EP3724221A1 - Variants avec fragment fc ayant une affinité augmentée pour fcrn et une affinité augmentée pour au moins un récepteur du fragment fc - Google Patents

Variants avec fragment fc ayant une affinité augmentée pour fcrn et une affinité augmentée pour au moins un récepteur du fragment fc

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EP3724221A1
EP3724221A1 EP18829783.2A EP18829783A EP3724221A1 EP 3724221 A1 EP3724221 A1 EP 3724221A1 EP 18829783 A EP18829783 A EP 18829783A EP 3724221 A1 EP3724221 A1 EP 3724221A1
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EP
European Patent Office
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variant
fragment
cells
receptor
parent polypeptide
Prior art date
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Pending
Application number
EP18829783.2A
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German (de)
English (en)
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Harry Meade
Céline MONNET
Philippe Mondon
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LFB SA
Original Assignee
LFB SA
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Publication date
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Pending legal-status Critical Current

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    • C07K2317/73—Inducing cell death, e.g. apoptosis, necrosis or inhibition of cell proliferation
    • C07K2317/734—Complement-dependent cytotoxicity [CDC]
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    • C07K2317/90—Immunoglobulins specific features characterized by (pharmaco)kinetic aspects or by stability of the immunoglobulin
    • C07K2317/92—Affinity (KD), association rate (Ka), dissociation rate (Kd) or EC50 value

Definitions

  • Fc fragment variants having increased affinity for FcRn and increased affinity for at least one Fc receptor
  • the present invention relates to a polypeptide (also called variant) comprising a mutated Fc region and having increased affinity for the FcRn receptor as well as increased affinity for at least one Fc receptor (FcR) relative to a parent polypeptide .
  • An antibody consists of a tetramer of heavy and light chains.
  • the two light chains are identical to each other, and the two heavy chains are identical and connected by disulfide bridges.
  • There are five types of heavy chains (alpha, gamma, delta, epsilon, mu), which determine immunoglobulin classes (IgA, IgG, IgD, IgE, IgM).
  • the light chain group includes two subtypes, lambda and kappa.
  • IgGs are soluble antibodies that can be found in blood and other body fluids.
  • IgG is a Y-shaped glycoprotein with an approximate molecular weight of 150 kDa, consisting of two heavy and two light chains. Each chain stands out in a constant region and a variable region. The two carboxy-terminal domains of the heavy chains form the Fc fragment, whereas the amino-terminal domains of the heavy and light chains recognize the antigen and are named Fab fragment.
  • the Fc fusion proteins are created by a combination of an antibody Fc fragment with a protein domain that provides the specificity for a given therapeutic target. Examples are combinations of the Fc fragment with any type of therapeutic proteins or fragments thereof.
  • Fc polypeptides including Fc fragments, therapeutic antibodies and Fc fusion proteins, are used today to treat various diseases, such as rheumatoid arthritis, psoriasis, multiple sclerosis and many forms of cancer.
  • Therapeutic antibodies can be monoclonal or polyclonal antibodies.
  • the monoclonal antibodies are obtained from a single antibody producing cell line, which shows identical specificity for a single antigen.
  • the therapeutic Fc fusion proteins are used or developed as drugs against autoimmune diseases and / or inflammatory component, such as etanercept (Amgen's Enbrel, which is a Fc-bound TNF receptor) or Alefacept (Biogen Idea's Amevive, which is LFA-3 linked to the Fc portion of human IgGI).
  • the Fc polypeptides such as the Fc fragments, the Fc antibodies and fusion proteins, have, in particular, an activity dependent on the binding of their Fc part to their receptors, namely FcRn and the Fc fragment receptors (FcR), such as Fc ⁇ RI receptors (CD64), Fc ⁇ RI 1a (CD16a) and Fc ⁇ RIla (CD32a).
  • Fc-based therapies can act by blocking Fc receptors and thus by competing with autoantibodies for access to these receptors. This results in inhibition of direct activities normally mediated by autoantibodies (e.g., antibody-dependent cellular cytotoxicity, complement-dependent cytotoxicity, or antibody-dependent cellular phagocytosis) and decreased activation of the immune system, including cytokine release.
  • autoantibodies e.g., antibody-dependent cellular cytotoxicity, complement-dependent cytotoxicity, or antibody-dependent cellular phagocytosis
  • FcRn receptor is involved in the recycling of antibodies, blocking them with Fc polypeptides allows faster elimination of autoantibodies, thus reducing their half-life. This is why treatments based on Fc fragments are particularly suitable for autoimmune and / or inflammatory diseases, triggered by uncontrolled stimulation of the cells of the immune system, in particular by autoantibodies and / or cytokines.
  • IglV intravenous immunoglobulin
  • IgG intravenously immunoglobulins
  • Fc fragments have been developed for the purpose of modifying their Fc receptor binding properties. Nevertheless, their effectiveness remains to be demonstrated. There is still a need to optimize these Fc fragments, in particular to increase their half-life time, and / or their therapeutic efficacy.
  • Fc fragments exhibiting improved activity, in particular by an improved FcRn binding affinity. These Fc fragments can be used in therapy, and are particularly suitable for the treatment of inflammatory and / or autoimmune diseases, in order to bring greater effectiveness to the product that contains them.
  • these fragments may exhibit a more efficient blockade of Fc receptors present on the cells of the immune system, which are then less, or no longer, accessible for the binding of autoantibodies, whose activity is then inhibited.
  • Fc fragments make it possible to block the FcRn receptor more efficiently and thus to eliminate autoantibodies more quickly.
  • Fc fragments have, as demonstrated by example, better inhibition of complement-dependent cytotoxicity (CDC) than IVIG. They would therefore make it possible to reduce the toxicity of pathogenic autoantibodies, such as those involved in inflammatory and / or autoimmune diseases.
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • the present invention thus provides a variant of a parent polypeptide having optimized properties relating to functional activity mediated by the Fc region.
  • the present invention thus relates to a variant of a parent polypeptide comprising an Fc fragment, said variant having an increased affinity for the FcRn receptor, and an increased affinity for at least one Fc receptor (FcR) selected from Fc ⁇ RI receptors.
  • FcR Fc receptor
  • CD64 Fc ⁇ RI1a
  • CD32a Fc ⁇ RIla
  • the variant according to the invention further comprises at least one mutation (iii) in the Fc fragment chosen from Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V240S, F241H, F241Y, L242A, L242F, L242G, L242H, L242I, L242K, L242P, L242S, L242T, L242V, F243L, F243S, E258G, E258I, E258R, E258M, E258Q, E258Y, V259C, V259I, V259L, T260A, T260H, T260I, T260M, T260N, T260R, T260S, T260W, V262S, V263T, V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S267Q, S267V, K290D, K290E, K
  • variant according to the invention variant according to the invention
  • mutant according to the invention mutant according to the invention
  • polypeptide according to the invention polypeptide according to the invention
  • the variant according to the invention has both an increased affinity for the FcRn receptor and an increased affinity for all Fc ⁇ RI (CD64), Fc ⁇ RIIIa (CD16 ⁇ ) and Fc ⁇ RIla (CD32 ⁇ ) receptors.
  • the variant according to the invention is capable of inhibiting complement-dependent cytotoxicity (CDC), attributed to a modification of binding to complement proteins, in particular C1 q.
  • CDC complement-dependent cytotoxicity
  • the variant according to the invention is different from the variant consisting of a Fc fragment, in particular of IgGI, having the five mutations N434Y, K334N, P352S, V397M and A378V, and produced in HEK293 cells, the numbering being that of EU index or equivalent in Kabat.
  • the variant according to the invention is different from the Fc fragment, in particular IgGI, N434Y / K334N / P352S / V397M / A378V produced in HEK293 cells, the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat.
  • the numbering of residues in the Fc region is that of the immunoglobulin heavy chain according to the EU index or equivalent in Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5th ed., Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, Maryland, 1991).
  • EU index or equivalent in Kabat refers to the US numbering of the residues of the human IgG1, IgG2, IgG3 or IgG4 antibody. This is illustrated on the IMGT website (http: //www.imat.ora/IMGTScientificChart/Numberina/Hu IGHGnber.html).
  • polypeptide or “protein” is meant a sequence comprising at least 100 amino acids covalently attached.
  • amino acid is meant one of the 20 naturally occurring amino acids or unnatural analogues.
  • the term "position” means a position in the sequence of a polypeptide. For the Fc region, the positions are numbered according to the EU index or equivalent in Kabat.
  • the term “antibodies” is used in the common sense. It corresponds to a tetramer that includes at least one Fc region, and two variable regions. Antibodies include, but are not limited to, full-length immunoglobulins, monoclonal antibodies, multi-specific antibodies, chimeric antibodies, humanized antibodies, and fully human antibodies.
  • the amino-terminal portion of each heavy chain comprises a variable region of about 100 to 10 amino acids responsible for antigen recognition. In each variable region, three loops are pooled to form an antigen binding site. Each of the loops is called a complementarity determining region (hereinafter referred to as a "CDR").
  • CDR complementarity determining region
  • IgGs have several subclasses, including IgG1, IgG2, IgG3 and IgG4.
  • the subclasses of IgM are in particular IgM1 and IgM2.
  • isotype is meant one of the subclasses of immunoglobulins defined by the chemical and antigenic characteristics of their constant regions.
  • the known isotypes of human immunoglobulins are IgG1, IgG2, IgG3, IgG4, IgA1, IgA2, IgM1, IgM2, IgD and IgE.
  • Full length IgGs are tetramers and consist of two identical pairs of two immunoglobulin chains, each pair having a light chain and a heavy chain, each light chain comprising the VL and CL domains, and each heavy chain comprising the VH domains.
  • Cy1 also called CH1
  • Cy2 also called CH2
  • Cy3 also called CH3
  • CH1 refers to positions 1-18 to 215
  • CH2 refers to positions 231 to 340
  • CH3 refers to positions 341 to 447 according to the EU index or equivalent in Kabat .
  • the IgG heavy chain also includes an N-terminal flexible hinge domain which refers to positions 216-230 in the case of IgGI.
  • the lower hinge range refers to positions 226 to 230 according to the EU index or equivalent in Kabat.
  • variable region is meant the region of an immunoglobulin which comprises one or more Ig domains substantially encoded by any of the VK, VA and / or VH genes that make up the kappa, lambda, and immunoglobulin heavy chains. , respectively.
  • Variable regions include complementarity determining regions (CDRs) and framework regions (FRs).
  • Fc or "Fc region” refers to the constant region of an antibody excluding the first immunoglobulin constant region (CH1) domain.
  • Fc refers to the last two domains (CH2 and CH3) of IgGI constant region, and to the flexible N-terminal hinge of these domains.
  • the Fc region corresponds to the residue C226 to its carboxy terminal end, ie the residues of the position 226 to 447, where the numbering is according to the EU index or equivalent in Kabat.
  • the Fc region used may further comprise a portion of the upper hinge region located between positions 216-226 according to the EU index or equivalent in Kabat; in this case, the Fc region used corresponds to the residues of heading 216 to 447, 217 to 447, 218 to 447, 219 to 447, 220 to 447, 221 to 447, 222 to 447, 223 to 447, 224 to 447 or 225 to 447, where the numbering is according to the EU index or equivalent in Kabat.
  • the Fc region used corresponds to the residues of position 216 to 447, where the numbering is according to the EU index or equivalent in Kabat.
  • the Fc region used is chosen from the sequences SEQ ID NO: 1 to 10 and 14.
  • parent polypeptide is meant a reference polypeptide.
  • the said parent polypeptide may be of natural or synthetic origin.
  • the parent polypeptide comprises an Fc region, referred to as the "parent Fc region". This Fc region may be selected from the group of wild-type Fc regions, their fragments and mutants.
  • the parent polypeptide comprises a human Fc fragment, preferably an Fc fragment of a human IgG1 or a human IgG2.
  • the parent polypeptide may include preexisting amino acid modifications in the Fc region (eg, Fc mutant) relative to wild type Fc regions.
  • the parent polypeptide is an isolated Fc region (ie an Fc fragment as such), a sequence derived from an isolated Fc region, an antibody, an antibody fragment comprising an Fc region, a fusion protein comprising a Fc region or a conjugate Fc, this list not being limiting.
  • sequence derived from an isolated region Fc is meant a sequence comprising at least two isolated Fc regions linked together, such as a scFc (single chain Fc) or a multimer Fc.
  • fusion protein comprising an Fc region is meant a polypeptide sequence fused to an Fc region, said polypeptide sequence being preferably selected from variable regions of any antibody, receptor binding sequences to its ligand, adhesion molecules, ligands, enzymes, cytokines and chemokines.
  • Fc conjugate is meant a compound which is the result of the chemical coupling of an Fc region with a conjugation partner.
  • the conjugation partner may be protein or non-protein.
  • the coupling reaction generally utilizes functional groups on the Fc region and the conjugation partner.
  • Various linking groups are known in the art as being suitable for the synthesis of a conjugate; for example, homo-or heterobifunctional linkers are well known (see, Pierce Chemical Company catalog, 2005-2006, technical section on crosslinking agents, pages 321-350).
  • Suitable conjugation partners include therapeutic proteins, labels, cytotoxic agents such as chemotherapeutic agents, toxins and their active fragments. Suitable toxins and fragments thereof include diphtheria toxin, exotoxin A, ricin, abrin, saporin, gelonin, calicheolyin, auristatin E and F, and mertansin.
  • the parent polypeptide - and therefore the polypeptide according to the invention - consists of an Fc region.
  • the parent polypeptide - and therefore the polypeptide according to the invention - is an antibody.
  • mutation is meant a change of at least one amino acid of the sequence of a polypeptide, including a change of at least one amino acid of the Fc region of the parent polypeptide.
  • the mutated polypeptide thus obtained is a variant polypeptide; it is a polypeptide according to the invention.
  • Such a polypeptide comprises a mutated Fc region, relative to the parent polypeptide.
  • the mutation is a substitution, an insertion or a deletion of at least one amino acid.
  • substitution is meant the replacement of an amino acid at a particular position in a parent polypeptide sequence by another amino acid.
  • the N434S substitution refers to a variant polypeptide, in this case a variant for which asparagine at position 434 is replaced by serine.
  • amino acid insertion or “insertion” is meant the addition of an amino acid at a particular position in a parent polypeptide sequence.
  • insertion G> 235-236 refers to a glycine insertion between positions 235 and 236.
  • amino acid deletion or “deletion” is meant the deletion of an amino acid at a particular position in a parent polypeptide sequence.
  • E294del refers to the removal of glutamic acid at position 294.
  • the following mutation label is used: "434S” or “N434S”, and means that the parent polypeptide comprises asparagine at position 434, which is replaced by serine in the variant.
  • the preferred format is "259I / 315D / 434Y” or "V259I / N315D / N434Y”.
  • FcRn or “neonatal Fc receptor” as used herein is meant a protein that binds to the Fc region of IgG and is encoded at least in part by a FcRn gene.
  • the functional FcRn protein comprises two polypeptides, often referred to as heavy chain and light chain.
  • the light chain is beta-2-microglobulin and the heavy chain is encoded by the FcRn gene.
  • FcRn or FcRn protein refers to the ⁇ -chain complex with beta-2-microglobulin.
  • the gene encoding FcRn is called FCGRT.
  • the variant according to the invention has an increased affinity for the FcRn receptor, relative to that of the parent polypeptide, of a ratio at least equal to 2, preferably greater than 5, preferably greater than 10, preferably greater than 15, preferably greater than 20, preferably greater than 25, preferably greater than 30.
  • the variant according to the invention has an increased half-life compared to that of the parent polypeptide.
  • the variant according to the invention has an increased half-life with respect to that of the parent polypeptide, of a ratio at least equal to 2, preferably greater than 5, preferably greater than 10, preferably greater than 15. preferably greater than 20, preferably greater than 25, preferably greater than 30.
  • IgG recycling One of the major functions of FcRn is known as IgG recycling. It consists of extracting IgG from the endothelial catabolism pathway of plasma proteins to restore them intact to the circulation. This recycling explains their half-life under normal physiological conditions (three weeks for IgG), while maintaining high plasma concentrations.
  • the transcytosis of IgG from one pole to the other of epithelia or endothelium is the second major function of FcRn to ensure their biodistribution in the body.
  • the variant according to the invention has an increased affinity for at least one receptor of the Fc fragment (FcR) chosen from the receptors Fc ⁇ RI (CD64), Fc ⁇ RIIIa (CD16 ⁇ ) and Fc ⁇ RIla (CD32 ⁇ ), with respect to that of the parent polypeptide. , a ratio at least equal to 2, preferably greater than 5, preferably greater than 10, preferably greater than 15, preferably greater than 20, preferably greater than 25, preferably greater than 30.
  • FcR Fc fragment
  • the Fc ⁇ RI receptor (CD64) is involved in phagocytosis and cell activation.
  • the Fc ⁇ RIIIa receptor (CD16a) is also involved in Fc-dependent activity, including ADCC and phagocytosis; it has a V / F polymorphism at position 158.
  • the Fc? RIIa receptor (CD32a) is, in turn, involved in platelet activation and phagocytosis; it has an H / R polymorphism at position 131.
  • the variant according to the invention has both an increased affinity for the FcRn receptor and an increased affinity for all Fc ⁇ RI (CD64), Fc ⁇ RIIIa (CD16 ⁇ ) and Fc ⁇ RIla (CD32 ⁇ ) receptors.
  • the affinity of a polypeptide comprising an Fc region for a FcR can be evaluated by methods well known in the art. For example, one skilled in the art can determine affinity (Kd) using surface plasmon resonance (SPR). Alternatively, one skilled in the art can perform an appropriate ELISA test. An appropriate ELISA assay compares the binding forces of the parent Fc and the mutated Fc. The detected signals specific for the mutated Fc and the parent Fc are compared. Binding affinity can be indifferently determined by evaluating whole polypeptides or evaluating isolated Fc regions thereof. Alternatively, one skilled in the art can perform an appropriate competitive test.
  • An appropriate competitive assay is used to determine the ability of the mutated Fc to inhibit the binding of a labeled FcR ligand when these are incubated simultaneously with cells expressing these receptors.
  • the binding of the labeled ligand to FcR is evaluated for example by flow cytometry.
  • the binding affinity of the Fc mutated at FcR is then determined by evaluating the variability of the average fluorescence intensity emitted by the labeled ligand bound to FcR.
  • the mutated Fc region of the polypeptide according to the invention comprises from 3 to 20 mutations relative to the parent polypeptide, preferably from 4 to 20 mutations.
  • from 3 to 20 amino acid modifications is meant 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 and Amino acid mutations.
  • it comprises from 4 to 15 mutations, preferably from 4 to 10 mutations relative to the parent polypeptide.
  • the mutated Fc region of the polypeptide according to the invention comprises at least one combination of 5 mutations, said combination comprising the four mutations (i) as described above, and at least one mutation (ii) as described herein. above the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat.
  • the mutated Fc region of the polypeptide according to the invention comprises a combination of 6 mutations, said combination comprising the four mutations (i) as described above, at least one mutation (ii) as described above, and at least one mutation (iii) as described above, the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat.
  • the mutated Fc region of the polypeptide according to the invention comprises the following mutations:
  • mutation (iii) when mutation (iii) is present, it is selected from K290G and Y296W,
  • the mutated Fc region of the polypeptide according to the invention comprises the following mutations:
  • the mutated Fc region of the polypeptide according to the invention comprises a combination of mutations chosen from the combinations: N434Y / K334N / P352S / V397M / A378V and N434Y / K334N / P352S / V397M / A378V / Y296W.
  • the polypeptide according to the invention is produced in mammary epithelial cells of transgenic non-human mammals.
  • the polypeptide according to the invention is produced in non-human transgenic animals, preferably in transgenic non-human mammals, more preferably in their mammary epithelial cells.
  • transgenic non-human mammal is meant a mammal chosen in particular from cattle, pigs, goats, sheep and rodents, preferably from the goat, the mouse, the sow, the rabbit, the ewe and the cow.
  • the non-human transgenic animal or the non-human transgenic mammal is a transgenic goat.
  • the variant according to the invention comprises at least the five mutations N434Y, K334N, P352S, V397M and A378V in its Fc fragment, and is produced in mammary epithelial cells of transgenic non-human mammals, or in transgenic non-transgenic animals. humans, preferably in transgenic non-human mammals, such as a goat.
  • Such a variant has both increased affinity for the FcRn receptor, and increased affinity for all Fc ⁇ RI (CD64), Fc ⁇ RI1a (CD16a) and Fc ⁇ RIla (CD32a) receptors.
  • the variant according to the invention is the Fc N434Y / K334N / P352S / V397M / A378V variant produced in mammary epithelial cells of transgenic non-human mammals.
  • the variant according to the invention is the Fc N434Y / K334N / P352S / V397M / A378V variant produced in non-human transgenic animals, preferably in transgenic non-human mammals, such as a goat.
  • Such a variant has both increased affinity for the FcRn receptor, and increased affinity for all Fc ⁇ RI (CD64), Fc ⁇ RIIIa (CD16 ⁇ ) and Fc ⁇ RIla (CD32 ⁇ ) receptors.
  • the variant according to the invention comprises the sequence SEQ ID NO: 1 1 or the sequence SEQ ID NO: 15.
  • the variant according to the invention is the variant Fc N434Y / K334N / P352S / V397M / A378V / Y296W produced in epithelial cells. mammals of transgenic non-human mammals.
  • the variant according to the invention is the Fc N434Y / K334N / P352S / V397M / A378V / Y296W variant produced in non-human transgenic animals, preferably in transgenic non-human mammals, such as a goat.
  • Such a variant has both increased affinity for the FcRn receptor, and increased affinity for all Fc ⁇ RI (CD64), Fc ⁇ RIIIa (CD16 ⁇ ) and Fc ⁇ RIla (CD32 ⁇ ) receptors.
  • the method for producing a variant according to the invention comprises the expression of said variant in mammary epithelial cells of transgenic non-human mammals.
  • the present invention also relates to a method for producing a variant of a parent polypeptide comprising an Fc fragment, said variant having an increased affinity for the FcRn receptor, and an increased affinity for at least one Fc receptor (FcR) selected from FcyRI (CD64), Fc ⁇ RIIIa (CD16a) and Fc ⁇ RIla (CD32a) receptors, relative to that of the parent polypeptide, said variant comprising:
  • said method comprising expressing said variant in mammary epithelial cells of transgenic non-human mammals.
  • said variant further comprises at least one mutation (iii) in the Fc fragment chosen from Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V240S, F241H, F241Y, L242A, L242F, L242G, L242H, L242I, L242K, L242P, L242S, L242T,
  • V259L T260A, T260H, T260I, T260M, T260N, T260R, T260S, T260W, V262S, V263T,
  • such a method comprises the following steps:
  • a) preparing a DNA sequence comprising a sequence encoding the variant, a sequence encoding a mammalian casein promoter or a mammalian whey promoter, and a sequence encoding a signal peptide permitting the secretion of said variant;
  • Step a) thus comprises the preparation of a DNA sequence comprising a sequence coding for the variant, a sequence coding for a mammalian casein promoter or a mammalian whey promoter, and a sequence coding for a signal peptide. allowing the secretion of said variant.
  • a DNA sequence comprising a sequence coding for the variant, a sequence coding for a mammalian casein promoter or a mammalian whey promoter, and a sequence coding for a signal peptide.
  • the sequence coding for the variant is a DNA sequence coding for the variant according to the invention.
  • this variant has the sequence SEQ ID NO: 1 1.
  • the corresponding sequence is the sequence SEQ ID NO: 13.
  • this variant has the sequence SEQ ID NO: 15. With the signal peptide, the corresponding sequence is the sequence SEQ ID NO: 16.
  • the coding sequence for a mammalian casein promoter or a mammalian whey promoter makes it possible to express the variant in the milk.
  • the person skilled in the art knows how to choose such a promoter.
  • a signal peptide is an amino acid sequence, preferably from 2 to 30 amino acids, located at the N-terminus of the Fc polypeptide variant, serving to address it in the mammalian milk.
  • the coding sequence for a signal peptide is interposed between the sequence coding for the variant and the promoter. Without such a sequence, the variant would remain in the breast tissue, and purification would be difficult and would require the sacrifice of the host animal.
  • the signal peptide can be cleaved upon secretion.
  • the coding sequence for the peptide signal may be one that is naturally associated with a parent polypeptide according to the invention.
  • the coding sequence for the signal peptide may be that of the milk protein from which the promoter is derived, ie, when the milk protein gene is digested in order to isolate the promoter, a DNA fragment is selected comprising both the promoter and the coding sequence the signal peptide directly downstream of the promoter.
  • Another alternative is to use a signal sequence derived from another secreted protein that is neither the milk protein normally expressed from the promoter nor a polypeptide according to the invention.
  • the signal peptide has the sequence SEQ ID NO: 12.
  • the DNA sequence used may comprise optimized codons.
  • Codon optimization aims to replace natural codons by codons whose transfer RNA (tRNA) carrying the amino acids are most common in the cell type considered.
  • tRNA transfer RNA
  • the mobilization of frequently encountered tRNAs has the major advantage of increasing the translation speed of messenger RNAs (mRNAs) and therefore of increasing the final titre (JM Carton et al., Protein Expr Purif, 2007).
  • Sequence optimization also plays on the prediction of mRNA secondary structures that could slow down reading by the ribosomal complex. Sequence optimization also has an impact on the percentage of G / C that is directly related to the half-life of the mRNAs and therefore to their potential to be translated (Chechetkin, J. of Theoretical Biology 242, 2006 922-934 ).
  • Codon optimization can be done by substitution of natural codons using codon frequency (Codon Usage Table) tables for mammals and more specifically for Homo sapiens.
  • codon frequency Codon Usage Table
  • step a) is comprised of the following steps:
  • step a there is obtained a DNA sequence comprising, from the N- to C-terminal end, the coding sequence for a mammalian casein promoter or a mammalian whey promoter, fused to the coding sequence for a signal peptide, itself fused to the coding sequence for the variant according to the invention.
  • the method according to the invention comprises a step b) of introducing the DNA sequence obtained in a) into a non-human mammalian embryo, in order to obtain a transgenic non-human mammal expressing the variant coded by said sequence. of DNA obtained in a) in the mammary gland.
  • the method according to the invention comprises a step c) of recovering the variant in the milk produced by the transgenic nonhuman mammal obtained in b).
  • Steps b) and c) are known from the prior art, in particular patent EP0264166.
  • such a process comprises, after step c), a purification step d) recovered milk.
  • the purification step d) can be carried out by any known method of the prior art, in particular by purification on protein A.
  • a step is described in particular in patent EP0264166.
  • the present invention also relates to a DNA sequence comprising a gene encoding a variant of a parent polypeptide comprising an Fc fragment, said variant having an increased affinity for the FcRn receptor, and an increased affinity for at least one fragment receptor.
  • Fc (FcR) selected from Fc ⁇ RI (CD64), Fc ⁇ RIIIa (CD16 ⁇ ) and Fc ⁇ RIla (CD32 ⁇ ) receptors, relative to that of the parent polypeptide, said variant comprising:
  • said gene being under the control of a transcriptional promoter of casein or mammalian whey which does not naturally control the transcription of said gene, said DNA sequence further comprising a sequence coding for a signal peptide allowing the secretion of said variant interposed between the sequence encoding the variant and the promoter.
  • said variant further comprising at least one mutation (iii) in the Fc fragment chosen from Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V240S, F241H, F241 Y, L242A, L242F, L242G , L242H, L242I, L242K, L242P, L242S, L242T, L242V, F243L, F243S, E258G, E258I, E258R, E258M, E258Q, E258Y, V259C, V259I, V259L, T260A, T260H, T260I, T260M, T260N, T260R, T260S , T260W, V262S, V263T, V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S267Q, S267V, K290D, K290E,
  • the present invention also relates to a DNA sequence comprising a gene encoding a variant of a parent polypeptide comprising an Fc fragment, said variant having an increased affinity for the FcRn receptor, and an increased affinity for at least one fragment receptor.
  • Fc (FcR) selected from Fc ⁇ RI (CD64), Fc ⁇ RIIIa (CD16 ⁇ ) and Fc ⁇ RIla (CD32 ⁇ ) receptors, relative to that of the parent polypeptide, said variant comprising:
  • said DNA sequence optionally comprising a sequence encoding a signal peptide permitting the secretion of said variant.
  • said variant further comprising at least one mutation (iii) in the Fc fragment chosen from Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V240S, F241H, F241 Y, L242A, L242F, L242G , L242H, L242I, L242K, L242P, L242S, L242T, L242V, F243L, F243S, E258G, E258I, E258R, E258M, E258Q, E258Y, V259C, V259I, V259L, T260A, T260H, T260I, T260M, T260N, T260R, T260S, T260W, V262S, V263T, V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S267Q, S267V, K290D, K290E, K
  • the polypeptide according to the invention can be produced in cultured mammalian cells.
  • the preferred cells are the YB2 / 0 rat line, the CHO hamster line, in particular the CHO dhfr- and CHO Lec13 lines, the PER cells.
  • the CHO hamster line is used.
  • the present invention also relates to a method for producing a variant of a parent polypeptide comprising an Fc fragment, said variant having an increased affinity for the FcRn receptor, and an increased affinity for at least one Fc receptor (FcR) selected from FcyRI (CD64), Fc ⁇ RI1a (CD16a) and Fc ⁇ RIla (CD32a) receptors, relative to that of the parent polypeptide, said variant comprising:
  • said method comprising expressing said variant in mammalian cells in culture.
  • said variant further comprising at least one mutation (iii) in the Fc fragment chosen from Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V240S, F241H, F241 Y, L242A, L242F, L242G , L242H, L242I, L242K, L242P, L242S, L242T, L242V, F243L, F243S, E258G, E258I, E258R, E258M, E258Q, E258Y, V259C, V259I, V259L, T260A, T260H, T260I, T260M, T260N, T260R, T260S , T260W, V262S, V263T, V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S267Q, S267V, K290D, K290E,
  • such a method comprises the following steps:
  • the introduction can be carried out transiently or stably (i.e. integration of the DNA sequence obtained in a) into the genome of the cells);
  • the present invention also relates to a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising (i) a polypeptide according to the invention, and (ii) at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • the subject of the present invention is also a pharmaceutical composition
  • a pharmaceutical composition comprising (i) the variant consisting of an Fc fragment, in particular of IgGI, exhibiting the five mutations N434Y, K334N, P352S, V397M and A378V, the numbering being that of the EU index. or equivalent in Kabat, and (ii) at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • the composition of the present invention comprises (i) the variant consisting of an Fc fragment, in particular of IgGI, having the six mutations N434Y, K334N, P352S, V397M and A378V, Y296W, the numbering being that of the index EU or equivalent in Kabat, and (ii) at least one pharmaceutically acceptable excipient.
  • the subject of the present invention is also the polypeptide according to the invention or the composition as described above, for its use as a medicament.
  • the subject of the present invention is also the use of the variant consisting of an Fc fragment, in particular of IgGI, exhibiting the five mutations N434Y, K334N, P352S, V397M and A378V, the numbering being that of the EU index or equivalent in Kabat. (ie variant N434Y / K334N / P352S / V397M / A378V) as a drug.
  • the subject of the present invention is also the use of the variant consisting of an Fc fragment, in particular of IgGI, presenting the six mutations N434Y, Y296W, K334N, P352S, V397M, A378V, and Y296W, the numbering being that of the index EU or equivalent in Kabat (ie variant N434Y / K334N / P352S / V397M / A378V / Y296W) as a drug.
  • the parent polypeptide - and therefore the polypeptide according to the invention - is an antibody.
  • the antibody may be directed against an antigen selected from a tumor antigen, a viral antigen, a bacterial antigen, a fungal antigen, a toxin, a membrane or circulating cytokine and a membrane receptor.
  • cancer When the antibody is directed against a tumor antigen, its use is particularly suitable in the treatment of cancers.
  • cancer is meant any physiological condition characterized by an abnormal proliferation of cells. Examples of cancers include carcinomas, lymphomas, blastomas, sarcomas (including liposarcomas), neuroendocrine tumors, mesotheliomas, meningiomas, adenocarcinomas, melanomas, leukemias and lymphoid malignancies. not being exhaustive.
  • Viral infections include infections caused by HIV, a retrovirus, a Coxsackie virus, smallpox virus, influenza, yellow fever, West Nile, a cytomegalovirus, a rotavirus or hepatitis B or C, this list is not exhaustive.
  • the antibody When the antibody is directed against a toxin, its use is particularly useful in the treatment of bacterial infections, for example infections with tetanus toxin, diphtheria toxin, anthrax toxins Bacillus anthracis, or in the treatment of infections by botulinum toxins, ricin toxins, shigatoxins, this list is not exhaustive.
  • Inflammatory and / or autoimmune diseases include thrombotic thrombocytopenic purpura (ITP), transplant and organ rejection, graft-versus-host disease, rheumatoid arthritis, systemic lupus erythematosus, various types of sclerosis, primary Sjögren's syndrome (or Sjögren's syndrome), autoimmune polyneuropathies such as multiple sclerosis, type I diabetes, autoimmune hepatitis, ankylosing spondylitis, Reiter's syndrome, gout arthritis, celiac disease, Crohn's disease, Hashimoto chronic thyroiditis (hypothyroidism), Adisson's disease, autoimmune hepatitis, Basedow (hyperthyroidism), ulcerative colitis, vasculitis and systemic vasculitis associated with ANCA (anti-cytoplasmic antibodies to neutrophils),
  • ITP thrombotic thrombocytopenic purpura
  • transplant and organ rejection graft-versus-host disease
  • the child including antiphospholipid syndrome, connective tissue disease, pulmonary autoimmune inflammation, Guillain-Barré syndrome, chronic inflammatory demyelinating polyradiculoneuropathy (PDCI), autoimmune thyroiditis, mellitis, myasthenia gravis , inflammatory autoimmune disease of the eye, optic neuromyelitis (Devia's disease), scleroderma, pemphigus, insulin resistance diabetes, polymyositis, Biermer's anemia, glomerulonephritis, Wegener's disease, Horton, periarthritis nodosa and Churg and Strauss syndrome, Still's disease, atrophic polychondritis, malaise of Behçet, monoclonal gammopathy, Wegener's granulomatosis, lupus, ulcerative colitis, psoriatic arthritis, sarcoidosis, collagenous colitis, dermatitis herpetiformis, familial Mediterranean fever, IgA glomerulonephritis
  • inflammatory diseases are also understood, such as acute respiratory distress syndrome (ARDS), acute septic arthritis, adjuvant arthritis, allergic encephalomyelitis, allergic rhinitis, allergic vasculitis, allergy, asthma, atherosclerosis, chronic inflammation due to chronic bacterial or viral infections, chronic obstructive pulmonary disease (COPD), coronary heart disease, encephalitis, inflammatory bowel disease, inflammatory osteolysis, inflammation associated with acute and delayed hypersensitivity reactions, inflammation associated with tumors, peripheral nerve injury or demyelinating diseases, inflammation associated with tissue trauma such as burns and ischemia, inflammation due to meningitis, multiorgan organ failure syndrome (multiple organ dysfunction syndrome, MODS), pulmonary fibrosis, sepsis and septic shock, Stevens-Johnson syndrome, undifferentiated arthritis, and undifferentiated spondyloarthropathies.
  • the autoimmune disease is idiopathic thrombotic purpura (ITP) and chronic inflammatory demyelinating poly
  • the autoimmune or inflammatory pathology is selected from immunologic thrombocytopenic purpura (also called idiopathic thrombocytopenic purpura, or ITP), optic neuromyelitis or deviant disease (OMN) and multiple sclerosis.
  • ITP immunologic thrombocytopenic purpura
  • OPN optic neuromyelitis or deviant disease
  • multiple sclerosis Multiple sclerosis and in particular studied thanks to a model of experimental autoimmune encephalomyelitis (EAE).
  • Figure 1 Production of variant A3A-184AY in goat milk and mouse using the vector Bc451
  • the NotI-NotI fragment is the prokaryotic fragment.
  • the NotI fragment (15730) - XhoI is the 3 'genomic sequence that contains the polyA signal.
  • BamHI - XhoI is the promoter region of beta casein.
  • the disease was induced by transferring 10 mI of K / BxN mouse serum intravenously on day 0 to C57 / BI / 6J mice.
  • the test molecules were administered once intraperitoneally at 0 h 2h before injection of K / BxN mouse serum.
  • the clinical score is obtained by summing the four-legged index:
  • 0 normal
  • 1 swelling of a joint
  • 2 swelling of more than one joint
  • 3 severe swelling of the entire joint (arbitrary units or arbitrary units).
  • Figure 3 Results of tests in a therapeutic model of arthritis induced by the transfer of K / BxN mouse serum
  • the disease was induced by transferring 10 mI of K / BxN mouse serum intravenously on day 0 to C57 / BI / 6J mice.
  • the test molecules were administered once intraperitoneally at 0, 72 hours after injection of K / BxN mouse serum (indicated by dotted lines).
  • the clinical score is obtained by summing the four-legged index:
  • 0 normal
  • 1 swelling of a joint
  • 2 swelling of more than one joint
  • 3 severe swelling of the entire joint (arbitrary units or arbitrary units).
  • IglV or Fc variants according to the invention labeled with Alexa were incubated at 65 nM (10 ⁇ g / ml for Fc in 2% CSF PBS) with target cells for 20 minutes on ice. After 2 washes in 2% CSF, the cells were suspended in 500mI Isoflow prior to flow cytometric analysis.
  • B cells labeled with anti-CD19 ("% positive B cells");
  • NK cells labeled with anti-CD56 ("% positive NK cells");
  • Raji cells 50mI at 5 x 10 6 cells / ml
  • Rituxan 50mI to 2m9 / ml
  • Jurkat cells expressing human CD64 Jurkat-H-CD64
  • PMA 50 mI to 40 ng / ml
  • IglV or the variant according to the invention RRC A3A-184AY
  • the plates were centrifuged (125 g for 1 minute) and NL2 contained in the supernatant was evaluated by ELISA.
  • Effector cells (mononuclear cells) (25 mI at 8 x 10 7 cells / ml) and Rh-positive RBCs (25 mI at 4 x 10 7 cells / ml final) were incubated with different concentrations (0 to 75 ng / ml).
  • ml) of anti-Rh-antibody D with an Effector / Target ratio of 2/1.
  • lysis was estimated by quantifying the hemoglobin released into the supernatant using a specific substrate (DAF).
  • DAF specific substrate
  • Raji cells were incubated for 30 minutes with a final concentration of 50 ng / ml of rituximab.
  • a solution of young rabbit serum diluted 1/10 and previously incubated with the variant Fc according to the invention (rFc A3A-184AY) or IglV (vol / vol) for 1 h at 37 ° C. was added. After 1 hour of incubation at 37 ° C, the plates were centrifuged (125 g for 1 minute) and the CDC was estimated by measuring the intracellular LDH released in the culture medium. The results were expressed as percent inhibition and compared to IgG and negative control (Fc without Fc function, ie rFc neg), 100% corresponding to a complete inhibition of lytic activity and 0% to the control value obtained without Fc or IglV.
  • IglV, Fc-Rec (wild-type Fc), Fc MST-HN or Fc variants according to the invention (A3A-184AY CHO, A3A-184EY CHO) labeled with Alexa-Fluor® were incubated at 65 nM (10 ⁇ g / ml).
  • NK Natural Killer
  • mice expressing humanized FcRn were induced in mice expressing humanized FcRn by injecting an anti-platelet antibody 6A6-hlgG1 (0.3pg / g body weight) intravenously to deplete platelets, also called thrombocytes, from mice.
  • Negative Control (“CTL PBS"), IglV (1000 mg / kg), Fc-Rec (Fc-wild) fragment (380 and 750 mg / kg), Fc MST-HN fragment (190 mg / kg) and the variant of the invention Fc A3A-184AY CHO (190 mg / kg and 380 mg / kg), were administered intraperitoneally 2 hours before platelet depletion. Platelet count was determined with an Advia Hematology system (Bayer). The number of platelets before the injection of antibodies was set at 100%.
  • An Fc fragment according to the invention can be produced in the milk of transgenic animals, by placing the coding sequence of the Fc fragment in a milk-specific expression vector.
  • the vector can be introduced into the genome of a transgenic mouse or goat by microinjection. Following the screening and identification of an animal with the transgene, the females are reproduced. Following the parturition, milking the females allows to recover their milk, in which the Fc could be secreted following the expression of the specific promoter of the milk.
  • a signal peptide (MRWSWIFLLLLSITSANA, SEQ ID NO: 12) is linked to the N-terminus of the protein sequence, in order to obtain the sequence SEQ ID NO: 13. It allows the secretion of the protein in milk, once expressed.
  • the nucleotide sequence has been optimized for expression in the goat mammary gland.
  • the sequence was optimized for the Bos taurus species by the algorithm of a synthetic gene provider (such as GeneArt).
  • the goat beta casein expression vector (Bc451) was used for the production of the A3A-184AY variant in mouse and goat milk (see Figure 1).
  • the beta casein vector, Bc451 was digested with XhoI (FIG. 1A).
  • the SalI fragment containing the Fc A3A-184AY variant coding region was inserted to generate the BC3180 FC A3A-184AY gene construct ( Figures 1B and 1C).
  • the DNA fragment for microinjection was then isolated from the prokaryotic vector.
  • BC3180 was digested with NotI and NruI ( Figure 1D).
  • the released 16.4kb fragment containing the Fc gene under the control of the beta casein promoter was then purified by gel elution. This DNA was then used in the microinjection stage.
  • the DNA fragment was inserted by microinjection into preimplantation mouse embryos. The embryos were then implanted in pseudopregnant females. The offspring that were born were screened for the presence of the transgene by PCR analysis.
  • the DNA fragment prepared for microinjection can also be used for the production of the Fc variant A3A-184AY in goat's milk.
  • Each mutation of interest in the Fc fragment of sequence SEQ ID NO: 14 was inserted by overlap PCR using two sets of primers adapted to integrate the targeted mutation (s) with the codon (s). encoding the desired amino acid.
  • the mutations to be inserted are close to the Fc sequence, they are added via the same oligonucleotide.
  • the fragments thus obtained by PCR were combined and the resulting fragment was amplified by PCR using standard protocols.
  • the PCR product was purified on 1% (w / v) agarose gel, digested with the appropriate restriction enzymes and cloned.
  • the biotinylated hFcRn receptor is immobilized on Streptavidin Biosensors, diluted to 0.7 ⁇ g / ml in run buffer (0.1 M phosphate buffer, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH6).
  • run buffer 0.1 M phosphate buffer, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH6.
  • Regeneration 120s in regeneration buffer (0.1 M phosphate buffer, 150 mM NaCl, 0.05% Tween 20, pH 7.8).
  • association and dissociation curves (first 10s) are used to calculate the kinetic constants of association (kon) and dissociation (koff) using a 1/1 association model. KD (nM) is then calculated (kon / koff).
  • the hCD16aV (R & D System) or hCD32aH (PX therapeutics) HisTag receptor is immobilized on anti-Penta-HIS Biosensors (HIS 1 K), diluted to 1 ⁇ g / ml in kinetic buffer (Pall).
  • the Fc variants according to the invention, WT and IglV, were tested at 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15 and 0 nM in kinetic buffer.
  • Regeneration 5s in regeneration buffer (Glycine 10mM pH 1 .5 / Neutralization: PBS).
  • association and dissociation curves (first 5s) are used to calculate the kinetic constants of association (kon) and dissociation (koff) using a 1/1 association model. KD (nM) is then calculated (kon / koff).
  • the variant Fc A3A 184AY (HEK) according to the invention exhibits both an increased affinity for the hFcRn receptor, and an increased affinity for the Fc ⁇ RIIIa (CD16a) and Fc ⁇ RIla (CD32a) receptors, and this, compared to Fc parent not mutated (Fc-WT) but also compared to IVIG.
  • K / BxN model was generated by crossing the transgenic mice for the KRN T cell receptor to the NOD mouse strain.
  • K / BxN F1 mice develop spontaneously develop a disease at 3 to 5 weeks of age and share many clinical features with human rheumatoid arthritis.
  • the disease was induced by transferring 10 mI of K / BxN mouse serum intravenously on day 0 to C57 / BI / 6J mice.
  • the molecules tested were administered once intraperitoneally at 0, 2h before or 72 hours after the injection of K / BxN mouse serum.
  • mice were monitored daily for signs and symptoms of arthritis to assess incidence and severity by adding the four-leg index:
  • 0 normal
  • 1 swelling of a joint
  • 2 swelling of more than one joint
  • 3 severe swelling of the entire joint.
  • treatment with the Fc WT fragment at 750 mg / kg significantly reduced the clinical score compared to the group. treated with K / BxN mouse serum.
  • treatment with the variant Fc A3A-184AY (HEK) according to the invention significantly reduced the clinical score similarly to the Fc-WT fragment, but at a dose 4-fold lower (190 mg / kg) (FIG. 3).
  • IglV or Fc variants according to the invention labeled with Alexa were incubated at 65 nM (10 ⁇ g / ml for Fc in 2% CSF PBS) with target cells for 20 minutes on ice. After 2 washes in 2% CSF, the cells were suspended in 500mI Isoflow prior to flow cytometric analysis. B cells, NK cells, monocytes and neutrophils were specifically labeled with anti-CD19, anti-CD56, anti-CD14 and anti-CD15 respectively.
  • the Fc ⁇ RIII receptor (CD16) was demonstrated using the anti-CD16 3G8 antibody.
  • an effector cell-mediated red cell lysis in the presence of an anti-human monoclonal antibody was conducted, and the ability of different amounts of polyvalent immunoglobulins (IVIg) or mutated or non-mutated recombinant Fc fragments, to inhibit this lysis, for example by competition with anti-RhD for fixation Fc receptors on the surface of the effector cells were evaluated.
  • effector cells monoonuclear cells
  • Rh-positive red cells 25 to 4 x 10 7 cells / ml final
  • DAF specific substrate
  • results are expressed as a percentage of specific lysis as a function of the amount of antibody.
  • the inhibition of ADCC induced by IglV or the Fc variant according to the invention (RFC A3A-184AY) added to 33 nM was evaluated.
  • the results are expressed in percent, 100% and 0% being the values obtained with IglV at 650 nM and 0 nM respectively according to the following formula:
  • This test estimates the ability of the Fc variants according to the invention or IgG (total IgG) to inhibit the secretion of IL2 by Jurkat cells expressing human CD64 (Jurkat-H-CD64) induced by the Raji cell line with Rituxan.
  • Raji cells 50mI at 5 x 10 6 cells / ml
  • Rituxan 50mI at 2mg / ml
  • Jurkat H-CD64 cells 25mI at 5 x 10 6 cells / ml
  • PMA phorbol ester
  • the plates were centrifuged (125 g for 1 minute) and NL2 contained in the supernatant was evaluated by ELISA.
  • This assay estimates the ability of the Fc variant according to the invention or IgGV to inhibit rituximab-mediated CDC activity on the Raji cell line in the presence of rabbit serum as a source of complement. Briefly, Raji cells were incubated for 30 minutes with a final concentration of 50 ng / ml of rituximab. A solution of young rabbit serum diluted 1/10 and previously incubated with the variant according to the invention or IglV (vol / vol) for 1 h at 37 ° C was added. After 1 hour of incubation at 37 ° C, the plates were centrifuged (125 g for 1 minute) and the CDC was estimated by measuring the intracellular LDH released in the culture medium.
  • results were expressed as percentage inhibition and compared to IgG and negative control (Fc without Fc function), 100% corresponding to a complete inhibition of lytic activity and 0% to the control value obtained without Fc or IglV.
  • the Fc variant according to the invention (A3A-184AY (HEK)) has a better inhibition of the activity of the Jurkat cells expressing CD64, of the ADCC and of the CDC, in comparison with the IVIg. .
  • A3A-184AY can be effective for the treatment of pathologies involving patient autoantibodies, in particular by blocking Fc receptors on the effector cells of the patient (see FIG. 4).
  • the recombinant Fc fragment can be obtained from SEQ ID NO: 14 in the same manner as that described in Example 2.
  • This mutated Fc fragment can be produced by transfection into CHO-S cells with the aid of lipofection such as Freestyle Max Reagent (Thermofisher) using a vector optimized for expression in this cell line.
  • the CHO-S cells are cultured in CD FortiCHO medium + 8 mM Glutamine, under conditions agitated at 135 rpm in a controlled atmosphere (8% CO 2 ) at 37 ° C. On the day before the day of transfection, the cells are seeded at a density of 6.10 5 cells / ml.
  • the linearized DNA (50 ⁇ g) and 50 ⁇ l of transfection agent (AT) are pre-incubated separately in Opti-Pro SFM medium and then mixed and incubated for 20 minutes to allow the formation of the DNA complex. / AT.
  • the whole is then added to a cell preparation of 1.10 6 cells / ml in a volume of 30 ml.
  • transfection agents are added (Neomycin 1 g / L and Methotrexate 200 nM) to the cells.
  • the cell density and viability are determined every 3-4 days and the culture volumes adapted to maintain a cell density greater than 6.10 5 cells / ml.
  • the stable pools obtained are saved by freeze-thaw and productions in agitated conditions are carried out in "Fedbatch" mode for 10 days with an addition of 4g / L or 6g / L of glucose during production.
  • the cells and the supernatant are separated by centrifugation. The cells are removed and the supernatant is harvested, concentrated and filtered in 0.22 ⁇ m.
  • a protein A resin HiTrap protein A, GE Healthcare
  • Fc receptor binding assays are performed with the following molecules:
  • a wild-type Fc Fc-WT or Fc-Rec fragment obtained by digesting with papain an IgG1 produced in transgenic goat milk;
  • FcRn binding is studied by competitive assay using A488 labeled Rituxan (Rituxan-A488) and Jurkat cells expressing the FcRn receptor (Jurkat-FcRn).
  • the Jurkat-FcRn cells are seeded in a 96-well plate (V bottom) at a concentration of 2.10 5 cells per well. The cells are then incubated for 20 minutes at 4 ° C. with the test molecules diluted in buffer at the following final concentrations: 167 ⁇ g / ml; 83 ⁇ g / ml; 42 ⁇ g / ml; 21 ⁇ g / ml; 10 ⁇ g / ml; 5 ⁇ g / ml; 3 ⁇ g / ml; 1 ⁇ g / ml; 0 ⁇ g / ml, and simultaneously with 25 ⁇ g / ml Rituxan-A488. The cells are then washed by adding 100 ⁇ l of PBS at pH 6 and centrifuged at 1700 rpm for 3 minutes at 4 ° C. The supernatant is then removed and 300 ⁇ l of cold PBS is added at pH 6.
  • the binding of Rituxan-A488 to FcRn expressed by Jurkat-FcRn cells is evaluated by flow cytometry.
  • the mean fluorescence values (MFI) observed are expressed as a percentage, 100% being the value obtained with Rituxan-A488 alone and 0% the value in the absence of Rituxan-A488.
  • the molecular concentrations required to induce 50% inhibition of Rituxan-A488 binding to FcRn of Jurkat-FcRn cells are calculated using "Prism Software".
  • Fc A3A-184AY CHO, Fc A3A-184EY CHO and A3A-184AY-TGg variants show increased Rituxan-A488 binding inhibition (x100 compared to IVIg).
  • the variants of the invention show a FcRn binding affinity equivalent to that observed with the Fc MST-HN fragment described in the literature as optimized only for FcRn (Ulrichts et al, JCI, 2018).
  • Jurkat-CD64 cells are seeded in a 96-well plate (V-bottom) at a concentration of 2.10 5 cells per well. The cells are then incubated for 20 minutes at 4 ° C. with the test molecules diluted in the concentration buffer. final results: 167 pg / ml; 83 ⁇ g / ml; 42 ⁇ g / ml; 21 ⁇ g / ml; 10 ⁇ g / ml; 5 ⁇ g / ml; 3 ⁇ g / ml; 1 ⁇ g / ml; 0 ⁇ g / ml, and simultaneously with 25 ⁇ g / ml Rituxan-A488.
  • the cells are then washed by adding 1 ⁇ l of PBS at pH 6 and centrifuged at 1700 rpm for 3 minutes at 4 ° C. The supernatant is then removed and 300 ⁇ l of cold PBS is added at pH 6.
  • the binding of Rituxan-A488 to CD64 expressed by Jurkat-CD64 cells is evaluated by flow cytometry.
  • the mean fluorescence values (MFI) observed are expressed as a percentage, 100% being the value obtained with Rituxan-A488 alone and 0% the value in the absence of rituxan-A488.
  • the molecular concentrations required to induce 50% inhibition of Rituxan-A488 binding to CD64 of Jurkat-CD64 cells are calculated using "Prism Software" software.
  • Human CD32 receptor binding is studied by competitive assay using Rituxan-A488 and HEK cells transfected with CD32aH and CD32aR receptors (HEK-CD32).
  • the HEK-CD32 cells are seeded in a 96-well plate (V bottom) at a concentration of 2.10 5 cells per well. The cells are then incubated for 20 minutes at 4 ° C. with the test molecules diluted in buffer at the following final concentrations: 333 ⁇ g / ml; 167 ⁇ g / ml, 83 ⁇ g / ml; 42 ⁇ g / ml; 21 ⁇ g / ml; 10 ⁇ g / ml; 5 ⁇ g / ml; 3 ⁇ g / ml; 1 ⁇ g / ml; 0 ⁇ g / ml, and simultaneously with 30 ⁇ g / ml Rituxan-A488.
  • the cells are then washed by adding 100 ⁇ l of PBS at pH 6 and centrifuged at 1700 rpm for 3 minutes at 4 ° C. The supernatant is then removed and 300 ⁇ l of cold PBS is added at pH 6.
  • the binding of Rituxan-A488 to CD32aH and CD32aR expressed by HEK-CD32 cells is evaluated by flow cytometry.
  • the mean fluorescence values (MFI) observed are expressed as a percentage, 100% being the value obtained with the Rituxan- A488_seul and 0% the value in the absence of Rituxan-A488.
  • the molecular concentrations required to induce 50% inhibition of Rituxan-A488 binding to CD32aH and CD32aR of HEK-CD32 cells are calculated using "Prism Software".
  • the binding to human CD16aH is studied by competitive assay using a murine anti-CD16 3G8 antibody labeled with phycoerythrin (3G8-PE) and Jurkat cells transfected with the human CD16aH receptor (Jurkat-CD16aH).
  • the Jurkat-CD16aH cells are seeded in a 96-well plate (V bottom) at a concentration of 2.10 5 cells per well. The cells are then incubated for 20 minutes at 4 ° C.
  • test molecules diluted in buffer at the following final concentrations: 83 ⁇ g / ml; 42 ⁇ g / ml; 21 ⁇ g / ml; 10 ⁇ g / ml; 5 ⁇ g / ml; 3 ⁇ g / ml; 1 ⁇ g / ml; 0 ⁇ g / ml, and simultaneously with 0.5 ⁇ g / ml mAb 3G8-PE.
  • the cells are then washed by adding 1 ⁇ l of PBS at pH 6 and centrifuged at 1700 rpm for 3 minutes at 4 ° C. The supernatant is then removed and 300 ⁇ l of cold PBS is added at pH 6.
  • the binding of mAb 3G8-PE to CD16aH expressed by Jurkat-CD16aH cells is evaluated by flow cytometry.
  • the average fluorescence values (MFI) observed are expressed as a percentage, 100% being the value obtained with the mAb 3G8-PE alone and 0% the value in the absence of mAb 3G8-PE.
  • the molecular concentrations required to induce 50% inhibition of mAb 3G8-PE binding to CD16aH of Jurkat-CD16aH cells are calculated using the "Prism Software" software.
  • A3A-184AY CHO Fc, A3A-184EY CHO Fc and A3A-184AY_TGg variants have an increased affinity for the Fc ⁇ RIIIa (CD16a), Fc ⁇ RI (CD64) and Fc ⁇ RIla (CD32a) receptors, compared to the Fc non mutated (Fc-WT) but also compared to IVIG.
  • the mutants of the invention show a very increased affinity for Fc ⁇ RIIIa (CD16a), Fc ⁇ RI (CD64) and Fc ⁇ RIla (CD32a) receptors compared to MST-HN.
  • HisTag hCD16aV (R & D System) receptor is immobilized on anti-Penta-HIS Biosensors (HIS 1 K), diluted to 1 ⁇ g / ml in kinetic buffer (Pall). The molecules were tested at concentrations of 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31, 25, 15 and 0 nM in kinetic buffer. -Loading before each sample
  • association and dissociation curves (first 5s) are used to calculate the kinetic constants of association (kon) and dissociation (koff) using a 1/1 association model. KD (nM) is then calculated (kon / koff).
  • Fc A3A-184AY CHO, Fc A3A-184EY CHO and A3A-184AY_TGg variants show a binding increase for the human Fc ⁇ RIIIa-V receptor (CD16a-V), and this, compared to the non-mutated Fc (Fc- WT) but also compared to IgM and Fc fragment MST-HN containing mutations M252Y / S254T / T256E / H433K / N434F.
  • EXAMPLE 5 ADCC Inhibition and Activation Tests of Jurkat Cells of Variants Produced in CHO Cells and in Transgenic Goat Milk
  • ADCC inhibition and Jurkat cell activation tests are performed with the following molecules:
  • a wild-type Fc "Fc-Rec” or "Fc-WT” fragment obtained by digesting with papain an IgG1 produced in transgenic goat's milk,
  • effector cells monoonuclear cells
  • Rh-positive red cells 25 to 4 x 10 7 cells / ml final
  • DAF specific substrate
  • the results are expressed as a percentage of specific lysis as a function of the amount of antibody.
  • the inhibition of ADCC is induced by the molecules tested (IgM, MST-HN, Fc-WT A3A-184AY CHO, A3A-184EY CHO) at concentrations of 500, 50, 5, 0.5 ⁇ g / ml. for MST-HN, Fc-WT A3A-184AY_CHO, A3A-184EY_CHO and 1500, 150, 15, 1, 5 ⁇ g / ml for IglV.
  • the molecule concentrations to induce 25% or 50% inhibition were calculated with the software "Prism Software".
  • A3A-184AY CHO or A3A-184EY CHO is greatly increased compared to the Fc fragment, MST-HN, containing the M252Y / S254T / T256E / H433K / N434F mutations.
  • This test estimates the ability of the Fc variants according to the invention or IgIV (total IgG) to inhibit the secretion of IL2 by Jurkat cells expressing human CD64 (Jurkat-H-CD64) induced by the Raji cell line with Rituxan.
  • Raji cells 50mI at 5 x 10 6 cells / ml
  • Rituxan 50mI at 2mg / ml
  • Jurkat H-CD64 cells 25mI at 5 x 10 6 cells / ml
  • PMA phorbol ester
  • the plates were centrifuged (125 g for 1 minute) and NL2 contained in the supernatant was evaluated by ELISA.
  • Inhibition of IL2 secretion was induced by IgIV, Fc-WT, MST-HN or Fc variants according to the invention (A3A-184AY CHO or A3A-184EY CHO) added at 50 and 100 ⁇ g / ml.
  • Fc-WT, MST-HN fragments or Fc variants according to the invention A3A-184AY CHO or A3A-184EY CHO
  • 150 and 300 ⁇ g / ml for IVIG was induced by IgIV, Fc-WT, MST-HN or Fc variants according to the invention (A3A-184AY CHO or A3A-184EY CHO) added at 50 and 100 ⁇ g / ml.
  • Fc-WT, MST-HN fragments or Fc variants according to the invention A3A-184AY CHO or A3A-184EY CHO
  • RFC A3A-184AY CHO or A3A-184EY CHO is greatly increased compared to the MST-HN Fc fragment containing the M252Y / S254T / T256E / H433K / N434F mutations.
  • the blood cell binding assays are performed with the following molecules:
  • M252Y / S254T / T256E / H433K / N434F described in the literature as having a binding optimized only to the FcRn receptor (Ulrichts et al, JCI, 2018) was produced in HEK-293 cells (293-F cells, Freestyle InvitroGen),
  • a wild-type Fc "Fc-Rec” or "Fc-WT” fragment obtained by digesting with papain an IgG1 produced in transgenic goat's milk,
  • the labeled molecules labeled with the Alexa Fluor® marker were incubated at 65 nM (10 ⁇ g / ml for Fc in 2% CSF PBS) with target cells for 20 minutes on ice.
  • NK cells Natural Killer (NK) cells labeled with anti-CD56 ("% positive NK cells”);
  • the Fc ⁇ RIII receptor (CD16) was demonstrated using the anti-CD16 3G8 antibody.
  • the disease was induced in mice expressing a humanized FcRn (mFcRn - / - hFcRnTg 276 heterozygous B6 gene background, The Jackson Laboratory) by injecting an anti-platelet antibody 6A6-hlgG1 (0.3pg / g body weight) by way intravenous to deplete the platelets of the mice.
  • a blood test is made (number of thrombocytes) 24 hours before the injection of 6A6-hlgG1, 4h after the induction of the disease.
  • IglV 1000 mg / kg
  • Fc-Rec 380 and 750 mg / kg
  • Fc MST-HN 190 mg / kg
  • Fc A3A-184AY CHO 190 mg / kg and 380 mg / kg
  • Platelet count was determined with an Advia Hematology system (Bayer). The number of platelets before the injection of antibodies was set at 100%.
  • the anti-platelet antibody 6A6-hlgG1 (0.3 .mu.g / g) makes it possible to deplete 90% of the platelets.

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Abstract

La présente invention a pour objet un Variant d'un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une affinité augmentée pour le récepteur FcRn, et une affinité augmentée pour au moins un récepteur du fragment Fc (FcR) choisi parmi les récepteurs FcγRI (CD64), FcγRIIIa (CD16a) et FcγRIIa (CD32a), par rapport à celle du polypeptide parent, caractérisé en ce qu'il comprend: (i) les quatre mutations 334N, 352S, 378V et 397M; et (ii) au moins une mutation choisie parmi 434Y, 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T et 389K; la numérotation étant celle de l'index EU ou équivalent dans Kabat.

Description

Variants avec fragment Fc ayant une affinité augmentée pour FcRn et une affinité augmentée pour au moins un récepteur du fragment Fc
La présente invention se rapporte à un polypeptide (appelé également variant) comprenant une région Fc mutée et présentant une affinité augmentée pour le récepteur FcRn ainsi qu’une affinité augmentée pour au moins un récepteur du fragment Fc (FcR) par rapport à un polypeptide parent.
Un anticorps est constitué d’un tétramère de chaînes lourdes et légères. Les deux chaînes légères sont identiques entre elles, et les deux chaînes lourdes sont identiques et reliées par des ponts disulfures. Il existe cinq types de chaînes lourdes (alpha, gamma, delta, epsilon, mu), qui déterminent les classes d'immunoglobulines (IgA, IgG, IgD, IgE, IgM). Le groupe de la chaîne légère comprend deux sous-types, lambda et kappa.
Les IgG sont des anticorps solubles qui peuvent être trouvés dans le sang et d'autres fluides corporels. L'IgG est une glycoprotéine en forme de Y avec un poids moléculaire approximatif de 150 kDa, composée de deux chaînes lourdes et deux chaînes légères. Chaque chaîne se distingue en une région constante et une région variable. Les deux domaines carboxy-terminaux des chaînes lourdes forment le fragment Fc, tandis que les domaines amino-terminaux des chaînes lourdes et légères reconnaissent l'antigène et sont nommés fragment Fab.
Les protéines de fusion Fc sont créées par une combinaison d'un fragment Fc d'anticorps avec un domaine protéique qui fournit la spécificité pour une cible thérapeutique donnée. Des exemples sont des combinaisons du fragment Fc avec tout type de protéines thérapeutiques ou leurs fragments.
Les polypeptides Fc, notamment les fragments Fc, les anticorps thérapeutiques et les protéines de fusion Fc, sont utilisés aujourd’hui pour traiter diverses maladies, comme la polyarthrite rhumatoïde, le psoriasis, la sclérose en plaques et de nombreuses formes de cancer. Des anticorps thérapeutiques peuvent être des anticorps monoclonaux ou polyclonaux. Les anticorps monoclonaux sont obtenus à partir d'une lignée cellulaire de production d'anticorps unique, qui montre une spécificité identique pour un seul antigène. Les protéines de fusion Fc thérapeutiques sont utilisées ou développées comme médicaments contre les maladies autoimmunes et/ou à composante inflammatoire, comme l'étanercept (Enbrel d’Amgen, qui est un récepteur TNF lié à un fragment Fc) ou Alefacept (Amevive de Biogen Idée, qui est LFA-3 lié à la portion Fc d’IgGI humaine).
Les polypeptides Fc, tels que les fragments Fc, les anticorps et protéines de fusion Fc, ont notamment une activité dépendante de la liaison de leur partie Fc à leurs récepteurs, à savoir le FcRn et les récepteurs du fragment Fc (FcR), tels que les récepteurs FcyRI (CD64), FcyRI lia (CD16a) et FcyRIla (CD32a).
L’un des effets recherchés dans les thérapies faisant intervenir les interactions de polypeptides Fc avec les récepteurs du fragment Fc (FcR), est une inhibition de l’activation du système immunitaire par liaison aux récepteurs Fc présents à la surface des cellules effectrices. Notamment dans le cadre du traitement de maladies inflammatoires et/ou auto-immunes, impliquant des autoanticorps et/ou cytokines, les thérapies à base de fragments Fc peuvent agir par blocage des récepteurs Fc et ainsi par compétition avec les autoanticorps pour l’accès à ces récepteurs. Cela entraîne une inhibition des activités directes normalement médiées par les autoanticorps (par exemple cytotoxicité cellulaire dépendante des anticorps, cytotoxicité dépendante du complément, ou phagocytose cellulaire dépendante des anticorps) et une diminution de l’activation du système immunitaire, notamment du relargage de cytokines. De plus, le récepteur FcRn étant impliqué dans le recyclage des anticorps, leur blocage par les polypeptides Fc permet une élimination plus rapide des autoanticorps, entraînant ainsi une diminution de leur demi-vie. C’est pourquoi, les traitements à base de fragments Fc sont particulièrement adaptés aux maladies auto-immunes et/ou inflammatoires, déclenchées par des stimulations incontrôlées des cellules du système immunitaire, notamment par des autoanticorps et/ou des cytokines.
La thérapie de base proposée pour le traitement de ces maladies est une thérapie à base d’immunoglobulines intraveineuses (IglV) qui consiste à administrer aux malades par voie intraveineuse des immunoglobulines (IgG le plus souvent) issues de pools de dons de plasma humain. Il est communément admis que ces IglV agissent notamment en bloquant les récepteurs Fc et ainsi en entrant en compétition avec les autoanticorps pour l’accès à ces récepteurs. Plus récemment, des fragments Fc ont été développés dans le but de modifier leurs propriétés de liaison aux récepteurs Fc. Néanmoins, leur efficacité reste à démontrer. Il existe toujours un besoin d’optimiser ces fragments Fc, de manière notamment à augmenter leur temps de demi-vie, et/ou leur efficacité thérapeutique.
La Demanderesse a maintenant mis au point des fragments Fc particuliers, présentant une activité améliorée, notamment par une affinité de liaison au FcRn améliorée. Ces fragments Fc peuvent être utilisés en thérapie, et sont notamment adaptés pour le traitement des maladies inflammatoires et/ou auto-immunes, en vue d’apporter une meilleure efficacité au produit qui les contient.
En particulier, ces fragments peuvent présenter un blocage plus efficace des récepteurs Fc présents sur les cellules du système immunitaire, qui sont alors moins, ou ne sont plus, accessibles pour la liaison des autoanticorps, dont l’activité est alors inhibée.
De plus, les fragments Fc permettent de bloquer plus efficacement le récepteur FcRn et d’éliminer ainsi plus rapidement les autoanticorps.
En outre, certains de ces fragments Fc particuliers présentent, comme cela est démontré en exemples, une meilleure inhibition de la cytotoxicité dépendante du complément (CDC) que les IgIV. Ils permettraient donc de diminuer la toxicité des autoanticorps pathogènes, tels que ceux qui sont impliqués dans les maladies inflammatoires et/ou auto-immunes.
La présente invention fournit ainsi un variant d'un polypeptide parent ayant des propriétés optimisées relatives à l’activité fonctionnelle médiée par la région Fc.
La présente invention se rapporte ainsi à un variant d’un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une affinité augmentée pour le récepteur FcRn, et une affinité augmentée pour au moins un récepteur du fragment Fc (FcR) choisi parmi les récepteurs FcyRI (CD64), FcyRIl la (CD16a) et FcyRIla (CD32a), par rapport à celle du polypeptide parent, caractérisé en ce qu’il comprend :
(i) les quatre mutations 334N, 352S, 378V et 397M ; et
(ii) au moins une mutation choisie parmi 434Y, 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241 L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T et 389K ;
la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat.
Selon un mode de réalisation, le variant selon l’invention comprend en outre au moins une mutation (iii) dans le fragment Fc choisie parmi Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V240S, F241 H, F241 Y, L242A, L242F, L242G, L242H, L242I, L242K, L242P, L242S, L242T, L242V, F243L, F243S, E258G, E258I, E258R, E258M, E258Q, E258Y, V259C, V259I, V259L, T260A, T260H, T260I, T260M, T260N, T260R, T260S, T260W, V262S, V263T, V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S267Q, S267V, K290D, K290E, K290H, K290L, K290N, K290Q, K290R, K290S, K290Y, P291 G, P291 Q, P291 R, R292I, R292L, E293A, E293D, E293G, E293M, E293Q, E293S, E293T, E294A, E294G, E294P, E294Q, E294R, E294T, E294V, Q295I, Q295M, Y296H, S298A, S298R, Y300I, Y300V, Y300W, R301 A, R301 M, R301 P, R301 S, V302F, V302L, V302M, V302R, V302S, V303S, V303Y, S304T, V305A, V305F, V305I, V305L, V305R et V305S,
la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat.
Un tel variant est appelé « variant selon l’invention », « mutant selon l’invention » ou « polypeptide selon l’invention ».
De préférence, le variant selon l’invention présente à la fois une affinité augmentée pour le récepteur FcRn, et une affinité augmentée pour tous les récepteurs FcyRI (CD64), FcyRIIIa (CD16a) et FcyRIla (CD32a).
De préférence, en outre, le variant selon l’invention est capable d’inhiber la cytotoxicité dépendante du complément (CDC), attribuée à une modification de liaison aux protéines du complément, en particulier le C1 q. Cette inhibition est significativement améliorée par rapport à celle conférée par des Ig IV.
De préférence, le variant selon l’invention est différent du variant consistant en un fragment Fc, notamment d’IgGI , présentant les cinq mutations N434Y, K334N, P352S, V397M et A378V, et produit en cellules HEK293, la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat. Ainsi, de préférence, le variant selon l’invention est différent du fragment Fc, notamment d’IgGI , N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V produit en cellules HEK293, la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat.
Tout au long de la présente demande, la numérotation des résidus dans la région Fc est celle de la chaîne lourde d'immunoglobuline selon l'index EU ou équivalent dans Kabat et al. (Sequences of Proteins of Immunological Interest, 5e éd. Public Health Service, National Institutes of Health, Bethesda, dans le Maryland, 1991 ). L’expression «index EU ou équivalent dans Kabat» fait référence à la numérotation EU des résidus de l'anticorps humain lgG1 , lgG2, lgG3 ou lgG4. Cela est illustré sur le site IMGT (http://www.imat.ora/IMGTScientificChart/Numberina/Hu IGHGnber.html). Par «polypeptide» ou «protéine», on entend une séquence comprenant au moins 100 acides aminés attachés de manière covalente.
Par «acide aminé», on entend l'un des 20 acides aminés naturels ou des analogues non naturels.
Le terme « position » signifie une position dans la séquence d’un polypeptide. Pour la région Fc, les positions sont numérotées selon l'indice de l'UE ou équivalent dans Kabat. Le terme «anticorps» est utilisé dans le sens commun. Il correspond à un tétramère qui comprend au moins une région Fc, et deux régions variables. Les anticorps comprennent notamment les immunoglobulines pleine longueur, les anticorps monoclonaux, les anticorps multi-spécifiques, les anticorps chimériques, les anticorps humanisés et les anticorps entièrement humains. La partie amino-terminale de chaque chaîne lourde comprend une région variable d'environ 100 à 1 10 acides aminés responsable de la reconnaissance de l'antigène. Dans chaque région variable, trois boucles sont rassemblées pour former un site de liaison à l'antigène. Chacune des boucles est appelée une région déterminant la complémentarité (ci-après dénommé un «CDR») La partie carboxy-terminale de chaque chaîne lourde définit une région constante principalement responsable de la fonction effectrice.
Les IgG ont plusieurs sous-classes, notamment lgG1 , lgG2, lgG3 et lgG4. Les sous- classes d’IgM sont notamment lgM1 et lgM2. Ainsi, par «isotype», on entend l'une des sous-classes d'immunoglobulines définies par les caractéristiques chimiques et antigèniques de leurs régions constantes. Les isotypes connus d'immunoglobulines humaines sont les lgG1 , lgG2, lgG3, lgG4, lgA1 , lgA2, lgM1 , lgM2, IgD et IgE.
Les IgG pleine longueur sont des tétramères et se composent de deux paires identiques de deux chaînes d'immunoglobulines, chaque paire ayant une chaîne légère et une chaîne lourde, chaque chaîne légère comprenant les domaines VL et CL, et chaque chaîne lourde comprenant les domaines VH, Cy1 (aussi appelé CH1 ), Cy2 (également appelé CH2), et Cy3 (également appelé CH3). Dans le cadre d’une lgG1 humaine, « CH1 » fait référence aux positions 1 18 à 215, « CH2 » renvoie aux positions 231 à 340 et « CH3 » se réfère aux positions 341 à 447 selon l’index EU ou équivalent dans Kabat. La chaîne lourde des IgG comprend également un domaine charnière flexible N-terminal qui se réfère aux positions 216 à 230 dans le cas d'IgGI . Le domaine charnière inférieur se réfère aux positions 226 à 230 selon l’index EU ou équivalent dans Kabat.
Par "région variable", on entend la région d'une immunoglobuline qui comprend un ou plusieurs domaines Ig sensiblement codés par l’un quelconque des gènes VK, VA et/ou VH qui composent les chaînes kappa, lambda, et lourde d'immunoglobuline, respectivement. Les régions variables comprennent les régions déterminant la complémentarité (CDR) et les régions charpente (FR).
Le terme "Fc" ou "région Fc" désigne la région constante d'un anticorps à l'exclusion du premier domaine de région constante d'immunoglobuline (CH1 ). Ainsi Fc fait référence aux deux derniers domaines (CH2 et CH3) de région constante d'IgGI , et à la charnière flexible N-terminale de ces domaines. Pour une lgG1 humaine, la région Fc correspond au résidu C226 jusqu’à son extrémité carboxy-terminale, soit les résidus de la position 226 à 447, où la numérotation est selon l’index EU ou équivalent dans Kabat. La région Fc utilisée peut comprendre en outre une partie de la région charnière supérieure, située entre les positions 216 à 226 selon l’index EU ou équivalent dans Kabat ; dans ce cas, la région Fc utilisée correspond aux résidus de la position 216 à 447, 217 à 447, 218 à 447, 219 à 447, 220 à 447, 221 à 447, 222 à 447, 223 à 447, 224 à 447 ou 225 à 447, où la numérotation est selon l’index EU ou équivalent dans Kabat. De préférence dans ce cas, la région Fc utilisée correspond aux résidus de la position 216 à 447, où la numérotation est selon l’index EU ou équivalent dans Kabat.
De préférence, la région Fc utilisée est choisie parmi les séquences SEQ ID NO :1 à 10 et 14.
Par «polypeptide parent», on entend un polypeptide de référence. Ledit polypeptide parent peut être d'origine naturelle ou synthétique. Dans le contexte de la présente invention, le polypeptide parent comprend une région Fc, appelée « région Fc parente ». Cette région Fc peut être choisie parmi le groupe de régions Fc de type sauvage, leurs fragments et leurs mutants. De préférence, le polypeptide parent comprend un fragment Fc humain, de préférence un fragment Fc d’une lgG1 humaine ou d’une lgG2 humaine. Le polypeptide parent peut comprendre des modifications d'acides aminés préexistantes dans la région Fc (par exemple un mutant Fc) par rapport à des régions Fc de type sauvage.
Avantageusement, le polypeptide parent est une région Fc isolée (i.e. un fragment Fc en tant que tel), une séquence dérivée d’une région Fc isolée, un anticorps, un fragment d’anticorps comprenant une région Fc, une protéine de fusion comprenant une région Fc ou un conjugué Fc, cette liste n'étant pas limitative.
Par « séquence dérivée d’une région Fc isolée », on entend une séquence comprenant au moins deux régions Fc isolées liées entre elles, telle qu’un scFc (single Chain Fc) ou un multimère Fc. Par « protéine de fusion comprenant une région Fc », on entend une séquence polypeptidique fusionnée à une région Fc, ladite séquence polypeptidique étant de préférence choisie parmi les régions variables de tout anticorps, les séquences de liaison d'un récepteur à son ligand, les molécules d'adhésion, les ligands, les enzymes, les cytokines et les chimiokines. Par « conjugué Fc », on entend un composé qui est le résultat du couplage chimique d'une région Fc avec un partenaire de conjugaison. Le partenaire de conjugaison peut être protéique ou non protéique. La réaction de couplage utilise généralement des groupes fonctionnels sur la région Fc et le partenaire de conjugaison. Divers groupes de liaison sont connus dans l'art antérieur comme étant appropriés pour la synthèse d'un conjugué; par exemple, des groupes de liaison homo-ou hétérobifonctionnels sont bien connus (voir, catalogue Pierce Chemical Company, 2005- 2006, section technique sur des agents de réticulation, pages 321 -350). Parmi les partenaires de conjugaison appropriés, on peut citer les protéines thérapeutiques, les étiquettes, les agents cytotoxiques tels que les agents chimiothérapeutiques, les toxines et leurs fragments actifs. Les toxines appropriées et leurs fragments incluent notamment la toxine de la diphtérie, l'exotoxine A, la ricine, l'abrine, la saporine, la gélonine, la calichéamicine, les auristatines E et F et la mertansine.
Avantageusement, le polypeptide parent - et donc le polypeptide selon l’invention - consiste en une région Fc.
Avantageusement, le polypeptide parent - et donc le polypeptide selon l’invention - est un anticorps.
Par « mutation », on entend un changement d’au moins un acide aminé de la séquence d’un polypeptide, notamment un changement d’au moins un acide aminé de la région Fc du polypeptide parent. Le polypeptide muté ainsi obtenu est un polypeptide variant ; c’est un polypeptide selon l’invention. Un tel polypeptide comprend une région Fc mutée, par rapport au polypeptide parent. De préférence, la mutation est une substitution, une insertion ou une délétion d'au moins un acide aminé.
Par «substitution», on entend le remplacement d'un acide aminé à une position particulière dans une séquence de polypeptide parent par un autre acide aminé. Par exemple, la substitution N434S se réfère à un polypeptide variant, en l’occurrence un variant pour lequel l'asparagine à la position 434 est remplacé par la sérine.
Par "insertion d'acide aminé" ou "insertion", on entend l'addition d'un acide aminé à une position particulière dans une séquence de polypeptide parent. Par exemple, l’insertion G>235-236 désigne une insertion de glycine entre les positions 235 et 236. Par « délétion d'acides aminés» ou «délétion», on entend la suppression d'un acide aminé à une position particulière dans une séquence de polypeptide parent. Par exemple, E294del désigne la suppression de l'acide glutamique en position 294.
De préférence, le libellé suivant de mutation est utilisé: « 434S » ou « N434S », et signifie que le polypeptide parent comprend l'asparagine en position 434, qui est remplacée par la sérine dans le variant. Dans le cas d'une combinaison de substitutions, le format préféré est le suivant: « 259I/315D/434Y » ou « V259I/N315D/N434Y ». Cela signifie qu'il existe trois substitutions dans le variant, en positions 259, 315 et 434, et que l'acide aminé en position 259 du polypeptide parent, à savoir la valine, est remplacé par l'isoleucine, que l'acide aminé en position 315 du polypeptide parent, soit l'asparagine, est remplacé par l'acide aspartique et que l'acide aminé en position 434 du polypeptide parent, soit l'asparagine, est remplacé par la tyrosine.
Par «FcRn» ou «récepteur Fc néonatal» tel qu'utilisé ici, on entend une protéine qui se lie à la région Fc des IgG et est codée au moins en partie par un gène FcRn. Comme cela est connu dans la technique, la protéine FcRn fonctionnelle comprend deux polypeptides, souvent désignés sous le nom de chaîne lourde et de chaîne légère. La chaîne légère est la bêta-2-microglobuline et la chaîne lourde est codée par le gène FcRn. Sauf indication contraire ici, FcRn ou protéine FcRn se réfère au complexe de la chaîne a avec la bêta-2- microglobuline. Chez l'homme, le gène codant pour le FcRn est appelé FCGRT.
De préférence, le variant selon l’invention présente une affinité augmentée pour le récepteur FcRn, par rapport à celle du polypeptide parent, d’un ratio au moins égal à 2, de préférence supérieur à 5, de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur à 15, de préférence supérieur à 20, de préférence supérieur à 25, de préférence supérieur à 30.
De préférence, le variant selon l’invention présente une demi-vie augmentée par rapport à celle du polypeptide parent. De préférence, le variant selon l’invention présente une demi- vie augmentée par rapport à celle du polypeptide parent, d’un ratio au moins égal à 2, de préférence supérieur à 5, de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur à 15, de préférence supérieur à 20, de préférence supérieur à 25, de préférence supérieur à 30.
L’une des fonctions majeures du FcRn est connue sous le nom de recyclage des IgG. Elle consiste à extraire les IgG de la voie du catabolisme endothélial des protéines plasmatiques pour les restituer intactes dans la circulation. Ce recyclage explique leur demi-vie longue dans des conditions physiologiques normales (trois semaines pour les IgG), tout en permettant le maintien de concentrations plasmatiques élevées. La transcytose des IgG d’un pôle à l’autre des épithéliums ou des endothéliums est la deuxième fonction majeure du FcRn permettant d’assurer leur biodistribution dans l’organisme.
De préférence, le variant selon l’invention présente une affinité augmentée pour au moins un récepteur du fragment Fc (FcR) choisi parmi les récepteurs FcyRI (CD64), FcyRIIIa (CD16a) et FcyRIla (CD32a), par rapport à celle du polypeptide parent, d’un ratio au moins égal à 2, de préférence supérieur à 5, de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur à 15, de préférence supérieur à 20, de préférence supérieur à 25, de préférence supérieur à 30.
Le récepteur FcyRI (CD64) est impliqué dans la phagocytose et l’activation cellulaire. Le récepteur FcyRIIIa (CD16a) est également impliqué dans l’activité dépendante du fragment Fc, notamment l’ADCC et la phagocytose ; il présente un polymorphisme V/F en position 158. Le récepteur FcyRIla (CD32a) est, quant à lui, impliqué dans l’activation plaquettaire et la phagocytose ; il présente un polymorphisme H/R en position 131 .
De préférence, le variant selon l’invention présente à la fois une affinité augmentée pour le récepteur FcRn, et une affinité augmentée pour tous les récepteurs FcyRI (CD64), FcyRIIIa (CD16a) et FcyRIla (CD32a).
L'affinité d’un polypeptide comprenant une région Fc pour un FcR peut être évaluée par des procédés bien connus de l'art antérieur. Par exemple, l'homme de l'art peut déterminer l’affinité (Kd) en utilisant la résonance plasmonique de surface (SPR). Alternativement, l'homme de l'art peut effectuer un test ELISA approprié. Un dosage ELISA approprié permet de comparer les forces de liaison du Fc parent et du Fc muté. Les signaux détectés spécifiques du Fc muté et du Fc parent sont comparés. L'affinité de liaison peut être indifféremment déterminée en évaluant les polypeptides entiers ou en évaluant les régions Fc isolées de ceux-ci. Alternativement, l’homme de l’art peut effectuer un test compétitif approprié. Un test compétitif approprié permet de déterminer la capacité du Fc muté à inhiber la liaison d’un ligand marqué du FcR lorsque ceux-ci sont incubés simultanément avec des cellules exprimant ces récepteurs. La liaison du ligand marqué au FcR est évaluée par exemple par cytométrie en flux. L’affinité de liaison des Fc mutés aux FcR est alors déterminée en évaluant la variabilité de l’intensité moyenne de fluorescence émise par le ligand marqué lié aux FcR.
De préférence, la région Fc mutée du polypeptide selon l’invention comprend de 3 à 20 mutations par rapport au polypeptide parent, de préférence de 4 à 20 mutations. Par «de 3 à 20 modifications d'acides aminés», on englobe 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 1 1 , 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 et 20 mutations d'acides aminés. De préférence, elle comprend de 4 à 15 mutations, de préférence de 4 à 10 mutations par rapport au polypeptide parent.
Plus préférentiellement, la région Fc mutée du polypeptide selon l’invention comprend au moins une combinaison de 5 mutations, ladite combinaison comprenant les quatre mutations (i) telles que décrites ci-dessus, et au moins une mutation (ii) telle que décrite ci-dessus la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat.
Plus préférentiellement, la région Fc mutée du polypeptide selon l’invention comprend une combinaison de 6 mutations, ladite combinaison comprenant les quatre mutations (i) telles que décrites ci-dessus, au moins une mutation (ii) telle que décrite ci-dessus, et au moins une mutation (iii) telle que décrite ci-dessus, la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat.
De préférence, la région Fc mutée du polypeptide selon l’invention comprend les mutations suivantes:
(i) les quatre mutations 334N, 352S, 378V et 397M;
(ii) au moins une mutation choisie parmi 434Y 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241 L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T et 389K; et
lorsqu’une mutation (iii) est présente, elle est choisie parmi K290G et Y296W,
la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat.
De préférence, la région Fc mutée du polypeptide selon l’invention comprend les mutations suivantes:
(i) les quatre mutations 334N, 352S, 378V et 397M;
(ii) au moins une mutation choisie parmi 434Y 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241 L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T et 389K; et
(iii) au moins une mutation choisie parmi K290G et Y296W,
la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat. De préférence, la région Fc mutée du polypeptide selon l’invention comprend une combinaison de mutations choisie parmi les combinaisons : N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V et N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V/Y296W.
De préférence, le polypeptide selon l’invention est produit dans des cellules épithéliales mammaires de mammifères non humains transgéniques.
De préférence, le polypeptide selon l’invention est produit dans des animaux transgéniques non humains, de préférence dans des mammifères non humains transgéniques, plus préférentiellement dans leurs cellules épithéliales mammaires.
Par « mammifère non humain transgénique », on entend un mammifère notamment choisi parmi les bovins, les porcins, les chèvres, les ovins et les rongeurs, de préférence parmi la chèvre, la souris, la truie, la lapine, la brebis et la vache. De préférence, l’animal transgénique non humain ou le mammifère transgénique non humain est une chèvre transgénique.
De préférence, le variant selon l’invention comprend au moins les cinq mutations N434Y, K334N, P352S, V397M et A378V dans son fragment Fc, et est produit dans des cellules épithéliales mammaires de mammifères non humains transgéniques, ou bien dans des animaux transgéniques non humains, de préférence dans des mammifères non humains transgéniques, telle qu’une chèvre. Un tel variant présente à la fois une affinité augmentée pour le récepteur FcRn, et une affinité augmentée pour tous les récepteurs FcyRI (CD64), FcyRIl la (CD16a) et FcyRIla (CD32a).
Ainsi, de préférence, le variant selon l’invention est le variant Fc N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V produit dans des cellules épithéliales mammaires de mammifères non humains transgéniques. Alternativement, de préférence, le variant selon l’invention est le variant Fc N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V produit dans des animaux transgéniques non humains, de préférence dans des mammifères non humains transgéniques, telle qu’une chèvre. Un tel variant présente à la fois une affinité augmentée pour le récepteur FcRn, et une affinité augmentée pour tous les récepteurs FcyRI (CD64), FcyRIIIa (CD16a) et FcyRIla (CD32a). De préférence, le variant selon l’invention comprend la séquence SEQ ID NO :1 1 ou la séquence SEQ ID NO :15.
Alternativement, de préférence, le variant selon l’invention est le variant Fc N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V/Y296W produit dans des cellules épithéliales mammaires de mammifères non humains transgéniques. Alternativement, de préférence, le variant selon l’invention est le variant Fc N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V/Y296W produit dans des animaux transgéniques non humains, de préférence dans des mammifères non humains transgéniques, telle qu’une chèvre. Un tel variant présente à la fois une affinité augmentée pour le récepteur FcRn, et une affinité augmentée pour tous les récepteurs FcyRI (CD64), FcyRIIIa (CD16a) et FcyRIla (CD32a).
De préférence, le procédé de production d’un variant selon l’invention comprend l’expression dudit variant dans des cellules épithéliales mammaires de mammifères non humains transgéniques.
Ainsi, la présente invention a également pour objet un procédé de production d’un variant d’un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une affinité augmentée pour le récepteur FcRn, et une affinité augmentée pour au moins un récepteur du fragment Fc (FcR) choisi parmi les récepteurs FcyRI (CD64), FcyRIIIa (CD16a) et FcyRIla (CD32a), par rapport à celle du polypeptide parent, ledit variant comprenant :
(i) les quatre mutations 334N, 352S, 378V et 397M ; et
(ii) au moins une mutation choisie parmi 434Y, 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241 L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T et 389K ; et
la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat,
ledit procédé comprenant l’expression dudit variant dans des cellules épithéliales mammaires de mammifères non humains transgéniques.
De préférence, ledit variant comprend en outre au moins une mutation (iii) dans le fragment Fc choisie parmi Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V240S, F241 H, F241Y, L242A, L242F, L242G, L242H, L242I, L242K, L242P, L242S, L242T,
L242V, F243L, F243S, E258G, E258I, E258R, E258M, E258Q, E258Y, V259C, V259I,
V259L, T260A, T260H, T260I, T260M, T260N, T260R, T260S, T260W, V262S, V263T,
V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S267Q, S267V, K290D, K290E, K290H, K290L,
K290N, K290Q, K290R, K290S, K290Y, P291 G, P291 Q, P291 R, R292I, R292L, E293A, E293D, E293G, E293M, E293Q, E293S, E293T, E294A, E294G, E294P, E294Q, E294R, E294T, E294V, Q295I, Q295M, Y296H, S298A, S298R, Y300I, Y300V, Y300W, R301A, R301 M, R301 P, R301 S, V302F, V302L, V302M, V302R, V302S, V303S, V303Y, S304T, V305A, V305F, V305I, V305L, V305R et V305S,
la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat. En particulier, un tel procédé comprend les étapes suivantes :
a) préparation d’une séquence d’ADN comprenant une séquence codant pour le variant, une séquence codant pour un promoteur de caséine de mammifère ou un promoteur de lactosérum de mammifère, et une séquence codant pour un peptide signal permettant la sécrétion dudit variant ;
b) introduction de la séquence d’ADN obtenue en a) dans un embryon de mammifère non humain, afin d’obtenir un mammifère non humain transgénique exprimant le variant codé par ladite séquence d’ADN obtenue en a) dans la glande mammaire ; et
c) récupération du variant dans le lait produit par le mammifère non humain transgénique obtenu en b).
L’étape a) comprend ainsi la préparation d’une séquence d’ADN comprenant une séquence codant pour le variant, une séquence codant pour un promoteur de caséine de mammifère ou un promoteur de lactosérum de mammifère, et une séquence codant pour un peptide signal permettant la sécrétion dudit variant. Une telle étape est illustrée en figure 1.
La séquence codant le variant est une séquence d’ADN codant pour le variant selon l’invention.
Par exemple ce variant a pour séquence SEQ ID NO :1 1. Avec le peptide signal, la séquence correspondante est la séquence SEQ ID NO :13.
Selon un autre exemple, ce variant a pour séquence SEQ ID NO :15. Avec le peptide signal, la séquence correspondante est la séquence SEQ ID NO :16.
La séquence codant pour un promoteur de caséine de mammifère ou un promoteur de lactosérum de mammifère, permet d’exprimer le variant dans le lait. L’homme du métier sait choisir un tel promoteur.
Dans le cadre de la présente demande, un peptide signal est une séquence d’acides aminés, de préférence de 2 à 30 acides aminés, située à l'extrémité N-terminale du variant de polypeptide Fc, servant à adresser celui-ci dans le lait du mammifère hôte. De préférence, la séquence codant pour un peptide signal est interposée entre la séquence codant pour le variant et le promoteur. Sans une telle séquence, le variant resterait dans le tissu mammaire, et la purification serait difficile et exigerait le sacrifice de l'animal hôte. Le peptide signal peut être clivé lors de la sécrétion. La séquence codant pour le peptide signal peut être celle qui est naturellement associée à un polypeptide parent selon l’invention. Alternativement, la séquence codant pour le peptide signal peut être celle de la protéine de lait dont est issu le promoteur, à savoir, lorsque le gène de la protéine de lait est digéré en vue d’isoler le promoteur, un fragment d'ADN est sélectionné comprenant à la fois le promoteur et la séquence codante le peptide signal directement en aval du promoteur. Une autre alternative consiste à utiliser une séquence signal dérivée d'une autre protéine sécrétée qui n’est ni la protéine de lait normalement exprimée à partir du promoteur, ni un polypeptide selon l’invention.
De préférence, le peptide signal a pour séquence SEQ ID NO :12.
La séquence d’ADN utilisée peut comprendre des codons optimisés.
L'optimisation de codon a pour but de remplacer les codons naturels par des codons dont les ARN de transfert (ARNt) portant les acides aminés sont les plus fréquents dans le type cellulaire considéré. Le fait de mobiliser des ARNt fréquemment rencontrés à pour avantage majeur d'accroitre la vitesse de traduction des ARN messagers (ARNm) et donc d'augmenter le titre final (Carton JM et al, Protein Expr Purif, 2007). L'optimisation de séquence joue aussi sur la prédiction des structures secondaires d'ARNm qui pourrait ralentir la lecture par le complexe ribosomal. L'optimisation de séquence a également un impact sur le pourcentage de G/C qui est directement lié à la demi-vie des ARNm et donc à leur potentiel d'être traduit (Chechetkin, J. of theoretical biology 242, 2006 922-934). L’optimisation de codons peut être faite par substitution des codons naturels en utilisant des tables de fréquence des codons (codon Usage Table) pour mammifères et plus particulièrement pour Homo sapiens. Il existe des algorithmes présents sur internet et mis à disposition par les fournisseurs de gènes de synthèse (DNA2.0, GeneArt, MWG, Genscript) qui permettent de faire cette optimisation de séquence.
De préférence, l'étape a) est comprend les étapes suivantes :
(a1 ) préparation d’une séquence d’ADN comprenant une séquence codant pour le variant selon l’invention, directement fusionnée à son extrémité N-terminale à une séquence codant pour un peptide signal permettant la sécrétion dudit variant ;
(a2) introduction de la séquence d’ADN obtenue en (a1 ) dans un vecteur comprenant une séquence codant pour un promoteur de caséine de mammifère ou un promoteur de lactosérum de mammifère ;
(a3) digestion dudit vecteur obtenu en (a2), afin d’obtenir une séquence d’ADN comprenant la séquence codant pour un promoteur de caséine de mammifère ou un promoteur de lactosérum de mammifère, et la séquence d’ADN comprenant une séquence codant pour le variant selon l’invention directement fusionnée à son extrémité N-terminale à une séquence codant pour un peptide signal.
En d’autres termes, de préférence, à la fin de l’étape a), on obtient une séquence d’ADN comprenant, de l’extrémité N- à C-terminale, la séquence codant pour un promoteur de caséine de mammifère ou un promoteur de lactosérum de mammifère, fusionnée à la séquence codant pour un peptide signal, elle-même fusionnée à la séquence codant pour le variant selon l’invention.
Ensuite, le procédé selon l’invention comprend une étape b) d’introduction de la séquence d’ADN obtenue en a) dans un embryon de mammifère non humain, afin d’obtenir un mammifère non humain transgénique exprimant le variant codé par ladite séquence d’ADN obtenue en a) dans la glande mammaire.
Enfin, le procédé selon l’invention comprend une étape c) de récupération du variant dans le lait produit par le mammifère non humain transgénique obtenu en b).
Les étapes b) et c) sont connues de l’art antérieur, notamment du brevet EP0264166.
De préférence, un tel procédé comprend, après l’étape c), une étape de purification d) du lait récupéré. L’étape de purification d) peut être réalisée par toute méthode connue de l’art antérieur, notamment par purification sur protéine A. Une fois encore, une telle étape est notamment décrite dans le brevet EP0264166.
La présente invention a également pour objet une séquence d'ADN comprenant un gène codant un variant d’un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une affinité augmentée pour le récepteur FcRn, et une affinité augmentée pour au moins un récepteur du fragment Fc (FcR) choisi parmi les récepteurs FcyRI (CD64), FcyRIIIa (CD16a) et FcyRIla (CD32a), par rapport à celle du polypeptide parent, ledit variant comprenant :
(i) les quatre mutations 334N, 352S, 378V et 397M ; et
(ii) au moins une mutation choisie parmi 434Y 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241 L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T et 389K ;
la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat, ledit gène étant sous le contrôle d'un promoteur de transcription de la caséine ou du lactosérum de mammifère qui ne contrôle pas naturellement la transcription dudit gène, ladite séquence d'ADN comprenant en outre une séquence codant pour un peptide signal permettant la sécrétion dudit variant, interposée entre la séquence codant pour le variant et le promoteur.
Dans un mode de réalisation particulier, ledit variant comprenant en outre au moins une mutation (iii) dans le fragment Fc choisie parmi Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V240S, F241 H, F241 Y, L242A, L242F, L242G, L242H, L242I, L242K, L242P, L242S, L242T, L242V, F243L, F243S, E258G, E258I, E258R, E258M, E258Q, E258Y, V259C, V259I, V259L, T260A, T260H, T260I, T260M, T260N, T260R, T260S, T260W, V262S, V263T, V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S267Q, S267V, K290D, K290E, K290H, K290L, K290N, K290Q, K290R, K290S, K290Y, P291 G, P291 Q, P291 R, R292I, R292L, E293A, E293D, E293G, E293M, E293Q, E293S, E293T, E294A, E294G, E294P, E294Q, E294R, E294T, E294V, Q295I, Q295M, Y296H, S298A, S298R, Y300I, Y300V, Y300W, R301 A, R301 M, R301 P, R301 S, V302F, V302L, V302M, V302R, V302S, V303S, V303Y, S304T, V305A, V305F, V305I, V305L, V305R et V305S, la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat.
La présente invention a également pour objet une séquence d'ADN comprenant un gène codant un variant d’un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une affinité augmentée pour le récepteur FcRn, et une affinité augmentée pour au moins un récepteur du fragment Fc (FcR) choisi parmi les récepteurs FcyRI (CD64), FcyRIIIa (CD16a) et FcyRIla (CD32a), par rapport à celle du polypeptide parent, ledit variant comprenant :
(i) les quatre mutations 334N, 352S, 378V et 397M ; et
(ii) au moins une mutation choisie parmi 434Y 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241 L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T et 389K ;
la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat,
ladite séquence d'ADN comprenant optionnellement une séquence codant pour un peptide signal permettant la sécrétion dudit variant.
Dans un mode de réalisation particulier, ledit variant comprenant en outre au moins une mutation (iii) dans le fragment Fc choisie parmi Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V240S, F241 H, F241 Y, L242A, L242F, L242G, L242H, L242I, L242K, L242P, L242S, L242T, L242V, F243L, F243S, E258G, E258I, E258R, E258M, E258Q, E258Y, V259C, V259I, V259L, T260A, T260H, T260I, T260M, T260N, T260R, T260S, T260W, V262S, V263T, V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S267Q, S267V, K290D, K290E, K290H, K290L, K290N, K290Q, K290R, K290S, K290Y, P291 G, P291 Q, P291 R, R292I, R292L, E293A, E293D, E293G, E293M, E293Q, E293S, E293T, E294A, E294G, E294P, E294Q, E294R, E294T, E294V, Q295I, Q295M, Y296H, S298A, S298R, Y300I, Y300V, Y300W, R301 A, R301 M, R301 P, R301 S, V302F, V302L, V302M, V302R, V302S, V303S, V303Y, S304T, V305A, V305F, V305I, V305L, V305R et V305S, la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat,
Alternativement, le polypeptide selon l’invention peut être produit dans des cellules de mammifère en culture. Les cellules préférées sont la lignée de rat YB2/0, la lignée de hamster CHO, en particulier les lignées CHO dhfr- et CHO Lec13, les cellules PER. C6™ (Crucell), NSO, SP2/0, les cellules HeLa, BHK ou COS, les cellules HEK293. De préférence, on utilise la lignée de hamster CHO.
Ainsi, la présente invention a également pour objet un procédé de production d’un variant d’un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une affinité augmentée pour le récepteur FcRn, et une affinité augmentée pour au moins un récepteur du fragment Fc (FcR) choisi parmi les récepteurs FcyRI (CD64), FcyRIl la (CD16a) et FcyRIla (CD32a), par rapport à celle du polypeptide parent, ledit variant comprenant :
(i) les quatre mutations 334N, 352S, 378V et 397M ; et
(ii) au moins une mutation choisie parmi 434Y 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241 L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T et 389K ; et
la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat,
ledit procédé comprenant l’expression dudit variant dans des cellules de mammifère en culture.
Dans un mode de réalisation particulier, ledit variant comprenant en outre au moins une mutation (iii) dans le fragment Fc choisie parmi Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V240S, F241 H, F241 Y, L242A, L242F, L242G, L242H, L242I, L242K, L242P, L242S, L242T, L242V, F243L, F243S, E258G, E258I, E258R, E258M, E258Q, E258Y, V259C, V259I, V259L, T260A, T260H, T260I, T260M, T260N, T260R, T260S, T260W, V262S, V263T, V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S267Q, S267V, K290D, K290E, K290H, K290L, K290N, K290Q, K290R, K290S, K290Y, P291 G, P291 Q, P291 R, R292I, R292L, E293A, E293D, E293G, E293M, E293Q, E293S, E293T, E294A, E294G, E294P, E294Q, E294R, E294T, E294V, Q295I, Q295M, Y296H, S298A, S298R, Y300I, Y300V, Y300W, R301 A, R301 M, R301 P, R301 S, V302F, V302L, V302M, V302R, V302S, V303S, V303Y, S304T, V305A, V305F, V305I, V305L, V305R et V305S, la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat,
En particulier, un tel procédé comprend les étapes suivantes :
a) préparation d’une séquence d’ADN codant pour le variant;
b) introduction de la séquence d’ADN obtenue en a) dans des cellules de mammifère en culture. L’introduction peut être effectuée de façon transitoire ou stable (i.e. intégration de la séquence d’ADN obtenue en a) dans le génome des cellules) ; et
c) expression du variant à partir des cellules obtenues en b), puis
d) optionnellement, récupération du variant dans le milieu de culture.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant (i) un polypeptide selon l’invention, et (ii) au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention a également pour objet une composition pharmaceutique comprenant (i) le variant consistant en un fragment Fc, notamment d’IgGI , présentant les cinq mutations N434Y, K334N, P352S, V397M et A378V, la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat, et (ii) au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable. De préférence, la composition de la présente invention comprend (i) le variant consistant en un fragment Fc, notamment d’IgGI , présentant les six mutations N434Y, K334N, P352S, V397M et A378V, Y296W, la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat, et (ii) au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
La présente invention a également pour objet le polypeptide selon l’invention ou la composition telle que décrite précédemment, pour son utilisation comme médicament.
La présente invention a également pour objet l’utilisation du variant consistant en un fragment Fc, notamment d’IgGI , présentant les cinq mutations N434Y, K334N, P352S, V397M et A378V, la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat (i.e. variant N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V), comme médicament. Dans un mode de réalisation particulier, la présente invention a également pour objet l’utilisation du variant consistant en un fragment Fc, notamment d’IgGI , présentant les six mutations N434Y, Y296W, K334N, P352S, V397M, A378V, et Y296W, la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat (i.e. variant N434Y/K334N/P352S/V397M/A378V/Y296W), comme médicament.
Comme indiqué précédemment, avantageusement, le polypeptide parent - et donc le polypeptide selon l’invention - est un anticorps. Dans ce cas, l’anticorps peut être dirigé contre un antigène choisi parmi un antigène tumoral, un antigène viral, un antigène bactérien, un antigène fongique, une toxine, une cytokine membranaire ou circulante et un récepteur membranaire.
Lorsque l’anticorps est dirigé contre un antigène tumoral, son utilisation convient particulièrement dans le traitement de cancers. Par « cancer », on entend toute condition physiologique caractérisée par une prolifération anormale des cellules. Des exemples de cancers incluent notamment les carcinomes, les lymphomes, les blastomes, les sarcomes (incluant les liposarcomes), les tumeurs neuroendocrines, les mésothéliomes, les méningiomes, les adénocarcinomes, les mélanomes, les leucémies et les pathologies lymphoïdes malignes, cette liste n’étant pas exhaustive.
Lorsque l’anticorps est dirigé contre un antigène viral, son utilisation convient particulièrement dans le traitement des infections virales. Les infections virales sont notamment des infections dues au VIH, à un rétrovirus, à un virus Coxsackie, au virus de la variole, de la grippe, de la fièvre jaune, du Nil occidental, à un cytomégalovirus, à un rotavirus ou au virus de l’hépatite B ou C, cette liste n’étant pas exhaustive.
Lorsque l’anticorps est dirigé contre une toxine, son utilisation convient particulièrement dans le traitement des infections bactériennes, par exemple les infections par la toxine tétanique, la toxine diphtérique, les toxines du charbon Bacillus anthracis, ou encore dans le traitement des infections par les toxines botuliques, les toxines de la ricine, les shigatoxines, cette liste n’étant pas exhaustive.
Lorsque l’anticorps est dirigé contre une cytokine, son utilisation convient particulièrement dans le traitement des maladies inflammatoires et/ou auto-immunes. Les maladies inflammatoires et/ou auto-immunes incluent notamment le purpura thrombotique thrombocytopénique (PTI), le rejet de greffes ou d’organes, la maladie du greffon contre l’hôte, la polyarthrite rhumatoïde, le lupus érythémateux disséminé, les différents types de sclérose, le syndrome de Sjôgren primitif (ou syndrome de Gougerot-Sjôgren), les polyneuropathies auto-immunes comme la sclérose en plaques, le diabète de type I, les hépatites auto-immunes, la spondylarthrite ankylosante, le syndrome de Reiter, l’arthrite de goutte, la maladie coeliaque, la maladie de Crohn, la thyroïdite chronique d’Hashimoto (hypothyroïdie), la maladie d’Adisson, les hépatites auto-immunes, la maladie de Basedow (hyperthyroïdie), la colite ulcérative, les vascularites comme les vascularites systémiques associées aux ANCA (anticorps anti-cytoplasme des neutrophiles), les cytopénies auto-immunes et autres complications hématologiques de l’adulte et de l’enfant, telles que les thrombopénies auto-immunes aiguës ou chroniques, les anémies hémolytiques auto-immunes, la maladie hémolytique du nouveau-né (MHN), la maladie des agglutinines froides, l’hémophilie acquise auto-immune ; le syndrome de Goodpasture, les néphropathies extra-membraneuses, les affections cutanées bulleuses auto-immunes, la myasthénie réfractaire, les cryoglobulinémies mixtes, le psoriasis, l’arthrite chronique juvénile, les myosites inflammatoires, les dermatomyosites et les affections systémiques auto-immunes de l’enfant incluant le syndrome des antiphospholipides, la maladie des tissus conjonctifs, l’inflammation auto-immune pulmonaire, le syndrome Guillain-Barré, la polyradiculonévrite inflammatoire demyélisante chronique (PDCI), la thyroïdite auto-immune, le mellitis, le myasthenia gravis, la maladie autoimmune inflammatoire de l’œil, la neuromyélite optique (maladie de Dévie), les sclérodermies, le pemphigus, le diabète par insulinorésistance, la polymyosite, l’anémie de Biermer, la glomérulonéphrite, la maladie de Wegener, la maladie de Horton, la périarthrite noueuse et le syndrome de Churg et Strauss, la maladie de Still, la polychondrite atrophiante, la maladie de Behçet, la gammapathie monoclonale, la granulomatose de Wegener, le lupus, la rectocolite hémorragique, le rhumatisme psoriasique, la sarcoïdose, la colite collagène, la dermatite herpétiforme, la fièvre méditerranéenne familiale, la glomérulonéphrite à dépôts d’IgA, le syndrome myasthénique de Lambert-Eaton, l’ophtalmie sympathique, le syndrome de Fiessinger- Leroy-Reiter et le syndrome uvéo-méningo-encéphalique.
D’autres maladies inflammatoires sont également comprises, comme par exemple le syndrome de détresse respiratoire aiguë (ARDS), l'arthrite septique aiguë, l'arthrite adjuvante, l'encéphalomyélite allergique, la rhinite allergique, la vasculite allergique, l'allergie, l'asthme, l'athérosclérose, l'inflammation chronique due à des infections bactériennes ou virales chroniques, la bronchopneumopathie chronique obstructive (MPOC), les maladies coronariennes, l'encéphalite, les maladies inflammatoires de l'intestin, l'ostéolyse inflammatoire, l'inflammation associée à des réactions d'hypersensibilité aiguë et retardée, l'inflammation associée à des tumeurs, une lésion nerveuse périphérique ou des maladies démyélinisantes, une inflammation associée à un traumatisme des tissus tels que les brûlures et l'ischémie, l’inflammation due à une méningite, le syndrome de défaillance multiviscérale (multiple organ dysfunction syndrome, MODS), la fibrose pulmonaire, la septicémie et le choc septique, le syndrome de Stevens-Johnson, l’arthrite indifférenciée, et les spondylarthropathies indifférenciées. Dans un mode de réalisation particulier de l’invention, la maladie auto-immune est le purpura thrombotique idiopatique (PTI) et le la polyradiculonévrite inflammatoire demyélisante chronique (PDCI).
De préférence, la pathologie auto-immune ou inflammatoire est choisie parmi le purpura thrombocytopénique immunologique (appelé également purpura thrombocytopénique idiopathique, ou PTI), la neuromyélite optique ou maladie de Dévie (NMO) et la sclérose en plaques. La sclérose en plaques et notamment étudiée grâce à un modèle d’encéphalomyélite auto-immune expérimentale (EAE).
Les séquences décrites dans la présente demande peuvent être résumées comme suit:
La présente invention sera mieux comprise à la lecture des exemples suivants.
Les légendes des figures sont les suivantes :
Figure 1 : Production du variant A3A-184AY dans le lait de chèyre et de souris à l’aide du vecteur Bc451
A) Le vecteur beta caséine, Bc451 , a été digéré par Xhol.
Dans le vecteur Bc451 , le fragment Notl-Notl est le fragment procaryote. Le fragment Notl (15730) - Xhol est la séquence génomique 3’ qui contient le signal polyA. Le fragment
BamHI - Xhol est la région promotrice de béta caséine.
B) Le fragment Sali contenant la région codante du variant Fc A3A-184AY (i.e. FC3179 A3A-184AY 884 bp) a été inséré dans le vecteur, pour générer la construction génique BC3180 FC A3A-184AY (C).
D) Le fragment d’ADN pour la micro-injection a ensuite été isolé du vecteur procaryote. Pour cela, BC3180 a été digéré par Notl et Nrul. Le fragment libéré de 16.4kb, contenant le gène Fc (codant le variant A3A-184AY) sous contrôle du promoteur de la beta caséine, a ensuite été purifié par élution de gel. Fiaure 2 : Résultats des tests dans un modèle oréventif d’arthrite induite oar le transfert de sérum de souris K/BxN
La maladie a été induite en transférant 10 mI de sérum de souris K/BxN par voie intraveineuse le jour 0 à des souris C57/BI/6J. Les molécules testées ont été administrées une fois par voie intrapéritonéale à J0, 2h avant l'injection de sérum de souris K/BxN.
Le score clinique (« clinical score ») est obtenu en additionnant l'indice des quatre pattes:
0 = normal, 1 = gonflement d'une articulation, 2 = gonflement de plus d’une articulation, et 3 = gonflement sévère de toute l’articulation (unités arbitraires ou « arbitrary units »).
Fiqure 3 : Résultats des tests dans un modèle thérapeutique d’arthrite induite par le transfert de sérum de souris K/BxN
La maladie a été induite en transférant 10 mI de sérum de souris K/BxN par voie intraveineuse le jour 0 à des souris C57/BI/6J. Les molécules testées ont été administrées une fois par voie intrapéritonéale à J0, 72h après l'injection de sérum de souris K/BxN (indiqué par des pointillés).
Le score clinique (« clinical score ») est obtenu en additionnant l'indice des quatre pattes:
0 = normal, 1 = gonflement d'une articulation, 2 = gonflement de plus d’une articulation, et 3 = gonflement sévère de toute l’articulation (unités arbitraires ou « arbitrary units »).
Fiqure 4 : Résultats des tests de liaison des Fc et IqlV aux cellules sanquines
Des IglV ou des variants Fc selon l’invention marqués par Alexa ont été incubés à 65 nM (10 pg / ml pour Fc dans du PBS 2% CSF) avec des cellules cibles pendant 20 minutes sur de la glace. Après 2 lavages dans du PBS à 2% de CSF, les cellules ont été mises en suspension dans 500 mI d'Isoflow avant l'analyse par cytométrie de flux.
Les résultats sont les suivants :
A) Cellules B marquées avec des anti-CD19 (« % positive B cells ») ;
B) Cellules NK marquées avec des anti-CD56 (« % positive NK cells ») ;
C) Monocytes marqués avec des anti-CD14, en présence d’IglV (« % positive cells + IglV ») ;
D) Monocytes CD16+ marqués avec des anti-CD14 et avec l’anticorps anti-CD16 3G8, en présence d’IglV (« % positive cells + IglV ») ;
E) Neutrophiles marqués avec des anti-CD15, en présence d’IglV (« % positive cells +
IglV ») ;
F) Cellules NK marquées avec des anti-CD56, en présence d’IglV ou de Fc WT (« % cell positives »). Figure 5 : Résultats des tests d’ADCC, d’activation des cellules Jurkat CD64 et de
CDC
A) Inhibition de l’activation des cellules Jurkat CD64 :
Des cellules Raji (50 mI à 5 x 106 cellules / ml) ont été mélangées avec du Rituxan (50 mI à 2 m9 / ml), des cellules Jurkat exprimant CD64 humain (Jurkat-H-CD64) (25 mI à 5 x 106 cellules / ml), du PMA (50 mI à 40 ng / ml), puis incubées avec les IglV ou le variant selon l’invention (RFC A3A-184AY) à 1950 nM.
Après une nuit d'incubation, les plaques ont été centrifugées (125 g pour 1 minute) et NL2 contenue dans le surnageant a été évaluée par ELISA.
Les résultats ont été exprimés en pourcentage par rapport aux IglV, selon la formule suivante: (IL-2 IglV / IL-2 de l’échantillon) X100.
B) Inhibition de l’ADCC :
Des cellules effectrices (cellules mononucléaires) (25 mI à 8 x 107 cellules / ml) et des globules rouges Rhésus positifs (25 mI à 4 x 107 cellules / ml final) ont été incubés avec différentes concentrations (0 à 75 ng / ml) d'anticorps anti-Rhésus D, avec un rapport Effecteur / Cible de 2/1. Après 16 heures d'incubation, la lyse a été estimée en quantifiant l'hémoglobine libérée dans le surnageant en utilisant un substrat spécifique (DAF).
Les résultats sont exprimés en pourcentage de lyse spécifique en fonction de la quantité d'anticorps. L’inhibition de l’ADCC a été induite par les IglV ou le variant Fc selon l’invention (RFC A3A-184AY) ajouté à 33 nM.
Les résultats sont exprimés en pourcentage, 100% et 0% étant les valeurs obtenues avec les IglV à 650 nM et 0 nM respectivement selon la formule suivante:
[(ADCC avec échantillon à 33nM - ADCC sans IVIg) / (ADCC avec IglV à 33nM - ADCC sans IVIg) x100].
C) Activité d'inhibition de la CDC :
Des cellules Raji ont été incubées pendant 30 minutes avec une concentration finale de 50 ng/ml de rituximab. Une solution de sérum de jeune lapin diluée à 1/10 et préalablement incubée avec le variant Fc selon l’invention (rFc A3A-184AY) ou des IglV (vol / vol) pendant 1 h à 37°C a été ajoutée. Après 1 heure d'incubation à 37°C, les plaques ont été centrifugées (125 g pour 1 minute) et la CDC a été estimée en mesurant la LDH intracellulaire libérée dans le milieu de culture. Les résultats ont été exprimés en pourcentage d'inhibition et comparés aux IglV et au contrôle négatif (Fc sans fonction Fc, i.e. rFc neg), 100% correspondant à une inhibition complète de l'activité lytique et 0% à la valeur témoin obtenue sans Fc ou IglV.
Fiaure 6 : Résultats des tests de liaisons aux cellules sanauines
Des IglV, Fc-Rec (Fc sauvage), Fc MST-HN ou des variants Fc selon l’invention (A3A- 184AY CHO, A3A-184EY CHO) marqués par Alexa-Fluor® ont été incubés à 65 nM (10 pg / ml pour Fc dans du PBS 2% CSF (Colony Stimulating Factor) avec des cellules cibles pendant 20 minutes sur de la glace. Après 2 lavages dans du PBS à 2% de CSF, les cellules ont été mises en suspension dans 500 pi d'Isoflow avant l'analyse par cytométrie de flux. Les tests sont réalisés sur les cellules cibles suivantes :
- Cellules Natural Killer (NK) marquées avec des anti-CD56 ;
- Monocytes marqués avec des anti-CD14;
- Monocytes CD16+ marqués avec des anti-CD14 et avec l’anticorps anti-CD16 3G8;
- Neutrophiles marqués avec des anti-CD15.
Fiaure 7 : Résultats des tests dans un modèle vivo de purpura thrombocvtopéniaue
La maladie a été induite chez des souris exprimant un FcRn humanisé en injectant un anticorps anti-plaquettaire 6A6-hlgG1 (0,3pg/g de poids corporel) par voie intraveineuse pour dépléter les plaquettes, appelées aussi thrombocytes, des souris. Le contrôle négatif (« CTL PBS »), des IglV (1000 mg/kg), un fragment Fc-Rec (Fc-sauvage) (380 et 750 mg/kg), un fragment Fc MST-HN (190 mg/kg) et le variant de l’invention Fc A3A- 184AY CHO (190 mg/kg et 380 mg/kg), ont été administrés par voie intra-péritonéale 2 heures avant la déplétion des plaquettes. La numération plaquettaire a été déterminée avec un système Advia Hematology (Bayer). Le nombre de plaquettes avant l'injection d'anticorps a été fixé à 100%.
EXEMPLES
EXEMPLE 1 : Préparation de variants (fragments Fc mutés) selon l’invention produits dans le lait d’animaux transgéniques et caractérisation desdits variants I. Matériels et méthodes
Principe :
Un fragment Fc selon l’invention peut être produit dans le lait d’animaux transgéniques, en plaçant la séquence codante du fragment Fc dans un vecteur d’expression spécifique du lait. Le vecteur peut être introduit dans le génome d’une souris ou d’une chèvre transgénique, par micro-injection. Suite au criblage et à l’identification d’un animal possédant le transgène, les femelles sont reproduites. Suite à la parturition, traire les femelles permet de récupérer leur lait, dans lequel le Fc a pu être sécrété suite à l’expression du promoteur spécifique du lait.
Séquence protéique du variant Fc A3A-184AY (K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y) :
DKTHTCPPCPAPELLGGPSVFLFPPKPKDTLMISRTPEVTCVVVDVSHEDPEVKFNWYV DGVEVHNAKTKPREEQYNSTYRVVSVLTVLHQDWLNGKEYKCKVSNKALPAPIENTISK AKGQPREPQVYTLSPSRDELTKNQVSLTCLVKGFYPSDIVVEWESNGQPENNYKTTPPM LDSDGSFFLYSKLTVDKSRWQQGNVFSCSVMHEALHYHYTQKSLSLSPGK (SEQ ID NO :1 1 )
Un peptide signal (MRWSWIFLLLLSITSANA, SEQ ID NO :12) est lié à l’extrémité N- terminale de la séquence protéique, afin d’obtenir la séquence SEQ ID NO :13. Il permet la sécrétion de la protéine dans le lait, une fois exprimé.
Optimisation de la séquence nucléotidique :
La séquence nucléotidique a été optimisée pour l’expression dans la glande mammaire de chèvre. Pour cela, la séquence a été optimisée pour l’espèce Bos taurus par l'algorithme d’un fournisseur de gènes de synthèse (tel que GeneArt).
Vecteur d’expression :
Le vecteur d’expression de la beta caséine de chèvre (Bc451 ) a été utilisé pour la production du variant A3A-184AY dans le lait de souris et de chèvre (voir figure 1 ).
Le vecteur beta caséine, Bc451 , a été digéré par Xhol (figure 1A). Le fragment Sali contenant la région codante du variant Fc A3A-184AY a été inséré pour générer la construction génique BC3180 FC A3A-184AY (figures 1 B et 1 C).
Le fragment d’ADN pour la micro-injection a ensuite été isolé du vecteur procaryote. BC3180 a été digéré par Notl et Nrul (figure 1 D). Le fragment libéré de 16.4kb contenant le gène Fc sous contrôle du promoteur de la beta caséine a ensuite été purifié par élution de gel. Cet ADN a ensuite été utilisé dans l’étape de micro-injection.
Production chez la souris :
Le fragment d’ADN a été inséré par micro-injection dans des embryons de souris préimplantatoires. Les embryons ont ensuite été implantés dans des femelles pseudo gravides. Les descendants qui sont nés ont été criblés pour la présence du transgène par analyse PCR.
Expression chez la chèvre :
Le fragment d’ADN préparé pour la micro-injection peut également être utilisé pour la production du variant Fc A3A-184AY dans le lait de chèvre.
EXEMPLE 2: Préparation de variants (fragments Fc mutés) selon l’invention produits dans des cellules HEK et caractérisation desdits variants
I. Matériels et méthodes pour la production
Chaque mutation d’intérêt dans le fragment Fc de séquence SEQ ID NO :14 a été insérée par PCR de chevauchement en utilisant deux ensembles d'amorces adaptées pour intégrer la ou les mutation(s) ciblées avec le(s) codon(s) codant l’acide aminé souhaité. Avantageusement, quand les mutations à insérer sont proches sur la séquence du Fc, elles sont ajoutées via un même oligonucléotide. Les fragments ainsi obtenus par PCR ont été associés et le fragment résultant a été amplifié par PCR en utilisant des protocoles standards. Le produit de PCR a été purifié sur gel d'agarose 1% (w/v), digéré avec les enzymes de restriction adéquates et cloné.
Le fragment Fc recombinant a été produit par transfection transitoire (par lipofection) dans les cellules HEK293 (Cellules 293-F, freestyle InvitroGen) dans du milieu F17 additionné de L-glutamine en utilisant le vecteur pCEP4. Après 8 jours de culture, le surnageant est clarifié par centrifugation et filtré sur filtre de 0,2pm. Le Fragment Fc est ensuite purifié sur protéine A Hi-Trap, et l’élution est faite avec un tampon citrate 25mM pH = 3,0, neutralisation et dialyse dans du PBS avant stérilisation par filtration (0,2pm). II. Tests de liaison sur Octet® (technologie BLI « Bio-Layer Interferometry », appareil Octet RED96, Fortebio, Rail)
Protocoles :
Liaison au FcRn humain (hFcRn) :
Le récepteur hFcRn biotinylé est immobilisé sur des Biosensors Streptavidin, dilué à 0.7 pg/ml en tampon de run (tampon phosphate 0,1 M, NaCI 150mM, Tween 20 0,05%, pH6). Les variants selon l’invention, WT et IglV, ont été testés à 200, 100, 50, 25, 12.5, 6.25, 3.125 et 0 nM en tampon de run (200 nM = 10 pg/ml pour les Fc).
- Design de l’essai:
Baseline 1 x 120s en tampon de run
Loading 300s : le récepteur est chargé sur les biosensors
Baseline 2 x 60s en tampon de run
Association 60s : les échantillons (Fc ou IVIg) sont ajoutés aux biosensors chargés en hFcRn
Dissociation 30s en tampon de run
Régénération 120s en tampon de régénération (tampon Phosphate 0,1 M, NaCI 150mM, Tween 20 0,05%, pH7.8).
- Interprétation des résultats:
Les courbes d’association et de dissociation (premières 10s) sont utilisées pour calculer les constantes cinétiques d’association (kon) et de dissociation (koff) en utilisant un modèle d’association 1/1. Le KD (nM) est ensuite calculé (kon/koff).
Liaison aux récepteurs hCD16aV et hCD32aH :
Le récepteur hCD16aV (R&D System) ou hCD32aH (PX therapeutics) HisTag est immobilisé sur des Biosensors anti-Penta-HIS (HIS 1 K), dilué à 1 pg/ml en tampon de cinétique (Pall). Les variants Fc selon l’invention, WT et IglV, ont été testés à 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31.25, 15 et 0 nM en tampon de cinétique.
-Loading avant chaque échantillon
-Design de l’essai : Toutes les étapes sont réalisées en tampon de cinétique (Pall)
Baseline 1 x 60s Loading 400s
Baseline 2 x 60s
Association 60s
Dissociation 30s
Régénération 5s en tampon de régénération (Glycine 10mM pH 1 .5 / Neutralisation : PBS).
-Interprétation des résultats :
Les courbes d’association et de dissociation (premières 5s) sont utilisées pour calculer les constantes cinétiques d’association (kon) et de dissociation (koff) en utilisant un modèle d’association 1/1. Le KD (nM) est ensuite calculé (kon/koff).
Résultats :
Les résultats sont présentés dans le tableau 1 ci-dessous :
Tableau 1
SD = écart-type
Les résultats montrent que le variant Fc A3A 184AY (HEK) selon l’invention présente à la fois une affinité augmentée pour le récepteur hFcRn, et une affinité augmentée pour les récepteurs FcyRIIIa (CD16a) et FcyRIla (CD32a), et ce, comparé au Fc parent non muté (Fc-WT) mais également comparé aux IgIV.
III. Tests sur modèle d’arthrite induite par le transfert de sérum de souris K/BxN Protocole :
Le modèle K/BxN a été généré en croisant les souris transgéniques pour le récepteur de cellules T KRN à la souche de souris NOD. Les souris K/BxN F1 développent spontanément une maladie à l'âge de 3 à 5 semaines et partagent de nombreuses caractéristiques cliniques avec l’arthrite rhumatoïde humaine.
La maladie a été induite en transférant 10 mI de sérum de souris K/BxN par voie intraveineuse le jour 0 à des souris C57/BI/6J. Les molécules testées ont été administrées une fois par voie intrapéritonéale à J0, 2h avant ou 72 heures après l'injection de sérum de souris K/BxN.
Les souris ont été surveillées quotidiennement pour rechercher et identifier des signes d'arthrite afin d'évaluer l'incidence et la sévérité en ajoutant l'indice des quatre pattes:
0 = normal, 1 = gonflement d'une articulation, 2 = gonflement de plus d’une articulation, et 3 = gonflement sévère de toute l’articulation.
Résultats :
Les souris ayant reçu du sérum K/BxN ont développé une arthrite dans l'articulation. La maladie était caractérisée par une augmentation de la taille de la cheville, induisant une augmentation du score clinique. Ces souris ont montré une augmentation significative du score clinique et de l'épaisseur de la cheville par rapport aux souris témoins traitées avec du sérum physiologique.
1 -Modèle préventif :
Administré 2h avant l'injection de sérum de souris K/BxN, le traitement par 750 mg/kg de fragment Fc de type sauvage (Fc WT) a significativement réduit le score clinique comparé au groupe traité par sérum de souris K/BxN.
Le traitement par le variant Fc A3A-184AY (HEK) selon l’invention a significativement réduit le score clinique de manière similaire au fragment Fc WT, mais à une dose 15 fois plus faible (50 mg/kg) (figure 2).
2-Modèle thérapeutique :
72h après l'injection de sérum de souris K/BxN, les IglV administrées à 2 g/kg ne réduisent pas significativement le score clinique comparé au groupe traité par sérum de souris K/BxN.
Cependant, le traitement par le fragment Fc WT à 750 mg/kg (dose moléculaire équivalente à 2g /kg d’IVIg) a significativement réduit le score clinique comparé au groupe traité par sérum de souris K/BxN. De plus, le traitement par le variant Fc A3A-184AY (HEK) selon l’invention a significativement réduit le score clinique de manière similaire au fragment Fc-WT, mais à une dose 4 fois plus faible (190 mg/kg) (figure 3).
IV. Tests in vitro sur cellules
Protocoles :
Evaluation de la liaison des fragments Fc et Ig IV aux cellules sanguines :
Des IglV ou des variants Fc selon l’invention marqués par Alexa ont été incubés à 65 nM (10 pg / ml pour Fc dans du PBS 2% CSF) avec des cellules cibles pendant 20 minutes sur de la glace. Après 2 lavages dans du PBS à 2% de CSF, les cellules ont été mises en suspension dans 500 mI d'Isoflow avant l'analyse par cytométrie de flux. Les cellules B, les cellules NK, les monocytes et les neutrophiles étaient spécifiquement marqués avec des anti-CD19, anti-CD56, anti-CD14 et anti-CD15 respectivement. Le récepteur FcyRIII (CD16) a été mis en évidence en utilisant l’anticorps anti-CD16 3G8.
Inhibition de l’ADCC :
Pour mimer la situation de lyse de globules rouges qu’on observe dans le purpura thrombopénique idiopathique (PTI), impliquant les autoanticorps du patient atteint du PTI, une lyse de globules rouges médiée par des cellules effectrices en présence d’un anticorps monoclonal anti-Rhésus D (RhD) a été conduite, et la capacité de différentes quantités d’immunoglobulines polyvalentes (IVIg) ou de fragments Fc recombinants mutés ou non mutés, à inhiber cette lyse, par exemple par compétition avec l’anti-RhD pour la fixation des récepteurs Fc à la surface des cellules effectrices, a été évaluée.
La cytotoxicité des anticorps anti-RhD a été étudiée par la technique d’ADCC. Brièvement, des cellules effectrices (cellules mononucléaires) (25 mI à 8 x 107 cellules / ml) et des globules rouges Rhésus positifs (25 mI à 4 x 107 cellules / ml final) ont été incubés avec différentes concentrations (0 à 75 ng / ml) d'anticorps anti-RhD, avec un rapport Effecteur / Cible de 2/1 . Après 16 heures d'incubation, la lyse a été estimée en quantifiant l'hémoglobine libérée dans le surnageant en utilisant un substrat spécifique (DAF).
Les résultats sont exprimés en pourcentage de lyse spécifique en fonction de la quantité d'anticorps. L’inhibition de l’ADCC induite par les IglV ou le variant Fc selon l’invention (RFC A3A-184AY) ajouté à 33 nM a été évaluée. Les résultats sont exprimés en pourcentage, 100% et 0% étant les valeurs obtenues avec les IglV à 650 nM et 0 nM respectivement selon la formule suivante:
[(ADCC avec échantillon à 33nM - ADCC sans IVIg) / (ADCC avec IglV à 33nM - ADCC sans IVIg) x100].
Inhibition de l’activation des cellules Jurkat CD64 :
Ce test estime la capacité des variants Fc selon l’invention ou des IglV (IgG totales) à inhiber la sécrétion d'IL2 par des cellules Jurkat exprimant CD64 humain (Jurkat-H-CD64) induite par la lignée cellulaire Raji avec Rituxan.
Brièvement, des cellules Raji (50 mI à 5 x 106 cellules/ml) ont été mélangées avec du Rituxan (50 mI à 2 mg/ml), des cellules Jurkat H-CD64 (25 mI à 5 x 106 cellules / ml), un ester de phorbol (PMA, 50 mI à 40 ng/ml), puis incubées avec les IglV ou le variant Fc selon l’invention à 1950 nM.
Après une nuit d'incubation, les plaques ont été centrifugées (125 g pour 1 minute) et NL2 contenue dans le surnageant a été évaluée par ELISA.
Les résultats ont été exprimés en pourcentage par rapport aux IglV, selon la formule suivante:
(IL- 2 IglV / IL- 2 de l’échantillon) X100.
Activité d'inhibition de la CDC :
Ce test estime la capacité du variant Fc selon l’invention ou des IglV à inhiber l'activité CDC médiée par le rituximab sur la lignée cellulaire Raji en présence de sérum de jeune lapin comme source de complément. Brièvement, les cellules Raji ont été incubées pendant 30 minutes avec une concentration finale de 50 ng/ml de rituximab. Une solution de sérum de jeune lapin diluée à 1/10 et préalablement incubée avec le variant selon l’invention ou des IglV (vol / vol) pendant 1 h à 37°C a été ajoutée. Après 1 heure d'incubation à 37°C, les plaques ont été centrifugées (125 g pour 1 minute) et la CDC a été estimée en mesurant la LDH intracellulaire libérée dans le milieu de culture.
Les résultats ont été exprimés en pourcentage d'inhibition et comparés aux IglV et au contrôle négatif (Fc sans fonction Fc), 100% correspondant à une inhibition complète de l'activité lytique et 0% à la valeur témoin obtenue sans Fc ou IglV.
Résultats :
Les résultats sont en figures 4 et 5. Comme exposé dans la figure 5, le variant Fc selon l’invention (A3A-184AY (HEK)) présente une meilleure inhibition de l’activité des cellules Jurkat exprimant CD64, de l’ADCC et de la CDC, en comparaison avec les IgIV. Ces résultats montrent qu’un variant selon l’invention tel que A3A-184AY peut être efficace pour le traitement de pathologies impliquant des autoanticorps de patients, notamment par blocage des récepteurs Fc sur les cellules effectrices du patient (voir figure 4).
EXEMPLE 3: Préparation de variants (fragments Fc mutés) selon l’invention produits dans des cellules CHO
Le fragment Fc recombinant peut être obtenu à partir de la SEQ ID NO :14 de la même façon que celle décrite en exemple 2. Ce fragment Fc muté peut être produit par transfection dans les cellules CHO-S à l’aide d’agent de lipofection tel que le Freestyle Max Reagent (Thermofisher) en utilisant un vecteur optimisé pour l’expression dans cette lignée cellulaire. Les cellules CHO-S sont cultivées en milieu CD FortiCHO + 8 mM de Glutamine, en conditions agitées à 135 rpm en atmosphère contrôlée (8% C02) à 37°C. La veille du jour de transfection, les cellules sont ensemencées à une densité de 6.105 cellules/ml.
Le jour de la transfection, l’ADN linéarisé (50 pg) et 50 mI d’agent de transfection (AT) sont pré-incubés séparément en milieu Opti-Pro SFM puis mélangés et incubés durant 20 minutes pour permettre la formation du complexe ADN/AT. L’ensemble est ensuite ajouté à une préparation cellulaire de 1.106 cellules/ml dans un volume de 30 ml. Après 48h d’incubation, des agents de transfection sont ajoutés (Néomycine 1 g/L et Méthotrexate 200nM) aux cellules. La densité cellulaire et la viabilité sont déterminées tous les 3 à 4 jours et les volumes de culture adaptés pour maintenir une densité cellulaire supérieure à de 6.105 cellules/ml. Lorsque la viabilité est supérieure à 90% les pools stables obtenus sont sauvegardés par cryocongélation et des productions en conditions agitées sont réalisées en mode « Fedbatch » durant 10 jours avec un ajout de 4g/L ou 6g/L de glucose durant la production. En fin de production, les cellules et le surnageant sont séparés par centrifugation. Les cellules sont éliminées et le surnageant a est récolté, concentré et filtré en 0.22pm.
Le fragment Fc est ensuite purifié par chromatographie d’affinité sur une résine de protéine A (HiTrap protein A, GE Healthcare). Après capture sur la résine équilibrée en tampon PBS, le fragment Fc est élué avec un tampon citrate 25mM pH = 3,0, suivi d’une neutralisation rapide du pH à l’aide de Tris 1 M puis dialysé en tampon PBS avant stérilisation par filtration (0,2pm).
EXEMPLE 4 : Tests de liaison aux récepteurs FcRn, CD16aH, CD16aV, CD64 et
CD32a des variants produits dans des cellules CHO et dans le lait de chèyres transgéniques
Les tests de liaison aux récepteurs Fc sont réalisés avec les molécules suivantes :
Les variants de l’invention A3A-184AY CHO
(K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y), A3A-184EY_CHO
(Y296W/K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y) produits dans des cellules CHOs selon la méthode donnée en exemple 3, A3A-184AY_TGg produit chez la chèvre transgénique selon la méthode décrite dans l’exemple 1 ;
Le fragment Fc MST-HN contenant les mutations M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, décrit dans la littérature comme ayant une liaison optimisée uniquement au récepteur FcRn (Ulrichts et al, JCI, 2018) a été produit dans des cellules HEK-293 (Cellules 293-F, freestyle InvitroGen) ;
- Un fragment Fc sauvage « Fc-WT » ou « Fc-Rec », obtenu en digérant par la papaïne une lgG1 produite dans du lait de chèvre transgénique ;
- Des IglV
Liaison au FcRn humain ( hFcRn ) :
La liaison au FcRn est étudiée par essai compétitif en utilisant un Rituxan marqué au marqueur A488 (Rituxan-A488) et des cellules Jurkat exprimant le récepteur FcRn (Jurkat-FcRn).
Les cellules Jurkat-FcRn sont ensemencées dans une plaque 96 puits (fond V) à une concentration de 2.105 cellules par puits. Les cellules sont ensuite incubées pendant 20 minutes à 4°C avec les molécules testées diluées dans du tampon aux concentrations finales suivantes : 167 pg/ml; 83 pg/ml; 42 pg/ml; 21 pg/ml; 10 pg/ml; 5 pg/ml; 3 pg/ml; 1 pg/ml ; 0 pg/ml, et simultanément avec 25 pg/mL de Rituxan-A488. Les cellules sont ensuite lavées par ajout de 10OpL de PBS à pH 6 et centrifugées à 1700 rpm pendant 3 minutes à 4°C. Le surnageant est ensuite retiré et 300pL de PBS froid est ajouté à pH 6.
La liaison du Rituxan-A488 au FcRn exprimé par les cellules Jurkat-FcRn est évaluée par cytométrie en flux. Les valeurs de fluorescence moyennes (MFI) observées sont exprimées en pourcentage, 100% étant la valeur obtenue avec le Rituxan-A488 seul et 0% la valeur en absence de Rituxan-A488. Les concentrations moléculaires requises pour induire 50% d’inhibition de la liaison du Rituxan-A488 au FcRn des cellules Jurkat-FcRn sont calculées à l’aide du logiciel « Prism Software ».
Les résultats figurent dans le tableau 2 ci-dessous.
Tableau 2
Les résultats montrent que les variants Fc A3A-184AY CHO, Fc A3A-184EY CHO et A3A-184AY-TGg présentent une inhibition de liaison du Rituxan-A488 augmentée (x100 comparé aux IVIg). Les variants de l’invention montrent une affinité de liaison au FcRn équivalente à celle observée avec le fragment Fc MST-HN décrit dans la littérature comme optimisé seulement pour FcRn (Ulrichts et al, JCI, 2018).
Liaison aux récepteurs hCD64 et hCD16aH. hCD16aV, hCD32aH, hCD32aR :
• Liaison au CD64 humain (hCD64 )
La liaison au CD64 humain est étudiée par essai compétitif en utilisant du Rituxan-A488 et des cellules Jurkat exprimant le récepteur CD64 (Jurkat-CD64).
Les cellules Jurkat-CD64 sont ensemencées dans une plaque 96 puits (fond V) à une concentration de 2.105 cellules par puits. Les cellules sont ensuite incubées pendant 20 minutes à 4°C avec les molécules testées diluées dans du tampon aux concentrations finales suivantes : 167 pg/ml; 83 pg/ml; 42 pg/ml; 21 pg/ml; 10 pg/ml; 5 pg/ml; 3 pg/ml; 1 pg/ml ; 0 pg/ml, et simultanément avec 25 pg/mL de Rituxan-A488.
Les cellules sont ensuite lavées par ajout de 1 OOpL de PBS à pH 6 et centrifugées à 1700 rpm pendant 3 minutes à 4°C. Le surnageant est ensuite retiré et 300pL de PBS froid est ajouté à pH 6.
La liaison du Rituxan-A488 au CD64 exprimé par les cellules Jurkat-CD64 est évaluée par cytométrie en flux. Les valeurs de fluorescence moyennes (MFI) observées sont exprimées en pourcentage, 100% étant la valeur obtenue avec le Rituxan-A488 seul et 0% la valeur en absence de rituxan-A488. Les concentrations moléculaires requises pour induire 50% d’inhibition de la liaison du Rituxan-A488 au CD64 des cellules Jurkat-CD64 sont calculées à l’aide du logiciel « Prism Software ».
• Liaison au CD32aH et CD32aR
La liaison au récepteur humain CD32 est étudiée par essai compétitif en utilisant du Rituxan-A488 et des cellules HEK transfectées avec les récepteurs CD32aH et CD32aR (HEK-CD32).
Les cellules HEK-CD32 sont ensemencées dans une plaque 96 puits (fond V) à une concentration de 2.105 cellules par puits. Les cellules sont ensuite incubées pendant 20 minutes à 4°C avec les molécules testées diluées dans du tampon aux concentrations finales suivantes : 333 pg/mL ; 167 pg/mL ;83 pg/ml; 42 pg/ml; 21 pg/ml; 10 pg/ml; 5 pg/ml; 3 pg/ml; 1 pg/ml ; 0 pg/ml, et simultanément avec 30 pg/mL de Rituxan-A488.
Les cellules sont ensuite lavées par ajout de 100pL de PBS à pH 6 et centrifugées à 1700 rpm pendant 3 minutes à 4°C. Le surnageant est ensuite retiré et 300pL de PBS froid est ajouté à pH 6.
La liaison du Rituxan-A488_au CD32aH et CD32aR exprimés par les cellules HEK-CD32 est évaluée par cytométrie en flux. Les valeurs de fluorescence moyennes (MFI) observées sont exprimées en pourcentage, 100% étant la valeur obtenue avec le Rituxan- A488_seul et 0% la valeur en absence de Rituxan-A488. Les concentrations moléculaires requises pour induire 50% d’inhibition de la liaison du Rituxan-A488 au CD32aH et CD32aR des cellules HEK-CD32 sont calculées à l’aide du logiciel « Prism Software ».
• Liaison au hCD16aH La liaison au CD16aH humain est étudiée par essai compétitif en utilisant un anticorps anti-CD16 3G8 murin marqué à la phycoérythrin (3G8-PE) et des cellules Jurkat transfectées avec le récepteur CD16aH humain (Jurkat-CD16aH). Les cellules Jurkat-CD16aH sont ensemencées dans une plaque 96 puits (fond V) à une concentration de 2.105 cellules par puits. Les cellules sont ensuite incubées pendant 20 minutes à 4°C avec les molécules testées diluées dans du tampon aux concentrations finales suivantes : 83 pg/ml; 42 pg/ml; 21 pg/ml; 10 pg/ml; 5 pg/ml; 3 pg/ml; 1 pg/ml ; 0 pg/ml, et simultanément avec 0.5 pg/mL de mAb 3G8-PE.
Les cellules sont ensuite lavées par ajout de 1 OOpL de PBS à pH 6 et centrifugées à 1700 rpm pendant 3 minutes à 4°C. Le surnageant est ensuite retiré et 300pL de PBS froid est ajouté à pH 6.
La liaison du mAb 3G8-PE_au CD16aH exprimé par les cellules Jurkat-CD16aH est évaluée par cytométrie en flux. Les valeurs de fluorescence moyennes (MFI) observées sont exprimées en pourcentage, 100% étant la valeur obtenue avec le mAb 3G8-PE seul et 0% la valeur en absence de mAb 3G8-PE. Les concentrations moléculaires requises pour induire 50% d’inhibition de la liaison du mAb 3G8-PE au CD16aH des cellules Jurkat-CD16aH sont calculées à l’aide du logiciel « Prism Software ».
Les résultats figurent dans le tableau 3 ci-dessous.
Tableau 3
Les résultats montrent que les variants Fc A3A-184AY CHO, Fc A3A-184EY CHO et A3A-184AY_TGg présentent une affinité augmentée pour les récepteurs FcyRIIIa (CD16a), FcyRI (CD64) et FcyRIla (CD32a), et ce, comparé au Fc non muté (Fc-WT) mais également comparé aux IgIV.
Les mutants de l’invention montrent une affinité très augmentée pour les récepteurs FcyRIIIa (CD16a), FcyRI (CD64) et FcyRIla (CD32a) comparé au MST-HN.
• Liaison au CD16aV humain :
Le récepteur hCD16aV (R&D System) HisTag est immobilisé sur des Biosensors anti- Penta-HIS (HIS 1 K), dilué à 1 pg/ml en tampon de cinétique (Pall). Les molécules ont été testées aux concentrations de 1000, 500, 250, 125, 62.5, 31 .25, 15 et 0 nM en tampon de cinétique. -Loading avant chaque échantillon
-Design de l’essai : Toutes les étapes sont réalisées en tampon de cinétique (Pall)
Baseline 1 x 60s
Loading 400s
Baseline 2 x 60s
Association 60s
Dissociation 30s
Régénération 5s en tampon de régénération (Glycine 10mM pH 1 .5 / Neutralisation : PBS). -Interprétation des résultats :
Les courbes d’association et de dissociation (premières 5s) sont utilisées pour calculer les constantes cinétiques d’association (kon) et de dissociation (koff) en utilisant un modèle d’association 1/1. Le KD (nM) est ensuite calculé (kon/koff).
Les résultats figurent dans le tableau 4 ci-dessous.
Tableau 4
SD : standard déviation
Les résultats montrent que les variants Fc A3A-184AY CHO, Fc A3A-184EY CHO et A3A-184AY_TGg présentent une augmentation de liaison pour le récepteur humain FcyRIIIa-V (CD16a-V), et ce, comparé au Fc non muté (Fc-WT) mais également comparé aux IglV et au fragment Fc MST-HN contenant les mutations M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F.
EXEMPLE 5 : Tests d’inhibition d’ADCC et d’activation des cellules Jurkat des variants produits dans des cellules CHO et dans le lait de chèyres transgéniques
Les tests d’inhibition de l’ADCC et d’activation des cellules Jurkat sont réalisés avec les molécules suivantes :
Les variants de l’invention A3A-184AY CHO
(K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y), A3A-184EY_CHO
(Y296W/K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y) produits dans des cellules CHOs selon la méthode donnée en exemple 3,
Le fragment Fc MST-HN contenant les mutations M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, décrit dans la littérature comme ayant une liaison optimisée uniquement au récepteur FcRn (Ulrichts et al, JCI, 2018) a été produit dans des cellules HEK-293 (Cellules 293-F, freestyle InvitroGen),
- Un fragment Fc sauvage « Fc-Rec » ou « Fc-WT », obtenu en digérant par la papaïne une lgG1 produite dans du lait de chèvre transgénique,
- Des IglV
• Test d’inhibition de l’ADCC :
Pour mimer la situation de lyse de globules rouges qu’on observe dans le purpura thrombopénique idiopathique (PTI), impliquant les autoanticorps du patient atteint du PTI, une lyse de globules rouges médiée par des cellules effectrices en présence d’un anticorps monoclonal anti-Rhésus D (RhD) a été conduite, et la capacité de différentes quantités d’immunoglobulines polyvalentes (IglV) ou de fragments Fc recombinants mutés ou non mutés, à inhiber cette lyse, par exemple par compétition avec l’anti-RhD pour la fixation des récepteurs Fc à la surface des cellules effectrices, a été évaluée.
La cytotoxicité des anticorps anti-RhD a été étudiée par la technique d’ADCC. Brièvement, des cellules effectrices (cellules mononucléaires) (25 mI à 8 x 107 cellules/ml) et des globules rouges Rhésus positifs (25 mI à 4 x 107 cellules / ml final) ont été incubés avec différentes concentrations (0 à 75 ng/ml) d'anticorps anti-RhD, avec un rapport Effecteur / Cible de 2/1. Après 16 heures d'incubation, la lyse a été estimée en quantifiant l'hémoglobine libérée dans le surnageant en utilisant un substrat spécifique (DAF).
Les résultats sont exprimés en pourcentage de lyse spécifique en fonction de la quantité d'anticorps. L’inhibition de l’ADCC est induite par les molécules testées (IglV, le MST-HN, Fc-WT A3A-184AY CHO, A3A-184EY CHO) à des concentrations de 500, 50, 5, 0,5 pg/ml pour MST-HN, Fc-WT A3A-184AY_CHO, A3A-184EY_CHO et 1500, 150, 15, 1 ,5 pg/ml pour les IglV. Les concentrations de molécule pour induire 25% ou 50 %d’inhibition ont été calculées avec le logiciel « Prism Software ».
Les résultats figurent dans le tableau 5 ci-dessous.
Tableau 5
Les résultats montrent que les variants Fc, A3A-184AY CHO et A3A-184EY CHO présentent une inhibition de la lyse des globules rouges par un anticorps anti-Rhésus D augmentée comparé au Fc non muté (Fc-WT) mais également comparé aux IgIV.
De plus, l’inhibition de A3A-184AY CHO ou A3A-184EY CHO est très augmentée comparé au fragment Fc, MST-HN, contenant les mutations M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F.
• Inhibition de l’activation des cellules Jurkat CD64 :
Ce test estime la capacité des variants Fc selon l’invention ou des IgIV (IgG totales) à inhiber la sécrétion d'IL2 par des cellules Jurkat exprimant CD64 humain (Jurkat-H-CD64) induite par la lignée cellulaire Raji avec Rituxan.
Brièvement, des cellules Raji (50 mI à 5 x 106 cellules/ml) ont été mélangées avec du Rituxan (50 mI à 2 mg/ml), des cellules Jurkat H-CD64 (25 mI à 5 x 106 cellules / ml), un ester de phorbol (PMA, 50 mI à 40 ng/ml), puis incubées avec les IgIV ou le variant Fc selon l’invention à 1950 nM.
Après une nuit d'incubation, les plaques ont été centrifugées (125 g pour 1 minute) et NL2 contenue dans le surnageant a été évaluée par ELISA.
L’inhibition de la sécrétion d’IL2 a été induite par les IgIV, Fc-WT, MST-HN ou les variants Fc selon l’invention (A3A-184AY CHO ou A3A-184EY CHO) ajouté à 50 et 100 pg/ml pour les fragments Fc-WT, MST-HN ou les variants Fc selon l’invention (A3A- 184AY CHO ou A3A-184EY CHO) et 150 et 300 pg/ml pour les IgIV.
Les concentrations de molécule pour induire 25% ou 50% d’inhibition ont été calculées avec le logiciel « prism Software ».
Les résultats figurent dans le tableau 6 ci-dessous. Tableau 6
Les résultats montrent que les variants Fc A3A-184AY-CHO et A3A-184EY-CHO, présentent une inhibition de la sécrétion d’IL2 augmentée comparé au Fc non muté (Fc- WT) mais également comparé aux IgIV.
De plus, l’inhibition des RFC A3A-184AY CHO ou A3A-184EY CHO est très augmentée comparé au fragment Fc MST-HN, contenant les mutations M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F.
EXEMPLE 6 : Tests de liaison des variants Fc aux cellules sanguines
Les tests de liaison aux cellules sanguines sont réalisés avec les molécules suivantes :
- Les variants de l’invention A3A-184AY CHO
(K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y), A3A-184EY_CHO
(Y296W/K334N/P352S/A378V/V397M/N434Y) produits dans des cellules CHOs selon la méthode donnée en exemple 3, A3A-184AY_TGg produit chez la chèvre transgénique selon la méthode décrite dans l’exemple 1 ,
- Le fragment Fc MST-HN contenant les mutations
M252Y/S254T/T256E/H433K/N434F, décrit dans la littérature comme ayant une liaison optimisée uniquement au récepteur FcRn (Ulrichts et al, JCI, 2018) a été produit dans des cellules HEK-293 (Cellules 293-F, freestyle InvitroGen),
- Un fragment Fc sauvage « Fc-Rec » ou « Fc-WT », obtenu en digérant par la papaïne une lgG1 produite dans du lait de chèvre transgénique,
- Des IglV
Les molécules testées marquées avec le marqueur Alexa Fluor® (marqueur des protéines hautement fluorescent) ont été incubés à 65 nM (10 pg/ml pour Fc dans du PBS 2% CSF) avec des cellules cibles pendant 20 minutes sur de la glace.
Après 2 lavages dans du PBS à 2% de CSF, les cellules ont été mises en suspension dans 500 mI d'Isoflow avant l'analyse par cytométrie de flux. Les tests sont réalisés sur les cellules suivantes :
- Cellules Natural Killer (NK) marquées avec des anti-CD56 (« % positive NK cells ») ;
- Monocytes marqués avec des anti-CD14 (« % positive cells») ;
- Monocytes CD16+ marqués avec des anti-CD14 et avec l’anticorps anti-CD16 3G8 (« % positive cells ») ;
- Neutrophiles marqués avec des anti-CD15 (« % positive cells»)
Le récepteur FcyRIII (CD16) a été mis en évidence en utilisant l’anticorps anti-CD16 3G8.
Les résultats montrent que les variants Fc A3A-184AY CHO, A3A-184EY CHO et A3A- 184AY_TGg, quel que soit le mode de production, présentent une liaison augmentée comparé au Fc non muté (Fc-Rec) mais également comparé aux IglV. De plus, la liaison de A3A-184AY ou A3A-184EY est très augmentée comparé au fragment MST-HN pour les cellules NK, les monocytes CD16+ et les neutrophiles (cf figure 6).
EXEMPLE 7 : Tests sur modèle vivo de purpura thrombocvtopénique idiopathique i!IEl
La maladie a été induite chez des souris exprimant un FcRn humanisé (mFcRn -/- hFcRnTg 276 hétérozygote de fonds génétique B6, The Jackson Laboratory) en injectant un anticorps anti-plaquettaire 6A6-hlgG1 (0,3pg/g de poids corporel) par voie intraveineuse pour dépléter les plaquettes des souris. Une analyse sanguine est faite (nombre de thrombocytes) 24 heures avant l'injection de 6A6-hlgG1 , 4h après l'induction de la maladie. Les IglV (1000 mg/kg), Fc-Rec (380 et 750 mg/kg), Fc MST-HN (190 mg/kg) et Fc A3A-184AY CHO (190 mg/kg et 380 mg/kg), ont été administrés par voie voie intra-péritonéale 2 heures avant la déplétion des plaquettes.
La numération plaquettaire a été déterminée avec un système Advia Hematology (Bayer). Le nombre de plaquettes avant l'injection d'anticorps a été fixé à 100%.
L'anticorps anti-plaquettaire 6A6-hlgG1 (0,3 pg/g) permet de dépléter 90% des plaquettes.
L’administration de médicaments candidats 2 heures avant la déplétion des plaquettes permet de rétablir (figure 7):
· 100% des plaquettes pour A3A 184AY CHO à la dose de 380 mg/kg ;
106% des plaquettes pour A3A-184AY CHO à la dose de 190 mg/kg ;
90% des plaquettes pour les IglV à la dose de 1000 mg/kg ;
64% des plaquettes pour le Fc-WT à la dose de 750g/kg ;
75% des plaquettes pour le Fc-WT à la dose de 380 mg/kg ;
61 % des plaquettes pour le variant MST-HN à la dose de 190mg/kg.

Claims

REVENDICATIONS
1. Variant d’un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une affinité augmentée pour le récepteur FcRn, et une affinité augmentée pour au moins un récepteur du fragment Fc (FcR) choisi parmi les récepteurs FcyRI (CD64), FcyRIIIa (CD16a) et FcyRI la (CD32a), par rapport à celle du polypeptide parent, caractérisé en ce qu’il comprend :
(i) les quatre mutations 334N, 352S, 378V et 397M ; et
(ii) au moins une mutation choisie parmi 434Y 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241 L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T et 389K ;
la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat.
2. Variant selon la revendication 1 , comprenant en outre au moins une mutation (iii) dans le fragment Fc choisie parmi Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V240S, F241 H, F241Y, L242A, L242F, L242G, L242H, L242I, L242K, L242P, L242S, L242T,
L242V, F243L, F243S, E258G, E258I, E258R, E258M, E258Q, E258Y, V259C, V259I,
V259L, T260A, T260H, T260I, T260M, T260N, T260R, T260S, T260W, V262S, V263T,
V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S267Q, S267V, K290D, K290E, K290H, K290L,
K290N, K290Q, K290R, K290S, K290Y, P291 G, P291 Q, P291 R, R292I, R292L, E293A, E293D, E293G, E293M, E293Q, E293S, E293T, E294A, E294G, E294P, E294Q, E294R, E294T, E294V, Q295I, Q295M, Y296H, S298A, S298R, Y300I, Y300V, Y300W, R301A, R301 M, R301 P, R301 S, V302F, V302L, V302M, V302R, V302S, V303S, V303Y, S304T, V305A, V305F, V305I, V305L, V305R et V305S,
la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat,
3. Variant selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce qu’il comprend :
(i) les quatre mutations 334N, 352S, 378V et 397M;
(ii) au moins une mutation choisie parmi 434Y 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241 L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T et 389K; et
(iii) au moins une mutation choisie parmi K290G et Y296W,
la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat.
4. Variant selon l’une des revendications 1 à 3, présentant une affinité augmentée pour le récepteur FcRn, par rapport à celle du polypeptide parent, d’un ratio au moins égal à 2, de préférence supérieur à 5, de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur à 15, de préférence supérieur à 20, de préférence supérieur à 25, de préférence supérieur à 30.
5. Variant selon l’une des revendications 1 à 4, présentant une affinité augmentée pour au moins un récepteur du fragment Fc (FcR) choisi parmi les récepteurs FcyRI (CD64), FcyRI lia (CD16a) et FcyRI la (CD32a), par rapport à celle du polypeptide parent, d’un ratio au moins égal à 2, de préférence supérieur à 5, de préférence supérieur à 10, de préférence supérieur à 15, de préférence supérieur à 20, de préférence supérieur à 25, de préférence supérieur à 30.
6. Variant selon l’une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce qu’il est produit dans des cellules épithéliales mammaires de mammifères non humains transgéniques.
7. Variant selon l’une des revendications 1 à 6, caractérisé en ce qu’il est produit dans des animaux transgéniques non humains, de préférence dans des mammifères non humains transgéniques.
8. Variant selon la revendication 7, caractérisé en ce que l’animal transgénique non humain est une chèvre transgénique.
9. Variant selon l’une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que le polypeptide parent comprend un fragment Fc parent qui est un fragment Fc humain, de préférence un fragment Fc d’une lgG1 humaine ou d’une lgG2 humaine, plus préférentiellement choisi parmi les séquences SEQ ID NO :1 à 10 et 14.
10. Variant selon l’une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce qu’il est choisi parmi un fragment Fc isolé, une séquence dérivée d’un fragment Fc isolé, un anticorps, un fragment d’anticorps comprenant un fragment Fc, et une protéine de fusion comprenant un fragment Fc.
1 1. Variant selon l’une des revendications 1 à 10, dirigé contre un antigène choisi parmi un antigène tumoral, un antigène viral, un antigène bactérien, un antigène fongique, une toxine, une cytokine membranaire ou circulante, un récepteur membranaire.
12. Variant selon l’une des revendications 1 à 1 1 , pour son utilisation comme médicament.
13. Variant selon l’une des revendications 1 à 1 1 , pour son utilisation dans le traitement d’une pathologie auto-immune ou inflammatoire, de préférence choisie parmi le purpura thrombocytopénique immunologique, la neuromyélite optique ou maladie de Dévie et la sclérose en plaques.
14. Composition pharmaceutique comprenant un variant selon l’une des revendications 1 à 13, et au moins un excipient pharmaceutiquement acceptable.
15. Procédé de production d’un variant d’un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une affinité augmentée pour le récepteur FcRn, et une affinité augmentée pour au moins un récepteur du fragment Fc (FcR) choisi parmi les récepteurs FcyRI (CD64), FcyRIl la (CD16a) et FcyRIla (CD32a), par rapport à celle du polypeptide parent, caractérisé en ce qu’il comprend :
(i) les quatre mutations 334N, 352S, 378V et 397M ; et
(ii) au moins une mutation choisie parmi 434Y 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241 L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T et 389K ;
la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat,
ledit procédé comprenant l’expression dudit variant dans des cellules épithéliales mammaires de mammifères non humains transgéniques, ou
ledit procédé comprenant l’expression dudit variant dans des cellules de mammifère en culture.
16. Procédé de production d’un variant d’un polypeptide parent comprenant un fragment
Fc selon la revendication 15, caractérisé en ce que ledit variant comprend en outre au moins une mutation (iii) dans le fragment Fc choisie parmi Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V240S, F241 H, F241 Y, L242A, L242F, L242G, L242H, L242I, L242K, L242P, L242S, L242T, L242V, F243L, F243S, E258G, E258I, E258R, E258M, E258Q,
E258Y, V259C, V259I, V259L, T260A, T260H, T260I, T260M, T260N, T260R, T260S,
T260W, V262S, V263T, V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S267Q, S267V, K290D,
K290E, K290H, K290L, K290N, K290Q, K290R, K290S, K290Y, P291 G, P291 Q, P291 R,
R292I, R292L, E293A, E293D, E293G, E293M, E293Q, E293S, E293T, E294A, E294G, E294P, E294Q, E294R, E294T, E294V, Q295I, Q295M, Y296H, S298A, S298R, Y300I, Y300V, Y300W, R301 A, R301 M, R301 P, R301 S, V302F, V302L, V302M, V302R, V302S, V303S, V303Y, S304T, V305A, V305F, V305I, V305L, V305R et V305S,
la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat.
17. Procédé de production d’un variant d’un polypeptide comprenant un fragment Fc selon la revendication 15 ou 16, comprenant les étapes suivantes :
a) préparation d’une séquence d’ADN comprenant une séquence codant pour le variant, une séquence codant pour un promoteur de caséine de mammifère ou un promoteur de lactosérum de mammifère, et une séquence codant pour un peptide signal permettant la sécrétion dudit variant ;
b) introduction de la séquence d’ADN obtenue en a) dans un embryon de mammifère non humain, afin d’obtenir un mammifère non humain transgénique exprimant le variant codé par ladite séquence d’ADN obtenue en a) dans la glande mammaire ; et
c) récupération du variant dans le lait produit par le mammifère non humain transgénique obtenu en b).
18. Procédé de production d’un variant d’un polypeptide comprenant un fragment Fc selon l’une des revendications 15 à 17, dans lequel le mammifère non humain transgénique est choisi parmi les bovins, les porcins, les chèvres, les ovins et les rongeurs, de préférence parmi la chèvre, la souris, la truie, la lapine, la brebis et la vache.
19. Procédé de production d’un variant d’un polypeptide comprenant un fragment Fc selon la revendication 15 ou 16, comprenant les étapes suivantes :
a) préparation d’une séquence d’ADN codant pour le variant;
b) introduction de la séquence d’ADN obtenue en a) dans des cellules de mammifère en culture de façon transitoire ou stable ;
c) expression du variant à partir des cellules obtenues en b), et
d) récupération du variant dans le milieu de culture.
20. Séquence d'ADN comprenant un gène codant un variant d’un polypeptide parent comprenant un fragment Fc, ledit variant présentant une affinité augmentée pour le récepteur FcRn, et une affinité augmentée pour au moins un récepteur du fragment Fc (FcR) choisi parmi les récepteurs FcyRI (CD64), FcyRIl la (CD16a) et FcyRIla (CD32a), par rapport à celle du polypeptide parent, caractérisé en ce que ledit variant comprend :
(i) les quatre mutations 334N, 352S, 378V et 397M ; et (ii) au moins une mutation choisie parmi 434Y 434S, 226G, P228L, P228R, 230S, 230T, 230L, 241 L, 264E, 307P, 315D, 330V, 362R, 389T et 389K ;
la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat,
ladite séquence d'ADN comprenant optionnellement une séquence codant pour un peptide signal permettant la sécrétion dudit variant.
21. Séquence d'ADN comprenant un gène codant un variant d’un polypeptide parent comprenant un fragment Fc selon la revendication 20, ledit variant comprenant en outre au moins une mutation (iii) dans le fragment Fc choisie parmi Y296W, K290G, V240H, V240I, V240M, V240N, V240S, F241 H, F241 Y, L242A, L242F, L242G, L242H, L242I,
L242K, L242P, L242S, L242T, L242V, F243L, F243S, E258G, E258I, E258R, E258M,
E258Q, E258Y, V259C, V259I, V259L, T260A, T260H, T260I, T260M, T260N, T260R,
T260S, T260W, V262S, V263T, V264L, V264S, V264T, V266L, S267A, S267Q, S267V,
K290D, K290E, K290H, K290L, K290N, K290Q, K290R, K290S, K290Y, P291 G, P291 Q, P291 R, R292I, R292L, E293A, E293D, E293G, E293M, E293Q, E293S, E293T, E294A,
E294G, E294P, E294Q, E294R, E294T, E294V, Q295I, Q295M, Y296H, S298A, S298R, Y300I, Y300V, Y300W, R301A, R301 M, R301 P, R301 S, V302F, V302L, V302M, V302R, V302S, V303S, V303Y, S304T, V305A, V305F, V305I, V305L, V305R et V305S, la numérotation étant celle de l’index EU ou équivalent dans Kabat.
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