JP2021508444A - FcRnに対する増大した親和性および少なくとも1つのFcフラグメント受容体に対する増大した親和性を有するFcフラグメントを伴う変異体 - Google Patents
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Abstract
【選択図】なし
Description
(i)4つの突然変異334N、352S、378Vおよび397Mと、
(ii)434Y、434S、226G、P228L、P228R、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、362R、389Tおよび389Kの中から選択された少なくとも1つの突然変異と、
を含み、
付番がKabat中のEUインデックスまたは等価物の付番であること、を特徴とする変異体に関する。
付番はKabat中のEUインデックスまたは等価物の付番である。
(i)4つの突然変異334N、352S、378Vおよび397Mと、
(ii)434Y 434S、226G、P228L、P228R、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、362R、389Tおよび389Kの中から選択された少なくとも1つの突然変異と、
を含み、
突然変異(iii)が存在する場合には、この突然変異は、K290GおよびY296Wの中から選択され、
ここで付番はKabat中のEUインデックスまたは等価物の付番である。
(i)4つの突然変異334N、352S、378Vおよび397Mと、
(ii)434Y 434S、226G、P228L、P228R、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、362R、389Tおよび389Kの中から選択された少なくとも1つの突然変異と、
(iii)K290GおよびY296Wの中から選択された少なくとも1つの突然変異と、
を含み、
ここで付番はKabat中のEUインデックスまたは等価物の付番である。
(i)4つの突然変異334N、352S、378Vおよび397Mと、
(ii)434Y、434S、226G、P228L、P228R、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、362R、389Tおよび389Kの中から選択された少なくとも1つの突然変異と
を含み、
ここで付番はKabat中のEUインデックスまたは等価物の付番であり、
トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞内での前記変異体の発現を含む方法も、本発明の対象としている。
付番はKabat中のEUインデックスまたは等価物の付番である。
a)変異体についてコードする配列、哺乳動物のカゼインプロモーターまたは哺乳動物の乳清プロモーターについてコードする配列、および前記変異体の分泌を可能にするシグナルペプチドについてコードする配列を含むDNA配列を調製するステップ、
b)a)で得たDNA配列を非ヒト哺乳動物の胚中に導入して、乳腺内でa)において得られた前記DNA配列によりコードされた変異体を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得るステップ、および
c)b)で得られたトランスジェニック非ヒト哺乳動物によって産生された乳中の変異体を回収するステップ。
(a1)本発明に係る変異体の分泌を可能にするシグナルペプチドについてコードする配列にN末端端部において直接融合された、本発明に係る変異体についてコードする配列を含むDNA配列を調製するステップ、
(a2)哺乳動物カゼインプロモーターまたは哺乳動物乳清プロモーターについてコードする配列を含むベクター内に、(a1)で得たDNA配列を導入するステップ、および
(a3)哺乳動物カゼインプロモーターまたは哺乳動物乳清プロモーターについてコードする配列、および、シグナルペプチドについてコードする配列にN末端端部において直接融合された本発明に係る変異体についてコードする配列を含むDNA配列を含むDNA配列を得るために、(a2)で得た前記ベクターを消化するステップ。
(i)4つの突然変異334N、352S、378Vおよび397Mと、
(ii)434Y 434S、226G、P228L、P228R、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、362R、389Tおよび389Kの中から選択された少なくとも1つの突然変異と、
を含み、
付番がKabat中のEUインデックスまたは等価物の付番であり、
前記遺伝子が、この遺伝子の転写を自然に制御しない哺乳動物の乳清またはカゼインの転写プロモーターの制御下にあり、
変異体についてコードする配列とプロモーターの間に配置されて、前記変異体の分泌を可能にするシグナルペプチドについてコードする配列をさらに含む、
DNA配列をも本発明の対象とする。
(i)4つの突然変異334N、352S、378Vおよび397Mと、
(ii)434Y、434S、226G、P228L、P228R、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、362R、389Tおよび389Kの中から選択された少なくとも1つの突然変異と、
を含み、
付番がKabat中のEUインデックスまたは等価物の付番であり、
任意には、前記変異体の分泌を可能にするシグナルペプチドについてコードする配列を含む、
DNA配列をも本発明の対象とする。
(i)4つの突然変異334N、352S、378Vおよび397Mと、
(ii)434Y 434S、226G、P228L、P228R、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、362R、389Tおよび389Kの中から選択された少なくとも1つの突然変異と、
を含み、
付番がKabat中のEUインデックスまたは等価物の付番であり、
培養中の哺乳動物細胞内での前記変異体の発現を含む、
方法を対象とする。
付番はKabat中のEUインデックスまたは等価物の付番である。
a)変異体についてコードするDNA配列を調製するステップと、
b)培養中の哺乳動物細胞内にa)で得たDNA配列を導入するステップ(この導入は過渡的または安定的に実現可能である(すなわち細胞のゲノム内へのa)で得たDNA配列の組込み))、および
c)b)で得た細胞から変異体を発現するステップ、そして
d)任意には、培地内で変異体を回収するステップ。
ベクターBc451中、NotI−NotIフラグメントは原核生物フラグメントである。NotI(15370)−Xholフラグメントは、polyAシグナルを含むゲノム配列3’である。BamHI−Xholフラグメントは、ベータカゼインのプロモーター領域である。
A)抗CD19で標識されたB細胞(「%陽性B細胞」)、
B)抗CD56で標識されたNK細胞(「%陽性NK細胞」)、
C)IgIVの存在下で、抗CD14で標識された単球(「%陽性細胞+IgIV」)、
D)IgIVの存在下で、抗CD14および抗CD16抗体3G8で標識されたCD16+単球(「%陽性細胞+IgIV」)、
E)IgIVの存在下で、抗CD15で標識された好中球(「%陽性細胞+IgIV」)、
F)IgIVまたはWT Fcの存在下で、抗CD56で標識されたNK細胞(「%細胞陽性」)。
Raji細胞(5×106細胞/mlで50μl)を、リツキサン(Rituxan)(2μg/mlで50μl)、ヒトCD64を発現するJurkat細胞(Jurkat−H−CD64)(5×106細胞/mlで25μl)、PMA(40ng/mlで50μl)と混合し、その後1950nMで、本発明に係る変異体(RFC A3A−184AY)またはIgIVと共にインキュベートした。
一晩インキュベートした後、プレートを遠心分離し(1分間125g)、上清に含まれたIL2をELISAにより評価した。
結果は、以下の式により、IgIVとの関係における百分率として表されている:(IL−2 IgIV/試料のIL−2)×100
エフェクター細胞(単核細胞)(8×107細胞/mlで25μl)およびRh(Rhesus)陽性赤血球細胞(最終4×107細胞/mlで25μl)を、異なる濃度(0〜75ng/ml)の抗RhD抗体と、2/1のエフェクター/標的比でインキュベートした。16時間のインキュベーション後、特異的基質(DAF)を用いて上清中に遊離したへモグロビンを定量することによって溶解を推定した。
結果は、抗体数量に応じた特異的溶解百分率で表されている。ADCCの阻害は、33nMで添加した本発明に係るFc変異体(RFC A3A−184AY)またはIgIVによって誘発された。
結果を百分率で表し、100%と0%は、以下の式によってそれぞれ650nMおよび0nMでIgIVを用いて得られた値である。
[(33nMで試料を伴うADCC−IVIg無しのADCC)/(33nMでIgIVを伴うADCC−IVIg無しのADCC)×100]
Raji細胞を30分間、最終濃度50ng/mlのリツキシマブ(rituximab)と共にインキュベートした。1/10に希釈し、予め本発明のFc変異体(rFc A3A−184AY)またはIgIV(vol/vol)と共に37℃で1時間インキュベートした子ウサギの血清溶液を添加した。37℃で1時間のインキュベーションの後、プレートを遠心分離(1分間125g)し、培地中に遊離した細胞内LDHを測定することによってCDCを推定した。
結果を阻害百分率で表し、IgIVおよび負の対照群(Fc機能の無いFc、すなわちrFc neg)と比較し、100%は溶解活性の完全な阻害に対応し、0%はFcまたはIgIV無しで得た対照値に対応していた。
− 抗CD56で標識されたナチュラルキラー(NK)細胞、
− 抗CD14で標識された単球、
− 抗CD14および抗CD16 3G8抗体で標識された単球CD16+、
− 抗CD15で標識された好中球。
I. 材料と方法
原理:
本発明に係るFcフラグメントは、乳の特異的発現ベクター内にFcフラグメントのコード配列を置くことによって、トランスジェニック動物の乳中で産生させることができる。ベクターは、マイクロインジェクションによりトランスジェニックヤギまたはマウスのゲノム内に導入可能である。トランス遺伝子を有する動物のスクリーニングおよび同定の後、雌を繁殖させる。分娩の後、雌を搾乳することで、乳の特異的プロモーターの発現後にFcが分泌された可能性のあるその乳を回収することができる。
ヤギの乳腺内での発現のために、ヌクレオチド配列を最適化した。そのために、合成遺伝子供給業者(GeneArtなど)のアルゴリズムによりBos taurus(ウシ)種について配列を最適化した。
マウスおよびヤギの乳中における変異体A3A−184AYの産生のためには、ヤギのベータカゼイン(Bc451)の発現ベクターを使用した。(図1参照)
ベータカゼインベクターBc451をXholで消化させた(図1A)。Fc変異体A3A−184AYのコード領域を含むSallフラグメントを挿入して、遺伝構造BC3180 FC A3A−184AYを生成した(図1Bおよび1C)。
着床前のマウスの胚中にマイクロインジェクションによりDNAフラグメントを挿入した。次に、擬妊娠状態の雌の体内に、胚を移植した。生まれた後世代を、PCR分析によってトランス遺伝子の存在についてスクリーニングした。
マイクロインジェクションのために調製したDNAフラグメントは同様に、ヤギの乳中でのFc変異体A3A−184AYの産生のためにも使用することができる。
I.産生のための材料および方法
所望のアミノ酸をコードするコドンで標的化された単数または複数の突然変異を組込むために適応された2つのプライマーセットを用いて、オーバーラップPCRにより、配列番号14の配列のFcフラグメント内の各々の対象突然変異を挿入した。有利には、挿入すべき突然変異がFcの配列上に近い場合、これらの突然変異は同じオリゴヌクレオチドを介して付加される。このようにしてPCRによって得られたフラグメントを会合させ、結果として得たフラグメントを、標準的プロトコールを用いてPCRによって増幅した。PCR生成物を1%(w/v)のアガロースゲル上で精製し、適切な制限酵素を用いて消化させ、クローン化した。
プロトコール:
ヒトFcRn(hFcRn)に対する結合:
ビオチン化hFcRn受容体を、ランニング緩衝液(0.1Mのリン酸緩衝液、NaCl 150mM、Tween20 0.05%、pH6)中0.7μg/mlで希釈した状態で、ストレプトアビジンバイオセンサー上で固定化する。本発明に係る変異体、WTおよびIgIVを、ランニング緩衝液中で200、100、50、25、12.5、6.25、3.125および0nM(200nM=Fcについて10μg/ml)で試験した。
ベースライン1×120秒、ランニング緩衝液中、
ローディング300秒:バイオセンサ上に受容体を投入する、
ベースライン2×60秒、ランニング緩衝液中、
会合60秒:hFcRnが投入されたバイオセンサに対して試料(FcまたはIVIg)を添加する、
解離30秒、ランニング緩衝液中、
再生120秒、再生緩衝液中(リン酸緩衝液0.1M、NaCl 150mM、Tween20 0.05%、pH7.8)。
会合および解離曲線(最初の10秒)を使用して、会合モデル1/1を用いて会合速度定数(kon)および解離速度定数(koff)を計算する。その後、KD(nM)を計算する(kon/koff)。
hCD16aV受容体(R&D system)またはhCD32aH受容体(PX therapeutics)His Tagを、速度論的緩衝液(Pall)中1μ/mlに希釈された状態で、抗Penta−HISバイオセンサー(HIS 1K)上で固定化する。本発明に係るFc変異体、WTおよびIgIVを、速度論的緩衝液中で1000、500、250、125、62.5、31.25、15および0nMで試験した。
−試験の設計:全ステップを、速度論的緩衝液(Pall)中で実施する。
ベースライン 1×60秒
ローディング 400秒
ベースライン 2×60秒
会合 60秒
解離 30秒
再生 再生緩衝液(グリシン10mM pH1.5/中和:PBS)中で5秒。
会合および解離曲線(最初の5秒)を使用して、会合モデル1/1を用いて会合速度定数(kon)および解離速度定数(koff)を計算する。その後、KD(nM)を計算する(kon/koff)。
結果を、下表1で提示した:
プロトコール:
T細胞受容体KRNについてのトランスジェニックマウスをNODマウス株に交雑させることによって、K/BxNモデルを生成した。K/BxN F1マウスは、生後3〜5週で自発的に疾病を発生させ、ヒトリウマチ性関節炎と多くの臨床的特徴を共有する。
K/BxN血清を受けたマウスは、関節内部に関節炎を発生させた。疾病は、踝のサイズ増大によって特徴付けられ、臨床スコアの増加を誘発した。これらのマウスは、生理学的血清で治療された対照マウスに比べて、臨床スコアおよび踝の厚みの有意な増大を示した。
K/BxNマウス血清の注射の2時間前に投与された、野生型のFcフラグメント(Fc WT)750mg/kgによる治療は、K/BxNマウス血清によって治療された群に比べて、臨床スコアを有意に低下させた。
K/BxNマウス血清注射の72時間後、2g/kgで投与したIgIVは、K/BxNマウス血清により治療された群と比べて、臨床スコアを有意に低下させない。
プロトコール:
血液細胞に対するFcフラグメントおよびIgIVの結合の評価
Alexaで標識付された本発明に係るFc変異体またはIgIVを、氷上で20分間、標的細胞と共に65nM(CSF2%のPBS中でFcについて10μg/ml)でインキュベートした。CSF2%のPBS中で2回洗浄した後、フローサイトメトリーによる分析の前に500μlのIsoflow中で細胞を懸濁させた。B細胞、NK細胞、単球および好中球を、それぞれ抗CD19、抗CD56、抗CD14および抗CD15抗体で特異的に標識した。抗CD16 3G8抗体を用いて、FcγRIII受容体(CD16)を明らかにした。
特発性血小板減少性紫斑病(ITP)に罹患した患者の自己抗体が関与する、ITPで見られる赤血球溶解状況を模倣するため、抗RhesusD(RhD)モノクローナル抗体の存在下でエフェクター細胞により媒介される赤血球溶解を行ない、例えばエフェクター細胞の表面におけるFc受容体の固定のための抗RhDとの競合により、この溶解を阻害する異なる数量の多価免疫グロブリン(IVIg)または突然変異したまたは突然変異していない組換え型Fcフラグメントの能力を評価した。
[(33nMで試料を伴うADCC−IVIg無しのADCC)/(33nMでIgIVを伴うADCC−IVIg無しのADCC)×100]
この試験は、リツキサンを用いてRajiセルラインにより誘発されたヒトCD64を発現するJurkat細胞(Jurkat−H−CD64)によるIL2分泌を阻害する、本発明に係るFc変異体またはIgIVの能力(合計IgG)を推定する。
(IL−2IgIV/試料のIL−2)×100
この試験は、補体源としての子ウサギの血清の存在下でのRajiセルラインでリツキシマブにより媒介されるCDC活性を阻害する、本発明に係るFc変異体またはIgIVの能力を推定する。簡単に言うと、Raji細胞を、50ng/mlの最終濃度のリツキシマブと共に30分間インキュベートした。1/10に希釈し、37℃で1時間、本発明に係る変異体またはIgIV(vol/vol)と共に予めインキュベートした子ウサギの血清溶液を、添加した。37℃で1時間のインキュベーションの後、プレートを遠心分離し(1分間125g)、培地中に遊離した細胞内LDHを測定することによって、CDCを推定した。
結果を、図4および5で示している。
実施例2で説明したものと同じ要領で配列番号14から、組換え型Fcフラグメントを得ることができる。この突然変異したFcフラグメントは、CHO−Sセルラインでの発現のために最適化されたベクターを使用して、Freestyle Max Reagent(Thermofisher)などのリポフェクション試薬を用いてこのCHO−S細胞内でトランスフェクションにより産生可能である。CHO−S細胞を、37℃で制御された雰囲気(CO2 8%)中において135rpmで撹拌された条件の下で、CDFortiCHO+8mMのグルタミンの培地内で培養する。トランスフェクション日の前日に、6×105細胞/mlの密度で細胞を播種する。
Fc受容体に対する結合試験を、以下の分子を用いて実施する。
−本発明の変異体、実施例3に記された方法にしたがってCHO細胞内で産生されたA3A−184AY_CHO(K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y)、A3A−184EY_CHO(Y296W/K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y)、実施例1中で説明された方法にしたがってトランスジェニックヤギにおいて産生されたA3A−184AY_TGg、
− FcRn受容体に対してのみ最適化された結合を有するものとして文献中(Ulrichtsら、JCI、2018)に記載されている突然変異M252Y/S254T/T256E/H433K/N434Fを含むFcフラグメントMST−HNは、HEK−293細胞(293−F細胞、freestyle Invitro Gen)中で産生された、
−トランスジェニックヤギの乳中で産生されたIgG1をパパインで消化することによって得られる、野生Fcフラグメント「Fc−WT」または「Fc−Rec」、
−IgIV。
A488マーカーで標識されたリツキサン(Rituxan−A488)およびFcRn受容体を発現するJurkat細胞(Jurkat−FcRn)を使用して、競合試験によりFcRnに対する結合を研究する。
ヒトCD64(hCD64)に対する結合
Rituxan−A488およびCD64受容体を発現するJurkat細胞(Jurkat−CD64)を使用して、競合試験によりヒトCD64に対する結合を研究する。
CD32aHおよびCD32aR受容体(HEK−CD32)を用いてトランスフェクトされたHEK細胞およびRituxan−A488を使用して、競合試験によりヒトCD32受容体に対する結合を研究する。
フィコエルスリン(3G8−PE)で標識されたマウス抗CD16 3G8抗体、およびヒトCD16aH受容体を用いてトランスフェクトされたJurkat細胞(Jurkat−CD16aH)を使用して、競合試験によりヒトCD16aHに対する結合を研究する。
hCD16aV受容体(R&D system)His Tagを、速度論的緩衝液(Pall)中1μ/mlに希釈された状態で、抗Penta−HISバイオセンサ(HIS 1K)上で固定化させる。分子を、速度論的緩衝液中で1000、500、250、125、62.5、31.25、15および0nMの濃度で試験した。
−試験の設計:全ステップを、速度論的緩衝液(Pall)中で実施する。
ベースライン 1×60秒
ローディング 400秒
ベースライン 2×60秒
会合 60秒
解離 30秒
再生 再生緩衝液(グリシン10mM pH1.5/中和:PBS)中で5秒
会合および解離曲線(最初の5秒)を使用して、会合モデル1/1を用いて会合速度定数(kon)および解離速度定数(koff)を計算する。その後、KD(nM)を計算する(kon/koff)。
ADCC阻害およびJurkat細胞活性化試験を、以下の分子を用いて実施する:
−本発明の変異体、実施例3に記された方法にしたがってCHO細胞内で産生されたA3A−184AY_CHO(K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y)、A3A−184EY_CHO(Y296W/K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y)、
−FcRn受容体に対してのみ最適化された結合を有するものとして文献中(Ulrichtsら、JCI、2018)に記載されている突然変異M252Y/S254T/T256E/H433K/N434Fを含むFcフラグメントMST−HNは、HEK−293細胞(293−F細胞、freestyle Invitro Gen)中で産生された、
−トランスジェニックヤギの乳中で産生されたIgG1をパパインで消化することによって得られる、野生Fcフラグメント「Fc−Rec」または「Fc−WT」、
−IgIV。
特発性血小板減少性紫斑病(ITP)に罹患した患者の自己抗体が関与する、ITPで見られる赤血球溶解状況を模倣するため、抗RhesusD(RhD)モノクローナル抗体の存在下でエフェクター細胞により媒介される赤血球溶解を行ない、例えばエフェクター細胞の表面におけるFc受容体の固定のための抗RhDとの競合により、この溶解を阻害すべき異なる数量の多価免疫グロブリン(IVIg)または突然変異したまたは突然変異していない組換え型Fcフラグメントの能力を評価した。
この試験は、リツキサンを用いてRaji細胞系統により誘発されたヒトCD64を発現するJurkat細胞(Jurkat−H−CD64)によるIL2分泌を阻害する、本発明に係るFc変異体またはIgIVの能力(合計IgG)を推定する。
血液細胞に対する結合試験を、以下の分子を用いて実施する:
−本発明の変異体、実施例3に記された方法にしたがってCHO細胞内で産生されたA3A−184AY_CHO(K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y)、A3A−184EY_CHO(Y296W/K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y)、実施例1中で説明された方法にしたがってトランスジェニックヤギにおいて産生されたA3A−184AY_TGg、
−FcRn受容体に対してのみ最適化された結合を有するものとして文献中(Ulrichtsら、JCI、2018)に記載されている突然変異M252Y/S254T/T256E/H433K/N434Fを含むFcフラグメントMST−HNは、HEK−293細胞(293−F細胞、freestyle Invitro Gen)中で産生された、
−トランスジェニックヤギの乳中で産生されたIgG1をパパインで消化することによって得られる、野生Fcフラグメント「Fc−Rec」または「Fc−WT」、
−IgIV。
−抗CD56で標識されたナチュラルキラー(NK)細胞(「%陽性NK細胞」)、
−抗CD14で標識された単球(「%陽性細胞」)、
−抗CD14および抗CD16 3G8抗体で標識された単球CD16+(「%陽性細胞」)、
−抗CD15で標識された好中球(「%陽性細胞」)。
マウスの血小板を枯渇させるために静脈内投与により抗血小板抗体6A6−hlgG1(体重1gあたり0.3μg)を注射することによってヒト化されたFcRn(遺伝子的背景B6のヘテロ接合体mFcRn−/−hFcRnTg 276、The Jackson Laboratory)を発現するマウスにおいて、疾病を誘発した。疾病の誘発から4時間後、6A6−hlgG1の注入24時間前に血液分析(血小板数)を実施した。IgIV(1000mg/kg)、Fc−Rec(380および750mg/kg)、Fc MST−HN(190mg/kg)およびFc A3A−184AY_CHO(190mg/kgおよび380mg/kg)を、血小板の枯渇の2時間前に腹腔内投与した。
・380mg/kgの用量のA3A 184AY_CHOの場合100%の血小板、
・190mg/kgの用量のA3A−184AY_CHOの場合106%の血小板、
・1000mg/kgの用量のIgIVの場合90%の血小板、
・750g/kgの用量のFc−WTの場合64%の血小板、
・380mg/kgの用量のFc−WTの場合75%の血小板、
・190mg/kgの用量の変異体MST−HNの場合61%の血小板。
Claims (21)
- Fcフラグメントを含む親ポリペプチドの変異体において、親ポリペプチドの親和性と比べ、FcRn受容体に対する増大した親和性、ならびにFcγRI受容体(CD64)、FcγRIIIa受容体(CD16a)およびFcγRIIa受容体(CD32a)の中から選択された少なくとも1つのFcフラグメントの受容体(FcR)に対する増大した親和性を有する変異体であって、
(i)4つの突然変異334N、352S、378Vおよび397Mと、
(ii)434Y 434S、226G、P228L、P228R、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、362R、389Tおよび389Kの中から選択された少なくとも1つの突然変異と
を含み、
付番がKabat中のEUインデックスまたは等価物の付番であること、
を特徴とする変異体。 - Y296W、K290G、V240H、V240I、V240M、V240N、V240S、F241H、F241Y、L242A、L242F、L242G、L242H、L242I、L242K、L242P、L242S、L242T、L242V、F243L、F243S、E258G、E258I、E258R、E258M、E258Q、E258Y、V259C、V259I、V259L、T260A、T260H、T260I、T260M、T260N、T260R、T260S、T260W、V262S、V263T、V264L、V264S、V264T、V266L、S267A、S267Q、S267V、K290D、K290E、K290H、K290L、K290N、K290Q、K290R、K290S、K290Y、P291G、P291Q、P291R、R292I、R292L、E293A、E293D、E293G、E293M、E293Q、E293S、E293T、E294A、E294G、E294P、E294Q、E294R、E294T、E294V、Q295I、Q295M、Y296H、S298A、S298R、Y300I、Y300V、Y300W、R301A、R301M、R301P、R301S、V302F、V302L、V302M、V302R、V302S、V303S、V303Y、S304T、V305A、V305F、V305I、V305L、V305RおよびV305Sの中から選択されたFcフラグメント内の少なくとも1つの突然変異(iii)をさらに含み、
付番がKabat中のEUインデックスまたは等価物の付番である、請求項1に記載の変異体。 - (i)4つの突然変異334N、352S、378Vおよび397Mと、
(ii)434Y 434S、226G、P228L、P228R、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、362R、389Tおよび389Kの中から選択された少なくとも1つの突然変異と、
(iii)K290GおよびY296Wの中から選択された少なくとも1つの突然変異と
を含み、
付番がKabat中のEUインデックスまたは等価物の付番であること、
を特徴とする、請求項1または2に記載の変異体。 - 親ポリペプチドの親和性に比べ、少なくとも2の比率に等しい、好ましくは5超、好ましくは10超、好ましくは15超、好ましくは20超、好ましくは25超、好ましくは30超の比率で増大した、FcRn受容体に対する親和性を有する、請求項1から3のいずれか一つに記載の変異体。
- 親ポリペプチドの親和性に比べ、少なくとも2の比率に等しい、好ましくは5超、好ましくは10超、好ましくは15超、好ましくは20超、好ましくは25超、好ましくは30超の比率で増大した、FcγRI受容体(CD64)、FcγRIIIa受容体(CD16a)およびFcγRIIa受容体(IC32a)の中から選択された少なくとも1つのFcフラグメントの受容体(FcR)に対する親和性を有する、請求項1から4のいずれか一つに記載の変異体。
- トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞内で産生されることを特徴とする、請求項1から5のいずれか一つに記載の変異体。
- 非ヒトトランスジェニック動物において、好ましくは、トランスジェニック非ヒト哺乳動物において産生されることを特徴とする、請求項1から6のいずれか一つに記載の変異体。
- 非ヒトトランスジェニック動物がトランスジェニックヤギであることを特徴とする、請求項7に記載の変異体。
- 親ポリペプチドが、ヒトFcフラグメント、好ましくはヒトIgG1またはヒトIgG2のFcフラグメントであるか、より優先的には配列番号1〜10および14の配列の中から選択される親Fcフラグメントを含むことを特徴とする、請求項1から8のいずれか一つに記載の変異体。
- 単離Fcフラグメント、単離Fcフラグメントから誘導された配列、抗体、Fcフラグメントを含む抗体フラグメント、およびFcフラグメントを含む融合タンパク質の中から選択されることを特徴とする、請求項1から9のいずれか一つに記載の変異体。
- 腫瘍抗原、ウィルス抗原、細菌抗原、真菌抗原、毒素、膜サイトカインまたは循環サイトカイン、膜受容体の中から選択された抗原に対して向けられた、請求項1から10のいずれか一つに記載の変異体。
- 薬剤として使用するための請求項1から11のいずれか一つに記載の変異体。
- 好ましくは、免疫性血小板減少性紫斑病、視神経脊髄炎またはデビック病および多発性硬化症の中から選択された、自己免疫性または炎症性病理の治療において使用するための、請求項1から11のいずれか一つに記載の変異体。
- 請求項1から13のいずれか一つに記載の変異体、および医薬的に許容可能な少なくとも1つの賦形剤を含む医薬組成物。
- Fcフラグメントを含む親ポリペプチドの変異体の産生方法において、前記変異体が親ポリペプチドの親和性と比べ、FcRn受容体に対する増大した親和性、ならびにFcγRI受容体(CD64)、FcγRIIIa受容体(CD16a)およびFcγRIIa受容体(CD32a)の中から選択された少なくとも1つのFcフラグメントの受容体(FcR)に対する増大した親和性を有し、
(i)4つの突然変異334N、352S、378Vおよび397Mと、
(ii)434Y 434S、226G、P228L、P228R、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、362R、389Tおよび389Kの中から選択された少なくとも1つの突然変異と、
を含み、
付番がKabat中のEUインデックスまたは等価物の付番であること、を特徴とし、
トランスジェニック非ヒト哺乳動物の乳房上皮細胞内での前記変異体の発現を含むか、または
培養中の哺乳動物細胞内での前記変異体の発現を含む、
方法。 - 前記変異体が、Y296W、K290G、V240H、V240I、V240M、V240N、V240S、F241H、F241Y、L242A、L242F、L242G、L242H、L242I、L242K、L242P、L242S、L242T、L242V、F243L、F243S、E258G、E258I、E258R、E258M、E258Q、E258Y、V259C、V259I、V259L、T260A、T260H、T260I、T260M、T260N、T260R、T260S、T260W、V262S、V263T、V264L、V264S、V264T、V266L、S267A、S267Q、S267V、K290D、K290E、K290H、K290L、K290N、K290Q、K290R、K290S、K290Y、P291G、P291Q、P291R、R292I、R292L、E293A、E293D、E293G、E293M、E293Q、E293S、E293T、E294A、E294G、E294P、E294Q、E294R、E294T、E294V、Q295I、Q295M、Y296H、S298A、S298R、Y300I、Y300V、Y300W、R301A、R301M、R301P、R301S、V302F、V302L、V302M、V302R、V302S、V303S、V303Y、S304T、V305A、V305F、V305I、V305L、V305RおよびV305Sの中から選択されたFcフラグメント内の少なくとも1つの突然変異(iii)をさらに含み、
付番がKabat中のEUインデックスまたは等価物の付番であること、
を特徴とする、請求項15に記載のFcフラグメントを含む親ポリペプチドの変異体の産生方法。 - a)変異体についてコードする配列、哺乳動物のカゼインプロモーターまたは哺乳動物の乳清プロモーターについてコードする配列、および前記変異体の分泌を可能にするシグナルペプチドについてコードする配列を含むDNA配列を調製するステップと、
b)a)で得たDNA配列を非ヒト哺乳動物の胚中に導入して、乳腺内でa)において得られた前記DNA配列によりコードされた変異体を発現するトランスジェニック非ヒト哺乳動物を得るステップと、および
c)b)で得られたトランスジェニック非ヒト哺乳動物によって産生された乳中の変異体を回収するステップと
を含む、請求項15または16に記載のFcフラグメントを含むポリペプチドの変異体の産生方法。 - トランスジェニック非ヒト哺乳動物が、ウシ類、ブタ類、ヤギ類、ヒツジ類、およびゲッ歯類の中から、好ましくはヤギ、マウス、雌ブタ、雌ウサギ、雌ヒツジおよび雌ウシの中から選択される、請求項15から17のいずれか一つに記載のFcフラグメントを含むポリペプチドの変異体の産生方法。
- a)変異体についてコードするDNA配列を調製するステップと、
b)過渡的または安定的に、培養中の哺乳動物細胞内にa)で得たDNA配列を導入するステップと、
c)b)で得た細胞から変異体を発現するステップと、そして
d)培地内で変異体を回収するステップと
を含む、請求項15または16に記載のFcフラグメントを含むポリペプチドの変異体の産生方法。 - Fcフラグメントを含む親ポリペプチドの変異体をコードする遺伝子を含むDNA配列において、前記変異体が、親ポリペプチドの親和性と比べ、FcRn受容体に対する増大した親和性、ならびにFcγRI受容体(CD64)、FcγRIIIa受容体(CD16a)およびFcγRIIa受容体(CD32a)の中から選択された少なくとも1つのFcフラグメントの受容体(FcR)に対する増大した親和性を有し、
(i)4つの突然変異334N、352S、378Vおよび397Mと、
(ii)434Y 434S、226G、P228L、P228R、230S、230T、230L、241L、264E、307P、315D、330V、362R、389Tおよび389Kの中から選択された少なくとも1つの突然変異と
を含み、
付番がKabat中のEUインデックスまたは等価物の付番であること、を特徴とし、
任意には、前記変異体の分泌を可能にするシグナルペプチドについてコードする配列を含むDNA配列。 - 前記変異体がY296W、K290G、V240H、V240I、V240M、V240N、V240S、F241H、F241Y、L242A、L242F、L242G、L242H、L242I、L242K、L242P、L242S、L242T、L242V、F243L、F243S、E258G、E258I、E258R、E258M、E258Q、E258Y、V259C、V259I、V259L、T260A、T260H、T260I、T260M、T260N、T260R、T260S、T260W、V262S、V263T、V264L、V264S、V264T、V266L、S267A、S267Q、S267V、K290D、K290E、K290H、K290L、K290N、K290Q、K290R、K290S、K290Y、P291G、P291Q、P291R、R292I、R292L、E293A、E293D、E293G、E293M、E293Q、E293S、E293T、E294A、E294G、E294P、E294Q、E294R、E294T、E294V、Q295I、Q295M、Y296H、S298A、S298R、Y300I、Y300V、Y300W、R301A、R301M、R301P、R301S、V302F、V302L、V302M、V302R、V302S、V303S、V303Y、S304T、V305A、V305F、V305I、V305L、V305RおよびV305Sの中から選択されたFcフラグメント内の少なくとも1つの突然変異(iii)をさらに含み、
付番がKabat中のEUインデックスまたは等価物の付番である、請求項20に記載のFcフラグメントを含む親ポリペプチドの変異体をコードする遺伝子を含むDNA配列。
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