CA3084602A1

CA3084602A1 - Variants avec fragment fc ayant une affinite augmentee pour fcrn et une affinite augmentee pour au moins un recepteur du fragment fc

Info

Publication number: CA3084602A1
Application number: CA3084602A
Authority: CA
Inventors: Harry Meade; Celine Monnet; Philippe Mondon
Original assignee: LFB SA
Current assignee: LFB SA
Priority date: 2017-12-15
Filing date: 2018-12-14
Publication date: 2019-06-20
Also published as: FR3075200A1; JP2021508444A; AU2018382593A1; EP3724221A1; WO2019115773A1; RU2020119543A; FR3075200B1; CN111601821A; BR112020012016A2; MX2020006013A; JP2023134604A; KR20200098512A; US20210214434A1

Abstract

La présente invention a pour objet un Variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une affinité augmentée pour le récepteur FcRn, et une affinité augmentée pour au moins un récepteur du fragment Fc (FcR) choisi parmi les récepteurs Fc?RI (CD64), Fc?RIIIa (CD16a) et Fc?RIIa (CD32a), par rapport à celle du polypeptide parent, caractérisé en ce qu'il comprend: (i) les quatre mutations 334N, 352S, 378V et 397M; et (ii) au moins une mutation choisie parmi 434Y, 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T et 389K; la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.

Description

Variants avec fragment Fc ayant une affinité augmentée pour FcRn et une affinité
augmentée pour au moins un récepteur du fragment Fc La présente invention se rapporte à un polypeptide (appelé également variant) comprenant une région Fc mutée et présentant une affinité augmentée pour le récepteur FcRn ainsi qu'une affinité augmentée pour au moins un récepteur du fragment Fc (FcR) par rapport à un polypeptide parent.
Un anticorps est constitué d'un tétramère de chaînes lourdes et légères. Les deux chaînes légères sont identiques entre elles, et les deux chaînes lourdes sont identiques et reliées par des ponts disulfures. Il existe cinq types de chaînes lourdes (alpha, gamma, delta, epsilon, mu), qui déterminent les classes d'immunoglobulines (IgA, IgG, IgD, IgE, IgM). Le groupe de la chaîne légère comprend deux sous-types, lambda et kappa.
Les IgG sont des anticorps solubles qui peuvent être trouvés dans le sang et d'autres fluides corporels. L'IgG est une glycoprotéine en forme de Y avec un poids moléculaire approximatif de 150 kDa, composée de deux chaînes lourdes et deux chaînes légères.
Chaque chaîne se distingue en une région constante et une région variable. Les deux domaines carboxy-terminaux des chaînes lourdes forment le fragment Fc, tandis que les domaines amino-terminaux des chaînes lourdes et légères reconnaissent l'antigène et sont nommés fragment Fab.
Les protéines de fusion Fc sont créées par une combinaison d'un fragment Fc d'anticorps avec un domaine protéique qui fournit la spécificité pour une cible thérapeutique donnée.
Des exemples sont des combinaisons du fragment Fc avec tout type de protéines thérapeutiques ou leurs fragments.
Les polypeptides Fc, notamment les fragments Fc, les anticorps thérapeutiques et les protéines de fusion Fc, sont utilisés aujourd'hui pour traiter diverses maladies, comme la polyarthrite rhumatoïde, le psoriasis, la sclérose en plaques et de nombreuses formes de cancer. Des anticorps thérapeutiques peuvent être des anticorps monoclonaux ou polyclonaux. Les anticorps monoclonaux sont obtenus à partir d'une lignée cellulaire de production d'anticorps unique, qui montre une spécificité identique pour un seul antigène.
Les protéines de fusion Fc thérapeutiques sont utilisées ou développées comme médicaments contre les maladies autoimmunes et/ou à composante inflammatoire,

2 comme l'étanercept (Enbrel d'Amgen, qui est un récepteur TNF lié à un fragment Fc) ou Alefacept (Amevive de Biogen ldec, qui est LFA-3 lié à la portion Fc d'IgG1 humaine).
Les polypeptides Fc, tels que les fragments Fc, les anticorps et protéines de fusion Fc, ont notamment une activité dépendante de la liaison de leur partie Fc à leurs récepteurs, à savoir le FcRn et les récepteurs du fragment Fc (FcR), tels que les récepteurs FcyRI
(0D64), FcyRIlla (CD16a) et FcyRI la (CD32a).
L'un des effets recherchés dans les thérapies faisant intervenir les interactions de polypeptides Fc avec les récepteurs du fragment Fc (FcR), est une inhibition de l'activation du système immunitaire par liaison aux récepteurs Fc présents à
la surface des cellules effectrices. Notamment dans le cadre du traitement de maladies inflammatoires et/ou auto-immunes, impliquant des autoanticorps et/ou cytokines, les thérapies à base de fragments Fc peuvent agir par blocage des récepteurs Fc et ainsi par compétition avec les autoanticorps pour l'accès à ces récepteurs. Cela entraîne une inhibition des activités directes normalement médiées par les autoanticorps (par exemple cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps, cytotoxicité dépendante du complément, ou phagocytose cellulaire dépendante des anticorps) et une diminution de l'activation du système immunitaire, notamment du relargage de cytokines. De plus, le récepteur FcRn étant impliqué dans le recyclage des anticorps, leur blocage par les polypeptides Fc permet une élimination plus rapide des autoanticorps, entrainant ainsi une diminution de leur demi-vie. C'est pourquoi, les traitements à base de fragments Fc sont particulièrement adaptés aux maladies auto-immunes et/ou inflammatoires, déclenchées par des stimulations incontrôlées des cellules du système immunitaire, notamment par des autoanticorps et/ou des cytokines.
La thérapie de base proposée pour le traitement de ces maladies est une thérapie à base d'immunoglobulines intraveineuses (IgIV) qui consiste à administrer aux malades par voie intraveineuse des immunoglobulines (IgG le plus souvent) issues de pools de dons de plasma humain. Il est communément admis que ces IgIV agissent notamment en bloquant les récepteurs Fc et ainsi en entrant en compétition avec les autoanticorps pour l'accès à
ces récepteurs. Plus récemment, des fragments Fc ont été développés dans le but de modifier leurs propriétés de liaison aux récepteurs Fc. Néanmoins, leur efficacité reste à
démontrer.

3 Il existe toujours un besoin d'optimiser ces fragments Fc, de manière notamment à
augmenter leur temps de demi-vie, et/ou leur efficacité thérapeutique.
La Demanderesse a maintenant mis au point des fragments Fc particuliers, présentant une activité améliorée, notamment par une affinité de liaison au FcRn améliorée. Ces fragments Fc peuvent être utilisés en thérapie, et sont notamment adaptés pour le traitement des maladies inflammatoires et/ou auto-immunes, en vue d'apporter une meilleure efficacité au produit qui les contient.
En particulier, ces fragments peuvent présenter un blocage plus efficace des récepteurs Fc présents sur les cellules du système immunitaire, qui sont alors moins, ou ne sont plus, accessibles pour la liaison des autoanticorps, dont l'activité est alors inhibée.
De plus, les fragments Fc permettent de bloquer plus efficacement le récepteur FcRn et d'éliminer ainsi plus rapidement les autoanticorps.
En outre, certains de ces fragments Fc particuliers présentent, comme cela est démontré
en exemples, une meilleure inhibition de la cytotoxicité dépendante du complément (CDC) que les IgIV. Ils permettraient donc de diminuer la toxicité des autoanticorps pathogènes, tels que ceux qui sont impliqués dans les maladies inflammatoires et/ou auto-immunes.
La présente invention fournit ainsi un variant d'un polypeptide parent ayant des propriétés optimisées relatives à l'activité fonctionnelle médiée par la région Fc.
La présente invention se rapporte ainsi à un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une affinité augmentée pour le récepteur FcRn, et une affinité augmentée pour au moins un récepteur du fragment Fc (FcR) choisi parmi les récepteurs FcyRI (0D64), FcyRIlla (CD16a) et FcyRIla (CD32a), par rapport à
celle du polypeptide parent, caractérisé en ce qu'il comprend :
(i) les quatre mutations 334N, 352S, 378V et 397M ; et (ii) au moins une mutation choisie parmi 434Y, 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T et 389K;
la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.
Selon un mode de réalisation, le variant selon l'invention comprend en outre au moins une mutation (iii) dans le fragment Fc choisie parmi Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V2405, F241H, F241Y, L242A, L242F, L242G, L242H, L242I, L242K, L242P, L2425, L242T, L242V, F243L, F243S, E258G, E2581, E258R, E258M, E2580, E258Y, V2590, V259I, V259L, T260A, T260H, T260I, T260M, T260N, T260R, T2605, T260W,

4 V262S, V263T, V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S2670, S267V, K290D, K290E, K290H, K290L, K290N, K2900, K290R, K290S, K290Y, P291G, P2910, P291R, R292I, R292L, E293A, E293D, E293G, E293M, E2930, E293S, E293T, E294A, E294G, E294P, E2940, E294R, E294T, E294V, 02951, 0295M, Y296H, S298A, S298R, Y300I, Y300V, Y300W, R301A, R301M, R301P, R301S, V302F, V302L, V302M, V302R, V302S, V303S, V303Y, S304T, V305A, V305F, V3051, V305L, V305R et V305S, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.
Un tel variant est appelé variant selon l'invention , mutant selon l'invention ou polypeptide selon l'invention .
De préférence, le variant selon l'invention présente à la fois une affinité
augmentée pour le récepteur FcRn, et une affinité augmentée pour tous les récepteurs FcyRI
(0D64), FcyRIlla (CD16a) et FcyRI la (CD32a).
De préférence, en outre, le variant selon l'invention est capable d'inhiber la cytotoxicité
dépendante du complément (CDC), attribuée à une modification de liaison aux protéines du complément, en particulier le C1q. Cette inhibition est significativement améliorée par rapport à celle conférée par des IgIV.
De préférence, le variant selon l'invention est différent du variant consistant en un fragment Fc, notamment d'IgG1, présentant les cinq mutations N434Y, K334N, P352S, V397M et A378V, et produit en cellules HEK293, la numérotation étant celle de l'index EU
ou équivalent dans Kabat. Ainsi, de préférence, le variant selon l'invention est différent du fragment Fc, notamment d'IgG1, N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V produit en cellules HEK293, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.
Tout au long de la présente demande, la numérotation des résidus dans la région Fc est celle de la chaîne lourde d'immunoglobuline selon l'index EU ou équivalent dans Kabat et al. (Sequences of Proteins of lmmunological Interest, 5e éd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, dans le Maryland, 1991). L'expression index EU
ou équivalent dans Kabat fait référence à la numérotation EU des résidus de l'anticorps humain IgG1, IgG2, IgG3 ou IgG4. Cela est illustré sur le site IMGT
(http://www.imqt.orq/IMGTScientificChart/Numbering/Hu IGHGnber.html).

Par polypeptide ou protéine , on entend une séquence comprenant au moins acides aminés attachés de manière covalente.
Par acide aminé , on entend l'un des 20 acides aminés naturels ou des analogues non naturels.

5 Le terme position signifie une position dans la séquence d'un polypeptide. Pour la région Fc, les positions sont numérotées selon l'indice de l'UE ou équivalent dans Kabat.
Le terme anticorps est utilisé dans le sens commun. Il correspond à un tétramère qui comprend au moins une région Fc, et deux régions variables. Les anticorps comprennent notamment les immunoglobulines pleine longueur, les anticorps monoclonaux, les anticorps multi-spécifiques, les anticorps chimériques, les anticorps humanisés et les anticorps entièrement humains. La partie amino-terminale de chaque chaîne lourde comprend une région variable d'environ 100 à 110 acides aminés responsable de la reconnaissance de l'antigène. Dans chaque région variable, trois boucles sont rassemblées pour former un site de liaison à l'antigène. Chacune des boucles est appelée une région déterminant la complémentarité (ci-après dénommé un CDR ). La partie carboxy-terminale de chaque chaîne lourde définit une région constante principalement responsable de la fonction effectrice.
Les IgG ont plusieurs sous-classes, notamment IgG1, IgG2, IgG3 et IgG4. Les sous-classes d'IgM sont notamment IgM1 et IgM2. Ainsi, par isotype , on entend l'une des sous-classes d'immunoglobulines définies par les caractéristiques chimiques et antigéniques de leurs régions constantes. Les isotypes connus d'immunoglobulines humaines sont les IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM1, IgM2, IgD et IgE.
Les IgG pleine longueur sont des tétramères et se composent de deux paires identiques de deux chaînes d'immunoglobulines, chaque paire ayant une chaîne légère et une chaîne lourde, chaque chaîne légère comprenant les domaines VL et CL, et chaque chaîne lourde comprenant les domaines VH, Cy1 (aussi appelé CH1), Cy2 (également appelé CH2), et Cy3 (également appelé CH3). Dans le cadre d'une IgG1 humaine, CH1 fait référence aux positions 118 à 215, CH2 renvoie aux positions 231 à 340 et CH3 se réfère aux positions 341 à 447 selon l'index EU ou équivalent dans Kabat.
La chaîne lourde des IgG comprend également un domaine charnière flexible N-terminal qui se réfère aux positions 216 à 230 dans le cas d'IgG1. Le domaine charnière inférieur se réfère aux positions 226 à 230 selon l'index EU ou équivalent dans Kabat.
Par "région variable", on entend la région d'une immunoglobuline qui comprend un ou plusieurs domaines Ig sensiblement codés par l'un quelconque des gènes VK, VA
et/ou VH qui composent les chaînes kappa, lambda, et lourde d'immunoglobuline,

6 respectivement. Les régions variables comprennent les régions déterminant la complémentarité (CDR) et les régions charpente (FR).
Le terme "Fe" ou "région Fe" désigne la région constante d'un anticorps à
l'exclusion du premier domaine de région constante d'immunoglobuline (CH1). Ainsi Fc fait référence aux deux derniers domaines (CH2 et CH3) de région constante d'IgG1, et à la charnière flexible N-terminale de ces domaines. Pour une IgG1 humaine, la région Fc correspond au résidu 0226 jusqu'à son extrémité carboxy-terminale, soit les résidus de la position 226 à 447, où la numérotation est selon l'index EU ou équivalent dans Kabat.
La région Fe utilisée peut comprendre en outre une partie de la région charnière supérieure, située entre les positions 216 à 226 selon l'index EU ou équivalent dans Kabat ; dans ce cas, la région Fc utilisée correspond aux résidus de la position 216 à 447, 217 à 447, 218 à 447, 219 à 447, 220 à 447, 221 à 447, 222 à 447, 223 à 447, 224 à 447 ou 225 à 447, où la numérotation est selon l'index EU ou équivalent dans Kabat. De préférence dans ce cas, la région Fc utilisée correspond aux résidus de la position 216 à 447, où la numérotation est selon l'index EU ou équivalent dans Kabat.
De préférence, la région Fc utilisée est choisie parmi les séquences SEQ ID NO
:1 à 10 et 14.
Par polypeptide parent , on entend un polypeptide de référence. Ledit polypeptide parent peut être d'origine naturelle ou synthétique. Dans le contexte de la présente invention, le polypeptide parent comprend une région Fc, appelée région Fc parente .
Cette région Fc peut être choisie parmi le groupe de régions Fc de type sauvage, leurs fragments et leurs mutants. De préférence, le polypeptide parent comprend un fragment Fc humain, de préférence un fragment Fc d'une IgG1 humaine ou d'une IgG2 humaine.
Le polypeptide parent peut comprendre des modifications d'acides aminés préexistantes dans la région Fc (par exemple un mutant Fc) par rapport à des régions Fc de type sauvage.
Avantageusement, le polypeptide parent est une région Fc isolée (i.e. un fragment Fc en tant que tel), une séquence dérivée d'une région Fc isolée, un anticorps, un fragment d'anticorps comprenant une région Fc, une protéine de fusion comprenant une région Fc ou un conjugué Fc, cette liste n'étant pas limitative.
Par séquence dérivée d'une région Fc isolée , on entend une séquence comprenant au moins deux régions Fc isolées liées entre elles, telle qu'un scFc (single chain Fc) ou un multimère Fe. Par protéine de fusion comprenant une région Fc , on entend une séquence polypeptidique fusionnée à une région Fc, ladite séquence polypeptidique étant

7 de préférence choisie parmi les régions variables de tout anticorps, les séquences de liaison d'un récepteur à son ligand, les molécules d'adhésion, les ligands, les enzymes, les cytokines et les chimiokines. Par conjugué Fc , on entend un composé
qui est le résultat du couplage chimique d'une région Fc avec un partenaire de conjugaison. Le partenaire de conjugaison peut être protéique ou non protéique. La réaction de couplage utilise généralement des groupes fonctionnels sur la région Fc et le partenaire de conjugaison. Divers groupes de liaison sont connus dans l'art antérieur comme étant appropriés pour la synthèse d'un conjugué; par exemple, des groupes de liaison homo-ou hétérobifonctionnels sont bien connus (voir, catalogue Pierce Chemical Company, 2005-2006, section technique sur des agents de réticulation, pages 321-350). Parmi les partenaires de conjugaison appropriés, on peut citer les protéines thérapeutiques, les étiquettes, les agents cytotoxiques tels que les agents chimiothérapeutiques, les toxines et leurs fragments actifs. Les toxines appropriées et leurs fragments incluent notamment la toxine de la diphtérie, l'exotoxine A, la ricine, l'abrine, la saporine, la gélonine, la calichéamicine, les auristatines E et F et la mertansine.
Avantageusement, le polypeptide parent ¨ et donc le polypeptide selon l'invention ¨
consiste en une région Fc.
Avantageusement, le polypeptide parent ¨ et donc le polypeptide selon l'invention ¨ est un anticorps.
Par mutation , on entend un changement d'au moins un acide aminé de la séquence d'un polypeptide, notamment un changement d'au moins un acide aminé de la région Fc du polypeptide parent. Le polypeptide muté ainsi obtenu est un polypeptide variant ; c'est un polypeptide selon l'invention. Un tel polypeptide comprend une région Fc mutée, par rapport au polypeptide parent. De préférence, la mutation est une substitution, une insertion ou une délétion d'au moins un acide aminé.
Par substitution , on entend le remplacement d'un acide aminé à une position particulière dans une séquence de polypeptide parent par un autre acide aminé.
Par exemple, la substitution N434S se réfère à un polypeptide variant, en l'occurrence un variant pour lequel l'asparagine à la position 434 est remplacé par la sérine.
Par "insertion d'acide aminé" ou "insertion", on entend l'addition d'un acide aminé à une position particulière dans une séquence de polypeptide parent. Par exemple, l'insertion G>235-236 désigne une insertion de glycine entre les positions 235 et 236.

8 Par délétion d'acides aminés ou délétion , on entend la suppression d'un acide aminé à une position particulière dans une séquence de polypeptide parent. Par exemple, E294del désigne la suppression de l'acide glutamique en position 294.
De préférence, le libellé suivant de mutation est utilisé: 434S ou N434S
, et signifie que le polypeptide parent comprend l'asparagine en position 434, qui est remplacée par la sérine dans le variant. Dans le cas d'une combinaison de substitutions, le format préféré
est le suivant: 259I/315D/434Y ou V259I/N315D/N434Y . Cela signifie qu'il existe trois substitutions dans le variant, en positions 259, 315 et 434, et que l'acide aminé en position 259 du polypeptide parent, à savoir la valine, est remplacé par l'isoleucine, que l'acide aminé en position 315 du polypeptide parent, soit l'asparagine, est remplacé par l'acide aspartique et que l'acide aminé en position 434 du polypeptide parent, soit l'asparagine, est remplacé par la tyrosine.
Par FcRn ou récepteur Fc néonatal tel qu'utilisé ici, on entend une protéine qui se lie à la région Fc des IgG et est codée au moins en partie par un gène FcRn. Comme cela est connu dans la technique, la protéine FcRn fonctionnelle comprend deux polypeptides, souvent désignés sous le nom de chaîne lourde et de chaîne légère. La chaîne légère est la bêta-2-microglobuline et la chaîne lourde est codée par le gène FcRn. Sauf indication contraire ici, FcRn ou protéine FcRn se réfère au complexe de la chaîne a avec la bêta-2-microglobuline. Chez l'homme, le gène codant pour le FcRn est appelé FCGRT.
De préférence, le variant selon l'invention présente une affinité augmentée pour le récepteur FcRn, par rapport à celle du polypeptide parent, d'un ratio au moins égal à 2, de préférence supérieur à 5, de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur à 15, de préférence supérieur à 20, de préférence supérieur à 25, de préférence supérieur à 30.
De préférence, le variant selon l'invention présente une demi-vie augmentée par rapport à
celle du polypeptide parent. De préférence, le variant selon l'invention présente une demi-vie augmentée par rapport à celle du polypeptide parent, d'un ratio au moins égal à 2, de préférence supérieur à 5, de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur à 15, de préférence supérieur à 20, de préférence supérieur à 25, de préférence supérieur à 30.
L'une des fonctions majeures du FcRn est connue sous le nom de recyclage des IgG. Elle consiste à extraire les IgG de la voie du catabolisme endothélial des protéines plasmatiques pour les restituer intactes dans la circulation. Ce recyclage explique leur

9 demi-vie longue dans des conditions physiologiques normales (trois semaines pour les IgG), tout en permettant le maintien de concentrations plasmatiques élevées.
La transcytose des IgG d'un pôle à l'autre des épithéliums ou des endothéliums est la deuxième fonction majeure du FcRn permettant d'assurer leur biodistribution dans l'organisme.
De préférence, le variant selon l'invention présente une affinité augmentée pour au moins un récepteur du fragment Fc (FcR) choisi parmi les récepteurs FcyRI (0D64), FcyRIlla (CD16a) et FcyRIla (CD32a), par rapport à celle du polypeptide parent, d'un ratio au moins égal à 2, de préférence supérieur à 5, de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur à 15, de préférence supérieur à 20, de préférence supérieur à 25, de préférence supérieur à 30.
Le récepteur FcyRI (0D64) est impliqué dans la phagocytose et l'activation cellulaire. Le récepteur FcyRIlla (CD16a) est également impliqué dans l'activité dépendante du fragment Fc, notamment l'ADCC et la phagocytose ; il présente un polymorphisme V/F en position 158. Le récepteur FcyRIla (CD32a) est, quant à lui, impliqué dans l'activation plaquettaire et la phagocytose ; il présente un polymorphisme H/R en position 131.
De préférence, le variant selon l'invention présente à la fois une affinité
augmentée pour le récepteur FcRn, et une affinité augmentée pour tous les récepteurs FcyRI
(0D64), FcyRIlla (CD16a) et FcyRI la (CD32a).
L'affinité d'un polypeptide comprenant une région Fc pour un FcR peut être évaluée par des procédés bien connus de l'art antérieur. Par exemple, l'homme de l'art peut déterminer l'affinité (Kd) en utilisant la résonance plasmonique de surface (SPR).
Alternativement, l'homme de l'art peut effectuer un test ELISA approprié. Un dosage ELISA approprié permet de comparer les forces de liaison du Fc parent et du Fc muté.
Les signaux détectés spécifiques du Fc muté et du Fc parent sont comparés.
L'affinité de liaison peut être indifféremment déterminée en évaluant les polypeptides entiers ou en évaluant les régions Fc isolées de ceux-ci. Alternativement, l'homme de l'art peut effectuer un test compétitif approprié. Un test compétitif approprié permet de déterminer la capacité du Fc muté à inhiber la liaison d'un ligand marqué du FcR lorsque ceux-ci sont incubés simultanément avec des cellules exprimant ces récepteurs. La liaison du ligand marqué au FcR est évaluée par exemple par cytométrie en flux. L'affinité de liaison des Fc mutés aux FcR est alors déterminée en évaluant la variabilité de l'intensité moyenne de fluorescence émise par le ligand marqué lié aux FcR.
De préférence, la région Fc mutée du polypeptide selon l'invention comprend de 3 à 20 5 mutations par rapport au polypeptide parent, de préférence de 4 à 20 mutations. Par de 3 à 20 modifications d'acides aminés , on englobe 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 et 20 mutations d'acides aminés. De préférence, elle comprend de 4 à
mutations, de préférence de 4 à 10 mutations par rapport au polypeptide parent.
Plus préférentiellement, la région Fc mutée du polypeptide selon l'invention comprend au

10 moins une combinaison de 5 mutations, ladite combinaison comprenant les quatre mutations (i) telles que décrites ci-dessus, et au moins une mutation (ii) telle que décrite ci-dessus la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.
Plus préférentiellement, la région Fc mutée du polypeptide selon l'invention comprend une 15 combinaison de 6 mutations, ladite combinaison comprenant les quatre mutations (i) telles que décrites ci-dessus, au moins une mutation (ii) telle que décrite ci-dessus, et au moins une mutation (iii) telle que décrite ci-dessus, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.
De préférence, la région Fc mutée du polypeptide selon l'invention comprend les mutations suivantes:
(i) les quatre mutations 334N, 352S, 378V et 397M;
(ii) au moins une mutation choisie parmi 434Y 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T et 389K; et lorsqu'une mutation (iii) est présente, elle est choisie parmi K290G et Y296W, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.
De préférence, la région Fc mutée du polypeptide selon l'invention comprend les mutations suivantes:
(i) les quatre mutations 334N, 352S, 378V et 397M;
(ii) au moins une mutation choisie parmi 434Y 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T et 389K; et (iii) au moins une mutation choisie parmi K290G et Y296W, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.

11 De préférence, la région Fc mutée du polypeptide selon l'invention comprend une combinaison de mutations choisie parmi les combinaisons :
N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V et N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V/Y296W.
De préférence, le polypeptide selon l'invention est produit dans des cellules épithéliales mammaires de mammifères non humains transgéniques.
De préférence, le polypeptide selon l'invention est produit dans des animaux transgéniques non humains, de préférence dans des mammifères non humains transgéniques, plus préférentiellement dans leurs cellules épithéliales mammaires.
Par mammifère non humain transgénique , on entend un mammifère notamment choisi parmi les bovins, les porcins, les chèvres, les ovins et les rongeurs, de préférence parmi la chèvre, la souris, la truie, la lapine, la brebis et la vache. De préférence, l'animal transgénique non humain ou le mammifère transgénique non humain est une chèvre transgénique.
De préférence, le variant selon l'invention comprend au moins les cinq mutations N434Y, K334N, P352S, V397M et A378V dans son fragment Fe, et est produit dans des cellules épithéliales mammaires de mammifères non humains transgéniques, ou bien dans des animaux transgéniques non humains, de préférence dans des mammifères non humains transgéniques, telle qu'une chèvre. Un tel variant présente à la fois une affinité
augmentée pour le récepteur FeRn, et une affinité augmentée pour tous les récepteurs FeyRI (0D64), FeyRIlla (CD16a) et FeyRI la (CD32a).
Ainsi, de préférence, le variant selon l'invention est le variant Fc N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V produit dans des cellules épithéliales mammaires de mammifères non humains transgéniques. Alternativement, de préférence, le variant selon l'invention est le variant Fc N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V produit dans des animaux transgéniques non humains, de préférence dans des mammifères non humains transgéniques, telle qu'une chèvre. Un tel variant présente à la fois une affinité
augmentée pour le récepteur FeRn, et une affinité augmentée pour tous les récepteurs FeyRI (0D64), FeyRIlla (CD16a) et FeyRIla (CD32a). De préférence, le variant selon l'invention comprend la séquence SEQ ID NO :11 ou la séquence SEQ ID NO :15.
Alternativement, de préférence, le variant selon l'invention est le variant Fc N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V/Y296W produit dans des cellules épithéliales

12 mammaires de mammifères non humains transgéniques. Alternativement, de préférence, le variant selon l'invention est le variant Fc produit dans des animaux transgéniques non humains, de préférence dans des mammifères non humains transgéniques, telle qu'une chèvre. Un tel variant présente à la fois une affinité augmentée pour le récepteur FcRn, et une affinité augmentée pour tous les récepteurs FcyRI (0D64), FcyRIlla (CD16a) et FcyRI la (CD32a).
De préférence, le procédé de production d'un variant selon l'invention comprend l'expression dudit variant dans des cellules épithéliales mammaires de mammifères non humains transgéniques.
Ainsi, la présente invention a également pour objet un procédé de production d'un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une affinité
augmentée pour le récepteur FcRn, et une affinité augmentée pour au moins un récepteur du fragment Fc (FcR) choisi parmi les récepteurs FcyRI (0D64), FcyRIlla (CD16a) et FcyRIla (CD32a), par rapport à celle du polypeptide parent, ledit variant comprenant :
(i) les quatre mutations 334N, 352S, 378V et 397M ; et (ii) au moins une mutation choisie parmi 434Y, 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T et 389K ; et la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat, ledit procédé comprenant l'expression dudit variant dans des cellules épithéliales mammaires de mammifères non humains transgéniques.
De préférence, ledit variant comprend en outre au moins une mutation (iii) dans le fragment Fc choisie parmi Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V240S, F241 H, F241Y, L242A, L242F, L242G, L242H, L242I, L242K, L242P, L242S, L242T, L242V, F243L, F243S, E258G, E2581, E258R, E258M, E2580, E258Y, V2590, V259I, V259L, T260A, T260H, T260I, T260M, T260N, T260R, T260S, T260W, V262S, V263T, V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S2670, S267V, K290D, K290E, K290H, K290L, K290N, K2900, K290R, K290S, K290Y, P291G, P2910, P291R, R292I, R292L, E293A, E293D, E293G, E293M, E2930, E293S, E293T, E294A, E294G, E294P, E2940, E294R, E294T, E294V, 02951, 0295M, Y296H, S298A, S298R, Y300I, Y300V, Y300W, R301A, R301M, R301P, R301S, V302F, V302L, V302M, V302R, V302S, V303S, V303Y, S304T, V305A, V305F, V305I, V305L, V305R et V305S, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.

13 En particulier, un tel procédé comprend les étapes suivantes :
a) préparation d'une séquence d'ADN comprenant une séquence codant pour le variant, une séquence codant pour un promoteur de caséine de mammifère ou un promoteur de lactosérum de mammifère, et une séquence codant pour un peptide signal permettant la sécrétion dudit variant ;
b) introduction de la séquence d'ADN obtenue en a) dans un embryon de mammifère non humain, afin d'obtenir un mammifère non humain transgénique exprimant le variant codé
par ladite séquence d'ADN obtenue en a) dans la glande mammaire ; et c) récupération du variant dans le lait produit par le mammifère non humain transgénique obtenu en b).
L'étape a) comprend ainsi la préparation d'une séquence d'ADN comprenant une séquence codant pour le variant, une séquence codant pour un promoteur de caséine de mammifère ou un promoteur de lactosérum de mammifère, et une séquence codant pour un peptide signal permettant la sécrétion dudit variant. Une telle étape est illustrée en figure 1.
La séquence codant le variant est une séquence d'ADN codant pour le variant selon l'invention.
Par exemple ce variant a pour séquence SEQ ID NO :11. Avec le peptide signal, la séquence correspondante est la séquence SEQ ID NO :13.
Selon un autre exemple, ce variant a pour séquence SEQ ID NO :15. Avec le peptide signal, la séquence correspondante est la séquence SEQ ID NO :16.
La séquence codant pour un promoteur de caséine de mammifère ou un promoteur de lactosérum de mammifère, permet d'exprimer le variant dans le lait. L'homme du métier sait choisir un tel promoteur.
Dans le cadre de la présente demande, un peptide signal est une séquence d'acides aminés, de préférence de 2 à 30 acides aminés, située à l'extrémité N-terminale du variant de polypeptide Fc, servant à adresser celui-ci dans le lait du mammifère hôte. De préférence, la séquence codant pour un peptide signal est interposée entre la séquence codant pour le variant et le promoteur. Sans une telle séquence, le variant resterait dans le tissu mammaire, et la purification serait difficile et exigerait le sacrifice de l'animal hôte.
Le peptide signal peut être clivé lors de la sécrétion. La séquence codant pour le peptide

14 signal peut être celle qui est naturellement associée à un polypeptide parent selon l'invention. Alternativement, la séquence codant pour le peptide signal peut être celle de la protéine de lait dont est issu le promoteur, à savoir, lorsque le gène de la protéine de lait est digéré en vue d'isoler le promoteur, un fragment d'ADN est sélectionné
comprenant à la fois le promoteur et la séquence codante le peptide signal directement en aval du promoteur. Une autre alternative consiste à utiliser une séquence signal dérivée d'une autre protéine sécrétée qui n'est ni la protéine de lait normalement exprimée à partir du promoteur, ni un polypeptide selon l'invention.
De préférence, le peptide signal a pour séquence SEQ ID NO :12.
La séquence d'ADN utilisée peut comprendre des codons optimisés.
L'optimisation de codon a pour but de remplacer les codons naturels par des codons dont les ARN de transfert (ARNt) portant les acides aminés sont les plus fréquents dans le type cellulaire considéré. Le fait de mobiliser des ARNt fréquemment rencontrés à
pour avantage majeur d'accroitre la vitesse de traduction des ARN messagers (ARNm) et donc d'augmenter le titre final (Carton JM et al, Protein Expr Purif, 2007).
L'optimisation de séquence joue aussi sur la prédiction des structures secondaires d'ARNm qui pourrait ralentir la lecture par le complexe ribosomal. L'optimisation de séquence a également un impact sur le pourcentage de G/C qui est directement lié à la demi-vie des ARNm et donc à leur potentiel d'être traduit (Chechetkin, J. of theoretical biology 242, 2006 922-934).
L'optimisation de codons peut être faite par substitution des codons naturels en utilisant des tables de fréquence des codons (codon Usage Table) pour mammifères et plus particulièrement pour Homo sapiens. Il existe des algorithmes présents sur internet et mis à disposition par les fournisseurs de gènes de synthèse (DNA2.0, GeneArt, MWG, Genscript) qui permettent de faire cette optimisation de séquence.
De préférence, l'étape a) est comprend les étapes suivantes :
(al) préparation d'une séquence d'ADN comprenant une séquence codant pour le variant selon l'invention, directement fusionnée à son extrémité N-terminale à
une séquence codant pour un peptide signal permettant la sécrétion dudit variant ;
(a2) introduction de la séquence d'ADN obtenue en (al) dans un vecteur comprenant une séquence codant pour un promoteur de caséine de mammifère ou un promoteur de lactosérum de mammifère ;
(a3) digestion dudit vecteur obtenu en (a2), afin d'obtenir une séquence d'ADN
comprenant la séquence codant pour un promoteur de caséine de mammifère ou un promoteur de lactosérum de mammifère, et la séquence d'ADN comprenant une séquence codant pour le variant selon l'invention directement fusionnée à son extrémité N-terminale à une séquence codant pour un peptide signal.
5 En d'autres termes, de préférence, à la fin de l'étape a), on obtient une séquence d'ADN
comprenant, de l'extrémité N- à C-terminale, la séquence codant pour un promoteur de caséine de mammifère ou un promoteur de lactosérum de mammifère, fusionnée à
la séquence codant pour un peptide signal, elle-même fusionnée à la séquence codant pour le variant selon l'invention.
Ensuite, le procédé selon l'invention comprend une étape b) d'introduction de la séquence d'ADN obtenue en a) dans un embryon de mammifère non humain, afin d'obtenir un mammifère non humain transgénique exprimant le variant codé par ladite séquence d'ADN obtenue en a) dans la glande mammaire.
Enfin, le procédé selon l'invention comprend une étape c) de récupération du variant dans le lait produit par le mammifère non humain transgénique obtenu en b).
Les étapes b) et c) sont connues de l'art antérieur, notamment du brevet EP0264166.
De préférence, un tel procédé comprend, après l'étape c), une étape de purification d) du lait récupéré. L'étape de purification d) peut être réalisée par toute méthode connue de l'art antérieur, notamment par purification sur protéine A. Une fois encore, une telle étape est notamment décrite dans le brevet EP0264166.
La présente invention a également pour objet une séquence d'ADN comprenant un gène codant un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une affinité augmentée pour le récepteur FcRn, et une affinité
augmentée pour au moins un récepteur du fragment Fc (FcR) choisi parmi les récepteurs FcyRI
(CD64), FcyRIlla (CD16a) et FcyRIla (CD32a), par rapport à celle du polypeptide parent, ledit variant comprenant :
(i) les quatre mutations 334N, 352S, 378V et 397M ; et (ii) au moins une mutation choisie parmi 434Y 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T et 389K;
la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat, ledit gène étant sous le contrôle d'un promoteur de transcription de la caséine ou du lactosérum de mammifère qui ne contrôle pas naturellement la transcription dudit gène, ladite séquence d'ADN comprenant en outre une séquence codant pour un peptide signal permettant la sécrétion dudit variant, interposée entre la séquence codant pour le variant et le promoteur.
Dans un mode de réalisation particulier, ledit variant comprenant en outre au moins une mutation (iii) dans le fragment Fc choisie parmi Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V240S, F241H, F241Y, L242A, L242F, L242G, L242H, L242I, L242K, L242P, L242S, L242T, L242V, F243L, F243S, E258G, E2581, E258R, E258M, E2580, E258Y, V2590, V259I, V259L, T260A, T260H, T260I, T260M, T260N, T260R, T260S, T260W, V262S, V263T, V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S2670, S267V, K290D, K290E, K290H, K290L, K290N, K2900, K290R, K290S, K290Y, P291G, P2910, P291R, R292I, R292L, E293A, E293D, E293G, E293M, E2930, E293S, E293T, E294A, E294G, E294P, E2940, E294R, E294T, E294V, 02951, 0295M, Y296H, S298A, S298R, Y300I, Y300V, Y300W, R301A, R301M, R301P, R301S, V302F, V302L, V302M, V302R, V302S, V303S, V303Y, S304T, V305A, V305F, V305I, V305L, V305R et V305S, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.
La présente invention a également pour objet une séquence d'ADN comprenant un gène codant un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une affinité augmentée pour le récepteur FcRn, et une affinité
augmentée pour au moins un récepteur du fragment Fc (FcR) choisi parmi les récepteurs FcyRI
(0D64), FcyRIlla (CD16a) et FcyRIla (CD32a), par rapport à celle du polypeptide parent, ledit variant comprenant :
(i) les quatre mutations 334N, 352S, 378V et 397M ; et (ii) au moins une mutation choisie parmi 434Y 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T et 389K;
la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat, ladite séquence d'ADN comprenant optionnellement une séquence codant pour un peptide signal permettant la sécrétion dudit variant.
Dans un mode de réalisation particulier, ledit variant comprenant en outre au moins une mutation (iii) dans le fragment Fc choisie parmi Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V240S, F241H, F241Y, L242A, L242F, L242G, L242H, L242I, L242K, L242P, L242S, L242T, L242V, F243L, F243S, E258G, E2581, E258R, E258M, E2580, E258Y, V2590, V259I, V259L, T260A, T260H, T260I, T260M, T260N, T260R, T260S, T260W, V262S, V263T, V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S2670, S267V, K290D, K290E, K290H, K290L, K290N, K2900, K290R, K290S, K290Y, P291G, P2910, P291R, R292I, R292L, E293A, E293D, E293G, E293M, E2930, E293S, E293T, E294A, E294G, E294P, E2940, E294R, E294T, E294V, 02951, 0295M, Y296H, S298A, S298R, Y300I, Y300V, Y300W, R301A, R301M, R301P, R301S, V302F, V302L, V302M, V302R, V302S, V303S, V303Y, S304T, V305A, V305F, V305I, V305L, V305R et V305S, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat, Alternativement, le polypeptide selon l'invention peut être produit dans des cellules de mammifère en culture. Les cellules préférées sont la lignée de rat YB2/0, la lignée de hamster CHO, en particulier les lignées CHO dhfr- et CHO Lec13, les cellules PER.C6TM
(Crucell), NSO, SP2/0, les cellules HeLa, BHK ou COS, les cellules HEK293. De préférence, on utilise la lignée de hamster CHO.
Ainsi, la présente invention a également pour objet un procédé de production d'un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une affinité
augmentée pour le récepteur FcRn, et une affinité augmentée pour au moins un récepteur du fragment Fc (FcR) choisi parmi les récepteurs FcyRI (0D64), FcyRIlla (CD16a) et FcyRIla (CD32a), par rapport à celle du polypeptide parent, ledit variant comprenant :
(i) les quatre mutations 334N, 352S, 378V et 397M ; et (ii) au moins une mutation choisie parmi 434Y 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T et 389K ; et la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat, ledit procédé comprenant l'expression dudit variant dans des cellules de mammifère en culture.
Dans un mode de réalisation particulier, ledit variant comprenant en outre au moins une mutation (iii) dans le fragment Fc choisie parmi Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V240S, F241H, F241Y, L242A, L242F, L242G, L242H, L242I, L242K, L242P, L242S, L242T, L242V, F243L, F243S, E258G, E2581, E258R, E258M, E2580, E258Y, V2590, V259I, V259L, T260A, T260H, T260I, T260M, T260N, T260R, T260S, T260W, V262S, V263T, V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S2670, S267V, K290D, K290E, K290H, K290L, K290N, K2900, K290R, K290S, K290Y, P291G, P2910, P291R, R292I, R292L, E293A, E293D, E293G, E293M, E2930, E293S, E293T, E294A, E294G, E294P, E2940, E294R, E294T, E294V, 02951, 0295M, Y296H, S298A, S298R, Y300I, Y300V, Y300W, R301A, R301M, R301P, R301S, V302F, V302L, V302M, V302R, V302S, V303S, V303Y, S304T, V305A, V305F, V305I, V305L, V305R et V305S, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat, En particulier, un tel procédé comprend les étapes suivantes :
a) préparation d'une séquence d'ADN codant pour le variant;
b) introduction de la séquence d'ADN obtenue en a) dans des cellules de mammifère en culture. L'introduction peut être effectuée de façon transitoire ou stable (i.e. intégration de la séquence d'ADN obtenue en a) dans le génome des cellules) ; et c) expression du variant à partir des cellules obtenues en b), puis d) optionnellement, récupération du variant dans le milieu de culture.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant (i) un polypeptide selon l'invention, et (ii) au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant (i) le variant consistant en un fragment Fc, notamment d'IgG1, présentant les cinq mutations N434Y, K334N, P352S, V397M et A378V, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat, et (ii) au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. De préférence, la composition de la présente invention comprend (i) le variant consistant en un fragment Fc, notamment d'IgG1, présentant les six mutations N434Y, K334N, P352S, V397M et A378V, Y296W, la numérotation étant celle de l'index EU
ou équivalent dans Kabat, et (ii) au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention a également pour objet le polypeptide selon l'invention ou la composition telle que décrite précédemment, pour son utilisation comme médicament.
La présente invention a également pour objet l'utilisation du variant consistant en un fragment Fc, notamment d'IgG1, présentant les cinq mutations N434Y, K334N, P352S, V397M et A378V, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat (i.e.
variant N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V), comme médicament. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention a également pour objet l'utilisation du variant consistant en un fragment Fc, notamment d'IgG1, présentant les six mutations N434Y, Y296W, K334N, P352S, V397M, A378V, et Y296W, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat (i.e. variant N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V/Y296W), comme médicament.
Comme indiqué précédemment, avantageusement, le polypeptide parent ¨ et donc le polypeptide selon l'invention ¨ est un anticorps. Dans ce cas, l'anticorps peut être dirigé
contre un antigène choisi parmi un antigène tumoral, un antigène viral, un antigène bactérien, un antigène fongique, une toxine, une cytokine membranaire ou circulante et un récepteur membranaire.
Lorsque l'anticorps est dirigé contre un antigène tumoral, son utilisation convient particulièrement dans le traitement de cancers. Par cancer , on entend toute condition physiologique caractérisée par une prolifération anormale des cellules. Des exemples de cancers incluent notamment les carcinomes, les lymphomes, les blastomes, les sarcomes (incluant les liposarcomes), les tumeurs neuroendocrines, les mésothéliomes, les méningiomes, les adénocarcinomes, les mélanomes, les leucémies et les pathologies lymphoïdes malignes, cette liste n'étant pas exhaustive.
Lorsque l'anticorps est dirigé contre un antigène viral, son utilisation convient particulièrement dans le traitement des infections virales. Les infections virales sont notamment des infections dues au VIH, à un rétrovirus, à un virus Coxsackie, au virus de la variole, de la grippe, de la fièvre jaune, du Nil occidental, à un cytomégalovirus, à un rotavirus ou au virus de l'hépatite B ou C, cette liste n'étant pas exhaustive.
Lorsque l'anticorps est dirigé contre une toxine, son utilisation convient particulièrement dans le traitement des infections bactériennes, par exemple les infections par la toxine tétanique, la toxine diphtérique, les toxines du charbon Bacillus anthracis, ou encore dans le traitement des infections par les toxines botuliques, les toxines de la ricine, les shigatoxines, cette liste n'étant pas exhaustive.
Lorsque l'anticorps est dirigé contre une cytokine, son utilisation convient particulièrement dans le traitement des maladies inflammatoires et/ou auto-immunes. Les maladies inflammatoires et/ou auto-immunes incluent notamment le purpura thrombotique thrombocytopénique (PTI), le rejet de greffes ou d'organes, la maladie du greffon contre l'hôte, la polyarthrite rhumatoïde, le lupus érythémateux disséminé, les différents types de sclérose, le syndrome de Sjôgren primitif (ou syndrome de Gougerot-Sjôgren), les polyneuropathies auto-immunes comme la sclérose en plaques, le diabète de type I, les hépatites auto-immunes, la spondylarthrite ankylosante, le syndrome de Reiter, l'arthrite de goutte, la maladie coeliaque, la maladie de Crohn, la thyroïdite chronique d'Hashimoto (hypothyroïdie), la maladie d'Adisson, les hépatites auto-immunes, la maladie de Basedow (hyperthyroïdie), la colite ulcérative, les vascularites comme les vascularites systémiques associées aux ANCA (anticorps anti-cytoplasme des neutrophiles), les cytopénies auto-immunes et autres complications hématologiques de l'adulte et de l'enfant, telles que les thrombopénies auto-immunes aiguës ou chroniques, les anémies 5 hémolytiques auto-immunes, la maladie hémolytique du nouveau-né (MHN), la maladie des agglutinines froides, l'hémophilie acquise auto-immune ; le syndrome de Goodpasture, les néphropathies extra-membraneuses, les affections cutanées bulleuses auto-immunes, la myasthénie réfractaire, les cryoglobulinémies mixtes, le psoriasis, l'arthrite chronique juvénile, les myosites inflammatoires, les dermatomyosites et les 10 affections systémiques auto-immunes de l'enfant incluant le syndrome des antiphospholipides, la maladie des tissus conjonctifs, l'inflammation auto-immune pulmonaire, le syndrome Guillain-Barré, la polyradiculonévrite inflammatoire demyélisante chronique (PDCI), la thyroïdite auto-immune, le mellitis, le myasthenia gravis, la maladie autoimmune inflammatoire de l'oeil, la neuromyélite optique (maladie de Devic), les

15 sclérodermies, le pemphigus, le diabète par insulinorésistance, la polymyosite, l'anémie de Biermer, la glomérulonéphrite, la maladie de Wegener, la maladie de Horton, la périarthrite noueuse et le syndrome de Churg et Strauss, la maladie de Still, la polychondrite atrophiante, la maladie de Behçet, la gammapathie monoclonale, la granulomatose de Wegener, le lupus, la rectocolite hémorragique, le rhumatisme 20 psoriasique, la sarcoïdose, la colite collagène, la dermatite herpétiforme, la fièvre méditerranéenne familiale, la glomérulonéphrite à dépôts d'IgA, le syndrome myasthénique de Lambert-Eaton, l'ophtalmie sympathique, le syndrome de Fiessinger-Leroy-Reiter et le syndrome uvéo-méningo-encéphalique.
D'autres maladies inflammatoires sont également comprises, comme par exemple le syndrome de détresse respiratoire aiguë (ARDS), l'arthrite septique aiguë, l'arthrite adjuvante, l'encéphalomyélite allergique, la rhinite allergique, la vasculite allergique, l'allergie, l'asthme, l'athérosclérose, l'inflammation chronique due à des infections bactériennes ou virales chroniques, la bronchopneumopathie chronique obstructive (MPOC), les maladies coronariennes, l'encéphalite, les maladies inflammatoires de l'intestin, l'ostéolyse inflammatoire, l'inflammation associée à des réactions d'hypersensibilité aiguë et retardée, l'inflammation associée à des tumeurs, une lésion nerveuse périphérique ou des maladies démyélinisantes, une inflammation associée à un traumatisme des tissus tels que les brûlures et l'ischémie, l'inflammation due à une méningite, le syndrome de défaillance multiviscérale (multiple organ dysfunction syndrome, MODS), la fibrose pulmonaire, la septicémie et le choc septique, le syndrome de Stevens-Johnson, l'arthrite indifférenciée, et les spondylarthropathies indifférenciées.
Dans un mode de réalisation particulier de l'invention, la maladie auto-immune est le purpura thrombotique idiopatique (PTI) et le la polyradiculonévrite inflammatoire demyélisante chronique (PDCI).
De préférence, la pathologie auto-immune ou inflammatoire est choisie parmi le purpura thrombocytopénique immunologique (appelé également purpura thrombocytopénique idiopathique, ou PTI), la neuromyélite optique ou maladie de Devic (NMO) et la sclérose en plaques. La sclérose en plaques et notamment étudiée grâce à un modèle d'encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE).
Les séquences décrites dans la présente demande peuvent être résumées comme suit:
SEQ Protéine Séquence ID
NO:
1 Région Fc d'IgG1 CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV
humaine G1m1,17 VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST
(résidus 226-447 selon YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS
l'index EU ou équivalent KAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYP
dans Kabat) sans région SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT
charnière supérieure N- VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
terminale 2 Région Fc d'IgG2 CPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVV
humaine sans région DVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNSTF
charnière supérieure N- RVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPAPIEKTISK
terminale TKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPS
DIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTV
DKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
3 Région Fc d'IgG3 CPRCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV
humaine sans région VDVSHEDPEVQFKWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST
charnière supérieure N- FRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS
terminale KTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP
SDIAVEWESSGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLT
VDKSRWQQGNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK

4 Région Fc d'IgG4 CPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV
humaine sans région VDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQFNST
charnière supérieure N- YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPSSIEKTIS
terminale KAKGQPREPQVYTLPPSQEEMTKNQVSL
TCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDG
SFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEALHNHYTQ
KSLSLSLGK
Région Fc d'IgG1 CPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVV
humaine Glm3 sans VDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREEQYNST
région charnière YRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTIS
supérieure N-terminale KAKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYP
SDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFLYSKLT
VDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLSLSPGK
6 Région Fc d'IgG1 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI
humaine G1m1,17 avec SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT
région charnière KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN
supérieure N-terminale KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR
(résidus 216-447 selon DELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
l'index EU ou équivalent TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM
dans Kabat) HEALHNHYTQKSLSLSPGK
7 Région Fc d'IgG2 ERKCCVECPPCPAPPVAGPSVFLFPPKPKDTLMISRTP
humaine avec région EVTCVVVDVSHEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPRE
charnière supérieure N- EQFNSTFRVVSVLTVVHQDWLNGKEYKCKVSNKGLPA
terminale PIEKTISKTKGQPREPQVYTLPPSREEMTKNQVSLTCL
VKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFF
LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSL
SLSPGK
8 Région Fc d'IgG3 ELKTPLGDTTHTCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPEPKSC
humaine avec région DTPPPCPRCPEPKSCDTPPPCPRCPAPELLGGPSVFL
charnière supérieure N- FPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVQFKWYV
terminale DGVEVHNAKTKPREEQYNSTFRVVSVLTV
LHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIEKTISKTKGQPREP
QVYTLPPSREEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWES
SGQPENNYNTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQ
GNIFSCSVMHEALHNRFTQKSLSLSPGK

9 Région Fc d'IgG4 ESKYGPPCPSCPAPEFLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRT
humaine avec région PEVTCVVVDVSQEDPEVQFNWYVDGVEVHNAKTKPR
charnière supérieure N- EEQFNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKGLP
terminale SSIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSQEEM
TKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTP
PVLDSDGSFFLYSRLTVDKSRWQEGNVFSCSVMHEAL
HNHYTQKSLSLSLGK
Région Fc d'IgG1 EPKSCDKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMI
humaine Glm3 avec SRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKT
région charnière KPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSN
supérieure N-terminale KALPAPIEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSR
EEMTKNQVSLTCLVKGFYPSDIAVEWESNGQPENNYK
TTPPVLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVM
HEALHNHYTQKSLSLSPGK
11 Variant Fc A3A-184AY DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE
VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE
QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP
IENTISKAKGQPREPQVYTLSPSRDELTKNQVSLTCLV
KGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFFL
YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLS
LSPGK
12 Peptide signal MRWSWIFLLLLSITSANA
13 Variant Fc A3A-184AY MRWSWIFLLLLSITSANADKTHTCPPCPAPELLGGPSV
avec peptide signal FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY
(i.e. fusion de SEQ ID VDGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWL
NO :12 avec SEQ ID NGKEYKCKVSNKALPAPIENTISKAKGQPREPQVYTLS
NO :11) PSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPEN
NYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC
SVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK
14 Région Fc d'IgG1 DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE
humaine G1m1,17 avec VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE
résidus 221-447 selon QYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAP
l'index EU ou équivalent IEKTISKAKGQPREPQVYTLPPSRDELTKNQVSLTCLV
dans Kabat KGFYPSDIAVEWESNGQPENNYKTTPPVLDSDGSFFL
YSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHNHYTQKSLS

LSPGK
15 Variant Fc A3A-184EY DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPE
VTCVVVDVSHEDPEVKFNWYVDGVEVHNAKTKPREE
QWNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPA
PIENTISKAKGQPREPQVYTLSPSRDELTKNQVSLTCL
VKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTPPMLDSDGSFF
LYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSL
SLSPGK

16 Variant Fc A3A-184EY MRWSWIFLLLLSITSANADKTHTCPPCPAPELLGGPSV
avec peptide signal FLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWY
(i.e. fusion de SEQ ID VDGVEVHNAKTKPREEQWNSTYRVVSVLTVLHQDWL
NO :12 avec SEQ ID NGKEYKCKVSNKALPAPIENTISKAKGQPREPQVYTLS
NO :15) PSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPEN
NYKTTPPMLDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSC
SVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK
La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples suivants.
Les légendes des figures sont les suivantes :
Figure 1 : Production du variant A3A-184AY dans le lait de chèvre et de souris à
l'aide du vecteur Bc451 A) Le vecteur beta caséine, Bc451, a été digéré par Xhol.
Dans le vecteur Bc451, le fragment Notl-Notl est le fragment procaryote. Le fragment Notl (15730) ¨ Xhol est la séquence génomique 3' qui contient le signal polyA. Le fragment BamHI ¨ Xhol est la région promotrice de béta caséine.
B) Le fragment Sali contenant la région codante du variant Fc A3A-184AY (i.e.

A3A-184AY 884 bp) a été inséré dans le vecteur, pour générer la construction génique BC3180 FC A3A-184AY (C).
D) Le fragment d'ADN pour la micro-injection a ensuite été isolé du vecteur procaryote.
Pour cela, B03180 a été digéré par Notl et Nrul. Le fragment libéré de 16.4kb, contenant le gène Fc (codant le variant A3A-184AY) sous contrôle du promoteur de la beta caséine, a ensuite été purifié par élution de gel.

Figure 2: Résultats des tests dans un modèle préventif d'arthrite induite par le transfert de sérum de souris K/BxN
La maladie a été induite en transférant 10 pl de sérum de souris K/BxN par voie intraveineuse le jour 0 à des souris 057/61/6J. Les molécules testées ont été
administrées 5 une fois par voie intrapéritonéale à JO, 2h avant l'injection de sérum de souris K/BxN.
Le score clinique ( clinical score ) est obtenu en additionnant l'indice des quatre pattes:
0 = normal, 1 = gonflement d'une articulation, 2 = gonflement de plus d'une articulation, et 3 = gonflement sévère de toute l'articulation (unités arbitraires ou arbitrary units ).
10 Figure 3: Résultats des tests dans un modèle thérapeutique d'arthrite induite par le transfert de sérum de souris K/BxN
La maladie a été induite en transférant 10 pl de sérum de souris K/BxN par voie intraveineuse le jour 0 à des souris 057/61/6J. Les molécules testées ont été
administrées une fois par voie intrapéritonéale à JO, 72h après l'injection de sérum de souris K/BxN
15 (indiqué par des pointillés).
Le score clinique ( clinical score ) est obtenu en additionnant l'indice des quatre pattes:
0 = normal, 1 = gonflement d'une articulation, 2 = gonflement de plus d'une articulation, et 3 = gonflement sévère de toute l'articulation (unités arbitraires ou arbitrary units ).
20 Figure 4 : Résultats des tests de liaison des Fc et IgIV aux cellules sanguines Des IgIV ou des variants Fc selon l'invention marqués par Alexa ont été
incubés à 65 nM
(10 pg / ml pour Fc dans du PBS 2% CSF) avec des cellules cibles pendant 20 minutes sur de la glace. Après 2 lavages dans du PBS à 2% de CSF, les cellules ont été
mises en suspension dans 500 pl d'Isoflow avant l'analyse par cytométrie de flux.
25 Les résultats sont les suivants :
A) Cellules B marquées avec des anti-CD19 ( % positive B cells ) ;
B) Cellules NK marquées avec des anti-CD56 ( % positive NK cells ) ;
C) Monocytes marqués avec des anti-CD14, en présence d'IgIV ( % positive cells + IgIV
) ;
D) Monocytes CD16+ marqués avec des anti-CD14 et avec l'anticorps anti-CD16 3G8, en présence d'IgIV ( % positive cells + IgIV ) ;
E) Neutrophiles marqués avec des anti-CD15, en présence d'IgIV ( % positive cells +
IgIV ) ;
F) Cellules NK marquées avec des anti-CD56, en présence d'IgIV ou de Fc WT ( % cell positives ).

Figure 5: Résultats des tests d'ADCC, d'activation des cellules Jurkat C064 et de CDC
A) Inhibition de l'activation des cellules Jurkat 0D64 :
Des cellules Raji (50 I à 5 x 106 cellules / ml) ont été mélangées avec du Rituxan (50 I à
2 g / ml), des cellules Jurkat exprimant 0D64 humain (Jurkat-H-0D64) (25 I à
5 x 106 cellules / ml), du PMA (50 I à 40 ng / ml), puis incubées avec les IgIV ou le variant selon l'invention (RFC A3A-184AY) à 1950 nM.
Après une nuit d'incubation, les plaques ont été centrifugées (125 g pour 1 minute) et l'IL2 contenue dans le surnageant a été évaluée par ELISA.
Les résultats ont été exprimés en pourcentage par rapport aux IgIV, selon la formule suivante: (IL-2 IgIV / IL-2 de l'échantillon) X100.
B) Inhibition de l'ADCC :
Des cellules effectrices (cellules mononucléaires) (25 I à 8 x 107 cellules /
ml) et des globules rouges Rhésus positifs (25 I à 4 x 107 cellules / ml final) ont été
incubés avec différentes concentrations (0 à 75 ng / ml) d'anticorps anti-Rhésus D, avec un rapport Effecteur / Cible de 2/1. Après 16 heures d'incubation, la lyse a été estimée en quantifiant l'hémoglobine libérée dans le surnageant en utilisant un substrat spécifique (DAF).
Les résultats sont exprimés en pourcentage de lyse spécifique en fonction de la quantité
d'anticorps. L'inhibition de l'ADCC a été induite par les IgIV ou le variant Fc selon l'invention (RFC A3A-184AY) ajouté à 33 nM.
Les résultats sont exprimés en pourcentage, 100% et 0% étant les valeurs obtenues avec les IgIV à 650 nM et 0 nM respectivement selon la formule suivante:
[(ADCC avec échantillon à 33nM - ADCC sans IVIg) / (ADCC avec IgIV à 33nM -ADCC
sans IVIg) x100].
C) Activité d'inhibition de la CDC :
Des cellules Raji ont été incubées pendant 30 minutes avec une concentration finale de 50 ng/ml de rituximab. Une solution de sérum de jeune lapin diluée à 1/10 et préalablement incubée avec le variant Fc selon l'invention (rFc A3A-184AY) ou des IgIV
(vol / vol) pendant 1h à 37 C a été ajoutée. Après 1 heure d'incubation à 37 C, les plaques ont été centrifugées (125 g pour 1 minute) et la CDC a été estimée en mesurant la LDH intracellulaire libérée dans le milieu de culture.

Les résultats ont été exprimés en pourcentage d'inhibition et comparés aux IgIV et au contrôle négatif (Fc sans fonction Fc, i.e. rFc neg), 100% correspondant à une inhibition complète de l'activité lytique et 0% à la valeur témoin obtenue sans Fc ou IgIV.
Figure 6 : Résultats des tests de liaisons aux cellules sanguines Des IgIV, Fc-Rec (Fc sauvage), Fc MST-HN ou des variants Fc selon l'invention (A3A-184AY CHO, A3A-184EY CHO) marqués par Alexa-Fluor ont été incubés à 65 nM (10 g / ml pour Fc dans du PBS 2% CSF (Colony Stimulating Factor) avec des cellules cibles pendant 20 minutes sur de la glace. Après 2 lavages dans du PBS à 2% de CSF, les cellules ont été mises en suspension dans 500 I d'Isoflow avant l'analyse par cytométrie de flux. Les tests sont réalisés sur les cellules cibles suivantes :
- Cellules Natural Killer (NK) marquées avec des anti-CD56 ;
- Monocytes marqués avec des anti-CD14;
- Monocytes CD16+ marqués avec des anti-CD14 et avec l'anticorps anti-CD16 3G8;
- Neutrophiles marqués avec des anti-CD15.
Figure 7: Résultats des tests dans un modèle vivo de purpura thrombocvtopénique idiopathique (ITP) La maladie a été induite chez des souris exprimant un FcRn humanisé en injectant un anticorps anti-plaquettaire 6A6-hIgG1 (0,3 g/g de poids corporel) par voie intraveineuse pour dépléter les plaquettes, appelées aussi thrombocytes, des souris. Le contrôle négatif ( CTL PBS ), des IgIV (1000 mg/kg), un fragment Fc-Rec (Fe-sauvage) (380 et mg/kg), un fragment Fe MST-HN (190 mg/kg) et le variant de l'invention Fc A3A-184AY CHO (190 mg/kg et 380 mg/kg), ont été administrés par voie intra-péritonéale 2 heures avant la déplétion des plaquettes. La numération plaquettaire a été
déterminée avec un système Advia Hematology (Bayer). Le nombre de plaquettes avant l'injection d'anticorps a été fixé à 100%.
EXEMPLES
EXEMPLE 1: Préparation de variants (fragments Fc mutés) selon l'invention produits dans le lait d'animaux transgéniques et caractérisation desdits variants I. Matériels et méthodes Principe :
Un fragment Fc selon l'invention peut être produit dans le lait d'animaux transgéniques, en plaçant la séquence codante du fragment Fc dans un vecteur d'expression spécifique du lait. Le vecteur peut être introduit dans le génome d'une souris ou d'une chèvre transgénique, par micro-injection. Suite au criblage et à l'identification d'un animal possédant le transgène, les femelles sont reproduites. Suite à la parturition, traire les femelles permet de récupérer leur lait, dans lequel le Fc a pu être sécrété
suite à
l'expression du promoteur spécifique du lait.
Séquence protéique du variant Fc A3A-184AY (K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y) :
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFP PKPKDTLMISRTP EVTCVVVDVSH EDP EVKFNWYV
DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIENTISK
AKGQPREPQVYTLSPSRDELTKNOVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGOPENNYKTTPPM
LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID
NO :11) Un peptide signal (MRWSWIFLLLLSITSANA, SEQ ID NO :12) est lié à l'extrémité N-terminale de la séquence protéique, afin d'obtenir la séquence SEQ ID NO :13.
Il permet la sécrétion de la protéine dans le lait, une fois exprimé.
Optimisation de la séquence nucléotidique :
La séquence nucléotidique a été optimisée pour l'expression dans la glande mammaire de chèvre. Pour cela, la séquence a été optimisée pour l'espèce Bos taurus par l'algorithme d'un fournisseur de gènes de synthèse (tel que GeneArt).
Vecteur d'expression :
Le vecteur d'expression de la beta caséine de chèvre (Bc451) a été utilisé
pour la production du variant A3A-184AY dans le lait de souris et de chèvre (voir figure 1).
Le vecteur beta caséine, Bc451, a été digéré par Xhol (figure 1A). Le fragment Sali contenant la région codante du variant Fc A3A-184AY a été inséré pour générer la construction génique BC3180 FC A3A-184AY (figures 1B et 10).
Le fragment d'ADN pour la micro-injection a ensuite été isolé du vecteur procaryote.

B03180 a été digéré par Notl et Nrul (figure 1D). Le fragment libéré de 16.4kb contenant le gène Fc sous contrôle du promoteur de la beta caséine a ensuite été purifié
par élution de gel. Cet ADN a ensuite été utilisé dans l'étape de micro-injection.
Production chez la souris :
Le fragment d'ADN a été inséré par micro-injection dans des embryons de souris préimplantatoires. Les embryons ont ensuite été implantés dans des femelles pseudo-gravides. Les descendants qui sont nés ont été criblés pour la présence du transgène par analyse PCR.
Expression chez la chèvre :
Le fragment d'ADN préparé pour la micro-injection peut également être utilisé
pour la production du variant Fe A3A-184AY dans le lait de chèvre.
EXEMPLE 2: Préparation de variants (fragments Fc mutés) selon l'invention produits dans des cellules HEK et caractérisation desdits variants I. Matériels et méthodes pour la production Chaque mutation d'intérêt dans le fragment Fc de séquence SEQ ID NO :14 a été
insérée par PCR de chevauchement en utilisant deux ensembles d'amorces adaptées pour intégrer la ou les mutation(s) ciblées avec le(s) codon(s) codant l'acide aminé souhaité.
Avantageusement, quand les mutations à insérer sont proches sur la séquence du Fc, elles sont ajoutées via un même oligonucléotide. Les fragments ainsi obtenus par PCR
ont été associés et le fragment résultant a été amplifié par PCR en utilisant des protocoles standards. Le produit de PCR a été purifié sur gel d'agarose 1% (w/v), digéré
avec les enzymes de restriction adéquates et cloné.
Le fragment Fc recombinant a été produit par transfection transitoire (par lipofection) dans les cellules HEK293 (Cellules 293-F, freestyle InvitroGen) dans du milieu F17 additionné
de L-glutamine en utilisant le vecteur pCEP4. Après 8 jours de culture, le surnageant est clarifié par centrifugation et filtré sur filtre de 0,21.1m. Le Fragment Fc est ensuite purifié sur protéine A Hi-Trap, et l'élution est faite avec un tampon citrate 25mM pH =
3,0, neutralisation et dialyse dans du PBS avant stérilisation par filtration (0,2 m).

Il. Tests de liaison sur Octet (technologie BLI Bio-Layer Interferometry >
, appareil Octet RED96, Fortebio, Pall) Protocoles :

Liaison au FcRn humain (hFcRn) :
Le récepteur hFcRn biotinylé est immobilisé sur des Biosensors Streptavidin, dilué à 0.7 pg/ml en tampon de run (tampon phosphate 0,1M, NaCI 150mM, Tween 20 0,05%, pH6).
Les variants selon l'invention, WT et IgIV, ont été testés à 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 10 3.125 et 0 nM en tampon de run (200 nM = 10 pg/ml pour les Fc).
- Design de l'essai:
Baseline 1 x 120s en tampon de run Loading 300s : le récepteur est chargé sur les biosensors 15 Baseline 2 x 60s en tampon de run Association 60s : les échantillons (Fc ou IVIg) sont ajoutés aux biosensors chargés en hFcRn Dissociation 30s en tampon de run Régénération 120s en tampon de régénération (tampon Phosphate 0,1M, NaCI
150mM, 20 Tween 20 0,05%, pH7.8).
- Interprétation des résultats:
Les courbes d'association et de dissociation (premières 10s) sont utilisées pour calculer les constantes cinétiques d'association (kon) et de dissociation (koff) en utilisant un 25 modèle d'association 1/1. Le KD (nM) est ensuite calculé (kon/koff).
Liaison aux récepteurs hCD16aV et hCD32aH :
Le récepteur hCD16aV (R&D system) ou hCD32aH (PX therapeutics) HisTag est immobilisé sur des Biosensors anti-Penta-HIS (HIS 1K), dilué à 1 pg/ml en tampon de 30 cinétique (Pall). Les variants Fc selon l'invention, WT et IgIV, ont été
testés à 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15 et 0 nM en tampon de cinétique.
-Loading avant chaque échantillon -Design de l'essai : Toutes les étapes sont réalisées en tampon de cinétique (Pall) Baseline 1 x 60s Loading 400s Baseline 2 x 60s Association 60s Dissociation 30s Régénération 5s en tampon de régénération (Glycine 10mM pH 1.5 /
Neutralisation : PBS).
-Interprétation des résultats :
Les courbes d'association et de dissociation (premières 5s) sont utilisées pour calculer les constantes cinétiques d'association (kon) et de dissociation (koff) en utilisant un modèle d'association 1/1. Le KD (nM) est ensuite calculé (kon/koff).
Résultats :
Les résultats sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous :
Tableau 1 Molécule hCD16aV SD hFcRn SD hCD32aH SD
IVIg 653,8 4,0 34,4 1,94 438,2 114,3 Fc-WT (HEK) 504,3 75,0 36,5 8,2 659,3 203,1 A3A-184AY (HEK) 132,0 14,1 7,8 0 313,0 29,7 SD = écart-type Les résultats montrent que le variant Fc A3A 184AY (HEK) selon l'invention présente à la fois une affinité augmentée pour le récepteur hFcRn, et une affinité augmentée pour les récepteurs FcyRIlla (CD16a) et FcyRIla (CD32a), et ce, comparé au Fc parent non muté
(Fc-WT) mais également comparé aux IgIV.
III. Tests sur modèle d'arthrite induite par le transfert de sérum de souris K/BxN
Protocole :
Le modèle K/BxN a été généré en croisant les souris transgéniques pour le récepteur de cellules T KRN à la souche de souris NOD. Les souris K/BxN F1 développent spontanément une maladie à l'âge de 3 à 5 semaines et partagent de nombreuses caractéristiques cliniques avec l'arthrite rhumatoïde humaine.
La maladie a été induite en transférant 10 pl de sérum de souris K/BxN par voie intraveineuse le jour 0 à des souris 057/61/6J. Les molécules testées ont été
administrées une fois par voie intrapéritonéale à JO, 2h avant ou 72 heures après l'injection de sérum de souris K/BxN.
Les souris ont été surveillées quotidiennement pour rechercher et identifier des signes d'arthrite afin d'évaluer l'incidence et la sévérité en ajoutant l'indice des quatre pattes:
0 = normal, 1 = gonflement d'une articulation, 2 = gonflement de plus d'une articulation, et 3 = gonflement sévère de toute l'articulation.
Résultats :
Les souris ayant reçu du sérum K/BxN ont développé une arthrite dans l'articulation. La maladie était caractérisée par une augmentation de la taille de la cheville, induisant une augmentation du score clinique. Ces souris ont montré une augmentation significative du score clinique et de l'épaisseur de la cheville par rapport aux souris témoins traitées avec du sérum physiologique.
1-Modèle préventif :
Administré 2h avant l'injection de sérum de souris K/BxN, le traitement par 750 mg/kg de fragment Fc de type sauvage (Fc WT) a significativement réduit le score clinique comparé
au groupe traité par sérum de souris K/BxN.
Le traitement par le variant Fc A3A-184AY (HEK) selon l'invention a significativement réduit le score clinique de manière similaire au fragment Fc WT, mais à une dose 15 fois plus faible (50 mg/kg) (figure 2).
2-Modèle thérapeutique :
72h après l'injection de sérum de souris K/BxN, les IgIV administrées à 2 g/kg ne réduisent pas significativement le score clinique comparé au groupe traité par sérum de souris K/BxN.
Cependant, le traitement par le fragment Fc WT à 750 mg/kg (dose moléculaire équivalente à 2g /kg d'IVIg) a significativement réduit le score clinique comparé au groupe traité par sérum de souris K/BxN. De plus, le traitement par le variant Fc A3A-(HEK) selon l'invention a significativement réduit le score clinique de manière similaire au fragment Fc-WT, mais à une dose 4 fois plus faible (190 mg/kg) (figure 3).
IV. Tests in vitro sur cellules Protocoles :
Evaluation de la liaison des fragments Fc et IgIV aux cellules sanguines :
Des IgIV ou des variants Fc selon l'invention marqués par Alexa ont été
incubés à 65 nM
(10 g / ml pour Fc dans du PBS 2% CSF) avec des cellules cibles pendant 20 minutes sur de la glace. Après 2 lavages dans du PBS à 2% de CSF, les cellules ont été
mises en suspension dans 500 I d'Isoflow avant l'analyse par cytométrie de flux. Les cellules B, les cellules NK, les monocytes et les neutrophiles étaient spécifiquement marqués avec des anti-CD19, anti-0D56, anti-CD14 et anti-CD15 respectivement. Le récepteur FcyRIII
(CD16) a été mis en évidence en utilisant l'anticorps anti-CD16 3G8.
Inhibition de l'ADCC :
Pour mimer la situation de lyse de globules rouges qu'on observe dans le purpura thrombopénique idiopathique (PTI), impliquant les autoanticorps du patient atteint du PTI, une lyse de globules rouges médiée par des cellules effectrices en présence d'un anticorps monoclonal anti-Rhésus D (RhD) a été conduite, et la capacité de différentes quantités d'Immunoglobulines polyvalentes (IVIg) ou de fragments Fc recombinants mutés ou non mutés, à inhiber cette lyse, par exemple par compétition avec l'anti-RhD
pour la fixation des récepteurs Fc à la surface des cellules effectrices, a été évaluée.
La cytotoxicité des anticorps anti-RhD a été étudiée par la technique d'ADCC.
Brièvement, des cellules effectrices (cellules mononucléaires) (25 I à 8 x 107 cellules!
ml) et des globules rouges Rhésus positifs (25 I à 4 x 107 cellules / ml final) ont été
incubés avec différentes concentrations (0 à 75 ng / ml) d'anticorps anti-RhD, avec un rapport Effecteur! Cible de 2/1. Après 16 heures d'incubation, la lyse a été
estimée en quantifiant l'hémoglobine libérée dans le surnageant en utilisant un substrat spécifique (DAF).
Les résultats sont exprimés en pourcentage de lyse spécifique en fonction de la quantité
d'anticorps. L'inhibition de l'ADCC induite par les IgIV ou le variant Fc selon l'invention (RFC A3A-184AY) ajouté à 33 nM a été évaluée.

Les résultats sont exprimés en pourcentage, 100% et 0% étant les valeurs obtenues avec les IgIV à 650 nM et 0 nM respectivement selon la formule suivante:
[(ADCC avec échantillon à 33nM - ADCC sans IVIg) / (ADCC avec IgIV à 33nM -ADCC
sans IVIg) x100].
Inhibition de l'activation des cellules Jurkat CD64 :
Ce test estime la capacité des variants Fc selon l'invention ou des IgIV (IgG
totales) à
inhiber la sécrétion d'IL2 par des cellules Jurkat exprimant 0D64 humain (Jurkat-H-0D64) induite par la lignée cellulaire Raji avec Rituxan.
Brièvement, des cellules Raji (50 1 à 5 x 106 cellules/mi) ont été mélangées avec du Rituxan (50 1 à 2 g/m1), des cellules Jurkat H-0D64 (25 1 à 5 x 106 cellules / ml), un ester de phorbol (PMA, 50 1 à 40 ng/ml), puis incubées avec les IgIV ou le variant Fc selon l'invention à 1950 nM.
Après une nuit d'incubation, les plaques ont été centrifugées (125 g pour 1 minute) et l'IL2 contenue dans le surnageant a été évaluée par ELISA.
Les résultats ont été exprimés en pourcentage par rapport aux IgIV, selon la formule suivante:
(IL-2 IgIV / IL-2 de l'échantillon) X100.
Activité d'inhibition de la CDC:
Ce test estime la capacité du variant Fc selon l'invention ou des IgIV à
inhiber l'activité
CDC médiée par le rituximab sur la lignée cellulaire Raji en présence de sérum de jeune lapin comme source de complément. Brièvement, les cellules Raji ont été
incubées pendant 30 minutes avec une concentration finale de 50 ng/ml de rituximab. Une solution de sérum de jeune lapin diluée à 1/10 et préalablement incubée avec le variant selon l'invention ou des IgIV (vol / vol) pendant 1h à 37 C a été ajoutée. Après 1 heure d'incubation à 37 C, les plaques ont été centrifugées (125 g pour 1 minute) et la CDC a été estimée en mesurant la LDH intracellulaire libérée dans le milieu de culture.
Les résultats ont été exprimés en pourcentage d'inhibition et comparés aux IgIV et au contrôle négatif (Fc sans fonction Fc), 100% correspondant à une inhibition complète de l'activité lytique et 0% à la valeur témoin obtenue sans Fc ou 1g IV.
Résultats :
Les résultats sont en figures 4 et 5.

Comme exposé dans la figure 5, le variant Fc selon l'invention (A3A-184AY
(HEK)) présente une meilleure inhibition de l'activité des cellules Jurkat exprimant CD64, de l'ADCC et de la CDC, en comparaison avec les 1g IV. Ces résultats montrent qu'un variant selon l'invention tel que A3A-184AY peut être efficace pour le traitement de pathologies 5 impliquant des autoanticorps de patients, notamment par blocage des récepteurs Fc sur les cellules effectrices du patient (voir figure 4).
EXEMPLE 3: Préparation de variants (fragments Fc mutés) selon l'invention 10 produits dans des cellules CHO
Le fragment Fc recombinant peut être obtenu à partir de la SEQ ID NO :14 de la même façon que celle décrite en exemple 2. Ce fragment Fc muté peut être produit par transfection dans les cellules CHO-S à l'aide d'agent de lipofection tel que le Freestyle 15 Max Reagent (Thermofisher) en utilisant un vecteur optimisé pour l'expression dans cette lignée cellulaire. Les cellules CHO-S sont cultivées en milieu CD FortiCHO + 8 mM de Glutamine, en conditions agitées à 135 rpm en atmosphère contrôlée (8% CO2) à
37 C.
La veille du jour de transfection, les cellules sont ensemencées à une densité
de 6.105 cellules/ml.
20 Le jour de la transfection, l'ADN linéarisé (50 g) et 50 I d'agent de transfection (AT) sont pré-incubés séparément en milieu Opti-Pro SFM puis mélangés et incubés durant minutes pour permettre la formation du complexe ADN/AT. L'ensemble est ensuite ajouté
à une préparation cellulaire de 1.106 cellules/mi dans un volume de 30 ml.
Après 48h d'incubation, des agents de transfection sont ajoutés (Néomycine 1g/L et Méthotrexate 25 200nM) aux cellules. La densité cellulaire et la viabilité sont déterminées tous les 3 à 4 jours et les volumes de culture adaptés pour maintenir une densité cellulaire supérieure à
de 6.105 cellules/ml. Lorsque la viabilité est supérieure à 90% les pools stables obtenus sont sauvegardés par cryocongélation et des productions en conditions agitées sont réalisées en mode Fedbatch durant 10 jours avec un ajout de 4g/L ou 6g/L
de glucose 30 durant la production. En fin de production, les cellules et le surnageant sont séparés par centrifugation. Les cellules sont éliminées et le surnageant a est récolté, concentré et filtré en 0.22 m.
Le fragment Fc est ensuite purifié par chromatographie d'affinité sur une résine de 35 protéine A (HiTrap protein A, GE Healthcare). Après capture sur la résine équilibrée en tampon PBS, le fragment Fc est élue avec un tampon citrate 25mM pH = 3,0, suivi d'une neutralisation rapide du pH à l'aide de Tris 1M puis dialysé en tampon PBS
avant stérilisation par filtration (0,21.1m).
EXEMPLE 4 : Tests de liaison aux récepteurs FcRn, CD16aH, CD16aV, C064 et CD32a des variants produits dans des cellules CHO et dans le lait de chèvres transgéniques Les tests de liaison aux récepteurs Fc sont réalisés avec les molécules suivantes :
- Les variants de l'invention A3A-184AY CHO
(K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y), A3A-184EY CHO
(Y296W/K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y) produits dans des cellules CHOs selon la méthode donnée en exemple 3, A3A-184AY TGg produit chez la chèvre transgénique selon la méthode décrite dans l'exemple 1 ;
- Le fragment Fc MST-HN contenant les mutations M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, décrit dans la littérature comme ayant une liaison optimisée uniquement au récepteur FcRn (Ulrichts et al, JCI, 2018) a été
produit dans des cellules HEK-293 (Cellules 293-F, freestyle InvitroGen) ;
- Un fragment Fc sauvage Fc-WT ou Fc-Rec , obtenu en digérant par la papaïne une IgG1 produite dans du lait de chèvre transgénique ;
- Des IgIV
Liaison au FcRn humain (hFcRn) :
La liaison au FcRn est étudiée par essai compétitif en utilisant un Rituxan marqué au marqueur A488 (Rituxan-A488) et des cellules Jurkat exprimant le récepteur FcRn (Jurkat-FcRn).
Les cellules Jurkat-FcRn sont ensemencées dans une plaque 96 puits (fond V) à
une concentration de 2.105 cellules par puits. Les cellules sont ensuite incubées pendant 20 minutes à 4 C avec les molécules testées diluées dans du tampon aux concentrations finales suivantes : 167 1..tg/m1; 83 1..tg/m1; 42 1..tg/m1; 21 1..tg/m1; 10 1..tg/m1; 5 1..tg/m1; 3 1..tg/m1; 1 ..tg/ml; 04/ml, et simultanément avec 25 i..tg/mL de Rituxan-A488.

Les cellules sont ensuite lavées par ajout de 100e de PBS à pH 6 et centrifugées à 1700 rpm pendant 3 minutes à 4 C. Le surnageant est ensuite retiré et 300e de PBS
froid est ajouté à pH 6.
La liaison du Rituxan-A488 au FcRn exprimé par les cellules Jurkat-FcRn est évaluée par cytométrie en flux. Les valeurs de fluorescence moyennes (MFI) observées sont exprimées en pourcentage, 100% étant la valeur obtenue avec le Rituxan-A488 seul et 0% la valeur en absence de Rituxan-A488. Les concentrations moléculaires requises pour induire 50% d'inhibition de la liaison du Rituxan-A488 au FcRn des cellules Jurkat-FcRn sont calculées à l'aide du logiciel Prism Software .
Les résultats figurent dans le tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2 A3A- A3A- A3A- MST- Fc- IgIV
184AY_CHO 184EY CHO 184AY_TGg HN WT
Inhibition de liaison au FcRn 13 15 12 14 476 (IC 50%, nM) Les résultats montrent que les variants Fc A3A-184AY CHO, Fc A3A-184EY CHO et A3A-184AY-TGg présentent une inhibition de liaison du Rituxan-A488 augmentée (x100 comparé aux IVIg). Les variants de l'invention montrent une affinité de liaison au FcRn équivalente à celle observée avec le fragment Fc MST-HN décrit dans la littérature comme optimisé seulement pour FcRn (Ulrichts et al, JCI, 2018).
Liaison aux récepteurs hCD64 et hCD16aH, hCD16aV, hCD32aH, hCD32aR :
= Liaison au CD64 humain (hCD64) La liaison au CD64 humain est étudiée par essai compétitif en utilisant du Rituxan-A488 et des cellules Jurkat exprimant le récepteur CD64 (Jurkat-CD64).
Les cellules Jurkat-CD64 sont ensemencées dans une plaque 96 puits (fond V) à
une concentration de 2.105 cellules par puits. Les cellules sont ensuite incubées pendant 20 minutes à 4 C avec les molécules testées diluées dans du tampon aux concentrations finales suivantes : 167 pg/m1; 83 pg/m1; 42 pg/m1; 21 pg/m1; 10 pg/m1; 5 pg/m1; 3 pg/m1; 1 pg/m1; 0 pg/ml, et simultanément avec 25 pg/mL de Rituxan-A488.
Les cellules sont ensuite lavées par ajout de 100e de PBS à pH 6 et centrifugées à 1700 rpm pendant 3 minutes à 4 C. Le surnageant est ensuite retiré et 300e de PBS
froid est ajouté à pH 6.
La liaison du Rituxan-A488 au 0D64 exprimé par les cellules Jurkat-0D64 est évaluée par cytométrie en flux. Les valeurs de fluorescence moyennes (MFI) observées sont exprimées en pourcentage, 100% étant la valeur obtenue avec le Rituxan-A488 seul et 0% la valeur en absence de rituxan-A488. Les concentrations moléculaires requises pour induire 50% d'inhibition de la liaison du Rituxan-A488 au CD64 des cellules Jurkat-CD64 sont calculées à l'aide du logiciel Prism Software .
= Liaison au CD32aH et CD32aR
La liaison au récepteur humain CD32 est étudiée par essai compétitif en utilisant du Rituxan-A488 et des cellules HEK transfectées avec les récepteurs CD32aH et CD32aR
(HEK-CD32).
Les cellules HEK-CD32 sont ensemencées dans une plaque 96 puits (fond V) à une concentration de 2.105 cellules par puits. Les cellules sont ensuite incubées pendant 20 minutes à 4 C avec les molécules testées diluées dans du tampon aux concentrations finales suivantes : 333 pg/mL ; 167 pg/mL ;83 pg/m1; 42 pg/m1; 21 pg/m1; 10 pg/m1; 5 pg/m1; 3 pg/m1; 1 pg/m1; 0 pg/ml, et simultanément avec 30 pg/mL de Rituxan-A488.
Les cellules sont ensuite lavées par ajout de 100e de PBS à pH 6 et centrifugées à 1700 rpm pendant 3 minutes à 4 C. Le surnageant est ensuite retiré et 300e de PBS
froid est ajouté à pH 6.
La liaison du Rituxan-A488_au CD32aH et CD32aR exprimés par les cellules HEK-est évaluée par cytométrie en flux. Les valeurs de fluorescence moyennes (MFI) observées sont exprimées en pourcentage, 100% étant la valeur obtenue avec le Rituxan-A488_seul et 0% la valeur en absence de Rituxan-A488. Les concentrations moléculaires requises pour induire 50% d'inhibition de la liaison du Rituxan-A488 au CD32aH
et CD32aR des cellules HEK-CD32 sont calculées à l'aide du logiciel Prism Software .
= Liaison au hCD16aH

La liaison au CD16aH humain est étudiée par essai compétitif en utilisant un anticorps anti-CD16 3G8 murin marqué à la phycoérythrin (3G8-PE) et des cellules Jurkat transfectées avec le récepteur CD16aH humain (Jurkat-CD16aH).
Les cellules Jurkat-CD16aH sont ensemencées dans une plaque 96 puits (fond V) à une concentration de 2.105 cellules par puits. Les cellules sont ensuite incubées pendant 20 minutes à 4 C avec les molécules testées diluées dans du tampon aux concentrations finales suivantes : 83 ug/m1; 42 ug/m1; 21 ug/m1; 10 ug/m1; 5 ug/m1; 3 ug/m1;
1 ug/m1 ; 0 ug/ml, et simultanément avec 0.5 ug/mL de mAb 3G8-PE.
Les cellules sont ensuite lavées par ajout de 100e de PBS à pH 6 et centrifugées à 1700 rpm pendant 3 minutes à 4 C. Le surnageant est ensuite retiré et 300e de PBS
froid est ajouté à pH 6.
La liaison du mAb 3G8-PE_au CD16aH exprimé par les cellules Jurkat-CD16aH est évaluée par cytométrie en flux. Les valeurs de fluorescence moyennes (MFI) observées sont exprimées en pourcentage, 100% étant la valeur obtenue avec le mAb 3G8-PE
seul et 0% la valeur en absence de mAb 3G8-PE. Les concentrations moléculaires requises pour induire 50% d'inhibition de la liaison du mAb 3G8-PE au CD16aH des cellules Jurkat-CD16aH sont calculées à l'aide du logiciel Prism Software .
Les résultats figurent dans le tableau 3 ci-dessous.
Tableau 3 A3A- A3A- A3A- MST- Fc- IgIV
184AY_CHO 184EY CHO 184AY TGg HN WT
Inhibition de liaison au 262 123 105 >2170 282 1684 CD16a-F (IC
50%, nM) Inhibition de liaison au 135 147 170 >2170 >2170 671 CD32a-H (IC
50%, nM) Inhibition de liaison au 176 132 ND >2170 >2170 1308 CD32a-R (IC
50%, nM) Inhibition de liaison au 57 55 59 >2170 >2170 761 CD32b (IC
50%, nM) Inhibition de liaison au C064 (IC 50%, nM) Les résultats montrent que les variants Fc A3A-184AY CHO, Fc A3A-184EY CHO et A3A-184AY TGg présentent une affinité augmentée pour les récepteurs FcyRIlla (CD16a), FcyRI (0D64) et FcyRIla (CD32a), et ce, comparé au Fc non muté (Fc-WT) 5 mais également comparé aux IgIV.
Les mutants de l'invention montrent une affinité très augmentée pour les récepteurs FcyRIlla (CD16a), FcyRI (0D64) et FcyRIla (CD32a) comparé au MST-HN.
= Liaison au CD16aV humain :
10 Le récepteur hCD16aV (R&D system) HisTag est immobilisé sur des Biosensors anti-Penta-HIS (HIS 1K), dilué à 1 pg/ml en tampon de cinétique (Pall). Les molécules ont été
testées aux concentrations de 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15 et 0 nM en tampon de cinétique.
15 -Loading avant chaque échantillon -Design de l'essai : Toutes les étapes sont réalisées en tampon de cinétique (Pall) Baseline 1 x 60s Loading 400s Baseline 2 x 60s 20 Association 60s Dissociation 30s Régénération 5s en tampon de régénération (Glycine 10mM pH 1.5 /
Neutralisation : PBS).

-Interprétation des résultats :
Les courbes d'association et de dissociation (premières 5s) sont utilisées pour calculer les constantes cinétiques d'association (kon) et de dissociation (koff) en utilisant un modèle d'association 1/1. Le KD (nM) est ensuite calculé (kon/koff).
Les résultats figurent dans le tableau 4 ci-dessous.
Tableau 4 Molécule KD hCD16aV (nM) SD
A3A-184AY CHO 80,3 18,1 A3A-184EY_CHO 59,3 7,7 A3A-184AY TGg 51,2 10,7 MST-HN 268,2 83,6 Fc-WT 314,1 72,7 IgIV 339,0 103,9 SD : standard deviation Les résultats montrent que les variants Fc A3A-184AY CHO, Fc A3A-184EY CHO et A3A-184AY TGg présentent une augmentation de liaison pour le récepteur humain FcyRIlla-V (CD16a-V), et ce, comparé au Fc non muté (Fc-WT) mais également comparé
aux IgIV et au fragment Fc MST-HN contenant les mutations M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F.
EXEMPLE 5 : Tests d'inhibition d'ADCC et d'activation des cellules Jurkat des variants produits dans des cellules CHO et dans le lait de chèvres transgéniques Les tests d'inhibition de l'ADCC et d'activation des cellules Jurkat sont réalisés avec les molécules suivantes :
- Les variants de l'invention A3A-184AY CHO
(K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y), A3A-184EY CHO
(Y296W/K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y) produits dans des cellules CHOs selon la méthode donnée en exemple 3, - Le fragment Fc MST-HN contenant les mutations M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, décrit dans la littérature comme ayant une liaison optimisée uniquement au récepteur FcRn (Ulrichts et al, JCI, 2018) a été
produit dans des cellules HEK-293 (Cellules 293-F, freestyle InvitroGen), - Un fragment Fc sauvage Fc-Rec ou Fc-WT , obtenu en digérant par la papaïne une IgG1 produite dans du lait de chèvre transgénique, - Des IgIV
= Test d'inhibition de l'ADCC :
Pour mimer la situation de lyse de globules rouges qu'on observe dans le purpura thrombopénique idiopathique (PTI), impliquant les autoanticorps du patient atteint du PTI, une lyse de globules rouges médiée par des cellules effectrices en présence d'un anticorps monoclonal anti-Rhésus D (RhD) a été conduite, et la capacité de différentes quantités d'Immunoglobulines polyvalentes (IgIV) ou de fragments Fe recombinants mutés ou non mutés, à inhiber cette lyse, par exemple par compétition avec l'anti-RhD
pour la fixation des récepteurs Fc à la surface des cellules effectrices, a été évaluée.
La cytotoxicité des anticorps anti-RhD a été étudiée par la technique d'ADCC.
Brièvement, des cellules effectrices (cellules mononucléaires) (25 là 8 x 107 cellules/mi) et des globules rouges Rhésus positifs (25 1 à 4 x 107 cellules / ml final) ont été incubés avec différentes concentrations (0 à 75 ng/ml) d'anticorps anti-RhD, avec un rapport Effecteur / Cible de 2/1. Après 16 heures d'incubation, la lyse a été estimée en quantifiant l'hémoglobine libérée dans le surnageant en utilisant un substrat spécifique (DAF).
Les résultats sont exprimés en pourcentage de lyse spécifique en fonction de la quantité
d'anticorps. L'inhibition de l'ADCC est induite par les molécules testées (IgIV, le MST-HN, Fc-WT A3A-184AY CHO, A3A-184EY CHO) à des concentrations de 500, 50, 5, 0,5 g/m1 pour MST-HN, Fc-WT A3A-184AY CHO, A3A-184EY CHO et 1500, 150, 15, 1,5 g/m1 pour les IgIV. Les concentrations de molécule pour induire 25% ou 50 %d'inhibition ont été calculées avec le logiciel Prism Software .
Les résultats figurent dans le tableau 5 ci-dessous.
Tableau 5 A3A- A3A- MST- Fc-WT IVIg 184AY CHO 184EY_CHO HN
Inhibition de la lyse des 13,5 7,6 190,2 82 59,6 globules rouges médiée par l'anti-D AD1 (IC
25%, nM) Inhibition de la lyse des globules rouges médiée par l'anti-D AD1 (IC
50%, nM) Les résultats montrent que les variants Fc, A3A-184AY CHO et A3A-184EY CHO
présentent une inhibition de la lyse des globules rouges par un anticorps anti-Rhésus D
augmentée comparé au Fc non muté (Fc-WT) mais également comparé aux 1g IV.
De plus, l'inhibition de A3A-184AY CHO ou A3A-184EY CHO est très augmentée comparé au fragment Fc, MST-HN, contenant les mutations M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F.
= Inhibition de l'activation des cellules Jurkat CD64 :
Ce test estime la capacité des variants Fc selon l'invention ou des IgIV (IgG
totales) à
inhiber la sécrétion d'IL2 par des cellules Jurkat exprimant 0D64 humain (Jurkat-H-0D64) induite par la lignée cellulaire Raji avec Rituxan.
Brièvement, des cellules Raji (50 1 à 5 x 106 cellules/mi) ont été mélangées avec du Rituxan (50 1 à 2 g/m1), des cellules Jurkat H-0D64 (25 1 à 5 x 106 cellules / ml), un ester de phorbol (PMA, 50 1 à 40 ng/ml), puis incubées avec les IgIV ou le variant Fc selon l'invention à 1950 nM.
Après une nuit d'incubation, les plaques ont été centrifugées (125 g pour 1 minute) et l'IL2 contenue dans le surnageant a été évaluée par ELISA.
L'inhibition de la sécrétion d'IL2 a été induite par les IgIV, Fc-WT, MST-HN
ou les variants Fc selon l'invention (A3A-184AY CHO ou A3A-184EY CHO) ajouté à 50 et g/m1 pour les fragments Fc-WT, MST-HN ou les variants Fc selon l'invention (A3A-184AY CHO ou A3A-184EY CHO) et 150 et 300 g/m1 pour les 1g IV.
Les concentrations de molécule pour induire 25% ou 50% d'inhibition ont été
calculées avec le logiciel prism Software .
Les résultats figurent dans le tableau 6 ci-dessous.

Tableau 6 A3A- A3A- MST- Fc-WT IgIV
184AY CHO 184EY_CHO HN
Inhibition de la sécrétion d'IL-2 des cellules Jurkat 448 442 1455 926 1106 transfectées avec C064 (IC 25%, nM) Inhibition de la sécrétion d'IL-2 des cellules Jurkat 600 600 <1950 <1950 <1950 transfectées avec C064 (IC 50%, nM) Les résultats montrent que les variants Fc A3A-184AY-CHO et A3A-184EY-CHO, présentent une inhibition de la sécrétion d'IL2 augmentée comparé au Fc non muté (Fc-WT) mais également comparé aux IgIV.
De plus, l'inhibition des RFC A3A-184AY CHO ou A3A-184EY CHO est très augmentée comparé au fragment Fe MST-HN, contenant les mutations M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F.
EXEMPLE 6 : Tests de liaison des variants Fc aux cellules sanguines Les tests de liaison aux cellules sanguines sont réalisés avec les molécules suivantes :
- Les variants de l'invention A3A-184AY CHO
(K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y), A3A-184EY CHO
(Y296W/K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y) produits dans des cellules CHOs selon la méthode donnée en exemple 3, A3A-184AY TGg produit chez la chèvre transgénique selon la méthode décrite dans l'exemple 1, - Le fragment Fc MST-HN contenant les mutations M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, décrit dans la littérature comme ayant une liaison optimisée uniquement au récepteur FcRn (Ulrichts et al, JCI, 2018) a été
produit dans des cellules HEK-293 (Cellules 293-F, freestyle InvitroGen), - Un fragment Fc sauvage Fc-Rec ou Fc-WT , obtenu en digérant par la papaïne une IgG1 produite dans du lait de chèvre transgénique, 5 - Des IgIV
Les molécules testées marquées avec le marqueur Alexa Fluor (marqueur des protéines hautement fluorescent) ont été incubés à 65 nM (10 g/m1 pour Fc dans du PBS
2% CSF) avec des cellules cibles pendant 20 minutes sur de la glace.
Après 2 lavages dans du PBS à 2% de CSF, les cellules ont été mises en suspension dans 500 I d'Isoflow avant l'analyse par cytométrie de flux. Les tests sont réalisés sur les cellules suivantes :
- Cellules Natural Killer (NK) marquées avec des anti-CD56 ( % positive NK
cells ) ;
- Monocytes marqués avec des anti-CD14 ( % positive cens ) ;
- Monocytes CD16+ marqués avec des anti-CD14 et avec l'anticorps anti-CD16 3G8 ( % positive cells ) ;
- Neutrophiles marqués avec des anti-CD15 ( % positive cens ) Le récepteur FcyRIII (CD16) a été mis en évidence en utilisant l'anticorps anti-CD16 3G8.
Les résultats montrent que les variants Fc A3A-184AY CHO, A3A-184EY CHO et A3A-184AY TGg, quel que soit le mode de production, présentent une liaison augmentée comparé au Fc non muté (Fc-Rec) mais également comparé aux IgIV. De plus, la liaison de A3A-184AY ou A3A-184EY est très augmentée comparé au fragment MST-HN pour les cellules NK, les monocytes CD16+ et les neutrophiles (cf figure 6).
EXEMPLE 7: Tests sur modèle vivo de purpura thrombocytopénique idiopathique (ITP) La maladie a été induite chez des souris exprimant un FcRn humanisé (mFcRn -/-hFcRnTg 276 hétérozygote de fonds génétique B6, The Jackson Laboratory) en injectant un anticorps anti-plaquettaire 6A6-hIgG1 (0,3 g/g de poids corporel) par voie intraveineuse pour dépléter les plaquettes des souris. Une analyse sanguine est faite (nombre de thrombocytes) 24 heures avant l'injection de 6A6-hIgG1, 4h après l'induction de la maladie. Les IgIV (1000 mg/kg), Fc-Rec (380 et 750 mg/kg), Fc MST-HN
(190 mg/kg) et Fc A3A-184AY CHO (190 mg/kg et 380 mg/kg), ont été administrés par voie voie intra-péritonéale 2 heures avant la déplétion des plaquettes.
La numération plaquettaire a été déterminée avec un système Advia Hematology (Bayer).
Le nombre de plaquettes avant l'injection d'anticorps a été fixé à 100%.
L'anticorps anti-plaquettaire 6A6-hIgG1 (0,3 pg/g) permet de dépléter 90% des plaquettes.
L'administration de médicaments candidats 2 heures avant la déplétion des plaquettes permet de rétablir (figure 7):
= 100% des plaquettes pour A3A 184AY CHO à la dose de 380 mg/kg;
= 106% des plaquettes pour A3A-184AY CHO à la dose de 190 mg/kg;
= 90% des plaquettes pour les IgIV à la dose de 1000 mg/kg;
= 64% des plaquettes pour le Fc-WT à la dose de 750g/kg ;
= 75% des plaquettes pour le Fc-WT à la dose de 380 mg/kg;
= 61% des plaquettes pour le variant MST-HN à la dose de 190mg/kg.

Claims

REVENDICATIONS

1. Variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une affinité augmentée pour le récepteur FcRn, et une affinité augmentée pour au moins un récepteur du fragment Fc (FcR) choisi parmi les récepteurs FcyRI (CD64), FcyRIlla (CD16a) et FcyRI la (CD32a), par rapport à celle du polypeptide parent, caractérisé en ce qu'il comprend :
(i) les quatre mutations 334N, 352S, 378V et 397M ; et (ii) au moins une mutation choisie parmi 434Y 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T et 389K ;
la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.

2. Variant selon la revendication 1, comprenant en outre au moins une mutation (iii) dans le fragment Fc choisie parmi Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V2405, F241H, F241Y, L242A, L242F, L242G, L242H, L242I, L242K, L242P, L2425, L242T, L242V, F243L, F2435, E258G, E2581, E258R, E258M, E258Q, E258Y, V259C, V259I, V259L, T260A, T260H, T260I, T260M, T260N, T260R, T2605, T260W, V2625, V263T, V264L, V2645, V264T, V266L, 5267A, S2670, 5267V, K290D, K290E, K290H, K290L, K290N, K2900, K290R, K2905, K290Y, P291G, P2910, P291R, R292I, R292L, E293A, E293D, E293G, E293M, E2930, E2935, E293T, E294A, E294G, E294P, E294Q, E294R, E294T, E294V, Q295I, Q295M, Y296H, 5298A, 5298R, Y300I, Y300V, Y300W, R301A, R301M, R301P, R3015, V302F, V302L, V302M, V302R, V3025, V3035, V303Y, 5304T, V305A, V305F, V305I, V305L, V3O5R et V3055, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat,

3. Variant selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu'il comprend :
(i) les quatre mutations 334N, 352S, 378V et 397M;
(ii) au moins une mutation choisie parmi 434Y 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T et 389K; et (iii) au moins une mutation choisie parmi K290G et Y296W, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.

4. Variant selon l'une des revendications 1 à 3, présentant une affinité
augmentée pour le récepteur FcRn, par rapport à celle du polypeptide parent, d'un ratio au moins égal à 2, de préférence supérieur à 5, de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur à 15, de préférence supérieur à 20, de préférence supérieur à 25, de préférence supérieur à 30.

5. Variant selon l'une des revendications 1 à 4, présentant une affinité
augmentée pour au moins un récepteur du fragment Fc (FcR) choisi parmi les récepteurs FeyRI
(0D64), FeyRIlla (CD16a) et FeyRI la (CD32a), par rapport à celle du polypeptide parent, d'un ratio au moins égal à 2, de préférence supérieur à 5, de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur à 15, de préférence supérieur à 20, de préférence supérieur à 25, de préférence supérieur à 30.

6. Variant selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu'il est produit dans des cellules épithéliales mammaires de mammifères non humains transgéniques.

7. Variant selon l'une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu'il est produit dans des animaux transgéniques non humains, de préférence dans des mammifères non humains transgéniques.

8. Variant selon la revendication 7, caractérisé en ce que l'animal transgénique non humain est une chèvre transgénique.

9. Variant selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le polypeptide parent comprend un fragment Fc parent qui est un fragment Fc humain, de préférence un fragment Fc d'une IgG1 humaine ou d'une IgG2 humaine, plus préférentiellement choisi parmi les séquences SEQ ID NO :1 à 10 et 14.

10. Variant selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu'il est choisi parmi un fragment Fc isolé, une séquence dérivée d'un fragment Fc isolé, un anticorps, un fragment d'anticorps comprenant un fragment Fe, et une protéine de fusion comprenant un fragment Fc.

11. Variant selon l'une des revendications 1 à 10, dirigé contre un antigène choisi parmi un antigène tumoral, un antigène viral, un antigène bactérien, un antigène fongique, une toxine, une cytokine membranaire ou circulante, un récepteur membranaire.

12. Variant selon l'une des revendications 1 à 11, pour son utilisation comme médicament.

13. Variant selon l'une des revendications 1 à 11, pour son utilisation dans le traitement d'une pathologie auto-immune ou inflammatoire, de préférence choisie parmi le purpura thrombocytopénique immunologique, la neuromyélite optique ou maladie de Devic et la sclérose en plaques.

14. Composition pharmaceutique comprenant un variant selon l'une des revendications 1 à 13, et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.

15. Procédé de production d'un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fe, ledit variant présentant une affinité augmentée pour le récepteur FcRn, et une affinité
augmentée pour au moins un récepteur du fragment Fe (FcR) choisi parmi les récepteurs FeyRI (CD64), FeyRIlla (CD16a) et FeyRIla (CD32a), par rapport à celle du polypeptide parent, caractérisé en ce qu'il comprend :
(i) les quatre mutations 334N, 352S, 378V et 397M ; et (ii) au moins une mutation choisie parmi 434Y 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T et 389K ;
la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat, ledit procédé comprenant l'expression dudit variant dans des cellules épithéliales mammaires de mammifères non humains transgéniques, ou ledit procédé comprenant l'expression dudit variant dans des cellules de mammifère en culture.

16. Procédé de production d'un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fe selon la revendication 15, caractérisé en ce que ledit variant comprend en outre au moins une mutation (iii) dans le fragment Fc choisie parmi Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V2405, F241H, F241Y, L242A, L242F, L242G, L242H, L242I, L242K, L242P, L2425, L242T, L242V, F243L, F2435, E258G, E2581, E258R, E258M, E2580, E258Y, V259C, V259I, V259L, T260A, T260H, T260I, T260M, T260N, T260R, T2605, T260W, V2625, V263T, V264L, V2645, V264T, V266L, 5267A, S267Q, 5267V, K290D, K290E, K290H, K290L, K290N, K2900, K290R, K2905, K290Y, P291G, P2910, P291R, R292I, R292L, E293A, E293D, E293G, E293M, E2930, E2935, E293T, E294A, E294G, E294P, E294Q, E294R, E294T, E294V, Q295I, Q295M, Y296H, 5298A, 5298R, Y300I, Y300V, Y300W, R301A, R301M, R301P, R301S, V302F, V302L, V302M, V302R, V3025, V3035, V303Y, 5304T, V305A, V305F, V3051, V305L, V3O5R et V3055, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.

17. Procédé de production d'un variant d'un polypeptide comprenant un fragment Fc selon la revendication 15 ou 16, comprenant les étapes suivantes :
a) préparation d'une séquence d'ADN comprenant une séquence codant pour le variant, une séquence codant pour un promoteur de caséine de mammifère ou un promoteur de lactosérum de mammifère, et une séquence codant pour un peptide signal permettant la sécrétion dudit variant ;
b) introduction de la séquence d'ADN obtenue en a) dans un embryon de mammifère non humain, afin d'obtenir un mammifère non humain transgénique exprimant le variant codé
par ladite séquence d'ADN obtenue en a) dans la glande mammaire ; et c) récupération du variant dans le lait produit par le mammifère non humain transgénique obtenu en b).

18. Procédé de production d'un variant d'un polypeptide comprenant un fragment Fc selon l'une des revendications 15 à 17, dans lequel le mammifère non humain transgénique est choisi parmi les bovins, les porcins, les chèvres, les ovins et les rongeurs, de préférence parmi la chèvre, la souris, la truie, la lapine, la brebis et la vache.

19. Procédé de production d'un variant d'un polypeptide comprenant un fragment Fc selon la revendication 15 ou 16, comprenant les étapes suivantes :
a) préparation d'une séquence d'ADN codant pour le variant;
b) introduction de la séquence d'ADN obtenue en a) dans des cellules de mammifère en culture de façon transitoire ou stable ;
c) expression du variant à partir des cellules obtenues en b), et d) récupération du variant dans le milieu de culture.

20. Séquence d'ADN comprenant un gène codant un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une affinité augmentée pour le récepteur FcRn, et une affinité augmentée pour au moins un récepteur du fragment Fc (FcR) choisi parmi les récepteurs FcyR1 (0D64), FcyR111a (CD16a) et FcyR1la (CD32a), par rapport à celle du polypeptide parent, caractérisé en ce que ledit variant comprend :
(i) les quatre mutations 334N, 352S, 378V et 397M ; et (ii) au moins une mutation choisie parmi 434Y 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T et 389K ;
la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat, ladite séquence d'ADN comprenant optionnellement une séquence codant pour un peptide signal permettant la sécrétion dudit variant.

21. Séquence d'ADN comprenant un gène codant un variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc selon la revendication 20, ledit variant comprenant en outre au moins une mutation (iii) dans le fragment Fc choisie parmi Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V2405, F241H, F241Y, L242A, L242F, L242G, L242H, L242I, L242K, L242P, L2425, L242T, L242V, F243L, F2435, E258G, E2581, E258R, E258M, E2580, E258Y, V2590, V259I, V259L, T260A, T260H, T260I, T260M, T260N, T260R, T2605, T260W, V2625, V263T, V264L, V2645, V264T, V266L, 5267A, S267Q, 5267V, K290D, K290E, K290H, K290L, K290N, K2900, K290R, K2905, K290Y, P291G, P2910, P291R, R292I, R292L, E293A, E293D, E293G, E293M, E2930, E2935, E293T, E294A, E294G, E294P, E294Q, E294R, E294T, E294V, Q2951, Q295M, Y296H, 5298A, 5298R, Y300I, Y300V, Y300W, R301A, R301M, R301P, R3015, V302F, V302L, V302M, V302R, V3025, V3035, V303Y, 5304T, V305A, V305F, V3051, V305L, V3O5R et V3055, la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.