ES2876407T3

ES2876407T3 - Anticuerpos anti-Pd-1

Info

Publication number: ES2876407T3
Application number: ES17746860T
Authority: ES
Inventors: Hemanta Baruah; Cheng Chen; Xiaolin Liu; Andy Tsun; De-Chao Michael Yu
Original assignee: Innovent Biologics Suzhou Co Ltd
Current assignee: Innovent Biologics Suzhou Co Ltd
Priority date: 2016-02-02
Filing date: 2017-01-23
Publication date: 2021-11-12
Anticipated expiration: 2037-01-23
Also published as: EP3411410A1; CN108779177B; EP3411410A4; EP3411410B1; DK3411410T3; US20190040149A1; JP6533630B2; WO2017133540A1; US10913801B2; JP2019512017A; WO2017132827A1; CN108779177A

Abstract

Un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), que comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC), en donde la cadena ligera comprende regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera. LCDR1, LCDR2 y LCDR3 y la cadena pesada comprende regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada HCDR1, HCDR2 y HCDR3, en donde: (i) LCDR1, LCDR2 y LCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 14), YDASKRAT (SEQ ID NO: 15) y DQRNNWPLT (SEQ ID NO: 16), respectivamente, y HCDR1, HCDR2 y HCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos KASGYTFTSYYMH (SEQ ID NO: 2), IINPSGGSTSYAQKFQG (SEQ ID NO: 8) y AKEGVADGYGLVDV (SEQ ID NO: 13), respectivamente; (i) LCDR1, LCDR2 y LCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 14), YDASKRAT (SEQ ID NO: 15) y DQRNNWPLT (SEQ ID NO: 16), respectivamente, y HCDR1, HCDR2 y HCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos KASGYTFEGYYMH (SEQ ID NO: 3), IINPEGGETSYAQKFQG (SEQ ID NO: 9) y AKEGVADGYGLVDV (SEQ ID NO: 13), respectivamente; (iii) LCDR1, LCDR2 y LCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos: RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 14), YDASKRAT (SEQ ID NO: 15) y DQRNNWPLT (SEQ ID NO: 16), respectivamente, y HCDR1, HCDR2 y HCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos KASGYTFTAQYMH (SEQ ID NO: 4), IINPSGGETGYAQKFQG (SEQ ID NO: 10) y AKEGVADGYGLVDV (SEQ ID NO: 13), respectivamente; (iv) LCDR1, LCDR2 y LCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 14), YDASKRAT (SEQ ID NO: 15) y DQRNNWPLT (SEQ ID NO: 16), respectivamente, y HCDR1, HCDR2 y HCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos KASGYTFEKYYMH (SEQ ID NO: 5), IINPDGGSTGYAQKFQG (SEQ ID NO: 12) y AKEGVADGYGLVDV (SEQ ID NO: 13), respectivamente; (v) LCDR1, LCDR2 y LCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 14), YDASKRAT (SEQ ID NO: 15) y DQRNNWPLT (SEQ ID NO: 16), respectivamente, y HCDR1, HCDR2 y HCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos KASGYTFTSNYMH (SEQ ID NO: 6), IINPSEGSTGYAQKFQG (SEQ ID NO: 11) y AKEGVADGYGLVDV (SEQ ID NO: 13), respectivamente; o (vi) LCDR1, LCDR2 y LCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 14), YDASKRAT (SEQ ID NO: 15) y DQRNNWPLT (SEQ ID NO: 16), respectivamente, y HCDR1, HCDR2 y HCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos KASGYTFSAYYMH (SEQ ID NO: 7), IINPDGGSTGYAQKFQG (SEQ ID NO: 12) y AKEGVADGYGLVDV (SEQ ID NO: 13), respectivamente.

Description

DESCRIPCIÓN

Anticuerpos anti-Pd-1

La presente invención se refiere al campo de la medicina. Más particularmente, la presente invención se refiere a anticuerpos que se unen a la proteína de muerte celular programada 1 humana (PD-1) y pueden ser útiles para tratar el cáncer solo y en combinación con quimioterapia y otras terapias contra el cáncer.

Las células tumorales escapan a la detección y eliminación por parte del sistema inmunitario a través de múltiples mecanismos. Las vías de los puntos de control inmunológico se utilizan para el mantenimiento de la auto-tolerancia y el control de las células T activadas, pero las células cancerosas pueden utilizar las vías para evitar la destrucción. La vía de PD-1 / ligando 1 de la proteína de muerte celular programada 1 humana (PD-L1) es uno de esos puntos de control inmunológico. La PD-1 humana se encuentra en las células T, y la unión de PD-L1 y el ligando 2 de muerte celular programada 1 humana (PD-L2) a PD-1 inhibe la proliferación de células T y la producción de citoquinas. Por lo tanto, la producción de células tumorales de PD-L1 y PD-L2 puede permitir escapar de la vigilancia de las células T.

Se ha demostrado que un anticuerpo IgG4 (S228P) completamente humano contra PD-1 humana, nivolumab, inhibe la unión de PD-1 a PD-L1 y PD-L2, y ha sido testado en diversos ensayos clínicos. (Wang et al., Cancer Immunol Res (2014) 2(9):846). Se ha demostrado que un anticuerpo IgG4 (S228P) humanizado contra PD-1, pembrolizumab (anteriormente lambrolizumab), inhibe la unión de PD-1 a PD-L1 y PD-L2, y ha sido testado en diversos ensayos clínicos. (Documento WO2008156712 y Hamid et al., N Engl J Med (2013) 369:2).

El documento WO2014/206107 describe anticuerpos o fragmentos funcionales de los mismos que se unen específicamente a PD-1 con alta afinidad. Los anticuerpos demostraron ser capaces de unirse a PD-1 de seres humanos o de Macaca fascicularis con afinidad similar, pero no a la PD-1 derivada de ratón.

Wang C. et al, Cancer Immunology Research, vol. 2 n° 9 (2014) - arriba citado - describe el desarrollo y la caracterización de nivolumab, demostrando que el tratamiento con este anticuerpo no indujo eventos adversos relacionados con la inmunidad cuando se administró a macacos cynomolgus.

Ikebuchi R. et al., Microbiology and Immunology 54:291 -298 (2010) describe la clonación molecular y caracterización de PD-1 bovina.

Li D. et al., MABS vol. 9 n° 4, 628-637 (2017) describen el desarrollo de un anticuerpo contra PD-1 tanto humana como murina y su mapeo de epítopos para explorar el mecanismo de su actividad de unión entre especies.

Sigue existiendo la necesidad de proporcionar anticuerpos alternativos que se unan y neutralicen la interacción de PD-1 humana con PD-L1 y PD-L2. En particular, sigue existiendo la necesidad de proporcionar anticuerpos que se unan a PD-1 humana con alta afinidad pero con características diferentes a las de los anticuerpos anti-PD-1 clínicamente aprobados, tales como la unión a PD-1 de ratón y humana. Además, sigue existiendo la necesidad de proporcionar anticuerpos que se unan a PD-1 humana con una afinidad similar a la PD-1 clínicamente aprobada, pero que se unen a la PD-1 humana de forma diferente. Además, sigue existiendo la necesidad de proporcionar anticuerpos que bloqueen de forma más eficaz la interacción de PD-1 humana con PD-L1 y PD-L2 que determinados anticuerpos de la técnica anterior. Un mejor bloqueo puede traducirse en una mayor actividad in vivo o menores cantidades de dosificación requeridas.

Determinados anticuerpos de la presente invención bloquean las interacciones de PD-1 humana a PD-L1 y PD-L2 en células CHO de manera más eficaz que nivolumab y pembrolizumab. Además, determinados anticuerpos de la presente invención se unen a PD-1 murino en células CHO, mientras que no se detecta la unión de nivolumab y pembrolizumab a PD-1 murina.

Por consiguiente, en algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), que comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC), en donde la cadena ligera comprende regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera. LCDR1, LCDR2 y LCDR3 que consisten en las secuencias de aminoácidos RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 14), YDASKrAt (SEQ ID NO: 15) y DQRNNWPLT (SEQ ID NO: 16), respectivamente, y en donde la cadena pesada comprende las regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada HCDR1, HCDR2 y HCDR3, en donde HCDR1, HCDR2 y HCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos KASGYTFTs Yy MH (s Eq ID NO: 2), IINPSGGSTs Ya QKFq G (SEQ ID NO: 8) y AKEGVADGYGLVDV (SEQ ID NO: 13), respectivamente.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), en donde LCDR1, LCDR2 y LCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 14), YDASKRAT (SEQ ID NO: 15) y DQRNNWPLT (SEQ ID NO: 16), respectivamente, y en donde HCDR1, HCDR2 y HCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos KASGYTFEGYYMH (SEQ ID NO: 3), IINPEGGETSYAQKFQG (SEQ ID NO: 9) y AKEGVADGYGLVDV (SEQ ID NO: 13), respectivamente.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), en donde LCDR1, LCDR2 y LCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 14), YDASKRAT (SEQ ID NO: 15) y DQRNNWPLT (SEQ ID NO: 16), respectivamente, y en donde HCDR1, HCDR2 y HCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos KASGYTFTa Qy m H (SEQ ID NO: 4), IINPSGGETGy Aq KFQG (SEQ ID NO: 10), y AKEGVADGYGLVDV (SEQ ID NO: 13), respectivamente.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), en donde LCDR1, LCDR2 y LCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 14), YDASKRAT (SEQ ID NO: 15) y DQRNNWPLT (SEQ ID NO: 16), respectivamente, y en donde HCDR1, HCDR2 y HCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos KASGYTFEk Yy m H (SEQ ID NO: 5), IINPDGGSTGYAQKFQG (SEQ ID NO: 12) y AKEGVADGYGLVDV (SEQ ID NO: 13), respectivamente.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), en donde LCDR1, LCDR2 y LCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 14), YDASKRAT (SEQ ID NO: 15) y DQRNNWPLT (SEQ ID NO: 16), respectivamente, y en donde HCDR1, HCDR2 y HCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos KASGYTFTSNYm H (SEQ ID NO: 6), IINPSEGSTGy Aq KFQG (SEQ ID NO: 11) y AKEGVADGYGLVDV (SEQ ID NO: 13), respectivamente.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), en donde LCDR1, LCDR2 y LCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 14), YDASKRAT (SEQ ID NO: 15) y DQRNNWPLT (SEQ ID NO: 16), respectivamente, y en donde HCDR1, HCDR2 y HCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos KASGYTFSa Yy m H (SEQ ID NO: 7), IINPDGGSTGYAQKFQG (SEQ ID NO: 12) y AKEGVADGYGLVDV (SEQ ID NO: 13), respectivamente.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo, que comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC), en donde la cadena ligera comprende una región variable de la cadena ligera (LCVR) y la cadena pesada comprende una región variable de la cadena pesada ( HCVR), en donde la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 23, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 22.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 23, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 17. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 23, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 18. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 23, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 19. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 23, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 20. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 23, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 21. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 23, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22. En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 29.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 24.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 25.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 26.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 27.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 28.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 29.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo, que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 29.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 24.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 25.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 26.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 27.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 28.

En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 29.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde una de las cadenas pesadas forma un enlace disulfuro entre cadenas con una de las cadenas ligeras y la otra cadena pesada forma un enlace disulfuro entre cadenas con la otra cadena ligera, y una de las cadenas pesadas forma dos enlaces disulfuro entre cadenas con la otra cadena pesada.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo, en donde el anticuerpo está glicosilado.

En algunas realizaciones, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une tanto a PD-1 humana como a PD-1 de ratón. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo que es un anticuerpo antagonista y que se une tanto a PD-1 humana como a PD-1 de ratón. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une tanto a PD-1 humana como a PD-1 de ratón con una Kd para cada uno menor que 400 Pm. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo que se une tanto a PD-1 humana como a PD-1 de ratón con una Kd para cada uno menor que 200 pM.

En una realización, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la presente invención y un soporte, diluyente o excipiente aceptable.

En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención para uso en terapia. En una realización, la presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención para uso en el tratamiento del cáncer. En una realización adicional, la presente invención proporciona un anticuerpo de la presente invención, para uso en el tratamiento del cáncer, en donde el cáncer es melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario o carcinoma hepatocelular. En una realización adicional, la presente invención proporciona el anticuerpo de la presente invención para uso en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más agentes antitumorales. En una realización adicional, la presente invención proporciona el anticuerpo de la presente invención para uso en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más agentes antitumorales seleccionados del grupo que consiste en ramucirumab, necitumumab, olaratumab, galunisertib, abemaciclib, cisplatino, carboplatino, dacarbazina, doxorrubicina liposomal, docetaxel, ciclofosfamida y doxorrubicina, navelbina, eribulina, paclitaxel, partículas unidas a proteína paclitaxel para suspensión inyectable, ixabepilona, capecitabina, FOLFOX (leucovorina, fluorouracilo y oxaliplatino), FOLFIRI (leucovorina, fluorouracilo e irinotecan), y cetuximab, en el tratamiento del cáncer.

En una realización adicional, la presente invención proporciona el anticuerpo de la presente invención para uso en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más agentes inmuno-oncológicos. En una realización adicional, la presente invención proporciona el anticuerpo de la presente invención para uso en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más agentes inmuno-oncológicos seleccionados del grupo que consiste nivolumab, ipilimumab, pidilizumab, pembrolizumab, tremelimumab, urelumab, lirilumab, atezolizumab y durvalumab en el tratamiento del cáncer.

Un anticuerpo de la presente invención es un complejo polipeptídico manipulado que no se produce de forma natural. Una molécula de ADN de la presente invención es una molécula de ADN que no se produce de forma natural que comprende una secuencia de polinucleótidos que codifica un polipéptido que tiene la secuencia de aminoácidos de uno de los polipéptidos en un anticuerpo de la presente invención.

Un anticuerpo de la presente invención está diseñado para tener CDR manipuladas genéticamente y tener algunas porciones del anticuerpo (todas o partes de los marcos, regiones bisagra y regiones constantes) de origen humano que son idénticas o sustancialmente idénticas (sustancialmente humanas). con marcos y regiones constantes derivados de secuencias genómicas humanas. Los marcos, las regiones bisagra y las regiones constantes completamente humanos son aquellas secuencias de la línea germinal humana, así como las secuencias con mutaciones somáticas que no se producen de forma natural y aquellas con mutaciones manipuladas genéticamente. Un anticuerpo de la presente invención puede comprender regiones marco, bisagra o constantes derivadas de una región marco, bisagra o constante completamente humana que contiene una o más sustituciones, deleciones o adiciones de aminoácidos en las mismas. Además, un anticuerpo de la presente invención es de preferencia sustancialmente no inmunogénico en seres humanos.

El anticuerpo de la presente invención es un anticuerpo de tipo IgG y tiene cadenas "pesadas" y cadenas "ligeras" que están entrecruzadas mediante enlaces disulfuro intra- e inter-cadena. Cada una de las cadenas pesadas está compuesta por una HCVR N-terminal y una región constante de la cadena pesada ("HCCR"). Cada una de las cadenas ligeras está compuesta por una LCVR y una región constante de la cadena ligera ("LCCR"). Cuando se expresan en determinados sistemas biológicos, los anticuerpos que tienen secuencias Fc humanas nativas están glicosilados en la región Fc. Típicamente, la glicosilación se produce en la región Fc del anticuerpo en un sitio de N-glicosilación altamente conservado. Los N-glicanos se fijan típicamente a asparagina. Los anticuerpos también pueden estar glicosilados en otras posiciones.

Opcionalmente, el anticuerpo de la presente invención contiene una porción Fc que se deriva de la región Fc de IgG⁴humana debido a una capacidad reducida de participar en mecanismos inflamatorios mediados por el receptor Fc o para activar el complemento, dando como resultado una función efectora reducida.

Determinados anticuerpos de la presente invención contienen una porción Fc de IgG4 que tiene una mutación de serina a prolina en la posición 228. La mutación S228P es una mutación de la bisagra que previene la formación de un medio anticuerpo (fenómeno de intercambio dinámico de medias moléculas en anticuerpos IgG4).

Las regiones HCVR y LCVR se pueden subdividir en regiones de hipervariabilidad, denominadas regiones determinantes de la complementariedad ("CDRs"), intercaladas con regiones que están más conservadas, denominadas regiones marco ("FR"). Cada una de las HCVR y LCVR se compone de tres CDRs y cuatro FRs, dispuestos desde el extremo amino al extremo carboxi en el siguiente orden: FR1, CDR1, FR2, CDR2, FR3, CDR3, FR4. En esta memoria, a las tres CDRs de la cadena pesada se las alude como "HCDR1, HCDR2 y HCDR3" y a las tres CDRs de la cadena ligera se las alude como "LCDR1, LCDR2 y LCDR3". Las CDRs contienen la mayoría de los residuos que forman interacciones específicas con el antígeno. Actualmente existen tres sistemas de asignaciones de CDR para anticuerpos que se utilizan para la delimitación de secuencias. La definición de CDR por Kabat (Kabat et al., "Sequences of Proteins of Immunological Interest," National Institutes of Health, Bethesda, Md. 1991)) se basa en la variabilidad de la secuencia de anticuerpos. La definición de CDR por Chothia (Chothia et al., (Chothia et al., "Canonical structures for the hypervariable regions of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 196, 901-917 (1987); Al-Lazikani et al., "Standard conformations for the canonical structures of immunoglobulins", Journal of Molecular Biology, 273, 927-948 (1997)) se basa en estructuras tridimensionales de anticuerpos y topologías de los bucles de la CDR. Las definiciones de CDR por Chothia son idénticas a las definiciones de CDR por Kabat, con la excepción de HCDR1 y HCDR2. La definición de CDR por North (North et al., "A New Clustering of Antibody CDR Loop Conformations", Journal of Molecular Biology, 406, 228-256 (2011)) se basa en el agrupamiento de propagación por afinidad con un gran número de estructuras cristalinas.

Un ADN aislado que codifica una región HCVR puede convertirse en un gen de la cadena pesada de longitud completa enlazando operativamente el ADN que codifica HCVR a otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de cadena pesada. Las secuencias de genes de la región constante de cadena pesada humana, así como de otros mamíferos, son conocidas en la técnica. Los fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse, p. ej., mediante amplificación por PCR estándar.

Un ADN aislado que codifica una región LCVR puede convertirse en un gen de la cadena ligera de longitud completa enlazando operativamente el ADN que codifica LCVR a otra molécula de ADN que codifica regiones constantes de cadena ligera. Las secuencias de genes de la región constante de cadena ligera humana, así como de otros mamíferos, son conocidas en la técnica. Fragmentos de ADN que abarcan estas regiones pueden obtenerse mediante amplificación por PCR estándar. La región constante de la cadena ligera puede ser una región constante kappa o lambda.

Los polinucleótidos de la presente invención se expresarán en una célula huésped después de que las secuencias se hayan enlazado operativamente a una secuencia de control de la expresión. Los vectores de expresión son típicamente replicables en los organismos huésped como episomas o como parte integral del ADN cromosómico del huésped. Comúnmente, los vectores de expresión contendrán marcadores de selección, p. ej., tetraciclina, neomicina y dihidrofolato reductasa, para permitir la detección de aquellas células transformadas con las secuencias de ADN deseadas.

El anticuerpo de la presente invención se puede producir fácilmente en células de mamífero, tales como células CHO, NS0, HEK293 o COS. Las células huésped se cultivan utilizando técnicas bien conocidas en la técnica.

Los vectores que contienen las secuencias de polinucleótidos de interés (p. ej., los polinucleótidos que codifican los polipéptidos del anticuerpo y las secuencias de control de la expresión) pueden transferirse a la célula huésped mediante métodos bien conocidos, que varían dependiendo del tipo de huésped celular.

Pueden emplearse diversos métodos de purificación de proteínas y métodos de este tipo son conocidos en la técnica y se describen, por ejemplo, en Deutscher, Methods in Enzymology 182: 83-89 (1990) y Scopes, Protein Purification: Principles and Practice, 3a Edición, Springer, NY (1994).

En otra realización de la presente invención, el anticuerpo, o los ácidos nucleicos que lo codifican, se proporcionan en forma aislada. Tal como se utiliza en esta memoria, el término "aislado" se refiere a una proteína, péptido o ácido nucleico que está libre o sustancialmente libre de cualquier otra especie macromolecular encontrada en un entorno celular. "Sustancialmente libre", tal como se utiliza en esta memoria, significa que la proteína, el péptido o el ácido nucleico de interés comprende más del 80% (sobre una base molar) de las especies macromoleculares presentes, preferiblemente más del 90% y más preferiblemente más del 95%.

El anticuerpo de la presente invención, o las composiciones farmacéuticas que lo comprenden, pueden administrarse por vías parenterales (p. ej., subcutánea e intravenosa). Un anticuerpo de la presente invención puede administrarse a un paciente solo con soportes, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables en dosis únicas o múltiples. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención se pueden preparar mediante métodos bien conocidos en la técnica (p. ej., Remington: The Science and Practice of Pharmacy, 19a ed. (1995), A. Gennaro et al., Mack Publishing Co.) y comprenden un anticuerpo, tal como se describe en esta memoria, y uno o más soportes, diluyentes o excipientes farmacéuticamente aceptables.

El término "tratar" (o "tratar" o "tratamiento") se refiere a ralentizar, interrumpir, detener, aliviar, detener, reducir o revertir la progresión o la gravedad de un síntoma, trastorno, afección o enfermedad existente.

"Se une", tal como se utiliza en esta memoria, en referencia a la afinidad de un anticuerpo por PD-1 humano pretende significar, a menos que se indique lo contrario, una K^dde menos de aproximadamente 1 x 10-6 M, preferiblemente, menos de aproximadamente 1 x 10- 9 M según se determina mediante métodos comunes conocidos en la técnica, incluido el uso de MSD esencialmente como se describe en esta memoria.

Para los propósitos de la presente divulgación, la expresión "alta afinidad" se refiere a una K^dde menos de aproximadamente 150 pM para la PD-1 humana, según se determina por MSD. Los valores de K^dse establecen mediante la cinética de unión tal como se describe en "Cinética de unión y afinidad" en la sección de Ensayos.

"Cantidad eficaz" significa la cantidad de un anticuerpo de la presente invención o composición farmacéutica que comprende un anticuerpo de la presente invención que provocará la respuesta biológica o médica o el efecto terapéutico deseado en un tejido, sistema, animal, mamífero o ser humano que está siendo buscado por el investigador, el médico u otro clínico. Una cantidad eficaz del anticuerpo puede variar de acuerdo con factores tales como el estado de la enfermedad, la edad, el sexo y el peso del individuo, y la capacidad del anticuerpo para provocar una respuesta deseada en el individuo. Una cantidad eficaz es también aquella en la que los efectos terapéuticamente beneficiosos superan cualquier efecto tóxico o perjudicial del anticuerpo.

Esta invención se ilustra adicionalmente mediante el siguiente ejemplo no limitativo.

Ejemplo 1: Expresión y purificación de anticuerpos

Los polipéptidos de las regiones variables de la cadena pesada y la cadena ligera, las secuencias completas de aminoácidos de la cadena pesada y ligera del Anticuerpo A - Anticuerpo F, y las secuencias de nucleótidos que codifican el mismo, se enumeran a continuación en la sección titulada "Aminoácido y Secuencias de Nucleótidos". Además, las SEQ ID NOs para la cadena ligera, la cadena pesada, la región variable de la cadena ligera y la región variable de la cadena pesada del Anticuerpo A - Anticuerpo F se muestran en la Tabla 1.

Los anticuerpos de la presente invención, incluyendo, pero no limitados a Anticuerpo A - Anticuerpo F pueden prepararse y purificarse esencialmente como sigue. Una célula huésped apropiada, tal como HEK 293 o CHO, puede transfectarse de forma transitoria o estable con un sistema de expresión para secretar anticuerpos utilizando una relación de vector HC:LC óptima predeterminada o un sistema de vector único que codifica tanto HC como LC. Los medios clarificados, en los que se ha secretado el anticuerpo, pueden purificarse utilizando cualquiera de las muchas técnicas comúnmente utilizadas. Por ejemplo, el medio se puede aplicar convenientemente a una columna MabSelect (GE Healthcare) o columna KappaSelect (GE Healthcare) para el fragmento Fab, que ha sido equilibrado con un tampón compatible, tal como solución salina tamponada con fosfato (pH 7,4). La columna se puede lavar para eliminar los componentes de unión inespecíficos. El anticuerpo unido puede eluirse, por ejemplo, mediante gradiente de pH (tal como tampón Tris 20 mM pH 7 a tampón citrato sódico 10 mM pH 3,0, o solución salina tamponada con fosfato pH 7,4 a tampón glicina 100 mM pH 3,0). Las fracciones de anticuerpos pueden detectarse, tal como mediante SDS-PAGE, y luego pueden agruparse. La purificación adicional es opcional, dependiendo del uso pretendido. El anticuerpo puede concentrarse y/o esterilizarse por filtración utilizando técnicas comunes. Los agregados solubles y los multímeros pueden eliminarse eficazmente mediante técnicas comunes, incluyendo exclusión por tamaño, interacción hidrófoba, intercambio iónico, cromatografía multimodal o de hidroxiapatito. La pureza del anticuerpo después de estas etapas de cromatografía es superior al 95%. El producto puede congelarse inmediatamente a -70°C o puede liofilizarse.

Tabla 1: SEQ ID NOs

Ensayos

Cinética de unión y afinidad

La cinética y la constante de disociación de equilibrio (K^d) para la PD-1 humana se determinan para los anticuerpos de la presente invención utilizando métodos de ensayo MSD e interferometría de bio-capa (ForteBio).

Tal como se utiliza en esta memoria, nivolumab es un anticuerpo IgG4 anti-PD-1 humano expresado transitoriamente en células 293 HEK que utiliza las secuencias de cadena pesada y cadena ligera de la INN Propuesta: Lista 107 (CAS n° 946414-94-4). Tal como se utiliza en esta memoria, pembrolizumab es un anticuerpo IgG4 anti-PD-1 humano expresado transitoriamente en células 293 HEK que utiliza las secuencias de cadena pesada y cadena ligera de la INN Propuesta: Lista 72.

Ensayo MSD

Las mediciones de afinidad de equilibrio se realizan como se describió previamente (Estep, P., et al., MAbs, 2013.

5(2): págs. 270-8). Las valoraciones en equilibrio de la solución (SET) se realizan en PBS BSA libre de IgG al 0,1% (PBSF), en que el antígeno (monómero b-PD-1) se mantiene constante a 10-100 pM y se incuba con diluciones seriadas de 3 a 5 veces de Fab o mAb partiendo de 5-100 nM (la condición experimental depende de la muestra). Anticuerpos diluidos a 20 nM en PBS se recubren sobre placas de MSD-ECL de unión estándar durante la noche a 4°C o a temperatura ambiente durante 30 min. Las placas se bloquean con BSA durante 30 min al tiempo que se agitan a 700 rpm. A continuación, las placas se lavan 3 veces con tampón de lavado (PBSF Tween 20 al 0,05%). Las muestras de SET se aplican y se incuban en las placas durante 150 s con agitación a 700 rpm seguido de un lavado. El antígeno capturado en una placa se detecta con 250 ng/mL de estreptavidina marcada con sulfotag en PBSF mediante incubación en la placa durante 3 min. Las placas se lavan tres veces con tampón de lavado y luego se leen en el instrumento MSD Sector Imager 2400 utilizando 1x Tampón de Lectura T con tensioactivo. El porcentaje de antígeno libre se representa en función del anticuerpo titulado en Prism y se ajusta a una ecuación cuadrática para extraer la KD. Para mejorar el rendimiento, se utilizan robots de manipulación de líquidos en todos los experimentos de MSD-SET, incluyendo la preparación de muestras de SET.

En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, el Anticuerpo C y el Anticuerpo E, en un formato de IgG1 y expresados en levadura, se unen a Fc de PD-1 humana con una K^dde 120 pM y 91 pM, respectivamente. Pembrolizumab y nivolumab se unen a PD-1 con una K^dde 130 pM y 640 pM, respectivamente. Las mediciones de avidez para el Anticuerpo C y el Anticuerpo E dan como resultado una K^dde aproximadamente 9 pM y 22 pM, respectivamente, para la PD-1 humana. Pembrolizumab y nivolumab se unen a PD-1 humana con una K^dde aproximadamente 3 pM y 5 pM, respectivamente. El Anticuerpo C y el Anticuerpo E, en un formato de IgG1 y expresados en levadura, se unen a PD-1 humana con una K^dde 1900 pM y 1100 pM, respectivamente. Las mediciones de avidez para el Anticuerpo C y el Anticuerpo E dan como resultado una K^dde aproximadamente 130 pM y 330 pM, respectivamente, para la PD-1 murina.

Tabla 1: Unión por MSD de anticuerpos de la invención en formato IgG1

(P.F.: ajuste deficiente; N.D.: ninguno detectado)

Interferometría de bio-capa

Las mediciones de afinidad de ForteBio se realizaron generalmente como se describió previamente (Estep, P., et al., Medición basada en solución de alto rendimiento de la afinidad anticuerpo-antígeno y agrupación de epítopos. MAbs, 2013. 5 (2): p. 270-8.). Brevemente, las mediciones de afinidad de ForteBio se realizaron cargando IgG en línea en sensores AHQ. Los sensores se equilibraron fuera de línea en tampón de ensayo durante 30 minutos y luego se monitorizaron en línea durante 60 segundos para establecer la línea de base. Los sensores con IgG cargados se expusieron a 100 nM de antígeno durante 5 min, luego se transfirieron al tampón de ensayo durante 5 min para la medición de la tasa de inactividad. La cinética se analizó utilizando el modelo de unión 1: 1.

Tabla 2: Unión por interferometría de bio-capa de anticuerpos de la invención en formato IgG1

(N.D.: ninguno detectado)

En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, el Anticuerpo C y el Anticuerpo E, en un formato de IgG1 y expresados en levadura, se unen a PD -1 humana con una K^dsimilar a nivolumab y pembrolizumab cuando Fc de PD-1 estaba en la punta del sensor. Cuando el anticuerpo estaba en la punta del sensor, el Anticuerpo C y el Anticuerpo E, en un formato de IgG1 y expresados en levadura, se unen a Fc de PD-1 humana con una K^dde manera similar a nivolumab y pembrolizumab. El anticuerpo C y el anticuerpo E, en un formato IgG1 y expresados en levadura, se unen a Fc de PD-1 de cyno con una K^dsimilar a nivolumab y pembrolizumab. El anticuerpo C y el anticuerpo E, en un formato IgG1 y expresados en levadura, se unen a Fc de PD-1 murina, mientras que no se detectó con nivolumab y pembrolizumab.

Unión a PD-1 humana y murina en células CHO

La unión de un anticuerpo de la presente invención a PD-1 humana puede medirse en un ensayo de citometría de flujo.

Se incuban células CHO (0,2 x 106) con el anticuerpo experimental desde 100 nM titulado 14 veces por un factor de 2 hasta la concentración más baja de 6,1 pM durante 30 min en PBS BSA al 1% en hielo. A continuación, las células se lavan 3 veces y se incuban con un anticuerpo secundario (marcado con PE, a una concentración final de 5 pg/ml) en PBS BSA al 1 % durante 30 min en hielo (protegido de la luz). Las células se lavan 3 veces y se analizan mediante citometría de flujo. La citometría de flujo se realiza en un sistema Accuri C6 (BD Biosciences) y los MFIs se calculan en el software C6. Las CE50 se calculan en el software Graphpad.

En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, el Anticuerpo A, el Anticuerpo C y el Anticuerpo E, en un formato de IgG1 y expresados en levadura, se unen a la PD-1 humana de una manera dependiente de la dosis, con un valor de CE50 (n = 1) de 10,22 nM, 4,115 nM y 4,587 nM, respectivamente, y pembrolizumab se une a PD-1 humana con un valor de CE50 (n = 1) de 0,6921 nM y nivolumab con un valor de CE50 (n = 1) de 0,8057 nM.

El anticuerpo A, B, C, D, E y F, en un formato de IgG1 y expresado en levadura, se une a PD-1 murina de una manera dependiente de la dosis con una CE50 de 11,01 nM, 6,135 nM, 2,884 nM, 9,259 nM y 5,044 nM y 5,855 nM, respectivamente, mientras que no se detectó unión para nivolumab o pembrolizumab.

Bloqueo de PD-1 humana a PD-L1 y PD-L2 en células CHO.

La capacidad de un anticuerpo de la presente invención de bloquear la unión de PD-1 humana a PD-L1 y PD-L2 puede medirse mediante citometría de flujo.

Se incuban células CHO (0,2 x 106) con el anticuerpo experimental (100 nM) durante 30 min en PBS BSA al 1% en hielo. A continuación, las células se lavan 3 veces y se incuban con PD-L2 enlazada con NHS-FIuoresceína (Promega) en PBS BSA al 1% durante 30 min en hielo (protegido de la luz). Las células se lavan 3 veces y se analizan mediante citometría de flujo. La citometría de flujo se realiza en un sistema Accuri C6 (BD Biosciences) y los MFIs se calculan en el software C6. Las CE50 se calculan en el software Graphpad.

En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, el Anticuerpo C y el Anticuerpo E (formato IgG1 expresado en levadura) bloquearon la unión de PD-L2-FITC humana, lo que resultó en un MFI de 30,123.4 y 38,682.1, respectivamente, en comparación con el control IgG que resultó en un MFI de 182.959,1. El pembrolizumab y el nivolumab dieron como resultado un MFI de 46.245,9 y 54.509,8 respectivamente.

Tabla 3: Bloqueo de PD-1 humana en células CHO

Reacción de Linfocitos Mixtos

El bloqueo de las señales de PD-1 por los anticuerpos de la presente invención puede evaluarse midiendo la liberación de señales inhibidoras durante la activación de las células T.

2 x 106 PBMC se siembran por pocilio en una placa de cultivo tisular de 6 pocilios o matraz de cultivo tisular T25 en medios de células T completos. Las células se incuban durante 2-3 horas, para permitir la adherencia de los monocitos. Si la adherencia es insuficiente, se utilizan medios libres de suero. Las células sueltas se eliminan agitando suavemente el matraz con medio de reciente aportación 3X.

DCs mieloides inmaduras se generan cultivando monocitos (1 x 106células/ml) de PBMC en medio X-VIVO 15 que contiene suero AB al 1%, HEPES 10 mM, p-Me 50 pM, IL-4 (1000 U/ml) y GM-CSF (1000 U/ml) o 25-50 ng/ml de cada uno. Después de 2 días, se añade medio de reciente aportación complementado con IL-4 y GM-CSF. El día 5, las células se congelan o se induce la maduración añadiendo un cóctel de estimulación que contiene rTNFa (1000 U/ml), IL-1 b (5 ng/ml), IL-6 (10 ng/ml) y 1 pM de PGE²durante 2 días a una densidad celular de 3 x 105 células/ml.

El aislamiento de células T se realiza según las instrucciones del fabricante en el kit de aislamiento de células T CD4 sin tocar (Invitrogen). Se utiliza un imán equipado con una gradilla para tubos de 1,5 ml para eliminar las perlas magnéticas no deseadas (QIAGEN). Se mezclan 100.000-200.000 células T aisladas con 10.000-20.000 moDCs alogénicas en un volumen total de 200 pl en placas de cultivo de tejidos de fondo redondo de 96 pocillos durante 4-5 días a 37°C. Las células T se estimulan utilizando DynaBeads anti-CD3/CD28 en una relación de 3:1 (células:perlas) como control positivo; las perlas se preparan según las instrucciones del fabricante. Los anticuerpos de ensayo se añaden al comienzo de la MLR y se incuban a lo largo de todo el período de cultivo. La detección de IL-2 e IFN-y se lleva a cabo según las instrucciones del fabricante (eBioscience). Las mediciones de DO se determinan en un sistema Multiskan FC (Thermo).

En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, el Anticuerpo C y el Anticuerpo E aumentan la secreción de IL-2 e IFNg por parte de las células T activadas en la reacción de linfocitos mixtos con una potencia equivalente en comparación con nivolumab y pembrolizumab.

Tabla 4: Múltiplo de cambio de secreción de IL-2 frente a IgG control

Tabla 5: Múltiplo de cambio de secreción de IFNg frente a IgG control

Modelo de tumor

Se puede medir la actividad inmunomoduladora in vivo de los anticuerpos de la presente invención con el modo de tumor MC38 in vivo. Se inoculan ratones C57B1/6 por vía subcutánea con células de cáncer de colon murino MC38 2 X 106 por ratón para establecer el modelo portador de tumor. Los ratones se seleccionan 10 días después de la inoculación del tumor con volúmenes de tumor entre 34,81 mm3 ~ 148,24 mm3 y luego se dividen en cinco grupos. Estos grupos incluyen un grupo de control, RMP1 -14 (Bio X Cell), Compuesto C-2.5, Compuesto C-5 y Compuesto C-10 (n = 10). El grupo RMP1-14 recibe una dosis de 10 mg/kg. A los grupos de Compuesto C-2.5, Compuesto C-5 y Compuesto C-10 se les administran 2,5 mg/kg, 5 mg/kg y 10 mg/kg de 11430, respectivamente (Compuesto C S228P IgG4 producido en células HEK293).

El grupo de control recibe un volumen igual de solución salina, y todos los grupos se dosifican mediante inyección intraperitoneal, con una frecuencia de dosis de 2 veces por semana durante 4 semanas. Se lleva a cabo la monitorización semanal del peso corporal del animal y el volumen del tumor (utilizando la fórmula V=LxW2/2). Después del experimento, los tumores se fotografían y pesan para calcular el peso del tumor y para calcular la inhibición relativa del tumor.

En experimentos realizados esencialmente como se describe en este ensayo, los resultados demuestran que la administración de RMP1-14 y el Compuesto C no tiene efecto alguno sobre el peso del animal. RMP1-14 y el compuesto C muestran un efecto antitumoral significativo después de una semana de administración. Los tres grupos de dosis del Compuesto C tienen mayores efectos antitumorales (reducción del volumen del tumor) en comparación con el grupo RMP1-14. En los grupos Compuesto C-2.5 y Compuesto C-10, 1 y 2 ratones, respectivamente, presentaron una regresión completa del tumor. Después del tratamiento, el peso del tumor se reduce significativamente por el RMP1-14 y los tres grupos del Compuesto C en comparación con el grupo de control. El grupo RMP1-14 tenía un valor relativo de inhibición del tumor de 55,03%, con los grupos Compuesto C -2,5, Compuesto C -5 y Compuesto C -10 con valores relativos de inhibición del tumor de 69,70%, 76,53% y 81,04%, respectivamente, demostrando una forma dependiente de la dosis del Compuesto C sobre el peso del tumor. Por lo tanto, Compuesto C tiene una eficacia antitumoral significativa en ratones portadores de tumores y tiene un mejor efecto que el clon de control positivo RMP1-14.

Secuencias de Aminoácidos y Nucleótidos

SFQ ID NO ¡ (PC-1 humana':

MGfPQAPWPVVWAVLQUAVRPOWFI.DSPDRPWNPPTFSPAI .LVVTEODNATFT

C'SFSNT'SE SI-VLNWYRMSPKNQTDKLAAFPKDRSQPGQOniFRVTQLPNORDFH

M SVVRARRNDSGTYLÍXtAÍSLAPKAQIKESLRAEl ftVTFRRAF.VPTAHPSPSPRPA

<iQFQTLWGV¥ÍK}LL<ÍSLVLLVWytAVICSRAARGTlGA^RTGQPLfíEDPSAVP

^FS VD YGELDFQWREK TPEPP VPC VREQTE Y ATIVFPSGM GTSSP ARR($S ADGPR

SAQPLRPEPGHCSWPL SEQ ID NO: 2 (HCDR1 de Anticuerpo A) KASGYTFTSYYMH

SEQ ID NO: 3 (HCDR1 de Anticuerpo B) KASGYTFEGYYMH

SEQ ID NO: 4 (HCDR1 de Anticuerpo C) KASGYTFTAQYMH

SEQ ID NO: 5 (HCDR1 de Anticuerpo D) KASGYTFEKYYMH

SEQ ID NO: 6 (HCDR1 de Anticuerpo E) KASGYTFTSNYMH

SEQ ID NO: 7 (HCDR1 de Anticuerpo F) KASGYTFSAYYMH

SEQ ID NO: 8 (HCDR2 de Anticuerpo A) IINPSGGSTSYAQKFQG

SEQ ID NO: 9 (HCDR2 de Anticuerpo B) IINPEGGETSYAQKFQG

SEQ ID NO: 10 (HCDR2 de Anticuerpo C) IINPSGGETGYAQKFQG

SEQ ID NO: 11 (HCDR2 de Anticuerpo E) IINPSEGSTGYAQKFQG

SEQ ID NO: 12 (HCDR2 de Anticuerpos D y F) IINPDGGSTGYAQKFQG

SEQ ID NO: 13 (HCDR3 de Anticuerpos A-F) AKEGVADGYGLVDV

SEQ ID NO: 14 (LCDR1 de Anticuerpos A-F) RASQSVSSYLA

SEQ ID NO: 15 (LCDR2 de Anticuerpos A-F) YDASKRAT

SEQ ID NO: 16 (LCDR3 de Anticuerpos A-F) DQRNNWPLT

SFQ ID NO 17 (HCVR de Anticuerpo A}

QVQ L VQ SG A E V K k PG A 5 V K V SC K A SG YTFTS Y Y M HWVRQA PGQGLEWMG 11N P

SpGS 1 S V AQ K FQt jR VTM FRDTST ST V Y M ELSS1 -RSEDTA V Y YC AK LG V A DG Y G

LVDVWGQGTMVTISS SEQ ÍD NO t ¡i ÍHCVR de Anticuerpo B)

QVQ E.^ QSGA F V KKPGASYK VSCK A SG YTFEGYYMHW V RQ A P( JQCil - E W MGHN

PEGGETSYAQki QGRV1M1RDISIS ! AYMELSR] R SDDT A VYYC A KEGVADGY

Gl VDVWGQGTM VIVSS

SFQ ¡D NO 19 [HCVR de Anticuerpo fcí

Q VQ L VQSCA C VK K PG A S V K VSCK A SG YT F T A QYMI ÍW V RQ A PG QC L EVV M GILN PSGGETGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSUtSEDTAVYyCAKEGVADGY G I. VD V^VGQGTIVI Y T VS S

SF.QIDNO'20 (HCVR de Anticuerpo D)

QVQLVQ SG AEV K K PG A S VK VSCK ASG YTFEK Y YMHW VRQ A PGQGLE WMG [] N PDGGSTG Y AQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSL RSEDTAVY YC AK EGV ADGY GL VDVWGQGTM VTVSS

SFQ ID NO; 2:1 (HCVR de Anticuerpo E}

QVQIVQSGAEVKKPG VS YK VSCK ASG YITTSN YY! fÍWVRQAPGQGI-EWMGiJNP SLGS I GY AOKJ QGKVTMTRD [STSTVYMLLSSLRSEDI AVYYCAKEÜVAUGYG ¿VDVWGQGTM VTVSS:

SFQ ID NO' 22 (HCVR de Anticuerpo F)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCECASGYTFSAYYMHWVRQAPGQGLEWMGIINP DGGSTGYAQKFQGRVTMTRDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAKEGVADGYG L VDVWGQGTM VTVS S

SFQ ID NO; 23 RCVR de Anticuerpos A-F)

ElVI.TQSP.VI LSLSPGFRATLSCRASQS V5SYLA\VYQQKPGQAPRLL1 YF>ASK RAT GIPARFSGSQSGTDFTLTJ5SLEPEDFAVYYCDQRNNWPLTFGGGTKVEIK

SFQ ID N Q 24 (HC de Ant i cuerpos A- S22SP lgG4)

QVQLVQSGAE'VKKPGASVKVSCKASGY r n ’SYYMIIWVRQA PGQGLEWMGIINP SGGSTS Y ÁQ K F QO R VTMTR DTSTST VYMELSSLRS EI)T A V Y Y C A K1=G V A DGY G L \ DVWGOGTM VTISSAS IKGPSV1 PL.APCSRSTSES I AALGC LVKDYI PEP\'TVS WNSG ALTSGVHTt PAV LQSSGLYSLSSVV1 VPSSSLGTK J Y TCN VÜHKPSNTKVD KRVESKVGÍ'PCPPCPAÍEF LGGPSVF LFPFfí PKDTLM1 SR TPEVTC V V VDVS QFD P EVQFNWyVDGVEVHNAKTKPREE^NSTYRWSVLTVLEÍQDWLNGKEYKCKV SNKGLPSSILKIJSKAKGQPREPQVY í LPPSQLEM CEÍNQVSL i CLVKGl YPSDIAV E W ES NG QPE NNYK I" IV P V LUS DGS FF.L Y SRLTVDKSR WQEGMVFSCSVMH LA LH NHYTQJÍSLSLSLGK

SF.QIONO; 25 ( HCde Ant i cuerpos B - S22BP lgG4)

QVQLVQSGAEVKKPGASVKVSCKASGYTFEGYYMHWVRQAPGQGLEWMGIEN PEGGETSYAQKEOGRVrMTRDTSlSTAYMELSRLRSDDTAVYYCAKEGVADGY GLVDVWGQGTMVTVSSASTKGPSVFPLAPCSRSTSESTAALGCLVKDYFPEPY ] V SWNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKV

DKRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQED PEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRWSVLTVLHQDWLNGKEYKCK VSNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIA VEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEAL FTNHYTQK SLSL SLGK

ShQ IO N O : 26 (H C de Anticue rpc s C - S22BP IgG4}

O VQI;VQSG Al’;1V K K ROAS V K VSCK A SG YTFT AQ Y M M W VRQ A PGQGLEW MGlIN PSGGIFIGYAQKI QGRVT.vi | RDTSTSTVYMELSSLRSEDTAWYCAKEGVAtXíY í i L VD V WCiQG T.\ 1VTVSSÁSTKGPS VFPL AFC SRSISE ST A AL (3CLVKD Y FPEPVT V SWNSÜAl.TSGVHTFPAVLQSSGl.YSl,SSVVTVPSSSl.íjTKTYTC'\'VDFIKPSNTK\-O K R VF$K Y GPPO PPC? A P EF [. GG P S VFI .FPPK PK D TI .M J S RTPE VT C Y V VD VSQF D PEVQPNWYVltóVEVHÍ®TKPKEEOFNSTYRVV^VLTVLHQDWLNGJÍEYIÍCIC VSNKGLPSS!ÉííISK,AKGQPREI%\'\TLPPSOEEM'rKÍípVSLT€LVKGFYPSDlA V E W ESNGQPENNYKT1 V P1Y LL> SI)GS FFL YSRLTVDKSRW QEG M VFSCS V MHE AL HNHYTQKSLSl.Sl.GK

SEQ ID N O 27 (HC de Anticuerpos D-S22SP lgQ4)

$ VQL VQSG AE VKK PG AS VK VSGK A SGYTF EK Y YMHW VRQA PGQGLE WMG11N PDCGSTGYAQKFQGEtVTMTUDTSTSTVYMELSSLRSEDTAVYYCAKEGVADGY GLVÓVW GQGTM VT VSSASTTCG PS VF PE, A PCSR STSH ST A A Lt¡C’ L VKD YF PEPVT V SWNSGAL l’SGVH IIP A VLQSSGLYSLSS W I VPSSSLG 1 K IY J CN M íH K PSM K Y OKRVLSKYGFPCPPt PAPE! LGGPSVFLi FFKPKL>] LMJSR.TPLV ]OVVVL>VSQLL> P EVQF N W Y Y'DG VE VI INAKTKPRE ÉQlNST Y R V VS VLT VIJ-IQDWL NGK EYK i K VSNKGLPSSIEKT1SKÁXGQPREPQ V YTLPPSQF EMTKNQVSI hTCLVKGF YPSDIA VEWFSNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEAL IFNI ¡YTQKSLSLS1.GK

SEQ ID NO 2S [HC de Ant i cuerpos E - S22SP lgG4}

QYQIA'QSGAEVKKl’GASVKVSCKASGYTFTSNIYMHWVRQAPGQGLEWMGllhíP SríGSTGYA<^CFQC3RVTM‘raDTSTS l VYMELSSLRSLDTAVYVCAKEGVAbGYG l v is v w c m j g t m v t v s s a s t k g p s v f p l a p c s r s t s e s t a Al g c l m c d y f p e p v t v s WNSCLALTSGVi i TF P AVLQS SOL YSL S SYVTVJ>S S SLOTKTYTC N VDILK P S NTK YD t& V E SK YGPPCPP CP A PEF LÜ&PSVFl FPPKPKDTLMi SRTPEVTC V WDVSQEDP V. VQF N W Y \ DGVE VT TNAKTK PR ECO r NS T YR V V S VT. t VLI IQDWLNGK e Vk CK V SNKGLPSSIEKT!SKAKCK)PREPQVYTLPPÍiQEEMTfíNQVSLTCLVKGFYPSDTAV HWESNÍ ¡OPEXNYK n PPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWGEGNVFSCSVrvíHEALH NMYTQKSi.Sl.Sl.GK

Sl’-Q I D NO 2 ^ [HC de Ant i cuerp^{ce f}- S22SP lgG^>

Q VQL VQSG AL VK KPG.A S V K V SCKASGYTFS A Y VMM W V RQ A PGQG L LW MGÍIN P DGGSIGVAQKF'íiGftVTMTRDTSTSl VYMELSSLRSEDlAVYYCAItEGVADGYG LVDWGQGTMVTASSASTKGPSVFPLAPGSRSÍTSESTAALGCLVKDYFREPVfVS

WNSGALTSGVHTFPAVLQSSGLYSLSSVVTVPSSSLGTKTYTCNVDHKPSNTKVD KRVESKYGPPCPPCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSQEDP EVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKV SNKGLPSSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAV EWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALH NHYTQKSLSLSLGK

SI Q MÍ N O 30 [LC de Ant icuerpos A-F}

E ¡ V LTQS PA t LS L S P<i ERA J LSC RA SQS V S SY L A W YQQ K PGQ APR L L 1Y DASK RA T GlPARFSGSGSü J'UFTL I ISSLEPEDFAVYYCDQRN.NWPLJ'PGGGTKVELKRTVAA PSVT-TFPPSDEQLKSGTASVVCLLNNFWREAKVQWKVDNALQSCi XSQESVTEQD SKDSTYSL3STI-TLSKAOYEKHKVY ACEVTHQGl SSPYr l’KSINRGFC

Anticuerpos A - S228F lgG+>

iOGGCT^^GOTGAAGAAGCCTCKKKiCCTCAG l'CAAGGTT TCCTGCAAGGCATC TCGAIACACC TTCACCAGC1 \C l'A T.A'TGCAC I ’GGGl’CjCGAC AGGCcrC tCGACA A GGGC T FGA GTGG ATGGO A ATA ATC A A r r CIAGTGGTGG1AGCACAAGCTACGCACAGAAGTTCCACGGCAGAGTCACCAT G A CC AG G G AC A CG TCC A CG AGC AC AGTCTACATG G A G CTQAGCAQC CTG ACA TC TGÁGG A C ACG GCti GTGTACTÁCTGCGCC A A AGA^CGAGTGGCCGA COG A T A TGG ATTGGT AC ACCT ATCCG CTC AGGCT A CA A TGGTC A CC A TC TC C TC AGC CAGCACCAAGGGACCCTCCGTQTTCCCTCTGGCTCCTTGCAGCAGGT#ACCA (iCCA ATCCA(’( ’í ¡ í ’TCCCCT(i(iCjCTCTCTCCíTCA AAÍiACTACTTTÍ ( C íi AÍ ¡CCT GTCACCGTGAGCTGOAACTCCGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACATITC CTGCCGKiC re ¡^{c a í}; ^ac¡t: í CCC 3GC Ct g t a c TCC :c r e re :c re :C( ;^{tg c}¡ ^tc ^{a c a}es i ( ’ CCC AGCACCACCC I GCGA ACC AACAC’C I AC ACC VCCA ACC i COAC’CACA AGC CTTCC A AC ACC A AGGTGG AC A AG AGGGTGfiAGTCC A A AT ATGGCCCCCCCTG CCCTCCTTCTCCCCCTCCTGAGTTCCTCGGCCCCCCTTCCCTGTTCCTCTTCCC I C'C( AAt¡CÍX:AAC(VAt ACXC I CiATCÍA J’CTCCCTiGAt ( í'CCGAGGTGACOCi J ClTGGTGGTGGACGTGTCt C AGGAGG ACCC TCSAGGTGC A ATICA ACTGGTACG TG G ACCG CCTCG A GG TGC AC A A CGCC A AG ACC A A G CCCC G GG A G G AGC AG T

l í : A AC A < tC A CC T A CCGGGTCG I í ¡ re CÜ I G í 7 G ACCGTGC I GC A CC ACG A I IG G CTC' A A CÜÜC A AGG AG TAC A AGTGC A A AGTGTCC’ A AT A A GG GCCT GCC C TCCT CC A TCG AC A A C ACC A TC TCC A AGG CC A A GC G ACA ACCC CG TG AG CCCC AGC-T e i ^{a c a c c c}T G C C T ce rrccc a g g ^{a g g a g a t g a}cc a ^ag ^{a a}re ^{a g g t g t c}e r r e ACCTGCC'f GGTGAAGGGC r i C l'ACCC’rr!'CCGACA l CXiCCGTGGAA tGCSGAGTC C A ACGGC C A GCC CG A G A AC A A CT A C A Á G AC A AC C CGCCCTGTÍ CTG CACA Gt GACGGC J e m e r n CTGTAC AGCAGGCTGACCG lGG ACAAGAGCGCiG EGGC AGG A GGGC A A CGTGTT T A G CT G T A GCGTC ATGC A CG AGGCCC TGC A C A ACC A CT AC ACCC A G A A A l CCC I GTCCCTCI CCCTGC GC A AC, TG A 1G A

SEQ 10 NO: 32 [ADN de Anticuerpos B - S228P lgG4>

CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGGGGCTGAGGTGAAGAAGCCTGGGGCCTCAG TGAAGGTTTCCTGCAAGGCATCTGGATACACCTTCGAGGGTTACTATATGCAC TGGGTGCGACAGGCCCCTGGACAAGGGCTTGAGTGGATGGGAATAATCAACC CTGAGGGTGGTGAGACAAGCTACGCACAGAAGTTCCAGGGCAGAGTCACCAT GACCAGGGACACGTCCATCAGCACAGCCTACATGGAGCTGAGCAGGCTGAGA TCTGACGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAAAGAGGGAGTGGCCGACGGAT AT GG ATT GGT AG ACGT AT GGGGTC AGGGT AC AAT GGTC ACCGT C TCCTC AGC CAGCACCAAGGGACCCTCCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGCAGCAGGTCCACCA GCGAATCCACCGCTGCCCTGGGCTGTCTGGTGAAAGACTACTTTCCCGAGCCT GTGACCGTGAGCTGGAACTCCGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACATTTC CTGCCGTGCTGCAGAGCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACAGTC CCCAGCAGCAGCCTGGGAACCAAGACCTACACCTGCAACGTCGACCACAAGC CTTCCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGTCCAAAT ATGGCCCCCCCTG CCCTCCTTGTCCCGCTCCTGAGTTCCTGGGCGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTCCC TCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAGGTGACCTGT GTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCTGAGGTGCAATTCAACTGGTACG TGGACGGCGTCGAGGTGCACAACGCCAAGACCAAGCCCCGGGAGGAGCAGT TCAACAGCACCTACCGGGTCGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGG CTCAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAATAAGGGCCTGCCCTCCT CCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGACAACCCCGTGAGCCCCAGGT GTACACCCTGCCTCCTTCCCAGGAGGAGATGACCAAGAATCAGGTGTCCCTC ACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTGGAATGGGAGTC CAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACAACCCCCCCTGTCCTGGACAGC GACGGCTCCTTCTTTCTGTACAGCAGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGC AGGAGGGCAACGTGTTTAGCTGTAGCGTCATGCACGAGGCCCTGCACAACCA CTACACCCAGAAATCCCTGTCCCTGTCCCTGGGCAAGTGATGA

SEQ )T> ^{NO' .13 (ADN de HG de Anticuerpos C - S228P lgG4}}

C AÜGTCC A GC TG G TGC AGTCTGGGGC TGAGGTG A A G AAGC CTGGGGC CTC A,O i C A AG G r j i CC'i’GC AAGOC’M ’C í G A l A C ACC i i C’ A CX’GCn C’ AC i’A r A I GC AC TG f ÍGTGÍ'G AC: ACi GC CGÍ'TG( P A ( 'A A Gí rGCTTCJ A GTGÍÍ A TGGG A A T A A TG A A(X’ CT A GTGGt GGT G AG AG AGGGT A CGC AC A G A AGTTOCA G GGG A G A QT CACC AT G ACC AGaíACACGTCCACGAGCACAÍTTCTAC A T O A GCT&AGCÁfcCCTGAGA T<’ [ GACKIAGAÍ'GGÍ G ín GTAt TAG 1 G< GCOAAa GAGÍHÍAG i Gí ¡(’GGAGCGAT ATGGATTGGlAGACGTATGGGGTCAGGGLACAAIGGICACCGTCrCCTCAGC C AGC A CC A AGGG AG CC TCCGTGTTCCC TCTGGCTGÉTTGC ACC A GGTCC AC G A CCGAAiCCACCCnGCCCTGGGCTGTCTGGTGAAAGACÍ ACTnCCCGAGCCI GTGACCÍTGAGCTG<^\ACTCCGGGGG:TC TG ACGÁGCGGCGT# ACAC ATTTC CTGCCGTGCT GC AGAGCTG CGG C CTGT ACTC CCTGTCCT C C GTGGTG AC AGTC CGC A G C AGC AGCCrI GGGAACOAA GACCIACACCIGC AACG¡ COACCACAAGC CTTCC A AC ACC A AGG TG G A C A ACA GGGTC ¡ G ACTCC A A A TA TGGCCC CC C C TG CCCTCCTTGTCCCGCTCCTGAGTTCCTGGGCGGCCCTTCCGTCTTCCTGTTCCC TCCCAAGCCCAAGGACACCCTGAJGATCTCCCGGACCCCCGAGGíGACCTGJ GT GGTGGTG G ACGTG TC CC AGG A GG ACC C TG A GGTGC A A TTC A AC TGGTACG I G G ACGGCG ICO AGG ÍGC AC A AC GCCA A G ACC A AGCCCC GGG AGG AGC AGI

TCAACAGCACCTACCGGGTCGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGG CTCAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAATAAGGGCCTGCCCTCCT CCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGACAACCCCGTGAGCCCCAGGT GTACACCCTGCCTCCTTCCCAGGAGGAGATGACCAAGAATCAGGTGTCCCTC ACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTGGAATGGGAGTC CAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACAACCCCCCCTGTCCTGGACAGC GACGGCTCCTTCTTTCTGTACAGCAGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGC AGGAGGGCAACGTGTTTAGCTGTAGCGTCATGCACGAGGCCCTGCACAACCA CTACACCCAGAAATCCCTGTCCCTGTCCCTGGGCAAGTGATGA

SEQ ID NO .14 (ADN de HC de Anticuerpos DF -S228P lgG4)

C A0GTCC A GCTG GTGC AGTCTGGG GCTü AG GTG A A G A A GC C T G G G GCC TC AG TG A AG GTT TCC TGC A A GGC A TC TGG A T AC A CC TTCG A G A \ GT AC T A T \ TGC A C TG G G TG CG AC AG G CC C C TG G AC \A G G G C TTG A G TG G A TU G G A A TA A TC A A C C GTG A l £ i t r T( i t iT ÁC iC A C AGGGT A f ‘GC A C AG A A G T TCC: AGGGC AG AG TC A CCÁ r G ACC AGGG AC ACGTCC ACGA GC AC AG K ’ 1 AC A I GG A GC I G AGC AGCCTGAGA TC IG AGG AC ACG UCG G TÜTACTAC TGCGCC A A AG AG G Ü AC TGGCCÜACGGAT A TGG ATTGGT AG A CGT ATG G G G TC AGGGT AC \ ATGGTCACCGTC TCCTC AGC CÁGC ACC A AGGG A CCCTCCGTGTTCTCCÍCTGGCTCCTTGC AGC AGGT^C ACC A GCGA ATCCACCGC TGCCCTGGGCTCíTCTGGTGAAACWCTÁCTTTCCCGAGCCT GTGACCGTGAGCT^AACTQCGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACATTTC CTGC X G TÍiC TGC A G AC iCTCCÍ 5GC CTG'TAC TCC C TG I CC TCCC iTC KjTGAC A GT C: CCCAGCAGCAGGC iGGGAACCAAGACn AC ACCTCCAACGI CGACCAC AAGC A AC ACC A AGGTGG AG A ACiAGGGTGCiACiTCC A A AT ATGGCCCCCCCTG

CTTG TCC CG C TC C TG A ÜTTCCTGGG C GGCCCTTC C GTG TTCC TGT TCCC

AtiGGC AAtiG AÍ A t CC'ITiATtiA J'CTl'CGGGACCt'CCGAGírrG AGÍ I CÍ J GTGGTGGTGGAC(5TGTC( C ACt£iA ( íGACCCTGAGGTGCAATTCAA(’T(}GTA(’G TG G ACGGCGTCG A GG TG C AC A A CGCC A AG ACC A A G C CCC G GG A G G AGC AG T

iCAACAGt ACCTACCGGGTC G rGTCCGTGC fGACCG 1 GCTGCACCAGGATI GG CTC' A A CGGCA AGG AG TACA AGTGC A V AGTGTCC A AT A A GG GCCT GCOC TCCT CX AF CG AG A AG A CC' A 1C ICC A A GGC CAA GGG A C A A CC CCG í G AGCC CC A GG' l G I AC ACCCIGCCTCCI TCCC AGGAGG AG A I G ACÍ A AG A A ÍC AGGTG r CCCTC ACCTGCCTGGlirAAGGGCTrCTACCCnEeGACATCGCCGTGGAAJGGGAGTC CAACGGCCAGCCCUAGAACAACJ ACA AG ACA ACCC CCC CTGTCCTGG ACA GC G ACGGC 1 CC n C m CTGT A C >\ GC AGGCI G A t CG I GG AC A AG AGCCGG PGGC AGG A GGGC A A CGTGT T7A GC T G T p\ GC GTC A TGC ACG AGGC CCTGCA C' A AC C A CT A C ACCC A G A A AT CCC TGTCCCTGTCCCTGC GC AAG TG A TG A

Sr.Q H> NO: '>5 [AON de HC de Anticuerpos E-S228P lgG4>

r AGGTGCAGC rGGTGCAGTC i'GGGGCTG AGGTGAAGA AGOTTGGGGCCTC AG T&ÁAGGTT ICC ro e A AGGC ATCTGG A^AC A CCTTTj ACC A GC A A IT a i A IGCAC TGGGTGCGAC AGGCCGCTGG AC AAGGGCTTGAGTGG ATGGG AAT AATCA ACC CT AGT^AÜGGfÁGC AC AGGTTACGC AC AG A AGT I COAGGGCAGAGTCACOAT GALO AGGG AC ACGTCC ACG A GCAC AG’ IC l‘AC A J GG AGC’l G AGCAGCC1 G AG A

TCTGAGGACACGGCGGTGTACTACTGCGCCAAAGAGGGAGTGGCCGACGGAT ATGGATTGGTAGACGTATGGGGTCAGGGTACAATGGTCACCGTCTCCTCAGC CAGCACCAAGGGACCCTCCGTGTTCCCTCTGGCTCCTTGCAGCAGGTCCACCA GCGAATCCACCGCTGCCCTGGGCTGTCTGGTGAAAGACTACTTTCCCGAGCCT GTGACCGTGAGCTGGAACTCCGGCGCTCTGACCAGCGGCGTGCACACATTTC CTGCCGTGCTGCAGAGCTCCGGCCTGTACTCCCTGTCCTCCGTGGTGACAGTC CCCAGCAGCAGCCTGGGAACCAAGACCTACACCTGCAACGTCGACCACAAGC CTTCCAACACCAAGGTGGACAAGAGGGTGGAGTCCAAATATGGCCCCCCCTG CCCTCCTTGTCCCGCTCCTGAGTTCCTGGGCGGCCCTTCCGTGTTCCTGTTCCC TCCCAAGCCCAAGGACACCCTGATGATCTCCCGGACCCCCGAGGTGACCTGT GTGGTGGTGGACGTGTCCCAGGAGGACCCTGAGGTGCAATTCAACTGGTACG TGGAC GGCGTCGAGGTGC AC AAC GCC AAGACC AAGC CCC GGGAGGAGC AGT TCAACAGCACCTACCGGGTCGTGTCCGTGCTGACCGTGCTGCACCAGGATTGG CTCAACGGCAAGGAGTACAAGTGCAAAGTGTCCAATAAGGGCCTGCCCTCCT CCATCGAGAAGACCATCTCCAAGGCCAAGGGACAACCCCGTGAGCCCCAGGT GTACACCCTGCCTCCTTCCCAGGAGGAGATGACCAAGAATCAGGTGTCCCTC ACCTGCCTGGTGAAGGGCTTCTACCCTTCCGACATCGCCGTGGAATGGGAGTC CAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACAACCCCCCCTGTCCTGGACAGC GACGGCTCCTTCTTTCTGTACAGCAGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGC AGGAGGGCAACGTGTTTAGCTGTAGCGTCATGCACGAGGCCCTGCACAACCA CTACACCCAGAAATCCCTGTCCCTGTCCCTGGGCAAGTGATGA

SEQJDNO 36 [AON de HC de Anticuorpos F - S22SP lgG4)

c a g g t c k :a g c t g g t g c : a g t c t g g g í k t g a g g t g a a g a a g c c t g g g g c c t c acj 1 G A AG G r r TC C l GC A A GGC A TCT GG AI AC A CC TI c A G J’GC G l AC I’A J A i GC AC rGGGTGC'GACÁGGCCCC FGGAiííAAGGGCTTGAGTGGATGGGAATA ATCAACC CTí i ATGC iTGGT AGC A C M ÍGGT A CC iC AC A ( i A A i iTTCC A i ¡G( iC A i i AL ¡T(’ A CC AT G A C'C AG GG AC A CGTCC A CG AGC AC AGTCT A C ATGGA GC TG AGC AGCCTG AG A 11 TG AGG AC AC G GC'G G l’GT A t ¡ AC IG CG Ct: A A AG A GGG AG I GGC CG AL G G A l ATGGATTGGTAGACGTATGGGGTCAGGGXACÁATGGTCÁCCGTCTCCTGAGC C AGC ACC A A GGG A CCC TCCGT G TTCCCTC TGCCTCCTTGC AGC \ GG TCC A CC A jPCGA A I’CCACCGC-TÚCCCTGGGCT ( ¡ ! í TGG I GA AAGAC I AC'iTTtCCGAGCCT GTG AC CGTG AGC TGG A A CTCt GÜCÜCTC TG A CC A GC ÜG CGTGC A C A C ATTTC CTGC C GTGC Tí ’ A G A i K’TCC< ¡<: C TGT \C TC CC TGTCCTCC GTCK ¡TG A C AG TC CC C AGC AGC AGC CTGCG A ACC A AG ACOTA C ACC T GC A ACGTCG A CC AC A AGC C U CC A AC ACC A AGÜTGG AC A AG A GGGTQ G AG ICC A A A T ATGGC CCCCCC TG CCCTCCTTGTCCCGCTCCTGAC^CCTGCrGC'&GCCCTTCC&TGTTCCTGTTCCé l’í í'CAAGCCCA A íit í ACACCC IGATGATC Í CCCGGACÍ CCÍ ÍÍAGGTGAÍ CTÍÍT GTGG TGÍ.FTGG AC GTGTCfcC A GG A G G AC CCTG A GG TGC A ATTC A AC TGG T ACG TG G A CGCCGTCG AGG TG C ACA AC CCC A AG ACC A A C COCO G G G A G G AGC AG T TCAACAGCACCT ACCGGGTCGTGTC CGTGC TCTACCGTGr ¡(¡CACO AGG A JTGG c t í ’a a c g í p í ’a a g g a í ; i a c a a g t g c a a a í i [ í pTc c a a i a a g g íj COt g c í ;c i c o i CCATÍ'GAÍiAAGACCATITCCAAGGCÍ’AAÍKJCJACAAÍ’CCÍ (¡TtiALK’C’CCAÍiOT ífTACACCCTGCCTCCTTCCCAGtiAGGAüATGACCAAGA ATC AGGTGTCCCTC ACCTGCC: í GG JGAAGGGC n C'l A C C riTC C G A f A 1 CGCCGIGOAA'I GGGAG tX

CAACGGCCAGCCCGAGAACAACTACAAGACAACCCCCCCTGTCCTGGACAGC GACGGCTCCTTCTTTCTGTACAGCAGGCTGACCGTGGACAAGAGCCGGTGGC AGGAGGGCAACGTGTTTAGCTGTAGCGTCATGCACGAGGCCCTGCACAACCA CT AC AC CC AGAAATC CCTGT CCC TGT C CCTGGGC AAGTGAT GA

Claims

REIVINDICACIONES

1. Un anticuerpo que se une a PD-1 humana (SEQ ID NO: 1), que comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC), en donde la cadena ligera comprende regiones determinantes de la complementariedad de cadena ligera. LCDR1, LCDR2 y LCDR3 y la cadena pesada comprende regiones determinantes de la complementariedad de cadena pesada HCDR1, HCDR2 y HCDR3, en donde:

(i) LCDR1, LCDR2 y LCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 14), YDASKRAT (SEQ ID NO: 15) y DQRNNWPLT (SEQ ID NO: 16), respectivamente, y HCDR1, HCDR2 y HCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos KASGYTFTSYYMH (SEQ ID NO: 2), IINPSGGSTSYAQKFQG (SEQ ID NO: 8) y AKEGVADGYGLVDV (SEQ ID NO: 13), respectivamente;

(i) LCDR1, LCDR2 y LCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 14), YDASKRAT (SEQ ID NO: 15) y DQRNNWPLT (SEQ ID NO: 16), respectivamente, y HCDR1, HCDR2 y HCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos KASGYTFEGYYMH (SEQ ID NO: 3), IINPEGGETSYAQKFQG (SEQ ID NO: 9) y AKEGVADGYGLVDV (SEQ ID NO: 13), respectivamente;

(iii) LCDR1, LCDR2 y LCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos: RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 14), YDASKRAT (SEQ ID NO: 15) y DQRNNWPLT (SEQ ID NO: 16), respectivamente, y HCDR1, HCDR2 y HCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos KASGYTFTAQYMH (SEQ ID NO: 4), IINPSGGETGYAQKFQG (SEQ ID NO: 10) y AKEGVADGYGLVDV (SEQ ID NO: 13), respectivamente;

(iv) LCDR1, LCDR2 y LCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 14), YDASKRAT (SEQ ID NO: 15) y DQRNNWPLT (SEQ ID NO: 16), respectivamente, y HCDR1, HCDR2 y HCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos KASGYTFEKYYMH (SEQ ID NO: 5), IINPDGGSTGYAQKFQG (SEQ ID NO: 12) y AKEGVADGYGLVDV (SEQ ID NO: 13), respectivamente;

(v) LCDR1, LCDR2 y LCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 14), YDASKRAT (SEQ ID NO: 15) y DQRNNWPLT (SEQ ID NO: 16), respectivamente, y HCDR1, HCDR2 y HCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos KASGYTFTSNYMH (SEQ ID NO: 6), IINPSEGSTGYAQKFQG (SEQ ID NO: 11) y AKEGVADGYGLVDV (SEQ ID NO: 13), respectivamente; o

(vi) LCDR1, LCDR2 y LCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos RASQSVSSYLA (SEQ ID NO: 14), YDASKRAT (SEQ ID NO: 15) y DQRNNWPLT (SEQ ID NO: 16), respectivamente, y HCDR1, HCDR2 y HCDR3 consisten en las secuencias de aminoácidos KASGYTFSAYYMH (SEQ ID NO: 7), IINPDGGSTGYAQKFQG (SEQ ID NO: 12) y AKEGVADGYGLVDV (SEQ ID NO: 13), respectivamente.

2. Un anticuerpo, que comprende una cadena ligera (LC) y una cadena pesada (HC), en donde la cadena ligera comprende una región variable de la cadena ligera (LCVR) y la cadena pesada comprende una región variable de la cadena pesada (HCVR), en donde la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 23, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 17, SEQ ID NO: 18, SEQ ID NO: 19, SEQ ID NO: 20, SEQ ID NO: 21 o SEQ ID NO: 22.

3. El anticuerpo de la reivindicación 2, en donde

(i) la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 23, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 17;

(ii) la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 23, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 18;

(iii) la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 23, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 19;

(iv) la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 23, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 20;

(v) la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 23, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 21; o

(vi) la LCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 23, y la HCVR tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 22.

4. El anticuerpo de la reivindicación 2, en donde la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 29.

5. El anticuerpo de la reivindicación 4, en donde

(i) la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 24;

(ii) la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 25;

(iii) la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 26;

(iv) la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 27;

(v) la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 28;

(vi) la LC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y la HC tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 29.

6. El anticuerpo de la reivindicación 4, que comprende dos cadenas ligeras y dos cadenas pesadas, en donde cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 24, SEQ ID NO: 25, SEQ ID NO: 26, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 28 o SEQ ID NO: 29.

7. El anticuerpo de la reivindicación 6, en donde:

(i) cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 24;

(ii) cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 25;

(iii) cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 26;

(iv) cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 27;

(v) cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 28; o

(vi) cada una de las cadenas ligeras tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 30, y cada una de las cadenas pesadas tiene la secuencia de aminoácidos dada en SEQ ID NO: 29.

8. El anticuerpo de la reivindicación 6 o 7, en donde una de las cadenas pesadas forma un enlace disulfuro entre cadenas con una de las cadenas ligeras y la otra cadena pesada forma un enlace disulfuro entre cadenas con la otra cadena ligera, y una de las cadenas pesadas forma dos enlaces disulfuro entre cadenas con la otra cadena pesada.

9. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en donde el anticuerpo está glicosilado.

10. Una composición farmacéutica, que comprende el anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, y un soporte, diluyente o excipiente aceptable.

11. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para uso en terapia.

12. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1 -9, para uso en el tratamiento del cáncer, preferiblemente el cáncer es melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario o carcinoma hepatocelular.

13. El anticuerpo de una cualquiera de las reivindicaciones 1-9, para uso en combinación simultánea, separada o secuencial con uno o más agentes antitumorales, en el tratamiento del cáncer, preferiblemente el cáncer es melanoma, cáncer de pulmón, cáncer de cabeza y cuello, cáncer colorrectal, cáncer de páncreas, cáncer gástrico, cáncer de riñón, cáncer de vejiga, cáncer de próstata, cáncer de mama, cáncer de ovario o carcinoma hepatocelular.