TWI748962B - 抗ｖｅｇｆ抗體之最佳化變異體 - Google Patents

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Abstract

本發明提供抗VEGF抗體及包括抗VEGF抗體之組成物(例如，抗體結合物、融合蛋白質及聚合物調配物)及其用途，例如用於治療與病理性血管生成相關之病症。本發明亦提供鑑別具有改良之性質，例如增強之結合親和力、穩定性、藥物動力學及/或表現的抗體變異體的方法。

Description

抗VEGF抗體之最佳化變異體
本發明大體上係關於具有有益於研究、治療及診斷目的之性質的抗VEGF抗體以及包括抗VEGF抗體之組成物(例如抗體結合物、融合蛋白質及聚合物調配物)。本發明亦係關於鑑別具有改良之性質，例如增強之結合親和力、穩定性及/或表現的抗體變異體的方法。
血管生成為受到嚴格調控之過程，藉此由預先存在之血管形成新血管。儘管血管生成在發育以確保充分血液循環期間非常重要，但許多病症與病理性血管生成相關，諸如眼部病症(例如，年齡相關性黃斑變性，AMD)及細胞增殖性病症(例如，癌症)。血管內皮生長因子(VEGF)為經臨床驗證之血管生成驅動因子，且例如使用抗VEGF阻斷抗體中和VEGF可用於治療與病理性血管生成相關之病症。
仍需要具有增強之結合親和力、穩定性、藥物動力學及/或表現之抗體，諸如抗VEGF抗體，例如，以用於治療與病理性血管生成相關之病症。特定言之，需要長效遞送之抗體組成物以用於治療眼部病症(例如，AMD(例如，濕性AMD)、糖尿病性黃斑水腫(DME)、糖尿病性視網膜病(DR)及視網膜靜脈阻塞(RVO))。另外，對於鑑別此種具有改良之性質(例如，增強之結合親和力、穩定性、藥物動力學及/或表現)之抗體的改良型方法的需要未得以滿足。
本發明提供抗VEGF抗體、包括抗VEGF抗體之組成物(例如抗體結合物、融合蛋白質及聚合物調配物)及其使用方法，例如用於治療與病理性血管生成相關之病症(例如，眼部病症及細胞增殖性病症)。本發明亦提供鑑別具有改良之性質，例如增強之結合親和力、穩定性、藥物動力 學及/或表現的抗體變異體的方法。
在一個態樣中，本發明提供一種經分離之抗體，其特異性結合血管內皮生長因子(VEGF)，其中該抗體包含以下六個高變區(HVR)：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列DYWIH(SEQ ID NO：1)；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列GX1TPX2GGX3X4X5YX6DSVX7X8(SEQ ID NO：2)，其中X1為Ile或His，X2為Ala或Arg，X3為Tyr或Lys，X4為Thr或Glu，X5為Arg、Tyr、Gln或Glu，X6為Ala或Glu，X7為Lys或Glu，且X8為Gly或Glu；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQX1VSTAVA(SEQ ID NO：4)，其中X1為Asp或Arg；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列X1ASFLYS(SEQ ID NO：5)，其中X1為Ser或Met；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列X1QGYGX2PFT(SEQ ID NO：6)，其中X1為Gln、Asn或Thr，且X2為Ala、Asn、Gln或Arg。在一些實施例中，該抗體包含以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列DYWIH(SEQ ID NO：1)；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列GITPAGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO：7)、GITPAGGYEYYADSVKG(SEQ ID NO：21)或GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO：22)；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：8)；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：9)；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)或QQGYGNPFT(SEQ ID NO：23)。
在以上態樣之一些實施例中，該抗體包含以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列DYWIH(SEQ ID NO：1)；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列GITPAGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO：7)；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：8)；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：9)；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)。在一些實施例中，該抗體進一步包含以下重鏈可變(VH)域架構區(FR)：(a)FR-H1，其包含胺基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS(SEQ ID NO：13)；(b)FR-H2， 其包含胺基酸序列WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO：14)；(c)FR-H3，其包含胺基酸序列RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：15)；及(d)FR-H4，其包含胺基酸序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：16)。在一些實施例中，該抗體進一步包含以下輕鏈可變(VL)域FR：(a)FR-L1，其包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：17)；(b)FR-L2，其包含胺基酸序列WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：18)；(c)FR-L3，其包含胺基酸序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO：19)；及(d)FR-L4，其包含胺基酸序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)。
在以上態樣之一些實施例中該抗體包含以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列DYWIH(SEQ ID NO：1)；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO：22)；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：8)；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：9)；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQGYGNPFT(SEQ ID NO：23)。在一些實施例中，該抗體進一步包含以下VL域FR：(a)FR-L1，其包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：17)；(b)FR-L2，其包含胺基酸序列WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：18)；(c)FR-L3，其包含胺基酸序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：24)；及(d)FR-L4，其包含胺基酸序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)。
在以上態樣之一些實施例中該抗體包含以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列DYWIH(SEQ ID NO：1)；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO：22)；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：8)；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：9)；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)。在一些實施例中，該抗體進一步包含以下VL域FR：(a)FR-L1，其包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGD RVTITC(SEQ ID NO：17)、DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO：25)或DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO：26)；(b)FR-L2，其包含胺基酸序列WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：18)或WYQQKPGEAPKLLIY(SEQ ID NO：27)；(c)FR-L3，其包含胺基酸序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO：19)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC(SEQ ID NO：28)；及(d)FR-L4，其包含胺基酸序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)。在一些實施例中，該抗體進一步包含以下VH域FR：(a)FR-H1，其包含胺基酸序列EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO：29)或EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO：51)；(b)FR-H2，其包含胺基酸序列WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO：30)；(c)FR-H3，其包含胺基酸序列RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：31)；及(d)FR-H4，其包含胺基酸序列WGQGELVTVSS(SEQ ID NO：32)。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離之抗體，其特異性結合VEGF，其中該抗體包含：(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：11、40或42之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：12、41或46之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。在一些實施例中，該VH域進一步包含以下FR：(a)FR-H1，其包含胺基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS(SEQ ID NO：13)；(b)FR-H2，其包含胺基酸序列WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO：14)或WVRQEPGKGLEWVA(SEQ ID NO：39)；(c)FR-H3，其包含胺基酸序列RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：15)；及(d)FR-H4，其包含胺基酸序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：16)。在一些實施例中，該VH域包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列。在一些實施例中，該VL域進一步包含以下FR：(a)FR-L1，其包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：17)或DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIDC(SEQ ID NO：45)；(b)FR-L2，其包含胺基酸序列WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：18)；(c)FR-L3，其包含胺基酸序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPED AATYYC(SEQ ID NO：19)、GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYC(SEQ ID NO：44)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC(SEQ ID NO：54)；及(d)FR-L4，其包含胺基酸序列FGQGTKVEIK(SEQ I D NO：20)或FGQGTKVEVK(SEQ ID NO：55)。在一些實施例中，該VL域包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離之抗體，其特異性結合VEGF，其中該抗體包含：(a)VH域，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列；及(b)VL域，其包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離之抗體，其特異性結合VEGF，其中該抗體包含：(a)VH域，其包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列；及(b)VL域，其包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離之抗體，其特異性結合VEGF，其中該抗體包含：(a)VH域，其包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列；及(b)VL域，其包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離之抗體，其特異性結合VEGF，其中該抗體包含：(a)VH域，其包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列；及(b)VL域，其包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離之抗體，其特異性結合VEGF，其中該抗體包含：(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：33或51之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：12、34、35、36、37或38之胺基酸序列具有至少95%序列一致性的胺基酸序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。在一些實施例中，該抗體進一步包含以下FR：(a)FR-H1，其包含胺基酸序列EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO：29)或EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO：52)；(b)FR-H2，其包含胺基酸序列WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO：30)；(c)FR-H3，其包含胺基酸序列RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：31)；及(d)FR-H4，其包含胺基酸序列WGQGELVTVSS(SEQ ID NO：32)。在一些實施例中，該VH域包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列。在一些實 施例中，該VH域包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列。在一些實施例中，該抗體進一步包含以下FR：(a)FR-L1，其包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：17)、DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO：25)或DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO：26)；(b)FR-L2，其包含胺基酸序列WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：18)或WYQQKPGEAPKLLIY(SEQ ID NO：27)；(c)FR-L3，其包含胺基酸序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO：19)、GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：24)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC(SEQ ID NO：28)；及(d)FR-L4，其包含胺基酸序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)。在一些實施例中，該VL域包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列。在一些實施例中，該VL域包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列。在一些實施例中，該VL域包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列。在一些實施例中，該VL域包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列。在一些實施例中，該VL域包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列。在一些實施例中，該VL域包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離之抗體，其特異性結合VEGF，其中該抗體包含：(a)VH域，其包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列；及(b)VL域，其包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離之抗體，其特異性結合VEGF，其中該抗體包含：(a)VH域，其包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列；及(b)VL域，其包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離之抗體，其特異性結合VEGF，其中該抗體包含：(a)VH域，其包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列；及(b)VL域，其包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離之抗體，其特異性結合VEGF，其中該抗體包含：(a)VH域，其包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列；及(b)VL域，其包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離之抗體，其特異性結合VEGF，其中該抗體包含：(a)VH域，其包含SEQ ID NO：33之胺基酸序 列；及(b)VL域，其包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離之抗體，其特異性結合VEGF，其中該抗體包含：(a)VH域，其包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列；及(b)VL域，其包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離之抗體，其特異性結合VEGF，其中該抗體包含：(a)VH域，其包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列；及(b)VL域，其包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離之抗體，其特異性結合VEGF，其中該抗體包含：(a)VH域，其包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列；及(b)VL域，其包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離之抗體，其特異性結合VEGF，其中該抗體包含：(a)VH域，其包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列；及(b)VL域，其包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離之抗體，其特異性結合VEGF，其中該抗體包含：(a)VH域，其包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列；及(b)VL域，其包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離之抗體，其特異性結合VEGF，其中該抗體包含：(a)重鏈，其包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列；及(b)輕鏈，其包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列。
在另一態樣中，本發明提供一種經分離之抗體，其特異性結合VEGF，其中該抗體包含：(a)重鏈，其包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列；及(b)輕鏈，其包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該抗體能夠抑制VEGF與VEGF受體之結合。在一些實施例中，該VEGF受體為VEGF受體1(Flt-1)。在一些實施例中，該VEGF受體為VEGF受體2(KDR)。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該抗體以約2nM或更低之Kd結合人類VEGF(hVEGF)。在一些實施例中，該抗體以介於約75pM與約2nM之間的Kd結合hVEGF。在一些實施例中，該抗體以介於約75pM與約600pM之間的Kd結合hVEGF。在一些實施例中，該抗體以介 於約75pM與約500pM之間的Kd結合hVEGF。在一些實施例中，該抗體以約80pM之Kd結合hVEGF。在一些實施例中，該抗體以約60pM之Kd結合hVEGF。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該抗體具有超過約83.5℃之解鏈溫度(Tm)。在一些實施例中，該抗體具有約85℃至約91℃之Tm。在一些實施例中，該抗體具有約89℃之Tm。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該抗體具有低於8之等電點(pI)。在一些實施例中，該抗體具有約5至約7之pI。在一些實施例中，該抗體具有約5至約6之pI。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該抗體為單株抗體、人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該抗體為結合VEGF之抗體片段。在一些實施例中，該抗體片段選自由以下各項組成之群：Fab、Fab-C、Fab'-SH、Fv、scFv及(Fab')2片段。在一些實施例中，該抗體片段為Fab。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該抗體為單特異性抗體。在前述態樣中任一者之其他實施例中，該抗體為多特異性抗體。在一些實施例中，該多特異性抗體為雙特異性抗體。在一些實施例中，該雙特異性抗體結合VEGF及第二生物分子，該第二生物分子選自由以下各項組成之群：介白素Iβ(IL-1β)；介白素-6(IL-6)；介白素-6受體(IL-6R)；介白素-13(IL-13)；IL-13受體(IL-13R)；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體；ST-2受體；及與年齡相關性黃斑變性(AMD)風險基因相關之蛋白質。在一些實施例中，該VEGF受體為VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、膜結合型VEGF受體(mbVEGFR)或可溶性VEGF受體(sVEGFR)。在一些實施例中，該與AMD風險基因相關之蛋白質選自由以下各項組成之群：補體途徑組件C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；介白素-8(IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC、COL10A1；及TNFRSF10A。
在另一態樣中，本發明提供一種多核苷酸(例如，經分離之多核苷酸)，其編碼本文中所描述之任何抗體。在另一態樣中，本發明提供一種載體(例如，表現載體)，其包含用於表現該抗體之多核苷酸。在另一態樣中，本發明提供包含前述多核苷酸及/或載體之宿主細胞。在一些實施例中，該宿主細胞為哺乳動物細胞。在一些實施例中，該哺乳動物細胞為293細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、酵母細胞或植物細胞。在一些實施例中，該宿主細胞為原核細胞。在一些實施例中，該原核細胞為大腸桿菌。
在另一態樣中，本發明提供一種產生本文中所描述之任何抗體的方法，該方法包括在培養基中培養包含任何前述載體(例如表現載體)之宿主細胞。在一些實施例中，該方法進一步包括自該宿主細胞或該培養基回收該抗體。在一些實施例中，該哺乳動物細胞為293細胞、中國倉鼠卵巢(CHO)細胞、酵母細胞或植物細胞。在一些實施例中，該宿主細胞為原核細胞。在一些實施例中，該原核細胞為大腸桿菌。
在另一態樣中，本發明提供一種在患有與病理性血管生成相關之病症的個體中減少或抑制血管生成的方法，其包括向該個體投與有效量之任一種前述抗體，從而在該個體中減少或抑制血管生成。在一些實施例中，該與病理性血管生成相關之病症為眼部病症或細胞增殖性病症。在一些實施例中，該與病理性血管生成相關之病症為眼部病症。在一些實施例中，該眼部病症選自由以下各項組成之群：年齡相關性黃斑變性(AMD)、黃斑變性、黃斑水腫、糖尿病性黃斑水腫(DME)(包括局部非中心性DME及擴散性中心參與性DME)、視網膜病、糖尿病性視網膜病(DR)(包括增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)及高原DR)、其他局部缺血相關性視網膜病、早產兒視網膜病(ROP)、視網膜靜脈阻塞(RVO)(包括中央形式(CRVO)及分枝形式(BRVO))、CNV(包括近視性CNV)、角膜新血管形成、與角膜新血管形成相關之疾病、視網膜新血管形成、與視網膜/脈絡膜新血管形成相關之疾病、病理性近視、馮希伯-林島氏病(von Hippel-Lindau disease)、眼組織胞漿菌病、家族性滲出性玻璃體視網膜病變(FEVR)、柯氏病(Costs' disease)、諾裡氏病(Norrie Disease)、骨質疏鬆症-假神經膠質瘤症候群(OPPG)、結膜下出血、虹膜發紅、眼部新血管疾病、新血管性青光眼、色 素性視網膜炎(RP)、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤性增生、黃斑毛細血管擴張、虹膜新血管形成、眼內新血管形成、視網膜變性、囊樣黃斑水腫(CME)、血管炎、視乳頭水腫、視網膜炎、結膜炎(包括感染性結膜炎及非感染性(例如過敏性)結膜炎)、萊伯先天性黑矇(Leber congenital amaurosis)、葡萄膜炎(包括感染性及非感染性葡萄膜炎)、脈絡膜炎、眼組織胞漿菌病、瞼緣炎、乾眼症、創傷性眼損傷及修格連氏病(Sjögren's disease)。在一些實施例中，該眼部病症為AMD、DME、DR或RVO。在一些實施例中，該眼部病症為AMD。在一些實施例中，該AMD為濕性AMD。在一些實施例中，該與病理性血管生成相關之病症為細胞增殖性病症。在一些實施例中，該細胞增殖性病症為癌症。在一些實施例中，該癌症選自由以下各項組成之群：乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、腎癌、前列腺癌、肝癌、頭頸癌、黑色素瘤、卵巢癌、間皮瘤及多發性骨髓瘤。
在另一態樣中，本發明提供一種治療與病理性血管生成相關之病症的方法，該方法包括向需要此種治療之個體投與有效量之任一種前述抗體。在一些實施例中，該與病理性血管生成相關之病症為眼部病症或細胞增殖性病症。在一些實施例中，該與病理性血管生成相關之病症為眼部病症。在一些實施例中，該眼部病症選自由以下各項組成之群：年齡相關性黃斑變性(AMD)、黃斑變性、黃斑水腫、糖尿病性黃斑水腫(DME)(包括局部非中心性DME及擴散性中心參與性DME)、視網膜病、糖尿病性視網膜病(DR)(包括增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)及高原DR)、其他局部缺血相關性視網膜病、早產兒視網膜病(ROP)、視網膜靜脈阻塞(RVO)(包括中央形式(CRVO)及分枝形式(BRVO))、CNV(包括近視性CNV)、角膜新血管形成、與角膜新血管形成相關之疾病、視網膜新血管形成、與視網膜/脈絡膜新血管形成相關之疾病、病理性近視、馮希伯-林島氏病、眼組織胞漿菌病、家族性滲出性玻璃體視網膜病變(FEVR)、柯氏病、諾裡氏病、骨質疏鬆症-假神經膠質瘤症候群(OPPG)、結膜下出血、虹膜發紅、眼部新血管疾病、新血管性青光眼、色素性視網膜炎(RP)、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤性增生、黃斑毛細血管擴張、虹膜新血管形成、眼內新血管 形成、視網膜變性、囊樣黃斑水腫(CME)、血管炎、視乳頭水腫、視網膜炎、結膜炎(包括感染性結膜炎及非感染性(例如過敏性)結膜炎)、萊伯先天性黑矇、葡萄膜炎(包括感染性及非感染性葡萄膜炎)、脈絡膜炎、眼組織胞漿菌病、瞼緣炎、乾眼症、創傷性眼損傷及修格連氏病。在一些實施例中，該眼部病症為AMD、DME、DR或RVO。在一些實施例中，該眼部病症為AMD。在一些實施例中，該AMD為濕性AMD。在一些實施例中，該與病理性血管生成相關之病症為細胞增殖性病症。在一些實施例中，該細胞增殖性病症為癌症。在一些實施例中，該癌症選自由以下各項組成之群：乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、腎癌、前列腺癌、肝癌、頭頸癌、黑色素瘤、卵巢癌、間皮瘤及多發性骨髓瘤。
在另一態樣中，本發明提供一種在受與不合需要之血管滲透相關之病症困擾的個體中抑制血管滲透的方法，該方法包括向該個體投與有效量之任一種前述抗體，從而在該個體中抑制血管滲透。
在另一態樣中，本發明提供一種治療與不合需要之血管滲透相關之病症的方法，該方法包括向需要此種治療之個體投與有效量之任一種前述抗體。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該與不合需要之血管滲透相關之病症選自由以下各項組成之群：與腦腫瘤相關之水腫、與惡性病相關之腹水、梅格斯氏症候群(Meigs' syndrome)、肺炎、腎病症候群、心包膜積液、胸膜積液及與心血管疾病相關之滲透。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該方法進一步包括向該個體投與有效量之第二藥劑，其中該第二藥劑選自由以下各項組成之群：另一抗體、化學治療劑、細胞毒性劑、抗血管生成劑、免疫抑制劑、前藥、細胞因子、細胞因子拮抗劑、細胞毒性放射療法、皮質類固醇、抗吐劑、癌症疫苗、止痛劑、生長抑制劑及結合第二生物分子之化合物。在一些實施例中，該抗血管生成劑為VEGF拮抗劑。在一些實施例中，該VEGF拮抗劑為抗VEGF抗體、抗VEGF受體抗體、可溶性VEGF受體融合蛋白質、適體、抗VEGF DARPin®或VEGFR酪胺酸激酶抑制劑。在一些實施例中，該抗VEGF抗體為雷珠單抗(LUCENTIS®)、RTH-258或雙特異性抗 VEGF抗體。在一些實施例中，該雙特異性抗VEGF抗體為抗VEGF/抗Ang2抗體。在一些實施例中，該抗VEGF/抗Ang2抗體為RG-7716。在一些實施例中，該可溶性VEGF受體融合蛋白質為阿柏西普(aflibercept)(EYLEA®)。在一些實施例中，該適體為哌加他尼(pegaptanib)(MACUGEN®)。在一些實施例中，該抗VEGF DARPin®為abiciparpegol。在一些實施例中，該VEGFR酪胺酸激酶抑制劑選自由以下各項組成之群：4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯啶-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787)、司馬沙尼(semaxaminib)(SU5416)及SUTENT®(舒尼替尼(sunitinib))。在一些實施例中，該第二生物分子選自由以下各項組成之群：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體；ST-2受體；及與AMD風險基因相關之蛋白質。在一些實施例中，該VEGF受體為VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR。在一些實施例中，該與AMD風險基因相關之蛋白質選自由以下各項組成之群：補體途徑組件C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC、COL10A1；及TNFRSF10A。在一些實施例中，該結合第二生物分子之化合物為抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，該抗原結合抗體片段選自由以下各項組成之群：Fab、Fab-C、Fab'-SH、Fv、scFv及(Fab')2片段。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該抗體係經玻璃體內、經眼、經眼內、經鞏膜旁、經德濃氏囊下、經脈絡膜周隙、經局部、經靜脈內、經肌肉內、經真皮內、經皮膚、經動脈內、經腹膜內、經病變內、經顱骨內、經關節內、經前列腺內、經胸膜內、經氣管內、經鞘內、經鼻內、經陰道內、經直腸內、經局部、經腫瘤內、經腹膜內、經腹膜、經心室內、經皮下、經結膜下、經膀胱內、經黏膜、經心包內、經臍靜脈內、經眶內、經口、透皮、藉由吸入、藉由注射、藉由滴眼劑、藉由植入、藉由輸注、藉由連續輸注、藉由直接局部灌注浸浴靶細胞、藉由導管、藉 由灌洗、於乳膏中或於脂質組成物中投與。在一些實施例中，該抗體係經玻璃體內、經眼、經眼內、經鞏膜旁、經德濃氏囊下、經脈絡膜周隙或經局部投與。在一些實施例中，該抗體係藉由注射而經玻璃體內投與。在一些實施例中，該抗體係藉由滴眼劑或軟膏而經局部投與。在一些實施例中，該抗體係藉由孔口式遞送裝置投與。在一些實施例中，該個體為人類。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含任一種前述抗體。在一些實施例中，該醫藥調配物進一步包含聚合物。在一些實施例中，該聚合物為生物可降解聚合物。在一些實施例中，該醫藥組成物調配為聚合物溶劑貯庫、聚合物植入物或聚合物微胞。在一些實施例中，該聚合物為聚乳酸聚羥基乙酸(PLGA)共聚物。在一些實施例中，該醫藥組成物係調配為PLGA棒體。在一些實施例中，該醫藥組成物用於在哺乳動物中治療與病理性血管生成相關之病症或與不合需要之血管滲透相關之病症。在一些實施例中，該與病理性血管生成相關之病症為眼部病症或細胞增殖性病症。在一些實施例中，該與病理性血管生成相關之病症為眼部病症。在一些實施例中，該眼部病症選自由以下各項組成之群：年齡相關性黃斑變性(AMD)、黃斑變性、黃斑水腫、糖尿病性黃斑水腫(DME)(包括局部非中心性DME及擴散性中心參與性DME)、視網膜病、糖尿病性視網膜病(DR)(包括增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)及高原DR)、其他局部缺血相關性視網膜病、早產兒視網膜病(ROP)、視網膜靜脈阻塞(RVO)(包括中央形式(CRVO)及分枝形式(BRVO))、CNV(包括近視性CNV)、角膜新血管形成、與角膜新血管形成相關之疾病、視網膜新血管形成、與視網膜/脈絡膜新血管形成相關之疾病、病理性近視、馮希伯-林島氏病、眼組織胞漿菌病、家族性滲出性玻璃體視網膜病變(FEVR)、柯氏病、諾裡氏病、骨質疏鬆症-假神經膠質瘤症候群(OPPG)、結膜下出血、虹膜發紅、眼部新血管疾病、新血管性青光眼、色素性視網膜炎(RP)、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤性增生、黃斑毛細血管擴張、虹膜新血管形成、眼內新血管形成、視網膜變性、囊樣黃斑水腫(CME)、血管炎、視乳頭水腫、視網膜炎、結膜炎(包括感染性結膜炎及非感染性(例如過敏性)結膜炎)、萊伯先天性黑矇、葡萄膜炎(包括感染性及非感染性葡萄膜炎)、脈絡膜炎、眼組織胞漿菌 病、瞼緣炎、乾眼症、創傷性眼損傷及修格連氏病。在一些實施例中，該眼部病症為AMD、DME、DR或RVO。在一些實施例中，該眼部病症為AMD。在一些實施例中，該AMD為濕性AMD。在一些實施例中，該與病理性血管生成相關之病症為細胞增殖性病症。在一些實施例中，該細胞增殖性病症為癌症。在一些實施例中，該癌症選自由以下各項組成之群：乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、腎癌、前列腺癌、肝癌、頭頸癌、黑色素瘤、卵巢癌、間皮瘤及多發性骨髓瘤。在一些實施例中，該與不合需要之血管滲透相關之病症選自由以下各項組成之群：與腦腫瘤相關之水腫、與惡性病相關之腹水、梅格斯氏症候群、肺炎、腎病症候群、心包膜積液、胸膜積液及與心血管疾病相關之滲透。在一些實施例中，該醫藥組成物進一步包含第二藥劑，其中該第二藥劑選自由以下各項組成之群：另一抗體、化學治療劑、細胞毒性劑、抗血管生成劑、免疫抑制劑、前藥、細胞因子、細胞因子拮抗劑、細胞毒性放射療法、皮質類固醇、抗吐劑、癌症疫苗、止痛劑、生長抑制劑及結合第二生物分子之化合物。在一些實施例中，該抗血管生成劑為VEGF拮抗劑。在一些實施例中，該VEGF拮抗劑為抗VEGF抗體、抗VEGF受體抗體、可溶性VEGF受體融合蛋白質、適體、抗VEGF DARPin®或VEGFR酪胺酸激酶抑制劑。在一些實施例中，該抗VEGF抗體為雷珠單抗(LUCENTIS®)、RTH-258或雙特異性抗VEGF抗體。在一些實施例中，該雙特異性抗VEGF抗體為抗VEGF/抗Ang2抗體。在一些實施例中，該抗VEGF/抗Ang2抗體為RG-7716。在一些實施例中，該可溶性VEGF受體融合蛋白質為阿柏西普(EYLEA®)。在一些實施例中，該適體為哌加他尼(MACUGEN®)。在一些實施例中，該抗VEGF DARPin®為abicipar pegol。在一些實施例中，該VEGFR酪胺酸激酶抑制劑選自由以下各項組成之群：4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯啶-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、瓦他拉尼(PTK787)、司馬沙尼(SU5416)及SUTENT®(舒尼替尼)。在一些實施例中，該第二生物分子選自由以下各項組成之群：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、 αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體；ST-2受體；及與AMD風險基因相關之蛋白質。在一些實施例中，該VEGF受體為VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR。在一些實施例中，該與AMD風險基因相關之蛋白質選自由以下各項組成之群：補體途徑組件C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC、COL10A1；及TNFRSF10A。在一些實施例中，該結合第二生物分子之化合物為抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，該抗原結合抗體片段選自由以下各項組成之群：Fab、Fab-C、Fab'-SH、Fv、scFv及(Fab')2片段。
在另一態樣中，本發明提供一種抗體結合物，其包含(i)任一種前述抗體及(ii)共價連接於該抗體之親水性聚合物。在一些實施例中，該親水性聚合物為透明質酸(HA)聚合物或聚乙二醇(PEG)聚合物。在一些實施例中，該親水性聚合物為HA聚合物。在一些實施例中，該HA聚合物具有約1兆道爾頓(MDa)或更低之分子量。在前述態樣中任一者之一些實施例中，該HA聚合物具有介於約25kDa與約500kDa之間的分子量。在一些實施例中，該HA聚合物具有介於約100kDa與約250kDa之間的分子量。在一些實施例中，該HA聚合物具有約200kDa之分子量。在一些實施例中，該HA聚合物未交聯。在一些實施例中，該抗體為結合VEGF之抗體片段。在一些實施例中，該抗體片段選自由以下各項組成之群：Fab、Fab-C、Fab'、Fab'-SH、Fv、scFv及(Fab')2片段。在一些實施例中，該抗體片段為Fab、Fab-C或Fab'。在一些實施例中，該抗體結合物具有介於約10nm與約60nm之間的流體動力學半徑。在一些實施例中，該抗體結合物具有介於約25nm與約35nm之間的流體動力學半徑。在一些實施例中，該流體動力學半徑為約28nm。在一些實施例中，該抗體結合物具有相對於非共價連接於該親水性聚合物之參考抗體有所增加的眼部半衰期。在一些實施例中，該眼部半衰期相對於該參考抗體增加至少約2倍。在一些實施例中，該眼部半衰期相對於該參考抗體增加至少約4倍。在一些實施例中，該眼部半衰期為玻璃體半衰期。在一些實施例中，該參考抗體與該抗體結合物之該抗體一 致。
在另一態樣中，本發明提供一種抗體結合物，其包含(i)特異性結合VEGF之抗體及(ii)共價連接於該抗體之HA聚合物，其中該HA聚合物具有1MDa或更低之分子量。在前述態樣中任一者之一些實施例中，該HA聚合物具有介於約25kDa與約500kDa之間的分子量。在一些實施例中，該HA聚合物具有介於約100kDa與約250kDa之間的分子量。在一些實施例中，該HA聚合物具有約200kDa之分子量。在一些實施例中，該HA聚合物未交聯。在一些實施例中，該抗體為結合VEGF之抗體片段。在一些實施例中，該抗體片段選自由以下各項組成之群：Fab、Fab-C、Fab'、Fab'-SH、Fv、scFv及(Fab')2片段。在一些實施例中，該抗體片段為Fab、Fab-C或Fab'。在一些實施例中，該抗體結合物具有介於約10nm與約60nm之間的流體動力學半徑。在一些實施例中，該抗體結合物具有介於約25nm與約35nm之間的流體動力學半徑。在一些實施例中，該流體動力學半徑為約28nm。在一些實施例中，該抗體結合物具有相對於非共價連接於該親水性聚合物之參考抗體有所增加的眼部半衰期。在一些實施例中，該眼部半衰期相對於該參考抗體增加至少約2倍。在一些實施例中，該眼部半衰期相對於該參考抗體增加至少約4倍。在一些實施例中，該眼部半衰期為玻璃體半衰期。在一些實施例中，該參考抗體與該抗體結合物之該抗體一致。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該抗體藉由可逆前藥連接子而共價連接於該聚合物。在一些實施例中，該聚合物為水凝膠。在一些實施例中，該水凝膠為基於PEG之水凝膠。在一些實施例中，該水凝膠呈微粒狀珠粒之形狀。
在另一態樣中，本發明提供一種融合蛋白質，其包含共價連接於HA結合域之任一種前述抗體。在一些實施例中，該HA結合域共價連接於該抗體之重鏈或輕鏈。在一些實施例中，該HA結合域共價連接於該重鏈之C末端或該輕鏈之C末端。在一些實施例中，該HA結合域共價連接於該重鏈之該C末端。在一些實施例中，該HA結合域共價連接於該輕鏈之該C末端。在一些實施例中，該融合蛋白質進一步包含連接子，該連 接子位於該抗體與該HA結合域之間。在一些實施例中，該連接子包含胺基酸序列GGGGS(SEQ ID NO：61)。在一些實施例中，該連接子由胺基酸序列GGGGS(SEQ ID NO：61)組成。在一些實施例中，該抗體為結合VEGF之抗體片段。在一些實施例中，該抗體片段選自由以下各項組成之群：Fab、Fab-C、Fab'、Fab'-SH、Fv、scFv及(Fab')2片段。在一些實施例中，該抗體片段為Fab。在一些實施例中，該HA結合域共價連接於該Fab之CH1域之C末端。在一些實施例中，該HA結合蛋白質共價連接於該Fab之CL域之C末端。在一些實施例中，該HA結合域選自由以下各項組成之群：連接模組、G1域及富離胺酸寡肽。在一些實施例中，該HA結合域為連接模組。在一些實施例中，該連接模組選自由以下各項組成之群：腫瘤壞死因子刺激基因6(TSG6)、CD44、淋巴管內皮透明質酸受體1(LYVE-1)、透明質酸及蛋白聚糖連接蛋白(HAPLN)1、HAPLN2、HAPLN3、HAPLN4、聚集蛋白聚糖、短小蛋白聚糖、神經蛋白聚糖、磷酸蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、CAB61358、KIA0527、穩定素-1及穩定素-2連接模組。在一些實施例中，該連接模組為TSG6連接模組。在一些實施例中，該TSG6連接模組為人類TSG6連接模組或兔TSG6連接模組。在一些實施例中，該TSG連接模組為人類TSG6連接模組。在一些實施例中，該人類TSG6連接模組包含人類TSG6之胺基酸殘基36-128。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該融合蛋白質進一步包含至少一個額外HA結合域。在一些實施例中，該至少一個額外HA結合域共價連接於該抗體之重鏈或輕鏈。在一些實施例中，該至少一個額外HA結合蛋白質藉由連接子而連接於該抗體。在一些實施例中，該連接子包含胺基酸序列GGGGS(SEQ ID NO：61)。在一些實施例中，該連接子由胺基酸序列GGGGS(SEQ ID NO：61)組成。在一些實施例中，第一HA結合域共價連接於該重鏈且第二HA結合域共價連接於該輕鏈。在一些實施例中，該第一HA結合域連接於該重鏈之C末端且該第二HA結合域連接於該輕鏈之C末端。在一些實施例中，該至少一個額外HA結合蛋白質選自由以下各項組成之群：連接模組、G1域及富離胺酸寡肽。在一些實施例中，該至少一個額外HA結合蛋白質為連接模組。在一些實施例中，該連接模組 為TSG6連接模組。在一些實施例中，該TSG6連接模組為人類TSG6連接模組或兔TSG6連接模組。在一些實施例中，該TSG6連接模組為人類TSG6連接模組。在一些實施例中，該人類TSG6連接模組包含人類TSG6之胺基酸殘基36-128。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該融合蛋白質特異性結合VEGF及HA。在一些實施例中，該融合蛋白質以約2μM或更低之Kd結合HA。在一些實施例中，該融合蛋白質以介於約1nM與約500nM之間的Kd結合HA。在一些實施例中，該融合蛋白質以介於約1nM與約50nM之間的Kd結合HA。在一些實施例中，該融合蛋白質以約10nM之Kd結合HA。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該融合蛋白質具有相對於非共價連接於HA結合域之參考抗體有所增加的眼部半衰期。在一些實施例中，該眼部半衰期相對於該參考抗體增加至少約2倍。在一些實施例中，該眼部半衰期相對於該參考抗體增加至少約4倍。在一些實施例中，該眼部半衰期為玻璃體半衰期。在一些實施例中，該參考抗體與該融合蛋白質之該抗體一致。
在另一態樣中，本發明提供一種在患有與病理性血管生成相關之病症的個體中減少或抑制血管生成的方法，其包括向該個體投與有效量之任一種前述抗體結合物，從而在該個體中減少或抑制血管生成。
在另一態樣中，本發明提供一種治療與病理性血管生成相關之病症的方法，該方法包括向需要此種治療之個體投與有效量之任一種前述抗體結合物。
在另一態樣中，本發明提供一種在患有與病理性血管生成相關之病症的個體中減少或抑制血管生成的方法，其包括向該個體投與有效量之任一種前述融合蛋白質，從而在該個體中減少或抑制血管生成。
在另一態樣中，本發明提供一種治療與病理性血管生成相關之病症的方法，該方法包括向需要此種治療之個體投與有效量之任一種前述融合蛋白質。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該與病理性血管生成 相關之病症為眼部病症。在一些實施例中，該眼部病症選自由以下各項組成之群：AMD、黃斑變性、黃斑水腫、DME(包括局部非中心性DME及擴散性中心參與性DME)、視網膜病、DR(包括PDR、NPDR及高原DR)、其他局部缺血相關性視網膜病、ROP、RVO(包括CRVO及BRVO形式)、CNV(包括近視性CNV)、角膜新血管形成、與角膜新血管形成相關之疾病、視網膜新血管形成、與視網膜/脈絡膜新血管形成相關之疾病、病理性近視、馮希伯-林島氏病、眼組織胞漿菌病、FEVR、柯氏病、諾裡氏病、OPPG、結膜下出血、虹膜發紅、眼部新血管疾病、新血管性青光眼、RP、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤性增生、黃斑毛細血管擴張、虹膜新血管形成、眼內新血管形成、視網膜變性、CME、血管炎、視乳頭水腫、視網膜炎、結膜炎(包括感染性結膜炎及非感染性(例如過敏性)結膜炎)、萊伯先天性黑矇、葡萄膜炎(包括感染性及非感染性葡萄膜炎)、脈絡膜炎、眼組織胞漿菌病、瞼緣炎、乾眼症、創傷性眼損傷及修格連氏病。在一些實施例中，該眼部病症為AMD、DME、DR或RVO。在一些實施例中，該眼部病症為AMD。在一些實施例中，該AMD為濕性AMD。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該方法進一步包括向該個體投與有效量之第二藥劑，其中該第二藥劑選自由以下各項組成之群：另一抗體、抗血管生成劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、皮質類固醇、止痛劑及與第二生物分子結合之化合物。在一些實施例中，該抗血管生成劑為VEGF拮抗劑。在一些實施例中，該VEGF拮抗劑為抗VEGF抗體、抗VEGF受體抗體、可溶性VEGF受體融合蛋白質、適體、抗VEGF DARPin®或VEGFR酪胺酸激酶抑制劑。在一些實施例中，該抗VEGF抗體為雷珠單抗(LUCENTIS®)、RTH-258或雙特異性抗VEGF抗體。在一些實施例中，該雙特異性抗VEGF抗體為抗VEGF/抗Ang2抗體。在一些實施例中，該抗VEGF/抗Ang2抗體為RG-7716。在一些實施例中，該可溶性VEGF受體融合蛋白質為阿柏西普(EYLEA®)。在一些實施例中，該適體為哌加他尼(MACUGEN®)。在一些實施例中，該抗VEGF DARPin®為abicipar pegol。在一些實施例中，該VEGFR酪胺酸激酶抑制劑選自由以下各項組成之群：4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉 (ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯啶-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、瓦他拉尼(PTK787)、司馬沙尼(SU5416)及SUTENT®(舒尼替尼)。在一些實施例中，該第二生物分子選自由以下各項組成之群：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體；ST-2受體；及與AMD風險基因相關之蛋白質。在一些實施例中，該VEGF受體為VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR。在一些實施例中，該與AMD風險基因相關之蛋白質選自由以下各項組成之群：補體途徑組件C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC、COL10A1；及TNFRSF10A。在一些實施例中，該結合第二生物分子之化合物為抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，該抗原結合抗體片段選自由以下各項組成之群：Fab、Fab-C、Fab'-SH、Fv、scFv及(Fab')2片段。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該抗體結合物係經玻璃體內、經眼、經眼內、經鞏膜旁、經德濃氏囊下、經脈絡膜周隙、經局部、經靜脈內、經肌肉內、經真皮內、經皮膚、經動脈內、經腹膜內、經病變內、經顱骨內、經關節內、經前列腺內、經胸膜內、經氣管內、經鞘內、經鼻內、經陰道內、經直腸內、經局部、經腫瘤內、經腹膜內、經腹膜、經心室內、經皮下、經結膜下、經膀胱內、經黏膜、經心包內、經臍靜脈內、經眶內、經口、透皮、藉由吸入、藉由注射、藉由滴眼劑、藉由植入、藉由輸注、藉由連續輸注、藉由直接局部灌注浸浴靶細胞、藉由導管、藉由灌洗、於乳膏中或於脂質組成物中投與。在一些實施例中，該抗體結合物係經玻璃體內、經眼、經眼內、經鞏膜旁、經德濃氏囊下、經脈絡膜周隙或經局部投與。在一些實施例中，該抗體結合物係藉由注射而經玻璃體內投與。在一些實施例中，該抗體結合物係藉由滴眼劑或軟膏而經局部投與。在一些實施例中，該抗體結合物係藉由孔口式遞送裝置投與。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該融合蛋白質係經玻璃體內、經眼、經眼內、經鞏膜旁、經德濃氏囊下、經脈絡膜周隙、經局 部、經靜脈內、經肌肉內、經真皮內、經皮膚、經動脈內、經腹膜內、經病變內、經顱骨內、經關節內、經前列腺內、經胸膜內、經氣管內、經鞘內、經鼻內、經陰道內、經直腸內、經局部、經腫瘤內、經腹膜內、經腹膜、經心室內、經皮下、經結膜下、經膀胱內、經黏膜、經心包內、經臍靜脈內、經眶內、經口、透皮、藉由吸入、藉由注射、藉由滴眼劑、藉由植入、藉由輸注、藉由連續輸注、藉由直接局部灌注浸浴靶細胞、藉由導管、藉由灌洗、於乳膏中或於脂質組成物中投與。在一些實施例中，該融合蛋白質係經玻璃體內、經眼、經眼內、經鞏膜旁、經德濃氏囊下、經脈絡膜周隙或經局部投與。在一些實施例中，該融合蛋白質係藉由注射而經玻璃體內投與。在一些實施例中，該融合蛋白質係藉由滴眼劑或軟膏而經局部投與。在一些實施例中，該融合蛋白質係藉由孔口式遞送裝置投與。在一些實施例中，該個體為人類。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含任一種前述抗體結合物。
在另一態樣中，本發明提供一種醫藥組成物，其包含任一種前述融合蛋白質。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該醫藥組成物用於在哺乳動物中治療與病理性血管生成相關之病症。在一些實施例中，該與病理性血管生成相關之病症為眼部病症。在一些實施例中，該眼部病症選自由以下各項組成之群：AMD、黃斑變性、黃斑水腫、DME(包括局部非中心性DME及擴散性中心參與性DME)、視網膜病、DR(包括PDR、NPDR及高原DR)、其他局部缺血相關性視網膜病、ROP、RVO(包括CRVO及BRVO形式)、CNV(包括近視性CNV)、角膜新血管形成、與角膜新血管形成相關之疾病、視網膜新血管形成、與視網膜/脈絡膜新血管形成相關之疾病、病理性近視、馮希伯-林島氏病、眼組織胞漿菌病、FEVR、柯氏病、諾裡氏病、OPPG、結膜下出血、虹膜發紅、眼部新血管疾病、新血管性青光眼、RP、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤性增生、黃斑毛細血管擴張、虹膜新血管形成、眼內新血管形成、視網膜變性、CME、血管炎、視乳頭水腫、視網膜炎、結膜炎(包括感染性結膜炎及非感染性(例如過敏性)結膜 炎)、萊伯先天性黑矇、葡萄膜炎(包括感染性及非感染性葡萄膜炎)、脈絡膜炎、眼組織胞漿菌病、瞼緣炎、乾眼症、創傷性眼損傷及修格連氏病。在一些實施例中，該眼部病症為AMD、DME、DR或RVO。在一些實施例中，該眼部病症為AMD。在一些實施例中，該AMD為濕性AMD。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該醫藥組成物進一步包含第二藥劑，其中該第二藥劑選自由以下各項組成之群：另一抗體、抗血管生成劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、皮質類固醇、止痛劑及與第二生物分子結合之化合物。在一些實施例中，該抗血管生成劑為VEGF拮抗劑。在一些實施例中，該VEGF拮抗劑為抗VEGF抗體、抗VEGF受體抗體、可溶性VEGF受體融合蛋白質、適體、抗VEGF DARPin®或VEGFR酪胺酸激酶抑制劑。在一些實施例中，該抗VEGF抗體為雷珠單抗(LUCENTIS®)、RTH-258或雙特異性抗VEGF抗體。在一些實施例中，該雙特異性抗VEGF抗體為抗VEGF/抗Ang2抗體。在一些實施例中，該抗VEGF/抗Ang2抗體為RG-7716。在一些實施例中，該可溶性VEGF受體融合蛋白質為阿柏西普(EYLEA®)。在一些實施例中，該適體為哌加他尼(MACUGEN®)。在一些實施例中，該抗VEGF DARPin®為abicipar pegol。在一些實施例中，該VEGFR酪胺酸激酶抑制劑選自由以下各項組成之群：4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯啶-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、瓦他拉尼(PTK787)、司馬沙尼(SU5416)及SUTENT®(舒尼替尼)。在一些實施例中，該第二生物分子選自由以下各項組成之群：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體；ST-2受體；及與AMD風險基因相關之蛋白質。在一些實施例中，該VEGF受體為VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR。在一些實施例中，該與AMD風險基因相關之蛋白質選自由以下各項組成之群：補體途徑組件C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC、COL10A1；及 TNFRSF10A。在一些實施例中，該結合第二生物分子之化合物為抗體或其抗原結合片段。在一些實施例中，該抗原結合抗體片段選自由以下各項組成之群：Fab、Fab-C、Fab'-SH、Fv、scFv及(Fab')2片段。
在另一態樣中，本發明提供一種鑑別可賦予增強之抗體與靶分子結合的胺基酸殘基變化的方法，該方法包括：(a)提供包含編碼候選抗體變異體之核酸的呈現庫，其中各候選抗體變異體與參考抗體相比在VH或VL中包含胺基酸殘基變化，且其中該呈現庫中存在該VH或VL之每個位置上的胺基酸殘基變化；(b)基於該等候選抗體變異體與該靶分子之結合來分選該呈現庫以形成經分選之庫，其中該經分選之庫包括與該參考抗體相比與該靶分子具有增強之結合的候選抗體變異體；及(c)比較如藉由大規模平行定序所測定之各胺基酸殘基變化在該呈現庫中及在該經分選之庫中的存在頻率，從而確定與該呈現庫相比，各胺基酸殘基變化在該經分選之庫中是否得以增濃，藉此，若與該呈現庫相比，該胺基酸殘基變化在該經分選之庫中得以增濃，則將其鑑別為賦予增強之與該靶分子之結合。
在另一態樣中，本發明提供一種鑑別可賦予抗體增強之穩定性的胺基酸殘基變化的方法，該方法包括：(a)提供包含編碼候選抗體變異體之核酸的呈現庫，其中各候選抗體變異體與參考抗體相比在VH或VL中包含胺基酸殘基變化，且其中該呈現庫中存在該VH或VL之每個位置上的胺基酸殘基變化；(b)基於該等候選抗體變異體與該靶分子之結合來分選該呈現庫以形成經分選之庫，其中該經分選之庫包括與該參考抗體相比具有增強之穩定性的候選抗體變異體；及(c)比較如藉由大規模平行定序所測定之各胺基酸殘基變化在該呈現庫中及在該經分選之庫中的存在頻率，從而確定與該呈現庫相比，各胺基酸殘基變化在該經分選之庫中是否得以增濃，藉此，若與該呈現庫相比，該胺基酸殘基變化在該經分選之庫中得以增濃，則將其鑑別為賦予該抗體增強之穩定性。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該方法進一步包括在步驟(b)之後藉由大規模平行定序來測定各胺基酸變化在該呈現庫及該經分選之庫中的存在頻率。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，與該呈現庫相比，該 胺基酸殘基變化在該經分選之庫中增濃至少2倍。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該呈現庫選自由以下各項組成之群：噬菌體呈現庫、細菌呈現庫、酵母呈現庫、哺乳動物呈現庫、核糖體呈現庫及mRNA呈現庫。在一些實施例中，該呈現庫為噬菌體呈現庫。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該胺基酸殘基變化係由簡併密碼子集編碼。在一些實施例中，該簡併密碼子集為NNK或NNS密碼子集，其中N為A、C、G或T；K為G或T；且S為C或G。在一些實施例中，該簡併密碼子集為NNK密碼子集。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該步驟(b)之分選包括使該呈現庫與經固定之靶分子或抗原決定基接觸。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該步驟(b)之分選包括使該呈現庫與可溶性靶分子或抗原決定基接觸。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該呈現庫包括至少1×106個候選抗體變異體。在一些實施例中，該呈現庫包括至少1×108個抗體變異體。在一些實施例中，該呈現庫包括至少1×109個抗體變異體。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該大規模平行定序包括深度定序、超深度定序及/或下一代定序。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該抗體為單株抗體。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該抗體為IgG抗體。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該抗體為抗體片段。在一些實施例中，抗體片段選自由以下各項組成之群：Fab、scFv、Fv、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2及雙功能抗體。在一些實施例中，該抗體片段為Fab。
在前述態樣中任一者之一些實施例中，該方法進一步包括產生包含藉由該方法之該等步驟鑑別之胺基酸殘基變化的抗體。
在一些態樣中，任一種前述抗體均可用於製造用以在患有與病理性血管生成相關之病症的個體中減少或抑制血管生成的藥劑。
在一些態樣中，任一種前述抗體均可用於製造用以在需要此種治療之個體中治療與病理性血管生成相關之病症的藥劑。
在一些態樣中，任一種前述抗體均可用於製造用以在受與不合需要之血管滲透相關之病症困擾的個體中抑制血管滲透的藥劑。
在一些態樣中，任一種前述抗體均可用於在患有與病理性血管生成相關之病症的個體中減少或抑制血管生成的方法中。
在一些態樣中，任一種前述抗體均可用於在需要此種治療之個體中治療與病理性血管生成相關之病症的方法中。
在一些態樣中，任一種前述抗體均可用於在受與不合需要之血管滲透相關之病症困擾的個體中抑制血管滲透的方法中。
在另一態樣中，本發明提供一種包含任一種前述抗體之組成物，其用於在患有與病理性血管生成相關之病症的個體中減少或抑制血管生成的方法中。
在另一態樣中，本發明提供一種包含任一種前述抗體之組成物，其用於在需要此種治療之個體中治療與病理性血管生成相關之病症的方法中。
在另一態樣中，本發明提供一種包含任一種前述抗體之組成物，其用於在受與不合需要之血管滲透相關之病症困擾的個體中抑制血管滲透的方法中。
在一些態樣中，任一種前述抗體結合物均可用於製造用以在患有與病理性血管生成相關之病症的個體中減少或抑制血管生成的藥劑。
在一些態樣中，任一種前述抗體結合物均可用於製造用以在需要此種治療之個體中治療與病理性血管生成相關之病症的藥劑。
在一些態樣中，任一種前述抗體結合物均可用於在患有與病理性血管生成相關之病症的個體中減少或抑制血管生成的方法中。
在一些態樣中，任一種前述抗體結合物均可用於在需要此種治療之個體中治療與病理性血管生成相關之病症的方法中。
在另一態樣中，本發明提供一種包含任一種前述抗體結合物之組成物，其用於在患有與病理性血管生成相關之病症的個體中減少或抑制血管生成的方法中。
在另一態樣中，本發明提供一種包含任一種前述抗體結合物 之組成物，其用於在需要此種治療之個體中治療與病理性血管生成相關之病症的方法中。
在一些態樣中，任一種前述融合蛋白質均可用於製造用以在患有與病理性血管生成相關之病症的個體中減少或抑制血管生成的藥劑。
在一些態樣中，任一種前述融合蛋白質均可用於製造用以在需要此種治療之個體中治療與病理性血管生成相關之病症的藥劑。
在一些態樣中，任一種前述融合蛋白質均可用於在患有與病理性血管生成相關之病症的個體中減少或抑制血管生成的方法中。
在一些態樣中，任一種前述融合蛋白質均可用於在需要此種治療之個體中治療與病理性血管生成相關之病症的方法中。
在另一態樣中，本發明提供一種包含任一種前述融合蛋白質之組成物，其用於在患有與病理性血管生成相關之病症的個體中減少或抑制血管生成的方法中。
在另一態樣中，本發明提供一種包含任一種前述融合蛋白質之組成物，其用於在需要此種治療之個體中治療與病理性血管生成相關之病症的方法中。
應理解，以上關於治療方法(例如，關於抗體性質、額外治療劑、與病理性血管生成相關之病症(例如，眼部病症，諸如AMD、DME、DR或RVO)、投藥途徑(例如，玻璃體內注射)及其類似因素)所描述之任何實施例均可用於以上所描述之藥劑、用途及組成物的內容中。
圖1A至圖1F為顯示獲自NNK走查VH庫(圖1A至圖1C)及VL庫(圖1D至圖1F)且針對抗gD標籤抗體(抗gD)、蛋白L或蛋白A之淘選結果中所有突變之增濃比之log2值(亦稱為log2增濃比)的熱圖。野生型G6.31VH(圖1A至圖1C)或VL(圖1D至圖1F)自位置2開始之胺基酸序列顯示於各熱圖下。圖1A顯示由針對抗gD淘選NNK走查VH庫而獲得之結果。圖1B顯示由針對蛋白L淘選NNK走查VH庫而獲得之結果。圖1C顯示由針對蛋白A淘選NNK走查VH庫而獲得之結果。圖1D顯示由針對抗gD淘選NNK走查VL庫而獲得之結果。圖1E顯示由針對蛋白L淘選 NNK走查VL庫而獲得之結果。圖1F顯示由針對蛋白A淘選NNK走查VL庫而獲得之結果。
圖2A至圖2B為顯示得自於對VH(圖2A)及VL(圖2B)之淘選的log2增濃比相對於抗gD-標籤抗體(「gD」)、蛋白A(「protA」)及蛋白L(「protL」)之相關性的一系列圖表。該等表顯示用於(i)在gD與protA之間；(ii)在gD與protL之間；及(iii)在protA與protL之間進行比較的皮爾生相關係數(r2；「Cor」)。亦確定分類為屬於疏水性核心(「核心」)、延伸疏水性核心(「延伸核心」)、VH/VL界面(「界面」)之位置或者形成重要氫鍵、鹽橋或在其他方面令人感興趣(「其他」)之位置上的突變的增濃比的相關性。此等圖顯示使用抗gD抗體、蛋白A或蛋白L來偵測噬菌體上之Fab分子之摺疊獲得類似之結果。其增濃比在不同的淘選中顯著不同的僅有突變為直接位於蛋白A或蛋白L結合位點中之彼等突變。彼等殘基分別標記為「蛋白A」、「蛋白L1」及「蛋白L2」(蛋白L存在兩個結合位點)。蛋白L之結合位點描述於Graille等人，Structure 9(8)：679-687,2001中，該文獻以全文引用之方式併入本文中。蛋白G之結合位點描述於Graille等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(10)：5399-5404,2000中，該文獻以全文引用之方式併入本文中。
圖3A至圖3B為顯示VH(圖3A)及VL(圖3B)中指定位置上之所有突變的log2增濃比的圖。根據位置是位於疏水性核心中(暗灰色)、位於延伸疏水性核心中(中灰色)或是位於VH/VL界面上(淡灰色)而對其進行渲染。標記保守且不耐受突變之位置(log2增濃比Z評分<-0.5)。
圖3C至圖3D為無抗原G6Fab(蛋白質資料庫(PDB)代碼：2FJF)之晶體結構的彩色圖，其分別顯示VH(圖3C)及VL(圖3D)結構中保守位置之定位。渲染方案與圖3A至圖3B中相同。另外，指示形成重要氫鍵、鹽橋或在其他方面重要之保守位置。
圖4A至圖4B為顯示藉由針對VEGF淘選NNK走查VH庫(圖4A)及VL庫(圖4B)而獲得之所有單胺基酸取代的log2增濃比的熱圖。
圖5A至圖5B為顯示由對具有雙峰分佈之VH庫(圖5A)及VL庫(圖5B)進行VEGF淘選而獲得之log2增濃比的圖。將超出偵測極限 之缺失型突變設為特定實驗之最大觀測缺失。針對突變在HVR中、在如使用gD淘選鑑別之保守架構中或在架構之其餘部分中之定位而相應地對其進行著色。
圖5C至圖5D為顯示得自於對所選突變進行VEGF淘選之log2增濃比與Kd相對於親本抗體G6.31之變化(圖5C)或解鏈溫度(Tm)相對於G6.31之變化(圖5D)之間的比較的圖。使用與圖5A至圖5B中相同的渲染方案。
圖5E至圖5F為G6 Fab(PDB代碼2FJG)之VH(圖5E)及VL(圖5F)之VEGF結合形式的晶體結構的彩色圖，其顯示所選突變(呈球體形式)之定位。VEGF之表面顯示為表面表示。使用與圖5A至圖5B中相同的渲染方案。標記顯示與G6.31相比之Tm(℃)變化及結合親和力(Kd)變化倍數。
圖6A為無抗原G6 Fab(PDB 2FJF)之晶體結構中所存在之分子的重疊彩色圖的視覺化，其顯示該分子所展現之不同的Fab肘角。
圖6B至圖6C分別為顯示具有小Fab肘角之分子(圖6B，暗灰色)及具有大Fab肘角之分子(圖6C，淡灰色)中的LC-83F及LC-106I之VL-VH界面及側鏈構形之詳細視圖的彩色圖。出於清楚性之目的移除β鏈E、螺旋α-1及連接兩個元件之環。
圖7A為顯示來自於得自PDB之319種人類抗體結構之位置LC-F83之χ1(chi1)角的圖(右圖)。彩色圖(左圖)顯示呈「袋內」構形及「袋外」構形之LC-F83位置。
圖7B為顯示位置105處之Ψ(psi)角及位置106處之Φ(phi)角的肘角骨幹構形的圖(右圖)。根據如圖7A中所示之其χ1角對結構進行渲染。彩色圖(左圖)顯示呈「袋內」構形及「袋外」構形之輕鏈(LC)位置103-108。
圖7C為顯示LC-F83呈「袋內」構形及呈「袋外」構形之抗體結構之肘角(右上)及VL/CL界面面積(右下)的一系列圖。將結果與來自PDB之攜帶LC-F83之319個人類Fab結構及22個攜帶LC-83A之人類結構的Fab肘角及VL/CL界面大小相比較。左圖顯示具有大肘角及小肘角之 G6分子的重疊彩色圖。以環形指示VL/CL界面面積。
圖8A為顯示具有大肘角之G6 Fab晶體結構(G6鏈VU，G6-VU)及具有小肘角之晶體結構(G6鏈BA，G6-BA)的LC-F83之χ1角的圖。
圖8B為顯示所指示之分子的分子動力學模擬結果的圖。繪製肘角隨時間變化之曲線圖。
圖8C為顯示分子動力學模擬結果之圖，其繪出了Fab肘角隨VH/VL扭轉角(「HL角」)變化之曲線圖。散佈/等高線圖顯示VU.F83(暗灰色)及VU.F83A(淡灰色)在分子動力學模擬期間所呈現之VH/VL扭轉角及肘角。兩個分子可見兩個不同的群體。
圖9A為顯示100ns分子動力學模擬中最後75ns期間所獲得之分子BA-F83(呈「袋外」構形之LC-F83)、BA-F83A、VU-F93(呈「袋內」構形之LC-F83)及VU-F83A之Fab肘角分佈的圖。如藉由變異數分析(ANOVA)/杜凱公正顯著差異(HSD)檢定所測定，除了BA-F83及BA-F83A，所有樣品均顯著不同(p<0.001)。
圖9B為顯示五個具有呈「袋外」構形之LC-F83的G6未結合分子(黑色)及五個具有呈「袋內」構形之LC-F83的G6未結合分子(暗灰色)的VH/VL扭轉角以及VEGF結合之G6結構(「AG結合」，淡灰色)的VH/VL扭轉角的圖。
圖9C為顯示與圖9A中相同之分子在相同100ns分子動力學模擬期間之VH/VL扭轉角分佈的圖。如藉由ANOVA/杜凱HSD檢定所測定，除了BA-F83A及VU-F83A，所有樣品均顯著不同(p<0.001)。
圖9D為未結合G6之晶體結構的彩色圖，其顯示在G6.31與G6.31LC-F83A之間具有不同的氫-氘交換模式的區域。渲染成暗灰色之區域與G6.31相比在G6.31LC-F83A中具有較慢交換，而渲染成中灰色之區域與G6.31相比在G6.31LC-F83A中具有較快交換。以線條指示F83A突變及DE環之位置。
圖10A為顯示來源於IGKV1生殖系之抗體序列之所指示VL位置上的體細胞突變分佈的圖。上圖中之突變分佈係使用得自 Genbank、蛋白質資料庫(PDB)、Kabat資料庫、Abysis資料庫及IMGT資料庫(「公共資料集」)之公眾可利用人類抗體序列獲得。下圖中之突變分佈係使用獲自超過1000份個別人類淋巴組織之cDNA的單分子即時定序(SMRT)來獲得。公眾可利用序列之N末端的高突變率可能來自於選殖人為因素。
圖10B為顯示來自於圖10A及實例8中所描述之公共資料集(Sanger)或SMRT資料集(PacBio)之IGKV1.39序列中位置LC-83上之最常見突變的圖。IGKV1.39在位置LC-83上攜帶苯丙胺酸。根據個別胺基酸尺寸對各點進行著色。將大胺基酸著色為黃色並且將小胺基酸著色為暗紅色。
圖10C為顯示公共資料集(Sanger)或SMRT資料集(PacBio)中所發現之所有IGKJ序列中位置LC-106上之最常見突變的圖。根據個別胺基酸尺寸對各點進行渲染。將大胺基酸著色為淡灰色並且將小胺基酸著色為暗灰色。
圖10D為顯示如藉由BIACORE®表面電漿子共振所量測之所選G6.31突變變異體之親和力(Kd)(左圖)及如藉由差示掃描螢光測定法(DSF)所量測之所選G6.31突變變異體之解鏈溫度Tm(右圖)的一系列圖。左圖中之環形表示三次重複實驗之平均值，其中個別標準偏差以誤差條顯示。右圖中之環形表示三次重複實驗之平均值，且個別標準偏差以誤差條顯示。
圖11A為顯示G6.31 AAEE、G6.31 WT及G6.31 AARR中之每一者在如實例11中所描述將個別Fab經玻璃體內(IVT)投與兔眼之後的水狀液及玻璃體藥物動力學的圖。
圖11B為顯示G6.31 AAEE、G6.31 WT及G6.31 AARR中之每一者在如實例11中所描述將個別Fab經玻璃體內投與兔眼之後自血清中之清除率的圖。
圖12為顯示藉由毛細管電泳-十二烷基硫酸鈉(CE-SDS)對所指示之抗體選殖株進行片段化分析之表。片段化由在37℃下在PBS中4週、12週及24週之後的低分子量實體百分比(LMW%)表示。與野生型G6.31 相比，所有N94A變異體之片段化一致降低。高分子量實體(HMW%)指示雜質或聚集物。此分析中之主峰大小不直接與片段化程度相關，而是視片段大小及染料標記程度而定。抗VEGF Fab雷珠單抗(ranibizumab)充當對照。
圖13為顯示如實例12中所描述在不同Fab濃度下對由G6.31變異體LC-N94A所致之VEGF誘導之HUVEC移行之抑制與親本G6.31相比較的曲線圖的圖。
圖14為顯示對重量平均莫耳質量(Mw)重疊之HA40K-rabFab、HA200K-rabFab及HA600K-rabFab之尺寸排阻層析(SEC)與折射率(RI)多角度光散射(MALS)(SEC-RI-MALS)分析的圖。
圖15為顯示如藉由對HYAL-2培育之HA及HA100K-rabFab之SEC-MALS分析所評定，與rabFab結合之透明質酸(HA)保留對透明質酸酶2(HYAL2)消化之酶敏感性的圖。對於HA-rabFab樣品，右Mw軸表示為僅結合物之HA組分的Mw。
圖16為顯示玻璃體內注射後雷珠單抗、rabFab及HA100K-rabFab(「線性HA-rabFab」)自兔玻璃體中之清除率的圖。HA100K-rabFab顯示約11.9天之半衰期，相比之下，rabFab之半衰期為約2.5天。
圖17為顯示在兔玻璃體中玻璃體滯留時間與流體動力學半徑(Rh；在該圖中指示為「RH」)線性相關的圖。rabFab、rabFab-20kDa PEG、rabFab-40kDa PEG及HA100K-rabFab之歷史資料(填充環形)可用於基於所量測之Rh值來預測HA100K-G6.31 AARR(開口環形)、HA200K-G6.31 AARR(開口正方形)及HA300K-G6.31(開口三角形)之半衰期。
I. 定義
如本文中所使用之術語「約」係指熟習此技術領域者容易獲知的各別值之慣常誤差範圍。本文中提及「約」某一值或參數包括(且描述)針對該值或參數本身之實施例。
「受體人類架構」出於本文之目的為如下文所定義，包含來源於人類免疫球蛋白架構或人類共同架構的輕鏈可變域(VL)架構或重鏈可 變域(VH)架構之胺基酸序列的架構。「來源於」人類免疫球蛋白架構或人類共同架構之受體人類架構可包含與其相同的胺基酸序列，或其可含有胺基酸序列變化。在一些實施例中，胺基酸變化數為10或更少、9或更少、8或更少、7或更少、6或更少、5或更少、4或更少、3或更少，或2或更少。在一些實施例中，VL受體人類架構序列與VL人類免疫球蛋白架構序列或人類共同架構序列一致。
「親和力」係指分子(例如抗體)之單一結合位點與其結合搭配物(例如抗原)之間的非共價相互作用總和的強度。除非另有指示，否則如本文中所使用，「結合親和力」係指固有結合親和力，其體現結合對成員(例如抗體與抗原)之間的1：1相互作用。分子X對其搭配物Y之親和力一般可由解離常數(Kd)表示。親和力可藉由此項技術中已知之常用方法加以量測，包括本文中所描述之彼等方法。用於量測結合親和力之特定說明性及例示性實施例描述於下文中。
「親和力成熟」抗體係指在一或多個高變區(HVR)及/或架構區(FR)中具有一或多個變化之抗體，與不具有該等變化之親本抗體相比，該等變化導致改良該抗體對抗原之親和力。
術語「血管內皮生長因子」或「VEGF」係指如SEQ ID NO：47所例示之血管內皮生長因子蛋白A(另參見Swiss Prot登錄號P15692，基因ID(NCBI)：7422)。術語「VEGF」涵蓋具有胺基酸序列SEQ ID NO：47之蛋白質以及其同系物及同功異型物。術語「VEGF」亦涵蓋VEGF之已知同功異型物，例如剪接同功異型物，例如VEGF111、VEGF121、VEGF145、VEGF165、VEGF189及VEGF206，連同其天然存在之對偶基因及經處理形式，包括由胞漿素裂解VEGF165產生之110個胺基酸之人類血管內皮細胞生長因子，如以下文獻中所描述：Ferrara Mol.Biol.Cell.21：687(2010)；Leung等人，Science,246：1306(1989)；及Houck等人，Mol.Endocrin.,5：1806(1991)。術語「VEGF」亦係指來自諸如小鼠、大鼠或靈長類動物之非人類物種的VEGF。有時以術語指示來自特定物種之VEGF，諸如hVEGF用於人類VEGF，mVEGF用於鼠類VEGF，及其類似情形。術語「VEGF」亦用於指包含165個胺基酸人類血管內皮細胞生長因子之胺基酸8至109或1 至109的多肽截短形式。在本申請案中，提及VEGF之任何此種形式可例如藉由「VEGF109」、「VEGF(8-109)」、「VEGF(1-109)」或「VEGF165」加以鑑別。如天然VEGF序列中所指示對「截短」天然VEGF之胺基酸位置加以編號。舉例而言，截短天然VEGF中之胺基酸位置17(甲硫胺酸)亦為天然VEGF中之位置17(甲硫胺酸)。截短天然VEGF對KDR及Flt-1受體之結合親和力與天然VEGF相當。如本文中所使用之術語「VEGF變異體」係指在天然VEGF序列中包括一或多個胺基酸突變之VEGF多肽。視情況，該一或多個胺基酸突變包括胺基酸取代。出於本文中所描述之VEGF變異體之簡記命名之目的，應注意，數字係指沿推定天然VEGF之胺基酸序列的胺基酸殘基位置(提供於Leung等人，同上及Houck等人，同上中)。除非另外規定，否則如本文中所使用之術語「VEGF」指示VEGF-A。
術語「抗VEGF抗體」、「結合VEGF之抗體」及「特異性結合VEGF之抗體」係指能夠以足夠親和力結合VEGF，使得該抗體適用作靶向VEGF之診斷劑及/或治療劑的抗體。在一個實施例中，如例如藉由放射免疫分析法(RIA)所量測，抗VEGF抗體與無關非VEGF蛋白之結合程度小於該抗體與VEGF之結合的約10%。在某些實施例中，抗體結合VEGF之解離常數(Kd)
Figure 105130888-A0202-12-0033-5
1μM、
Figure 105130888-A0202-12-0033-6
100nM、
Figure 105130888-A0202-12-0033-7
10nM、
Figure 105130888-A0202-12-0033-8
1nM、
Figure 105130888-A0202-12-0033-10
0.1nM、
Figure 105130888-A0202-12-0033-11
0.01nM或
Figure 105130888-A0202-12-0033-12
0.001nM(例如10-8M或更小，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)。在某些實施例中，抗VEGF抗體結合在來自於不同物種之VEGF之間保守的VEGF抗原決定基。
本文中之術語「抗體」係以廣義使用且涵蓋各種抗體結構，包括但不限於單株抗體、多株抗體、多特異性抗體(例如雙特異性抗體)及抗體片段，只要其展現所要抗原結合活性即可。
「抗體片段」係指除完整抗體以外包含完整抗體中結合該完整抗體所結合之抗原的一部分的分子。抗體片段之實例包括但不限於Fv、Fab、Fab'、Fab-C、Fab'-SH、F(ab')2；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。在一些情況下，抗體片段之實例包括但不限於Fv、Fab、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2；雙功能抗體；線性抗體；單鏈抗體分子(例如scFv)；及由抗體片段形成之多特異性抗體。
抗體之木瓜蛋白酶消化產生兩個一致抗原結合片段，稱為「Fab」片段，以及剩餘「Fc」片段，該名稱體現能夠容易地結晶。Fab片段由整個輕(L)鏈以及重(H)鏈可變區結構域(VH)及一個重鏈之第一恆定域(CH1)組成。抗體之胃蛋白酶處理產生單一大F(ab')2片段，其大致對應於兩個由二硫鍵連接之具有二價抗原結合活性之Fab片段且仍能夠使抗原交聯。Fab'片段與Fab片段的不同之處在於在CH1結構域之羧基末端具有數個額外殘基，包括來自於抗體鉸鏈區之一或多個半胱胺酸。Fab-C分子為表現後使序列在第一個鉸鏈半胱胺酸處被截短，從而在表現後直接產生具有游離半胱胺酸之Fab的Fab分子(參見例如Shatz等人，Mol.Pharmaceutics 2016；PubMed識別碼(PMID)27244474)。舉例而言，Fab-C分子可在重鏈之位置Cys227上具有游離半胱胺酸。在其他情況下，Fab-C分子可在重鏈之位置Cys229上具有游離半胱胺酸。Fab'-SH為本文中用於恆定域之半胱胺酸殘基攜帶游離硫醇基之Fab'的名稱。F(ab')2抗體片段起初產生為成對Fab'片段，在其之間具有鉸鏈半胱胺酸。抗體片段之其他化學偶合亦為已知的。
本文中之術語「Fc區」用於定義免疫球蛋白重鏈中含有恆定區之至少一部分的C末端區。該術語包括天然序列Fc區及變異Fc區。在一個實施例中，人類IgG重鏈Fc區自Cys226或Pro230延伸至重鏈之羧基末端。然而，Fc區之C末端離胺酸(Lys447)可能存在或可能不存在。除非本文中另外規定，否則Fc區或恆定區中之胺基酸殘基編號係根據EU編號系統，亦稱為EU指數，如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991)中所描述。
「Fv」由一個重鏈可變區結構域與一個輕鏈可變區結構域緊密非共價締合之二聚物組成。由此兩個結構域之摺疊發出六個高變環(來自於H及L鏈之各3個環)，其貢獻胺基酸殘基用於抗原結合且賦予抗體抗原結合特異性。然而，即使單一可變域(或僅包含三個抗原特異性HVR之Fv部分)亦具有識別及結合抗原之能力，但親和力往往低於完整結合位點。
「單鏈Fv」亦縮寫為「sFv」或「scFv」，其為包含連接至 單一多肽鏈中之VH及VL抗體結構域的抗體片段。sFv多肽較佳進一步包含介於VH與VL結構域之間的多肽連接子，其使得該sFv能夠形成所要結構以供抗原結合。關於sFv之綜述，參見Pluckthun,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，Springer-Verlag,New York，第269-315頁(1994)。
術語「雙功能抗體」係指藉由以下方式製備之小抗體片段：構築sFv片段(參見前一段)，其中短連接子(約5至10個殘基)介於VH與VL結構域之間，從而達成V結構域之鏈間而非鏈內配對，從而產生二價片段，亦即，具有兩個抗原結合位點之片段。雙特異性雙功能抗體為兩個「交叉」sFv片段之異源二聚體，其中該兩個抗體之VH及VL結構域存在於不同的多肽鏈上。雙功能抗體更詳細描述於例如以下文獻中：EP 404,097；WO 93/11161；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。
「阻斷」抗體或「拮抗性」抗體為抑制或降低其所結合之抗原的生物學活性的抗體。某些阻斷抗體或拮抗性抗體實質上或完全抑制抗原之生物學活性。
與參考抗體「結合相同抗原決定基之抗體」係指在競爭分析法中阻斷參考抗體與其抗原結合達50%以上的抗體，且相反，參考抗體在競爭分析法中阻斷該抗體與其抗原結合達50%以上。本文中提供例示性競爭分析法。
術語「嵌合」抗體係指重鏈及/或輕鏈之一部分來源於特定來源或物種，而重鏈及/或輕鏈之其餘部分來源於不同的來源或物種的抗體。
抗體之「類別」係指其重鏈所具有之恆定域或恆定區的類型。有五種主要抗體類別：IgA、IgD、IgE、IgG及IgM，且此等中若干者可進一步分成子類(同型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1及IgA2。對應於不同免疫球蛋白類別之重鏈恆定域分別稱為α、δ、ε、γ及μ。
「效應子功能」係指可歸因於抗體Fc區且隨抗體同型而變化之彼等生物學活性。抗體效應子功能之實例包括：C1q結合及補體依賴性細胞毒性(CDC)；Fc受體結合；抗體依賴性細胞介導之細胞毒性(ADCC)； 吞噬；細胞表面受體(例如B細胞受體)下調；及B細胞活化。
「架構」或「架構區」或「FR」係指除高變區(HVR)殘基以外的可變域殘基。可變域之FR一般由四個FR域組成：FR1、FR2、FR3及FR4。
術語「全長抗體」、「完整抗體」及「整抗體」在本文中可互換用於指具有實質上與天然抗體結構相似之結構或具有含有如本文中所定義之Fc區之重鏈的抗體。
「人類抗體」為胺基酸序列對應於由人類或人類細胞產生或來源於利用人類抗體譜系或其他人類抗體編碼序列之非人類來源之抗體的胺基酸序列的抗體。此人類抗體定義明確排除包含非人類抗原結合殘基之人類化抗體。
「人類共同架構」為代表在選擇人類免疫球蛋白VL或VH架構序列中最常存在之胺基酸殘基的架構。一般而言，人類免疫球蛋白VL或VH序列係選自於可變域序列之亞組。一般而言，序列亞組為如Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第五版，NIH Publication 91-3242,Bethesda MD(1991)，第1-3卷中之亞組。在一個實施例中，對於VL而言，亞組為如Kabat等人，同上中之亞組κI。在一個實施例中，對於VH而言，亞組為如Kabat等人，同上中之亞組III。
非人類(例如齧齒動物)抗體之「人類化」形式為含有來源於非人類抗體之最小序列的嵌合抗體。在很大程度上，人類化抗體為人類免疫球蛋白(受體抗體)，其中來自於該受體之高變區的殘基已置換為來自於具有所要抗體特異性、親和力及容量之諸如小鼠、大鼠、兔或非人類靈長類動物之非人類物種(供體抗體)之高變區的殘基。在一些情況下，人類免疫球蛋白之FR殘基由相應的非人類殘基置換。此外，人類化抗體可包含未見於受體抗體或供體抗體中之殘基。進行此等修飾以進一步改進抗體效能。一般而言，人類化抗體將包含實質上所有至少一個且典型地兩個可變域，其中所有或實質上所有高變環對應於非人類免疫球蛋白序列之高變環，且所有或實質上所有FR為人類免疫球蛋白序列之FR。人類化抗體亦將視情況包含免疫球蛋白恆定區(Fc)之至少一部分，典型地人類免疫球蛋白恆定區之 至少一部分。關於進一步細節，參見Jones等人，Nature 321：522-525(1986)；Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；及Presta,Curr.Op.Struct.Biol.2：593-596(1992)。
術語「可變」係指可變域之某些區段的序列在抗體之間廣泛不同。可變或「V」結構域介導抗原結合且限定特定抗體對其特定抗原之特異性。然而，可變性並非均勻分佈於可變域之整個跨度。相反，V區由稱為「高變區」之較短極高可變性區域所隔開的稱為架構區(FR)之具有15至30個胺基酸之相對不變區段組成，各高變區為9至12個胺基酸長。術語「高變區」或「HVR」當用於本文中時係指抗體中負責抗原結合之胺基酸殘基。高變區一般包含來自於例如VL中之殘基24-34(L1)、50-56(L2)及89-97(L3)周圍及VH中之殘基26-35(H1)、49-65(H2)及95-102(H3)周圍的胺基酸殘基(在一個實施例中，H1在殘基31-35周圍)；Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD.(1991))，及/或來自於「高變環」之彼等殘基(例如VL中之殘基26-32(L1)、50-52(L2)及91-96(L3)及VH中之殘基26-32(H1)、53-55(H2)及96-101(H3)；Chothia及Lesk,J.Mol.Biol.196：901-917(1987)。天然重鏈及輕鏈之可變域各自包含四個FR，在很大程度上採取β片構形，由三個高變區連接，由此形成環連接，且在一些情況下形成β片結構之一部分。各鏈中之高變區由FR保持緊密鄰近，且與來自於另一鏈之高變區一起促成抗體之抗原結合位點的形成(參見Kabat等人，Sequences of Immunological Interest，第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,MD(1991))。因此，HVR及FR序列一般按以下順序出現在VH(或VL)中：FR1-H1(L1)-FR2-H2(L2)-FR3-H3(L3)-FR4。恆定域不直接參與抗體與抗原之結合，但展現多種效應子功能，諸如抗體參與抗體依賴性細胞毒性(ADCC)。
術語「如Kabat中之可變域殘基編號」或「如Kabat中之胺基酸位置編號」及其變化形式係指Kabat等人，同上中用於抗體編譯之重鏈可變域或輕鏈可變域的編號系統。使用此編號系統，實際綫性胺基酸序列可含有更少或額外胺基酸，從而對應於縮短或插入可變域之FR或HVR中。 舉例而言，重鏈可變域可包括在H2之殘基52之後的單一胺基酸插入(殘基52a，根據Kabat)及在重鏈FR殘基82之後的多個插入殘基(例如，殘基82a、82b及82c等，根據Kabat)。對於指定抗體，殘基之Kabat編號可藉由在抗體序列之同源性區域上與「標準」Kabat編號序列進行比對來確定。
當提及可變域(大約輕鏈之殘基1至107及重鏈之殘基1至113)中之殘基時一般使用Kabat編號系統(例如Kabat等人，Sequences of Immunological Interest.第5版，Public Health Service,National Institutes of Health,Bethesda,Md.(1991))。當提及免疫球蛋白重鏈恆定區中之殘基時一般使用「EU編號系統」或「EU指數」(例如，Kabat等人，同上中所報導之EU指數)。「如Kabat中之EU指數」係指人類IgG1 EU抗體之殘基編號。除非本文中另外陳述，否則提及抗體可變域中之殘基編號意謂由Kabat編號系統產生之殘基編號。除非本文中另外陳述，否則提及抗體恆定域中之殘基編號意謂由EU編號系統產生之殘基編號(例如，關於EU編號之圖，參見美國臨時申請案第60/640,323號)。
除非另外指出，否則HVR殘基及可變域中之其他殘基(例如FR殘基)在本文中係根據Kabat等人，同上進行編號。
「免疫結合物」為抗體與一或多個異源分子(包括但不限於細胞毒性劑)之結合物。
術語「經分離之抗體」當用於描述本文中所揭示之各種抗體時意謂已鑑別且與表現其之細胞或細胞培養物分離及/或已自其中回收之抗體。其天然環境之污染組分為典型地將干擾多肽之診斷性或治療性用途的物質，且可包括酶、激素及其他蛋白質或非蛋白質溶質。在一些實施例中，將抗體純化至超過95%或99%純度，如藉由例如電泳(例如SDS-PAGE、等電聚焦(IEF)、毛細管電泳)或層析(例如離子交換或逆相HPLC)所測定。關於用於評定抗體純度之方法的綜述，參見例如Flatman等人，J.Chromatogr.B 848：79-87(2007)。在較佳實施例中，將抗體純化(1)至足以藉由使用旋杯定序儀來獲得N末端或內部胺基酸序列之至少15個殘基的程度，或(2)至藉由SDS-PAGE在非還原或還原條件下使用考馬斯藍或較佳銀染色來證實均質性。經分離之抗體包括重組細胞內之原位抗體，因為多肽天然環境中之至 少一種組分將不存在。然而，一般而言，將藉由至少一個純化步驟來製備經分離之多肽。
如本文中所使用之術語「單株抗體」係指獲自實質上均質之抗體之群體的抗體，亦即，構成該群體之個別抗體為一致的及/或結合相同的抗原決定基，但除了例如含有天然存在之突變或在單株抗體製備期間出現之可能之變異抗體，該等變異體一般以微量存在。與典型地包括針對不同決定子(抗原決定基)之不同抗體的多株抗體製劑形成對比，單株抗體製劑之各單株抗體針對抗原上之單一決定子。因而，修飾語「單株」指示抗體之特徵為獲自實質上均質之抗體群體，而不應被視為需要藉由任何特定方法產生抗體。舉例而言，根據本發明使用之單株抗體可藉由多種技術製造，包括但不限於雜交瘤方法、重組DNA方法、噬菌體呈現方法及利用含有所有或部分人類免疫球蛋白基因座之轉殖基因動物的方法，該等方法及用於製造單株抗體之其他例示性方法描述於本文中。
術語「多特異性抗體」係以廣義使用且明確覆蓋包含重鏈可變域(VH)及輕鏈可變域(VL)之抗體，其中該VH-VL單元具有多抗原決定基特異性(亦即，能夠結合一個生物分子上的兩個不同抗原決定基或不同生物分子上的各一個抗原決定基)。此種多特異性抗體包括但不限於全長抗體、具有兩個或更多個VL及VH結構域之抗體、抗體片段(諸如Fab、Fab'、Fab-C、Fv、dsFv、scFv)、雙功能抗體、雙特異性雙功能抗體及三功能抗體、已共價或非共價連接之抗體片段。「多抗原決定基特異性」係指能夠特異性結合相同或不同標靶上之兩個或更多個不同的抗原決定基。「雙重特異性」或「雙特異性」係指能夠特異性結合相同或不同標靶上之兩個不同的抗原決定基。然而，與雙特異性抗體相反，雙重特異性抗體具有在胺基酸序列方面一致之兩個抗原結合臂，且各Fab臂能夠識別兩個抗原。雙重特異性允許抗體如同單一Fab或IgG分子般以高親和力與兩個不同的抗原相互作用。根據一個實施例，呈IgG1形式之多特異性抗體以5μM至0.001pM、3μM至0.001pM、1μM至0.001pM、0.5μM至0.001pM或0.1μM至0.001pM之親和力結合各抗原決定基。「單特異性」係指能夠結合僅一個抗原決定基。
「天然抗體」係指天然存在之具有不同結構之免疫球蛋白分子。舉例而言，天然IgG抗體為由以二硫鍵鍵結之兩個一致輕鏈及兩個一致重鏈構成的約150,000道爾頓之異源四聚醣蛋白。自N末端至C末端，各重鏈具有可變區(VH)，亦稱為可變重鏈域或重鏈可變域，隨後為三個恆定域(CH1、CH2及CH3)。類似地，自N末端至C末端，各輕鏈具有可變區(VL)，亦稱為可變輕鏈域或輕鏈可變域，隨後為恆定輕鏈(CL)結構域。抗體之輕鏈可基於其恆定域之胺基酸序列而分至兩個類型之一，稱為κ(kappa)及λ(lambda)。
就抗體與靶分子之結合而言，術語「特異性結合」特定多肽或特定多肽靶上之抗原決定基或者與特定多肽或特定多肽靶上之抗原決定基「特異性地結合」或對特定多肽或特定多肽靶上之抗原決定基具有「特異性」意謂結合可量測地不同於非特異性相互作用。特異性結合可例如藉由測定分子之結合且與對照分子之結合相比較來量測。舉例而言，可藉由與類似於標靶之對照分子(例如，過量未標記標靶)競爭來測定特異性結合。在此情況下，若經標記之標靶與探針之結合因過量未標記標靶而受到競爭性抑制，則指示特異性結合。如本文中所使用之術語「特異性結合」特定多肽或特定多肽靶上之抗原決定基或者與特定多肽或特定多肽靶上之抗原決定基「特異性地結合」或者對特定多肽或特定多肽靶上之抗原決定基具有「特異性」可例如藉由對該標靶具有10-4M或更低、或者10-5M或更低、或者10-6M或更低、或者10-7M或更低、或者10-8M或更低、或者10-9M或更低、或者10-10M或更低、或者10-11M或更低、或者10-12M或更低之Kd或者在10-4M至10-6M或10-6M至10-10M或10-7M至10-9M範圍內之Kd的分子來展現。如熟習此項技術者應瞭解，親和力與Kd值逆相關。對抗原之高親和力係由低Kd值來量度。在一個實施例中，術語「特異性結合」係指分子與特定多肽或特定多肽上之抗原決定基結合而實質上不與任何其他多肽或多肽抗原決定基結合的結合。
「編碼抗VEGF抗體之核酸」係指編碼抗體重鏈及輕鏈(或其片段)之一或多個核酸分子，包括處於單一載體或單獨載體中之此種核酸分子及存在於宿主細胞中之一或多個位置上的此種核酸分子。
如本文中所使用之術語「載體」係指能夠使其所連接之另一核酸增殖的核酸分子。該術語包括呈自複製核酸結構形式之載體以及併入已引入其之宿主細胞之基因組中的載體。某些載體能夠指導與其可操作地連接之核酸的表現。該等載體在本文中稱為「表現載體」。
術語「宿主細胞」、「宿主細胞株」及「宿主細胞培養物」可互換使用且係指已引入外源核酸之細胞，包括該等細胞之子代。宿主細胞包括「轉型體」及「轉化細胞」，包括初代轉化細胞及來源於其之子代，與繼代數無關。子代在核酸內容上可能與親本細胞不完全一致，而是可能含有突變。本文中包括具有與在最初轉化細胞中所篩選或選擇相同之功能或生物學活性的突變子代。
關於參考多肽序列之「胺基酸序列一致性百分比(%)」係定義為在將候選序列與參考多肽序列對準且必要時引入間隙以達成最大序列一致性百分比後且在任何保守取代均不被視為序列一致性之一部分的情況下，候選序列中與參考多肽序列中之胺基酸殘基一致的胺基酸殘基的百分比。用於確定胺基酸序列一致性百分比之目的的比對可用熟習此項技術者能力範圍內的多種方式實現，例如使用公開可得之電腦軟體，諸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)軟體。熟習此項技術者可確定適用於比對序列之參數，包括在所比較之序列全長上達成最大對準所需之任何演算法。然而，出於本文之目的，胺基酸序列一致性%值係使用序列比較電腦程式ALIGN-2產生。ALIGN-2序列比較電腦程式由Genentech,Inc.授權，且原始碼已與用戶文件一起提交在美國著作權局(Washington D.C.，20559)，在此處以美國著作權登記號TXU510087寄存。ALIGN-2程式可公開得自Genentech,Inc.(South San Francisco，California)，或可由原始碼編譯。ALIGN-2程式應經編譯以用於UNIX作業系統，包括數位UNIX V4.0D。所有序列比較參數均由ALIGN-2程式設定且不發生變化。
在採用ALIGN-2進行胺基酸序列比較之情形下，指定胺基酸序列A同、與或相對於指定胺基酸序列B(其可替代地表述為同、與或相對於指定胺基酸序列B具有或包含一定胺基酸序列一致性%的指定胺基酸序列A)之胺基酸序列一致性%計算如下：100×分數X/Y，其中X為在對A 與B進行程式比對時由序列比對程式ALIGN-2評分為一致匹配之胺基酸殘基數目，且其中Y為B中之胺基酸殘基總數。應瞭解，在胺基酸序列A之長度不等於胺基酸序列B之長度的情況下，A與B之胺基酸序列一致性%將不等於B與A之胺基酸序列一致性%。除非另外特定陳述，否則本文中所使用之所有胺基酸序列一致性%值係使用ALIGN-2電腦程式如前一段落中所描述而獲得。
如本文中所使用，「投與」意指給予個體一定劑量之化合物(例如本發明之抗VEGF抗體、本發明之抗體結合物、本發明之融合蛋白質、本發明之聚合物調配物或編碼本發明之抗VEGF抗體之核酸)或組成物(例如醫藥組成物，例如包括本發明之抗VEGF抗體、本發明之抗體結合物、本發明之融合蛋白質或本發明之聚合物調配物之醫藥組成物)之方法。本文中所描述之方法中所利用的組成物可例如經玻璃體內(例如藉由玻璃體內注射)、藉由滴眼劑、經肌肉內、經靜脈內、經真皮內、經皮膚、經動脈內、經腹膜內、經病變內、經顱骨內、經關節內、經前列腺內、經胸膜內、經氣管內、經鞘內、經鼻內、經陰道內、經直腸內、經局部、經腫瘤內、經腹膜、經皮下、經結膜下、經膀胱內、經黏膜、經心包內、經臍靜脈內、經眼球內、經眶內、經口、局部、透皮、藉由吸入、藉由注射、藉由植入、藉由輸注、藉由連續輸注、藉由直接局部灌注浸浴靶細胞、藉由導管、藉由灌洗、於乳膏中或於脂質組成物中投與。本文中所描述之方法中所利用之組成物亦可全身或局部投與。投與方法可視多種因素(例如所投與之化合物或組成物及所治療之病狀、疾病或病症之嚴重程度)而變化。
「血管生成」係指由預先存在之血管形成新血管之過程。血管生成與由中胚層前驅細胞重新形成內皮細胞之血管發生不同。可藉由本發明之組成物及方法來治療與病理性血管生成相關之病症。此等病症包括非贅生性病症及細胞增殖性病症兩者。細胞增殖性病症包括但不限於以下所描述之彼等病症。非贅生性病症包括但不限於眼部病狀(非限制性眼部病狀包括例如視網膜病，包括增殖性糖尿病性視網膜病、脈絡膜新血管形成(CNV)、年齡相關性黃斑變性(AMD)、糖尿病性及其他局部缺血相關性視網膜病、糖尿病性黃斑水腫(DME)、病理性近視、馮希伯-林島氏病、眼組織 胞漿菌病、視網膜靜脈阻塞(包括中央形式(CRVO)及分枝形式(BRVO))、角膜新血管形成、視網膜新血管形成、早產兒視網膜病(ROP)、家族性滲出性玻璃體視網膜病變(FEVR)、柯氏病、諾裡氏病、骨質疏鬆症-假神經膠質瘤症候群(OPPG)、結膜下出血、虹膜發紅、眼部新血管疾病、新血管性青光眼及高血壓性視網膜病變)、自體免疫疾病(例如變形性關節炎(RA)、牛皮癬、關節黏連性脊椎炎及炎性腸病(例如克羅恩氏病及潰瘍性結腸炎))、不理想或異常肥大、關節炎、牛皮癬性關節炎、斑塊狀牛皮癬、類肉瘤病、動脈粥樣硬化、動脈粥樣硬化斑塊、動脈硬化、血管再狹窄、動靜脈畸形(AVM)、腦膜瘤、血管瘤、血管纖維瘤、甲狀腺增生(包括葛瑞夫茲氏病)、角膜及其他組織移植、肺炎、急性肺損傷/ARDS、敗血症、原發性肺動脈高壓、惡性肺積水、腦水腫(例如與急性中風/閉合性腦損傷/創傷相關)、滑膜炎、RA中之血管翳形成、骨化性肌炎、肥大性骨形成、骨關節炎(OA)、難治性腹水、囊性卵巢病、子宮內膜異位症、第三空間流失病(胰臟炎、隔室症候群、胃灼熱、腸病)、慢性哮喘、子宮纖維瘤、早產、慢性炎症諸如IBD(克羅恩氏病及潰瘍性結腸炎)、炎性腎病(包括腎小球性腎炎，尤其系膜增生性腎小球性腎炎、溶血性尿毒癥症候群、糖尿病性腎病及高血壓性腎硬化)、移植繼發性疾病、腎同種異體移植排斥、炎性疾病、腎病症候群、不理想或異常組織大量生長(非癌症)、血友病性關節、肥厚性瘢痕、抑制毛髮生長、奧-韋二氏症候群(Osler-Weber syndrome)、化膿性肉芽腫晶體後纖維膜增生症、硬皮病、沙眼、血管黏連、滑膜炎、皮炎、子癇前期、腹水、心包膜積液(諸如與心囊炎相關者)及胸膜積液。以下描述其他眼部病症。
可能與病理性血管生成相關之其他病症包括骨摺不癒合(將不癒合之骨摺)、化膿性肉芽腫、沙眼、血友病性關節、血管黏連及肥厚性瘢痕、移植物排斥、纖維血管組織、紅斑痤瘡、後天免疫缺乏症候群、動脈阻塞、特應性角膜炎、細菌性潰瘍、貝賽特氏病(Bechet’s disease)、頸動脈阻塞病、慢性炎症、慢性視網膜脫落、慢性葡萄膜炎、慢性玻璃體炎、接觸式透鏡超戴症、角膜移植物排斥、角膜移植物新血管形成、伊爾斯氏病(Eales disease)、流行性角膜結膜炎、真菌性潰瘍、單純性皰疹感染、帶狀皰疹感染、黏性過大症候群、卡波西氏肉瘤、白血病、脂肪樣變性、萊 姆病(Lyme’s disease)、邊緣性角質層分離、莫倫氏潰瘍(Mooren ulcer)、除麻瘋病以外之分枝桿菌感染、近視、視窩、骨關節炎、柏哲德氏病(Paget’s disease)、平坦部炎、類天皰瘡、皰性角結膜病、多動脈炎、雷射後併發症、原生動物感染、彈性假黃瘤、翼狀胬肉乾燥性角膜炎、放射狀角膜切開術、晶狀體後纖維增生症、類肉瘤、鞏膜炎、鐮狀細胞性貧血、修格連氏症候群、斯塔加氏病(Stargarts disease)、史蒂芬-強森症候群(Steven’s Johnson disease)、上輪部角結膜炎、梅毒、全身性狼瘡、特芮安氏角膜邊緣變性(Terrien’s marginal degeneration)、弓形體病、創傷、靜脈阻塞、維生素A缺乏症及韋氏類肉瘤病(Wegeners sarcoidosis)、與糖尿病相關之不理想血管生成、寄生蟲性疾病、異常創口癒合、手術後肥大、損傷或創傷、抑制毛髮生長、抑制排卵及黃體形成、抑制移植及抑制胚胎在子宮中發育。
如本文中所使用之術語「眼部病症」包括與病理性血管生成相關之任何眼部病症(在本文中亦可互換稱為「眼部病狀」)。眼部病症之特徵可能在於新血管向眼組織(諸如視網膜或角膜)結構中之經改變或不受調控之增殖及/或侵襲。非限制性眼部病症包括例如AMD(例如，濕性AMD、乾性AMD、中期AMD、晚期AMD及地圖樣萎縮(GA))、黃斑變性、黃斑水腫、DME(例如局部非中心性DME及擴散性中心參與性DME)、視網膜病、糖尿病性視網膜病(DR)(例如，增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)及高原DR)、其他局部缺血相關性視網膜病、ROP、視網膜靜脈阻塞(RVO)(例如中央形式(CRVO)及分枝形式(BRVO))、CNV(例如近視性CNV)、角膜新血管形成、與角膜新血管形成相關之疾病、視網膜新血管形成、與視網膜/脈絡膜新血管形成相關之疾病、病理性近視、馮希伯-林島氏病、眼組織胞漿菌病、FEVR、柯氏病、諾裡氏病、OPPG、結膜下出血、虹膜發紅、眼部新血管疾病、新血管性青光眼、色素性視網膜炎(RP)、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤性增生、黃斑毛細血管擴張、虹膜新血管形成、眼內新血管形成、視網膜變性、囊樣黃斑水腫(CME)、血管炎、視乳頭水腫、視網膜炎、結膜炎(例如感染性結膜炎及非感染性(例如過敏性)結膜炎)、萊伯先天性黑矇(亦稱為萊伯氏先天性黑矇或LCA)、葡萄膜炎(包括感染性及非感染性葡萄膜炎)、脈絡膜炎(例如多灶性脈絡膜炎)、眼組織胞漿菌病、瞼 緣炎、乾眼症、創傷性眼損傷、修格連氏病及其他眼科疾病，其中該疾病或病症與眼部新血管形成、血管滲漏及/或視網膜水腫相關。其他例示性眼部病症包括與虹膜發紅(隅角新血管形成)相關之疾病及由維管或纖維組織之異常增殖引起之疾病，包括增殖性玻璃體視網膜病之所有形式。
與角膜新血管形成相關之例示性疾病包括但不限於流行性角結膜炎、維生素A缺乏症、接觸式透鏡超戴症、特應性角膜炎、上輪部角結膜炎、翼狀胬肉乾燥性角膜炎、修格連氏病、紅斑痤瘡、皰性角結膜病、梅毒、分枝桿菌感染、脂肪樣變性、化學灼傷、細菌性潰瘍、真菌性潰瘍、單純性皰疹感染、帶狀皰疹感染、原生動物感染、卡波西肉瘤、莫倫氏潰瘍、特芮安氏角膜邊緣變性、邊緣性角質層分離、變形性關節炎、全身性狼瘡、多動脈炎、創傷、韋氏類肉瘤病、鞏膜炎、史蒂芬-強森症候群、天皰瘡樣放射狀角膜切開術及角膜移植物排斥。
與視網膜/脈絡膜新血管形成相關之例示性疾病包括但不限於糖尿病性視網膜病、黃斑變性、鐮狀細胞性貧血、類肉瘤、梅毒、彈性假黃瘤、柏哲德氏病、靜脈阻塞、動脈阻塞、頸動脈阻塞病、慢性葡萄膜炎/玻璃體炎、分枝桿菌感染、萊姆病、全身性紅斑狼瘡、早產兒視網膜病、色素性視網膜炎、視網膜水腫(包括黃斑水腫)、伊爾斯氏病、貝賽特氏病、引起視網膜炎或脈絡膜炎(例如多灶性脈絡膜炎)之感染、眼假組織胞漿菌病、貝斯特氏症(卵黃樣黃斑變性)、近視、視窩、斯塔加氏病、平坦部炎、視網膜脫落(例如慢性視網膜脫落)、黏性過大症候群、弓形體病、創傷及雷射後併發症。
如本文中所使用之「與不理想血管滲透相關之病症」包括例如與腦腫瘤相關之水腫、與惡性病相關之腹水、梅格斯氏症候群、肺炎、腎病症候群、心包膜積液、胸膜積液、與心血管疾病相關之滲透(諸如心肌梗死後病狀及中風)及其類似病症。
應理解，以上所描述之分類不會相互排斥，且一種病症可能屬於多個類別。
術語「細胞增殖性病症」及「增殖性病症」係指與一定程度之異常細胞增殖相關之病症。在一個實施例中，該細胞增殖性病症為癌症。
如本文中所提及，術語「癌症」、「癌性」、「細胞增殖性病症」、「增殖性病症」及「腫瘤」不互相排斥。
如本文中所使用之「腫瘤」係指所有贅生性細胞生長及增殖，無論是惡性或是良性，及所有癌症前及癌性細胞及組織。
「血管生成因子或血管生成劑」為刺激血管發育，例如促進血管生成、內皮細胞生長、血管穩定性及/或血管發生等之生長因子。舉例而言，血管生成因子包括但不限於例如VEGF及VEGF家族成員、PlGF、PDGF家族、纖維母細胞生長因子(FGF)、TIE配位體(血管生成素)、肝配蛋白(ephrin)、Del-1、纖維母細胞生長因子(酸性(aFGF)及鹼性(bFGF))、濾泡抑素、顆粒球群落刺激因子(G-CSF)、肝細胞生長因子(HGF)/分散因子(SF)、介白素-8(IL-8)、瘦素、中期因子、胎盤生長因子、血小板衍生內皮細胞生長因子(PD-ECGF)、血小板衍生生長因子(尤其PDGF-BB或PDGFR-β)、多效生長因子(PTN)、顆粒蛋白前體、增殖蛋白、轉型生長因子-α(TGF-α)、轉型生長因子-β(TGF-β)、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血管內皮生長因子(VEGF)/血管滲透因子(VPF)等。其亦將包括加速創口癒合之因子，諸如生長激素、胰島素樣生長因子-I(IGF-I)、VIGF、表皮生長因子(EGF)、CTGF及其家族成員以及TGF-α及TGF-β。參見例如Klagsbrun及D’Amore,Annu.Rev.Physiol.,53：217-39(1991)；Streit及Detmar,Oncogene,22：3172-3179(2003)；Ferrara及Alitalo,Nature Medicine 5(12)：1359-1364(1999)；Tonini等人，Oncogene,22：6549-6556(2003)(例如，列出已知血管生成因子之表1)；及Sato,Int.J.Clin.Oncol.,8：200-206(2003)。
「抗血管生成劑」或「血管生成抑制劑」係指直接或間接地抑制血管生成、血管發生或不合需要之血管滲透的小分子量物質、多核苷酸、多肽、經分離蛋白質、重組蛋白質、抗體或其結合物或融合蛋白質。應理解，抗血管生成劑包括結合並阻斷血管生成因子或其受體之血管生成活性的彼等藥劑。舉例而言，抗血管生成劑為針對如以上所定義之血管生成劑的抗體或其他拮抗劑，例如VEGF拮抗劑(例如針對VEGF-A或針對VEGF-A受體(例如KDR受體或Flt-1受體)之抗體)、PDGF拮抗劑(例如抗PDGFR抑制劑，諸如GLEEVECTM(甲磺酸伊馬替尼))。抗血管生成劑亦包 括天然血管生成抑制劑，例如血管抑素、內皮抑素等。參見例如Klagsbrun及D’Amore,Annu.Rev.Physiol.,53：217-39(1991)；Streit及Detmar,Oncogene,22：3172-3179(2003)(例如，列出用於惡性黑色素瘤之抗血管生成療法的表3)；Ferrara及Alitalo,Nature Medicine 5(12)：1359-1364(1999)；Tonini等人，Oncogene,22：6549-6556(2003)(例如，列出已知抗血管生成因子之表2)；及Sato Int.J.Clin.Oncol.,8：200-206(2003)(例如，表1列出用於臨床試驗之抗血管生成劑)。
如本文中所使用之術語「VEGF拮抗劑」係指能夠結合VEGF、降低VEGF表現水準或者中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF生物學活性(包括但不限於VEGF與一或多種VEGF受體結合、VEGF信號傳導以及VEGF介導之血管生成及內皮細胞存活或增殖)之分子。舉例而言，能夠中和、阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF生物學活性之分子可藉由結合一或多種VEGF受體(VEGFR)(例如，VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、膜結合VEGF受體(mbVEGFR)或可溶性VEGF受體(sVEGFR))而發揮其效應。適用於本發明方法之VEGF拮抗劑包括特異性結合VEGF之多肽、抗VEGF抗體及其抗原結合片段、特異性結合VEGF從而抑制其與一或多種受體結合之受體分子及衍生物、融合蛋白質(例如VEGF-Trap(Regeneron))及VEGF121-白樹毒素(Peregrine)。VEGF拮抗劑亦包括VEGF多肽之拮抗性變異體、與編碼VEGF多肽之核酸分子之至少一個片段互補的反義核鹼基寡聚物；與編碼VEGF多肽之核酸分子之至少一個片段互補之小RNA；靶向VEGF之核糖酶；針對VEGF之肽體；及VEGF適體。VEGF拮抗劑亦包括結合VEGFR之多肽、抗VEGFR抗體及其抗原結合片段，及結合VEGFR從而阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF生物學活性(例如VEGF信號傳導)之衍生物或融合蛋白質。VEGF拮抗劑亦包括結合VEGF或VEGFR且能夠阻斷、抑制、消除、降低或干擾VEGF生物學活性之非肽小分子。因而，術語「VEGF活性」尤其包括VEGF介導之VEGF生物學活性。在某些實施例中，VEGF拮抗劑使VEGF表現水準或生物學活性降低或抑制至少10%、20%、30%、40%、50%、60%、70%、80%、90%或更多。在一些實施例中，受VEGF特異性拮抗劑抑制之VEGF為VEGF (8-109)、VEGF(1-109)或VEGF165。
如本文中所使用，VEGF拮抗劑可包括但不限於抗VEGFR2抗體及相關分子(例如雷莫蘆單抗(ramucirumab)、他尼蘆單抗(tanibirumab)、阿柏西普)、抗VEGFR1抗體及相關分子(例如伊魯庫單抗(icrucumab)、阿柏西普(VEGF Trap-Eye；EYLEA®)及ziv-阿柏西普(VEGF Trap；ZALTRAP®))、雙特異性VEGF抗體(例如MP-0250、伐奴珠單抗(vanucizumab)(VEGF-ANG2)及US 2001/0236388中所揭示之雙特異性抗體)、包括抗VEGF、抗VEGFR1及抗VEGFR2臂、抗VEGF抗體中兩者之組合的雙特異性抗體(例如貝伐珠單抗(bevacizumab)、賽伐珠單抗(sevacizumab)及雷珠單抗)及非肽小分子VEGF拮抗劑(例如帕唑帕尼(pazopanib)、阿西替尼(axitinib)、凡德他尼(vandetanib)、癌瑞格(stivarga)、卡博替尼(cabozantinib)、樂伐替尼(lenvatinib)、尼達尼布(nintedanib)、奧蘭替尼(orantinib)、替拉替尼(telatinib)、朵維替尼(dovitinig)、西地尼布(cediranib)、莫特塞尼(motesanib)、索凡替尼(sulfatinib)、阿帕替尼(apatinib)、福樂替尼(foretinib)、法米替尼(famitinib)及替伏贊尼(tivozanib))。以下描述其他VEGF拮抗劑。
藥劑(例如醫藥調配物)之「有效量」係指在必需劑量下及時間段內有效達成所要治療或預防結果的量。
「個人」或「個體」為哺乳動物。哺乳動物包括但不限於馴化動物(例如牛、羊、貓、狗及馬)、靈長類動物(例如人類及非人類靈長類動物，諸如猴)、兔及齧齒動物(例如小鼠及大鼠)。在某些實施例中，該個人或個體為人類。「個體」可為「患者」。
術語「癌症」及「癌性」係指或描述哺乳動物中典型地以失調之細胞生長為特徵之生理病狀。癌症之實例包括但不限於癌瘤、淋巴瘤、母細胞瘤、肉瘤及白血病或淋巴惡性病。該等癌症之更特定實例包括鱗狀細胞癌、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、胃腸癌、胰臟癌、神經膠母細胞瘤、子宮頸癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝細胞癌、乳癌、結腸癌、結腸直腸癌、子宮內膜癌、唾液腺癌、腎臟癌、腎癌、前列腺癌、外陰癌、甲狀腺癌、肝癌及多種類型之頭頸癌。「哺乳動物」出於治療之目的係指分類為哺 乳動物之任何動物，包括人類、馴養動物及農場動物、非人類靈長類動物，以及動物園動物、競技動物或寵物動物，諸如狗、馬、貓、牛等。
「病症」為將受益於用抗體治療之任何病狀。舉例而言，哺乳動物罹患或需要預防異常血管生成(過度、不當或不受控制之血管生成)或血管滲透。此包括慢性及急性病症或疾病，包括使哺乳動物易於患上所論述病症之病理學病狀。本文中欲治療之病症的非限制性實例包括與病理性血管生成相關之病症(例如眼部病症及細胞增殖性病症)及與不合需要之血管滲透相關之病症。
術語「抗贅生性組成物」係指適用於治療癌症之組成物，其包含至少一種活性治療劑，例如「抗癌劑」。治療劑(抗癌劑)之實例包括但限於例如化學治療劑、生長抑制劑、細胞毒性劑、放射療法中所使用之藥劑、抗血管生成劑、細胞凋亡劑、抗微管蛋白劑及其他用於治療癌症之藥劑，諸如抗HER-2抗體、抗CD20抗體、表皮生長因子受體(EGFR)拮抗劑(例如酪胺酸激酶抑制劑)、HER1/EGFR抑制劑(例如埃羅替尼(erlotinib)(TARCEVATM)、血小板衍生生長因子抑制劑(例如GLEEVECTM(甲磺酸伊馬替尼))、COX-2抑制劑(例如希樂葆(celecoxib))、干擾素、細胞因子、結合以下標靶ErbB2、ErbB3、ErbB4、PDGFR-β、BlyS、APRIL、BCMA或VEGF受體TRAIL/Apo2中之一或多者的拮抗劑(例如中和抗體)及其他生物學活性及有機化學劑，及其類似物。本發明中亦包括其組合。
如本文中所使用之術語「細胞毒性劑」係指抑制或預防細胞功能及/或引起細胞死亡或破壞的物質。細胞毒性劑包括但不限於放射性同位素(例如At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素)；化學治療劑或藥物(例如胺甲蝶呤(methotrexate)、亞德里亞黴素(adriamicin)、長春花生物鹼(長春新鹼、長春花鹼、依託泊苷(etoposide))、阿黴素、美法侖(melphalan)、絲裂黴素C(mitomycin C)、苯丁酸氮芥(chlorambucil)、道諾黴素(daunorubicin)或其他插入劑)；生長抑制劑；酶及其片段，諸如核分解酶；抗生素；毒素，諸如細菌、真菌、植物或動物來源之小分子毒素或酶活性毒素，包括其片段及/或變異體；及下文所揭示之各種抗腫瘤或抗癌劑。
「化學治療劑」為適用於治療癌症之化合物。化學治療劑之實例包括適用於治療癌症之化學化合物。化學治療劑之實例包括烷基化劑，諸如噻替派(thiotepa)及CYTOXAN®環磷醯胺；烷基磺酸鹽，諸如白消安(busulfan)、英丙舒凡(improsulfan)及保釋芬(piposulfan)；氮丙啶，諸如苯佐替派(benzodopa)、卡波醌(carboquone)、美妥替哌(meturedopa)及烏瑞替哌(uredopa)；伸乙基亞胺及甲基三聚氰胺，包括六甲密胺(altretamine)、三伸乙基密胺、三伸乙基磷醯胺、三伸乙基硫代磷醯胺及三羥甲基三聚氰胺；多聚乙醯(尤其布拉它辛(bullatacin)及布拉它辛酮(bullatacinone))；喜樹鹼(包括合成類似物拓朴替康(topotecan))；苔蘚抑素；卡利他汀(callystatin)；CC-1065(包括其阿多來新(adozelesin)、卡摺來新(carzelesin)及比摺來新(bizelesin)合成類似物)；念珠藻素(cryptophycins)(尤其念珠藻素1及念珠藻素8)；朵拉司他汀(dolastatin)；度卡黴素(duocarmycin)(包括合成類似物KW-2189及CB1-TM1)；艾榴塞洛素(eleutherobin)；水鬼蕉鹼(pancratistatin)；珊瑚素(sarcodictyin)；海綿素(spongistatin)；氮芥類，諸如苯丁酸氮芥、萘氮芥(chlomaphazine)、氯環磷醯胺(chlorophosphamide)、雌氮芥、異環磷醯胺(ifosfamide)、甲氮芥、氧化甲氮芥鹽酸鹽、苯丙胺酸氮芥、新恩比興(novembichin)、苯芥膽固醇(phenesterine)、潑尼氮芥(prednimustine)、曲洛磷胺(trofosfamide)、尿嘧啶氮芥；亞硝基脲，諸如卡莫司汀(carmustine)、氯脲菌素(chlorozotocin)、福莫司汀(fotemustine)、洛莫司汀(lomustine)、尼莫司汀(nimustine)及雷莫司汀(ranimnustine)；抗生素，諸如烯二炔抗生素(例如卡奇黴素(calicheamicin)，尤其卡奇黴素γ1I及卡奇黴素ωI1)(參見例如Agnew,Chem Intl.Ed.Engl.,33：183-186(1994))；達內黴素(dynemicin)，包括達內黴素A；雙膦酸鹽，諸如氯屈膦酸鹽；埃斯培拉黴素(esperamicin)；以及新制癌菌素發色團及相關色蛋白烯二炔抗生素發色團)、阿克拉黴素(aclacinomysins)、放線菌素(actinomycin)、安麯黴素(authramycin)、重氮絲胺酸(azaserine)、爭光黴素(bleomycins)、放線菌素C(cactinomycin)、卡柔比星(carabicin)、洋紅黴素(caminomycin)、嗜癌菌素(carzinophilin)、色黴素(chromomycins)、放線菌素D(dactinomycin)、道諾黴素、阿黴素(detorubicin)、6-重氮-5-側氧基-L-正白胺酸、ADRIAMYCIN®(包 括N-嗎啉基阿黴素、氰基(N-嗎啉基)阿黴素、2-吡咯啉基阿黴素及去氧阿黴素)、表柔比星(epirubicin)、依索比星(esorubicin)、伊達比星(idarubicin)、麻西羅黴素(marcellomycin)、絲裂黴素(諸如絲裂黴素C)、黴酚酸(mycophenolic acid)、諾加黴素(nogalamycin)、橄欖黴素(olivomycins)、培洛黴素(peplomycin)、泊非黴素(porfiromycin)、嘌呤黴素(puromycin)、三鐵阿黴素(quelamycin)、羅多比星(rodorubicin)、鏈黑菌素(streptonigrin)、鏈脲黴素(streptozocin)、殺結核菌素(tubercidin)、烏苯美司(ubenimex)、淨司他丁(zinostatin)、佐柔比星(zorubicin)；抗代謝物，諸如胺甲蝶呤及5-氟尿嘧啶(5-FU)；葉酸類似物，諸如二甲葉酸、胺甲蝶呤、蝶羅呤(pteropterin)、曲美沙特(trimetrexate)；嘌呤類似物，諸如氟達拉濱(fludarabine)、6-巰基嘌呤、硫咪嘌呤(thiamiprine)、硫鳥嘌呤；嘧啶類似物，諸如環胞苷、阿紮胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟(carmofur)、阿糖胞苷、二去氧尿苷、去氧氟尿苷(doxifluridine)、依諾他濱(enocitabine)、氟尿苷；雄激素，諸如卡魯睪酮(calusterone)、丙酸屈他雄酮(dromostanolone propionate)、環硫雄醇(epitiostanol)、美雄烷(mepitiostane)、睪內酯；抗腎上腺抗體，諸如胺魯米特(aminoglutethimide)、米托坦(mitotane)、曲洛司坦(trilostane)；葉酸補充劑，諸如亞葉酸；醋葡內酯；醛磷醯胺糖苷；胺基乙醯丙酸；恩尿嘧啶(eniluracil)；安吖啶(amsacrine)；貝斯布希(bestrabucil)；比生群(bisantrene)；依達曲沙(edatraxate)；地磷醯胺(defofamine)；脫羰秋水仙鹼(demecolcine)；地吖醌(diaziquone)；依洛尼塞(elfornithine)；依利醋銨(elliptinium acetate)；埃博黴素(epothilone)；依託格魯(etoglucid)；硝酸鎵；羥基脲；香菇多糖；洛尼達寧(lonidainine)；類美登素，諸如美坦生(maytansine)及安絲菌素(ansamitocins)；米托胍腙(mitoguazone)；米托蒽醌(mitoxantrone)；莫哌達醇(mopidanmol)；硝呋旦(nitraerine)；噴司他丁(pentostatin)；苯來美特(phenamet)；吡柔比星(pirarubicin)；洛索蒽醌(losoxantrone)；鬼臼酸；2-乙基醯肼；丙卡巴肼(procarbazine)；PSK®多糖複合物(JHS Natural Products,Eugene,OR)；雷佐生(razoxane)；根瘤菌素(rhizoxin)；西索菲蘭(sizofuran)；鍺螺胺(spirogermanium)；細交鏈孢菌酮酸(tenuazonic acid)；三亞胺醌(triaziquone)；2,2',2"-三氯三乙胺；單端孢菌素(尤其T-2毒素、黏液黴素A (verracurin A)、漆斑菌素A(roridin A)及蛇形菌素(anguidine))；尿烷(urethan)；長春地辛(vindesine)；達卡巴嗪(dacarbazine)；甘露醇氮芥；二溴甘露醇；二溴衛矛醇(mitolactol)；哌泊溴烷(pipobroman)；加西托辛(gacytosine)；阿拉伯糖苷(「Ara-C」)；環磷醯胺；噻替派；紫杉烷，例如TAXOL®太平洋紫杉醇(Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)、ABRAXANETM無Cremophor型經白蛋白工程改造之太平洋紫杉醇奈米粒子調配物及TAXOTERE®多烯紫杉醇(docetaxel)(Rhône-Poulene Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；GEMZAR®吉西他濱；6-硫代鳥嘌呤；巰基嘌呤；胺甲蝶呤；鉑類似物，諸如順鉑(cisplatin)及卡鉑(carboplatin)；敏伯斯登(vinblastine)；鉑；依託泊苷(VP-16)；異環磷醯胺(ifosfamide)；米托蒽醌；敏克瘤(vincristine)；NAVELBINE®溫諾平(vinorelbine)；諾消靈(novantrone)；替尼泊苷；依達曲沙(edatrexate)；道諾黴素；胺基蝶呤；截瘤達(xeloda)；伊班膦酸鹽(ibandronate)；伊立替康(irinotecan)(Camptosar、CPT-11)(包括伊立替康與5-FU及亞葉酸之治療方案)；拓撲異構酶抑制劑RFS 2000；二氟甲基鳥胺酸(DMFO)；類視黃素，諸如視黃酸；卡培他濱(capecitabine)；康普瑞汀(combretastatin)；亞葉酸(LV)；益樂鉑(oxaliplatin)，包括益樂鉑治療方案(FOLFOX)；減少細胞增殖之PKC-α、Raf、H-Ras、EGFR(例如埃羅替尼(TARCEVATM))及VEGF-A抑制劑，以及以上任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。
此定義中亦包括用於調節或抑制對腫瘤之激素作用的抗激素劑，諸如抗雌激素及選擇性雌激素受體調節劑(SERM)，包括例如他莫西芬(tamoxifen)(包括NOLVADEX®他莫西芬)、雷洛昔芬(raloxifene)、屈洛昔芬(droloxifene)、4-羥基他莫西芬、曲沃昔芬(trioxifene)、雷洛西芬(keoxifene)、LY117018、奧那司酮(onapristone)及FARESTON®托瑞米芬；抑制在腎上腺中調節雌激素產生之芳香酶的芳香酶抑制劑，諸如，例如4(5)-咪唑、胺魯米特、MEGASE®甲地孕酮、AROMASIN®依西司坦(exemestane)、福美司坦(formestanie)、法屈唑(fadrozole)、RIVISOR®伏氯唑(vorozole)、FEMARA®來曲唑(letrozole)及ARIMIDEX®阿那曲唑(anastrozole)；及抗雄激素，諸如氟他胺(flutamide)、尼魯米特(nilutamide)、 比卡魯胺(bicalutamide)、亮丙瑞林(leuprolide)及歌舍瑞林(goserelin)；以及曲沙他濱(troxacitabine)(1,3-二氧戊環核苷胞嘧啶類似物)；反義寡核苷酸，尤其在異常細胞增殖中所牽涉之信號傳導途徑中抑制基因表現之彼等反義寡核苷酸，諸如，例如PKC-α、Raf及H-Ras；核糖酶，諸如VEGF表現抑制劑(例如ANGIOZYME®核糖酶)及HER2表現抑制劑；疫苗，諸如基因療法疫苗，例如ALLOVECTIN®疫苗、LEUVECTIN®疫苗及VAXID®疫苗；PROLEUKIN® rIL-2；LURTOTECAN®拓撲異構酶1抑制劑；ABARELIX® rmRH；長春瑞濱及埃斯培拉黴素(參見美國專利第4,675,187號)，及上述任一者之醫藥學上可接受之鹽、酸或衍生物。
如本文中所使用之術語「前藥」係指醫藥學活性物質之與母體藥物相比對腫瘤細胞具有較低細胞毒性且能夠被酶活化或轉化成更具活性之母體形式的前驅物或衍生物形式。參見例如Wilman,「Prodrugs in Cancer Chemotherapy」Biochemical Society Transactions,14，第375-382頁，615th Meeting Belfast(1986)；及Stella等人，「Prodrugs：A Chemical Approach to Targeted Drug Delivery」,Directed Drug Delivery,Borchardt等人(編)，第247-267頁，Humana Press(1985)。本發明之前藥包括但不限於可轉化成更具活性之無細胞毒性藥物的含磷酸鹽之前藥、含硫代磷酸鹽之前藥、含硫酸鹽之前藥、含肽前藥、經D-胺基酸改質之前藥、糖基化前藥、含β-內醯胺之前藥、含視情況經取代之苯氧基乙醯胺之前藥或含視情況經取代之苯基乙醯胺之前藥、5-氟胞嘧啶及其他5-氟尿苷前藥。可衍生化成前藥形式以用於本發明之細胞毒性藥物之實例包括但不限於以上所描述之彼等化學治療劑。
術語「包裝插頁」用於指通常包括在治療產品之商業包裝中的說明書，其含有關於適應症、用法、劑量、投藥、組合療法、禁忌症及/或關於使用該等治療產品之警告的資訊。
「醫藥學上可接受之載劑」係指醫藥調配物中除活性成分以外對個體無毒之成分。醫藥學上可接受之載劑包括但不限於緩衝劑、賦形劑、穩定劑或防腐劑。
術語「醫藥調配物」係指呈允許其中所含之活性成分(例如， 抗VEGF抗體、抗體結合物、融合蛋白質或聚合物調配物)的生物學活性有效之形式且不含對將投與調配物之個體具有不可接受之毒性的附加組分的製劑。
如本文中所使用，「治療」(及其語法變化形式)係指試圖改變所治療個體之天然過程的臨床干預，且可為了預防而進行或在臨床病理學過程中進行。理想治療效果包括但不限於防止疾病發生或復發、減輕症狀、消除疾病之任何直接或間接病理學後果、預防轉移、降低疾病進展速率、改善或減緩疾病狀態及緩解或改良預後。在一些實施例中，本發明之抗體或包括本發明之抗體之其他組成物(例如抗體結合物、融合蛋白質或聚合物調配物)用於延遲疾病發展或減緩疾病進展。
「經分離之」核酸分子為已鑑別且已與在該核酸之天然來源中一般同其締合之至少一種污染核酸分子分離的核酸分子。經分離之核酸分子不呈其現於自然界中之形式或設定。因此，經分離之核酸分子不同於其存在於天然細胞中時之核酸分子。然而，經分離之核酸分子包括一般表現抗體之細胞(其中例如該核酸分子處於與天然細胞中不同的染色體位置上)中所含有之核酸分子。
表述「控制序列」係指在特定宿主生物體中表現可操作地連接之編碼序列所必需的DNA序列。舉例而言，適用於原核生物之控制序列包括啟動子、視情況存在之操作子序列及核糖體結合位點。已知真核細胞利用啟動子、聚腺苷酸化信號及增強子。
當核酸與另一核酸序列置於功能性關係中時，其得以「可操作地連接」。舉例而言，若前驅序列或分泌前導序列之DNA表現為參與多肽分泌之前驅蛋白質，則其可操作地連接於多肽之DNA；若啟動子或增強子影響序列之轉錄，則其可操作地連接於編碼序列；或若核糖體結合位點經安置以促進轉譯，則其可操作地連接於編碼序列。一般而言，「可操作地連接」意謂所連接之DNA序列為連續的且在分泌前導序列之情況下為連續的且處於閱讀相中。然而，增強子不必為連續的。連接係藉由在適宜限制位點處連結來實現。若該等位點不存在，則根據習知實務使用合成寡核苷酸銜接子或連接子。
如本文中所使用，表述「細胞」、「細胞株」及「細胞培養物」可互換使用且所有此種名稱均包括子代。因而，字組「轉型體」及「經轉型之細胞」包括原代個體細胞及由其獲得之培養物，與轉換次數無關。亦應理解，由於有意或無意之突變，所有子代在DNA內容方面不可能精確一致。包括具有相同功能或生物學活性之突變子代，如針對原始經轉型細胞所篩選。在意欲獨特命名之情況下，將根據上下文顯而易見。
如本文中所使用，「庫」係指多個抗體或抗體片段序列(例如本發明之抗VEGF抗體)或編碼此等序列之核酸、根據本發明之方法引入此等序列中之變異胺基酸之組合中的不同的序列。
「突變」為相對於參考核苷酸序列(諸如野生型序列)之核苷酸缺失、插入或取代。
如本文中所使用，「密碼子集」係指用於編碼所要變異胺基酸之一組不同的核苷酸三連體序列。可例如藉由固相合成來合成包括表示密碼子集所提供之核苷酸三連體之所有可能組合而且將編碼所要胺基酸群組的序列的一組寡核苷酸。密碼子名稱之標準形式為此項技術中已知且本文中已描述之IUB代碼形式。密碼子集典型地由3個斜體大寫字母表示，例如NNK、NNS、XYZ、DVK及其類似物。利用某些位置上之所選核苷酸「簡併」來合成寡核苷酸在此項技術中為熟知的，例如TRIM方法(Knappek等人，J.Mol.Biol.296：57-86(1999))；Garrard等人，Gene 128：103(1993))。此種具有某些密碼子集之寡核苷酸集可使用市售核酸合成器(可獲自例如Applied Biosystems，Foster City，CA)來合成，或可獲自市面(例如，得自Life Technologies，Rockville，MD)。因此，所合成之具有特定密碼子集之寡核苷酸集典型地將包括具有不同的序列的多種寡核苷酸，不同之處由整個序列內之密碼子集確定。如根據本發明使用之寡核苷酸具有允許與可變域核酸模板雜交之序列，且亦可但未必包括適用於例如選殖目的之限制酶位點。
「噬菌體呈現」為將變異多肽作為與外殼蛋白之至少一部分的融合蛋白質呈現至噬菌體(例如絲狀噬菌體、粒子)表面上的技術。噬菌體呈現之實用性在於可針對以高親和力結合靶抗原之彼等序列而快速且有效 地分選較大隨機蛋白質變異體庫。在噬菌體上呈現肽及蛋白質庫已用於針對具有特定結合性質之多肽來篩選數百萬多肽。多價噬菌體呈現方法已用於藉由與絲狀噬菌體之基因III或基因VIII融合來呈現小隨機肽及小蛋白質。Wells及Lowman,Curr.Opin.Struct.Biol.,3：355-362(1992)以及其中所引用之參考文獻。在單價噬菌體呈現中，使蛋白質或肽庫與基因III或其部分融合，且在野生型基因III蛋白存在下以低水準表現，使得噬菌體粒子呈現融合蛋白質之一個副本或不呈現該融合蛋白質。親合力效應相對於多價噬菌體有所降低，使得分選基於固有配體親和力，並且使用噬菌體質體載體，由此簡化DNA操縱。Lowman及Wells,Methods：A companion to Methods in Enzymology,3：205-0216(1991)。
「噬菌體質體」為具有細菌複製起點例如ColE1及噬菌體基因間區域之副本的質體載體。噬菌體質體可用於任何已知的噬菌體，包括絲狀噬菌體及λ形噬菌體。質體一般亦將含有抗生素抗性之選擇標記。選殖至此等載體中之DNA節段可作為質體而增殖。當給帶有此等載體之細胞提供產生噬菌體粒子所必需之所有基因時，質體之複製模式變成滾環複製以產生質體DNA之一個股鏈的副本並且包裝噬菌體粒子。噬菌體質體可形成感染性或非感染性噬菌體粒子。此術語包括含有與異源多肽基因連接為基因融合物，從而該異源多肽呈現在噬菌體粒子表面上之噬菌體外殼蛋白基因或其片段的噬菌體質體。
術語「噬菌體載體」意謂含有異源基因且能夠複製之雙鏈可複製形式噬菌體。噬菌體載體具有允許噬菌體複製及噬菌體粒子形成之噬菌體複製起點。噬菌體較佳為絲狀噬菌體，諸如M13、f1、fd、Pf3噬菌體或其衍生物；或者λ形噬菌體，諸如λ、21、phi80、phi81、82、424、434等，或其衍生物。
起始或參考多肽(例如參考抗體或其可變域/HVR)之「變異體」或「突變體」為如下之多肽：(1)不同於該起始或參考多肽之具有胺基酸序列；及(2)藉由天然或人工(人為)突變誘發而來源於該起始或參考多肽。此種變異體包括例如對相關多肽之胺基酸序列進行殘基缺失及/或插入變成取代，本文中稱為「胺基酸殘基變化」。因而，變異HVR係指相對於起始 或參考多肽序列(諸如來源抗體或抗原結合片段之序列)而言包含變異序列之HVR。在本文中，胺基酸殘基變化係指胺基酸不同於起始或參考多肽序列(諸如參考抗體或其片段之序列)中相應位置上之胺基酸。可對缺失、插入及取代進行任何組合以獲得最終變異或突變構築體，其限制條件為該最終構築體具有所要功能特徵。胺基酸變化亦可改變多肽之轉譯後過程，諸如改變糖基化位點之數目或位置。
「野生型(WT)」或「參考」序列或者「野生型」或「參考」蛋白質/多肽之序列，諸如參考抗體之HVR或可變域，可為藉由引入突變而獲得變異多肽之參考序列。一般而言，指定蛋白質之「野生型」序列為自然界中最常見之序列。類似地，「野生型」基因序列為自然界中最常見之基因的序列。可藉由自然過程或藉由人工誘導手段向「野生型」基因(且因而向其編碼之蛋白質中)引入突變。此種方法之產物為原始「野生型」蛋白質或基因之「變異」或「突變」形式。
如本文中所使用之「參考抗體」係指抗原結合序列充當模板序列，此後根據本文中所描述之準則進行多樣化的抗體或其片段。抗原結合序列一般包括抗體可變區，較佳至少一個HVR，較佳包括架構區。
「大規模地平行定序」或「大規模平行定序」在此項技術中亦稱為「下一代定序」或「第二代定序」，意謂任何高輸出量核酸定序方法。此等方法典型地包括大量(例如數千、數百萬或數十億)空間上隔開、經選殖擴增之DNA模板或單一DNA分子進行平行定序。參見例如Metzker,Nature Reviews Genetics 11：31-36,2010。
如本文中所使用之「增濃」意謂與相應參考庫(例如未分選之庫，或已針對不同或無關抗原加以分選之庫)相比，實體(例如胺基酸殘基變化)以較高頻率存在於經分選之庫中。相比之下，「缺失」意謂與相應參考庫(例如未分選之庫，或已針對不同或無關抗原加以分選之庫)相比，實體(例如胺基酸殘基變化)以較較低頻率存在於經分選之庫中。術語「中性」當參考鑑別胺基酸殘基變異體之方法使用時意謂實體既未經富集又未缺失，換言之，與相應參考庫(例如未分選之庫，或已針對不同或無關抗原加以分選之庫)相比，其以大致相同之頻率存在於經分選之庫中。
「等電點(pI)」意謂分子(例如蛋白質，諸如抗體)不攜帶淨電荷時之pH值，在此項技術中亦稱為「pH(I)」或「IEP」。
如本文中所使用，「抗體結合物」為共價連接於一或多種聚合物之抗體。任何適合之聚合物均可與抗體結合，例如，親水性聚合物(例如透明質酸(HA)或聚乙二醇(PEG))或疏水性聚合物(例如，聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA))。
如本文中所使用，術語「聚合物」意謂包括由化學鍵以線性、圓形、分枝、交聯或樹枝狀方式或其組合連接之重複結構單元(亦即，單體)的分子。聚合物可為合成的或天然存在的，或其組合。應理解，術語「聚合物」涵蓋共聚物，其為包括兩種或更多種不同的單體的聚合物。聚合物亦可為均聚物，其為僅包括單一類型單體之聚合物。
在本文中可互換使用之術語「透明質酸」及「HA」係指聚合糖胺聚糖(GAG)，其含有N-乙醯基葡糖胺及葡糖醛酸之重複二糖單元。HA為陰離子性非硫酸化GAG，其可見於例如細胞外基質(例如眼玻璃體中)、結締組織、上皮及神經組織中。
如本文中所使用之術語「聚乙二醇」或「PEG」係指亦稱為聚環氧乙烷(PEO)或聚氧乙烯(POE)之聚醚化合物，視其分子量而定。PEG可具有結構H-(O-CH2-CH2)n-OH，其中n為任何適合之整數。PEG可為分枝PEG、星形PEG或梳形PEG。PEG可為例如PEG四聚物、PEG六聚物或PEG八聚物。
如本文中所使用，術語「融合蛋白質」係指第一肽、蛋白質或多肽，例如抗體(例如抗VEGF抗體(例如本文中所描述之任何抗VEGF抗體，例如G6.31 AARR))直接或間接地與第二肽、蛋白質或多肽，例如眼部結合域(例如HA結合域)連接之蛋白質。在一個實例中，該第一肽、蛋白質或多肽(例如抗體)可藉由連接子與該第二肽、蛋白質或多肽(例如眼部結合域(例如HA結合域))連接。在融合蛋白之上下文中，術語「連接」及其語法變化形式可與術語「共價連接」互換使用且係指融合蛋白質之兩個部分之間的直接或間接共價鍵結(例如肽鍵)。一般而言，本發明之融合蛋白質為抗體融合蛋白質。抗體可為抗體片段，例如Fab、Fab'或Fab-C。在一些 情況下，該抗體片段為Fab。
術語「眼部結合域」係指結合眼部(例如角膜、玻璃體、視網膜、視網膜色素上皮或脈絡膜)所發現之生物學物質的肽、蛋白質、多肽或其片段。作為一個實例，在一些情況下，眼中所發現之生物學物質為細胞外基質組分，例如碳水化合物(例如帶電碳水化合物(例如糖胺聚糖))、糖蛋白(例如原纖維蛋白及旋光蛋白)或蛋白質(例如膠原蛋白(例如I至XXVII型膠原蛋白，尤其膠原蛋白II、膠原蛋白IX、膠原蛋白V、膠原蛋白VI、膠原蛋白XI及其異型膠原蛋白纖維)或例如Le Goff等人，Eye 22：1214-1222,2008中所描述之其他細胞外基質組分。在一些情況下，細胞外基質組分為糖胺聚糖，例如HA或蛋白聚糖(例如硫酸軟骨素或硫酸肝素)。在一個實例中，該眼部結合域為透明質酸結合域。
如本文中所使用，術語「透明質酸結合域」或「HA結合域」係指結合HA之肽、蛋白質、多肽或其片段。HA結合域可來源於HA結合蛋白質(在此項技術中亦稱為「透明質酸黏素」)，包括例如腫瘤壞死因子刺激基因6(TSG6)、淋巴管內皮透明質酸受體1(LYVE-1)、透明質酸及蛋白聚糖連接蛋白(HAPLN)1、HAPLN2、HAPLN3、HAPLN4、聚集蛋白聚糖、短小蛋白聚糖、神經蛋白聚糖、磷酸蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、CAB61358、KIA0527、穩定素-1、穩定素-2、RHAMM、細菌HA合成酶及膠原蛋白VI。其他HA結合蛋白在此項技術中為已知的。例示性HA結合域包括連接模組、G1域及富離胺酸寡肽。
「連接模組」(此項技術中亦稱為「連接域」)為結合HA之具有約100個胺基酸之結構域(參見例如Yang等人，EMBO J.,13(2)：286-296；Mahoney等人，J.Biol.Chem.276(25)：22764-22771,2001；及Blundell等人，J.Biol.Chem.278(49)：49261-49270,2003)。例示性非限制性連接模組包括來自於TSG6、CD44、LYVE-1、HAPLN1、HAPLN2、HAPLN3、HAPLN4、聚集蛋白聚糖、短小蛋白聚糖、神經蛋白聚糖、磷酸蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、CAB61358、KIA0527、穩定素-1及穩定素-2連接模組或其變異體之彼等連接模組。作為一個實例，HA結合蛋白TSG6之連接模組可包括人類TSG6(UniProt登錄號P98066)之胺基酸殘基36-128。變異連接模 組結合HA且可與野生型或參考連接模組具有例如至少80%胺基酸序列一致性(例如80%、85%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%或更高序列一致性)，且相對於野生型或參考連接模組胺基酸序列可包括諸如插入、缺失及取代(例如保守胺基酸取代)之序列變化。
在融合蛋白質之上下文中，「連接子」可為連接(例如共價連接)第一部分(例如抗體(例如抗VEGF抗體(例如本文中所描述之任何抗VEGF抗體，例如G6.31 AARR)))與第二部分(例如眼部結合域(例如HA結合域))之肽或多肽。連接子可包括具有任何適合之長度，例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20或更多個胺基酸殘基的胺基酸序列。在一些情況下，連接子包括約3、約4、約5、約6、約7或約8個殘基。在一些情況下，連接子包括胺基酸序列GGGGS(SEQ ID NO：61)。
如本文中所使用之「水凝膠」係指由因存在共價化學交聯而不溶之均聚物或共聚物構成的親水性或兩親性聚合物網狀結構。交聯可提供網狀結構及物理完整性。水凝膠可展現與水之熱力學相容性，由此允許其在水性介質中膨脹。
如本文中所使用，術語「可逆前藥連接子」意謂一端經由可逆鍵聯而連接於生物學活性部分(例如藥物，諸如抗VEGF抗體)且另一端經由永久鍵而連接於載體(例如水凝膠)，從而連接該生物學活性部分與該載體的部分。此種可逆前藥連接子為非酶水解可降解的，亦即，在生理條件(例如，pH 7.4、37℃水性緩衝液)下可裂解，半衰期介於例如一小時至十二個月之範圍內。可逆鍵聯包括例如烏頭酸、縮醛、醯胺、羧酸酐、酯、亞胺、腙、馬來酸醯胺、原酸酯、磷醯胺、磷酸酯、磷酸矽烷基酯、矽烷基酯、磺酸酯、芳族胺基甲酸酯及其組合。相比之下，永久鍵聯在生理條件(pH 7.4、37℃水性緩衝液)下為非酶水解可降解的，半衰期超過十二個月。例示性可逆前藥連接子描述於例如國際專利申請公開案第2014/056923號中，該案以全文引用之方式併入本文中。
如本文中所使用之「清除率」係指每單位時間自隔室(例如眼(例如玻璃體))中清除之物質(例如抗VEGF抗體、抗體結合物、融合蛋白 質(例如Fab融合蛋白質)或聚合物調配物)之體積。
術語「半衰期」係指物質(例如抗VEGF抗體、抗體結合物、融合蛋白質(例如Fab融合蛋白質)或聚合物調配物)之濃度在生體內(例如在眼(例如玻璃體))中)或生體外降低一半所需之時間。
II. 組成物及方法
本發明提供結合VEGF之新穎抗體以及製造及使用其之方法，例如，用於診斷及治療用途。本發明亦提供包括抗VEGF抗體(包括本文中所描述之任何抗VEGF抗體)之組成物，包括抗體結合物、融合蛋白質及聚合物調配物，以及製造及使用其之方法，例如用於診斷及治療用途。本發明亦提供鑑別具有改良之性質，例如增強之結合親和力、穩定性及/或表現的抗體變異體的方法。
A. 例示性抗VEGF抗體
在一個態樣中，本發明部分基於特異性結合VEGF之抗體。本發明之抗體適用於例如減少血管生成及用於治療或延遲與病理性血管生成相關之病症(例如，眼部病症或細胞增殖性病症)之進展。本發明之抗體亦適用於例如抑制血管滲透及治療與不合需要之血管滲透相關之病症。
在一些情況下，該抗VEGF抗體可包括至少一、二、三、四、五或六個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列DYWIH(SEQ ID NO：1)；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列GX1TPX2GGX3X4X5YX6DSVX7X8(SEQ ID NO：2)，其中X1為Ile或His，X2為Ala或Arg，X3為Tyr或Lys，X4為Thr或Glu，X5為Arg、Tyr、Gln或Glu，X6為Ala或Glu，X7為Lys或Glu，且X8為Gly或Glu；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQX1VSTAVA(SEQ ID NO：4)，其中X1為Asp或Arg；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列X1ASFLYS(SEQ ID NO：5)，其中X1為Ser或Met；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列X1QGYGX2PFT(SEQ ID NO：6)，其中X1為Gln、Asn或Thr，且X2為Ala、Asn、Gln或Arg；或以上HVR中之一或多者之組合，及其與SEQ ID NO：1-6中之任一者具有至少約80%序列一致性(例如，81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、 90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)的一或多種變異體。
舉例而言，該抗VEGF抗體可包括至少一、二、三、四、五或六個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列DYWIH(SEQ ID NO：1)；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列GITPAGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO：7)、GITPAGGYEYYADSVKG(SEQ ID NO：21)或GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO：22)；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：8)；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：9)；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)或QQGYGNPFT(SEQ ID NO：23)，或以上HVR中之一或多者之組合，及其與SEQ ID NO：1、3、7-10或21-23中之任一者具有至少約80%序列一致性(例如，81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)的一或多種變異體。
舉例而言，在一些情況下，該抗VEGF抗體可包括至少一、二、三、四、五或六個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列DYWIH(SEQ ID NO：1)；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列GITPAGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO：7)；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：8)；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：9)；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)；或以上HVR中之一或多者之組合，及其與SEQ ID NO：1、3或7-10中之任一者具有至少約80%序列一致性(例如，81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)的一或多種變異體。在一特定實例中，在一些情況下，該抗VEGF抗體包括以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列DYWIH(SEQ ID NO：1)；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列GITPAGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO：7)；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列 FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：8)；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：9)；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)。
在一些情況下，前述抗VEGF抗體中之任一者均可包括以下重鏈可變域架構區(FR)中之一、二、三或四個：(a)FR-H1，其包含胺基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS(SEQ ID NO：13)；(b)FR-H2，其包含胺基酸序列WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO：14)；(c)FR-H3，其包含胺基酸序列RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：15)；及(d)FR-H4，其包含胺基酸序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：16)。
在一些情況下，前述抗VEGF抗體中之任一者均可包括以下輕鏈可變域FR中之一、二、三或四個：(a)FR-L1，其包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：17)；(b)FR-L2，其包含胺基酸序列WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：18)；(c)FR-L3，其包含胺基酸序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO：19)；及(d)FR-L4，其包含胺基酸序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)。
舉例而言，在一些情況下，該抗VEGF抗體包括以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列DYWIH(SEQ ID NO：1)；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列GITPAGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO：7)；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：8)；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：9)；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)。在一些情況下，該抗VEGF抗體包括以下四個重鏈可變域FR：(a)FR-H1，其包含胺基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS(SEQ ID NO：13)；(b)FR-H2，其包含胺基酸序列WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO：14)；(c)FR-H3，其包含胺基酸序列RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：15)；及(d)FR-H4，其包含胺基酸序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID N O：16)。在其他情況下，該抗VEGF抗體包括以下四個輕鏈可變域FR：(a)FR-L1，其包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：17)；(b)FR-L2，其包含胺基酸序列WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：18)；(c)FR-L3，其包含胺基酸序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO：19)；及(d)FR-L4，其包含胺基酸序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)。在一些情況下，該抗VEGF抗體包括(a)包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的VH域及(b)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的VL域。
舉例而言，在一些情況下，該抗VEGF抗體可包括至少一、二、三、四、五或六個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列DYWIH(SEQ ID NO：1)；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO：22)；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：8)；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：9)；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQGYGNPFT(SEQ ID NO：23)，或以上HVR中之一或多者之組合，及其與SEQ ID NO：1、3、8、9、22或23中之任一者具有至少約80%序列一致性(例如，81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)的一或多種變異體。在一特定實例中，在一些情況下，該抗VEGF抗體包括以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列DYWIH(SEQ ID NO：1)；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO：22)；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：8)；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：9)；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQGYGNPFT(SEQ ID NO：23)。
在一些情況下，前述抗VEGF抗體中之任一者均可包括以下重鏈可變域架構區(FR)中之一、二、三或四個：(a)FR-H1，其包含胺基酸序列EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO：29)或 EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO：51)；(b)FR-H2，其包含胺基酸序列WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO：30)；(c)FR-H3，其包含胺基酸序列RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：31)；及(d)FR-H4，其包含胺基酸序列WGQGELVTVSS(SEQ ID NO：32)。
在一些情況下，前述抗VEGF抗體中之任一者均可包括以下輕鏈可變域FR中之一、二、三或四個：(a)FR-L1，其包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：17)；(b)FR-L2，其包含胺基酸序列WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：18)；(c)FR-L3，其包含胺基酸序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：24)；及(d)FR-L4，其包含胺基酸序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)。
舉例而言，在一些情況下，該抗VEGF抗體包括以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列DYWIH(SEQ ID NO：1)；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO：22)；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：8)；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：9)；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQGYGNPFT(SEQ ID NO：23)。在一些情況下，該抗VEGF抗體包括以下四個重鏈可變域FR：(a)FR-H1，其包含胺基酸序列EEQLVEEGGGIVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO：29)；(b)FR-H2，其包含胺基酸序列WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO：30)；(c)FR-H3，其包含胺基酸序列RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：31)；及(d)FR-H4，其包含胺基酸序列WGQGELVTVSS(SEQ ID NO：32)。在其他情況下，該抗VEGF抗體包括以下四個輕鏈可變域FR：(a)FR-L1，其包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：17)；(b)FR-L2，其包含胺基酸序列WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：18)；(c)FR-L3，其包含胺基酸序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：24)；及(d)FR-L4，其包含胺基酸序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)。在一些情況下，該抗VEGF抗體包括(a)包含SEQ ID NO：33之 胺基酸序列的VH域及(b)包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的VL域。
在一些情況下，該抗VEGF抗體包括以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列DYWIH(SEQ ID NO：1)；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO：22)；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：8)；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：9)；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQGYGNPFT(SEQ ID NO：23)。在一些情況下，該抗VEGF抗體包括以下四個重鏈可變域FR：(a)FR-H1，其包含胺基酸序列EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO：51)；(b)FR-H2，其包含胺基酸序列WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO：30)；(c)FR-H3，其包含胺基酸序列RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：31)；及(d)FR-H4，其包含胺基酸序列WGQGELVTVSS(SEQ ID NO：32)。在其他情況下，該抗VEGF抗體包括以下四個輕鏈可變域FR：(a)FR-L1，其包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：17)；(b)FR-L2，其包含胺基酸序列WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：18)；(c)FR-L3，其包含胺基酸序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：24)；及(d)FR-L4，其包含胺基酸序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)。在一些情況下，該抗VEGF抗體包括(a)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的VH域及(b)包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的VL域。
舉例而言，在一些情況下，該抗VEGF抗體可包括至少一、二、三、四、五或六個選自以下之HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列DYWIH(SEQ ID NO：1)；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO：22)；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：8)；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：9)；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)；或以上HVR中之一或多者之組合，及其與SEQ ID NO：1、3、8-10或22中之任一者具有至少約80%序列一致性(例如，81%、82%、83%、84%、 85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)的一或多種變異體。在一特定實例中，在一些情況下，該抗VEGF抗體包括以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列DYWIH(SEQ ID NO：1)；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO：22)；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：8)；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：9)；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)。
在一些情況下，前述抗VEGF抗體中之任一者均可包括以下重鏈可變域架構區(FR)中之一、二、三或四個：(a)FR-H1，其包含胺基酸序列EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO：29)或EEQIVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO：51)；(b)FR-H2，其包含胺基酸序列WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO：30)；(c)FR-H3，其包含胺基酸序列RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：31)；及(d)FR-H4，其包含胺基酸序列WGQGELVTVSS(SEQ ID NO：32)。
在一些情況下，前述抗VEGF抗體中之任一者均可包括以下輕鏈可變域FR中之一、二、三或四個：(a)FR-L1，其包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：17)、DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO：25)或DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO：26)；(b)FR-L2，其包含胺基酸序列WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：18)或WYQQKPGEAPKLLIY(SEQ ID NO：27)；(c)FR-L3，其包含胺基酸序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO：19)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC(SEQ ID NO：28)；及(d)FR-L4，其包含胺基酸序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)。
舉例而言，在一些情況下，該抗VEGF抗體包括以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列DYWIH(SEQ ID NO：1)；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO：22)；(c)HVR-H3， 其包含胺基酸序列FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：8)；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：9)；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)。在一些情況下，該抗VEGF抗體包括以下四個重鏈可變域FR：(a)FR-H1，其包含胺基酸序列EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO：29)；(b)FR-H2，其包含胺基酸序列WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO：30)；(c)FR-H3，其包含胺基酸序列RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：31)；及(d)FR-H4，其包含胺基酸序列WGQGELVTVSS(SEQ ID NO：32)。在其他情況下，該抗VEGF抗體包括以下四個輕鏈可變域FR：(a)FR-L1，其包含胺基酸序列DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO：25)；(b)FR-L2，其包含胺基酸序列WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：18)；(c)FR-L3，其包含胺基酸序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO：19)；及(d)FR-L4，其包含胺基酸序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)。在一些情況下，該抗VEGF抗體包括(a)包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的VH域及(b)包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的VL域。
舉例而言，在其他情況下，該抗VEGF抗體包括以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列DYWIH(SEQ ID NO：1)；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO：22)；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：8)；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：9)；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)。在一些情況下，該抗VEGF抗體包括以下四個重鏈可變域FR：(a)FR-H1，其包含胺基酸序列EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO：29)；(b)FR-H2，其包含胺基酸序列WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO：30)；(c)FR-H3，其包含胺基酸序列RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：31)；及(d)FR-H4，其包含胺基酸序列WGQGELVTVSS(SEQ ID NO：32)。在其他情況下，該抗VEGF抗體包括以下四個輕鏈可變域FR：(a)FR-L1， 其包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO：26)；(b)FR-L2，其包含胺基酸序列WYQQKPGEAPKLLIY(SEQ ID NO：27)；(c)FR-L3，其包含胺基酸序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC(SEQ ID NO：28)；及(d)FR-L4，其包含胺基酸序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)。在一些情況下，該抗VEGF抗體包括(a)包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的VH域及(b)包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的VL域。
舉例而言，在其他情況下，該抗VEGF抗體包括以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列DYWIH(SEQ ID NO：1)；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO：22)；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：8)；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：9)；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)。在一些情況下，該抗VEGF抗體包括以下四個重鏈可變域FR：(a)FR-H1，其包含胺基酸序列EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO：51)；(b)FR-H2，其包含胺基酸序列WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO：30)；(c)FR-H3，其包含胺基酸序列RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：31)；及(d)FR-H4，其包含胺基酸序列WGQGELVTVSS(SEQ ID NO：32)。在其他情況下，該抗VEGF抗體包括以下四個輕鏈可變域FR：(a)FR-L1，其包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO：26)；(b)FR-L2，其包含胺基酸序列WYQQKPGEAPKLLIY(SEQ ID NO：27)；(c)FR-L3，其包含胺基酸序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC(SEQ ID NO：28)；及(d)FR-L4，其包含胺基酸序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)。在一些情況下，該抗VEGF抗體包括(a)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的VH域及(b)包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的VL域。
舉例而言，在又其他情況下，該抗VEGF抗體包括以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列DYWIH(SEQ ID NO：1)；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO：22)；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)；(d) HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：8)；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：9)；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)。在一些情況下，該抗VEGF抗體包括以下四個重鏈可變域FR：(a)FR-H1，其包含胺基酸序列EEQIVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO：29)；(b)FR-H2，其包含胺基酸序列WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO：30)；(c)FR-H3，其包含胺基酸序列RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：31)；及(d)FR-H4，其包含胺基酸序列WGQGELVTVSS(SEQ ID NO：32)。在其他情況下，該抗VEGF抗體包括以下四個輕鏈可變域FR：(a)FR-L1，其包含胺基酸序列DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO：25)；(b)FR-L2，其包含胺基酸序列WYQQKPGEAPKLLIY(SEQ ID NO：27)；(c)FR-L3，其包含胺基酸序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO：19)；及(d)FR-L4，其包含胺基酸序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)。在一些情況下，該抗VEGF抗體包括(a)包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的VH域及(b)包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的VL域。
舉例而言，在再其他情況下，該抗VEGF抗體包括以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列DYWIH(SEQ ID NO：1)；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO：22)；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：8)；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：9)；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)。在一些情況下，該抗VEGF抗體包括以下四個重鏈可變域FR：(a)FR-H1，其包含胺基酸序列EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO：29)；(b)FR-H2，其包含胺基酸序列WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO：30)；(c)FR-H3，其包含胺基酸序列RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：31)；及(d)FR-H4，其包含胺基酸序列WGQGELVTVSS(SEQ ID NO：32)。在其他情況下，該抗VEGF抗體包括以下四個輕鏈可變域FR：(a)FR-L1，其包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO：26)；(b) FR-L2，其包含胺基酸序列WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：18)；(c)FR-L3，其包含胺基酸序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO：19)；及(d)FR-L4，其包含胺基酸序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)。在一些情況下，該抗VEGF抗體包括(a)包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的VH域及(b)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的VL域。
在其他情況下，該抗VEGF抗體包括以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列DYWIH(SEQ ID NO：1)；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO：22)；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：8)；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SASFLYs(SEQ ID NO：9)；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)。在一些情況下，該抗VEGF抗體包括以下四個重鏈可變域FR：(a)FR-H1，其包含胺基酸序列EEQIVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO：51)；(b)FR-H2，其包含胺基酸序列WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO：30)；(c)FR-H3，其包含胺基酸序列RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：31)；及(d)FR-H4，其包含胺基酸序列WGQGELVTVSS(SEQ ID NO：32)。在其他情況下，該抗VEGF抗體包括以下四個輕鏈可變域FR：(a)FR-L1，其包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO：26)；(b)FR-L2，其包含胺基酸序列WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：18)；(c)FR-L3，其包含胺基酸序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO：19)；及(d)FR-L4，其包含胺基酸序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)。在一些情況下，該抗VEGF抗體包括(a)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的VH域及(b)包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的VL域。
舉例而言，在其他情況下，該抗VEGF抗體包括以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列DYWIH(SEQ ID NO：1)；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO：22)；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：8)；(e)HVR-L2，其包含胺基酸 序列SASFLYS(SEQ ID NO：9)；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)。在一些情況下，該抗VEGF抗體包括以下四個重鏈可變域FR：(a)FR-H1，其包含胺基酸序列EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO：29)；(b)FR-H2，其包含胺基酸序列WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO：30)；(c)FR-H3，其包含胺基酸序列RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：31)；及(d)FR-H4，其包含胺基酸序列WGQGELVTVSS(SEQ ID NO：32)。在其他情況下，該抗VEGF抗體包括以下四個輕鏈可變域FR：(a)FR-L1，其包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：17)；(b)FR-L2，其包含胺基酸序列WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：18)；(c)FR-L3，其包含胺基酸序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO：19)；及(d)FR-L4，其包含胺基酸序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)。在一些情況下，該抗VEGF抗體包括(a)包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的VH域及(b)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的VL域。
在其他情況下，該抗VEGF抗體包括以下六個HVR：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列DYWIH(SEQ ID NO：1)；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列GITPAGGYEYYADSVEG(SEQ ID NO：22)；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：8)；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SASFLYs(SEQ ID NO：9)；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)。在一些情況下，該抗VEGF抗體包括以下四個重鏈可變域FR：(a)FR-H1，其包含胺基酸序列EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO：51)；(b)FR-H2，其包含胺基酸序列WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO：30)；(c)FR-H3，其包含胺基酸序列RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：31)；及(d)FR-H4，其包含胺基酸序列WGQGELVTVSS(SEQ ID NO：32)。在其他情況下，該抗VEGF抗體包括以下四個輕鏈可變域FR：(a)FR-L1，其包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：17)；(b)FR-L2，其包含胺基酸序列WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：18)；(c) FR-L3，其包含胺基酸序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO：19)；及(d)FR-L4，其包含胺基酸序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)。在一些情況下，該抗VEGF抗體包括(a)包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的VH域及(b)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的VL域。
在一些情況下，該抗VEGF抗體包含(a)重鏈可變(VH)域，其包含與SEQ ID NO：11、40或42中之任一者具有至少90%序列一致性(例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)的胺基酸序列或SEQ ID NO：11、40或42中之任一者的序列；(b)輕鏈可變(VL)域，其包含與SEQ ID NO：12、41或46中之任一者具有至少90%序列一致性(例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)的胺基酸序列或SEQ ID NO：12、41或46中之任一者的序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。舉例而言，在一些情況下，該抗體包括包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的VL域。在一些情況下，該抗體包括包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的VL域。在一些情況下，該抗體包括包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的VL域。在一些情況下該抗體包括包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO：41之胺基酸序列的VL域。在一些情況下，該抗體包括包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO：46之胺基酸序列的VL域。
在一些情況下，前述抗VEGF抗體中之任一者均可包括以下重鏈可變域架構區(FR)中之一、二、三或四個：(a)FR-H1，其包含胺基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS(SEQ ID NO：13)；(b)FR-H2，其包含胺基酸序列WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO：14)或WVRQEPGKGLEWVA(SEQ ID NO：39)；(c)FR-H3，其包含胺基酸序列RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：15)；及(d)FR-H4，其包含胺基酸序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：16)。
在一些情況下，前述抗VEGF抗體中之任一者均可包括以下輕鏈可變域FR中之一、二、三或四個：(a)FR-L1，其包含胺基酸序列D IQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：17)或DIQMTQSPSSLSASVGDRVTIDC(SEQ ID NO：45)；(b)FR-L2，其包含胺基酸序列WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：18)；(c)FR-L3，其包含胺基酸序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO：19)、GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDSATYYC(SEQ ID NO：44)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYC(SEQ ID NO：54)；及(d)FR-L4，其包含胺基酸序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)或FGQGTKVEVK(SEQ ID NO：55)。
在一些情況下，該抗體包括包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列的VH域及包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：59)之VL域。
在一些情況下，該抗體包括包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的VH域及包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：59)之VL域。
在一些情況下，該抗體包括包含SEQ D NO：40之胺基酸序列的VH域及包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：59)之VL域。
在一些情況下，該抗體包括包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的VH域及包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：59)之VL域。
在一些情況下，該抗體包括包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的VH域及包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGNPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：59)之VL域。
在一些情況下，該抗體包括包含SEQ ID NO：11之胺基酸 序列的VH域及包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：60)之VL域。
在一些情況下，該抗體包括包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的VH域及包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：60)之VL域。
在一些情況下，該抗體包括包含SEQ ID NO：40之胺基酸序列的VH域及包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：60)之VL域。
在一些情況下，該抗體包括包含SEQ ID NO：42之胺基酸序列的VH域及包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFLYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：60)之VL域。
在一些情況下，該抗體包括包含SEQ ID N0：51之胺基酸序列的VH域及包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITCRASQDVSTAVAWYQQKPGKAPKLLIYSASFIYSGVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDVATYYCQQGYGAPFTFGQGTKVEIK(SEQ ID NO：60)之VL域。舉例而言，在一些情況下，該抗VEGF抗體包含：(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：11具有至少90%序列一致性(例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列或SEQ ID NO：11之序列；(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：11具有至少90%序列一致性(例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列或SEQ ID NO：11之序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。在一些情況下，該抗VEGF抗體可包括：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列DYWIH(SEQ ID NO：1)；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列GITPAGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO：7)；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)；(d)HVR-L1，其包含胺基酸 序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：8)；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：9)；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)。在一些情況下，該抗VEGF抗體包括以下重鏈架構區：(a)FR-H1，其包含胺基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS(SEQ ID NO：13)；(b)FR-H2，其包含胺基酸序列WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO：14)；(c)FR-H3，其包含胺基酸序列RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：15)；及(d)FR-H4，其包含胺基酸序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：16)。在一些情況下，該抗VEGF抗體包括以下輕鏈架構區：(a)FR-L1，其包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：17)；(b)FR-L2，其包含胺基酸序列WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：18)；(c)FR-L3，其包含胺基酸序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO：19)；及(d)FR-L4，其包含胺基酸序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)。在一些情況下，該抗VEGF抗體包括結合域，該結合域包括(a)包含SEQ I D NO：11之胺基酸序列的VH域及(b)包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的VL域。在一些情況下，例示性抗VEGF為N94A.F83A.N82aR.Y58R。
在一些情況下，該抗VEGF抗體包含：(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：33或51具有至少90%序列一致性(例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)之胺基酸序列或者SEQ ID NO：33或51之序列；(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：12、34、35、36、37或38中之任一者具有至少90%序列一致性(例如，至少91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)的胺基酸序列或者SEQ ID NO：12、34、35、36、37或38中之任一者的序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。舉例而言，在一些情況下，該抗體包括包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的VL域。在一些情況下，該抗體包括包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO：34之胺基酸序列的VL域。在一些情況下，該抗體包括包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的VL域。在一些情況下，該抗體包括包含SEQ ID NO：33之胺基酸序 列的VH域及包含SEQ ID NO：36之胺基酸序列的VL域。在一些情況下，該抗體包括包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的VL域。在一些情況下，該抗體包括包含SEQ ID NO：33之胺基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的VL域。在一些情況下，該抗體包括包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO：38之胺基酸序列的VL域。在一些情況下該抗體包括包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO：35之胺基酸序列的VL域。在一些情況下，該抗體包括包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO：37之胺基酸序列的VL域。在一些情況下，該抗體包括包含SEQ ID NO：51之胺基酸序列的VH域及包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列的VL域。
在一些情況下，前述抗VEGF抗體中之任一者均可包括以下重鏈可變域架構區(FR)中之一、二、三或四個：FR-H1，其包含胺基酸序列EEQLVEEGGGLVQPGESLELSCAASGFEIS(SEQ ID NO：29)或EEQLVEEGGGLVQPGESLRLSCAASGFEIS(SEQ ID NO：52)；(b)FR-H2，其包含胺基酸序列WVRQEPGEGLEWVA(SEQ ID NO：30)或WVRQEPGKGLEWVA(SEQ ID NO：39)；(c)FR-H3，其包含胺基酸序列RFTISADTSENTAYLQMNELRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：31)；及(d)FR-H4，其包含胺基酸序列WGQGELVTVSS(SEQ ID NO：32)。
在一些情況下，前述抗VEGF抗體中之任一者均可包括以下輕鏈可變域FR中之一、二、三或四個：(a)FR-L1，其包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：17)、DIQMTQSPESLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO：25)或DIQMTQSPSSLSASVGDEVTITC(SEQ ID NO：26)；(b)FR-L2，其包含胺基酸序列WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：18)或WYQQKPGEAPKLLIY(SEQ ID NO：27)；(c)FR-L3，其包含胺基酸序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO：19)、GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDFATYYC(SEQ ID NO：24)或GVPSRFSGSGSGTDFTLTIESLQPEDAATYYC(SEQ ID NO：28)；及(d)FR-L4，其包含胺基酸序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)。
在一些情況下，本發明提供一種抗體，其包含：(a)重鏈，其包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列；及/或(b)輕鏈，其包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列。在某些實施例中，該抗體為以Fab形式表現之G6.31 AARR。
在一些情況下，本發明提供一種抗體，其包含：(a)重鏈，其包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列；及/或(b)輕鏈，其包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列。在某些實施例中，該抗體為對抗人類IgG缺乏反應性之G6.31 AARR變異型式。
在另一態樣中，根據任何以上實施例之抗VEGF抗體可單獨或組合地併入如以下第1部分至第8部分中所描述之任何特徵：
1. 抗體親和力
在某些實施例中，本文中所提供之抗體具有
Figure 105130888-A0202-12-0078-13
1μM、
Figure 105130888-A0202-12-0078-15
100nM、
Figure 105130888-A0202-12-0078-16
10nM、
Figure 105130888-A0202-12-0078-17
1nM、
Figure 105130888-A0202-12-0078-18
0.1nM、
Figure 105130888-A0202-12-0078-19
0.01nM或
Figure 105130888-A0202-12-0078-20
0.001nM(例如10-8M或更低，例如10-8M至10-13M，例如10-9M至10-13M)之解離常數(Kd)。舉例而言，在一些情況下，本文中所提供之抗體以約10nM或更低之Kd結合人類VEGF(hVEGF)。在一些情況下，本文中所提供之抗體以約5nM或更低之Kd結合hVEGF。在一些情況下，本文中所提供之抗體以約2nM或更低之Kd結合hVEGF。舉例而言，在一些情況下，該抗體以介於約25pM與約2nM之間(例如約25pM、約50pM、約75pM、約100pM、約125pM、約150pM、約175pM、約200pM、約225pM、約250pM、約275pM、約300pM、約325pM、約350pM、約375pM、約400pM、約425pM、約450pM、約475pM、約500pM、約525pM、約550pM、約575pM、約600pM、約625pM、約650pM、約675pM、約700pM、約725pM、約750pM、約775pM、約800pM、約825pM、約850pM、約875pM、約900pM、約925pM、約950pM、約975pM、約1nM、約1.1nMM、約1.2nM、約1.3nM、約1.4nM、約1.5nM、約1.6nM、約1.7nM、約1.8nM、約1.9nM或約2nM)的Kd結合hVEGF。在一些情況下，該抗體以介於約75pM與約600pM之間(例如約75pM、約100pM、約125pM、約150pM、約175pM、約200pM、約225pM、約250pM、約275pM、約300pM、約325pM、約350pM、約375pM、約400pM、約425pM、約450pM、 約475pM、約500pM、約525pM、約550pM、約575pM、約600pM)的Kd結合hVEGF。在一些情況下，該抗體以介於約75pM與約500pM之間的Kd結合hVEGF。在一些情況下，該抗體以介於約75pM與約400pM之間的Kd結合hVEGF。在一些情況下，該抗體以介於約75pM與約300pM之間的Kd結合hVEGF。在一些情況下，該抗體以介於約75pM與約200pM之間的Kd結合hVEGF。在一些情況下，該抗體以介於約75pM與約150pM之間的Kd結合hVEGF。在一些情況下，該抗體以介於約75pM與約125pM之間的Kd結合hVEGF。在一些情況下，該抗體以介於約75pM與約100pM之間的Kd結合hVEGF。在一些情況下，該抗體以約80pM之Kd結合hVEGF。在一些情況下，該抗體以約60pM之Kd結合hVEGF。在一些情況下，該抗體以約40pM之Kd結合hVEGF。
在一個實施例中，Kd係藉由經放射性標記之抗原結合分析法(RIA)加以量測。在一個實施例中，RIA係利用相關抗體及其抗原之Fab型式來進行。舉例而言，藉由以下方式來量測Fab對抗原之溶液結合親和力：在未經標記之抗原之滴定系列存在下以最低濃度之經(125I)標記之抗原使Fab平衡，隨後以經抗Fab抗體塗佈之培養盤俘獲已結合之抗原(參見例如Chen等人，J.Mol.Biol.293：865-881(1999))。為了建立用於該分析法之條件，將MICROTITER®多孔培養盤(Thermo Scientific)用含5μg/ml俘獲抗Fab抗體(Cappel Labs)之50mM碳酸鈉(pH 9.6)塗佈隔夜，且隨後在室溫(約23℃)下用含2%(w/v)牛血清白蛋白(BSA)之磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)阻斷2至5小時。在非吸附性培養盤(Nunc #269620)中，將100pM或26pM[125I]-抗原與相關Fab之連續稀釋液混合(例如，按照Presta等人，Cancer Res.57：4593-4599(1997)中對抗VEGF抗體Fab-12之評定)。接著將相關Fab培育隔夜；然而，該培育可持續更長時段(例如約65小時)以確保達到平衡。此後，將該等混合物轉移至俘獲培養盤以便在室溫下培育(例如1小時)。接著移除該溶液且用含0.1%聚山梨酸酯20(TWEEN-20®)之PBS將培養盤洗滌八次。當培養盤已乾燥時，添加150μl/孔之閃爍劑(MICROSCINT-20TM；Packard)，且在TOPCOUNTTM γ計數器(Packard)上對培養盤計數10分鐘。選擇可提供小於或等於20%最大結合之各Fab濃度用於競爭性結合分析法。
根據另一實施例，Kd係使用BIACORE®表面電漿子共振分析法來量測。舉例而言，在25℃下用經固定之抗原CM5晶片以約10個反應單位(RU)進行使用BIACORE®-2000或BIACORE®-3000(BIAcore,Inc.，Piscataway，NJ)之分析法。在一個實施例中，根據製造商說明用N-乙基-N’-(3-二甲基胺基丙基)-碳化二亞胺鹽酸鹽(EDC)及N-羥基丁二醯亞胺(NHS)活化羧甲基化聚葡萄糖生物感測器晶片(CM5，BIAcore,Inc.)。用10mM乙酸鈉pH 4.8將抗原稀釋至5μg/ml(約0.2μM)，隨後以5μl/min之流速注入以達成約10個反應單位(RU)之偶合蛋白質。在注入抗原後，注入1M乙醇胺以阻斷未反應之基團。對於動力學量測，在25℃下將Fab之兩倍連續稀釋液(0.78nM至500nM)以約25μl/min之流速注入含0.05%聚山梨酸酯20(TWEEN-20TM)界面活性劑(PBST)之PBS中。使用簡單一對一朗謬結合模型(BIACORE® Evaluation Software 3.2版)，藉由同時擬合締合及解離感應譜來計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(Kd)計算為比率kon/koff。參見例如Chen等人，J.MolBiol.293：865-881(1999)。若由以上表面電漿子共振分析法所得之締合速率超過106M-1s-1，則可藉由使用螢光淬滅技術來測定締合速率，該技術量測含20nM抗抗原抗體(Fab形式)之PBS pH 7.2在25℃下在抗原濃度逐漸增加之情況下的螢光發射強度增加或降低(激發=295nm；發射=340nm，16nm帶通)，如在諸如裝備停流之光譜儀(Aviv Instruments)或具有攪拌光析管之8000系列SLM-AMINCOTM光譜儀(ThermoSpectronic)之光譜儀中所量測。
2. 抗體穩定性
本發明提供例如與抗VEGF抗體(例如G6.31)相比具有增強之穩定性的抗體(參見例如美國專利第7,758,859號及國際申請公開案第WO 2005/012359號，該兩者以全文引用之方式併入本文中)。可使用本領域中已知的任何方法來測定抗體之穩定性，例如差示掃描螢光測定法(DSF)、圓偏光二色性(CD)、內源蛋白質螢光、差示掃描量熱法、光譜法、光散射(例如動態光散射(DLS)及靜態光散射(SLS))、自身相互反應層析(SIC)。該抗VEGF抗體與例如G6.31之抗VEGF抗體相比可具有例如增加之解鏈溫度I、聚集溫度(Tagg)或其他穩定性度量。
在某些實施例中，本文中所提供之抗體具有大於或等於約80℃(例如約81℃、約82℃、約83℃、約84℃、約85℃、約86℃、約87℃、約88℃、約89℃、約90℃、約91℃、約92℃或約93℃)之Tm。舉例而言，在一些情況下，該抗VEGF抗體具有大於或等於約83.5℃(例如約83.5℃、約84℃、約85℃、約86℃、約87℃、約88℃、約89℃、約90℃、約91℃、約92℃或約93℃)之Tm。在一些情況下，該抗VEGF抗體具有約82℃至約92℃(例如約82℃、約83℃、約84℃、約85℃、約86℃、約87℃、約88℃、約89℃、約90℃、約91℃或約92℃)之Tm。在一些情況下，該抗VEGF抗體具有約82℃之Tm。在一些情況下，抗VEGF抗體之任何前述Tm值均使用DSF測定。在一些實施例中，如本文中(例如實例1中)所描述來測定抗VEGF抗體之Tm值。
3. 抗體片段
在某些實施例中，本文中所提供之抗體為抗體片段。抗體片段包括但不限於Fab、Fab’、Fab-C、Fab’-SH、F(ab’)2、Fv及scFv片段以及下文所描述之其他片段。關於某些抗體片段之綜述，參見Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)。關於scFv片段之綜述，參見例如Pluckthün,The Pharmacology of Monoclonal Antibodies，第113卷，Rosenburg及Moore編，(Springer-Verlag,New York)，第269-315頁(1994)；另參見WO 93/16185；及美國專利第5,571,894號及第5,587,458號。關於包含救助受體結合抗原決定基殘基且生體內半衰期有所增加之Fab及F(ab’)2片段之論述，參見美國專利第5,869,046號。
雙功能抗體為具有兩個抗原結合位點之抗體片段，其可為二價或雙特異性的。參見例如EP 404,097；WO 1993/01161；Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)；及Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：6444-6448(1993)。三功能抗體及四功能抗體亦描述於Hudson等人，Nat.Med.9：129-134(2003)中。
單域抗體為包含抗體之所有或部分重鏈可變域或者所有或部分輕鏈可變域的抗體片段。在某些實施例中，單域抗體為人類單域抗體(Domantis,Inc.，Waltham，MA；參見例如美國專利第6,248,516 B1號)。
抗體片段可藉由各種技術產生，包括但不限於完整抗體之蛋白水解消化以及藉由如本文中所描述之重組宿主細胞(例如大腸桿菌或噬菌體)產生。
4. 嵌合抗體及人類化抗體
在某些實施例中，本文中所提供之抗體為嵌合抗體。某些嵌合抗體描述於例如美國專利第4,816,567號；及Morrison等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,81：6851-6855(1984))中。在一個實例中，嵌合抗體包含非人類可變區(例如來源於小鼠、大鼠、倉鼠、兔或諸如猴之非人類靈長類動物的可變區)及人類恆定區。在另一實例中，嵌合抗體為「類別轉換」抗體，其中類別或子類已由親本抗體發生改變。嵌合抗體包括其抗原結合片段。
在某些實施例中，嵌合抗體為人類化抗體。典型地，非人類抗體經人類化以降低對人類之免疫原性，同時保留親本非人類抗體之特異性及親和力。一般而言，人類化抗體包含一或多個可變域，其中HVR，例如CDR，(或其部分)來源於非人類抗體，且FR(或其部分)來源於人類抗體序列。人類化抗體視情況亦將包含人類恆定區之至少一部分。在一些實施例中，人類化抗體中之一些FR殘基經來自於非人類抗體(例如獲得HVR殘基之抗體)之相應殘基取代，例如以修復或改良抗體特異性或親和力。
人類化抗體及其製造方法可查閱例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008)，且進一步描述於例如以下文獻中：Riechmann等人，Nature 332：323-329(1988)；Queen等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 86：10029-10033(1989)；美國專利第5,821,337號、第7,527,791號、第6,982,321號及第7,087,409號；Kashmiri等人，Methods 36：25-34(2005)(描述特異性決定區(SDR)接枝)；Padlan,Mol.Immunol.28：489-498(1991)(描述「表面重整」)；Dall’Acqua等人，Methods 36：43-60(2005)(描述「FR改組」)；以及Osbourn等人，Methods 36：61-68(2005)及Klimka等人，Br.J.Cancer,83：252-260(2000)(描述針對FR改組之「指導選擇」法)。
可用於人類化之人類架構區包括但不限於：使用「最佳擬合」法選擇之架構區(參見例如Sims等人，J.Immunol.151：2296(1993))；來源於特定輕鏈或重鏈可變區亞組之人類抗體之共同序列的架構區(參見例如 Carter等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,89：4285(1992)；及Presta等人，J.Immunol.,151：2623(1993))；人類成熟(體細胞突變)架構區或人類生殖系架構區(參見例如Almagro及Fransson,Front.Biosci.13：1619-1633(2008))；及由篩選FR庫而獲得之架構區(參見例如Baca等人，J.Biol.Chem.272：10678-10684(1997)及Rosok等人，J.Biol.Chem.271：22611-22618(1996))。
5. 人類抗體
在某些實施例中，本文中所提供之抗體為人類抗體。人類抗體可使用此項技術中已知的各種技術產生。人類抗體一般描述於van Dijk及van de Winkel,Curr.Opin.Pharmacol.5：368-74(2001)及Lonberg,Curr.Opin.Immunol.20：450-459(2008)中。
人類抗體可藉由將免疫原投與經修飾以響應於抗原攻擊產生完整人類抗體或具有人類可變區之完整抗體的轉殖基因動物來製備。該等動物典型地含有所有或部分人類免疫球蛋白基因座，其置換內源免疫球蛋白基因座或存在於染色體外或隨機整合於該等動物之染色體中。在此種轉殖基因小鼠中，內源免疫球蛋白基因座一般已滅活。關於由轉殖基因動物獲得人類抗體之方法的綜述，參見Lonberg,Nat.Biotech.23：1117-1125(2005)。另參見例如美國專利第6,075,181號及第6,150,584號(描述XENOMOUSETM技術)；美國專利第5,770,429號(描述HUMAB®技術)；美國專利第7,041,870號(描述K-M MOUSE®技術)；及美國申請公開案第US 2007/0061900號(描述VELOCIMOUSE®技術)。得自於由此種動物產生之完整抗體的人類可變區可經進一步修飾，例如藉由與不同的人類恆定區組合。
人類抗體亦可藉由基於融合瘤之方法來製造。已描述用於產生人類單株抗體之人類骨髓瘤及小鼠-人類雜交骨髓瘤細胞株。(參見例如Kozbor J.Immunol.,133：3001(1984)；Brodeur等人，Monoclonal Antibody Production Techniques and Applications，第51-63頁(Marcel Dekker,Inc.,New York,1987)；及Boerner等人，J.Immunol.,147：86(1991)。)經由人類B細胞融合瘤技術產生之人類抗體亦描述於Li等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,103：3557-3562(2006)中。其他方法包括例如美國專利第7,189,826號(描述由 融合瘤細胞株產生單株人類IgM抗體)及Ni,Xiandai Mianyixue,26(4)：265-268(2006)(描述人類-人類融合瘤)中所描述之彼等方法。人類融合瘤技術(Trioma技術)亦描述於Vollmers及Brandlein,Histology and Histopathology,20(3)：927-937(2005)以及Vollmers及Brandlein,Methods and Findings in Experimental and Clinical Pharmacology,27(3)：185-91(2005)中。
人類抗體亦可藉由分離選自人類來源噬菌體呈現庫之Fv選殖株可變域序列來產生。接著可將此種可變域序列與所要人類恆定域組合。以下描述用於自抗體庫選擇人類抗體之技術。
6. 庫來源抗體
可藉由針對具有所要活性之抗體來篩選組合庫而分離出本發明之抗體。舉例而言，此項技術中已知用於產生噬菌體呈現庫及針對具有所要結合特徵之抗體來篩選此種庫的多種方法。該等方法可查閱例如Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien等人編，Human Press,Totowa,NJ,2001)，且進一步描述於例如以下文獻中：McCafferty等人，Nature 348：552-554；Clackson等人，Nature 352：624-628(1991)；Marks等人，J.Mol.Biol.222：581-597(1992)；Marks及Bradbury,Methods in Molecular Biology 248：161-175(Lo編，Human Press,Totowa,NJ,2003)；Sidhu等人，J.Mol.Biol.338(2)：299-310(2004)；Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004)；Fellouse,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 101(34)：12467-12472(2004)；及Lee等人，J.Immunol.Methods 284(1-2)：119-132(2004)。
在某些噬菌體呈現方法中，藉由聚合酶鏈反應(PCR)單獨選殖VH及VL基因譜系，且隨機重組於噬菌體庫中，接著可如Winter等人，Ann.Rev.Immunol.,12：433-455(1994)中所描述針對抗原-結合噬菌體進行篩選。噬菌體典型地將抗體片段呈現為單鏈Fv(seFv)片段或Fab片段。來自於免疫源之庫提供針對免疫原之高親和力抗體，而無需構築融合瘤。替代地，可如Griffiths等人，EMBO J,12：725-734(1993)所描述選殖天然譜系(例如自人類)以提供針對廣泛非自體抗原以及自體抗原之單一抗體來源，而不進行任何免疫。最後，亦可如Hoogenboom及Winter,J.Mol.Biol.,227：381-388 (1992)所描述藉由自幹細胞選殖未重排V基因區段且使用含有隨機序列之PCR引物編碼高變CDR3區及實現生體外重排而合成產生天然庫。描述人類抗體噬菌體庫之專利公開案包括例如：美國專利第5,750,373號及美國專利公開案第2005/0079574號、第2005/0119455號、第2005/0266000號、第2007/0117126號、第2007/0160598號、第2007/0237764號、第2007/0292936號及第2009/0002360號。
自人類抗體庫分離之抗體或抗體片段在本文中被視為人類抗體或人類抗體片段。
7. 多特異性抗體
在某些實施例中，本文中所提供之抗體為多特異性抗體，例如雙特異性抗體。多特異性抗體為對至少兩個不同的位點具有結合特異性的單株抗體。在某些實施例中，結合特異性中一者針對VEGF且另一者針對任何其他抗原(例如，第二生物分子，例如介白素-1β(IL-1β)、介白素-6(IL-6)；介白素-6受體(IL-6R)；介白素-13(IL-13)；IL-13受體(IL-13R)；PDGF(例如，PDGF-BB)；血管生成素；血管生成素2(Ang2)；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體(例如VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、膜結合型VEGF受體(mbVEGFR)或可溶性VEGF受體(sVEGFR))；ST-2受體；及與年齡相關性黃斑變性(AMD)風險基因相關之蛋白質，諸如補體途徑組件C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；介白素-8(IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；及TNFRSF10A。因此，雙特異性抗體可對VEGF及IL-1β、VEGF及IL-6、VEGF及IL-6R、VEGF及IL-13、VEGF及IL-13R、VEGF及PDGF(例如PDGF-BB)、VEGF及血管生成素、VEGF及Ang2、VEGF及Tie2、VEGF及S1P、VEGF及整合素αvβ3、VEGF及整合素αvβ5、VEGF及整合素α5β1、VEGF及β細胞素、VEGF及apelin/APJ、VEGF及紅血球生成素、VEGF及補體因子D、VEGF及TNFα、VEGF及HtrA1、VEGF及VEGF受體(例如VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR)、VEGF及ST-2受體、VEGF及C2、VEGF及因子B、VEGF及因子H、VEGF及 CFHR3、VEGF及C3b、VEGF及C5、VEGF及C5a、VEGF及C3a、VEGF及ARMS2、VEGF及TIMP3、VEGF及HLA、VEGF及IL-8、VEGF及CX3CR1、VEGF及TLR3、VEGF及TLR4、VEGF及CETP、VEGF及LIPC、VEGF及COL10A1或VEGF及TNFRSF10A具有結合特異性。在某些實施例中，雙特異性抗體可結合VEGF之兩個不同的抗原決定基。雙特異性抗體亦可用於將細胞毒性劑定位於表現VEGF之細胞。雙特異性抗體可製備為全長抗體或抗體片段(例如Fab、Fab’或Fab-C片段)。
在一些情況下，該雙特異性抗體為美國專利申請案第US 2014/0017244號中所揭示之雙特異性抗VEGF/抗血管生成素2(Ang2)抗體，該案以全文引用之方式併入本文中。舉例而言，該抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體可包括結合VEGF之第一結合域(諸如本文中所描述之任何抗VEGF抗體)及結合Ang2之第二結合域，其包括：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列GYYMH(SEQ ID NO：62)；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列WINPNSGGTNYAQKFQG(SEQ ID NO：63)；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列SPNPYYYDSSGYYYPGAFDI(SEQ ID NO：64)；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列GGNNIGSKSVH(SEQ ID NO：65)；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列DDSDRPS(SEQ ID NO：66)；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列QVWDSSSDHWV(SEQ ID NO：67)；或以上HVR中之一或多者之組合，及其與SEQ ID NO：62-67中之任一者具有至少約80%序列一致性(例如，81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%一致性)的一或多種變異體。
在一些情況下，該抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體可包括結合VEGF之第一結合域(諸如本文中所描述之任何抗VEGF抗體)及結合Ang2之第二結合域，且包括：(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：68具有至少80%序列一致性(例如，80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%或99%序列一致性)的胺基酸序列或SEQ ID NO：68之序列；(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：69具有至少80%序列一致性(例如，80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、 96%、97%、98%或99%序列一致性)的胺基酸序列或SEQ ID NO：69之序列；或(c)如(a)中之VH域及如(b)中之VL域。在一些情況下，該抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體可包括結合VEGF之第一結合域(諸如本文中所描述之任何抗VEGF抗體)及特異性結合Ang2之第二結合域，其中該第二結合域為國際專利申請公開案第WO 2010/069532號中所描述之任何抗體結合域或其變異體，該案以全文引用之方式併入本文中。
在其他情況下，該抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體為國際專利申請公開案第WO 2016/073157號中所描述之任何抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體。
在一些情況下，該雙特異性抗體為雙特異性抗VEGF/抗IL-6抗體。在一些情況下，抗VEGF/抗IL-6雙特異性抗體可包括結合VEGF之第一結合域(諸如本文中所描述之任何抗VEGF抗體)及結合IL-6之第二結合域。該第二結合域可為此項技術中已知的任何抗IL-6抗體，例如EBI-031(Eleven Biotherapeutics；參見例如WO 2016/073890，該案以全文引用之方式併入本文中)、司妥昔單抗(siltuximab)(SYLVANT®)、奧洛珠單抗(olokizumab)、克萊紮珠單抗(clazakizumab)、司魯庫單抗(sirukumab)、艾西莫單抗(elsilimomab)、戈利珠單抗(gerilimzumab)、OPR-003、MEDI-5117、PF-04236921或其變異體的結合域。
在一些情況下，該雙特異性抗體為雙特異性抗VEGF/抗IL-6R抗體。在一些情況下，抗VEGF/抗IL-6R雙特異性抗體可包括結合VEGF之第一結合域(諸如本文中所描述之任何抗VEGF抗體)及結合IL-6R之第二結合域。該第二結合域可為此項技術中已知的任何抗IL-6R抗體，例如托珠單抗(tocilizumab)(ACTEMRA®)(參見例如WO 1992/019579，該案以全文引用之方式併入本文中)、賽利魯單抗(sarilumab)、沃巴利珠單抗(vobarilizumab)(ALX-0061)、SA-237或其變異體的結合域。
用於製造多特異性抗體之技術包括但不限於具有不同的特異性的兩個免疫球蛋白重鏈-輕鏈配對之重組共表現(參見Milstein及Cuello,Nature 305：537(1983))；WO 93/08829；及Traunecker等人，EMBO J.10：3655(1991))，及「杵入臼」式工程改造(參見例如美國專利第5,731,168號)。亦 可藉由以下方式製造多特異性抗體：對靜電轉向效應進行工程改造以製造抗體Fc異源二聚分子(WO 2009/089004A1)；使兩個或更多個抗體或片段交聯(參見例如美國專利第4,676,980號；及Brennan等人，Science,229：81(1985))；使用白胺酸拉鍊來產生雙特異性抗體(參見例如Kostelny等人，J.Immunol.,148(5)：1547-1553(1992))；使用「雙功能抗體」技術來製造雙特異性抗體片段(參見例如Hollinger等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,90：6444-6448(1993))；及使用單鏈Fv(sFv)二聚物(參見例如Gruber等人，J.Immunol.,152：5368(1994))；及如例如Tutt等人，J.Immunol.147：60(1991)中所描述來製備三特異性抗體。
本文中亦包括具有三個或更多個功能抗原結合位點之經工程改造之抗體，包括「章魚抗體」(參見例如US 2006/0025576A1)。
本文中之抗體或片段亦包括包含結合VEGF以及另一不同抗原之抗原結合位點的「雙作用FAb」或「DAF」(參見例如US 2008/0069820)。
8. 抗體變異體
在某些實施例中，涵蓋本文中所提供之抗體的胺基酸序列變異體(例如包括一或多個胺基酸殘基變化之抗體變異體)。舉例而言，可能需要改良抗體之結合親和力及/或其他生物學性質。抗體之胺基酸序列變異體可藉由向編碼該抗體之核苷酸序列中引入適當修飾或藉由肽合成來製備。該等修飾包括例如抗體胺基酸序列內之殘基缺失及/或插入及/或取代。可對缺失、插入及取代進行任何組合以獲得最終構築體，條件為最終構築體具有所要特徵，例如抗原結合。
a)取代、插入及缺失變異體
在某些實施例中，提供具有一或多個胺基酸取代之抗體變異體。取代型突變誘發之相關位點包括HVR及FR。保守取代顯示於表1中之「較佳取代」標題下。更多實質性變化提供於表1中之「例示性取代」標題下，且如下文參考胺基酸側鏈類別進一步描述。可將胺基酸取代引入相關抗體中且針對所要活性(例如保留/改良抗原結合、降低免疫原性或改良ADCC或CDC)來篩選產物。
Figure 105130888-A0202-12-0089-168
可根據共同側鏈性質對胺基酸進行分組：(1)疏水性：正白胺酸、Met、Ala、Val、Leu、Ile；(2)中性親水性：Cys、Ser、Thr、Asn、Gln；(3)酸性：Asp、Glu；(4)鹼性：His、Lys、Arg；(5)影響鏈取向之殘基：Gly、Pro；(6)芳族：Trp、Tyr、Phe。
非保守取代將需要將此等類別之一的成員交換成另一類別。
一種類型取代型變異體涉及取代親本抗體(例如人類化抗體或人類抗體)之一或多個高變區殘基及/或FR殘基。一般而言，選擇用於進一步研究之所得變異體將在某些生物學性質方面相對於親本抗體得以修飾(例如改良)(例如增加之親和力、增加之穩定性、增加之表現、改變之pI及/或降低之免疫原性)及/或將實質上保留親本抗體之某些生物學性質。例示性取代型變異體為親和力成熟抗體，其可使用例如基於噬菌體呈現之親和力成熟技術(諸如本文中所描述者)便利地產生。簡而言之，使一或多個HVR殘基突變且使變異抗體展現於噬菌體上，且針對特定生物學活性(例如結合親和力)進行篩選。
可在HVR中進行變化(例如取代)，例如以改良抗體親和力。該等變化可在HVR「熱點」，亦即，由在體細胞成熟過程中以較高頻率發生突變之密碼子所編碼之殘基(參見例如Chowdhury,Methods Mol.Biol.207：179-196(2008))及/或接觸抗原之殘基中進行，且測試所得變異VH或VL之結合親和力。藉由構築二級庫且自其中再選擇來進行親和力成熟已描述於例如以下文獻中：Hoogenboom等人，Methods in Molecular Biology 178：1-37(O’Brien等人編，Human Press,Totowa,NJ,(2001))。在親和力成熟之一些實施例中，藉由多種方法(例如易錯PCR、鏈改組或寡核苷酸定向突變誘發)中之任一種向選擇用於成熟之可變基因中引入多樣性。接著創建二級庫。接著篩選該庫以鑑別具有所要親和力之任何抗體變異體。用於引入多樣性之另一方法包括HVR定向方法，其中隨機選取若干HVR殘基(例如每次4至6個殘基)。參與抗原結合之HVR殘基可藉由使用例如丙胺酸掃描突變誘發或模型化而特異性地鑑別。特定言之，通常靶向CDR-H3及CDR-L3。
在某些實施例中，一或多個HVR內可發生取代、插入或缺失，只要該等變化實質上不削弱抗體結合抗原之能力即可。舉例而言，可在HVR中進行實質上不降低結合親和力之保守變化(例如，如本文中所提供之保守取代)。舉例而言，該等變化可在HVR中之抗原接觸殘基以外。在以上所提供之變異VH及VL序列之某些實施例中，各HVR未改變或含有不超過1、2或3個胺基酸取代。
在某些實施例中，一或多個FR內可發生取代、插入或缺失，只要該等變化實質上不削弱抗體結合抗原之能力即可。該等變化可例如改良抗體親和力及/或穩定性(例如，如藉由增加之解鏈溫度所評定)。
用於鑑別可靶向以進行突變誘發之抗體殘基或區域之適用方法稱為「丙胺酸掃描突變誘發」，如Cunningham及Wells(1989)Science,244：1081-1085所描述。在此方法中，鑑別標靶殘基中之一個殘基或一組標靶殘基(例如帶電殘基，諸如Arg、Asp、His、Lys及Glu)且以中性或帶負電胺基酸(例如丙胺酸或聚丙胺酸)置換以確定抗體與抗原之相互作用是否受影響。可在該等胺基酸位置上引入其他取代，從而顯示對初始取代之功能敏感性。替代地，或另外，抗原-抗體複合物之晶體結構鑑別抗體與抗原之間的接觸點。可靶向或消除該等接觸殘基及相鄰殘基作為取代候選物。可篩選變異體以確定其是否含有所要性質。
胺基酸序列插入包括長度在1個殘基至含有100個或更多個殘基之多肽範圍內之胺基及/或羧基末端融合，以及單個或多個胺基酸殘基之序列內插入。末端插入之實例包括具有N末端甲硫胺醯基殘基之抗體。抗體分子之其他插入型變異體包括使抗體之N或C末端與酶(例如，對於ADEPT)或可增加抗體之血清半衰期的多肽融合。
b)糖基化變異體
在某些實施例中，可改變本文中所提供之抗體以增加或降低抗體之糖基化程度。對抗體添加或缺失糖基化位點可藉由改變胺基酸序列從而創建或移除一或多個糖基化位點而便利地實現。
在抗體包含Fc區之情況下，可改變與其連接之碳水化合物。由哺乳動物細胞產生之天然抗體典型地包含一般藉由N-鍵聯連接於Fc區之CH2域之Asn297的分支鏈雙觸角寡醣。參見例如Wright等人，TIBTECH 15：26-32(1997)。寡醣可包括各種碳水化合物，例如甘露糖、N-乙醯基胺基葡萄糖(GlcNAc)、半乳糖及唾液酸，以及連接於雙觸角寡醣結構之「桿狀結構」中之GlcNAc的海藻糖。在一些實施例中，可修飾本發明抗體中之寡醣，以便產生具有某些改良性質之抗體變異體。
在一個實施例中，提供具有碳水化合物結構之抗體變異體， 該碳水化合物結構缺乏(直接或間接)連接於Fc區之海藻糖。舉例而言，此種抗體中之海藻糖之量可為1%至80%、1%至65%、5%至65%或20%至40%。舉例而言，海藻糖之量係藉由以下方式確定：如WO 2008/077546中所描述，計算如藉由MALDI-TOF質譜所量測之Asn297處糖鏈內之岩藻糖平均量相對於連接於Asn297之所有糖結構(例如複合型、混合型及高甘露糖型結構)之和。Asn297係指位於Fc區中之約位置297上的天冬醯胺殘基(Fc區殘基之Eu編號)；然而，由於抗體中之微小序列變化，Asn297亦可位於位置297上游或下游約±3個胺基酸處，亦即，介於位置294與300之間。該等海藻糖基化變異體可具有經改良之ADCC功能。參見例如美國專利公開案第US 2003/0157108號；第US 2004/0093621號。關於「去海藻糖基化」或「海藻糖缺乏型」抗體變異體之公開案的實例包括：US 2003/0157108；WO 2000/61739；WO 2001/29246；US 2003/0115614；US 2002/0164328；US 2004/0093621；US 2004/0132140；US 2004/0110704；US 2004/0110282；US 2004/0109865；WO 2003/085119；WO 2003/084570；WO 2005/035586；WO 2005/035778；WO2005/053742；WO2002/031140；Okazaki等人，J.MolBiol.336：1239-1249(2004)；Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)。能夠產生去海藻糖基化抗體之細胞株的實例包括缺乏蛋白質海藻糖基化之Lec13 CHO細胞(Ripka等人，Arch.Biochem.Biophys.249：533-545(1986)；美國專利申請案第US 2003/0157108 A1號，Presta,L；及WO 2004/056312 A1，Adams等人，尤其實例11)及基因敲除細胞株，諸如α-1,6-海藻糖基轉移酶基因、FUT8、基因敲除CHO細胞(參見例如Yamane-Ohnuki等人，Biotech.Bioeng.87：614(2004)；Kanda等人，Biotechnol.Bioeng.,94(4)：680-688(2006)；及WO2003/085107)。
進一步提供具有二等分寡醣之抗體變異體，例如，其中藉由G1cNAc將連接於抗體Fc區之雙觸角寡醣二等分。該等抗體變異體可具有減少之海藻糖基化及/或改良之ADCC功能。該等抗體變異體之實例描述於例如以下文獻中：WO 2003/011878；美國專利第6,602,684號；及US 2005/0123546(Umana等人)。亦提供寡醣中之至少一個半乳糖殘基連接於Fc區之抗體變異體。該等抗體變異體可具有經改良之CDC功能。該等抗體 變異體描述於例如以下文獻中：WO 1997/30087；WO 1998/58964；及WO 1999/22764(Raju,S.)。
c)Fc區變變異體
在某些實施例中，可在本文中所提供之抗體的Fc區中引入一或多個胺基酸修飾，從而產生Fc區變異體。Fc區變異體可包含在一或多個胺基酸位置上包含胺基酸殘基變化(例如取代)之人類Fc區序列(例如人類IgG1、IgG2、IgG3或IgG4 Fc區)。
在某些實施例中，本發明涵蓋具有一些而非所有效應子功能之抗體變異體，由此使其成為抗體生體內半衰期非常重要而某些效應子功能(諸如補體及ADCC)不必要或有害之應用的理想候選物。可進行試管內及/或生體內細胞毒性分析法以證實CDC及/或ADCC活性之降低/消耗。舉例而言，可進行Fc受體(FcR)結合分析以確保抗體缺乏FcγR結合(因此可能缺乏ADCC活性)，但保留FcRn結合能力。用於介導ADCC之原代細胞NK細胞僅表現Fc(RIII，而單核細胞表現Fc(RI、Fc(RII及Fc(RIII。造血細胞上之FcR表現彙總於Ravetch及Kinet,Annu.Rev.Immunol.9：457-492(1991)第464頁之表3中。
用於評估相關分子之ADCC活性之試管內分析法的非限制性實例描述於以下文獻中：美國專利第5,500,362號(參見例如Hellstrom,I.等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 83：7059-7063(1986)；及Hellstrom,I.等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 82：1499-1502(1985)；美國專利第5,821,337號；及Bruggemann等人，J.Exp.Med.166：1351-1361(1987))。替代地，可採用非放射性分析法(參見例如用於流式細胞術之ACTITM非放射性細胞毒性分析法(CellTechnology,Inc.Mountain View，CA)；及CYTOTOX 96®非放射性細胞毒性分析法(Promega，Madison，WI))。用於該等分析法之適用效應細胞包括周邊血液單核細胞(PBMC)及天然殺手(NK)細胞。替代地，或另外，可在例如動物模型(諸如Clynes等人，Proc.Nat’l Acad.Sci.USA 95：652-656(1998)中所揭示者)中生體內評估相關分子之ADCC活性。亦可進行C1q結合分析法以證實抗體不能結合C1q且因此缺乏CDC活性。參見例如WO 2006/029879及WO 2005/100402中之C1q及C3c結合ELISA。為了評估補 體活化，可進行CDC分析法(參見例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods 202：163(1996)；Cragg等人，Blood.101：1045-1052(2003)；以及Cragg等人Blood.103：2738-2743(2004))。FcRn結合及生體內清除/半衰期測定亦可使用此項技術中已知的方法來進行(參見例如Petkova等人，Int’l.Immunol.18(12)：1759-1769(2006))。
具有降低之效應子功能的抗體包括Fc區殘基238、265、269、270、297、327及329中之一或多者經取代者(美國專利第6,737,056號)。該等Fc突變體包括在胺基酸位置265、269、270、297及327中之兩者或更多者上經取代之Fc突變體，包括殘基265及297取代為丙胺酸之所謂「DANA」Fc突變體(美國專利第7,332,581號)。
描述與FcR之結合有所改良或削弱之某些抗體變異體。(參見例如美國專利第6,737,056號；WO 2004/056312；及Shields等人，J.Biol.Chem.9(2)：6591-6604(2001))。
在某些實施例中，抗體變異體所包含的Fc區具有一或多個可改良ADCC之胺基酸取代，例如Fc區之位置298、333及/或334上之取代(殘基之EU編號)。
在一些實施例中，Fc區中進行之變化改變(亦即，改良或削弱)C1q結合及/或補體依賴性細胞毒性(CDC)，例如，如美國專利第6,194,551號、WO 99/51642及Idusogie等人，J.Immunol.164：4178-4184(2000)中所描述。
US2005/0014934A1(Hinton等人)中描述具有增加之半衰期及改良之新生兒Fc受體(FcRn)結合的抗體，其負責將母體IgG轉移至胎兒(Guyer等人，J.Immunol.117：587(1976)及Kim等人，J.Immunol.24：249(1994))。彼等抗體包含其中具有一或多個可改良Fc區與FcRn之結合之取代的Fc區。該等Fc變異體包括在以下Fc區殘基中之一或多者上具有取代的Fc變異體：238、256、265、272、286、303、305、307、311、312、317、340、356、360、362、376、378、380、382、413、424或434，例如對Fc區殘基434之取代(美國專利第7,371,826號)。關於Fc區變異體之其他實例，另參見Duncan及Winter,Nature 322：738-40(1988)；美國專利第5,648,260 號；美國專利第5,624,821號；及WO 94/29351。
d)經半胱胺酸工程改造之抗體變異體
在某些實施例中，可能需要創建經半胱胺酸工程改造之抗體，例如「硫代MAb」，其中抗體之一或多個殘基經半胱胺酸殘基取代。在特定實施例中，經取代之殘基存在於該抗體之可及位點上。藉由用半胱胺酸取代彼等殘基，從而使反應性硫醇基位於該抗體之可及位點上且可用於使該抗體與其他部分(諸如藥物部分或連接子-藥物部分)結合，以創建免疫結合物。如本文中進一步描述。在某些實施例中，以下殘基中之任何一或多者可經半胱胺酸取代：輕鏈之V205(Kabat編號)；重鏈之A118(EU編號)；及重鏈Fc區之S400(EU編號)。經半胱胺酸工程改造之抗體可如例如美國專利第7,521,541號中所描述來產生。
e)抗體衍生物
在某些實施例中，本文中所提供之抗體可經進一步修飾以含有本領域中已知且容易獲得之額外非蛋白質部分。適用於對該抗體進行衍生化之部分包括但不限於水溶性聚合物。水溶性聚合物之非限制性實例包括但不限於聚乙二醇(PEG)、乙二醇/丙二醇共聚物、羧甲基纖維素、聚葡萄糖、聚乙烯醇、聚乙烯吡咯啶酮、聚-1,3-二氧雜環戊烷、聚-1,3,6-三氧雜環已烷、乙烯/馬來酸酐共聚物、聚胺基酸(均聚物或無規共聚物)及聚葡萄糖或聚(N-乙烯基吡咯啶酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚環氧丙烷/環氧乙烷共聚合物、聚氧乙烯化多元醇(例如甘油)、聚乙烯醇及其混合物。聚乙二醇丙醛可由於其在水中之穩定性而在製造中具有優勢。聚合物可具有任何分子量，且可為分枝型或無分枝型。連接於該抗體之聚合物數目可變化，且若連接多於一個聚合物，則其可為相同或不同的分子。一般而言，可基於諸多考量來決定用於衍生化之聚合物的數目及/或類型，包括但不限於抗體之欲改良之特定性質或功能、抗體衍生物是否將在所限定之條件下用於療法中及其類似因素。其他抗體結合物描述於本文中，例如以下部分K中及實例13中。
在另一實施例中，提供可藉由暴露於輻射而選擇性地加熱之抗體與非蛋白質部分結合物。在一個實施例中，該非蛋白質部分為碳奈米 管(Kam等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 102：11600-11605(2005))。該輻射可具有任何波長，且包括但不限於不傷害普通細胞但可將非蛋白質部分加熱至會殺死抗體-非蛋白質部分近端之細胞的溫度的波長。
f)等電點變異體
本發明提供具有改變之等電點的抗體變異體。舉例而言，本發明提供例如與抗VEGF抗體(例如G6.31)相比具有降低之等電點(pI)的抗體變異體。在一些情況下，表面電荷在生理pH值下有所減少。在一些情況下，該抗VEGF抗體具有等於或低於約8(例如約8、約7、約6、約5或約4)之pI。在一些情況下，該抗體具有約4至約8(例如約4、約5、約6、約7或約8)之pI。在一些情況下，該抗VEGF抗體具有約5至約7(例如約5、約6或約7)之pI。在一些情況下，該抗VEGF抗體具有約5至約6(例如約5.1、約5.2、約5.3、約5.4、約5.5、約5.6、約5.7、約5.8、約5.9或約6)之pI。
本發明之抗體可經工程改造以具有降低之PI，例如藉由用具有較低pI之胺基酸取代指定位置上之野生型胺基酸殘基。可基於胺基酸之胺(-NH2)、羧酸(-COOH)及側鏈的pKa值來確定胺基酸之pI，該等pKa值在本領域中為已知的。在一些實施例中，表面暴露之胺基酸殘基可經取代以降低抗體之pI。在一個實施例中，表面暴露之胺基酸殘基可經麩胺酸(E)取代。在一個實施例中，表面暴露之胺基酸殘基可經天冬胺酸(D)取代。
B. 重組方法及組成物
本文中所描述之任何抗體(例如抗VEGF抗體)均可使用例如美國專利第4,816,567號中所描述之重組方法及組成物來產生。在一個實施例中，提供編碼本文中所描述之抗VEGF抗體的經分離之核酸。此種核酸可編碼包含該抗體之VL的胺基酸序列及/或包含該抗體之VH的胺基酸序列(例如該抗體之輕鏈及/或重鏈)。在另一實施例中，提供一或多種包含此種核酸之載體(例如表現載體)。在另一實施例中，提供一種包含此種核酸之宿主細胞。在一個此種實施例中，宿主細胞包含以下各項(例如經以下各項轉型)：(1)包含編碼包含該抗體之VL之胺基酸序列及包含該抗體之VH之胺基酸序列的核酸的載體，(2)包含編碼包含該抗體之VL之胺基酸序列的 核酸的第一載體及包含編碼包含該抗體之VH之胺基酸序列的核酸的第二載體。在一個實施例中，該宿主細胞為真核細胞，例如中國倉鼠卵巢(CHO)細胞或淋巴樣細胞(例如，Y0、NS0、Sp20細胞)。在一個實施例中，提供一種製造抗VEGF抗體之方法，其中該方法包括在適於表現該抗體之條件下培養包含如以上所提供之編碼該抗體之核酸的宿主細胞，及視情況自該宿主細胞(或宿主細胞培養基)中回收該抗體。
關於抗VEGF抗體之重組產生，分離出編碼抗體之核酸(例如，如以上所描述)且插入一或多種載體中以便在宿主細胞中進行進一步選殖及/或表現。可容易地分離出此種核酸且使用習知程序(例如，藉由使用能夠特異性結合編碼該抗體之重鏈及輕鏈之基因的寡核苷酸探針)來定序。
適用於選殖或表現抗體編碼載體之宿主細胞包括本文中所描述之原核細胞或真核細胞。舉例而言，可在細菌中產生抗體，尤其當不需要糖基化及Fc效應子功能時。關於在細菌中表現抗體片段及多肽，參見例如美國專利第5,648,237號、第5,789,199號及第5,840,523號。另參見Charlton,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編，Humana Press,Totowa,NJ,2003)，第245-254頁，其描述在大腸桿菌中表現抗體片段。在表現之後，可自細菌細胞漿中分離出該抗體(處於可溶性部分中)且可進行進一步純化。
除原核生物以外，諸如絲狀真菌或酵母之真核微生物為適用於抗體編碼載體之選殖或表現宿主，包括糖基化途徑已得以「人類化」從而產生具有部分或完全人類糖基化模式之抗體的真菌及酵母菌株。參見Gerngross,Nat.Biotech.22：1409-1414(2004)；及Li等人，Nat.Biotech.24：210-215(2006)。
適用於表現糖基化抗體之宿主細胞亦來源於多細胞生物體(無脊椎動物及脊椎動物)。無脊椎動物細胞之實例包括植物及昆蟲細胞。已鑑別出可與昆蟲細胞聯合使用，尤其用於轉染草地貪夜蛾(Spodoptera frugiperda)細胞之許多桿狀病毒株。
植物細胞培養物亦可用作宿主。參見例如美國專利第5,959,177號、第6,040,498號、第6,420,548號、第7,125,978號及第6,417,429 號(描述用於在轉殖基因植物中產生抗體之PLANTIBODIESTM技術)。
脊椎動物細胞亦可用作宿主。舉例而言，適於在懸浮液中生長之哺乳動物細胞株可能適用。適用哺乳動物宿主細胞株之其他實例為藉由SV40轉型之猴腎CV1細胞株(COS-7)；人類胚胎腎細胞株(如例如Graham等人，J.Gen Virol.36：59(1977)中所描述之293或293細胞)；幼倉鼠腎細胞(BHK)；小鼠足細胞(如例如Mather,Biol.Reprod.23：243-251(1980)中所描述之TM4細胞)；猴腎細胞(CV1)；非洲綠猴腎細胞(VERO-76)；人類宮頸癌細胞(HELA)；犬腎細胞(MDCK)；布法羅大鼠肝細胞(BRL 3A)；人類肺細胞(W138)；人類肝細胞(Hep G2)；小鼠乳房腫瘤(MMT 060562)；如例如Mather等人，Annals N.Y.Acad.Sci.383：44-68(1982)中所描述之TRI細胞；MRC 5細胞；及FS4細胞。其他適用哺乳動物宿主細胞株包括中國倉鼠卵巢(CHO)細胞，包括DHFR- CHO細胞(Urlaub等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 77：4216(1980))；及骨髓瘤細胞株，諸如Y0、NS0及Sp2/0。關於適用於抗體產生之某些哺乳動物宿主細胞株的綜述，參見例如Yazaki及Wu,Methods in Molecular Biology，第248卷(B.K.C.Lo編，Humana Press,Totowa,NJ)，第255-268頁(2003)。
C. 分析法
本文中所提供之抗VEGF抗體以及包括抗VEGF抗體(例如，本文中所提供之任何抗VEGF抗體)之組成物，諸如抗體結合物、融合蛋白質及聚合物調配物，可藉由本領域中已知的各種分析法針對其物理/化學性質及/或生物學活性加以鑑別、篩選或表徵。
1. 結合分析法及其他分析法
在一個態樣中，測試本發明抗體或其抗體結合物、融合蛋白質或聚合物調配物之抗原結合活性，例如，藉由已知方法，諸如ELISA、西方墨點法等。
在另一態樣中，可使用競爭分析來鑑別與如本文中所描述之抗體或其抗體結合物、融合蛋白質或聚合物調配物競爭結合VEGF之抗體。在某些實施例中，此種競爭抗體結合與如本文中所描述之抗體所結合者相同的抗原決定基(例如，線性或構形抗原決定基)。用於對抗體所結合之抗原 決定基進行圖譜分析之詳細例示性方法提供於Morris(1996)「Epitope Mapping Protocols」,Methods in Molecular Biology第66卷(Humana Press,Totowa,NJ)中。
在一例示性競爭分析中，在包含可結合VEGF之第一經標記抗體及正測試其與該第一抗體競爭結合VEGF之能力的第二未經標記抗體的溶液中培育經固定之VEGF。該第二抗體可存在於雜交瘤上清液中。作為對照，在包含該第一經標記抗體但不含該第二未經標記抗體之溶液中培育經固定之VEGF。在允許該第一抗體與VEGF結合之條件下培育之後，移除過量未結合抗體，且量測與經固定之VEGF締合之標記的量。若測試樣品中與經固定之VEGF締合之標記的量相對於對照樣品有所減少，則指示該第二抗體與該第一抗體競爭結合VEGF。參見Harlow及Lane(1988)Antibodies：A Laboratory Manual第14章(Cold Spring Harbor Laboratory,Cold Spring Harbor,NY)。
2. 活性分析
在一個態樣中，提供用於鑑別具有生物學活性之抗VEGF抗體或其抗體結合物、融合蛋白質或聚合物調配物之分析法。生物學活性可包括例如在生體內、生體外或離體結合VEGF(例如血流中之VEGF)或其肽片段。在某些實施例中，生物學活性可包括阻斷或中和VEGF，或防止VEGF與配位體(例如受體，諸如KDR或Flt-1)結合。亦提供在生體內及/或生體外具有此種生物學活性之抗體或其抗體結合物、融合蛋白質或聚合物調配物。在某些實施例中，測試本發明抗體或其抗體結合物、融合蛋白質或聚合物調配物之此種生物學活性。
3. 穩定性分析
在一個態樣中，提供用於測定抗VEGF抗體或其抗體結合物、融合蛋白質或聚合物調配物之穩定性(例如熱穩定性)的分析法。舉例而言，可使用本領域中已知的任何方法來測定抗體或其抗體結合物、融合蛋白質或聚合物調配物之穩定性，例如差示掃描螢光測定法(DSF)、圓偏光二色性(CD)、內源蛋白質螢光、差示掃描量熱法、光譜法、光散射(例如動態光散射(DLS)及靜態光散射(SLS))、自身相互反應層析(SIC)。可如本文中所 描述，例如使用如例如實例1及實例2中所描述之DSF來測定分析物之穩定性。
D. 免疫結合物
本發明亦提供包含本文中之抗VEGF抗體與一或多種細胞毒性劑結合之免疫結合物，該等細胞毒性劑為諸如化學治療劑或化學治療藥物、生長抑制劑、毒素(例如蛋白毒素、細菌、真菌、植物或動物來源之酶活性毒素或其片段)或放射性同位素。
在一個實施例中，免疫結合物為抗體-藥物結合物(ADC)，其中抗體與一或多種藥物結合，包括但不限於類美登素(參見美國專利第5,208,020號、第5,416,064號及歐洲專利EP 0 425 235 B1)；澳瑞斯他汀(auristatin)，諸如單甲基澳瑞斯他汀藥物部分DE及DF(MMAE及MMAF)(參見美國專利第5,635,483號、第5,780,588號及第7,498,298號)；朵拉司他汀；卡奇黴素或其衍生物(參見美國專利第5,712,374號、第5,714,586號、第5,739,116號、第5,767,285號、第5,770,701號、第5,770,710號、第5,773,001號及第5,877,296號；Hinman等人，Cancer Res.53：3336-3342(1993)；及Lode等人，Cancer Res.58：2925-2928(1998))；蒽環類，諸如道諾黴素或阿黴素(參見Kratz等人，Current Med.Chem.13：477-523(2006)；Jeffrey等人，Bioorganic & Med.Chem.Letters 16：358-362(2006)；Torgov等人，Bioconj.Chem.16：717-721(2005)；Nagy等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97：829-834(2000)；Dubowchik等人，Bioorg.& Med.Chem.Letters 12：1529-1532(2002)；King等人，J.Med.Chem.45：4336-4343(2002)；及美國專利第6,630,579號)；胺甲蝶呤；長春地辛；紫杉烷，諸如多烯紫杉醇、太平洋紫杉醇、拉洛紫杉醇(larotaxel)、特西紫杉醇(tesetaxel)及歐塔紫杉醇(ortataxel)；單端孢黴毒素(trichothecene)；及CC1065。
在另一實施例中，免疫結合物包含如本文中所描述之抗體與酶活性毒素或其片段之結合物，該酶活性毒素包括但不限於白喉A鏈、白喉毒素之非結合活性片段、外毒素A鏈(得自於綠膿桿菌(Pseudomonas aeruginosa))、蓖麻毒素A鏈、相思子毒素A鏈、莫迪素(modeccin)A鏈、α-帚麴菌素、油桐蛋白、石竹素蛋白、美國商陸(Phytolaca americana)蛋白 (PAPI、PAPII及PAP-S)、苦瓜抑制劑、麻瘋樹毒素、巴豆毒素、肥阜草(sapaonaria officinalis)抑制劑、白樹毒素(gelonin)、米托菌素(mitogellin)、侷限麴菌素、酚黴素、伊諾黴素及單端孢黴毒素。
在另一實施例中，免疫結合物包含如本文中所描述之抗體與放射性原子結合形成之放射性結合物。多種放射性同位素可用於產生放射性結合物。實例包括At211、I131、I125、Y90、Re186、Re188、Sm153、Bi212、P32、Pb212及Lu之放射性同位素。當放射性結合物用於偵測時，其可包含用於閃爍研究之放射性原子，例如tc99m或1123；或用於核磁共振(NMR)成像(亦稱為磁共振成像，mri)之自旋標記物，諸如碘-123、碘-131、銦-111、氟-19、碳-13、氮-15、氧-17、釓、錳或鐵。
抗體與細胞毒性劑之結合物可使用多種雙官能蛋白偶合劑製造，諸如N-丁二醯亞胺基-3-(2-吡啶基二硫)丙酸酯(SPDP)、丁二醯亞胺基-4-(N-順丁烯二醯亞胺基甲基)環己烷-1-甲酸酯(SMCC)、亞胺基硫雜環戊烷(IT)、醯亞胺酯之雙官能衍生物(諸如己二酸二甲酯鹽酸鹽)、活性酯(諸如辛二酸二丁二醯亞胺酯)、醛(諸如戊二醛)、雙疊氮基化合物(諸如雙(對疊氮基苯甲醯)己二胺)、雙重氮衍生物(諸如雙(對重氮苯甲醯)乙二胺)、二異氰酸酯(諸如甲苯2,6-二異氰酸酯)及雙活性氟化合物(諸如1,5-二氟-2,4-二硝基苯)。舉例而言，可如Vitetta等人，Science 238：1098(1987)中所描述來製備篦麻毒素免疫毒素。經碳14標記1之異硫氰酸酯基苯甲基-3-甲基二伸乙基三胺五乙酸(MX-DTPA)為用於使放射性核苷酸與抗體結合之例示性螯合劑。參見WO94/11026。連接子可為有助於在細胞中釋放細胞毒性藥物之「可裂解連接子」。舉例而言，可使用酸不穩定連接子、肽酶敏感性連接子、光不穩定連接子、二甲基連接子或含二硫鍵之連接子(Chari等人，Cancer Res.52：127-131(1992)；美國專利第5,208,020號)。
本文中之免疫結合物或ADC明確涵蓋但不限於用交聯劑試劑製備之該等結合物，該等試劑包括但不限於BMPS、EMCS、GMBS、HBVS、LC-SMCC、MBS、MPBH、SBAP、SIA、SIAB、SMCC、SMPB、SMPH、磺基-EMCS、磺基-GMBS、磺基-KMUS、磺基-MBS、磺基-SIAB、磺基-SMCC及磺基-SMPB，及市售SVSB(丁二醯亞胺基-(4-乙烯碸)苯甲酸 酯)(例如購自Pierce Biotechnology,Inc.，Rockford，IL.，U.S.A)。
E. 用於親和力純化、診斷及偵測之方法及組成物
本發明之抗體可用作親和力純化劑。在此方法中，使用此項技術中所熟知的方法將抗體固定於諸如SEPHADEX®樹脂或濾紙之固相上。使經固定之抗體與含有欲純化之抗原的樣品接觸，且此後用適合之溶劑洗滌載體，由此將移除樣品中除已與經固定之抗體結合的欲純化之抗原以外的實質上所有物質。最後，用另一適合之溶劑(諸如甘胺酸緩衝液pH 5.0)洗滌載體，由此自抗體釋放抗原。
在某些實施例中，本文中所提供之抗VEGF抗體中之任一者適用於在生物樣品中偵測VEGF之存在。如本文中所使用之術語「偵測」涵蓋定量或定性偵測。在某些實施例中，生物樣品包含細胞或組織，諸如血液(例如，全血、血漿及/或血清)、組織樣品(例如，腫瘤樣品)及其類似物。
在一個實施例中，提供用於診斷或偵測方法中之抗VEGF抗體。在另一態樣中，提供在生物樣品中偵測VEGF之存在的方法。在某些實施例中，該方法包括使該生物樣品與如本文中所描述之抗VEGF抗體在允許該抗VEGF抗體與VEGF結合之條件下接觸，及偵測該抗VEGF抗體與VEGF之間是否形成複合物。此種方法可為生體外或生體內方法。在一個實施例中，使用抗VEGF抗體來選擇利用抗VEGF抗體之療法勝任的個體，例如，其中VEGF為用於選擇患者之生物標記。
可使用本發明抗體診斷之例示性病症包括與病理性血管生成相關之病症(例如眼部病症及細胞增殖性病症)及/或與不合需要之血管滲透相關之病症(例如與腦腫瘤相關之水腫、與惡性病相關之腹水、梅格斯氏症候群、肺炎、腎病症候群、心包膜積液、胸膜積液及與心血管疾病相關之滲透)。在一些情況下，該眼部病症為AMD(例如，濕性AMD、乾性AMD、中期AMD、晚期AMD或地圖樣萎縮(GA))、黃斑變性、黃斑水腫、DME(例如局部非中心性DME或擴散性中心參與性DME)、視網膜病、糖尿病性視網膜病(DR)(例如，增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)或高原DR)、其他局部缺血相關性視網膜病、ROP、視網膜靜脈阻塞(RVO)(例如中央形式(CRVO)及分枝形式(BRVO))、CNV(例如近視性CNV)、角膜新血管形成、 與角膜新血管形成相關之疾病、視網膜新血管形成、與視網膜/脈絡膜新血管形成相關之疾病、病理性近視、馮希伯-林島氏病、眼組織胞漿菌病、FEVR、柯氏病、諾裡氏病、OPPG、結膜下出血、虹膜發紅、眼部新血管疾病、新血管性青光眼、色素性視網膜炎(RP)、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤性增生、黃斑毛細血管擴張、虹膜新血管形成、眼內新血管形成、視網膜變性、囊樣黃斑水腫(CME)、血管炎、視乳頭水腫、視網膜炎、結膜炎(例如感染性結膜炎及非感染性(例如過敏性)結膜炎)、萊伯先天性黑矇(亦稱為萊伯氏先天性黑矇或LCA)葡萄膜炎(包括感染性及非感染性葡萄膜炎)、脈絡膜炎(例如多灶性脈絡膜炎)、眼組織胞漿菌病、瞼緣炎、乾眼症、創傷性眼損傷或修格連氏病。在一些情況下，該眼部病症為視網膜病，包括增殖性糖尿病性視網膜病、脈絡膜新血管形成(CNV)、年齡相關性黃斑變性(AMD)、糖尿病性及其他局部缺血相關性視網膜病、糖尿病性黃斑水腫(DME)、病理性近視、馮希伯-林島氏病、眼組織胞漿菌病、視網膜靜脈阻塞(包括中央形式(CRVO)及分枝形式(BRVO))、角膜新血管形成、視網膜新血管形成、早產兒視網膜病(ROP)、家族性滲出性玻璃體視網膜病變(FEVR)、柯氏病、諾裡氏病、骨質疏鬆症-假神經膠質瘤症候群(OPPG)、結膜下出血或高血壓性視網膜病變。在一些情況下，該細胞增殖性病症為癌症。在一些情況下，該癌症為乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、腎癌、前列腺癌、肝癌、頭頸癌、黑色素瘤、卵巢癌、間皮瘤或多發性骨髓瘤。
在某些實施例中，提供經標記之抗VEGF抗體。標記包括但不限於例如藉由酶反應或分子間相互作用直接偵測之標記或部分(諸如螢光標記、發色標記、電子緻密標記、化學發光標記及放射性標記)，以及間接偵測之部分，諸如酶或配體。例示性標記包括但不限於放射性同位素32P、14C、125I、3H及131I；螢光團，諸如稀土螯合物或螢光素及其衍生物、若丹明及其衍生物、丹醯、傘形酮；螢光素酶，例如螢光蟲螢光素酶及細菌螢素光酶(美國專利第4,737,456號)；螢光素；2,3-二氫酞嗪二酮；辣根過氧化物酶(HRP)；鹼性磷酸酶；β-半乳糖苷酶；葡糖澱粉酶；溶菌酶；醣類氧化酶，例如葡萄糖氧化酶、半乳糖氧化酶及葡萄糖-6-磷酸脫氫酶；雜環氧化 酶，諸如尿酸酶及黃嘌呤氧化酶，該等標記係與採用過氧化氫來氧化染料前驅物之酶偶合，諸如HRP、乳酸過氧化物酶或微過氧化物酶、生物素/親和素、自旋標記、噬菌體標記、穩定自由基及其類似物。
在本發明之另一實施例中，該抗體不必經標記，且其存在可使用結合該抗體之經標記抗體加以偵測。
本發明之抗體可用於任何已知分析法中，諸如競爭性結合分析法、直接及間接夾心分析法及免疫沈澱分析法。Zola,Monoclonal Antibodies：A Manual of Techniques,pp.147-158(CRC Press,Inc.1987)。
競爭性結合分析法依賴於經標記之標準物與測試樣品分析物競爭同有限量之抗體結合的能力。測試樣品中之抗原的量與同抗體結合之標準物的量成反比。為了有助於測定結合之標準物的量，抗體一般在競爭前後不溶解，從而可便利地分離與抗體結合之標準物及分析物與仍未結合之標準物及分析物。
夾心分析法涉及使用兩種抗體，每一種均能夠結合欲偵測蛋白質之不同的免疫原部分或抗原決定基。在夾心分析法中，固定於固體載體上之第一抗體結合測試樣品分析物，且此後第二抗體結合該分析物，因而形成不溶性三部分複合物。參見例如美國專利第4,376,110號。第二抗體本身可用可偵測部分加以標記(直接夾心分析法)或可使用經可偵測部分標記之抗免疫球蛋白抗體加以量測(間接夾心分析法)。舉例而言，一種類型夾心分析法為ELISA分析法，在該情況下可偵測部分為酶。
對於免疫組織化學，舉例而言，腫瘤樣品可為新鮮的或冷凍的，或可嵌埋在石蠟中且用諸如福馬林之防腐劑固定。
該等抗體亦可用於生體內診斷分析。一般而言，該抗體經放射性核素(諸如111In、99Tc、14C、131I、125I、3H、32P或35S)或染料標記，從而可使用免疫閃爍掃描術來定位腫瘤。
F. 診斷套組
為便利起見，本發明之抗體可提供於套組中，亦即，預定量試劑之包裝組合與關於進行診斷分析之說明書。在抗體經酶標記之情況下，該套組將包括該酶所需之受質及輔因子(例如提供可偵測發色團或螢光 團之受質前驅物)。另外，可包括其他添加劑，諸如穩定劑、緩衝液(例如阻斷緩衝液或溶解緩衝液)及其類似物。各種試劑之相對量可廣泛變化，以提供多種試劑溶液濃度，由此實質上最佳化分析物之敏感性。特定言之，該等試劑可作為包括賦形劑之乾粉末(通常經凍乾)提供，其在溶解後將提供具有適當濃度之試劑溶液。
G. 醫藥調配物
如本文中所描述之抗VEGF抗體或其抗體結合物、融合蛋白質或聚合物調配物之醫藥調配物係藉由將具有所要純度之此種抗體與一或多種視情況選用之醫藥學上可接受之載劑(Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編(1980))混合呈凍乾調配物或水溶液形式來製備。醫藥學上可接受之載劑在所採用之劑量及濃度下一般對受體無毒，且包括但不限於：緩衝劑，諸如磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸；抗氧化劑，包括抗壞血酸及甲硫胺酸；防腐劑(諸如十八烷基二甲基苯甲基氯化銨；氯化六烴季銨；苯紮氯銨；苄索氯銨；苯酚、丁醇或苯甲醇；對羥基苯甲酸烷基酯，諸如對羥基苯甲酸甲酯或對羥基苯甲酸丙酯；兒茶酚；間苯二酚；環己醇；3-戊醇；及間甲酚)；低分子量(少於約10個殘基)多肽；蛋白質，諸如血清白蛋白、明膠或免疫球蛋白；親水性聚合物，諸如聚乙烯吡咯啶酮；胺基酸，諸如甘胺酸、麩醯胺酸、天冬醯胺、組胺酸、精胺酸或離胺酸；單醣、二醣及其他碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；螯合劑，諸如EDTA；糖，諸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇；成鹽相對離子，諸如鈉；金屬錯合物(例如鋅-蛋白錯合物)；及/或非離子界面活性劑，諸如聚乙二醇(PEG)。本文中之例示性醫藥學上可接受之載劑進一步包括間質藥物分散劑，諸如可溶性中性活性透明質酸酶糖蛋白(sHASEGP)，例如人類可溶性PH-20透明質酸酶糖蛋白，諸如rHuPH20(HYLENEX®，Baxter International,Inc.)。某些例示性sHASEGP及使用方法(包括rHuPH20)描述於美國專利公開案第2005/0260186號及第2006/0104968號中。在一個態樣中，sHASEGP係與一或多種其他糖胺聚糖酶(諸如軟骨素酶)組合。
例示性凍乾抗體調配物描述於美國專利第6,267,958號中。水性抗體調配物包括美國專利第6,171,586號及WO2006/044908中所描述 者，後者之調配物包括組胺酸-乙酸鹽緩衝液。
本文中之調配物亦可含有超過一種對於所治療之特定適應症而言必需存在的活性成分，較佳具有不會對彼此造成不利影響之互補活性的活性成分。舉例而言，可能需要進一步提供免疫抑制劑。該等分子適合以組合形式以對預定目的有效之量存在。
活性成分可嵌埋在所製備之微膠囊中，例如藉由團聚技術或藉由界面聚合，例如羥甲基纖維素或明膠微膠囊及聚(甲基丙烯酸甲酯)微膠囊，分別嵌埋於膠體藥物遞送系統(例如脂質體、白蛋白微球體、微乳液、奈米粒子及奈米膠囊)或粗乳液中。該等技術揭示於Remington’s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol,A.編(1980)中。
欲用於生體內投與之調配物一般為無菌的。無菌可藉由例如通過無菌過濾膜進行過濾而容易地實現。
在某些實施例中，該醫藥調配物包括一或多種額外化合物。在某些實施例中，該額外化合物結合選自由以下各項組成之群的第二生物分子：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體；ST-2受體；及與年齡相關性黃斑變性(AMD)風險基因相關之蛋白質，諸如補體途徑組分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；及TNFRSF10A。在某些實施例中，該額外化合物為抗體或其抗原結合片段。
舉例而言，在一些情況下，該額外化合物為雙特異性抗體(例如抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體，諸如RG-7716或者WO 2010/069532或WO 2016/073157中所揭示之任何雙特異性抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體)。
在另一實例中，在一些情況下，該額外化合物為抗IL-6抗體，例如EBI-031(Eleven Biotherapeutics；參見例如WO 2016/073890)、司妥昔單抗(SYLVANT®)、奧洛珠單抗、克萊紮珠單抗、司魯庫單抗、艾西莫單抗、戈利珠單抗、OPR-003、MEDI-5117、PF-04236921或其變異體。
在另一實例中，在一些情況下，該額外化合物為抗IL-6R抗體，例如，托珠單抗(ACTEMRA®)(參見例如WO 1992/019579)、賽利魯單抗、沃巴利珠單抗(ALX-0061)、SA-237或其變異體。
H. 治療方法及組成物
本文中所提供之抗VEGF抗體、抗體結合物(例如，HA結合物、PEG結合物及前藥抗體結合物)、融合蛋白質及聚合物調配物中之任一者均可用於治療方法中。
在一個態樣中，提供一種抗VEGF抗體以用作藥劑。在另一態樣中，提供一種抗體結合物以用作藥劑。在又另一態樣中，提供一種融合蛋白質以用作藥劑。在再另一態樣中，提供一種聚合物調配物以用作藥劑。在其他態樣中，本發明提供一種抗VEGF抗體以用於治療與病理學血管生成相關之病症。在另一態樣中，本發明提供一種抗體結合物以用於治療與病理學血管生成相關之病症。在又另一態樣中，本發明提供一種融合蛋白質以用於治療與病理學血管生成相關之病症。在其他態樣中，本發明提供一種聚合物調配物以用於治療與病理學血管生成相關之病症。在一些實施例中，該與病理性血管生成相關之病症為眼部病症或細胞增殖性病症。在一些情況下，該眼部病症為AMD(例如，濕性AMD、乾性AMD、中期AMD、晚期AMD或地圖樣萎縮(GA))、黃斑變性、黃斑水腫、DME(例如局部非中心性DME或擴散性中心參與性DME)、視網膜病、糖尿病性視網膜病(DR)(例如，增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)或高原DR)、其他局部缺血相關性視網膜病、ROP、視網膜靜脈阻塞(RVO)(例如中央形式(CRVO)及分枝形式(BRVO))、CNV(例如近視性CNV)、角膜新血管形成、與角膜新血管形成相關之疾病、視網膜新血管形成、與視網膜/脈絡膜新血管形成相關之疾病、病理性近視、馮希伯-林島氏病、眼組織胞漿菌病、FEVR、柯氏病、諾裡氏病、OPPG、結膜下出血、虹膜發紅、眼部新血管疾病、新血管性青光眼、色素性視網膜炎(RP)、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤性增生、黃斑毛細血管擴張、虹膜新血管形成、眼內新血管形成、視網膜變性、囊樣黃斑水腫(CME)、血管炎、視乳頭水腫、視網膜炎、結膜炎(例如，感染性結膜炎及非感染性(例如，過敏性)結膜炎)、萊伯先天性黑 矇、葡萄膜炎(包括感染性及非感染性葡萄膜炎)、脈絡膜炎(例如多處脈絡膜炎)、眼組織胞漿菌病、瞼緣炎、乾眼症、創傷性眼損傷或修格連氏病。在一些情況下，該細胞增殖性病症為癌症。在一些情況下，該癌症為乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、腎癌、前列腺癌、肝癌、頭頸癌、黑色素瘤、卵巢癌、間皮瘤或多發性骨髓瘤。在另一態樣中，提供一種抗VEGF抗體以用於治療與不合需要之血管滲透相關之病症。在一些情況下，該與不合需要之血管滲透相關之病症為與腦腫瘤相關之水腫、與惡性病相關之腹水、梅格斯氏症候群、肺炎、腎病症候群、心包膜積液、胸膜積液或與心血管疾病相關之滲透。
在另一態樣中，提供一種抗VEGF抗體以用於治療方法中。在另一態樣中，提供一種抗體結合物以用於治療方法中。在又另一態樣中，提供一種融合蛋白質以用於治療方法中。在再另一態樣中，提供一種聚合物調配物以用於治療方法中。在某些情況下，本發明提供一種抗VEGF抗體以用於治療患有與病理性血管生成相關之病症的個體的方法中，該方法包括向該個體投與有效量之該抗VEGF抗體。本發明亦提供一種抗體結合物以用於治療患有與病理性血管生成相關之病症的個體的方法中，該方法包括向該個體投與有效量之該抗體結合物。本發明亦提供一種融合蛋白質以用於治療患有與病理性血管生成相關之病症的個體的方法中，該方法包括向該個體投與有效量之該融合蛋白質。本發明亦提供一種聚合物調配物以用於治療患有與病理性血管生成相關之病症的個體的方法中，該方法包括向該個體投與有效量之該聚合物調配物。在一些情況下，該眼部病症為AMD(例如，濕性AMD、乾性AMD、中期AMD、晚期AMD或地圖樣萎縮(GA))、黃斑變性、黃斑水腫、DME(例如局部非中心性DME或擴散性中心參與性DME)、視網膜病、糖尿病性視網膜病(DR)(例如，增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)或高原DR)、其他局部缺血相關性視網膜病、ROP、視網膜靜脈阻塞(RVO)(例如中央形式(CRVO)及分枝形式(BRVO))、CNV(例如近視性CNV)、角膜新血管形成、與角膜新血管形成相關之疾病、視網膜新血管形成、與視網膜/脈絡膜新血管形成相關之疾病、病理性近視、馮希伯-林島氏病、眼組織胞漿菌病、FEVR、柯氏病、諾裡氏病、OPPG、 結膜下出血、虹膜發紅、眼部新血管疾病、新血管性青光眼、色素性視網膜炎(RP)、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤性增生、黃斑毛細血管擴張、虹膜新血管形成、眼內新血管形成、視網膜變性、囊樣黃斑水腫(CME)、血管炎、視乳頭水腫、視網膜炎、結膜炎(例如，感染性結膜炎及非感染性(例如，過敏性)結膜炎)、萊伯先天性黑矇、葡萄膜炎(包括感染性及非感染性葡萄膜炎)、脈絡膜炎(例如多處脈絡膜炎)、眼組織胞漿菌病、瞼緣炎、乾眼症、創傷性眼損傷或修格連氏病。在一些情況下，該細胞增殖性病症為癌症。在一些情況下，該癌症為乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、腎癌、前列腺癌、肝癌、頭頸癌、黑色素瘤、卵巢癌、間皮瘤或多發性骨髓瘤。
在其他情況下，本發明提供一種抗VEGF抗體以用於治療患有與不合需要之血管滲透相關之病症的個體的方法中。在一些情況下，該與不合需要之血管滲透相關之病症為與腦腫瘤相關之水腫、與惡性病相關之腹水、梅格斯氏症候群、肺炎、腎病症候群、心包膜積液、胸膜積液或與心血管疾病相關之滲透。任何前述用途均可進一步包括向該個體投與有效量之至少一種額外治療劑，例如，如以下所描述。
在一些情況下，本發明提供一種抗VEGF抗體以用於在個體中減少或抑制血管生成。在另一態樣中，提供一種抗體結合物以用於在個體中減少或抑制血管生成。在又另一態樣中，提供一種融合蛋白質以用於在個體中減少或抑制血管生成。在再另一態樣中，提供一種聚合物調配物以用於在個體中減少或抑制血管生成。在某些實施例中，本發明提供一種抗VEGF抗體以用於在個體中減少或抑制血管生成之方法中，該方法包括向該個體投與有效量之該抗VEGF抗體以減少或抑制血管生成。本發明亦提供一種抗體結合物以用於在個體中減少或抑制血管生成之方法中，該方法包括向該個體投與有效量之該抗體結合物。本發明亦提供一種融合蛋白質以用於在個體中減少或抑制血管生成之方法中，該方法包括向該個體投與有效量之該融合蛋白質。本發明亦提供一種聚合物調配物以用於在個體中減少或抑制血管生成之方法中，該方法包括向該個體投與有效量之該聚合物調配物。在其他情況下，本發明提供一種抗VEGF抗體以用於在個 體中減少或抑制血管滲透。在某些實施例中，本發明提供一種抗VEGF抗體以用於在個體中減少或抑制血管滲透之方法中，該方法包括向該個體投與有效量之該抗VEGF抗體以減少或抑制血管滲透。根據以上用途中任一者之「個體」可為人類。
在一些情況下，本發明提供一種抗VEGF抗體以用於在個體中治療自體免疫疾病。在一些情況下，該自體免疫病症為變形性關節炎、關節黏連性脊椎炎、牛皮癬性關節炎及克羅恩氏病。任何前述用途均可進一步包括向該個體投與有效量之至少一種額外治療劑，例如，如以下所描述。
本發明提供抗VEGF抗體用於製造或製備藥劑之用途。本發明亦提供抗體結合物用於製造或製備藥劑之用途。再此外，本發明提供融合蛋白質用於製造或製備藥劑之用途。本發明亦提供聚合物調配物用於製造或製備藥劑之用途。舉例而言，在一種情況下，該藥劑用於治療與病理性血管生成相關之病症。在另一種情況下，該藥劑用於治療與病理性血管生成相關之病症的方法中，該方法包括向患有與病理性血管生成相關之病症的個體投與有效量之該藥劑。在一些情況下，該眼部病症為AMD(例如，濕性AMD、乾性AMD、中期AMD、晚期AMD或地圖樣萎縮(GA))、黃斑變性、黃斑水腫、DME(例如局部非中心性DME或擴散性中心參與性DME)、視網膜病、糖尿病性視網膜病(DR)(例如，增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)或高原DR)、其他局部缺血相關性視網膜病、ROP、視網膜靜脈阻塞(RVO)(例如中央形式(CRVO)及分枝形式(BRVO))、CNV(例如近視性CNV)、角膜新血管形成、與角膜新血管形成相關之疾病、視網膜新血管形成、與視網膜/脈絡膜新血管形成相關之疾病、病理性近視、馮希伯-林島氏病、眼組織胞漿菌病、FEVR、柯氏病、諾裡氏病、OPPG、結膜下出血、虹膜發紅、眼部新血管疾病、新血管性青光眼、色素性視網膜炎(RP)、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤性增生、黃斑毛細血管擴張、虹膜新血管形成、眼內新血管形成、視網膜變性、囊樣黃斑水腫(CME)、血管炎、視乳頭水腫、視網膜炎、結膜炎(例如，感染性結膜炎及非感染性(例如，過敏性)結膜炎)、萊伯先天性黑矇、葡萄膜炎(包括感染性及非感染性葡萄膜 炎)、脈絡膜炎(例如多處脈絡膜炎)、眼組織胞漿菌病、瞼緣炎、乾眼症、創傷性眼損傷或修格連氏病。在一些情況下，該細胞增殖性病症為癌症。在一些情況下，該癌症為乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、腎癌、前列腺癌、肝癌、頭頸癌、黑色素瘤、卵巢癌、間皮瘤或多發性骨髓瘤。在另一種情況下，該藥劑用於在個體中減少或抑制血管生成。在另一種情況下，該藥劑用於在個體中減少或抑制血管生成之方法中，該方法包括向該個體投與有效量之該藥劑以減少或抑制血管生成。在前述藥劑用途中之任一者中，該方法均可包括向該個體投與有效量之至少一種額外治療劑，例如，如以下所描述。
在另一種情況下，該藥劑用於治療與不合需要之血管滲透相關之病症。在一些情況下，該與不合需要之血管滲透相關之病症為與腦腫瘤相關之水腫、與惡性病相關之腹水、梅格斯氏症候群、肺炎、腎病症候群、心包膜積液、胸膜積液或與心血管疾病相關之滲透。在另一種情況下，該藥劑用於治療與不合需要之血管滲透相關之病症的方法中，該方法包括向患有與不合需要之血管滲透相關之病症的個體投與有效量之該藥劑。在另一種情況下，該藥劑用於在個體中減少或抑制血管滲透。在另一種情況下，該藥劑用於在個體中減少或抑制血管滲透之方法中，該方法包括向該個體投與有效量之該藥劑以減少或抑制血管生成。在前述藥劑用途中之任一者中，該方法均可包括向該個體投與有效量之至少一種額外治療劑，例如，如以下所描述。根據以上用途中任一者之「個體」可為人類。
在另一種情況下，該藥劑用於治療自體免疫病症。在一些情況下，該自體免疫病症為變形性關節炎、關節黏連性脊椎炎、牛皮癬性關節炎及克羅恩氏病。在另一種情況下，該藥劑用於治療自體免疫病症之方法中，該方法包括向患有自體免疫病症之個體投與有效量之該藥劑。根據以上用途中任一者之「個體」可為人類。
本發明提供一種用於治療與病理性血管生成相關之病症的方法。在一個實施例中，該方法包括向患有與病理性血管生成相關之病症的個體投與有效量之抗VEGF抗體。在另一實例中，該方法包括向患有與病理性血管生成相關之病症的個體投與有效量之抗體結合物。在又另一實 例中，該方法包括向患有與病理性血管生成相關之病症的個體投與有效量之融合蛋白質。在又另一實例中，該方法包括向患有與病理性血管生成相關之病症的個體投與有效量之聚合物調配物。在一些情況下，該眼部病症為AMD(例如，濕性AMD、乾性AMD、中期AMD、晚期AMD或地圖樣萎縮(GA))、黃斑變性、黃斑水腫、DME(例如局部非中心性DME或擴散性中心參與性DME)、視網膜病、糖尿病性視網膜病(DR)(例如，增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)或高原DR)、其他局部缺血相關性視網膜病、ROP、視網膜靜脈阻塞(RVO)(例如中央形式(CRVO)及分枝形式(BRVO))、CNV(例如近視性CNV)、角膜新血管形成、與角膜新血管形成相關之疾病、視網膜新血管形成、與視網膜/脈絡膜新血管形成相關之疾病、病理性近視、馮希伯-林島氏病、眼組織胞漿菌病、FEVR、柯氏病、諾裡氏病、OPPG、結膜下出血、虹膜發紅、眼部新血管疾病、新血管性青光眼、色素性視網膜炎(RP)、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤性增生、黃斑毛細血管擴張、虹膜新血管形成、眼內新血管形成、視網膜變性、囊樣黃斑水腫(CME)、血管炎、視乳頭水腫、視網膜炎、結膜炎(例如，感染性結膜炎及非感染性(例如，過敏性)結膜炎)、萊伯先天性黑矇、葡萄膜炎(包括感染性及非感染性葡萄膜炎)、脈絡膜炎(例如多處脈絡膜炎)、眼組織胞漿菌病、瞼緣炎、乾眼症、創傷性眼損傷或修格連氏病。在一些情況下，該細胞增殖性病症為癌症。在一些情況下，該癌症為乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、腎癌、前列腺癌、肝癌、頭頸癌、黑色素瘤、卵巢癌、間皮瘤或多發性骨髓瘤。在其他情況下，該方法進一步包括向該個體投與有效量之至少一種額外治療劑，如以下所描述。根據以上方法中任一者之「個體」可為人類。
本發明提供一種用於治療與不合需要之血管滲透相關之病症的方法。在一個實施例中，該方法包括向患有與不合需要之血管滲透相關之病症的個體投與有效量之抗VEGF抗體。在一些情況下，該與不合需要之血管滲透相關之病症為與腦腫瘤相關之水腫、與惡性病相關之腹水、梅格斯氏症候群、肺炎、腎病症候群、心包膜積液、胸膜積液或與心血管疾病相關之滲透。在其他情況下，該方法進一步包括向該個體投與有效量 之至少一種額外治療劑，如以下所描述。根據以上方法中任一者之「個體」可為人類。
預期本發明之抗體或其抗體結合物、融合蛋白質或聚合物調配物可用於治療哺乳動物。在一個實施例中，舉例而言，出於獲得臨床前資料之目的將本發明之抗體或其抗體結合物、融合蛋白質或聚合物調配物投與非人類哺乳動物。欲治療之例示性非人類哺乳動物包括進行臨床前研究之非人類靈長類動物、狗、貓、齧齒動物(例如小鼠及大鼠)及其他哺乳動物。此種哺乳動物可用於建立針對欲用該抗體治療之疾病的動物模型，或可用於研究相關抗體之毒性或藥物動力學性質。在此等實施例中之每一者中，可在哺乳動物中進行劑量遞增研究。舉例而言，該抗體可投與實體腫瘤模型中之宿主齧齒動物。該抗體或其抗體結合物、融合蛋白質或聚合物調配物可投與宿主(例如齧齒動物，例如兔)以用於眼部藥物動力學研究，例如藉由玻璃體內投與(例如玻璃體內注射)或使用孔口式遞送裝置。
在另一態樣中，本發明提供包含本文中所提供之任何抗VEGF抗體、抗體結合物、融合蛋白質及/或聚合物調配物之醫藥調配物，例如，以用於任一種以上治療方法中。在一個實施例中，醫藥調配物包含本文中所提供之任何抗VEGF抗體、抗體結合物、融合蛋白質及/或聚合物調配物及醫藥學上可接受之載劑。在另一實施例中，醫藥調配物包含本文中所提供之任何抗VEGF抗體、抗體結合物、融合蛋白質及/或聚合物調配物及至少一種額外治療劑，例如，如以下所描述。在某些實施例中，該醫藥調配物包含一或多種額外化合物。在某些實施例中，該額外化合物結合選自由以下各項組成之群的第二生物分子：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；Ang2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體；ST-2受體；及與年齡相關性黃斑變性(AMD)風險基因相關之蛋白質，諸如補體途徑組分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；介白素-8(IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；及TNFRSF10A。在某些實施例中，該額外化合物為抗體或其抗原結合片段。舉例而言，在一些情況下，該額外化 合物為雙特異性抗體(例如抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體，諸如RG-7716或者WO 2010/069532或WO 2016/073157中所揭示之任何雙特異性抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體)或其變異體。在另一實例中，在一些情況下，該額外化合物為抗IL-6抗體，例如EBI-031(Eleven Biotherapeutics；參見例如WO 2016/073890)、司妥昔單抗(SYLVANT®)、奧洛珠單抗、克萊紮珠單抗、司魯庫單抗、艾西莫單抗、戈利珠單抗、OPR-003、MEDI-5117、PF-04236921或其變異體。在再另一實例中，在一些情況下，該額外化合物為抗IL-6R抗體，例如，托珠單抗(ACTEMRA®)(參見例如WO 1992/019579)、賽利魯單抗、沃巴利珠單抗(ALX-0061)、SA-237或其變異體。
本發明之抗體或其抗體結合物、融合蛋白質或聚合物調配物可單獨或與其他藥劑組合使於療法中。舉例而言，本發明之抗體或其抗體結合物、融合蛋白質及/或聚合物調配物可與至少一種額外治療劑共同投與。在某些實施例中，額外治療劑為另一抗體、化學治療劑、細胞毒性劑、抗血管生成劑、免疫抑制劑、前藥、細胞因子、細胞因子拮抗劑、細胞毒性放射療法、皮質類固醇、抗吐劑、癌症疫苗、止痛劑、生長抑制劑或其組合。
舉例而言，在某些實施例中，前述方法中之任一種進一步包括投與一或多種額外化合物。在某些實施例中，該抗VEGF抗體、抗體結合物、融合蛋白質或聚合物調配物與該(等)額外化合物同時投與。在某些實施例中，該抗VEGF抗體、抗體結合物、融合蛋白質或聚合物調配物在該(等)額外化合物前後投與。在某些實施例中，該額外化合物結合選自由以下各項組成之群的第二生物分子：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；Ang2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體；ST-2受體；及與AMD風險基因相關之蛋白質，諸如補體途徑組分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；介白素-8(IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；及TNFRSF10A。在某些實施例中，該額外化合物為抗體或其抗原結合片段。 在根據(或適用於)以上實施例中之任一者的某些實施例中，該眼部病症為選自由以下各項組成之群的眼內新血管疾病：增生性視網膜病、脈絡膜新血管形成(CNV)、年齡相關性黃斑變性(AMD)、糖尿病性及其他局部缺血相關性視網膜病、糖尿病性黃斑水腫、病理性近視、馮希伯-林島氏病、眼組織胞漿菌病、視網膜靜脈阻塞(RVO，包括CRVO及BRVO)、角膜新血管形成、視網膜新血管形成及早產兒視網膜病(ROP)。舉例而言，在一些情況下，該額外化合物為雙特異性抗體(例如抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體，諸如RG-7716或者WO 2010/069532或WO 2016/073157中所揭示之任何雙特異性抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體)或其變異體。在另一實例中，在一些情況下，該額外化合物為抗IL-6抗體，例如EBI-031(Eleven Biotherapeutics；參見例如WO 2016/073890)、司妥昔單抗(SYLVANT®)、奧洛珠單抗、克萊紮珠單抗、司魯庫單抗、艾西莫單抗、戈利珠單抗、OPR-003、MEDI-5117、PF-04236921或其變異體。在再另一實例中，在一些情況下，該額外化合物為抗IL-6R抗體，例如，托珠單抗(ACTEMRA®)(參見例如WO 1992/019579)、賽利魯單抗、沃巴利珠單抗(ALX-0061)、SA-237或其變異體。
在一些情況下，本發明之抗體或其抗體結合物、融合蛋白質及/或聚合物調配物可與至少一種額外治療劑組合投與以用於治療眼部病症，例如本文中所描述之眼部病症(例如AMD(例如濕性AMD)、DME、DR或RVO)。用於組合療法以用於治療眼部病症之例示性額外治療劑包括但不限於抗血管生成劑，諸如VEGF拮抗劑，包括例如抗VEGF抗體(例如抗VEGF Fab LUCENTIS®(雷珠單抗))、可溶性受體融合蛋白質(例如重組可溶性受體融合蛋白質EYLEA®(阿柏西普，亦稱為VEGF Trap Eye；Regeneron/Aventis))、適體(例如抗VEGF聚乙二醇化適體MACUGEN®(哌加他尼鈉；NeXstar Pharmaceuticals/OSI Pharmaceuticals))及VEGFR酪胺酸激酶抑制劑(例如4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯啶-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、瓦他拉尼(PTK787)、司馬沙尼(SU5416；SUGEN)及SUTENT®(舒尼替尼))；色胺醯基-tRNA合成酶(TrpRS)；角鯊胺 (squalamine)；RETAANE®(用於貯庫懸浮液之乙酸阿奈可他(anecortave acetate)；Alcon,Inc.)；考布他汀A4前藥(CA4P)；MIFEPREX®(米非司酮-ru486)；德濃氏囊下曲安奈德；玻璃體內結晶曲安奈德；基質金屬蛋白酶抑制劑(例如普馬司他(Prinomastat)(AG3340；Pfizer))；丙酮化氟新龍(包括氟輕鬆眼內植入物；Bausch & Lomb/Control Delivery Systems)；羅喹美克(linomide)；整合素β3功能抑制劑；及其組合。可與本發明之抗體組合投與之此等及其他治療劑描述於例如美國專利申請案第US 2014/0017244號中，該案以全文引用之方式併入本文中。
可與本發明之抗體或其抗體結合物、融合蛋白質及/或聚合物調配物組合使用於治療眼部病症(例如AMD、DME、DR或RVO)之額外治療劑的其他實例包括但不限於VISUDYNE®(維替泊芬(verteporfin)；典型地連同光動力療法與非熱療式雷射一起使用之光活化藥物)、PKC412、恩多維隆(Endovion)(NS 3728；NeuroSearch A/S)、神經營養因子(例如神經膠質衍生神經營養因子(GDNF)及睫狀體神經營養因子(CNTF))、地爾硫卓(diltiazem)、舒露瞳(dorzolamide)、PHOTOTROP®、9-順式視黃醛、眼用藥劑(例如碘化磷醯硫膽鹼、二乙氧膦醯硫膽鹼或碳酸酐酶抑制劑)、鯊癌靈(veovastat)(AE-941；Aeterna Laboratories,Inc.)、Sirna-027(AGF-745；Sima Therapeutics,Inc.)、營養因子(包括例如NT-4/5，Genentech)、Cand5(Acuity Pharmaceuticals)、INS-37217(Inspire Pharmaceuticals)、整合素拮抗劑(包括得自於Jerini AG及Abbott Laboratories之彼等整合素拮抗劑)、EG-3306(Ark Therapeutics Ltd.)、BDM-E(BioDiem Ltd.)、沙利度胺(如例如EntreMed,Inc.所使用)、心營養素-1(Genentech)、2-甲氧基雌二醇(Allergan/Oculex)、DL-8234(Toray Industries)、NTC-200(Neurotech)、四硫鉬酸鹽(University of Michigan)、LYN-002(Lynkeus Biotech)、微藻化合物(Aquasearch/Albany、Mera Pharmaceuticals)、D-9120(Celltech Group plc)、ATX-S10(Hamamatsu Photonics)、TGF-β2(Genzyme/Celtrix)、酪胺酸激酶抑制劑(例如得自於Allergan、SUGEN或Pfizer之彼等酪胺酸激酶抑制劑)、NX-278-L(NeXstar Pharmaceuticals/Gilead Sciences)、Opt-24(OPTIS France SA)、視網膜細胞神經節神經營養因子(Cogent Neurosciences)、N-硝基吡唑衍生物(Texas A & M University System)、KP-102(Krenitsky Pharmaceuticals)、環孢菌素A、光動力療法中所使用之治療劑(例如VISUDYNE®；受體靶向PDT，Bristol-Myers Squibb,Co.；與PDT一起注射之蔔吩姆鈉；維替泊芬，QLT Inc.；羅他泊芬與PDT，Miravent Medical Technologies；他拉泊芬鈉與PDT，Nippon Petroleum；及莫特沙芬鎦，Pharmacyclics,Inc.)、反義寡核苷酸(包括例如由Novagali Pharma SA及ISIS-13650測試之產品，Isis Pharmaceuticals)及其組合。
本發明之抗體或其抗體結合物、融合蛋白質及/或聚合物調配物可與用於治療眼部病症(例如AMD、DME、DR或RVO)之療法或手術程序組合投與，包括例如雷射光凝(例如全視網膜光凝(PRP))、隱結雷射處理、黃斑裂孔手術、黃斑易位手術、可植入式微型望遠鏡、PHI-運動血管攝影術(亦稱為微型雷射療法及滋養血管療法)、質子束療法、微刺激療法、視網膜脫落及玻璃體手術、鞏膜扣壓術、黃斑下手術、經瞳孔熱療法、光系統I療法、使用RNA干擾(RNAi)、體外流變析離術(亦稱為膜差壓過濾及流變療法)、微晶片植入、幹細胞療法、基因置換療法、核糖酶基因療法(包括用於缺氧反應元件之基因療法，Oxford Biomedica；Lentipak，Genetix；及PDEF基因療法，GenVec)、光受體/視網膜細胞移植(包括可移植視網膜上皮細胞，Diacrin,Inc.；視網膜細胞移植，Cell Genesys,Inc.)、針灸及其組合。
在一些情況下，本發明之抗體或其抗體結合物、融合蛋白質及/或聚合物調配物可與抗血管生成劑組合投與以用於治療眼部病症(例如AMD、DME、DR或RVO)。任何適合之抗血管生成劑均可與本發明之抗體組合使用，包括但不限於Carmeliet等人，Nature 407：249-257,2000所列出之彼等抗血管生成劑。在一些實施例中，該抗血管生成劑為VEGF拮抗劑，包括但不限於抗VEGF抗體(例如抗VEGF Fab LUCENTIS®(雷珠單抗)、RTH-258(原ESBA-1008，即抗VEGF單鏈抗體片段；Novartis)或雙特異性抗VEGF抗體(例如抗VEGF/抗血管生成素2雙特異性抗體，諸如RG-7716；Roche)、可溶性重組受體融合蛋白質(例如，EYLEA®(阿柏西普))、VEGF變異體、可溶性VEGFR片段、能夠阻斷VEGF之適體(例如哌加他尼)或 VEGFR、中和抗VEGFR抗體、VEGFR酪胺酸激酶之小分子抑制劑、抗VEGF DARPin®(例如abiciparpegol)、抑制VEGF或VEGFR之表現的小干擾RNA、VEGFR酪胺酸激酶抑制劑(例如4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯啶-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、瓦他拉尼(PTK787)、司馬沙尼(SU5416；SUGEN)及SUTENT®(舒尼替尼))及其組合。在一些情況下，該雙特異性抗VEGF抗體結合第二生物分子，包括但不限於IL-1β；IL-6；IL-6R；PDGF(例如PDGF-BB)；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體(例如VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR)；ST-2受體；及與年齡相關性黃斑變性(AMD)風險基因相關之蛋白質，諸如補體途徑組分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；及TNFRSF10A。舉例而言，在一些情況下，該額外化合物為雙特異性抗體(例如抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體，諸如RG-7716或者WO 2010/069532或WO 2016/073157中所揭示之任何雙特異性抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體)或其變異體。
可與本發明之抗體或其抗體結合物、融合蛋白質及/或聚合物調配物組合投與以用於治療眼部病症(例如AMD、DME、DR或RVO)之其他適合抗血管生成劑包括皮質類固醇、血管抑制性類固醇、乙酸阿奈可他、血管抑素、內皮抑素、酪胺酸激酶抑制劑、基質金屬蛋白酶(MMP)抑制劑、胰島素樣生長因子結合蛋白3(IGFBP3)、基質衍生因子(SDF-1)拮抗劑(例如抗SDF-1抗體)、色素上皮衍生因子(PEDF)、γ-分泌酶、δ樣配位體4、整合素拮抗劑、缺氧誘導因子(HIF)-1α拮抗劑、蛋白激酶CK2拮抗劑、抑制歸巢至新血管形成位點之幹細胞(例如內皮祖細胞)的藥劑(例如抗血管內皮鈣黏蛋白(CD-144)抗體及/或抗SDF-1抗體)及其組合。
在另一實例中，在一些情況下，本發明之抗體或其抗體結合物、融合蛋白質及/或聚合物調配物可與對新血管形成具有活性之藥劑組合 投與以用於治療眼部病症(例如AMD、DME、DR或RVO)，諸如消炎藥、哺乳動物雷帕黴素標靶(mTOR)抑制劑(例如雷帕黴素、AFINITOR®(癌伏妥(everolimus))及TORISEL®(特癌適(temsirolimus)))、環孢黴素、腫瘤壞死因子(TNF)拮抗劑(例如抗TNFα抗體或其抗原結合片段(例如英利昔單抗(infliximab)、阿達木單抗(adalimumab)、聚乙二醇化賽妥珠單抗(certolizumab pegol)及戈利木單抗(golimumab))或可溶性受體融合蛋白質(例如依那西普))、抗補體劑、非類固醇消炎劑(NSAID)或其組合。
在再另一實例中，在一些情況下，本發明之抗體或其抗體結合物、融合蛋白質及/或聚合物調配物可與具有神經保護性且可潛在地減緩乾性AMD進展至濕性AMD之藥劑組合投與，諸如稱為「神經類固醇」之藥物類別，其包括諸如去氫表雄固酮(DHEA)(商品名：PRASTERATM及FIDELIN®)、硫酸去氫表雄固酮及硫酸孕烯醇酮之藥物。
任何適合之AMD治療劑均可作為額外治療劑與本發明之抗體或其抗體結合物、融合蛋白質及/或聚合物調配物組合投與以用於治療眼部病症(例如AMD、DME、DR或RVO)，包括但不限於VEGF拮抗劑，例如抗VEGF抗體(例如LUCENTIS®(雷珠單抗)、RTH-258(原ESBA-1008，即抗VEGF單鏈抗體片段；Novartis)或雙特異性抗VEGF抗體(例如抗VEGF/抗血管生成素2雙特異性抗體，諸如RG-7716；Roche)、可溶性重組受體融合蛋白質(例如，EYLEA®(阿柏西普))、抗VEGF DARPin®(例如abicipar pegol；Molecular Partners AG/Allergan)或抗VEGF適體(例如MACUGEN®(哌加他尼鈉))；血小板衍生生長因子(PDGF)拮抗劑，例如抗PDGF抗體、抗PDGFR抗體(例如REGN2176-3)、抗PDGF-BB聚乙二醇化適體(例如FOVISTA®；Ophthotech/Novartis)、可溶性PDGFR受體融合蛋白質或雙重PDGF/VEGF拮抗劑(例如小分子抑制劑(例如DE-120(Santen)或X-82(TyrogeneX))或雙特異性抗PDGF/抗VEGF抗體))；VISUDYNE®(維替泊芬)與光動力療法組合；抗氧化劑；補體系統拮抗劑，例如補體因子C5拮抗劑(例如小分子抑制劑(例如ARC-1905；Opthotech)或抗C5抗體(例如LFG-316；Novartis)、備解素拮抗劑(例如抗備解素抗體，例如CLG-561；Alcon)或補體因子D拮抗劑(例如抗補體因子D抗體，例如拉帕珠單抗 (lampalizumab)；Roche))、視覺循環調節劑(例如，鹽酸艾美斯他(emixustat hydrochloride))；角鯊胺(例如OHR-102；Ohr Pharmaceutical)；維生素及礦物補充劑(例如年齡相關性眼病研究1(AREDS1)中所描述之彼等維生素及礦物補充劑(鋅及/或抗氧化劑)及年齡相關性眼病研究2(AREDS2)中所描述之彼等維生素及礦物補充劑(鋅、抗氧化劑、葉黃素、玉米黃素及/或ω3脂肪酸))；基於細胞之療法，例如NT-501(Renexus)；PH-05206388(Pfizer)、huCNS-SC細胞移植(StemCells)、CNTO-2476(Janssen)、OpRegen(Cell Cure Neurosciences)或MA09-hRPE細胞移植(Ocata Therapeutics)；組織因子拮抗劑(例如hI-con1；Iconic Therapeutics)；α-腎上腺素激導性受體促效劑(例如酒石酸溴莫尼定(brimonidine tartrate))；肽疫苗(例如S-646240；Shionogi)；類澱粉β拮抗劑(例如抗β類澱粉單株抗體，例如GSK-933776)；S1P拮抗劑(例如抗S1P抗體，例如iSONEPTM；Lpath Inc)；ROBO4拮抗劑(例如抗ROBO4抗體，例如DS-7080a；Daiichi Sankyo)；表現內皮抑素及血管抑素之慢病毒載體(例如RetinoStat)；及其組合。在一些情況下，AMD治療劑(包括前述AMD治療劑中之任一者)可共調配。舉例而言，抗PDGFR抗體REGN2176-3可與阿柏西普(EYLEA®)共調配。在一些情況下，此種共調配物可與本發明之抗體組合投與。在一些情況下，該眼部病症為AMD(例如濕性AMD)。
本發明之抗體或其抗體結合物、融合蛋白質及/或聚合物調配物可與LUCENTIS®(雷珠單抗)組合投與以用於治療眼部病症(例如AMD、DME、DR或RVO)。LUCENTIS®(雷珠單抗)可例如以0.3mg/眼或0.5mg/眼藉由玻璃體內注射投與，例如每個月一次。在一些情況下，該眼部病症為AMD(例如濕性AMD)。
本發明之抗體或其抗體結合物、融合蛋白質及/或聚合物調配物可與EYLEA®(阿柏西普)組合投與以用於治療眼部病症(例如AMD、DME、DR或RVO)。EYLEA®(阿柏西普)可例如以2mg/眼藉由玻璃體內注射投與，例如每四週一次(Q4W)，或前三個月Q4W隨後每兩個月注射一次以維持。在一些情況下，該眼部病症為AMD(例如濕性AMD)。
本發明之抗體或其抗體結合物、融合蛋白質及/或聚合物調 配物可與MACUGEN®(哌加他尼鈉)組合投與以用於治療眼部病症(例如AMD、DME、DR或RVO)。MACUGEN®(哌加他尼鈉)可例如以0.3mg/眼藉由玻璃體內注射投與，每六週一次。在一些情況下，該眼部病症為AMD(例如濕性AMD)。
本發明之抗體或其抗體結合物、融合蛋白質及/或聚合物調配物可與VISUDYNE®(維替泊芬)組合與光動力療法組合投與以用於治療眼部病症(例如AMD、DME、DR或RVO)。VISUDYNE®可例如以任何適合之劑量(例如6mg/m2體表面積)藉由靜脈內輸注而投與，且每三個月遞送一次(例如經10分鐘輸注)。在一些情況下，該眼部病症為AMD(例如濕性AMD)。
本發明之抗體或其抗體結合物、融合蛋白質及/或聚合物調配物可與PDGF拮抗劑組合投與以用於治療眼部病症(例如AMD、DME、DR或RVO)。可與本發明之抗體組合使用之例示性PDGF拮抗劑包括抗PDGF抗體、抗PDGFR抗體、小分子抑制劑(例如角鯊胺)、抗PDGF-B聚乙二醇化適體諸如FOVISTA®(E10030；Ophthotech/Novautis)或雙重PDGF/VEGF拮抗劑(例如小分子抑制劑(例如DE-120(Santen)或X-82(TyrogeneX))或雙特異性抗PDGF/抗VEGF抗體)。舉例而言，FOVISTA®可作為本發明之抗體的輔助療法投與。FOVISTA®可以任何適合之劑量，例如0.1mg/眼至2.5mg/眼，例如0.3mg/眼或1.5mg/眼，例如藉由玻璃體內注射投與，例如每四週一次(Q4W)。OHR-102(乳酸角鯊胺眼用溶液，0.2%)可藉由滴眼劑投與，例如每日兩次。OHR-102可與諸如LUCENTIS®或EYLEA®之VEGF拮抗劑組合投與。在一些實施例中，本發明之抗體可與OHR-102、LUCENTIS®及/或EYLEA®組合投與。在一些情況下，該眼部病症為AMD(例如濕性AMD)。
本發明之抗體或其抗體結合物、融合蛋白質及/或聚合物調配物可與RTH-258組合投與以用於治療眼部病症(例如AMD、DME、DR或RVO)。RTH-258可例如藉由玻璃體內注射或眼部輸注而投與。對於玻璃體內注射，RTH-258可以任何適合之劑量(例如3mg/眼或6mg/眼)投與，例如前三個月每四週一次(Q4W)作為負載，隨後每12週一次(Q12W)或每八週 一次(Q8W)注射用於維持。在一些情況下，該眼部病症為AMD(例如濕性AMD)。
本發明之抗體或其抗體結合物、融合蛋白質及/或聚合物調配物可與abicipar pegol組合投與以用於治療眼部病症(例如AMD、DME、DR或RVO)。abicipar pegol可例如藉由玻璃體內注射投與。abicipar pegol可以任何適合之劑量(例如1mg/眼、2mg/眼、3mg/眼、4mg/眼或4.2mg/眼)投與，例如前三個月每四週一次(Q4W)作為負載，隨後每12週一次(Q12W)或每八週一次(Q8W)注射用於維持。在一些情況下，該眼部病症為AMD(例如濕性AMD)。
任何適合之DME及/或DR治療劑均可與本發明之抗體或其抗體結合物、融合蛋白質及/或聚合物調配物組合投與以用於治療眼部病症(例如AMD、DME、DR或RVO)，包括但不限於VEGF拮抗劑(例如LUCENTIS®或EYLEA®)、皮質類固醇(例如皮質類固醇植入物(例如OZURDEX®(地塞米松玻璃體內植入物)或ILUVIEN®(丙酮化氟新龍玻璃體內植入物))或經調配以用於藉由玻璃體內注射來投與之皮質類固醇(例如曲安奈德))或其組合。在一些情況下，該眼部病症為DME及/或DR。
本發明之抗體或其抗體結合物、融合蛋白質及/或聚合物調配物可與LUCENTIS®(雷珠單抗)組合投與以用於治療DME及/或DR(例如NPDR或PDR)。LUCENTIS®(雷珠單抗)可例如以0.3mg/眼或0.5mg/眼藉由玻璃體內注射投與，例如每四週一次(Q4W)。
本發明之抗體或其抗體結合物、融合蛋白質及/或聚合物調配物可與EYLEA®(阿柏西普)組合投與以用於治療DME及/或DR(例如NPDR或PDR)。EYLEA®(阿柏西普)可例如以2mg/眼藉由玻璃體內注射來投與，例如每四週一次(Q4W)，或前五個月Q4W，隨後每八週注射一次(Q8W)以維持。
本發明之抗體或其抗體結合物、融合蛋白質及/或聚合物調配物可與OZURDEX®(地塞米松玻璃體內植入物)組合投與以用於治療DME及/或DR。OZURDEX®可作為0.7mg地塞米松玻璃體內植入物投與，其可至多每六個月投與一次。
本發明之抗體或其抗體結合物、融合蛋白質及/或聚合物調配物可與ILUVIEN®(地塞米松玻璃體內植入物)組合投與以用於治療DME及/或DR。OZURDEX®可作為0.19mg丙酮化氟新龍玻璃體內植入物投與，其可以0.25μg/天之速率溶離且可持續多達約36個月。
在一些情況下，TAO/PRN治療方案或TAE治療方案可用於投與AMD治療劑(例如雷珠單抗或阿柏西普)與本發明抗體或其抗體結合物、融合蛋白質及/或聚合物調配物之組合。對於TAO/PRN方案，在每四週一次(Q4W)初始玻璃體內注射(典型持續約3個月)後，每個月或每隔一個月(或以甚至更長之間隔)監測個體，在出現疾病活性(光同調斷層掃瞄(OCT)時視覺敏銳度或流體下降))之證據的情況下投與注射。對於TAE方案，可每四週一次(Q4W)治療個體，隨後將各後續就診之治療間隔延長固定週數(例如+2週)，直至最大間隔(例如每6週、每8週、每10週或每12週)。可在每次就診時觀察並治療眼睛，即使不存在疾病活性之證據。若黃斑部看起來濕潤(例如藉由OCT)，則可縮短注射間隔(例如-2週)，直至黃斑部再次看起來乾燥。在一些情況下，該眼部病症為AMD(例如濕性AMD)。
以上所指出之此種組合療法涵蓋組合投與(其中兩種或更多種治療劑包括在相同或獨立之調配物中)及獨立投與(在此情況下，本發明抗體之投與可在額外治療劑之投與之前、同時及/或之後發生)。在一個實施例中，抗VEGF抗體、抗體結合物、融合蛋白質或聚合物調配物之投與及額外治療劑之投與彼此在約一、二、三、四或五個月內或者在約一、二或三週內或者在約一、二、三、四、五或六天內。本發明之抗體、抗體結合物、融合蛋白質及聚合物調配物亦可與放射療法組合使用。
用於預防或治療眼部疾病或病狀之本發明抗體、抗體結合物、融合蛋白質或聚合物調配物(及任何額外治療劑)可藉由任何適合之方法投與，包括但不限於例如經眼、眼內及/或玻璃體內注射及/或鞏膜旁注射及/或德濃氏囊下注射及/或脈絡膜周隙注射及/或呈滴眼劑及/或軟膏形式之局部投與。本發明之此種抗體、抗體結合物、融合蛋白質或聚合物調配物可藉由多種方法遞送，例如作為允許向玻璃體中緩慢釋放化合物之裝置及/或貯庫經玻璃體內遞送，包括諸如Intraocular Drug Delivery,Jaffe,Jaffe,Ashton 及Pearson編，Taylor & Francis(2006年3月)之參考文獻中所描述的彼等裝置及/或貯庫。在一個實例中，裝置可呈微型泵及/或基質及/或被動擴散系統及/或在較長時段內釋放化合物之囊封細胞形式(Intraocular Drug Delivery,Jaffe,Jaffe,Ashton及Pearson編，Taylor & Francis(2006年3月))。可使用之其他方法描述於以下部分K中。
用於經眼、眼內或玻璃體內投與之調配物可藉由此項技術中已知的方法且使用此項技術中已知的賦形劑來製備。有效治療之重要特徵為適當透過眼睛。不同於可局部遞送藥物之眼前部疾病，視網膜疾病典型地受益於更具位點特異性之方法。滴眼劑及軟膏很少滲透眼後部，且血眼屏障阻礙全身投與之藥物滲入眼組織中。因此，用於治療視網膜疾病(諸如AMD及CNV)之所選藥物遞送方法典型地為直接玻璃體內注射。玻璃體內注射通常以諸多間隔重複，視患者之病狀以及所遞送之藥物的性質及半衰期而定。可使用之其他方法描述於以下部分K中。
在治療特定眼部病症或病狀方面將有效之抗體、其抗體變異體、其抗體結合物、融合蛋白質或聚合物調配物之量將視所治療之病症或病狀之性質而定，且可藉由標準臨床技術來確定。在可能之情況下，需要測定劑量反應曲線，且本發明之醫藥組成物首先用於生體外，接著用於動物模型系統中，隨後於人類中測試。
其他適合投與手段包括非經腸、肺內及鼻內，且若希望用於局部治療，則包括病變內投與。非經腸輸注包括肌肉內、靜脈內、動脈內、腹膜內或皮下投與。投配可藉由任何適合之途徑，例如藉由注射，諸如靜脈內或皮下注射，部分視投與是短暫的或是長期的而定。本文中涵蓋多種投配時程，包括但不限於在不同的時間點單次或多次投與、團注投與及脈衝式輸注。在一些情況下，本發明之抗VEGF抗體、抗體結合物、融合蛋白質或聚合物調配物可經靜脈內、經肌肉內、經真皮內、經皮膚、經動脈內、經腹膜內、經病變內、經顱骨內、經關節內、經前列腺內、經胸膜內、經氣管內、經鞘內、經鼻內、經陰道內、經直腸內、經局部、經腫瘤內、經腹膜內、經腹膜、經心室內、經皮下、經結膜下、經膀胱內、經黏膜、經心包內、經臍靜脈內、經眶內、經口、局部、透皮、藉由吸入、藉由注 射、藉由植入、藉由輸注、藉由連續輸注、藉由直接局部灌注浸浴靶細胞、藉由導管、藉由灌洗、於乳膏中或於脂質組成物中投與。
為了預防或治療疾病，本發明抗體、抗體結合物、融合蛋白質或聚合物調配物之適當劑量(當單獨或與一或多種其他額外治療劑組合使用時)將視所治療之疾病之類型、抗體類型、疾病之嚴重程度及過程、該抗體是出於預防目的或是治療目的而投與、先前療法、患者之臨床病史及對該抗體之反應以及主治醫師之判斷而定。該抗體、抗體結合物、融合蛋白質或聚合物調配物一次性或經一系列治療而適當地投與患者。視疾病之類型及嚴重程度而定，約1μg/kg至15mg/kg(例如0.1mg/kg、0.2mg/kg、0.4mg/kg、0.6mg/kg、0.8mg/kg、1mg/kg、2mg/kg、3mg/kg、4mg/kg、5mg/kg、6mg/kg、7mg/kg、8mg/kg、9mg/kg或10mg/kg)之抗體可為投與患者之初始候選劑量，例如，無論是藉由一或多次單獨投與或是藉由連續輸注。在一些實施例中，所使用之抗體為約0.01mg/kg至約45mg/kg、約0.01mg/kg至約40mg/kg、約0.01mg/kg至約35mg/kg、約0.01mg/kg至約30mg/kg、約0.01mg/kg至約25mg/kg、約0.01mg/kg至約20mg/kg、約0.01mg/kg至約15mg/kg、約0.01mg/kg至約10mg/kg、約0.01mg/kg至約5mg/kg或約0.01mg/kg至約1mg/kg。視以上所提及之因素而定，一個典型日劑量可介於約1μg/kg至100mg/kg或更大之範圍內。對於在若干天或更久時間內重複投與，視病狀而定，該治療一般將持續直至對疾病症狀出現所要抑制。
在一些實施例中，該等方法可進一步包括額外療法。該額外療法可為放射療法、手術、化學療法、基因療法、DNA療法、病毒療法、RNA療法、免疫療法、骨髓移植、奈米療法、單株抗體療法或上述之組合。該額外療法可呈輔助或新輔助療法之形式。在一些實施例中，該額外療法為投與小分子酶抑制劑或抗轉移劑。在一些實施例中，該額外療法為投與副作用限制劑(例如，意欲減輕治療副作用之發生率及/或嚴重程度的藥劑，諸如抗噁心劑等)。在一些實施例中，該額外療法為放射療法。在一些實施例中，該額外療法為手術。在一些實施例中，該額外療法為放射療法與手術之組合。在一些實施例中，該額外療法為γ照射。在一些實施例中，該 額外療法可為單獨投與以上所描述之治療劑中的一或多種。
應理解，以上調配物或治療方法中之任一者均可使用本發明之免疫結合物替代或加上抗VEGF抗體來進行。
應理解，以上調配物或治療方法中之任一者均可使用本發明之抗體結合物、融合蛋白質或聚合物調配物(例如本文中(例如以下部分K中)所描述之任一者)替代或加上抗VEGF抗體來進行。
I. 製品
在本發明之另一態樣中，提供含有適用於治療、預防及/或診斷上述病症之材料的製品。該製品包含容器及處於該容器上或與該容器相關聯之標籤或包裝插頁。適合之容器包括例如瓶、小瓶、注射器、IV溶液袋等。該等容器可由多種材料形成，諸如玻璃或塑膠。該容器容納可有效治療、預防及/或診斷病狀之一組成物自身或該組成物與另一組成物之組合，且可具有無菌進入口(例如，該容器可為靜脈內溶液袋或具有可由皮下注射針刺穿之瓶塞的小瓶)。該組成物中之至少一種活性劑為本發明之抗體。該標籤或包裝插頁指示該組成物用於治療所選病狀。此外，該製品可包含(a)其中含有組成物之第一容器，其中該組成物包含本發明之抗體；及(b)其中含有組成物之第二容器，其中該組成物包含另一細胞毒性劑或其他治療劑。本發明之此實施例中之製品可進一步包含指示該等組成物可用於治療特定病狀之包裝插頁。替代地，或另外，該製品可進一步包括第二(或第三)容器，該容器包含醫藥學上可接受之緩衝劑，諸如抑菌注射用水(BWFI)、磷酸鹽緩衝鹽水、林格氏溶液及右旋糖溶液。其可進一步包括自商業及使用者之立場來看合乎需要之其他材料，包括其他緩衝劑、稀釋劑、過濾器、針及注射器。
應理解，以上製品中之任一者均可包括本發明之免疫結合物來替代或加上抗VEGF抗體。
應理解，以上製品中之任一者均可包括本發明之抗體結合物、融合蛋白質或聚合物調配物來替代或加上抗VEGF抗體。
J. 鑑別抗體變異體及改良抗體之方法
本發明提供改良抗體及鑑別抗體變異體之方法。在一些情況 下，該等方法包括鑑別可賦予增強之抗體與靶分子結合的一或多個胺基酸殘基變化。在一些情況下，該等方法包括鑑別可賦予抗體增強之穩定性(例如熱穩定性)、功能表現及/或蛋白質摺疊的一或多個胺基酸殘基變化。在一些情況下，本發明提供改良抗體與靶分子之結合親和力的方法。在一些情況下，本發明提供改良抗體之穩定性(例如熱穩定性)、功能表現及/或蛋白質摺疊的方法。在一些情況下，本發明提供改良抗體與靶分子之結合親和力及改良抗體之穩定性(例如熱穩定性)的方法。
舉例而言，本發明提供鑑別可賦予增強之抗體與靶分子結合的胺基酸殘基變化的方法，其包括以下步驟中之一或多個(例如1、2或3個)：(a)提供包含編碼候選抗體變異體之核酸的呈現庫，其中各候選抗體變異體與參考抗體相比在VH或VL中包含胺基酸殘基變化，且其中該呈現庫中存在該VH或VL之每個位置上的胺基酸殘基變化；(b)基於該等候選抗體變異體與該靶分子之結合來分選該呈現庫以形成經分選之庫，其中該經分選之庫包括與該參考抗體相比與該靶分子具有增強之結合的候選抗體變異體；及(c)比較如藉由大規模平行定序所測定之各胺基酸殘基變化在該呈現庫中及在該經分選之庫中的存在頻率，從而確定與該呈現庫相比，各胺基酸殘基變化在該經分選之庫中是否得以增濃，藉此，若與該呈現庫相比，該胺基酸殘基變化在該經分選之庫中得以增濃，則將其鑑別為賦予增強之與該靶分子之結合。在一些情況下，該方法進一步包括鑑別可賦予抗體增強之穩定性的胺基酸殘基，例如，如以下所描述。
在另一實例中，本發明提供鑑別賦予抗體增強之穩定性的胺基酸殘基變化的方法，其包括以下步驟中之一或多個(例如1、2或3個)：(a)提供包含編碼候選抗體變異體之核酸的呈現庫，其中各候選抗體變異體與參考抗體相比在VH或VL中包含胺基酸殘基變化，且其中該呈現庫中存在該VH或VL之每個位置上的胺基酸殘基變化；(b)基於該等候選抗體變異體與該靶分子之結合來分選該呈現庫以形成經分選之庫，其中該經分選之庫包括與該參考抗體相比具有增強之穩定性的候選抗體變異體；及(c)比較如藉由大規模平行定序所測定之各胺基酸殘基變化在該呈現庫中及在該經分選之庫中的存在頻率，從而確定與該呈現庫相比，各胺基酸殘基變化 在該經分選之庫中是否得以增濃，藉此，若與該呈現庫相比，該胺基酸殘基變化在該經分選之庫中得以增濃，則將其鑑別為賦予該抗體增強之穩定性。在一些情況下，該方法進一步包括鑑別可賦予增強之抗體與靶分子結合的胺基酸殘基，例如，如以上所描述。
前述方法中之任一者均可進一步包括在步驟(b)之後藉由大規模平行定序來測定各胺基酸變化在該呈現庫及該經分選之庫中的存在頻率。
在一些情況下，與呈現庫相比，在經分選之庫中，胺基酸殘基變化可增濃至少2倍。舉例而言，與呈現庫相比，在經分選之庫中，胺基酸殘基變化可增濃1.25倍、1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、14倍、16倍或更多。
呈現庫可包括任何適合數目之抗體變異體，例如約1×103至約1×1012或更多(例如，約1×103、約1×104、約1×105、約1×106、約1×107、約1.5×107、約2.5×107、約1×108、約5×108、約1×109、約5×109、約1×1010、約1×1011、約1×1012或更多)個抗體變異體。在一些實施例中，該呈現庫可包括約3×109個抗體變異體。在其他實施例中，該呈現庫可包括約8×108個抗體變異體。
在前述方法中之任一者中，胺基酸殘基變化可由任何適合之密碼子集編碼。舉例而言，在一些情況下，該胺基酸殘基變化係由簡併密碼子集編碼。所選胺基酸取代至模板核酸中之方法在此項技術中為確立的，其中一些描述於本文中。參見美國專利第7,985,840號，該專利以全文引用之方式併入本文中。舉例而言，如以上或以下實例部分中所描述之庫可使用Kunkel方法藉由用變異胺基酸進行胺基酸取代來創建。參見例如Kunkel等人，Methods Enzymol.154：367-382,1987。
胺基酸殘基變化可由任何適合之密碼子集編碼。密碼子集為用於編碼所要變異胺基酸之一組不同的核苷酸三連體序列。可使用指定特定核苷酸或核苷酸之等莫耳混合物的符號來表示密碼子集，如以下根據IUB代碼所示。
IUB化碼
G鳥嘌呤
A腺嘌呤
T胸嘧礎
C胞嘧啶
R(A或G)
Y(C或T)
M(A或C)
K(G或T)
S(C或G)
W(A或T)
H(A或C或T)
B(C或G或T)
V(A或C或G)
D(A或G或T)
N(A或C或G或T)
作為一說明性實例，在密碼子集DVK中，D可為核苷酸A或G或T；V可為A或G或C；且K可為G或T。此密碼子集可提供18個不同的密碼子且可編碼胺基酸Ala、Trp、Tyr、Lys、Thr、Asn、Ser、Arg、Asp、Glu、Gly及Cys。
可使用標準方法合成寡核苷酸或引子集。可例如藉由固相合成來合成含有表示密碼子集合所提供之核苷酸三連體之所有可能組合而且將編碼所要胺基酸群組的序列的一組寡核苷酸。利用某些位置上之所選核苷酸「簡併」來合成寡核苷酸在此項技術中為熟知的。此種具有某些密碼子集之核苷酸集可使用市售核酸合成器(可獲自例如Applied Biosystems，Foster City，Calif.)來合成，或可獲自市面(例如，得自Life Technologies，Rockville，Md.)。因此，所合成之具有特定密碼子集之寡核苷酸集典型地將包括具有不同的序列的多種寡核苷酸，不同之處由整個序列內之密碼子集確定。如根據本發明使用之寡核苷酸具有允許與可變域核酸模板雜交之序列，且亦可包括適用於例如選殖目的之限制酶位點。
在前述方法中之任一者中，簡併密碼子集可用於編碼胺基酸殘基變化。在一些情況下，該簡併密碼子集為NNK或NNS密碼子集，其中N為A、C、G或T；K為G或T；且S為C或G。在特定情況下，該簡併密碼子集為NNK密碼子集。
應理解，此項技術中已知的或本文中所描述的任何適合之呈現方法均可與前述方法中之任一者聯合使用。舉例而言，該等方法可包括噬菌體呈現、細菌呈現、酵母呈現、哺乳動物呈現、核糖體呈現及/或mRNA呈現。在前述方法中之任一者中，可使用任何適合之呈現庫。舉例而言，該呈現庫可選自由以下各項組成之群：噬菌體呈現庫、細菌呈現庫、酵母呈現庫、哺乳動物呈現庫、核糖體呈現庫及mRNA呈現庫。在特定實施例中，該呈現庫為噬菌體呈現庫。
可將抗體可變域之融合多肽以多種形式呈現於細胞、病毒、噬菌體質體或其他粒子之表面上。此等形式包括例如此等片段之scFv、Fab及多價形式。該等多價形式可為ScFv、Fab或Fab'之二聚物，在本文中分別稱為(ScFv)2、Fab2及F(ab')2。用於在噬菌體表面上呈現包含抗體片段之融合多肽的方法在此項技術中為熟知的，例如，如專利公開案第WO 92/01047號及本文中所描述。其他專利公開案，例如WO 92/20791、WO 93/06213、WO 93/11236及WO 93/19172描述相關方法。其他公開案已顯示針對噬菌體表面上所呈現之多種抗原鑑別具有人工重排V基因譜系之抗體(參見例如Hoogenboom等人，J.Mol.Biol.227：381-388,1992；且如WO 93/06213及WO 93/11236中所揭示)。
在前述方法中之任一者中，可對呈現庫進行分選(選擇)及/或篩選以鑑別例如抗原之高親和力結合劑。可如本文中所描述或藉由此項技術中已知的其他方法來進行分選。參見例如美國專利7,985,840。在一些實施例中，分選可包括使呈現庫與經固定之抗原(例如靶分子或其抗原決定基)接觸。在其他實施例中，分選可包括使呈現庫與可溶性抗原接觸。可進一步篩選已選擇之抗體變異體以便在結合親和力(例如藉由SPR)、穩定性、摺疊、結構(例如，藉由X射線結晶學)或其他屬性方面表徵抗體變異體。
前述方法中之任一者均可包括大規模平行定序，例如，以確 定胺基酸殘基變化在分選後之庫(稱為經分選之庫)中出現之頻率，與該胺基酸殘基變化在未分選庫中出現之頻率相比較。用於大規模平行定序之多種方法為此項技術中已知的，且任何適合之方法均可用於本發明之方法中。參見例如Metzker,Nature Reviews Genetics 11：31-36,2010，該文獻以全文引用之方式併入本文中。例示性方法包括大規模平行標記定序(MPSS)、聚合酶選殖定序、焦磷酸定序(454/Roche Diagnostics)、離子半導體定序、單分子即時定序、邊合成邊定序、邊連結邊定序。市售大規模平行定序平臺可購自Roche Diagnostics及其他公司。定序可為深度定序、超深度定序及/或下一代定序。
在前述方法中之任一者中，該方法可包括測定具有至少約100,000個讀數或更多(例如，100,000個讀數、200,000個讀數、300,000個讀數、400,000個讀數、500,000個讀數、600,000個讀數、700,000個讀數、800,000個讀數、900,000個讀數、1,000,000個讀數、2×106個讀數、3×106個讀數、4×106個讀數、5×106個讀數、6×106個讀數、7×106個讀數、8×106個讀數、9×106個讀數、107個讀數、108個讀數、109個讀數或1010個讀數或更多)之序列。該方法可包括在任何適合之深度下定序。
在前述方法中之任一者中，該抗體可為單株抗體。在前述方法中之任一者中，該抗體可為IgG抗體。在前述方法中之任一者中，該抗體可為抗體片段。該抗體片段可選自由以下各項組成之群：Fab、scFv、Fv、Fab'、Fab-C、Fab'-SH、F(ab')2及雙功能抗體。在特定情況下，該抗體片段為Fab。
在前述方法中之任一者中，該雙重特異性抗體可為單株抗體。在前述方法中之任一者中，該雙重特異性抗體可為IgG抗體。在前述方法中之任一者中，該雙重特異性抗體可為抗體片段。該抗體片段可選自由以下各項組成之群：Fab、scFv、Fv、Fab-C、Fab'、Fab'-SH、F(ab')2及雙功能抗體。在特定情況下，該抗體片段為Fab。
前述方法中之任一者可進一步包括產生已藉由該方法之步驟鑑別之抗體。以上所描述之方法可用於本文中所描述之任何抗體。
K. 抗VEGF抗體之眼部長效遞送方法
本發明提供用於治療眼部病症之組成物，其可用於向眼長效遞送抗VEGF抗體(包括本文中所描述之任何抗VEGF抗體，諸如G6.31 AARR)。舉例而言，本發明提供包括本文中所描述之抗VEGF抗體的抗體結合物(例如Fab或Fab-C抗體結合物)。本發明亦提供融合蛋白質(例如Fab融合蛋白質)。在其他態樣中，本發明提供包括本文中所描述之抗VEGF抗體的調配物(例如聚合物調配物)。本發明亦提供可用於眼部投與本文中所描述之抗VEGF抗體的裝置。本發明進一步提供包括本文中所描述之抗體結合物、融合蛋白質及/或調配物(例如聚合物調配物)的醫藥組成物。此等組成物可用於本文中所描述之任何治療方法，例如，治療眼部病症(例如AMD(例如濕性AMD)、DME、DR(例如NPDR或PDR)或RVO(例如CRVO或BRVO))之方法中。
1. 抗體結合物
本發明提供包括抗VEGF抗體及與該抗體共價連接之聚合物的抗體結合物。抗VEGF抗體可以不可逆方式或可逆方式與該聚合物共價連接。可使用任何適合之聚合物，包括本文中所描述之彼等聚合物或此項技術中已知的其他聚合物。該聚合物可為親水性聚合物或疏水性聚合物。應理解，親水性聚合物可為水溶性聚合物。任何適合之親水性聚合物均可使用，例如，以下文獻中所描述之親水性聚合物：國際專利申請公開案第WO 2011/066417號；及/或Pelegri-O'Day等人，J.Am.Chem.Soc.136：14323-14332,2014，該等文獻以全文引用之方式併入本文中。可使用之例示性非限制性親水性聚合物包括透明質酸(HA)、聚乙二醇(PEG；亦稱為聚(乙二醇))(例如直鏈PEG、分枝PEG、梳狀PEG及樹枝狀PEG)、聚[(環氧乙烷)-(亞甲基環氧乙烷)共聚物]、聚(聚(乙二醇)甲醚甲基丙烯酸酯)(pPEGMA)、瓊脂糖、海藻酸鹽、角叉菜膠、羧甲基纖維素、纖維素、纖維素衍生物、殼聚糖、硫酸軟骨素、膠原蛋白、硫酸皮膚素、聚葡萄糖、硫酸聚葡萄糖、纖維蛋白、纖維蛋白原、纖維接合素、岩藻多糖、明膠、糖胺聚糖(GAG)、糖基聚合物、肝素、硫酸肝素、高度分枝聚糖(例如半乳糖樹枝狀聚合物)、硫酸角質素、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、聚(N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺)(pHPMA)、果膠、果膠衍生物、戊聚糖聚硫酸 酯、澱粉、羥乙基澱粉(HES)、苯乙烯、玻璃體結合蛋白、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚(丙烯醯胺)、聚(丙烯酸)、聚(胺)、聚(胺基酸)、聚(羧基甜菜鹼)(PCB)、聚電解質、聚(麩胺酸)(PGA)、聚(甘油)(PG)(例如線性中官能超分枝或線性超分枝PG)、聚(馬來酸)、聚(2-噁唑啉)(POZ)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、聚唾液酸(PSA)、聚苯乙烯、聚苯乙烯衍生物(例如，帶電聚苯乙烯衍生物)、聚(苯乙烯磺酸-PEGMA)共聚物、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、聚(N-丙烯醯基嗎啉)(pNAcM)及其共聚物。在一些情況下，該聚合物為疏水性聚合物，例如聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚丙交酯(PLA)及聚乙交酯(PGA)。該聚合物可為生物可降解的及/或生物相容的。
舉例而言，該聚合物可包括任何適合數目之單體，例如介於2與約1×104個之間的單體(例如約10、約50、100、約200、約300、約400、約500、約600、約700、約800、約900、約1000、約2000、約3000、約4000、約5000、約6000、約7000、約8000、約9000或約1×104個單體)或更多。舉例而言，該聚合物可包括介於約50與約250個之間的單體、介於約50與約500個之間的單體、介於約50與約1000個之間的單體、介於約50與約2000個之間的單體、介於約50與約3000個之間的單體、介於約50與約4000個之間的單體、介於約50與約5000個之間的單體、介於約50與約6000個之間的單體、介於約50與約7000個之間的單體、介於約50與約8000個之間的單體、介於約50與約9000個之間的單體、介於約50與約10000個之間的單體、介於約100與約250個之間的單體、介於約100與約500個之間的單體、介於約100與約1000個之間的單體、介於約100與約2000個之間的單體、介於約100與約3000個之間的單體、介於約100與約4000個之間的單體、介於約100與約5000個之間的單體、介於約100與約6000個之間的單體、介於約100與約7000個之間的單體、介於約100與約8000個之間的單體、介於約100與約9000個之間的單體、介於約100與約10000個之間的單體、介於約250與約500個之間的單體、介於約250與約1000個之間的單體、介於約250與約2000個之間的單體、介於約250與約3000個之間的單體、介於約250與約4000個之間的單體、介於約250與約5000個之間的單體、介於約250與約6000個之間的單體、 介於約250與約7000個之間的單體、介於約250與約8000個之間的單體、介於約250與約9000個之間的單體、介於約250與約10000個之間的單體、介於約500與約1000個之間的單體、介於約500與約2000個之間的單體、介於約500與約3000個之間的單體、介於約500與約4000個之間的單體、介於約500與約5000個之間的單體、介於約500與約6000個之間的單體、介於約500與約7000個之間的單體、介於約500與約8000個之間的單體、介於約500與約9000個之間的單體或介於約500與約10000個之間的單體。在一些情況下，該聚合物可包括約500個單體。
本發明提供一種抗體結合物，其包括與HA聚合物共價連接之抗VEGF抗體(例如本文中所描述之抗VEGF抗體，諸如G6.31 AARR)。此種抗體結合物在本文中有時稱為「HA結合物」。在一些情況下，該HA聚合物具有約2.5兆道爾頓(MDa)或更低(例如約2.5MDa或更低、約2.4MDa或更低、約2.3MDa或更低、約2.2.MDa或更低、約2.1MDa或更低、約2.0MDa或更低、約1.9MDa或更低、約1.8MDa或更低、約1.7MDa或更低、約1.6MDa或更低、約1.5MDa或更低、約1.4MDa或更低、約1.3MDa或更低、約1.2MDa或更低、約1.1MDa或更低、約1.0MDa或更低、約900kDa或更低、約800kDa或更低、約700kDa或更低、約600kDa或更低、約500kDa或更低、約400kDa或更低、約300kDa或更低、約200kDa或更低或者約100kDa或更低)之分子量。在一些情況下，該HA聚合物具有約1MDa或更低(例如約1.0MDa或更低、約900kDa或更低、約800kDa或更低、約700kDa或更低、約600kDa或更低、約500kDa或更低、約400kDa或更低、約300kDa或更低、約200kDa或更低或者約100kDa或更低)之分子量。在一些情況下，該HA聚合物具有介於約25kDa與約2.5MDa之間(例如介於約25kDa與約2.5mDa之間、介於約25kDa與約2MDa之間、介於約25kDa與約1.5MDa之間、介於約25kDa與約1MDa之間、介於約25kDa與約900kDa之間、介於約25kDa與約800kDa之間、介於約25kDa與約700kDa之間、介於約25kDa與約600kDa之間、介於約25kDa與約500kDa之間、介於約100kDa與約2.5mDa之間、介於約100kDa與約2MDa之間、介於約100kDa與約1.5MDa之間、介於 約100kDa與約1MDa之間、介於約100kDa與約900kDa之間、介於約100kDa與約800kDa之間、介於約100kDa與約700kDa之間、介於約100kDa與約600kDa之間、介於約100kDa與約500kDa之間、介於約250kDa與約2.5MDa之間、介於約250kDa與約2MDa之間、介於約250kDa與約1.5MDa之間、介於約250kDa與約1MDa之間、介於約250kDa與約900kDa之間、介於約250kDa與約800kDa之間、介於約250kDa與約700kDa之間、介於約250kDa與約600kDa之間、介於約250kDa與約500kDa之間、介於約500kDa與約2.5MDa之間、介於約500kDa與約2MDa之間、介於約500kDa與約1.5MDa之間、介於約500kDa與約1MDa之間、介於約500kDa與約900kDa之間、介於約500kDa與約800kDa之間、介於約500kDa與約700kDa之間、介於約500kDa與約600kDa之間、介於約1MDa與約2.5MDa之間、介於約1MDa與約2MDa之間、介於約1MDa與約1.5MDa之間、介於約1MDa與約1.25MDa之間、介於約1.25MDa與約2.5MDa之間、介於約1.25MDa與約2MDa之間、介於約1.25MDa與約1.5MDa之間、介於約1.5MdDa與約2.5MDa之間、介於約1.5MDa與約2MDa之間、介於約1.5MDa與約1.75MDa之間或介於1.75MDa與約2.5MDa之間)的分子量。
在一些情況下，該HA聚合物具有介於約25kDa與約500kDa之間的分子量(例如介於約25kDa與約500kDa之間、介於約25kDa與約450kDa之間、介於約25kDa與約400kDa之間、介於約25kDa與約350kDa之間、介於約25kDa與約300kDa之間、介於約25kDa與約300kDa之間、介於約25kDa與約250kDa之間、介於約25kDa與約200kDa之間、介於約25kDa與約150kDa之間、介於約25kDa與約100kDa之間、介於約25kDa與約50kDa之間、介於約40kDa與約500kDa之間、介於約40kDa與約450kDa之間、介於約40kDa與約400kDa之間、介於約40kDa與約350kDa之間、介於約40kDa與約300kDa之間、介於約40kDa與約300kDa之間、介於約40kDa與約250kDa之間、介於約40kDa與約200kDa之間、介於約40kDa與約150kDa之間、介於約40kDa與約100kDa之間、介於約40kDa與約50kDa之間、介於約50kDa與約500kDa之間、介於 約50kDa與約450kDa之間、介於約50kDa與約400kDa之間、介於約50kDa與約350kDa之間、介於約50kDa與約300kDa之間、介於約50kDa與約300kDa之間、介於約50kDa與約250kDa之間、介於約50kDa與約200kDa之間、介於約50kDa與約150kDa之間、介於約50kDa與約100kDa之間、介於約50kDa與約75kDa之間、介於約100kDa與約500kDa之間、介於約100kDa與約450kDa之間、介於約100kDa與約400kDa之間、介於約100kDa與約350kDa之間、介於約100kDa與約300kDa之間、介於約100kDa與約300kDa之間、介於約100kDa與約250kDa之間、介於約100kDa與約200kDa之間、介於約100kDa與約150kDa之間、介於約150kDa與約500kDa之間、介於約150kDa與約450kDa之間、介於約150kDa與約400kDa之間、介於約150kDa與約350kDa之間、介於約150kDa與約300kDa之間、介於約150kDa與約300kDa之間、介於約150kDa與約250kDa之間、介於約150kDa與約200kDa之間、介於約175kDa與約500kDa之間、介於約175kDa與約450kDa之間、介於約175kDa與約400kDa之間、介於約175kDa與約350kDa之間、介於約175kDa與約300kDa之間、介於約175kDa與約300kDa之間、介於175 200kDa與約250kDa之間、介於約175kDa與約225kDa之間、介於約200kDa與約500kDa之間、介於約200kDa與約450kDa之間、介於約200kDa與約400kDa之間、介於約200kDa與約350kDa之間、介於約200kDa與約300kDa之間、介於約200kDa與約300kDa之間、介於約200kDa與約250kDa之間或介於約200kDa與約225kDa之間)。
在一些情況下，該HA聚合物具有介於約100kDa與約250kDa之間的分子量(例如約100kDa、約110kDa、約120kDa、約130kDa、約140kDa、約150kDa、約160kDa、約170kDa、約180kDa、約190kDa、約200kDa、約210kDa、約220kDa、約230kDa、約240kDa或約250kDa)。在特定情況下，該HA聚合物具有約200kDa之分子量。
前述分子量中之任一者均可為重量平均分子量(亦稱為重量平均莫耳質量)。
在一些情況下，前述HA聚合物中之任一者均為線性的，亦 即，未交聯。
在其他情況下，本發明提供一種抗體結合物，其包括與PEG聚合物共價連接之抗VEGF抗體(例如本文中所描述之抗VEGF抗體)。此種抗體結合物在本文中有時稱為「PEG結合物」。可使用任何適合之PEG聚合物。PEG可為分枝PEG、星形PEG或梳形PEG。PEG聚合物可為例如PEG四聚物、PEG六聚物或PEG八聚物。在一些情況下，該抗體結合物包括與PEG樹枝狀聚合物共價連接之抗VEGF抗體(例如本文中所描述之抗VEGF抗體，諸如G6.31 AARR)。PEG聚合物可購自例如JenKem Technology、Quanta BioDesign、NOF America Corporation及其他供應商。
在一些情況下，該PEG聚合物具有介於約1kDa與約500kDa之間的分子量(例如介於約1kDa與約500kDa之間、介於約1kDa與約450kDa之間、介於約1kDa與約400kDa之間、介於約1kDa與約350kDa之間、介於約1kDa與約300kDa之間、介於約1kDa與約300kDa之間、介於約1kDa與約250kDa之間、介於約1kDa與約200kDa之間、介於約1kDa與約150kDa之間、介於約1kDa與約100kDa之間、介於約1kDa與約50kDa之間、介於約10kDa與約500kDa之間、介於約10kDa與約450kDa之間、介於約10kDa與約400kDa之間、介於約10kDa與約350kDa之間、介於約10kDa與約300kDa之間、介於約10kDa與約300kDa之間、介於約10kDa與約250kDa之間、介於約10kDa與約200kDa之間、介於約10kDa與約150kDa之間、介於約10kDa與約100kDa之間、介於約10kDa與約50kDa之間、介於約20kDa與約500kDa之間、介於約20kDa與約450kDa之間、介於約20kDa與約400kDa之間、介於約20kDa與約350kDa之間、介於約20kDa與約300kDa之間、介於約20kDa與約300kDa之間、介於約20kDa與約250kDa之間、介於約20kDa與約200kDa之間、介於約20kDa與約150kDa之間、介於約20kDa與約100kDa之間、介於約20kDa與約75kDa之間、介於約30kDa與約500kDa之間、介於約30kDa與約450kDa之間、介於約30kDa與約400kDa之間、介於約30kDa與約350kDa之間、介於約30kDa與約300kDa之間、介於約30kDa與約300kDa之間、介於約30kDa與約250kDa之間、介於約30kDa與約 200kDa之間、介於約30kDa與約150kDa之間、介於約40kDa與約500kDa之間、介於約40kDa與約450kDa之間、介於約40kDa與約400kDa之間、介於約40kDa與約350kDa之間、介於約40kDa與約300kDa之間、介於約40kDa與約300kDa之間、介於約40kDa與約250kDa之間、介於約40kDa與約200kDa之間、介於約50kDa與約500kDa之間、介於約50kDa與約450kDa之間、介於約50kDa與約400kDa之間、介於約50kDa與約350kDa之間、介於約50kDa與約300kDa之間、介於約50kDa與約300kDa之間、介於50 200kDa與約250kDa之間或介於約50kDa與約225kDa之間)。
在一些情況下，該PEG聚合物具有介於約5kDa與約250kDa之間(例如約1kDa、約5kDa、約10kDa、約15kDa、約20kDa、約25kDa、約30kDa、約35kDa、約40kDa、約50kDa、約60kDa、約70kDa、約80kDa、約90kDa,100kDa、約110kDa、約120kDa、約130kDa、約140kDa、約150kDa、約160kDa、約170kDa、約180kDa、約190kDa、約200kDa、約210kDa、約220kDa、約230kDa、約240kDa或約250kDa)的分子量。在特定情況下，該PEG聚合物具有約20kDa之分子量。在其他情況下，該PEG聚合物具有約40kDa之分子量。
前述分子量中之任一者均可為重量平均分子量(亦稱為重量平均莫耳質量)。
在一些情況下，該PEG聚合物為PEG四聚物。PEG四聚物可購自例如NOF America SUNBRIGHT® PTE-400MA、PTE-200MA、PTE-100MA及JenKem Technology USA 4臂PEG馬來醯亞胺(目錄號4ARM-MAL)。在一些情況下，該PEG四聚物具有新戊四醇核心。舉例而言，在一些情況下，該PEG四聚物包括式(I)之結構，其中n獨立地為任何適合之整數：
式I：
Figure 105130888-A0202-12-0139-5
在另一實例中，在一些情況下，該PEG聚合物為PEG六聚物。PEG六聚物可購自市面，例如JenKem Technology USA 6臂PEG胺(目錄號6ARM(DP)-NH2HCl)或得自於Quanta BioDesign之PEG六聚物。在一些情況下，該PEG六聚物包括二新戊四醇核心。
在一些情況下，該PEG聚合物為PEG八聚物。PEG八聚物可購自市面，例如NOF America SUNBRIGHT® HGEO系列或JenKem Technology USA 8臂PEG馬來醯亞胺(目錄號8ARM(TP)-MAL)。在一些情況下，該PEG八聚物可包括三新戊四醇核心。舉例而言，在一些情況下，該PEG八聚物包括式(II)之結構，其中n獨立地為任何適合之整數：
式II：
Figure 105130888-A0202-12-0139-6
在又另一實例中，在一些情況下，該PEG八聚物包括三新 戊四醇核心。
應理解，任何適合之結合方法，包括本文中所描述之彼等方法及此項技術中已知的其他方法，均可用於使本發明之抗VEGF抗體與聚合物結合。舉例而言，該聚合物可與任何適合之蛋白質官能基(包括一級胺基、羧基、巰基或羰基)結合。任何適合之化學反應性基團均可用於靶向蛋白質官能基，例如碳化二亞胺(例如EDC)、NHS酯、醯亞胺酯、五氟苯基酯、羥甲基膦、馬來醯亞胺、鹵乙醯基(例如溴乙醯基或碘乙醯基)、吡啶基二硫化物、硫代硫酸酯、乙烯基碸、肼、烷氧基胺、二氮環丙烯、芳基疊氮化物、異氰酸酯或此項技術中已知的其他基團。參見例如Hermanson,Bioconjugate Techniques，第3版，2013。
前述抗體結合物中之任一者均可具有介於約5nm與約200nm之間(例如約5nm、約10nm、約20nm、約30nm、約40nm、約50nm、約60nm、約70nm、約80nm、約90nm、約100nm、約110nm、約120nm、約130nm、約140nm、約150nm、約160nm、約170nm、約180nm、約190nm或約200nm)的流體動力學半徑。在一些情況下，該抗體結合物具有介於約5nm與約150nm之間(例如約5nm、約10nm、約20nm、約30nm、約40nm、約50nm、約60nm、約70nm、約80nm、約90nm、約100nm、約110nm、約120nm、約130nm、約140nm或約150nm)的流體動力學半徑。在一些情況下，該抗體結合物具有介於約5nm與約100nm之間(例如約5nm、約10nm、約20nm、約30nm、約40nm、約50nm、約60nm、約70nm、約80nm、約90nm或約100nm)的流體動力學半徑。在一些情況下，該抗體結合物具有介於約5nm與約60nm之間(例如約5nm、約10nm、約20nm、約30nm、約40nm、約50nm或約60nm)的流體動力學半徑。在一些情況下，該抗體結合物具有介於約25nm與約35nm之間(例如約25nm、約26nm、約27nm、約28nm、約29nm、約30nm、約31nm、約32nm、約33nm、約34nm或約35nm)的流體動力學半徑。在一些情況下，該流體動力學半徑為約28nm。
在一些情況下，該抗體結合物具有介於約10nm與約200nm之間、介於約10nm與約180nm之間、介於約10nm與約160nm之間、 介於約10nm與約140nm之間、介於約10nm與約120nm之間、介於約10nm與約100nm之間、介於約10nm與約80nm之間、介於約10nm與約60nm之間、介於約10nm與約50nm之間、介於約10nm與約40nm之間、介於約10nm與約30nm之間、介於約20nm與約200nm之間、介於約20nm與約180nm之間、介於約20nm與約160nm之間、介於約20nm與約140nm之間、介於約20nm與約120nm之間、介於約20nm與約100nm之間、介於約20nm與約80nm之間、介於約20nm與約60nm之間、介於約20nm與約50nm之間、介於約20nm與約40nm之間、介於約20nm與約30nm之間、介於約30nm與約200nm之間、介於約30nm與約180nm之間、介於約30nm與約160nm之間、介於約30nm與約140nm之間、介於約30nm與約120nm之間、介於約30nm與約100nm之間、介於約30nm與約80nm之間、介於約30nm與約60nm之間、介於約30nm與約50nm之間、介於約30nm與約40nm之間、介於約40nm與約200nm之間、介於約40nm與約180nm之間、介於約40nm與約160nm之間、介於約40nm與約140nm之間、介於約40nm與約120nm之間、介於約40nm與約100nm之間、介於約40nm與約80nm之間、介於約40nm與約60nm之間、介於約40nm與約50nm之間、介於約50nm與約200nm之間、介於約50nm與約180nm之間、介於約50nm與約160nm之間、介於約50nm與約140nm之間、介於約50nm與約120nm之間、介於約50nm與約100nm之間、介於約50nm與約80nm之間、介於約50nm與約60nm之間、介於約60nm與約200nm之間、介於約60nm與約180nm之間、介於約60nm與約160nm之間、介於約60nm與約140nm之間、介於約60nm與約120nm之間、介於約60nm與約100nm之間或介於約60nm與約80nm之間的流體動力學半徑。
在一些情況下，該抗體結合物為前藥抗體結合物(亦稱為載體連接之前藥)，其中舉例而言，抗VEGF抗體(例如本文中所描述之抗VEGF抗體，例如G6.31 AARR)經由連接子(例如可逆前藥連接子)與載體(例如水凝膠)可逆結合。此方法進一步描述於例如國際專利申請公開案第WO 2006/003014號、第WO 2009/095479號、第WO 2011/012715號、第WO 2013/053856號及第WO 2014/056923號中，各案以全文引用之方式併入本文中。此種前藥抗體結合物可購自Ascendis Pharma(例如TransCon技術平臺)。該連接子可具有固有自我裂解性質(例如該連接子可在投與眼中後發生非酶促水解)，從而在眼(例如玻璃體)中進行抗VEGF抗體之時間控制釋放。
舉例而言，在一些情況下，本發明提供一種前藥抗體結合物，其包括藉由連接子與載體共價連接之抗VEGF抗體(例如本文中所描述之抗VEGF抗體，例如G6.31 AARR)。在特定情況下，該連接子為可逆前藥連接子。在一些情況下，該載體包括聚合物，例如PEG。舉例而言，該PEG可為線性、分枝、多臂或樹枝狀PEG。在一些情況下，該載體為水凝膠，包括生物可降解水凝膠。可使用任何適合之水凝膠，例如基於PEG之水凝膠。基於PEG之水凝膠可包括例如至少10% PEG、至少20% PEG、至少30% PEG或更多。該水凝膠可呈微粒狀珠粒形狀。此種微粒狀珠粒可具有約1μm至約1000μm，例如約5μm至約500μm、約10μm至約100μm、約20μm至約100μm或約20μm至約80μm之直徑。當微粒狀珠粒懸浮於等張水性緩衝液中時，可量測珠粒直徑。在一些情況下，該水凝膠可為WO 2006/003014或WO 2011/012715中所揭示之任何水凝膠。
在前述抗體結合物中之任一者中，該抗體可為結合VEGF之抗體片段，例如本文中所描述之結合VEGF之抗VEGF抗體的抗體片段。在一些情況下，該抗體片段選自由以下各項組成之群：Fab、Fab'、Fab-C、Fab'-SH、Fv、scFv及(Fab')2片段。在特定情況下，該抗體片段為Fab、Fab'或Fab-C。在一些情況下，該抗體片段為Fab-C。
前述抗體結合物中之任一者均可具有相對於與聚合物(例如親水性聚合物)非共價連接之參考抗體有所增加之眼部半衰期。在一些情況下，相對於該參考抗體，該眼部半衰期增加至少約2倍(例如，約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約12倍、約14倍、約16倍、約18倍、約20倍或更多)。在一些情況下，該眼部半衰期相對於該參考抗體增加至少約4倍。在一些情況下，該眼部半衰期為玻璃體半衰期。在一些情況下，該參考抗體與該抗體結合物之該抗體一致。在其他情況下，該參考抗體與該抗體結合物之抗體不一致。
前述抗體結合物中之任一者均可具有相對於與聚合物(例如親水性聚合物)非共價連接之參考抗體有所降低之眼部清除率。在一些情況下，相對於該參考抗體，該清除率降低至少約2倍(例如，約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約12倍、約14倍、約16倍、約18倍、約20倍或更多)。在一些情況下，相對於該參考抗體，該清除率降低至少約4倍。在一些情況下，該清除率為自玻璃體之清除率。在一些情況下，該參考抗體與該抗體結合物之該抗體一致。在其他情況下，該參考抗體與該抗體結合物之抗體不一致。
在一些情況下，介於前述抗體結合物(例如HA結合物、PEG結合物及前藥抗體結合物)中之任一者的兩次眼內投藥(例如，藉由玻璃體內注射)之間的時段為至少1個月，例如至少1個月、至少5週、至少6週、至少7週、至少8週、至少9週、至少10週、至少11週、至少12週、至少13週、至少14週、至少15週、至少16週、至少20週、至少24週、至少28週、至少32週、至少36週、至少40週、至少44週、至少48週、至少52週或更久。在一些情況下，介於兩次眼內投藥之間的最大時段不超過四年，例如不超過三年、不超過兩年或不超過一年。該抗體結合物可例如每二至十二個月，例如每四至十個月投與。在一些情況下，該抗體結合物係每六個月投與。
本發明亦提供包括以上所描述之抗體結合物(例如HA結合物、PEG結合物及前藥抗體結合物)中之任一者的組成物(例如醫藥組成物)。在某些實施例中，該組成物包含一或多種額外化合物。在某些實施例中，該額外化合物結合選自由以下各項組成之群的第二生物分子：IL-1β；IL-6；IL-6R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體；ST-2受體；及與年齡相關性黃斑變性(AMD)風險基因相關之蛋白質，諸如補體途徑組分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；介白素-8(IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；及TNFRSF10A。在某些實施例中，該額外化合物為抗體或其抗原結合片段。舉例而言，在一些情況下， 該額外化合物為雙特異性抗體(例如抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體，諸如RG-7716或者WO 2010/069532或WO 2016/073157中所揭示之任何雙特異性抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體)或其變異體。在另一實例中，在一些情況下，該額外化合物為抗IL-6抗體，例如EBI-031(Eleven Biotherapeutics；參見例如WO 2016/073890)、司妥昔單抗(SYLVANT®)、奧洛珠單抗、克萊紮珠單抗、司魯庫單抗、艾西莫單抗、戈利珠單抗、OPR-003、MEDI-5117、PF-04236921或其變異體。在再另一實例中，在一些情況下，該額外化合物為抗IL-6R抗體，例如，托珠單抗(ACTEMRA®)(參見例如WO 1992/019579)、賽利魯單抗、沃巴利珠單抗(ALX-0061)、SA-237或其變異體。
本發明進一步提供包括以上所描述之抗體結合物(例如HA結合物、PEG結合物及前藥抗體結合物)中之任一者及額外VEGF拮抗劑的組成物(例如醫藥組成物)。
2. 融合蛋白質
本發明提供包括抗VEGF抗體(例如本文中所描述之任何抗VEGF抗體，例如，G6.31 AARR)及眼部結合域之融合蛋白質。該眼部結合域可結合例如眼(例如角膜、玻璃體、視網膜、視網膜色素上皮或脈絡膜)中所發現之生物學物質，由此可增加該抗體之眼部(例如玻璃體)滯留時間(舉例而言，藉由增加半衰期及/或降低清除率)。該眼部結合域可結合任何適合之生物學物質，包括例如細胞外基質組分。舉例而言，適合之眼(例如玻璃體)中生物學物質可包括細胞外基質組分，諸如碳水化合物(例如帶電碳水化合物(例如糖胺聚糖))、糖蛋白(例如原纖維蛋白及旋光蛋白)或蛋白質(例如膠原蛋白(例如I至XXVII型膠原蛋白，尤其膠原蛋白II、膠原蛋白IX、膠原蛋白V、膠原蛋白VI、膠原蛋白XI及其異型膠原蛋白纖維)或例如Le Goff等人，Eye 22：1214-1222,2008中所描述之其他細胞外基質組分。在一些情況下，細胞外基質組分為糖胺聚糖，例如透明質酸(HA)或蛋白聚糖(例如硫酸軟骨素或硫酸肝素)。在特定情況下，該糖胺聚糖為HA。HA結合域以及包括HA結合域之融合蛋白質描述於例如以下文獻中：Park等人，Molecular Pharmaceutics 6(3)：801-812,2009；美國專利第5,986,052號、第 7,183,377號、第7,723,472號及第8,846,034號；美國專利申請公開案第2004/005277號；及國際專利申請案第WO 1998/052590號、第WO 2010/045506號、第WO 2014/099997號、第WO 2015/198243號、第WO 2015/110809號，該等文獻以全文引用之方式併入本文中。該眼部結合域可例如藉由與該抗VEGF抗體重組融合而與該抗體共價連接。在其他情況下，該眼部結合域可與該抗VEGF抗體共價結合或非共價結合(例如，藉由生物素-鏈酶親和素鍵聯)。
舉例而言，本發明提供一種融合蛋白質，其包括與HA結合域共價連接之抗VEGF抗體(例如本文中所描述之任何抗VEGF抗體，諸如G6.31 AARR)。在一些情況下，該HA結合域與該抗體之重鏈或輕鏈共價連接。舉例而言，該HA結合域與該重鏈共價連接。在另一實例中，該HA結合域與該輕鏈共價連接。該HA結合域可在任何適合之位點，例如N末端、C末端或內部位點(例如插入)與該抗VEGF抗體共價連接。該HA結合域可與該重鏈之C末端或該輕鏈之C末端共價連接。舉例而言，在一些情況下，該HA結合域與該重鏈之該C末端共價連接。在其他情況下，該HA結合域與該輕鏈之該C末端共價連接。
在前述融合蛋白質中之任一者中，該融合蛋白質可進一步包括連接子，該連接子位於該抗體與該HA結合域之間。可使用任何適合之連接子，例如(Glyn-Sern)n或(Sern-Glyn)n連接子，其中n獨立地為等於或大於1之整數(例如1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13或更大)。WO 2014/099997描述許多連接子，其中任一者均可用於本發明之融合蛋白質中。在一些情況下，連接子可包括胺基酸序列GGGGS(SEQ ID NO：61)。在一些情況下，連接子可由胺基酸序列GGGGS(SEQ ID NO：61)組成。其他適合之連接子包括包括(Gly4Ser)4、(Gly4Ser)3及其類似物。在一些情況下，絲胺酸可經丙胺酸置換(例如(Gly4Ala)或(Gly3Ala))。
在前述融合蛋白質中之任一者中，該抗體可為結合VEGF之抗體片段。在一些情況下，該抗體片段選自由以下各項組成之群：Fab、Fab'、Fab-C、Fab'-SH、Fv、scFv及(Fab')2片段。舉例而言，在一些情況下，該抗體片段為Fab、Fab'或Fab-C。在一些情況下，該HA結合域與該Fab 之CH1域之C末端共價連接。在其他情況下，該HA結合蛋白質與該Fab之CL域之C末端共價連接。
在前述融合蛋白質中之任一者中，該HA結合域可選自由以下各項組成之群：連接模組、G1域、富離胺酸寡肽及此項技術中已知的其他HA結合域。舉例而言，該HA結合域可為以下文獻中所描述之任何HA結合域：Park等人，Molecular Pharmaceutics 6(3)：801-812,2009；美國專利第5,986,052號、第7,183,377號、第7,723,472號及第8,846,034號；美國專利申請公開案第2004/005277號；及/或國際專利申請案第WO 1998/052590號、第WO 2010/045506號、第WO 2014/099997號、第WO 2015/198243號、第WO 2015/110809號。舉例而言，該HA結合域可為如WO 2014/099997中所描述之HA10、HA10.1、HA10.2、HA11或HA11.1。
在一些情況下，該HA結合域為連接模組。可使用任何適合之連接模組。舉例而言，在一些情況下，該連接模組選自由以下各項組成之群：TSG6、CD44、淋巴管內皮透明質酸受體1(LYVE-1)、透明質酸及蛋白聚糖連接蛋白(HAPLN)1、HAPLN2、HAPLN3、HAPLN4、聚集蛋白聚糖、短小蛋白聚糖、神經蛋白聚糖、磷酸蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、CAB61358、KIA0527、穩定素-1及穩定素-2連接模組或其變異體。在一些情況下，該連接模組為TSG6連接模組，例如人類TSG6連接模組。在一些情況下，該HA結合蛋白TSG6之連接模組可包括人類TSG6(UniProt登錄號P98066)之胺基酸殘基36-128。
前述融合蛋白質中之任一者可進一步包括至少一個額外HA結合域。舉例而言，該融合蛋白質可進一步包括至少1、2、3、4、5、6、7或8個額外HA結合域。在一些情況下，該至少一個額外HA結合域共價連接於該抗體之重鏈或輕鏈。舉例而言，在一些情況下，該至少一個額外HA結合域與該抗體之重鏈共價連接。在其他情況下，該至少一個額外HA結合域與該抗體之輕鏈共價連接。在一些情況下，該至少一個額外HA結合蛋白質藉由連接子而連接於該抗體。可使用任何適合之連接子，諸如以上所描述之連接子。在一些情況下，該連接子包括胺基酸序列GGGGS(SEQ ID NO：61)。在一些情況下，該連接子由胺基酸序列GGGGS(SEQ ID NO：61)組成。在一些情況下，第一HA結合域與該重鏈共價連接，且第二HA結合域與該輕鏈共價連接。該至少一個額外HA結合域可在任何適合之位點，例如N末端、C末端或內部位點(例如插入)與該抗VEGF抗體共價連接。在該抗體在抗體中包括多於一個額外HA結合域的情況下，該等插入可處於該抗體中之單一位點或處於該抗體中之多個不同的位點。舉例而言，在一些情況下，該第一HA結合域連接於該重鏈之C末端且該第二HA結合域連接於該輕鏈之C末端。在一些情況下，該至少一個額外HA結合蛋白質選自由以下各項組成之群：連接模組、G1域及富離胺酸寡肽。舉例而言，在一些情況下，該至少一個額外HA結合蛋白質為連接模組。該連接模組可為本文中所描述或此項技術中已知的任何連接模組。在一些情況下，該連接模組為TSG6連接模組，例如人類TSG6連接模組。在一些情況下，該HA結合蛋白TSG6之連接模組可包括人類TSG6(UniProt登錄號P98066)之胺基酸殘基36-128。
前述融合蛋白質中之任一者可特異性結合VEGF及HA。在一些情況下，該融合蛋白質以約10μM或更低之Kd結合HA。舉例而言，在一些情況下，該融合蛋白質以約10μM或更低、8μM或更低、6μM或更低、4μM或更低、2μM或更低、1μM或更低、750nM或更低、500nM或更低、250nM或更低、100nM或更低、50nM或更低、10nm或更低或者1nm或更低之Kd結合HA。在一些情況下，該融合蛋白質以約2nM或更低之Kd結合HA。在一些情況下，該融合蛋白質以介於約1nM與約2μM之間，例如介於約1nM與約1.8μM之間、介於約1nM與約1.6μM之間、介於約1nM與約1.4μM之間、介於約1nM與約1.2μM之間、介於約1nM與約1.0μM之間、介於約1nM與約900nM之間、介於約1nM與約800nM之間、介於約1nM與約700nM之間、介於約1nM與約600nM之間、介於約1nM與約500nM之間、介於約1nM與約400nM之間、介於約1nM與約300nM之間、介於約1nM與約200nM之間、介於約1nM與約100nM之間、介於約1nM與約50nM之間、介於約1nM與約40nM之間、介於約1nM與約30nM之間、介於約1nM與約20nM之間、介於約1nM與約10nM之間、介於約5nM與約100nM之間、介於約5nM與約50nM 之間、介於約5nM與約25nM之間、介於約5nM與約15nM之間或介於約5nM與約10nM之間的Kd結合HA。在一些情況下，該融合蛋白質以約10nM之Kd結合HA。
前述融合蛋白質中之任一者可具有相對於與HA結合域非共價連接之參考抗體有所增加之眼部半衰期。在一些情況下，相對於該參考抗體，該眼部半衰期增加至少約2倍(例如，約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約12倍、約14倍、約16倍、約18倍、約20倍或更多)。在一些情況下，該眼部半衰期相對於該參考抗體增加至少約4倍。在一些情況下，該眼部半衰期為玻璃體半衰期。在一些情況下，該參考抗體與該融合蛋白質之該抗體一致。在其他情況下，該參考抗體與該融合蛋白質之抗體不一致。
前述融合蛋白質中之任一者可具有相對於與HA結合域非共價連接之參考抗體有所降低之眼部清除率。在一些情況下，相對於該參考抗體，該清除率降低至少約2倍(例如，約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約12倍、約14倍、約16倍、約18倍、約20倍或更多)。在一些情況下，相對於該參考抗體，該清除率降低至少約4倍。在一些情況下，該清除率為自玻璃體之清除率。在一些情況下，該參考抗體與該融合蛋白質之該抗體一致。在其他情況下，該參考抗體與該融合蛋白質之抗體不一致。
在一些情況下，介於前述融合蛋白質中之任一者的兩次眼內投藥(例如，藉由玻璃體內注射)之間的時段為至少1個月，例如至少1個月、至少5週、至少6週、至少7週、至少8週、至少9週、至少10週、至少11週、至少12週、至少13週、至少14週、至少15週、至少16週、至少20週、至少24週、至少28週、至少32週、至少36週、至少40週、至少44週、至少48週、至少52週或更久。在一些情況下，介於兩次眼內投藥之間的最大時段不超過四年，例如不超過三年、不超過兩年或不超過一年。該融合蛋白質可例如每二至十二個月，例如每四至十個月投與。在一些情況下，該融合蛋白質係每六個月投與。
本發明亦提供包括以上所描述之融合蛋白質中之任一者的 組成物(例如，醫藥組成物)。在某些實施例中，該組成物包含一或多種額外化合物。在某些實施例中，該額外化合物結合選自由以下各項組成之群的第二生物分子：IL-1β；IL-6；IL-6R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體；ST-2受體；及與AMD風險基因相關之蛋白質，諸如補體途徑組分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；及TNFRSF10A。在某些實施例中，該額外化合物為抗體或其抗原結合片段。舉例而言，在一些情況下，該額外化合物為雙特異性抗體(例如抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體，諸如RG-7716或者WO 2010/069532或WO 2016/073157中所揭示之任何雙特異性抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體)或其變異體。在另一實例中，在一些情況下，該額外化合物為抗IL-6抗體，例如EBI-031(Eleven Biotherapeutics；參見例如WO 2016/073890)、司妥昔單抗(SYLVANT®)、奧洛珠單抗、克萊紮珠單抗、司魯庫單抗、艾西莫單抗、戈利珠單抗、OPR-003、MEDI-5117、PF-04236921或其變異體。在再另一實例中，在一些情況下，該額外化合物為抗IL-6R抗體，例如，托珠單抗(ACTEMRA®)(參見例如WO 1992/019579)、賽利魯單抗、沃巴利珠單抗(ALX-0061)、SA-237或其變異體。
本發明亦提供包括以上所描述之融合蛋白質中之任一者及額外VEGF拮抗劑的組成物(例如，醫藥組成物)。
3. 聚合物調配物
本發明提供包括本發明之抗VEGF抗體及聚合物的調配物。該聚合調配物可為例如微球體、植入物、水凝膠、有機凝膠、奈米組合件、微胞、原位形成貯庫或此項技術中已知的另一類型聚合物調配物。任何適合之聚合物均可用於本發明之聚合物調配物中。舉例而言，該聚合物可為親水性聚合物或疏水性聚合物。應理解，親水性聚合物可為水溶性聚合物。任何適合之親水性聚合物均可使用，例如，以下文獻中所描述之親水性聚合物：國際專利申請公開案第WO 2011/066417號；或 Pelegri-O’Day等人，J.Am.Chem.Soc.136：14323-14332,2014。在其他情況下，舉例而言，可使用疏水性聚合物。該聚合物可為生物可降解的及/或生物相容的。
可使用之例示性非限制性親水性聚合物包括透明質酸(HA)、聚乙二醇(PEG；亦稱為聚(乙二醇))(例如直鏈PEG、分枝PEG、梳狀PEG及樹枝狀PEG)、聚[(環氧乙烷)-(亞甲基環氧乙烷)共聚物]、聚(聚(乙二醇)甲醚甲基丙烯酸酯)(pPEGMA)、瓊脂糖、海藻酸鹽、角叉菜膠、羧甲基纖維素、纖維素、纖維素衍生物、殼聚糖、硫酸軟骨素、膠原蛋白、硫酸皮膚素、聚葡萄糖、硫酸聚葡萄糖、纖維蛋白、纖維蛋白原、纖維接合素、岩藻多糖、明膠、糖胺聚糖(GAG)、糖基聚合物、肝素、硫酸肝素、高度分枝聚糖(例如半乳糖樹枝狀聚合物)、硫酸角質素、甲基纖維素、羥丙基甲基纖維素(HPMC)、聚(N-(2-羥丙基)甲基丙烯醯胺)(pHPMA)、果膠、果膠衍生物、戊聚糖聚硫酸酯、澱粉、羥乙基澱粉(HES)、苯乙烯、玻璃體結合蛋白、聚(丙烯酸)、聚(甲基丙烯酸)、聚(丙烯醯胺)、聚(丙烯酸)、聚(胺)、聚(胺基酸)、聚(羧基甜菜鹼)(PCB)、聚電解質、聚(麩胺酸)(PGA)、聚(甘油)(PG)(例如線性中官能超分枝或線性超分枝PG)、聚(馬來酸)、聚(2-噁唑啉)(POZ)、聚(2-乙基-2-噁唑啉)、聚唾液酸(PSA)、聚苯乙烯、聚苯乙烯衍生物(例如，帶電聚苯乙烯衍生物)、聚(苯乙烯磺酸-PEGMA)共聚物、聚乙烯吡咯啶酮(PVP)、聚(N-丙烯醯基嗎啉)(pNAcM)及其共聚物。在其他情況下，可使用任何適合之疏水性聚合物，包括例如聚(乳酸-乙醇酸)共聚物(PLGA)、聚丙交酯(PLA)及聚乙交酯(PGA)。
本發明提供調配為聚合物溶劑貯庫(亦稱為原位形成植入物)之抗VEGF抗體。舉例而言，聚合物溶劑貯庫可包括聚合物(例如本文中所描述之聚合物中之任一者，例如疏水性聚合物，諸如PLGA)、溶劑(例如有機溶劑)及抗VEGF抗體(例如本文中所描述之任何抗VEGF抗體)。該溶劑可具有低水混溶性。可使用之例示性有機溶劑包括三醋酸甘油酯(乙酸甘油酯)、N-甲基-2-吡咯啶酮、聚(乙二醇)二甲醚及苯甲酸乙酯。在一個工作例中，可藉由將抗VEGF抗體(例如本文中所描述之任何抗VEGF抗體，例如G6.31 AARR)之噴霧乾燥粉末分散在PLGA-三醋酸甘油酯溶液內來製備聚 合物溶劑貯庫(參見例如Chang等人，J.Pharm.Sci.104(10)：3404-17,2015，該文獻以全文引用之方式併入本文中)。該PLGA可具有例如約10kDa、約41kDa或約56kDa之分子量。PLGA聚合物可購自市面，例如RG 752S、RG755S及RG 756S(Evonik Industries，Darmstadt，Germany)。PLGA濃度可為約7.5%、約10%、約12.5%、約15%、約20%或更高(wt%)。抗體濃度可為約1%、約1.5%、約2%、約2.5%、約3%、約4%、約5%或更高(wt%)。在一些情況下，抗體濃度為約1.5%(wt%)。聚合物溶劑貯庫調配物中之任一者均可為可注射的，例如藉由27號(27G)針。在投與(例如藉由注射(例如玻璃體內注射))後，此種聚合物溶劑貯庫調配物可在眼中轉化成凝膠或固體貯庫。該凝膠或固體貯庫可由於水相與非水相之反混合而形成。部分視針對水相之溶劑轉移速率而定，所注射之貯庫可由於聚合物沈澱及物理俘獲抗VEGF抗體(及任何額外治療劑或化合物)而向固體或凝膠材料過渡。在其他情況下，舉例而言，可使用原位交聯或原位固化有機凝膠來形成凝膠或固體貯庫。聚合物溶劑貯庫可允許長期遞送，例如在約30天內或更久，例如約30天、約40天、約50天、約60天、約70天、約80天、約90天、約100天、約110天、約120天、約130天或更久。在一些情況下，該聚合物溶劑貯庫可允許在眼中長期遞送達約80天。
本發明亦提供一種調配為聚合物微胞之抗VEGF抗體(例如本文中所描述之任何抗VEGF抗體)。可例如藉由聚合物(例如兩親性嵌段(例如二嵌段或多嵌段)共聚物)自組裝至具有疏水性核心及親水性殼體之奈米粒子中來形成聚合物微胞。聚合物微胞可具有任何適合之直徑(例如平均直徑)，例如約1nm至約1000nm(例如約1nm、約10nm、約100nm、約200nm、約300nm、約400nm、約500nm、約600nm、約700nm、約800nm、約900nm、約1000nm)或更大之直徑。在一些情況下，聚合物微胞可具有約5nm至約100nm(例如約5、約10、約20、約30、約40、約50、約60、約70、約80、約90或約100nm)之直徑(例如平均直徑)。可使用任何適合之聚合物，包括例如兩親性嵌段共聚物，諸如聚(環氧丙烷)(PPO)、聚(D,L-乳酸)(PDLLA)、聚(ε-己內酯)(PCL)、聚(L-天冬胺酸)及泊洛沙姆(例如，聚(環氧乙烷)嵌段-聚(環氧丙烷)嵌段-聚(環氧乙烷)共聚物(例如 PLURONICS®))。其他兩親性嵌段共聚物為此項技術中已知的。在一些情況下，該抗VEGF抗體可例如藉由與該聚合物共價連接而連接於該聚合物微胞之親水性殼體。因此，在一些情況下，以上所描述之抗體結合物可用於製備包括抗VEGF抗體之聚合物微胞。
本發明亦提供一種調配為聚合物植入物之抗VEGF抗體(例如本文中所描述之任何抗VEGF抗體，例如G6.31 AARR)。聚合物植入物為剛性物體，其中固體藥物調配物(例如抗體)均勻分佈在疏水性聚合物(例如PLGA)內。聚合物植入物典型地具有毫米級尺寸(例如0.1mm、0.2mm、0.3mm、0.4mm、0.5mm、0.6mm、0.7mm、0.8mm、0.9mm、1mm、1.1mm、1.2mm、1.3mm、1.4mm、1.5mm、1.6mm、1.7mm、1.8mm、1.9mm、2mm、2.1mm、2.2mm、2.3mm、2.5mm、3mm、4mm、5mm、6mm、7mm、8mm、9mm、10mm、11mm、12mm、13mm、14mm、15mm、16mm、17mm、18mm、19mm、20mm或更大)。聚合物植入物可例如使用適合之裝置藉由手術程序(例如微手術)或藉由注射(例如藉由玻璃體內注射)而投與眼睛。該聚合物植入物可經調配以用於投與眼中任何適合之位點，例如玻璃體、眼前房或眼後房，或者眼中之視網膜內、視網膜下、脈絡膜內、脈絡膜上、鞏膜、結膜下、角膜內或角膜上位點。在特定情況下，該聚合物植入物經調配以投與玻璃體。
包括抗VEGF抗體(例如本文中所描述之任何抗VEGF抗體，例如G6.31 AARR)之聚合物植入物可使用熱熔體擠出(HME)方法來製備。施加熱以熔融(流體化)該聚合物，接著可施加機械剪切力以摻合併微混配流體聚合物相內之固體藥物調配物。接著，可將藥物-聚合物混合物通過毫米尺寸模(例如圓形模)擠出。當允許擠出物冷卻(例如至室溫)時，其形成可切至任何所要長度之棒體(例如圓柱形棒體)。在一些情況下，該聚合物植入物可為包括抗VEGF抗體及PLGA之PLGA棒體。可用於本發明內容中之聚合物植入物描述於例如以下文獻中：Rajagopal等人，J.Pharmaceutical Sciences 102(8)：2655-2666,2013；及國際專利申請公開案第WO 2006/093758號，該等文獻以全文引用之方式併入本文中。
在一個工作例中，可將抗VEGF抗體(例如本文中所描述之 任何抗VEGF抗體)製備為噴霧乾燥調配物，該調配物可包括海藻糖及組胺酸鹽酸緩衝劑以達成高溫下穩定性，接著可將其添加至諸如PLGA之疏水性聚合物中且進行HME以形成聚合物植入物(參見例如Rajagopal等人，同上)。舉例而言，該噴霧乾燥調配物可包括處於任何適合之濃度下的抗體(例如1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、8mg/mL、9mg/mL、10mg/mL、11mg/mL、12mg/mL、13mg/mL、14mg/mL、15mg/mL、16mg/mL、20mg/mL、25mg/mL、30mg/mL)、處於任何適合之濃度下的海藻糖(例如1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、3.3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL、6mg/mL、7mg/mL、10mg/mL)及/或緩衝液(例如10mM組胺酸鹽酸)。該噴霧乾燥調配物可具有任何適合之pH值，例如，約介於約5與約8之間(例如約5、約6、約7或約8)的pH值。在一些情況下，該噴霧乾燥調配物可具有約6或約6.2之pH值。在特定情況下，該噴霧乾燥調配物包括抗VEGF抗體、3.3mg/mL海藻糖及10mM組胺酸HCl，pH 6.2。可藉由對該噴霧乾燥調配物與諸如PLGA之疏水性聚合物進行HME來製備該聚合物植入物。舉例而言，可在室溫下預混合固體PLGA球粒及該噴霧乾燥調配物且饋入圓錐形相對旋轉雙螺桿擠出機中。可對該組合進行微混配，隨後在100℃下通過0.5mm圓形模擠出。在一些情況下，該噴霧乾燥調配物暴露於100℃持續少於30min。
該聚合物植入物可含有例如以重量計約1%至約90%抗VEGF抗體(例如以重量計約1%、約5%、約10%、約20%、約30%、約40%、約50%、約60%、約70%、約80%或約90%)。在一些情況下，該聚合物植入物包括以重量計約10%抗VEGF抗體。該聚合物植入物可具有任何適合之尺寸，舉例而言，在一些情況下，該植入物具有約0.1至約1mm(例如約0.5mm)之直徑及約1至約30mm(例如約14mm)之長度。對於PLGA植入物(例如PLGA棒體)，PLGA共聚物中之聚乳酸之百分比可為0至100%，例如，約15%至85%、約35%至65%或50%。在一些情況下，PLGA植入物(例如PLGA棒體)可進一步包括一或多種額外聚合物，例如羥丙基甲基纖維素(HPMC)。
在前述聚合物調配物(例如聚合物溶劑貯庫、聚合物微胞及 聚合物植入物)中之任一者中，該抗體可為結合VEGF之抗體片段。在一些情況下，該抗體片段選自由以下各項組成之群：Fab、Fab'、Fab-C、Fab'-SH、Fv、scFv及(Fab')2片段。舉例而言，在一些情況下，該抗體片段為Fab、Fab'或Fab-C。
前述聚合物調配物(例如聚合物溶劑貯庫、聚合物微胞及聚合物植入物)中之任一者均可具有相對於未調配為聚合物調配物之參考抗體有所增加之眼部半衰期。在一些情況下，相對於該參考抗體，該眼部半衰期增加至少約2倍(例如，約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約12倍、約14倍、約16倍、約18倍、約20倍或更多)。在一些情況下，該眼部半衰期相對於該參考抗體增加至少約4倍。在一些情況下，該眼部半衰期為玻璃體半衰期。在一些情況下，該參考抗體與該聚合物調配物之抗體一致。在其他情況下，該參考抗體與該聚合物調配物之抗體不一致。
前述聚合物調配物(例如聚合物溶劑貯庫、聚合物微胞及聚合物植入物)中之任一者均可具有相對於未調配為聚合物調配物之參考抗體有所降低之眼部清除率。在一些情況下，相對於該參考抗體，該清除率降低至少約2倍(例如，約2倍、約3倍、約4倍、約5倍、約6倍、約7倍、約8倍、約9倍、約10倍、約12倍、約14倍、約16倍、約18倍、約20倍或更多)。在一些情況下，相對於該參考抗體，該清除率降低至少約4倍。在一些情況下，該清除率為自玻璃體之清除率。在一些情況下，該參考抗體與該聚合物調配物之抗體一致。在其他情況下，該參考抗體與該聚合物調配物之抗體不一致。
在一些情況下，介於前述聚合物調配物中之任一者的兩次眼內投藥(例如，藉由玻璃體內注射)之間的時段為至少1個月，例如至少1個月、至少5週、至少6週、至少7週、至少8週、至少9週、至少10週、至少11週、至少12週、至少13週、至少14週、至少15週、至少16週、至少20週、至少24週、至少28週、至少32週、至少36週、至少40週、至少44週、至少48週、至少52週或更久。在一些情況下，介於兩次眼內投藥之間的最大時段不超過四年，例如不超過三年、不超過兩年或不超過 一年。該聚合物調配物可例如每二至十二個月，例如每四至十個月投與。在一些情況下，該聚合物調配物係每六個月投與。
本發明亦提供包括以上所描述之聚合物調配物(例如聚合物溶劑貯庫、聚合物微胞及聚合物植入物)中之任一者的組成物(例如醫藥組成物)。在某些實施例中，該組成物包含一或多種額外化合物。在某些實施例中，該額外化合物結合選自由以下各項組成之群的第二生物分子：IL-1β、IL-6；IL-6R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體；ST-2受體；及與AMD風險基因相關之蛋白質，諸如補體途徑組分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；及TNFRSF10A。在某些實施例中，該額外化合物為抗體或其抗原結合片段。舉例而言，在一些情況下，該額外化合物為雙特異性抗體(例如抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體，諸如RG-7716或者WO 2010/069532或WO 2016/073157中所揭示之任何雙特異性抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體)或其變異體。在另一實例中，在一些情況下，該額外化合物為抗IL-6抗體，例如EBI-031(Eleven Biotherapeutics；參見例如WO 2016/073890)、司妥昔單抗(SYLVANT®)、奧洛珠單抗、克萊紮珠單抗、司魯庫單抗、艾西莫單抗、戈利珠單抗、OPR-003、MEDI-5117、PF-04236921或其變異體。在再另一實例中，在一些情況下，該額外化合物為抗IL-6R抗體，例如，托珠單抗(ACTEMRA®)(參見例如WO 1992/019579)、賽利魯單抗、沃巴利珠單抗(ALX-0061)、SA-237或其變異體。
本發明亦提供包括以上所描述之聚合物調配物(例如聚合物溶劑貯庫、聚合物微胞及聚合物植入物)中之任一者及額外VEGF拮抗劑的組成物(例如醫藥組成物)。
4. 裝置
本文中所描述之任何組成物(例如抗VEGF抗體、抗體結合物、融合蛋白質及聚合物調配物)均可使用孔口式遞送裝置投與眼部。孔口式遞送裝置為可植入式可再填充式裝置，其可在數月(例如1、2、3、4、5、 6、7、8、9、10、11、12或更多個月)之時段內釋放治療劑(例如抗VEGF抗體)。可使用之例示性孔口式遞送裝置包括得自於ForSight Labs、LLC及/或ForSight VISION4之彼等裝置，例如，如國際專利申請公開案第WO 2010/088548號、第WO2015/085234號、第WO 2013/116061號、第WO 2012/019176號、第WO 2013/040247號及第WO 2012/019047號中所描述，各案以全文引用之方式併入本文中。
舉例而言，本發明提供包括含有本文中所描述之任何組成物(例如抗VEGF抗體、抗體結合物、融合蛋白質及聚合物調配物)之儲存器的孔口式遞送裝置。該孔口式遞送裝置可進一步包括近端區域、與該近端區域偶聯且與該儲存器流體連通之管狀體及一或多個與該儲存器流體連通且經配置以便向眼中釋放該組成物之出口。該管狀體可具有經配置以便經由眼中約0.5mm或更小之切口或開口插入的外徑。該裝置可為約1mm至約15mm長(例如約1mm、約2mm、約4mm、約5mm、約6mm、約7mm、約9mm、約11mm、約13mm或約15mm長)。該儲存器可具有任何適合之體積。在一些情況下，該儲存器具有約1μl至約100μl(例如約1μl、約5μl、約10μl、約20μl、約50μl、約75μl或約100μl)之體積。該裝置或其組成部分可由任何適合之材料，例如聚醯亞胺製造。
在一些情況下，該孔口式遞送裝置包括含有本文中所描述之任何組成物(例如抗VEGF抗體、抗體結合物、融合蛋白質及聚合物調配物)及一或多種額外化合物之儲存器。在某些實施例中，該額外化合物結合選自由以下各項組成之群的第二生物分子：IL-1β；IL-6；IL-6R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體；ST-2受體；及與AMD風險基因相關之蛋白質，諸如補體途徑組分C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC；COL10A1；及TNFRSF10A。在某些實施例中，該額外化合物為抗體或其抗原結合片段。舉例而言，在一些情況下，該額外化合物為雙特異性抗體(例如抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體，諸如RG-7716或者WO 2010/069532或WO 2016/073157中所揭示之任何雙特異性抗VEGF/抗Ang2雙特異性抗體)或其變異體。在另一實例中，在一些情況下，該額外化合物為抗IL-6抗體，例如EBI-031(Eleven Biotherapeutics；參見例如WO 2016/073890)、司妥昔單抗(SYLVANT®)、奧洛珠單抗、克萊紮珠單抗、司魯庫單抗、艾西莫單抗、戈利珠單抗、OPR-003、MEDI-5117、PF-04236921或其變異體。在再另一實例中，在一些情況下，該額外化合物為抗IL-6R抗體，例如，托珠單抗(ACTEMRA®)(參見例如WO 1992/019579)、賽利魯單抗、沃巴利珠單抗(ALX-0061)、SA-237或其變異體。
在一些情況下，該孔口式遞送裝置包括本文中所描述之任何組成物(例如抗VEGF抗體、抗體結合物、融合蛋白質及聚合物調配物)及額外VEGF拮抗劑。
III. 實例
以下為本發明之方法及組成物之實例。應理解，鑑於以上所提供之一般性描述，可實施各種其他實施例。
實例1：G6.31之深度掃描突變誘發可鑑別對於穩定組裝Fab之組裝而言重要之位置
G6.31為高親和力抗VEGF抗體(Fuh等人，J.Biol.Chem.281(10)：6625-6631(2006)；Liang等人，J.Biol.Chem.281(2)：951-961(2006))。G6.31被視為代表人類抗體，因為其重鏈及輕鏈可變域分別為常用人類生殖系IGHV3-23及IGKV1-39起源。
為了系統性評定單一突變在G6.31之VH及VL域中的效應，針對各可變域(VL位置2-107及VH位置2-113，根據Kabat編號方案)產生飽和單位點突變誘發庫。此等庫分別稱為VH及VL NNK走查庫。在深度突變掃描實驗中使用此等庫允許在選擇期間計算兩個庫中之各突變之增濃比(ER)，從而充當突變對分子適合度之影響的評定。特定突變之ER聚集多種效應，包括突變對功能表現之影響、突變對摺疊穩定性之影響及突變對與所選蛋白質(例如抗gD(與輕鏈C末端融合之肽標籤)、蛋白A、蛋白L或VEGF)之結合的影響。
為了評定各突變對Fab之功能表現及摺疊穩定性的影響，分 別針對抗gD、蛋白A或蛋白L淘選VH及VL庫。此等淘選策略偵測Fab分子是否呈現於噬菌體上且在一定程度上偵測其是否適當摺疊及組裝。三次淘選中之每一者均分別測定重鏈庫及輕鏈庫之2331及2226個胺基酸取代(包括終止)及指定位置上之個別野生型胺基酸的ER(圖1A至圖1F)。三種重鏈淘選策略或三種輕鏈淘選之比較顯示獲得非常類似之結果(圖2A至圖2B)。舉例而言，ER顯示抗gD與蛋白L淘選之間的良好線性關係(r2=0.98)(圖2A)。蛋白A淘選資料集與蛋白L淘選資料集之間的比較顯示較低線性相關性(r2=0.611)，此可歸因於對蛋白A結合具有直接影響之突變子集且因此歸因於兩種選擇中之差異性增濃。對輕鏈觀測到類似模式(圖2B)。
在鑑別會影響Fab之功能表現及穩定性之位置的一種方法中，確定在選擇期間保守且不耐受突變之位置。使用獲自抗gD淘選之資料集作為代表性掃描，針對各位置計算指定位置上之所有突變之平均增濃比(ERpos)作為保守度量(圖3A至圖3B)。在VH及VL域中，由β鏈B與F之間的半胱胺酸對(HC-C22、HC-C93；LC-C23、LC-88)以及相鄰色胺酸殘基(HC-W36、LC-W35)組成的中心核心殘基高度保守(圖3A至圖3D)。免疫球蛋白摺疊之疏水性核心描述於例如Halaby等人，Protein Engineering 12(7)：563-571,1999中。與中心核心相鄰處為位於該分子之下半部中(當該Fab經取向以使得HVR面向上時)的數個疏水性殘基，其為延伸疏水性核心之一部分。其為保守的但所顯示之ERpos值小於中心核心殘基。此等胺基中有酪胺酸(HC-Y90、HC-86)，先前已證明其對Ig摺疊之穩定性非常重要(參見例如Hamill等人，J.Mol.Biol.295(3)：641-649(2000))。第三組保守殘基位於VH/VL界面上(HC-L45、HC-Y91、HC-W103、LC-P44、LC-Y36、LC-Y96)。VH/VL界面殘基不僅在利用間接選擇之淘選中(例如得自於蛋白L淘選之VH資料)而且在利用直接選擇之淘選中(例如得自於蛋白A淘選之VH資料)為保守的，表明所提及界面位置上之突變導致組裝Fab具有降低之穩定性。第四組保守殘基(HC-E46、HC-R38、HC-D86、LC-R61、LC-D82)包括Fab下半部之氫鍵網狀結構中對穩定性非常重要之殘基。尤其，α1-螺旋中之天冬胺酸殘基屬於該等位置，其顯示該資料集中之最高保存之一。先前已顯示位置LC-R61及LC-D82上之突變誘導原纖維形成且誘導輕鏈中之聚集 (參見Helms等人，J.Mol.Biol.257(1)：77-86(1996))。最後，HVR-H3中有四個位置被鑑別為高度保守：HC-A93、HC-R94、HC-P100、HC-D101。因為未選擇此等淘選策略進行抗原結合，故此等結果指示HVR3環構形涉及Fab之穩定性。
總而言之，除可變域中高度保守之數個位置以外，許多位置可耐受突變而不影響Fab分子在此等選擇中之總體穩定性及表現。此外，甚至一些具有小ERpos之位置亦可耐受保守胺基酸取代。舉例而言，突變誘發資料表明下核心之疏水性殘基可經類似疏水性殘基取代而不影響Fab之穩定性(圖1A至圖1F)。VH/VL穩定性對單一取代之耐受性與獲自人類IgG1之CH3域之深度突變誘發掃描的結果形成對比，其中大多數殘基不耐受任何突變(參見Traxylmayr等人，J.Mol.Biol.423(3)：397-412(2012))。
材料及方法
A. 全可變域NNK走查庫設計及產生。
對G6.31之全VH(殘基2-113)及VL(殘基2-107)進行隨機化。每個子庫隨機化10至12個後續殘基。在子庫內，藉由Kunkel突變誘發在各隨機化位置引入TAA密碼子(Kunkel,Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83(2)：488-492(1985))。產生10個VL子庫及12個VH子庫終止模板。對於庫設計而言，藉由利用NNK密碼子之寡核苷酸定點突變誘發對各位置進行隨機化，其中N為四種天然核苷酸中之任一者，且K為50% T(胸嘧啶)及50% G(鳥嘌呤)。NNK密碼子可編碼20種天然胺基酸中之任一者。分別產生輕鏈及重鏈之子庫，接著將各鏈之個別庫組合以形成VL庫及VH庫。該等組合庫亦稱為VH或VL NNK走查庫。在噬菌體Fab片段呈現載體中產生庫。VH NNK走查庫具有3×109個成員之大小，而VL NNK走查庫具有8×108個成員之大小。
B. 對抗gD、蛋白L或蛋白A之噬菌體淘選選擇
藉由在連續數輪選擇中培育VH或VL NNK走查噬菌體呈現庫與5、0.5、0.1nM生物素化VEGF，接著在室溫或37℃下與100nM非生物素化VEGF競爭以減少較低親和力選殖株與VEGF之結合來選擇結合選殖株。將結合選殖株俘獲在經中性親和素塗佈之ELISA板上，洗滌，且在 室溫下在100mM HCl中溶離20分鐘。用1/10體積之1M Tris pH 8.0中和溶離之噬菌體且用於感染大腸桿菌以擴增，以便用於下一輪選擇。
對於利用抗gD、蛋白L或蛋白A之選擇，藉由在經抗gD、蛋白L或蛋白A塗佈之ELISA板上培育VH或VL NNK走查噬菌體呈現庫來選擇結合選殖株，洗滌，且在室溫下在100mM HCl中溶離20分鐘。用1/10體積之1M Tris pH 8.0中和溶離之噬菌體且用於感染大腸桿菌以擴增，以便用於下一輪選擇。
C. 對G6.31深度突變掃描庫之Illumina定序
對於深度定序而言，自攜帶來自於未經選擇或經選擇VH或VL NNK走查庫之噬菌體質體載體的大腸桿菌XL1細胞分離出噬菌體質體DNA。使用經純化之DNA作為模板對VL及VH區進行有限循環之基於PCR之擴增。藉由瓊脂糖凝膠萃取及淨化(Qiagen Gel Extraction Kit)來純化PCR產物。使用溶離之擴增子DNA作為利用標準Illumina庫製備方法使用TRUSEQTM DNA Sample Prep(Illumina)進行深度定序庫製備之基礎。對銜接子連結庫進行單循環PCR且在Illumina MISEQ®上定序，雙端定序300bp以涵蓋擴增子之整個長度。
D. 深度掃描突變誘發資料分析
使用FLASh合併雙端定序讀數(Magoc等人，Bioinformatics 27(21)：2957-2963(2011))。使用統計程式語言R(Team RC「R：A language and environment for statistical computing」R Foundation for Statistical Computing(2014))及ShortRead(Morgan等人，Bioinformatics 25(19)：2607-2608(2009))套裝軟體進行進一步定序資料分析。品質控制之第一步驟為對攜帶個別HC及LC條碼之序列進行過濾。在第二步驟中，針對各合併讀數，鑑別VH及VL域之側接區域且檢查正確長度，以便移除絕大多數具有插入或缺失突變(indel)之讀數。為了進一步修正定序誤差，將非NNK突變轉化回野生型鹼基，且濾出含有超過兩個NNK突變之讀數。藉由計算每個隨機化位置之所有突變之頻率來產生位置權重矩陣。藉由如先前所描述將指定突變在經分選樣品中之指定位置上的頻率除以相同突變在未分選樣品中之頻率來計算所有突變之增濃比(Fowler等人，Nature Methods 7(9)：7412-746(2010))。
實例2：對G6.31之深度掃描突變誘發篩選可鑑別具有增強之穩定性及/或改良之VEGF結合親和力的胺基酸殘基變異體
為了獲得G6.31之單一取代對抗原結合之影響的全面概述，針對VEGF淘選實例1中所描述之VH及VL NNK走查庫(圖4A至圖4B)。所獲得之增濃比(ER)值顯示雙峰分佈(圖5A至圖5B)。突變子集對結合功能具有強負面效應，而大多數突變為中性的，且數個突變對適合度具有強正面效應。對結合具有負面影響之突變在很大程度上位於HC-HVR中，因為彼等環被視為提供G6.31之大部分結合功能，或位於架構之保守殘基中，如在抗gD淘選中所鑑別(參見實例1)。強增濃突變大部分位於架構區及HC-HVR之弱保守部分中。此等結果證實自以上所描述之gD淘選(參見實例1)的觀測結果，可變域穩固而且可耐受許多單突變，而實質上不影響Fab之抗原結合功能。
為了證實獲自深度突變誘發掃描之結果，表現所選突變並純化，並且使用BIACORE®表面電漿子共振(SPR)來量測其對VEGF之親和力且使用差示掃描螢光測定法(DSF)來量測其熱穩定性(如藉由解鏈溫度Tm所評定)。評估所選強增濃突變對抗原結合及摺疊之效應。此外，根據Abysis資料庫，基於其在人類抗體中之指定位置上之出現率來選擇具有高增濃之突變。另外，亦測試一些強缺失型突變作為負對照。所指示之G6.31變異體的Kd及Tm示於表2中。表2中所列出之Kd值係使用單循環動力學分析使用BIACORE® T200裝置量測。
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使用來自於34個突變(VH上之16個及VL上之18個)之資料，在增濃比與所獲得之親和力或穩定性增加之間未觀測到線性關係(圖5C至圖5D)。不希望受理論束縛，此可能體現出ER受多種因素影響，包括在大腸桿菌中之功能表現、Fab在噬菌體粒子上之穩定性以及與選擇蛋白質之結合。說明此事實之一個實例為突變LC-L73G，其為輕鏈疏水性核心之一部分。在此位置用甘胺酸置換疏水性白胺酸可能減少在核心中之封裝且導致不太穩定之輕鏈。LC-L73G突變體之Tm比野生型G6.31 Fab低14.4℃。在VEGF淘選實驗中缺失LC-L73G突變，但如藉由BIACORE® SPR所量測，其對抗原結合親和力具有顯著影響(與野生型G6.31相比親和力增加約 1.6倍(亦即，較低Kd))。缺失G6.31LCL73G可能為突變體於噬菌體上之呈現減少之效應，且此效應控制在實際抗原選擇中選擇此突變體。此外，反之亦成立：可增濃增加呈現(例如藉由增強表現及/或穩定性)之突變，但實際抗原結合功能與野生型(產生假陽性)相比受損或不變化。因此，藉由增濃鑑別之變異體可改良結合親和力、穩定性、表現及/或其他性質。
HVR-H2中藉由深度掃描突變誘發方法鑑別之兩個突變HC-T57E及HC-Y58R與野生型G6.31相比具有最高親和力增加(8至9倍)(圖5E)。架構區突變HC-N82aR導致與野生型G6.31相比存在約6.6倍親和力增加(圖5E)。若干其他架構區突變顯示與野生型G6.31相比存在2至4倍親和力增加(圖5E至圖5F)。在輕鏈突變LC-F83A中獲得最高熱穩定性增加(+5.4℃)(圖5F)。除解鏈溫度增加以外，LC-F83A使G6.31對VEGF之親和力增加3倍。令人驚訝的是，導致親和力增加之突變中有許多位於抗原結合位點遠端(圖5E至圖5F)。此等突變中有位於螺旋α1與股鏈βE之間的環中且距離抗原結合位點超過22Å之HC-N82aR及位於VL與輕鏈恆定域(CL)之間的界面中且距離HVR超過25Å之LC-F83A。
總而言之，使用VH及VL NNK走查庫及下一代定序之G6.31深度掃描突變誘發鑑別出可增加與VEGF之結合親和力及/或Fab之穩定性的胺基酸殘基變化。
材料及方法
A. 對VEGF之噬菌體淘選選擇
藉由在連續數輪選擇中培育VH或VL NNK走查噬菌體呈現庫(描述於實例1中)與5、0.5、0.1nM生物素化VEGF，接著在室溫或37℃下與100nM非生物素化VEGF競爭以減少較低親和力選殖株與VEGF之結合來選擇結合選殖株。將結合選殖株俘獲在經中性親和素塗佈之ELISA板上，洗滌，且在室溫下在100mM HCl中溶離20分鐘。用1/10體積之1M Tris pH 8.0中和溶離之噬菌體且用於感染大腸桿菌以擴增，以便用於下一輪選擇。
B. 對G6.31深度突變掃描庫之Illumina定序及資料分析
對於深度定序而言，自攜帶來自於未經選擇或針對VEGF 加以淘選之經選擇VH及VL NNK走查庫之噬菌體質體載體的大腸桿菌XL1細胞分離出噬菌體質體DNA。使用經純化之DNA作為模板對VL及VH區進行有限循環之基於PCR之擴增。藉由瓊脂糖凝膠萃取及淨化(Qiagen Gel Extraction Kit)來純化PCR產物。使用溶離之擴增子DNA作為利用標準Illumina庫製備方法使用TRUSEQTM DNA Sample Prep(Illumina)進行深度定序庫製備之基礎。對銜接子連結庫進行單循環PCR且在Illumina MISEQ®上定序，雙端定序300bp以涵蓋擴增子之整個長度。如實例1中進行資料分析以計算位置權重矩陣及增濃比。
C. 抗體表現
將所選變異體之VH及VL序列選殖至哺乳動物Fab載體中以用於表現。將用於重鏈及輕鏈之質體轉染(15μg)至30ml 293T細胞中持續7天。收集上清液以藉由蛋白G管柱加以純化。
D. 藉由BIACORE® SPR進行抗體親和力測定
為了測定所選Fab變異體之結合親和力，使用利用BIACORE® T200儀器之SPR量測。簡而言之，用1-乙基-3-(3-二甲基胺基丙基)碳化二亞胺(EDC)及N-羥基琥珀醯亞胺(NHS)試劑根據供應商之說明來活化一系列S感測器晶片CM5，且使人類VEGF(hVEGF)偶合至達到50-80個反應單位(RU)，接著隨後用1M乙醇胺阻斷未反應之基團。
注入(流速：30μl/min)Fab在HBS-P緩衝液(0.01 MHEPES pH 7.4、0.15 MNaCl、0.005%界面活性劑P20)中之三倍連續稀釋，由低(0.02nM)至高(50nM)。藉由減去得自於空白流動池之RU來修正hVEGF上之結合反應。記錄感測圖且進行參考及緩衝液減法，隨後藉由BIACORE® T200評估軟體(版本2.0)加以評估。使用簡單一對一朗繆爾結合模型來計算締合速率(kon)及解離速率(koff)。平衡解離常數(Kd)計算為比率koff/kon。
E. 藉由差示掃描螢光測定法進行解鏈溫度(T m )測定
差示掃描螢光測定法(DSF)監測在螢光染料存在下之蛋白質熱開摺且典型地藉由使用即時PCR儀器(例如Bio-Rad CFX)來進行。將SYPRO®橙色染料(Invitrogen，目錄號S6650)1：20稀釋於磷酸鹽緩衝生理鹽水(PBS)中。將1μl經稀釋之染料添加至每孔中之24μl Fab蛋白中(約100 μg/ml)。使用即時PCR儀器(Bio-Rad CFX)將溫度自20℃增至100℃，並且對螢光強度進行繪圖，且使用諸如玻耳茲曼方程之方程來計算過渡曲線之反曲點(Tm)(參見例如Niesen等人，Nature Protocols 2(9)：2212-2221(2007))。
實例3：LC-F83之構形變化與G6結構中之Fab肘部構形相關
為了理解空間上遠離抗原結合位點之突變以何種方式對抗原結合及穩定性具有此種強影響，更詳細地研究LC-F83A突變之結構效應。G6.31之親本抗體G6先前已呈VEGF結合形式及無VEGF形式結晶(Fuh等人，同上)。與G6相比，G6.31在HVR-L3中僅攜帶四個取代。因此將G6之晶體結構用作G6.31之模型。G6之無VEGF形式之晶體結構含有12個呈不對稱單元形式之Fab分子。Fab結構可基於恆定域對可變域之取向(V-C界面)而簇集至兩個不同的群組中(圖6A)，此為Fab肘部區域中之不同構形的結果且可藉由量測Fab肘角進行定量(參見例如Stanfield等人，J.Mol.Biol.357(5)：1566-1574(2006))。
Fab肘角之靈活性受重鏈中之球窩接合影響(參見例如Lesk等人，Nature 335(6186)：188-190(1988))，而且或許更重要地，受制於輕鏈類別。儘管κ輕鏈抗體典型地受肘角限制，但其可適應且顯示雙峰分佈，在約140°及約175°處達到峰值，很少超過180°，λ輕鏈抗體可適應較寬角度範圍(參見例如Stanfield等人，同上)。晶體結構中之六個G6分子具有小肘角(143°-155°)及CL域之DE-環抵靠VL之α1之緊密堆疊，而另六個分子具有大肘部角(170°-187°)與鬆散堆疊之VL-CL界面(圖6B至圖6C)。具有鬆散堆疊或緊密堆疊之VL-CL界面的不同Fab分子的界面面積分布示於圖7C中。緊密堆疊之界面面積平均為約600Å，而鬆散堆疊之界面面積為約450Å。進一步及更詳細分析顯示，六個G6游離分子具有小肘角(143°-155°)，此與緊密堆疊之VL-CL界面(包含抵靠VL之α1堆疊之CL域DE-環；304±48Å2)相關，而另六個具有大肘角(170°-187°)與不太緊密堆疊之VL-CL界面(234±29Å2界面面積)。因而，G6晶體結構顯示G6表現得如同肘角低於180°之典型人類κ輕鏈抗體(圖6A至圖6C)。
LC-F83之側鏈構形與Fab肘角變化相關。在大肘角結構中，LC-F83緊密結合於VL域遠端封端區域中之疏水性袋狀結構中(稱為「袋 內」構形)(圖6C)。在小肘角結構中，LC-F83自該疏水性袋狀結構中翻出(稱為「袋外」構形)且部分溶劑暴露(圖6B)。雖然位於在空間上接近Fab肘部區域處，但LC-F83並非肘部之一部分。然而，肘部殘基LC-I106之側鏈位置變化反映出LC-F83之構形變化。在LC-F83呈「袋外」構形之結構中，LC-F106I之側鏈「向上」運動且佔據疏水性袋狀結構。相比之下，在LC-F83呈「袋內」構形之結構中，LC-I106之側鏈「向下」運動(注意：參考HVR「向上」且恆定域「向下」來描述「向上」及「向下」取向)。與LC-F83相反，LC-I106之運動不限於側鏈且亦在蛋白質骨幹中引起構形變化(LC-105Φ角、LC-106ψ角)，從而可能導致觀測到不同的肘角。總而言之，G6之晶體結構表明，G6中之肘角變化需要位置LC-I106及LC-F83上之構形變化。
實例4：LC-83F與LC-106I之構形之偶合為人類抗體結構之共同特徵
G6/G6.31來源於基於重鏈及輕鏈之常見架構區而構建之噬菌體庫(Lee等人，J.Mol.Biol.340(5)：1073-1093(2004))。輕鏈之最接近生殖系基因為IGKV1-39及IGKJ1。根據IMGT資料庫(Lefranc等人，In Silico Biology 5(1)：45-60(2005))，最常用人類IGKV亞組IGKV1及IGKV3在位置LC-83上攜帶苯丙胺酸，而其他不太頻繁使用之生殖系典型地在位置83上攜帶纈胺酸(IGKV2及IGKV4)或丙胺酸(IGKV5及IGKV6)。在所有五個人類IGKJ生殖系基因中，位置LC-106上之異白胺酸均為保守的。
為了確定位置F83之側鏈構形與Fab肘部構形偶合是否為人類抗體之共同特徵，在來自於蛋白質資料庫(PDB)之319個人類Fab晶體結構中測定LC-F83構形。將該等結構分組為具有呈「袋內」構形之LC-F83之結構(二面角χ1介於-50°與-100°之間)及呈「袋外」構形之結構(χ1角主要介於50°與180°之間)(圖7A)。LC-F83構形在絕大多數結構中與位置LC-106上之Fab肘部區域變化相關(圖7B)。此外，該兩組在肘角方面(圖7C)以及在V-C界面面積方面展現顯著差異，顯示具有大肘角之結構具有較小、不太緊密堆疊之V-C界面，而具有大肘角之結構具有大V-C界面(圖7C)。
因為LC-F83A突變引起較高熱穩定性及對抗原之較高親和力，故測定PDB中可獲得之攜帶LC-83A及LC-106I之20種人類Fab結構 的肘角。此等結構反映出LC-83F「袋外」構形結構之性質：其展現小肘角及大V-C界面(圖7C)。
總而言之，此等結果顯示如先前所觀測(Stanfield等人，同上)之人類κ輕鏈抗體之Fab肘角之雙峰分佈主要為位置LC-83上之苯丙胺酸側鏈之不同的構形的結果。該資料進一步顯示位置LC-83上所存在之胺基酸的類型對Fab肘角具有較大影響。
材料及方法
人類抗體結構係獲自結構抗體資料庫(SAbDab，Dunbar等人，Nucleic Acids Research 42：D1140-1146(2014))。使用Bio3D進行額外結構過濾及結構處理(胺基酸重編號、二面角測定、結構比對)(Grant等人，Bioinformatics 22(21)：2695-2696(2006))。使用CCP4-Pisa之局部情形來計算介於恆定域與可變域之間的界面面積(Krissinel等人，J.Mol.Biol.372(3)：774-797(2007))。使用ABangle(Dunbar等人，Protein Eng.Des.Sel.26(10)：611-620(2013))來表徵VH-VL相互作用。使用Pymol及公眾可利用之腳本來計算肘角。
實例5：分子動力學模擬證實位置LC-83表現得如同在大Fab肘角構形與小Fab肘角構形之間過渡之開關
使用分子動力學以進一步洞悉實例4中所描述之結構統合分析中所鑑別之LC-F83A突變的效應。在兩種不同的結構背景中模擬LC-F83A突變之效應。使用具有大肘角之G6 Fab晶體結構(G6鏈VU，「VU.F83」)及具有小肘角之晶體結構(G6鏈BA，「BA.F83」)。在水中模擬兩種結構以及變化結構(VU.F83A及BA.F83A)持續100ns。在模擬時間期間，觀測到F83之構形無變化：在VU.F83之情況下，LC-F83保持「袋內」構形，而在BA.F83之情況下，該殘基保持「袋外」構形(圖8A)。對模擬期間肘角隨時間變化之比較顯示，所有四個分子之肘角在模擬期間在約25ns之初始平衡期之後均保持相當穩定(圖8B)。在BA.F83及BA.F83A之肘角分佈中未觀測到統計上顯著之差異。對於兩種分子，肘角波動約135°。然而，在模擬期間，VU.F83與VU.F83A之肘角之間存在顯著差異。在模擬之前25ns期間，VU.F83A之肘角收縮且在140°左右波動，而VU.F83之 肘角保持穩定在161°之大角度下(圖9A)。
以上所提供之結果顯示LC-F83「袋內」構形對穩定大Fab肘角之重要性。在分子動力學模擬中，LC-F83A突變導致立即過渡至小肘角及更大VL-CL界面。由於可觀測到LC-F83側鏈自「袋內」構形至「袋外」構形無過渡且反之亦然，故此等結果表明LC-F83對該分子之肘角變化施加顯著能量屏障。
總而言之，G6.31LC-F83A與G6.31相比之熱穩定性增加可由V-C界面相互作用面積增加來解釋，此又進一步穩定Fab之四個結構域之摺疊。此外，V-C界面中之更緊密堆疊減少疏水性殘基(如LC-I106)之溶劑暴露。
材料及方法
使用amber12進行分子動力學模擬(Case等人，J.Comput.Chem.26(16)：1668-1688(2005))。若未另外指出，則在恆定壓力及300K下模擬100ns。在模擬之前，由於丟失電子密度而使用PDB入口4hh9來補充未拆解之G6結構之恆定域中之部分。使用VMD(Humphrey等人，Journal of Molecular Graphics 14(1)：33-38,27-38(1996))、Bio3d、CCP4-Pisa、Pymol及ABangle分析所獲得之模擬結構。
實例6：G6 Fab之肘角動力學藉由調節VH-VL扭轉角來影響抗原結合界面
儘管Fab肘角變化解釋了LC-F83A變異體之解鏈溫度增加，但Fab肘部動力學變化不直接解釋此突變對抗原結合之效應。不希望受理論束縛，LC-F83A突變可經由Fab肘角變化間接影響抗原結合，或可直接影響抗原結合，因為LC-F83A位於接近VH-VL界面處且可影響VH及VL域相對於彼此之取向。VH-VL界面雖然不與抗原直接接觸但可在抗原結合親和力中具有強影響(參見例如Masuda等人，FEBS J.273(10)：2184-2194(2006)；Khalifa等人，Journal of Molecular Recognition 13(3)：127-139(2000))。此外，在無抗原狀態下，Fab之VH-VL界面典型地為可撓性的，而抗原結合導致剛性增加(Dunbar等人，Prot.Eng.Des.Sel.26(10)：611-620(2013))。另外，VH-VL取向可實質上在無配位體與抗原結合 形式之間變化(參見例如Stanfield等人，Structure 1(2)：83-93(1993))。
實際上，G6之晶體結構顯示可撓性及在不同的無G6抗原結構(G6未結合)與VEGF結合結構(G6結合)之間的顯著VH/VL扭轉角(HL扭轉角)差異。具有大肘角之六個G6游離分子之平均VH/VL扭轉角(HL扭轉角)為約60°，而對於具有小肘角之六個分子則為約58°。此又實質上更接近於G6VEGF之平均HL扭轉角-55°(圖9B)。
使用分子動力學模擬來排除扭轉角之此等變化為結晶之人為因素的可能性。VU.F83之中值HL扭轉角為約62°，而對於BA.F83其為約59°，符合在G6未結合晶體結構中所發現之結果。此外，兩種突變Fab(BA.F83A及VU.F83A)展現甚至更小之扭轉角(分別為約57°及約57°)，此甚至更接近於在G6結合結構中所觀測之扭轉角(圖9C)。此外，LC-F83A處之突變表明突變對VH-VL界面之額外效應，因為BA.F83A之HL角顯著小於BA.F83(p<0.0001)。
此等結果指示LC-F83A突變藉由兩種不同的機制影響HL扭轉角且又影響抗原結合。首先，LC-F83A突變藉由改變Fab肘角間接地介導此結果。結構資料及分子動力學模擬顯示肘角與HL角之間存在相關性(圖8A至圖8C及圖9A至圖9D)。其次，LC-83直接影響VH-VL界面。當引入LC-F83A時，HL扭轉角存在額外顯著增加(圖9A至圖9D，比較分子BA.F83與BA.F83A)。結果為G6.31LC-F83A之無抗原形式中之抗原結合位點構形更接近於在G6VEGF之結構中所觀測者。不希望受理論束縛，G6.31LC-F83A之重排抗原結合界面可能降低VEGF結合之能量成本，且因而觀測到G6.31LC-F83A之親和力增加(Kd降低)。另外，G6.31LC-F83A中之VH-VL界面之假定較佳堆疊可提供替代或額外摺疊穩定機制(參見例如Rothlisberger等人，J.Mol.Biol.347(4)：773-789(2005))，從而解釋所觀測之Tm增加。
材料及方法
如實例3至實例5中所描述來進行結構分析及分子動力學模擬。
實例7：氫-氘交換質譜(HDX-MS)證實與G6.31相比恆定可變界面中之構形變化亦存在於G6.31 F83A 之抗原結合區中。
使用HDX-MS來證明在溶液中可觀測到由於實例3至實例6中所描述之LC-F83A突變所致之Fab分子域間動力學變化。HDX-MS量測骨幹醯胺氫原子與氘之交換速率。與其被嵌埋及/或參與氫鍵形成時相比，骨幹醯胺氫原子在其得以溶劑暴露且不參與氫鍵形成時典型地較快速地交換。當比較G6.31與G6.31LC-F83A之氫-氘交換模式時，若干區域顯示出差異(圖9D)。與G6.31相比，在G6.31LC-F83A中，CL域中形成VL-CL界面且鄰近LC-F83A突變之DE-環較緩慢地交換。亦觀測到HVR環及相鄰區域之交換速率變化。與G6.31相比，G6.31LC-F83A中之HVR環H1及L2較緩慢地交換，而HVR-H3環之位於VH-VL界面中之相鄰區域較快速地交換。HVR-L2及HVR-H3環為VH-VL界面之一部分(參見例如Vargas-Madrazo等人，Journal of Molecular Recognition 16(3)：113-120(2003)；Aburatani等人，J.Biochem.132(5)：775-782(2002)；Padlan,Molecular Immunology 31(3)：169-217(1994))。因此，在G6.31與G6.31LC-F83A之間的HDX-MS中，在HVR及VL-CL界面中所觀測之交換模式變化獨立地證實獲自結構分析及分子動力學模擬之結果。
材料及方法
在20℃下將G6.31 WT及F83A突變樣品(45μM)以15倍稀釋於20mM組胺酸-乙酸鹽緩衝液pD 7.0及具有>90% D2O含量之50mM NaCl中以開始標記反應。在跨度為30秒至1000分鐘之六個對數間隔之時間間隔，藉由pH值降低(pH 2.5)且添加2M氯化脈(GdmCl)及0.25M叁(2-羧乙基)膦(TCEP)來淬滅標記反應，隨後注入冷線上系統中(參見例如Mayne等人，J.Am.Soc.Mass Spectrom.22(11)：1898-1905,2011)。
簡而言之，首先在0℃下使淬滅之樣品通過經固定之胃蛋白酶管柱(2.1×30mm，Applied Biosystems)以進行蛋白水解，接著與捕獲管柱結合以脫鹽(ACQUITY VANGUARDTM C8)，隨後藉由逆相層析(ACQUITY UPLC® BEH C18，1.7μm粒度，1.0×50mm)加以分離且引入質譜儀(Thermo ORBITRAP ELITETM，120k Hz，在m/z 400下拆解)中以量測氘含量。如先前所描述來製備層析移動相(Walters等人，J.Am.Soc.Mass Spectrom.23(12)：2132-2139,2012)，利用pH 2.25來最大化氘回收率，藉由量測完全氘 化對照，其平均值為82%。突變及野生型實驗交錯進行且以一式三份收集隨機化時間點；整個過程由LEAPv1機器人平臺(Leap Technologies，Carrboro，NC)自動進行，該平臺進行所有樣品處理步驟。此方法產生152種不同的肽，一致藉由ExMS程式(Kan等人，J.Am.Soc.Mass Spectrom.22(11)：1906-1915,2011)鑑別野生型及突變樣品，提供大約95%之序列覆蓋率。氘含量分析包括使用先前描述之定製python腳本(Kan等人，同上；Walters等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110(47)：18898-18903,2013；及Hu等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 110(19)：7684-7689,2013)，且藉由司徒頓氏t檢定鑑別野生型與突變體之間的氘吸收水準之顯著差異具有p值<0.05，如先前針對HDX-MS實驗所描述(Leurs等人，Anal.Chem.86(23)：11734-11741,2014)。
實例8：人類抗體中之體細胞超突變靶LC-83及LC-106
位置LC-83位於接近IGKV1-39生殖系輕鏈基因中之AID熱點基元(RGYW，其中R為嘌呤，Y為嘧啶，且W為A或T)處。由LC-F83A突變引起之熱穩定性增加可轉移至與G6.31來源於相同生殖系之其他抗體。因此，評估人類抗體中位置LC-83上之體細胞突變頻率。另外，此分析中亦包括LC-106。
使用兩種方法來研究體細胞超突變(SHM)在來源於IGKV1生殖系之輕鏈序列中的分佈。首先校對若干公眾可利用資料庫中可獲得之4623個獨特人類IGKV1輕鏈序列之體細胞突變(圖10A，上圖)。其次擴增來自來源於超過1000份個別人類淋巴組織之RNA的IGKV1序列，隨後進行高保真度單分子即時定序(SMRT)及SHM校對。儘管兩個資料集之來源不同，但觀測到體細胞突變之分佈非常類似(圖10A至圖10C)。LC-83為VL節段中最頻繁突變之位置之一；在兩個資料集中，分別有所有IGKV1序列之7%及19%在LC-83位置上攜帶突變。令人感興趣的是，在IGKV1序列中位置LC-106亦頻繁突變(分別9%及20%)，且最常見突變為纈胺酸。G6 VL之最接近生殖系基因節段為IGKV1-39及IGJ1。因此，研究IGKV1.39生殖系來源之抗體，由此顯示LC-F83處之體細胞突變主要產生較小側鏈(包括絲胺酸、纈胺酸及白胺酸)(圖10A至圖10C)。未觀測到IGKV1.39抗體 中之丙胺酸取代，可能因為丙胺酸突變將需要在LC-F83處之密碼子中進行很少發生之雙鹼基取代。
接下來，產生攜帶對位置LC-83及LC-106而言最頻繁之體細胞突變的G6.31 Fab變異體，且測定其對抗原結合及熱穩定性之效應(圖10D)。所有單突變變異體均使Tm增加4.8℃至6℃，此大概由減小Fab肘角及增加VL-CL界面面積所致。一致的是，雙突變LC-F83A/LC-I106V不會導致Tm顯著增加。不希望受理論束縛，同時減小兩個側鏈之大小將在典型地由LC-F83或LC-I106佔據之疏水性腔中留下空隙，且降低VL抵靠CL穩定堆疊之能力。混合LC-83突變對VEGF親和力之效應。LC-F83V導致親和力增加3倍，與LC-F83A類似，而突變LC-F83S及LC-I106V顯示親和力幾乎不增加。LC-83突變對抗原親和力之效應可具有情形依賴性。將LC-F83A突變引入與G6.31來源於相同生殖系之另一抗體中且觀測到熱穩定性及親和力存在類似增加。另外，已報導LC-F83S突變增加抗雌二醇抗體之親和力。
總而言之，LC-83及LC-106在人類抗體中頻繁突變。鑑於此兩個位置對親和力及穩定性之影響，總體Fab域動力學之最佳化為生體內抗體親和力成熟期間可高度利用之分子機制。
材料及方法
人類輕鏈序列係獲自多種公眾可利用來源：Abysis(可得自bioinf.org.uk/abysis網站)、Kabat資料庫(Martin,Proteins 25(1)：130-133(1996))、IMGT資料庫(Lefranc,Molecular Biotechnology 40(1)：101-111(2008))、GenBank(Benson等人，Nucleic Acids Research 43：D30-35(2015))及蛋白質資料庫(Berman等人，Nucleic Acids Research 28(1)：235-242(2000))。移除重複序列且使用IGBlast指配個別V節段之最接近生殖系基因(Ye等人，Nucleic Acids Research 41：W34-40(2013))。自資料集中移除被指配為小鼠或大鼠生殖系之序列。對序列進行Kabat編號(參見例如Wu等人，J.Exp.Med.132(2)：211-250(1970))，且鑑別V節段架構中之體細胞突變。此分析中不考慮HVR區(如藉由Kabat編號方案所定義)中之突變。
人類抗體序列之第二來源係來自於來源於1088名個體之人 類脾臟、扁桃體、骨髓及周圍血液淋巴細胞之市售RNA(Clonetech及Ams bio)。首先使用SMARTER® RACE cDNA擴增套組(Clonetech)將RNA轉錄至cDNA中。使用5' R-ACE(Advantage 2 PCR套組，Clonetech)，用黏接IGKC區之5'區的定製引子(5'-CATCAGATGGCGGGAAGATGAAGACAGATGGTGC-3'(SEQ ID NO：56))擴增IGKV特異性DNA，同時在第二PCR步驟中使用以下引子增濃IGKV1節段：前置引子：5'-GCCATCCAGATGACCCAGTCTCC-3'(SEQ ID NO：57)；及反置引子：5'-GGCTGCACCATCTGTCTTC-3'(SEQ ID NO：58)。使用Pacific Bioscience RSII(EA Genomic Services)對PCR產物進行凝膠純化及定序。獲得總計994.8Mbp。使用Pacific Bioscience之SMRT Analysis 2.3套裝軟體產生各讀數之共同序列。使用VDJFasta進行共同序列之生殖系註解(Glanville等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 106(48)：20216-20221)。對序列進行Kabat編號且鑑別V節段架構中之體細胞突變。總計將19034個序列註解為IGKV1，其中3796個含有至少三個架構區及兩個HVR且包括在內以產生SHM分佈。
實例9：G6.31之表面帶電變異體之鑑別
為了分離出可用於降低G6.31之pI的突變，使用來自於G6晶體結構之結構資訊鑑別可變域內之表面暴露位置。基於對NNK走查VH及VL庫之VEGF淘選(實例2)，選擇麩胺酸取代顯示出1或更大之增濃比的位置，以測試其對VEGF結合親和力(使用BIACORE® T200系統，藉由單循環動力學分析)及熱穩定性(DSF)之影響(表3A)。產生含有麩胺酸以及其他帶電殘基(例如精胺酸、離胺酸)取代之突變變異體，表現，並且如以上所描述進行純化(參見實例2，材料及方法)。應注意，在一些情況下，由於單循環動力學分析(表3A)與多循環動力學分析(表4)之間的擬合差異，表3A中針對一些變異體所列出之總體Kd與表4中所列出之結果相比較弱。表3B顯示所指示變異體之產率、單體百分比(單體%)及溶離時間。
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Figure 105130888-A0202-12-0175-11
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如表3A中所示，鑑別與G6.31相比具有相當或改良之VEGF結合親和力的若干表面暴露帶電變異體。
實例10：具有改良之VEGF結合親和力及改良之穩定性的組合變異體的產生及表徵
A. 具有改良之VEGF結合親和力及改良之穩定性的變異體的產生
G6.31在HVR-L3中含有可影響其穩定性之自動裂解位點(N94-P95)。組合實例2中所描述之單一變異體(參見例如表2)之組合以便鑑別具有增加之結合親和力及增加之穩定性的選殖株。特定言之，四個突變集中於以下各項上：LC-F83A(提供改良之熱穩定性及親和力)、LC-N94A(移除自動裂解位點)、HC-Y58R(改良親和力)及HC-N82aR(改良親和力)。亦測試位置LC-N94上意欲移除該自動裂解位點之若干其他取代對與VEGF之結合親和力(藉由多循環動力學量測)以及穩定性(藉由DSF)之效應(表 4)。移除自動裂解位點一致減少片段化，如藉由使用非還原型毛細管電泳十二烷基硫酸鈉(CE-SDS)測定之低分子量實體百分比所評估(圖12)。
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將LC-F83A、LC-N94A、HC-Y58R及HC-N82aR變異體組合至單一選殖株(「Y58R.N94A.N82aR.F83A」，亦稱為「G6.31 AARR」)中產生顯著增加之VEGF結合親和力(Kd=80pM)，與G6.31相比提高6.6倍。Y58R.N94A.N82aR.F83A與G6.31相比亦具有顯著改良之熱穩定性，Tm增高4.8℃(表5)。Y58R.N94A.N82aR.F83A之VH域之胺基酸序列示於SEQ ID NO：11中，且VL域之胺基酸序列示於SEQ ID NO：12中。
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B. 具有改變之pI的表面暴露帶電變異體的產生
為了產生具有較低pI之變異體，將若干麩胺酸取代引入G6.31之序列中。基於單一表面暴露帶電變異體突變資料(表3A至表3B)，選擇對VEGF結合不具有大負面影響之變異體用於進一步工程改造。在選擇突變時亦考慮表現水準(如藉由產率所評定)及聚集減少(如藉由高單體% 所評定)。使用APBS計算G6.31之等靜電表面(Baker等人，Proc Natl.Acad.Sci.USA 98(18)：10037-10041(2001))。將所選麩胺酸突變映射至靜電表面上且如下選擇麩胺酸突變組合：(i)避免位於空間上靠在一起處之突變；及(ii)偏好位於帶強正電之區塊內的突變。產生兩種重鏈組合變異體(有及無R19E)及五種輕鏈組合變異體以用於進一步表徵(表6)。所有輕鏈組合變異體均含有LC-N94A突變以移除自動裂解位點及LC-F83A突變以改良抗體之熱穩定性。若干變異體顯示改良之VEGF親和力(參見表6、表7及表9)。舉例而言，與G6.31相比，HCLC2及HCLC5顯示改良之親和力及顯著降低之pI(pI分別為5.3及5.6，相比之下，G6.31之pI為8.9)(參見表7及表9)。
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另外，產生包括所選表面暴露麩胺酸取代之若干其他組合變異體及具有改良之親和力及/或穩定性的單一變異體(表8)。
Figure 105130888-A0202-12-0179-18
表9顯示所選組合變異體之結合親和力、穩定性及pI資料之彙總。使用自有方案且藉由與標準pI對照一起進行等電聚焦(IEF)跑膠來計算抗體pI。表10顯示此等抗體之相應VH及VL胺基酸序列。表11顯示此等抗體之VL HVR胺基酸序列。表12顯示此等抗體之VH HVR胺基酸序列。
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可使以上所列出之抗體中之任一者，例如G6.31 AARR之Fab重鏈之上鉸鏈區突變以移除文獻中已報導之對抗IgG1鉸鏈自體抗體之反應性。參見例如Brezski等人，J.Immunol.181：3183-3192,2008；及Brezski等人，mAbs 2：3,212-220,2010。因而，G6.31 AARR重鏈之C末端胺基酸可為T(野生型(WT)型式)或L(對抗人類IgG Fab缺乏反應性之變異型式)。野生型G6.31 AARR之全長重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：48。對抗人類IgG Fab缺乏反應性之變異型式的全長重鏈胺基酸序列為SEQ ID NO：49。G6.31 AARR及對抗人類IgG Fab缺乏反應性之變異型式的全長輕鏈胺基酸序列均為SEQ ID NO：50。
總而言之，藉由深度掃描突變誘發鑑別之變異體的組合產生具有改良之性質的抗體。在一些情況下，與G6.31相比，該等抗體具有改良之VEGF結合親和力以及改良之穩定性(如根據Tm顯著增高所判斷)。一些變異體(例如抗體HCcombo、HCLC1、HCLC2、HCLC3、HCLC4及HCLC5)兼具改良之VEGF結合親和力及顯著降低之pI。對於具有降低之pI的變異體，重鏈中之R19E突變回復至位置19上之原始精胺酸(例如，如在R19HCcombo、R19HCLC2、R19HCLC4及R19HCLC5中)產生具有進一步親和力改良及Tm增加(約2.2℃至2.8℃)之變異體。
實例11：G6.31變異體經玻璃體內投與兔之後的眼部及全身藥物動力學
為了生體內評定G6.31變異體之藥物動力學(PK)性質，使用新西蘭白兔(NZW)進行以下實驗。測定兩種不同的G6.31變異體G6.31 AA EE(LC-N94A.LC-F83A.HC-A40E.HC-T57E)及G6.31 AARR(Y58R.N94A.N82aR.F83A)以及親本G6.31 WT的眼半衰期。在各情況下，以10mg/mL之濃度在PBS中調配各抗體之Fab。經玻璃體內注射50μL(0.5mg)以便將兔麻醉。將兔子(每組10隻)每隻眼投配一次。第1組給與G6.31 AAEE，第2組給與G6.31 WT，且第3組給與G6.31 AARR。在投配前、投配後2小時、6小時、1天、2天、4天、8天、15天及21天收集組織(玻璃體液、水狀液及血清)。使用以下所描述之總Fab ELISA分析樣品之抗VEGF水準。
各玻璃體液及水狀液中之各變異體及WT之藥物動力學分析結果提供於圖11A中。結果顯示在玻璃體液及水狀液中，G6.31 AAEE及G6.31 AARR之PK基本上與WT G6.31之PK相同。計算玻璃體及水狀液半衰期且彼等結果提供於以下表13中。變異體G6.31 Fab之半衰期類似於WT且亦與文獻中所報導之Fab之眼半衰期一致。
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藉由量測血清中之抗VEGF水準來評定玻璃體內注射後對Fab之全身暴露。分析血清樣品之抗VEGF。結果示於圖11B中。計算清除率(ml/kg/天)且彼等結果示於以下表14中。亦分析血清之抗治療劑抗體(ATA)。自第14天起所有動物中均存在ATA。
Figure 105130888-A0202-12-0183-27
如表14中所示之結果所示，若所有三種Fab均具有相同生體可用率，則G6.31 AARR具有最快清除率，此指示與G6.31 WT及G6.31 AAEE相比存在較低全身暴露。與G6.31 WT及GG6.31 AAEE相比，G6.31 AARR之此種較低全身暴露可產生較佳安全概況。
材料及方法
A. 總Fab ELISA
在4℃下將ELISA板用AffiniPure F(ab')2片段山羊抗人類IgG塗佈隔夜。接著將板洗滌3次，隨後與阻斷緩衝液(PBS pH 7.4、0.5% BSA及15ppm PROCLINTM)一起培育。在3次洗滌之後，在室溫下在輕緩攪拌下在板中將自給與WT G6.31、G6.31 AARR或G6.31 AAEE之NZW兔收集的水狀液及玻璃體樣品培育2h。隨後在室溫下用F(ab')2過氧化物酶結合之山羊抗人類IgG偵測與塗佈抗體結合之G6.31分子持續1h。在3次洗滌之後，向板添加TMBE-1000受質溶液後維持30min且使用1M H3PO4終止反應。在450/620nm下記錄信號。
使用標準曲線確定G6.31分子之濃度。
實例12：VEGF誘導之HUVEC移行分析
測試G6.31變異體抑制VEGF誘導之HUVEC移行的能力。使用Falcon 24多孔插入系統(BD Biosciences，目錄號351184)對表15中所指示之變異體進行HUVEC移行分析。用8mg/ml小鼠層連結蛋白(LifeTechnologies，23017-015)預塗佈插入物隔夜。使HUVEC饑餓隔夜，收集，且再懸浮於分析培養基(EBM-2、0.1% BSA)中。將細胞(5×104個)添加至上腔室且將20ng/mL VEGF添加至下腔室以便在存在或不存在不同劑量水準之阻斷抗體的情況下刺激移行16h。在固定且自上面膜刮下之後，用甲醇固定下面上之細胞且用SYTOX®綠(LifeTechnologies，S7020)染色。使用倒立式顯微鏡獲取影像且使用ImageJ軟體分析細胞數目。
圖13顯示在不同的Fab濃度下由G6.31 LC-N94A所致之對VEGF誘導之HUVEC移行之抑制與親本G6.31相比較的圖。如自圖13可見，在VEGF誘導之HUVEC移行分析中，單一LC-N94A突變之效力與WT G6.31親本相比顯著較弱，減弱約五倍。如表15中所示，在此分析中，雙重突變體LC-N94A.LC-F83A之效力與WT G6.31親本相比亦減弱低約五倍。四重突變體LC-N94A.LC-F83A.HC-A40E.HC-T57E(G6.31 AAEE)恢復且稍微改良了效力(表15)。令人驚訝的是，四重突變體N94A.F83A.N82aR.Y58R(G6.31 AARR)與WT G6.31親本相比具有顯著改良之效力，提高約兩倍(表15)。
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實例13：透明質酸(HA)與G6.31 AARR及其他抗體之結合
用於治療與病理性血管生成(例如AMD(例如濕性AMD)、DME、DR或RVO)相關之眼部病症的當前方法典型地包括玻璃體內注射VEGF拮抗劑(例如抗VEGF Fab雷珠單抗)。因為抗VEGF Fab之作用位點在眼後部之視網膜處，且亦因為Fab可在眼中具有相對較短之滯留時間，故典型地藉由玻璃體內注射藉由相對頻繁之投配(例如Q4W)來獲得抗VEGF Fab之最大患者益處。可能需要抗VEGF抗體或抗體片段(例如Fab)之長效遞送以用於眼部病症，至少部分用於降低投配頻率，由此改良患者便利性及順應性。在此實例中，評估線性未交聯透明質酸(HA)與G6.31變異體G6.31 AARR結合之效應。分析結合物之分子性質、藥物動力學參數(例如玻璃體半衰期及清除率)、熱力學穩定性及VEGF抑制效力。
使用模型兔Fab(rabFab；Shatz等人，Mol.Pharmaceutics 2016；PubMed識別碼(PMID)27244474)作為此分析之一部分。開發用於蛋白質治療劑之遞送技術典型地包括在相關動物模型中測試以證明生體內效用。在眼部藥物動力學之早期研究期間通常採用兔模型。令人遺憾的是，大部分人類及人類化抗體在兔中具有免疫原性，從而妨礙使用長效遞送技術估計關鍵藥物動力學參數。為了解決此問題，開發出替代化合物，即適用於在兔模型中評估遞送技術之物種匹配型兔Fab(「rabFab」)。本文中所描述之rabFab來源於結合人類磷酸c-Met之兔單株抗體。製造兔抗體(包括兔單株抗體)之方法在此項技術中為熟知的。參見例如美國專利第5,675,063號及/或第7,429,487號。結合人類磷酸c-Met之例示性兔單株抗體可購自 Abcam(Cambridge，MA，USA)，產品編號ab68141。
在當前實驗中，使G6.31 AARR或rabFab Fab-C分子與具有不同的重量平均莫耳質量(Mw)的線性未交聯HA結合，包括40kDa(HA40K-)、100kDa(HA100K-)、200kDa(HA200K-)及600kDa(HA600K-)。Fab-C分子為經表現以使得序列在第一個鉸鏈半胱胺酸處被截短，從而由表現直接產生具有游離半胱胺酸之Fab的Fab分子。亦可使用Fab'分子，即具有由全長單株抗體之消化所產生之游離半胱胺酸的Fab分子。對於此實例中所描述之HA結合物，使Fab-C分子共價連接於HA之葡糖醛酸糖單元上之羧酸基。在合成之第一個步驟中，將HA上某一百分比之此等酸基轉化成馬來醯亞胺(典型地，轉化2%至10%之酸基)。接著使Fab-C分子經由Fab-C分子上之游離半胱胺酸與馬來醯亞胺基結合。然而，可利用對綴合化學反應稍加修改以使Fab分子或其他抗體形式與HA結合。
尺寸排阻層析法(SEC)、折射率(RI)多角度光散射(MALS)及準彈性光散射(QELS)之組合(亦稱為SEC-RI-MALS-QELS)可用於評定所選HA-Fab結合物之HA Mw、結合物Mw、Fab負載百分比(定義為由共價連接之Fab分子所佔據之HA羧酸基的百分比)、流體動力學半徑(Rh)、游離Fab(定義為在溶液中游離且未共價連接於HA分子之Fab分子的百分比)及蛋白質質量分數(蛋白質質量/(蛋白質質量+HA質量)(表16)。圖14顯示SEC-RI-MALS-QELS用於評定HA40K-rabFab、HA200K-rabFab及HA600K-rabFab之重量平均莫耳質量(Mw)的例示性結果(注意QELS資料未示於圖14中)。
Figure 105130888-A0202-12-0186-29
Figure 105130888-A0202-12-0187-30
對於諸如AMD之眼部病症之治療，可能需要較長眼半衰期但較短全身半衰期，例如，以便將全身性抗VEGF暴露減至最少。HA全身循環清除由攜帶透明質酸酶之肝細胞介導。先前報導指示對天然HA之透明質酸酶活性包括由葡糖醛酸羧酸基進行識別。因為此等羧酸基經修飾以便與Fab-C分子連接，故評定結合之HA由透明質酸酶酶促消化之能力。如藉由對HYAL-2培育之HA及HA100K-rabFab之SEC-MALS分析所評定，HA結合之rabFab保留對透明質酸酶2(HYAL2)消化之酶敏感性(圖15)。
在玻璃體內投與後在兔玻璃體中測定Fab片段之HA結合對眼部藥物動力學參數(例如半衰期及清除率)之效應。與未結合之rabFab或雷珠單抗相比，rabFab與HA100K結合(HA100K-I125-rabFab)導致清除率顯著降低及玻璃體半衰期顯著增加(圖16及表17)。HA100K結合之rabFab與得自歷史資料之未結合rabFab相比在玻璃體半衰期(t 1/2)方面具有約四倍增加(分別為11.9天相對於3.2天)(圖16及表17)。表17亦顯示rabFab及HA100K-I125-rabFab之Rh。此等資料指示HA結合增加Fab之流體動力學半徑且導致玻璃體清除率減緩及玻璃體半衰期增加。
Figure 105130888-A0202-12-0187-31
rabFab、與20KDa聚乙二醇(PEG)結合之rabFab(rabFab-20kDa PEG)及與40kDa PEG結合之rabFab(rabFab-40kDa PEG)的流體動力學尺寸(例如就流體動力學半徑而言)與玻璃體滯留時間(例如就半衰期而言)之間的線性相關性以及歷史資料(Shatz等人，同上)連同以上針對HA100K-rabFab所描述之資料允許預測與HA100K或HA200K結合之G6.31 及與HA300K結合之G6.31的玻璃體半衰期(圖17)。HA100K-G6.31具有約11天之預測玻璃體半衰期，而HA200K-G6.31具有約17天之甚至更長之預測玻璃體半衰期(圖17)。HA300K-G6.31具有約19天之預測玻璃體半衰期(圖17)。此等結果提供G6.31 AARR或本文中所描述之其他G6.31變異體與線性未交聯HA結合在經玻璃體內注射後增加眼部滯留時間(例如半衰期)且降低清除率的進一步證據。
亦評估HA結合對Fab熱力學穩定性之效應(表18)。rabFab與具有三種不同莫耳質量之HA的共價連接不改變Fab之熱力學穩定性，如結合物與親本Fab相比具有類似Tm起點及峰值Tm所顯示(表18)。
Figure 105130888-A0202-12-0188-32
最終，評定HA結合對G6.31 AARR之VEGF抑制效力的效應。令人驚訝的是，當在針對VEGF抑制之pKDR分析中加以比較時，與親本Fab相比，G6.31 AARR與線性未交聯HA結合顯著改良效力(表19)。表19中之qAC50值指示在活性分析形式中引發50%反應所需之濃度。qAC50值等於IC50值。HA結合之G6.31 AARR與未結合之親本Fab相比在效力方面具有約7倍增加(表19)。因此，G6.31 AARR及本文中所描述之其他G6.31變異體的結合可適用於改良玻璃體藥物動力學參數(包括半衰期及清除率)以及VEGF抑制效力。
Figure 105130888-A0202-12-0188-33
基於上述實驗資料，對於治療眼部病症，包括AMD(例如濕性AMD)、DME、DR及RVO而言，HA結合之G6.31 AARR分子具有顯著改良之特徵。此等改良之特徵包括增加之效力及由於玻璃體滯留時間增加而降低投配頻率之機會。
材料及方法
A. 馬來醯亞胺官能化HA(HA-mal)之合成
具有不同莫耳質量之線性未交聯HA聚合物係獲自Lifecore Biomedical。使用水溶液反應，利用偶合試劑氯化4-(4,6-二甲氧基-1,3,5-三嗪-2-基)-4-甲基嗎啉(DMTMM)及連接子N-(2-胺基乙基)馬來醯亞胺三氟乙酸鹽(AEM)而以馬來醯亞胺基修飾HA。將HA以2.5mg/mL溶解於100mM 2-(N-嗎啉基)乙磺酸pH 5.5中且在攪拌下向此溶液中添加1.5莫耳過量DMTMM及3.75莫耳過量AEM(莫耳過量係基於HA中之羧酸之莫耳數來計算)。將溶液加熱至70℃後維持2小時。
經由脫鹽程序自反應物中移除過量AEM及DMTMM。將HiPrepTM 26/10脫鹽管柱安裝在ÄKTATM純化系統上且用10mM乙酸鈉pH 4.0、150mM NaCl平衡。將反應物淨注入管柱上，且根據在302nm下之吸光率收集HA-mal峰並且使用離心超濾裝置濃縮至大於5mg/mL。使用紫外-可見光分光光度計藉由302nm下之吸光率來量測HA-mal儲備溶液中之馬來醯亞胺濃度，且經由尺寸排阻層析法與多角度光散射(SEC-MALS)來評定馬來醯亞胺基/HA鏈之莫耳比。
B. Fab-C與HA-mal結合
使用1M磷酸鹽pH 6.5將Fab-C溶液之pH值調節至6.5，最終磷酸鹽濃度為50mM。將乙二胺四乙酸(EDTA)快速傾入該溶液中，達至2.5mM之最終濃度。攪拌Fab-C溶液且向其中添加稀釋於反應緩衝液(10mM磷酸鹽、150mM NaCl、2.5mM EDTA(pH 6.5))中之HA-mal。化學計算量設為最終反應物中每莫耳馬來醯亞胺存在1.2莫耳Fab-C，並且設定體積以得到1mg/mL之最終蛋白質濃度。在室溫下在攪拌下進行結合反應。在3小時，針對每莫耳馬來醯亞胺添加2莫耳巰基乙醇以便將未反應之馬來醯亞胺基封端。在添加巰基乙醇後30分鐘之後，用10mM磷酸鹽(pH 6.5)將反應物稀釋至小於50mM NaCl以便純化。
使用陰離子交換層析法進行純化以分離游離Fab-C及Fab二聚物與結合物。將HiTrapTM Q FF 5mL管柱安裝在ÄKTATM純化系統上且用10mM HisHCl(pH 5.5)平衡。使經稀釋之反應物流經管柱，從而俘獲HA-Fab結合物且同時溶離游離Fab-C及二聚物。在用10mM HisHCl (pH 5.5)、100mM NaCl洗滌之後，藉由分級梯度達至10mM HisHCl(pH 5.5)、500mM NaCl來溶離結合物。彙集所溶離之結合物且用10mM HisHCl(pH 5.5)稀釋至10mM HisHCl(pH 5.5)、150mM NaCl之最終組成。藉由離心超濾來濃縮所調配之結合物。
C. HA-Fab結合物之分析
在具有串聯之Wyatt Optilab T-rEX RI偵測器及Wyatt HELEOS-II MALS偵測器的Agilent 1200高效液相層析(HPLC)系統上藉由尺寸排阻層析法(SEC)與折射率(RI)多角度光散射(MALS)及準彈性光散射(QELS)之組合(亦稱為SEC-RI-MALS-QELS)來評定殘餘游離Fab含量、總結合物莫耳質量及蛋白質質量分數。使用Tosoh G6000 PWxl管柱進行分析，以PBS(pH 7.4)作為運作緩衝液。使用BSA對照來校正MALS偵測器且修正偵測器之間的譜帶增寬。藉由對符合Fab及HA-Fab結合物之UV A280峰進行積分來量測游離Fab含量。將結合物莫耳質量視作結合物峰之重量平均分子量(Mw)(亦稱為重量平均莫耳質量)。使用蛋白質結合物分析，使用差分RI(dRI)及UV A280信號來計算蛋白質質量分數。
D. HA-rabFab結合物之動態掃描量熱術(DSC)研究
在10mM HisHCl(pH 5.5)、150mM NaCl中以0.5mg/mL(基於蛋白質之濃度)製備rabFab、與具有39kDa之重量平均莫耳質量(Mw)的HA結合的rabFab(HA39K-rabFab)、與具有100kDa之Mw的HA結合的rabFab(HA100K-rabFab)及與具有300kDa之Mw的HA結合的rabFab(HA300K-rabFab)之溶液。在VP-DSC微型熱量計(MicroCal,Inc.)上進行DSC研究，以1℃/min之升溫速率自15℃升至105℃。自各樣品掃描中減去單獨緩衝液之參考掃描。使用所附ORIGIN套裝軟體來評估解鏈溫度(Tm)及Tm起點。
E. 磷酸化KDR(pKDR)受體活化分析
將經工程改造以過度表現KDR之CHO細胞(KDR-CHO細胞；參見Binétruy-Tournaire等人，EMBO J.19(7)：1525-1533,2000；及Benzinger等人，BBA Biomembranes 1466：71-78,2000，該等文獻以全文引用之方式併入本文中)以1×104個細胞/孔接種於平底96孔組織培養板中之80 μl細胞接種培養基(50：50高葡萄糖DMEM/Ham’s F-12、0.2% BSA、0.25%滲濾胎牛血清(FBS)、25mM HEPES及2mM L-glutamax)中。在37℃下將細胞培育隔夜。並行地，用25μl稀釋於PBS中之抗gD抗體(Genentech)塗佈NUNC® MAXISORB® 384孔ELISA板(Thermo，目錄號439454)，且在4℃下培育隔夜。
次日，在細胞刺激之前2小時，輕彈組織培養板並搗實，並且將培養基變成40μl無血清細胞刺激培養基(50：50高葡萄糖DMEM/Ham’s F-12、0.5% BSA及25mM HEPES)且在37℃下培育2h。在細胞刺激培養基中製造G6.31 AARR或HA100K-G6.31 AARR之三倍連續稀釋。亦在細胞刺激培養基中製備人類VEGF165之稀釋液(100ng/ml)。使用深孔阻斷板，將來自G6.31 AARR或HA100K-G6.31 AARR之連續稀釋的樣品與經稀釋之VEGF樣品混合且在37℃下培育1h。將40μL所得混合物添加至具有細胞之各孔，達至80μL之總培養體積。亦製備僅具有VEGF或未添加VEGF之諸孔作為對照。在37℃下將細胞培育15min。輕彈培養基並搗實，且添加25μL冰冷細胞溶解緩衝液(150mM NaCl、50mM HEPES、0.5% TRITONTM X-100、1×HALT®蛋白酶及磷酸酶抑制劑混合液(Thermo，目錄號78444，使用前即刻自100×儲備液添加)、5mM EDTA)。在冰上溶解細胞15min，隨後進行ELISA。
將經抗gD塗佈之ELISA板之諸孔用洗滌緩衝液(PBS+0.05% TWEEN® 20，pH 7.4)洗滌3次。在室溫下用80μl阻斷緩衝液(PBS+0.5% BSA(R & D Systems，目錄號#DY995))將各孔阻斷1h。接著用洗滌緩衝液將諸孔洗滌三次。接下來將25μl細胞溶解產物/孔添加至各孔且在室溫下培育2h，隨後用洗滌緩衝液將孔洗滌四次。將25μl處於分析緩衝液(PBS+0.5% BSA；與阻斷緩衝液相同)中之經1：2000稀釋之抗磷酸酪胺酸(選殖株4G10)生物素結合抗體(0.5μg/ml)(Millipore目錄號16-103)添加至各孔且在室溫下將所得混合物培育2h，隨後用洗滌緩衝液洗滌三次。將25μl處於分析緩衝液中之經1：10,000稀釋之辣根過氧化物酶(HRP)-鏈酶親和素(GE Health Care UK；目錄號RPN44OIV)添加至各孔且在室溫下培育30min，隨後用洗滌緩衝液再洗滌三次。接著將25μl TMB添加至各孔，且允 許顯色20min，隨後添加25 H2SO4以終止反應。最後，在培養板讀數器上在450/620nm下讀取諸孔之光學密度。
F. HA100K-rabFab之透明質酸酶消化
為了證實多達10%(百分比基於HA上之可利用酸基來表示)之Fab結合不改變HA-Fab結合物之透明質酸酶敏感性，將具有100kDa之Mw的HA(HA100K)及與HA100K結合之rabFab(HA100K-rabFab)以200μg/mL HA(調節HA100K-rabFab濃度以便就HA骨幹而言達到200μg/mL濃度)與4μg/mL透明質酸酶-2一起在10mM乙酸鈉pH 4.5中培育。在37℃下培育樣品且以30min間隔即刻注入SEC-RI-MALS上以便如以上所描述進行Mw分析。
G. 用於評定HA-Fab自兔玻璃體中清除之速率的PK研究
如以下所描述將HA100K-rabFab在兔玻璃體中之眼部藥物動力學概況與rabFab之歷史資料相比較。
在投配前一天用125I標記HA100K-rabFab。為了製備投配調配物，使用Millipore AMICON® 30K離心過濾管使適量HA100K-rabFab與Tris碘化緩衝液(25mM Tris HCl、0.4M NaCl，pH 7.5)交換。用Tris碘化緩衝液潤濕Pierce預塗佈型碘化管並且傾析。依序向管底部添加適當體積之Tris碘化緩衝液及適量Na125I(Perkin Elmer)。允許碘活化15min，其中每30s進行渦漩。將適當體積之測試樣品、Tris碘化緩衝液及已活化之碘添加至NUNC®微量離心管中且藉由輕緩振盪加以混合，持續約1至5min。藉由添加清除緩衝液(酪胺酸，2mg/mL Tris緩衝液)來終止碘化反應，且將調配物混合並培育5min，其中在1及4min時輕彈混合。對於蛋白質純化，藉由在6,000RPM下與PBS一起離心15min來製備AMICON® 30K離心過濾管。將NUNC®管內含物添加至AMICON® 30K離心過濾管中且在PBS中洗滌多達四次，以達到約400μL最終放射性標記測試製品體積。測定各測試製品之放射性、蛋白質濃度及放射化學純度。使用移液管，將AMICON®管之內含物轉移至NUNC®管且使調配物達到約10mg/mL之最終濃度。
將HA100K-rabFab-125I經玻璃體內(500μg/眼)注射至新西蘭 白兔之眼中(n=24隻眼睛)。對於玻璃體內注射，用異氟烷實現使兔子鎮靜/麻醉且置於側臥位。將托平卡胺眼用溶液(兩滴)及2.5%苯腎上腺素鹽酸鹽(一滴)施用至兩眼。在製備及投配前即刻將局部用丙對卡因施用至各眼。用必達定溶液之1：50稀釋液沖洗結膜下穹且用未稀釋之5%必達定溶液擦拭眼瞼緣。用未稀釋之必達定溶液擦拭顳上側球結膜。使用Jameson測徑規在顳上側球結膜上緣後部1.5至2.0mm標記一斑點。以左手使用結膜鑷來固定眼球位置，同時用右手在所標記之斑點處插入注射器附帶之針，通過鞏膜且向玻璃體液中前進5mm。定位注射針以面向眼球之後軸且藉由緩慢壓下注射器柱塞而將內含物遞送至中玻璃體中。拔出注射器所附帶之針且用結膜鑷抓住接近插入位點之鞏膜上組織持續30s以減輕所注射物質之回流。拭去投配位點之殘餘放射性。用相同方式對第二隻眼睛重複製備及劑量投與。在該程序持續時間內將適當測試製品維持在濕冰上且以50μL/眼之劑量體積一次性投與。注射後進行間接檢眼鏡檢查以確保未發生晶狀體或視網膜接觸。收集各注射部位之劑量拭子且保持在室溫下，隨後藉由液體閃爍計數(LSC)加以分析以確定殘餘放射性。自所投與之量中減去所回收之放射性，得到所投與之實際放射劑量。
投配前、投配後6小時以及投配後1、2、4、7、11、14、21及28天在室溫下自動物之頸靜脈將血液樣品收集至不含抗凝劑之管中。收集全血之等分試樣(約0.1mL)並且處理，以用於放射性分析。在環境溫度下對其餘血液進行離心以獲得血清並且處理以用於放射性分析。
每個時間點藉由靜脈內注射安樂死溶液對兩隻動物施以安樂死，隨後聽診。終點時間點為：投配後6小時以及投配後2、7、14、21及28天。自指定動物收集水狀液、晶狀體、玻璃體液、視網膜/脈絡膜及鞏膜。移出眼睛且自眼球外部剪去任何外附組織。經由注射器用結核菌素注射針移出水狀液且收集至預稱重之γ管中。將其餘眼睛在液氮中冷凍約30s。在冷硬切割表面上移出角膜、虹膜及晶狀體。用少量PBS沖洗晶狀體且將沖洗液收集至γ管中。將晶狀體揩乾且置放在預稱重之γ管中。視需要在液氮中再冷凍眼睛。切割鞏膜且自玻璃體液向後剝離。移出玻璃體液且置放在預稱重之容器中以便溶解。將與視網膜/脈絡膜連接之鞏膜浸入1ml PBS沖洗液中，與先前沖洗液彙集在一起並且輕緩地揩乾該組織。自鞏膜移出視網膜/脈絡膜且置放在單獨的預稱重γ管中。用濕紗布擦拭適當表面及工具且收集至γ管中以用於計數。所有組織、沖洗液及拭子收集至塑膠容器中並且處理，以用於放射性分析。
每個時間點處理所選動物(包括來自於時間點投配後2、14及28天之動物)之一隻眼睛以進行玻璃體液之放射層析剖析。移出右眼且自眼球外部剪去任何外附組織。經由注射器用結核菌素注射針移出水狀液且置放在預稱重之γ管中。使用具有18號針之10ml注射器收集最大量之玻璃體液。將內含物轉移至預稱重之容器中以便藉由HPLC-Gamma-RAMTM加以分析。將玻璃體液樣品保持冷藏或在濕冰上以用於放射層析剖析。將其餘右眼組織置放在預稱重之容器中以便溶解，並且處理以用於放射性分析。
將投配調配物、血清及全血之單一或一式兩份等分試樣充分混合並且取樣，以經由γ計數器直接分析放射性。直接對眼組織進行計數，稀釋於PBS中，或在設在約50℃之培育烘箱中溶解於3N KOH/甲醇/TRITONTM X-100溶液中，且以一式三份取樣以經由γ計數器來分析放射性。在樣品大小允許之情況下以一式兩份或一式三份對所收集之所有放射性樣品計數達至少5min或100,000個計數。放射性大於200dpm之所有樣品結果(以dpm/g樣品計算)均在平均值±15%以內。
對在投配後2、14及28小時得自一隻動物之右眼玻璃體液樣品進行放射層析剖析。根據適合目的之方法藉由HPLC-Gamma-RAMTM來分析樣品。比較峰面積及滯留時間以評定測試製品完整性隨時間變化。為了製備樣品，用冷卻氮氣流將PRECELLYS® 24均質器預冷至-10℃至0℃。將氧化鋯珠粒添加至適當管中。利用正壓式移液管，將玻璃體液樣品添加至含有氧化鋯珠粒之管中。將樣品置放在預冷PRECELLYS® 24均質器中且在6,500RPM下均質化六個60s循環。在14,000RPM下將管離心10min，隨後分析。
使用PHOENIX® WinNonlin® 6.2.1版(Certara USA,Inc.，Princeton，NJ)來估計藥物動力學參數。使用符合玻璃體內投藥途徑之非隔 室法進行參數估計。HA100K-rabFab-125I在兔玻璃體中之半衰期值為11.9天，相比之下，得自歷史資料之rabFab半衰期值為3.2天(Shatz等人，Mol.Pharmaceutics 2016；PubMed識別碼(PMID)27244474)。
儘管已出於清楚理解之目的藉由說明及實例在一定程度上詳細地描述了上述發明，但該等描述及實例不應被視為限制本發明之範疇。本文中所引用之所有專利及科學文獻之揭示內容明確地以全文引用的方式併入。
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<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成構築體
<400> 1
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<210> 2
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
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<223> 合成構築體
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (2)..(2)
<223> Xaa為Ile或His
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (5)..(5)
<223> Xaa為Ala或Arg
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (8)..(8)
<223> Xaa為Tyr或Lys
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (9)..(9)
<223> Xaa為Thr或Glu
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (10)..(10)
<223> Xaa為Arg、Tyr、Gln或Glu
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (12)..(12)
<223> Xaa為Ala或Glu
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (16)..(16)
<223> Xaa為Lys或Glu
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (17)..(17)
<223> Xaa為Gly或Glu
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<210> 3
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<223> 合成構築體
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<223> 合成構築體
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<221> 雜項特徵
<222> (5)..(5)
<223> Xaa為Asp或Arg
<400> 4
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<223> 合成構築體
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<221> 雜項特徵
<222> (1)..(1)
<223> Xaa為Ser或Met
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<221> 雜項特徵
<222> (1)..(1)
<223> Xaa為Gln、Asn或Thr
<220>
<221> 雜項特徵
<222> (6)..(6)
<223> Xaa為Ala、Asn、Gln或Arg
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<223> 合成構築體
<400> 27
Figure 105130888-A0305-02-0209-29
<210> 28
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 28
Figure 105130888-A0305-02-0209-30
<210> 29
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 29
Figure 105130888-A0305-02-0209-31
<210> 30
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 30
Figure 105130888-A0305-02-0210-32
<210> 31
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 31
Figure 105130888-A0305-02-0210-33
<210> 32
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 32
Figure 105130888-A0305-02-0210-34
<210> 33
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 33
Figure 105130888-A0305-02-0211-35
<210> 34
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 34
Figure 105130888-A0305-02-0211-36
Figure 105130888-A0305-02-0212-37
<210> 35
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 35
Figure 105130888-A0305-02-0212-38
Figure 105130888-A0305-02-0213-39
<210> 36
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 36
Figure 105130888-A0305-02-0213-40
<210> 37
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 37
Figure 105130888-A0305-02-0214-41
<210> 38
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 38
Figure 105130888-A0305-02-0214-42
Figure 105130888-A0305-02-0215-43
<210> 39
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 39
Figure 105130888-A0305-02-0215-44
<210> 40
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 40
Figure 105130888-A0305-02-0215-45
Figure 105130888-A0305-02-0216-46
<210> 41
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 41
Figure 105130888-A0305-02-0216-47
Figure 105130888-A0305-02-0217-48
<210> 42
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 42
Figure 105130888-A0305-02-0217-49
Figure 105130888-A0305-02-0218-50
<210> 43
<211> 227
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 43
Figure 105130888-A0305-02-0218-51
Figure 105130888-A0305-02-0219-52
<210> 44
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 44
Figure 105130888-A0305-02-0219-53
<210> 45
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 45
Figure 105130888-A0305-02-0220-54
<210> 46
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 46
Figure 105130888-A0305-02-0220-55
<210> 47
<211> 232
<212> PRT
<213> 智人
<400> 47
Figure 105130888-A0305-02-0221-56
Figure 105130888-A0305-02-0222-57
<210> 48
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 48
Figure 105130888-A0305-02-0222-58
Figure 105130888-A0305-02-0223-59
<210> 49
<211> 228
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 49
Figure 105130888-A0305-02-0223-60
Figure 105130888-A0305-02-0224-61
Figure 105130888-A0305-02-0225-62
<210> 50
<211> 214
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 50
Figure 105130888-A0305-02-0225-63
Figure 105130888-A0305-02-0226-64
<210> 51
<211> 120
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 51
Figure 105130888-A0305-02-0226-65
Figure 105130888-A0305-02-0227-66
<210> 52
<211> 30
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 52
Figure 105130888-A0305-02-0227-67
<210> 53
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 53
Figure 105130888-A0305-02-0227-68
<210> 54
<211> 32
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 54
Figure 105130888-A0305-02-0228-69
<210> 55
<211> 10
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 55
Figure 105130888-A0305-02-0228-70
<210> 56
<211> 34
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 56
Figure 105130888-A0305-02-0228-71
<210> 57
<211> 23
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 57
Figure 105130888-A0305-02-0229-88
<210> 58
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 58
Figure 105130888-A0305-02-0229-75
<210> 59
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 59
Figure 105130888-A0305-02-0229-74
Figure 105130888-A0305-02-0230-76
<210> 60
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 60
Figure 105130888-A0305-02-0230-77
<210> 61
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 61
Figure 105130888-A0305-02-0231-78
<210> 62
<211> 5
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 62
Figure 105130888-A0305-02-0231-79
<210> 63
<211> 17
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 63
Figure 105130888-A0305-02-0231-80
<210> 64
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 64
Figure 105130888-A0305-02-0232-81
<210> 65
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 65
Figure 105130888-A0305-02-0232-82
<210> 66
<211> 7
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 66
Figure 105130888-A0305-02-0232-83
<210> 67
<211> 11
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 67
Figure 105130888-A0305-02-0232-84
Figure 105130888-A0305-02-0233-85
<210> 68
<211> 129
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 68
Figure 105130888-A0305-02-0233-86
<210> 69
<211> 110
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 69
Figure 105130888-A0305-02-0234-87

Claims (79)

  1. 一種經分離之抗體，其特異性結合血管內皮生長因子(VEGF)，其中該抗體包含以下六個高變區(HVR)：(a)HVR-H1，其包含胺基酸序列DYWIH(SEQ ID NO：1)；(b)HVR-H2，其包含胺基酸序列GITPAGGYTRYADSVKG(SEQ ID NO：7)；(c)HVR-H3，其包含胺基酸序列FVFFLPYAMDY(SEQ ID NO：3)；(d)HVR-L1，其包含胺基酸序列RASQDVSTAVA(SEQ ID NO：8)；(e)HVR-L2，其包含胺基酸序列SASFLYS(SEQ ID NO：9)；及(f)HVR-L3，其包含胺基酸序列QQGYGAPFT(SEQ ID NO：10)。
  2. 如請求項1之抗體，其中該抗體進一步包含以下重鏈可變(VH)域架構區(FR)：(a)FR-H1，其包含胺基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS(SEQ ID NO：13)；(b)FR-H2，其包含胺基酸序列WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO：14)；(c)FR-H3，其包含胺基酸序列RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：15)；及(d)FR-H4，其包含胺基酸序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：16)。
  3. 如請求項1之抗體，其中該抗體進一步包含以下輕鏈可變(VL)域FR：(a)FR-L1，其包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：17)；(b)FR-L2，其包含胺基酸序列WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：18)；(c)FR-L3，其包含胺基酸序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO：19)；及(d)FR-L4，其包含胺基酸序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)。
  4. 一種經分離之抗體，其特異性結合VEGF，其中該抗體包含：(a)VH域，其包含與SEQ ID NO：11之胺基酸序列具有至少99%序列一致性的胺基酸序列；及(b)VL域，其包含與SEQ ID NO：12之胺基酸序列 具有至少99%序列一致性的胺基酸序列。
  5. 如請求項4之抗體，其中該VH域進一步包含以下FR：(a)FR-H1，其包含胺基酸序列EVQLVESGGGLVQPGGSLRLSCAASGFTIS(SEQ ID NO：13)；(b)FR-H2，其包含胺基酸序列WVRQAPGKGLEWVA(SEQ ID NO：14)；(c)FR-H3，其包含胺基酸序列RFTISADTSKNTAYLQMRSLRAEDTAVYYCAR(SEQ ID NO：15)；及(d)FR-H4，其包含胺基酸序列WGQGTLVTVSS(SEQ ID NO：16)；其中視情況該VH域包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列；且其中視情況該VL域進一步包含以下FR：(a)FR-L1，其包含胺基酸序列DIQMTQSPSSLSASVGDRVTITC(SEQ ID NO：17)；(b)FR-L2，其包含胺基酸序列WYQQKPGKAPKLLIY(SEQ ID NO：18)；(c)FR-L3，其包含胺基酸序列GVPSRFSGSGSGTDFTLTISSLQPEDAATYYC(SEQ ID NO：19)；及(d)FR-L4，其包含胺基酸序列FGQGTKVEIK(SEQ ID NO：20)，其中視情況該VL域包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列。
  6. 一種經分離之抗體，其特異性結合VEGF，其中該抗體包含：(a)VH域，其包含SEQ ID NO：11之胺基酸序列；及(b)VL域，其包含SEQ ID NO：12之胺基酸序列。
  7. 一種經分離之抗體，其特異性結合VEGF，其中該抗體包含：(a)重鏈，其包含SEQ ID NO：48之胺基酸序列；及(b)輕鏈，其包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列。
  8. 一種經分離之抗體，其特異性結合VEGF，其中該抗體包含：(a)重鏈，其包含SEQ ID NO：49之胺基酸序列；及(b)輕鏈，其包含SEQ ID NO：50之胺基酸序列。
  9. 如請求項1之抗體，其中該抗體能夠抑制VEGF與VEGF受體之結合；其中視情況該VEGF受體為VEGF受體1(Flt-1)或VEGF受體2 (KDR)；其中視情況該抗體以約2nM或更低之Kd結合人類VEGF(hVEGF)；其中視情況該抗體以介於約75pM與約2nM之間的Kd結合hVEGF；其中視情況該抗體以介於約75pM與約600pM之間的Kd結合hVEGF；其中視情況該抗體以介於約75pM與約500pM之間的Kd結合hVEGF；且其中視情況該抗體以約60pM之Kd結合hVEGF。
  10. 如請求項1之抗體，其中該抗體具有超過約83.5℃之解鏈溫度(Tm)；其中視情況該抗體具有約85℃至約91℃之Tm；且其中視情況該抗體具有約89℃之Tm。
  11. 如請求項1之抗體，其中該抗體具有低於8之等電點(pI)；其中視情況該抗體具有約5至約7之pI；其中視情況該抗體具有約5至約6之pI。
  12. 如請求項1至11中任一項之抗體，其中該抗體為單株抗體、人類抗體、人類化抗體或嵌合抗體；其中視情況該抗體為結合VEGF之抗體片段；其中視情況該抗體片段選自由以下各項組成之群：Fab、Fab-C、Fab'-SH、Fv、scFv及(Fab')2片段；其中視情況該抗體片段為Fab；其中視情況該抗體為單特異性抗體或多特異性抗體；其中視情況該多特異性抗體為雙特異性抗體；其中視情況該雙特異性抗體結合VEGF及第二生物分子，該第二生物分子選自由以下各項組成之群：IL-1β；介白素-6(IL-6)；介白素-6受體(IL-6R)；介白素-13(IL-13)；IL-13受體(IL-13R)；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體；ST-2受體；及與年齡相關性黃斑變性(AMD)風險基因相關之蛋 白質；其中視情況該VEGF受體為VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、膜結合型VEGF受體(mbVEGFR)或可溶性VEGF受體(sVEGFR)，或該與AMD風險基因相關之蛋白質選自由以下各項組成之群：補體途徑組件C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；介白素-8(IL-8)；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC、COL10A1；及TNFRSF10A。
  13. 一種多核苷酸，其編碼如請求項1至12中任一項之抗體。
  14. 一種載體，其包含如請求項13之多核苷酸。
  15. 一種宿主細胞，其包含如請求項14之載體。
  16. 一種產生如請求項1至12中任一項之抗體的方法，該方法包括培養包含如請求項14之載體的宿主細胞及回收該抗體。
  17. 如請求項16之方法，其中該宿主細胞為原核細胞；其中視情況該宿主細胞為大腸桿菌；或該宿主細胞為真核細胞；其中視情況該宿主細胞為293細胞、CHO細胞、酵母細胞或植物細胞。
  18. 一種如請求項1至12中任一項之抗體之用途，其用於製備在患有與病理性血管生成相關之病症的個體中減少或抑制血管生成的藥劑。
  19. 一種如請求項1至12中任一項之抗體之用途，其用於製備治療與病理性血管生成相關之病症的藥劑。
  20. 如請求項18之用途，其中(i)該與病理性血管生成相關之病症為眼部病症或細胞增殖性病症；其中視情況(ii)該與病理性血管生成相關之病症為眼部病症；其中視情況(iii)該眼部病症選自由以下各項組成之群：與年齡相關性黃斑變性(AMD)、黃斑變性、黃斑水腫、糖尿病性黃斑水腫(DME)(包括局部非中心性DME及擴散性中心參與性DME)、視網膜病、糖尿病性視網膜病(DR)(包括增生性DR(PDR)、非增生性DR(NPDR)及高原DR)、其他局部缺血相關性視網膜病、早產兒視網膜病(ROP)、視網膜靜脈阻塞(RVO)(包括中央形式RVO(CRVO)及分枝形式RVO(BRVO))、CNV(包 括近視性CNV)、角膜新血管形成、與角膜新血管形成相關之疾病、視網膜新血管形成、與視網膜/脈絡膜新血管形成相關之疾病、病理性近視、馮希伯-林島氏病、眼組織胞漿菌病、家族性滲出性玻璃體視網膜病變(FEVR)、柯氏病、諾裡氏病、骨質疏鬆症-假神經膠質瘤症候群(OPPG)、結膜下出血、虹膜發紅、眼部新血管疾病、新血管性青光眼、色素性視網膜炎(RP)、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤性增生、黃斑毛細血管擴張、虹膜新血管形成、眼內新血管形成、視網膜變性、囊樣黃斑水腫(CME)、血管炎、視乳頭水腫、視網膜炎、結膜炎(包括感染性結膜炎及非感染性(例如過敏性)結膜炎)、萊伯先天性黑矇、葡萄膜炎(包括感染性及非感染性葡萄膜炎)、脈絡膜炎、眼組織胞漿菌病、瞼緣炎、乾眼症、創傷性眼損傷及修格連氏病；且其中視情況(iv)該眼部病症為AMD、DME、DR或RVO。
  21. 如請求項20之用途，其中該眼部病症為AMD；其中視情況該AMD為濕性AMD。
  22. 如請求項20之用途，其中該與病理性血管生成相關之病症為細胞增殖性病症；其中視情況該細胞增殖性病症為癌症；且其中視情況該癌症選自由以下各項組成之群：乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、腎癌、前列腺癌、肝癌、頭頸癌、黑色素瘤、卵巢癌、間皮瘤及多發性骨髓瘤。
  23. 一種如請求項1至12中任一項之抗體之用途，其用於製備在受與不合需要之血管滲透相關之病症困擾的個體中抑制血管滲透的藥劑。
  24. 一種如請求項1至12中任一項之抗體之用途，其用於製備治療所需個體中之與不合需要之血管滲透相關之病症的藥劑。
  25. 如請求項23之用途，其中該與不合需要之血管滲透相關之病症選自由以下各項組成之群：與腦腫瘤相關之水腫、與惡性病相關之腹水、梅格斯氏症候群(Meigs' syndrome)、肺炎、腎病症候群、心包膜積液、胸膜積液及與心血管疾病相關之滲透。
  26. 如請求項25之用途，其中(i)該藥劑係供與第二藥劑一起投與，其中該第二藥劑選自由以下各項 組成之群：另一抗體、化學治療劑、細胞毒性劑、抗血管生成劑、免疫抑制劑、前藥、細胞因子、細胞因子拮抗劑、細胞毒性放射療法、皮質類固醇、抗吐劑、癌症疫苗、止痛劑、生長抑制劑及與第二生物分子結合之化合物；其中視情況(ii)該抗血管生成劑為VEGF拮抗劑；其中視情況(iii)該VEGF拮抗劑為抗VEGF抗體、抗VEGF受體抗體、可溶性VEGF受體融合蛋白質、適體、抗VEGF DARPin®或VEGFR酪胺酸激酶抑制劑；其中視情況(iv)該抗VEGF抗體為雷珠單抗(LUCENTIS®)、RTH-258或雙特異性抗VEGF抗體，其中視情況該雙特異性抗VEGF抗體為抗VEGF/抗Ang2抗體，且其中視情況該抗VEGF/抗Ang2抗體為RG-7716或其中該可溶性VEGF受體融合蛋白質為阿柏西普(aflibercept)(EYLEA®)，或其中該適體為哌加他尼(pegaptanib)(MACUGEN®)，或其中該抗VEGF DARPin®為abicipar pegol，或其中該VEGFR酪胺酸激酶抑制劑選自由以下各項組成之群：4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯啶-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、瓦他拉尼(vatalanib)(PTK787)、司馬沙尼(semaxaminib)(SU5416)及SUTENT®(舒尼替尼(sunitinib))。
  27. 如請求項26之用途，其中(i)中之該第二生物分子選自由以下各項組成之群：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體；ST-2受體；及與AMD風險基因相關之蛋白質；其中視情況該VEGF受體為VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR；或該與AMD風險基因相關之蛋白質選自由以下各項組成之群：補體途徑組件C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC、COL10A1；及TNFRSF10A。
  28. 如請求項27之用途，其中(i)中之該結合第二生物分子之化合物為抗體 或其抗原結合片段；其中視情況該抗原結合抗體片段選自由以下各項組成之群：Fab、Fab-C、Fab'-SH、Fv、scFv及(Fab')2片段。
  29. 如請求項18至28中任一項之用途，其中(i)該抗體係供經玻璃體內、經眼、經眼內、經鞏膜旁、經德濃氏囊下、經脈絡膜周隙、經局部、經靜脈內、經肌肉內、經真皮內、經皮膚、經動脈內、經腹膜內、經病變內、經顱骨內、經關節內、經前列腺內、經胸膜內、經氣管內、經鞘內、經鼻內、經陰道內、經直腸內、經腫瘤內、經腹膜內、經腹膜、經心室內、經皮下、經結膜下、經膀胱內、經黏膜、經心包內、經臍靜脈內、經眶內、經口、透皮、藉由吸入、藉由注射、藉由滴眼劑、藉由植入、藉由輸注、藉由連續輸注、藉由直接局部灌注浸浴靶細胞、藉由導管、藉由灌洗、於乳膏中或於脂質組成物中投與；其中視情況(ii)該抗體係供經玻璃體內、經眼、經眼內、經鞏膜旁、經德濃氏囊下、經脈絡膜周隙或經局部投與；其中視情況(iii)該抗體係藉由注射而供經玻璃體內投與或藉由滴眼劑或軟膏而供局部投與。
  30. 如請求項29之用途，其中(i)或(ii)中之該抗體係供藉由孔口式遞送裝置投與。
  31. 如請求項18至28中任一項之用途，其中該個體為人類。
  32. 一種醫藥組成物，其包含如請求項1至12中任一項之抗體。
  33. 如請求項32之醫藥組成物，其進一步包含聚合物；其中視情況該聚合物為生物可降解聚合物；或其中該醫藥組成物係調配為聚合物溶劑貯庫、聚合物植入物或聚合物微胞。
  34. 如請求項33之醫藥組成物，其中該聚合物為聚乳酸聚羥基乙酸(PLGA)共聚物；其中視情況該醫藥組成物係調配為PLGA棒體。
  35. 一種如請求項32至34中任一項之醫藥組成物之用途，其用於製備治療在哺乳動物中與病理性血管生成相關之病症或與不合需要之血管滲透相關之病症。
  36. 如請求項35之用途，其中(i)該與病理性血管生成相關之病症為眼部病症或細胞增殖性病症；其中視情況(ii)該與病理性血管生成相關之病症為眼部病症；其中視情況(iii)該眼部病症選自由以下各項組成之群：AMD、黃斑變性、黃斑水腫、DME(包括局部非中心性DME及擴散性中心參與性DME)、視網膜病、DR(包括PDR、NPDR及高原DR)、其他局部缺血相關性視網膜病、ROP、RVO(包括CRVO及BRVO形式)、CNV(包括近視性CNV)、角膜新血管形成、與角膜新血管形成相關之疾病、視網膜新血管形成、與視網膜/脈絡膜新血管形成相關之疾病、病理性近視、馮希伯-林島氏病、眼組織胞漿菌病、FEVR、柯氏病、諾裡氏病、OPPG、結膜下出血、虹膜發紅、眼部新血管疾病、新血管性青光眼、RP、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤性增生、黃斑毛細血管擴張、虹膜新血管形成、眼內新血管形成、視網膜變性、CME、血管炎、視乳頭水腫、視網膜炎、結膜炎(包括感染性結膜炎及非感染性(例如過敏性)結膜炎)、萊伯先天性黑矇、葡萄膜炎(包括感染性及非感染性葡萄膜炎)、脈絡膜炎、眼組織胞漿菌病、瞼緣炎、乾眼症、創傷性眼損傷及修格連氏病；且其中視情況(iv)該眼部病症為AMD、DME、DR或RVO。
  37. 如請求項36之用途，其中(iii)或(iv)中之該眼部病症為AMD；其中視情況該AMD為濕性AMD。
  38. 如請求項36之用途，其中(i)中之該與病理性血管生成相關之病症為細胞增殖性病症；其中視情況該細胞增殖性病症為癌症；且其中視情況其中該癌症選自由以下各項組成之群：乳癌、結腸直腸癌、非小細胞肺癌、非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、腎癌、前列腺癌、肝癌、頭頸癌、黑色素瘤、卵巢癌、間皮瘤及多發性骨髓瘤。
  39. 如請求項35之用途，其中該與不合需要之血管滲透相關之病症選自由以下各項組成之群：與腦腫瘤相關之水腫、與惡性病相關之腹水、梅格斯氏症候群、肺炎、腎病症候群、心包膜積液、胸膜積液及與心血 管疾病相關之滲透。
  40. 如請求項34之醫藥組成物，(i)其進一步包含第二藥劑，其中該第二藥劑選自由以下各項組成之群：另一抗體、化學治療劑、細胞毒性劑、抗血管生成劑、免疫抑制劑、前藥、細胞因子、細胞因子拮抗劑、細胞毒性放射療法、皮質類固醇、抗吐劑、癌症疫苗、止痛劑、生長抑制劑及與第二生物分子結合之化合物；其中視情況(ii)該抗血管生成劑為VEGF拮抗劑；其中視情況(iii)該VEGF拮抗劑為抗VEGF抗體、抗VEGF受體抗體、可溶性VEGF受體融合蛋白質、適體、抗VEGF DARPin®或VEGFR酪胺酸激酶抑制劑，其中視情況該抗VEGF抗體為雷珠單抗(LUCENTIS®)、RTH-258或雙特異性抗VEGF抗體，其中視情況該雙特異性抗VEGF抗體為抗VEGF/抗Ang2抗體且其中視情況該抗VEGF/抗Ang2抗體為RG-7716，或其中該可溶性VEGF受體融合蛋白質為阿柏西普(EYLEA®)，或其中該適體為哌加他尼(MACUGEN®)，或其中該抗VEGF DARPin®為abicipar pegol，或其中該VEGFR酪胺酸激酶抑制劑選自由以下各項組成之群：4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯啶-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、瓦他拉尼(PTK787)、司馬沙尼(SU5416)及SUTENT®(舒尼替尼)。
  41. 如請求項40之醫藥組成物，其中(i)中之該第二生物分子選自由以下各項組成之群：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體；ST-2受體；及與AMD風險基因相關之蛋白質；其中視情況該VEGF受體為VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR或該與AMD風險基因相關之蛋白質選自由以下各項組成之群：補體途徑組件C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMR3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC、 COL10A1；及TNFRSF10A。
  42. 如請求項40或41之醫藥組成物，其中該(i)中之結合第二生物分子之化合物為抗體或其抗原結合片段；其中視情況該抗原結合抗體片段選自由以下各項組成之群：Fab、Fab-C、Fab'-SH、Fv、scFv及(Fab')2片段。
  43. 一種抗體結合物，其包含(i)如請求項1至12中任一項之抗體及(ii)共價連接於該抗體之親水性聚合物。
  44. 如請求項43之抗體結合物，其中(i)該親水性聚合物為透明質酸(HA)聚合物或聚乙二醇(PEG)聚合物；其中視情況(ii)該親水性聚合物為HA聚合物；且其中視情況(iii)該HA聚合物具有約1兆道爾頓(MDa)或更低之分子量。
  45. 一種抗體結合物，其包含(i)特異性結合VEGF之抗體及(ii)共價連接於該抗體之HA聚合物，其中該HA聚合物具有1MDa或更低之分子量。
  46. 如請求項44或45之抗體結合物，其中(i)該HA聚合物具有介於約25kDa與約500kDa之間的分子量；其中視情況(ii)該HA聚合物具有介於約100kDa與約250kDa之間的分子量；且其中視情況(iii)該HA聚合物具有約200kDa之分子量。
  47. 如請求項46之抗體結合物，其中(i)該HA聚合物未交聯；其中視情況(ii)該抗體為結合VEGF之抗體片段；其中視情況(iii)該抗體片段選自由以下各項組成之群：Fab、Fab-C、Fab'、Fab'-SH、Fv、scFv及(Fab')2片段；其中視情況(iv)該抗體片段為Fab、Fab-C或Fab'；其中視情況(v)該抗體結合物具有介於約10nm與約60nm之間的流體動力學半徑；其中視情況(vi)該抗體結合物具有介於約25nm與約35nm之間的流體動力學半徑；其中視情況 (vii)該流體動力學半徑為約28nm；且其中視情況(viii)該抗體結合物具有相對於非共價連接於該親水性聚合物之參考抗體有所增加的眼部半衰期；其中視情況(ix)該眼部半衰期相對於該參考抗體增加至少約2倍；且其中視情況(x)該眼部半衰期相對於該參考抗體增加至少約4倍。
  48. 如請求項47之抗體結合物，其中該(viii)-(x)中之眼部半衰期為玻璃體半衰期；其中視情況該參考抗體與該抗體結合物之該抗體一致。
  49. 如請求項43之抗體結合物，其中(i)該抗體藉由可逆前藥連接子而共價連接於該聚合物；其中視情況(ii)該聚合物為水凝膠；其中視情況(iii)該水凝膠為基於PEG之水凝膠。
  50. 如請求項49之抗體結合物，其中該(ii)或(iii)中之水凝膠呈微粒狀珠粒之形狀。
  51. 一種融合蛋白質，其包含共價連接於HA結合域之如請求項1至12中任一項之抗體。
  52. 如請求項51之融合蛋白質，其中(i)該HA結合域共價連接於該抗體之重鏈或輕鏈；其中視情況(ii)該HA結合域共價連接於該重鏈之C末端或該輕鏈之C末端；其中視情況(iii)該融合蛋白質進一步包含連接子，該連接子位於該抗體與該HA結合域之間；其中視情況(iv)該連接子包含胺基酸序列GGGGS(SEQ ID NO：61)；其中視情況(v)該連接子由胺基酸序列GGGGS(SEQ ID NO：61)組成；其中視情況(vi)該抗體為結合VEGF之抗體片段；其中視情況(vii)該抗體片段選自由以下各項組成之群：Fab、Fab-C、Fab'、Fab'-SH、Fv、scFv及(Fab')2片段；其中視情況(viii)該抗體片段為Fab；其中視情況(ix)該HA結合域共價連接於該Fab之CH1域或該Fab之CL域之 C末端；其中視情況(x)該HA結合域選自由以下各項組成之群：連接模組、G1域及富離胺酸寡肽；其中視情況(xi)該HA結合域為連接模組；其中視情況(xii)該連接模組選自由以下各項組成之群：腫瘤壞死因子刺激基因6(TSG6)、CD44、淋巴管內皮透明質酸受體1(LYVE-1)、透明質酸及蛋白聚糖連接蛋白(HAPLN)1、HAPLN2、HAPLN3、HAPLN4、聚集蛋白聚糖、短小蛋白聚糖、神經蛋白聚糖、磷酸蛋白聚糖、多能蛋白聚糖、CAB61358、KIA0527、穩定素-1及穩定素-2連接模組；其中視情況(xiii)該連接模組為TSG6連接模組；其中視情況(xiv)該TSG6連接模組為人類TSG6連接模組或兔TSG6連接模組；其中視情況(xv)該TSG連接模組為人類TSG6連接模組；其中視情況(xvi)該人類TSG6連接模組包含人類TSG6之胺基酸殘基36-128；其中視情況(xvii)該融合蛋白質進一步包含至少一個額外HA結合域；其中視情況(xviii)該至少一個額外HA結合域共價連接於該抗體之重鏈或輕鏈。
  53. 如請求項52之融合蛋白質，於(xvii)或(xviii)中，其中(i)該至少一個額外HA結合蛋白質藉由連接子而連接於該抗體；其中視情況(ii)該連接子包含胺基酸序列GGGGS(SEQ ID NO：61)；其中視情況(iii)該連接子由胺基酸序列GGGGS(SEQ ID NO：61)組成；其中視情況(iv)第一HA結合域共價連接於該重鏈且第二HA結合域共價連接於該輕鏈；其中視情況(v)該第一HA結合域連接於該重鏈之C末端且該第二HA結合域連接於該輕鏈之C末端；其中視情況(vi)該至少一個額外HA結合蛋白質選自由以下各項組成之群：連 接模組、G1域及富離胺酸寡肽；其中視情況(vii)該至少一個額外HA結合蛋白質為連接模組；其中視情況(viii)該連接模組為TSG6連接模組；其中視情況(ix)該TSG6連接模組為人類TSG6連接模組或兔TSG6連接模組；其中視情況(x)該TSG6連接模組為人類TSG6連接模組。
  54. 如請求項53之融合蛋白質，其中(ix)或(x)中之該人類TSG6連接模組包含人類TSG6之胺基酸殘基36-128。
  55. 如請求項51至54中任一項之融合蛋白質，其中(i)該融合蛋白質特異性結合VEGF及HA；其中視情況(ii)該融合蛋白質以約2μM或更低之Kd結合HA；其中視情況(iii)該融合蛋白質以介於約1nM與約500nM之間的Kd結合HA；其中視情況(iv)該融合蛋白質以介於約1nM與約50nM之間的Kd結合HA；其中視情況(v)該融合蛋白質以約10nM之Kd結合HA；且其中視情況(vi)該融合蛋白質具有相對於非共價連接於HA結合域之參考抗體有所增加的眼部半衰期；其中視情況(vii)該眼部半衰期相對於該參考抗體增加至少約2倍；且其中視情況(viii)該眼部半衰期相對於該參考抗體增加至少約4倍。
  56. 如請求項55之融合蛋白質，其中該(vi)-(viii)中之眼部半衰期為玻璃體半衰期；其中視情況該參考抗體與該融合蛋白質之該抗體一致。
  57. 一種如請求項43至50中任一項之抗體結合物之用途，其用於製備在患有與病理性血管生成相關之病症的個體中減少或抑制血管生成的藥劑。
  58. 一種如請求項43至50中任一項之抗體結合物之用途，其用於製備治療與病理性血管生成相關之病症的藥劑。
  59. 一種如請求項51至56中任一項之融合蛋白質之用途，其用於製備在患有與病理性血管生成相關之病症的個體中減少或抑制血管生成的藥 劑。
  60. 一種如請求項51至56中任一項之融合蛋白質之用途，其用於製備治療與病理性血管生成相關之病症的藥劑。
  61. 如請求項57至60中任一項之用途，其中(i)該與病理性血管生成相關之病症為眼部病症；其中視情況(ii)該眼部病症選自由以下各項組成之群：AMD、黃斑變性、黃斑水腫、DME(包括局部非中心性DME及擴散性中心參與性DME)、視網膜病、DR(包括PDR、NPDR及高原DR)、其他局部缺血相關性視網膜病、ROP、RVO(包括CRVO及BRVO形式)、CNV(包括近視性CNV)、角膜新血管形成、與角膜新血管形成相關之疾病、視網膜新血管形成、與視網膜/脈絡膜新血管形成相關之疾病、病理性近視、馮希伯-林島氏病、眼組織胞漿菌病、FEVR、柯氏病、諾裡氏病、OPPG、結膜下出血、虹膜發紅、眼部新血管疾病、新血管性青光眼、RP、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤性增生、黃斑毛細血管擴張、虹膜新血管形成、眼內新血管形成、視網膜變性、CME、血管炎、視乳頭水腫、視網膜炎、結膜炎(包括感染性結膜炎及非感染性(例如過敏性)結膜炎)、萊伯先天性黑矇、葡萄膜炎(包括感染性及非感染性葡萄膜炎)、脈絡膜炎、眼組織胞漿菌病、瞼緣炎、乾眼症、創傷性眼損傷及修格連氏病；其中視情況(iii)該眼部病症為AMD、DME、DR或RVO；其中視情況(iv)該眼部病症為AMD。
  62. 如請求項61之用途，其中該AMD為濕性AMD。
  63. 如請求項57至60中任一項之用途，其中(i)該藥劑係供與第二藥劑一起投與，其中該第二藥劑選自由以下各項組成之群：另一抗體、抗血管生成劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、皮質類固醇、止痛劑及與第二生物分子結合之化合物；其中視情況(ii)該抗血管生成劑為VEGF拮抗劑；其中視情況(iii)該VEGF拮抗劑為抗VEGF抗體、抗VEGF受體抗體、可溶性VEGF受體融合蛋白質、適體、抗VEGF DARPin®或VEGFR酪胺酸激酶抑制劑；其中視情況 (iv)該抗VEGF抗體為雷珠單抗(LUCENTIS®)、RTH-258或雙特異性抗VEGF抗體；其中視情況(v)該雙特異性抗VEGF抗體為抗VEGF/抗Ang2抗體；且其中視情況(vi)該抗VEGF/抗Ang2抗體為RG-7716。
  64. 如請求項63之用途，其中(iii)中之該可溶性VEGF受體融合蛋白質為阿柏西普(EYLEA®)，或其中該適體為哌加他尼(MACUGEN®)，或其中該抗VEGF DARPin®為abicipar pegol，或其中該VEGFR酪胺酸激酶抑制劑選自由以下各項組成之群：4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯啶-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、瓦他拉尼(PTK787)、司馬沙尼(SU5416)及SUTENT®(舒尼替尼)。
  65. 如請求項63之用途，其中該(i)中之第二生物分子選自由以下各項組成之群：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體；ST-2受體；及與AMD風險基因相關之蛋白質；其中視情況該VEGF受體為VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR，或該與AMD風險基因相關之蛋白質選自由以下各項組成之群：補體途徑組件C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC、COL10A1；及TNFRSF10A。
  66. 如請求項63之用途，其中(i)中之該結合第二生物分子之化合物為抗體或其抗原結合片段；其中視情況該抗原結合抗體片段選自由以下各項組成之群：Fab、Fab-C、Fab'-SH、Fv、scFv及(Fab')2片段。
  67. 如請求項57至60中任一項之用途，其中(i)該藥劑係供經玻璃體內、經眼、經眼內、經鞏膜旁、經德濃氏 囊下、經脈絡膜周隙、經局部、經靜脈內、經肌肉內、經真皮內、經皮膚、經動脈內、經腹膜內、經病變內、經顱骨內、經關節內、經前列腺內、經胸膜內、經氣管內、經鞘內、經鼻內、經陰道內、經直腸內、經腫瘤內、經腹膜內、經腹膜、經心室內、經皮下、經結膜下、經膀胱內、經黏膜、經心包內、經臍靜脈內、經眶內、經口、透皮、藉由吸入、藉由注射、藉由滴眼劑、藉由植入、藉由輸注、藉由連續輸注、藉由直接局部灌注浸浴靶細胞、藉由導管、藉由灌洗、於乳膏中或於脂質組成物中投與；其中視情況(ii)該藥劑係供經玻璃體內、經眼、經眼內、經鞏膜旁、經德濃氏囊下、經脈絡膜周隙或局部投與；其中視情況(iii)該藥劑係供藉由注射而經玻璃體內投與，或藉由滴眼劑或軟膏而經局部投與。
  68. 如請求項67之用途，其中該藥劑係供藉由孔口式遞送裝置投與。
  69. 如請求項57至60中任一項之用途，其中該個體為人類。
  70. 一種醫藥組成物，其包含如請求項43至50中任一項之抗體結合物。
  71. 一種醫藥組成物，其包含如請求項51至56中任一項之融合蛋白質。
  72. 一種如請求項70或71之醫藥組成物之用途，其用於製備在哺乳動物中治療與病理性血管生成相關之病症之藥劑。
  73. 如請求項72之用途，其中(i)該與病理性血管生成相關之病症為眼部病症；其中視情況(ii)該眼部病症選自由以下各項組成之群：AMD、黃斑變性、黃斑水腫、DME(包括局部非中心性DME及擴散性中心參與性DME)、視網膜病、DR(包括PDR、NPDR及高原DR)、其他局部缺血相關性視網膜病、ROP、RVO(包括CRVO及BRVO形式)、CNV(包括近視性CNV)、角膜新血管形成、與角膜新血管形成相關之疾病、視網膜新血管形成、與視網膜/脈絡膜新血管形成相關之疾病、病理性近視、馮希伯-林島氏病、眼組織胞漿菌病、FEVR、柯氏病、諾裡氏病、OPPG、結膜下出血、虹膜發紅、眼部新血管疾病、新血管性青光眼、RP、高血壓性視網膜病變、視網膜血管瘤性增生、黃斑毛細血管擴張、虹膜新血管形成、眼內新血管形成、視網膜變性、CME、血管炎、視乳頭 水腫、視網膜炎、結膜炎(包括感染性結膜炎及非感染性(例如過敏性)結膜炎)、萊伯先天性黑矇、葡萄膜炎(包括感染性及非感染性葡萄膜炎)、脈絡膜炎、眼組織胞漿菌病、瞼緣炎、乾眼症、創傷性眼損傷及修格連氏病；且其中視情況(iii)該眼部病症為AMD、DME、DR或RVO。
  74. 如請求項73之用途，其中該眼部病症為AMD。
  75. 如請求項73或74之用途，其中該AMD為濕性AMD。
  76. 如請求項70或71之醫藥組成物，其進一步包含第二藥劑，其中(i)該第二藥劑選自由以下各項組成之群：另一抗體、抗血管生成劑、細胞因子、細胞因子拮抗劑、皮質類固醇、止痛劑及與第二生物分子結合之化合物；其中視情況(ii)該抗血管生成劑為VEGF拮抗劑；其中視情況(iii)該VEGF拮抗劑為抗VEGF抗體、抗VEGF受體抗體、可溶性VEGF受體融合蛋白質、適體、抗VEGF DARPin®或VEGFR酪胺酸激酶抑制劑；其中視情況(iv)該抗VEGF抗體為雷珠單抗(LUCENTIS®)、RTH-258或雙特異性抗VEGF抗體；其中視情況(v)該雙特異性抗VEGF抗體為抗VEGF/抗Ang2抗體；且其中視情況(vi)該抗VEGF/抗Ang2抗體為RG-7716。
  77. 如請求項76之醫藥組成物，其中(iii)中之該可溶性VEGF受體融合蛋白質為阿柏西普(EYLEA®)，或其中該適體為哌加他尼(MACUGEN®)，或其中該抗VEGF DARPin®為abicipar pegol，或其中該VEGFR酪胺酸激酶抑制劑選自由以下各項組成之群：4-(4-溴-2-氟苯胺基)-6-甲氧基-7-(1-甲基哌啶-4-基甲氧基)喹唑啉(ZD6474)、4-(4-氟-2-甲基吲哚-5-基氧基)-6-甲氧基-7-(3-吡咯啶-1-基丙氧基)喹唑啉(AZD2171)、瓦他拉尼(PTK787)、司馬沙尼(SU5416)及SUTENT®(舒尼替尼)。
  78. 如請求項76之醫藥組成物，其中(i)該第二生物分子選自由以下各項組成之群：IL-1β；IL-6；IL-6R；IL-13；IL-13R；PDGF；血管生成素；血管生成素2；Tie2；S1P；整合素αvβ3、αvβ5及α5β1；β細胞素；apelin/APJ；紅血球生成素；補體因子D；TNFα；HtrA1；VEGF受體；ST-2受體；及與AMD風險基因相關之蛋白質；其中視情況(ii)該VEGF受體為VEGFR1、VEGFR2、VEGFR3、mbVEGFR或sVEGFR，或(iii)該與AMD風險基因相關之蛋白質選自由以下各項組成之群：補體途徑組件C2、因子B、因子H、CFHR3、C3b、C5、C5a及C3a；HtrA1；ARMS2；TIMP3；HLA；IL-8；CX3CR1；TLR3；TLR4；CETP；LIPC、COL10A1；及TNFRSF10A。
  79. 如請求項76之醫藥組成物，其中該結合第二生物分子之化合物為抗體或其抗原結合片段；其中視情況該抗原結合抗體片段選自由以下各項組成之群：Fab、Fab-C、Fab'-SH、Fv、scFv及(Fab')2片段。
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