JP2023544410A - タンパク質を濃縮するための方法 - Google Patents

Abstract

フェドバッチ設定を使用するバッチ様方式による限外濾過によって、大量の抗体供給原料を濃縮して濃縮原薬を生成するための最適化方法を本明細書において提供する。

Description

関連出願の相互参照
本出願は、２０２０年１０月５日申請の米国特許仮出願第６３／０８７，７１９号の優先的利益を主張し、その全体を参照により本明細書に組み込む。

開示の背景
抗体療法は、大きな患者利便性および患者コンプライアンスのために皮下形式による送達に移行しつつある。皮下送達を可能とするために、治療用タンパク質、例えば、抗体は、高用量で低容量の注射を介して送達しなければならず、これにより高濃度の最終製剤に製剤化することが必要となる。タンパク質製造プロセスでは、高濃度原薬生成の負荷は主に、限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）工程にかかり、ここで、精製タンパク質供給流は典型的に、第１の限外濾過工程において中等濃度に濃縮され、バッファーを目的の製剤に交換して、第２の限外濾過工程において高い最終濃度に濃縮される。これにより、剪断および界面応力への長期曝露下で濃縮による溶液粘度ならびにタンパク質の凝集傾向が著しく上昇するため、特有の課題が提起される。粘度が高いとシステム圧力が高くなり、これによって、システム圧力に対する安全性に関連する制約のため、達成可能な最大タンパク質濃度が制限される。粘度の上昇は、透過液流動の著しい低下と相関する可能性を有し、この低下によりプロセス時間が長くなり、このためタンパク質凝集のリスクが増幅し得る。高濃度物質の生成により充填物質の容量が著しく減少し、これによって設備の適合性および収容能力の課題が提起されるだけでなく、剪断および界面応力への長期曝露に起因する凝集の課題も増幅し得る。

高濃度原薬を生成するための改善方法の必要性が存在する。

開示の概要
本開示は、少なくとも１回濾過されている目的のタンパク質を含むタンパク質混合物（「保持液」）により供給タンクを持続的に充填することを含む、目的のタンパク質の濾過プロセス時間を削減する方法であって、この供給タンクが、主要リザーバー（「保持液」）タンクから分離している、方法に関する。また、本開示は、少なくとも１回濾過されている目的のタンパク質を含むタンパク質混合物（「保持液」）により供給タンクを持続的に充填することを含む、目的のタンパク質を濃縮する方法であって、この供給タンクが、主要リザーバー（「保持液」）タンクから分離している、方法に関する。一部の態様では、供給タンクは、少なくとも１回濾過されている目的のタンパク質を含む初期タンパク質混合物をさらに含む。一部の態様では、初期タンパク質混合物および保持液を混合する。一部の態様では、タンパク質混合物および／または保持液をフィルターにより濾過する。一部の態様では、濾過したタンパク質混合物および保持液（「保持液」）を供給タンクに充填する。一部の態様では、充填を、目的のタンパク質が、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約６０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約７０ｍｇ／ｍＬまたは少なくとも約８０ｍｇ／ｍＬに濃縮されるまで継続する。一部の態様では、充填を、目的のタンパク質が、約１ｍｇ／ｍＬ～８０ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ～７０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～４０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～３０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～２０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ～７０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ～４０ｍｇ／ｍＬ、または約２０ｍｇ／ｍＬ～３０ｍｇ／ｍＬに濃縮されるまで継続する。一部の態様では、保持液の充填を少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、少なくとも６０回、少なくとも７０回、少なくとも８０回、少なくとも９０回、少なくとも１００回、少なくとも１１０回、少なくとも１２０回、少なくとも１３０回、少なくとも１４０回、少なくとも１５０回、少なくとも１６０回、少なくとも１７０回、少なくとも１８０回、少なくとも１９０回、少なくとも２００回、少なくとも２１０回、少なくとも２２０回、少なくとも２３０回、少なくとも２４０回、少なくとも２５０回、少なくとも２６０回、少なくとも２７０回、少なくとも２８０回、少なくとも２９０回、または少なくとも３００回繰り返す。一部の態様では、方法は、供給タンクへの保持液の充填を停止することをさらに含む。一部の態様では、方法は、保持液をリザーバータンクに方向づけることをさらに含む。

また、本開示は、供給タンク、リザーバータンク、フィルター、フィルターを供給タンクに接続する供給タンク弁およびフィルターをリザーバータンクに接続するリザーバータンク弁を含む三方弁、ならびに供給タンクとリザーバータンクとを接続するリザーバーインプットを含む、濾過システムに、目的のタンパク質を含むタンパク質混合物を充填することを含む、目的のタンパク質の濾過プロセス時間を削減する方法に関する。また、本開示は、供給タンク、リザーバータンク、フィルター、フィルターを供給タンクに接続する供給タンク弁およびフィルターをリザーバータンクに接続するリザーバータンク弁を含む三方弁、ならびに供給タンクとリザーバータンクとを接続するリザーバーインプットを含む、濾過システムに、目的のタンパク質を含むタンパク質混合物を充填することを含む、目的のタンパク質を濃縮する方法に関する。一部の態様では、リザーバータンク弁は、目的のタンパク質が十分に濃縮されるまで閉じている。一部の態様では、方法は、タンパク質混合物を供給タンクに頻繁に加えることをさらに含む。一部の態様では、タンパク質混合物を供給タンクからリザーバータンクへ方向づける。一部の態様では、リザーバータンクをフィルターに接続する。一部の態様では、フィルターは、インライン濾過膜を含む。一部の態様では、インライン濾過膜は、限外濾過膜である。一部の態様では、インライン濾過膜は、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ナイロン、ケイ素、ポリケイ素、超ナノ結晶ダイヤモンド、ダイヤモンド様炭素、二酸化ケイ素、チタン、シリカ、窒化ケイ素、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリカーボネート、グラフェン、酸化グラフェン、ポリサッカライド、セラミック粒子、ポリ（スチレンジビニル）ベンゼン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、修飾ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリフェニルスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリ乳酸、ポリアクリロニトリル、フッ化ポリビニリデン、ポリピペラジン、ポリアミド－ポリエーテルブロックポリマー、ポリイミド、ポリエーテルイミド、ポリアミド、再生セルロース、複合再生セルロースまたはこれらの組合せである。一部の態様では、濾過膜は、約５０ｋＤ～約５ｋＤ、約５０ｋＤ、約４０ｋＤ、約３０ｋＤ、約２０ｋＤ、約１０ｋＤまたは約５ｋＤ未満の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する。一部の態様では、ＭＷＣＯは、約５ｋＤ未満である。

一部の態様では、混合物を所望の濾過タンパク質濃度に達するまで流動させる。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約１０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬ、例えば、約１０ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１１０ｍｇ／ｍＬ、約１２０ｍｇ／ｍＬ、約１３０ｍｇ／ｍＬ、約１４０ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１６０ｍｇ／ｍＬ、約１７０ｍｇ／ｍＬ、約１８０ｍｇ／ｍＬ、約１９０ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬ、約２５０ｍｇ／ｍＬ、または約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約１５０ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約０ｃＰ～約２００ｃＰである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約２０ｃＰ～約６０ｃＰである。一部の態様では、供給タンク容量とリザーバー容量との間の容量比は、約１：２～約１０：１、約１：２～約１：１、約１：１～約１：２、約１：１ 約１：３、約１：１～約１：４、約１：１～約１：５、約１：１～約１：６、約１：１～約１：７、約１：１～約１：８、約１：１～約１：９、または約１：１～約１：１０である。一部の態様では、供給タンク容量とリザーバー容量との間の容量比は、約１：１、約２：１または約５：１である。一部の態様では、タンパク質混合物をダイヤフラムポンプ、ロータリーローブポンプまたは蠕動ポンプを使用してリザーバータンクおよび／またはフィルターに方向づける。

一部の態様では、方法は、少なくとも１回濾過されている目的のタンパク質を含むタンパク質混合物（「保持液」）による供給タンクの持続的充填の前に、１回も濾過されていない目的のタンパク質を含む初期タンパク質混合物を供給タンクに充填することをさらに含む。一部の態様では、初期タンパク質混合物を約１ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの濃度で供給タンクに加える。一部の態様では、初期タンパク質混合物を約５ｍｇ／ｍＬの濃度で供給タンクに加える。

一部の態様では、プロセス時間は、フェドバッチ濃縮プロセスのプロセス時間と比較して約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％削減される。一部の態様では、プロセス時間は、フェドバッチ濃縮プロセスのプロセス時間と比較して約４０％削減される。

一部の態様では、プロセス時間は、フェドバッチ濃縮プロセスのプロセス時間と比較して約０．２時間、約０．４時間、約０．５時間、約０．６時間、約０．８時間または約１．０時間削減される。一部の態様では、プロセス時間は、フェドバッチ濃縮プロセスのプロセス時間と比較して約０．５時間削減される。

一部の態様では、１～２μｍの粒子数は、フェドバッチ濃縮プロセスの粒子数と比較して約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％減少する。一部の態様では、５～１０μｍの粒子数は、フェドバッチ濃縮プロセスの粒子数と比較して約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％減少する。一部の態様では、１０～２５μｍの粒子数は、フェドバッチ濃縮プロセスの粒子数と比較して約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％減少する。

一部の態様では、タンパク質混合物は、抗体、抗体断片、抗原結合断片、融合タンパク質、天然に存在するタンパク質、キメラタンパク質またはこれらの任意の組合せを含む。一部の態様では、タンパク質混合物は、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＧから選択される抗体を含む。一部の態様では、タンパク質混合物は抗体を含み、この抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４から選択されるＩｇＧ抗体である。一部の態様では、抗体は、二重可変ドメイン免疫グロブリンを含む。一部の態様では、抗体は、三価抗体を含む。一部の態様では、抗体または抗体断片は、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌｌ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＮＫＧ２ａ抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗ＴＧＦβ抗体、抗ＩＬ－１０抗体、抗Ｂ７－Ｈ４抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＩＬ－８抗体またはこれらの抗体断片を含む。

一部の態様では、タンパク質混合物は、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物細胞培養物に由来する。一部の態様では、哺乳動物細胞培養物は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養物である。

一部の態様では、タンパク質混合物は、バッチ細胞培養物から得られる。一部の態様では、タンパク質混合物は、フェドバッチ細胞培養物から得られる。一部の態様では、タンパク質混合物をバイオリアクターにおいて生成する。一部の態様では、タンパク質混合物を使い捨てバイオリアクターにおいて生成する。一部の態様では、タンパク質混合物は、灌流細胞培養物から得られる。一部の態様では、タンパク質混合物を灌流またはＴＦＦ灌流バイオリアクターにおいて生成する。一部の態様では、タンパク質混合物を約１日間～約６０日間存続する細胞培養物により生成する。一部の態様では、タンパク質混合物を約２５日間存続する細胞培養物により生成する。

一部の態様では、タンパク質混合物は、ローディングバッファーとともに供給タンクに加える。一部の態様では、ローディングバッファーは、アミノ酸、弱酸、弱塩基および／または糖を含む。

一部の態様では、方法は、タンパク質を医薬組成物に製剤化することをさらに含む。一部の態様では、タンパク質は、本明細書に開示の方法により調製する。一部の態様では、医薬組成物は、本明細書において調製したタンパク質を含む。

また、本開示は、本明細書に開示の医薬組成物を投与する方法に関する。また、本開示は、医薬組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における疾患または症状を治療する方法に関する。

また、本開示は、
（ａ）供給タンク、
（ｂ）第１の流体経路により供給タンクに接続するリザーバータンク、
（ｃ）第２の流体経路によりリザーバータンクに接続する濾過膜、および
（ｄ）第３の流体経路により濾過膜に接続し、第４の流体経路によりリザーバータンクに接続し、第５の流体経路により供給タンクに接続する、三方弁
を含む、目的のタンパク質を濃縮するためのシステムであって、
リザーバータンクが、第１の流体経路を介して供給タンクから目的のタンパク質を含むタンパク質混合物を受領し、
濾過膜が、第２の流体経路を介してリザーバータンクから目的のタンパク質を含むタンパク質混合物を受領して、タンパク質混合物を濾過し、
三方弁が、第３の流体経路を介してフィルターから保持液を受領して、保持液を第４の流体経路を介してリザーバータンク、または第５の流体経路を介して供給タンクのいずれかに方向づける、システムに関する。

一部の態様では、三方弁は、システム内のタンパク質混合物の全容量がリザーバータンクの収容能力未満である場合、保持液をリザーバータンクに方向づけ、システム内のタンパク質混合物の全容量がリザーバータンクの収容能力よりも大きい場合、保持液を供給タンクに方向づける。

一部の態様では、システムは、システム内のタンパク質混合物の全容量および／または濃度を判定するように構成されたセンサーをさらに含み、ここで、三方弁は、センサーからのフィードバックに基づいて、保持液をリザーバータンクまたは供給タンクのいずれかに自動的に方向づける。一部の態様では、システムは、１つまたは複数のダイヤフラムポンプ、ロータリーローブポンプまたは蠕動ポンプをさらに含む。一部の態様では、フィルターは、インライン濾過膜を含む。一部の態様では、インライン濾過膜は、限外濾過膜である。一部の態様では、インライン濾過膜は、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ナイロン、ケイ素、ポリケイ素、超ナノ結晶ダイヤモンド、ダイヤモンド様炭素、二酸化ケイ素、チタン、シリカ、窒化ケイ素、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリカーボネート、グラフェン、酸化グラフェン、ポリサッカライド、セラミック粒子、ポリ（スチレンジビニル）ベンゼン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、修飾ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリフェニルスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリ乳酸、ポリアクリロニトリル、フッ化ポリビニリデン、ポリピペラジン、ポリアミド－ポリエーテルブロックポリマー、ポリイミド、ポリエーテルイミド、ポリアミド、再生セルロース、複合再生セルロースまたはこれらの組合せである。

図１Ａ～１Ｃは、接線流濾過（ＴＦＦ）システムの模式図を示す。図１Ａは、フェドバッチ構成におけるＴＦＦ限外濾過／透析濾過システム設定の模式図を示す。図１Ｂは、シュードバッチ構成におけるＴＦＦ限外濾過／透析濾過システム設定の模式図を示す。図１Ｃは、バッチ構成におけるＴＦＦ限外濾過／透析濾過システム設定の模式図を示す。 同上。 同上。

図２Ａ～２Ｂは、バッチ充填、フェドバッチ充填およびシュードバッチ充填構成における、経過プロセス時間の関数としての保持液ｍＡｂ濃度を示す。図２Ａは、バッチ、フェドバッチおよびシュードバッチ充填戦略についての、経過プロセス時間（時間）の関数としての算出したｍＡｂ Ａ（ｇ／Ｌ）の保持液濃度を示す。図２Ｂは、左から右にそれぞれ限外濾過１（ＵＦ１）、透析濾過（ＤＦ）および限外濾過２（ＵＦ２）のプロセス段階のそれぞれにおける対応するプロセス時間を示す。 同上。

図３は、限外濾過／透析濾過実行中の、ｍＡｂ Ａの算出保持液濃度の関数としての透過液流動（ＬＨＭ）を示す。実行は、バッチ、フェドバッチまたはシュードバッチ充填（ＵＦ１）を使用して実施したが、３回すべての実行は、ＤＦおよびＵＦ２工程においてバッチ構成により操作した。

図４は、バッチ、フェドバッチ（ハイブリッド）およびシュードバッチ充填戦略についてのＵＦ／ＤＦプロセスの中間点におけるｍＡｂ Ａの高分子量（ＨＭＷ）種のレベルを示す。

図５Ａ～５Ｄは、バッチ、フェドバッチ（ハイブリッド）およびシュードバッチ充填戦略を使用して生成したプロセス中のＵＦ／ＤＦプールにおける粒子のｍＡｂ Ａ粒子数を示す。図５Ａは、１～２μｍ粒子の粒子数を示す。図５Ｂは、５～１０μｍ粒子の粒子数を示す。図５Ｃは、１０～２５μｍ粒子の粒子数を示す。図５Ｄは、５０～１００μｍ粒子の粒子数を示す。粒子量は、マイクロ流体イメージングを使用して定量した。２～５μｍおよび２５～５０μｍのサイズ範囲の粒子数は、簡潔さのために除外したが、５～１０μｍおよび５０～１００μｍのサイズ範囲においてそれぞれ観察された傾向と一致した。 同上。 同上。 同上。

図６Ａは、ダイヤフラムポンプおよび蠕動ポンプを使用するシュードバッチ実行における、プロセス時間の関数としての保持液ｍＡｂ濃度を示す。図６Ｂは、図６Ａの各プロセス段階（例えば、ＵＦ１、ＤＦおよびＵＦ２）における対応するプロセス時間を示す。 同上。

図７は、ダイヤフラムポンプおよび蠕動ポンプを使用するシュードバッチ実行における、保持液濃度の関数としての透過液流動を示す。

図８は、ダイヤフラムポンプおよび蠕動ポンプを使用するシュードバッチプロセスにおける高分子量（ＨＭＷ）種のレベルを示す。

図９Ａ～９Ｄは、ダイヤフラムポンプまたは蠕動ポンプのいずれかを使用したシュードバッチ充填戦略を使用して生成したプロセス中のＵＦ／ＤＦプールにおける粒子のｍＡｂ Ａ粒子数を示す。図９Ａは、１～２μｍ粒子の粒子数を示す。図９Ｂは、５～１０μｍ粒子の粒子数を示す。図９Ｃは、１０～２５μｍ粒子の粒子数を示す。図９Ｄは、５０～１００μｍ粒子の粒子数を示す。粒子数は、マイクロ流体イメージングを使用して定量した。 同上。 同上。 同上。

図１０Ａは、シュードバッチ実行におけるプロセス時間の関数としての保持液ｍＡｂ濃度を示す。ここでは、充填工程における保持液タンクの液体容量は、全充填容量に対して低容量（例えば、１０％および２０％）で一定に維持した。図１０Ｂは、図１０Ａの各プロセス段階（例えば、ＵＦ１、ＤＦおよびＵＦ２）における対応するプロセス時間を示す。 同上。

図１１は、シュードバッチ実行における保持液濃度の関数としての透過液流動を示す。ここでは、充填工程における保持液タンクの液体容量は、全充填容量に対して低容量で一定に維持した。

図１２は、シュードバッチ実行における高分子量（ＨＭＷ）種のレベルを示す。ここでは、充填工程における保持液タンクの液体容量は、全充填容量に対して低容量で一定に維持した。

図１３Ａ～１３Ｄは、シュードバッチ充填を使用して生成したプロセス中のＵＦ／ＤＦプールにおける粒子のｍＡｂ Ａ粒子数を示す。ここでは、充填工程における保持液タンクの液体容量は、全充填容量に対して低容量で一定に維持した。図１３Ａは、１～２μｍ粒子の粒子数を示す。図１３Ｂは、５～１０μｍ粒子の粒子数を示す。図１３Ｃは、１０～２５μｍ粒子の粒子数を示す。図１３Ｄは、５０～１００μｍ粒子の粒子数を示す。粒子数は、マイクロ流体イメージングを使用して定量した。 同上。 同上。 同上。

図１４は、非ｍＡｂ治療用タンパク質（ＭＷは、およそ２０Ｄａ）に対するシュードバッチおよびフェドバッチプロセス実行におけるプロセス時間の関数としての保持液タンパク質濃度を示す。

図１５は、図１４に示すシュードバッチおよびフェドバッチプロセス実行における保持液濃度の関数としての透過液流動を示す。

図１６は、図１４に示すシュードバッチおよびフェドバッチプロセス実行における高分子量（ＨＭＷ）種のレベルを示す。

図１７Ａ～１７Ｄは、図１４の非ｍＡｂ治療用タンパク質に対するシュードバッチおよびフェドバッチプロセス実行における粒子数を示す。図１７Ａは、１～２μｍ粒子の粒子数を示す。図１７Ｂは、５～１０μｍ粒子の粒子数を示す。図１７Ｃは、１０～２５μｍ粒子の粒子数を示す。図１７Ｄは、５０～１００μｍ粒子の粒子数を示す。粒子数は、マイクロ流体イメージングを使用して定量した。 同上。 同上。 同上。

開示の詳細な説明
本開示は、目的のタンパク質の濾過プロセス時間を削減する方法を対象とする。また、本開示は、目的のタンパク質を濃縮する方法に関する。

Ｉ．定義
本開示をより容易に理解可能とするために、特定の用語を最初に定義する。本明細書において使用する場合、本明細書において他に明示的に提示するものを除いて、次の用語のそれぞれは、以下に記載の意味を有するものとする。さらなる定義は、本明細書を通じて記載する。

「ａ」または「ａｎ」の用語が、その実体の１つまたは複数を指すことに留意されたい。例えば、「ヌクレオチド配列」は、１つまたは複数のヌクレオチド配列を表すことが理解される。したがって、「ａ」（または「ａｎ」）、「１つまたは複数」および「少なくとも１つ」の用語は、本明細書において互換的に使用することができる。

本明細書において使用する「および／または」の用語は、特定する２つの特徴または成分のそれぞれを、他方の有無にかかわらず詳細に開示することとして解釈すべきである。したがって、「および／または」の用語は、本明細書において「Ａおよび／またはＢ」のような句により使用する場合、「ＡおよびＢ」、「ＡまたはＢ」、「Ａ」（単独）および「Ｂ」（単独）を含むことを意図する。同様に、「および／または」の用語は、「Ａ、Ｂおよび／またはＣ」のような句により使用する場合、次の態様：Ａ、ＢおよびＣ；Ａ、ＢまたはＣ；ＡまたはＣ；ＡまたはＢ；ＢまたはＣ；ＡおよびＣ；ＡおよびＢ；ＢおよびＣ；Ａ（単独）；Ｂ（単独）；ならびにＣ（単独）のそれぞれを包含することを意図する。

本明細書において態様を「ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ（含む）」の言葉により記載する場合はいつでも、「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ（からなる）」および／または「ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｅｓｓｅｎｔｉａｌｌｙ ｏｆ（から本質的になる）」の用語により記載する類似の態様をも提示することが理解される。

他に定義しない場合、本明細書において使用するすべての技術的および科学的用語は、本開示が関連する技術分野の当業者により一般に理解されるものと同一の意味を有する。例えば、the Concise Dictionary of Biomedicine and Molecular Biology, Juo, Pei-Show, 2nd ed., 2002, CRC Press；The Dictionary of Cell and Molecular Biology, 3rd ed., 1999, Academic Press；およびthe Oxford Dictionary Of Biochemistry And Molecular Biology, Revised, 2000, Oxford University Pressによって、本開示において使用する多くの用語の一般的辞典が、当業者に提供される。

単位、接頭辞および記号は、これらの国際単位系（Ｓｙｓｔｅｍｅ Ｉｎｔｅｒｎａｔｉｏｎａｌ ｄｅ Ｕｎｉｔｅｓ、ＳＩ）により認められた形態において表す。数値範囲は、その範囲を定義する数を含む。本明細書において提示する見出しは、本開示の種々の態様の制限ではなく、本明細書を全体として参照することにより有し得る。したがって、直下に定義する用語は、本明細書をその全体において参照することにより、さらに十分に定義される。

選択肢（例えば、「または」）の使用は、選択肢のいずれか１つ、両方またはそれらの任意の組合せを意味することを理解すべきである。本明細書において使用する場合、「ａ」または「ａｎ」の不定冠詞は、列挙または数え上げた任意の成分の「１つまたは複数」を指すことを理解すべきである。

「約」または「から本質的になる」の用語は、当業者により決定される、特定の値または組成物の許容される誤差の範囲内の値または組成物を指し、これは部分的に、値または組成物の測定または決定方法、すなわち、測定システムの制限に依存する。例えば、「約」または「から本質的になる」は、当技術分野における実践１回あたり１以上の標準偏差を意味し得る。あるいは、「約」または「から本質的になる」は、最大２０％の範囲を意味し得る。その上、特に、生物学的システムまたはプロセスに関して、用語は、最大一桁または最大５倍の値を意味し得る。本出願および特許請求の範囲において特定の値または組成物が提示される場合、他に述べない限り、「約」または「から本質的になる」の意味は、この特定の値または組成物の許容される誤差の範囲内であると想定すべきである。

本明細書において記載する場合、任意の濃度範囲、百分率範囲、比率範囲または整数範囲は、他に指示しない限り、列挙する範囲内の任意の整数の値、および適切な場合、これらの分率（例えば、整数の１０分の１および１００分の１）を含むことを理解すべきである。

「限外濾過」の用語は、例えば、溶液中の分子をサイズに基づいて分離する、膜に基づく分離プロセスを指し、これにより異分子の分離が達成されるか、または同分子の濃縮が達成され得る。

「接線流濾過」の用語は、溶質含有溶液が限外濾過膜を接線方向に通過し、加圧により低分子量の溶質に膜を通過させる、特定の濾過方法を指す。限外濾過膜を接線方向に通過する高分子量溶質含有溶液は、保持されるため、この溶液を本明細書において「保持液」と呼ぶ。限外濾過膜を通過する低分子量溶質は、本明細書において「透過液」と呼ぶ。したがって、保持液は、圧力下で限外濾過膜の表面を、例えば、接線方向に流れることにより濃縮される。限外濾過膜は、特定のカットオフ値による孔径を有する。一部の態様では、カットオフ値は、約５０ｋＤａ以下、例えば、５０ｋＤａ、４０ｋＤａ、３０ｋＤａ、２０ｋＤａまたは１０Ｄａである。一部の態様では、カットオフ値は、３０ｋＤａ以下である。

「透析濾過」または「ＤＦ」の用語は、例えば、限外濾過膜を使用してタンパク質、ペプチド、核酸または他の生体分子を含む溶液または混合物からソルベント、バッファーおよび／または塩の濃度を除去、置換または低下させることを指す。

「フェドバッチ」、「フェドバッチ濾過」または「フェドバッチ濾過プロセス」の用語は、本明細書において使用する場合、目的のタンパク質を含む供給原料を供給タンクに充填し、その後、リザーバータンク内に方向づける、接線流濾過の濾過（例えば、限外濾過）方法を指し、ここで、供給原料は、ＴＦＦにおいて濃縮し、保持液は、保持液タンク内に戻るように方向づける。「バッチ」、「バッチ濾過」または「バッチ濾過プロセス」の用語は、タンパク質混合物をリザーバータンクに充填して、ここから保持液を生成し、この保持液をリザーバータンク内に戻るように方向づける一方、透過液を排液管に方向づけて廃棄する濾過（例えば、限外濾過）構成を指す。

本明細書において互換的に使用する「ポリペプチド」または「タンパク質」の用語は、任意の長さのアミノ酸のポリマーを指す。ポリマーは、直鎖または分枝鎖状であってもよく、修飾アミノ酸を含んでもよく、非アミノ酸により分断されていてもよい。また、この用語は、天然に、または介入、例えば、ジスルフィド結合形成、グリコシル化、脂質化、アセチル化、リン酸化または他の修飾操作、例えば、標識成分とのコンジュゲーションにより修飾したアミノ酸ポリマーを包含する。例えば、アミノ酸（例えば、非天然アミノ酸等を含む）の１つまたは複数の類似体を含むポリペプチドならびに当技術分野において公知の他の修飾も定義に含む。「ポリペプチド」および「タンパク質」の用語は、本明細書において使用する場合、抗体およびＦｃドメイン含有ポリペプチド（例えば、イムノアドヘシン）を特に包含する。

本明細書において使用する場合、「目的のタンパク質」の用語は、精製することが望まれる混合物に存在する任意のタンパク質（天然または組換えのいずれか）を含むように使用する。このような目的のタンパク質は、酵素、ホルモン、増殖因子、サイトカイン、免疫グロブリン（例えば、抗体）および／または融合タンパク質を含むが、これらに限定されない。一部の態様では、目的のタンパク質は、本明細書に記載の接線流濾過（ＴＦＦ）方法を使用して精製および／または濃縮可能な任意のタンパク質を指す。一部の態様では、目的のタンパク質は、抗体である。一部の態様では、目的のタンパク質は、組換えタンパク質である。

「フェドバッチ培養」または「フェドバッチ培養プロセス」の用語は、本明細書において使用する場合、培養プロセス開始後のある時点で、さらなる成分を培養物に提供する、細胞を培養する方法を指す。フェドバッチ培養は、基本培地を使用して開始することができる。培養プロセス開始後のある時点でさらなる成分を培養物に提供する培養培地は、フィード培地である。フェドバッチ培養は典型的に、ある時点で停止させ、培地中の細胞および／または成分を回収して適宜精製する。

本明細書において使用する場合、「灌流」または「灌流培養」または「灌流培養プロセス」は、細胞集団の中または上を通じた安定速度による生理学的栄養液の持続流を指す。灌流システムは、培養単位における細胞の保持を一般に含むため、灌流培養は、比較的高い細胞密度を特性的に有するが、培養条件の維持および調節が困難である。加えて、細胞が増殖して、培養単位において高密度で保持されるため、増殖率は典型的に、時間とともに持続的に低下し、これにより細胞増殖の対数期または静止期までもが遅くなる。この持続培養戦略は一般に、持続細胞培養システムの生成段階において目的のポリペプチドおよび／またはウイルスを発現する哺乳動物細胞、例えば、非足場依存性細胞の培養を含む。

本明細書において使用する場合、「設定点」は、他に指示しない限り、ＴＦＦシステムまたはタンパク質生成物の濃縮および／もしくは生成に使用する他の上流処理容器における条件の初期設定を指す。設定点は、本明細書に記載のＵＦ／ＤＦプロセスの開始時に確立する。ＴＦＦにおいてＵＦ／ＤＦ条件が変動するため、設定点後のＵＦ／ＤＦにおける条件は、引き続いて変化し得る。例えば、設定点は、質量設定点であり得る。一部の態様では、設定点は、温度設定点である。一部の態様では、設定点は、細胞培養方法を通じて維持することができる。他の態様では、設定点は、異なる設定点を設定するまで維持することができる。他の態様では、設定点は、別の設定点に変えることができる。

「抗体」（Ａｂ）は、抗原に特異的に結合し、ジスルフィド結合により相互接続された少なくとも２つの重（Ｈ）鎖および２つの軽（Ｌ）鎖を含む、糖タンパク質免疫グロブリンを含むが、これらに限定されないものとする。各Ｈ鎖は、重鎖可変領域（本明細書においてＶ_Ｈとして省略する）および重鎖定常領域を含む。重鎖定常領域は、３つの定常ドメイン、ＣＨ_１、ＣＨ_２およびＣＨ_３を含む。各軽鎖は、軽鎖可変領域（本明細書においてＶ_Ｌとして省略する）および軽鎖定常領域を含む。軽鎖定常領域は、１つの定常ドメイン、Ｃ_Ｌを含む。Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌ領域は、相補性決定領域（ＣＤＲ）と呼ばれる超可変性領域にさらに細分され、これは、フレームワーク領域（ＦＲ）と呼ばれる、より保存された領域が組み込まれ得る。各Ｖ_ＨおよびＶ_Ｌは、３つのＣＤＲおよび４つのＦＲを含み、これは、アミノ末端からカルボキシ末端まで次の順序：ＦＲ１、ＣＤＲ１、ＦＲ２、ＣＤＲ２、ＦＲ３、ＣＤＲ３、ＦＲ４で配置される。重および軽鎖の可変領域は、抗原と相互作用する結合ドメインを含む。抗体の定常領域は、免疫系の種々の細胞（例えば、エフェクター細胞）および古典的補体系の第１成分（Ｃ１ｑ）を含む、宿主組織または因子への免疫グロブリンの結合を媒介し得る。重鎖は、Ｃ末端リジンを有しても有しなくてもよい。一部の態様では、抗体は、完全長抗体である。

免疫グロブリンは、ＩｇＡ、分泌型ＩｇＡ、ＩｇＧ、ＩｇＤ、ＩｇＥおよびＩｇＭを含むが、これらに限定されない一般に公知のアイソタイプのいずれかに由来し得る。また、ＩｇＧサブクラスは、当業者に周知であり、ヒトＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４を含むが、これらに限定されない。「アイソタイプ」は、重鎖定常領域遺伝子によりコードされる、抗体クラスまたはサブクラス（例えば、ＩｇＭまたはＩｇＧ１）を指す。「抗体」の用語は、例として、モノクローナル抗体およびポリクローナル抗体、キメラ抗体およびヒト化抗体、ヒトまたは非ヒト抗体、完全合成抗体ならびに一本鎖抗体を含む。非ヒト抗体は、組換え方法によりヒト化して、ヒトにおけるその免疫原性を低下させ得る。「抗体」の用語は、３つ以上の抗原に結合可能な多価抗体（例えば、三価抗体）を含み得る。三価抗体は、第３の非対称性Ｆａｂサイズ結合分子１つに可動性リンカーペプチドを介して融合する２つの左右対称のＦａｂアームから構成されるＩｇＧ型二重特異性抗体である。この第３の分子は、ＩｇＧ Ｆｃ領域に代わり、「ノブ」変異を有するＣＨ３に融合する重鎖の可変領域、および適合する「ホール」を有するＣＨ３に融合する軽鎖の可変領域からなる。ヒンジ領域は、第３の結合部位への抗原の接触を容易とするジスルフィド結合を含まない。明示的に述べない場合および文脈上他に指示しない限り、「抗体」の用語は、単一特異性、二重特異性または多重特異性抗体ならびに一本鎖抗体を含む。

抗体の「抗原結合部分」または「抗原結合断片」の用語は、本明細書において使用する場合、抗原に特異的に結合する能力を保持する抗体の１つまたは複数の断片を指す。抗体の抗原結合機能は、完全長抗体の断片により実施可能であることがわかっている。抗体の「抗原結合断片」の用語に包含される結合断片の例としては、（ｉ）Ｆａｂ断片（パパイン切断による断片）またはＶＬ、ＶＨ、ＬＣおよびＣＨ１ドメインからなる類似の一価断片、（ｉｉ）Ｆ（ａｂ’）２断片（ペプシン切断による断片）またはヒンジ領域においてジスルフィド架橋により結合する２つのＦａｂ断片を含む類似の二価断片、（ｉｉｉ）ＶＨおよびＣＨ１ドメインからなるＦｄ断片、（ｉｖ）抗体の単一アームのＶＬおよびＶＨドメインからなるＦｖ断片、（ｖ）ＶＨドメインからなるｄＡｂ断片（Ward et al., (1989) Nature 341:544-546）、（ｖｉ）単離相補性決定領域（ＣＤＲ）、ならびに（ｖｉｉ）合成リンカーにより適宜結合する２つ以上の単離ＣＤＲの組合せが挙げられる。その上、Ｆｖ断片の２つのドメイン、ＶＬおよびＶＨは別々の遺伝子によりコードされるが、これらは、組換え方法を使用して、ＶＬおよびＶＨ領域が対となり一価分子を形成する単一のタンパク質鎖とすることが可能な合成リンカーにより結合させることができる（一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）として知られる；例えば、Bird et al. (1988) Science 242:423-426およびHuston et al. (1988) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:5879-5883を参照）。また、このような一本鎖抗体は、抗体の「抗原結合部分」の用語に包含することを意図する。このような抗体断片は、当業者に公知の従来技術を使用して得られ、断片は、インタクトな抗体として同一の方法により有用性についてスクリーニングする。抗原結合部分は、組換えＤＮＡ技術によって、またはインタクトな免疫グロブリンの酵素的もしくは化学的切断によって生成することができる。

「二重特異性」または「二機能性抗体」は、種々の抗原に対する特異性を有する２つの抗原結合部位が生じる、２つの異なる重／軽鎖対を有する人工ハイブリッド抗体である。二重特異性抗体は、ハイブリドーマの融合またはＦａｂ’断片の結合を含む多様な方法により生成することができる。例えば、Songsivilai & Lachmann, Clin. Exp. Immunol. 79:315-321 (1990)；Kostelny et al., J. Immunol. 148, 1547-1553 (1992)を参照されたい。

「融合」または「キメラ」タンパク質は、本来、天然には結合しない第２のアミノ酸配列に結合する第１のアミノ酸配列を含む。別々のタンパク質に通常存在するアミノ酸配列は、融合ポリペプチドにまとめることができるか、または同一タンパク質に通常存在するアミノ酸配列は、融合ポリペプチドの新たな配列に配置することができ、例えば、ＩｇＦｃドメインを有するこの開示の第ＶＩＩＩ因子ドメインの融合が挙げられる。融合タンパク質は、例えば、化学合成によって、またはペプチド領域が所望の関係でコードされるポリヌクレオチドの生成および翻訳によって生成する。キメラタンパク質は、共有、非ペプチド結合または非共有結合により第１のアミノ酸配列と関連する第２のアミノ酸配列をさらに含み得る。

「投与」は、当業者に公知の種々の方法および送達システムのいずれかを使用する、対象への治療薬を含む組成物の物理的導入を指す。本明細書に開示の製剤の投与経路は、静脈内、筋肉内、皮下、腹腔内、脊髄、または例えば、注射もしくは注入による他の非経口的投与経路を含む。「非経口的投与」の句は、本明細書において使用する場合、通常は注射による、経腸および局所投与以外の投与方式を意味し、通常、静脈内、筋肉内、動脈内、くも膜下腔内、リンパ内、病巣内、嚢内、眼窩内、心臓内、皮内、腹腔内、経気管、皮下、表皮下、関節内、被膜下、くも膜下、脊髄内、硬膜外および胸骨内注射および注入ならびにインビボ（ｉｎ ｖｉｖｏ）でのエレクトロポレーションを含むが、これらに制限されない。一部の実施形態では、製剤は、非経口経路以外の経路を介して投与し、一部の実施形態では、経口経路を介して投与する。他の非経口経路以外の経路としては、局所、上皮または粘膜の投与経路、例えば、鼻腔内、膣内、直腸内、舌下または局所投与が挙げられる。また、投与は、例えば、１回、複数回および／または１期間もしくは複数期間の長期間にわたって実施することができる。

対象の「治療」または「療法」は、症候、合併症もしくは症状または疾患と関連する生物化学的指標の進行、発症、重症度または再発を回復、緩和、寛解、阻害、遅延させる目的で、対象に対して実施する任意の種類の介入もしくはプロセスまたは活性剤の投与を指す。固形腫瘍における奏効評価基準（ＲＥＣＩＳＴ）は、治療有効性の指標であり、治療の間に腫瘍が奏効、安定または増悪する場合を定義するように確立された規定である。ＲＥＣＩＳＴ１．１は、成人および小児のがん臨床試験における使用についての、腫瘍サイズにおける変化の客観的評価のための、固形腫瘍の測定および定義に対する現在のガイドラインである。米国東海岸癌臨床試験グループ（ＥＣＯＧ）パフォーマンスステータスは、患者を登録する医師らが一律に再現することができるように、試験において調査する患者集団を定義するために使用する番号付けの尺度である。小児患者では、Ｌａｎｓｋｙパフォーマンススケールが、子供における機能状態を説明するための方法である。これは、小児がん患者を対象に、療法に対する奏効および全身状態を評価するために導きだされ、内部的に検証されたものである。

本明細書に記載するように、任意の濃度範囲、百分率範囲、比率範囲または整数範囲は、他に指示しない限り、列挙する範囲内の任意の整数の値、および適切な場合、これらの分率（例えば、整数の１０分の１および１００分の１）を含むことを理解すべきである。

「所望の最終タンパク質濃度」の用語は、本明細書において使用する場合、本明細書に記載の接線流濾過方法を使用して濃縮された目的のタンパク質のタンパク質濃度を指す。例えば、目的のタンパク質の所望の最終タンパク質濃度は、目的のタンパク質を含む混合物を、本明細書に記載のＵＦ１、ＤＦおよびＵＦ２工程に供することにより達成する。一部の態様では、所望の最終タンパク質濃度は、最大３００ｍｇ／ｍＬである。

本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される担体」は、薬理学的に活性な薬剤の媒体を指す。担体により、薬剤の機能を遮ることなく、標的部位への活性剤の送達が容易となる。担体の適する形態の非限定的な例としては、溶液、クリーム、ゲル、ゲルエマルジョン、ゼリー、ペースト、ローション、塗布薬（ｓａｌｖｅ）、スプレー、軟膏、粉末、固形混合物、エアロゾル、エマルジョン（例えば、油中水または水中油）、ゲル水溶液、水溶液、懸濁液、リニメント、チンキおよび局所投与に適するパッチが挙げられる。

本明細書において使用する場合、「薬学的に許容される組成物」（または「医薬組成物」）の句は、例えば、ヒトへの薬学的投与に許容される組成物を指す。このような組成物は、薬学的投与に許容されるレベルを越えないレベル（このようなレベルは、このような不純物が存在しない場合を含む）で不純物を有する物質を含むことができ、例えば、投与し易いようにこのような組成物を製剤化するために、薬学的に許容される賦形剤、媒体、担体および他の不活性成分を、任意の活性剤（複数可）に加えて含むことができる。例えば、薬学的に許容される抗ＰＤ１抗体組成物は、ヒトへの投与に許容されるレベルである限り、ＤＮＡを含むことができる。

ＩＩ．限外濾過方法
本開示では、最終タンパク質収集物を高度に濃縮することが可能となるタンパク質精製方法を提供する。一部の態様では、本開示の方法により、供給原料が大量の減少し、初期容量が十分大きいためフェドバッチ方式での初期操作を必要とするタンパク質精製プロセスにおいて、第１の限外濾過工程（例えば、第１の限外濾過工程、透析濾過および第２の限外濾過工程を含むか、またはこれらからなるプロセスにおける）に必要とされるプロセス時間が削減される。

一部の態様では、本開示の方法により、限外濾過による高濃度原薬（例えば、目的のタンパク質）の生成に関連する間接的課題が軽減される。例えば、高濃度物質（例えば、およそ１５０～３００ｇ／Ｌ）の生成により充填物質の容量が著しく減少し、これによって設備の適合性および収容能力の課題が提起されるだけでなく、剪断および界面応力への長期曝露に起因する凝集の課題も増幅し得る。限外濾過中に、試料容量は著しく減少するが（例えば、典型的には１０分の１以下）、保持液容器およびシステム貯蔵容量は固定されて、プロセスにおいてシステム規模（例えば、保持液容器およびシステム貯蔵容量）と試料容量との間に大きな不適合が存在する時点が生じる。容器の下部を含むシステム流路が、濾過プロセスを通じて液体で満たされたままでいなければならないため、最終濃度の原薬（例えば、目的のタンパク質）容量は、保持液容器形状と相まって、システムの最小可動容量を決定づける。最小可動容量は容器サイズとともに増加するため、最終原薬によって保持液容器サイズの上限が設定される。この上限は、充填容量未満である。したがって、充填物質の一部は、フェドバッチ充填を使用して保持液容器に供給する必要を有する。フェドバッチ充填により供給しなければならない初期充填容量の百分率は、設備適合性、例えば、利用可能な容器サイズおよびシステム貯蔵容量の関数である。

フェドバッチ充填により大量の充填処理が可能となるが、この充填戦略は、バッチ操作と比較してプロセス時間のペナルティーを課す。バッチプロセスでは、試料の液体（バッファー）容量が、全タンパク質量（例えば、保持液容器中のすべて）中で均一に分配されるが、フェドバッチプロセスでは、充填容器（例えば、供給タンク）の希釈物質と保持液容器の濃縮タンパク質との間で分割されるため、所与の量の残存試料容量では、保持液タンパク質濃度は、バッチプロセスよりもフェドバッチプロセスの方が高い。結果として、フェドバッチ透過流動は、保持液濃度が高いために低くなる。したがって、システムでは、フェドバッチ方式の第１の限外濾過工程の大部分においてバッチ方式と比較して高濃度および低流動で操作するためプロセス時間が長くなり、次いで、これにより剪断および界面応力により誘導される凝集のリスクが増大する。

製造規模設定では、高濃度原薬を生成するための第１の限外濾過工程の操作方式は典型的に、完全バッチでもフェドバッチでもない。代わりに、限外濾過工程では、保持液容器への充填物質の供給においてフェドバッチ方式により操作し、次いで、充填物質が保持液容器に十分に含まれるとバッチ方式に切り換える。この混合方式による限外濾過工程は、以後「ハイブリッド」方式と呼ぶ。ハイブリッド方式では、第１の限外濾過工程のプロセス時間が、完全なバッチ方式またはフェドバッチ方式で操作する場合に予想されるプロセス時間以内となり、これは、システム操作がフェドバッチ方式からバッチ方式に切り換わる交差点に依存する。交差点およびハイブリッドプロセス時間を説明する式は、実施例１に記載する。次いで、交差点に対応する濃度は、相対的充填量およびシステム容量の関数であり、これによりプロセス時間が、設備適合性の強力な関数となる。

技術移行において相対的充填量およびシステム容量の差が考慮されていない場合、実験室規模で開発されたプロセスパラメーターの規格によって製造規模において予想外に長いプロセス時間が引き起こされ得るため、この依存性によってプロセス開発および技術移行の課題が生まれる。対照的に、バッチプロセスのプロセス時間は膜充填のみに依存するため、プロセスは、十分に拡張可能となる。

第１の限外濾過工程におけるハイブリッド操作方式により生じる、プロセス時間のペナルティーまたは設備適合依存性に取り組むための体系的手法は、開発されていない。このような課題を軽減するために、本明細書においてシュードバッチ操作方式と呼ぶ、フェドバッチ様設定を使用する限外濾過工程のバッチ様操作が可能となる、本明細書に開示の方法を開発した。

本開示では、フェドバッチ設定を使用するバッチ様方式による限外濾過によって、大量のタンパク質供給原料を濃縮して濃縮原薬を生成するための最適化方法を提供する。また、本開示は、高度に濃縮されたタンパク質を含む溶液を接線流濾過（ＴＦＦ）により生成するための方法に関する。本明細書に開示の方法では、供給原量が大量の減少し、初期容量が十分大きいためフェドバッチ方式での初期操作を必要とするプロセスにおいて、第１の限外濾過工程（例えば、第１の限外濾過工程、透析濾過および第２の限外濾過工程を含むか、またはこれらからなるプロセスにおける）に必要とされるプロセス時間が削減される。一部の態様では、プロセス時間が短いために限外濾過工程において生成される粒子および不純物負荷によって定量する場合、方法により生成物の品質が向上する。一部の態様では、方法により、フェドバッチ方式により操作する場合、実験室、例えば、開発と製造との規模間の機器設定において観察されるプロセス時間の可変性が排除される。一部の態様では、規模間で生じるプロセス時間における一貫性の向上により、規模縮小限外濾過／透析濾過（ＵＦ／ＤＦ）モデルの正確性が向上する可能性を有し、これにより、さらに効率的な規模拡大および技術移行キャンペーンがもたらされる。

本開示は、一部の態様では、フェドバッチ設定（例えば、供給タンクおよび保持液容器を使用する）をバッチ様操作（例えば、供給タンクと保持液容器とを本明細書に記載のように接続して、接線流濾過（ＴＦＦ）再循環ループにおいて単一容器として機能させる）に転換して目的のタンパク質を濃縮することにより、フェドバッチ充填と関連する時間ペナルティーが軽減し得る、ＵＦ／ＤＦのためのシュードバッチ構成を対象とする。

接線流濾過は、限外濾過膜による低分子の遊走を駆動すると同時に高分子を保持する（例えば、「保持液」）、流圧の使用に依存する限外濾過手順である。一般には、保持されるタンパク質の分子量の３～６分の１の大きさである、分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する膜を選択する。当業者に公知の他の因子、例えば、流量、処理時間、膜間差圧、分子形状または構造、溶質濃度、他の溶質の存在およびイオン条件も、適切なＭＷＣＯの選択に影響し得る。

伝統的フェドバッチＴＦＦ構成は、図１Ａに示す。ここでは、充填物質を保持する供給タンクは、供給ポンプにより保持液容器（例えば、リザーバー）に接続し、保持液容器は、ＴＦＦ膜装置および再循環ポンプとともに再循環ループに別々に組み込む。

一部の態様では、ＴＦＦにより目的のタンパク質について濃縮し、および／または濾過時間を削減する方法は、第１の限外濾過工程（ＵＦＩ）、透析濾過（ＤＦ）および第２の限外濾過工程（ＵＦ２）を含む。

一部の態様では、本明細書に記載のシュードバッチ構成において、流路は、再循環ループに供給タンクを組み込むように変更する（図１Ｂ）。三方弁は、ＴＦＦフィルターモジュールの保持液ポートの後に配置して、保持液流を第１の限外濾過工程の状況に応じて供給タンクまたは保持液容器のいずれかに方向づける。一部の態様では、撹拌機は、供給タンクとリザーバー（例えば、保持液）タンクとの両方に使用する。

一部の態様では、ＵＦ１の初期充填段階において、三方弁は、保持液流を供給タンクに方向づけ、保持液容器への流れを遮断するように設定する。充填物質は、供給ポンプにより供給タンクから保持液容器に供給するが、ＴＦＦフィルターモジュールからの保持液は、供給タンクに戻し、残存充填物質と混合する。この新たな充填物質混合物は、ここで、わずかにさらに濃縮して保持液容器に供給し、サイクルを繰り返す。一部の態様では、保持液は次第にさらに濃縮されるが、充填物質は初期希釈濃度に固定されたままであるフェドバッチ充填とは異なり、供給タンクおよび保持液容器の両方のタンパク質溶液は、同一の比率で濃縮される。この構成では、バッチ設定と同様に、供給タンクは、保持液容器の拡張として効率的に作用し、この２つは、再循環ループにおける単一リザーバーとして作用する（図１Ｃ）。本明細書に記載のシュードバッチ構成では、別のハイブリッド方式のプロセスをバッチ様プロセスに転換することにより、第１の限外濾過工程のフェドバッチ充填部の時間ペナルティーならびにプロセス時間の設備適合依存性が軽減される。一部の態様では、充填工程において、保持液タンクの液体容量は、全充填容量に対して低容量により一定に維持する。一部の態様では、液体容量は、充填工程において全初期充填容量の約１０％、約１５％、約２０％、約２５％、約３０％、約３５％または約４０％に一定に維持する。一部の態様では、液体容量は、充填工程において全初期充填容量の約５％～約１０％、約５％～約１５％、約５％～約２０％、約５％～約２５％、約５％～約３０％、約１０％～約１５％、約１０％～約２０％、約１０％～約２５％、約１０％～約３０％、約１５％～約２０％、約１５％～約２５％、約１５％～約３０％、約２０％～約３０％または約２５％～約３０％に一定に維持する。一部の態様では、液体容量は、充填工程において全初期充填容量の約１０％に一定に維持する。一部の態様では、液体容量は、充填工程において全初期充填容量の約２０％に一定に維持する。

一部の態様では、充填工程が完了する場合（例えば、全タンパク質溶液容量が保持液容器容量未満に減少した場合）、三方弁が作動して、保持液流が保持液容器に再度向けられ、供給タンクへの流れが遮断されて、再循環ループから供給タンクが効率的に排除され、ＴＦＦ設定が実質的バッチ構成に転換される。一部の態様では、供給ポンプをさらなる時間操作して、充填物質の回収を最大化するために２つの容器間の接続チューブにおける残留物質の空気による追出し（例えば、保持液容器への）を実行することができる。

濃縮用のＴＦＦ膜は、濃縮する試料に対する拒絶特性に基づいて選択することができる。一般的規定として、完全な保持を保証するために、膜の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）は、保持される分子（例えば、目的のタンパク質）の分子量の１／３～１／６であるべきである。ＭＷＣＯが試料のそれに近いほど、濃縮における一部の生成物損失のリスクは大きい。相対的損失が、生成される濾液の全容量に依存するため、透析濾過をも使用する場合、リスクは増大する。膜流動速度（膜の単位面積あたりの濾過流量）は、孔径と関連する。孔が小さいほど、同一加圧における流動速度は低い。したがって、濃縮／透析濾過用の膜を選択する場合、時間因子に対する生成物の回収率を考慮しなければならない。プロセス時間は、使用する膜面積の量を増大させることにより削減することができる。

透析濾過は、濾過膜（例えば、限外濾過膜）を使用して、タンパク質、ペプチド、核酸および他の生体分子を含む溶液から塩またはソルベントを完全に除去、置換または濃度を低下させる技術である。ＤＦでは、透過性（例えば、多孔性）膜フィルターを選択的に利用して、成分の分子サイズに基づいて溶液および懸濁液の成分を分離する。限外濾過膜は、膜孔よりも大型の分子は保持するが、小型の分子、例えば、１００％透過性の塩、ソルベントおよび水は、膜を自由に通過させる。ＤＦは、濃度を最終的に変えることなく、保持液中の小型の分子は膜を通して洗い流し、大型の分子（例えば、目的のタンパク質）は保持する分画プロセスである。

透析濾過は、持続的または非持続的であり得る。持続的透析濾過では、透析濾過溶液（例えば、バッファー）を、濾液が生成された場合と同一の速度で試料供給リザーバーに加える。この方法では、試料リザーバーの容量は一定のままであるが、膜を自由に透過可能な小型の分子（例えば、塩）は洗い流される。例として除塩を使用すると、それぞれのさらなる透析濾過容量（ＤＶ）により、塩濃度がさらに低下する。（ＤＶは、ＤＦ工程において実施された洗い流しの程度の基準である。これは、保持液容量と比較した導入透析濾過バッファーの容量に基づく。一定容量のＤＦでは、保持液容量は、一定に維持され、透過液が出るのと同じ速度でＤＦバッファーが入る。例えば、ある透析濾過容量は、システムにおける生成物の容量と等しいバッファー容量を供給リザーバーに加え、次いで、濃縮して出発容量に戻すことに等しい。例えば、出発試料２００ｍＬの第１の透析濾過容量（ＤＶ１）は、２００ｍＬに等しい。）第２の透析濾過容量（ＤＶ２）では、持続的透析濾過によりイオン強度が約９９％低下する。非持続的透析濾過では、溶液は最初に希釈され、次いで、濃縮されて出発容量に戻る。次いで、プロセスは、リザーバーに残存する低分子（例えば、塩）が必要とされる濃度に達するまで繰り返す。さらなるＤＶのそれぞれにより、塩濃度がさらに低下する。持続的透析濾過では、非持続的透析濾過と同程度の減塩を達成するのに、濾液容量はそれほど必要とされない。試料を最初に濃縮することにより、特定のイオン強度を達成するのに必要とされる透析濾過溶液の量は、実質的に減少する。

一部の態様では、ＤＦ供給ポンプは、保持液容器質量が保持液容器質量設定点未満である場合、ＤＦまたは回収方式においてのみ実行する。一部の態様では、この質量は、調節システムによって２秒毎に確認される。一部の態様では、ＤＦ質量を設定し、ＤＦ終点までＤＦポンプを維持する。一部の態様では、ＤＦポンプは、容器質量が入力した設定点未満に下がる場合、作動する。ＤＦ終点に達した後、システムは濃縮工程に進む。一部の態様では、ＤＦ終点の選択は、調節システムのグラフィカルユーザーインターフェースから選択する。一部の態様では、デフォルト終点の選択は、配線内に空気である。一部の態様では、ＤＦ質量設定点は、全保持液容器質量である。

本開示では、少なくとも１回濾過されている目的のタンパク質を含むタンパク質混合物（例えば、保持液）により供給タンクを持続的に充填することを含む、目的のタンパク質の濾過プロセス時間を削減する方法であって、供給タンクが、主要リザーバー（例えば、保持液）タンクから分離している、方法を提供する。一部の態様では、目的のタンパク質の濾過プロセス時間を削減する方法は、供給タンク、リザーバータンク、フィルター、フィルターを供給タンクに接続する供給タンク弁およびフィルターをリザーバータンクに接続するリザーバータンク弁を含む三方弁、ならびに供給タンクとリザーバータンクとを接続するリザーバーインプットを含む、濾過システムに、目的のタンパク質を含むタンパク質混合物を充填することを含む。

また、本開示では、少なくとも１回濾過されている目的のタンパク質を含むタンパク質混合物（例えば、保持液）により供給タンクを持続的に充填することを含む、目的のタンパク質を濃縮する方法であって、供給タンクが、主要リザーバー（例えば、保持液）タンクから分離している、方法を提供する。一部の態様では、目的のタンパク質を濃縮する方法は、供給タンク、リザーバータンク、フィルター、フィルターを供給タンクに接続する供給タンク弁およびフィルターをリザーバータンクに接続するリザーバータンク弁を含む三方弁、ならびに供給タンクとリザーバータンクとを接続するリザーバーインプットを含む、濾過システムに、目的のタンパク質を含むタンパク質混合物を充填することを含む。

一部の態様では、供給タンクは、少なくとも１回も濾過されていない目的のタンパク質を含む初期タンパク質混合物をさらに含み、ここで、初期タンパク質混合物および保持液を混合する。一部の態様では、タンパク質混合物および保持液は、フィルター（例えば、限外濾過フィルター）により濾過する。一部の態様では、濾過したタンパク質混合物および保持液は、供給タンクに充填する。一部の態様では、タンパク質混合物および保持液は、目的のタンパク質が、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約６０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約７０ｍｇ／ｍＬまたは少なくとも約８０ｍｇ／ｍＬに濃縮されるまで持続的に供給タンクに充填する。一部の態様では、タンパク質混合物および保持液は、目的のタンパク質が、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１９ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２０ｍｇ／ｍＬに濃縮されるまで持続的に供給タンクに充填する。一部の態様では、タンパク質混合物および保持液は、目的のタンパク質が、少なくとも約２１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２９ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも約３０ｍｇ／ｍＬに濃縮されるまで持続的に供給タンクに充填する。一部の態様では、タンパク質混合物および保持液は、目的のタンパク質が、少なくとも約３１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３２ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３３ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３４ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３６ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３７ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３８ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３９ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約５５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約６０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約６５ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約７０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約７５ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも約８０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約８５ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも約９０ｍｇ／ｍＬに濃縮されるまで持続的に供給タンクに充填する。一部の態様では、タンパク質混合物および保持液は、目的のタンパク質が、約１ｍｇ／ｍＬ～８０ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ～７０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～４０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～３０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～２０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ～７０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ～４０ｍｇ／ｍＬ、または約２０ｍｇ／ｍＬ～３０ｍｇ／ｍＬに濃縮されるまで持続的に供給タンクに充填する。一部の態様では、タンパク質混合物および保持液は、目的のタンパク質が、約１ｍｇ／ｍＬ～１０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～２０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ～３０ｍｇ／ｍＬ、約３０ｍｇ／ｍＬ～４０ｍｇ／ｍＬ、約４０ｍｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬ、約６０ｍｇ／ｍＬ～７０ｍｇ／ｍＬ、または約７０ｍｇ／ｍＬ～８０ｍｇ／ｍＬに濃縮されるまで持続的に供給タンクに充填する。

一部の態様では、保持液の充填は、本明細書に記載のシュードバッチ流路により再循環させる。一部の態様では、保持液の充填は、少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、少なくとも６０回、少なくとも７０回、少なくとも８０回、少なくとも９０回、少なくとも１００回、少なくとも１１０回、少なくとも１２０回、少なくとも１３０回、少なくとも１４０回、少なくとも１５０回、少なくとも１６０回、少なくとも１７０回、少なくとも１８０回、少なくとも１９０回、少なくとも２００回、少なくとも２１０回、少なくとも２２０回、少なくとも２３０回、少なくとも２４０回、少なくとも２５０回、少なくとも２６０回、少なくとも２７０回、少なくとも２８０回、少なくとも２９０回、または少なくとも３００回繰り返す。

一部の態様では、方法は、供給タンクへの保持液の充填を停止することをさらに含む。一部の態様では、方法は、保持液をリザーバータンクに方向づけることをさらに含む。一部の態様では、リザーバータンク弁は、目的のタンパク質が十分に濃縮されるまで閉じている。一部の態様では、方法は、タンパク質混合物を供給タンクに頻繁に加えることをさらに含む。一部の態様では、タンパク質混合物を供給タンクからリザーバータンクへ方向づける。

一部の態様では、リザーバータンクをフィルターに接続する。一部の態様では、フィルターは、インライン濾過膜を含む。一部の態様では、インライン濾過膜は、限外濾過膜である。一部の態様では、インライン濾過膜は、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ナイロン、ケイ素、ポリケイ素、超ナノ結晶ダイヤモンド、ダイヤモンド様炭素、二酸化ケイ素、チタン、シリカ、窒化ケイ素、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリカーボネート、グラフェン、酸化グラフェン、ポリサッカライド、セラミック粒子、ポリ（スチレンジビニル）ベンゼン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、修飾ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリフェニルスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリ乳酸、ポリアクリロニトリル、フッ化ポリビニリデン、ポリピペラジン、ポリアミド－ポリエーテルブロックポリマー、ポリイミド、ポリエーテルイミド、ポリアミド、再生セルロース、複合再生セルロースまたはこれらの組合せである。一部の態様では、インライン濾過膜は、ポリエーテルスルホンである。一部の態様では、インライン濾過膜は、セルロースである。一部の態様では、インライン濾過膜は、ポリエーテルスルホンとセルロースとの組合せである。一部の態様では、濾過膜は、約５０ｋＤ～約５ｋＤ未満の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する。一部の態様では、濾過膜は、約５ｋＤ未満のＭＷＣＯを有する。

一部の態様では、混合物は、所望の濾過タンパク質濃度に達するまで流す（例えば、再循環させる）。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約１０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約２０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約３０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約４０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約５０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約６０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約７０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約８０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約９０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約１００ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約１１０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約１２０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約１３０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約１４０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約１５０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約１６０～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約１７０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約１８０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約１９０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約２００ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約２１０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約２２０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約２３０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約２４０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約２５０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約２６０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約２７０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約２８０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、約２９０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬである。一部の態様では、所望の濾過タンパク質濃度は、１５０ｍｇ／ｍＬである。

一部の態様では、タンパク質粘度は、約０ｃＰ～約２００ｃＰである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約２０ｃＰ～約６０ｃＰである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約１０ｃＰ～約２００ｃＰである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約２０ｃＰ～約２００ｃＰである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約３０ｃＰ～約２００ｃＰである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約４０ｃＰ～約２００ｃＰである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約５０ｃＰ～約２００ｃＰである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約６０ｃＰ～約２００ｃＰである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約７０ｃＰ～約２００ｃＰである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約８０ｃＰ～約２００ｃＰである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約９０ｃＰ～約２００ｃＰである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約１００ｃＰ～約２００ｃＰである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約１００ｃＰ～約２００ｃＰである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約１２０ｃＰ～約２００ｃＰである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約１３０ｃＰ～約２００ｃＰである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約１４０ｃＰ～約２００ｃＰである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約１５０ｃＰ～約２００ｃＰである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約１６０ｃＰ～約２００ｃＰである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約１７０ｃＰ～約２００ｃＰである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約１８０ｃＰ～約２００ｃＰである。一部の態様では、タンパク質粘度は、約１９０ｃＰ～約２００ｃＰである。

一部の態様では、供給タンク容量とリザーバー容量との間の容量比は、約１：２～約１０：１、約１：２～約１：１、約１：１～約１：２、約１：１ 約１：３、約１：１～約１：４、約１：１～約１：５、約１：１～約１：６、約１：１～約１：７、約１：１～約１：８、約１：１～約１：９、または約１：１～約１：１０である。一部の態様では、供給タンク容量とリザーバータンク容量との間の容量比は、約１：１、約２：１または約５：１である。

一部の態様では、タンパク質混合物をダイヤフラムポンプ、ロータリーローブポンプまたは蠕動ポンプを使用してリザーバータンクおよび／またはフィルターに方向づける。一部の態様では、タンパク質混合物を、ダイヤフラムポンプを使用してリザーバータンクおよび／またはフィルターに方向づける。一部の態様では、タンパク質混合物を、蠕動ポンプを使用してリザーバータンクおよび／またはフィルターに方向づける。

一部の態様では、目的のタンパク質を濃縮し、および／または目的のタンパク質の濾過プロセス時間を削減する方法は、少なくとも１回濾過されている目的のタンパク質を含むタンパク質混合物（「保持液」）による供給タンクの持続的充填の前に、少なくとも１回も濾過されていない目的のタンパク質を含む初期タンパク質混合物を供給タンクに充填することを含む。一部の態様では、初期タンパク質混合物を約１ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの濃度で供給タンクに加える。一部の態様では、初期タンパク質混合物を約５ｍｇ／ｍＬの濃度で供給タンクに加える。

一部の態様では、プロセス時間は、フェドバッチ濃縮プロセスのプロセス時間と比較して約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％削減される。一部の態様では、プロセス時間は、フェドバッチ濃縮プロセスのプロセス時間と比較して約４０％削減される。一部の態様では、プロセス時間は、フェドバッチ濃縮プロセスのプロセス時間と比較して約０．２時間、約０．４時間、約０．５時間、約０．６時間、約０．８時間または約１．０時間削減される。一部の態様では、プロセス時間は、フェドバッチ濃縮プロセスのプロセス時間と比較して約０．５時間削減される。

一部の態様では、１～２μｍの粒子数は、フェドバッチ濃縮プロセスの粒子数と比較して約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％減少する。一部の態様では、５～１０μｍの粒子数は、フェドバッチ濃縮プロセスの粒子数と比較して約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％減少する。一部の態様では、１０～２５μｍの粒子数は、フェドバッチ濃縮プロセスの粒子数と比較して約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％減少する。

一部の態様では、タンパク質混合物は、ローディングバッファーとともに供給タンクに加える。一部の態様では、ローディングバッファーは、アミノ酸、弱酸、弱塩基および／または糖を含む。

ＩＩＩ．目的のタンパク質
一部の態様では、本明細書に開示の方法は、任意のタンパク質生成物（例えば、目的のタンパク質）に適用することができる。一部の態様では、タンパク質生成物は、治療用タンパク質である。一部の態様では、治療用タンパク質は、抗体またはこの抗原結合断片、Ｆｃ融合タンパク質、抗凝固剤、血液凝固因子、骨形態形成タンパク質、改変タンパク質足場、酵素、増殖因子、ホルモン、インターフェロン、インターロイキンおよび血栓溶解剤から選択される。一部の態様では、タンパク質生成物は、抗体またはこの抗原結合断片である。一部の態様では、タンパク質は、組換えタンパク質である。

一部の態様では、タンパク質生成物は、抗体またはこの抗原結合断片である。一部の態様では、タンパク質生成物は、抗体の抗原結合断片を含むキメラポリペプチドである。一部の態様では、タンパク質生成物は、モノクローナル抗体またはこの抗原結合断片（「ｍＡｂ」）である。抗体は、ヒト抗体、ヒト化抗体またはキメラ抗体であり得る。一部の態様では、タンパク質生成物は、二重特異性抗体である。

一部の態様では、タンパク質生成物および夾雑物を含む混合物は、前の精製工程の生成物を含む。一部の態様では、混合物は、前の精製工程の原生成物である。一部の態様では、混合物は、前の精製工程の原生成物およびバッファー、例えば、開始バッファーを含む溶液である。一部の態様では、混合物は、開始バッファー中に再構成した前の精製工程の原生成物を含む。

一部の態様では、タンパク質生成物の原料は、バルクタンパク質である。一部の態様では、タンパク質生成物の供給源は、タンパク質生成物および非タンパク質成分を含む組成物である。非タンパク質成分は、ＤＮＡおよび他の夾雑物を含み得る。

一部の態様では、タンパク質生成物の供給源は、動物由来である。一部の態様では、動物は、哺乳動物、例えば、非霊長類（例えば、ウシ、ブタ、ウマ、ネコ、イヌ、ラット等）または霊長類（例えば、サルまたはヒト）である。一部の態様では、供給源は、ヒト由来の組織または細胞である。特定の態様では、このような用語は、非ヒト動物（例えば、ブタ、ウマ、ウシ、ネコまたはイヌのような非ヒト動物）を指す。一部の態様では、このような用語は、ペットまたは家畜を指す。一部の態様では、このような用語は、ヒトを指す。

一部の態様では、本明細書に記載の方法により精製したタンパク質生成物は、融合タンパク質である。「融合」または「融合タンパク質」は、本来、天然には結合しない第２のアミノ酸配列にインフレームで結合する第１のアミノ酸配列を含む。別々のタンパク質に通常存在するアミノ酸配列は、融合ポリペプチドにまとめることができるか、または同一タンパク質に通常存在するアミノ酸配列は、融合ポリペプチドにおいて新たな配列に配置することができる。融合タンパク質は、例えば、化学合成によって、またはペプチド領域が所望の関連性によりコードされるポリヌクレオチドに生成および翻訳されることによって生成する。融合タンパク質は、共有、非ペプチド結合または非共有結合により第１のアミノ酸配列と結合する第２のアミノ酸配列をさらに含み得る。転写／翻訳時に、単一タンパク質が生成される。この方法では、複数のタンパク質またはこれらの断片は、単一ポリペプチドに組み込まれ得る。「動作可能に結合する」は、２つ以上のエレメント間の機能的結合を意味することを意図する。例えば、２つのポリペプチド間の動作可能な結合により、両ポリペプチドがインフレームで融合されて、単一ポリペプチド融合タンパク質が生成される。特定の態様では、融合タンパク質は、以下にさらに詳細に考察するように、リンカー配列を含み得る、第３のポリペプチドをさらに含む。

一部の態様では、本明細書に記載の方法により精製したタンパク質は、抗体である。抗体は、例えば、モノクローナル抗体、組換えにより生成した抗体、単一特異性抗体、多特異性抗体（二重特異性抗体を含む）、ヒト抗体、ヒト化抗体、キメラ抗体、免疫グロブリン、合成抗体、２つの重鎖および２つの軽鎖分子を含む四量体抗体、抗体軽鎖単量体、抗体重鎖単量体、抗体軽鎖二量体、抗体重鎖二量体、抗体軽鎖－抗体重鎖対、イントラボディ、ヘテロコンジュゲート抗体、単一ドメイン抗体、一価抗体、一本鎖抗体または一本鎖Ｆｖ（ｓｃＦｖ）、ラクダ化抗体、アフィボディ、Ｆａｂ断片、Ｆ（ａｂ’）２断片、ジスルフィド結合Ｆｖ（ｓｄＦｖ）、抗イディオタイプ（抗Ｉｄ）抗体（例えば、抗－抗Ｉｄ抗体を含む）および上記のいずれかの抗原結合断片を含み得る。一部の態様では、本明細書に記載の抗体は、ポリクローナル抗体集団を指す。抗体は、任意の型（例えば、ＩｇＧ、ＩｇＥ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＡもしくはＩｇＹ）、任意のクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、ＩｇＧ４、ＩｇＡ１もしくはＩｇＡ２）または任意のサブクラス（例えば、ＩｇＧ２ａもしくはＩｇＧ２ｂ）の免疫グロブリン分子であり得る。一部の態様では、本明細書に記載の抗体は、ＩｇＧ抗体、あるいはクラス（例えば、ヒトＩｇＧ１もしくはＩｇＧ４）またはサブクラスのＩｇＧ抗体である。ある態様では、抗体は、ヒト化モノクローナル抗体である。一部の態様では、抗体は、ヒトモノクローナル抗体であり、これは好ましくは、免疫グロブリンである。一部の態様では、本明細書に記載の抗体は、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４抗体である。

一部の態様では、タンパク質は、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＣＴＬＡ－４抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＮＫＧ２ａ抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗ＴＧＦβ抗体、抗ＩＬ－１０抗体、抗Ｂ７－Ｈ４抗体、抗Ｆａｓリガンド抗体、抗メソテリン抗体、抗ＣＤ２７抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＤ７３抗体、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌ１抗体、抗ＩＬ８抗体またはこれらの任意の組合せである。一部の態様では、タンパク質は、アバタセプトＮＧＰである。他の態様では、タンパク質は、ベラタセプトＮＧＰである。

一部の態様では、タンパク質は、抗ＰＤ－１抗体である。

当技術分野において公知の抗ＰＤ－１抗体を、ここに記載の組成物および方法において使用することができる。高親和性でＰＤ－１に特異的に結合する種々のヒトモノクローナル抗体は、米国特許第８，００８，４４９号に記載されている。米国特許第８，００８，４４９号に開示の抗ＰＤ－１ヒト抗体は、（ａ）Ｂｉａｃｏｒｅバイオセンサーシステムを使用する表面プラズモン共鳴により決定した場合、１×１０^－７Ｍ以下のＫ_ＤでヒトＰＤ－１に結合し、（ｂ）ヒトＣＤ２８、ＣＴＬＡ－４またはＩＣＯＳに実質的に結合せず、（ｃ）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいてＴ細胞増殖が増加し、（ｄ）ＭＬＲアッセイにおいてインターフェロンγ産生が増加し、（ｅ）ＭＬＲアッセイにおいてＩＬ－２分泌が増加し、（ｆ）ヒトＰＤ－１およびカニクイザルＰＤ－１に結合し、（ｇ）ＰＤ－１へのＰＤ－Ｌ１および／またはＰＤ－Ｌ２の結合を阻害し、（ｈ）抗原特異的メモリー応答を刺激し、（ｉ）抗体応答を刺激し、（ｊ）インビボで腫瘍細胞増殖を阻害する特性の１つまたは複数を示すことが実証されている。本開示において使用可能な抗ＰＤ－１抗体としては、ヒトＰＤ－１に特異的に結合し、前述の特性の少なくとも１つ、一部の態様では、少なくとも５つを示すモノクローナル抗体が挙げられる。

他の抗ＰＤ－１モノクローナル抗体は、例えば、米国特許第６，８０８，７１０号、第７，４８８，８０２号、第８，１６８，７５７号および第８，３５４，５０９号、米国特許出願公開第２０１６／０２７２７０８号、ならびにＰＣＴ国際公開ＷＯ２０１２／１４５４９３号、ＷＯ２００８／１５６７１２、ＷＯ２０１５／１１２９００、ＷＯ２０１２／１４５４９３、ＷＯ２０１５／１１２８００、ＷＯ２０１４／２０６１０７、ＷＯ２０１５／３５６０６、ＷＯ２０１５／０８５８４７、ＷＯ２０１４／１７９６６４、ＷＯ２０１７／０２０２９１、ＷＯ２０１７／０２０８５８、ＷＯ２０１６／１９７３６７、ＷＯ２０１７／０２４５１５、ＷＯ２０１７／０２５０５１、ＷＯ２０１７／１２３５５７、ＷＯ２０１６／１０６１５９、ＷＯ２０１４／１９４３０２、ＷＯ２０１７／０４０７９０、ＷＯ２０１７／１３３５４０、ＷＯ２０１７／１３２８２７、ＷＯ２０１７／０２４４６５、ＷＯ２０１７／０２５０１６、ＷＯ２０１７／１０６０６１、ＷＯ２０１７／１９８４６、ＷＯ２０１７／０２４４６５、ＷＯ２０１７／０２５０１６、ＷＯ２０１７／１３２８２５およびＷＯ２０１７／１３３５４０号に記載されており、これらのそれぞれは、その全体を参照により本明細書に組み込む。

一部の態様では、抗ＰＤ－１抗体は、ニボルマブ（ＯＰＤＩＶＯ（登録商標）、５Ｃ４、ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ－１１０６およびＯＮＯ－４５３８としても知られる）、ペムブロリズマブ（Ｍｅｒｃｋ社；ＫＥＹＴＲＵＤＡ（登録商標）、ラムブロリズマブおよびＭＫ－３４７５としても知られる；ＷＯ２００８／１５６７１２号を参照）、ＰＤＲ００１（Ｎｏｖａｒｔｉｓ社；ＷＯ２０１５／１１２９００号を参照）、ＭＥＤＩ－０６８０（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ社；ＡＭＰ－５１４としても知られる；ＷＯ２０１２／１４５４９３号を参照）、セミプリマブ（Ｒｅｇｅｎｅｒｏｎ社；ＲＥＧＮ－２８１０としても知られる；ＷＯ２０１５／１１２８００号を参照）、ＪＳ００１（ＴＡＩＺＨＯＵ ＪＵＮＳＨＩ ＰＨＡＲＭＡ社；トリパリマブ（ｔｏｒｉｐａｌｉｍａｂ）としても知られる；Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)を参照）、ＢＧＢ－Ａ３１７（Ｂｅｉｇｅｎｅ社；チスレリズマブ（Ｔｉｓｌｅｌｉｚｕｍａｂ）としても知られる；ＷＯ２０１５／３５６０６号および米国特許出願公開第２０１５／００７９１０９号を参照）、ＩＮＣＳＨＲ１２１０（ＪｉａｎｇｓｕＨｅｎｇｒｕｉＭｅｄｉｃｉｎｅ社；ＳＨＲ－１２１０としても知られる；ＷＯ２０１５／０８５８４７号；Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)を参照）、ＴＳＲ－０４２（ＴｅｓａｒｏＢｉｏｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ社；ＡＮＢ０１１としても知られる；ＷＯ２０１４／１７９６６４号を参照）、ＧＬＳ－０１０（Ｗｕｘｉ／ＨａｒｂｉｎＧｌｏｒｉａＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌｓ社；ＷＢＰ３０５５としても知られる；Si-Yang Liu et al., J. Hematol. Oncol. 10:136 (2017)を参照）、ＡＭ－０００１（Ａｒｍｏ社）、ＳＴＩ－１１１０（ＳｏｒｒｅｎｔｏＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社；ＷＯ２０１４／１９４３０２号を参照）、ＡＧＥＮ２０３４（Ａｇｅｎｕｓ社；ＷＯ２０１７／０４０７９０号を参照）、ＭＧＡ０１２（Ｍａｃｒｏｇｅｎｉｃｓ社、ＷＯ２０１７／１９８４６号を参照）、ＢＣＤ－１００（Ｂｉｏｃａｄ社；Kaplon et al., mAbs 10(2):183-203 (2018)、ならびにＩＢＩ３０８（Ｉｎｎｏｖｅｎｔ社；ＷＯ２０１７／０２４４６５号、ＷＯ２０１７／０２５０１６号、ＷＯ２０１７／１３２８２５号およびＷＯ２０１７／１３３５４０号を参照）からなる群から選択される。

一部の態様では、タンパク質は、抗ＰＤ－Ｌ１抗体である。当技術分野において公知の抗ＰＤ－Ｌ１抗体を、本開示の組成物および方法において使用することができる。本開示の組成物および方法において有用な抗ＰＤ－Ｌ１抗体の例としては、米国特許第９，５８０，５０７号に開示の抗体が挙げられる。米国特許第９，５８０，５０７号に開示の抗ＰＤ－Ｌ１ヒトモノクローナル抗体は、（ａ）Ｂｉａｃｏｒｅバイオセンサーシステムを使用する表面プラズモン共鳴により決定した場合、１×１０^－７Ｍ以下のＫ_ＤでヒトＰＤ－Ｌ１に結合し、（ｂ）混合リンパ球反応（ＭＬＲ）アッセイにおいてＴ細胞増殖が増加し、（ｃ）ＭＬＲアッセイにおいてインターフェロンγ産生が増加し、（ｄ）ＭＬＲアッセイにおいてＩＬ－２分泌が増加し、（ｅ）抗体応答を刺激し、（ｆ）Ｔ細胞エフェクター細胞および／または樹状細胞に対する制御性Ｔ細胞の作用を回復させる特性の１つまたは複数を示すことが実証されている。本開示において使用可能な抗ＰＤ－Ｌ１抗体としては、ヒトＰＤ－Ｌ１に特異的に結合し、前述の特徴の少なくとも１つ、一部の態様では、少なくとも５つを示すモノクローナル抗体が挙げられる。

特定の態様では、抗ＰＤ－Ｌ１抗体は、ＢＭＳ－９３６５５９（１２Ａ４、ＭＤＸ－１１０５としても知られる；例えば、米国特許第７，９４３，７４３号およびＷＯ２０１３／１７３２２３号を参照）、アテゾリズマブ（Ｒｏｃｈｅ社；ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ（登録商標）；ＭＰＤＬ３２８０Ａ、ＲＧ７４４６としても知られる；米国特許第８，２１７，１４９号を参照；Herbst et al. (2013) J Clin Oncol 31(suppl):3000も参照）、デュルバルマブ（ＡｓｔｒａＺｅｎｅｃａ社；ＩＭＦＩＮＺＩ（商標）、ＭＥＤＩ－４７３６としても知られる；ＷＯ２０１１／０６６３８９号を参照）、アベルマブ（Ｐｆｉｚｅｒ社；ＢＡＶＥＮＣＩＯ（登録商標）、ＭＳＢ－００１０７１８Ｃとしても知られる；ＷＯ２０１３／０７９１７４号を参照）、ＳＴＩ－１０１４（Ｓｏｒｒｅｎｔｏ社；ＷＯ２０１３／１８１６３４号を参照）、ＣＸ－０７２（Ｃｙｔｏｍｘ社；ＷＯ２０１６／１４９２０１号を参照）、ＫＮ０３５（３Ｄ Ｍｅｄ／Ａｌｐｈａｍａｂ社；Zhang et al., Cell Discov. 7:3 (March 2017)を参照）、ＬＹ３３０００５４（ＥｌｉＬｉｌｌｙＣｏ．社；例えば、ＷＯ２０１７／０３４９１６号を参照）、ＢＧＢ－Ａ３３３（ＢｅｉＧｅｎｅ社；Desai et al., JCO 36 (15suppl):TPS3113 (2018)を参照）、ならびにＣＫ－３０１（ＣｈｅｃｋｐｏｉｎｔＴｈｅｒａｐｅｕｔｉｃｓ社；Gorelik et al., AACR:Abstract 4606 (Apr 2016)を参照）からなる群から選択される。

一部の態様では、タンパク質は、抗ＧＩＴＲ（グルココルチコイド誘導腫瘍壊死因子受容体ファミリー関連遺伝子）抗体である。一部の態様では、抗ＧＩＴＲ抗体は、６Ｃ８のＣＤＲ配列を有し、例えば、ＷＯ２００６／１０５０２１号に記載の６Ｃ８のＣＤＲを有するヒト化抗体、ＷＯ２０１１／０２８６８３号に記載の抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤＲを含む抗体；ＪＰ特開２００８２７８８１４号に記載の抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤＲを含む抗体、ＷＯ２０１５／０３１６６７号、ＷＯ２０１５／１８７８３５号、ＷＯ２０１５／１８４０９９号、ＷＯ２０１６／０５４６３８号、ＷＯ２０１６／０５７８４１号、ＷＯ２０１６／０５７８４６号、ＷＯ２０１８／０１３８１８号に記載の抗ＧＩＴＲ抗体または本明細書に記載もしくは言及する他の抗ＧＩＴＲ抗体のＣＤＲを含む抗体等が挙げられ、これらのすべては、その全体を本明細書に組み込む。

他の態様では、タンパク質は、抗ＬＡＧ３抗体である。ＬＡＧ－３としても知られるリンパ球活性化遺伝子３は、ヒトにおいてＬＡＧ３遺伝子によりコードされるタンパク質である。１９９０年に発見されたＬＡＧ３は、Ｔ細胞機能に対する多様な生物学的作用を有する細胞表面分子である。これは、免疫チェックポイント受容体であり、このため、がんおよび自己免疫障害のための新たな治療を開発しようと努力する製薬会社による、種々の薬物開発プログラムの標的である。可溶性形態では、これは、それ自体でがん薬物としても開発されている。抗ＬＡＧ３抗体の例としては、ＷＯ２０１７／０８７９０１号Ａ２、ＷＯ２０１６／０２８６７２号Ａ１、ＷＯ２０１７／１０６１２９号Ａ１、ＷＯ２０１７／１９８７４１号Ａ１、米国特許出願公開第２０１７／００９７３３３号Ａ１、米国特許出願公開第２０１７／０２９０９１４号Ａ１および米国特許出願公開第２０１７／０２６７７５９号Ａ１の抗体が挙げられるが、これらに限定されない。これらのすべては、その全体を本明細書に組み込む。

一部の態様では、タンパク質は、抗ＣＸＣＲ４抗体である。ＣＸＣＲ４は、Ｇ１に結合された７回膜貫通タンパク質である。ＣＸＣＲ４は、造血系起源の細胞上に広範に発現し、ヒト免疫不全ウイルス１（ＨＩＶ－１）に対するＣＤ４＋との主要な共受容体である。Feng, Y., Broeder, C.C., Kennedy, P. E., and Berger, E. A. (1996) Science 272, 872-877を参照されたい。抗ＣＸＣＲ４抗体の例としては、ＷＯ２００９／１４０１２４号Ａ１、米国特許出願公開第２０１４／０２８６９３６号Ａ１、ＷＯ２０１０／１２５１６２号Ａ１、ＷＯ２０１２／０４７３３９号Ａ２、ＷＯ２０１３／０１３０２５号Ａ２、ＷＯ２０１５／０６９８７４号Ａ１、ＷＯ２００８／１４２３０３号Ａ２、ＷＯ２０１１／１２１０４０号Ａ１、ＷＯ２０１１／１５４５８０号Ａ１、ＷＯ２０１３／０７１０６８号Ａ２およびＷＯ２０１２／１７５５７６号Ａ１の抗体が挙げられるが、これらに限定されない。これらのすべては、その全体を本明細書に組み込む。

一部の態様では、タンパク質は、抗ＣＤ７３（エクト－５’－ヌクレオチダーゼ）抗体である。一部の態様では、抗ＣＤ７３抗体は、アデノシンの形成を阻害する。ＡＭＰのアデノシンへの分解により、腫瘍微小環境内に免疫が抑制され血管新生が促進される微小環境が生成され、これにより、がんの発症および増悪が促進される。抗ＣＤ７３抗体の例としては、ＷＯ２０１７／１００６７０号Ａ１、ＷＯ２０１８／０１３６１１号Ａ１、ＷＯ２０１７／１５２０８５号Ａ１およびＷＯ２０１６／０７５１７６号Ａ１の抗体が挙げられるが、これらに限定されない。これらのすべては、その全体を本明細書に組み込む。

一部の態様では、タンパク質は、抗ＴＩＧＩＴ（ＩｇおよびＩＴＩＭドメインを有するＴ細胞免疫受容体）抗体である。ＴＩＧＩＴは、免疫グロブリンタンパク質のＰＶＲ（ポリオウイルス受容体）ファミリーのメンバーである。ＴＩＧＩＴは、濾胞性ＢヘルパーＴ細胞（ＴＦＨ）を含むいくつかのクラスのＴ細胞上に発現する。このタンパク質は、ＰＶＲに高親和性で結合することがわかっており、この結合は、ＴＦＨと樹状細胞との間の相互作用を助けて、Ｔ細胞依存的Ｂ細胞応答を制御すると考えられている。抗ＴＩＧＩＴ抗体の例としては、ＷＯ２０１６／０２８６５６号Ａ１、ＷＯ２０１７／０３０８２３号Ａ２、ＷＯ２０１７／０５３７４８号Ａ２、ＷＯ２０１８／０３３７９８号Ａ１、ＷＯ２０１７／０５９０９５号Ａ１およびＷＯ２０１６／０１１２６４号Ａ１の抗体が挙げられるが、これらに限定されない。これらのすべては、その全体を本明細書に組み込む。

一部の態様では、タンパク質は、抗ＯＸ４０（すなわち、ＣＤ１３４）抗体である。ＯＸ４０は、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）リガンドファミリーのサイトカインである。ＯＸ４０は、Ｔ細胞抗原呈示細胞（ＡＰＣ）相互作用において機能し、活性化Ｔ細胞の内皮細胞への接着を媒介する。抗ＯＸ４０抗体の例としては、ＷＯ２０１８／０３１４９０号Ａ２、ＷＯ２０１５／１５３５１３号Ａ１、ＷＯ２０１７／０２１９１２号Ａ１、ＷＯ２０１７／０５０７２９号Ａ１、ＷＯ２０１７／０９６１８２号Ａ１、ＷＯ２０１７／１３４２９２号Ａ１、ＷＯ２０１３／０３８１９１号Ａ２、ＷＯ２０１７／０９６２８１号Ａ１、ＷＯ２０１３／０２８２３１号Ａ１、ＷＯ２０１６／０５７６６７号Ａ１、ＷＯ２０１４／１４８８９５号Ａ１、ＷＯ２０１６／２００８３６号Ａ１、ＷＯ２０１６／１００９２９号Ａ１、ＷＯ２０１５／１５３５１４号Ａ１、ＷＯ２０１６／００２８２０号Ａ１およびＷＯ２０１６／２００８３５号Ａ１が挙げられるが、これらに限定されない。これらのすべては、その全体を本明細書に組み込む。

一部の態様では、タンパク質は、抗ＩＬ８抗体である。ＩＬ－８は、好中球、好塩基球およびＴ細胞を誘引するが、単球は誘引しない走化性因子である。これは、好中球活性化にも関与する。これは、炎症性刺激に応答して、いくつかの細胞型から放出される。

一部の態様では、タンパク質は、アバタセプト（ＯＲＥＮＣＩＡ（登録商標）として市販されている）である。アバタセプト（本明細書においてＡｂａとも省略する）は、Ｔ細胞の免疫活性に干渉することにより、関節リウマチのような自己免疫疾患を治療するために使用する薬物である。アバタセプトは、ＣＴＬＡ－４の細胞外ドメインに融合した免疫グロブリンＩｇＧ１のＦｃ領域からなる融合タンパク質である。Ｔ細胞を活性化して免疫応答をもたらすために、抗原呈示細胞は、２つのシグナルをＴ細胞に呈示しなければならない。このようなシグナルの一方は、抗原と複合した主要組織適合複合体（ＭＨＣ）であり、他方のシグナルは、ＣＤ８０またはＣＤ８６分子（Ｂ７－１およびＢ７－２としても知られる）である。

一部の態様では、タンパク質は、ベラタセプト（商品名ＮＵＬＯＪＩＸ（登録商標））である。ベラタセプトは、ＣＴＬＡ－４の細胞外ドメインに結合したヒトＩｇＧ１免疫グロブリンのＦｃ断片からなる融合タンパク質であり、これは、Ｔ細胞共刺激の制御において重要な分子であり、Ｔ細胞活性化のプロセスを選択的に遮断する。これは、標準的免疫抑制治療計画、例えば、カルシニューリン阻害剤により生じた毒性を制限しながら、移植片生存期間を延長することを意図する。これは、わずか２つのアミノ酸によりアバタセプト（ＯＲＥＮＣＩＡ（登録商標））とは異なる。

一部の態様では、タンパク質混合物は、抗体、抗体断片、抗原結合断片、融合タンパク質、天然に存在するタンパク質、キメラタンパク質またはこれらの任意の組合せを含む。一部の態様では、タンパク質混合物は、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＧから選択される抗体を含む。一部の態様では、タンパク質混合物は抗体を含み、この抗体はＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４から選択されるＩｇＧ抗体である。一部の態様では、抗体は、二重可変ドメイン免疫グロブリンを含む。一部の態様では、抗体は、三価抗体を含む。一部の態様では、抗体または抗体断片は、抗ＰＤ－１、抗ＰＤ－Ｌｌ、抗ＣＴＬＡ４、抗ＴＩＭ３、抗ＬＡＧ３、抗ＮＫＧ２ａ、抗ＩＣＯＳ、抗ＣＤ１３７、抗ＫＩＲ、抗ＴＧＦβ、抗ＩＬ－１０、抗Ｂ７－Ｈ４、抗ＧＩＴＲ、抗ＣＸＣＲ４、抗ＣＤ７３、抗ＴＩＧＩＴ、抗ＯＸ４０、抗ＩＬ－８抗体またはこれらの抗体断片を含む。

一部の態様では、目的のタンパク質を含むタンパク質混合物は、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物細胞培養物に由来する。一部の態様では、哺乳動物細胞培養物は、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養物である。

一部の態様では、目的のタンパク質を含むタンパク質混合物は、バッチ細胞培養物から得られる。一部の態様では、目的のタンパク質を含むタンパク質混合物は、フェドバッチ細胞培養物から得られる。一部の態様では、タンパク質混合物をバイオリアクターにおいて生成する。一部の態様では、タンパク質混合物を使い捨てバイオリアクターにおいて生成する。一部の態様では、タンパク質混合物は、灌流細胞培養物から得られる。一部の態様では、タンパク質混合物をＴＦＦ灌流バイオリアクターの灌流において生成する。一部の態様では、タンパク質混合物を約１日間～約６０日間存続する細胞培養物により生成する。一部の態様では、タンパク質混合物を約２５日間存続する細胞培養物により生成する。

ＩＶ．医薬組成物
本開示の方法により生成したタンパク質は、ヒト投与に適するように、例えば、医薬組成物に、さらに製剤化することができる。組成物は、薬学的投与に許容される組成物であり、このような組成物は、薬学的投与に許容されるレベルを越えないレベル（このようなレベルは、このような不純物が存在しない場合を含む）で不純物である物質を含むことができ、例えば、投与し易いようにこのような組成物を製剤化するために、薬学的に許容される賦形剤、媒体、担体および他の不活性成分を、任意の活性剤（複数可）に加えて含むことができる。本開示の方法により調製した組成物は、多様な疾患を治療するのに有用である。

Ｖ．限外濾過システム
本開示では、目的のタンパク質の濾過プロセス時間を削減するためのシステムを提供する。また、本開示では、目的のタンパク質を濃縮するためのシステムを提供する。

一部の態様では、目的のタンパク質を濃縮するためのシステムは、供給タンク、第１の流体経路により供給タンクに接続するリザーバータンク、第２の流体経路によりリザーバータンクに接続する濾過膜、および第３の流体経路により濾過膜に接続し、第４の流体経路によりリザーバータンクに接続し、第５の流体経路により供給タンクに接続する、三方弁を含み、ここで、リザーバータンクが、第１の流体経路を介して供給タンクから目的のタンパク質を含むタンパク質混合物を受領し、濾過膜が、第２の流体経路を介してリザーバータンクから目的のタンパク質を含むタンパク質混合物を受領して、タンパク質混合物を濾過し、三方弁が、第３の流体経路を介してフィルターから保持液を受領して、保持液を第４の流体経路を介してリザーバータンク、または第５の流体経路を介して供給タンクのいずれかに方向づける。

一部の態様では、三方弁は、システム内のタンパク質混合物の全容量がリザーバータンクの収容能力未満である場合、保持液をリザーバータンクに方向づけ、システム内のタンパク質混合物の全容量がリザーバータンクの収容能力よりも大きい場合、保持液を供給タンクに方向づける。

一部の態様では、システムは、システム内のタンパク質混合物の全容量、質量および／または濃度を判定するように構成されたセンサーをさらに含み、ここで、三方弁が、センサーからのフィードバックに基づいて、保持液をリザーバータンクまたは供給タンクのいずれかに自動的に方向づける。一部の態様では、インラインＵＶ可視分光光度計を使用して、タンパク質混合物のタンパク質濃度をリアルタイムで監視する。一部の態様では、レベルセンサーを使用して、供給タンクおよびリザーバータンクのいずれかまたは両方におけるタンパク質溶液の容量をリアルタイムで監視する。一部の態様では、このようなレベルセンサーは、ウェーブガイドレーダーまたは膜に基づく圧力レベルセンサーを含むが、これらに限定されない。一部の態様では、供給タンクおよびリザーバータンクのいずれかまたは両方におけるタンパク質溶液の容量は、重量測定により監視し、ここで、供給タンクおよび／またはリザーバータンクにおけるタンパク質溶液の質量は、秤を使用して測定し、質量は、溶液密度を使用して容量に変換する。一部の態様では、システムは、１つまたは複数のダイヤフラムポンプ、ロータリーローブポンプまたは蠕動ポンプをさらに含む。

一部の態様では、フィルターは、インライン濾過膜を含む。一部の態様では、インライン濾過膜は、限外濾過膜である。一部の態様では、インライン濾過膜は、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ナイロン、ケイ素、ポリケイ素、超ナノ結晶ダイヤモンド、ダイヤモンド様炭素、二酸化ケイ素、チタン、シリカ、窒化ケイ素、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリカーボネート、グラフェン、酸化グラフェン、ポリサッカライド、セラミック粒子、ポリ（スチレンジビニル）ベンゼン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、修飾ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリフェニルスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリ乳酸、ポリアクリロニトリル、フッ化ポリビニリデン、ポリピペラジン、ポリアミド－ポリエーテルブロックポリマー、ポリイミド、ポリエーテルイミド、ポリアミド、再生セルロース、複合再生セルロースまたはこれらの組合せである。一部の態様では、インライン濾過膜は、ポリエーテルスルホンである。一部の態様では、インライン濾過膜は、セルロースである。一部の態様では、インライン濾過膜は、ポリエーテルスルホンとセルロースとの組合せである。一部の態様では、濾過膜は、約５０ｋＤ～約５ｋＤ未満の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する。一部の態様では、濾過膜は、約５ｋＤ未満のＭＷＣＯを有する。

実施例１
フェドバッチプロセス時間は、複数の設備適合性パラメーター、すなわち、保持液容器容量、システム貯蔵容量、充填タンパク質濃度および充填容量の関数である。

充填物質容量が、充填して保持液容器内に適合するのに大きすぎる場合、充填物質の一部を供給タンクに維持し、フェドバッチ限外濾過において保持液容器に緩徐に供給する。保持液容量が、保持液容器内に全タンパク質充填物（数グラムのタンパク質）を含むまで十分に減少した時点は、交差濃度（式１）と呼ぶ。

式中、Ｃ_０およびＶ_０は、それぞれタンパク質充填濃度および容量であり、Ｖ_ｒｅｓは保持液容器容量であり、Ｖ_{ｈｏｌｄｕｐ}はシステム貯蔵容量である。

タンパク質をフェドバッチ方式で濃縮するのに必要とされるプロセス時間は、式２ｃを使用して数値的に算出することができ、この式２ｃは、流動式（式２ａ、累積透過液容量Ｖ’に関して定義する）を積分し、流動に対する濃度分極モデルを想定することにより得た（式２ｂ）。式２ｃ中の積分Ｖ_{ｐｅｒｍ，ｆｉｎａｌ}の極限は、交差濃度における予想透過液容量である。フェドバッチ操作におけるタンパク質濃度は、累積透過液容量Ｖ’の関数として式３により定義することができ、式中、Ｖ_ｒｅｓは、保持液容器の充満容量であり、これは、フェドバッチ充填中に一定に維持する。したがって、Ｖ_{ｐｅｒｍ，ｆｉｎａｌ}は、交差タンパク質濃度（式１）を使用して、式３をＶ’について解くことにより算出することができる。

このような式により、フェドバッチプロセス時間は、複数の設備適合性パラメーター、すなわち、保持液容器容量、システム貯蔵容量、充填タンパク質濃度および充填容量の関数であることが明らかとなる。

実施例２
伝統的フェドバッチＴＦＦ構成は、図１Ａに例示する。ここでは、充填物質を保持する供給タンクは、供給ポンプにより保持液容器（例えば、リザーバー）に接続し、保持液容器を、ＴＦＦ膜装置および再循環ポンプとともに再循環ループに別々に組み込む。

本明細書に記載のシュードバッチ構成では、図１Ｂに例示するように、流路は、再循環ループに供給タンクを組み込むように変更する。三方弁は、以下に説明するように、ＴＦＦフィルターモジュールの保持液ポートの後に配置して、保持液流を第１の限外濾過工程の状況に応じて供給タンクまたは保持液容器のいずれかに方向づける。一部の態様では、撹拌機（図示せず）は、タンク／容器の両方に使用する。

第１の限外濾過工程の初期充填段階において、三方弁は、保持液流を充填タンク（ｌｏａｄ ｔａｎｋ）に方向づけ、保持液容器への流れを遮断するように設定する。充填物質は基準として、供給ポンプにより供給タンクから保持液容器に供給するが、ＴＦＦフィルターモジュールからの保持液は代わりに、供給タンクに戻し、残存充填物質と混合する。この新たな充填物質は、ここで、わずかにさらに濃縮して保持液容器に供給し、サイクルを繰り返す。したがって、保持液は次第にさらに濃縮されるが、充填物質は初期希釈濃度に固定されたままであるフェドバッチ充填とは異なり、充填タンクおよび保持液容器の両方のタンパク質溶液は、同一の速度で濃縮される。この構成では、バッチ設定と同様に、供給タンクは、保持液容器の拡張として効率的に作用し、この２つは、再循環ループにおける単一リザーバーとして作用する（図１Ｃ）。したがって、シュードバッチ構成では、別のハイブリッド方式のプロセスをバッチ様プロセスに転換することにより、第１の限外濾過工程のフェドバッチ充填部の時間ペナルティーならびにプロセス時間の設備適合依存性が軽減される。

充填工程が完了する場合（例えば、全タンパク質溶液容量が保持液容器容量未満に減少した場合）、三方弁が作動して、保持液流が保持液容器に再方向づけられ、供給タンクへの流れが遮断されて、再循環ループから供給タンクが効率的に排除され、ＴＦＦ設定が実質的バッチ構成に転換される。供給ポンプをさらなる時間操作して、充填物質の回収を最大化するために２つの容器間の接続チューブにおける残留物質の空気による追出し（例えば、保持液容器への）を実行することができる。

上記のシュードバッチ構成の利点を実証する概念の証拠として、ｍＡｂ Ａの高濃度溶液（約１８０ｇ／Ｌ）をバッチ、ハイブリッドおよびシュードバッチ構成により実験室規模で実施したＴＦＦによって生成した。各濾過工程（第１の限外濾過（ＵＦ１）、透析濾過（ＤＦ）および第２の限外濾過（ＵＦ２））のプロセス時間ならびに回収後精製原薬（ＰＤＳ）の品質特性（例えば、高分子量（ＨＭＷ）種、粒子数）を、３つの構成間で比較した。ＨＭＷレベルを、モデル２４８７の二波長検出器（ＷａｔｅｒｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ社、ＭｉｌｆｏｒｄＭＡ ＵＳＡ）ならびにＴＳＫｇｅｌ ＳｕｐｅｒＳＷ３０００メインおよびガードカラム（ＴｏｓｏｈＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅ社、Ｋｉｎｇ ｏｆＰｒｕｓｓｉａＰＡ ＵＳＡ）を備えるＡｌｌｉａｎｃｅ２６９５ＨＰＬＣシステムを使用する高性能液体サイズ排除クロマトグラフィーにより測定し、一方、１～１００μｍ粒子の粒子数を、ＭＦＩ５２００（ＰｒｏｔｅｉｎＳｉｍｐｌｅ社、ＳａｎＪｏｓｅＣＡ ＵＳＡ）を使用するマイクロフローイメージングにより定量した。ＰＤＳ濁度は、Ｈａｃｈ ２１００Ｑ濁度計を使用して三つ組で測定し、これは、使用前に毎日較正した。

ＴＦＦ実験は、Ｑｕａｔｔｒｏｆｌｏｗ１５０ポンプ（ＨｉｇｈＰｕｒｉｔｙＮｅｗＥｎｇｌａｎｄ社、ＳｍｉｔｈｆｉｅｌｄＲＩ ＵＳＡ）および８８ｃｍ^２ ３０ｋＤａのＵｌｔｒａｃｅｌＰｅｌｌｉｃｏｎ３Ｄ－ｓｃｒｅｅｎ膜（ＭｉｌｌｉｐｏｒｅＳｉｇｍａ社、ＢｕｒｌｉｎｇｔｏｎＭＡ ＵＳＡ）を備えるＰｅｎｄｏＴＥＣＨ制御およびデータ収集システム（ＰｅｎｄｏＴＥＣＨ社、ＰｒｉｎｃｅｔｏｎＮＪ ＵＳＡ）を使用して実施した。単一バッチの精製した１０ｇ／ＬのｍＡｂ溶液を別々の一定分量に分けて、３回の実行において同一の充填物質を生成した。ここでは、一定分量の容量は、およそ６００ｇ／ｍ^２の膜充填を達成するように定義した。シュードバッチおよびハイブリッド後成の両方では、システム貯蔵容量を加えた保持液容器に対する初期充填容量の容量比は、５に設定した。各実行では、ｍＡｂは、第１の限外濾過工程において５０ｇ／Ｌに濃縮され、次いで、バッファーを透析濾過容量５の透析濾過バッファーと交換した。次いで、透析濾過タンパク質溶液を、第２の限外濾過工程において１８０ｇ／Ｌにさらに濃縮した（保持液および透過液の質量から重量測定により決定して、高濃度における溶液密度の変化を説明した）。次いで、バッファーにより貯蔵容量外に残留タンパク質溶液を追い出すことにより原薬を回収した。ここでは、使用した追出しバッファーの容量は、システム貯蔵容量の１．２倍であった。

実施例３
Ａ．プロセス時間
プロセス時間の関数としてのおよその保持液ｍＡｂ濃度（システムにおける保持液容量およびタンパク質の全質量から算出）は、３つの構成について図２Ａに示す。各プロセス段階（ＵＦ１、ＤＦおよびＵＦ２）における対応するプロセス時間は、図２Ｂに示す。３回の実行において観察された対応する透過液流動は、図３に示す。

ハイブリッド（フェドバッチ充填）実行のＵＦ１工程のプロセス時間は、図２Ｂに見られるように、バッチ実行よりも６０％長かった。フェドバッチ戦略を使用した、充填工程における透過液流動（ＵＦ１の初期部）は、低くなることが観察され（図３）、これは、ハイブリッド実行の長いＵＦ１プロセス時間にも寄与する可能性を有する。対照的に、シュードバッチ実行におけるＵＦ１プロセス時間（図２Ｂ）および透過液流動（図３）の両方は、バッチ実行とほぼ同一であった。ＤＦおよびＵＦ２工程は、充填（ＵＦ１）工程におけるシステム構成とは無関係に、バッチ構成において必ず実施するため、当然、透析濾過およびＵＦ２プロセス時間は、３回すべての実行間でほぼ同一であった（図２Ｂ）。３回の実行間における透析濾過プロセス時間の差がわずかであるのは、透析濾過工程におけるタンパク質濃度の可変性が軽度であるためであった（４９～５１ｇ／Ｌ）。このような結果により、初期試料充填（ＵＦ１）工程におけるシステム構成の全プロセス時間に対する影響が例示され、ＵＦ１工程においてフェドバッチ充填と関連する時間ペナルティーを軽減するだけでなく、ハイブリッド（フェドバッチ充填）プロセスと関連するプロセス時間拡張可能性の課題を排除する、シュードバッチ構成の能力が実証される。

Ｂ．品質特性
原薬品質特性に対するシュードバッチ構成の影響を評価して、第２のポンプ（例えば、供給ポンプ）を再循環ループへ組み込むことにより、ここで、タンパク質溶液が再循環サイクル毎に１つではなく２つのポンプの通過を経るため、有害作用がもたらされるかどうかを判定した。

ｍＡｂ Ａは、ＵＦ／ＤＦにおける可溶性の高分子量（ＨＭＷ）種の形成に関するポンプ剪断への曝露に対して非感受性であることが見出された。ＨＭＷレベルは、３つすべての構成戦略について、全プロセスを通じて本質的に不変のままであった（図４）。したがって、シュードバッチ構成と関連するポンプ剪断への曝露の増加によって、ＨＭＷ形成に対する有害作用がもたらされるとは思われなかった。

大型の不溶性凝集物に対するシュードバッチ構成の影響を、マイクロ流体イメージング（ＭＦＩ）により定量した。３つの構成を使用して生成したプロセス中のプールにおける顕微鏡下で可視の（１～１００μｍ）粒子数を図５Ａ～Ｄに示す。ＨＭＷ形成において観察されたものとは異なり、ｍＡｂ Ａは、経時的な顕微鏡下で可視の粒子形成における著しい増加は示さず、ここで、粒子の全数および相対的粒子サイズ分布の両方は、構成間で顕著に異なる。

ハイブリッド実行では、すべての粒子サイズ範囲において、バッチ実行よりも粒子数が一貫して多く、長いプロセス時間ならびに対応する剪断および界面応力に対するタンパク質曝露の増加と一致した。対照的に、シュードバッチ実行では、５０～１００μｍのサイズ範囲（図５Ｄ）を除いて、１～２５μｍのサイズ範囲（図５Ａ～Ｃ）において、バッチ実行と同等かまたは少ない量の粒子が生成された。５０～１００μｍのサイズ範囲における多粒子数は、他の２つの充填戦略と比較して二重のポンプを通過する結果としてＵＦ１工程において生成される（未検出の）凝集前駆物質レベルの上昇に潜在的に起因し得る。しかし、５０～１００μｍのサイズ範囲における全粒子数が、小型の粒子サイズ範囲における粒子数よりも桁違いに少ないことに留意することが重要である。全体的な粒子生成の観点からすれば、シュードバッチ構成は、フェドバッチ構成を超える顕著な改良であり、バッチ構成と同等品質の原薬を生成すると思われる。

興味深いことには、３つの構成間の粒子数における最も大きな差は、ＵＦ２工程が全体的プロセスのうちの最も短い部分であるという事実にもかかわらず、ＤＶ５とＵＦ２後との間で生じる（図２Ｂ）。３つすべての構成が、ＤＦおよびＵＦ２の両工程において同一のプロセス時間および設定を有することを考慮すると、このような結果は、ＳＥＣ／ＭＦＩにより検出されない可能性を有するが、最終原薬の品質に影響する凝集前駆物質の生成において、ＵＦ１工程の重要性を実証する。

実施例４
供給ポンプの型がシュードバッチプロセスに影響するかどうかを判定するために、ダイヤフラム供給ポンプを蠕動供給ポンプと交換した。約１８０ｇ／ＬのｍＡｂ Ａ溶液を、シュードバッチ充填構成を使用して、実施例３のシュードバッチ実行と同一のプロセスパラメーター（例えば、膜充填、充填濃度、透析濾過濃度、交換透析濾過容量、ポンプ供給流動およびＴＭＰ）により生成した。保持液タンク容量に対する初期充填容量の容量比は、実施例３のように、５に維持した（すなわち、充填工程における保持液タンクの液体容量を、初期全充填容量の２０％と等しい一定の値に維持した）。この実行のプロセス性能を、ダイヤフラム供給ポンプを使用してシュードバッチ実行のそれと比較した。

プロセス時間の関数としてのおよその保持液ｍＡｂ濃度（システムにおける保持液容量およびタンパク質の全質量から算出）は、２回のシュードバッチ実行について図６Ａに示す。各プロセス段階（ＵＦ１、ＤＦおよびＵＦ２）における対応するプロセス時間は、図６Ｂに示す。算出した保持液濃度の関数としての対応する透過液流動は、図７に示す。２回の実行の流動プロファイルならびにプロセス時間は、ＵＦ／ＤＦプロセスの各段階において、ほぼ同一であり、供給ポンプのための蠕動またはダイヤフラムポンプの選択は、プロセス処理量に関するシュードバッチ充填方法の性能に対して影響を与えないことを示す。

また、原薬品質特性を評価して、シュードバッチ構成における供給ポンプ型が、シュードバッチ方法の一般的実用性における決定因子となり得る、ＵＦ／ＤＦプロセスにおけるタンパク質安定性に著しく影響するかどうかを判定した。図８からわかるように、蠕動供給ポンプの使用によって、ＵＦ／ＤＦにおけるＨＭＷ形成は、ダイヤフラム供給ポンプを超えて増加しなかった（アッセイ可変性の範囲内）。したがって、ダイヤフラム供給ポンプを超える、蠕動供給ポンプの使用と関連する剪断曝露の差によって、ＨＭＷ形成に対する有害作用がもたらされるとは思われなかった。

大型の不溶性凝集物に対する供給ポンプ型の影響を、マイクロ流体イメージング（ＭＦＩ）により定量した。複数の供給ポンプ型を使用して生成したプロセス中のプールにおける顕微鏡下で可視の（１～１００μｍ）粒子数を図９Ａ～９Ｄに示す。ＨＭＷ形成において観察されたものとは異なり、粒子の全数および相対的粒子サイズ分布の両方は、ポンプ型間で顕著に異なった。蠕動供給ポンプによって、小型の粒子（＜２５μｍ）がダイヤフラムポンプと比較して著しくさらに生成されたが、大型の粒子（＞５０μｍ）は少なかった。このプロファイルは、蠕動ポンプにより、タンパク質溶液が供給ポンプを通じて循環するため、さらに高い剪断またはさらなる乱流形態が生じ、これにより大型粒子が不安定化して、小型粒子の集団が相対的に多くなることを示唆する。しかし、上記のように、粒子サイズ分布の差によって、膜流動またはプロセス処理量が影響されるとは思われない。このような粒子は、ＵＦ／ＤＦ工程後の最終的製剤化および濾過工程において除去されるため、２つのポンプ型間における粒子生成の差が、最終生成物品質の懸念となる可能性は低い。

実施例５
充填工程における保持液対全充填容量比がシュードバッチ性能に影響するかどうかを判定するために、充填工程における保持液タンクの液体容量を、全充填容量に対して低容量により一定に維持した。約１８０ｇ／ＬのｍＡｂ Ａ溶液を、シュードバッチ充填方法を使用して、実施例４に記載のＵＦ／ＤＦプロセスパラメーターおよび構成（蠕動供給ポンプ）を使用して生成した。しかし、保持液タンクの液体容量を、実施例４での２０％ではなく、ＵＦ１工程の充填部分において全初期充填容量の１０％に維持した。この実行のプロセス性能は、保持液タンク容量を充填工程において全初期充填容量の２０％に維持したシュードバッチ実行のそれと比較した。

プロセス時間の関数としてのおよその保持液ｍＡｂ濃度（システムにおける保持液容量およびタンパク質の全質量から算出）は、２回のシュードバッチ実行について図１０Ａに示す。各プロセス段階（ＵＦ１、ＤＦおよびＵＦ２）における対応するプロセス時間は、図１０Ｂに示す。算出した保持液濃度の関数としての対応する透過液流動は、図１１に示す。２回の実行の流動プロファイルならびにＵＦ１およびＵＦ２プロセス時間は、ほぼ同一であり、充填工程における保持液タンク対全充填容量比は、タンパク質を濃縮するのに必要とされるプロセス時間に対して影響を与えないことを示す。透析濾過時間の小さな差は、標的値５０ｇ／Ｌ付近の実際の透析濾過濃度におけるわずかな変動のためである可能性を有する。この結果は、実施例１においてこれまでに説明したように、ＵＦ１プロセス時間が、保持液タンクおよび全充填容量の相対容量比に依存する、フェドバッチ操作とは異なる。実施例４および５の充填工程における相対的保持液および充填容量比に対するＵＦ１プロセス時間の独立性は、シュードバッチ方法の主要な原理と一致しており、ここで、ＵＦ／ＤＦ再循環ループにおいて供給タンクおよび保持液タンクを接続することにより、それらを単一リザーバーとして効率的に機能させ、充填工程をバッチプロセスに転換することが可能となる。

また、原薬品質特性を評価して、充填工程における保持液対全充填容量比が、ＵＦ／ＤＦプロセスにおけるタンパク質安定性に影響するかどうかを判定した。図１２からわかるように、保持液容量を初期充填容量の１０％に維持して実施した実行では、ＨＭＷレベルは、２０％の容量比により実施した実行と同一であった。同様に、ＭＦＩにより定量したＵＦ２後の溶液の粒子サイズ分布（１～１００μｍ）は、図１３Ａ～図１３Ｄに見られるように、２回の実行間でほぼ同一であった。タンパク質が結果として、同一数のポンプの通過および２回の実行間の他のストレス因子の影響を受けるため、２回の実行間のＨＭＷおよび大型粒子プロファイルの類似性は、同一のＵＦ１プロセス時間（図１０Ｂ）およびプロセス時間の関数としての濃度プロファイル（図１０Ａ）に部分的に起因し得る。

実施例６
シュードバッチ方法は、非ｍＡｂタンパク質製剤（ＭＷ＝約２０Ｄａ）に対して実施した。この非ｍＡｂタンパク質製剤は、充填物質として使用した。タンパク質は、伝統的フェドバッチならびにシュードバッチ方法を使用して０．７から１５．５ｇ／Ｌまで濃縮した。このような２回の実行において、バッファー交換は実施しなかった。他のすべてのプロセスパラメーター（膜充填、ポンプ供給流動、ＴＭＰ）は、２回の実行間で一定に保持した。保持液タンクの液体容量は、両実行において充填工程を通じて全初期充填容量の３０％に等しい値で一定に維持し、蠕動ポンプを供給ポンプとして使用した。

プロセス時間の関数としてのおよその保持液タンパク質濃度（システムにおける保持液容量およびタンパク質の全質量から算出）は、２回の実行について図１４に示す。対応するプロセス時間は、フェドバッチ実行では３．０時間およびシュードバッチ実行では２．９時間であった。算出した保持液濃度の関数としての透過液流動は、図１５に示す。流動対濃度プロファイルは同一であることにより、これまでの実施例による知見と一致して、充填方法における差が本来の膜性能には影響しないことを示す。この実施例では、プロセスの充填工程は、この濃度範囲にわたって減衰する流動が本質的に無視できるものであるような、非常に狭く希薄な濃度範囲（０．７～２ｇ／Ｌ）にわたって行い、これにより、充填工程においてほぼ同一の平均透過液流動が生じ、このため２回の実行間で同様のプロセス時間が生じる。しかし、シュードバッチ充填戦略は、この場合の差が充填工程を行う濃度範囲が非常に低いために非常に小さい（約０．１時間）としても、フェドバッチ充填方法と比較してプロセス時間を削減する利点をさらにもたらす。

また、原薬品質特性を評価して、シュードバッチ充填戦略が、タンパク質が経るポンプ通過数を増加した結果としてＵＦ／ＤＦにおける非ｍＡｂタンパク質の安定性に対して有害な影響を有するかどうかを判定した。図１６からわかるように、シュードバッチおよびフェドバッチ方法により、同等量のＨＭＷ種が生成された。しかし、２つの方法は、ＭＦＩにより特性決定した場合のＵＦ／ＤＦにおいて形成された大型粒子の量および相対的サイズ分布において異なった。図１７Ａ～図１７Ｄに見られるように、シュードバッチ充填方法により、フェドバッチ方法よりも小型の粒子（＜２５μｍ）が生成されるが、同等量の大型粒子（＞５０μｍ）が生成された。この結果は、実施例３～５のｍＡｂ Ａに見られたことと一致する。シュードバッチ充填方法に固有のさらなる数のポンプ通過によって、小型粒子の形成は増加するが、大型粒子は増加しない。製造バイオプロセスが、ＵＦ／ＤＦ工程後の最終的製剤化および濾過工程を典型的に含むため、このような粒子は、最終原薬から除去されることが予想される。したがって、シュードバッチ方法により生じる小型粒子形成の増加が、最終原薬の品質に対して有害な影響を有することは予想されない。

本明細書に記載のＵＦ／ＤＦのためのシュードバッチ構成では、フェドバッチ設定（供給タンクおよび保持液容器を使用する）をバッチ様操作（ＴＦＦ再循環ループにおいて単一容器として作用するように２つの容器を接続する）に転換することによる、フェドバッチ充填と関連する時間ペナルティーを軽減することが可能である。この転換により、ハイブリッドプロセス（例えば、フェドバッチ充填＋バッチ濃縮）と関連するプロセス時間の規模依存性も排除されることにより、プロセスが十分に拡張可能となる。加えて、バッチ構成と比較して２倍のポンプ通過が生じる、再循環ループへの供給ポンプの組入れによって、ＨＭＷ形成および顕微鏡下で可視の粒子数により定量した場合、生成物品質に対して顕著ないかなる有害作用も生じなかった。

高濃度原薬を生成するためのハイブリッドＵＦ／ＤＦプロセスは、バイオ医薬品産業が、薬物送達のために皮下形式に次第に移行するにつれて、必然的にさらに普及するようになるであろう。本明細書に記載のシュードバッチ構成を代わりに使用することにより、フェドバッチ充填と関連する時間ペナルティーを削減し、ハイブリッドプロセスから生じるプロセス時間の規模依存性を排除し、ハイブリッドプロセスと比較して生成物品質を潜在的に改良することができる。まとめると、このような利点により、プロセス処理量および収率が向上するだけでなく、実験室／開発規模から製造規模へのさらに合理化した技術移行のためのＵＦ／ＤＦプロセスの拡張可能性が向上し得る。

前述の特定の態様の記載によって、当業者が当技術分野内の知識を適用することにより種々の適用、例えば、特定の態様に対して、過度な実験の必要なく、本発明の一般的概念から逸脱せずに、容易に修飾および／または適応可能な本発明の一般的性質が、かなり十分に明らかとなる。したがって、このような適応および修飾は、本明細書に示す教示およびガイダンスに基づく、開示の態様の等価物の意味および範囲の内であることを意図する。本明細書の表現または用語は、制限目的のためではなく説明目的のためであり、このため本明細書の用語または表現は、教示およびガイダンスを考慮して当業者により解釈されるものであることを理解すべきである。

本明細書において言及するすべての公表文献、特許および特許出願は、個々の公表文献、特許または特許出願を参照により組み込むことを詳細かつ個別に示す場合と同等に、参照により本明細書に組み込む。

本発明の他の態様は、本明細書に開示する本発明の明細書および実践の考察から当業者に明らかとなる。明細書および実施例は、単なる例示として考えられることを意図するとともに、本発明の実質的範囲および趣旨は、次の特許請求の範囲によって示す。

Claims (70)

1. 少なくとも１回濾過されている目的のタンパク質を含むタンパク質混合物（「保持液」）により供給タンクを持続的に充填することを含む、目的のタンパク質の濾過プロセス時間を削減する方法であって、前記供給タンクが、主要リザーバー（「保持液」）タンクから分離している、方法。
2. 少なくとも１回濾過されている目的のタンパク質を含むタンパク質混合物（「保持液」）により供給タンクを持続的に充填することを含む、目的のタンパク質を濃縮する方法であって、前記供給タンクが、主要リザーバー（「保持液」）タンクから分離している、方法。
3. 供給タンクが、少なくとも１回も濾過されていない目的のタンパク質を含む初期タンパク質混合物をさらに含む、請求項１または２に記載の方法。
4. 初期タンパク質混合物および保持液を混合する、請求項３に記載の方法。
5. タンパク質混合物および／または保持液をフィルターにより濾過する、請求項３または４に記載の方法。
6. 濾過したタンパク質混合物および保持液（「保持液」）を供給タンクに充填する、請求項５に記載の方法。
7. 充填を、目的のタンパク質が、少なくとも約１ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約１０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約２０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約３０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約４０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約５０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約６０ｍｇ／ｍＬ、少なくとも約７０ｍｇ／ｍＬ、または少なくとも約８０ｍｇ／ｍＬに濃縮されるまで継続する、請求項１から６のいずれか一項に記載の方法。
8. 充填を、目的のタンパク質が、約１ｍｇ／ｍＬ～８０ｍｇ／ｍＬ、約５ｍｇ／ｍＬ～７０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～４０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～３０ｍｇ／ｍＬ、約１０ｍｇ／ｍＬ～２０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ～７０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ～６０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ～５０ｍｇ／ｍＬ、約２０ｍｇ／ｍＬ～４０ｍｇ／ｍＬ、または約２０ｍｇ／ｍＬ～３０ｍｇ／ｍＬに濃縮されるまで継続する、請求項１から７のいずれか一項に記載の方法。
9. 保持液の充填を少なくとも２回、少なくとも３回、少なくとも４回、少なくとも５回、少なくとも６回、少なくとも７回、少なくとも８回、少なくとも９回、少なくとも１０回、少なくとも２０回、少なくとも３０回、少なくとも４０回、少なくとも５０回、少なくとも６０回、少なくとも７０回、少なくとも８０回、少なくとも９０回、少なくとも１００回、少なくとも１１０回、少なくとも１２０回、少なくとも１３０回、少なくとも１４０回、少なくとも１５０回、少なくとも１６０回、少なくとも１７０回、少なくとも１８０回、少なくとも１９０回、少なくとも２００回、少なくとも２１０回、少なくとも２２０回、少なくとも２３０回、少なくとも２４０回、少なくとも２５０回、少なくとも２６０回、少なくとも２７０回、少なくとも２８０回、少なくとも２９０回、または少なくとも３００回繰り返す、請求項１から８のいずれか一項に記載の方法。
10. 供給タンクへの保持液の充填を停止することをさらに含む、請求項１から９のいずれか一項に記載の方法。
11. 保持液をリザーバータンクに方向づけることをさらに含む、請求項１０に記載の方法。
12. 供給タンク、リザーバータンク、フィルター、フィルターを供給タンクに接続する供給タンク弁およびフィルターをリザーバータンクに接続するリザーバータンク弁を含む三方弁、ならびに供給タンクとリザーバータンクとを接続するリザーバーインプットを含む、濾過システムに、目的のタンパク質を含むタンパク質混合物を充填することを含む、目的のタンパク質の濾過プロセス時間を削減する方法。
13. 供給タンク、リザーバータンク、フィルター、フィルターを供給タンクに接続する供給タンク弁およびフィルターをリザーバータンクに接続するリザーバータンク弁を含む三方弁、ならびに供給タンクとリザーバータンクとを接続するリザーバーインプットを含む、濾過システムに、目的のタンパク質を含むタンパク質混合物を充填することを含む、目的のタンパク質を濃縮する方法。
14. リザーバータンク弁が、目的のタンパク質が十分に濃縮されるまで閉じている、請求項１２または１３に記載の方法。
15. タンパク質混合物を供給タンクに頻繁に加えることをさらに含む、請求項１２から１４のいずれか一項に記載の方法。
16. タンパク質混合物を供給タンクからリザーバータンクへ方向づける、請求項１２から１５のいずれか一項に記載の方法。
17. リザーバータンクをフィルターに接続する、請求項１１から１６のいずれか一項に記載の方法。
18. フィルターが、インライン濾過膜を含む、請求項１７に記載の方法。
19. インライン濾過膜が、限外濾過膜である、請求項１８に記載の方法。
20. インライン濾過膜が、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ナイロン、ケイ素、ポリケイ素、超ナノ結晶ダイヤモンド、ダイヤモンド様炭素、二酸化ケイ素、チタン、シリカ、窒化ケイ素、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリカーボネート、グラフェン、酸化グラフェン、ポリサッカライド、セラミック粒子、ポリ（スチレンジビニル）ベンゼン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、修飾ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリフェニルスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリ乳酸、ポリアクリロニトリル、フッ化ポリビニリデン、ポリピペラジン、ポリアミド－ポリエーテルブロックポリマー、ポリイミド、ポリエーテルイミド、ポリアミド、再生セルロース、複合再生セルロースまたはこれらの組合せである、請求項１８または請求項１９に記載の方法。
21. 濾過膜が、約５０ｋＤ～約５ｋＤ、約５０ｋＤ、約４０ｋＤ、約３０ｋＤ、約２０ｋＤ、約１０ｋＤまたは約５ｋＤ未満の分子量カットオフ（ＭＷＣＯ）を有する、請求項１８から２０のいずれか一項に記載の方法。
22. ＭＷＣＯが、約５ｋＤ未満である、請求項２１に記載の方法。
23. 混合物を所望の濾過タンパク質濃度に達するまで流動させる、請求項１から２２のいずれか一項に記載の方法。
24. 所望の濾過タンパク質濃度が、約１０ｍｇ／ｍＬ～約３００ｍｇ／ｍＬ、例えば、約１０ｍｇ／ｍＬ、約５０ｍｇ／ｍＬ、約１００ｍｇ／ｍＬ、約１１０ｍｇ／ｍＬ、約１２０ｍｇ／ｍＬ、約１３０ｍｇ／ｍＬ、約１４０ｍｇ／ｍＬ、約１５０ｍｇ／ｍＬ、約１６０ｍｇ／ｍＬ、約１７０ｍｇ／ｍＬ、約１８０ｍｇ／ｍＬ、約１９０ｍｇ／ｍＬ、約２００ｍｇ／ｍＬ、約２５０ｍｇ／ｍＬ、または約３００ｍｇ／ｍＬである、請求項２３に記載の方法。
25. 所望の濾過タンパク質濃度が、約１５０ｍｇ／ｍＬである、請求項２４に記載の方法。
26. タンパク質粘度が、約０ｃＰ～約２００ｃＰである、請求項２３から２５のいずれか一項に記載の方法。
27. タンパク質粘度が、約２０ｃＰ～約６０ｃＰである、請求項２６に記載の方法。
28. 供給タンク容量とリザーバー容量との間の容量比が、約１：２～約１０：１、約１：２～約１：１、約１：１～約１：２、約１：１ 約１：３、約１：１～約１：４、約１：１～約１：５、約１：１～約１：６、約１：１～約１：７、約１：１～約１：８、約１：１～約１：９、または約１：１～約１：１０である、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
29. 供給タンク容量とリザーバー容量との間の容量比が、約１：１、約２：１または約５：１である、請求項１から２７のいずれか一項に記載の方法。
30. タンパク質混合物をダイヤフラムポンプ、ロータリーローブポンプまたは蠕動ポンプを使用してリザーバータンクおよび／またはフィルターに方向づける、請求項１６から２９のいずれか一項に記載の方法。
31. 少なくとも１回濾過されている目的のタンパク質を含むタンパク質混合物（「保持液」）による供給タンクの持続的充填の前に、１回も濾過されていない目的のタンパク質を含む初期タンパク質混合物を供給タンクに充填することをさらに含む、請求項１から３０のいずれか一項に記載の方法。
32. 初期タンパク質混合物を約１ｍｇ／ｍＬ～約３０ｍｇ／ｍＬの濃度で供給タンクに加える、請求項３１に記載の方法。
33. 初期タンパク質混合物を約５ｍｇ／ｍＬの濃度で供給タンクに加える、請求項３２に記載の方法。
34. プロセス時間が、フェドバッチ濃縮プロセスのプロセス時間と比較して約１％、約５％、約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％削減される、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
35. プロセス時間が、フェドバッチ濃縮プロセスのプロセス時間と比較して約４０％削減される、請求項３４に記載の方法。
36. プロセス時間が、フェドバッチ濃縮プロセスのプロセス時間と比較して約０．２時間、約０．４時間、約０．５時間、約０．６時間、約０．８時間または約１．０時間削減される、請求項１から３３のいずれか一項に記載の方法。
37. プロセス時間が、フェドバッチ濃縮プロセスのプロセス時間と比較して約０．５時間削減される、請求項３６に記載の方法。
38. １～２μｍの粒子数が、フェドバッチ濃縮プロセスの粒子数と比較して約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％減少する、請求項１から３７のいずれか一項に記載の方法。
39. ５～１０μｍの粒子数が、フェドバッチ濃縮プロセスの粒子数と比較して約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％減少する、請求項１から３８のいずれか一項に記載の方法。
40. １０～２５μｍの粒子数が、フェドバッチ濃縮プロセスの粒子数と比較して約１０％、約２０％、約３０％、約４０％または約５０％減少する、請求項１から３９のいずれか一項に記載の方法。
41. タンパク質混合物が、抗体、抗体断片、抗原結合断片、融合タンパク質、天然に存在するタンパク質、キメラタンパク質またはこれらの任意の組合せを含む、請求項１から４０のいずれか一項に記載の方法。
42. タンパク質混合物が、ＩｇＭ、ＩｇＡ、ＩｇＥ、ＩｇＤおよびＩｇＧから選択される抗体を含む、請求項４１に記載の方法。
43. タンパク質混合物が抗体を含み、前記抗体がＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３およびＩｇＧ４から選択されるＩｇＧ抗体である、請求項４２に記載の方法。
44. 抗体が、二重可変ドメイン免疫グロブリンを含む、請求項４１から４３のいずれか一項に記載の方法。
45. 抗体が、三価抗体を含む、請求項４１から４３のいずれか一項に記載の方法。
46. 抗体または抗体断片が、抗ＰＤ－１抗体、抗ＰＤ－Ｌｌ抗体、抗ＣＴＬＡ４抗体、抗ＴＩＭ３抗体、抗ＬＡＧ３抗体、抗ＮＫＧ２ａ抗体、抗ＩＣＯＳ抗体、抗ＣＤ１３７抗体、抗ＫＩＲ抗体、抗ＴＧＦβ抗体、抗ＩＬ－１０抗体、抗Ｂ７－Ｈ４抗体、抗ＧＩＴＲ抗体、抗ＣＸＣＲ４抗体、抗ＣＤ７３、抗ＴＩＧＩＴ抗体、抗ＯＸ４０抗体、抗ＩＬ－８抗体またはこれらの抗体断片を含む、請求項４１に記載の方法。
47. タンパク質混合物が、細菌、酵母、昆虫または哺乳動物細胞培養物に由来する、請求項４１から４６のいずれか一項に記載の方法。
48. 哺乳動物細胞培養物が、チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞培養物である、請求項４７に記載の方法。
49. タンパク質混合物が、バッチ細胞培養物から得られる、請求項１から４８のいずれか一項に記載の方法。
50. タンパク質混合物が、フェドバッチ細胞培養物から得られる、請求項１から４９のいずれか一項に記載の方法。
51. タンパク質混合物をバイオリアクターにおいて生成する、請求項１から５０のいずれか一項に記載の方法。
52. タンパク質混合物を使い捨てバイオリアクターにおいて生成する、請求項５１に記載の方法。
53. タンパク質混合物が、灌流細胞培養物から得られる、請求項１から４８のいずれか一項に記載の方法。
54. タンパク質混合物を灌流またはＴＦＦ灌流バイオリアクターにおいて生成する、請求項５３に記載の方法。
55. タンパク質混合物を約１日間～約６０日間存続する細胞培養物により生成する、請求項４７から５４のいずれか一項に記載の方法。
56. タンパク質混合物を約２５日間存続する細胞培養物により生成する、請求項５５に記載の方法。
57. タンパク質混合物をローディングバッファーとともに供給タンクに加える、請求項１から５４のいずれか一項に記載の方法。
58. ローディングバッファーが、アミノ酸、弱酸、弱塩基および／または糖を含む、請求項５７に記載の方法。
59. タンパク質を医薬組成物に製剤化することをさらに含む、請求項１から５８のいずれか一項に記載の方法。
60. 請求項１から５９のいずれか一項に記載の方法により調製したタンパク質。
61. 請求項１から６０に記載のタンパク質を含む医薬組成物。
62. それを必要とする対象に請求項６１に記載の医薬組成物を投与する方法。
63. 請求項６１に記載の医薬組成物を対象に投与することを含む、それを必要とする対象における疾患または症状を治療する方法。
64. 供給タンク、
    第１の流体経路により前記供給タンクに接続するリザーバータンク、
    第２の流体経路により前記リザーバータンクに接続する濾過膜、および
    第３の流体経路により前記濾過膜に接続し、第４の流体経路により前記リザーバータンクに接続し、第５の流体経路により前記供給タンクに接続する、三方弁
    を含む、目的のタンパク質を濃縮するためのシステムであって、
    前記リザーバータンクが、第１の前記流体経路を介して前記供給タンクから目的の前記タンパク質を含むタンパク質混合物を受領し、
    前記濾過膜が、第２の流体経路を介して前記リザーバータンクから目的の前記タンパク質を含む前記タンパク質混合物を受領して、前記タンパク質混合物を濾過し、
    前記三方弁が、第３の前記流体経路を介して前記フィルターから保持液を受領して、前記保持液を第４の前記流体経路を介して前記リザーバータンク、または第５の前記流体経路を介して前記供給タンクのいずれかに方向づける、システム。
65. 三方弁が、システム内のタンパク質混合物の全容量がリザーバータンクの収容能力未満である場合、保持液をリザーバータンクに方向づけ、システム内のタンパク質混合物の全容量がリザーバータンクの収容能力よりも大きい場合、保持液を供給タンクに方向づける、請求項６４に記載のシステム。
66. 三方弁が、センサーからのフィードバックに基づいて、保持液をリザーバータンクまたは供給タンクのいずれかに自動的に方向づける、システム内のタンパク質混合物の全容量および／または濃度を判定するように構成されたセンサーをさらに含む、請求項６４から６５のいずれか一項に記載のシステム。
67. １つまたは複数のダイヤフラムポンプ、ロータリーローブポンプまたは蠕動ポンプをさらに含む、請求項６４から６６のいずれか一項に記載のシステム。
68. フィルターが、インライン濾過膜を含む、請求項６４から６７のいずれか一項に記載のシステム。
69. インライン濾過膜が、限外濾過膜である、請求項６８に記載のシステム。
70. インライン濾過膜が、ポリビニルエーテル、ポリビニルアルコール、ナイロン、ケイ素、ポリケイ素、超ナノ結晶ダイヤモンド、ダイヤモンド様炭素、二酸化ケイ素、チタン、シリカ、窒化ケイ素、ポリテトラフルオロエチレン、シリコーン、ポリメタクリル酸、ポリメタクリル酸メチル、ポリアクリル酸、ポリスチレン、ポリアクリルアミド、ポリメタクリルアミド、ポリカーボネート、グラフェン、酸化グラフェン、ポリサッカライド、セラミック粒子、ポリ（スチレンジビニル）ベンゼン、ポリスルホン、ポリエーテルスルホン、修飾ポリエーテルスルホン、ポリアリールスルホン、ポリフェニルスルホン、ポリ塩化ビニル、ポリプロピレン、酢酸セルロース、硝酸セルロース、ポリ乳酸、ポリアクリロニトリル、フッ化ポリビニリデン、ポリピペラジン、ポリアミド－ポリエーテルブロックポリマー、ポリイミド、ポリエーテルイミド、ポリアミド、再生セルロース、複合再生セルロースまたはこれらの組合せである、請求項６９に記載のシステム。

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