TW201641515A - Ｖｅｇｆａ／ａｎｇ２化合物 - Google Patents

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Abstract

本發明係關於一種化合物，其結合至人類血管內皮生長因子A(VEGFA)及人類血管生成素-2(Ang2)，且可適用於治療血管生成性眼睛疾病，諸如糖尿病性及其他增生性視網膜病變，及癌症，尤其由VEGFA及Ang2驅動之實體腫瘤，包括胃癌、肺癌、肝細胞癌、卵巢癌、結腸直腸癌及乳癌。

Description

VEGFA/ANG2化合物
本發明係關於醫學領域。更特定言之，本發明係關於化合物，其結合至人類血管內皮生長因子A(VEGFA)及人類血管生成素-2(Ang2)，且可適用於治療血管生成性眼睛疾病，諸如糖尿病性及其他增生性視網膜病變，及癌症，尤其由VEGFA及Ang2驅動之實體腫瘤，包括胃、肺、肝細胞癌、卵巢、結腸直腸及乳癌。
癌症標誌為持續性新血管形成，稱作血管生成。血管內皮生長因子(VEGF)路徑為調節血管生成之重要信號級聯；人類VEGFA為VEGF路徑中之關鍵配位體。
血管生成素-1(Ang1)及Ang2為調節血管生成的另一關鍵路徑之成員；Ang1及Ang2為結合至內皮細胞特異性受體酪胺酸激酶Tie2之分泌因子。Ang1藉由外被細胞組成性分泌，且經由Tie2受體穩定血管完整性。Ang2僅回應於刺激(例如傷口癒合，腫瘤生長)自內皮細胞釋放，且促進血管萌發，且經由Tie2信號傳導抑制外被細胞-內皮細胞相互作用。已展示，針對人類Ang2之抗體當與VEGF阻斷劑阿柏西普(aflibercept)組合給藥時抑制腫瘤生長，且減少小鼠異種移植腫瘤模型中之腫瘤血管分佈(Daly等人，Cancer Res(2013)73(1)：108)。多種研究性Ang2抗體當前正在臨床試驗中。
已提出血管生成之VEGF及Ang/Tie2路徑兩者的抑制具有改良針對癌症之結果的可能性(參看例如Daly等人，Cancer Res(2013) 73：108)。當前，共投與VEGFA抗體及Ang-2抗體將需要注射或輸注兩種獨立產物或投與抗體混合物之共調配物。獨立投與將准許劑量及時序之彈性，但由於注射時間增加，將成為患者順應性及便利性之潛在問題。共調配物亦可提供劑量之一定彈性，但由於兩種不同抗體之不同分子特徵，找到准許兩種抗體均具化學及物理穩定性的調配條件可能具有挑戰性。另外，共投與或共調配涉及兩種藥物療法之相加成本。
WO2012/009705揭示複合物，其含有附接至包括抗體之骨架的一或多個模組辨識域(MRD)。Ang2列為預期用於複合物之MRD部分，且VEGFA抗體指定為MRD可附接之抗體。不例示針對附接至VEGFA抗體之Ang2的MRD。WO2010/040508、WO2011/117329及WO2012/131078主張對VEGFA及Ang-2之雙特異性抗體。
仍需要提供藉由結合及中和人類VEGFA及人類Ang2兩者來抑制兩種血管生成路徑的化合物。特定言之，仍需要提供在不由於使用Ang2 scFv而損害顯著Ang2活體外結合活性之情況下，且在不由於VEGFA抗體及Ang2 scFv組合成一種化合物而損害顯著活體外基於細胞之分析活性的情況下，藉由結合及中和人類VEGFA及人類Ang2兩者來抑制兩種血管生成路徑的化合物。仍需要提供中和Ang2介導之Tie2磷酸化，但非Ang1介導之磷酸化的化合物。
因此，本發明之一實施例提供一種化合物，其包含藉由兩個連接子融合至兩個單鏈可變片段(single chain fragment variable；scFv)多肽之抗體，其中：a)該抗體包含兩個相同重鏈(HC)及兩個相同輕鏈(LC)，其中各HC包含重鏈可變區(HCVR)，該HCVR之胺基酸序列在SEQ ID NO：1中出示，且其中各LC包含輕鏈可變區(LCVR)，該LCVR之胺基酸序列在SEQ ID NO：4中出示， b)該兩個scFv多肽為相同的，且各自包含可操作地連接至LCVR之HCVR，其中各HCVR具有在SEQ ID NO：7中出示之胺基酸序列，且其中各LCVR具有在SEQ ID NO：8中出示之胺基酸序列，且c)該兩個連接子為相同的富含甘胺酸之連接子，其各自可操作地將該抗體之一個HC的羧基端連接至該等scFv多肽中之一者的胺基端。
在另一實施例中，本發明提供一種化合物，其包含藉由兩個連接子融合至兩個scFv多肽之抗體，其中該兩個scFv多肽各自包含可操作地連接至一個scFv多肽之LCVR之胺基端的一個scFv多肽之HCVR之羧基端。
在一實施例中，本發明提供一種化合物，其包含藉由兩個連接子融合至兩個scFv多肽之抗體，其中該抗體包含兩個重鏈(HC)及兩個輕鏈(LC)，其中各HC具有在SEQ ID NO：2中出示之胺基酸序列，且各LC具有在SEQ ID NO：5中出示之胺基酸序列。
在一實施例中，本發明提供一種化合物，其包含藉由兩個連接子融合至兩個scFv多肽之抗體，其中各scFv多肽具有在SEQ ID NO：6中出示之相同胺基酸序列。
在一實施例中，本發明提供一種化合物，其包含兩個第一多肽及兩個第二多肽，其中該等第一多肽中之每一者具有SEQ ID NO：3之胺基酸序列，且該等第二種多肽中之每一者具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列。如表1中所示，兩個第一多肽包含抗體之HC、連接子及scFv多肽；兩個第二多肽包含抗體之LC。
在一實施例中，本發明進一步提供一種化合物，其包含兩個第一多肽及兩個第二多肽，其中該等第一多肽中之每一者與該等第二多肽中之每一者形成鏈間二硫鍵，且該第一多肽與另一第一多肽形成兩個鏈間二硫鍵，且該等第一多肽中之每一者形成七個鏈內二硫鍵。
在一實施例中，本發明提供一種結合人類VEGFA及人類Ang2之化合物，其包含藉由兩個連接子融合至兩個結合人類Ang2(SEQ ID NO：12)之scFv多肽的結合人類VEGFA(SEQ ID NO：11)之抗體，其中：a)該抗體包含兩個相同重鏈(HC)及兩個相同輕鏈(LC)，其中各HC包含重鏈可變區(HCVR)，該HCVR之胺基酸序列在SEQ ID NO：1中出示，且其中各LC包含輕鏈可變區(LVCR)，該LVCR之胺基酸序列在SEQ ID NO：4中出示，b)該兩個scFv多肽為相同的，且各自包含可操作地連接至LCVR之HCVR，其中各HCVR具有在SEQ ID NO：7中出示之胺基酸序列，且其中各LCVR具有在SEQ ID NO：8中出示之胺基酸序列，且c)該兩個連接子為相同的富含甘胺酸之連接子，其各自可操作地將該抗體之一個HC的羧基端連接至該等scFv多肽中之一者的胺基端。
在另一實施例中，本發明提供一種結合人類VEGFA及人類Ang2之化合物，其包含藉由兩個連接子融合至兩個結合人類Ang2(SEQ ID NO：12)之scFv多肽的結合人類VEGFA(SEQ ID NO：11)之抗體，其中各scFv多肽之HCVR之羧基端可操作地連接至LCVR之胺基端。
在一實施例中，本發明提供一種結合人類VEGFA及人類Ang2之化合物，其包含藉由兩個連接子融合至兩個結合人類Ang2(SEQ ID NO：12)之scFv多肽的結合人類VEGFA(SEQ ID NO：11)之抗體，其中該抗體包含兩個重鏈(HC)及兩個輕鏈(LC)，其中各HC具有在SEQ ID NO：2中出示之胺基酸序列，且各LC具有在SEQ ID NO：5中出示之胺基酸序列。
在一實施例中，本發明提供一種結合人類VEGFA及人類Ang2之化合物，其包含藉由兩個連接子融合至兩個結合人類Ang2(SEQ ID NO：12)之scFv多肽的結合人類VEGFA(SEQ ID NO：11)之抗體，其中各scFv多肽具有在SEQ ID NO：6中出示之相同胺基酸序列。
在一實施例中，本發明提供一種結合人類VEGFA(SEQ ID NO：11)及人類Ang2(SEQ ID NO：12)之化合物，其包含兩個第一多肽及兩個第二多肽，其中該等第一多肽中之每一者具有SEQ ID NO：3之胺基酸序列，且該等第二多肽中之每一者具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列。
在一實施例中，本發明進一步提供一種結合人類VEGFA(SEQ ID NO：11)及人類Ang2(SEQ ID NO：12)之化合物，其包含兩個第一多肽及兩個第二多肽，其中該等第一多肽中之每一者與該等第二多肽中之每一者形成鏈間二硫鍵，且該第一多肽與另一第一多肽形成兩個鏈間二硫鍵，且該等第一多肽中之每一者形成七個鏈內二硫鍵。
在一實施例中，本發明提供一種結合人類VEGFA(SEQ ID NO：11)之抗體，其包含輕鏈(LC)及重鏈(HC)，其中該輕鏈包含輕鏈可變區(LCVR)，且該重鏈包含重鏈可變區(HCVR)，其中該LCVR具有在SEQ ID NO：4中出示之胺基酸序列，且該HCVR具有在SEQ ID NO：1中出示之胺基酸序列。
在一實施例中，本發明提供一種結合人類VEGFA(SEQ ID NO：11)之抗體，其包含輕鏈(LC)及重鏈(HC)，其中該LC具有在SEQ ID NO：5中出示之胺基酸序列，且該HC具有在SEQ ID NO：2中出示之胺基酸序列。
在另一實施例中，本發明提供一種結合VEGFA(SEQ ID NO：11)之抗體，其包含兩個輕鏈及兩個重鏈，其中各輕鏈具有在SEQ ID NO：5中出示之胺基酸序列，且各重鏈具有在SEQ ID NO：2中出示之胺基酸序列。
在一實施例中，本發明提供一種包含DNA分子之哺乳動物細 胞，該DNA分子包含編碼藉由SEQ ID NO：3出示之第一多肽的聚核苷酸序列及編碼藉由SEQ ID NO：5出示之第二多肽的聚核苷酸序列，其中該細胞能夠表現包含該第一多肽及該第二多肽之化合物。
在一實施例中，本發明提供一種製備包含藉由SEQ ID NO：3出示之兩個第一多肽及藉由SEQ ID NO：5出示之兩個第二多肽之化合物的方法，其包含在使得該化合物得以表現之條件下培養本發明之哺乳動物細胞，且回收該經表現之化合物。
在上述方法之一實施例中，本發明之哺乳動物細胞中的兩個聚核苷酸序列為同一核酸分子之部分(SEQ ID NO：9及SEQ ID NO：10)。
在一實施例中，本發明提供一種可藉由前述方法中之一者獲得的化合物。
在一實施例中，本發明提供一種醫藥組合物，其包含本發明化合物及可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
在一實施例中，本發明提供一種治療癌症之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之本發明化合物。在另一實施例中，本發明提供一種治療癌症之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之本發明化合物，其中該癌症為乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、結腸直腸癌、肝細胞癌或逢希伯-林道症候群(Von Hippel-Lindau syndrome)。
在另一實施例中，此等方法包含與一或多種選自由以下組成之群之抗腫瘤劑同時、獨立或依序組合投與有效量之本發明化合物：順鉑(cisplatin)、卡鉑(carboplatin)、脂質體小紅莓(liposomal doxorubicin)、多西他賽(docetaxel)、環磷醯胺及小紅莓(doxorubicin)、溫諾平(navelbine)、艾瑞布林(eribulin)、用於可注射懸浮液的太平洋紫杉醇(paclitaxel)蛋白質結合之粒子、伊沙匹隆(ixabepilone)、卡培他濱(capecitabine)、雷莫蘆單抗(ramucirumab)、FOLFOX(甲醯四氫葉酸、氟尿嘧啶及奧沙利鉑(oxaliplatin))、 FOLFIRI(甲醯四氫葉酸、氟尿嘧啶及伊立替康(irinotecan))及西妥昔單抗(cetuximab)。
在另一實施例中，此等方法包含與一或多種選自由以下組成之群之腫瘤免疫劑同時、獨立或依序組合投與有效量之本發明化合物：尼沃單抗(nivolumab)、伊派利單抗(ipilimumab)、皮立珠單抗(pidilizumab)、派立珠單抗(pembrolizumab)及杜瓦單抗(durvalumab)。
在一實施例中，本發明提供一種治療增生性視網膜病變之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之本發明化合物。在另一實施例中，本發明提供一種治療增生性視網膜病變之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之本發明化合物，其中該增生性視網膜病變為糖尿病性視網膜病變或早產兒視網膜病變。
在一實施例中，本發明提供一種治療血管生成性眼睛疾病之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之本發明化合物。在另一實施例中，本發明提供一種治療血管生成性眼睛疾病之方法，其包含向有需要之患者投與有效量之本發明化合物，其中該血管生成性眼睛疾病為新生血管性青光眼、年齡相關之黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、角膜新血管生成、角膜移植新血管生成、角膜移植排斥、視網膜/脈絡膜新血管生成、房角之新血管生成(虹膜紅變)、眼部新生血管性疾病、血管再狹窄或動靜脈畸形(AVM)。
在一實施例中，本發明提供一種用於療法之本發明化合物。在一實施例中，本發明提供一種用於治療癌症之本發明化合物。在另一實施例中，本發明提供一種用於治療癌症之本發明化合物，其中該癌症為乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、結腸直腸癌或肝細胞癌。在另一實施例中，將本發明化合物與一或多種選自由以下組成之群之抗腫瘤劑同時、獨立或依序組合用於治療癌症：順鉑、卡鉑、脂質體小紅莓、多西他賽、環磷醯胺及小紅莓、溫諾平、艾瑞布林、用於可注射懸浮 液的太平洋紫杉醇蛋白質結合之粒子、伊沙匹隆、卡培他濱、雷莫蘆單抗、FOLFOX(甲醯四氫葉酸、氟尿嘧啶及奧沙利鉑)、FOLFIRI(甲醯四氫葉酸、氟尿嘧啶及伊立替康)及西妥昔單抗。
在另一實施例中，本發明化合物與一或多種選自由以下組成之群之腫瘤免疫劑同時、獨立或依序組合用於治療癌症：尼沃單抗、伊派利單抗、皮立珠單抗、派立珠單抗及杜瓦單抗。
在一實施例中，本發明提供一種用於治療增生性視網膜病變之本發明化合物。在另一實施例中，本發明提供一種用於治療增生性視網膜病變之本發明化合物，其中該增生性視網膜病變為糖尿病性視網膜病變、早產兒視網膜病變、鐮狀細胞性視網膜病變、創傷後視網膜病變、黏性過大症候群、主動脈弧症候群、眼部缺血性症候群、頸動脈海綿狀瘺、多發性硬化症、視網膜血管炎、全身性紅斑性狼瘡症、伴隨SS-A自體抗體之小動脈炎(arteriolitis with SS-A autoantibody)、急性多灶性出血性血管炎、由感染引起之血管炎、由貝赫切特疾病(Behçet's disease)引起之血管炎、類肉瘤病、凝血病、鐮狀細胞形成血紅素病、AC及C-ß地中海貧血症、小血管透明變性、色素失禁症、伊爾斯氏病(Eales' disease)、視網膜分支動脈或靜脈閉塞、霜樣樹枝狀視網膜血管炎(frosted branch angiitis)、特發性視網膜血管炎、動脈瘤、視神經視網膜炎、視網膜栓塞、早產兒視網膜病變、葡萄膜炎、睫狀體扁平部炎、急性視網膜壞死、鳥槍彈樣視網膜脈絡膜病變、存在已久之視網膜剝離、脈絡膜黑素瘤、輻射性視網膜病變、家族性滲出性玻璃體視網膜病變、遺傳性視網膜靜脈串珠(inherited retinal venous beading)、視網膜劈裂症、色素性視網膜炎或常染色體顯性玻璃體視網膜脈絡膜病變。
在一實施例中，本發明提供一種用於治療血管生成性眼睛疾病之本發明化合物。在另一實施例中，本發明提供一種用於治療血管生 成性眼睛疾病之本發明化合物，其中該血管生成性眼睛疾病為新生血管性青光眼、年齡相關之黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、角膜新血管生成、角膜移植新血管生成、角膜移植排斥、視網膜/脈絡膜新血管生成、房角之新血管生成(虹膜紅變)、眼部新生血管性疾病、血管再狹窄或動靜脈畸形(AVM)。年齡相關之黃斑變性之實例為非新生血管性(亦稱為「乾燥」)及新生血管性(亦稱為「濕潤」或「滲出性」)黃斑變性。
在一實施例中，本發明提供本發明化合物用於製造治療癌症之藥劑的用途。在另一實施例中，本發明提供本發明化合物用於製造治療癌症之藥劑的用途，其中該癌症為乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、結腸直腸癌、肝細胞癌或逢希伯-林道症候群。
在另一實施例中，本發明提供本發明化合物與一或多種選自由以下組成之群之抗腫瘤劑同時、獨立或依序組合用於製造治療癌症之藥劑的用途：順鉑、卡鉑、脂質體小紅莓、多西他賽、環磷醯胺及小紅莓、溫諾平、艾瑞布林、用於可注射懸浮液的太平洋紫杉醇蛋白質結合之粒子、伊沙匹隆、卡培他濱、雷莫蘆單抗、FOLFOX(甲醯四氫葉酸、氟尿嘧啶及奧沙利鉑)、FOLFIRI(甲醯四氫葉酸、氟尿嘧啶及伊立替康)及西妥昔單抗。
在另一實施例中，本發明提供本發明化合物與一或多種選自由以下組成之群之腫瘤免疫劑同時、獨立或依序組合用於製造治療癌症之藥劑的用途：尼沃單抗、伊派利單抗、皮立珠單抗、派立珠單抗及杜瓦單抗。
在一實施例中，本發明提供本發明化合物用於製造治療增生性視網膜病變之藥劑的用途。在另一實施例中，本發明提供本發明化合物用於製造治療增生性視網膜病變之藥劑的用途，其中該增生性視網膜病變為糖尿病性視網膜病變、早產兒視網膜病變、鐮狀細胞性視網 膜病變、創傷後視網膜病變、黏性過大症候群、主動脈弧症候群、眼部缺血性症候群、頸動脈海綿狀瘺、多發性硬化症、視網膜血管炎、全身性紅斑性狼瘡症、伴隨SS-A自體抗體之小動脈炎、急性多灶性出血性血管炎、由感染引起之血管炎、由貝赫切特疾病引起之血管炎、類肉瘤病、凝血病、鐮狀細胞形成血紅素病、AC及C-ß地中海貧血症、小血管透明變性、色素失禁症、伊爾斯氏病、視網膜分支動脈或靜脈閉塞、霜樣樹枝狀視網膜血管炎、特發性視網膜血管炎、動脈瘤、視神經視網膜炎、視網膜栓塞、早產兒視網膜病變、葡萄膜炎、睫狀體扁平部炎、急性視網膜壞死、鳥槍彈樣視網膜脈絡膜病變、存在已久之視網膜剝離、脈絡膜黑素瘤、輻射性視網膜病變、家族性滲出性玻璃體視網膜病變、遺傳性視網膜靜脈串珠、視網膜劈裂症、色素性視網膜炎或常染色體顯性玻璃體視網膜脈絡膜病變。
在一實施例中，本發明提供本發明化合物用於製造治療血管生成性眼睛疾病之藥劑的用途。在另一實施例中，本發明提供本發明化合物用於製造治療血管生成性眼睛疾病之藥劑的用途，其中該血管生成性眼睛疾病為新生血管性青光眼、年齡相關之黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、角膜新血管生成、角膜移植新血管生成、角膜移植排斥、視網膜/脈絡膜新血管生成、房角之新血管生成(虹膜紅變)、眼部新生血管性疾病、血管再狹窄或動靜脈畸形(AVM)。年齡相關之黃斑變性之實例為非新生血管性(亦稱為「乾燥」)及新生血管性(亦稱為「濕潤」或「滲出性」)黃斑變性。
本發明化合物為經工程改造、非天然存在之多肽複合物。本發明之DNA分子為非天然存在之DNA分子，其包含編碼具有本發明化合物中該等多肽中之一者之胺基酸序列之多肽的聚核苷酸序列。
本發明化合物之抗體部分經設計以具有經工程改造之CDR，且具有人類來源的抗體之一些部分(構架、鉸鏈區及恆定區之所有或部 分)，其與來源於人類基因組序列之構架及恆定區相同或實質上相同(實質上人類)。完整人類構架、鉸鏈區及恆定區為彼等人類生殖系序列以及具有天然存在之體細胞突變的序列及具有經工程改造之突變的彼等序列。本發明化合物之抗體部分可包含來源於其中含有一或多種胺基酸取代、缺失或添加之完整人類構架區、鉸鏈區或恆定區的構架區、鉸鏈區或恆定區。另外，本發明化合物之抗體部分在人類中較佳為實質上非免疫原性的。
本發明化合物之抗體部分為IgG類型抗體，且具有經由鏈內及鏈間二硫鍵共價穩定之四個胺基酸鏈(兩個「重」鏈及兩個「輕」鏈)。各重鏈由N端HCVR及重鏈恆定區(「HCCR」)組成。各輕鏈由LCVR及輕鏈恆定區(「LCCR」)組成。當在某些生物系統中表現時，具有原生人類Fc序列之抗體在Fc區中糖基化。通常，糖基化在抗體之Fc區中高度保守N-糖基化位點處進行。N-聚糖通常附接至天冬醯胺。抗體亦可在其他位置糖基化。
由於參與Fc受體介導之發炎機制或活化補體的能力降低引起效應功能降低，故視情況，本發明化合物之抗體部分含有來源於人類IgG4 Fc區之Fc部分。
另外，本發明之某些化合物之抗體部分含有IgG4-PAA Fc部分。IgG4-PAA Fc部分在位置231處絲胺酸突變為脯胺酸，在位置237處苯丙胺酸突變為丙胺酸，且在位置238處白胺酸突變為丙胺酸。S231P突變為鉸鏈突變，其阻止半抗體形成(半分子在IgG4抗體中動態交換之現象)。F237A及L238A突變進一步降低已經較低之人類IgG4同型的效應功能。
編碼HCVR區之經分離DNA分子可藉由將編碼HCVR之DNA可操作地連接至編碼重鏈恆定區之另一DNA分子而轉化成全長重鏈基因。人類以及其他哺乳動物重鏈恆定區基因之序列係此項技術中已知。可 例如藉由標準PCR擴增獲得包涵此等區之DNA片段。
編碼LCVR區之經分離DNA可藉由將編碼LCVR之DNA可操作地連接至編碼輕鏈恆定區之另一DNA分子而轉化成全長輕鏈基因。人類以及其他哺乳動物輕鏈恆定區基因之序列係此項技術中已知。可藉由標準PCR擴增獲得包涵此等區之DNA片段。輕鏈恆定區可為κ或λ恆定區。
「單鏈可變片段」或「scFv」或「scFv多肽」係指經工程改造、非天然存在之單一摺疊多肽，其包含經由scFv連接子分子連接的抗體之LCVR及HCVR。本發明化合物之scFv多肽部分為經工程改造、非天然存在之scFv，其經設計以具有經工程改造之CDR，且具有人類來源的scFv之一些部分(所有或部分構架)，其與來源於人類基因組序列之構架相同或實質上相同(實質上人類)。完整人類構架為彼等人類生殖系序列以及具有天然存在之體細胞突變的序列及具有經工程改造之突變的彼等序列。本發明化合物之scFv多肽部分可包含來源於其中含有一或多種胺基酸取代、缺失或添加之完整人類構架的構架。另外，本發明化合物之scFv多肽部分在人類中較佳為實質上非免疫原性。視情況，化合物之scFv多肽部分可具有來自HCVR中半胱胺酸44及LCVR中半胱胺酸100之二硫化物(Cys44及Cys100編號對應於scFv多肽之HCVR及LCVR之胺基酸編號；對於在抗體之HC+連接子+scFv多肽中的編號，其為Cys507及Cys709)。在該scFv多肽中，HCVR及LCVR域可呈HCVR-scFv連接子-LCVR次序或LCVR-scFv連接子-HCVR次序。scFv連接子可為使得HCVR及LCVR鏈摺疊成用於識別抗原之功能性單體單元的可撓性富含甘胺酸之肽連接子。視情況，scFv連接子為富含甘胺酸之連接子，諸如2×G4S連接子、3×G4S連接子、4×G4S連接子或5×G4S連接子。
術語「連接子」及「scFv連接子」均係指富含甘胺酸之肽連接 子。「連接子」在本發明之某些實施例中用於將抗體連接至scFv，且「scFv連接子」在本發明之某些實施例中用於將scFv之LCVR連接至scFv之HCVR。較佳地，肽連接子為具有至少5個胺基酸、較佳至少10個胺基酸、更佳介於10與50個之間胺基酸的富含甘胺酸之肽。在本發明之一些實施例中，該富含甘胺酸之肽連接子為(GxS)n，其中G=甘胺酸，S=絲胺酸，(x=3且n=3、4、5或6)或(x=4且n=2、3、4或5)。舉例而言，在本發明之一些實施例中，該富含甘胺酸之肽連接子為(GxS)n，其中G=甘胺酸，S=絲胺酸，x=4且n=2、3、4或5(亦即分別為GGGGSGGGGS(SEQ ID NO：13)、GGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：14)、GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：15)或GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：16)。在本發明之一些實施例中，在抗體恆定區中最後一個胺基酸為甘胺酸的情況下，該富含甘胺酸之肽連接子為GGGSGGGGSGGGGS(SEQ ID NO：17)。
在序列可操作地連接至表現控制序列之後，本發明之聚核苷酸將在宿主細胞中表現。表現載體在宿主生物體中通常可複製為游離基因體或宿主染色體DNA之整體部分。一般，表現載體將含有選擇標記，例如四環素、新黴素(neomycin)及二氫葉酸還原酶，以准許偵測用所需DNA序列轉型之彼等細胞。
本發明化合物可在哺乳動物細胞，諸如CHO、NS0、HEK293或COS細胞中容易地製備。宿主細胞使用此項技術中所熟知之技術培養。
含有所關注之聚核苷酸序列(例如編碼化合物之多肽的聚核苷酸及表現控制序列)的載體可藉由熟知方法轉移至宿主細胞中，該等熟知方法視細胞宿主之類型而改變。
可採用蛋白質純化之各種方法，且該等方法為此項技術中已知的，且描述於例如Deutscher,Methods in Enzymology 182：83-89(1990) 及Scopes,Protein Purification：Principles and Practice，第三版，Springer,NY(1994)中。
在本發明之另一實施例中，化合物或編碼該化合物之核酸以經分離之形式提供。如本文所用，術語「經分離之」係指不含或實質上不含在細胞環境中所發現之任何其他巨分子種類的蛋白質、肽或核酸。如本文所用之「實質上不含」意謂所關注之蛋白質、肽或核酸包含超過80%(以莫耳計)、較佳超過90%且更佳超過95%的所存在之巨分子種類。
本發明化合物或包含該本發明化合物之醫藥組合物可非經腸投與(例如玻璃體內、眼內、結膜下、皮下或經由靜脈注射或植入)。本發明化合物可與醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑一起以單個或多個劑量向患者投與。本發明之醫藥組合物可藉由此項技術中熟知之方法(例如Remington：The Science and Practice of Pharmacy，第19版(1995),A.Gennaro等人，Mack Publishing Co.)製備，且包含如本文中所揭示之化合物及一或多種醫藥學上可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
術語「治療(treating)」(或「治療(treat)」或「治療(treatment)」)係指減緩、中斷、停滯、緩解、終止、減小或逆轉現有症狀、病症、病狀或疾病之進程或嚴重程度。患者係指哺乳動物，較佳患有將受益於VEGFA及/或Ang2抑制之疾病、病症或病狀的人類。
除非另外指示，否則如本文所用之「結合」在與化合物、抗體或scFv多肽對人類VEGFA或人類Ang2之親和力相關的情況下欲意謂，如藉由此項技術中已知之常用方法，包括使用基本上如本文所述之表面電漿子共振(SPR)生物感測器在25℃或37℃下測定的KD小於約1×10-8M、較佳小於約1×10-9M。本文中所用之術語「選擇性的」或「選擇性」在與本發明化合物相關的情況下係指如藉由表面電漿子共 振在25℃或37℃下所量測，化合物結合目標(諸如人類Ang2)之KD約為該化合物結合其他蛋白質(包括目標家族之成員，諸如人類Ang1)的1/1000、1/500、1/200、1/100、1/50或約1/10。另外或替代地，當藉由本文中以下實例中所述之方法分析時，本發明之Ang2選擇性化合物結合人類Ang2，但並未結合或僅最低限度地結合人類Ang1。
「有效量」意謂本發明化合物或包含本發明化合物之醫藥組合物的量，其將引發由研究人員、醫生或其他臨床師所探尋的對組織、系統、動物、哺乳動物或人類之生物或醫學反應或所需治療效應。化合物之有效量可根據諸如個體之疾病病況、年齡、性別及體重以及化合物引發個體中所需反應之能力的因素而變化。有效量亦為治療上有益之效應超過化合物之任何毒性或損害效應的一個量。
本發明藉由以下非限制性實例進一步說明。
實例1：化合物表現及純化
對於如表1中所示之實例1(化合物A)，兩個第一多肽(化合物A的抗體之HC-連接子-scFv)具有SEQ ID NO：3之胺基酸序列，且兩個第二多肽(化合物A的抗體之LC)具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列。
化合物A之抗體部分、scFv部分及抗體-連接子-scFv的多肽及編碼該多肽之核苷酸序列列於以下名為「胺基酸及核苷酸序列」的部分中。
本發明化合物，包括(但不限於)化合物A，可基本上如下製備且純化。諸如HEK 293或CHO之適當宿主細胞可用使用最佳預定HC-連接子-scFv：LC載體比率(諸如1：3或1：2)分泌化合物之表現系統或編碼HC-連接子-scFv及LC之單一載體系統來短暫或穩定地轉染。已有化合物分泌其中之已澄清化培養基可使用諸多常用技術中之任一者純化。舉例而言，宜施加培養基至用於Fab片段之MabSelect管柱(GE Healthcare)或KappaSelect管柱(GE Healthcare)(其已經過諸如磷酸鹽緩 衝鹽水(pH 7.4)之相容緩衝液平衡)上。可洗滌管柱以移除非特異性結合組分。經結合之化合物可例如藉由pH梯度(諸如20mM Tris緩衝液pH 7至10mM檸檬酸鈉緩衝液pH 3.0，或磷酸鹽緩衝鹽水pH 7.4至100mM甘胺酸緩衝液pH 3.0)溶離。化合物溶離份可諸如藉由SDS-PAGE偵測，且接著可進行合併。進一步純化為視預期用途而選用。化合物可使用常見技術濃縮及/或無菌過濾。可溶聚集體及多聚體可藉由常用技術有效地移除，包括尺寸排阻、疏水性相互作用、離子交換、多模式或羥基磷灰石層析法。在此等層析法步驟之後，化合物之純度超過95%。產物可緊接著在-70℃下冷凍或可凍乾。
分析 結合動力學、親和力及選擇性
根據此項技術中已知之方法，本發明化合物對人類Ang2及人類VEGFA之結合動力學、親和力及選擇性藉由使用表面電漿子共振(SPR)生物感測器，諸如Biacore® 2000、Biacore® 3000或Biacore® T100(GE HealthCare)，或替代地藉由與Kinexa 3000或3200(Sapidyne Instruments)相關之動力排阻分析方法測定。
使用Biacore SPR之親和力量測
本發明化合物對可溶全長人類Ang2及人類VEGFA之動力學及平衡解離常數(KD)使用Biacore表面電漿子共振分析方法在25℃下測定。 人類Ang2來自R&D Systems(編號623-AN-01M/CF)，且人類VEGFA165來自R&D Systems(編號293-VE-001MG/CF)、Peprotech(編號00-20)，或藉由重組表現方法製備。用於捕獲抗體之蛋白質A表面使用以下方法製備。可溶蛋白質A(Calbiochem編號539202)在CM4(GE Healthcare編號BR-1005-34)或CM5(GE Healthcare編號BR-1000-99)上之固定使用EDC/NHS胺偶合方法(GE Healthcare編號BR-1000-50)製備。簡言之，所有四個流動細胞之表面藉由以10μL/min注射EDC/NHS之1：1混合物持續七分鐘來活化。其後，將可溶蛋白質A稀釋於10mM乙酸酯緩衝液，pH 4.5中達到50至100μg/mL，且以10μL/min之流動速率固定至流動細胞(Fc)2、3或4上持續七分鐘。仍殘留在晶片表面上的未反應之位點以10μL/min注射乙醇胺七分鐘來阻斷。操作緩衝液為添加有100mM NaCl之HBS-EP+(GE Healthcare編號BR-1006-69)。化合物樣品藉由稀釋至操作緩衝液中以1μg/mL製備。在50nM至1.56nM範圍內之人類Ang2或人類VEGFA165在操作緩衝液中使用兩倍連續稀釋製備。各分析循環由一系列五個獨立步驟組成：(1)捕獲化合物至獨立流動細胞(Fc2、Fc3及Fc4)上，(2)以50μL/min對所有Fc注射(使用kinject)250μL(300秒表面接觸時間)離散濃度之人類Ang2或人類VEGFA165，(3)返回至緩衝液流體持續20分鐘以監測解離階段，(4)注射10μL(30秒接觸時間)10mM甘胺酸，pH 1.5，再生晶片表面，(5)注射15μL(45秒接觸時間)HBS-EP+操作緩衝液，平衡晶片表面。所得資料使用標準雙重參考處理，且使用Biacore 2000評估軟體，版本4.1擬合成1：1結合模型，以測定締合速率(kon，M-1s-1單位)、解離速率(koff，s-1單位)。平衡解離常數(KD)之計算自以下關係KD=koff/kon計算，且以莫耳單位呈現。
在基本上如此分析中所述進行之實驗中，化合物A之親代抗VEGFA抗體對人類VEGFA165展現KD為13.2pM。化合物A，即將親代 抗VEGFA抗體與由來自Ang2 Mab之HCVR及LCVR組成之C端重鏈scFv組合的Mab-scFv融合體展現KD為83.2pM(表2)。使用Biacore SPR在25℃下評估的化合物A對人類Ang2之結合親和力(KD)為136pM(表3)。
由於解離速率過於緩慢而不能精確定量，表2中所呈現之值為所報導之親和力的上限。
用KinExA KEA之親和力量測
KinExA 3200儀器用於量測與人類VEGFA165之結合動力學。簡言之，人類VEGFA165共價偶合至NHS活化之瓊脂糖凝膠珠粒(GE Healthcare編號17-0906-01)，且游離Mab與結合(conjugated)珠粒之結合(bind)在KinExA 3200上偵測。為了量測KD，含有固定濃度(通常1至5pM)之化合物的個別管與降低濃度之連續稀釋之人類VEGFA165混合，且在25℃或37℃(視所分析之溫度而定)下在酪蛋白阻斷緩衝液(ThermoFisher編號37528)中預培育超過24小時。在預培育達至穩定狀態平衡後，各樣品經受以下五步驟分析循環：1)將VEGFA165結合之珠粒之小管柱填充至毛細管中達到預界定高度，2)將界定體積之各離散人類VEGFA165/化合物混合物在管柱上方注射持續界定時段，3)將界定體積的適當螢光標記之抗體(亦即CY5標記之抗人類Fc γ特異性，Immunoresearch編號309-175-008)在管柱上方注射，4)管柱用1×PBS洗滌，以移除過量偵測抗體及任何非特異性結合之材料，及5)特異性結 合之材料的偵測藉由激發及後續發射監測所結合之二級抗體來量測。因此，在此等步驟中生成的信號之相對強度與各測試溶液中存在的游離/未複合化合物之程度成比例。螢光強度之所得複合組繪製為各離散樣品中存在之人類VEGFA165之濃度的函數，且使用N-曲線分析軟體(KinExA)擬合成標準兩種狀態結合模型，以測定對所出示之MOI的KD。統計信賴藉由計算95%信賴區間報導。
在基本上如所述進行之實驗中，在37℃下對化合物A之結合為84pM(表4)，且在25℃下對化合物A之結合為26.6pM(表5)。
經由固相Elisa的人類Ang2與人類Tie2相互作用之抑制
本發明化合物對人類Ang2結合至其受體人類Tie 2之阻斷在固相活體外ELISA分析中量測。活體外基於細胞之分析用於在本發明化合物及與該化合物之scFv多肽部分具有相同HCDR及LCDR序列的Ang2抗體之間建立類似阻斷活性。
對此分析，將高結合96孔ELISA盤(Costar編號2592)用4μg/ml(於100μl中)重組人類Tie2-Fc(R&D Systems編號313-TI)塗佈，在室溫下隔夜。將盤用TBST(含有0.05% Tween 20之Tris緩衝鹽水)洗滌3×，且接著用300微升/孔之阻斷緩衝液(0.5% BSA/D-PBS)(BSA：Jackson ImmunoResearch編號001-000-162；無IgG，無蛋白酶)在室溫下在環繞式振盪器上阻斷1至2小時。在阻斷步驟期間，在獨立聚丙烯多孔盤中，75μl之2×測試化合物(連續1：3稀釋於阻斷緩衝液中)與75μl之2× 生物素標記人類Ang2(R&D Systems編號BT623)(亦稀釋於阻斷緩衝液中)一起添加。化合物/生物素標記Ang2混合物接著在37℃下培育1小時(最終生物素標記Ang2濃度為100ng/ml)。自Tie2-Fc塗佈之ELISA盤移除阻斷溶液，其後添加50微升/孔之化合物/生物素標記Ang2混合物(在雙份孔中)。接著將盤用盤封膜覆蓋，在室溫下在環繞式振盪器上培育2小時。接著將盤洗滌3×，其後添加100微升/孔之1：200稀釋於阻斷緩衝液中的抗生蛋白鏈菌素-HRP(R&D Systems編號DY998)。接著將盤用盤封膜覆蓋，在室溫下在環繞式振盪器上培育35分鐘。接著將盤再次洗滌3×。
藉由添加升溫至室溫的100微升/孔之One Component TMB底物(Surmodics/BioFX Labs編號TMBW-1000-01)來使盤顯色。使顯色在室溫下進行10分鐘，盤用鋁箔覆蓋。顯色用100微升/孔之停止溶液(Surmodics/BioFX Labs編號LSTP-1000-01)停止。將盤在環繞式振盪器上混合，其後在450nM下在ELISA讀取器(Molecular Devices SpectraMax 190)上使用SOFTmax PRO 5.4.1軟體(Molecular Devices Corp.)讀取。A450值反映保持結合至Tie-2-Fc的生物素標記Ang2之量。A450值之減小反映生物素標記Ang2結合至Tie-2-Fc受到阻斷。
用於抑制Ang2結合至Tie-2之IC50值用SigmaPlot 9.0，使用「藥理學(Pharmacology)」選單，「標準曲線分析(Standard Curves Analysis)」功能計算。曲線使用4-參數邏輯擬合(Hillslope方法)來擬合。
在基本上如此分析中所述進行之實驗中，化合物A及化合物A之Ang2親代抗體產生分別為0.118nM及0.087nM之幾何平均IC50值(n=1)。化合物A劑量依賴性地阻斷人類Ang2結合至人類Tie-2，與Ang2親代抗體類似。此資料指示化合物A之Ang2 scFv多肽部分在此分析中具有與親代Ang2抗體之效能類似的效能。
Ang2介導之Tie2磷酸化而非Ang1介導之磷酸化的中和
本發明化合物對人類Ang2的活體外基於細胞之抑制在基於細胞之分析中量測，其中Ang1及Ang2結合至人類Tie2，且以劑量依賴性方式誘發人類Tie2磷酸化。活體外基於細胞之分析用於評估本發明化合物以劑量依賴性方式選擇性中和Ang2而非Ang1介導之Tie-2受體磷酸化的能力。分別包括Ang2抗體、Ang2/Ang1抗體及對照人類IgG4PAA同型抗體作為陽性及陰性對照物。
CHO-Tie2細胞株藉由穩定轉染全長人類Tie2受體(在C端處有3×FLAG標籤)生成。CHO-Tie2細胞維持於Hams F-12(CellGro/Mediatech編號10-080-CV)、10%熱失活FBS(Life Technologies/Invitrogen編號10082-147)、1×抗生素-抗黴菌素(Life Technologies/Invitrogen #15240-062)、1.25mg/ml G418(Corning Cellgro編號30-234-CI)、10μg/ml嘌呤黴素(puromycin)(Calbiochem編號540411)及0.078%碳酸氫鈉(Thermo Hyclone編號SH30033.01)之完全培養基中。
此分析中，將CHO-Tie2細胞以10,000個細胞/孔(於100μl生長培養基中)再懸浮至聚離胺酸塗佈之96孔盤(BD Biocoat編號356640)之內部60孔中。將200μl之D-PBS置放至邊緣孔中以減少蒸發。細胞在37℃、95% RH、5% CO2下培育隔夜。次日，洗滌細胞一次，且培養基用100μl含有0.1% BSA(Sigma編號A7979，低內毒素)之無血清生長培養基替換。細胞接著於無血清培養基中在37℃、95% RH、5% CO2下饑餓7至24小時。在饑餓時段期間，化合物(在6×最終濃度下)於聚丙烯盤中含有0.1% BSA之無血清生長培養基中連續1：2稀釋。人類Ang2(R&D Systems編號623-AN，復原於D-PBS/0.1% BSA中)及人類Ang1(R&D Systems編號923-AN，復原於D-PBS/0.1% BSA中)亦於含有0.1% BSA之無血清生長培養基中稀釋至6×最終濃度。測試化合物及Ang2 或Ang1配位體接著以1：1比率(v/v)於聚丙烯盤中混合，且在37℃下培育60至80分鐘。化合物/配位體混合物接著以50微升/孔添加至細胞(三個重複孔/處理)中，且在37℃、95% RH、5% CO2下培育13分鐘至21小時。化合物之最終濃度範圍為0.125至383nM，且人類Ang2及Ang1之最終濃度分別為0.3μg/ml(約6nM)及0.5μg/ml(約8.9nM)。在培育時間之後，培養基迅速且完全自細胞移除，且將細胞溶解於60微升/孔之冷1×Tris溶胞緩衝液(Meso Scale Discovery編號R60TX；150mM NaCl，20mM Tris pH 7.5，1mM EDTA，1mM EGTA，1% Triton X-100)中，其含有新添加之蛋白酶及磷酸酶抑制劑(1×蛋白酶抑制劑混合液，Sigma編號P8340；1×磷酸酶抑制劑混合液2，Sigma編號P5726；1×磷酸酶抑制劑混合液3，Sigma編號P0044；1mM最終活化之原釩酸鈉EMD Chemicals編號567540)。接著將盤置放於冰上10分鐘，其後可置放於環繞式振盪器上以低速度在4℃下持續25分鐘。接著將盤密封，且在-80℃下冷凍。
在分析磷酸化Tie2(使用來自R&D Systems的人類磷酸化Tie2 DuoSet ELISA套組，編號DYC2720)之前一天，高結合ELISA盤(Greiner BioOne，編號655081)在4℃下用4μg/ml小鼠抗人類總Tie2捕捉抗體於1×ELISA塗佈緩衝液(Surmodics/BioFX Labs編號COAT-1000-01)中塗佈隔夜。
磷酸化Tie2量測當天，將含有溶胞物之盤於冰上解凍。經塗佈之ELISA盤用洗滌緩衝液(含有0.05% Tween 20之1×TBST)洗滌，且在室溫下在環繞式振盪器上(同時用盤封膜覆蓋)用300微升/孔之阻斷緩衝液(1% BSA(Jackson ImmunoResearch編號001-000-162；無IgG，無蛋白酶)，0.01%疊氮化鈉)阻斷最少1小時。在阻斷期間，溶胞物於聚丙烯盤中含有蛋白酶及磷酸酶抑制劑之冷溶胞緩衝液中1：5或1：10稀釋。將ELISA盤洗滌4×，且添加100微升/孔之稀釋溶胞物或磷酸化Tie2 ELISA標準物，且用封膜覆蓋，在室溫下在環繞式振盪器上培育2小時。將盤洗滌4×，且添加100微升/孔之HRP結合小鼠抗磷酸化酪胺酸(如小瓶上所建議於TBST/0.1% BSA中稀釋)。盤可接著用封膜覆蓋，且在室溫下在環繞式振盪器上培育2小時。接著將盤洗滌6×，且確保自孔移除液體。接著藉由添加100微升/孔之One Component TMB底物(Surmodics/BioFX Labs編號TMBW-1000-01)來使盤顯色。使盤在室溫下用鋁箔覆蓋顯色30分鐘。顯色用100微升/孔之停止溶液(Surmodics/BioFX Labs編號LSTP-1000-01)停止。接著將盤在環繞式振盪器上混合。ELISA盤在450nm下在ELISA讀取器(Molecular Devices SpectraMax 190)上使用SOFTmax PRO 5.4.1軟體(Molecular Devices Corp.)讀取。樣品之磷酸化Tie2值獲自標準曲線(4-參數邏輯擬合)，且乘以稀釋因數5或10。
抑制Ang2誘發之磷酸化Tie2的IC50值用GraphPad Prism 4使用經對數轉換之X值計算。對經對數轉換之資料進行非線性回歸(曲線擬合)分析(S形劑量反應，可變斜率)，獲得IC50值。
在基本上如此分析中所述進行之實驗中，化合物A在CHO-Tie2細胞中劑量依賴性地中和人類Ang2誘發之磷酸化Tie2，其IC50為0.87nM(n=1)，同時親代Ang2抗體之IC50為1.01nM。結果指示當與陽性對照Ang2/Ang1抗體相比時，化合物A在CHO-Tie-2細胞中中和Ang2誘發之磷酸化Tie2，但並未中和人類Ang1誘發之磷酸化Tie2。另外，此資料指示化合物A之Ang2 scFv多肽部分在此分析中維持了與親代Ang2抗體之效能類似的效能。
人類VEGFA誘發之人類VEGFR2磷酸化之中和
人類VEGFA的活體外基於細胞之抑制在基於細胞之分析中量測，其中VEGFA165與VEGFR2表現細胞株上之VEGFR2的結合以劑量依賴性方式誘發VEGFR2磷酸化。該分析用於評估本發明化合物以劑 量依賴性方式選擇性中和VEGFA介導之VEGFR2受體磷酸化的能力。包括VEGFA抗體及不相關抗體人類IgG4 PAA同型分別作為陽性及陰性對照物。
分析時，取表現VEGFR2之人類ECFC(形成內皮群落之細胞，來源於臍帶血內皮祖細胞)(Endgenitor Technologies，批次100506-14-P4，繼代8至10次)以14,000個細胞/孔(於100μl生長培養基中)接種至經膠原蛋白I塗佈之96孔盤(BD Biocoat編號35-4407)之內部60個孔中的生長培養基：EGM-2MV BulletKit(Lonza編號CC-4147)中。所包括EGM-2MV Singlequot袋之組分可添加至500ml之EBM-2基礎培養基中，調整至10%最終FBS濃度(Life Technologies/Invitrogen編號10082-147，熱失活)。將250μl之生長培養基置放至邊緣孔中以減少蒸發。細胞在37℃、95% RH、5% CO2下培育。次日，移除培養基，且用100μl含有0.1% BSA(Sigma編號A7979，低內毒素)之無血清EBM-2基礎培養基替換。細胞在37℃、95% RH、5% CO2下饑餓6.5小時。在饑餓時段期間，化合物(在6×最終濃度下)於聚丙烯盤中，使用EBM-2/0.1% BSA連續1：4稀釋。人類VEGFA165於EBM-2/0.1% BSA中稀釋至6×最終濃度。化合物及VEGFA165接著以1：1比率(v/v)於聚丙烯盤中混合，且在37℃下培育1小時。化合物/VEGFA165混合物接著以50微升/孔添加至細胞(每種處理重複三個孔)中，且在37℃、95% RH、5% CO2下培育5分鐘。(化合物之最終濃度範圍為0.018至300nM，且人類VEGFA165之最終濃度為0.16nM)。培養基自細胞移除，且將細胞溶解於60微升/孔之冷1×Tris溶胞緩衝液(Meso Scale Discovery編號R60TX；150mM NaCl，20mM Tris pH 7.5，1mM EDTA，1mM EGTA，1% Triton X-100)中，其含有新添加之1×蛋白酶及磷酸酶抑制劑(包括於磷酸化VEGFR2分析套組中)。將盤置放於冰上10分鐘，接著置放於環繞式振盪器上，以低速度在4℃下持續20分鐘。接著將盤 密封，且在-80℃下冷凍。
磷酸化VEGFR2量測當天，將含有溶胞物之盤在冰上解凍。使用磷酸化-VEGFR2(Tyr1054)全細胞溶胞物套組(Meso Scale Discovery編號K151DJD)量測磷酸化VEGFR2含量。使用已預塗佈針對磷酸化VEGFR2之抗體的Meso Scale分析盤，用150微升/孔之阻斷緩衝液(含3%阻斷劑之TBST)在室溫下在環繞式振盪器(同時使用封膜覆蓋)上阻斷最少1小時。將盤用1×Meso Scale洗滌緩衝液洗滌3×，且每孔添加50μl溶胞物(用封膜覆蓋，在室溫下在環繞式振盪器上培育1小時)。將盤洗滌3×，且添加25微升/孔之1×MSD SULFO-TAGTM與抗總VEGFR2之結合物(在製造商推薦之抗體稀釋劑中稀釋)，且用封膜覆蓋，在室溫下在環繞式振盪器上培育1小時。將盤洗滌3×，且自孔移除液體。將150微升/孔之1×讀取緩衝液T添加至盤中，且在Meso Scale Discovery SECTOR Imager MA6000上即刻讀取。
抑制VEGFA165誘發之磷酸化VEGFR2的IC50值用GraphPad Prism 4使用經對數轉換之X值計算。對經對數轉換之資料進行非線性回歸(曲線擬合)分析(S形劑量反應，可變斜率)，獲得IC50值。若實驗進行超過一次，則計算實驗之間的幾何平均IC50值。
在基本上如此分析中所述進行之實驗中，化合物A之IC50為0.252nM(n=2)，其與親代VEGFA抗體的0.194nM(n=2)之IC50類似。結果指示化合物A之VEGFA抗體部分維持了效能。結果亦展示化合物A具有與IC50為0.290nM之貝伐單抗(購自Myoderm Medical Supply，Norristown，PA)類似的VEGFA165中和活性。
VEGFA誘發之細胞增殖之中和
本發明化合物對人類VEGFA的活體外基於細胞之抑制在基於細胞之分析中量測，其中VEGFA165以劑量依賴性方式誘發增殖。本發明化合物中和人類VEGFA165誘發之增殖的能力在人類ECFC(形成內 皮群落之細胞，來源於臍帶血內皮祖細胞)中量測。包括VEGFA抗體及不相關人類IgG4 PAA抗體作為陽性及陰性對照物。
將人類ECFC(Endgenitor Technologies，批次100506-14-P4)維持在膠原蛋白塗佈之燒瓶中EGM-2MV BulletKit(Lonza編號CC-4147)中。所包括EGM-2MV Singlequot袋之組分添加至500ml之EBM-2基礎培養基中，調整至10%最終FBS濃度(Life Technologies/Invitrogen編號10082-147，熱失活)。
分析時，繼代7至12次之ECFC在預升溫之細胞平板接種培養基中洗滌兩次，且以每150微升/孔之細胞平板接種培養基4,200個細胞接種至經膠原蛋白I塗佈之96孔盤(BD Biocoat編號35-4407)之內部60個孔中。將250μl分析稀釋劑添加至邊緣孔中以減少蒸發。細胞平板接種培養基由具有厄爾氏鹽(Earle's Salts)(Life Technologies/Invitrogen編號11150-059)含有3.3% FBS(Life Technologies/Invitrogen編號10082-147，熱失活)之培養基199(M199)、10mM HEPES(Thermo Scientific/HyClone編號SH30237.01)及1×青黴素-鏈黴素(Thermo Scientific/HyClone編號SV30010)組成。分析稀釋劑由含有0.1% BSA(Sigma編號A7979，低內毒素)之無血清M199/HEPES/青黴素-鏈黴素組成。在處理之前，細胞在37℃、95% RH、5% CO2下培育60至90分鐘。化合物及人類VEGFA165在分析稀釋劑中以8×最終濃度稀釋。化合物在聚丙烯盤中分析稀釋劑中連續1：4稀釋。化合物及VEGFA165接著以1：1比率(v/v)在聚丙烯盤中混合，且在37℃下培育1至3小時。化合物/VEGFA165混合物接著以50微升/孔添加至細胞(重複三個孔/處理)中，且在37℃、95% RH、5% CO2下培育總共3天。化合物之最終濃度範圍為0.049至800nM，且人類VEGFA165之最終濃度為0.16至0.5nM。
在培育期結束之前兩天，細胞用10μl(1μCi)之甲基-3H胸苷 (Perkin Elmer編號NET027005MC，6.7Ci/mmol；1mCi/ml儲備液1：10稀釋於PBS中)脈衝。在培育期結束時，將盤在-80℃下冷凍，且接著在37℃下解凍1至2小時。細胞接著在96孔玻璃纖維過濾盤(Perkin Elmer UniFilter，GF/C，編號6005174)上用蒸餾水收集。在過濾盤風乾之後，併入之3H胸苷在20μl閃爍體/孔(MicroScint 0，Perkin Elmer編號6013611)中在Perkin Elmer-Packard TopCount微定量盤式閃爍計數器上計數。
抑制VEGFA165誘發之增殖的IC50值用GraphPad Prism 4使用經對數轉換之X值計算。包括單獨培養基值作為曲線之最高點；單獨培養基之X值(濃度)設定為最高X值的100倍。另外，包括單獨VEGFA值作為曲線之最低點；單獨VEGFA之濃度設定為最低X值的1/100。對經對數轉換之資料進行非線性回歸(曲線擬合)分析(S形劑量反應，可變斜率)，獲得IC50值。若實驗進行超過一次，則計算實驗之間的幾何平均IC50值。
在基本上如此分析中所述進行之實驗中，化合物A劑量依賴性地中和人類VEGFA165誘發之ECFC增殖至與親代VEGFA抗體及貝伐單抗(n=2至3次實驗)類似的水準，其IC50分別為1.18nM、1.38nM及2.68nM。
在氧氣誘發之視網膜病變模型中病理性血管生成之壓制
VEGFA-Ang2雙特異性分子(諸如化合物A)對病理性血管生成之活體內壓制在小鼠視網膜中氧氣誘發之視網膜病變的模型中量測。該分析用於研究本發明化合物壓制小鼠視網膜中病理性血管生成的能力。
對此分析，將懷孕雌性分娩幼鼠的當天標記為P0(產後第0天)。分娩之後，在第7天(P7)，將幼鼠置放於75%氧氣下之腔室中。在P12，將幼鼠移回室內空氣(20%氧氣)下，且用媒劑對照物(PBS)或10 mg/kg之Ang2或VEGFA抗體或13.5mg/kg之測試化合物注射，維持分子之類似莫耳量。在P15，將幼鼠以相同劑量注射第二次。在P17，處死小鼠，且收集眼睛，且將其固定於福馬林中5小時，且用PBS洗滌。
接著剝離視網膜，且沾染以1：200稀釋之抗CD31(BD Pharmingen；純系MEC 13.3；編號553370)及以1：200稀釋之抗SMA-FTIC(Sigma；純系1A4編號F3777)。對於經抗CD31處理之視網膜，以1：400稀釋之抗大鼠Alexa-647抗體(Jackson Immuno Research；編號712-606-153)用作二級抗體。視網膜之獲取藉由使用Nikon Ti完成，且包圍病理性血液內皮細胞結構之面積，亦即完整視網膜之絲球體樣微血管增殖(GMP；glomeruloid microvascular proliferation)的定量藉由使用FIJI軟體進行。高放大率影像使用共焦Nikon A1獲得。
在基本上如此分析中所述進行之實驗中，化合物A以及親代Ang2抗體及親代VEGFA抗體之組合處理類似地壓制完整視網膜之GMP面積，其中平均值(%)分別為17.20%(標準誤差3.853)及14.10%(標準誤差3.822)，p=0.9778。另外，與分別展示平均值(%)為83.03%(標準誤差4.542)p<0.0001及40.14%(標準誤差2.189)p=0.029的單獨親代Ang2抗體或親代VEGFA抗體處理相比，化合物A展示對完整視網膜之GMP面積的壓制增加。此等結果指示化合物A不僅維持等效於Ang2抗體加VEGFA抗體之組合處理的功能及效能，而且當與各試劑單獨相比時具有優良處理效應。
VEGFA誘發之索狀組織(cord)形成之抑制
VEGFA誘發之索狀組織形成的活體外抑制在活體外共培養系統中量測。該分析用於量測本發明化合物對VEGFA誘發之索狀組織形成的抑制。
對此分析，脂肪源性幹細胞(ADSC；Lonza編號PT5006，批號OF4505-01)在Corning培養燒瓶(Corning編號431082)上EGM-2MV培養基(Lonza編號CC3202)中培養。形成內皮群落之細胞(ECFC；Lonza，批號EGT-ECFC100506r)在經膠原蛋白I塗佈之燒瓶(BD Biosciences編號356486)上補充有5%熱失活FBS(Gibco編號10082-147)之EGM-2MV培養基中培養。用DPBS(Hyclone編號SH30028.03)接著TrypLE表現(Gibco編號12605-010)沖洗培養燒瓶，自培養燒瓶收集繼代4至6次之ADSC。將ADSC細胞懸浮於基礎培養基(補充有10μg/ml胰島素、1μM地塞米松(dexamethasone)、30μg/ml抗壞血酸、10μg/ml人類運鐵蛋白及50μg/ml托普黴素(tobramycin)之MCDC-131(Gibco編號10372-019))中。測定活細胞數量，且將細胞以4×104個細胞/孔接種至黑色、透明底部96孔盤(BD Falcon編號353219)上100μl基礎培養基中。細胞在37℃下在5% CO2中培育隔夜以允許附接。次日，如上在基礎培養基中收集繼代7至10次之ECFC，且將活細胞數量調整至4×104個細胞/毫升。培養基自ADSC細胞移除，且將100μl ECFC細胞懸浮液添加至 各孔中。將盤在37℃下在5% CO2中培育2至3小時以允許細胞沈降在ADSC單層頂部上。將本發明化合物於基礎培養基中稀釋至80μg/ml，且接著用基礎培養基連續1：3稀釋，製備九點劑量反應系列。將50μl之各化合物稀釋液添加至共培養物中。將在基礎培養基中製備的50μl之rhVEGFA(R&D編號293-VE/CF，50μg/ml於DPBS中)之80ng/ml溶液添加至共培養物加化合物組合中。化合物及rhVEGFA之最終濃度分別為20μg/ml及20ng/ml。用於分析之陽性對照物為無化合物存在之20ng/ml rhVEGFA。用於分析之陰性對照物為無rhVEGFA之基礎培養基。接著將盤在37℃下在5% CO2中培育3天以允許索狀組織形成。
在培育期結束時，自各孔抽吸培養基，且小心地添加100μl室溫80%乙醇。將盤在室溫下培育20分鐘。抽吸乙醇溶液，且將孔用150μl DPBS洗滌兩次。抗huCD31(R&D編號AF806親和力純化之羊IgG，200ug/ml)及MAB抗肌動蛋白、α-平滑肌-Cy3(Sigma編號C6198)各自於2.5% FBS/DPBS中1：250稀釋。將100μl抗體混合物添加至孔中，且將盤在37℃下於5% CO2中培育2小時。接著抽吸盤，且將孔用150μl DPBS洗滌兩次。將Alexa Fluor 488驢抗羊IgG(H+L)(Life Technologies編號A11015)1：400稀釋，且將Hoescht 33342(Life Technologies編號H3570)於2.5% FBS/DPBS中1：1000稀釋，且將100微升/孔添加至盤中。將盤在室溫下在受到保護免受光照的情況下培育30分鐘。接著將孔用150μl DPBS洗滌兩次。將150μl DPBS添加至各孔中，盤用黑色黏性封膜(PerkinElmer編號6050173)密封。
盤在ArrayScan VTI HCS讀取器(Cellomics-Thermo Fisher)上使用管形成生物應用(Tube Formation Bio-application)讀取。總管面積資料針對化合物濃度以nM為單位在GraphPad Prism 6中繪製。將化合物濃度轉換為對數資料，且抑制之IC50值藉由非線性回歸(S形劑量反應， 可變斜率)計算。各實驗表示一式三份之平均值，且一式三份實驗表示為所計算之幾何平均值及95%信賴區間。
在基本上如此分析中所述進行之實驗中，化合物A劑量依賴性地抑制ADSC/ECFC共培養系統中人類VEGFA誘發之索狀組織形成，與貝伐單抗及親代VEGFA抗體類似，其平均IC50分別為1.680nM、1.578及1.570nM(n=3)。此指示化合物A之VEGFA抗體部分在此基於細胞之分析中維持了與親代VEGFA抗體相當的效能。
化合物A抑制活體內腫瘤生長
本發明化合物之功效經由活體內異種移植模型量測。親代VEGFA抗體、化合物A及其組合之抗腫瘤功效在皮下三陰性患者源性乳癌模型(EL1997)及皮下卵巢異種移植模型(SKOV3x.1)中評估。將攜帶腫瘤之小鼠用PBS中稀釋之化合物處理，以每週兩次形式經由腹膜內注射來處理。在處理過程期間，每週兩次藉由腫瘤體積之三維測徑規量測來測定腫瘤生長。
EL1997三陰性乳房患者源性異種移植：攜帶約350mm3體積的EL1997三陰性乳房患者源性異種移植物(TNBC PDX)的免疫缺陷小鼠以n=7隻小鼠/組隨機化，將其用媒劑對照物、20mg/kg親代VEGFA抗體、20mg/kg親代Ang2抗體或以26.7mg/kg給藥之抗體A處理。處理一週投與兩次，持續4個連續週。
在基本上如所述進行之實驗中，親代VEGFA抗體及親代Ang2抗體處理組分別展現12%及56.7%之%T/C(腫瘤體積改變)。當與親代VEGFA抗體相比時，化合物A引起-15.4%之消退%，其中p=0.0151。此等結果指示化合物A具有大於單獨用親代VEGFA抗體或親代Ang2抗體處理之功效。
SKOV3x.1卵巢異種移植：攜帶約250mm3體積的SKOV3x.1卵巢異種移植物之免疫缺陷小鼠以n=10隻小鼠/組隨機化，將其用媒劑對 照物、10mg/kg親代VEGFA抗體、10mg/kg親代Ang2抗體、親代VEGFA抗體及親代Ang2抗體各10mg/kg之組合或13.3mg/kg(與10mg/kg抗體等莫耳)化合物A處理。處理可一週投與兩次，持續4週。
在基本上如所述進行之實驗中，親代VEGFA抗體及親代Ang2抗體之單一療法處理分別引起9.6%及38.5%之%T/C。親代VEGFA抗體及親代Ang2抗體之組合或化合物A分別引起-8.1%及-2.7%之腫瘤消退。此等結果指示，在異種移植模型中，化合物A具有功效大於單獨親代VEGFA抗體或單獨親代Ang2抗體的可能性。
胺基酸及核苷酸序列
SEQ ID NO：1(抗體之HCVR-化合物A)
SEQ ID NO：2(抗體之HC-化合物A)
SEQ ID NO：3(抗體之HC/連接子/scFv多肽-化合物A)
SEQ ID NO：4(抗體之LCVR-化合物A)
SEQ ID NO：5(抗體之LC-化合物A)
SEQ ID NO：6(scFv多肽-化合物A)
SEQ ID NO：7(scFv多肽之HCVR-化合物A)
SEQ ID NO：8(scFv多肽之LCVR-化合物A)
SEQ ID NO：9(抗體之HC/連接子/scFv多肽-化合物A的DNA)
SEQ ID NO：10(抗體之LC-化合物A的DNA)
SEQ ID NO：11(人類VEGFA165)
SEQ ID NO：12(人類Ang2)
SEQ ID NO：13 GGGGSGGGGS
SEQ ID NO：14 GGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO：15 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO：16 GGGGSGGGGSGGGGSGGGGSGGGGS
SEQ ID NO：17 GGGSGGGGSGGGGS
<110> 美國禮來大藥廠
<120> VEGFA/ANG2化合物
<130> X20409
<150> 62/108,600
<151> 2015-01-28
<160> 17
<170> PatentIn version 3.5
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<213> 人工序列
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<223> 合成構築體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 2
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 4
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<220>
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<220>
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<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 13
<210> 14
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 14
<210> 15
<211> 20
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 15
<210> 16
<211> 25
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 16
<210> 17
<211> 14
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 合成構築體
<400> 17

Claims (23)

  1. 一種化合物，其包含藉由兩個連接子融合至兩個單鏈可變片段(scFv)多肽之抗體，其中：a)該抗體包含兩個相同重鏈(HC)及兩個相同輕鏈(LC)，其中各HC包含重鏈可變區(HCVR)，該HCVR之胺基酸序列在SEQ ID NO：1中出示，且其中各LC包含輕鏈可變區(LCVR)，該LCVR之胺基酸序列在SEQ ID NO：4中出示，b)該兩個scFv多肽為相同的，且各自包含可操作地連接至LCVR之HCVR，其中各HCVR具有在SEQ ID NO：7中出示之胺基酸序列，且其中各LCVR具有在SEQ ID NO：8中出示之胺基酸序列，且c)該兩個連接子為相同的富含甘胺酸之連接子，其各自可操作地將該抗體之一個HC的羧基端連接至該等scFv多肽中之一者的胺基端。
  2. 如請求項1之化合物，其中該兩個scFv多肽各自包含可操作地連接至一個scFv多肽之LCVR之胺基端的一個scFv多肽之HCVR之羧基端。
  3. 如請求項1或2之化合物，其中該抗體包含兩個重鏈(HC)及兩個輕鏈(LC)，其中各HC具有在SEQ ID NO：2中之一者中出示的胺基酸序列，且各LC具有在SEQ ID NO：5中之一者中出示的胺基酸序列。
  4. 如請求項1或2之化合物，其中各scFv多肽具有在SEQ ID NO：6中出示之相同胺基酸序列。
  5. 一種化合物，其包含兩個第一多肽及兩個第二多肽，其中該等第一多肽中之每一者具有SEQ ID NO：3之胺基酸序列，且該等第 二多肽中之每一者具有SEQ ID NO：5之胺基酸序列。
  6. 如請求項5之化合物，其中該等第一多肽中之每一者與該等第二多肽中之每一者形成鏈間二硫鍵，且該第一多肽與另一第一多肽形成兩個鏈間二硫鍵，且該等第一多肽中之每一者形成七個鏈內二硫鍵。
  7. 如請求項1、2、5及6中任一項之化合物，其用於療法。
  8. 如請求項1、2、5及6中任一項之化合物，其用於治療癌症。
  9. 如請求項8之化合物，其中該癌症為乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、結腸直腸癌或肝細胞癌。
  10. 如請求項1、2、5及6中任一項之化合物，其用於治療增生性視網膜病變。
  11. 如請求項10之化合物，其中該增生性視網膜病變為糖尿病性視網膜病變或早產兒視網膜病變。
  12. 如請求項1、2、5及6中任一項之化合物，其用於治療血管生成性眼睛疾病。
  13. 如請求項12之化合物，其中該血管生成性眼睛疾病為新生血管性青光眼、年齡相關之黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、角膜新血管生成、角膜移植新血管生成、角膜移植排斥、視網膜/脈絡膜新血管生成、房角之新血管生成(虹膜紅變)、眼部新生血管性疾病、血管再狹窄或動靜脈畸形(AVM)。
  14. 一種包含DNA分子之哺乳動物細胞，該DNA分子包含編碼藉由SEQ ID NO：3出示之第一多肽的聚核苷酸序列及編碼藉由SEQ ID NO：5出示之第二多肽的聚核苷酸序列，其中該細胞能夠表現包含該第一多肽及該第二多肽之化合物。
  15. 一種製備包含藉由SEQ ID NO：3出示之兩個第一多肽及藉由SEQ ID NO：5出示之兩個第二多肽之化合物的方法，其包含在使得該 化合物得以表現之條件下培養如請求項14之哺乳動物細胞，且回收該經表現之化合物。
  16. 一種可藉由如請求項15之方法獲得的化合物。
  17. 一種醫藥組合物，其包含如請求項1至6中任一項之化合物及可接受之載劑、稀釋劑或賦形劑。
  18. 一種如請求項1至6中任一項之化合物的用途，其用於製造治療癌症之藥劑。
  19. 如請求項18之用途，其中該癌症為乳癌、肺癌、卵巢癌、胃癌、結腸直腸癌或肝細胞癌。
  20. 一種如請求項1至6中任一項之化合物的用途，其用於製造治療增生性視網膜病變之藥劑。
  21. 如請求項20之用途，其中該增生性視網膜病變為糖尿病性視網膜病變或早產兒視網膜病變。
  22. 一種如請求項1至6中任一項之化合物的用途，其用於製造治療血管生成性眼睛疾病的藥劑。
  23. 如請求項22之用途，其中該血管生成性眼睛疾病為新生血管性青光眼、年齡相關之黃斑變性、糖尿病性黃斑水腫、角膜新血管生成、角膜移植新血管生成、角膜移植排斥、視網膜/脈絡膜新血管生成、房角之新血管生成(虹膜紅變)、眼部新生血管性疾病、血管再狹窄或動靜脈畸形(AVM)。
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