos de ADNc codificantes de VL y VH con cebadores inversos de cadenas ligera y pesada complementarios a las secuencias de nucleótidos de la región constante de cadena ligera kappa y cadena pesada y1 y cebador GeneRacerTM 5'-específicos, respectivamente. Los productos de PCR se clonaron utilizando el kit de clonación TOPOTM TA de InvitrogenTM Life Technologies y pCR4-TOPOTM como vector de clonación. Los productos de PCR clonados se identificaron mediante mapeado de restricción de los plásmidos apropiados utilizando EcoRI para la digestión y tamaños esperados/calculados de fragmentos de ADN de aproximadamente 740 y 790 pb para VL y VH, respectivamente.

Se determinó la secuencia de ADN de los fragmentos de PCR clonados mediante secuenciación de doble cadena.

El paquete informático del GCG (Genetics Computer Group, Madison, Wisconsin) versión 10.2 y Vector-NTI 8 (InforMax, Inc.) se utilizaron para el procesamiento general de los datos. Se alinearon las secuencias de ADN y de proteína utilizando el módulo CLUSTALW de GCG. Se realizaron alineaciones de las secuencias utilizando el programa GENEDOC (versión 2.1).

Ejemplo 3

Construcción de plásmidos de expresión para un HumAb IgG1 anti-OX40L

Los genes codificantes de las cadenas ligera y pesada de HumAb anti-OX40L se ensamblaron separadamente en vectores de expresión de célula de mamífero.

De esta manera, se unieron los segmentos génicos codificantes de la región variable de cadena ligera (VL) de HumAb anti-OX40L y de la región constante de cadena ligera kappa humana (CL, SEC ID nº 13, o de entre SEC ID nº 61, 65 ó 69), al igual que los segmentos génicos de la región variable de cadena pesada (VH) de HumAb anti-OX40L y la región constante de cadena pesada y1 humana (CH1-bisagra-CH2-CH3, SEC ID nº 14, o de entre SEC ID nº 58, nº 62 ó nº 66).

Se proporciona información general sobre secuencias de nucleótidos de las cadenas ligeras y pesadas a partir de las que se deduce el uso de los codones, en: Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, publicación del NIH nº 91-3242, 1991.

La unidad de transcripción de la cadena ligera kappa de HumAb anti-OX40L está compuesta de los elementos siguientes:

-

el intensificador y promotor tempranos inmediatos del citomegalovirus humano (CMVH),

-

un 5'-UT sintético que incluye una secuencia de Kozak,

-

una secuencia de señal de cadena pesada de inmunoglobulina murina que incluye el intrón de secuencia de señal,

-

el ADNc de cadena ligera variable HumAb anti-OX40L clonado dispuesto con un sitio de restricción BsmI único en el extremo 5' y un sitio donador de procesamiento y un sitio de restricción NotI único en el extremo 3'.

-

La región constante de gen kappa genómico humano, que incluye el intrón 2 intensificador de Ig-kappa de ratón [Picard D. y Schaffner W., Nature 307:80-82, 1984], y la secuencia de señal de poliadenilación (“poli A”) de inmunoglobulina kappa humana.

La unidad de transcripción de la cadena pesada de HumAb anti-OX40L está compuesta de los elementos siguientes:

-

el intensificador y promotor tempranos inmediatos del citomegalovirus humano (CMVH),

-

un 5'-UT sintético que incluye una secuencia de Kozak,

- una secuencia de señal de cadena pesada de inmunoglobulina murina modificada que incluye el intrón de secuencia de señal,

- el ADNc de cadena pesada variable de HumAb anti-OX40L clonado dispuesto con un sitio de restricción BsmI único en 5' y un sitio donador de procesamiento y un sitio de restricción NotI único en el extremo 3',

-

la región constante genómica del gen de la cadena pesada y1 humana, incluyendo el intensificador de la IgM de ratón (Neuberger M.S., EMBO J. 2:1373-1378, 1983).

-

la secuencia de señal de poliadenilación (“poli A”) de la inmunoglobulina y1 humana.

Elementos funcionales de los plásmidos de expresión de cadena ligera kappa de HumAb anti-OX40L y de la cadena pesada y1: aparte de la cadena ligera kappa de HumAb anti-OX40L o el casete de expresión de la cadena pesada y1, dichos plásmidos contienen:

-

un gen de resistencia a higromicina

-

un origen de replicación, oriP, del virus Epstein-Barr (VEB),

-

un origen de replicación del vector pUC18 que permite la replicación de este plásmido en E. coli, y

-

un gen �-lactamasa que proporciona resistencia a la ampicilina a E. coli.

Ejemplo 4

Construcción de plásmidos de expresión para un HumAb IgG4 anti-OX40L

Se derivó un plásmido de expresión prototipo de cadena pesada y4 de anti-OX40L a partir del plásmido de expresión de cadena pesada y1 anti-OX40L mediante la sustitución de la región constante genómica de y1 humana y la secuencia de señal de poliadenilación ("poli A") de la inmunoglobulina y1 por la región constante genómica de y4 humana (SEC ID nº 15 ó de entre la región constante de y4 no mutada seleccionada de entre SEC ID nº 60, nº 64 ó nº 68) y la secuencia de señal de poliadenilación de la inmunoglobulina y4.

Para la expresión de las cadenas ligeras kappa de HumAb anti-OX40L, se utilizaron los mismos plásmidos de expresión que los indicados para IgG1 (ver anteriormente).

Ejemplo 5

Construcción de plásmidos de expresión para las IgG1 e IgG4 anti-OX40L mutantes (variantes) basadas en LC.001

Se crearon los plásmidos de expresión codificantes de las cadenas pesadas de y1 y y4 anti-OX40L mediante mutagénesis sitio-dirigida de los plásmidos de expresión de tipo salvaje utilizando el kit de mutagénesis sitio-dirigido QuickChangeTM (Stratagene). Los aminoácidos se numeraron según la numeración EU (Edelman G.M. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 63:78-85, 1969; Kabat E.A. et al., Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5a edición, Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, MD, 1991).

Tabla 1

Isotipo

Nombre abreviado Mutaciones Descripción

IgG1

IgG1v1 PVA-236; GLPSS331 especificado por E233P; L234V; L235A; delta G236; A327G; A330S; P331S La secuencia de aminoácidos Glu233Leu234Leu235Gly236 de la cadena pesada y1 humana se sustituye por la secuencia de aminoácidos Pro233Val234Ala235 de la cadena pesada y2 humana. La secuencia de aminoácidos Ala327Leu328Pro329Ala330Pro331 de la cadena pesada y1 humana se sustituye por la secuencia de aminoácidos Gly327Leu328Pro329Ser330Ser331 de la cadena pesada y4 humana.

IgG1

IgG1v2 L234A; L235A La secuencia de aminoácidos Leu234Leu235 de la cadena pesada y1 se sustituye por la secuencia de aminoácidos Ala234Ala235

IgG4

IgG4v1 S228P; L235E Ser228 de la cadena pesada y4 humana se sustituye por Pro228 y Leu235 de la cadena pesada y4 humana se sustituye por Glu235

IgG4

IgG4x S228P Ser228 de la cadena pesada y4 humana se sustituye por Pro228

Ejemplo 6

Producción de HumAb anti-OX40L recombinantes

Se generaron HumAb recombinantes mediante transfección transitoria de células HEK293-EBNA adherentes (ATCC nº CRL10852) cultivadas en DMEM (Gibco) suplementadas con FCS al 10% con contenido ultrabajo de IgG (Gibco), glutamina 2 mM (Gibco), aminoácidos no esenciales al 1% v/v (Gico) y G418 250 mg/ml (Roche). Para la transfección se utilizó el reactivo de transfección FugeneTM 6 (Roche) en una proporción de reactivo (ml) a ADN (mg)

10 comprendida entre 3:1 y 6:1. Se expresaron las cadenas ligera y pesada de inmunoglobulina a partir de dos plásmidos diferentes utilizando una proporción molar de plásmido codificante de cadena ligera a plásmido codificante de cadena pesada de entre 1:2 y 2:1. Se recolectaron los sobrenadantes de cultivo celular que contenían HumAb entre los días 4 y 11 posteriores a la transfección. Los sobrenadantes se almacenaron a –20ºC hasta la purificación.

15 Se proporciona información general sobre la expresión recombinante de anticuerpo humano en, por ejemplo, HEK293, en: Meissner P. et al., Biotechnol. Bioeng. 75:197-203, 2001.

20 Ejemplo 7

Análisis de afinidad de los anticuerpos TAG34, LC.001, LC.005, LC.010, LC.019, LC.029 y LC.033

Aparato: Biacore 3000, tampón de migración y reacción: HBS-P (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 al

25 0,005%, pH 7,4), 25ºC. Se llevó a cabo la inyección de analito a 7 concentraciones comprendidas entre 0,78 nM y 100 nM durante 3 minutos y se lavó con HBS-P durante 5 minutos. La regeneración de la superficie (superficie de dextrano carboximetilado, CM) se llevó a cabo mediante dos inyecciones de glicina 10 mM, pH 2,0, de 1 minuto cada una. El chip, formato de ensayo y secuencia de inyecciones y datos cinéticos corresponden a la descripción proporcionada en la tabla a continuación. Los datos cinéticos se calcularon mediante ajuste de los datos cinéticos a

30 un modelo de unión 1:1 de Langmuir.

Tabla 2

Chip

Captura Ligando Analito ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)

CM5

Anti-mFcg TAG34 hOX40L-His 8,84x104 3,32x10-5 3,75x10-10

CM5

Anti-hFcg LC.001 hOX40L-His 9,01x104 7,16x10-9 <1,1x10-11

CM5

Anti-hFcg LC.005 hOX40L-His 6,84x104 2,02x10-7 <1,5x10-11

CM5

Anti-hFcg LC.010 hOX40L-His 6,25x104 2,5x10-5 3,99x10-10

CM5

Anti-hFcg LC.019 hOX40L-His 7,89x104 7,53x10-8 <1,2x10-11

CM5

Anti-hFcg LC.029 hOX40L-His 1,41x105 2,4x10-8 <7,1x10-12

CM5

Anti-hFcg LC.033 hOX40L-His 7,01x104 2,09x10-7 <1,4x10-11

No pudo medirse interacción entre TAG34 y mOX40L.

Evaluación de los datos y depósito de los datos de todos los ensayos Biacore

Se restaron los datos de control negativo (por ejemplo las curvas de tampón) de las curvas de muestras para la corrección de la deriva intrínseca de la línea base del sistema y para la reducción de la señal de ruido. Se utilizó el programa BiaEvaluation versión 4.01 para el análisis de los sensogramas y para el cálculo de los datos de afinidad.

10 Ejemplo 8

Ensayo de inhibición competitiva de anticuerpos anti-hOX40L que inhiben la interacción de hOX40L con hOX40 inmovilizado

15 Aparato: Biacore 3000, tampón de migración y reacción: HBS-P (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0,005%, pH 7,4), 25ºC. Antes de la inyección, se preincubaron el analito (10 nM) y el competidor (ocho concentraciones comprendidas entre 0,78 nM y 100 nM) durante como mínimo 20 minutos a 22ºC. La inyección de analito +/- competidor se llevó a cabo durante 3 minutos y se lavó con HBS-P durante tres minutos. La regeneración de la superficie se llevó a cabo mediante dos inyecciones de glicina 10 mM, pH 2,0, de 1 minuto cada una. El chip,

20 formato de ensayo y secuencia de inyecciones y datos cinéticos corresponden a la descripción proporcionada en la tabla 3 a continuación.

Tabla 3

Chip

Ligando Analito Competidor IC50 (M)

CM5

OX40-hFc hOX40L-His TAG34 7x10-9

CM5

OX40-hFc hOX40L-His LC.001 4x10-9

CM5

OX40-hFc hOX40L-His LC.005 3x10-9

25 Todos los anticuerpos inhibieron la unión de OX40L a OX40 en solución (afinidad en solución). LC.001 y LC.005 mostraron un valor de IC50 más bajo que TAG34.

Ejemplo 9

30 Caracterización de epítopos de los anticuerpos anti-OX40L TAG34, LC.001, LC.005, LC.010, LC.019, LC.029, LC.033, LC. 060

Aparato: Biacore 3000, tampón de migración y reacción: HBS-P (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0,005%, pH 7,4), 25ºC. Los grupos epitópicos se determinaron mediante competición cruzada entre los anticuerpos

35 indicados. Antes de la inyección, se preincubaron el analito (50 nM) y el competidor (100 nM) durante como mínimo 20 minutos a 22ºC. Inyección de analito +/- competidor durante dos minutos, lavado con HBS-P durante tres minutos. La regeneración de la superficie se llevó a cabo mediante dos inyecciones de glicina 10 mM, pH 2,0, de 1 minuto cada una. El chip, formato de ensayo y secuencia de inyecciones y datos cinéticos corresponden a la descripción proporcionada en la tabla 4 a continuación.

Tabla 4

Chip

Captura Ligando Analito Competidor Epítopo

CM5

Anti-hFcg Anti-OX40L (A,B,C) hOX40L-His TAG34 A

CM5

Anti-hFcg Anti-OX40L (A,B,C) hOX40L-His LC.001 A

CM5

Anti-hFcg Anti-OX40L (A,B,C) hOX40L-His LC.005 B

CM5

Anti-hFcg Anti-OX40L (A,B,C) hOX40L-His LC.010 B

CM5

Anti-hFcg Anti-OX40L (A,B,C) hOX40L-His LC.019 A/B

CM5

Anti-hFcg Anti-OX40L (A,B,C) hOX40L-His LC.029 B

CM5

Anti-hFCg Anti-OX40L (A,B,C) hOX40L-His LC.033 A

CM5

Anti-hFCg Anti-OX40L (A,B,C) hOX40L-His LC.060 A

El epítopo de OX40L reconocido por TAG34 se definió como epítopo A. Sin embargo, TAG34 no se unía a OX40L desnaturalizado (en una transferencia western) a una concentración de anticuerpo de 100 ng. Los anticuerpos en un 45 grupo epitópico (A o B) mostraban actividad de inhibición cruzada, mientras que los anticuerpos de grupos diferentes mostraban señales de unión aditivas. LC.019 neutralizaba otros anticuerpos del grupo A, así como del grupo B.

Ejemplo 10

Especificidad de unión de TAG34, LC.001 y LC.005 a CD40L y TNFa

Aparato: Biacore 3000, tampón de migración y reacción: HBS-P (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0,005%, pH 7,4), 25ºC. Se llevó a cabo la inyección de analito durante tres minutos a 100 nM y a 500 nM y se lavó con HBSP durante dos minutos. La regeneración de la superficie se llevó a cabo mediante dos inyecciones de HCl 100 mM de 1 minuto cada una. El chip, formato de ensayo y secuencia de inyecciones y datos cinéticos corresponden a la descripción proporcionada en la tabla 5 a continuación.

Tabla 5

Chip

Captura Ligando Analito

CM5

Anti-mFcg Anti-hFcg TAG34 LC.001 LC.005 Anti-TNFa Anti-CD40L TNFa CD40L OX40L

En estos ensayos, CD40L mostró cierta unión no específica a todos los anticuerpos o a la superficie del chip, pero tras restar las señales de fondo, este ensayo mostró que no se producía unión no específica de TNFa y CD40L (hasta 500 nM) a los anticuerpos inmovilizados TAG34, LC.001 y LC.005.

Ejemplo 11

Análisis de afinidad de los anticuerpos LC.001-IgG1 y LC.001-IgG4x

Aparato: Biacore 3000, tampón de migración y reacción: HBS-P (HEPES 10 mM, NaCl 150 mM, Tween-20 al 0,005%, pH 7,4), 25ºC. Se llevó a cabo la inyección de analito a ocho concentraciones comprendidas entre 0,78 nM y 100 nM durante tres minutos y se lavó con HBS-P durante cinco minutos. La regeneración de la superficie se llevó a cabo mediante dos inyecciones de HCl 100 mM de 1 minuto cada una. El chip, formato de ensayo y secuencia de inyecciones y datos cinéticos corresponden a la descripción proporcionada en la tabla a continuación. Los datos cinéticos se calcularon mediante ajuste de los datos cinéticos a un modelo de unión 1:1 de Langmuir.

Tabla 6

Chip

Captura Ligando Analito ka (1/Ms) kd (1/s) KD (M)

CM5

Anti-mFcg LC.001 hOX40L-His 4,27x104 3,46x10-8 <2,3x10-11

CM5

Anti-mFcg LC.001-IgG4x hOX40L-His 4,85x104 7,72x10-8 <2,06x10-11

LC.001 y LC-001-IgG4x mostraban la misma afinidad para hOX40L-His.

Ejemplo 12

Ensayo ELISA para la detección de anticuerpos de unión a OX40L

Se recubrieron placas recubiertas con SA (placa de ELISA de 96 pocillos de fondo plano, Microcoat) con 0,5 mg/ml de OX40L biotinilado disuelto en tampón de incubación (TI=PBS que contenía Tween-20 al 0,1% (Serva) y proteína de bloqueo al 1%) durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron dos veces con tampón de lavado (TL=solución salina que contenía Tween-20 al 0,1%).

Las muestras (sobrenadantes de cultivo celular o anticuerpos purificados) se diluyeron en serie en TB y se añadieron a los pocillos. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron dos veces utilizando TL. Seguidamente se diluyó un conjugado de un anticuerpo de cabra contra la IgG humana y POD (Dianova) hasta 50 ng/ml en TB y se añadió a los pocillos. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, las placas se lavaron dos veces con TB y se revelaron con solución ABTS® lista para utilizar (Roche) a temperatura ambiente (TA) en la oscuridad. Se midió la absorbancia a 405 nm tras alcanzar la absorbancia de la concentración más alta una DO suficiente (fig. 1a). Los valores obtenidos de EC50 se encontraban en el intervalo de entre 3 y 8 nM.

Ejemplo 13

Ensayo ELISA de detección de anticuerpos que inhibe la interacción de OX40 humano/OX40L humano Se recubrieron placas recubiertas con SA (placa de ELISA de 96 pocillos de fondo plano, Microcoat, Alemania) con 0,5 mg/ml de OX40L biotinilado disuelto en TB durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron dos veces con TL (tampón PBS, TweenTM-20 al 0,1% (p/v)).

Las muestras se diluyeron en TI a una concentración de 1 mg/ml y se añadieron a los pocillos en diluciones en serie. Con el fin de conseguir la unión máxima de OX40 a OX40L en algún pocillo sólo se añadió TI. A continuación, a cada pocillo se añadió una solución de OX40 humano conjugado con digoxigenina (Roche Diagnostics GmbH, DE) a una concentración de 0,2 mg/ml. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. A continuación, las placas se lavaron dos veces utilizando TL. Se diluyó <digoxigenina>-POD de oveja (Roche) hasta 50 mU/ml en TI y se añadió a los pocillos. Las placas se incubaron durante 1 hora a temperatura ambiente. Finalmente, las placas se lavaron dos veces con TB y se revelaron con solución ABTS® lista para utilizar (Roche) a temperatura ambiente (TA) en la oscuridad. Se midió la absorbancia a 405 nm tras 10 a 20 minutos (fig. 1b). Los valores obtenidos de EC50 se encontraban en el intervalo de entre 1 y 4 nM.

Ejemplo 14

Ensayo FACS de detección de HumAb que inhiben la interacción de OX40 humano con OX40L humano expresado sobre células K562 (células K562_OX40L).

Propósito: ensayo para la determinación de la propiedad de HumAb de hOX40L de bloquear la interacción de la proteína de fusión de hOX40 marcado con Dig: hFc con la línea celular K562_hOX40L expresante de hOX40L.

Procedimiento: el ensayo se llevó a cabo con hOX40 marcado con Dig:hFc como "reactivo de ensayo" y HumAb hOX40L como "competidor".

Reactivo de ensayo: solución madre 0,5 mg/ml, diluida 1:10 en PBS), 100 ml de anti-digoxigenina-FLUOS diluido

1:25 en PBS/BSA al 0,5%/reactivo de bloqueo al 1% (Roche Diagnostics GmbH, DE).

Se lavaron 2x105 células K562_OX40L (cultivadas en ISF-0) en 2 ml de PBS y se resuspendieron en 100 ml de PBS. A continuación, se añadió competidor en PBS (relación competidor/reactivo de 0:1/1:1/1,5:1/2:1/2,5:2/5:1). Seguidamente se incubó durante 30 minutos, TA y luz diurna. A continuación se añadió reactivo (en PBS); tiempo de incubación: 30 minutos, TA y luz diurna. Las células se lavaron con 2 ml de PBS y se peletizaron mediante centrifugación. Se añadió el anticuerpo secundario para tinción (anti-digoxigenina-fluoresceína, fragmentos Fab (Roche, 1207741)) y se incubó durante 30 minutos, a 4ºC en la oscuridad. Las células se lavaron con 2 ml de PBS y se peletizaron mediante centrifugación. Después, las células se resuspendieron en 0,5 ml de PBS. Se llevó a cabo la medición de las muestras en un FACS-Scan (fig. 2).

Ejemplo 15

Ensayo funcional para la determinación de la capacidad de los anticuerpos de inhibir la señalización hOX40/hOX40L ("ensayo NFKB")

Se cultivaron células HeLa de tipo salvaje (ta) y células HeLa expresantes de OX40 humano (HeLa_OX40) en medio esencial mínimo (MEM), 1x piruvato sódico, 1x aminoácidos no esenciales (Gibco), FCS al 10% y en el caso de las células recombinantes + 600 mg/ml de G418. Se cultivaron K562 y K562 expresante de OX40L en medio ISF-O y en el caso de las células recombinantes se añadieron 200 mg/ml de G418.

Se sembraron HeLa_wt o HeLa_OX40 a una densidad celular de 3x104 células/100 ml en una placa de 96 pocillos sin G418 y se incubaron durante la noche en un incubador de CO2. Se añadieron células K562_wt o K562_OX40L en una proporción célula a célula de 1:1. Se descongelaron células K562 fijadas con formalina o K562 expresantes de OX40L no fijadas con formalina (congeladas a -70ºC) y se diluyeron 1:10 en MEM/FCS al 10%; las células K562_OX40L se preincubaron con anticuerpo contra OX40L durante 30 minutos a TA. El tiempo de estimulación con las células K562_OX40L fue de entre 30 y 150 minutos. La extracción de proteínas de los núcleos celulares tuvo lugar siguiendo las instrucciones de los proveedores, con el kit NE de Active Motif. Se utilizó el ELISA-NFKB TransAM de Active Motif (el ensayo se llevó a cabo siguiendo las instrucciones de los proveedores) para determinar la señalización de OX40, resultando en la activación de NFKB. La medición se llevó a cabo a longitudes de onda de absorción de 450/620 nm en un lector de MTP Tecan (fig. 3). Los valores obtenidos de IC50 para todos los anticuerpos LC se encontraban en el intervalo de entre 0,6 y 5 nM.

Ejemplo 16

Ensayo de activación de células T Principio de ensayo:

se activaron células mononucleares de sangre periférica humana (PBL) con una concentración subóptima del mitógeno de células T fitohemaglutinina (PHA) y se coestimularon con células K562 sobreexpresantes de OX40L. Bajo las condiciones de ensayo, las células T activadas incubadas 24 h a 37ºC produjeron IL-2. Se midió la citoquina en el sobrenadante utilizando un ensayo ELISA. Para determinar el efecto de bloqueo de un mAb, las células K562_OX40L se preincubaron durante 1 hora con diluciones apropiadas del anticuerpo antes del cocultivo con PBL.

Procedimiento:

Se separaron células monucleares de sangre periférica humana (PBL) de sangre completa heparinizada, mediante centrifugación en gradiente de densidad en Histopaque®-1077 (Sigma). Tras lavar con solución de Hank, las células se contaron utilizando solución de Turk y se resuspendieron a una concentración de 106/ml en RPMI-1640 (Gibco), y se suplementó con penicilina, estreptomicina y glutamina (Gibco nº 10378-016) y FBS al 10%. Se mantuvieron células K562 de control (tipo salvaje) en el mismo medio RPMI suplemento tal como se ha indicado. Se mantuvieron células K562 transfectadas con OX40L en el mismo medio suplementado con geneticina (G418, Gibco) a una concentración final de 50 mg/ml. Se diluyeron las células K562 (WT o OX40L+) con el mismo medio a una densidad de 1,5x105 células/ml y se dispensaron en cada pocillo de una placa de cultivo de tejidos de 96 pocillos a razón de 50 ml/pocillo (0,75x104/pocillo). Se añadieron diluciones apropiadas del mAb a las células, en un volumen de 20 ml/pocillo, y se incubaron durante 1 h a 37ºC. Cada dilución se sometió a ensayo en pocillos por duplicado. Se añadió PBL a un volumen de 100 ml/pocillo (105 células/pocillo). La proporción final de PBL a células K562 era de

�13:1. Se añadió PHA (10X) (Sigma L-9132) a razón de 20 ml/pocillo (concentración final: 0,75 mg/ml). Se completó el volumen total de los pocillos a 200 ml con RPMI/FCS al 10%. Las placas se incubaron a 37ºC en un incubador humidificado con 5% de CO2 durante 24 h. Tras la centrifugación de las placas, se recogieron los sobrenadantes y se sometieron a ensayo para IL-2 mediante ELISA (BD, San Diego, CA, nº de cat. 2627KI), siguiendo las instrucciones del fabricante (fig. 4). Para calcular la IC50 (concentración de mAb que bloquea el 50% de la liberación de IL-2 por las PBL estimuladas con OX40L), la concentración de IL-2 de fondo producida en los cultivos de control (PBL+PHA+K562WT) se restó de la IL-2 total producida por PBL estimuladas con células K562-OX40L+ (fig. 5). IC50 TAG34: 0,07 mM; LC.001: 2 nM; LC.005: 10 nM. Los valores obtenidos de EC50 se encontraban en el intervalo de entre 2 y 10 nM.

Ejemplo 17

Ensayo de tétanos ('ensayo TT') que analiza el efecto inhibidor de los anticuerpos sobre los linfocitos de sangre periférica estimulados con toxoide tetánico

Se aislaron células mononucleares sanguíneas periféricas (PBMC) a partir de sangre heparinizada mediante Ficoll-Hypaque. En la mayoría de casos se utilizaron PBMC recién aisladas para este ensayo. En algunos casos también se utilizaron PBMC crioconservadas. El medio para este ensayo era RPMI que contenía suero AB masculino humano al 10% (Sigma-Aldrich), glutamina 2 mM y Pen/Strep (mezcla lista para utilizar de los antibióticos penicilina y estreptomicina (Roche Diagnostics GmbH, Alemania), liofilizado reconstituido en 20 ml; utilización de 2 ml por cada

1.000 ml de medio).

Con el fin de que pudiesen adherirse al plástico, se preincubaron 300.000 PBMC en cada pocillo durante la noche en placas de 96 pocillos de fondo plano.

Al día siguiente se añadió toxoide tetánico (TT) (Chiron Behring) a los pocillos a una concentración final de entre 2 y 5 mg/ml. Los pocillos de control positivo (máxima proliferación/estimulación) sólo contenían TT; a todos los demás pocillos se añadieron anticuerpos (en forma de IgG purificadas) a una concentración final de 10 mg/ml. Se incluyó el mAb murino TAG-34 en el ensayo (concentración final: 10 mg/ml). A modo de control de fonodo no estimulador se utilizó medio solo. Todos los ensayos se realizaron por triplicado.

Tras seis días de incubación adicional (37ºC, 5% de CO2, 95% de humedad), se añadió 3H-timidina a una concentración final de 1 mCurie/ml, y tras un periodo de incubación adicional de 16 h, se recolectaron las placas y se determinó la 3H-timidina incorporada en un contador beta (fig. 6).

Ejemplo 18

Reactividad cruzada de los anticuerpos de OX40L con OX40L de ratón

Para determinar la capacidad de los anticuerpos de la invención de reaccionar cruzadamente con OX40L murino, se incubaron anticuerpos diluidos en serie y anticuerpos de control con células K562-mOX40L que expresaban establemente mOX40L. También se evaluó la unión a las células K562 WT y a las células K562-hOX40L, que expresaban establemente hOX40L. A modo de control negativo se utilizó un anticuerpo HumAb dirigido contra la hemocianina de lapa americana (a-KLH). Se incluyó el anticuerpo RM134L, anticuerpo de rata anti-mOX40L (eBioscience, San Diego, CA) a modo de control positivo de la expresión de mOX40L. Se incluyó el anticuerpo TAG34, anticuerpo de ratón anti-hOX40L (MBL, Nagoya, Japón) a modo de control positivo de la expresión de hOX40L. Para la detección de los anticuerpos humanos unidos, se utilizó un anticuerpo de cabra anti-IgG humana conjugado con fluoresceína (FITC). Para la detección de RM134L unido, se utilizó un anticuerpo de conejo anti-IgG de rata biotinilado (DAKO, Glostrup, Dinamarca) en combinación con estreptavidina, conjugado con ficoeritrina (PE) (DAKO). Para la detección de TAG-34 unido, se utilizó un anticuerpo de conejo anti-IgG de ratón conjugado con FITC. Los cálculos de valores de EC50 o de unión máxima a 20 mg/ml (Bmax) de los HumAb sometidos a ensayo se calcularon a partir de la regresión no lineal (curva sigmoidal de respuesta a dosis con pendiente variable) utilizando el software Graphpad Prism.

Resultados:

LC.001 según la invención fue capaz de unirse a hOX40L, tal como indica un valor de EC50 de 5.16±2.93 mg/ml y un valor de Bmax (IFM) de 385,22, pero no a mOX40L o a células WT, tal como muestran los valores de Bmax (IFM) de 11,41 y 9,67, respectivamente. Además, LC.001 según la invención también fue capaz de unirse eficientemente a hOX40L, tal como indica un valor de EC50 de 8.19±1.05 mg/ml y un valor de Bmax (IFM) de 311,30, pero no a mOX40L o a células WT, tal como muestran los valores de Bmax (IFM) de 13,47 y 9,58, respectivamente. Tal como se esperaba, el control negativo de a-KLH no se unió a ninguna de las células (fig. 7). Por lo tanto, los anticuerpos de OX40L según la invención muestran una unión por lo menos 30 veces más baja a OX40L de ratón que a OX40L humano.

Ejemplo 19

Potencial de los HumAb de OX40L de activar el sistema del complemento

ELISA de unión de C1q y C3c

Para determinar la capacidad de los anticuerpos de la invención de inducir la unión de C1q y la activación de C3, se recubrió una placa de ELISA con anticuerpos diluidos en serie y anticuerpos de control. A modo de control negativo se utilizó IgG4 humano (The Binding Site, Birmingham, Inglaterra), que se une muy débilmente a C1q. Se incluyó IgG1 humano (The Binding Site) y a-KLH (IgG1) a modo de controles positivos. A continuación, se incubaron anticuerpos recubiertos con C1q recombinante o suero agrupado humano, como fuente de C3. Para la detección de C1q unido, se utilizó un anticuerpo de conejo dirigido contra C1q (DAKO) en combinación con anticuerpo porcino anti-IgG de conejo, conjugado con peroxidasa de rábano picante (HRP) (DAKO). Para la detección de C3c activado (generado mediante la activación de C3), se utilizaron un anticuerpo de ratón anti-C3c humano (DAKO) en combinación con un anticuerpo de conejo anti-IgG de ratón, conjugado con HRP (Jackson ImmunoResearch Laboratories, West Grove, PA). Para evaluar las diferencias de eficiencia de recubrimiento, se visualizaron los anticuerpos recubiertos con un anticuerpo de cabra anti-IgG humana, conjugado con HRP. Los cálculos de valores de EC50 o de unión máxima a 10 mg/ml (Bmax) de los HumAb sometidos a ensayo se calcularon a partir de la regresión no lineal (curva sigmoidal de respuesta a dosis con pendiente variable) utilizando el software Graphpad Prism.

Resultados:

LC.001 según la invención fue capaz de unirse eficientemente a C1q, tal como indica un valor de EC50 de 2,19±0,42 mg/ml y un valor de Bmax (DO405) de 3,089. Además, tanto la IgG humana de control positivo como anti-KLH pudieron unirse eficientemente a C1q, tal como indican los valores de EC50 de 4,17±1,08 mg/ml y 2,57±1,51 mg/ml, respectivamente, y valores de Bmax (DO405) de 2,685 y 3,306, respectivamente. Tal como se esperaba, la IgG4 humana de control negativo no se unía a C1q, tal como muestra un valor de Bmax (DO405) de 0,353. Además, LC.001IgG4x según la invención había perdido la capacidad de unirse a C1q, tal como muestra un valor de Bmax (DO405) de 0,357.

En línea con las capacidad de unión a C1q, se produjo deposición de C3c inducida por LC.001 de una manera dependiente de la concentración de anticuerpo, con un valor de EC50 de 2,67±0,16 mg/ml y un valor de Bmax (DO405) de 2,614. Además, tanto la IgG humana y anti-KLH de control positivo pudieron inducir eficientemente la deposición de C3c, tal como indican los valores de EC50 de 5,45±0,36 mg/ml y 2,16±0,26 mg/ml, respectivamente, y valores de Bmax (DO405) de 2,543 y 2,633, respectivamente. Tal como se esperaba, la IgG4 humana de control negativo no indujo la deposición de C3c, tal como muestra un valor de Bmax (DO405) de 0,095. Además, LC.001IgG4x según la invención había perdido la capacidad de inducir la deposición de C3c, tal como muestra un valor de Bmax (DO405) de 0,090 (figs. 8 y 9).

Ejemplo 20

Potencial de los HumAb de OX40L de unirse a los receptores I, IIa y IIb de Fcy

La citotoxicidad celular dependiente de anticuerpos (ADCC) inducida por IgG se encuentra mediada por los receptores de Fcy (FcyR) sobre las células efectoras. Para determinar la capacidad de los anticuerpos de la invención de unirse a los FcyR, se incubaron células IIA1.6 (derivadas mediante dilución limitante a partir de células IIA1; Jones B. et al. , J. Immunol. 136:348-356, 1986) establemente transfectadas con FcyRI, FcyRIIa, FcyRIIb humanos y células de tipo salvaje, con anticuerpos diluidos en serie y anticuerpos de control. A modo de controles negativos se utilizaron IgG2 humana (The Binding Site Ltd., Reino Unido), que no se une a FcyRI, e IgG4 humana (The Binding Site), que no se une a FcyRII. Se incluyó IgG1 humana (The Binding Site) como control positivo de la unión de FcyRI e IgG3 humana (The Binding Site) de la unión de FcyrII. Los anticuerpos unidos se detectaron mediante análisis de FACS utilizando un anticuerpo dirigido contra IgG humana conjugada con ficoeritrina (PE). Los cálculos de valores de EC50 o de unión máxima a 10 mg/ml (Bmax) de los HumAb sometidos a ensayo se calcularon a partir del ajuste de la curva de regresión no lineal (pendiente variable) utilizando el software Graphpad Prism.

LC.001 según la invención fue capaz de unirse eficientemente a FcyRI (en grado comparable al anticuerpo IgG1 de control), tal como indica un valor de EC50 de 0,11±0.03 mg/ml y un valor de Bmax (MFI) de 8041,54, pero no a FcyRIIa y a FcyRIIb, tal como muestran los valores de Bmax (MFI) de 25,06 y 21,18, respectivamente.

LC.0011gG4x era menos eficiente en la unión a FcyRI que LC.001, y comparable al anticuerpo IgG4 de control, con un valor de EC50 de 0,86±0,12 mg/ml y un valor de Bmax (IFM) de 6.030,07. No se observó unión de LC.001 IgG4x a FcyRIIa y a FcyRIIb (valores de Bmax (IFM) de 21,40 y 19,27, respectivamente), mientras que el anticuerpo IgG3 de control era capaz de unión (valores de Bmax (IFM) de 536,65 y 418,59, respectivamente) (fig. 10). Por lo tanto, el valor de EC50 de la unión a FcyRI para LC.001IgG4x era ocho veces el valor de EC50 del anticuerpo LC.001.

Ejemplo 21

Potencial de los HumAb de OX40L de unirse a FcyRIIIa sobre las células NK

Para determinar la capacidad de los anticuerpos de la invención de unirse a FcyRIIIa (CD16) sobre las células asesinas naturales (NK), se aislaron células mononucleares de sangre periférica (PBMC) y se incubaron con 20 mg/ml de anticuerpo HumAb y anticuerpos de control en presencia o en ausencia de 20 mg/ml de un anticuerpo de bloqueo de ratón contra FcyRIIIa (anti-CD16, clon 3G8, RDI, Flanders, NJ) con el fin de verificar la unión mediante FcyRIIIa. A modo de controles negativos se utilizó IgG2 e IgG4 humanos (The Binding Site), los cuales no se unen a FcyRIIIa. Se incluyeron IgG1 e IgG3 humanos (The Binding Site) a modo de controles positivos de la unión de FcyRIIIa. Los anticuerpos unidos sobre las células NK se detectaron mediante análisis de FACS utilizando un anticuerpo de ratón anti-CD56 humano marcado con PE (marcador de superficie celular de NK) (BD Biosciences Pharmingen, San Diego, CA) en combinación con un anticuerpo F(ab)2 de cabra anti-IgG (Fc) humana marcado con FITC (Protos Immunoresearch, Burlingame, CA). Se determinó el nivel máximo de unión a 20 mg/ml (Bmax) del HumAb sometido a ensayo.

LC.001

fue capaz de unirse eficientemente a FcyRIIIa (a nivel comparable al anticuerpo IgG1 de control), tal como indica un valor de Bmax (IFM) de 641,37. La adición de un anticuerpo de bloqueo contra FcyRIIIa anuló la unión de

LC.001

a las células NK (valor de Bmax (IFM) de 194,61, comparado con una tinción de fondo de 145,38). LC.001 IgG4x no se unía a FcyRIIIa y se comportó de manera comparable al anticuerpo IgG4 de control, con un valor de Bmax (IFM) de 170,52, resultando en una Bmax de LC.001 IgG4x que era de sólo aproximadamente 10% del valor Bmax de LC.001. La adición de un anticuerpo de bloqueo contra FcyRIIIa no presentó ningún efecto sobre la unión de LC.001 IgG4x (valor de Bmax (IFM) de 174,26) (fig. 11).

Ejemplo 22

Efecto de la unión de hmAb_hOX40L y mAb TAG-34 a HUVEC (células endoteliales de la vena umbilical humana primarias / PromoCell)

Se ha descrito que las células endoteliales expresan hOX40L (Kotani A. et al., Immunol. Lett. 84:1-7, 2002). Las células endoteliales de la vena umbilical humana (HUVEC) expresan naturalmente hOX40L y, por lo tanto, pudieron utilizarse como "modelo de célula endotelial". El objetivo del presente ensayo era determinar el destino de hOX40L sobre las células HUVEC tras la unión a los anticuerpos TAG-34 y LC.001.

Se descongelaron HUVEC y se expandieron en medio ECG-M más FCS al 2% durante 4 días en matraces T175 (Sarstedt). Se sembraron las células en placas de 24 pocillos (10.000 células/pocillo).

Tras 3 días, se cambió el medio a ECG-M + FCS al 0,5%. Se añadió anticuerpo (<KLH> (anticuerpo contra la hemocianina de lapa americana), TAG-34 ó LC.001 para la inducción de modulación negativa) a una concentración de 10 mg/ml y se incubó durante 2,5 h ó 24 h. Las células HUVEC se tiñeron nuevamente con TAG-34 ó con

LC.001. Se realizó tinción FCS con anticuerpo secundario contra IgG murina, marcada con Alexa488 (=<m>) o

5 contra IgG humana, marcada con Alexa488 (=<h>), cada una a 1,0 mg/ml. Se realizó la medición de FACS en FACS-scan (Becton Dickinson) y se calculó la intensidad de fluorescencia media (IFM).

Se utilizó el anticuerpo <KLH> a modo de control negativo no específico.

10 La Tabla 7 muestra que la adición de LC.001 no resulta en la modulación negativa de la expresión de OX40L sobre las células HUVEC ni tras 2,5 h ni tras 24 h (comparar la línea 4 con las líneas 5 y 6). Sin embargo, la adición de TAG-34 mostró una fuerte modulación negativa (aproximadamente de 3 veces) de hOX40L sobre las células HUVEC tras 2,5 h y también tras 24 h (comparar la línea 10 con las líneas 11 y 12).

15 Los anticuerpos según la invención a una concentración de 10 mg/ml no inducen la regulación negativa de la expresión de OX40L sobre las células HUVEC.

Tabla 7

mAb utilizado para la modulación negativa

mAb utilizado para la tinción mAb secundario para FACS IFM 2,5 h 24 h

1. control de medio

- <h> 5,17 5,39

2. control de medio

LC.001 <h> 28,52 24,99

3. <KLH>

- <h> 4,76 4,74

4. <KLH>

LC.001 <h> 31,44 23,07

5. LC.001

- <h> 36,52 30,78

6. LC.001

LC.001 <h> 38,58 38,69

7. control de medio

- <m> 3,66 3,18

8. control de medio

TAG-34 <m> 31,81 25,32

9. <KLH>

- <m> 3,68 3,43

10. <KLH>

TAG-34 <m> 30,79 31,58

11. TAG-34

- <m> 9,44 7,39

12. TAG34

TAG-34 <m> 8,97 14,89

20 Ejemplo 23

Análisis de transferencia western de TAG34, LC.001 y LC.005

Se prepararon 40 y 100 ng de hOX40L-His (R&D Systems, con un tamaño teórico de 28 a 34 kDa) y el marcador de

25 peso molecular Magik Mark XP (Invitrogen; 20, 30, 40, 50, 60, 80, 100, 120 y 220 kDa) para la electroforesis en gel. Por lo tanto, se mezclaron x ml de proteína, 2,5 ml de tampón para muestras LDS (sal dodecilsulfato de litio) de NuPage, 1 ml de agente reductor (10x) de NuPage y H2O hasta 10 ml, y se desnaturalizó durante 10 minutos a 70ºC. A continuación, las muestras se cargaron en un gel NuPage (Novex, Bis-Tris al 10%) y se realizó la migración durante 1 h a 150V en tampón de migración MOPS 1x (Novex).

30 Se transfirió el gel con un sistema Semi-Dry-Blot sobre una membrana de PVDF (Millipore; activación de la membrana mediante 5 minutos de incubación en metanol y 10 minutos de incubación en tampón de transferencia 1x) utilizando tampón de transferencia 1x de NuPage (tampón 1x, antioxidante al 0,1%, metanol al 10%) durante 1 h/50 mA en una cámara semiseca. La membrana se bloqueó en PBS 1x/leche al 5%/Tween al 0,5% bajo agitación

35 durante 1 h a TA. El anticuerpo primario (pAB) se diluyó en 1x PBS/leche al 1%/Tween al 0,5%, se añadió y se incubó durante la noche a 4ºC.

LC.001 : 1,9 1l (1,6 1g) en un volumen total de 4 ml

LC.005 : 1,1 1l (1,6 1g) / 4 ml 40 TAG34: 1,6 1l (1,6 1g) / 4ml

La membrana se lavó 3x durante 10 minutos en PBS 1x/Tween al 0,5%. El anticuerpo secundario (sAB) se diluyó en PBS 1x/leche al 1%/Tween al 0,5 %, se añadió y se incubó durante 1,5 h a TA. Para LC.001 y LC.005, se utilizó anticuerpo policlonal contra IgG humana (Pierce) a una dilución de 1:10.000 como sAB; para TAG34 se utilizó

45 anticuerpo policlonal contra IgG de ratón del kit de transferencia western Lumi-Light (Roche) a una dilución de 1:400 como sAB. La membrana se lavó 2x durante 30 minutos con PBS 1x/Tween al 0,5%. Para la detección se utilizó el kit de transferencia western Lumi-Light (Roche) siguiendo las instrucciones del fabricante. Los resultados de la transferencia western se muestran en la figura 12. LC.001 fue capaz de detectar (dodecilsulfato) OX40L desnaturalizado, mientras que LC.005 y TAG34 no se unieron a OX40L desnaturalizado.

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USA 90 (1993) 3720-3724 US 4,179,337 US 4,301,144 US 4,496,689 US 4,640,835 US 4,670,417 US 4,791,192 US 5,202,238 US 5,204,244 US 5,545,806 US 5,545,807 US 5,569,825 US 5,625,126 US 5,633,425 US 5,661,016 US 5,770,429 US 5,789,650 US 5,814,318 US 5,874,299 US 5,877,397 van de Winkel, J.G., and Anderson, C.L., J. Leukoc. Biol. 49 (1991) 511-524 van Dijk, M.A., and van de Winkel, J.G., Curr. Opin. Chem. Biol. 5 (2001) 368-374 Vitetta, E.S., et al., Science 238 (1987) 1098-1104 Ward, E.S., and Ghetie, V., Ther. Immunol. 2 (1995) 77-94 Weinberg, A.D., et al., J. Immunol. 162 (1999) 1818-1826

5 Weinberg, A.D., et al., Nature Medicine 2 (1996) 183-189 Weinberg, A.D., et al., Semin. Immunol. 10 (1998) 471-480 Weinberg, A.D., Trends Immunol. 23 (2002) 102-109 Werner, R.G., et al., Arzneimittelforschung 48 (1998) 870-880 WO 01/14424

10 WO 87/05330 WO 92/03918 WO 92/22645 WO 93/1227 WO 94/11026

15 WO 94/25585 WO 95/12673 WO 95/21915 WO 98/24884 WO 99/15200

20 Wu, T., et al., Transplant. Proc. 33 (2001) 217-218 Yoshioka, T., et al., Eur. J. Immunol. 30 (2000) 2815-2823 LISTADO DE SECUENCIAS

<110> F. Hoffmann-La Roche AG

5 <120> ANTICUERPOS ANTI-OX40L

<130> 22672 WO

<150> EP 04022158 10 <151> 2004-09-17

<150> EP 04030546

<151> 2004-12-23

15 <160> 69

<170> Patent In versión 3.2

<210> 1 20 <211> 107

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 25 <223> cadena ligera, región variable de LC.001, LC.059 y LC.063

<400> 1

30 35

<210> 2 <211> 120 <212> PRT <213> Artificial

36

<220>

<223> cadena pesada, región variable de LC.001

<400> 2

<210> 3

<213> Artificial

<220>

<223> cadena ligera, región variable de LC.005

<400> 3 <210> 4

<211> 120

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> cadena pesada, región variable de LC.005

10 <400> 4 <210> 5

<213> Artificial

<220>

<223> cadena ligera, región variable de LC.010

<400> 5

<210> 6 15 <211> 120

<212> PRT

<213> Artificial

<220> 20 <223> cadena pesada, región variable de LC.010

<400> 6 <210> 7

<213> Artificial

<220>

<223> cadena ligera, región variable de LC.029

<400> 7 <210> 8

<211> 120

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> cadena pesada, región variable de LC.029

10 <400> 8 <212> PRT

<210> 9

<211> 57

<212> PRT

<213> Artificial

5

<220>

<223> cadena ligera, región variable de LC.019

<400> 9

10

<213> Artificial

<220>

20 <223> cadena pesada, región variable de LC.019

<400> 10

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

10 <223> cadena ligera, región variable de LC.033 (a)

<400> 11

<210> 12

<213> Artificial

<220>

<223> cadena pesada, región variable de LC.033

<400> 12

<210> 13

<213> Artificial

<220>

<223> cadena ligera, región constante

<400> 13

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

10 <223> cadena pesada, región constante (gamma 1)

10 10

<400> 14

<210> 15

<211> 327

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> cadena pesada, región constante (gamma 4)

<400> 15

<210> 16

<211> 104

<212>

PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> cadena ligera, región variable de LC.033 (b)

<210> 17

<213> Artificial

<220>

<223> cadena pesada, región variable de LC.059

<400> 17

<210> 18

<211> 106

<212>

PRT 5 <213> Artificial

10 <400> 16

<220>

<223> cadena ligera, región variable de LC.060

10 <400> 18 <210> 19

<213> Artificial

<220>

<223> cadena pesada, región variable de LC.060

<400> 19 <210> 20

<213> Artificial

<220>

<223> cadena pesada, región variable de LC.063

<400> 20 5 <210> 21

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

10 <220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 21

15 <210> 22

<211> 5

<212> PRT

<213> Artificial

20 <220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 22

<210> 23

<211> 5

<212> PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

10 <400> 23

<210> 24

<211> 5

<212> PRT 15 <213> Artificial

<220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

20 <400> 24

<210> 25

<211> 5

<212> PRT 25 <213> Artificial

<220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

30 <400> 25

<210> 26

<211> 17

<212> PRT 35 <213> Artificial

<220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

40 <400> 26

<210> 27

<211> 17

<212> PRT 45 <213> Artificial

<220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 27

<210> 28

<211> 17

<212> PRT 10 <213> Artificial

<220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

15 <400> 28

<210> 29

<211>

17 20 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 29

<210> 30

<213> Artificial

<220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 30

<210> 31

<211> 18

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 31

<210> 33

<211>

11 25 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 33

<210> 34

<211>

11 35 <212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 34

<210> 35

<211>

7 45 <212> PRT

35 30

15

<211> 18 <212> PRT <213> Artificial <220> <223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 32

20

<213> Artificial <220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 35

<210> 36

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 36

<210> 37

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 37

<210> 38

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 38

<210> 39

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 39

<210> 40

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 40

5 <210> 41

<211> 12

<212> PRT

<213> Artificial

10 <220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 41

15 <210> 42

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

20 <220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 42

25 <210> 43

<211> 11

<212> PRT

<213> Artificial

30 <220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 43

35 <210> 44

<211> 24

<212> PRT

<213> Artificial

40 <223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 44

<210> 45

<211> 7

<212> PRT <213> Artificial

<220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 45

<210> 46

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 46

<210> 47

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 47

<210> 48

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 48

<210> 49

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 49

<210> 50

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 50

<210> 51

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 51

<210> 52

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 52

<210> 53

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 53

<210> 54

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 54

<210> 55

<211> 7

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 55

<210> 56

<211> 8

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 56

<210> 57

<211> 9

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> CDR / fragmento de anticuerpo

<400> 57

<210> 58

<211> 450

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> cadena pesada de LC.001 (de tipo IgG1 humana)

<400> 58

<210> 59

<211> 450

<212>

PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> cadena pesada de LC.001 (mutante L234A, L235A de IgG1 humana)

<210> 60

<213> Artificial

<220>

<223> cadena pesada de LC.001 (mutante S228P de IgG4 humana)

<400> 60

<210> 61

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> cadena ligera de LC.001

<400> 61

<210> 62

<211> 450

<212>

PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> cadena pesada de LC.005 (tipo IgG1 humana)

<210> 63

<211> 450

<212>

PRT 5 <213> Artificial

<220>

<223> cadena pesada de LC.005 (mutante L234A, L235A de IgG1 humana)

<210> 64

<211> 447

<212>

PRT 5 <213> Artificial

10 <400> 59

10 <400> 62

10 <400> 63

<220>

<223> cadena pesada de LC.005 (mutante S228P de IgG4 humana)

10 <400> 64

<210> 65

<211> 214

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> cadena ligera de LC.005

<400> 65

<210> 66

<211> 449

<212> PRT

<213> Artificial

<220>

<223> cadena pesada de LC.060 (de tipo IgG1 humana)

<400> 66

<210> 67

<213> Artificial

<220>

<223> heavy chain LC.060 (L234A, L235A human IgG1 mutant)

<400> 67

<210> 68

<213> Artificial

<220>

<223> cadena pesada de LC.060 (mutante S228P de IgG4 mutante)

<400> 68

<210> 69

<211> 213

<212> PRT

<213> Artificial <220>

<223> cadena ligera de LC.060

<400> 69

Claims (14)

1. REIVINDICACIONES

   1.

   Anticuerpo de unión a OX40L humano, caracterizado porque el anticuerpo comprende CDR de entre las CDR de cadena ligera (VL) de secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1 y las CDR variables de cadena pesada (VH) de SEC ID nº 2.

2. 2.

   Anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado porque comprende el dominio variable de cadena ligera definido por la secuencia de aminoácidos SEC ID nº 1 y el dominio variable de cadena pesada definido por SEC ID nº 2.

3. 3.

   Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, caracterizado porque el anticuerpo comprende una región constante de cadena ligera kappa según se define en SEC ID nº 13 ó la región constante de cadena ligera de SEC ID nº 61.

4. 4.

   Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque el anticuerpo comprende una región constante pasada según se define en SEC ID nº 14 ó en SEC ID nº 58, nº 59 ó nº 60.

5. 5.

   Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque la región constante de cadena ligera kappa del mismo se define en SEC ID nº 61 y la región constante pesada del mismo se define en SEC ID nº 58, nº 59 ó nº 60.

6. 6.

   Anticuerpo según la reivindicación 1, caracterizado porque es producido por la línea celular humAb<hOX40L>LC.001.

7. 7.

   Anticuerpo que es un fragmento Fab, F(ab')2 o un fragmento de cadena sencilla de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 y que se une a OX40L humano.

8. 8.

   Molécula de ácidos nucleicos codificante de una molécula de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7.

9. 9.

   Vector que comprende la molécula de ácidos nucleicos según la reivindicación 8.

10. 10.

    Célula huésped que comprende el vector según la reivindicación 9.

11. 11.

    Método para la preparación de una molécula de anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, que comprende cultivar la célula huésped según la reivindicación 10 bajo condiciones que permiten la síntesis de dicha molécula de anticuerpo y recuperar dicha molécula de anticuerpo a partir de dicho cultivo.

12. 12.

    Composición farmacéutica que comprende un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 y por lo menos un excipiente farmacéuticamente aceptable.

13. 13.

    Anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la utilización en la profilaxis y tratamiento de trastornos inflamatorios.

14. 14.

    Utilización de un anticuerpo según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7 para la preparación de un medicamento destinado a la profilaxis y tratamiento de trastornos inflamatorios.