JP2023546229A - 眼の疾患の処置のためのアゴニスト性ＴｒｋＢ結合分子 - Google Patents

眼の疾患の処置のためのアゴニスト性ＴｒｋＢ結合分子 Download PDF

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Abstract

本発明は、アゴニスト性ＴｒｋＢ結合分子、アゴニスト性ＴｒｋＢ結合分子を改善するための方法、医薬におけるその使用、それを含む医薬組成物並びに眼の疾患の治療及び／又は予防のための薬剤としてそれを使用する方法に関する。

Description

発明の分野
本発明は、アゴニスト性ＴｒｋＢ結合分子、アゴニスト性ＴｒｋＢ結合分子を改善するための方法、アゴニスト性ＴｒｋＢ結合分子を製造し又は生成するための方法、医薬におけるその使用、それを含む医薬組成物並びに例えば、眼の疾患の治療及び／又は予防のための薬剤としてそれを使用する方法に関する。
発明の背景
トロポミオシンレセプターキナーゼＢ（ＴｒｋＢ）は、チロシンレセプターキナーゼＢ又はＢＤＮＦ／ＮＴ－３増殖因子レセプター又は神経栄養チロシンキナーゼレセプター２型としても公知であり、ヒトにおいてＮＴＲＫ２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ：４９１５）によりコードされるタンパク質である。ＴｒｋＢは脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）についてのレセプターである。
神経栄養チロシンキナーゼレセプターＢ（ＴｒｋＢ；遺伝子記号：ＮＴＲＫ２）は、網膜ニューロン及びグリア細胞に発現する。正常な網膜では、ＴｒｋＢシグナル伝達は、細胞ストレスに対抗し、細胞生存を促進する。病気にかかった眼、例えば、糖尿病性網膜症又は地図状萎縮においては、視力障害及び視力喪失を引き起こす網膜ニューロン及びグリア細胞の喪失及び機能障害が生じる。ベースレベルを上回るＴｒｋＢシグナル伝達の活性化（糖尿病性網膜症では低下する）により、ニューロン及びグリア細胞の喪失及び機能障害が打ち消され、このため、視覚機能を改善することができる。さらに、ＴｒｋＢ活性化は、病気にかかった眼において失われたシナプス結合を再生し、それにより、視覚機能の回復を促進する可能性を有する。リガンドが結合すると、ＴｒｋＢは、ホモ二量体化し、続けて、自己リン酸化する。リン酸化部位（Ｙ５１６、Ｙ７０２、Ｙ７０６、Ｙ７０７又はＹ８１７）に応じて、種々のシグナル伝達経路が活性化され、軸索／神経突起伸長を誘引し、シナプス可塑性を向上させ又は細胞生存を増加させる別個の重複シグナル伝達カスケードを制御するＰＬＣγ１又はＡＫＴ及びＥＲＫの異なるサブフォームの活性を含む。
アゴニスト性抗ＴｒｋＢ抗体は、ＵＳ第２０１００１９６３９０号及び同第２０１００１５０９１４号に記載されており、それらには、例えば、シャルコー－マリー－トゥース病又は糖尿病の処置における使用が提唱されている。
しかしながら、ＴｒｋＢ経路を活性化するのに使用することができ、それにより、例えば、神経変性障害及び精神障害の治療的介入におけるそれらの使用が可能となる、新規でより有効なアゴニスト分子が依然として明らかに必要とされている。
発明の概要
本発明は、本発明のＴｒｋＢ結合分子におけるＴｒｋＢ結合部位（２つのｓｃＦｖ）の設計がＴｒｋＢ結合及び活性化の最適な立体形成を明らかに支持するという驚くべき知見に基づいている。本発明は、２つのｓｃＦｖを含むか又はそれらからなり、ここで、各ｓｃＦｖがＴｒｋＢに特異的に結合し、両方ともＴｒｋＢアゴニストとして作用する、ＴｒｋＢ結合分子を対象とする。理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、ＴｒｋＢ結合分子内で２つのｓｃＦｖを組み合わせることにより、観察された完全なＴｒｋＢアゴニスト活性をもたらす最適な立体形成が達成されると考えている。
第１の態様では、本発明は、２つのｓｃＦｖを含むか又はそれらからなり、ここで、各ｓｃＦｖがＴｒｋＢに特異的に結合する、ＴｒｋＢ結合分子に関する。
第１の態様に関する実施態様では、ｓｃＦｖ同士が、ヒンジ領域又はリンカーを介して連結している。
第１の態様に関する実施態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、Ｆｃ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、（ｓｃＦｖ’）２又はｓｃＦｖ－ＣＨ３のフォーマットにある。
第１の態様に関する実施態様又はその実施態様のいずれかにおいては、ＴｒｋＢ結合分子は、Ｉｇ分子をさらに含む。さらに、この実施態様に関して、Ｉｇ分子は、モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラ抗体、抗体のフラグメント、例えば、Ｆｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’もしくはＦ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体、例えば、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、小モデュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、ドメイン抗体、ナノボディ又はダイアボディである。さらに、これらの実施態様に関して、各ｓｃＦｖは、Ｉｇ分子の重鎖のＣ末端に融合している。さらに、これらの実施態様に関して、各ｓｃＦｖは、Ｉｇ分子の重鎖のＮ末端に融合している。さらに、これらの実施態様に関して、Ｉｇ分子は、ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ）又はＦ（ａｂ’）２である。さらに、これらの実施態様に関して、Ｉｇ分子は、Ｆｃ領域を含むか又はそれからなる。さらに関連する実施態様では、各ｓｃＦｖは、ペプチドリンカー、好ましくは、約４～２０個のアミノ酸の長さを有するペプチドリンカーによりＩｇ分子に融合している。
第１の態様に関する実施態様又はその実施態様のいずれかにおいては、２つのｓｃＦｖは、同じエピトープに結合するか又は異なるエピトープに結合する。
第１の態様に関する実施態様又はその実施態様のいずれかにおいては、２つのｓｃＦｖはそれぞれ、ＴｒｋＢアゴニスト、好ましくは、部分的アゴニストである。
第１の態様に関する実施態様又はその実施態様のいずれかにおいては、ＴｒｋＢ結合分子は、ＴｒｋＢアゴニストである。
第１の態様に関する実施態様又はその実施態様のいずれかにおいては、ＴｒｋＢ結合分子は、二重特異性かつ四価である。
第２の態様では、本発明は、アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの有効性を改善するための方法であって、アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーが軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含有し、
（ｉ）アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーのＶＬ及びＶＨにより第１の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を生成することと、
（ｉｉ）工程（ｉ）のアゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの同じかもしくは実質的に同じＶＬ及びＶＨ又は異なるアゴニスト性ＴｒｋＢバインダーのＶＬ及びＶＨにより第２のｓｃＦｖを生成することと、
（ｉｉｉ）第１及び第２のｓｃＦｖをＴｒｋＢ結合分子内に含ませることであって、ＴｒｋＢ結合分子が工程（ｉ）及び（ｉｉ）からの少なくとも２つのアゴニスト性ＴｒｋＢ結合ｓｃＦｖを含み、
ここで、ＴｒｋＢ結合分子がアゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの有効性と比較して、より高い有効性を有し、ここで、この有効性がＴｒｋＢレセプターを安定に発現するＣＨＯ細胞をアゴニスト性ＴｒｋＢバインダー又はＴｒｋＢ結合分子と共にインキュベーションし、処理されたＣＨＯ細胞の細胞ライセート中において、Ｙ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化を測定することにより決定された最大応答である、方法に関する。
第２の態様に関する実施態様又はその実施態様のいずれかにおいては、アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーは、部分的アゴニストである。
第２の態様に関する実施態様又はその実施態様のいずれかにおいては、アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの有効性と比較して、ＴｒｋＢ結合分子の有効性は、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％高い。
第２の態様に関する実施態様又はその実施態様のいずれかにおいては、ＴｒｋＢ結合分子は、ＢＤＮＦと比較して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％有効である。
第２の態様に関する実施態様又はその実施態様のいずれかにおいては、２つのアゴニスト性ＴｒｋＢ結合ｓｃＦｖは、同じエピトープに結合するか又は異なるエピトープに結合する。
第２の態様に関する実施態様又はその実施態様のいずれかにおいては、２つのアゴニスト性ＴｒｋＢ結合ｓｃＦｖは同一である。
第２の態様に関する実施態様又はその実施態様のいずれかにおいては、ｓｃＦｖ同士が、ヒンジ領域又はリンカーを介して連結している。
第２の態様に関する実施態様又はその実施態様のいずれかにおいては、ＴｒｋＢ結合分子は、Ｆｃ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、（ｓｃＦｖ’）２又はｓｃＦｖ－ＣＨ３のフォーマットにある。
第２の態様に関する実施態様又はその実施態様のいずれかにおいては、ＴｒｋＢ結合分子は、Ｉｇ分子をさらに含む。
第２の態様に関する実施態様又はその実施態様のいずれかにおいては、Ｉｇ分子は、モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラ抗体、抗体のフラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’もしくはＦ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体、例えば、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、小モデュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、ドメイン抗体、ナノボディ又はダイアボディである。
第２の態様に関する実施態様又はその実施態様のいずれかにおいては、各ｓｃＦｖは、Ｉｇ分子の重鎖のＣ末端に融合している。
第２の態様に関する実施態様又はその実施態様のいずれかにおいては、各ｓｃＦｖは、Ｉｇ分子の重鎖のＮ末端に融合している。
第２の態様に関する実施態様又はその実施態様のいずれかにおいては、Ｉｇ分子は、ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ）又はＦ（ａｂ’）２である。
第２の態様に関する実施態様又はその実施態様のいずれかにおいては、Ｉｇ分子は、Ｆｃ領域を含むか又はそれからなる。
第２の態様に関する実施態様又はその実施態様のいずれにおいては、各ｓｃＦｖは、ペプチドリンカー、好ましくは、約４～２０個のアミノ酸の長さを有するペプチドリンカーによりＩｇ分子に融合している。
第２の態様に関する実施態様又はその実施態様のいずれかにおいては、ＴｒｋＢ結合分子は、ＴｒｋＢアゴニストである。
第２の態様に関する実施態様又はその実施態様のいずれかにおいては、アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーは二価である。
第２の態様に関する実施態様又はその実施態様のいずれかにおいては、アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーは、二重特異性の部分的アゴニストである。
第３の態様では、本発明は、二価の部分的アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの有効性を改善するための方法であって、二価の部分的アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーが軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含有し、
（ｉ）アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーのＶＬ及びＶＨにより第１の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を生成することと、
（ｉｉ）工程（ｉ）のアゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの同じか又は実質的に同じＶＬ及びＶＨにより第２のｓｃＦｖを生成することと、
（ｉｉｉ）第１及び第２のｓｃＦｖをＴｒｋＢ結合分子内に含ませることであって、ＴｒｋＢ結合分子が工程（ｉ）及び（ｉｉ）からの少なくとも２つのアゴニスト性ＴｒｋＢ結合ｓｃＦｖを含み、
ここで、ＴｒｋＢ結合分子が二価の部分的アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの有効性と比較して、より高い有効性を有し、ここで、この有効性がＴｒｋＢレセプターを安定に発現するＣＨＯ細胞をアゴニスト性ＴｒｋＢバインダー又はＴｒｋＢ結合分子と共にインキュベーションし、処理されたＣＨＯ細胞の細胞ライセート中において、Ｙ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化を測定することにより決定された最大応答である、方法に関する。
第３の態様に関する実施態様又はその実施態様のいずれかにおいては、二価の部分的アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーは、ＩｇＧである。
第３の態様に関する実施態様又はその実施態様のいずれかにおいては、ＴｒｋＢ結合分子は、Ｆｃ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、（ｓｃＦｖ’）２又はｓｃＦｖ－ＣＨ３のフォーマットにある。
第３の態様に関する実施態様又はその実施態様のいずれかにおいては、ＴｒｋＢ結合分子は、二重特異性かつ四価である。
関連する態様では、本発明は、ベースとなるアゴニスト性ＴｒｋＢバインダーと比較して改善された有効性を有するＴｒｋＢ結合分子を製造し又は生成する方法であって、アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーが軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含有し、
（ｉ）アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーのＶＬ及びＶＨにより第１の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を生成することと、
（ｉｉ）工程（ｉ）のアゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの同じか又は実質的に同じＶＬ及びＶＨにより第２のｓｃＦｖを生成することと、
（ｉｉｉ）第１及び第２のｓｃＦｖをＴｒｋＢ結合分子内に含ませることであって、ＴｒｋＢ結合分子が工程（ｉ）及び（ｉｉ）からの少なくとも２つのアゴニスト性ＴｒｋＢ結合ｓｃＦｖを含み、
ここで、ＴｒｋＢ結合分子がアゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの有効性と比較して、より高い有効性を有し、ここで、この有効性がＴｒｋＢレセプターを安定に発現するＣＨＯ細胞をアゴニスト性ＴｒｋＢバインダー又はＴｒｋＢ結合分子と共にインキュベーションし、処理されたＣＨＯ細胞の細胞ライセート中において、Ｙ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化を測定することにより決定された最大応答である、方法を対象とする。
第４の態様では、本発明は、第１の態様又は第１の態様に関する任意の実施態様のＴｒｋＢ結合分子の（ｉ）重鎖もしくは重鎖可変ドメイン及び／又は（ｉｉ）軽鎖もしくは軽鎖可変ドメインをコードする、単離された核酸分子に関する。
第５の態様では、本発明は、第４の態様の単離された核酸分子を含む、ウイルスベクターに関する。
第６の態様では、本発明は、第５の態様の核酸分子を含む、発現ベクターに関する。
第７の態様では、本発明は、第６の態様の発現ベクターでトランスフェクションされた、宿主細胞に関する。
第８の態様では、本発明は、
（ａ）以下の分子の発現を可能にする条件下で、第７の態様の宿主細胞を培養することと、
（ｂ）該分子を回収することと、場合により、
（ｃ）該分子をさらに精製しかつ／又は修飾しかつ／又は製剤化することとを含む、
第１の態様又は第１の態様に関する任意の実施態様のＴｒｋＢ結合分子を製造する方法に関する。
第９の態様では、本発明は、医薬に使用するためのものであり、ここで、該使用が眼もしくは網膜の疾患又は神経変性疾患の処置である、第１の態様又は第１の態様に関する任意の実施態様のＴｒｋＢ結合分子に関する。関連する実施態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、第９の態様の使用のためのものであり、該使用は、黄斑変性症、加齢黄斑変性症、滲出性加齢黄斑変性症（ｗＡＭＤ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜色素変性症、遺伝性網膜ジストロフィー、遺伝性黄斑ジストロフィー、近視性変性症、地図状萎縮症、網膜動脈閉塞症、眼内炎、ブドウ膜炎、嚢胞様黄斑浮腫、任意の網膜疾患に続発する脈絡膜新生血管膜、視神経症、緑内障、網膜剥離、中毒性網膜症、放射線網膜症並びに外傷性網膜症、前駆型及び軽度から中等度のアルツハイマー病、アルツハイマー病を有する患者の疾患進行の遅延、ハンチントン病、パーキンソン病、大うつ病性障害、統合失調症、統合失調症に関連する認知障害、減弱精神病症候群を有する個体における初発精神病の予防、統合失調症を有する患者における再発の予防、処置抵抗性うつ病、過食症、肥満又はメタボリックシンドロームの治療及び／又は予防のためのものである。
第１０の態様では、本発明は、薬学的に許容し得る担体と、第１の態様又は第１の態様に関する任意の実施態様のＴｒｋＢ結合分子とを含む、医薬組成物に関する。
図１：シリーズ１～シリーズ４の単一のＶＥＧＦ－ＴｒｋＢ結合分子の設計の図。 図２Ａ～図２Ｂ：（Ａ）ＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）又は（Ｂ）ＥＲＫ１／２リン酸化（Ｔ２０２／Ｙ２０４－ＥＲＫ１）（Ｔ１８５／Ｙ１８７－ＥＲＫ２）を上昇する濃度の示された分子とインキュベーションした後に、ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞において測定した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図３Ａ～図３Ｄ：ＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）を上昇する濃度の示された分子とインキュベーションした後に、（Ａ）カニクイザルＴｒｋＢ、（Ｂ）ウサギＴｒｋＢ、（Ｃ）ラットＴｒｋＢ又は（Ｄ）マウスＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞において測定した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図４Ａ～図４Ｃ：Ｔｒｋリン酸化（Ｙ７０６／７０７）を上昇する濃度の示された分子とインキュベーションした後に、（Ａ）ヒトＴｒｋＡ、（Ｂ）ヒトＴｒｋＢ、又は（Ｃ）ヒトＴｒｋＣを安定に発現するＣＨＯ細胞において測定した。ＴｒｋＡについての天然のリガンドであるＮＧＦ、ＴｒｋＢについてのＢＤＮＦ及びＴｒｋＣについてのＮＴ－３を対照として使用した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図５Ａ～図５Ｂ：（Ａ）ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を示された濃度の天然ＴｒｋＢリガンドＢＤＮＦ（ダプリケート）、示された濃度のアゴニスト性ＴｒｋＢ抗体Ｃ２を伴う１nM ＢＤＮＦ（トリプリケート）又は示された濃度のDoppelmab ＴＰＰ－１１７３６を伴う１nM ＢＤＮＦ（トリプリケート）と共にインキュベーションした。（Ｂ）ＴｒｋＢの内部移行を表面ＴｒｋＢレセプターの免疫蛍光染色、続けて、共焦点顕微鏡分析により評価した。ヒートマップの暗視野及び明視野はそれぞれ、蛍光閾値を上回る細胞の割合の高低を表わす。 図６：２００ng/mL ヒトＶＥＧＦ－Ａのプレインキュベーションの有無で、ＥＲＫ１／２リン酸化（Ｔ２０２／Ｙ２０４－ＥＲＫ１）（Ｔ１８５／Ｙ１８７－ＥＲＫ２）を上昇する濃度の示された分子とインキュベーションした後に、ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞において測定した。ＶＥＧＦ－Ａのみとのインキュベーションを対照とした。データは、平均を表わす。明確にするために、エラーバーを省略する。 図７：糖尿病誘発網膜神経変性のラットモデルにおけるＴｒｋＢ活性化の神経保護機能。動物をＳＴＺで処置して、高血糖を誘発した。ついで、網膜機能をアゴニスト性ＴｒｋＢ抗体Ｃ２又はDoppelmab ＴＰＰ－１１７３６の硝子体内適用の直前及び２週間後に、網膜電図（ＥＲＧ）及び桿体駆動Ｂ波暗示時間遅延により評価した。平均＋／－ＳＥＭ；ｎ．ｓ．ｐ＞０．０５、有意差なし；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；テューキーの多重比較検定を使用した一元配置分散分析。抗ＴＮＰをアイソタイプ対照抗体とした。 図８Ａ～図８Ｂ：ＶＥＧＦ－Ａの捕捉を、ＶＥＧＦレセプター２リン酸化（Ｙ１１７５－ＶＥＧＦＲ２）を測定することにより評価した。この目的で、ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度の示された分子とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。（Ａ）Doppelmab ＴＰＰ－１１７３５、－７３６、－７３７及び－７３８の比較。（Ｂ）ＴＰＰ－１１７３６及びＴＰＰ－１１７３８とEYLEA（登録商標）（aflibercept）との比較。非刺激細胞（ベース）及び抗体処理を伴わない５０ng/mL ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図９Ａ～図９Ｂ：ＶＥＧＦ－Ａの捕捉をＥＲＫ１／２リン酸化（Ｔ２０２／Ｙ２０４－ＥＲＫ１）（Ｔ１８５／Ｙ１８７－ＥＲＫ２）により評価した。この目的で、ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度の示された分子とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。（Ａ）Doppelmab ＴＰＰ－１１７３５、－７３６、－７３７及び－７３８の比較。（Ｂ）ＴＰＰ－１１７３６、－７３８とEYLEA (登録商標)（aflibercept）との比較。非刺激細胞（ベース）及び抗体処理を伴わない５０ng/mL ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図１０：ＶＥＧＦ－Ａの捕捉を、ｐ３８ ＭＡＰＫリン酸化（Ｔ１８０／Ｙ１８２）を測定することにより評価した。この目的で、ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度の示された分子とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。非刺激細胞（ベース）及び抗体処理を伴わない５０ng/mL ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図１１Ａ～図１１Ｅ：ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度の示された分子とのプレインキュベーションの有無で、１０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。（Ａ）ＴＰＰ－１１７３５、（Ｂ）ＴＰＰ－１１７３６、（Ｃ）EYLEA (登録商標)（aflibercept）、（Ｄ）ＴＰＰ－１１７３７、（Ｅ）ＴＰＰ－１１７３８。分子濃度をmol/Lで示す。ＶＥＧＦ－Ａの捕捉をＨＲＭＥＣ細胞数の画像に基づく定量化により評価した。相対細胞数を示す。ｔ＝０での細胞数を１に設定した。非刺激細胞を対照（ベース）とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図１２：ＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）を上昇する濃度の示された分子とのインキュベーション後に、ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞において測定した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図１３：ＥＲＫ１／２リン酸化（Ｔ２０２／Ｙ２０４－ＥＲＫ１）（Ｔ１８５／Ｙ１８７－ＥＲＫ２）を上昇する濃度の示された分子とのインキュベーション後に、ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞において測定した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図１４Ａ～図１４Ｂ：ＶＥＧＦ－Ａの捕捉を、（Ａ）ＶＥＧＦレセプター２リン酸化（Ｙ１１７５）又は（Ｂ）ＥＲＫ１／２リン酸化（Ｔ２０２／Ｙ２０４－ＥＲＫ１）（Ｔ１８５／Ｙ１８７－ＥＲＫ２）を測定することにより評価した。この目的で、ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度の示された分子とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。非刺激細胞（ベース）及び抗体処理を伴わない５０ng/mL ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図１５：ＶＥＧＦ－Ａの捕捉をＨＲＭＥＣ細胞数の画像に基づく定量化により評価した。この目的で、ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、０．５nM Doppelmab又は１nM EYLEA (登録商標)（aflibercept）とのプレインキュベーションの有無で、１０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。画像を合計９６時間にわたって４時間毎に記録した。相対細胞数を示す。ｔ＝０での細胞数を１に設定した。非刺激細胞を対照（ベース）とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図１６：内皮の発芽を共焦点顕微鏡により評価し、Ｚスタックの最大投影から得られたスフェロイド外周を示した。この目的で、ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）のスフェロイドをコラーゲンマトリックス中に包埋した。内皮の発芽を２．５nM 示されたDoppelmab又は５nM EYLEA (登録商標)（aflibercept）との２４時間のプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦとのインキュベーションにより２４時間誘発した。非刺激細胞を対照（ベース）とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。ｎ 図１７Ａ～図１７Ｃ： ＶＥＧＦ－Ａの捕捉を、（Ａ）ＶＥＧＦレセプター２リン酸化（Ｙ１１７５）、（Ｂ）ＥＲＫ１／２のリン酸化（Ｔ２０２／Ｙ２０４－ＥＲＫ１）（Ｔ１８５／Ｙ１８７－ＥＲＫ２）又は（Ｃ）ｐ３８ ＭＡＰＫリン酸化（Ｔ１８０／Ｙ１８２）を測定することにより評価した。この目的で、ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度のDoppelmab ＴＰＰ－１１７３６又はＴＰＰ－１３７８８（Ｂ２０ ＩｇＧ）とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。抗体処理を伴わない５０ng/mL ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図１８：内皮の発芽を共焦点顕微鏡により評価し、Ｚスタックの最大投影から得られたスフェロイド外周を示した。この目的で、ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）のスフェロイドをコラーゲンマトリックス中に包埋した。内皮の発芽を２．５nM Doppelmab ＴＰＰ－１１７３６又は２．５nM ＴＰＰ－１３７８８（Ｂ２０ ＩｇＧ）とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦとのインキュベーションにより２４時間誘発した。非刺激細胞を対照（ベース）とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図１９Ａ～図１９Ｃ：（Ａ）ＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）又は（Ｂ及びＣ）ＥＲＫ１／２リン酸化（Ｔ２０２／Ｙ２０４－ＥＲＫ１）（Ｔ１８５／Ｙ１８７－ＥＲＫ２）を上昇する濃度の示された分子とのインキュベーション後に、ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞において測定した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図２０Ａ～図２０Ｂ：ＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）を上昇する濃度の示された分子とのインキュベーション後に、（Ａ）カニクイザルＴｒｋＢ又は（Ｂ）ラットＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞において測定した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図２１Ａ～図２１Ｃ：ＶＥＧＦ－Ａの捕捉を、（Ａ）ＶＥＧＦレセプター２リン酸化（Ｙ１１７５）、（Ｂ）ＥＲＫ１／２リン酸化（Ｔ２０２／Ｙ２０４－ＥＲＫ１）（Ｔ１８５／Ｙ１８７－ＥＲＫ２）又は（Ｃ）Ｓｒｃリン酸化（Ｙ４１９）を測定することにより評価した。この目的で、ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度の示された分子とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。抗体処理を伴わない５０ng/ml ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図２２：内皮の発芽を共焦点顕微鏡により評価し、Ｚスタックの最大投影から得られたスフェロイド外周を示した。この目的で、ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）のスフェロイドをコラーゲンマトリックス中に包埋した。内皮の発芽を２．５nM 示された分子とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦとのインキュベーションにより２４時間誘発した。非刺激細胞を対照（ベース）とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。ｎ．ｓ． ｐ＞０．０５ 有意差なし、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。 図２３Ａ～図２３Ｄ：ＶＥＧＦ－Ａの捕捉をＨＲＭＥＣ細胞数の画像に基づく定量化により評価した。この目的で、ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度の示された分子とのプレインキュベーションの有無で、１０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。非刺激細胞（ベース）及び抗体処理を伴わない５０ng/mL ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。（Ａ）ＴＰＰ－１１７３６、（Ｂ）ＴＰＰ－１４９３６、（Ｃ）ＴＰＰ－１４９３７又は（Ｄ）EYLEA (登録商標)（aflibercept）。結合分子／EYLEA (登録商標)（aflibercept）濃度をmol/Lで示す。画像を合計８４時間にわたって４時間毎に記録した。相対細胞数を示す。ｔ＝０での細胞数を１に設定した。非刺激細胞を対照（ベース）とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図２４Ａ～図２４Ｂ：（Ａ）ＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）又は（Ｂ）ＥＲＫ１／２リン酸化（Ｔ２０２／Ｙ２０４－ＥＲＫ１）（Ｔ１８５／Ｙ１８７－ＥＲＫ２）を上昇する濃度の第２のシリーズの示された分子とのインキュベーション後に、ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞において測定した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図２５：単一の結合分子を使用したＶＥＧＦ誘発クラスター形成の提案された基礎的な効果によりＴｒｋＢ活性化の有効性及び効力が増大したことを示すカートン。 図２６Ａ～図２６Ｂ：ＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）を上昇する濃度の第２のシリーズの示された分子とのインキュベーション後に、（Ａ）カニクイザルＴｒｋＢ又は（Ｂ）ラットＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞において測定した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図２７Ａ～図２７Ｃ：ＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）を２００ng/mL ヒトＶＥＧＦ－Ａとのプレインキュベーションの有無で、上昇する濃度のDoppelmab（Ａ）ＴＰＰ－１４９４０、（Ｂ）ＴＰＰ－１４９４１又は（Ｃ）Ｃ２抗体とのインキュベーション後に、ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞において測定した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図２８Ａ～図２８Ｃ：ＥＲＫ１／２リン酸化（Ｔ２０２／Ｙ２０４－ＥＲＫ１）（Ｔ１８５／Ｙ１８７－ＥＲＫ２）を２００ng/mL ヒトＶＥＧＦ－Ａとのプレインキュベーションの有無で、上昇する濃度のDoppelmab（Ａ）ＴＰＰ－１４９４０、（Ｂ）ＴＰＰ－１４９４１又は（Ｃ）Ｃ２抗体とのインキュベーション後に、ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞において測定した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図２９Ａ～図２９Ｂ：（Ａ）ＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）又は（Ｂ）ＥＲＫ１／２リン酸化（Ｔ２０２／Ｙ２０４－ＥＲＫ１）（Ｔ１８５／Ｙ１８７－ＥＲＫ２）を上昇する濃度のヒトＶＥＧＦ－Ａもしくは上昇する濃度のＢＤＮＦ単独のいずれか又は固定濃度の２００ng/mL ｈＶＥＧＦとの上昇する濃度のＢＤＮＦとのインキュベーション後に、ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞において測定した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図３０Ａ～図３０Ｃ：ＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）を２００ng/mL ヒトＶＥＧＦ－Ａとのプレインキュベーションの有無で、上昇する濃度のDoppelmab（Ａ）ＴＰＰ－１４９４０、（Ｂ）ＴＰＰ－１４９４１又は（Ｃ）Ｃ２抗体とのインキュベーション後に、カニクイザルＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞において測定した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図３１Ａ～図３１Ｃ：ＥＲＫ１／２リン酸化（Ｔ２０２／Ｙ２０４－ＥＲＫ１）（Ｔ１８５／Ｙ１８７－ＥＲＫ２）を２００ng/mL ヒトＶＥＧＦ－Ａとのプレインキュベーションの有無で、上昇する濃度のDoppelmab（Ａ）ＴＰＰ－１４９４０、（Ｂ）ＴＰＰ－１４９４１又は（Ｃ）Ｃ２抗体とのインキュベーション後に、カニクイザルＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞において測定した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図３２Ａ～図３２Ｃ：ＶＥＧＦ－Ａの捕捉を、（Ａ）ＶＥＧＦレセプター２リン酸化（Ｙ１１７５）、（Ｂ）ＥＲＫ１／２リン酸化（Ｔ２０２／Ｙ２０４－ＥＲＫ１）（Ｔ１８５／Ｙ１８７－ＥＲＫ２）又はＳｒｃリン酸化（Ｙ４１９）を測定することにより評価した。この目的で、ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度の示された分子とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。抗体処理を伴わない５０ng/ml ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図３３Ａ～図３３Ｃ：ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度の示された分子とのプレインキュベーションの有無で、１０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。（Ａ）ＴＰＰ－１１７３６、（Ｂ）ＴＰＰ－１４９３８、（Ｃ）ＴＰＰ－１４９３９。分子濃度をmol/Lで示す。ＶＥＧＦ－Ａの捕捉をＨＲＭＥＣ細胞数の画像に基づく定量化により評価した。相対細胞数を示す。ｔ＝０での細胞数を１に設定した。非刺激細胞を対照（ベース）とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図３４Ａ～図３４Ｃ：ＶＥＧＦ－Ａの捕捉を、（Ａ）ＶＥＧＦレセプター２リン酸化（Ｙ１１７５）、（Ｂ）ＥＲＫ１／２リン酸化（Ｔ２０２／Ｙ２０４－ＥＲＫ１）（Ｔ１８５／Ｙ１８７－ＥＲＫ２）又はＳｒｃリン酸化（Ｙ４１９）を測定することにより評価した。この目的で、ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度の示された分子とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。抗体処理を伴わない５０ng/ml ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図３５Ａ～図３５Ｄ：ＶＥＧＦ－Ａの捕捉をＨＲＭＥＣ細胞数の画像に基づく定量化により評価した。この目的で、ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度の（Ａ）ＴＰＰ－１４９３６、（Ｂ）ＴＰＰ－１４９３７、（Ｃ）ＴＰＰ－１４９４０又は（Ｄ）ＴＰＰ－１４９４１とのプレインキュベーションの有無で、１０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。分子濃度をmol/Lで示す。画像を合計８４時間にわたって４時間毎に記録した。相対細胞数を示す。ｔ＝０での細胞数を１に設定した。非刺激細胞を対照（ベース）とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図３６Ａ～図３６Ｃ：ＶＥＧＦ－Ａの捕捉を、（Ａ）ＶＥＧＦレセプター２リン酸化（Ｙ１１７５）、（Ｂ）ＥＲＫ１／２リン酸化（Ｔ２０２／Ｙ２０４－ＥＲＫ１）（Ｔ１８５／Ｙ１８７－ＥＲＫ２）又はＳｒｃリン酸化（Ｙ４１９）を測定することにより評価した。この目的で、ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度の示された分子とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。抗体処理を伴わない５０ng/ml ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図３７Ａ～図３７Ｄ：ＶＥＧＦ－Ａの捕捉をＨＲＭＥＣ細胞数の画像に基づく定量化により評価した。この目的で、ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度の（Ａ）ＴＰＰ－１４９３８、（Ｂ）ＴＰＰ－１４９３９、（Ｃ）ＴＰＰ－１４９４０又は（Ｄ）ＴＰＰ－１４９４１とのプレインキュベーションの有無で、１０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。分子濃度をmol/Lで示す。画像を合計８４時間にわたって４時間毎に記録した。相対細胞数を示す。ｔ＝０での細胞数を１に設定した。非刺激細胞を対照（ベース）とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図３８：内皮の発芽を共焦点顕微鏡により評価し、Ｚスタックの最大投影から得られたスフェロイド外周を示した。この目的で、ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）のスフェロイドをコラーゲンマトリックス中に包埋した。内皮の発芽を２．５nM 示された分子との２４時間のプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦとのインキュベーションにより２４時間誘発した。非刺激細胞を対照（ベース）とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。ｎ．ｓ． ｐ＞０．０５ 有意差なし；５０ng/mL ｈＶＥＧＦと比較して、§ｐ＜０．０００１；５０ng/mL ｈＶＥＧＦと比較して、＃ｐ＞０．０５ 有意差なし。＊＊＊ｐ＜０．００１；テューキーの多重比較検定を使用した一元配置分散分析。 図３９Ａ～図３９Ｂ：（Ａ）実験手法を示す時間プロトコール。抗ＶＥＧＦ化合物（１３又は２６pmol/眼 EYLEA (登録商標)（aflibercept）又はＴＰＰ－１４９４０）又は対照（２６pmol ＴＰＰ－１１７３７）の硝子体内（ｉｖｔ）投与の１５分後、１３pmol/眼 ヒトＶＥＧＦ－Ａをｉｖｔ注射により投与した。ＰＢＳ注射を対照とした。２４時間後、１mL/kg エバンスブルー（ＥＢ）溶液（０．９％ 生理食塩水中の４５mg/mL）を静脈内（ｉｖ）注射により３０分間投与し、その後、眼を単離し、固定した。同じ時点で、血漿サンプルを収集し、全身ＥＢ曝露量が等しいことを確認した。（Ｂ）Brown Norwayラットの網膜におけるＶＥＧＦ－Ａ誘発透過性亢進の定量を、共焦点顕微鏡により網膜フラットマウントにおけるＥＢ血管外漏出を測定することにより行った。眼を鋸状縁に沿って切断し、水晶体及び硝子体を除去し、眼杯をパラホルムアルデヒド（４％）中において、４℃で１時間固定し、ついで、４℃で一晩ＰＢＳに移した。網膜を外側セグメント（強膜及び脈絡膜）から分離し、スライドガラスに移し、４回切断して、平坦なクローバー葉様構造を達成した。組織をマウンティング媒体（ＤＮＡ染色ＤＡＰＩを含有するVectashield（登録商標）antifade mounting media H-1200）で覆い、カバースリップを上に置き、網膜フラットマウントを得た。サンプルを６３９nmの波長で励起し、６６９nmでのエバンスブルーの発光をLSM 700共焦点レーザー走査顕微鏡（Carl Zeiss, Jena；ゲイン８００、レーザー強度２％、５スタック ６０μm）で記録し、最大強度投影を有する網膜フラットマウントの画像を得た。蛍光強度の合計の分析を３０の閾値でプログラムImageJ中において画像を開いた後に行った。＊＊＊ｐ＜０．００１；＊ｐ＜０．０５；ｎ．ｓ． ｐ＞０．０５；＃ｐ＞０．０５ ＴＰＰ－１１７３７＋ＰＢＳに対して有意差なし。テューキーの多重比較検定を使用した一元配置分散分析。ｎ＝９～１７。 図４０Ａ～図４０Ｄ：（Ａ及びＢ）ＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）又は（Ｃ又はＤ）ＥＲＫ１／２リン酸化（Ｔ２０２／Ｙ２０４－ＥＲＫ１）（Ｔ１８５／Ｙ１８７－ＥＲＫ２）を上昇する濃度のＢＤＮＦ又は上昇する濃度の示された分子とのインキュベーション後に、ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞において測定した。 図４１Ａ～図４１Ｂ：（Ａ）ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を、示された濃度の天然のＴｒｋＢリガンドであるＢＤＮＦ（ダプリケート）又は示された濃度のDoppelmab（それぞれトリプリケート）との１nM ＢＤＮＦと共にインキュベーションした。（Ｂ）ＴｒｋＢ内部移行を表面ＴｒｋＢレセプターの免疫蛍光染色、続けて、共焦点顕微鏡分析により評価した。ヒートマップの暗視野及び明視野はそれぞれ、蛍光閾値を上回る細胞の割合の高低を表わす。 図４２：ＶＥＧＦ－Ａの捕捉を、ＶＥＧＦレセプター２リン酸化（Ｙ１１７５）を測定することにより評価した。この目的で、ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度の示された分子とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。分子処理を伴わない５０ng/ml ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図４３：内皮の発芽を共焦点顕微鏡により評価し、Ｚスタックの最大投影から得られたスフェロイド外周を示した。この目的で、ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）のスフェロイドをコラーゲンマトリックス中に包埋した。内皮の発芽を２．５nM 示された分子とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦとのインキュベーションにより２４時間誘発した。非刺激細胞を対照（ベース）とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。ｎ．ｓ． ｐ＞０．０５ 有意差なし；５０ng/mL ｈＶＥＧＦと比較して、§ｐ＜０．０００１；５０ng/mL ｈＶＥＧＦと比較して、＃ｐ＞０．０５ 有意差なし。＊＊＊ｐ＜０．００１；テューキーの多重比較検定を使用した一元配置分散分析。 図４４Ａ～図４４Ｄ：ＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）を上昇する濃度のDoppelmabとインキュベーションした後に、ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞において測定した。（Ａ）ＴＰＰ－２２１８０対ＴＰＰ－２２２０４；（Ｂ）ＴＰＰ－２２１９２対ＴＰＰ－２２２１６；（Ｃ）ＴＰＰ－２２１９０対ＴＰＰ－２２２１４；（Ｄ）ＴＰＰ－２２１９１対ＴＰＰ－２２２１５。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図４５Ａ～図４５Ｂ：ＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）を上昇する濃度のDoppelmabとインキュベーションした後に、ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞において測定した。（Ａ）ＴＰＰ－２２１８０対ＴＰＰ－２２２０４；（Ｂ）ＴＰＰ－２２１９２対ＴＰＰ－２２２１６。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図４６Ａ～図４６Ｃ：ＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）を上昇する濃度のＣ２抗体又はDoppelmab ＴＰＰ－２２２０４もしくはＴＰＰ－２２２１４とインキュベーションした後に、（Ａ）ヒトＴｒｋＡ、（Ｂ）ヒトＴｒｋＢ又は（Ｃ）ヒトＴｒｋＣを安定に発現するＣＨＯ細胞において測定した。ＴｒｋＡについての天然のリガンドであるＮＧＦ、ＴｒｋＢについてのＢＤＮＦ及びＴｒｋＣについてのＮＴ－３を対照として使用した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図４７Ａ～図４７Ｂ：ＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）を（Ａ）一定濃度の０．３nM、１nMもしくは３nM ＢＤＮＦの有無での上昇する濃度のＣ２抗体又は（Ｂ）一定濃度の０．３nM、１nMもしくは３nM ＢＤＮＦの有無での上昇する濃度のDoppelmab ＴＰＰ－２２２０４とインキュベーションした後に、ヒトＴｒｋＢレセプターを安定に発現するＣＨＯ細胞において測定した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図４８Ａ～図４８Ｄ：ＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）を（Ａ）２００ng/mL ヒトＶＥＧＦ－Ａ（ｈＶＥＧＦ）、（Ｂ）５０ng/mL ｈＶＥＧＦ、（Ｃ）１０ng/mL ｈＶＥＧＦ又は（Ｄ）２ng/mL ｈＶＥＧＦとのプレインキュベーションの有無で、上昇する濃度のDoppelmab ＴＰＰ－２２２１４とのインキュベーション後に、ヒトＴｒｋＢレセプターを安定に発現するＣＨＯ細胞において測定した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図４９Ａ～図４９Ｄ：ＥＲＫ１／２リン酸化（Ｔ２０２／Ｙ２０４－ＥＲＫ１）（Ｔ１８５／Ｙ１８７－ＥＲＫ２）を（Ａ）２００ng/mL ヒトＶＥＧＦ－Ａ（ｈＶＥＧＦ）、（Ｂ）５０ng/mL ｈＶＥＧＦ、（Ｃ）１０ng/mL ｈＶＥＧＦ又は（Ｄ）２ng/mL ｈＶＥＧＦとのプレインキュベーションの有無で、上昇する濃度のDoppelmab ＴＰＰ－２２２１４とのインキュベーション後に、ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞において測定した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図５０：Doppelmab複合体のサイズを、多角光散乱検出器と組み合わせたサイズ排除クロマトグラフィーを使用して評価した。示差屈折率（黒色、濃い灰色、薄い灰色及び破線）及び光散乱をタンパク質がサイズ排除カラムから溶出するのにかかる時間にわたってモニターした。光散乱データを、各点におけるモル質量を決定するのに使用する。各ピークの中間点におけるモル質量を星印で示し、右軸を使用して測定する。ＴＰＰ－２２２１４単独（破線）又は種々の比でのＶＥＧＦとの複合体を研究した（黒色 ２０：１、濃い灰色 ４：１、薄い灰色 １：１）。Ａ～Ｄは、測定されたモル質量に基づく可能性のある複合体の模式図を表わす。 図５１Ａ～図５１Ｃ：ＴｒｋＢの内部移行を細胞の透過化を伴わない表面ＴｒｋＢレセプターの免疫蛍光染色、続けて、共焦点顕微鏡分析により評価した。ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を（Ａ）上昇する濃度の天然のＴｒｋＢリガンドであるＢＤＮＦ、（Ｂ）上昇する濃度のＴＰＰ－２２２１４又は（Ｃ）上昇する濃度のＴＰＰ－２２２１４を伴う１nM ＢＤＮＦと共にインキュベーションした。データは、閾値を上回る表面ＴｒｋＢ染色強度有する細胞の割合を表わす。平均＋／－ＳＥＭ。 図５２：糖尿病誘発網膜神経変性のラットモデルにおけるＴｒｋＢ活性化の神経保護機能。動物をＳＴＺで処置して、高血糖を誘発した。ついで、網膜機能をアゴニスト性ＴｒｋＢ抗体Ｃ２又はDoppelmab ＴＰＰ－１１７３６の硝子体内適用の直前及び２週間後に、網膜電図（ＥＲＧ）及び桿体駆動Ｂ波暗示時間遅延により評価した。平均＋／－ＳＥＭ；ｎ．ｓ．ｐ＞０．０５、有意差なし（ｎ．ｓ．）；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；テューキーの多重比較検定を使用した一元配置分散分析。抗ＴＮＰをアイソタイプ対照抗体とした。 図５３Ａ～図５３Ｂ：ＶＥＧＦ－Ａの捕捉を、ＶＥＧＦレセプター２リン酸化（Ｙ１１７５－ＶＥＧＦＲ２）を測定することにより評価した。この目的で、ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度の示された分子とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。（Ａ）Doppelmab ＴＰＰ－１４９４１、ＴＰＰ－２２２１６、ＴＰＰ－２２１９２、ＴＰＰ－２２２０４及びＴＰＰ－２２１８０の比較。（Ｂ）Doppelmab ＴＰＰ－１４９４０、ＴＰＰ－１４９４１、ＴＰＰ－２２１９０、ＴＰＰ－２２２１４、ＴＰＰ－２２１９１及びＴＰＰ－２２２１５の比較。非刺激細胞（ベース）及び抗体処理を伴わない５０ng/ml ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図５４Ａ～図５４Ｂ：ＶＥＧＦ－Ａの捕捉を、（Ａ）ＶＥＧＦレセプター２（ＶＥＧＦＲ２）リン酸化（Ｙ１１７５）又は（Ｂ）ＥＲＫ１／２リン酸化（Ｔ２０２／Ｙ２０４－ＥＲＫ１）（Ｔ１８５／Ｙ１８７－ＥＲＫ２）を測定することにより評価した。この目的で、ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度のＴＰＰ－２２２１４又はEYLEA (登録商標)（aflibercept）とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。分子処理を伴わない５０ng/ml ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図５５Ａ～図５５Ｅ：ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度の示された分子とのプレインキュベーションの有無で、１０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。（Ａ）ＴＰＰＰ－２２２０４、（Ｂ）ＴＰＰ－２２２１４ｃ、（Ｃ）ＴＰＰ－２２２１６又は（Ｄ）EYLEA (登録商標)（aflibercept）。分子濃度をmol/Lで示す。ＶＥＧＦ－Ａの捕捉をＨＲＭＥＣ細胞数の画像に基づく定量化により評価した。画像を合計８４時間にわたって４時間毎に記録した。相対細胞数を示す。ｔ＝０での細胞数を１に設定した。非刺激細胞を対照（ベース）とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。（Ｅ）に、EYLEA (登録商標)（aflibercept）又はＴＰＰ－２２２１４の濃度に対する増殖曲線下面積とベース曲線下面積との差のプロットを示す。 図５６Ａ～図５６Ｂ：ＶＥＧＦ－Ａの捕捉を、（Ａ）ＶＥＧＦレセプター２（ＶＥＧＦＲ２）リン酸化（Ｙ１２１４）又は（Ｂ）ｐ３８－ＭＡＰＫリン酸化（Ｔ１８０／Ｙ１８２）を測定することにより評価した。この目的で、ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度のＴＰＰ－２２２１４又はEYLEA (登録商標)（aflibercept）とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。分子処理を伴わない５０ng/ml ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図５７Ａ～図５７Ｂ：ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）のスフェロイドをコラーゲンマトリックス中に包埋した。内皮の発芽を２．５nM ＴＰＰ－２２２０４、ＴＰＰ－２２２１４、ＴＰＰ－２２２１５、ＴＰＰ－２２２１６又は５nM EYLEA (登録商標)（aflibercept）とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦとのインキュベーションにより２４時間誘発した。内皮の発芽を共焦点顕微鏡により評価し、Ｚスタックの最大投影から得られたスフェロイド外周を示した。非刺激細胞を対照（ベース）とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。ｎ．ｓ． ｐ＞０．０５ 有意差なし；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。（Ｂ）に、ベース条件下での又は２．５nM ＴＰＰ－２２２１４もしくは５nM EYLEA (登録商標)（aflibercept）とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦでの刺激後の２４時間の発芽後のスフェロイドからの代表的な最大投影画像を示す。バー＝１００μm。 図５８Ａ～図５８Ｂ：ＶＥＧＦ－Ａの捕捉を、（Ａ）ＶＥＧＦレセプター２リン酸化（Ｙ９５１）又は（Ｂ）Ｓｒｃリン酸化（Ｙ４１９）を測定することにより評価した。この目的で、ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度のＴＰＰ－２２２１４又はEYLEA (登録商標)（aflibercept）とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。抗体処理を伴わない５０ng/ml ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図５９Ａ～図５９Ｂ：ＴＰＰ－２２２１４により、ラット網膜におけるヒトＶＥＧＦ－Ａ誘発透過性亢進が防止された。（Ａ）実験手法を示す時間プロトコール。抗ＶＥＧＦ化合物（１３又は２６pmol/眼 EYLEA (登録商標)（aflibercept）又はＴＰＰ－１４９４０）又は対照（２６pmol ＴＰＰ－１１７３７）の硝子体内（ｉｖｔ）投与の１５分後、１３pmol/眼 ヒトＶＥＧＦ－Ａをｉｖｔ注射により投与した。ＰＢＳ注射を対照とした。２４時間後、１mL/kg エバンスブルー（ＥＢ）溶液（０．９％ 生理食塩水中の４５mg/mL）を静脈内（ｉｖ）注射により３０分間投与し、その後、眼を単離し、固定した。同じ時点で、血漿サンプルを収集し、全身ＥＢ曝露量が等しいことを確認した。（Ｂ）Brown Norwayラットの網膜におけるＶＥＧＦ－Ａ誘発透過性亢進の定量を、共焦点顕微鏡により網膜フラットマウントにおけるＥＢ血管外漏出を測定することにより行った。眼を鋸状縁に沿って切断し、水晶体及び硝子体を除去し、眼杯をパラホルムアルデヒド（４％）中において、４℃で１時間固定し、ついで、４℃で一晩ＰＢＳに移した。網膜を外側セグメント（強膜及び脈絡膜）から分離し、スライドガラスに移し、４回切断して、平坦なクローバー葉様構造を達成した。組織をマウンティング媒体（ＤＮＡ染色ＤＡＰＩを含有するVectashield（登録商標）antifade mounting media H-1200）で覆い、カバースリップを上に置き、網膜フラットマウントを得た。サンプルを６３９nmの波長で励起し、６６９nmでのエバンスブルーの発光をLSM 700共焦点レーザー走査顕微鏡（Carl Zeiss, Jena；ゲイン８００、レーザー強度２％、５スタック ６０μm）で記録し、最大強度投影を有する網膜フラットマウントの画像を得た。蛍光強度の合計の分析を３０の閾値でプログラムImageJ中において画像を開いた後に行った。＊＊＊ｐ＜０．００１；＊ｐ＜０．０５；ｎ．ｓ． ｐ＞０．０５。テューキーの多重比較検定を使用した一元配置分散分析。ｎ＝９～１７。６７：１のモル比のEYLEA (登録商標)（aflibercept）と共にインキュベーション。ＶＥＧＦを比較のために示す。 図６０Ａ～図６０Ｂ：（Ａ）ＴｋｒＢ細胞外ドメイン（ＴｒｋＢ－ＥＣＤ）の機能的特徴。ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を上昇する濃度の天然のリガンドであるＢＤＮＦ又は上昇する濃度のＴｒｋＢ－ＥＣＤを伴う１０nM ＢＤＮＦと共にインキュベーションした。ＴｒｋＢ活性化を、ＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）を測定することにより評価した。（Ｂ）ＴＰＰ－２２２１４のＴｒｋＢ－ＥＣＤ結合がＶＥＧＦ誘発ＶＥＧＦＲ２リン酸化の阻害に及ぼす影響。ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦ、上昇する濃度のＴＰＰ－２２２１４を伴う５０ng/mL ヒトＶＥＧＦ又は上昇する濃度のＴＰＰ－２２２１４及び１００nM ＴｒｋＢ－ＥＣＤを伴う５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。５０ng/mL ＶＥＧＦの有無での上昇する濃度のＴｒｋＢ－ＥＣＤとのＨＲＭＥＣインキュベーション及び非刺激細胞（ベース）を対照とした。ＶＥＧＦ－Ａの捕捉を、ＶＥＧＦレセプター２リン酸化（Ｙ１１７５）を測定することにより評価した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図６１Ａ～図６１Ｂ：（Ａ）ＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）又は（Ｂ）ＥＲＫ１／２リン酸化（Ｔ２０２／Ｙ２０４－ＥＲＫ１）（Ｔ１８５／Ｙ１８７－ＥＲＫ２）を上昇する濃度の示された分子とのインキュベーション後に、ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞において測定した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図６２Ａ～図６２Ｃ：ＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）を２００ng/mL ヒトＶＥＧＦ－Ａとのプレインキュベーションの有無で、上昇する濃度のDoppelmab （Ａ）ＴＰＰ－２３４５７、（Ｂ）ＴＰＰ－２３４５９又は（Ｃ）ＴＰＰ－６８３０抗体とのインキュベーション後に、ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞において測定した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図６３Ａ～図６３Ｃ：ＥＲＫ１／２リン酸化（Ｔ２０２／Ｙ２０４－ＥＲＫ１）（Ｔ１８５／Ｙ１８７－ＥＲＫ２）を２００ng/mL ヒトＶＥＧＦ－Ａとのプレインキュベーションの有無で、上昇する濃度のDoppelmab （Ａ）ＴＰＰ－２３４５７、（Ｂ）ＴＰＰ－２３４５９又は（Ｃ）ＴＰＰ－６８３０抗体とのインキュベーション後に、ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞において測定した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図６４Ａ～図６４Ｂ：ＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）を（Ａ）一定濃度の０．３nM、１nMもしくは３nM ＢＤＮＦの有無での上昇する濃度のＣ２抗体又は（Ｂ）一定濃度の０．３nM、１nMもしくは３nM ＢＤＮＦの有無での上昇する濃度のDoppelmab ＴＰＰ－２３４５７とのインキュベーション後に、ヒトＴｒｋＢレセプターを安定に発現するＣＨＯ細胞において測定した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図６５Ａ～図６５Ｂ：ＥＲＫ１／２リン酸化（Ｔ２０２／Ｙ２０４－ＥＲＫ１）（Ｔ１８５／Ｙ１８７－ＥＲＫ２）を（Ａ）一定濃度の０．３nM、１nMもしくは３nM ＢＤＮＦの有無での上昇する濃度のＣ２抗体又は（Ｂ）一定濃度の０．３nM、１nMもしくは３nM ＢＤＮＦの有無での上昇する濃度のDoppelmab ＴＰＰ－２３４５７とのインキュベーション後に、ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞において測定した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図６６Ａ～図６６Ｂ：ＶＥＧＦ－Ａの捕捉を、（Ａ）ＶＥＧＦレセプター２リン酸化（Ｙ１１７５）又は（Ｂ）ＥＲＫ１／２リン酸化（Ｔ２０２／Ｙ２０４－ＥＲＫ１）（Ｔ１８５／Ｙ１８７－ＥＲＫ２）を測定することにより評価した。この目的で、ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度のＴＰＰ－２２２１５、ＴＰＰ－２３４５７、ＴＰＰ－２３４５９又はEYLEA (登録商標)（aflibercept）とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。分子処理を伴わない５０ng/ml ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。 図６７Ａ～図６７Ｃ：ナイーブなファージディスプレイにより又はファージに対するＢ細胞により特定されたＴｒｋＢバインダーをＩｇＧ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ又はＦｃ－ｓｃＦｖのいずれかとしてフォーマットした。各ヒット及び３つの分子フォーマットのそれぞれについての効力（ＥＣ５０）を、上昇する濃度の分子とのインキュベーション後に、ヒトＴｒｋＢレセプターを安定に発現するＣＨＯ細胞におけるＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）を測定することにより決定した。図Ａ～Ｃに、分子のＥＣ５０のペアワイズ直線化（均等線（ｌｉｎｅ ｏｆ ｅｑｕａｌｉｔｙ）を伴う散布図）を示す。図（Ａ）では、各ヒットについてのｓｃＦｖ－ＦｃのＥＣ５０（ｙ軸）に対するＩｇＧのＥＣ５０（ｘ軸）を比較する。図（Ｂ）では、各ヒットについてのＦｃ－ｓｃＦｖのＥＣ５０（ｙ軸）に対するＩｇＧのＥＣ５０（ｘ軸）を比較する。図（Ｃ）では、各ヒットについてのＦｃ－ｓｃＦｖのＥＣ５０（ｙ軸）に対するｓｃＦｖ－ＦｃのＥＣ５０（ｘ軸）を比較する。 図６８Ａ～図６８Ｃ：ナイーブなファージディスプレイにより又はファージに対するＢ細胞により特定されたＴｒｋＢバインダーをＩｇＧ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ又はＦｃ－ｓｃＦｖのいずれかとしてフォーマットした。各ヒット及び３つの分子フォーマットのそれぞれについての有効性を、上昇する濃度の分子とのインキュベーション後に、ヒトＴｒｋＢレセプターを安定に発現するＣＨＯ細胞におけるＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）を測定することにより決定した。ＢＤＮＦ処理細胞も同様に測定し、ＢＤＮＦの有効性を対照として１００％に設定した。図Ａ～Ｃに、分子の有効性のペアワイズ直線化（ｐａｉｒｗｉｓｅ ａｌｉｇｎｍｅｎｔ）（均等線（ｌｉｎｅ ｏｆ ｅｑｕａｌｉｔｙ）を伴う散布図）を示す。各分子の有効性を天然のリガンドであるＢＤＮＦと比較した割合とした表現する。図（Ａ）では、各ヒットについてのｓｃＦｖ－Ｆｃの有効性（ｙ軸）に対するＩｇＧの有効性（ｘ軸）を比較する。図（Ｂ）では、各ヒットについてのＦｃ－ｓｃＦｖの有効性（ｙ軸）に対するＩｇＧの有効性（ｘ軸）を比較する。図（Ｃ）では、各ヒットについてのＦｃ－ｓｃＦｖの有効性（ｙ軸）に対するｓｃＦｖ－Ｆｃの有効性（ｘ軸）を比較する。 図６９Ａ～図６９Ｈ：ナイーブなファージディスプレイにより又はファージに対するＢ細胞により特定された選択ヒットをＩｇＧ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ又はＦｃ－ｓｃＦｖのいずれかとしてフォーマットした。各ヒット及び３つの分子フォーマットのそれぞれについての有効性を、上昇する濃度の分子とのインキュベーション後に、ヒトＴｒｋＢレセプターを安定に発現するＣＨＯ細胞におけるＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）を測定することにより決定した。ＢＤＮＦ処理細胞も同様に測定し、ＢＤＮＦの有効性を対照として１．０に設定した。分子濃度をｘ軸にプロットし、ｙ軸は、ＢＤＮＦに対するＴｒｋＢリン酸化を示す。図Ａ～Ｈに、合計８つの選択されたヒットを示し、各ヒットについて、３つの異なるフォーマットＩｇＧ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ及びＦｃ－ｓｃＦｖを直接比較して示す。最低化合物濃度を溶媒単独とした。データは、平均±ＳＥＭを表わす。 図７０Ａ～図７０Ｃ：３つの異なる分子フォーマット：（Ａ）ＩｇＧ、（Ｂ）ｓｃＦｖ－Ｆｃ及び（Ｃ）Ｆｃ－ｓｃＦｖの模式図。 図７１：選択されたＴｒｋＢバインダーを、ＩｇＧ、ｓｃＦｖ－Ｆｃとして又は２つの異なるペプチドリンカーを介して互いに連結された２つのｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ－リンカー１－ｓｃＦｖ及びｓｃＦｖ－リンカー２－ｓｃＦｖ）としてフォーマットした。得られた分子を、上昇する濃度の分子とのインキュベーション後に、ヒトＴｒｋＢレセプターを安定に発現するＣＨＯ細胞におけるＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）を測定することにより、ＴｒｋＢを活性化するその能力について試験した。ＢＤＮＦ処理細胞も同様に測定し、参照とした。分子濃度をｘ軸にプロットし、ｙ軸は、ＴｒｋＢリン酸化を示す。最低化合物濃度を溶媒単独とした。データは、平均±ＳＥＭを表わす。 図７２：選択されたＴｒｋＢバインダーを、ＩｇＧ又はｓｃＦｖ－Ｆｃのいずれかとしてフォーマットした。加えて、ｓｃＦｖ－Ｆｃを、Ｆｃ部分を除去するためにヒンジの下でシステインプロテアーゼにより開裂させて、ヒンジ領域を介して互いに連結された２つのｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ－ヒンジ－ｓｃＦｖ）を生成した。３つ全ての分子を、上昇する濃度の分子とのインキュベーション後に、ヒトＴｒｋＢレセプターを安定に発現するＣＨＯ細胞におけるＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）を測定することにより、ＴｒｋＢを活性化するその能力について試験した。分子濃度をｘ軸にプロットし、ｙ軸は、ＴｒｋＢリン酸化を示す。最低化合物濃度を溶媒単独とした。データは、平均±ＳＥＭを表わす。
発明の詳細な説明
本発明は、単一の結合分子内で、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する抗原結合部位と、トロポミオシンレセプターキナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に特異的に結合する抗原結合部位とを組み合わせるという概念に基づいている。
本発明まで、これらの２つの抗原をターゲットとする結合分子を調製することは開示されておらず又は間接的にも企図されていなかったことを指摘することが重要である。したがって、本発明者らにより、ＶＥＧＦに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位と、ＴｒｋＢに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位とを含む、結合分子が調製された。
本発明者らの最初の目標は、それぞれの個々のバインダー、すなわち、それぞれのターゲットにのみ結合する個々のＶＥＧＦ又はＴｒｋＢバインダーと比較した場合、同等の有効性及び／又は効力を有する単一の結合分子を設計することであった。これは、単一の結合分子内での個々のバインダーのフォーマット化が単一の結合分子内の個々のバインダーの元の有効性及び／又は効力に悪影響を及ぼすであろうことが完全には理解されていなかったが、そのようなことが予想されるため、それ自体は困難であると既に考えられていた。
驚くべきことに、単一の結合分子においてＴｒｋＢ活性化をＶＥＧＦ捕捉と組み合わせると、ＴｒｋＢ活性化の有効性と効力との両方の予想外の上昇がもたらされることが見出された。本発明の単一の結合分子は、完全なＴｒｋＢアゴニスト活性を示し、個々のＴｒｋＢバインダーの部分的なアゴニスト活性とは対照的である。さらに、ＴｒｋＢ活性化の効力は、単一の結合分子へのＶＥＧＦの結合後にさらに上昇する。
理論に拘束されることを望むものではないが、本発明の単一の結合分子によるＶＥＧＦ誘発クラスター形成は、ＴｒｋＢ活性化の効力の観察された上昇を担っている場合があると考えられる。加えて、提案されたＶＥＧＦ誘発クラスター形成メカニズムとは無関係に、明らかに、本発明の結合分子におけるＴｒｋＢ結合部位の設計により、観察された完全なＴｒｋＢアゴニスト活性をもたらすＴｒｋＢ結合の最適な立体形成が支持される。有利には、ＶＥＧＦ捕捉（結果として、血管機能不全及び漏出の阻害）を神経保護ＴｒｋＢレセプターの活性化（結果として、神経細胞死の減少）と組み合わせることにより、患者は、直ちに、単回注射の恩恵を受ける。これは、網膜専門家が同じ日に２回以上の処置で同じ眼に注射することを好まないため、重要である。したがって、ｗＡＭＤ及びＧＡに対処する２つの別個の処置には、一方の眼につき２回の別個の処置訪問が必要である。まとめると、本発明の結合分子は、視覚機能の喪失の治療及び／又は予防、それによる生活の質の改善に有用である。
一態様では、本発明は、本明細書において以下に記載される特性のうちの１つ以上を有する、結合分子、特に、血管内皮増殖因子ＶＥＧＦ、好ましくは、ＶＥＧＦ－Ａに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位と、トロポミオシンレセプターキナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位とを有する分子を提供する。
別の態様では、本発明の結合分子は、ヒトＴｒｋＢに高い親和性で結合する。この態様に関する実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＴｒｋＢにＫＤ＜５００nMで結合する。別の実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＴｒｋＢにＫＤ＜４５０nMで結合する。別の実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＴｒｋＢにＫＤ＜４００nMで結合する。別の実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＴｒｋＢにＫＤ＜３００nMで結合する。別の実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＴｒｋＢにＫＤ＜２５０nMで結合する。この態様に関する実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＴｒｋＢにＫＤ＜２００nMで結合する。別の実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＴｒｋＢにＫＤ＜１５０nMで結合する。別の実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＴｒｋＢにＫＤ＜１００nMで結合する。別の実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＴｒｋＢにＫＤ＜５０nMで結合する。
別の態様では、本発明の結合分子は、２００ng/mL ヒトＶＥＧＦ－Ａとのプレインキュベーションを含む条件下で、ＴｒｋＢを高い効力で活性化する。この態様に関する実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＴｒｋＢをＥＣ５０＜１００nMで活性化する。更なる実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＴｒｋＢをＥＣ５０＜９０nMで活性化する。更なる実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＴｒｋＢをＥＣ５０＜８０nMで活性化する。更なる実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＴｒｋＢをＥＣ５０＜７０nMで活性化する。更なる実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＴｒｋＢをＥＣ５０＜６０nMで活性化する。更なる実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＴｒｋＢをＥＣ５０＜５０nMで活性化する。更なる実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＴｒｋＢをＥＣ５０＜４０nMで活性化する。更なる実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＴｒｋＢをＥＣ５０＜３０nMで活性化する。更なる実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＴｒｋＢをＥＣ５０＜２０nMで活性化する。更なる実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＴｒｋＢをＥＣ５０＜１０nMで活性化する。
別の態様では、本発明の結合分子は、ヒトＶＥＧＦ、好ましくは、ＶＥＧＦ－Ａに高い親和性で結合する。この態様に関する実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＶＥＧＦ－ＡにＫＤ＜１nMで結合する。別の実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＶＥＧＦ－ＡにＫＤ＜９００pMで結合する。別の実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＶＥＧＦ－ＡにＫＤ＜８００pMで結合する。別の実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＶＥＧＦ－ＡにＫＤ＜７００pMで結合する。別の実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＶＥＧＦ－ＡにＫＤ＜６００pMで結合する。別の実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＶＥＧＦ－ＡにＫＤ＜５００pMで結合する。別の実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＶＥＧＦ－ＡにＫＤ＜４００pMで結合する。
別の態様では、本発明の結合分子は、ＶＥＧＦ－Ａリン酸化（Ｔｙｒ１１７５）を高い効力で阻害する。この態様に関する実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＶＥＧＦ－Ａリン酸化（Ｔｙｒ１１７５）をＩＣ５０＜１nMで阻害する。この態様に関する実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＶＥＧＦ－Ａリン酸化（Ｔｙｒ１１７５）をＩＣ５０＜９００pMで阻害する。この態様に関する実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＶＥＧＦ－Ａリン酸化（Ｔｙｒ１１７５）をＩＣ５０＜８００pMで阻害する。この態様に関する実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＶＥＧＦ－Ａリン酸化（Ｔｙｒ１１７５）をＩＣ５０＜７００pMで阻害する。この態様に関する実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＶＥＧＦ－Ａリン酸化（Ｔｙｒ１１７５）をＩＣ５０＜６００pMで阻害する。この態様に関する実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＶＥＧＦ－Ａリン酸化（Ｔｙｒ１１７５）をＩＣ５０＜５００pMで阻害する。この態様に関する実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＶＥＧＦ－Ａリン酸化（Ｔｙｒ１１７５）をＩＣ５０＜４００pMで阻害する。この態様に関する実施態様では、本発明の結合分子は、ヒトＶＥＧＦ－Ａリン酸化（Ｔｙｒ１１７５）をＩＣ５０＜３００pMで阻害する。
別の態様では、本発明の結合分子は、天然のＴｒｋＢリガンドであるＢＤＮＦよりＴｒｋＢ下流シグナル伝達経路の活性化を誘導するのに強力である。更なる態様では、本発明の結合分子は、ＢＤＮＦのものと同等のパターンで、ＴｒｋＢ媒介性シグナル伝達経路を介して遺伝子発現をレギュレーションする。
さらに別の態様では、本発明の結合分子は、ＢＤＮＦ誘発ＥＲＫリン酸化を低減しない。更なる態様では、本発明の結合分子は、ＴｒｋＢリン酸化及び／又は活性化に特異的であり、ＴｒｋＡ又はＴｒｋＣを非特異的にリン酸化／活性化しない。
一態様では、本発明の結合分子は、疾患関連動物モデルにおける神経変性及び網膜機能の喪失を予防するのに有用である。更なる態様では、本発明の結合分子は、ＴｒｋＢ依存性生存シグナル伝達経路を刺激し、それにより、神経保護を提供することにより、例えば、黄斑変性症、加齢黄斑変性症、地図状萎縮又は糖尿病性網膜症を有する患者の網膜におけるニューロン、グリア細胞及び／又は神経血管単位を保護する。
別の態様では、本発明の結合分子は、例えば、黄斑変性症、加齢黄斑変性症、地図状萎縮又は糖尿病性網膜症において発症後に網膜において軸索／樹状突起及び／又はシナプスを再生し、それにより、神経再生をもたらす。一態様では、本発明の結合分子を眼への硝子体内注射のために高濃度に製剤化することができる。
別の態様では、本発明の結合分子は、ラット網膜におけるＶＥＧＦ誘発シグナル伝達の阻害、内皮細胞増殖／発芽及び／又はＶＥＧＦ誘発透過性亢進の阻害に関して、現在の抗ＶＥＧＦ標準治療化合物であるaflibercept（EYLEA(登録商標)aflibercept）と比較して、優れたＶＥＧＦ－Ａの捕捉を示す。
別の態様では、本発明の結合分子は、例えば、EYLEA（登録商標）aflibercept又は他のＩｇＧ抗体と比較して、ウサギＰＫ研究において、実質的により長い硝子体半減期を示す。したがって、本発明の結合分子は、年４回の注射又はより低い頻度の注射に適している。
別の態様では、本発明の結合分子は、ｗＡＭＤを有しかつ地理状萎縮を発症するリスクがある患者の満たされていない高い必要性をターゲットとするのに有用である。関連する実施態様では、本発明の結合分子は、ｗＡＭＤを有する患者を処置し、地理状萎縮の発症を予防するのに固有に有用である。更なる関連する実施態様では、地理状萎縮の発症が遅延され又は疾患の重症度が低減される、すなわち、地理状萎縮の発症及び／又は進行速度が低減される。この点において、本発明の結合分子による患者の処置を地理状萎縮の確定診断の前に、すなわち、地理状萎縮を発症するリスクがある患者のために、予め開始することができる。
別の態様では、本発明の結合分子は、網膜静脈閉塞（ＣＲＶＯ）を有する患者の満たされていない高い必要性をターゲットとするのに有用である。
別の態様では、本発明の結合分子は、現在の標準治療（EYLEA（登録商標）aflibercept）と比較した場合、ＥＲＧ欠損暗示時間を改善する。
一態様では、本発明の結合分子のＴｒｋＢへの結合によっては、レセプター内部移行は誘引されない。関連する態様では、本発明の結合分子のＴｒｋＢへの結合により、天然のリガンドであるＢＤＮＦと比較して、より少ないレセプター内部移行がもたらされるであろう。
一態様では、本発明の結合分子にＶＥＧＦ－Ａが結合することにより、ＴｒｋＢ活性化の効力が上昇する。
前記効力の上昇を、例えば、単一の結合分子により、例えば、（ヒト）ＴｒｋＢを過剰発現するＣＨＯ細胞等（実施例を参照のこと）における単一の結合分子による処理後に、適切な細胞モデルにおいて、ＴｒｋＢ又はＥｒｋ１／２リン酸化についてのＥＣ５０を決定することにより、ｉｎ ｖｉｔｒｏで測定することができる。単一の結合分子を適切な濃度、例えば、２００ng/mL、５０ng/mL、１０ng/mL又は２ng/mL ヒトＶＥＧＦ－Ａ（ｈＶＥＧＦ）との細胞のプレインキュベーションの有無で試験するものとする。細胞をヒトＶＥＧＦ－Ａとプレインキュベーションした後に、本発明の単一の結合分子は、ＴｒｋＢ又はＥｒｋ１／２リン酸化についてのＥＣ５０により測定された場合、ＶＥＧＦ－Ａとプレインキュベーションされていない細胞と比較して、効力の上昇、少なくとも約２倍、３倍、４倍、５倍、６倍、７倍、８倍、９倍又は少なくとも約１０倍の効力の上昇を示す。
別の態様では、本発明の結合分子は、完全なＴｒｋＢアゴニスト活性を示す。したがって、本発明の結合分子は、天然のリガンドであるＢＤＮＦと同様にＴｒｋＢの活性化に有効である。
別の態様では、本発明の結合分子は、ＴｒｋＢレセプターの活性化と、ＶＥＧＦ、好ましくは、ＶＥＧＦ－Ａの捕捉を同時に行うことができる。
定義
本明細書で具体的に定義されていない用語は、本開示及び文脈に照らして、当業者によりそれらに与えられるであろう意味を与えられるべきである。ただし、本明細書で使用する場合、特に断りない限り、下記用語は、示された意味を有し、下記慣例に従う。
本明細書で使用する場合、「抗原結合部位」という用語は、抗体に由来する重鎖可変ドメイン（ＶＨ）及び軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含む。このような場合、各可変ドメインは、３つのＣＤＲを含む。一態様では、本発明の抗原結合部位又はタンパク質の特定の部分は、一般的には、抗体に由来する。抗体又は免疫グロブリン分子の一般的な構造は、当業者に周知である。
「抗体」又は「免疫グロブリン分子」（Ｉｇと省略される免疫グロブリンとしても公知）は、脊椎動物の血液又は他の体液中に見出すことができるガンマグロブリンタンパク質であり、異物、例えば、細菌及びウイルスを識別し、中和するために、免疫系により使用される。それらは、典型的には、基本構造単位－それぞれが２つの大きな重鎖及び２つの小さな軽鎖を有する－から形成され、例えば、１つの単位を有するモノマー、２つの単位を有するダイマー又は５つの単位を有するペンタマーを形成する。抗体は、非共有結合的相互作用により、抗原として公知の他の分子又は構造に結合することができる。この結合は、抗体が高親和性で特定の構造にのみ結合するであろうという意味で特異的である。抗体により認識される抗原の固有の部分は、エピトープ又は抗原決定基と呼ばれる。エピトープに結合する抗体の部分は、パラトープと呼ばれる場合があり、抗体のいわゆる可変ドメイン又は可変領域（Ｆｖ）に存在する。可変ドメインは、フレームワーク領域（ＦＲ）により離間された３つのいわゆる相補性決定領域（ＣＤＲ）を含む。
本発明の文脈において、ＣＤＲへの言及は、種々の定義、例えば、ＩＭＧＴとも呼ばれるＣＣＧ（Lefranc MP, Pommie C, Ruiz M, Giudicelli V, Foulquier E, Truong L, Thouvenin-Contet V, Lefranc G. 「IMGT unique numbering for immunoglobulin and T cell receptor variable domains and Ig superfamily V-like domains.」 Dev Comp Immunol. 2003 Jan;27(1):55-77；Giudicelli V, Brochet X, Lefranc MP. 「IMGT/V-QUEST: IMGT standardized analysis of the immunoglobulin (IG) and T cell receptor (TR) nucleotide sequences」. Cold Spring Harb Protoc. 2011;2011(6):695-715）に基づいている。ＣＤＲの代替的な定義は、Ｋａｂａｔ（E.A. Kabat, T.T. Wu, H. Bilofsky, M. Reid-Miller and H. Perry, Sequence of Proteins of Immunological Interest, National Institutes of Health, Bethesda (1983)）と共に、Ｃｈｏｔｈｉａ（Chothia and Lesk, J. Mol. Biol. 1987, 196: 901-917）に基づいている。
本明細書で使用する場合、「可変ドメイン」もしくは「可変領域」又はＦｖという表現は、抗体の抗原への結合に直接関与する軽鎖及び重鎖の対のそれぞれを示す。軽鎖の可変ドメインは「ＶＬ」と略され、重鎖の可変ドメインは、「ＶＨ」と略される。可変軽鎖ドメイン及び重鎖ドメインは、同じ一般構造を有し、各ドメインは、４つのフレームワーク（ＦＲ）領域を含み、それらの配列は、広く保存され、３つのＨＶＲ（又はＣＤＲ）により連結されている。フレームワーク領域は、β－シートコンホーメーションをとり、ＣＤＲは、β－シート構造を連結するループを形成する場合がある。各鎖のＣＤＲは、フレームワーク領域により三次元構造に保持され、他の鎖のＣＤＲと共に、抗原結合部位を形成する。抗体の重鎖及び軽鎖ＣＤＲ３領域は、本発明の抗体の結合特異性／親和性において特に重要な役割を果たし、したがって、本発明の更なる目的を提供する。本出願で使用する場合、「定常ドメイン」又は「定常領域」という用語は、可変領域以外の抗体のドメインの合計を示す。このような定常ドメイン及び領域は、当技術分野の現状において周知であり、例えば、Kabat et al.（「Sequence of proteins of immunological interest」, US Public Health Services, NIH Bethesda, MD, Publication No. 91）に記載されている。
抗体の「Ｆｃ部分」は、抗体の抗原への結合には直接関与しないが、種々のエフェクター機能を示す。「抗体のＦｃ部分」は、当業者に周知の用語であり、抗体のパパイン開裂に基づいて定義される。それらの重鎖の定常領域のアミノ酸配列に応じて、抗体又は免疫グロブリンは、クラス：ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ、ＩｇＧ及びＩｇＭに分けられる。重鎖定常領域によれば、種々のクラスの免疫グロブリンはそれぞれ、α、δ、ε、γ及びμと呼ばれる。これらのうちのいくつかを、サブクラス（アイソタイプ）、例えば、ＩｇＧｌ、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３及びＩｇＧ４、ＩｇＡｌ及びＩｇＡ２にさらに分けることができる。抗体のＦｃ部分は、補体活性化、Ｃｌｑ結合及びＦｃレセプター結合に基づいて、ＡＤＣＣ（抗体依存性細胞媒介性細胞傷害）及びＣＤＣ（補体依存性細胞傷害）に直接関与する。補体活性化（ＣＤＣ）は、ほとんどのＩｇＧ抗体サブクラスのＦｃ部分への補体因子Ｃｌｑの結合により開始される。補体系に対する抗体の影響は、特定の条件に依存するが、Ｃｌｑへの結合は、Ｆｃ部分における定義された結合部位により生じる。このような結合部位は、当技術分野の現状において公知であり、例えば、Boakle et al., Nature 282 (1975) 742-743、Lukas et al., J. Immunol. 127 (1981) 2555-2560、Brunhouse and Cebra, Mol. Immunol. 16 (1979) 907-917、Burton et al., Nature 288 (1980) 338-344、Thommesen et al., Mol. Immunol. 37 (2000) 995-1004、Idusogie et al., J. Immunol.164 (2000) 4178-4184、Hezareh et al., J. Virology 75 (2001) 12161- 12168、Morgan et al., Immunology 86 (1995) 319-324、ＥＰ第０３０７４３４号に記載されている。このような結合部位は、例えば、Ｌ２３４、Ｌ２３５、Ｄ２７０、Ｎ２９７、Ｅ３１８、Ｋ３２０、Ｋ３２２、Ｐ３３１及びＰ３２９（ＫａｂａｔのＥＵインデックスに従ったナンバリング、以下を参照のこと）である。ＩｇＧ１におけるＣ１ｑ及びＦｃガンマレセプター結合を媒介するこれらの残基の中で最も重要なものは、Ｌ２３４及びＬ２３５である（Hezareh et al., J. Virology 75 (2001) 12161- 12168）。サブクラスＩｇＧｌ及びＩｇＧ３の抗体は、通常、補体活性化並びにＣｌｑ及びＣ３結合を示す。一方、ＩｇＧ２及びＩｇＧ４は、補体系を活性化せず、Ｃｌｑ及びＣ３に結合しない。
当技術分野では、抗体がさらに開発されており、医学及び技術における多用途のツールとなった。このため、本発明の文脈において、「抗体分子」又は「抗体」又は「Ｉｇ分子」（本明細書において同義語として使用される）という用語は、天然に見出すことができるような抗体を含むだけでなく、例えば、２つの軽鎖及び２つの重鎖又はラクダ科におけるような２つの重鎖のみを含む抗体を含み、さらに、抗原に対する結合特異性及び免疫グロブリンの可変ドメインに対する構造的類似性を有する少なくとも１つのパラトープを含む全ての分子を包含する。
このため、抗体又は免疫グロブリン又はＩｇ分子は、モノクローナル抗体、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、抗体のフラグメント、特に、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体、特に、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、小モデュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、ドメイン抗体、ナノボディ、ダイアボディを含むことができる。抗体は、通常、抗体のＦｃ部分（抗体定常領域）により媒介されるエフェクター機能、例えば、ＡＤＣＣ又はＣＤＣを有する場合があり又は例えば、Ｆｃ部分を欠くかもしくはブロックされ、マスクされたＦｃ部分、本質的には、免疫細胞又は免疫系成分、例えば、補体系により認識されないか又は十分に認識されないＦｃ部分を有することにより、エフェクター機能を有さない場合がある。モノクローナル抗体（ｍＡｂ）は、アミノ酸配列が同一である単一特異性抗体である。それらをハイブリドーマ技術により、特定の抗体産生Ｂ細胞と骨髄腫（Ｂ細胞ガン）細胞との融合体のクローンを表わすハイブリッド細胞系統（ハイブリドーマと呼ばれる）から産生することができる（Kohler G, Milstein C. Continuous culture of fused cells secreting antibody of predefined specificity. Nature 1975; 256:495-7）。代替的には、モノクローナル抗体を宿主細胞におけるリコンビナント発現により産生することができる（Norderhaug L, Olafsen T, Michaelsen TE, Sandlie I.(May 1997）.「Versatile vectors for transient and stable expression of recombinant antibody molecules in mammalian cells.」 J Immunol Methods 204 (1): 77-87；以下も参照のこと。「リコンビナント抗体」又は「リコンビナント結合分子」は、リコンビナントに操作された宿主細胞により産生された抗体又は結合分子である。それは、場合により、単離され又は精製される。
ヒトにおける適用のために、多くの場合、他の種、例えば、マウスに元々由来する抗体の免疫原性を低減することが望ましい。これをキメラ抗体の構築により又は「ヒト化」と呼ばれるプロセスにより行うことができる。この文脈において、「キメラ抗体」は、異なる種（例えば、ヒト）に由来する配列部分（例えば、定常ドメイン）に融合した１つの種（例えば、マウス）に由来する配列部分（例えば、可変ドメイン）を含む抗体であると理解される。「ヒト化抗体」は、元々非ヒト種に由来する可変ドメインを含む抗体であり、ここで、特定のアミノ酸を変異させて、その可変ドメインの全配列がヒト可変ドメインの配列により密接に類似するようになっている。抗体のキメラ化及びヒト化の方法は、当技術分野において周知である（Billetta R, Lobuglio AF. 「Chimeric antibodies」. Int Rev Immunol. 1993;10(2-3):165-76；Riechmann L, Clark M, Waldmann H, Winter G (1988). 「Reshaping human antibodies for therapy」. Nature: 332:323）。
「ヒト化」抗体は、非ヒト超可変領域（ＨＶＲ）由来のアミノ酸残基及びヒトＦＲ由来のアミノ酸残基を含む抗体を指す。特定の実施態様では、ヒト化抗体は、ＨＶＲ（例えば、相補性決定領域（ＣＤＲ））の全て又は実質的に全てが非ヒト抗体のものに対応し、フレームワーク領域（ＦＲ）の全て又は実質的に全体がヒト抗体のものに対応する、少なくとも１つ、典型的には、２つの可変ドメインのうちの実質的に全てを含むであろう。ヒト化抗体は、場合により、ヒト抗体に由来する抗体定常領域の少なくとも一部を含むことができる。抗体、例えば、非ヒト抗体の「ヒト化形態」は、ヒト化を受けた抗体を指す。
さらに、例えば、ファージディスプレイ又はトランスジェニック動物の使用により、ヒトゲノムに由来する配列に基づいて抗体を作製するための技術が開発されている（ＷＯ第９０／０５１４４号；D. Marks, H.R. Hoogenboom, T.P. Bonnert, J. McCafferty, A.D. Griffiths and G. Winter (1991) 「By-passing immunisation. Human antibodies from V-gene libraries displayed on phage.」 J.Mol.Biol., 222, 581-597；Knappik et al., J. Mol. Biol. 296: 57-86, 2000；S. Carmen and L. Jermutus, 「Concepts in antibody phage display」. Briefings in Functional Genomics and Proteomics 2002 1(2):189-203；Lonberg N, Huszar D. 「Human antibodies from transgenic mice」. Int Rev Immunol. 1995;13(1):65-93.； M, Taussig MJ. 「Production of human antibody repertoires in transgenic mice」. Curr Opin Biotechnol. 1997 Aug;8(4):455-8.）。このような抗体は、本発明の文脈における「ヒト抗体」である。
また、抗体は、抗原結合特性を保持している免疫グロブリンのフラグメント、例えば、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２フラグメントも含むことができる。このようなフラグメントは、免疫グロブリンの断片化により、例えば、タンパク質分解消化により又はこのようなフラグメントのリコンビナント発現により得ることができる。例えば、免疫グロブリン消化を、ありふれた技術、例えば、パパイン又はペプシンを使用することにより達成することができる（ＷＯ第９４／２９３４８号）。抗体のパパイン消化により、典型的には、２つの同一の抗原結合フラグメント、いわゆる、Ｆａｂフラグメントが産生される。このフラグメントはそれぞれ、単一の抗原結合部位及び残存Ｆｃフラグメントを有する。ペプシン処理により、Ｆ（ａｂ’）２が得られる。Ｆａｂ分子において、可変ドメインはそれぞれ、好ましくは、ヒト起源の免疫グロブリン定常ドメインに融合している。このため、重鎖可変ドメインは、ＣＨ１ドメイン（いわゆる、Ｆｄフラグメント）に融合している場合があり、軽鎖可変ドメインは、ＣＬドメインに融合している場合がある。Ｆａｂ分子を宿主細胞におけるそれぞれの核酸のリコンビナント発現により産生することができる。以下を参照のこと。
免疫グロブリンの可変ドメイン又はこのような可変ドメインに由来する分子を、異なる分子状況に置くための多くの技術が開発されてきた。それらも、本発明の「抗体」とみなされるべきである。一般的には、これらの抗体分子は、免疫グロブリンと比較してサイズがより小さく、単一のアミノ酸鎖又は幾つかのアミノ酸鎖を含む場合がある。例えば、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）は、短いリンカー、通常、セリン（Ｓ）又はグリシン（Ｇ）と共に連結された、免疫グロブリンの重鎖及び軽鎖の可変領域の融合物である（ＷＯ第８８／０１６４９号；同第９１／１７２７１号；Huston et al; International Reviews of Immunology, Volume 10, 1993, 195 - 217）。「単一ドメイン抗体」又は「ナノボディ」は、単一のＩｇ様ドメイン中に抗原結合部位を有する（ＷＯ第９４／０４６７８号；同第０３／０５０５３１号、Ward et al., Nature. 1989 Oct 12;341(6242):544-6；Revets et al., Expert Opin Biol Ther. 5(1):111-24, 2005）。同じか又は異なる抗原に対する結合特異性を有する１つ以上の単一ドメイン抗体同士を連結させることができる。ダイアボディは、２つの可変ドメインを含む２つのアミノ酸鎖からなる二価の抗体分子である（ＷＯ第９４／１３８０４号、Holliger et al., Proc Natl Acad Sci U S A. 1993 Jul 15;90(14):6444-8）。抗体様分子の他の例は、免疫グロブリンスーパーファミリー抗体である（ＩｇＳＦ；Srinivasan and Roeske, Current Protein Pept. Sci. 2005, 6(2): 185-96）。異なる概念により、定常ドメインＣＨ１を欠く一本鎖ヒンジ及びエフェクタードメインに連結されたＦｖドメインを含む、いわゆる、小モデュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）がもたらされる（ＷＯ第０２／０５６９１０号）。
本明細書で使用する場合、「結合する」又は「特異的に結合する」という用語は、ｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、抗体又は（例えば、本明細書に記載される結合分子中の）抗原結合部位が抗原のエピトープに結合することを指す。親和性は、抗体分子上の単一の抗原結合部位と単一のエピトープとの間の相互作用である。これは、平衡会合定数Ｋａ＝ｋｏｎ／ｋｏｆｆ又は平衡解離定数Ｋｄ＝ｋｏｆｆ／ｋｏｎにより表わされる。
抗体分子の結合親和性を親和性成熟として公知のプロセスにより増強することができる（Marks et al., 1992, Biotechnology 10:779-783；Barbas, et al., 1994, Proc. Nat. Acad. Sci, USA 91:3809-3813；Shier et al., 1995, Gene 169:147-155）。したがって、親和性成熟抗体も、本発明に包含される。
エピトープは、抗体又は抗原結合部分により結合される抗原の領域である。「エピトープ」という用語は、抗体又は抗原結合部分に特異的に結合可能な任意のポリペプチド決定基を含む。特定の実施態様では、エピトープ決定基は、分子の化学的に活性な表面基、例えば、アミノ酸、グリカン側鎖、ホスホリル又はスルホニルを含み、特定の実施態様では、特定の三次元構造特性及び／又は特定の電荷特性を有する場合がある。立体配座エピトープと非立体配座エピトープとは、変性溶媒の存在下では前者への結合は失われるが後者への結合は失われないという点で区別される。本明細書で使用する場合、「結合する」及び「特異的に結合する」という用語は、精製された野生型抗原を使用したｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、好ましくは、プラズモン共鳴アッセイ（BIAcore（登録商標）, GE-Healthcare Uppsala, Sweden）における、抗体又は抗原結合部分の抗原のエピトープへの結合を指す。
「一本鎖Ｆｖフラグメント」（ｓｃＦｖ）は、抗体重鎖可変ドメイン（ＶＨ）、リンカー及び抗体軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）を含むポリペプチドであり、ここで、前記抗体ドメイン及び前記リンカーは、Ｎ末端からＣ末端方向に下記順序：ａ）ＶＨ－リンカー－ＶＬ、ｂ）ＶＬ－リンカー－ＶＨのうちの１つを有し、ここで、前記リンカーは、長さが１５～２５個のアミノ酸、好ましくは、２０個のアミノ酸のポリペプチドである。
本明細書で使用する場合、２つ以上の核酸又はポリペプチド配列の文脈における「同一」又は「％ 同一性」という用語は、最大の対応について比較され、アライメントされる場合、同じか又は同じである特定の割合のヌクレオチドもしくはアミノ酸残基を有する２つ以上の配列又は部分配列を指す。％ 同一性を決定するために、配列を最適な比較目的でアラインメントする（例えば、第２のアミノ酸又は核酸配列との最適なアラインメントのために、第１のアミノ酸又は核酸配列の配列にギャップを導入することができる）。ついで、対応するアミノ酸位置又はヌクレオチド位置におけるアミノ酸残基又はヌクレオチドを比較する。第１の配列中の位置が、第２の配列中の対応する位置と同じアミノ酸残基又はヌクレオチドにより占められる場合には、分子は、その位置で同一である。２つの配列間の％ 同一性は、配列により共有される同一位置の数の関数である（すなわち、％ 同一性＝同一位置の数／位置の総数（例えば、重複する位置）×１００）。一部の実施態様では、比較される２つの配列は、必要に応じてギャップが配列内に導入された後、同じ長さである（例えば、比較される配列を超えて伸長する更なる配列を除く）。例えば、可変領域配列が比較される場合、リーダー及び／又は定常ドメイン配列は考慮されない。２つの配列間の配列比較のために、「対応する」ＣＤＲは、両方の配列中の同じ位置にあるＣＤＲ（例えば、各配列のＣＤＲ－Ｈ１）を指す。
２つの配列間の％ 同一性又は％ 類似性の決定を、数学的アルゴリズムを使用して達成することができる。２つの配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの好ましい非限定的な例は、Karlin and Altschul, 1990, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87:2264-2268のアルゴリズムであり、Karlin and Altschul, 1993, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90:5873-5877において修飾されている。このようなアルゴリズムは、Altschul et al., 1990, J. Mol. Biol. 215:403-410のＮＢＬＡＳＴ及びＸＢＬＡＳＴプログラムに組み込まれている。ＢＬＡＳＴヌクレオチド検索をＮＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝１００、ワード長＝１２を使用して行い、目的のタンパク質をコードする核酸に相同なヌクレオチド配列を得ることができる。ＢＬＡＳＴタンパク質検索を、ＸＢＬＡＳＴプログラム、スコア＝５０、ワード長＝３を使用して行い、目的のタンパク質に相同なアミノ酸配列を得ることができる。比較目的のためのギャップ付きアラインメントを得るために、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴをAltschul et al., 1997, Nucleic Acids Res. 25:3389-3402に記載されるように利用することができる。代替的には、ＰＳＩ－Ｂｌａｓｔを使用して、分子間の距離関係（Ｉｄ．）を検出する反復検索を行うことができる。ＢＬＡＳＴ、Ｇａｐｐｅｄ ＢＬＡＳＴ及びＰＳＩ－Ｂｌａｓｔプログラムを利用する場合、各プログラム（例えば、ＸＢＬＡＳＴ及びＮＢＬＡＳＴ）のデフォルトパラメータを使用することができる。配列の比較に利用される数学的アルゴリズムの別の好ましい非限定的な例は、Myers and Miller, CABIOS(1989)のアルゴリズムである。このようなアルゴリズムは、ＧＣＧ配列アラインメントソフトウェアパッケージの一部であるＡＬＩＧＮプログラム（バージョン２．０）に組み込まれている。アミノ酸配列を比較するためにＡＬＩＧＮプログラムを利用する場合、ＰＡＭ１２０重み残基表、ギャップ長ペナルティー１２及びギャップペナルティー４を使用することができる。配列分析のための更なるアルゴリズムは、当技術分野において公知であり、Torellis and Robotti, 1994, Comput. Appl. Biosci. 10:3-5に記載されているようなＡＤＶＡＮＣＥ及びＡＤＡＭ並びにPearson and Lipman, 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:2444-8に記載されているＦＡＳＴＡを含む。ＦＡＳＴＡ内では、ｋｔｕｐが検索の感度及び速度を設定する制御オプションである。ｋｔｕｐ＝２の場合、比較される２つの配列中の類似領域は、アライメントされた残基の対を見ることにより見つけられる。ｋｔｕｐ＝１の場合、単一のアライメントされたアミノ酸を調べる。ｋｔｕｐをタンパク質配列について２もしくは１に又はＤＮＡ配列について１～６に設定することができる。ｋｔｕｐが指定されていない場合のデフォルトは、タンパク質では２、ＤＮＡでは６である。代替的には、タンパク質配列アラインメントをHiggins et al., 1996, Methods Enzymol. 266:383-402に記載されているように、ＣＬＵＳＴＡＬ Ｗアルゴリズムを使用して行うことができる。
投与される分子の「治療上有効量」は、例えば、眼もしくは網膜の疾患又は神経変性疾患の臨床症状を予防し、改善し又は治療するのに必要な最少量、特に、これらの障害に有効な最少量である。
本明細書で使用する場合、「一価」、「二価」、「四価」という用語は、結合分子中の抗原結合要素の数（それぞれ１、２又は４）を指す。
本明細書で使用する場合、「単一特異性」、「二重特異性」という用語は、結合分子が特異的に結合する異なる抗原又はエピトープの数（１、２）を指す。
例として、典型的なモノクローナル抗体（ＭＡｂ）は、二価かつ単一特異性であり、両方とも同じエピトープを認識する２つの抗原結合アームを有する。二重特異性抗体は、２つの異なる抗原又はエピトープを認識し、結合することが可能な２つの抗原結合部位を有する。
ＴｒｋＢ結合
トロポミオシンレセプターキナーゼＢ（ＴｒｋＢ）は、チロシンレセプターキナーゼＢ又はＢＤＮＦ／ＮＴ－３増殖因子レセプター又は神経栄養チロシンキナーゼレセプター２型としても公知であり、ヒトにおいてＮＴＲＫ２遺伝子（Ｇｅｎｂａｎｋ ＩＤ：４９１５）によりコードされるタンパク質である。ＴｒｋＢは脳由来神経栄養因子（ＢＤＮＦ）についてのレセプターである。
神経栄養チロシンキナーゼレセプターＢ（ＴｒｋＢ；遺伝子記号：ＮＴＲＫ２）は、網膜ニューロン及びグリア細胞により発現される。正常な網膜では、ＴｒｋＢシグナル伝達は、細胞ストレスに対抗し、細胞生存を促進する。病気にかかった眼、例えば、糖尿病性網膜症又は地図状萎縮において、視力障害及び視力喪失を引き起こす網膜ニューロン及びグリア細胞の喪失及び機能障害が生じる。ベースレベル（糖尿病性網膜症では低下する）を上回るＴｒｋＢシグナル伝達の活性化により、ニューロン及びグリア細胞の喪失及び機能障害が打ち消され、このため、視覚機能を改善することができる。さらに、ＴｒｋＢ活性化は、病気にかかった眼において失われたシナプス結合を再生し、それにより、視覚機能の回復を促進する可能性を有する。リガンドが結合すると、ＴｒｋＢは、ホモ二量体化を受け、続けて、自己リン酸化を受ける。リン酸化部位（Ｙ５１６、Ｙ７０２、Ｙ７０６、Ｙ７０７又はＹ８１７）に応じて、種々のシグナル伝達経路が活性化され、軸索／神経突起伸長を誘引し、シナプス可塑性を向上させ又は細胞生存を増加させる別個の重複シグナル伝達カスケードをレギュレーションするＰＬＣγ１又はＡＫＴ及びＥＲＫの異なるサブフォームの活性を含む。
本発明の結合分子のＴｒｋＢ結合成分、例えば、ｓｃＦｖ又はｓｃＦｖ２は、天然又はリコンビナントヒトＴｒｋＢに特異的に結合する。ＴｒｋＢに結合することにより、本発明の結合分子は、ＴｒｋＢシグナル伝達を活性化し、したがって、本発明の結合分子は、ＴｒｋＢアゴニストとして作用する。
本発明の結合分子は、特定の「ＴｒｋＢ抗原エピトープ」及び「ＴｒｋＢエピトープ」を認識することができる。特に、本発明の結合分子は、ヒトＴｒｋＢの細胞外ドメイン中のエピトープに結合する。好ましくは、結合分子のＴｒｋＢ結合成分は、ＴｒｋＢアゴニストであり、より好ましくは、完全なアゴニストである。
ヒトＴｒｋＢの細胞外ドメインは、下記配列（配列番号：２２６）を本質的に含む。
CPTSCKCSASRIWCSDPSPGIVAFPRLEPNSVDPENITEIFIANQKRLEIINEDDVEAYVGLRNLTIVDSGLKFVAHKAFLKNSNLQHINFTRNKLTSLSRKHFRHLDLSELILVGNPFTCSCDIMWIKTLQEAKSSPDTQDLYCLNESSKNIPLANLQIPNCGLPSANLAAPNLTVEEGKSITLSCSVAGDPVPNMYWDVGNLVSKHMNETSHTQGSLRITNISSDDSGKQISCVAENLVGEDQDSVNLTVHFAPTITFLESPTSDHHWCIPFTVKGNPKPALQWFYNGAILNESKYICTKIHVTNHTEYHGCLQLDNPTHMNNGDYTLIAKNEYGKDEKQISAHFMGWPGIDDGANPNYPDVIYEDYGTAANDIGDTTNRSNEIPSTDVTDKTGREH
本明細書で使用する場合、「ＴｒｋＢ抗原エピトープ」及び「ＴｒｋＢエピトープ」という用語は、トロポミオシンレセプターキナーゼＢに特異的に結合する、本発明の結合分子又は結合分子フラグメントの抗原結合部位に結合可能な分子（例えば、ペプチド）又は分子のフラグメントを指す。これらの用語は、例えば、本発明の結合分子又は結合分子フラグメントのいずれかにより認識されるＴｒｋＢ抗原決定基をさらに含む。本発明の結合分子又は結合分子フラグメントは、
配列番号：２０１（ＣＤＲ１）、配列番号：２０２（ＣＤＲ２）及び配列番号：２０３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲ並びに
配列番号：２０４（ＣＤＲ１）、配列番号：２０５（ＣＤＲ２）及び配列番号：２０６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ又は
配列番号：２０７（ＣＤＲ１）、配列番号：２０８（ＣＤＲ２）及び配列番号：２０９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ又は
配列番号：２１０（ＣＤＲ１）、配列番号：２１１（ＣＤＲ２）及び配列番号：２１２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲ
から選択される軽鎖ＣＤＲと重鎖ＣＤＲとの組み合わせを有する。
ＴｒｋＢ抗原エピトープは、タンパク質、タンパク質フラグメント、ペプチド等に含まれる場合がある。エピトープは、最も一般的には、タンパク質、短いオリゴペプチド、オリゴペプチド模倣物（すなわち、ＴｒｋＢ抗原の抗体結合特性を模倣する有機化合物）又はそれらの組み合わせである。
ＶＥＧＦ結合
血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）は、ＶＥＧＦ－Ａ又は血管透過性因子（ＶＰＦ）とも呼ばれる最も重要な血管新生促進因子の１つである。ＶＥＧＦは、胎盤増殖因子（ＰｌＧＦ）、ＶＥＧＦ－Ｂ、ＶＥＧＦ－Ｃ、ＶＥＧＦ－Ｄ、ＶＥＧＦ－Ｅ及びＶＥＧＦ－Ｆを含む遺伝子ファミリーに属する。ヒトＶＥＧＦの単一遺伝子のｍＲＮＡの選択的スプライシングにより、少なくとも６つのアイソフォーム（ＶＥＧＦ１２１、ＶＥＧＦ１４５、ＶＥＧＦ１６５、ＶＥＧＦ１８３、ＶＥＧＦ１８９及びＶＥＧＦ２０６）がもたらされ、ＶＥＧＦ１６５が、最も豊富なアイソフォームである。
ＶＥＧＦと相互作用する２つのＶＥＧＦチロシンキナーゼレセプター（ＶＥＧＦＲ）、すなわち、ＶＥＧＦＲ－１（Ｆｌｔ－１としても公知）及びＶＥＧＦＲ－２（ＫＤＲ又はＦＩＫ－１としても公知）が特定されている。ＶＥＧＦＲ－１は、ＶＥＧＦに対して最も高い親和性を有するが、ＶＥＧＦＲ－２は、ＶＥＧＦに対して幾らか低い親和性を有する。Ferrara（Endocrine Rev. 2004, 25: 581-611）により、ＶＥＧＦの詳細な説明が提供されており、正常及び病理学的プロセスにおけるそのレセプターとの相互作用及びその機能をHoeben et al. Pharmacol. Rev. 2004, 56: 549-580に見出すことができる。
ＶＥＧＦは、正常な血管新生及び異常な血管新生の両方の重要なレギュレーターであることが報告されている（Ferrara and Davis-Smyth, Endocrine Rev. 1997, 18: 4-25；Ferrara J. MoL Med. 1999, 77: 527-543）。血管形成のプロセスに寄与する他の成長因子と比較して、ＶＥＧＦは、血管系内の内皮細胞に対するその高い特異性において固有である。
ＶＥＧＦは、特に、眼疾患に関与する。眼液中のＶＥＧＦ濃度は、糖尿病性網膜症及び他の虚血関連網膜症を有する患者における血管の活性増殖の存在と高度に相関している。さらに、研究から、加齢性黄斑変性症（ＡＭＤ）に罹患した患者の脈絡膜新生血管膜におけるＶＥＧＦの局在を実証されている。
本発明の結合分子、例えば、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子のＶＥＧＦ結合成分は、ＶＥＧＦ分子内の１つ以上のエピトープに特異的に結合するという点で、ＶＥＧＦに対する特異性を有する。ＶＥＧＦに結合することにより、本発明の結合分子は、ＶＥＧＦアンタゴニストとして作用する。好ましくは、本発明の結合分子は、ＶＥＧＦ－Ａに特異的に結合する。
ＶＥＧＦ結合成分のその抗原であるＶＥＧＦへの特異的結合を例えば、本明細書に記載されたアッセイ、散乱分析及び／又は競合的結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ及びＥＬＩＳＡ）及びサンドイッチ競合アッセイ並びに当技術分野においてそれ自体公知のその種々の変形形態を含む、それ自体公知の任意の適切な方法で決定することができる。同じことが、ＴｒｋＢ結合成分がその抗原に結合する場合にも当てはまる。
抗原ＶＥＧＦに関して、本発明のＶＥＧＦ結合成分、例えば、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子は、種に関して限定されない。このため、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子は、好ましくは、ヒトにおける治療目的が意図される場合、ヒトＶＥＧＦに結合する。ただし、別のほ乳類種由来のＶＥＧＦに結合する免疫グロブリン（Ｉｇ）分子も、本発明の範囲内である。ある種形態のＶＥＧＦに結合する免疫グロブリン（Ｉｇ）分子は、１つ以上の他の種に由来する、ヒトのものとは異なる配列を有するＶＥＧＦと交差反応する場合がある。例えば、ヒトＶＥＧＦに結合する免疫グロブリン（Ｉｇ）分子は、霊長類の１つ以上の他の種由来のＶＥＧＦ及び／又疾患のための動物モデル、特に、血管新生に対するＶＥＧＦ媒介作用に関連する疾患及び障害のための動物モデル（例えば、本明細書で言及された種及び動物モデル）に使用される動物の１つ以上の種、例えば、サル、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ由来のＶＥＧＦはとの交差反応性を示す場合がある。このような交差反応性を示す免疫グロブリン（Ｉｇ）分子は、研究及び／又は薬剤開発において有利である。本発明の免疫グロブリン単一可変ドメインを認知された疾患モデル、例えば、サル、特に、カニクイザルもしくはアカゲザル又はマウス及びラットにおいて試験することが可能であるためである。
好ましくは、治療用ＶＥＧＦアンタゴニストの開発中の動物モデルとしての使用が意図される、ヒト以外の種由来の１つ以上のＶＥＧＦ分子との交差反応性を考慮して、ＶＥＧＦ結合成分は、ヒトＶＥＧＦと高度の同一性を有する目的のＶＥＧＦの領域中のエピトープを認識する。
したがって、本発明の結合分子、例えば、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子のＶＥＧＦ結合成分は、そのレセプターへの結合に関連するＶＥＧＦの領域に全体的に又は部分的に位置するエピトープを認識する。好ましい態様によれば、本発明の結合分子のＶＥＧＦ結合成分は、ＶＥＧＦレセプター活性化を、好ましくは実質的に、最も好ましくは完全に遮断する。
上記されたように、ＶＥＧＦとそのレセプターとの間の相互作用を遮断するＶＥＧＦ結合成分の能力を実施例に記載されるように、増幅発光近接ホモジニアスアッセイ（AlphaScreen（登録商標））、競合ELISA又はプラズモン共鳴（ＳＰＲ）ベースのアッセイ（Biacore（登録商標））により決定することができる。
ＴｒｋＢ及びＶＥＧＦ結合分子
本発明は、少なくとも２つの異なるターゲットに対する結合特異性を有する結合分子に関する。本発明に関して、結合分子は、抗体に由来する。結合分子を調製するための技術は、異なる特異性を有する２つの免疫グロブリン重鎖－軽鎖対のリコンビナント共発現（Milstein and Cuello, Nature 305: 537 (1983)、ＷＯ第９３／０８８２９号及びTraunecker et al., EMBO J. 10: 3655 (1991)を参照のこと）及び「ノブ－イン－ホール」操作（例えば、ＵＳ第５，７３１，１６８号を参照のこと）を含むが、これらに限定されない。また、本発明の結合分子を、抗体Ｆｃ－ヘテロ二量体分子を調製するための静電的ステアリング効果を操作すること（ＷＯ第２００９／０８９００４号）；２つ以上の抗体又はフラグメントを架橋すること（例えば、ＵＳ第４，６７６，９８０号及びBrennan et al., Science, 229: 81 (1985)を参照のこと）；ロイシンジッパーを使用して、二重特異性抗体を産生すること（例えば、Kostelny et al., Immunol., 148(5): 1547-1553 (1992)を参照のこと）；二重特異性抗体フラグメントを調製するための「ダイアボディ」技術を使用すること（例えば、Hollinger et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 90:6444- 6448 (1993)を参照のこと）及び一本鎖Ｆｖ（ｓＦｖ）二量体を使用すること（例えば、Gruber et al., /. Immunol., 152:5368 (1994)を参照のこと）及び例えば、Tutt et al. /. Immunol. 147: 60 (1991)に記載されているような三重特異性抗体を調製することによっても調製することができる。
一実施態様では、結合分子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）、好ましくは、ＶＥＧＦ－Ａに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位と、トロポミオシンレセプターキナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位を含むか又はそれらからなる。関連する実施態様では、結合分子は、二重特異性かつ四価である。
別の実施態様では、結合分子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位と、トロポミオシンレセプターキナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位とを含むか又はそれらからなり、ここで、ＶＥＧＦに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、好ましくは、ＩｇＧ分子である。関連する実施態様では、結合分子は、二重特異性かつ四価である。
別の実施態様では、結合分子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位と、トロポミオシンレセプターキナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位とを含むか又はそれらからなり、ここで、ＴｒｋＢに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、１つ以上のｓｃＦｖを好ましくは、Ｎ末端からＣ末端へのＶＬ－ＶＨ配向で含む。関連する実施態様では、結合分子は、二重特異性かつ四価である。
別の実施態様では、結合分子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位と、トロポミオシンレセプターキナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位とを含むか又はそれらからなり、ここで、ＶＥＧＦに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、好ましくは、ＩｇＧ分子であり、ここで、ＴｒｋＢに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、Ｉｇ分子の重鎖のＣ末端に融合している。関連する実施態様では、結合分子は、二重特異性かつ四価である。
別の実施態様では、結合分子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位と、トロポミオシンレセプターキナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位とを含むか又はそれらからなり、ＶＥＧＦに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、好ましくは、ＩｇＧ分子であり、ここで、ＴｒｋＢに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、１つ以上のｓｃＦｖを好ましくは、Ｎ末端からＣ末端へのＶＬ－ＶＨ配向で含む。関連する実施態様では、結合分子は、二重特異性かつ四価である。
別の実施態様では、結合分子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位と、トロポミオシンレセプターキナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位とを含むか又はそれらからなり、ここで、ＶＥＧＦに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、好ましくは、ＩｇＧ分子であり、ここで、ＴｒｋＢに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、１つ以上のｓｃＦｖを好ましくは、Ｎ末端からＣ末端へのＶＬ－ＶＨ配向で含み、Ｉｇ分子の重鎖のＣ末端に融合している。関連する実施態様では、結合分子は、二重特異性かつ四価である。
好ましい実施態様では、本発明の結合分子は、（ｉ）それぞれがＶＥＧＦに特異的な重鎖可変領域、定常ＩｇＧドメイン及びＴｒｋＢに特異的なｓｃＦｖを含むか又はそれらからなる２つの重鎖と、（ｉｉ）それぞれがＶＥＧＦに特異的な軽鎖可変領域を含むか又はそれからなる２つの軽鎖とを含むか又はそれらからなる。
加えて、これらの一本鎖Ｆｖフラグメントを、システイン残基の取り込みを介して、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間、ＶＨドメイン内又はＶＬドメイン内のジスルフィド結合の取り込みによりさらに安定化させることができる。Ｎ末端という用語は、ポリペプチド鎖の最初のアミノ酸を示す。一方、Ｃ末端という用語は、ポリペプチド鎖のＣ末端の最後のアミノ酸を示す。したがって、本発明の実施態様は、１つ以上のｓｃＦｖがジスルフィド結合を形成するための追加のシステイン残基を含むものである。
一実施態様では、本発明は、（ｉ）２つの重鎖及び２つの軽鎖を有し、ＶＥＧＦに特異的に結合するＩｇ分子と、（ｉｉ）それぞれがＴｒｋＢに特異的に結合する２つのｓｃＦｖ分子（ｓｃＦｖ）とを含む多重特異的結合タンパク質である、結合分子を提供する。好ましくは、Ｉｇ分子の各重鎖は、そのＣ末端に融合している１つのｓｃＦｖを有し、それにより、二重特異性で四価の結合タンパク質を形成している。
一実施態様では、本発明は、
（ｉ）それぞれがＮ末端からＣ末端に向かって、
－ＶＥＧＦに特異的な重鎖可変ドメイン（例えば、マウス、ヒト化又はヒトＶＨドメイン）
－ＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４）の定常ドメイン
－ペプチドリンカー（例えば、ＧＳミニリンカー）及び
－ＴｒｋＢに特異的なｓｃＦｖ（例えば、Ｎ末端からＣ末端へのＶＨドメイン（例えば、マウス、ヒト化又はヒトＶＨドメイン）を含むｓｃＦｖ）、リンカー及びＶＬドメイン（例えば、マウス、ヒト化又はヒトＶＬドメイン）又はその逆に、ＶＬドメイン、リンカー及びＶＨドメイン）
含む２つの重鎖と、
（ｉｉ）それぞれがＮ末端からＣ末端に向かって
ＶＥＧＦに特異的な軽鎖可変ドメイン（例えば、マウス、ヒト化又はヒトＶＬドメイン）、
軽鎖定常ドメイン（例えば、ヒトカッパ鎖）
を含む２つの軽鎖と
を有する、結合分子（本明細書において、多重特異性結合タンパク質又は修飾Ｉｇ分子とも呼ばれる）を提供する。
本発明は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位と、トロポミオシンレセプターキナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位とを有する、結合分子を提供する。
特異的なターゲット抗原に結合する結合部位を調製する方法は、当技術分野において周知である。当業者であれば、これらの方法を容易に使用して、ＶＥＧＦ又はＴｒｋＢターゲット抗原に対して必要な特異性を有する抗原結合部位を考案することができる。
抗体及び抗体フラグメントを生成する方法は、当技術分野において周知である。例えば、抗体を抗体分子のｉｎ ｖｉｖｏ産生の誘導、免疫グロブリンライブラリーのスクリーニング（Orlandi et al, 1989. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 86:3833-3837；Winter et al 1991, Nature 349:293-299）又は培養中の細胞系統によるモノクローナル抗体分子の生成を利用する幾つかの方法のいずれか１つにより生成することができる。これらは、ハイブリドーマ技術、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ技術及びエプスタイン－バーウイルス（ＥＢＶ）－ハイブリドーマ技術（Kohler et al 1975. Nature 256:4950497；Kozbor et al 1985. J. Immunol. Methods 81 :31 -42；Cote et al 1983. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 80:2026-2030；Cole et al 1984. Mol. Cell. Biol. 62:109-120）を含むが、これらに限定されない。
当技術分野において公知であり、本明細書に記載された方法を使用して、ＶＥＧＦ及び／又はＴｒｋＢターゲット抗原に対して必要な特異性を有する結合部位を有する抗体並びに本明細書に記載された結合分子を調製することは、当業者には日常的であろう。このような抗体からの結合ドメインの単離は、日常的な実践であり、実際、本明細書に記載された抗体及び結合分子を生成するのに使用することができる方法に関する更なる情報が、添付の実施例において提供される。
本発明者らは、表１に示されるように、本発明のＶＥＧＦ／ＴｒｋＢに対する結合分子を考案し、これらの分子の選択を準備し、添付の実施例において検討する。
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Figure 2023546229000021

Figure 2023546229000022

Figure 2023546229000023

Figure 2023546229000024

Figure 2023546229000025

Figure 2023546229000026

Figure 2023546229000027

Figure 2023546229000028

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Figure 2023546229000030

Figure 2023546229000031

Figure 2023546229000032

Figure 2023546229000033

Figure 2023546229000034

Figure 2023546229000035
更なる実施態様では、本発明の結合分子又はＴｒｋＢ結合分子は、以下に開示されるＴｒｋＢバインダーのいずれかに基づくことができる。これらのバインダーは、ＷＯ第２０１８／２２４６３０号にも開示されている。
Figure 2023546229000036
Figure 2023546229000037

Figure 2023546229000038

Figure 2023546229000039

Figure 2023546229000040
好ましい実施態様では、結合分子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位と、トロポミオシンレセプターキナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位とを含み、ここで、ＴｒｋＢに特異的に結合する抗原結合部位は、配列番号：２０１（ＣＤＲ１）、配列番号：２０２（ＣＤＲ２）及び配列番号：２０３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：２０４（ＣＤＲ１）、配列番号：２０５（ＣＤＲ２）及び配列番号：２０６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる重鎖ＣＤＲ又は配列番号：２０７（ＣＤＲ１）、配列番号：２０８（ＣＤＲ２）及び配列番号：２０９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる重鎖ＣＤＲ又は配列番号：２１０（ＣＤＲ１）、配列番号：２１１（ＣＤＲ２）及び配列番号：２１２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる重鎖ＣＤＲを含み、ここで、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗原結合部位は、配列番号：１４５（ＣＤＲ１）、配列番号：１４６（ＣＤＲ２）及び配列番号：１４７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：１４８（ＣＤＲ１）、配列番号：１４９（ＣＤＲ２）及び配列番号：１５０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる重鎖ＣＤＲ又は配列番号：１５１（ＣＤＲ１）、配列番号：１５２（ＣＤＲ２）及び配列番号：１５３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる重鎖ＣＤＲ又は配列番号：１５４（ＣＤＲ１）、配列番号：１５５（ＣＤＲ２）及び配列番号：１５６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる重鎖ＣＤＲを含む。
さらに好ましい実施態様では、結合分子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位と、トロポミオシンレセプターキナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位とを含み、ここで、ＴｒｋＢに特異的に結合する抗原結合部位は、配列番号：２１３又は２１５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる軽鎖可変ドメインと、配列番号：２１４又は２１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる重鎖可変ドメインとを含み、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗原結合部位は、配列番号：１８９又は１９３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる軽鎖可変ドメインと、配列番号：１９０、１９１、１９２又は１９４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる重鎖可変ドメインとを含む。
さらに好ましい実施態様では、結合分子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位と、トロポミオシンレセプターキナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位とを含み、ここで、ＴｒｋＢに特異的に結合する抗原結合部位は、配列番号：２１３又は２１５のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる軽鎖可変ドメインと、配列番号：２１４又は２１６のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる重鎖可変ドメインとを含み、ここで、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗原結合部位は、配列番号：１８９又は１９３のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる軽鎖可変ドメインと、配列番号：１９０、１９１、１９２又は１９４のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる重鎖可変ドメインとを含む。
さらに好ましい実施態様では、結合分子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位と、トロポミオシンレセプターキナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位とを含み、ここで、ＴｒｋＢに特異的に結合する抗原結合部位は、配列番号：２１３のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる軽鎖可変ドメインと、配列番号：２１４のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる重鎖可変ドメインとを含み、ここで、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗原結合部位は、配列番号：１９３のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる軽鎖可変ドメインと、配列番号：１９１のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる重鎖可変ドメインとを含む。
さらに好ましい実施態様では、結合分子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位と、トロポミオシンレセプターキナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位とを含み、ここで、ＴｒｋＢに特異的に結合する抗原結合部位は、配列番号：２１３又は２１５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる軽鎖可変ドメインと、配列番号：２１４又は２１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる重鎖可変ドメインとを含み、ここで、軽鎖可変ドメインにおける軽鎖ＣＤＲは、sa配列番号：２０１（ＣＤＲ１）、配列番号：２０２（ＣＤＲ２）及び配列番号：２０３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列からなり、重鎖可変ドメインにおける重鎖ＣＤＲは、配列番号：２０４（ＣＤＲ１）、配列番号：２０５（ＣＤＲ２）及び配列番号：２０６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列からなり又は重鎖可変ドメインにおける重鎖ＣＤＲは、配列番号：２０７（ＣＤＲ１）、配列番号：２０８（ＣＤＲ２）及び配列番号：２０９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列からなり又は重鎖可変ドメインにおける重鎖ＣＤＲは、配列番号：２１０（ＣＤＲ１）、配列番号：２１１（ＣＤＲ２）及び配列番号：２１２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列からなり、ここで、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗原結合部位は、配列番号：１８９又は１９３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる軽鎖可変ドメインと、配列番号：１９０、１９１、１９２又は１９４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる重鎖可変ドメインとを含み、ここで、軽鎖可変ドメインにおける軽鎖ＣＤＲは、配列番号：１４５（ＣＤＲ１）、配列番号：１４６（ＣＤＲ２）及び配列番号：１４７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列からなり、重鎖可変ドメインにおける重鎖ＣＤＲは、配列番号：１４８（ＣＤＲ１）、配列番号：１４９（ＣＤＲ２）及び配列番号：１５０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列からなり又は重鎖可変ドメインにおける重鎖ＣＤＲは、配列番号：１５１（ＣＤＲ１）、配列番号：１５２（ＣＤＲ２）及び配列番号：１５３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列からなり又は重鎖可変ドメインにおける重鎖ＣＤＲは、配列番号：１５４（ＣＤＲ１）、配列番号：１５５（ＣＤＲ２）及び配列番号：１５６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列からなる。
さらに好ましい実施態様では、結合分子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位と、トロポミオシンレセプターキナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位とを含み、ここで、ＴｒｋＢに特異的に結合する抗原結合部位は、配列番号：２１３のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる軽鎖可変ドメインと、配列番号：２１４のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる重鎖可変ドメインとを含み、ここで、軽鎖可変ドメインにおける軽鎖ＣＤＲは、配列番号：２０１（ＣＤＲ１）、配列番号：２０２（ＣＤＲ２）及び配列番号：２０３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列からなり、重鎖可変ドメインにおける重鎖ＣＤＲは、配列番号：２０４（ＣＤＲ１）、配列番号：２０５（ＣＤＲ２）及び配列番号：２０６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列からなり又は重鎖可変ドメインにおける重鎖ＣＤＲは、配列番号：２０７（ＣＤＲ１）、配列番号：２０８（ＣＤＲ２）及び配列番号：２０９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列からなり又は重鎖可変ドメインにおける重鎖ＣＤＲは、配列番号：２１０（ＣＤＲ１）、配列番号：２１１（ＣＤＲ２）及び配列番号：２１２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列からなり、ここで、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗原結合部位は、配列番号：１９３のアミノ酸配列のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる軽鎖可変ドメインと、配列番号：１９１のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる重鎖可変ドメインとを含み、ここで、軽鎖可変ドメインにおける軽鎖ＣＤＲは、配列番号：１４５（ＣＤＲ１）、配列番号：１４６（ＣＤＲ２）及び配列番号：１４７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列からなり、重鎖可変ドメインにおける重鎖ＣＤＲは、配列番号：１４８（ＣＤＲ１）、配列番号：１４９（ＣＤＲ２）及び配列番号：１５０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列からなり又は重鎖可変ドメインにおける重鎖ＣＤＲは、配列番号：１５１（ＣＤＲ１）、配列番号：１５２（ＣＤＲ２）及び配列番号：１５３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列からなり又は重鎖可変ドメインにおける重鎖ＣＤＲは、配列番号：１５４（ＣＤＲ１）、配列番号：１５５（ＣＤＲ２）及び配列番号：１５６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列からなる。
一実施態様では、結合分子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位と、トロポミオシンレセプターキナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位とを含み、ここで、ＴｒｋＢに特異的に結合する抗原結合部位は、配列番号：２２８（ＣＤＲ１）、配列番号：２２９（ＣＤＲ２）及び配列番号：２３０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：２３１（ＣＤＲ１）、配列番号：２３２（ＣＤＲ２）及び配列番号：２３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる重鎖ＣＤＲ又は配列番号：２３４（ＣＤＲ１）、配列番号：２３５（ＣＤＲ２）及び配列番号：２３６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる重鎖ＣＤＲ又は配列番号：２３７（ＣＤＲ１）、配列番号：２３８（ＣＤＲ２）及び配列番号：２３９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる重鎖ＣＤＲを含み、ここで、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗原結合部位は、配列番号：１４５（ＣＤＲ１）、配列番号：１４６（ＣＤＲ２）及び配列番号：１４７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる軽鎖ＣＤＲ並びに配列番号：１４８（ＣＤＲ１）、配列番号：１４９（ＣＤＲ２）及び配列番号：１５０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる重鎖ＣＤＲ又は配列番号：１５１（ＣＤＲ１）、配列番号：１５２（ＣＤＲ２）及び配列番号：１５３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる重鎖ＣＤＲ又は配列番号：１５４（ＣＤＲ１）、配列番号：１５５（ＣＤＲ２）及び配列番号：１５６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含むかもしくはそれらからなる重鎖ＣＤＲを含む。
別の実施態様では、結合分子は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位と、トロポミオシンレセプターキナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位とを含み、ここで、ＴｒｋＢに特異的に結合する抗原結合部位は、軽鎖可変ドメイン及び重鎖可変ドメインを含み、それぞれが、配列番号：２４０及び２４１、２４２及び２４３、２４４及び２４５、２４６及び２４７、２４８及び２４９、２５０及び２５１、２５２及び２５３、２５４及び２５５又は２５６及び２５７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むか又はそれらからなり、ここで、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗原結合部位は、配列番号：１８９又は１９３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる軽鎖可変ドメインと、配列番号：１９０、１９１、１９２又は１９４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含むか又はそれらからなる重鎖可変ドメインとを含む。
前述の実施態様のいずれかに関するさらに好ましい実施態様では、結合分子は、二重特異性かつ四価である。疑義を避けるために、本発明の結合分子をそれぞれのターゲットであるＶＥＧＦ及びＴｒｋＢに結合させることにより、本発明の結合分子は、ＶＥＧＦアンタゴニスト又はＴｒｋＢアゴニストそれぞれとして作用する。
前述の実施態様のいずれかに関するさらに好ましい実施態様では、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗原結合部位は、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子であり、ＴｒｋＢに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、１つ以上のｓｃＦｖを含む。
前述の実施態様のいずれかに関するさらに好ましい実施態様では、１つ以上のｓｃＦｖは、Ｉｇ分子の重鎖のＣ末端に融合している。
前述の実施態様のいずれかに関するさらに好ましい実施態様では、ＶＥＧＦに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子、より好ましくは、ＩｇＧであり、ＴｒｋＢに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、１つ以上のｓｃＦｖ、より好ましくは、２つのｓｃＦｖを含む。
本明細書に記載された抗体分子又は結合分子は、抗体分子の特性に所望の影響を有する他の分子実体に（融合タンパク質として）融合しているか又はそうでなければ（共有結合又は非共有結合により）連結されている場合がある。例えば、本明細書に記載された抗体又は結合分子の薬物動態特性、特に、一本鎖抗体又はドメイン抗体の場合、例えば、体液、例えば、血液中での安定性を改善するのが望ましい場合がある。これに関して、特に、循環中のこのような抗体分子の半減期を延長するための多くの技術、例えば、ペグ化（ＷＯ第９８／２５９７１号；同第９８／４８８３７号；同第２００４０８１０２６号）、血清タンパク質、例えば、アルブミンに対する親和性を有する別の抗体分子への抗体分子の融合もしくは他の共有結合（ＷＯ第２００４０４１８６５号；ＷＯ第２００４００３０１９号）又は血清タンパク質、例えば、アルブミンもしくはトランスフェリンの全部もしくは一部との融合タンパク質としての抗体分子の発現（ＷＯ第０１／７９２５８号）が開発されてきた。
抗体のＦｃ領域は、多くの重要な機能的能力（「エフェクター機能」と呼ばれる）をもたらす多くのＦｃレセプターと相互作用するため、特定の実施態様では、抗体は、全長別紙又はＦｃ領域の一部を含有する抗体である。後者は、抗体が抗原の関連部分とＦｃレセプター及び補体との両方に特異的結合を示す限りである。定常領域のタイプ及び長さの選択は、エフェクター機能、例えば、補体固定又は抗体依存性細胞媒介性細胞傷害が望ましい特徴であるかどうか及び抗体タンパク質の所望の薬理学的特性により決まる。
本発明の実施態様では、ｓｃＦｖ部分の安定性をｓｃＦｖ内にジスルフィド結合を形成するために、２つのシステイン残基を極めて３次元的に近接して組み込むことにより工場させることができる。操作されたジスルフィド結合を介して安定化を達成するために、これらの位置における残基は、好ましくは、システイン残基で置換される。
添付の実施例において実証されているように、本発明者らは、Ｎ末端からＣ末端へのＶＬ－ＶＨ配向を有するＴｒｋＢ ｓｃＦｖがＴｒｋＢシグナル伝達を活性化するために、本発明の結合分子において機能することができることを示した。Ｎ末端からＣ末端へのＶＨ－ＶＬ配向を有するＴｒｋＢ ｓｃＦｖも機能することができるが、この配向では、活性が低下してしまう場合がある。したがって、本発明の好ましい実施態様は、順序がＮ末端からＣ末端へのＶＬ－ＶＨである場合である。
本発明のさらに好ましい実施態様は、ＴｒｋＢに特異的に結合する１つ以上のｓｃＦｖがペプチドリンカー、好ましくは、約４～２０個のアミノ酸の長さ（例えば、６、９、１０、１２又は１５のいずれか１つ）を有するペプチドリンカーにより、ＶＥＧＦに特異的に結合するＩｇ分子（例えば、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ１（ＫＯ）、ＩｇＧ１ＦｃＲｎｍｕｔ、ＩｇＧ４Ｐｒｏ）に融合している。好ましくは、ｓｃＦｖは、Ｉｇ分子の重鎖のＣ末端に融合している。好ましくは、Ｉｇ分子は、ＩｇＧである。
ｓｃＦｖ分子をＩｇＧ分子の重鎖のＣ末端に連結させる方法又は可変ドメインをｓｃＦｖ分子に連結させる方法は、当技術分野において周知である。典型的には、グリシン及びセリンの小さなリンカー配列（ＧＳミニリンカーと呼ばれる）のアミノ酸が使用される。リンカー中のアミノ酸の数は、４（ＧＧＧＳ）（配列番号：２２７）、６（ＧＧＳＧＧＳ）（配列番号：２１７）、１０（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号：２１８）、１５（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号：２１９）、２０（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号：２２０）又はそれ以上で変動させることができる。実際には、通常、リンカーは、目的のＩｇＧをコードする核酸分子（この場合、ＶＥＧＦ結合部位の重鎖の可変ドメイン及びＩｇＧタイプの定常ドメインをコードする核酸を含むであろう）を、リンカー配列（例えば、５、１０、１５又は２０個のアミノ酸のうちのいずれか１つのＧＳミニリンカー、好ましくは、配列番号：２１８のリンカー）をコードする核酸分子により離間された所望のｓｃＦｖをコードする核酸（この場合、ＴｒｋＢ結合部位についてのＶＬ－ＶＨ配向又はＶＨ－ＶＬ配向のいずれかの重鎖及び軽鎖の可変ドメインをコードする核酸を含むであろう）と組み合わせることにより形成される。ついで、以下でさらに説明されるように、この完全なＨＣ－ｓｃＦｖコード核酸分子を発現ベクター内に配置し、適切な宿主細胞に導入して、完全なＩｇＧ重鎖－ｓｃＦｖ単一ポリペプチドが形成される。
好ましくは、ｓｃＦＶ分子とＩｇＧ分子の重鎖のＣ末端との間のＧＳミニリンカーは、１０Ｌ１（配列番号：２１８）である。
本発明の実施態様では、本発明における結合分子による補体産物Ｃ１ｑ又はＦｃガンマレセプターへの結合が、２３４位及び２３５位においてＬからＡへの定方向突然変異誘発を有するＩｇＧ４定常領域又はＩｇＧ１定常領域の利用により除去される。
本発明の実施態様では、本発明の結合分子は、可溶性Ｆｃガンマレセプター又は補体Ｃ１ｑによる意図しない架橋を回避するように操作されたＦｃ領域又はその関連セクションを有する場合がある。一実施態様では、このような結合分子又は抗体変異体は、親抗体よりはるかに低いＦｃガンマレセプター及び補体Ｃ１ｑに対する親和性を有する（以下において、特に断りない限り、抗体分子の文脈における又はＩｇＧもしくはＦｃ領域の文脈における「親」という用語はそれぞれ、突然変異（操作）分子が由来する非操作抗体分子、Ｆｃ領域又はＩｇＧを指す。したがって、本発明の実施態様は、Ｉｇ分子が野生型Ｆｃ領域と比較して、Ｆｃガンマレセプターもしくは補体レセプター又はその両方に対して低下した親和性を有するＦｃ変異体を含むものである。このようなＩｇ分子は、本明細書において、ＩｇＧ１（ＫＯ）と呼ばれる。
新生児Ｆｃレセプター（ＦｃＲｎ）とのその相互作用を最適化することにより、例えば、Ｈ３１０Ａ位のＣＨ２ドメインにおける点突然変異又はＨ４３５Ａ位での点突然変異により、血清レベル（半減期）を改変するように操作されたＦｃ領域又はその関連セクションを含む結合分子も企図される。このようなＩｇ分子は、本明細書において、ＩｇＧ１ＦｃＲｎｍｕｔと呼ばれる。
重鎖の他のＩｇＧ４分子との交換を減少させるＩｇＧ４のヒンジ領域変異体を含むＩｇ分子を含む結合分子がさらに企図される。このようなＩｇ分子は、本明細書において、ＩｇＧ４Ｐｒｏと呼ばれる。
本発明の更なる態様は、本発明の結合分子もしくは本発明の抗体分子をコードする単離された核酸分子又はこのような核酸分子を含む発現ベクターを提供する。
一部の実施態様では、本発明の結合分子又は本発明の抗体分子は、抗体重鎖及び／又は軽鎖ポリペプチドを含む。当業者であれば理解することができるように、重鎖ポリペプチド、軽鎖ポリペプチド又は重鎖ポリペプチド及び軽鎖ポリペプチドをコードする核酸分子を容易に調製することができる。
軽鎖及び重鎖をコードする核酸分子を、標準的な方法を使用して、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により化学的かつ酵素的に合成することができる。まず、合成遺伝子を生成するのに使用することができ、当技術分野において公知の方法（例えば、Gait, 1984）を使用して、適切なオリゴヌクレオチドを合成することができる。オリゴヌクレオチドから合成遺伝子を生成する方法は、当技術分野において公知である（例えば、Stemmer et al., 1995；Ye et al., 1992; Hayden et Mandecki, 1988; Frank et al., 1987）。
本発明の核酸分子は、配列表に示されたポリペプチド配列をコードするＤＮＡ分子を含むが、これらに限定されない。また、本発明は、ＷＯ第２００７／０４２３０９号に定義されているように、高ストリンジェンシー結合及び洗浄条件下で、配列表に示されたポリペプチド配列をコードするＤＮＡ分子にハイブリダイゼーションする核酸分子に関する。好ましい分子（ｍＲＮＡの観点から）は、本明細書に記載されたＤＮＡ分子のうちの１つと少なくとも７５％又は８０％（好ましくは、少なくとも８５％、より好ましくは、少なくとも９０％、最も好ましくは、少なくとも９５％）の相同性又は配列同一性を有する分子である。例として、真核細胞における抗体の発現を考慮して、配列表に示されたＤＮＡ配列は、真核細胞におけるコドン使用頻度に一致するように設計されている。E. coli中で抗体を発現させるのが望ましい場合、これらの配列をE. coliコドン使用頻度に一致するように変更することができる。本発明のＤＮＡ分子の変異体を例えば、ＷＯ第２００７／０４２３０９号に記載されているように、幾つかの異なる方法で構築することができる。
本発明の更なる態様は、
（ａ）以下の分子の発現を可能にする条件下で、本発明の宿主細胞を培養することと、
（ｂ）該分子を回収することと、場合により、
を含む、本明細書に記載された結合分子又は抗体分子の製造方法を提供する。
本発明のこの態様の実施態様は、この製造方法が本発明の結合分子をさらに精製しかつ／又は修飾しかつ／又は製剤化する工程（ｃ）をさらに含むものである。
本発明の結合分子又は抗体を製造するために、全長軽鎖及び／もしくは重鎖又はそれらのフラグメントをコードするＤＮＡ分子は、配列が転写制御配列及び翻訳制御配列に操作可能に連結されるように、発現ベクター内に挿入される。
本発明の結合分子又は抗体を製造するために、当業者であれば、当技術分野において周知の非常に多様な発現系、例えば、Kipriyanov and Le Gall, Curr Opin Drug Discov Devel. 2004 Mar;7(2):233-42にレビューされた発現系から選択することができる。
発現ベクターは、プラスミド、レトロウイルス、コスミド、ＥＢＶ由来エピソーム等を含む。発現ベクター及び発現制御配列は、宿主細胞と適合するように選択される。本明細書に記載された抗体軽鎖遺伝子及び抗体重鎖遺伝子又は結合分子の重鎖の遺伝子（例えば、そのＣ末端がｓｃＦｖ配列に付着した免疫グロブリン重鎖配列を含む遺伝子）を別々のベクター内に挿入することができる。特定の実施態様では、軽鎖配列及び重鎖配列の両方のＤＮＡ配列が、同じ発現ベクター内に挿入される。好都合なベクターは、機能的に完全なヒトＣＨ又はＣＬ免疫グロブリン配列をコードするものであり、上記されたように、任意のＶＨ又はＶＬ配列を容易に挿入し、発現させることができるように操作された適切な制限部位を有するものである。定常鎖は、通常、抗体軽鎖について、カッパ又はラムダであり、抗体重鎖については、任意のＩｇＧアイソタイプ（ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４）又はアレル変異体を含む他の免疫グロブリンである場合があるが、これらに限定されない。
また、リコンビナント発現ベクターは、宿主細胞からの抗体鎖（例えば、本明細書に記載された結合分子又は抗体の重鎖及び軽鎖）の分泌を促進するシグナルペプチドもコードすることができる。抗体鎖をコードするＤＮＡを、シグナルペプチドが成熟抗体鎖ＤＮＡのアミノ末端にインフレームで連結されるようにベクター内にクローニングすることができる。シグナルペプチドは、免疫グロブリンシグナルペプチド又は非免疫グロブリンタンパク質由来の異種ペプチドである場合がある。代替的には、抗体鎖（例えば、本明細書に記載された結合分子又は抗体の重鎖及び軽鎖）をコードするＤＮＡ配列は、シグナルペプチド配列を予め含有することができる。
抗体鎖（例えば、本明細書に記載された結合分子又は抗体の重鎖及び軽鎖）をコードするＤＮＡ配列に加えて、リコンビナント発現ベクターは、プロモーター、エンハンサー、終止シグナル及びポリアデニル化シグナル並びに宿主細胞における抗体鎖の発現を制御する他の発現制御エレメントを含むレギュラトリー配列を保有する。プロモーター配列（ほ乳類細胞における発現のために例示される）についての例は、（ＣＭＶ）由来のプロモーター及び／又はエンハンサー（例えば、ＣＭＶシミアンウイルス４０（ＳＶ４０）（例えば、ＳＶ４０プロモーター／エンハンサー）、アデノウイルス（例えば、アデノウイルス主要後期プロモーター（ＡｄＭＬＰ））、ポリオーマ並びに強力なほ乳類プロモーター、例えば、ネイティブな免疫グロブリンプロモーター及びアクチンプロモーターである。ポリアデニル化シグナルについての例は、ＢＧＨポリＡ、ＳＶ４０後期又は初期ポリＡであり、代替的には、免疫グロブリン遺伝子の３’ＵＴＲ等を使用することができる。
また、リコンビナント発現ベクターは、宿主細胞におけるベクターの複製をレギュレーションする配列（例えば、複製起点）及び選択可能なマーカー遺伝子を保有する場合がある。本明細書に記載された結合分子又は抗体の重鎖もしくはその抗原結合部分及び／又は軽鎖もしくはその抗原結合部分をコードする核酸分子並びにこれらのＤＮＡ分子を含むベクターを宿主細胞、例えば、細菌細胞又は高等真核細胞、例えば、ほ乳類細胞内に、リポソーム媒介性トランスフェクション、ポリカチオン媒介性トランスフェクション、プロトプラスト融合、マイクロインジェクション、リン酸カルシウム沈殿、エレクトロポレーション又はウイルスベクターによる移入を含む当技術分野において周知のトランスフェクション法に従って導入することができる。
好ましくは、本明細書に記載された結合分子又は抗体の重鎖及び軽鎖をコードする核酸分子は、宿主細胞、好ましくは、ほ乳類細胞に同時トランスフェクトされる２つのベクター上に存在する。
したがって、更なる態様は、本明細書に記載された結合分子又は抗体の、重鎖をコードする核酸分子を含む発現ベクター及び軽鎖をコードする核酸分子を含む発現ベクターを含む、宿主細胞を提供する。
発現のための宿主として利用可能なほ乳類細胞系統は、当技術分野において周知であり、とりわけ、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ、ＣＨＯ－ＤＧ４４）細胞、ＮＳＯ、ＳＰ２／０細胞、ＨｅＬａ細胞、ベビーハムスター腎臓（ＢＨＫ）細胞、サル腎臓細胞（ＣＯＳ）、ヒトガン細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２）、Ａ５４９細胞、３Ｔ３細胞又は任意のこのような細胞系統の派生体／子孫を含む。ヒト、マウス、ラット、サル及びげっ歯類細胞系統を含む（が、これらに限定されない）他のほ乳類細胞又は酵母、昆虫及び植物細胞を含む（が、これらに限定されない）他の真核細胞又は原核細胞、例えば、細菌を使用することができる。本発明の結合分子は、宿主細胞における結合分子の発現を可能にするのに十分な期間、宿主細胞を培養することにより産生される。
本明細書に記載された結合分子及び抗体分子は、好ましくは、分泌ポリペプチドとして培養培地から回収されるか又は例えば、分泌シグナルなしで発現される場合、宿主細胞のライセートから回収される場合がある。本明細書に記載された結合分子又は抗体の実質的に均質な調製物が得られるように、リコンビナントタンパク質及び宿主細胞タンパク質に使用される標準的なタンパク質精製法を使用して、本明細書に記載された結合分子又は抗体分子を精製する必要がある。例として、本発明の結合分子及び抗体を得るのに有用な最新技術の精製法は、第１の工程として、培養培地又はライセートからの細胞及び／又は微粒子細胞デブリの除去を含む。ついで、結合分子又は抗体は、夾雑可溶性タンパク質、ポリペプチド及び核酸から、例えば、免疫親和性又はイオン交換カラムでの分画、エタノール沈殿、逆相ＨＰＬＣ、Sephadexクロマトグラフィー、シリカ又はカチオン交換樹脂でのクロマトグラフィーにより精製される。本明細書に記載されたＶＥＧＦ及びＴｒｋＢ単一結合分子を得るための工程における最終工程として、精製された結合分子を治療用途について以下に記載されるように、乾燥させ、例えば、凍結乾燥させることができる。
本発明の更なる態様は、医薬に使用するための、本発明の結合分子を提供する。また、医薬におけるこの使用及び以下に記載される疾患の処置のための使用も、本発明のＴｒｋＢ結合分子、ｓｃＦｖ及び抗体を含むと理解されたい。
本発明の結合分子は、例えば、眼もしくは網膜の疾患又は神経変性疾患の治療／処置における使用のために、好ましくは、神経／神経眼又は網膜の疾患の処置のために示される。更なる態様では、本発明は、眼もしくは網膜の疾患又は神経変性疾患の治療及び／又は予防のための方法に関し、この方法は、ヒト（例えば、ｗＡＭＤに患っているか又は地理状萎縮を発症するリスクがある個体）に有効量の本発明の結合分子を投与し、それにより、眼もしくは網膜の疾患又は神経変性疾患の１つ以上の症状を改善することを含む。
「処置」及び「治療」等の用語は、本明細書で使用する場合、１つ以上の症状の緩和又は軽減、疾患又は障害の退行、それらの進行の遅延又は停止を含む（が、これらに限定されない）任意の臨床的に望ましい又は有益な効果をもたらす疾患又は障害の治療的及び予防的又はサプレッション的手段を含むことを意味する。このため、例えば、処置という用語は、疾患又は障害の症状の発症前又は発症後に結合分子を投与し、それにより、疾患又は障害の１つ以上の徴候を予防し又は除去することを含む。別の例として、この用語は、疾患の症状と闘うための、疾患の臨床症状発現後に結合分子を投与することを含む。さらに、処置が疾患の改善をもたらすか否かにかかわらず、投与が疾患又は障害の臨床パラメータ、例えば、組織傷害の程度又は転移の量もしくは程度に影響を及ぼす臨床症状の発症後及び臨床症状の発症後の結合分子の投与は、本明細書で使用する場合、「処置」又は「治療」を含む。さらに、本発明の組成物が、単独で又は別の治療剤と組み合わせて、結合分子を使用しない場合の症状と比較して、処置される障害の少なくとも１つの症状を軽減し又は改善する限り、その結果は、その障害の全ての症状が軽減されるかどうかにかかわらず、根底にある障害の有効な処置とみなされるべきである。
本発明の結合分子を眼又は網膜の疾患を有するか又はそれを有するリスクがある対象に投与することができる。本発明は、さらに、眼又は網膜の疾患の予防及び／又は治療のための医薬の製造における結合分子の使用を提供する。本明細書で使用する場合、「対象」という用語は、例えば、ヒト及び非ヒトほ乳類、例えば、霊長類、げっ歯類及びイヌを含む、結合分子を投与することができる任意のほ乳類患者を意味する。本明細書に記載された方法を使用する処置が特に意図された対象は、ヒトを含む。結合分子を単独で又は他の組成と組み合わせて投与することができる。
一実施態様では、本発明の結合分子は、黄斑変性症、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜色素変性症、遺伝性網膜ジストロフィー、遺伝性黄斑ジストロフィー、近視性変性症、地図状萎縮症、加齢黄斑変性症に続発する地図状萎縮症、網膜動脈閉塞症、眼内炎、ブドウ膜炎、嚢胞様黄斑浮腫、任意の網膜疾患に続発する脈絡膜新生血管膜、視神経症、緑内障、網膜剥離、中毒性網膜症、放射線網膜症並びに外傷性網膜症、前駆型及び軽度から中等度のアルツハイマー病、アルツハイマー病を有する患者の疾患進行の遅延、ハンチントン病、パーキンソン病、大うつ病性障害、統合失調症、統合失調症に関連する認知障害の処置、減弱精神病症候群を有する個体における初発精神病の予防、統合失調症を有する患者における再発の予防、処置抵抗性うつ病、過食症、肥満又はメタボリックシンドロームの処置に使用される。
好ましい実施態様では、本発明の結合分子は、ｗＡＭＤの処置に有用性を有する。さらに好ましくは、本発明の結合分子は、ｗＡＭＤの処置及び地理状萎縮の処置に有用性を有する。さらに好ましい実施態様では、本発明の結合分子は、加齢性黄斑変性症に続発する地図状萎縮の処置に有用性を有する。さらに好ましい実施態様では、本発明の結合分子は、地理状萎縮の処置又は地理状萎縮を発症するリスクがある患者の処置に有用性を有する。さらに好ましい実施態様では、本発明の結合分子は、地理状萎縮の予防に有用性を有する。最も好ましい実施態様では、本発明の結合分子は、地理状萎縮を発症するリスクがある患者におけるｗＡＭＤの処置に有用性を有する。
別の実施態様では、本発明の結合分子は、難聴の処置、特にシスプラチン誘発性難聴並びに騒音性及び加齢性難聴の処置に有用である場合がある。
本発明の結合分子は、硝子体内、経口、非経口、皮下、腹腔内、肺内及び鼻腔内を含む、任意の適切な手段により投与される。非経口注入は、筋肉内、静脈内、動脈内、腹腔内又は皮下投与を含む。加えて、本発明の結合分子は、パルス注入により、特に、用量を減らして適切に投与される。一態様では、投与は、投与が短期であるか又は慢性であるかに部分的に依存して、注射、最も好ましくは、静脈内注射又は皮下注射により提供される。好ましくは、本発明の結合分子は、眼への硝子体内注射により提供される。
更なる態様では、本発明の結合分子は、結合分子の投与に有用な装置、例えば、シリンジ、注射ペン又は他の装置と組み合わせて使用される。更なる態様では、本発明の結合分子は、例えば、結合分子の使用のための説明書を伴う添付文書も含む、パーツキットに含まれる。
本発明の結合分子及びそれを含む組成物の有効性を関与する具体的な疾患に応じて、それ自体公知の任意の適切なｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイ、細胞ベースアッセイ、ｉｎ ｖｉｖｏアッセイ及び／もしくは動物モデル又はそれらの任意の組み合わせを使用して試験することができる。適切なアッセイ及び動物モデルは、当業者に明らかであろうし、例えば、以下の実施例で使用されるアッセイ及び動物モデルを含む。
実際の医薬上有効量又は治療用量は、当然、当業者に公知の要因、例えば、患者の年齢及び体重、投与経路並びに疾患の重症度により決まるであろう。いずれにしも、本発明の結合分子は、患者の固有の状態に基づいて、医薬上有効量を送達することが可能となる用量及び様式で投与されるであろう。
本発明の結合分子をそれ自体で又は他の薬理学的に活性な成分、例えば、最新技術もしくは標準治療化合物と組み合わせて使用することができる。
したがって、本発明の更なる態様は、本発明の結合分子を薬学的に許容し得る担体及び場合により、１種以上の更なる有効成分と共に含む、医薬組成物を提供する。
結合分子の硝子体内注射のために、一般的には、処置の間のより長い間隔が好ましい。一実施態様では、本発明の結合分子は、６週間毎、好ましくは、７週間毎、また好ましくは、８週間毎、さらに好ましくは、９週間毎、より好ましくは、１０週間毎、さらに好ましくは、１１週間毎、より好ましくは、１２週間毎に投与される。さらに好ましい実施態様では、ＴｒｋＢ抗体は、３か月に１回投与される。本発明の具体的な結合分子及びその具体的な薬物動態及び他の特性に応じて、投与頻度は、さらに長い、例えば、１３週間毎、１４週間毎、１５週間毎、１６週間毎、１７週間毎、１８週間毎、１９週間毎又は２０週間毎である場合がある。
代替的には、例えば、負荷用量を含む他の投与計画を適用することができ、ここで、本発明の結合分子を３つの負荷用量について毎月、ついで、１２週間毎に注射することができる。同様に、投与頻度をこのような場合にも延長することができ、さらに長い、例えば、１３週間毎、１４週間毎、１５週間毎、１６週間毎、１７週間毎、１８週間毎、１９週間毎又は２０週間毎である場合がある。
約２．５mg/眼の予想推定ヒト用量は、５０μLが眼内に注射されるであろう５０mg/mL 製剤に相当する。
治療に使用するために、本発明の結合分子は、動物又はヒトへの投与を容易にするのに適した医薬組成物に製剤化される。本明細書に記載された結合分子又は抗体分子の典型的な製剤を、結合分子を生理学的に許容し得る担体、賦形剤又は安定剤と混合することにより、凍結乾燥もしくは何等かの乾燥製剤又は水溶液もしくは水性もしくは非水性懸濁液の形態に調製することができる。担体、賦形剤、修飾剤又は安定剤は、利用される用量及び濃度で無毒である。それらは、バッファー系、例えば、ホスファート、シトラート、アセタート並びに他の無機又は有機酸及びそれらの塩；アスコルビン酸及びメチオニンを含む酸化防止剤；保存剤、例えば、塩化オクタデシルジメチルベンジルアンモニウム、塩化ヘキサメトニウム、塩化ベンザルコニウム、塩化ベンゼトニウム、フェノール、ブチルアルコール又はベンジルアルコール；アルキルパラベン、例えば、メチルパラベン又はプロピルパラベン；カテコール、レゾルシノール、シクロヘキサノール、３－ペンタノール及びｍ－クレゾール；タンパク質、例えば、血清アルブミン、ゼラチンもしくは免疫グロブリン；親水性ポリマー、例えば、ポリビニルピロリドンもしくはポリエチレングリコール（ＰＥＧ）；アミノ酸、例えば、グリシン、グルタミン、アスパラギン、ヒスチジン、アルギニンもしくはリシン；グルコース、マンノース、スクロース、トレハロース、デキストリンもしくはデキストランを含む単糖類、二糖類、オリゴ糖類もしくは多糖類及び他の炭水化物；キレート剤、例えば、ＥＤＴＡ；糖アルコール、例えば、マンニトールもしくはソルビトール；塩形成カウンターイオン、例えば、ナトリウム；金属錯体（例えば、Ｚｎ－タンパク質錯体）並びに／又はイオン性もしくは非イオン性界面活性剤、例えば、TWEEN（商標）（ポリソルベート）、PLURONICS（商標）もしくは脂肪酸エステル、脂肪酸エーテルもしくは糖エステルを含む。また、有機溶媒、例えば、エタノール又はイソプロパノールも製剤中に含有させることができる。また、賦形剤は、放出修飾又は吸収修飾機能を有する場合もある。
通常、水溶液又は懸濁液が好ましいであろう。一般的には、治療用タンパク質、例えば、本発明の結合分子に適した製剤は、緩衝タンパク質溶液、例えば、適切な濃度（例えば、０．００１～４００mg/ml、好ましくは、０．００５～２００mg/ml、より好ましくは、０．０１～２００mg/ml、より好ましくは、１．０～１００mg/ml）のタンパク質を含む溶液である。
ただし、上記与えられた成分及びその量は、１つの好ましい選択肢のみを表わすことは、当業者には明らかであろう。その代替形態及び変形形態は、当業者には直ちに明らかであろうし又は上記開示から出発して容易に想到することができる。
ＴｒｋＢ結合分子
本発明の結合分子におけるＴｒｋＢ結合部位（２つのｓｃＦｖ）の設計が、ＴｒｋＢ結合及び活性化の最適な立体形成を明らかに支持するという驚くべき知見（これは、更なる抗原結合部位、例えば、ＶＥＧＦ結合部位又はＶＥＧＦ誘発クラスター形成メカニズムとは無関係である場合がある）に基づいて、さらに、本発明は、２つのｓｃＦｖを含むか又はそれからなり、ここで、各ｓｃＦｖがＴｒｋＢに特異的に結合し、両方ともＴｒｋＢアゴニストとして作用する、ＴｒｋＢ結合分子に関する。
理論に拘束されることを望むものではないが、本発明者らは、２つのｓｃＦｖをＴｒｋＢ結合分子内で組み合わせることにより、観察された完全なＴｒｋＢアゴニスト活性をもたらす最適な立体形成が達成されると考える。このため、一態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、完全なＴｒｋＢアゴニストであり、すなわち、ＴｒｋＢ結合分子は、天然のリガンドであるＢＤＮＦと同様にＴｒｋＢの活性化に有効である。
したがって、最も広い形態では、本発明は、２つのｓｃＦｖを含むか又はそれらからなり、ここで、各ｓｃＦｖがＴｒｋＢに特異的に結合する、ＴｒｋＢ結合分子に関する。
ｓｃＦｖ、特に、ＴｒｋＢ結合分子のその抗原であるＴｒｋＢへの特異的結合を例えば、本明細書に記載されたアッセイ、散乱分析及び／又は競合的結合アッセイ、例えば、ラジオイムノアッセイ（ＲＩＡ）、酵素イムノアッセイ（ＥＩＡ及びＥＬＩＳＡ）及びサンドイッチ競合アッセイ並びに当技術分野においてそれ自体公知のその種々の変形形態を含む、それ自体公知の任意の適切な方法で決定することができる。
ＴｒｋＢ結合分子は、それがＢＤＮＦの有効性の少なくとも９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％又は１００％を示す場合、ＢＤＮＦと同程度に有効であると考えられる。有効性を比較する目的で、ＢＤＮＦ及びＴｒｋＢ結合分子の両方を、有効性を測定する／決定することにより試験するであろう。この有効性は、ＴｒｋＢレセプターを安定して発現するＣＨＯ細胞をＢＤＮＦ又はＴｒｋＢ結合分子と共にインキュベーションし、処理されたＣＨＯ細胞の細胞ライセート中におけるＹ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化を測定することにより決定される最大応答である。更なる詳細は、実施例に記載されている。
関連する注記において、ＴｒｋＢ結合分子の一部は、ＢＤＮＦほど有効ではなかった、すなわち、完全なＴｒｋＢアゴニストではなかったが、それにもかかわらず、非常に高い有効性を示したことも観察された。したがって、別の態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、ＴｒｋＢレセプターを安定して発現するＣＨＯ細胞をＢＤＮＦ又はＴｒｋＢ結合分子と共にインキュベーションし、処理されたＣＨＯ細胞の細胞ライセート中におけるＹ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化を測定することにより決定された場合、ＢＤＮＦと比較して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％又は９０％有効である場合がある。更なる詳細は、実施例に記載されている。
ＴｒｋＢ結合分子中の２つのｓｃＦｖ同士が連結して、ＴｒｋＢ結合分子、特に、二価のＴｒｋＢ結合分子を形成していると理解される。ＴｒｋＢ結合分子中の２つのｓｃＦｖ同士が融合しているか又はそうでなければ共有結合している場合がある。代替的には、２つのｓｃＦｖは、ペプチドリンカー、好ましくは、例えば、約４～２０個のアミノ酸の長さを有するペプチドリンカー、より好ましくは、フレキシブルペプチドリンカーを介して連結されている場合がある。いずれの場合も、４～１００個の範囲のアミノ酸の長さを有し、フレキシブル、らせん状又は剛性の他のリンカーを使用することができる。場合によっては、より長いリンカー及び／又は剛性のリンカーが好ましい場合がある。また、ＴｒｋＢ結合分子中のｓｃＦｖ同士を、ヒンジ領域を介しても連結させることができる。ヒンジ領域は、Ｆａｂ（フラグメント抗原結合）領域をＦｃ（フラグメント結晶化可能）領域に連結する抗体の重鎖の短い配列であると、当業者に十分に理解される。
１つの代替において、ＴｒｋＢ結合分子は、ペプチドリンカーを介して連結された２つのｓｃＦｖを含むか又はそれらからなる。別の代替では、ＴｒｋＢ結合分子は、ヒンジ領域を介して連結された２つのｓｃＦｖを含むか又はそれらからなる。別の代替では、ＴｒｋＢ結合分子は、ヒンジ領域を介して連結された２つのｓｃＦｖからなる。
ＴｒｋＢ結合分子中の各ｓｃＦｖは、ＴｒｋＢタンパク質内の同じか又は異なるエピトープに結合することができる。好ましくは、両方のｓｃＦｖが、同じＴｒｋＢエピトープに結合する。関連する実施態様では、２つのｓｃＦｖは同一である。この実施態様では、両方のｓｃＦｖが、同じＶＬ及びＶＨ配列に基づくであろう。別の実施態様では、２つのｓｃＦｖが、実質的に同じである、すなわち、両方のｓｃＦｖは、同じＣＤＲ領域を有するが、フレームワーク領域において幾らかの可変性を有する場合がある。関連する実施態様では、２つのｓｃＦｖは、同じＣＤＲ領域を有し、残りのフレームワーク領域同士は、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。別の実施態様では、両方のｓｃＦｖは、互いに異なる、すなわち、異なるＶＬ及び／又はＶＨ配列を有する。
ＴｒｋＢ結合分子中のｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端に向かって、ＶＨドメイン（例えば、マウス、ヒト化又はヒトＶＨドメイン）、リンカー及びＶＬドメイン（例えば、マウス、ヒト化又はヒトＶＬドメイン）又はその逆に、ＶＬドメイン、リンカー及びＶＨドメインを含むことができる。好ましくは、ＴｒｋＢ結合分子中のｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端へのＶＬ－ＶＨ配向を有する。
加えて、一本鎖Ｆｖフラグメントを、システイン残基の取り込みを介して、ＶＨドメインとＶＬドメインとの間、ＶＨドメイン内又はＶＬドメイン内のジスルフィド結合の取り込みによりさらに安定化させることができる。Ｎ末端という用語は、ポリペプチド鎖の最初のアミノ酸を示す。一方、Ｃ末端という用語は、ポリペプチド鎖のＣ末端の最後のアミノ酸を示す。したがって、一実施態様では、一方又は両方のｓｃＦｖは、ジスルフィド結合を形成するための追加のシステイン残基を含む。
一実施態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、Ｉｇ分子をさらに含む。この実施態様に関連して、Ｉｇ分子は、モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラ抗体、抗体のフラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体、例えば、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、小モデュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、ドメイン抗体、ナノボディ又はダイアボディであることができる。さらに、この実施態様に関連して、各ｓｃＦｖは、Ｉｇ分子の重鎖のＣ末端に融合していることができる。代替的には、各ｓｃＦｖは、Ｉｇ分子の重鎖のＮ末端に融合していることができる。好ましくは、Ｉｇ分子は、ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ）又はＦ（ａｂ’）２である。好ましくは、Ｉｇ分子は、Ｆｃ領域を含むか又はそれからなる。関連する実施態様では、各ｓｃＦｖは、ペプチドリンカー、好ましくは、約４～２０個のアミノ酸の長さを有するペプチドリンカーにより、Ｉｇ分子に融合していることができる。いずれの場合も、４～１００個の範囲のアミノ酸の長さを有し、フレキシブル、らせん状又は剛性の他のリンカーを使用することができる。場合によっては、より長いリンカー及び／又は剛性のリンカーが好ましい場合がある。
好ましい実施態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、Ｆｃ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、（ｓｃＦｖ’）２又はｓｃＦｖ－ＣＨ３のフォーマットにある。ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットは、図７０Ｂに示されており、２つのポリペプチド鎖を含むか又はそれらからなり、各ポリペプチド鎖は、ｓｃＦｖ、ＩｇＧのＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含有し、ここで、両方のポリペプチド鎖同士が、ヒンジ領域中のジスルフィド結合を介して二量体を一緒に形成しており、各ｓｃＦｖは、ヒンジ領域に融合している。Ｆｃ－ｓｃＦｖフォーマットは、図７０Ｃに示されており、２つのポリペプチド鎖を含むか又はそれらからなり、各ポリペプチド鎖は、ＩｇＧのＣＨ２及びＣＨ３ドメインと、ｓｃＦｖとを含有し、ここで、両方のポリペプチド鎖同士が、ヒンジ領域中のジスルフィド結合を介して二量体を形成しており、各ｓｃＦｖは、１つのポリペプチド鎖のＣＨ３ドメインのＣ末端に融合している。図７０Ｃに示されたＦｃ－ｓｃＦｖフォーマットは、１つ以上のＦａｂドメインをさらに含む場合があると理解されたい。
前述の実施態様のいずれかに関する実施態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、ＴｒｋＢアゴニストである。好ましくは、ＴｒｋＢ結合分子は、ＢＤＮＦと比較して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％９５％又は１００％有効である。
前述の実施態様のいずれかに関する実施態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、二重特異性かつ四価であり、より好ましくは、Doppelmabである。
更なるＩｇ分子を加えることにより、完全なＴｒｋＢアゴニスト効果を達成するためのＴｒｋＢ結合分子内の２つのｓｃＦｖの最適な立体形成が支持される。この効果は、ＴｒｋＢ結合分子の立体形成に基づくものであり、Ｉｇ分子の特異性に基づくものではないため、Ｉｇ分子の特異性に依存しないと考えられる。したがって、Ｉｇ分子を任意のターゲットに結合するように設計することができる。観察された完全なアゴニスト効果は、主に、ＴｒｋＢ結合分子内のｓｃＦｖの立体形成に基づいていると考えられるため、Ｉｇ分子は、任意のターゲットに特異的に結合しない場合もあり又は任意のターゲット特異的結合ドメインを全く含有しない場合もあるということになる。
さらに好ましい実施態様では、Ｉｇ分子は、Ｆｃ領域を含むか又はそれからなる。好ましくは、この実施態様では、各ｓｃＦｖは、Ｆｃ領域の重鎖のＣ末端に融合している。この実施態様に関する更なる実施態様では、各ｓｃＦｖは、ペプチドリンカー、好ましくは、約４～２０個のアミノ酸の長さを有するペプチドリンカーにより、Ｆｃ領域に融合している。
また、ここで、ＴｒｋＢ結合分子中の２つのｓｃＦｖ及びＩｇ分子同士が結合して、ＴｒｋＢ結合分子を形成していると理解される。ｓｃＦｖは、Ｉｇ分子に直接融合しているかもしくはそうでなければ共有結合している場合があり又はそれらは、リンカー、好ましくは、例えば、約４～２０個のアミノ酸の長さを有するペプチドリンカー、より好ましくは、フレキシブルペプチドリンカーを介してＩｇ分子に連結されている場合がある。
好ましくは、ｓｃＦｖは、Ｉｇ分子の重鎖のＣ末端に融合している。好ましくは、Ｉｇ分子は、ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ）又はＦ（ａｂ’）２である。したがって、好ましい実施態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、２つのｓｃＦｖ及びＩｇＧ、Ｆ（ａｂ）又はＦ（ａｂ’）２を含むか又はそれらからなり、ここで、各ｓｃＦｖは、ＴｒｋＢに特異的に結合する。関連する好ましい実施態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、二重特異性かつ四価であり、２つのｓｃＦｖ及び１つのＩｇＧ又はＦ（ａｂ’）２を含むか又はそれらからなり、ここで、各ｓｃＦｖは、ＴｒｋＢに特異的に結合する。好ましい実施態様では、Ｉｇ分子、より好ましくは、ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ）又はＦ（ａｂ’）２は、ＶＥＧＦに特異的に結合する。
ｓｃＦｖ分子をＩｇ分子、例えば、ＩｇＧ分子等の重鎖のＣ末端に連結させる方法又は可変ドメインをｓｃＦｖ分子に連結させる方法は、当技術分野において周知である。典型的には、グリシン及びセリンの小さなリンカー配列（ＧＳミニリンカーと呼ばれる）のアミノ酸が使用される。リンカー中のアミノ酸の数は、４（ＧＧＧＳ）（配列番号：２２７）、６（ＧＧＳＧＧＳ）（配列番号：２１７）、１０（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号：２１８）、１５（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号：２１９）、２０（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号：２２０）又はそれ以上で変動させることができる。実際には、通常、リンカーは、目的のＩｇをコードする核酸分子を、リンカー配列（例えば、５、１０、１５又は２０個のアミノ酸のうちのいずれか１つのＧＳミニリンカー、好ましくは、配列番号：２１８のリンカー）をコードする核酸分子により離間された所望のｓｃＦｖをコードする核酸（この場合、ＴｒｋＢ結合部位についてのＶＬ－ＶＨ配向又はＶＨ－ＶＬ配向のいずれかの重鎖及び軽鎖の可変ドメインをコードする核酸を含むであろう）と組み合わせることにより形成される。ついで、先で説明されたように、この完全なＨＣ－ｓｃＦｖコード核酸分子を発現ベクター内に配置し、適切な宿主細胞に導入して、完全なＩｇ重鎖－ｓｃＦｖ単一ポリペプチドが形成される。
好ましくは、ｓｃＦｖ分子とＩｇ分子の重鎖のＣ末端との間のＧＳミニリンカーは、１０Ｌ１（配列番号：２１８）である。
一態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、天然のＴｒｋＢリガンドであるＢＤＮＦより、ＴｒｋＢ下流シグナル伝達経路の活性化を強力に誘引する。更なる態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、ＢＤＮＦのものと同等のパターンで、ＴｒｋＢ媒介性シグナル伝達経路を介して遺伝子発現をレギュレーションする。
更なる態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、ＴｒｋＢリン酸化及び／又は活性化に特異的であり、ＴｒｋＡ又はＴｒｋＣを非特異的にリン酸化せず／活性化しない。
一実施態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、
（ｉ）それぞれがＮ末端からＣ末端に向かって、
－ＴｒｋＢに特異的なｓｃＦｖ（例えば、Ｎ末端からＣ末端へのＶＨドメイン（例えば、マウス、ヒト化又はヒトＶＨドメイン）、リンカー及びＶＬドメイン（例えば、マウス、ヒト化又はヒトＶＬドメイン）又はその逆に、ＶＬドメイン、リンカー及びＶＨドメインを含むｓｃＦｖ
－（場合により）ペプチドリンカー（例えば、ＧＳミニリンカー）及び
－好ましくは、ＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４）の定常ドメイン、より好ましくは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
含む２つの重鎖を含むか又はそれからなる。
一実施態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、
（ｉ）それぞれがＮ末端からＣ末端に向かって、
－好ましくは、ＩｇＧ（例えば、ヒトＩｇＧ１又はＩｇＧ４）の定常ドメイン、より好ましくは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３
－（場合により）ペプチドリンカー（例えば、ＧＳミニリンカー）及び
－ＴｒｋＢに特異的なｓｃＦｖ（例えば、Ｎ末端からＣ末端へのＶＨドメイン（例えば、マウス、ヒト化又はヒトＶＨドメイン）、リンカー及びＶＬドメイン（例えば、マウス、ヒト化又はヒトＶＬドメイン）又はその逆に、ＶＬドメイン、リンカー及びＶＨドメインを含むｓｃＦｖ）
含む２つの重鎖を含むか又はそれからなる。
更なる関連する態様では、本発明は、アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの有効性を改善する方法を提供する。本発明者らは、驚くべきことに、アゴニスト性ＴｒｋＢバインダー、特に、部分的アゴニスト性ＴｒｋＢバインダー、例えば、ＩｇＧの有効性を、本発明の方法を適用した場合、改善することができることを見出した。この態様に関連して、本発明は、それが基礎とするアゴニスト性ＴｒｋＢバインダーと比較して、改善された有効性を有するＴｒｋＢ結合分子を製造し又は生成する方法を提供する。
この方法は、アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの可変軽鎖ドメイン及び可変重鎖ドメインを使用して、第１のｓｃＦｖを生成することを含む。続けて、第１のｓｃＦｖと同一であるか又は異なるかのいずれかである第２のｓｃＦｖを生成し、１つの分子中で両方のｓｃＦｖを連結させ又は付着させて、両方のｓｃＦｖを含む二価のＴｒｋＢ結合分子を生成する。その最も広い意味において、この方法を、任意のアゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの有効性を改善しかつそれが基礎とするアゴニスト性ＴｒｋＢバインダーと比較して、改善された有効性を有するＴｒｋＢ結合分子を製造し又は生成するのに使用することができる。アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの有効性を改善するための以下の教示は、それが基礎とするアゴニスト性ＴｒｋＢバインダーと比較して、改善された有効性を有するＴｒｋＢ結合分子を製造し又は生成するための方法に準用されると理解されたい。
本明細書で使用する場合、「アゴニスト性ＴｒｋＢバインダー」は、結合分子の抗原結合部分を共に形成し、ＴｒｋＢレセプターに特異的に結合し、アゴニストとして作用する軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含むことを特徴とする、結合分子を指す。軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含有する多種類のフォーマットが、当業者に公知であり、非網羅的列記は、モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラ抗体、抗体のフラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体、例えば、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、小モデュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、ドメイン抗体、ナノボディ又はダイアボディを含む。
特に、この方法を例えば、スクリーニング及び適切なアッセイを介して特定され、特徴付けされたアゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの有効性を改善するのに使用することができる。この方法は、アゴニスト性ＴｒｋＢ結合抗体、例えば、ＩｇＧの有効性を改善するのに特に有用である。アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーは、ｓｃＦｖである場合があることも理解されたい。
当技術分野において、多数のアゴニスト性ＴｒｋＢバインダーが記載されており、当業者であれば、本明細書に記載された方法に従って、それらの有効性を改善するために、それらの中から自由に選択することが可能であろう。
したがって、一態様では、本発明の方法に従って生成されたＴｒｋＢ結合分子は、ＴｒｋＢ結合分子を生成するための基礎としたアゴニスト性ＴｒｋＢバインダーと比較して、ＴｒｋＢを活性化するのにより有効である、すなわち、より高い有効性を示すであろう。
本明細書で使用する場合、有効性は、薬剤により達成することができる最大応答を記載する。薬剤の効果は、グラフにおいて濃度に対してプロットされ、濃度－応答曲線を与える。使用される濃度の上昇は、Ｘ軸により表示され、最大半量及び最大応答は、Ｙ軸により表示される。曲線上の最も高い点は、最大応答（有効性）を示し、Ｅｍａｘと呼ばれる。有効性（Ｅｍａｘ）は、この薬剤から予想することができる最大の効果である（すなわち、この大きさの効果に達した場合、用量を増加させても、より大きな大きさの効果は生じないであろう）。本発明の目的で、有効性の絶対的向上は重要ではなく、アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーのＶＬ及びＶＨからＴｒｋＢ結合分子を生成することにより達成される相対的向上が重要である。
一実施態様では、本発明は、アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの有効性を改善するための方法であって、アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーが軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含有し、
（ｉ）アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーのＶＬ及びＶＨにより第１の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を生成することと、
（ｉｉ）工程（ｉ）のアゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの同じかもしくは実質的に同じＶＬ及びＶＨ又は異なるアゴニスト性ＴｒｋＢバインダーのＶＬ及びＶＨにより第２のｓｃＦｖを生成することと、
（ｉｉｉ）第１及び第２のｓｃＦｖをＴｒｋＢ結合分子内に含ませることであって、ＴｒｋＢ結合分子が工程（ｉ）及び（ｉｉ）からの少なくとも２つのアゴニスト性ＴｒｋＢ結合ｓｃＦｖを含み、
ここで、ＴｒｋＢ結合分子がアゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの有効性と比較して、より高い有効性を有し、
ここで、この有効性がＴｒｋＢレセプターを安定に発現するＣＨＯ細胞をアゴニスト性ＴｒｋＢバインダー又はＴｒｋＢ結合分子と共にインキュベーションし、処理されたＣＨＯ細胞の細胞ライセート中において、Ｙ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化を測定することにより決定された最大応答である、方法を提供する。
関連する実施態様では、アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーは、部分的アゴニストである。
関連する実施態様では、アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの有効性と比較したＴｒｋＢ結合分子の有効性は、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％高い。有効性を比較する目的で、アゴニスト性ＴｒｋＢバインダー及びＴｒｋＢ結合分子の両方を、有効性を測定する／決定することにより試験するであろう。この有効性は、ＴｒｋＢレセプターを安定して発現するＣＨＯ細胞をアゴニスト性ＴｒｋＢバインダー又はＴｒｋＢ結合分子と共にインキュベーションし、処理されたＣＨＯ細胞の細胞ライセート中におけるＹ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化を測定することにより決定される最大応答である。更なる詳細は、実施例に記載されている。
関連する実施態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、ＢＤＮＦと比較して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％有効である。ここでも、有効性を比較する目的で、ＢＤＮＦ及びＴｒｋＢ結合分子の両方を、有効性を測定する／決定することにより試験するであろう。この有効性は、ＴｒｋＢレセプターを安定して発現するＣＨＯ細胞をＢＤＮＦ又はＴｒｋＢ結合分子と共にインキュベーションし、処理されたＣＨＯ細胞の細胞ライセート中におけるＹ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化を測定することにより決定される最大応答である。更なる詳細は、実施例に記載されている。
関連する実施態様では、２つのｓｃＦｖは同一である。この実施態様では、両方のｓｃＦｖが、同じアゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの同じＶＬ及びＶＨに基づくであろう。別の実施態様では、２つのｓｃＦｖが、実質的に同じである、すなわち、両方のｓｃＦｖは、同じＣＤＲ領域を有するが、フレームワーク領域において幾らかの可変性を有する場合がある。関連する実施態様では、２つのｓｃＦｖは、同じＣＤＲ領域を有し、残りのフレームワーク領域同士は、少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は９９％同一である。別の実施態様では、両方のｓｃＦｖは、互いに異なる、すなわち、２つの異なるアゴニスト性ＴｒｋＢバインダーに基づいている。前記実施態様では、ＴｒｋＢ結合分子の有効性は、それが基礎とする両方のアゴニスト性ＴｒｋＢバインダーと比較して、両方とも改善されるであろう。
別の実施態様では、２つのアゴニスト性ＴｒｋＢ結合ｓｃＦｖは、同じエピトープに結合するか又は異なるエピトープに結合する。
最も広い意味において、ＴｒｋＢ結合分子は、第１及び第２のｓｃＦｖにより形成される、すなわち、両方とも、ＴｒｋＢ結合を形成するために含まれる。ＴｒｋＢ結合分子内で、両方のｓｃＦｖ同士が直接融合しているか又はそうでなければそれら同士が直接共有結合して、ＴｒｋＢ結合分子（ｓｃＦｖ－ｓｃＦｖ）を形成することができる。代替的には、ｓｃＦｖ同士が、リンカーを介して連結される場合もある（ｓｃＦｖ－リンカー－ｓｃＦｖ）。更なる代替において、ｓｃＦｖ同士が、ヒンジ領域を介して連結される場合がある（ｓｃＦｖ－ヒンジ－ｓｃＦｖ）。さらに別の代替において、ｓｃＦｖ同士が直接連結されておらず、Ｉｇ分子の一部である、すなわち、両方のｓｃＦｖが、Ｉｇ分子に付着している。
したがって、関連する実施態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、Ｉｇ分子をさらに含む。Ｉｇ分子は、モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラ抗体、フラグメント、例えば、Ｆｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’又はＦ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体、例えば、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、小モデュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、ドメイン抗体、ナノボディ又はダイアボディであることができる。
関連する実施態様では、各ｓｃＦｖは、Ｉｇ分子の重鎖のＣ末端に融合している。代替的には、各ｓｃＦｖは、Ｉｇ分子の重鎖のＮ末端に融合しているか又はＮ末端で抗原結合ドメインと置き換わっている。
好ましい実施態様では、Ｉｇ分子は、ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ）又はＦ（ａｂ’）２である。さらに好ましい実施態様では、Ｉｇ分子は、Ｆｃ領域を含むか又はそれからなる。より好ましい実施態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、Ｆｃ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、（ｓｃＦｖ’）２又はｓｃＦｖ－ＣＨ３のフォーマットにある。
関連する実施態様では、各ｓｃＦｖは、ペプチドリンカー、好ましくは、約４～２０個のアミノ酸の長さを有するペプチドリンカーによりＩｇ分子に融合している。
更なる実施態様では、ｓｃＦｖ同士が、ヒンジ領域又はリンカーのみを介して互いに連結されている場合がある。ここでも、ＴｒｋＢ結合分子中の２つのｓｃＦｖ同士が連結して、ＴｒｋＢ結合分子を形成すると理解されたい。ｓｃＦｖ同士が融合しているかもしくはそうでなければそれら同士が直接共有結合している場合があり又はそれらはリンカー、好ましくは、例えば、約４～２０個のアミノ酸の長さを有するペプチドリンカー、より好ましくは、フレキシブルペプチドリンカーを介して連結されている場合がある。
好ましい実施態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、リンカーを介して連結された２つのｓｃＦｖを含むか又はそれらからなる。ｓｃＦｖ分子を連結させる方法は、当技術分野において周知である。典型的には、グリシン及びセリンの小さなリンカー配列（ＧＳミニリンカーと呼ばれる）のアミノ酸が使用される。リンカー中のアミノ酸の数は、４（ＧＧＧＳ）（配列番号：２２７）、６（ＧＧＳＧＧＳ）（配列番号：２１７）、１０（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号：２１８）、１５（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号：２１９）、２０（ＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ）（配列番号：２２０）又はそれ以上で変動させることができる。
別の好ましい実施態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、ヒンジ領域のみを介して連結された２つのｓｃＦｖを含むか又はそれらからなる。このような分子を例えば、ｓｃＦｖ－Ｆｃ分子をペプシン処理に供することにより生成することができる。使用することができる他の酵素は、当業者に公知であり、例えば、ヒンジ領域直下の１つの特異的単一部位でＩｇＧ及びＦｃ融合を開裂させるシステインプロテアーゼであるＦａｂｒｉｃａｔｏｒである。ヒンジ領域のみを介して連結された２つのｓｃＦｖを生成するために、他の方法、物質及び／又は酵素を等しく使用することができると理解されたい。このような方法、物質及び／又は酵素により、特異的切断部位に応じて、異なる長さを有するヒンジ領域をもたらすことができる。別の実施態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、２つのｓｃＦｖと、２つのｓｃＦｖを連結させるヒンジ領域とからなる。
他の全ての実施態様に関する実施態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、ＴｒｋＢアゴニストである。さらに好ましい実施態様では、アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーは二価であり、得られたＴｒｋＢ結合分子は、二価又は四価のいずれかである。関連する実施態様では、アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーは、二価の部分的アゴニストである。
好ましい実施態様では、本発明は、二価の部分的アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの有効性を改善するための方法であって、二価の部分的アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーが軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含有し、
（ｉ）アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーのＶＬ及びＶＨにより第１の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を生成することと、
（ｉｉ）工程（ｉ）のアゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの同じか又は実質的に同じＶＬ及びＶＨにより第２のｓｃＦｖを生成することと、
（ｉｉｉ）第１及び第２のｓｃＦｖをＴｒｋＢ結合分子内に含ませることであって、ＴｒｋＢ結合分子が工程（ｉ）及び（ｉｉ）からの少なくとも２つのアゴニスト性ＴｒｋＢ結合ｓｃＦｖを含み、
ここで、ＴｒｋＢ結合分子が二価の部分的アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの有効性と比較して、より高い有効性を有し、
ここで、この有効性がＴｒｋＢレセプターを安定に発現するＣＨＯ細胞をアゴニスト性ＴｒｋＢバインダー又はＴｒｋＢ結合分子と共にインキュベーションし、処理されたＣＨＯ細胞の細胞ライセート中において、Ｙ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化を測定することにより決定された最大応答である、方法を提供する。
関連する実施態様では、二価の部分的アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーは、ＩｇＧである。好ましい実施態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、Ｆｃ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、（ｓｃＦｖ’）２又はｓｃＦｖ－ＣＨ３のフォーマットにある。さらに好ましい実施態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、二重特異性かつ四価である。
ＩｇＧと比較して、ｓｃＦｖ－Ｆｃ及びＦｃ－ｓｃＦｖフォーマットの両方が、それらが基礎とするＩｇＧより有効であった、すなわち、有効性：ＩｇＧ＜＜ｓｃＦｖ－Ｆｃ～Ｆｃ－ｓｃＦｖであったという、全般的な観察がなされた。効力に関して、ＩｇＧは、ｓｃＦｖ－Ｆｃと同様の効力を示した。一方、Ｆｃ－ｓｃＦｖは、わずかに効力が低かった、すなわち、効力：ＩｇＧ～ｓｃＦｖ－Ｆｃ＞＞Ｆｃ－ｓｃＦｖであった。
一態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、それが基礎とするＩｇＧ分子と同程度の効力である。別の態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、それが基礎とするＩｇＧ分子と同程度の効力であり、より有効である。別の態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、それが基礎とするＩｇＧ分子より有効である。別の態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、それが基礎とするＩｇＧ分子より有効であり、わずかに効力が低い。
また、本発明は、前述の実施態様のいずれかのＴｒｋＢ結合分子の（ｉ）重鎖もしくは重鎖可変ドメイン及び／又は（ｉｉ）軽鎖もしくは軽鎖可変ドメインをコードする、単離された核酸分子に関する。
また、本発明は、ＴｒｋＢ結合分子の単離された核酸分子を含む、ウイルスベクターに関する。さらに、本発明は、ＴｒｋＢ結合分子の核酸分子を含む、発現ベクターに関する。さらに、本発明は、ＴｒｋＢ結合分子の核酸分子を含む発現ベクターでトランスフェクトされた、宿主細胞に関する。
更なる態様では、本発明は、
（ａ）以下の分子の発現を可能にする条件下で、宿主細胞を培養することと、
（ｂ）該分子を回収することと、場合により、
（ｃ）該分子をさらに精製しかつ／又は修飾しかつ／又は製剤化することとを含む、
前述の実施態様のいずれかのＴｒｋＢ結合分子を製造する方法を提供する。
更なる態様では、本発明は、医薬に使用するためのものであり、ここで、該使用が眼もしくは網膜の疾患又は神経変性疾患の処置である、前述の実施態様のいずれかのＴｒｋＢ結合分子に関する。関連する実施態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、黄斑変性症、加齢黄斑変性症、滲出性加齢黄斑変性症（ｗＡＭＤ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜色素変性症、遺伝性網膜ジストロフィー、遺伝性黄斑ジストロフィー、近視性変性症、地図状萎縮症、網膜動脈閉塞症、眼内炎、ブドウ膜炎、嚢胞様黄斑浮腫、任意の網膜疾患に続発する脈絡膜新生血管膜、視神経症、緑内障、網膜剥離、中毒性網膜症、放射線網膜症並びに外傷性網膜症、前駆型及び軽度から中等度のアルツハイマー病、アルツハイマー病を有する患者の疾患進行の遅延、ハンチントン病、パーキンソン病、大うつ病性障害、統合失調症、統合失調症に関連する認知障害、減弱精神病症候群を有する個体における初発精神病の予防、統合失調症を有する患者における再発の予防、処置抵抗性うつ病、過食症、肥満又はメタボリックシンドロームの治療及び／又は予防に使用される。
別の実施態様では、ＴｒｋＢ結合分子は、難聴、特に、シスプラチン誘発性難聴並びに騒音性及び加齢性難聴の処置に有用である場合がある。
更なる態様では、本発明は、薬学的に許容し得る担体と、前述の実施態様のいずれかのＴｒｋＢ結合分子とを含む、医薬組成物に関する。
項
第１の項は、血管内皮増殖因子（ＶＥＧＦ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位と、トロポミオシンレセプターキナーゼＢ（ＴｒｋＢ）に特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位とを含む、結合分子に関する。第１の項に関して、結合分子は、二重特異性かつ四価である。さらに、第１の項の結合分子に関して、ＶＥＧＦに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子である。さらに、第１の項の結合分子に関して、ＴｒｋＢに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、Ｉｇ分子の重鎖のＣ末端に融合している。さらに、第１の項の結合分子に関して、ＴｒｋＢに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、１つ以上のｓｃＦｖを含む。さらに、第１の項の結合分子に関して、ＶＥＧＦに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、免疫グロブリン（Ｉｇ）分子であり、ＴｒｋＢに特異的に結合する少なくとも１つの抗原結合部位は、１つ以上のｓｃＦｖを含む。さらに、これに関して、１つ以上のｓｃＦｖは、Ｎ末端からＣ末端へのＶＬ－ＶＨ配向を有する。さらに、これに関して、１つ以上のｓｃＦｖは、Ｉｇ分子の重鎖のＣ末端に融合している。さらに、第１の項の結合分子に関して、Ｉｇ分子は、モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラ抗体、（ｓｃＦｖ）２又は抗体のフラグメント、例えば、Ｆ（ａｂ’）２フラグメントである。さらに、第１の項の結合分子に関して、Ｉｇ分子は、ＩｇＧ又はＦ（ａｂ’）２である。さらに、第１の項の結合分子に関して、１つ以上のｓｃＦｖは、ペプチドリンカー、好ましくは、約４～２０個のアミノ酸の長さを有するペプチドリンカーによりＩｇ分子に融合している。
さらに、第１の項の結合分子に関して、ＴｒｋＢに特異的に結合する抗原結合部位は、
ａ）配列番号：２０１（ＣＤＲ１）、配列番号：２０２（ＣＤＲ２）及び配列番号：２０３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位並びに
配列番号：２０４（ＣＤＲ１）、配列番号：２０５（ＣＤＲ２）及び配列番号：２０６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位又は
配列番号：２０７（ＣＤＲ１）、配列番号：２０８（ＣＤＲ２）及び配列番号：２０９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位又は
配列番号：２１０（ＣＤＲ１）、配列番号：２１１（ＣＤＲ２）及び配列番号：２１２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位
から選択される。
さらに、第１の項の結合分子に関して、ＴｒｋＢに特異的に結合する抗原結合部位は、
ａ）配列番号：２１３又は２１５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインと、配列番号：２１４又は２１６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインとを含む抗原結合部位
から選択される。
さらに、第１の項の結合分子に関して、結合分子は、配列番号：２２２のアミノ酸配列又は配列番号：２２３のアミノ酸配列又は配列番号：２２４のアミノ酸配列又は配列番号：２２５のアミノ酸配列を含む。
さらに、第１の項の結合分子に関して、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗原結合部位は、抗原結合部位ａ）～ｃ）：
ａ）配列番号：１４５（ＣＤＲ１）、配列番号：１４６（ＣＤＲ２）及び配列番号：１４７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位並びに
配列番号：１４８（ＣＤＲ１）、配列番号：１４９（ＣＤＲ２）及び配列番号：１５０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位又は
配列番号：１５１（ＣＤＲ１）、配列番号：１５２（ＣＤＲ２）及び配列番号：１５３（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位又は
配列番号：１５４（ＣＤＲ１）、配列番号：１５５（ＣＤＲ２）及び配列番号：１５６（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
ｂ）配列番号：１５７（ＣＤＲ１）、配列番号：１５８（ＣＤＲ２）及び配列番号：１５９（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位並びに
配列番号：１６０（ＣＤＲ１）、配列番号：１６１（ＣＤＲ２）及び配列番号：１６２（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位又は
配列番号：１６３（ＣＤＲ１）、配列番号：１６４（ＣＤＲ２）及び配列番号：１６５（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位又は
配列番号：１６６（ＣＤＲ１）、配列番号：１６７（ＣＤＲ２）及び配列番号：１６８（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位；
ｃ）配列番号：１６９（ＣＤＲ１）、配列番号：１７０（ＣＤＲ２）及び配列番号：１７１（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む軽鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位並びに
配列番号：１７２（ＣＤＲ１）、配列番号：１７３（ＣＤＲ２）及び配列番号：１７４（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位又は
配列番号：１７５（ＣＤＲ１）、配列番号：１７６（ＣＤＲ２）及び配列番号：１７７（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位又は
配列番号：１７８（ＣＤＲ１）、配列番号：１７９（ＣＤＲ２）及び配列番号：１８０（ＣＤＲ３）のアミノ酸配列を含む重鎖ＣＤＲを含む抗原結合部位
からなる群より選択される。
さらに、第１の項の結合分子に関して、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗原結合部位は、抗原結合部位ａ）～ｄ）：
ａ）配列番号：１８１のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインと、配列番号：１８２のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインとを含む抗原結合部位；
ｂ）配列番号：１８３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインと、配列番号：１８４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインとを含む抗原結合部位；
ｃ）配列番号：１８９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインと、配列番号：１９０、１９１、１９２又は１９４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインとを含む抗原結合部位；
ｄ）配列番号：１９３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメインと、配列番号：１９０、１９１、１９２又は１９４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインとを含む抗原結合部位
からなる群より選択される。
さらに、第１の項の結合分子に関して、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗原結合部位は、抗原結合部位ａ）～ｄ）：
ａ）配列番号：１８５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号：１８６のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖とを含む抗原結合部位；
ｂ）配列番号：１８７のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号：１８８のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖とを含む抗原結合部位；
ｃ）配列番号：１９５のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号：１９６、１９７、１９８又は２００のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖とを含む抗原結合部位；
ｄ）配列番号：１９９のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号：１９６、１９７、１９８又は２００のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖とを含む抗原結合部位
からなる群より選択される。
第２の項は、配列番号：１、３、５、７、９、１１、１３、１５、１７、１９、２１、２３、２５、２７、２９、３１、３３、３５、３７、３９、４１、４３、４５、４７、４９、５１、５３、５５、５７、５９、６１、６３、６５、６７、６９、７１、７３、７５、７７、７９、８１、８３、８５、８７、８９、９１、９３、９５、９７、９９、１０１、１０３、１０５、１０７、１０９、１１１、１１３、１１５、１１７、１１９、１２１、１２３、１２５、１２７、１２９、１３１、１３３、１３５、１３７、１３９、１４１又は１４３のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号：２、４、６、８、１０、１２、１４、１６、１８、２０、２２、２４、２６、２８、３０、３２、３４、３６、３８、４０、４２、４４、４６、４８、５０、５２、５４、５６、５８、６０、６２、６４、６６、６８、７０、７２、７４、７６、７８、８０、８２、８４、８６、８８、９０、９２、９４、９６、９８、１００、１０２，１０４、１０６、１０８、１１０、１１２、１１４、１１６、１１８、１２０、１２２、１２４、１２６、１２８、１３０、１３２、１３４、１３６、１３８、１４０、１４２又は１４４のアミノ酸配列と少なくとも８０％、８１％、８２％、８３％、８４％、８５％、８６％、８７％、８８％、８９％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％又は少なくとも９９％同一のアミノ酸配列を含む重鎖とを含む、結合分子に関する。
第３の項は、（ｉ）配列番号：４１のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：４２のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｉｉ）配列番号：４３のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：４４のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｉｉｉ）配列番号：４５のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：４６のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｉｖ）配列番号：４７のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：４８のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｖ）配列番号：４９のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：５０のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｖｉ）配列番号：５１のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：５２のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｖｉｉ）配列番号：５３のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：５４のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｖｉｉｉ）配列番号：５５のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：５６のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｉｘ）配列番号：５７のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：５８のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘ）配列番号：５９のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：６０のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｉ）配列番号：６１のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：６２のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｉｉ）配列番号：６３のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：６４のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｉｉｉ）配列番号：６５のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：６６のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｉｖ）配列番号：６７のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：６８のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｖ）配列番号：６９のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：７０のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｖｉ）配列番号：７１のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：７２のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｖｉｉ）配列番号：７３のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：７４のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｖｉｉｉ）配列番号：７５のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：７６のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｉｘ）配列番号：７７のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：７８のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｘ）配列番号：７９のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：８０のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｘｉ）配列番号：８１のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：８２のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｘｉｉ）配列番号：８３のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：８４のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｘｉｉｉ）配列番号：８５のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：８６のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｘｉｖ）配列番号：８７のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：８８のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｘｖ）配列番号：８９のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：９０のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｘｖｉ）配列番号：９１のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：９２のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｘｖｉｉ）配列番号：９３のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：９４のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｘｖｉｉｉ）配列番号：９５のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：９６のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｘｉｘ）配列番号：９７のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：９８のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｘｘ）配列番号：９９のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：１００のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｘｘｉ）配列番号：１０１のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：１０２のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｘｘｉｉ）配列番号：１０３のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：１０４のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｘｘｉｉｉ）配列番号：１０５のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：１０６のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｘｘｉｖ）配列番号：１０７のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：１０８のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｘｘｖ）配列番号：１０９のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：１１０のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｘｘｖｉ）配列番号：１１１のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：１１２のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｘｘｖｉｉ）配列番号：１１３のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：１１４のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｘｘｖｉｉｉ）配列番号：１１５のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：１１６のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｘｘｉｘ）配列番号：１１７のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：１１８のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｌ）配列番号：１１９のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：１２０のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｌｉ）配列番号：１２１のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：１２２のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｌｉｉ）配列番号：１２３のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：１２４のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｌｉｉｉ）配列番号：１２５のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：１２６のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｌｉｖ）配列番号：１２７のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：１２８のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｌｖ）配列番号：１２９のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：１３０のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｌｖｉ）配列番号：１３１のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：１３２のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｌｖｉｉ）配列番号：１３３のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：１３４のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｌｖｉｉｉ）配列番号：１３５のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：１３６のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｘｌｉｘ）配列番号：１３７のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：１３８のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｌ）配列番号：１３９のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：１４０のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｌｉ）配列番号：１４１のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：１４２のアミノ酸配列を含む重鎖又は（ｌｉｉ）配列番号：１４３のアミノ酸配列を含む軽鎖及び配列番号：１４４のアミノ酸配列を含む重鎖
を含む、結合分子関する。
第４の項は、２つのｓｃＦｖを含むか又はそれからなり、ここで、各ｓｃＦｖがＴｒｋＢに特異的に結合する、ＴｒｋＢ結合分子に関する。
さらに、第４の項に関して、ＴｒｋＢ結合分子は、Ｉｇ分子をさらに含む。
さらに、第４の項に関して、Ｉｇ分子は、モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラ抗体、抗体のフラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’もしくはＦ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体、例えば、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、小モデュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、ドメイン抗体、ナノボディ又はダイアボディである。
さらに、第４の項に関して、各ｓｃＦｖは、Ｉｇ分子の重鎖のＣ末端に融合している。さらに、第４の項に関して、Ｉｇ分子は、ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ）又はＦ（ａｂ’）２である。さらに、第４の項に関して、Ｉｇ分子は、Ｆｃ領域を含むか又はそれからなる。さらに、第４の項に関して、ＴｒｋＢ結合分子は、二重特異性かつ四価である。
第５の項は、（ｉ）配列番号：２１３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：２１４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン又は（ｉｉ）配列番号：２１５のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び配列番号：２１６のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメインを含む、ＴｒｋＢに特異的に結合するｓｃＦｖに関する。
さらに、第５の項に関して、ｓｃＦｖは、配列番号：２２２のアミノ酸配列又は配列番号：２２３のアミノ酸配列又は配列番号：２２４のアミノ酸配列又は配列番号：２２５のアミノ酸配列を含む。
第６の項は、
（ｉ）配列番号：１８９のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン及び
配列番号：１９１のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン又は
配列番号：１９２のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン又は
配列番号：１９４のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン；
（ｉｉ）配列番号：１９０のアミノ酸配列を含む重鎖可変ドメイン及び
配列番号：１９２のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン又は
配列番号：１９３のアミノ酸配列を含む軽鎖可変ドメイン
を含む、ＶＥＧＦに特異的に結合する抗体分子に関する。
さらに、第６の項に関して、抗体分子は、配列番号：１９５又は１９９のアミノ酸配列を含む軽鎖と、配列番号：１９６、１９７、１９８又は２００のアミノ酸配列を含む重鎖とを含む。
第７の項は、前述の項のいずれか１つの結合分子の（ｉ）重鎖もしくは重鎖可変ドメイン及び／又は（ｉｉ）軽鎖もしくは軽鎖可変ドメインをコードする、単離された核酸分子に関する。
第８の項は、前述の項のいずれか１つのＴｒｋＢ結合分子の（ｉ）重鎖もしくは重鎖可変ドメイン及び／又は（ｉｉ）軽鎖もしくは軽鎖可変ドメインをコードする、単離された核酸分子に関する。
第９の項は、前述の項のいずれか１つのｓｃＦｖの（ｉ）重鎖可変ドメイン及び／又は（ｉｉ）軽鎖可変ドメインをコードする、単離された核酸分子に関する。
第１０の項は、前述の項のいずれか１つの抗体分子の（ｉ）重鎖もしくは重鎖可変ドメイン及び／又は（ｉｉ）軽鎖もしくは軽鎖可変ドメインをコードする、単離された核酸分子に関する。
第１１の項は、第７、第８、第９又は第１０の項の単離された核酸分子を含む、ウイルスベクターに関する。
第１２の項は、第１１の項の核酸分子を含む、発現ベクターに関する。
第１３の項は、第１２の項の発現ベクターでトランスフェクションされた、宿主細胞に関する。
第１４の項は、
（ａ）以下の分子の発現を可能にする条件下で、第１３の態様の宿主細胞を培養することと、
（ｂ）該分子を回収することと、場合により、
（ｃ）該分子をさらに精製しかつ／又は修飾しかつ／又は製剤化することとを含む、
前述の項のいずれかの結合分子、ＴｒｋＢ結合分子、ｓｃＦｖ又は抗体分子を製造する方法に関する。
第１５の項は、医薬に使用するための、前述の項のいずれかの結合分子、ＴｒｋＢ結合分子、ｓｃＦｖ又は抗体分子に関する。
第１５の項に関して、該使用が眼もしくは網膜の疾患又は神経変性疾患の処置である、第１５の項の使用のための、結合分子、ＴｒｋＢ結合分子、ｓｃＦｖ又は抗体分子。
さらに、第１５の項に関して、該使用が神経／神経眼又は網膜の疾患の処置のためのものである、第１５の項の使用のための、結合分子、ＴｒｋＢ結合分子、ｓｃＦｖ又は抗体分子に関する。
さらに、第１５の項に関して、該使用が黄斑変性症、加齢黄斑変性症、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜色素変性症、遺伝性網膜ジストロフィー、遺伝性黄斑ジストロフィー、近視性変性症、地図状萎縮症、網膜動脈閉塞症、眼内炎、ブドウ膜炎、嚢胞様黄斑浮腫、任意の網膜疾患に続発する脈絡膜新生血管膜、視神経症、緑内障、網膜剥離、中毒性網膜症、放射線網膜症並びに外傷性網膜症、前駆型及び軽度から中等度のアルツハイマー病、アルツハイマー病を有する患者の疾患進行の遅延、ハンチントン病、パーキンソン病、大うつ病性障害、統合失調症、統合失調症に関連する認知障害、減弱精神病症候群を有する個体における初発精神病の予防、統合失調症を有する患者における再発の予防、処置抵抗性うつ病、過食症、肥満又はメタボリックシンドロームの処置のためのものである、第１５の項の使用のための、結合分子、ＴｒｋＢ結合分子、ｓｃＦｖ又は抗体分子。
さらに、第１５の項に関して、該使用が黄斑変性症、特に、滲出性加齢黄斑変性症（ｗＡＭＤ）の処置のためのものである、第１５の項の使用のための、結合分子、ＴｒｋＢ結合分子、ｓｃＦｖ又は抗体分子。さらに、第１５の項に関して、該使用が網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）の処置のためのものである、第１５の項の使用のための、結合分子、ＴｒｋＢ結合分子、ｓｃＦｖ又は抗体分子。さらに、第１５の項に関して、該使用が地図状萎縮の治療及び／又は予防のためのものである、第１５の項の使用のための、結合分子、ＴｒｋＢ結合分子、ｓｃＦｖ又は抗体分子。
第１６の項は、薬学的に許容し得る担体と、前述の項のいずれかの結合分子、ＴｒｋＢ結合分子、ｓｃＦｖ又は抗体分子とを含む、医薬組成物に関する。第１７の項は、眼もしくは網膜の疾患又は神経変性疾患を治療し又は予防する方法であって、治療上有効量の、前述の項のいずれかの結合分子、ＴｒｋＢ結合分子、ｓｃＦｖ又は抗体分子を、それを必要とする患者に投与することを含む、方法に関する。第１８の項は、眼もしくは網膜の疾患又は神経変性疾患を治療し又は予防するための医薬組成物を製造するための、前述の項のいずれかの結合分子、ＴｒｋＢ結合分子、ｓｃＦｖ又は抗体分子の使用に関する。
ここから、本発明を、下記非限定的な実施例により説明する。
実施例
方法
Ｔｒｋレセプターを発現するＣＨＯ細胞の培養
ヒトＴｒｋＢレセプターを発現するＣＨＯ細胞（ThermoFisher Scientific, #K1491）及びヒトＴｒｋＡ又はＴｒｋＣレセプターを発現するカスタマイズされたＣＨＯ細胞を、１０％ ウシ胎児血清、glutamax、非必須アミノ酸、２０mM ＨＥＰＥＳ、５μg/mL ブラストサイジン及び２００μg/mL ゼオシンを補充したＤＭＥＭ（Lonza, #BE12-604F）中で培養した。カニクイザル、ウサギ又はラットＴｒｋＢレセプターを発現するカスタマイズされたＣＨＯ細胞を、Hams F12（Lonza #BE12-615F）と、５％ ウシ胎仔血清、８mM グルタミン、０．５mg/mL Ｇ４１８を含むＤＭＥＭ（Lonza #BE12-604F）との１：１混合物中で培養した。マウスＴｒｋＢレセプターを発現するカスタマイズされたＣＨＯ細胞を、１０％ ウシ胎仔血清、glutamax、１０mM ＨＥＰＥＳ及び０．８mg/mL Ｇ４１８を補充したＤＭＥＭ（Lonza #BE12-604F）で培養した。
ヒト、カニクイザル、ウサギ、ラット又はマウスＴｒｋレセプターを発現するＣＨＯ細胞におけるＴｒｋＡ／Ｂ／Ｃ及びＥＲＫ１／２リン酸化の分析
各Ｔｒｋレセプターを発現する５０００個のＣＨＯ細胞を、３８４ウェル透明組織培養プレート（BD Falcon, #353963）の各キャビティに播種し、３７℃及び５％ ＣＯ２での加湿インキュベーター中でインキュベーションした。播種の２４時間後、細胞の上清を室温飢餓培地（０．１％ ＢＳＡ（Sigma, #A-3059）を含むが、他に補充しないＤＭＥＭ）で置き換えた。１５分後、上昇する濃度のヒトＢＤＮＦ（R&D #248-BD又はBachem #H-5594）、ヒトＮＧＦ（Biovision #4303R-20）、ヒトＮＴ－３（Sigma #N1905）、アゴニスト性抗体又はアイソタイプ対照を含む飢餓培地を室温において４５分間トリプリケートで加えて、ＴｒｋＢ及びＥＲＫ１／２リン酸化を刺激した。飢餓培地単独を対照とした。
一部の実験では、ＢＤＮＦ又はアゴニスト性抗体を細胞の刺激の前に、２、１０、５０又は２００ng/mL ヒトＶＥＧＦ（R&D Systems #293-VE-050）の有無で、１時間プレインキュベーションした。これらの実験では、ヒトＶＥＧＦ単独とのインキュベーションを対照とした。
アゴニスト性ＴｒｋＢ抗体が、ＴｒｋＢのＢＤＮＦ誘発リン酸化及び／又は下流ＥＲＫ１／２リン酸化を制限するか否かを分析するために、ヒトＴｒｋＢレセプターを発現するＣＨＯ細胞をＢＤＮＦなし又は一定濃度の０．３nM、１nMもしくは３nM ＢＤＮＦで、上昇する濃度の抗体と共にインキュベーションした。
刺激後、細胞上清を除去し、細胞を、完全ミニプロテアーゼ阻害剤錠剤（Roche #04693124001）並びにホスファターゼ阻害剤カクテル２（Sigma #P5726）及び３（Sigma #P0044）並びに１mM ＰＭＳＦ（Sigma #93482）を補充した溶解バッファー（１×Triton溶解バッファー（Cell Signaling Technology #9803-S）中において、ウェットアイス上で２０分間溶解させた。得られたライセートを製造業者の説明書に従って、市販のアッセイ（Perkin Elmer #ALSU-PTRKAB-A10K）を使用する、Ｙ６８０／６８１でのＴｒｋＡリン酸化、Ｙ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化又はＹ７０９／７１０でのＴｒｋＣリン酸化の定量に使用した。Ｔ２０２／Ｙ２０４（ＥＲＫ１）及びＴ１８５／Ｙ１８７（ＥＲＫ２）でのＥＲＫ１／２リン酸化の定量を製造業者の説明書に従って、別の市販のアッセイ（Perkin Elmer #TGRES10K又はALSU-PERK-A10K）を使用して同様に行った。リン酸化事象を反映するアクセプタービーズの発光をPerkin Elmer EnVision（登録商標）マイクロプレートリーダーにおいて、５７０nmで記録した。生データ（平均±ＳＥＭ）及び非線形回帰（ｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ））を含むデータをGraphPad Prism（バージョン８）による提示のために作成した。
ＴｒｋＢ細胞外ドメイン（ＴｒｋＢ－ＥＣＤ）の機能的特徴
ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を上昇する濃度のＴｒｋＢ－ＥＣＤ（R&D Systems #1494-TB）を伴う、上昇する濃度の天然のリガンドであるＢＤＮＦ又は１０nM ＢＤＮＦと共にインキュベーションした。ＴｒｋＢ活性化を、上記概説されたＹ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化を測定することにより評価した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
ＴｒｋＢレセプターの内部移行アッセイ
刺激の２４時間前に、２５０００個のヒトＴｒｋＢレセプターを発現するＣＨＯ細胞を、９６ウェル黒色透明底部組織培養プレート（PerkinElmer, #6055300）の各キャビティに播種し、３７℃及び５％ ＣＯ２の加湿インキュベーター中でインキュベーションした。ＣＨＯ／ｈＴｒｋＢ細胞の上清を飢餓培地（０．１％ ＢＳＡ（Sigma, #A-3059）及び２０mM Ｈｅｐｅｓ（Lonza, # BE17-737F）を含むＤＭＥＭ）で置き換え、細胞を３７℃で３０分間インキュベーションした。ついで、細胞を、上昇する濃度のＢＤＮＦ（R&D #248-BD又はBachem #H-5594）又はアゴニスト性ＴｒｋＢ抗体単独又は１nM ＢＤＮＦと飢餓培地中の上昇する濃度のアゴニスト性抗体との組み合わせで、３７℃において５０分間刺激した。細胞を４％ パラホルムアルデヒド中で２０分間固定し、洗浄し、ＰＢＳ中の５％ 正常ロバ血清中において１時間ブロッキングし、１μg/mL ヤギ抗ＴｒｋＢ抗体（R&D Systems, #AF-397）と共に、室温で一晩インキュベーションし、続けて、徹底的に洗浄し、２μg/mL AlexaFluor（登録商標） 647ロバ抗ヤギ抗体（ThermoFisher Scientific, #A21447）及び１μg/mL Hoechst #H3570中において、室温で２時間インキュベーションした。徹底的な洗浄後、細胞をＰＢＳ／０．０５％ Tween-20中の２μg/mL HCS-Cellmask（登録商標） green stain（ThermoFisher Scientific, #H32714）で１時間染色した。細胞表面レセプターを、２０×水対物レンズを備えたPerkinElmer Opera Phenix High Content Screening Systemで撮像し、PerkinElmer Harmony（登録商標） High-Content Imaging and Analysisソフトウェアで分析した。データを、蛍光閾値を上回る細胞の割合の高低をそれぞれ表わすヒートマップの暗視野及び明視野を有するヒートマップとして又は閾値を上回る表面ＴｒｋＢ染色強度を有する細胞の割合を表わす図としてのいずれかで提示する。後者の場合、生データ（平均±ＳＥＭ）及び非線形回帰（ｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ））を含むデータをGraphPad Prism（バージョン８）による提示のために作成した。
ＶＥＧＦ誘発ＶＥＧＦレセプター２リン酸化及び下流シグナル伝達の阻害
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ；Cell Systems #ACBRI181）を、サプリメント（Promocell #C-39210）及び１０U/mL ペニシリン／ストレプトマイシンそれぞれを含む内皮細胞基礎培地（Promocell #C-22210）中においてゼラチン（Millipore #ES-006B）被覆プレート上で培養した。ＶＥＧＦ捕捉の分析のために、１２０００個の細胞を、通常の増殖培地を使用して、９６ウェル透明組織培養プレートの各キャビティに播種し、３７℃及び５％ ＣＯ２での加湿インキュベーター中でインキュベーションした。２４時間後、培地を飢餓培地（０．１％ ＢＳＡ（Sigma, #A-3059）及び１０U/mL ペニシリン／ストレプトマイシンを補充したPromocell #C-22210）で置き換え、細胞を３７℃及び５％ ＣＯ２での加湿インキュベーター中で２０時間飢餓状態にした。ＶＥＧＦＲ２シグナル伝達の刺激前に、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦ（R&D Systems #293-VE-050）を、アンタゴニスト性抗体又はEYLEA（登録商標）（aflibercept）の有無で、室温において飢餓培地中で３０～６０分間プレインキュベーションし、ついで、３７℃に１５分間予め温めた。細胞刺激を、予め形成されたＶＥＧＦ－抗体／EYLEA（登録商標）（aflibercept）複合体又はＶＥＧＦ単独を細胞に加えることにより、３７℃に温めたプレート上において５分間で達成した。飢餓培地単独を対照とした。細胞を溶解バッファー（Perkin Elmer #ALSU-PVGFR-A500）中において、室温で１０分間溶解し、ついで、氷上でさらに１０分間インキュベーションした。製造業者の説明書に従い、市販のアッセイを使用して、Ｙ１１７５でのＶＥＧＦＲ２リン酸化（Perkin Elmer #ALSU-A500又は#ALSU-PVGFR-A10K）、Ｙ９５１でのＶＥＧＦＲ２リン酸化（Perkin Elmer #ALSU-PVGFR-B500）、Ｔ２０２／Ｙ２０４（ＥＲＫ１）及びＴ１８５／Ｙ１８７（ＥＲＫ２）でのＥＲＫ１／２リン酸化（Perkin Elmer #TGRES10K又はALSU-PERK-A10K）、Ｙ４１９でのＳｒｃリン酸化（Perkin Elmer #ALSU-PSRC-A10K）、Ｔｈｒ１８０／Ｔｙｒ１８２でのｐ３８－ＭＡＰＫリン酸化（Perkin Elmer #ALSU-PP38-B500）を定量した。上記言及されたリン酸化事象を反映するアクセプタービーズの発光をPerking Elmer EnVisionマイクロプレートリーダーにおいて、５７０nmで記録し、生データ（平均±ＳＥＭ）及び非線形回帰（ｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ））を含むデータをGraphPad Prism（バージョン８）による提示のために作成した。
二重特異性かつ四価のDoppelmabによるＶＥＧＦ捕捉に対するＴｒｋＢ結合の影響を調べるために、ＶＥＧＦ誘発ＶＥＧＦＲ２リン酸化の阻害をＴｒｋＢ－ＥＣＤの非存在下又は存在下で、飢餓状態のＨＲＭＥＣにおいて評価した。刺激前に、上昇する濃度の各Doppelmabを１００nM ＴｒｋＢ－ＥＣＤ（R&D Systems #1494-TB）と共に、飢餓培地中において、室温で１時間インキュベーションし、続けて、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にさらに１時間インキュベーションした。対照として、ＨＲＭＥＣを（ｉ）飢餓培地単独、（ｉｉ）５０ng/mL ヒトＶＥＧＦ、（ｉｉｉ）５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと上昇する濃度のＴｒｋＢ－ＥＣＤとの予め形成された複合体（室温で１時間）、（ｉｖ）５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと上昇する濃度の各Doppelmabとの予め形成された複合体（室温で１時間）及び（ｖ）上昇する濃度のＴｒｋＢ－ＥＣＤ単独と共にインキュベーションした。ＶＥＧＦ－Ａの捕捉を上記概説されたように、Ｙ１１７５でのＶＥＧＦレセプター２（ＶＥＧＦＲ２）リン酸化を測定することにより評価した。
ＶＥＧＦ誘発ＨＲＭＥＣ増殖の阻害
３０００個のＨＲＭＥＣを、サプリメント（Promocell #C-39210）及び１０U/mL ペニシリン／ストレプトマイシンを含む内皮細胞基礎培地（Promocell #C-22210）を使用して、透明平底９６ウェルプレートの各キャビティに播種し、３７℃及び５％ ＣＯ２の加湿インキュベーター中でインキュベーションした。１６時間後、増殖培地を飢餓培地（２％ ウシ胎児血清を補充した内皮細胞基礎培地（Promocell #C-22210））で置き換え、細胞を３７℃、５％ ＣＯ２での加湿インキュベーター中において、８時間飢餓状態にした。刺激前に、ヒトＶＥＧＦ（R&D Systems #293-VE-050）を、アンタゴニスト性抗体又はEYLEA（登録商標）（aflibercept）の有無で、室温において飢餓培地中で６０分間プレインキュベーションした。細胞刺激を、予め形成されたＶＥＧＦ－抗体／EYLEA（登録商標）（aflibercept）複合体又はＶＥＧＦ単独を細胞に加えることにより行った。飢餓培地単独を対照とした（ベース増殖）。細胞増殖を総ＨＲＭＥＣ核面積の自動位相コントラスト画像ベース定量化により評価した（Essen Bioscience, IncuCyte S3）。総ＨＲＭＥＣ核面積は、ＨＲＭＥＣ数に比例すると考えられた。ウェル当たりに４つの画像を４時間毎に、１０×対物レンズを使用して、合計９６時間記録した。データは、時間の関数としての相対細胞数（時点ｔでの細胞数／ｔ＝０での細胞数）を表わし、ｔ＝０での細胞数を１に設定した。一部の実験では、各増殖曲線とベース成長曲線（飢餓培地中での増殖）との間の面積を、各化合物濃度の１０を底とする対数に対してプロットした。必要に応じて、生データ（平均±ＳＥＭ）及び非線形回帰（ｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ））を含むデータをGraphPad Prism（バージョン８）による提示のために作成した。
ＶＥＧＦ誘発ＨＲＭＥＣ発芽の阻害
ＶＥＧＦ誘発発芽の阻害を、ＨＲＭＥＣに基づくスフェロイドアッセイにおいて評価した。ＨＲＭＥＣを、２０％ Methocoel（商標）modified cellulose media（内皮基礎培地中の１．２％ メチルセルロース及び１０％ ウシ胎児血清）を含有する通常の増殖培地に再懸濁させ、５００個のＨＲＭＥＣを含有する滴 ２５μlを正方形ペトリ皿に適用した。プレートを上下逆さまにして、細胞を吊り下げた滴中で培養した。これにより、スフェロイドの自発的な形成が可能となった。２４時間後、スフェロイドを収集し、４８ウェルプレートにおいて、Methocoel（商標） modified cellulose media－コラーゲン混合物（Ｍ１９９培地中の３mg/mL ラットテールコラーゲンＩ（Corning #354236）と混合した、８０％ Methocoel及び２０％ ＦＣＳ １：１）に包埋し、３７℃及び５％ ＣＯ２での加湿インキュベーター中で３０分間インキュベーションして、コラーゲン重合を達成した。刺激前に、ヒトＶＥＧＦ（R&D Systems #293-VE-050）を、２％ ウシ胎児血清を補充した基礎内皮増殖培地中において、アンタゴニスト性抗体又はEYLEA（登録商標）（aflibercept）の有無で、室温において６０分間プレインキュベーションした。発芽の刺激を、予め形成されたＶＥＧＦ－抗体／EYLEA（登録商標）（aflibercept）複合体又はＶＥＧＦ単独をスフェロイドに２４時間加えることにより行った。２％ ウシ胎児血清を補充し、ＶＥＧＦを含まない基礎内皮増殖培地を対照とした。４％ パラホルムアルデヒド中に固定した後、細胞を徹底的に洗浄し、０．２％ Triton X-100を含有するＰＢＳ中の２μg/mL HCS-Cellmask（商標） green stain（ThermoFisher Scientific, #H32714）で一晩染色した。スフェロイドをZEISS LSM 780共焦点顕微鏡で分析した。ＨＲＭＥＣの三次元発芽をＺスタックの最大投影画像から、手作業で定量化し、スフェロイド当たりの累積発芽長（mm）として表わすか又はZeiss ZEN撮像ソフトウェアで半自動化し、スフェロイド外周長（ピクセル）として表わすかのいずれかをした。データをGraphPad Prism（バージョン８）による提示のために作成し、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
網膜電図
一般的な手法
網膜電図（ＥＲＧ）は、種々の網膜ニューロンの光誘発電気的活動を評価するための非侵襲的電気生理学的技術であり、これにより、網膜機能の種々の態様、例えば、薄暗い光又は色覚を定量することが可能となる。ＥＲＧは、Espion E3 ＥＲＧ記録システム（Diagnosys LLC）を使用して、角膜と参照電極との間の電位変化として測定した。ＥＲＧ記録前に、動物を少なくとも２時間暗順応させ、ケタミン（Ketanest（登録商標）、約１００mg/kg）及びキシラジン（Rompun、約７mg/kg）のｉ．ｐ．注射により麻酔した。動物を、体温を３７℃で一定に保つため、加熱したステージに置いた。瞳孔を局所トロピカミド及び１０％ フェニレフリンで拡張させた。角膜に２％ Methocel（商標）溶液（OmniVision）の滴を角膜に載せて、記録中に角膜眼が乾燥しないようにした。記録を、金ループ電極を使用して、両眼で同時に行った。参照電極をMethocel（商標）mediaで湿らせ、動物の頬に取り付けた、歯のないワニ口クリップとした。電気的接地のために、クリップを動物の尾部に取り付けた。ＥＲＧシグナルを１kHzでサンプリングし、０．１５Hzの低周波数及び５００Hzの高周波カットオフを使用して記録した。光刺激は、発光ダイオードのセット又はキセノン電球（１cd・s/m2以上のフラッシュの場合）により発せられる全視野フラッシュ（持続時間約４ms）からなった。全てのフラッシュを暗所又はバックグラウンド光のいずれかにおいて、Ganzfeld刺激装置（ColorDome; Diagnosys）により発生させた。
ＥＲＧプロトコール
まず、ＥＲＧ応答を暗順応動物（桿体駆動応答を単離するため）から記録し、続けて、赤色バックグラウンド光（５０cd/m2、紫外線錐体駆動ＥＲＧ応答を単離するため）に順応させた動物から記録し、最後に、緑色－青色バックグラウンド光（２５．５cd/m2、Ｍ錐体駆動ＥＲＧ応答を単離するため）に順応させた。
暗順応ＥＲＧの場合、応答を１・１０－５～１００cd・s/m2の範囲の一連の閃光により誘発した。１・１０－５及び３・１０－５cd・s/m2の輝度を有するフラッシュについて、２０回の試行の応答を平均した。０．０５cd・s/m2までの１・１０－４間のフラッシュについて、１０回の試行の応答を平均し、０．１cd・s/m2のフラッシュについて、８回の試行の応答を平均し、１cd・s/m2のフラッシュについて、５回の試行を平均した。１０cd・s/m2の最後のフラッシュについて、３回の試行の反応を記録し、１００cd・s/m2の最後のフラッシュについて、１回のフラッシュを記録した。
個々のフラッシュ間の間隔を網膜が各フラッシュから完全に回復する（フラッシュにより誘発される応答振幅の低下又は暗示時間の短縮の兆候はない）ことを確実にするように選択した。これらの基準に基づいて、フラッシュ間の間隔を１・１０－５及び３・１０－５cd・s/m2のフラッシュについて２秒、０．０５cd・s/m2までの１・１０－４間のフラッシュについて５秒、０．１cd・s/m2のフラッシュについて１０秒及び１cd・s/m2のフラッシュについて２０秒とした。１０cd・s/m2及び１００cd・s/m2の１回のフラッシュ後、それぞれ３０秒及び１２０秒の回復期間を取った。
ＵＶ錐体駆動及びＭ錐体駆動応答の記録のために、まず、動物を赤色バックグラウンド光に、その後、緑色バックグラウンド光に２分間光適応させた。光応答を０．０２、０．０４、０．０８、０．１７、０．３５、０．８３、１．６６、２．９０及び４．１５μW/m2それぞれのＵＶフラッシュ及び０．１～最大１１０cd・s/m2のフラッシュのＭ錐体フラッシュにより誘発した。１０回の試行の全ての応答を、３秒のフラッシュ間隔で平均した。
動物及びＳＴＺ処置
オスのBrown Norwayラット（ＢＮラット）をCharles River（Germany）から入手した。高血糖をＳＴＺのｉ．ｐ．注射（６５mg/kg 体重）により誘発した。試験には、応答しない動物又は応答が不十分な動物、すなわち、ＳＴＺ適用後７日目の血糖濃度が２０mM未満の動物を含めなかった。体重及び血糖値を定期的にモニターした。ＳＴＺを硝子体内投与の約３週間前に投与した。
用量及び硝子体内注射
ｉｖｔ注射のために、ラットを２．５～３％ イソフルラン（Forene; Abbvie）で麻酔した。局所麻酔のために、４mg/mL オキシブプロカイン塩酸塩（Novesine（登録商標）; Omnivision）の滴を投与した。５μLを、（１０μlのHamiltonガラスシリンジに取り付けた）３４ゲージ針により、各眼の角膜縁のすぐ後ろの硝子体内に注射した。
データ分析
ＥＲＧを、Espion E3 ＥＲＧ記録システム（Diagnosys LLC）を使用して、角膜と参照電極との間の電位変化として測定した。
MATLAB（商標）ソフトウェアを使用して計算する前に、種々のセットの各ＥＲＧフラッシュが一貫していることを証明した。その後、各フラッシュから平均曲線を計算した。
ＥＲＧ ａ／ｂ波振幅を決定するために、ＥＲＧデータを処理し、MATLAB（商標）ソフトウェア（バージョンＲ２０１４ａ；MathWorks）を使用して分析した。この場合、データを個々のマクロでソートし、Matlabルーチン用のファイルを作成した。
ｂ波振幅をａ波応答の底部からｂ波ピークのピークまで計算した。ｂ波暗示時間をｂ波のピークに達するのに必要なフラッシュ刺激後の時間として測定した。
刺激強度の関数としてのｂ波の振幅を、最小二乗フィッティング法（GraphPad Prism、バージョン６．０１及びそれ以降のバージョンのGraphPad Prism）を使用することによりフィットさせた。ａ波振幅をベースライン（ゼロライン）から負のａ波応答まで計算した。
統計分析を一元配置分散分析により行った。
実施例１
ヒトＶＥＧＦ及びヒトＴｒｋＢを認識する結合分子の全体的な設計
図１
本発明者らは、ＶＥＧＦ及びＴｒｋＢに結合し、それぞれＶＥＧＦアンタゴニスト及びＴｒｋＢアゴニストとして作用する、結合分子を開発した。使用された分子設計は、重鎖のＣ末端に結合された異なる特異性のｓｃＦｖを有する、１つのターゲット抗原に対する特異性を有するＩｇＧ抗体（「マスター抗体」と呼ばれる）を有する。図１に、設計模式図を示す。好ましくは、結合分子は、二重特異性かつ四価である。
二重特異性分子は、ｓｃＦｖの可変重（ＶＨ）ドメインと可変軽（ＶＬ）ドメインとの間に柔軟なペプチド配列を含有し、ｓｃＦｖドメインは、更なる一連のリンカーを介して、マスターＩｇＧ抗体に連結される。一構成では、ｓｃＦｖは、ＶＬドメインがｓｃＦｖの「Ｎ末端」を形成し、このため、マスター抗体の重鎖のＣ末端に融合し、一方、ＶＨがｓｃＦｖのＣ末端、実際には、重鎖ポリペプチド全体を形成するように配向される。ただし、この「Ｎ－ＶＬ－ＶＨ－Ｃ」構造を逆にすることができる、すなわち、「Ｎ－ＶＨ－ＶＬ－Ｃ」とすることができると理解することができる。
この概念の実現可能性を試験するために、図１に示されたフォーマットに基づく数多くの異なる二重特異性分子を調製し、シリーズ１から出発してシリーズ４までの数サイクルの分子設計にわたってさらに最適化した。
下記実施例では、ＶＥＧＦ及びＴｒｋＢに結合する種々のシリーズの二重特異性分子及びこのフォーマットの変形形態を生成するのに使用される方法並びにこれらの分子の生体活性を説明する。
実施例２
ＶＥＧＦ及びＴｒｋＢを認識する結合ドメインの調製
図１
理解することができるように、ヒトＶＥＧＦ及びＴｒｋＢに結合する二重特異性分子を調製するために、それらの個々のターゲット抗原に結合する可変ドメインを得る必要がある。
この目的で、免疫グロブリン（Ｉｇ）ＶＨ及びＶＬ遺伝子を種々のＶＥＧＦ及びＴｒｋＢバインダーから取得し、本発明の二重特異性分子にフォーマットした。全体として、３種類のＶＥＧＦ結合ドメインをＢ２０、Ｇ６及びRanibizumabと呼ばれる個々のＶＥＧＦバインダーから得た。ＴｒｋＢへの結合のために、結合ドメインをＣ２と呼ばれる個々のＴｒｋＢバインダーから得た（ＷＯ第２０１００８６８２８号）。
本発明の二重特異性分子への個々のバインダーのフォーマット化を当業者に公知の日常的な方法により行う。簡潔に、ｓｃＦｖをコードする遺伝子セグメントを構築するために、可変ドメインをコードするＶＬ遺伝子とＶＨ遺伝子とのペアを、ペプチド配列ＧＧＳＥＧＫＳＳＧＳＧＳＥＳＫＳＴＧＧＳ（配列番号：２２１）のフレキシブルリンカーをコードする遺伝子セグメントにより連結させた。次に、得られたｓｃＦｖをコードする遺伝子セグメントを、ヒトＩｇＧ抗体の重鎖をコードする遺伝子の３’末端にインフレームでクローニングした。これらのコードセグメントをオーバーラップＰＣＲ法により合成し、発現ベクターｐＴＴ５内にクローニングした。
ついで、Ｆａｂ（２）部分をコードするＶＬ遺伝子とＶＨ遺伝子とのペアを実施例１に概説された二重特異性フォーマットにフォーマットした。ＶＨ遺伝子を、ヒトＩｇγをコードする遺伝子の５’末端でインフレーム融合物として、ｐＴＴ５発現ベクター内にクローニングした。ｓｃＦｖバインダーをコードする遺伝子を、同じＩｇγをコードするセグメントの３’末端にインフレームでクローニングした。同様に、ＶＬ遺伝子を、ヒトＩｇＧカッパ軽鎖をコードする遺伝子とのインフレーム融合物としてｐＴＴ５発現ベクター内にクローニングした。
In-Fusion（登録商標）ＨＤクローニングキット（Clonetech, U.S.A.）をＶＨ遺伝子及びＶＬ遺伝子の方向性クローニングのために、上記手法において使用した。線状化ベクターの末端に相補的な１５ｂｐの伸長を有するＶＬ／ＶＨ用のＰＣＲプライマーを合成した。ＰＣＲを、製造業者の標準プロトコールを使用して行い、アンプリコンを精製するか又はクローニングエンハンサーで処理し、ついで、適切なベクター内にクローニングした。ついで、E. coliを製造業者の説明書（Clonetech, U.S.A.）に従ってトランスフォーメーションした。ＤＮＡミニプレップを配列決定した。
各発現ベクターは、鎖をコードする遺伝子のための真核生物プロモーターエレメント、シグナル配列及び重鎖又は軽鎖をコードする遺伝子、原核生物選択マーカー遺伝子、例えば、アンピシリンのための発現カセット並びに複製起点を含有する。これらのＤＮＡプラスミドをアンピシリン耐性E. coliコロニー中で増殖させ、精製した。
発現ベクターをＣＨＯ－Ｅ細胞にトランスフェクションした。無血清培地における懸濁液中で増殖するトランスフェクションされたＣＨＯ－Ｅ細胞を１４０rpmでの撹拌下での振とうフラスコ中において、３７℃及び５％ ＣＯ２で培養し、指数増殖の条件で維持した。トランスフェクションの日に、細胞を１mg 軽鎖プラスミド及び０．５mg 重鎖プラスミドで化学的にトランスフェクションした。ついで、それらをGibco（登録商標）FreeStyle（商標）ＣＨＯ発現培地（LifeTechnologies, NY, US） １Ｌ中において、１～２×１０６個/mlで播種した。ついで、細胞をオービタル振とう下で、１０～１２日間インキュベーションし、市販の供給溶液 １５０mlを１回供給して、タンパク質を発現させた。細胞培養上清中の結合分子力価を、Octet（登録商標）機器（Pall ForteBio, CA, US）及びprotAバイオセンサーチップを使用し、製造業者の説明書に従って決定した。
リコンビナント結合分子を、MabSelect（商標）SuRe（商標）（Cytiva）を使用するプロテインＡ親和性クロマトグラフィー、続けて、サイズ排除クロマトグラフィー（Superdex（登録商標） 200 coulmn, Cytiva）又はカチオン交換クロマトグラフィー（POROS（商標）50 HS, ThermoFisher）のいずれかにより、培養上清から精製し、６０mM ＮａＯＡｃバッファー、１００mM ＮａＣｌ（ｐＨ５．０）中で保存した。サンプルの純度及び不均質性の程度を質量分光法及び分析用サイズ排除クロマトグラフィーにより評価した。全てのサンプルは、機能試験前に、≧９０％のモノマー含量を有し、＜１０％の不純物を含有することが確認された。
この結果、以下の表３に示されるように、異なるシリーズ１～シリーズ４による二重特異性で四価の結合分子が生成され、以下、Doppelmab（ＤＭａｂ）とも呼ばれる（Vekataramani et al., Biochemical and Biophysical Research ComMunications, Volume 504, Issue 1, 26 September 2018, Pages 19-24も参照のこと）。
Figure 2023546229000041
Figure 2023546229000042
簡潔に、下記設計活動を行った。
シリーズ１
シリーズ１において、二重特異性結合分子中にＴｒｋＢ結合部分として抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）を有する結合分子を生成した。ＶＥＧＦ結合部分をｓｃＦｖ（２）としてフォーマットし、種々のＶＥＧＦバインダー、例えば、Ｂ２０、Ｇ６又はRanibizumabを評価した。さらに、種々のＶＬ－ＶＨ又はＶＨ－ＶＬ配向を試験し、複数のリンカー、例えば、２０Ｌ３、２０Ｌ１、１５Ｌ１、１０Ｌ１、６ＧＳを結合分子の設計に使用した。
シリーズ２
シリーズ２において、二重特異性結合分子中にＶＥＧＦ結合部分として抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）を有する結合分子を生成し、再度、種々のＶＥＧＦバインダーを評価した。今回、ＴｒｋＢ結合部分をｓｃＦｖ（２）としてフォーマットし、種々のＶＬ－ＶＨ又はＶＨ－ＶＬ配向を試験した。
シリーズ３
シリーズ３において、結合分子を二重特異性結合分子中の抗原結合フラグメント（Ｆａｂ）及びＶＥＧＦ結合部分としてのRanibizumabに基づいて生成した。再度、ＴｒｋＢ結合部分をｓｃＦｖ（２）としてかつＣ２ ＴｒｋＢバインダーに基づいてフォーマットした。ＶＬ－ＶＨ又はＶＨ－ＶＬ配向における並べ替え及び種々のリンカーを試験した。
シリーズ４
最後のシリーズ４において、種々の突然変異、例えば、ＶＨＥ１Ｑ、ＶＨＥ６Ｑ及び／又はＶＬＤ７０ＧをRanibizumabの結合部分に導入し、ＣＣ架橋の安定化効果をＴｒｋＢ結合ｓｃＦｖ部分において分析した。
ここから、これらの設計活動の結果並びに特性及び生体活性に対するそれらの影響を下記実施例においてより詳細に記載する。
実施例３
Ｃ２、ＢＤＮＦ並びに第１シリーズの４種類のDoppelmab ＴＰＰ－１１７３５、７３６、７３７及び７３８によるヒトＴｒｋＢ活性化の比較
図２Ａ～図２Ｂ
ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を、上昇する濃度の天然のＴｒｋＢリガンドであるＢＤＮＦ、Ｃ２抗体、ＩｇＧ１アイソタイプ対照又は４つのDoppelmab ＴＰＰ－１１７３５、ＴＰＰ－１１７３６、ＴＰＰ－１１７３７、ＴＰＰ－１１７３８と共にインキュベーションした。ＴｒｋＢ活性化を、（Ａ）Ｙ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化又はＴｒｋＢの下流である（Ｂ）Ｔ２０２／Ｙ２０４（ＥＲＫ１）及びＴ１８５／Ｙ１８７（ＥＲＫ２）それぞれでのＥＲＫ１／２リン酸化を測定することにより評価した。最低化合物濃度を溶媒単独とする。
結果
ＤＭａｂによるＴｒｋＢ活性化は、親Ｃ２分子と実質的に同一であった。また、ＤＭａｂは、親Ｃ２分子と同じ性質も示し、ＢＤＮＦの約４０～５０％でＴｒｋＢ活性化の有効性を有する部分的ＴｒｋＢアゴニスト（ｐＴｒｋＢ）として作用した。しかし、ＤＭａｂは、配列又は配向／レイアウトを変化させることなく、親Ｃ２抗体の（Ｆａｂ）２部分全体を組み込んだが、これは、非常に有望な結果であった。この特異的なフォーマットへのフォーマット化が、ＴｒｋＢバインダーのＴｒｋＢ及びＴｒｋＢ下流シグナル伝達を活性化する能力に負の影響を及ぼさないことを示したためである。予想どおり、アイソタイプ対照はＴｒｋＢを活性化しなかった。
実施例４
Ｃ２、ＢＤＮＦ及び第１シリーズのDoppelmab ＴＰＰ－１１７３５／７３６によるカニクイザル／ウサギ／ラット／マウスＴｒｋＢ活性化の比較
図３Ａ～図３Ｄ
（Ａ）カニクイザルＴｒｋＢ、（Ｂ）ウサギＴｒｋＢ、（Ｃ）ラットＴｒｋＢ又は（Ｄ）マウスＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を上昇する濃度の天然のＴｒｋＢリガンドであるＢＤＮＦ、Ｃ２抗体又はDoppelmab ＴＰＰ－１１７３５もしくはＴＰＰ－１１７３６と共にインキュベーションした。ＴｒｋＢ活性化をＹ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化を測定することにより評価した。最低化合物濃度を溶媒単独とする。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
再度、ＤＭａｂによるＴｒｋＢ活性化は、親Ｃ２分子と実質的に同一であり、活性化は、ヒトＴｒｋＢレセプターの活性化と同等であった。このアッセイにおいても、ＤＭａｂは、親Ｃ２分子と同じ特性を示し、ＢＤＮＦの約４０～５０％でＴｒｋＢ活性化の有効性を有する部分的ＴｒｋＢアゴニスト（ｐＴｒｋＢ）として作用した。
実施例５
ＴＰＰ－１１７３５／７３６／７３７／７３８媒介性ＴｒｋＢ活性化の選択性
図４Ａ～図４Ｃ
（Ａ）ヒトＴｒｋＡ、（Ｂ）ヒトＴｒｋＢ又は（Ｃ）ヒトＴｒｋＣを安定に発現するＣＨＯ細胞を上昇する濃度のＣ２抗体又は４つのDoppelmab ＴＰＰ－１１７３５、ＴＰＰ－１１７３６、ＴＰＰ－１１７３７、ＴＰＰ－１１７３８と共にインキュベーションした。Ｔｒｋレセプターの活性化を、Ｙ７０６／７０７でのレセプターリン酸化を測定することにより評価した。上昇する濃度のＴｒｋＡ（ＮＧＦ）、ＴｒｋＢ（ＢＤＮＦ）及びＴｒｋＣ（ＮＴ－３）についての天然のリガンドとのインキュベーションを対照として使用した。最低化合物濃度を溶媒単独とする。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
試験されたDoppelmabはいずれも、ＴｒｋＡ又はＴｒｋＣを活性化しなかった。全てのDoppelmabは、ＴｒｋＢに対して非常に特異的／選択的であった。
実施例６
ヒトＴｒｋＢレセプターのＣ２、ＴＰＰ－１１７３６及び／又はＢＤＮＦ誘発内部移行の比較
図５Ａ～図５Ｂ
（Ａ）ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を上昇する濃度の天然のＴｒｋＢリガンドであるＢＤＮＦ又は上昇する濃度のＣ２抗体もしくはDoppelmab ＴＰＰ－１１７３６を伴う１nM ＢＤＮＦと共にインキュベーションした。（Ｂ）ＴｒｋＢ内部移行を、細胞の透過化を伴わない表面ＴｒｋＢレセプターの免疫蛍光染色、続けて、共焦点顕微鏡分析により評価した。ヒートマップの暗視野及び明視野はそれぞれ、蛍光閾値を上回る細胞の割合の高低を表わす。
結果
ＢＤＮＦは、ＴｒｋＢレセプター内部移行を誘発した（レーン１＋２；ヒートマップフィールドは、上から下に暗くなっている）。
抗体Ｃ２及びＴＰＰ－１１７３６は、ＴｒｋＢレセプターのＢＤＮＦ誘発内部移行を低下させた（レーン３～５及び６～８；ヒートマップフィールドは、下から上に暗くなっていることが留意される）。
実施例７
ヒトＶＥＧＦの存在下又は非存在下でのＣ２及びＴＰＰ－１１７３６（第１のシリーズ）によるヒトＴｒｋＢ活性化の比較
図６
ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を２００ng/mL ヒトＶＥＧＦ－Ａ（ｈＶＥＧＦ）とのプレインキュベーションの有無で、上昇する濃度のＣ２ツール抗体又はDoppelmab ＴＰＰ－１１７３６と共にインキュベーションした。ＴｒｋＢ活性化を、ＴｒｋＢの下流であるＴ２０２／Ｙ２０４（ＥＲＫ１）及びＴ１８５／Ｙ１８７（ＥＲＫ２）でのＥＲＫ１／２リン酸化を測定することにより評価した。抗体を伴わない、上昇する濃度のヒトＶＥＧＦ－Ａとのインキュベーションを対照とした。最低化合物濃度を溶媒単独とした。データは、平均を表わす。明確にするために、エラーバーを省略する。
結果
ヒトＶＥＧＦ単独とのインキュベーションにより、ＥＲＫ１／２リン酸化は変化しなかった。
また、ヒトＶＥＧＦとのプレインキュベーションにより、Ｃ２又はＴＰＰ－１１７３６によるＥＲＫ１／２リン酸化の効力も有効性も実質的に変化しなかった。
実施例８
ＳＴＺ誘発糖尿病ラットにおけるＤＭａｂ １１７３６及びＣ２の神経保護の有効性
図７
アゴニスト性ＴｒｋＢツール抗体（Ｃ２）及びDoppelmab ＴＰＰ－１１７３６のＩＶＴ注射を使用した糖尿病誘発網膜神経変性のラットモデルにおけるＴｒｋＢ活性化の神経保護機能。動物をＳＴＺで処置して、高血糖を誘発した。網膜機能を処置の前後に、網膜電図（ＥＲＧ）により評価した。糖尿病誘発により、ＳＴＺ処置後３週間以内に暗示時間の遅延がもたらされた。この時点で、動物に、アイソタイプ対照抗体（抗ＴＮＰ）もしくはＣ２（それぞれ１９μg/５μL）又は等モル量のＴＰＰ－１１７３６（２５μg/５μL）を硝子体内投与した。処置の２週間後、ＥＲＧ記録を繰り返し、分析した。抗体の硝子体内適用の直前及び同適用後２週間での桿体駆動Ｂ波暗示置換遅延を図７に示す。平均＋／－ＳＥＭ；ｎ．ｓ．ｐ＞０．０５、有意差なし；＊＊ｐ＜０．０１；＊＊＊ｐ＜０．００１；テューキーの多重比較検定を使用した一元配置分散分析。
結果
投与の２週間後、抗ＴＮＰ抗体処置では、抗ＴＮＰ処置前の時点と比較して、糖尿病誘発桿体駆動ｂ波暗示時間は短縮しなかった（ｔ＝２週間で１５．４ms対ｔ＝０で１３．３ms；ｐ＞０．０５、有意差なし）。
投与の２週間後、ＴＰＰ－１１７３６及びＣ２処置動物は、抗体処置前の時点と比較して、糖尿病誘発桿体駆動ｂ波暗示時間遅延の有意な短縮を示した（Ｃ２：ｔ＝２週間で８．６２ms対ｔ＝０で１４．４ms；＊＊＊ｐ＜０．０１；ＴＰＰ－１１７３６ ｔ＝２週間で１０．３ms対ｔ＝０で１６．１ms；＊＊ｐ＜０．０１）。
ＴｒｋＢ活性化のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおける初期の測定と一致して、Ｃ２及びＴＰＰ－１１７３６は、ｉｎ ｖｉｖｏにおいて同様の神経保護効果を示した。
実施例９
EYLEA（登録商標）（aflibercept）並びに第１シリーズの４つのDoppelmab ＴＰＰ－１１７３５、７３６、７３７及び７３８によるヒトＶＥＧＦ－Ａ捕捉の比較－ＶＥＧＦ誘発ＶＥＧＦＲ２リン酸化の阻害
図８Ａ～図８Ｂ
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度の示された結合分子又はEYLEA（登録商標）（aflibercept）とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。
ＶＥＧＦ－Ａ捕捉を、Ｙ１１７５でのＶＥＧＦレセプター２（ＶＥＧＦＲ２）リン酸化を測定することにより評価した。（Ａ）Doppelmab ＴＰＰ－１１７３５、－７３６、－７３７及び－７３８の比較。（Ｂ）ＴＰＰ－１１７３６及びＴＰＰ－１１７３８とEYLEA（登録商標）（aflibercept）との比較。非刺激細胞（ベース）及び抗体処理を伴わない５０ng/ml ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
ＴＰＰ－１１７３７対ＴＰＰ－１１７３８：これらの分子は両方とも、ｓｃＦｖとしてＧ６抗ＶＥＧＦ分子を有した。７３７は、ＶＨ－ＶＬ配向で連結されており、一方、７３８は、ＶＬ－ＶＨ配向を有する。ＶＬ－ＶＨ配向は、Ｇ６抗ＶＥＧＦ抗体に基づいて、はるかに良好に作用したことが判明した。
ＴＰＰ－１１７３５対ＴＰＰ－１１７３６：これらの分子は両方とも、ｓｃＦｖとしてＢ２０抗ＶＥＧＦ分子を有した。このアッセイにおけるＢ２０ ＶＥＧＦ抗体について、２つの配向の間に性能差はほとんど無かった。
ＴＰＰ－１１７３６対ＴＰＰ－１１７３８：これらの分子は、ｓｃＦｖとしてＢ２０（ＶＬ－ＶＨ）又はＧ６（ＶＬ－ＶＨ）抗ＶＥＧＦ分子のいずれかを有した。両結合分子は、同様の効力（ＩＣ５０ 約４nM）を示したが、ＴＰＰ－１１７３６はより有効であった。
EYLEA（登録商標）（aflibercept）（ＩＣ５０＝０．７nM）は、ＴＰＰ－１１７３６又はＴＰＰ－１１７３８（約４nM）のいずれかと比較して、より強力である。
実施例１０
EYLEA（登録商標）（aflibercept）並びに第１のシリーズの４つのDoppelmab ＴＰＰ－１１７３５、７３６、７３７及び７３８によるヒトＶＥＧＦ－Ａの捕捉の比較－ＶＥＧＦ誘発ＥＲＫ１／２リン酸化の阻害
図９Ａ～図９Ｂ
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度の示された抗体又はEYLEA（登録商標）（aflibercept）とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。
ＶＥＧＦ－Ａの捕捉を、Ｔ２０２／Ｙ２０４（ＥＲＫ１）及びＴ１８５／Ｙ１８７（ＥＲＫ２）でのＥＲＫ１／２リン酸化を測定することにより評価したＴｒｋＢ活性化により評価した。（Ａ）Doppelmab ＴＰＰ－１１７３５、－７３６、－７３７及び－７３８の比較。（Ｂ）ＴＰＰ－１１７３６、－７３８とEYLEA（登録商標）（aflibercept）との比較。非刺激細胞（ベース）及び抗体処理を伴わない５０ng/ml ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
ＴＰＰ－１１７３７対ＴＰＰ－１１７３８：これらの分子は両方とも、ｓｃＦｖとしてＧ６抗ＶＥＧＦ分子を有した。７３７は、ＶＨ－ＶＬ配向で連結されており、一方、７３８は、ＶＬ－ＶＨ配向を有する。ＶＬ－ＶＨ配向は、Ｇ６抗ＶＥＧＦ抗体に基づいて、はるかに良好に作用したことが判明した。
ＴＰＰ－１１７３５対ＴＰＰ－１１７３６：これらの分子は両方とも、ｓｃＦｖとしてＢ２０抗ＶＥＧＦ分子を有した。このアッセイにおけるＢ２０ ＶＥＧＦ抗体について、２つの配向の間に性能差はほとんど無かった。
ＴＰＰ－１１７３６対ＴＰＰ－１１７３８：これらの分子は、ｓｃＦｖとしてＢ２０（ＶＬ－ＶＨ）又はＧ６（ＶＬ－ＶＨ）抗ＶＥＧＦ分子のいずれかを有した。両結合分子は、同様の効力（ＩＣ５０ 約４nM）を示したが、ＴＰＰ－１１７３６はより有効であった。
EYLEA（登録商標）（aflibercept）（ＩＣ５０＝２nM）は、ＴＰＰ－１１７３６又はＴＰＰ－１１７３８（約１０nM）のいずれかと比較して、より強力である。
実施例１１
EYLEA（登録商標）（aflibercept）及び第１のシリーズの４つのDoppelmab ＴＰＰ－１１７３６によるヒトＶＥＧＦ－Ａの捕捉の比較－ＶＥＧＦ誘発ｐ３８ ＭＡＰＫリン酸化の阻害
図１０
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度のＴＰＰ－１１７３６又はEYLEA（登録商標）（aflibercept）とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。ＶＥＧＦ－Ａの捕捉を、Ｔ１８０／Ｙ１８２でのｐ３８ ＭＡＰＫリン酸化を測定することにより評価した。非刺激細胞（ベース）及び抗体処理を伴わない５０ng/ml ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
EYLEA（登録商標）（aflibercept）（ＩＣ５０＝約０．７４nM）は、ＴＰＰ－１１７３６（約７．４nM）より約１０倍強力であった
実施例１２
第１のシリーズの４つのDoppelmab ＴＰＰ－１１７３５、７３６、７３７及び７３８並びにEYLEA（登録商標）（aflibercept）によるヒトＶＥＧＦ－Ａの捕捉の比較－ＶＥＧＦ誘発性ＨＲＭＥＣ増殖の阻害
図１１Ａ～図１１Ｅ
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度の示された結合分子又はEYLEA（登録商標）（aflibercept）とのプレインキュベーションの有無で、１０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。分子濃度をmol/Lで示す。ＶＥＧＦ－Ａの捕捉を、ＨＲＭＥＣ細胞数の自動化された画像ベースの定量化により評価した（IncuCyte）。画像を合計９６時間にわたって４時間毎に記録した。相対細胞数を示す。ｔ＝０での細胞数を１に設定した。非刺激細胞を対照（ベース）とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
ＴＰＰ－１１７３７対ＴＰＰ－１１７３８：これらの分子は両方とも、ｓｃＦｖとしてＧ６抗ＶＥＧＦ分子を有した。ＴＰＰ－１１７３７は、ＶＨ－ＶＬ配向で連結されており、一方、ＴＰＰ－１１７３８は、ＶＬ－ＶＨ配向を有する。明らかに、ＶＬ－ＶＨ配向は、Ｇ６の場合に非常に良好に機能した。ＴＰＰ－１１７３７の効果は実質的に無かった。
ＴＰＰ－１１７３５（ＶＨ－ＶＬ）対ＴＰＰ－１１７３６（ＶＬ－ＶＨ）：これらの分子は両方とも、ｓｃＦｖとしてＢ２０抗ＶＥＧＦ分子を有する。再度、ＶＬ－ＶＨ配向は、より良好に機能した。
７３６対７３８：Ｂ２０（ＶＬ－ＶＨ）対Ｇ６（ＶＬ－ＶＨ）：このアッセイにおいて、ＴＰＰ－１１７３６（Ｂ２０）は明らかにより有効であった。
最後に、EYLEA（登録商標）（aflibercept）は、ＴＰＰ－１１７３６より有効であった。
シリーズ１－ＴＰＰ－１１７３５、ＴＰＰ－１１７３６、ＴＰＰ－１１７３７、ＴＰＰ－１１７３８の知見の概要
ＴｒｋＢ活性化
ＤＭａｂによるＴｒｋＢ活性化は、親Ｃ２分子と実質的に同一であった。これは、予想されなかったことである。Ｃ２ ＴｒｋＢバインダーの（Ｆａｂ）２部全体が、配列又は配向／レイアウトを変化させることなく、ＤＭａｂに組み込まれたためである。また、全てのDoppelmab（及びＣ２）は、部分的ＴｒｋＢアゴニストに過ぎなかった。
ＶＥＧＦ捕捉
明らかに、ＶＬ－ＶＨ配向は、ＶＥＧＦバインダーとしてＧ６及びＢ２０に対してより良好に作用し、Ｂ２０（ＶＬ－ＶＨ）は、Ｇ６（ＶＬ－ＶＨ）より有効であった。また、両方のDoppelmab（Ｂ２０及びＧ６）は、ｉｎ ｖｉｔｒｏにおいてEYLEA（登録商標）（aflibercept）より劣っていた。
これらの最初の知見に基づいて、本発明者らは、下記実施例において、Doppelmab（ＴＰＰ－１６０６１～ＴＰＰ－１６０６４）のＶＥＧＦ捕捉を改善するために、ＶＬ－ＶＨ配向におけるＢ２０の種々のリンカーを生成し、試験することを開始した。
実施例１３
Ｃ２、ＢＤＮＦ並びに第１のシリーズの４つのDoppelmab ＴＰＰ－１６０６１、１６０６２、１６０６３及び１６０６４によるヒトＴｒｋＢ活性化の比較；ＴｒｋＢリン酸化
図１２
ヒトＴｒｋＢを安定に発現するヒトＣＨＯ細胞を、上昇する濃度の天然のＴｒｋＢリガンドであるＢＤＮＦ、Ｃ２抗体、ＴＰＰ－１１７３６（Ｂ２０、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、ＶＬ－ＶＨ）又は種々のリンカーを有する４つのDoppelmab ＴＰＰ－１６０６１（Ｂ２０、ｓｃＦｖ、２０Ｌ１、ＶＬ－ＶＨ）、ＴＰＰ－１６０６２（Ｂ２０、ｓｃＦｖ、１５Ｌ１、ＶＬ－ＶＨ）、ＴＰＰ－１６０６３（Ｂ２０、ｓｃＦｖ、１０Ｌ１、ＶＬ－ＶＨ）、ＴＰＰ－１６０６４（Ｂ２０、ｓｃＦｖ、６ＧＳ、ＶＬ－ＶＨ）と共にインキュベーションした。ＴｒｋＢ活性化をＹ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化を測定することにより評価した。最低化合物濃度を溶媒単独とした。データは、平均を表わす。明確にするために、エラーバーを省略した。
結果
ＤＭａｂ ＴＰＰ－１６０６１～１６０６４によるＴｒｋＢ活性化は、親Ｃ２分子及びＴＰＰ－１１７３６と実質的に同一であった。ＴｒｋＢ活性化は、タンパク質のＦｃとｓｃＦｖ（抗ＶＥＧＦ）部分との間のリンカーの差異とはほぼ無関係なようであった。これは、予想されたことであった。リンカーが、タンパク質のＦｃとｓｃＦｖ（抗ＶＥＧＦ）部との間のＴｒｋＢ（Ｆａｂ）２フラグメントから離れて位置していたためである。それにもかかわらず、結合分子の活性に影響を及ぼすことなく、種々のリンカーを利用することができるという良好な確証であった。最後に、全ての提示された結合分子は、部分的ＴｒｋＢアゴニスト活性のみを示した。
実施例１４
ＢＤＮＦ、ＴＰＰ－１１７３６並びに第１のシリーズの２つのDoppelmab ＴＰＰ－１６０６１及び１６０６２によるヒトＴｒｋＢ活性化の比較；ＥＲＫ１／２リン酸化
図１３
ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を上昇する濃度の天然のＴｒｋＢリガンドであるＢＤＮＦ、ＴＰＰ－１１７３６（Ｂ２０、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、ＶＬ－ＶＨ）又は種々のリンカーを有する２つのDoppelmab ＴＰＰ－１６０６１（Ｂ２０、ｓｃＦｖ、２０Ｌ１、ＶＬ－ＶＨ）及びＴＰＰ－１６０６２（Ｂ２０、ｓｃＦｖ、１５Ｌ１、ＶＬ－ＶＨ）と共にインキュベーションした。ＴｒｋＢ活性化を、Ｔ２０２／Ｙ２０４（ＥＲＫ１）及びＴ１８５／Ｙ１８７（ＥＲＫ２）でのＥＲＫ１／２リン酸化を測定することにより評価した。最低化合物濃度を溶媒単独とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
ＤＭａｂ ＴＰＰ－１６０６１及び１６０６２によるＴｒｋＢ活性化は、ＴＰＰ－１１７３６と実質的に同一であった。また、ここで、ＴｒｋＢ活性化は、リンカーの差異とはほぼ無関係なようであり、提示された結合分子は、部分的ＴｒｋＢアゴニスト活性のみを示した。
実施例１５
第１のシリーズの４つのDoppelmab ＴＰＰ－１６０６１、０６２、０６３及び０６４とＴＰＰ－１１７３６とによるヒトＶＥＧＦ－Ａ捕捉の比較－（Ａ）ＶＥＧＦ誘発ＶＥＧＦＲ２リン酸化の阻害、（Ｂ）ＥＲＫ１／２リン酸化
図１４Ａ～図１４Ｂ
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度の示された抗体；ＴＰＰ－１１７３６（Ｂ２０、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、ＶＬ－ＶＨ）又は種々のリンカーを有する４つのDoppelmab ＴＰＰ－１６０６１（Ｂ２０、ｓｃＦｖ、２０Ｌ１、ＶＬ－ＶＨ）、ＴＰＰ－１６０６２（Ｂ２０、ｓｃＦｖ、１５Ｌ１、ＶＬ－ＶＨ）、ＴＰＰ－１６０６３（Ｂ２０、ｓｃＦｖ、１０Ｌ１、ＶＬ－ＶＨ）、ＴＰＰ－１６０６４（Ｂ２０、ｓｃＦｖ、６ＧＳ、ＶＬ－ＶＨ）とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。ＶＥＧＦ－Ａの捕捉を、（Ａ）Ｙ１１７５でのＶＥＧＦレセプター２（ＶＥＧＦＲ２）リン酸化又は（Ｂ）Ｔ２０２／Ｙ２０４（ＥＲＫ１）及びＴ１８５／Ｙ１８７（ＥＲＫ２）それぞれでのＥＲＫ１／２リン酸化を測定することにより評価した。非刺激細胞（ベース）及び抗体処理を伴わない５０ng/ml ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
リンカーの差異は、ＶＥＧＦ捕捉の効力又は有効性に実質的に影響を及ぼさなかった。これは、リンカーがＶＥＧＦ結合部位に近接して位置していたことを考えると、やや予想外であったが、種々のリンカーを結合分子の活性に影響を及ぼすことなく、利用することができることをさらに確認された。
実施例１６
第１のシリーズの４つのDoppelmab ＴＰＰ－１６０６１、０６２、０６３及び０６４によるヒトＶＥＧＦ－Ａの捕捉の比較－ＶＥＧＦ誘発ＨＲＭＥＣ増殖の阻害
図１５
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、０．５nM Doppelmab又は１nM EYLEA（登録商標）（aflibercept）とのプレインキュベーションの有無で、１０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。ＶＥＧＦ－Ａの捕捉を、ＨＲＭＥＣ細胞数の自動化された画像ベースの定量化により評価した（IncuCyte）。画像を合計９６時間にわたって４時間毎に記録した。相対細胞数を示す。ｔ＝０での細胞数を１に設定した。非刺激細胞を対照（ベース）とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
実施例１５に示されたリン酸化アッセイと同様に、リンカーの差異は、親分子であるＴＰＰ－１１７３６と比較して、より良好に（又はより悪く）は機能しなかった。EYLEA（登録商標）（aflibercept）を１nMで使用した。EYLEA（登録商標）（aflibercept）は一価の分子であると考えられ、一方、Doppelmabは二価であるためである。これらの条件下で、EYLEA（登録商標）（aflibercept）は、ＨＲＭＥＣのＶＥＧＦ誘発増殖の阻害においてより良好に機能した。
実施例１７
EYLEA（登録商標）（aflibercept）、ＴＰＰ－１１７３６並びに第１のシリーズの４つのDoppelmab ＴＰＰ－１６０６１、０６２、０６３及び０６４によるヒトＶＥＧＦ－Ａの捕捉の比較－ＶＥＧＦ誘発ＨＲＭＥＣ発芽の阻害
図１６
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）のスフェロイドをコラーゲンマトリックス中に包埋した。内皮の発芽を２．５nM 示されたDoppelmab又は５nM EYLEA（登録商標）（aflibercept）との２４時間のプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦとのインキュベーションにより２４時間誘発した。内皮の発芽を共焦点顕微鏡により評価し、Ｚスタックの最大投影から得られたスフェロイド外周を示した。非刺激細胞を対照（ベース）とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。ｎ．ｓ． ｐ＞０．０５ 有意差なし対５０ng/mL ｈＶＥＧＦ＋２．５nM ＴＰＰ－１１７３６。
結果
実施例１５に示されたリン酸化アッセイと同様に、リンカーの差異は、親分子であるＴＰＰ－１１７３６と比較して、より良好に（又はより悪く）は機能しなかった。EYLEA（登録商標）（aflibercept）を１nMで使用した。EYLEA（登録商標）（aflibercept）は一価の分子であると考えられ、一方、Doppelmabは二価であるためである。これらの条件下で、EYLEA（登録商標）（aflibercept）は、ＨＲＭＥＣのＶＥＧＦ誘発増殖の阻害においてより良好に機能した。
シリーズ１－ＴＰＰ－１６０６１、ＴＰＰ－１６０６２、ＴＰＰ－１６０６３、ＴＰＰ－１６０６４の知見の概要
ＴｒｋＢ活性化：親分子であるＴＰＰ－１１７３６と比較して差異／改善は観察されなかった。
ＶＥＧＦ捕捉：親分子であるＴＰＰ－１１７３６と比較して差異／改善が無かった。
これらの知見に基づいて、本発明者らは、ＴＰＰ－１１７３６（ｓｃＦｖとしてのＢ２０）のＶＥＧＦ捕捉をＴＰＰ－１３７８８（Ｂ２０ ＩｇＧ）と比較して、ＦａｂとしてのＢ２０の再フォーマット化がＶＥＧＦ捕捉を改善するであろうかどうかを試験することを開始した。
実施例１８
ＴＰＰ－１１７３６及びＴＰＰ－１３７８８（Ｂ２０ ＩｇＧ）によるヒトＶＥＧＦ－Ａの捕捉の比較－ＶＥＧＦＲ２、ＥＲＫ１／２及びｐ３８ ＭＡＰＫのＶＥＧＦ誘発リン酸化の阻害
図１７Ａ～図１７Ｃ
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度のDoppelmab ＴＰＰ－１１７３６（ｓｃＦｖとしてＢ２０抗ＶＥＧＦ）又はＴＰＰ－１３７８８（Ｂ２０ ＩｇＧ）とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。ＶＥＧＦ－Ａの捕捉を、（Ａ）Ｙ１１７５でのＶＥＧＦレセプター２（ＶＥＧＦＲ２）リン酸化、（Ｂ）Ｔ２０２／Ｙ２０４（ＥＲＫ１）及びＴ１８５／Ｙ１８７（ＥＲＫ２）でのＥＲＫ１／２リン酸化又は（Ｃ）Ｔ１８０／Ｙ１８２でのｐ３８ ＭＡＰＫリン酸化を測定することにより評価した。分子処理を伴わない５０ng/ml ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。以下の表４に、対応するベストフィットＩＣ５０（非線形回帰；ｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ））を報告する。
Figure 2023546229000043
結果
試験されたＢ２０ ＩｇＧであるＴＰＰ－１３７８８は、ＴＰＰ－１１７３６に対して約３倍向上したＶＥＧＦ－Ａ捕捉能を示す。
実施例１９
ＴＰＰ－１１７３６及びＴＰＰ－１３７８８（Ｂ２０ ＩｇＧ）によるヒトＶＥＧＦ－Ａの捕捉の比較－ＶＥＧＦ誘発ＨＲＭＥＣ発芽の阻害
図１８
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）のスフェロイドをコラーゲンマトリックスに包埋した。内皮の発芽を２．５nM Doppelmab ＴＰＰ－１１７３６又は２．５nM ＴＰＰ－１３７８８（Ｂ２０ ＩｇＧ）とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦとのインキュベーションにより２４時間誘発した。内皮の発芽を共焦点顕微鏡により評価し、Ｚスタックの最大投影から得られたスフェロイド外周を示した。非刺激細胞を対照（ベース）とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。ｎ．ｓ． ｐ＞０．０５ 有意差なし対５０ng/mL ｈＶＥＧＦ＋２．５nM ＴＰＰ－１１７３６。
結果
ＶＥＧＦＲ２、ＥＲＫ１／２及びｐ３８ ＭＡＰＫリン酸化アッセイにおけるＶＥＧＦ捕捉の改善にもかかわらず、ＶＥＧＦ誘発発芽のＴＰＰ－１３７８８（Ｂ２０ ＩｇＧ）媒介性阻害は、ＴＰＰ－１１７３６の阻害より良好ではなかった。
実施例２０
ＢＤＮＦ、ＴＰＰ－１１７３６並びに第１のシリーズの２つのDoppelmab ＴＰＰ－１４９３６及びＴＰＰ－１４９３７によるヒトＴｒｋＢ活性化の比較；ＴｒｋＢ及びＥＲＫ１／２のリン酸化
図１９Ａ～図１９Ｃ
ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を、上昇する濃度の天然のＴｒｋＢリガンドであるＢＤＮＦ、ＴＰＰ－１１７３６（Ｂ２０、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、ＶＬ－ＶＨ）又は２つのDoppelmab ＴＰＰ－１３９３６（Ranibizumab、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、ＶＨ－ＶＬ）又はＴＰＰ－１４９３７（Ranibizumab、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、ＶＬ－ＶＨ）と共にインキュベーションした。ＴｒｋＢ活性化を、（Ａ）Ｙ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化、（Ｂ及びＣ）Ｔ２０２／Ｙ２０４（ＥＲＫ１）及びＴ１８５／Ｙ１８７（ＥＲＫ２）それぞれでのＥＲＫ１／２リン酸化を測定することにより評価した。最低化合物濃度を溶媒単独とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
ＤＭａｂ ＴＰＰ－１４９３６及びＴＰＰ－１４９３７によるＴｒｋＢ活性化は、ＴＰＰ－１１７３６と実質的に同一であった。これは、予想されたことであった。結合分子のＴｒｋＢ結合成分が、常に、ＦａｂフラグメントとしてのＣ２であったためである。
実施例２１
ＢＤＮＦ、ＴＰＰ－１１７３６及びDoppelmab ＴＰＰ－１４９３６によるカニクイザルとラットのＴｒｋＢ活性化の比較；ＴｒｋＢリン酸化
図２０Ａ～図２０Ｂ
（Ａ）カニクイザルＴｒｋＢ又は（Ｂ）ラットＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を、上昇する濃度の天然のＴｒｋＢリガンドであるＢＤＮＦ、ＴＰＰ－１１７３６（Ｂ２０、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、ＶＬ－ＶＨ）又はＴＰＰ－１４９３６（Ranibizumab、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、ＶＨ－ＶＬ）と共にインキュベーションした。ＴｒｋＢ活性化を、Ｙ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化を測定することにより評価した。最低化合物濃度を溶媒単独とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
ＤＭａｂ ＴＰＰ－１４９３６によるＴｒｋＢ活性化は、ＴＰＰ－１１７３６と実質的に同一であった。再度、これは、予想されたことであった。２つの分子のＴｒｋＢ結合成分が、両方の場合において、ＦａｂフラグメントとしてのＣ２であるためである。
実施例２２
ＴＰＰ－１１７３６、ＴＰＰ－１４９３６又はＴＰＰ－１４９３７によるヒトＶＥＧＦ－Ａ捕捉の比較－ＶＥＧＦＲ２、ＥＲＫ１／２及びＳｒｃのＶＥＧＦ誘発リン酸化の阻害
図２１Ａ～図２１Ｃ
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度のDoppelmab ＴＰＰ－１１７３６（Ｂ２０、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、ＶＬ－ＶＨ）、ＴＰＰ－１４９３６（Ranibizumab、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、ＶＨ－ＶＬ）又はＴＰＰ－１４９３７（Ranibizumab、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、ＶＬ－ＶＨ）とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。ＶＥＧＦ－Ａ捕捉を、（Ａ）Ｙ１１７５でのＶＥＧＦレセプター２（ＶＥＧＦＲ２）リン酸化、（Ｂ）Ｔ２０２／Ｙ２０４及びＴ１８５／Ｙ１８７でのＥＲＫ１／２リン酸化又は（Ｃ）Ｙ４１９でのＳｒｃリン酸化を測定することにより評価した。抗体処理を伴わない５０ng/ml ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。以下の表５に、対応するベストフィットＩＣ５０値及び絶対有効性値（底部のプラトー）をそれぞれ報告する（非線形回帰；ｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ））。
Figure 2023546229000044
結果
ＶＥＧＦ捕捉の効力（ＩＣ５０）は、ＴＰＰ－１１７３６とＴＰＰ－１４９３６／ＴＰＰ－１４９３７との間で同様である。
ＴＰＰ－１４９３６によるＶＥＧＦ捕捉の効力（ＩＣ５０）は、ＴＰＰ－１４９３７より幾らか良好である→Ranibizumab ｓｃＦｖのＶＬ－ＶＨ配向よりＶＨ－ＶＬがより良好である。
ＴＰＰ－１４９３６及びＴＰＰ－１４９３７によるＶＥＧＦ捕捉は、ＴＰＰ－１１７３６より有効であった（底値はより小さかった）。
実施例２３
ＴＰＰ－１１７３６及びDoppelmab ＴＰＰ－１４９３６及びＴＰＰ－１４９３７によるヒトＶＥＧＦ－Ａ捕捉の比較－ＶＥＧＦ誘発ＨＲＭＥＣ発芽の阻害
図２２
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）のスフェロイドをコラーゲンマトリックス中に包埋した。内皮の発芽を２．５nM Doppelmab ＴＰＰ－１１７３６（Ｂ２０、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、ＶＬ－ＶＨ）、ＴＰＰ－１４９３６（Ranibizumab、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、ＶＨ－ＶＬ）又はＴＰＰ－１４９３７（Ranibizumab、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、ＶＬ－ＶＨ）とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦとのインキュベーションにより２４時間誘発した。内皮の発芽を共焦点顕微鏡により評価し、Ｚスタックの最大投影から得られたスフェロイド外周を示した。非刺激細胞を対照（ベース）とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。ｎ．ｓ． ｐ＞０．０５ 有意差なし、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。
結果
ＴＰＰ－１４９３６及びＴＰＰ－１４９３７によるＶＥＧＦ捕捉は、ＶＥＧＦＲ２／ＥＲＫ１＿２／Ｓｒｃリン酸化アッセイにおいて同様であったが、ＶＥＧＦ誘発発芽の阻害には、劇的な差があった。ＴＰＰ－１１７３６とＴＰＰ－１４９３７との間に有意差はなかったが、ＴＰＰ－１４９３６によるＶＥＧＦ誘発ＨＲＭＥＣ発芽の阻害は、ＴＰＰ－１４９３７又はＴＰＰ－１１７３６よりはるかに有効であった。
この予想外の知見から、抗ＶＥＧＦ ｓｃＦｖのＶＨ－ＶＬ配向が、このアッセイにおける性能に重要であることが示された。ＶＨ－ＶＬは、ＶＬ－ＶＨよりはるかに良好である。興味深いことに、ＶＬ－ＶＨ配向は、ＴＰＰ－１１７３５対７３６（Ｂ２０）の場合、また、ＴＰＰ－１１７３７対７３８（Ｇ６）の場合にも、ＶＨ－ＶＬより良好であった。
実施例２４
Doppelmab ＴＰＰ－１１７３６、ＴＰＰ－１４９３６及びＴＰＰ－１４９３７並びにEYLEA（登録商標）（aflibercept）によるヒトＶＥＧＦ－Ａ捕捉の比較－ＶＥＧＦ誘発ＨＲＭＥＣ増殖の阻害
図２３Ａ～図２３Ｄ
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度の示された結合分子又はEYLEA（登録商標）（aflibercept）とのプレインキュベーションの有無で、１０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。結合分子／EYLEA（登録商標）（aflibercept）濃度をmol/Lで示す。ＶＥＧＦ－Ａの捕捉を、ＨＲＭＥＣ細胞数の自動化された画像ベースの定量化により評価した（IncuCyte）。画像を合計８４時間にわたって４時間毎に記録した。相対細胞数を示す。ｔ＝０での細胞数を１に設定した。非刺激細胞を対照（ベース）とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
ＴＰＰ－１４９３６及びＴＰＰ－１４９３７は、ＴＰＰ－１１７３６と比較して、より良好な効力、特に、ＶＥＧＦ誘発ＨＲＭＥＣ増殖の阻害の有効性を示した。ＴＰＰ－１４９３６は、ＴＰＰ－１４９３７より強力であった。
非常に驚くべきことに、ＴＰＰ－１４９３６及びＴＰＰ－１４９３７は、EYLEA（登録商標）（aflibercept）より有効であった。両Doppelmabは、ベースライン以下でも増殖を減少させた。EYLEA（登録商標）（aflibercept）とは対照的に、それらは、ＶＥＧＦ誘発増殖の完全な阻害を示した。ただし、EYLEA（登録商標）（aflibercept）は、ＴＰＰ－１４９３６及び１４９３７よりさらに強力であった。
シリーズ１－ＴＰＰ－１４９３６／１４９３７の知見の概要
ＴｒｋＢ活性化：ＴＰＰ－１１７３６と比較して、差異／改善は観察されなかった。両方の結合分子が、ＦａｂフラグメントとしてＣ２バインダーを有していたため、この種のことは、予想されたことであった。
ＶＥＧＦ捕捉
リン酸化アッセイ：ＶＥＧＦ捕捉の効力（ＩＣ５０）は、ＴＰＰ－１１７３６とＴＰＰ－１４９３６／ＴＰＰ－１４９３７との間で同様であった。ＴＰＰ－１４９３６及びＴＰＰ－１４９３７によるＶＥＧＦ捕捉は、ＴＰＰ－１１７３６より有効であった（底部の値）。
発芽アッセイ：ＴＰＰ－１１７３６とＴＰＰ－１４９３７との間に有意差は無かった。ＴＰＰ－１４９３６によるＶＥＧＦ誘発ＨＲＭＥＣ発芽の阻害は、ＴＰＰ－１４９３７又はＴＰＰ－１１７３６よりはるかに有効であった。予想外に、抗ＶＥＧＦであるRanibizumabのＶＨ－ＶＬ配向は、ＶＬ－ＶＨよりはるかに良好であった。
増殖アッセイ：ＴＰＰ－１４９３６及びＴＰＰ－１４９３７は、ＴＰＰ－１１７３６と比較して、より良好な効力、特に、ＶＥＧＦ誘発ＨＲＭＥＣ増殖の阻害の有効性を示した。ＴＰＰ－１４９３６は、ＴＰＰ－１４９３７より強力であり、ＴＰＰ－１４９３６及びＴＰＰ－１４９３７は両方とも、EYLEA（登録商標）（aflibercept）より有効であった。
これらの知見に基づいて、本発明者らは、Doppelmabの逆のレイアウトをより良く理解することを開始し、ＶＥＧＦ捕捉及びｓｃＦｖとしてのＣ２ ＴｒｋＢバインダーの効力（有効性）を改善するために、ＦａｂとしてのRanibizumab／Ｂ２０を試みた。ここから、下記結合分子を生成し、下記実施例（シリーズ２）において試験した：ＴＰＰ－１４９３８（Ｂ２０ Ｆａｂ）、ＴＰＰ－１４９３９（Ｂ２０ Ｆａｂ）、ＴＰＰ－１４９４０（Ranibizumab Ｆａｂ）、ＴＰＰ－１４９４１（Ranibizumab Ｆａｂ）。
実施例２５
ＢＤＮＦ、ＴＰＰ－１１７３６並びに第２のシリーズの４つのDoppelmab ＴＰＰ－１４９３８、ＴＰＰ－１４９３９、ＴＰＰ－１４９４０及びＴＰＰ－１４９４１によるヒトＴｒｋＢ活性化の比較；ＴｒｋＢ及びＥＲＫ１／２のリン酸化
図２４Ａ～図２４Ｂ及び図２５
ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を、上昇する濃度の天然のＴｒｋＢリガンドであるＢＤＮＦ、ＴＰＰ－１１７３６（ＦａｂとしてのＣ２）又は第２のシリーズの４つのDoppelmab ＴＰＰ－１４９３８（ｓｃＦｖとしてのＣ２、２０Ｌ３、ＶＨ－ＶＬ）、ＴＰＰ－１４９３９（ｓｃＦｖとしてのＣ２、２０Ｌ３、ＶＬ－ＶＨ）、ＴＰＰ－１４９４０（ｓｃＦｖとしてのＣ２、２０Ｌ３、ＶＨ－ＶＬ）及びＴＰＰ－１４９４１（ｓｃＦｖとしてのＣ２、２０Ｌ３、ＶＬ－ＶＨ）と共にインキュベーションした。ＴｒｋＢ活性化を、（Ａ）Ｙ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化を測定することにより又は（Ｂ）Ｔ２０２／Ｙ２０４（ＥＲＫ１）及びＴ１８５／Ｙ１８７（ＥＲＫ２）それぞれでのＥＲＫ１／２リン酸化を測定することにより評価した。最低化合物濃度を溶媒単独とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
ＴＰＰ－１１７３６は、ＦａｂとしてＣ２ ＣＤＲを含有した。４つのDoppelmab ＴＰＰ－１４９３８、ＴＰＰ－１４９３９、ＴＰＰ－１４９４０及びＴＰＰ－１４９４１は、ｓｃＦｖとしてＣ２を含有した。
ＴＰＰ－１１７３６又は元のＣ２抗体－両方とも、部分的ＴｒｋＢレセプターアゴニストである－とは非常に対照的に、ここでは、４つの新規なDoppelmabは全て、完全なＴｒｋＢレセプターアゴニスト活性を示した。ここでは、これらのDoppelmabによるＴｒｋＢ活性化は、天然のリガンドであるＢＤＮＦと同様に有効であった。これは、全く予想外であった。元のＣ２抗体単独では、部分的ＴｒｋＢレセプターアゴニストを示したためである。理論に拘束されることを望むものではないが、単一の結合分子とのＶＥＧＦ誘発クラスター形成及び結合分子の立体形成をＴｒｋＢ活性化の有効性及び効力の観察された向上が担っている場合があると考えられる（図２５も参照のこと）。
また、ＴｒｋＢ活性化の効力も、ＴＰＰ－１４９３９及びＴＰＰ－１４９４１と比較して、Doppelmab ＴＰＰ－１４９３８及びＴＰＰ－１４９４０で幾らか良好であった。このため、Ｃ２ ｓｃＦｖの「ＶＨ－ＶＬ」配向は、ＴｒｋＢ活性化のより良好な効力を示した。
実施例２６
ＢＤＮＦ、ＴＰＰ－１１７３６並びに第２のシリーズの４つのDoppelmab ＴＰＰ－１４９３８、ＴＰＰ－１４９３９、ＴＰＰ－１４９４０及びＴＰＰ－１４９４１によるカニクイザル／ラットＴｒｋＢ活性化の比較；ＴｒｋＢ及びＥＲＫ１／２リン酸化
図２６Ａ～図２６Ｂ
（Ａ）カニクイザルＴｒｋＢ又は（Ｂ）ラットＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を、上昇する濃度の天然のＴｒｋＢリガンドであるＢＤＮＦ、ＴＰＰ－１１７３６（ＦａｂとしてのＣ２）又は第２のシリーズの２つのDoppelmab ＴＰＰ－１４９４０（ｓｃＦｖとしてのＣ２、２０Ｌ３、ＶＨ－ＶＬ）及びＴＰＰ－１４９４１（ｓｃＦｖとしてのＣ２、２０Ｌ３、ＶＬ－ＶＨ）と共にインキュベーションした。ＴｒｋＢ活性化を、Ｙ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化を測定することにより評価した。最低化合物濃度を溶媒単独とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
ヒトＴｒｋＢについての実施例２５の結果をカニクイザル及びラットのモデルにおいて再現することができた。また、ここでは、ＴＰＰ－１１７３６とは非常に対照的に、新規なDoppelmabは、完全なＴｒｋＢレセプターアゴニストであった。これらのDoppelmabによるＴｒｋＢ活性化は、天然のリガンドであるＢＤＮＦと同様に有効であった。
同様に、ＴｒｋＢ活性化の効力は、ＴＰＰ－１４９４１と比較して、Doppelmab ＴＰＰ－１４９４０で幾らか良好であった。このため、Ｃ２ ｓｃＦｖのＶＨ－ＶＬ配向は、ＴｒｋＢ活性化のより良好な効力を示した。
実施例２７
ヒトＶＥＧＦの存在下又は非存在下における、Ｃ２、ＴＰＰ－１４９４０及びＴＰＰ－１４９４１（第２のシリーズ）によるヒトＴｒｋＢ活性化（ＴｒｋＢリン酸化）の比較－相乗効果
図２７Ａ～図２７Ｃ
ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を２００ng/mL ヒトＶＥＧＦ－Ａ（ｈＶＥＧＦ）とのプレインキュベーションの有無で、上昇する濃度のDoppelmab（Ａ）ＴＰＰ－１４９４０、（Ｂ）ＴＰＰ－１４９４１又は（Ｃ）Ｃ２と共にインキュベーションした。ＴｒｋＢ活性化を、Ｙ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化を測定することにより評価した。最低化合物濃度を溶媒単独とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
驚くべきことに、ヒトＶＥＧＦとのプレインキュベーションにより、ＴＰＰ－１４９４１（ｓｃＦｖとしてのＣ２、２０Ｌ３、ＶＬ－ＶＨ）によるＴｒｋＢリン酸化（ＴｒｋＢ活性化）の効力が劇的に改善された。
ＴｒｋＢリン酸化（ＴｒｋＢ活性化）の効力に対するＶＥＧＦの影響は、ＴＰＰ－１４９４０と比較して、ＴＰＰ－１４９４１についてより大きかった。このため、両方の分子が、ＴｒｋＢリン酸化の効力に対して相乗効果を示したが、DoppelmabのＴｒｋＢ活性化部分の配向／幾何形状（ｓｃＦｖ ＶＬ－ＶＨ対ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ対Ｆａｂ）は、相乗効果に対して影響を有すると考えられ、ＶＬ－ＶＨ配向を有するｓｃＦｖが好ましい。
ＶＥＧＦプレインキュベーションは、Ｃ２（対照）によるＴｒｋＢリン酸化（ＴｒｋＢ活性化）の効力に影響を及ぼさなかった。
実施例２８
ヒトＶＥＧＦの存在下又は非存在下における、Ｃ２、ＴＰＰ－１４９４０及びＴＰＰ－１４９４１（第２のシリーズ）によるヒトＴｒｋＢ活性化（ＥＲＫ１／２リン酸）の比較－相乗効果
図２８Ａ～図２８Ｃ
ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を２００ng/mL ヒトＶＥＧＦ－Ａ（ｈＶＥＧＦ）とのプレインキュベーションの有無で、上昇する濃度のDoppelmab（Ａ）ＴＰＰ－１４９４０、（Ｂ）ＴＰＰ－１４９４１又は（Ｃ）Ｃ２と共にインキュベーションした。ＴｒｋＢ活性化を、ＴｒｋＢの下流であるＴ２０２／Ｙ２０４（ＥＲＫ１）及びＴ１８５／Ｙ１８７（ＥＲＫ２）でのＥＲＫ１／２リン酸化を測定することにより評価した。最低化合物濃度を溶媒単独とする。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
ここでも、驚くべきことに、ヒトＶＥＧＦとのプレインキュベーションにより、ＴＰＰ－１４９４１（ｓｃＦｖとしてのＣ２、２０Ｌ３、ＶＬ－ＶＨ）によるＥＲＫ１／２リン酸化（ＴｒｋＢ活性化）の効力が劇的に改善された。
また、ここでは、ＥＲＫ１／２リン酸化（ＴｒｋＢ活性化）の効力に対するＶＥＧＦの影響は、ＴＰＰ－１４９４０と比較して、ＴＰＰ－１４９４１についてより大きかった。再度、両方の分子が、ＴｒｋＢリン酸化の効力に対して相乗効果を示したが、DoppelmabのＴｒｋＢ活性化部分の配向／幾何形状（ｓｃＦｖ ＶＬ－ＶＨ対ｓｃＦｖ ＶＨ－ＶＬ対Ｆａｂ）は、相乗効果に対して影響を有すると考えられ、ＶＬ－ＶＨ配向を有するｓｃＦｖが好ましい。
先に示されたように、ＶＥＧＦプレインキュベーションは、ＴＰＰ－１１７３６（シリーズ１、ＦａｂとしてのＣ２）によるＥＲＫ１／２リン酸化（ＴｒｋＢ活性化）の効力にも影響を及ぼさなかった。最後に、ＶＥＧＦプレインキュベーションは、Ｃ２（対照）によるＥＲＫ１／２リン酸化（ＴｒｋＢ活性化）の効力に影響を及ぼさなかった。
実施例２９
ＶＥＧＦ単独及びＢＤＮＦとの組み合わせによるヒトＴｒｋＢ活性化（ＴｒｋＢ／ＥＲＫリン酸化）の比較－相乗効果についての対照実験
図２９Ａ～図２９Ｂ
ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を、固定濃度の２００ng/mL ｈＶＥＧＦを伴って又は伴わずに、上昇する濃度のヒトＶＥＧＦ－Ａ（ｈＶＥＧＦ）単独又は上昇する濃度のＢＤＮＦと共にインキュベーションした。ＴｒｋＢの活性化を、（Ａ）Ｙ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化又は（Ｂ）ＴｒｋＢの下流であるＴ２０２／Ｙ２０４（ＥＲＫ１）及びＴ１８５／Ｙ１８７（ＥＲＫ２）それぞれでのＥＲＫ１／２リン酸化を測定することにより評価した。最低化合物濃度を溶媒単独とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
ｈＶＥＧＦ単独では、ＴｒｋＢ又はＥＲＫ１／２のリン酸化が誘発されなかった。
ＢＤＮＦの用量－応答曲線は、ｈＶＥＧＦとはほぼ無関係である。
実施例３０
ヒトＶＥＧＦの存在下又は非存在下における、Ｃ２、ＴＰＰ－１４９４０及びＴＰＰ－１４９４１（第２のシリーズ）によるカニクイザルＴｒｋＢ活性化（ＴｒｋＢリン酸）の比較－相乗効果
図３０Ａ～図３０Ｃ
カニクイザルＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を２００ng/mL ヒトＶＥＧＦ－Ａ（ｈＶＥＧＦ）とのプレインキュベーションの有無で、上昇する濃度のDoppelmab（Ａ）ＴＰＰ－１４９４０、（Ｂ）ＴＰＰ－１４９４１又は（Ｃ）Ｃ２と共にインキュベーションした。ＴｒｋＢ活性化を、Ｙ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化を測定することにより評価した。最低化合物濃度を溶媒単独とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
また、このモデルでも、ヒトＶＥＧＦとのプレインキュベーションにより、ＴＰＰ－１４９４１（ｓｃＦｖとしてのＣ２、２０Ｌ３、ＶＬ－ＶＨ）によるＴｒｋＢリン酸化（ＴｒｋＢ活性化）の効力が劇的に改善された。ＴＰＰ－１４９４０（ｓｃＦｖとしてのＣ２、２０Ｌ３、ＨＬ）によるＴｒｋＢリン酸化（ＴｒｋＢ活性化）の効力に対するＶＥＧＦの影響はより小さかった。
実施例３１
ヒトＶＥＧＦの存在下又は非存在下における、Ｃ２、ＴＰＰ－１４９４０及びＴＰＰ－１４９４１（第２のシリーズ）によるカニクイザルＴｒｋＢ活性化（ＥＲＫ１／２リン酸化）の比較－相乗効果
図３１Ａ～図３１Ｃ
カニクイザルＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を２００ng/mL ヒトＶＥＧＦ－Ａ（ｈＶＥＧＦ）とのプレインキュベーションの有無で、上昇する濃度のDoppelmab（Ａ）ＴＰＰ－１４９４０、（Ｂ）ＴＰＰ－１４９４１又は（Ｃ）Ｃ２と共にインキュベーションした。ＴｒｋＢ活性化を、ＴｒｋＢの下流であるＴ２０２／Ｙ２０４（ＥＲＫ１）及びＴ１８５／Ｙ１８７（ＥＲＫ２）でのＥＲＫ１／２リン酸化を測定することにより評価した。最低化合物濃度を溶媒単独とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
また、このモデルでも、ヒトＶＥＧＦとのプレインキュベーションにより、ＴＰＰ－１４９４１（ｓｃＦｖとしてのＣ２、２０Ｌ３、ＶＬ－ＶＨ）によるＥＲＫ１／２リン酸化（ＴｒｋＢ活性化）の効力が劇的に改善された。ＴＰＰ－１４９４０（ｓｃＦｖとしてのＣ２、２０Ｌ３、ＨＬ）によるＥＲＫ１／２リン酸化（ＴｒｋＢ活性化）の効力に対するＶＥＧＦの影響はより小さかった。
実施例３２
ＴＰＰ－１１７３６（ｓｃＦｖとしてＢ２０）、ＴＰＰ－１４９３８（ＦａｂとしてＢ２０）又はＴＰＰ－１４９３９（ＦａｂとしてＢ２０）によるヒトＶＥＧＦ－Ａ捕捉の比較－ＶＥＧＦＲ２、ＥＲＫ１／２及びＳｒｃのＶＥＧＦ誘発リン酸化の阻害
図３２Ａ～図３２Ｃ
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度のDoppelmab ＴＰＰ－１１７３６（ｓｃＦｖとしてのＢ２０）、ＴＰＰ－１４９３８（ＦａｂとしてのＢ２０）又はＴＰＰ－１４９３９（ＦａｂとしてのＢ２０）とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。ＶＥＧＦ－Ａ捕捉を、（Ａ）Ｙ１１７５でのＶＥＧＦレセプター２（ＶＥＧＦＲ２）リン酸化、（Ｂ）Ｔ２０２／Ｙ２０４（ＥＲＫ１）及びＴ１８５／Ｙ１８７（ＥＲＫ２）でのＥＲＫ１／２リン酸化又は（Ｃ）Ｙ４１９でのＳｒｃリン酸化を測定することにより評価した。抗体処理を伴わない５０ng/ml ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。以下の表６に、対応するベストフィットＩＣ５０値及び絶対有効性値（底部のプラトー）をそれぞれ報告する（非線形回帰；ｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ））。
Figure 2023546229000045
結果
ＴＰＰ－１４９３８／３９によるＶＥＧＦ捕捉の効力（ＩＣ５０）は、ＴＰＰ－１１７３６より幾らか良好であった。
ＴＰＰ－１４９３８及びＴＰＰ－１４９３９によるＶＥＧＦ捕捉は、ＴＰＰ－１１７３６より有効であった（底値はより小さい）。
全体として、Ｂ２０ ｓｃＦｖとＢ２０ Ｆａｂとの間の差異はかなり小さく、図１７／１８に示された先の結果：ＴＰＰ－１１７３６対ＴＰＰ－１３７８８（Ｂ２０ ＩｇＧ）によく対応する。結論として、Ｂ２０は、ＦａｂからｓｃＦｖへの再フォーマット化を明らかに比較的良好に許容する。
実施例３３
ＴＰＰ－１１７３６（Ｂ２０ ｓｃＦｖ）、ＴＰＰ－１４９３８（Ｂ２０ Ｆａｂ）又はＴＰＰ－１４９３９（Ｂ２０ Ｆａｂ）によるヒトＶＥＧＦ－Ａ捕捉の比較－ＨＲＭＥＣのＶＥＧＦ誘発増殖の阻害
図３３Ａ～図３３Ｃ
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度の示された結合分子とのプレインキュベーションの有無で、１０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。分子濃度をmol/Lで示す。ＶＥＧＦ－Ａ捕捉を、ＨＲＭＥＣ細胞数の自動化された画像ベースの定量化により評価した（IncuCyte）。画像を合計８４時間にわたって４時間毎に記録した。相対細胞数を示す。ｔ＝０での細胞数を１に設定した。非刺激細胞を対照（ベース）とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
Ｂ２０ ｓｃＦｖ（ＴＰＰ－１１７３６）をＢ２０ Ｆａｂ（ＴＰＰ－１４９３８及びＴＰＰ－１４９３９）に再フォーマット化することによっては、増殖アッセイにおいて、ＶＥＧＦ－Ａ捕捉の効力も有効性も改善されなかった。実際、Ｂ２０ Ｆａｂベースの抗体は、ＴＰＰ－１１７３６より効力／有効性が幾らか低いと考えられた。
実施例３４
ＴＰＰ－１４９３６（Ranibizumab、ｓｃＦｖ、ＨＬ）又はＴＰＰ－１４９３７（Ranibizumab、ｓｃＦｖ、ＬＨ）とＴＰＰ－１４９４０及びＴＰＰ－１４９４１（Ranibizumab Ｆａｂ）とによるヒトＶＥＧＦ－Ａ捕捉の比較－ＶＥＧＦＲ２、ＥＲＫ１／２及びＳｒｃのＶＥＧＦ誘発リン酸化の阻害
図３４Ａ～図３４Ｃ
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度のDoppelmab ＴＰＰ－１１７３６（ｓｃＦｖとしてのＢ２０）、ＴＰＰ－１４９３６（ｓｃＦｖとしてのRanibizumab ＶＨ－ＶＬ）、ＴＰＰ－１４９３７（ｓｃＦｖとしてのRanibizumab、ＶＬ－ＶＨ）、ＴＰＰ－１４９４０（ＦａｂとしてのRanibizumab）又はＴＰＰ－１４９４１（ＦａｂとしてのRanibizumab）とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。ＶＥＧＦ－Ａ捕捉を、（Ａ）Ｙ１１７５でのＶＥＧＦレセプター２（ＶＥＧＦＲ２）リン酸化、（Ｂ）Ｔ２０２／Ｙ２０４（ＥＲＫ１）及びＴ１８５／Ｙ１８７（ＥＲＫ２）でのＥＲＫ１／２リン酸化又は（Ｃ）Ｙ４１９でのＳｒｃリン酸化を測定することにより評価した。抗体処理を伴わない５０ng/ml ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。以下の表７に、対応するベストフィットＩＣ５０値及び絶対有効性値（底部のプラトー）をそれぞれ報告する（非線形回帰；ｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ））。
Figure 2023546229000046
結果
ｓｃＦｖからＦａｂにRanibizumabに再フォーマット化することにより、３つ全てのアッセイにおいて、ＶＥＧＦ捕捉の効力が劇的に改善された（Ranibizumab ｓｃＦｖ又は参照である分子ＴＰＰ－１１７３６より１０倍良好なＩＣ５０）。
Ranibizumabベースの分子によるＶＥＧＦ捕捉の有効性は、ＴＰＰ－１１７３６（底値）よりもはるかに良好であった。
しかしながら、Ranibizumabは、ＦａｂからｓｃＦｖへの再フォーマット化には非常によく耐えなかった（Ｂ２０とは対照的、先の実施例を参照のこと）。
実施例３５
ＴＰＰ－１４９３６（ｓｃＦｖとしてのRanibizumab、ＶＨ－ＶＬ）又はＴＰＰ－１４９３７（ｓｃＦｖとしてのRanibizumab、ＶＬ－ＶＨ）とＴＰＰ－１４９４０及びＴＰＰ－１４９４１（Ranibizumab Ｆａｂ）とによるヒトＶＥＧＦ－Ａ捕捉の比較－ＨＲＭＥＣのＶＥＧＦ誘発増殖の阻害
図３５Ａ～図３５Ｄ
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度の示された結合分子のプレインキュベーションの有無で、１０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。分子濃度をmol/Lで示す。ＶＥＧＦ－Ａ捕捉を、ＨＲＭＥＣ細胞数の自動化された画像ベースの定量化により評価した（IncuCyte）。画像を合計８４時間にわたって４時間毎に記録した。相対細胞数を示す。ｔ＝０での細胞数を１に設定した。非刺激細胞を対照（ベース）とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
ｓｃＦｖとしてのRanibizumab（ＴＰＰ－１１７３６／ＴＰＰ－１４９３７）をRanibizumab Ｆａｂ（ＴＰＰ－１４９４０及びＴＰＰ－１４９４１）に再フォーマット化することにより、増殖アッセイにおいて、ＶＥＧＦ－Ａ捕捉の効力が顕著に改善された。
ＴＰＰ－１４９４０及びＴＰＰ－１４９４１では、完全なＶＥＧＦ阻害が、０．２５nMの濃度で既に見られた。一方、完全な阻害には、それぞれ１nM ＴＰＰ－１４９３６及び４nM ＴＰＰ－１４９３７が必要であった。
ＶＥＧＦ－Ａ阻害の有効性は、４つ全ての分子（全て完全な阻害剤）の間で同様であった。
実施例３６
ＴＰＰ－１４９３８又はＴＰＰ－１４９３９（Ｂ２０ Ｆａｂ）とＴＰＰ－１４９４０及びＴＰＰ－１４９４１（Ranibizumab Ｆａｂ）とによるヒトＶＥＧＦ－Ａ捕捉の比較－ＶＥＧＦＲ２、ＥＲＫ１／２及びＳｒｃのＶＥＧＦ誘発リン酸化の阻害
図３６Ａ～図３６Ｃ
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度のDoppelmab ＴＰＰ－１１７３６（ｓｃＦｖとしてのＢ２０）、ＴＰＰ－１３９３８（ＦａｂとしてのＢ２０）又はＴＰＰ－１３９３９（ＦａｂとしてのＢ２０）、ＴＰＰ－１４９４０（ＦａｂとしてのRanibizumab）又はＴＰＰ－１４９４１（ＦａｂとしてのRanibizumab）とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。ＶＥＧＦ－Ａ捕捉を、（Ａ）Ｙ１１７５でのＶＥＧＦレセプター２（ＶＥＧＦＲ２）リン酸化、（Ｂ）Ｔ２０２／Ｙ２０４（ＥＲＫ１）及びＴ１８５／Ｙ１８７（ＥＲＫ２）でのＥＲＫ１／２リン酸化又は（Ｃ）Ｙ４１９でのＳｒｃリン酸化を測定することにより評価した。分子処理を伴わない５０ng/ml ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。以下の表８に、対応するベストフィットＩＣ５０値及び絶対有効性値（底部のプラトー）をそれぞれ報告する（非線形回帰；ｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ））。
Figure 2023546229000047
結果
Ranibizumab Ｆａｂを有するDoppelmabは、３つのアッセイ全てにおいて、Ｂ２０ Ｆａｂに基づくDoppelmabよりＶＥＧＦ捕捉の効力が明らかに良好であることを示した。
Ranobizumab Ｆａｂを有するDoppelmabは、３つのアッセイ全てにおいて、Ｂ２０ Ｆａｂに基づくDoppelmabよりＶＥＧＦ捕捉の有効性が明らかに良好ことを示した（底値）。
実施例３７
ＴＰＰ－１４９３８又はＴＰＰ－１４９３９（ＦａｂとしてのＢ２０）とＴＰＰ－１４９４０及びＴＰＰ－１４９４１（ＦａｂとしてのRanibizumab）とによるヒトＶＥＧＦ－Ａ捕捉の比較－ＨＲＭＥＣのＶＥＧＦ誘発増殖の阻害
図３７Ａ～図３７Ｄ
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度の示された結合分子とのプレインキュベーションの有無で、１０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。分子濃度をmol/Lで示す。ＶＥＧＦ－Ａ捕捉を、ＨＲＭＥＣ細胞数の自動化された画像ベースの定量化により評価した（IncuCyte）。画像を合計８４時間にわたって４時間毎に記録した。相対細胞数を示す。ｔ＝０での細胞数を１に設定した。非刺激細胞を対照（ベース）とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
RanibizumabＦａｂベースの分子であるＴＰＰ－１４９４０及びＴＰＰ－１４９４１によるＶＥＧＦ誘発増殖の阻害の効力及び有効性は、Ｂ２０ Ｆａｂベースの分子であるＴＰＰ－１４９３８及びＴＰＰ－１４９３９と比較して明らかに優れていた。
最高濃度（１６nM）であっても、ＴＰＰ－１４９３８及びＴＰＰ－１４９３９は、ＶＥＧＦ誘発発芽を完全には阻害できなかった。
対照的に、ＴＰＰ－１４９４０及びＴＰＰ－１４９４１は、０．２５nMという６４倍低い濃度で既に、ＶＥＧＦ誘発増殖を完全に阻害した。
実施例３８
Doppelmab ＴＰＰ－１１７３６（ｓｃＦｖとしてのＢ２０）、ＴＰＰ－１４９３６（ｓｃＦｖとしてのRanibizumab、ＶＨ－ＶＬ）、ＴＰＰ－１４９３７（ｓｃＦｖとしてのRanibizumab、ＶＬ－ＶＨ）、ＴＰＰ－１４９３８（ＦａｂとしてのＢ２０）もしくはＴＰＰ－１４９３９（Ｂ２０ Ｆａｂ）、ＴＰＰ－１４９４０（ＦａｂとしてのRanibizumab）、ＴＰＰ－１４９４１（ＦａｂとしてのRanibizumab）又はEYLEA（登録商標）（aflibercept）によるヒトＶＥＧＦ－Ａ捕捉の比較－ＶＥＧＦ誘発ＨＲＭＥＣ発芽の阻害
図３８
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）のスフェロイドをコラーゲンマトリックス中に包埋した。内皮の発芽を２．５nM Doppelmab ＴＰＰ－１１７３６（Ｂ２０ ｓｃＦｖ）、ＴＰＰ－１４９３６（Ranibizumab ｓｃＦｖ、ＶＨ－ＶＬ）、ＴＰＰ－１４９３７（Ranibizumab ｓｃＦｖ、ＶＬ－ＶＨ）、ＴＰＰ－１４９３８（Ｂ２０ Ｆａｂ）、ＴＰＰ－１４９３９（Ｂ２０ Ｆａｂ）、ＴＰＰ－１４９４０（Ranibizumab Ｆａｂ）、ＴＰＰ－１４９４１（Ranibizumab Ｆａｂ）又は５nM EYLEA（登録商標）（aflibercept）とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦとのインキュベーションにより２４時間誘発した。内皮の発芽を共焦点顕微鏡により評価し、Ｚスタックの最大投影から得られたスフェロイド外周を示した。非刺激細胞を対照（ベース）とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。ｎ．ｓ． ｐ＞０．０５ 有意差なし;５０ng/mL ｈＶＥＧＦと比較して、§ｐ＜０．０００１；５０ng/mL ｈＶＥＧＦと比較して、＃ｐ＞０．０５ 有意差なし。＊＊＊ｐ＜０．００１；テューキーの多重比較検定を使用した一元配置分散分析。
結果
Ranibizumab ＦａｂベースのDoppelmab ＴＰＰ－１４９４０及びＴＰＰ－１４９４１は、明らかに、このアッセイにおいて、最良のＶＥＧＦ捕捉剤であった。EYLEA（登録商標）（aflibercept）とは対照的に、ＴＰＰ－１４９４０及びＴＰＰ－１４９４１は、ＶＥＧＦ誘発発芽を完全に阻害した。ＶＥＧＦの非存在下（ベース）での内皮発芽と２．５nM ＴＰＰ－１４９４０又はＴＰＰ－１４９４１と共にプレインキュベーションされた５０ng/mL ｈＶＥＧＦとの間に統計的有意差は見られなかった。
ＴＰＰ－１４９４０及びＴＰＰ－１４９４１によるＶＥＧＦ誘発ＥＣ発芽の阻害は、他のいずれのDoppelmabによる阻害より有意に良好であった。
ＴＰＰ－１４９４０及びＴＰＰ－１４９４１によるＶＥＧＦ誘発ＥＣ発芽の阻害は、EYLEA（登録商標）（aflibercept）による阻害より有意に良好であった。
さらに、５０ng/mL ｈＶＥＧＦとEYLEA（登録商標）（aflibercept）と共にプレインキュベーションされた５０ng/mL ｈＶＥＧＦとで刺激された内皮発芽の間には、統計的有意差は無かった。
実施例３９
Doppelmab ＴＰＰ－１１９４０及びEYLEA（登録商標）（aflibercept）によるヒトＶＥＧＦ－Ａ捕捉の比較－Brown NorwayラットにおけるヒトＶＥＧＦ－Ａ誘発網膜透過性亢進の阻害
図３９Ａ～図３９Ｂ
ＴＰＰ－１４９４０（EYLEA（登録商標）（aflibercept）ではない）は、ラット網膜におけるヒトＶＥＧＦ－Ａ誘発透過性亢進を予防した。（Ａ）実験手法を示す時間プロトコール。抗ＶＥＧＦ化合物（１３又は２６pmol/眼 EYLEA（登録商標）（aflibercept）又はＴＰＰ－１４９４０）又は対照（２６pmol ＴＰＰ－１１７３７）の硝子体内（ｉｖｔ）投与の１５分後、１３pmol ヒトＶＥＧＦ－Ａ/眼をｉｖｔ注射により投与した。ＰＢＳ注射を対照とした。２４時間後、１mL/kg エバンスブルー（ＥＢ）溶液（０．９％ 生理食塩水中の４５mg/mL）を静脈内（ｉｖ）注射により３０分間投与し、その後、眼を単離し、固定した。同じ時点で、血漿サンプルを収集し、全身ＥＢ曝露量が等しいことを確認した。（Ｂ）Brown Norwayラットの網膜におけるＶＥＧＦ－Ａ誘発透過性亢進の定量を、共焦点顕微鏡により網膜フラットマウントにおけるＥＢ血管外漏出を測定することにより行った。眼を鋸状縁に沿って切断し、水晶体及び硝子体を除去し、眼杯をパラホルムアルデヒド（４％）中において、４℃で１時間固定し、ついで、４℃で一晩ＰＢＳに移した。網膜を外側セグメント（強膜及び脈絡膜）から分離し、スライドガラスに移し、４回切断して、平坦なクローバー葉様構造を達成した。組織をマウンティング媒体（ＤＮＡ染色ＤＡＰＩを含有するVectashield（登録商標）antifade mounting media H-1200）で覆い、カバースリップを上に置き、網膜フラットマウントを得た。サンプルを６３９nmの波長で励起し、６６９nmでのエバンスブルーの発光をLSM 700共焦点レーザー走査顕微鏡（Carl Zeiss, Jena；ゲイン８００、レーザー強度２％、５スタック ６０μm）で記録し、最大強度投影を有する網膜フラットマウントの画像を得た。蛍光強度の合計の分析を３０の閾値でプログラムImageJ中において画像を開いた後に行った。＊＊＊ｐ＜０．００１；＊ｐ＜０．０５；ｎ．ｓ． ｐ＞０．０５；＃ｐ＞０．０５ ＴＰＰ－１１７３７＋ＰＢＳに対して有意差なし。テューキーの多重比較検定を使用した一元配置分散分析。ｎ＝９～１７。
結果
対照条件下で、硝子体内ＶＥＧＦ－Ａ注射により、血管透過性が約６０％向上した。ＴＰＰ－１４９４０と同じ分子フォーマット（Doppelmab）を有するため、ＴＰＰ－１１７３７を対照抗体として使用したが、初期のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイでは、この化合物はＶＥＧＦを捕捉しなかった。
１：１及び２：１の分子比の結合分子対ＶＥＧＦにおいて、ＴＰＰ－１４９４０は、血管透過性亢進を完全に遮断した。一方、はっきりと対照的に、EYLEA（登録商標）（aflibercept）は、同じ条件下でかつ２倍の濃度でさえも、血管漏出を顕著に減少させることができなかった。
シリーズ２－ＴＰＰ－１４９３８、ＴＰＰ－１４９３９、ＴＰＰ－１４９４０、ＴＰＰ－１４９４１の知見の概要
ＴｒｋＢ活性化
ＴＰＰ－１１７３６とは非常に対照的に、４つの新規な「Doppelmabは全て、完全なＴｒｋＢレセプターアゴニストであった。これらのDoppelmabによるＴｒｋＢ活性化は、天然のリガンドであるＢＤＮＦと同様に有効であった。
ＴｒｋＢ活性化の効力は、「ＶＨ－ＶＬ」配向を有するDoppelmab ＴＰＰ－１４９３８／４０対ＴＰＰ－１４９３９及びＴＰＰ－１４９４１において幾らか良好であった。
驚くべきことに、ヒトＶＥＧＦとのプレインキュベーションにより、相乗効果を示して、ＴＰＰ－１４９４１［Ｃ２、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、ＶＬ－ＶＨ］によるＴｒｋＢリン酸化（ＴｒｋＢ活性化）の効力が劇的に改善された。
ＴＰＰ－１４９４１とは対照的に、ＴＰＰ－１４９４０［Ｃ２、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、ＶＨ－ＶＬ］によるＴｒｋＢリン酸化（ＴｒｋＢ活性化）の効力に対するＶＥＧＦの影響は、比較的小さかった。
ＶＥＧＦ捕捉
Ｂ２０ ｓｃＦｖ（ＴＰＰ－１１７３６）をＢ２０ Ｆａｂ（ＴＰＰ－１４９３８及びＴＰＰ－１４９３９）に再フォーマット化することによっては、増殖アッセイにおいて、ＶＥＧＦ－Ａ捕捉の効力も有効性も改善されなかった。
Ranibizumab ｓｃＦｖ（ＴＰＰ－１１７３６／ＴＰＰ－１４９３７）をRanibizumab Ｆａｂ（ＴＰＰ－１４９４０及びＴＰＰ－１４９４１）に再フォーマット化することにより、増殖アッセイにおいて、ＶＥＧＦ－Ａ捕捉の効力が顕著に改善された。
完全なＶＥＧＦ阻害は、ＴＰＰ－１４９４０及びＴＰＰ－１４９４１を使用して、０．２５nMという低い濃度で既に見られた。
Ranibizumab Ｆａｂベースの分子であるＴＰＰ－１４９４０及びＴＰＰ－１４９４１によるＶＥＧＦ誘発増殖の阻害の効力及び有効性は、Ｂ２０ Ｆａｂベースの分子であるＴＰＰ－１４９３８及びＴＰＰ－１４９３９と比較して優れていた。
本発明者らは、下記実施例において結合分子におけるリンカークリッピングを観察した（データは示さず）ため、ＴＰＰ－１４９４０に基づいて、更なる分子：ＴＰＰ－１９９８６（ＶＨ－ＶＬ、１０Ｌ１）、ＴＰＰ－１９９８７（ＶＨ－ＶＬ、２０Ｌ１）及びＴＰＰ－１４９４１に基づいて、ＴＰＰ－１９９８８（ＶＬ－ＶＨ、１０Ｌ１）、ＴＰＰ－１９９８９（ＶＬ－ＶＨ、２０Ｌ１）を導き出した。これらは全て、ＦａｂとしてのRanibizumab及びｓｃＦｖとしてのＣ２に基づいた。
実施例４０
ＢＤＮＦ、ＴＰＰ－１４９４０［Ｃ２、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、ＶＨ－ＶＬ］又はそのリンカー変形形態であるＴＰＰ－１９９８６［Ｃ２、ｓｃＦｖ、１０Ｌ１、ＶＨ－ＶＬ］もしくはＴＰＰ－１９９８７［Ｃ２、ｓｃＦｖ、２０Ｌ１、ＶＨ－ＶＬ］又はＴＰＰ－１４９４１［Ｃ２、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、ＶＬ－ＶＨ］及びそのリンカー変形形態であるＴＰＰ－１９９８８［Ｃ２、ｓｃＦｖ、１０Ｌ１、ＶＬ－ＶＨ］もしくはＴＰＰ－１９９８９［Ｃ２、ｓｃＦｖ、２０Ｌ１、ＶＬ－ＶＨ］によるヒトＴｒｋＢ活性化の比較；ＴｒｋＢ及びＥＲＫ１／２のリン酸化－シリーズ３
図４０Ａ～図４０Ｄ
ヒトＴｒｋＢを安定に発現するヒトＣＨＯ細胞を上昇する濃度の天然のＴｒｋＢリガンドであるＢＤＮＦ、ＴＰＰ－１４９４０［Ｃ２、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、ＶＨ－ＶＬ］又はそのリンカー変形形態であるＴＰＰ－１９９８６［Ｃ２、ｓｃＦｖ、１０Ｌ１、ＶＨ－ＶＬ］もしくはＴＰＰ－１９９８７［Ｃ２、ｓｃＦｖ、２０Ｌ１、ＶＨ－ＶＬ］又はＴＰＰ－１４９４１［Ｃ２、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、Ｖ－ＶＨ］及びそのリンカー変形形態であるＴＰＰ－１９９８８［Ｃ２、ｓｃＦｖ、１０Ｌ１、ＶＬ－ＶＨ］もしくはＴＰＰ－１９９８９［Ｃ２、ｓｃＦｖ、２０Ｌ１、ＶＬ－ＶＨ］と共にインキュベーションした。ＴｒｋＢ活性化を、（Ａ及びＢ）Ｙ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化を測定することにより又は（Ｃ及びＤ）Ｔ２０２／Ｙ２０４（ＥＲＫ１）及びＴ１８５／Ｙ１８７（ＥＲＫ２）でのＥＲＫ１／２リン酸化をそれぞれ測定することにより評価した。最低化合物濃度を溶媒単独とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。以下の表９及び表１０に、ＴｒｋＢ及びＥＲＫ１／２リン酸化の対応するベストフィットＩＣ５０値及び絶対有効性値（底部のプラトー）をそれぞれ報告する（非線形回帰；ｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ））。
Figure 2023546229000048
Figure 2023546229000049
結果
親分子と各リンカー変形形態との間に有意差は無かった。ＴｒｋＢ及びＥＲＫ１／２のリン酸化の効力及び有効性は、実質的に同一であった。これは、注目に値する。リンカーが、ＴｒｋＢ結合部位の近くに位置していたが、結合分子の生体活性には影響を及ぼさなかったためである。
全ての試験分子が、完全ＴｒｋＢアゴニストであった。
再度、先に示されたように、ＴｒｋＢ／ＥＲＫリン酸化の効力は、ＴＰＰ－１４９４１分子及びそのリンカー変形形態（ＶＬ－ＶＨ配向）と比較して、ＴＰＰ－１４９４０分子及びそのリンカー変形形態（ＶＨ－ＶＬ配向）についてより良好であった。
実施例４１
ＢＤＮＦ、ＴＰＰ－１４９４０［Ｃ２、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、ＶＨ－ＶＬ］又はＴＰＰ－１４９４１［Ｃ２、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、ＶＬ－ＶＨ］及びリンカー変形形態であるＴＰＰ－１９９８８［Ｃ２、ｓｃＦｖ、１０Ｌ１、ＶＬ－ＶＨ］もしくはＴＰＰ－１９９８９［Ｃ２、ｓｃＦｖ、２０Ｌ１、ＶＬ－ＶＨ］によるヒトＴｒｋＢ内部移行の比較－シリーズ３
図４１Ａ～図４１Ｂ
カニクイザルＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を、上昇する濃度の天然のＴｒｋＢリガンドであるＢＤＮＦ又は上昇する濃度の第１のシリーズのDoppelmab ＴＰＰ－１４９４０［Ｃ２、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、ＶＨ－ＶＬ］もしくはＴＰＰ－１４９４１［Ｃ２、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、ＶＬ－ＶＨ］及びリンカー変形形態であるＴＰＰ－１９９８８［Ｃ２、ｓｃＦｖ、１０Ｌ１、ＶＬ－ＶＨ］もしくはＴＰＰ－１９９８９［Ｃ２、ｓｃＦｖ、２０Ｌ１、ＶＬ－ＶＨ］を伴う１nM ＢＤＮＦと共にインキュベーションした。ＴｒｋＢ内部移行を細胞の透過化を伴わない表面ＴｒｋＢレセプターの免疫蛍光染色、続けて、共焦点顕微鏡分析により評価した。ヒートマップの暗視野及び明視野はそれぞれ、蛍光閾値を上回る細胞の割合の高低を表わす。
結果
ＢＤＮＦにより、ＴｒｋＢレセプター内部移行が誘発された。ＴＰＰ－１４９４０、ＴＰＰ－１４９４１、ＴＰＰ－１９９８８及びＴＰＰ－１９９８９は、完全なＴｒｋＢレセプターアゴニストであったが、Doppelmabのいずれによっても、ＢＤＮＦ誘発レセプター内部移行を増加せず、むしろ、ＴｒｋＢレセプターのＢＤＮＦ誘発内部移行が減少した（注：ヒートマップフィールドは、下から上へ暗くなっている）。
実施例４２
ＴＰＰ－１４９４０並びにそのリンカー変形形態であるＴＰＰ－１９９８６及びＴＰＰ－１４９４１並びにそのリンカー変形形態であるＴＰＰ－１９９８８によるヒトＶＥＧＦ－Ａ捕捉の比較－ＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦ誘発リン酸化の阻害－シリーズ３
図４２
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度のDoppelmab ＴＰＰ－１４９４０並びにそのリンカー変形形態であるＴＰＰ－１９９８６及びＴＰＰ－１４９４１並びにそのリンカー変形形態であるＴＰＰ－１９９８８とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。ＶＥＧＦ－Ａ捕捉を、Ｙ１１７５でのＶＥＧＦレセプター２（ＶＥＧＦＲ２）リン酸化を測定することにより評価した。分子処理を伴わない５０ng/ml ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。以下の表１１に、ＶＥＧＦＲ２リン酸化の阻害の対応するベストフィットＩＣ５０値（非線形回帰；ｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ））を報告する。
Figure 2023546229000050
結果
親分子であるＴＰＰ－１４９４０／ＴＰＰ－１４９４１と各リンカー変形形態との間に有意差は無かった。ＶＥＧＦ誘発ＶＥＧＦＲ２リン酸化の阻害の効力及び有効性は、実質的に同一であった。
実施例４３
Doppelmab ＴＰＰ－１４９４０［Ｃ２、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、ＶＨ－ＶＬ］又はそのリンカー変形形態であるＴＰＰ－１９９８６［Ｃ２、ｓｃＦｖ、１０Ｌ１、ＶＨ－ＶＬ］もしくはＴＰＰ－１９９８７［Ｃ２、ｓｃＦｖ、２０Ｌ１、ＶＨ－ＶＬ］又はＴＰＰ－１４９４１［Ｃ２、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、ＶＬ－ＶＨ］及びそのリンカー変形形態であるＴＰＰ－１９９８８［Ｃ２、ｓｃＦｖ、１０Ｌ１、ＶＬ－ＶＨ］もしくはＴＰＰ－１９９８９［Ｃ２、ｓｃＦｖ、２０Ｌ１、ＶＬ－ＶＨ］によるヒトＶＥＧＦ－Ａ捕捉の比較－ＶＥＧＦ誘発ＨＲＭＥＣ発芽の阻害－シリーズ３
図４３
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）のスフェロイドをコラーゲンマトリックスに包埋した。内皮の発芽を２．５nM Doppelmab ＴＰＰ－１１７３６（Ｂ２０ ｓｃＦｖ）、ＴＰＰ－１４９４０［Ｃ２、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、ＶＨ－ＶＬ］又はそのリンカー変形形態であるＴＰＰ－１９９８６［Ｃ２、ｓｃＦｖ、１０Ｌ１、ＶＨ－ＶＬ］もしくはＴＰＰ－１９９８７［Ｃ２、ｓｃＦｖ、２０Ｌ１、ＶＨ－ＶＬ］又はＴＰＰ－１４９４１［Ｃ２、ｓｃＦｖ、２０Ｌ３、ＶＬ－ＶＨ］及びそのリンカー変形形態であるＴＰＰ－１９９８８［Ｃ２、ｓｃＦｖ、２０Ｌ１、ＶＬ－ＶＨ］もしくはＴＰＰ－１９９８９［Ｃ２、ｓｃＦｖ、２０Ｌ１、ＶＬ－ＶＨ］とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦとのインキュベーションにより２４時間誘発した。内皮の発芽を共焦点顕微鏡により評価し、Ｚスタックの最大投影から得られたスフェロイド外周を示した。非刺激細胞を対照（ベース）とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。ｎ．ｓ． ｐ＞０．０５ 有意差なし；５０ng/mL ｈＶＥＧＦと比較して、§ｐ＜０．０００１；５０ng/mL ｈＶＥＧＦと比較して、＃ｐ＞０．０５ 有意差なし。＊＊＊ｐ＜０．００１；テューキーの多重比較検定を使用した一元配置分散分析。
結果
親分子であるＴＰＰ－１４９４０／ＴＰＰ－１４９４１と各リンカー変形形態との間に、有意差は観察されなかった。全ての分子が、ＨＲＭＥＣのＶＥＧＦ誘発発芽を完全に阻害した。
シリーズ３－ＴＰＰ－１９９８６、１９９８７、１９９８８、１９９８９の知見の概要
ＴｒｋＢ活性化
親分子（ＴＰＰ－１４９４０／１４９４１）と各リンカー変形形態との間に、有意差は観察されなかった。
全ての試験された結合分子は、完全なＴｒｋＢレセプターアゴニストであった。ＶＨ－ＶＬ配向及びそのリンカー変形形態は、さらにより強力であった。
レセプター内部移行の変化は観察されなかった。これは、新規なDoppelmabが完全なＴｒｋＢレセプターアゴニストであるＢＤＮＦと同様であったことを考慮すると、非常に驚くべきことであった。
ＶＥＧＦ捕捉
親分子（ＴＰＰ－１４９４０／１４９４１）とそれぞれのリンカー変形形態との間に、有意差は観察されなかった。
ＣＭＣ特性
リンカー１０Ｌ１及び２０Ｌ１リンカーの使用により、リンカークリッピングは、もはや観察されなかった（データを示さず）。
次の段階として、結合分子のＣＭＣ及び生物物理学的特性を改善するために、最終シリーズの結合分子を設計した（シリーズ４）。ただし、本発明の結合分子の優れた生物学的機能を常に保存しようとした。
実施例４４
ＴｒｋＢ ｓｃＦｖ部分におけるジスルフィド架橋（ＣＣ）の有無でのDoppelmabによるヒトＴｒｋＢ活性化の比較；ＴｒｋＢリン酸化－シリーズ４
図４４Ａ～図４４Ｄ
ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を抗ＴｒｋＢ ｓｃＦｖ部分におけるＣＣ架橋の有無で、上昇する濃度の示されたDoppelmabと共にインキュベーションした。（Ａ）ＴＰＰ－２２１８０対ＴＰＰ－２２２０４；（Ｂ）ＴＰＰ－２２１９２対ＴＰＰ－２２２１６；（Ｃ）ＴＰＰ－２２１９０対ＴＰＰ－２２２１４；（Ｄ）ＴＰＰ－２２１９１対ＴＰＰ－２２２１５。ＴｒｋＢ活性化を、Ｙ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化を測定することにより評価した。最低化合物濃度を溶媒単独とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。以下の表１２に、ＴｒｋＢ活性化の対応するベストフィットＩＣ５０値及び絶対又は相対有効性値（上部のプラトー）をそれぞれ報告する（非線形回帰；ｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ））。
Figure 2023546229000051
結果
ジスルフィド架橋を主に、結合分子のＣＭＣ特性を改善するのに導入した。驚くべきことに、ｓｃＦｖ抗ＴｒｋＢ部分にジスルフィド架橋を含ませることにより、ＴｒｋＢ活性化の効力及び有効性の両方がさらに改善された。ＶＬ－ＶＨ配向を有する結合分子において、より大きな影響が観察された。
実施例４５
ＴｒｋＢ ｓｃＦｖ部分におけるジスルフィド架橋（ＣＣ）の有無でのDoppelmabによるラットＴｒｋＢ活性化の比較；ＴｒｋＢリン酸化－シリーズ４
図４５Ａ～図４５Ｂ
ラットＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を抗ＴｒｋＢ ｓｃＦｖ部分におけるＣＣ架橋の有無で、上昇する濃度の示されたDoppelmabと共にインキュベーションした。（Ａ）ＴＰＰ－２２１８０対ＴＰＰ－２２２０４；（Ｂ）ＴＰＰ－２２１９２対ＴＰＰ－２２２１６。ＴｒｋＢ活性化を、Ｙ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化を測定することにより評価した。最低化合物濃度を溶媒単独とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。以下の表１３に、ＴｒｋＢ活性化の対応するベストフィットＩＣ５０値及び絶対又は相対有効性値（上部のプラトー）をそれぞれ報告する（非線形回帰；ｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ））。
Figure 2023546229000052
結果
ｓｃＦｖ抗ＴｒｋＢ部品にジスルフィド架橋を含ませることにより、ＴｒｋＢ活性化の効力及び有効性の両方が改善された。再度、ＶＬ－ＶＨ配向の結合分子に対する影響は、より大きいようであった。全体として、データは、ヒトＴｒｋＢについて得られたデータと良好に一致した。
実施例４６
ＴＰＰ－２２２０４／２２２１４媒介性ＴｒｋＢ活性化の選択性
図４６
（Ａ）ヒトＴｒｋＡ、（Ｂ）ヒトＴｒｋＢ又は（Ｃ）ヒトＴｒｋＣを安定に発現するＣＨＯ細胞を上昇する濃度のＣ２抗体又はDoppelmab ＴＰＰ－２２２０４もしくはＴＰＰ－２２２１４と共にインキュベーションした。Ｔｒｋレセプターの活性化を、Ｙ７０６／７０７でのレセプターリン酸化を測定することにより評価した。上昇する濃度のＴｒｋＡ（ＮＧＦ）、ＴｒｋＢ（ＢＤＮＦ）及びＴｒｋＣ（ＮＴ－３）についての天然のリガンドとのインキュベーションを対照として使用した。最低化合物濃度を溶媒単独とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
両方のDoppelmabとも、ＴｒｋＢに非常に特異的／選択的であった－それらは、ＴｒｋＡ又はＴｒｋＣのいずれも活性化しなかった。
実施例４７
ＢＤＮＦ誘発ＴｒｋＢ活性化に対するＴＰＰ－２２２１４の影響
図４７Ａ～図４７Ｂ
ヒトＴｒｋＢレセプターを安定に発現するＣＨＯ細胞を、一定濃度の０．３nM、１nM又は３nM ＢＤＮＦの有無で、上昇する濃度の（Ａ）Ｃ２抗体又は（Ｂ）Doppelmab ＴＰＰ－２２２１４と共にインキュベーションした。ＴｒｋＢの活性化を、Ｙ７０６／７０７でのレセプターリン酸化を測定することにより評価した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
Ｃ２とは非常に対照的に、ＴＰＰ－２２２１４は、ＢＤＮＦ誘発ＴｒｋＢ活性化を制限しなかった。
実施例４８
ヒトＶＥＧＦの存在下又は非存在下におけるＴＰＰ－２２２１４によるヒトＴｒｋＢ活性化（ＴｒｋＢリン酸化）の比較
図４８Ａ～図４８Ｄ
ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を、（Ａ）２００ng/mL ヒトＶＥＧＦ－Ａ（ｈＶＥＧＦ）、（Ｂ）５０ng/mL ｈＶＥＧＦ、（Ｃ）１０ng/mL ｈＶＥＧＦ、又は（Ｄ）２ng/mL ｈＶＥＧＦとのプレインキュベーションの有無で、上昇する濃度のDoppelmab ＴＰＰ－２２２１４と共にインキュベーションした。ＴｒｋＢ活性化を、Ｙ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化を測定することにより評価した。最低化合物濃度を溶媒単独とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
先に示されたように、２００ng/mL ヒトＶＥＧＦとのプレインキュベーションにより、ＴＰＰ－２２２１４によるＴｒｋＢリン酸化（ＴｒｋＢ活性化）の効力が改善された。より重要なことには、この相乗効果が、５０、１０、さらには２ng/mL ｈＶＥＧＦでほぼ保持された。また、同様の効果が、他の種、例えば、カニクイザルでも得られた（データを示さず）。
実施例４９
ヒトＶＥＧＦの存在下又は非存在下におけるＴＰＰ－２２２１４によるヒトＴｒｋＢ活性化（ＥＲＫリン酸化）の比較
図４９Ａ～図４９Ｄ
ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を（Ａ）２００ng/mL ヒトＶＥＧＦ－Ａ（ｈＶＥＧＦ）、（Ｂ）５０ng/mL ｈＶＥＧＦ、（Ｃ）１０ng/mL ｈＶＥＧＦ又は（Ｄ）２ng/mL ｈＶＥＧＦとのプレインキュベーションの有無で、上昇する濃度のDoppelmab ＴＰＰ－２２２１４と共にインキュベーションした。ＴｒｋＢの活性化を、ＴｒｋＢの下流であるＴ２０２／Ｙ２０４（ＥＲＫ１）及びＴ１８５／Ｙ１８７（ＥＲＫ２）でのＥＲＫ１／２リン酸化を測定することにより評価した。最低化合物濃度を溶媒単独とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
同様に、２００ng/mL ヒトＶＥＧＦとのプレインキュベーションにより、ＴＰＰ－２２２１４によるＴｒｋＢ活性化の下流のＥＲＫリン酸化の効力も改善された。また、このアッセイにおいて、相乗効果は、２ng/mL ｈＶＥＧＦという低い濃度でほぼ保持された。同様の効果が、他の種、例えば、カニクイザルでも得られた（データを示さず）。
実施例５０
ＶＥＧＦ結合によりＴｒｋＢ活性化が増強される－提案されたメカニズムの研究
図５０
ＴＰＰ－２２２１４とｈＶＥＧＦとの複合体を１×ダルベッコＰＢＳ中において、記載されたモル比（１：１、４：１又は２０：１）でサンプル同士を混合することにより調製した。サンプルを室温で１時間インキュベーションし、その後、分析した。Agilent 1200をmini DAWN（登録商標） TREOS（登録商標） compact SEC-MAL検出器及びOptilab（登録商標） T-REX検出器（Wyatt Technologies Corp）と繋げて使用した。サンプルを、移動相としての１×ダルベッコＰＢＳ中において、０．６ml/分の流量で流した。複合体又はＴＰＰ－２２２１４単独 １００μlをSuperose（登録商標） 6 Increaseカラム（３０cm×１０mm、Cytiva）に注入し、そこで、分子を流体力学的体積による分離に供した。ついで、データを、Astra（登録商標）ソフトウェアバージョン 6.1.1.17（Wyatt Technologies Corp）を使用して分析した。
結果
ＴＰＰ－２２２１４は、ＶＥＧＦ－Ａの存在下で複合体を形成する。最大の複合体は、１：１のモル比で形成される。これらの複合体は、DoppelmabとＶＥＧＦとの１：１の比を超える複合体形成を示唆している。これらのより大きな複合体は、細胞表面上のＴｒｋＢレセプターのクラスター形成をもたらす場合がある。実験データは、提案されたメカニズムを支持している。
実施例５１
上昇する濃度のＢＤＮＦ又はＴＰＰ－２２２１４及び１nM ＢＤＮＦの存在下での上昇する濃度のＴＰＰ－２２２１４によるヒトＴｒｋＢ内部移行の比較
図５１Ａ～図５１Ｃ
ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を（Ａ）上昇する濃度の天然のＴｒｋＢリガンドであるＢＤＮＦ、（Ｂ）上昇する濃度のＴＰＰ－２２２１４又は（Ｃ）上昇する濃度のＴＰＰ－２２２１４を伴う１nM ＢＤＮＦと共にインキュベーションした。ＴｒｋＢ内部移行を、細胞の透過化を伴わない表面ＴｒｋＢレセプターの免疫蛍光染色、続けて、共焦点顕微鏡分析により評価した。データは、閾値を上回る表面ＴｒｋＢ染色強度を有する細胞の割合を表わす；平均＋／－ＳＥＭ。
結果
（Ａ）ＢＤＮＦとのインキュベーションにより、ＴｒｋＢレセプター内部移行が誘発された。
（Ｂ）ＴＰＰ－２２２１４は、ＴｒｋＢレセプター内部移行を誘発しなかった。
（Ｃ）上昇する濃度のＴＰＰ－２２２１４により、ＢＤＮＦ誘発レセプター内部移行は減少し／消失した。
実施例５２
ＳＴＺ誘発糖尿病ラットにおけるＴＰＰ－２２２１４及びＣ２の神経保護効果
図５２
アゴニスト性ＴｒｋＢ抗体（Ｃ２）及びDoppelmab ＴＰＰ－２２２１４のＩＶＴ注射を使用した糖尿病誘発網膜神経変性のラットモデルにおけるＴｒｋＢ活性化の神経保護機能。動物をＳＴＺで処置して、高血糖を誘発した。網膜機能を処置の前後に、網膜電図（ＥＲＧ）により評価した。糖尿病誘発により、ＳＴＺ処置後３週間以内に暗示時間の遅延がもたらされた。この時点で、動物に、アイソタイプ対照抗体（抗ＴＮＰ）もしくはＣ２（それぞれ１９μg/５μL）又は等モル量のＴＰＰ－２２２１４（２５μg/５μL）を硝子体内投与した。桿体駆動Ｂ波暗示時間は、分子の硝子体内適用の直前及び２週間後に遅延することが示された；平均＋／－ＳＥＭ；ｎ．ｓ． ｐ＞０．０５；有意差なし（ｎ．ｓ．）、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１；テューキーの多重比較検定を使用した一元配置分散分析。
結果
投与の２週間後、抗ＴＮＰ抗体処置では、抗ＴＮＰ処置前の時点と比較して、糖尿病誘発桿体駆動ｂ波暗示時間は短縮しなかった。実際、暗示遅延時間は、抗ＴＮＰ抗体適用前の時点と比較して、有意に延長さえした（ｔ＝２週間で１７．１ms対ｔ＝０週間で１１．２ms；＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。これは、ＳＴＺ誘発網膜損傷がｔ＝０週で完全には確立されなかったこと及び抗ＴＮＰ処置が暗示時間遅延の更なる増加を止めることができなかったことを示す。
投与の２週間後、Ｃ２抗体処置により、暗示時間遅延の更なる増加が防止された。一方、Ｃ２抗体処置では、Ｃ２処置前の時点と比較して、糖尿病誘発桿体駆動ｂ波暗示時間は有意に短縮しなかった（ｔ＝２週間で１０．３ms対ｔ＝０週間で１２．８ms、ｎ．ｓ． ｐ＞０．０５；有意差なし）。
投与の２週間後、ＴＰＰ－２２２１４抗体処置により、ＴＰＰ－２２２１４処置前の時点と比較して、暗示時間遅延の更なる増加が防止され、糖尿病誘発桿体駆動ｂ波暗示時間は４０％超まで有意に短縮さえした（ｔ＝２週間で８．３ms対ｔ＝０週間で１４．２ms、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１）。
実施例５３
ジスルフィド架橋（ＣＣ）の有無でのDoppelmab及び親分子であるＴＰＰ－１４９４０／ＴＰＰ－１４９４１によるヒトＶＥＧＦ－Ａ捕捉の比較－ＶＥＧＦＲ２のＶＥＧＦ誘発リン酸化の阻害
図５３Ａ～図５３Ｂ
ＶＥＧＦ－Ａ捕捉を、Ｙ１１７５でのＶＥＧＦレセプター２（ＶＥＧＦＲ２）リン酸化を測定することにより評価した。分子処理を伴わない５０ng/ml ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。以下の表１４に、対応するベストフィットＩＣ５０値を報告する（非線形回帰；ｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ））。
Figure 2023546229000053
結果
親分子であるＴＰＰ－１４９４０／ＴＰＰ－１４９４１とジスルフィド架橋の有無での各Doppelmab変形形態との間に、有意差は無かった。ＶＥＧＦ誘発ＶＥＧＦＲ２リン酸化の阻害の効力及び有効性は、実質的に同一であった。
実施例５４
ＴＰＰ－２２２１４又はEYLEA（登録商標）（aflibercept）によるヒトＶＥＧＦ－Ａ捕捉の比較－Ｙ１１７５でのＶＥＧＦＲ２及びＥＲＫ１／２のＶＥＧＦ誘発リン酸化（両方ともＥＣ増殖に関連する）の阻害
図５４Ａ～図５４Ｂ
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度のＴＰＰ－２２２１４又はEYLEA（登録商標）（aflibercept）とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。ＶＥＧＦ－Ａ捕捉を、（Ａ）Ｙ１１７５でのＶＥＧＦレセプター２（ＶＥＧＦＲ２）リン酸化又は（Ｂ）Ｔ２０２／Ｙ２０４（ＥＲＫ１）及びＴ１８５／Ｙ１８７（ＥＲＫ２）でのＥＲＫ１／２リン酸化を測定することにより評価した。分子処理を伴わない５０ng/ml ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。以下の表１５に、対応するベストフィット値を報告する（非線形回帰（ｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ））。EYLEA（登録商標）（aflibercept）とＴＰＰ－２２２１４との間で有意に異なるベストフィット値（Ｐ＜０．０５）を太字で示す。Ｐ値も、表１５に報告する。
Figure 2023546229000054
結果
EYLEA（登録商標）（aflibercept）と比較して、ＴＰＰ－２２２１４は、Ｙ１１７５でのＶＥＧＦＲ２及びＥＲＫ１／２のＶＥＧＦ誘発リン酸化を完全に阻害した。また、ＴＰＰ－２２２１４のＶＥＧＦ捕捉における改善された有効性も、底部のプラトーの値の大きな有意差に見ることができる（表１５を参照のこと）。最後に、ＴＰＰ－２２２１４は、EYLEA（登録商標）（aflibercept）よりＶＥＧＦ捕捉において有意により強力であった。
実施例５５
ＴＰＰ－２２２０４、ＴＰＰ－２２２１４又はＴＰＰ－２２２１６とEYLEA（登録商標）（aflibercept）とによるヒトＶＥＧＦ－Ａ捕捉の比較－ＨＲＭＥＣのＶＥＧＦ誘発増殖の阻害
図５５Ａ～図５５Ｅ
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度の示された結合分子：（Ａ）ＴＰＰＰ－２２２０４、（Ｂ）ＴＰＰ－２２２１４、（Ｃ）ＴＰＰ－２２２１６又は（Ｄ）EYLEA（登録商標）（aflibercept）とのプレインキュベーションの有無で、１０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。ＶＥＧＦ－Ａ捕捉を、ＨＲＭＥＣ細胞数の自動化された画像ベースの定量化により評価した（IncuCyte）。画像を合計８４時間にわたって４時間毎に記録した。相対細胞数を示す。ｔ＝０での細胞数を１に設定した。非刺激細胞を対照（ベース）とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。（Ｅ）EYLEA（登録商標）（aflibercept）又はＴＰＰ－２２２１４の濃度に対する増殖曲線下面積とベース曲線下面積との差のプロット。以下の表１６に、対応するベストフィット値を報告する（非線形回帰（ｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ））。EYLEA（登録商標）（aflibercept）とＴＰＰ－２２２１４との間で有意に異なるベストフィット値（Ｐ＜０．０５）を太字で示す。Ｐ値も、表１６に報告する。
Figure 2023546229000055
結果
DoppelmabによるＶＥＧＦ誘発増殖の阻害の効力及び有効性は、EYLEA（登録商標）（aflibercept）より明らかに優れていた（ＴＰＰ－２２２１４とEYLEA（登録商標）（aflibercept）との間のＬｏｇＩＣ５０及び底部のプラトーの数値における大きな有意差）。
最高濃度（１６ nm）でさえ、EYLEA（登録商標）（aflibercept）は、ＶＥＧＦ誘発発芽を完全には阻害することができなかった。対照的に、全てのDoppelmabは、０．２５nMという６４倍低い濃度で既に、ＶＥＧＦ誘発増殖を完全に阻害する。
実施例５６
ＴＰＰ－２２２１４又はEYLEA（登録商標）（aflibercept）によるヒトＶＥＧＦ－Ａ捕捉の比較－Ｙ１２１４でのＶＥＧＦＲ２及びｐ３８－ＭＡＰＫのＶＥＧＦ誘発リン酸化の阻害
図５６Ａ～図５６Ｂ
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度のＴＰＰ－２２２１４又はEYLEA（登録商標）（aflibercept）とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。ＶＥＧＦ－Ａ捕捉を、（Ａ）Ｙ１２１４でのＶＥＧＦレセプター２（ＶＥＧＦＲ２）リン酸化又は（Ｂ）Ｔ１８０／Ｙ１８２でのｐ３８－ＭＡＰＫリン酸化を測定することにより評価した。分子処理を伴わない５０ng/ml ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。以下の表１７に、対応するベストフィットＩＣ５０値（非線形回帰；（ｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ））を報告する。EYLEA（登録商標）（aflibercept）とＴＰＰ－２２２１４との間で有意に異なるベストフィット値（Ｐ＜０．０５）を太字で示す。Ｐ値も、表１７に報告する。
Figure 2023546229000056
結果
EYLEA（登録商標）（aflibercept）とは非常に対照的に、ＴＰＰ－２２２１４は、Ｙ１２１４でのＶＥＧＦＲ２及びｐ３８－ＭＡＰＫのＶＥＧＦ誘発リン酸化を完全に阻害した。ＴＰＰ－２２２１４のより有効なＶＥＧＦ捕捉は、表１７における底部のプラトーの値の大きな有意差に見ることができる。さらに、ＴＰＰ－２２２１４によるＶＥＧＦ捕捉の効力がEYLEA（登録商標）（aflibercept）の効力より良好であるという傾向が観察された。
実施例５７
ＴＰＰ－２２２０４、ＴＰＰ－２２２１４、ＴＰＰ－２２２１５又はＴＰＰ－２２２１６とEYLEA（登録商標）（aflibercept）とによるヒトＶＥＧＦ－Ａ捕捉の比較－ＶＥＧＦ誘発ＨＲＭＥＣ発芽の阻害
図５７Ａ～図５７Ｂ
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）のスフェロイドをコラーゲンマトリックス中に包埋した。内皮の発芽を２．５nM ＴＰＰ－２２２０４、ＴＰＰ－２２２１４、ＴＰＰ－２２２１５もしくはＴＰＰ－２２２１６又は５nM EYLEA（登録商標）（aflibercept）とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦとのインキュベーションにより２４時間誘発した。（Ａ）内皮の発芽を共焦点顕微鏡により評価し、Ｚスタックの最大投影から得られたスフェロイド外周を示した。非刺激細胞を対照（ベース）とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。ｎ．ｓ． ｐ＞０．０５ 有意差なし、＊＊＊＊ｐ＜０．０００１。（Ｂ）ベース条件下又は２．５nM ＴＰＰ－２２２１４もしくは５nM EYLEA（登録商標）（aflibercept）とのプレインキュベーションの有無での５０ng/mL ヒトＶＥＧＦにより刺激後の２４時間の発芽後のスフェロイドからの代表的な最大投影画像を示す。バー＝１００μm。
結果
Ｙ１２１４ ＶＥＧＦＲ２リン酸化アッセイと同様に、Doppelmabは、ＶＥＧＦ誘発ＨＲＭＥＣ発芽の阻害において、常に有効であった。さらに、Doppelmabは、ＶＥＧＦ誘発内皮細胞発芽を完全に阻害することが可能であった。注目すべきことに、EYLEA（登録商標）（aflibercept）をDoppelmabと比較して２倍の分子濃度で使用したが、依然として、細胞発芽を完全には阻害することができなかった。
実施例５８
ＴＰＰ－２２２１４又はEYLEA（登録商標）（aflibercept）によるヒトＶＥＧＦ－Ａ捕捉の比較－Ｙ９５１でのＶＥＧＦＲ２及びＳｒｃのＶＥＧＦ誘発リン酸化の阻害
図５８Ａ～図５８Ｂ
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度のＴＰＰ－２２２１４又はEYLEA（登録商標）（aflibercept）とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。ＶＥＧＦ－Ａ捕捉を、（Ａ）Ｙ９５１でのＶＥＧＦレセプター２（ＶＥＧＦＲ２）リン酸化又は（Ｂ）Ｙ４１９でのＳｒｃリン酸化を測定することにより評価した。抗体処理を伴わない５０ng/ml ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。以下の表１８に、対応するベストフィット値を報告する（非線形回帰；（ｌｏｇ（アゴニスト）対応答（３つのパラメータ））。EYLEA（登録商標）（aflibercept）とＴＰＰ－２２２１４との間で有意に異なるベストフィット値（Ｐ＜０．０５）を太字で示す。Ｐ値も、表１８に報告する。
Figure 2023546229000057
結果
EYLEA（登録商標）（aflibercept）とは非常に対照的に、ＴＰＰ－２２２１４は、Ｙ９５１でのＶＥＧＦＲ２及びＹ４１９でのＳｒｃのＶＥＧＦ誘発リン酸化を完全に阻害した。ＴＰＰ－２２２１４のより有効なＶＥＧＦ－捕捉は、底部のプラトーの値の大きな有意差に見ることができる（表１８）。
実施例５９
Doppelmab ＴＰＰ－２２２１４及びEYLEA（登録商標）（aflibercept）によるヒトＶＥＧＦ－Ａ捕捉の比較－Brown NorwayラットにおけるヒトＶＥＧＦ－Ａ誘発網膜透過性亢進の阻害
図５９Ａ～図５９Ｂ
ＴＰＰ－２２２１４により、ラット網膜におけるヒトＶＥＧＦ－Ａ誘発透過性亢進が防止された。（Ａ）実験手法を示す時間プロトコール。抗ＶＥＧＦ化合物（１３又は２６pmol/眼 EYLEA（登録商標）（aflibercept）又はＴＰＰ－１４９４０）又は対照（２６pmol ＴＰＰ－１１７３７）の硝子体内（ｉｖｔ）投与の１５分後、１３pmol/眼 ヒトＶＥＧＦ－Ａをｉｖｔ注射により投与した。ＰＢＳ注射を対照とした。２４時間後、１mL/kg エバンスブルー（ＥＢ）溶液（０．９％ 生理食塩水中の４５mg/mL）を静脈内（ｉｖ）注射により３０分間投与し、その後、眼を単離し、固定した。同じ時点で、血漿サンプルを収集し、全身ＥＢ曝露量が等しいことを確認した。（Ｂ）Brown Norwayラットの網膜におけるＶＥＧＦ－Ａ誘発透過性亢進の定量を、共焦点顕微鏡により網膜フラットマウントにおけるＥＢ血管外漏出を測定することにより行った。眼を鋸状縁に沿って切断し、水晶体及び硝子体を除去し、眼杯をパラホルムアルデヒド（４％）中において、４℃で１時間固定し、ついで、４℃で一晩ＰＢＳに移した。網膜を外側セグメント（強膜及び脈絡膜）から分離し、スライドガラスに移し、４回切断して、平坦なクローバー葉様構造を達成した。組織をマウンティング媒体（ＤＮＡ染色ＤＡＰＩを含有するVectashield（登録商標） H-1200 antifade mounting media）で覆い、カバースリップを上に置き、網膜フラットマウントを得た。サンプルを６３９nmの波長で励起し、６６９nmでのエバンスブルーの発光をLSM 700共焦点レーザー走査顕微鏡（Carl Zeiss, Jena；ゲイン８００、レーザー強度２％、５スタック ６０μm）で記録し、最大強度投影を有する網膜フラットマウントの画像を得た。蛍光強度の合計の分析を３０の閾値でプログラムImageJ中において画像を開いた後に行った。＊＊＊ｐ＜０．００１；＊ｐ＜０．０５；ｎ．ｓ． ｐ＞０．０５。テューキーの多重比較検定を使用した一元配置分散分析。ｎ＝９～１７。６７：１のモル比のEYLEA（登録商標）（aflibercept）と共にインキュベーション。ＶＥＧＦを比較のために示す。
結果
対象条件下において、硝子体内ＶＥＧＦ－Ａ注射により、血管透過性が約６０％向上した。注：ＴＰＰ－１１７３７を対照分子として使用した。ＴＰＰ－２２２１４と同じ分子フォーマット（Doppelmab）を有したが、初期のｉｎ ｖｉｔｒｏアッセイにおいて、ＶＥＧＦを捕捉しなかったためである（上記を参照のこと）。
結合分子対ＶＥＧＦの１：１の分子比で、ＴＰＰ－２２２１４は血管透過性亢進を完全に遮断した。一方、はっきりと対照的に、EYLEA（登録商標）（aflibercept）は、同じ条件下でかつ２倍の濃度でさえも、血管漏出を顕著に減少させることができなかった。６７：１の非常に高い分子比でのみ、EYLEA（登録商標）（aflibercept）により、ヒトＶＥＧＦ誘発血管漏出を阻害することが可能であった。
実施例６０
ＴＰＰ－２２２１４によるＶＥＧＦ捕捉に対するＴｒｋＢ結合の影響－ＴｒｋＢ細胞外ドメインの存在下又は非存在下でのＴＰＰ－２２２１４によるヒトＶＥＧＦ－Ａ捕捉の比較
図６０Ａ～図６０Ｂ
（Ａ）ＴｋｒＢ細胞外ドメイン（ＴｒｋＢ－ＥＣＤ）の機能的特徴。ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を上昇する濃度の天然のリガンドであるＢＤＮＦ又は上昇する濃度のＴｒｋＢ－ＥＣＤを伴う１０nM ＢＤＮＦと共にインキュベーションした。ＴｒｋＢ活性化を、Ｙ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化を測定することにより評価した。最低化合物濃度を溶媒単独とする。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
（Ｂ）ＴＰＰ－２２２１４のＴｒｋＢ－ＥＣＤ結合がＶＥＧＦ誘発ＶＥＧＦＲ２リン酸化の阻害に及ぼす影響。ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦ、上昇する濃度のＴＰＰ－２２２１４を伴う５０ng/mL ヒトＶＥＧＦ又は上昇する濃度のＴＰＰ－２２２１４及び１００nM ＴｒｋＢ－ＥＣＤを伴う５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。５０ng/mL ＶＥＧＦの有無での上昇する濃度のＴｒｋＢ－ＥＣＤとのＨＲＭＥＣインキュベーション及び非刺激細胞（ベース）を対照とした。ＶＥＧＦ－Ａの捕捉を、Ｙ１１７５でのＶＥＧＦレセプター２（ＶＥＧＦＲ２）リン酸化を測定することにより評価した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
図（Ａ）：ＢＤＮＦを上昇する濃度のＴｒｋＢ－ＥＣＤと共にプレインキュベーションすると、ＴｒｋＢレセプターの活性化が劇的に低下した。これは、ＢＤＮＦに結合し、これを捕捉することが可能であることを示した。これは、機能的ＴｒｋＢ－ＥＣＤから期待されたことである。
図（Ｂ）：ＴＰＰ－２２２１４によるＶＥＧＦ捕捉は、ＴｒｋＢ－ＥＣＤの有無とは無関係であった。両曲線は、ほぼ同一であった。これは、ＴＰＰ－２２２１４のＴｒｋＢ結合自体がDoppelmabのＶＥＧＦ捕捉を制限しなかったことを示した。これは、DoppelmabがＴｒｋＢレセプターを同時に活性化し、ＶＥＧＦを捕捉することができることを示唆している。
実施例６１
ＣＭＣ特性を改善するための操作の取り組み
シリーズ３～シリーズ４
シリーズ３及びシリーズ４からの分子の生物物理学的特性を評価した。分子の製造中、プロテインＡがモノマーの割合により測定された後の品質を、分析用サイズ排除クロマトグラフィーを使用して試験した。さらに、各分子の熱安定性及び凝集開始を１０mM ヒスチジンｐＨ６．０中で評価した。熱安定性を、Sypro-orange色素を使用して温度によるタンパク質のアンフォールディングを測定する熱シフトアッセイを使用して測定した。各Ｔｍを温度にわたる蛍光シグナルの一次導関数のピーク最大値として計算した。凝集開始を、動的光散乱を使用して測定し、流体力学的半径を温度の関数として測定した。最後に、種々のDoppelmabの保存安定性を、４０℃又は５℃のいずれかで、２週間後の凝集を測定することにより試験した。凝集を、分析用サイズ排除クロマトグラフィーを使用して測定した。
分子モデリングを使用して、RanibizumabのＦｖ部分のｐＩを潜在的に上昇させることができ、したがって、その立体配座安定性に影響を及ぼすことなく、その溶解度を潜在的に改善することができる単一の点突然変異を特定した。この計算設計演習は、３つのフレームワーク突然変異、すなわち、ＶＨ Ｅ１→Ｑ、ＶＨ Ｅ６→Ｑ及びＶＬ Ｄ７０Ｇを示唆する。ここで、ＶＨ及びＶＬはそれぞれ、Ranibizumab Ｆｖにおける重鎖及び軽鎖の可変部分を指す。重鎖における突然変異であるＶＨ Ｅ１→Ｑ及びＶＨ Ｅ６→Ｑは、これらの位置でのヒト生殖系列残基に対応する。軽鎖における突然変異であるＶＬ Ｄ７０→Ｇは、Ranibizumab Ｆｖの負に帯電したパッチに曝露された溶媒を破壊すると予想される。
操作の取り組みにより、Doppelmabの全体的な生物物理学的特性が向上し、分子全体についての改善されたＣＭＣ特性に変換された。プロテインＡ後のモノマーの割合の向上が、試験されたほとんどの分子について見られた。これにより、分子の全体的な製造可能性が改善される。Ｔｍ１及びＴａｇｇに見られる改良により、操作が分子の立体配座及びコロイド安定性を改善したことが示される。これにより、４０℃及び５℃の両方において、より良好な安定性プロファイルがさらにもたらされる。
Figure 2023546229000058
実施例６２
ＴＰＰ－２２２１４の硝子体半減期の測定
ニュージーランド白色メスのウサギに、ＴＰＰ－２２２１４又はBevacizumabの両側硝子体内投与を受けさせた。硝子体サンプルを種々の時点で収集し、ＴＰＰ－２２２１４又はBevacizumabについての濃度をELISAにより測定した。動物に、硝子体内投与前及び硝子体内投与後の定期的な間隔で検査を受けさせた。
Figure 2023546229000059
表２０に、ＴＰＰ－２２２１４及びBevacizumabの実験的に決定された硝子体半減期の結果を示し、社内で実験的に決定された値を、Bevacizumab、Ranibizumab及びAfliberceptの公知の文献値と比較する。Bevacizumabの報告された半減期は、適用された方法の正確性及びデータセットの比較可能性を確認する、社内／実験的に導出された値と同一である。ＴＰＰ－２２２１４は、ウサギにおいて、例えば、Bevacizumabと比較して約５０％高いｉｎ ｖｉｖｏ半減期を有することが示された（６．７日対４．３日）。
Figure 2023546229000060
表２１に、滲出加齢黄斑変性症（ｗＡＭＤ）患者における眼のＶＥＧＦ濃度の文献値を報告する。
Figure 2023546229000061
表２１に示された値に基づいて、Bevacizumabのヒト硝子体内半減期（ｔ１／２）（９．７日；Hutton-Smith, L., Mol. Pharmaceutics, 2016, 13, 2941-2950）を使用することによってのみ、ＴＰＰ－２２２１４のヒト投与頻度の保存的推定を計算した（表２１）。２mg/眼の用量では、４か月の投与間隔が妥当である。
実施例６３
ＢＤＮＦ、ＴＰＰ－６８３０並びに２つのDoppelmab ＴＰＰ－２３４５７及びＴＰＰ－２３４５９によるヒトＴｒｋＢ活性化の比較
図６１Ａ～図６１Ｂ
ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を上昇する濃度の天然のＴｒｋＢリガンドであるＢＤＮＦ、ＴＰＰ－６８３０（更なるモノクローナルＴｒｋＢ抗体）又は２つのDoppelmab ＴＰＰ－２３４５７（ｓｃＦｖとしてのＴＰＰ－６３８０、１０Ｌ１、ＶＨ－ＶＬ；ＦａｂとしてのRanibizumab）及びＴＰＰ－２３４５９（ｓｃＦｖとしてのＴＰＰ６３８０、１０Ｌ１、ＶＬ－ＶＨ；ＦａｂとしてのRanibizumab）と共にインキュベーションした。
ここで、新規なDoppelmab分子は、Ｃ２ ＴｒｋＢバインダーに基づくDoppelmabで観察された効果が異なるＴｒｋＢバインダーでも再現することができるかどうかを評価するために、異なるＴｒｋＢバインダー（ＴＰＰ－６８３０）に基づいていた。
結果
再度、ＴＰＰ－６８３０（元のＴｒｋＢ抗体は、部分的ＴｒｋＢレセプターアゴニストである）とは非常に対照的に、２つの新規なDoppelmab ＴＰＰ－２３４５７及びＴＰＰ－２３４５９ Doppelmabは、ここでは、完全なＴｒｋＢレセプターアゴニスト活性を示した。これらのDoppelmabによるＴｒｋＢ活性化は、天然のリガンドであるＢＤＮＦと少なくとも同じ効果があった。
これは、結合分子の立体形成が特定のＴｒｋＢバインダーとは無関係に、観察された有効性の向上を担う場合があるという理論をさらに支持している。
実施例６４
ヒトＶＥＧＦの存在下又は非存在下でのＴＰＰ－６８３０（ＴｒｋＢモノクローナル抗体）並びに２つのDoppelmab ＴＰＰ－２３４５７及びＴＰＰ－２３４５９によるヒトＴｒｋＢ活性化（ＴｒｋＢリン酸化）の比較
図６２Ａ～図６２Ｃ
ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を２００ng/mL ヒトＶＥＧＦ－Ａ（ｈＶＥＧＦ）とのプレインキュベーションの有無で、上昇する濃度のDoppelmab（Ａ）ＴＰＰ－２３４５７、（Ｂ）ＴＰＰ－２３４５９又は（Ｃ）ＴＰＰ－６８３０と共にインキュベーションした。ＴｒｋＢ活性化を、Ｙ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化を測定することにより評価した。最低化合物濃度を溶媒単独とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
再度、ヒトＶＥＧＦとのプレインキュベーションにより、ＴＰＰ－２３４５７（ｓｃＦｖとしてのＴＰＰ－６８３０、１０Ｌ１、ＶＨ－ＶＬ；ＦａｂとしてのRanibizumab）及びＴＰＰ－２３４５９（ｓｃＦｖとしてのＴＰＰ－６３８０、１０Ｌ１、ＶＬ－ＶＨ；ＦａｂとしてのRanibizumab）によるＴｒｋＢリン酸化（ＴｒｋＢ活性化）の効力が、劇的に改善された。
ＶＥＧＦプレインキュベーションは、ＴＰＰ－６８３０（対照）によるＴｒｋＢリン酸化（ＴｒｋＢ活性化）の効力に影響を及ぼさなかった。
これは、観察された効力の向上が特定のＴｒｋＢバインダーとは無関係であるという理論をさらに支持している。
実施例６５
ヒトＶＥＧＦの存在下又は非存在下でのＴＰＰ－６８３０（ＴｒｋＢモノクローナル抗体）並びに２つのDoppelmab ＴＰＰ－２３４５７及びＴＰＰ－２３４５９によるヒトＴｒｋＢ活性化（ＥＲＫリン酸化）の比較
図６３Ａ～図６３Ｃ
ヒトＴｒｋＢを安定に発現するＣＨＯ細胞を２００ng/mL ヒトＶＥＧＦ－Ａ（ｈＶＥＧＦ）とのプレインキュベーションの有無で、上昇する濃度のDoppelmab（Ａ）ＴＰＰ－２３４５７、（Ｂ）ＴＰＰ－２３４５９又は（Ｃ）ＴＰＰ－６８３０と共にインキュベーションした。ＴｒｋＢ活性化を、ＴｒｋＢの下流であるＴ２０２／Ｙ２０４（ＥＲＫ１）及びＴ１８５／Ｙ１８７（ＥＲＫ２）でのＥＲＫ１／２リン酸化を測定することにより評価した。最低化合物濃度を溶媒単独とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
ここでも、ヒトＶＥＧＦとのプレインキュベーションにより、ＴＰＰ－２３４５７（ｓｃＦｖとしてのＴＰＰ－６８３０、１０Ｌ１、ＶＨ－ＶＬ；ＦａｂとしてのRanibizumab）及びＴＰＰ－２３４５９（ｓｃＦｖとしてのＴＰＰ－６３８０、１０Ｌ１、ＶＬ－ＶＨ；ＦａｂとしてのRanibizumab）によるＥＲＫ１／２リン酸化（ＴｒｋＢ活性化）の効力が、劇的に改善された。
先に示されたように、ＶＥＧＦプレインキュベーションは、ＴＰＰ－６８３０（対照）によるＥＲＫ１／２リン酸化（ＴｒｋＢ活性化）の効力に影響を及ぼさなかった。これは、観察された効力の向上が特定のＴｒｋＢバインダーとは無関係であるという理論をさらに支持している。
実施例６６
ＢＤＮＦ誘発ＴｒｋＢ活性化（ＴｒｋＢリン酸化）に対するＴＰＰ－２３４５７の影響
図６４Ａ～図６４Ｂ
ヒトＴｒｋＢレセプターを安定に発現するＣＨＯ細胞を一定濃度の０．３nM、１nM又は３nM ＢＤＮＦの有無で、上昇する濃度の（Ａ）Ｃ２抗体又は（Ｂ）Doppelmab ＴＰＰ－２３４５７と共にインキュベーションした。ＴｒｋＢの活性化を、Ｙ７０６／７０７でのレセプターリン酸化を測定することにより評価した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
Ｃ２とは非常に対照的に、ＴＰＰ－２３４５７は、ＢＤＮＦ誘導ＴｒｋＢ活性化を制限しなかった。
実施例６７
ＢＤＮＦ誘発ＴｒｋＢ活性化（Ｅｒｋリン酸化）に対するＴＰＰ－２３４５７の影響
図６５Ａ～図６５Ｂ
ヒトＴｒｋＢレセプターを安定に発現するＣＨＯ細胞を一定濃度の０．３nM、１nM又は３nM ＢＤＮＦの有無で、上昇する濃度の（Ａ）Ｃ２抗体又は（Ｂ）Doppelmab ＴＰＰ－２３４５７と共にインキュベーションした。ＴｒｋＢの活性化を、ＴｒｋＢの下流であるＴ２０２／Ｙ２０４（ＥＲＫ１）及びＴ１８５／Ｙ１８７（ＥＲＫ２）でのＥＲＫ１／２リン酸化を測定することにより評価した。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
Ｃ２とは非常に対照的に、ＴＰＰ－２３４５７は、ＴｒｋＢの下流であるＢＤＮＦ誘発Ｅｒｋリン酸化を制限しなかった。
実施例６８
Ｙ１１７５でのＶＥＧＦＲ２及びＥＲＫ１／２のＶＥＧＦ誘発リン酸化（両方ともＥＣ増殖に関連する）のＴＰＰ－２２２１４、ＴＰＰ－２３４５７又はＴＰＰ－２３４５９の阻害によるヒトＶＥＧＦ－Ａ捕捉の比較
図６６Ａ～図６６Ｂ
ヒト網膜微小血管内皮細胞（ＨＲＭＥＣ）を飢餓状態にし、ついで、上昇する濃度のＴＰＰ－２２２１４、ＴＰＰ－２３４５７又はＴＰＰ２３４５９とのプレインキュベーションの有無で、５０ng/mL ヒトＶＥＧＦと共にインキュベーションした。ＶＥＧＦ－Ａ捕捉を、（Ａ）Ｙ１１７５でのＶＥＧＦレセプター２（ＶＥＧＦＲ２）リン酸化又は（Ｂ）Ｔ２０２／Ｙ２０４（ＥＲＫ１）及びＴ１８５／Ｙ１８７（ＥＲＫ２）でのＥＲＫ１／２リン酸化を測定することにより評価した。分子処理を伴わない５０ng/ml ヒトＶＥＧＦを対照とした。データは、平均＋／－ＳＥＭを表わす。
結果
Doppelmab ＴＰＰ－２３４５７及びＴＰＰ－２３４５９のＶＥＧＦ捕捉は、ＴＰＰ－２２２１５と実質的に同一であった。
予想どおり、種々のＴｒｋＢ ｓｃＦｖバインダー（ＴＰＰ－６８３０及びＣ２ではない）に基づくDoppelmbabも、ＦａｂのＶＥＧＦ捕捉機能に影響を及ぼさなかった。
実施例６９
ナイーブなファージディスプレイ又はファージに対するＢ細胞により特定され、ＩｇＧ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ又はＦｃ－ｓｃＦｖのいずれかとしてフォーマット化された種々のＴｒｋＢバインダーの比較
図６７Ａ～図６７Ｃ及び図６８Ａ～図６８Ｃ
合計３９個のＴｒｋＢバインダーをナイーブなファージディスプレイ（２７ヒット）又はファージに対するＢ細胞（１２ヒット）により特定した。これらのうち、選択された分子を、ＴｒｋＢバインダーの効力及び有効性に対する分子フォーマットの効果を分析するために、ＩｇＧ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ又はＦｃ－ｓｃＦｖのいずれかとして発現させた。
この目的で、各ヒット及び３つの分子フォーマットそれぞれについての効力（ＥＣ５０）及び有効性を、上昇する濃度の分子とのインキュベーション後に、ヒトＴｒｋＢレセプターを安定に発現するＣＨＯ細胞におけるＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）を測定することにより決定した。ＢＤＮＦ処理細胞も同様に測定し、ＢＤＮＦの有効性を対照として１００％に設定した。
図６７／図６８Ａ～Ｃに、分子の効力又は有効性のペアワイズ直線化（均等線を伴う散布図）を示す。効力をＥＣ５０として表わし、各分子の有効性を天然のリガンドであるＢＤＮＦと比較した割合として表わす（一方、ＢＤＮＦを１００％に設定する）。図（Ａ）では、各ヒットについてのｓｃＦｖ－ＦｃのＥＣ５０／有効性（ｙ軸）に対するＩｇＧのＥＣ５０／有効性（ｘ軸）を比較する。図（Ｂ）では、各ヒットについてのＦｃ－ｓｃＦｖのＥＣ５０／有効性（ｙ軸）に対するＩｇＧのＥＣ５０／有効性（ｘ軸）を比較する。図（Ｃ）では、各ヒットについてのＦｃ－ｓｃＦｖのＥＣ５０／有効性（ｙ軸）に対するｓｃＦｖ－ＦｃのＥＣ５０／有効性（ｘ軸）を比較する。
結果の解釈
ペアワイズ直線化におけるヒットが、均等線の直上にある場合、これは、それらの分子フォーマット間のＥＣ５０又は有効性に差がないと解釈されるべきである。線の上又は線の下のいずれかにそれぞれシフトするヒットは、分子フォーマットに基づくＥＣ５０又は有効性の変化を示す。異なる分子フォーマットを比較すると、明確な傾向を観察することができる。
ＥＣ５０：ＩｇＧ～ｓｃＦｖ－Ｆｃ＜＜Ｆｃ－ｓｃＦｖ
有効性：ＩｇＧ＜＜ｓｃＦｖ－Ｆｃ～Ｆｃ－ｓｃＦｖ
実施例７０
ナイーブなファージディスプレイ又はファージに対するＢ細胞により特定され、ＩｇＧ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ又はＦｃ－ｓｃＦｖのいずれかとしてフォーマット化された種々のＴｒｋＢバインダーの比較
図６９Ａ～図６９Ｈ
ナイーブなファージディスプレイにより又はファージに対するＢ細胞により特定された選択ヒットをＩｇＧ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ又はＦｃ－ｓｃＦｖのいずれかとしてフォーマットした。各ヒット及び３つの分子フォーマットのそれぞれについての有効性を、上昇する濃度の分子とのインキュベーション後に、ヒトＴｒｋＢレセプターを安定に発現するＣＨＯ細胞におけるＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）を測定することにより決定した。ＢＤＮＦ処理細胞も同様に測定し、ＢＤＮＦの有効性を対照として１．０に設定した。分子濃度をｘ軸にプロットし、ｙ軸は、ＢＤＮＦに対するＴｒｋＢリン酸化を示す。図Ａ～Ｈに、合計８つの選択されたヒットを示し、各ヒットについて、３つの異なるフォーマットＩｇＧ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ及びＦｃ－ｓｃＦｖを直接比較して示す。
結果の解釈
図６７／図６８Ａ～Ｃと一致して、データは、ｓｃＦｖ－Ｆｃ又はＦｃ－ｓｃＦｖのいずれかとしてフォーマット化されたＴｒｋＢバインダーがＩｇＧとしてフォーマット化された同じバインダーと比較して実質的に高いＴｒｋＢリン酸化の比較可能な有効性を示す明確な傾向を示す。有効性：ＩｇＧ＜＜ｓｃＦｖ－Ｆｃ～Ｆｃ－ｓｃＦｖ。さらに、データは、ＩｇＧ又はｓｃＦｖ－Ｆｃとしてフォーマット化されたＴｒｋＢバインダーがＦｃ－ｓｃＦｖとしてフォーマット化された同じバインダーのＥＣ５０値より実質的に低い比較可能なＥＣ５０値でＴｒｋＢリン酸化を誘発する明確な傾向を示す。ＥＣ５０：ＩｇＧ～ｓｃＦｖ－Ｆｃ＜＜Ｆｃ－ｓｃＦｖ。

実施例７１：ＩｇＧ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ又はペプチドリンカーを介して互いに連結された２つのｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ－リンカー－ｓｃＦｖ）のいずれかとしてフォーマット化されたＴｒｋＢバインダーの比較
図７１
選択されたＴｒｋＢバインダーを、ＩｇＧ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ又は２つの異なるペプチドリンカーを介して互いに連結された２つのｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ－リンカー１－ｓｃＦｖ及びｓｃＦｖ－リンカー２－ｓｃＦｖ）のいずれかとしてフォーマットした。得られた分子を、上昇する濃度の分子とのインキュベーション後に、ヒトＴｒｋＢレセプターを安定に発現するＣＨＯ細胞におけるＴｒｋＢリン酸化（Ｙ７０６／７０７）を測定することにより、ＴｒｋＢを活性化するその能力について試験した。ＢＤＮＦ処理細胞も同様に測定し、参照とした。分子濃度をｘ軸にプロットし、ｙ軸は、ＴｒｋＢリン酸化を示す。最低化合物濃度を溶媒単独とした。データは、平均±ＳＥＭを表わす。
結果の解釈
先の結果と一致して、ｓｃＦｖ－Ｆｃにフォーマット化されたＴｒｋＢバインダーによるＴｒｋＢリン酸化の有効性は、対応するＩｇＧの有効性よりも実質的に高い。重要なことに、２つの異なるペプチドリンカーを介して互いに連結された２つのｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ－リンカー１－ｓｃＦｖ及びｓｃＦｖ－リンカー２－ｓｃＦｖ）としてフォーマット化されたＴｒｋＢバインダーによるＴｒｋＢリン酸化の有効性は、ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットの有効性と同等であり、このため、ＩｇＧより実質的に高かった。これは、ｓｃＦｖによるＴｒｋＢリン酸化の有効性の向上を、ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットに限定されず、異なるペプチドリンカーを使用して２つのｓｃＦｖを連結させることによっても達成することができることを実証する。
実施例７２
異なるＴｒｋＢバインダーフォーマットＩｇＧ対ｓｃＦｖ－Ｆｖ及びｓｃＦｖ－ヒンジ－ｓｃＦｖの比較
図７２
選択されたＴｒｋＢバインダーを、ＩｇＧ又はｓｃＦｖ－Ｆｃのいずれかとしてフォーマットした。加えて、ｓｃＦｖ－Ｆｃを、Ｆｃ部分を除去するためにヒンジの下でシステインプロテアーゼFabRICATOR（登録商標）酵素（Genovis）により開裂させて、ヒンジ領域を介して互いに連結された２つのｓｃＦｖ（ｓｃＦｖ－ヒンジ－ｓｃＦｖ）を生成した。３つ全ての分子を、Ｙ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化を誘発するそれらの能力について試験した。
結果の解釈
先の結果と一致して、ｓｃＦｖ－Ｆｃにフォーマット化されたＴｒｋＢバインダーによるＴｒｋＢリン酸化の有効性は、対応するＩｇＧの有効性より実質的に高い。重要なことに、開裂されたｓｃＦｖ－Ｆｃ（ｓｃＦｖ－ヒンジ－ｓｃＦｖ）により誘発されるＴｒｋＢリン酸化の有効性は、ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットの有効性と同等であり、このため、対応するＩｇＧより実質的に高かった。これは、ｓｃＦｖによるＴｒｋＢリン酸化の有効性の向上を、ｓｃＦｖ－Ｆｃフォーマットに限定されず、Ｆｃフラグメントの非存在下で、ヒンジを使用して２つのｓｃＦｖを連結させることによっても達成することができることを実証する。

Claims (45)

  1. ２つのｓｃＦｖを含むか又はそれらからなり、
    ここで、各ｓｃＦｖは、ＴｒｋＢに特異的に結合する、
    ＴｒｋＢ結合分子。
  2. ｓｃＦｖ同士が、ヒンジ領域又はリンカーを介して連結している、請求項１記載のＴｒｋＢ結合分子。
  3. ＴｒｋＢ結合分子が、Ｆｃ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、（ｓｃＦｖ’）２又はｓｃＦｖ－ＣＨ３のフォーマットにある、請求項１記載のＴｒｋＢ結合分子。
  4. Ｉｇ分子をさらに含む、請求項１記載のＴｒｋＢ結合分子。
  5. Ｉｇ分子が、モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラ抗体、抗体のフラグメント、例えば、Ｆｃ、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’もしくはＦ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体、例えば、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、小モデュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、ドメイン抗体、ナノボディ又はダイアボディである、請求項４記載のＴｒｋＢ結合分子。
  6. 各ｓｃＦｖが、Ｉｇ分子の重鎖のＣ末端に融合している、請求項４又は５記載のＴｒｋＢ結合分子。
  7. 各ｓｃＦｖが、Ｉｇ分子の重鎖のＮ末端に融合している、請求項４又は５記載のＴｒｋＢ結合分子。
  8. Ｉｇ分子が、ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ）又はＦ（ａｂ’）２である、請求項４記載のＴｒｋＢ結合分子。
  9. Ｉｇ分子が、Ｆｃ領域を含むか又はそれからなる、請求項４記載のＴｒｋＢ結合分子。
  10. 各ｓｃＦｖが、ペプチドリンカー、好ましくは、約４～２０個のアミノ酸の長さを有するペプチドリンカーによりＩｇ分子に融合している、請求項４記載のＴｒｋＢ結合分子。
  11. ２つのｓｃＦｖが、同じエピトープに結合するか又は異なるエピトープに結合する、請求項１～１０のいずれか一項記載のＴｒｋＢ結合分子。
  12. ２つのｓｃＦｖがそれぞれ、ＴｒｋＢアゴニスト、好ましくは、部分的アゴニストである、請求項１～１１のいずれか一項記載のＴｒｋＢ結合分子。
  13. ＴｒｋＢ結合分子が、ＴｒｋＢアゴニストである、請求項１～１２のいずれか一項記載のＴｒｋＢ結合分子。
  14. ＴｒｋＢ結合分子が、二重特異性かつ四価である、請求項１～１３のいずれか一項記載のＴｒｋＢ結合分子。
  15. アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの有効性を改善するための方法であって、
    アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーは、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含有し、
    （ｉ）アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーのＶＬ及びＶＨにより第１の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を生成することと、
    （ｉｉ）工程（ｉ）のアゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの同じかもしくは実質的に同じＶＬ及びＶＨ又は異なるアゴニスト性ＴｒｋＢバインダーのＶＬ及びＶＨにより第２のｓｃＦｖを生成することと、
    （ｉｉｉ）第１及び第２のｓｃＦｖをＴｒｋＢ結合分子内に含ませることであって、ＴｒｋＢ結合分子は、工程（ｉ）及び（ｉｉ）からの少なくとも２つのアゴニスト性ＴｒｋＢ結合ｓｃＦｖを含み、
    ここで、ＴｒｋＢ結合分子は、アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの有効性と比較して、より高い有効性を有し、
    ここで、この有効性は、ＴｒｋＢレセプターを安定に発現するＣＨＯ細胞をアゴニスト性ＴｒｋＢバインダー又はＴｒｋＢ結合分子と共にインキュベーションし、処理されたＣＨＯ細胞の細胞ライセート中において、Ｙ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化を測定することにより決定された最大応答である、
    方法。
  16. アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーが、部分的アゴニストである、請求項１５記載の方法。
  17. アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの有効性と比較して、ＴｒｋＢ結合分子の有効性が、少なくとも１０％、１５％、２０％、２５％、３０％、３５％、４０％、４５％、５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％高い、請求項１５記載の方法。
  18. ＴｒｋＢ結合分子が、ＢＤＮＦと比較して、少なくとも約５０％、５５％、６０％、６５％、７０％、７５％、８０％、８５％、９０％、９５％又は１００％有効である。請求項１５～１７のいずれか一項記載の方法。
  19. ２つのアゴニスト性ＴｒｋＢ結合ｓｃＦｖが、同じエピトープに結合するか又は異なるエピトープに結合する、請求項１５記載の方法。
  20. ２つのアゴニスト性ＴｒｋＢ結合ｓｃＦｖが同一である、請求項１５記載の方法。
  21. ｓｃＦｖ同士が、ヒンジ領域又はリンカーを介して連結している、請求項１５記載の方法。
  22. ＴｒｋＢ結合分子が、Ｆｃ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、（ｓｃＦｖ’）２又はｓｃＦｖ－ＣＨ３のフォーマットにある、請求項２１記載の方法。
  23. ＴｒｋＢ結合分子が、Ｉｇ分子をさらに含む、請求項１５記載の方法。
  24. Ｉｇ分子が、モノクローナル抗体、ヒトモノクローナル抗体、ヒト化モノクローナル抗体、キメラ抗体、抗体のフラグメント、例えば、Ｆｖ、Ｆａｂ、Ｆａｂ’もしくはＦ（ａｂ’）２フラグメント、一本鎖抗体、例えば、一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）、小モデュラー免疫薬（ＳＭＩＰ）、ドメイン抗体、ナノボディ又はダイアボディである、請求項２３記載の方法。
  25. 各ｓｃＦｖが、Ｉｇ分子の重鎖のＣ末端に融合している、請求項２３記載の方法。
  26. 各ｓｃＦｖが、Ｉｇ分子の重鎖のＮ末端に融合している、請求項２３記載の方法。
  27. Ｉｇ分子が、ＩｇＧ、Ｆ（ａｂ）又はＦ（ａｂ’）２である、請求項２３記載の方法。
  28. Ｉｇ分子が、Ｆｃ領域を含むか又はそれからなる、請求項２３記載の方法。
  29. 各ｓｃＦｖが、ペプチドリンカー、好ましくは、約４～２０個のアミノ酸の長さを有するペプチドリンカーによりＩｇ分子に融合している、請求項２３記載の方法。
  30. ＴｒｋＢ結合分子が、ＴｒｋＢアゴニストである、請求項１５記載の方法。
  31. アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーが二価である、請求項１５～３０のいずれか一項記載の方法。
  32. アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーが、二重特異性の部分的アゴニストである、請求項１５～３１のいずれか一項記載の方法。
  33. 二価の部分的アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの有効性を改善するための方法であって、
    二価の部分的アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーは、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含有し、
    （ｉ）アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーのＶＬ及びＶＨにより第１の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を生成することと、
    （ｉｉ）工程（ｉ）のアゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの同じか又は実質的に同じＶＬ及びＶＨにより第２のｓｃＦｖを生成することと、
    （ｉｉｉ）第１及び第２のｓｃＦｖをＴｒｋＢ結合分子内に含ませることであって、ＴｒｋＢ結合分子は、工程（ｉ）及び（ｉｉ）からの少なくとも２つのアゴニスト性ＴｒｋＢ結合ｓｃＦｖを含み、
    ここで、ＴｒｋＢ結合分子は、二価の部分的アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの有効性と比較して、より高い有効性を有し、
    ここで、この有効性は、ＴｒｋＢレセプターを安定に発現するＣＨＯ細胞をアゴニスト性ＴｒｋＢバインダー又はＴｒｋＢ結合分子と共にインキュベーションし、処理されたＣＨＯ細胞の細胞ライセート中において、Ｙ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化を測定することにより決定された最大応答である、
    方法。
  34. 二価の部分的アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーが、ＩｇＧである、請求項３３記載の方法。
  35. ＴｒｋＢ結合分子が、Ｆｃ－ｓｃＦｖ、ｓｃＦｖ－Ｆｃ、（ｓｃＦｖ’）２又はｓｃＦｖ－ＣＨ３のフォーマットにある、請求項３３記載の方法。
  36. ＴｒｋＢ結合分子が、二重特異性かつ四価である、請求項１５～３２のいずれか一項記載の方法。
  37. ベースとなるアゴニスト性ＴｒｋＢバインダーと比較して改善された有効性を有するＴｒｋＢ結合分子を製造し又は生成する方法であって、
    アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーは、軽鎖可変ドメイン（ＶＬ）及び重鎖可変ドメイン（ＶＨ）を含有し、
    （ｉ）アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーのＶＬ及びＶＨにより第１の一本鎖可変フラグメント（ｓｃＦｖ）を生成することと、
    （ｉｉ）工程（ｉ）のアゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの同じか又は実質的に同じＶＬ及びＶＨにより第２のｓｃＦｖを生成することと、
    （ｉｉｉ）第１及び第２のｓｃＦｖをＴｒｋＢ結合分子内に含ませることであって、ＴｒｋＢ結合分子は、工程（ｉ）及び（ｉｉ）からの少なくとも２つのアゴニスト性ＴｒｋＢ結合ｓｃＦｖを含み、
    ここで、ＴｒｋＢ結合分子は、アゴニスト性ＴｒｋＢバインダーの有効性と比較して、より高い有効性を有し、
    ここで、この有効性は、ＴｒｋＢレセプターを安定に発現するＣＨＯ細胞をアゴニスト性ＴｒｋＢバインダー又はＴｒｋＢ結合分子と共にインキュベーションし、処理されたＣＨＯ細胞の細胞ライセート中において、Ｙ７０６／７０７でのＴｒｋＢリン酸化を測定することにより決定された最大応答である、
    方法。
  38. 請求項１～１４のいずれか一項記載のＴｒｋＢ結合分子の（ｉ）重鎖もしくは重鎖可変ドメイン及び／又は（ｉｉ）軽鎖もしくは軽鎖可変ドメインをコードする、
    単離された核酸分子。
  39. 請求項３８記載の単離された核酸分子を含む、
    ウイルスベクター。
  40. 請求項３８記載の核酸分子を含む、
    発現ベクター。
  41. 請求項４０記載の発現ベクターでトランスフェクションされた、
    宿主細胞。
  42. （ａ）以下の分子の発現を可能にする条件下で、請求項４１記載の宿主細胞を培養することと、
    （ｂ）該分子を回収することと、場合により、
    （ｃ）該分子をさらに精製しかつ／又は修飾しかつ／又は製剤化することとを含む、
    請求項１～１４のいずれか一項記載のＴｒｋＢ結合分子を製造する方法。
  43. 医薬に使用するためのものであり、ここで、該使用は、眼もしくは網膜の疾患又は神経変性疾患の処置である、請求項１～１４のいずれか一項記載のＴｒｋＢ結合分子。
  44. 該使用が、黄斑変性症、加齢黄斑変性症、滲出性加齢黄斑変性症（ｗＡＭＤ）、網膜静脈閉塞症（ＲＶＯ）、糖尿病性網膜症、糖尿病性黄斑浮腫、網膜色素変性症、遺伝性網膜ジストロフィー、遺伝性黄斑ジストロフィー、近視性変性症、地図状萎縮症、網膜動脈閉塞症、眼内炎、ブドウ膜炎、嚢胞様黄斑浮腫、任意の網膜疾患に続発する脈絡膜新生血管膜、視神経症、緑内障、網膜剥離、中毒性網膜症、放射線網膜症並びに外傷性網膜症、前駆型及び軽度から中等度のアルツハイマー病、アルツハイマー病を有する患者の疾患進行の遅延、ハンチントン病、パーキンソン病、大うつ病性障害、統合失調症、統合失調症に関連する認知障害、減弱精神病症候群を有する個体における初発精神病の予防、統合失調症を有する患者における再発の予防、処置抵抗性うつ病、過食症、肥満又はメタボリックシンドローム、難聴、特に、シスプラチン誘発性難聴並びに騒音性及び加齢性難聴の治療及び／又は予防のためのものである、請求項４３記載の使用のためのＴｒｋＢ結合分子。
  45. 薬学的に許容し得る担体と、請求項１～１４のいずれか一項記載のＴｒｋＢ結合分子とを含む、
    医薬組成物。
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