KR102341138B1 - 엑소좀의 막단백질 변이체를 포함하는 엑소좀 및 이의 제조방법 - Google Patents

엑소좀의 막단백질 변이체를 포함하는 엑소좀 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 고유의 엑소좀 막단백질 변이체에 목적 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 융합 폴리펩타이드 및 이를 코딩하는 유전자 작제물을 이용하여 종래의 다른 엑소좀 단백질(천연 엑소좀 단백질)을 이용하는 것 보다 엑소좀에 대한 목적 단백질 또는 펩타이드의 로딩 효율을 현저히 증가시킬 수 있다. 즉, 본 발명의 엑소좀 막단백질 변이체는 천연 엑소좀 단백질 보다 엑소좀 표면 상에 높은 함량으로 존재하고, 이에 따라 본 발명의 엑소좀 막단백질 변이체에 융합된 목적 단백질 또는 펩타이드 역시 엑소좀 표면 상에 높은 함량으로 존재하여 목적 단백질 또는 펩타이드를 엑소좀에 고효율로 로딩할 수 있는 장점이 있다.

Description

엑소좀의 막단백질 변이체를 포함하는 엑소좀 및 이의 제조방법 {Exosomes comprising exosomal membrane protein variant and manufacturing method thereof}
본 발명은 엑소좀의 막단백질 변이체를 포함하는 엑소좀 및 이의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 엑소좀의 막단백질 변이체와 목적 단백질 또는 펩타이드의 융합 폴리펩타이드를 이용하여 종래의 엑소좀의 막단백질을 이용하는 방법 보다 목적 단백질 또는 펩타이드를 증가된 양으로 엑소좀에 로딩할 수 있는 기술에 관한 것이다.
추가로, 본 발명은 엑소좀의 막단백질 변이체와 목적 단백질 또는 펩타이드의 융합 폴리펩타이드를 포함하는 엑소좀을 면역 관련 질환, 암, 염증 질환, 바이러스 질환, 기타 다양한 질환의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 응용하는 것에 관한 것이다.
인체에 투여되는 치료제가 효과적으로 작용하게 하고 부작용을 줄이기 위해 약물 전달 시스템(Drug Delivery System; DDS)이 사용된다.
예를 들어, 항체, 단백질, 또는 폴리펩타이드는 생체 내 환경에 노출되었을 때 그 효능이 저하되거나 치료 대상이 되는 표적 부위로 전달되지 못할 수 있다. 예를 들어, 표적 항암제는 암세포에 특이적으로 작용하도록 개발되었지만, 인체 내에 투여 시 치료 대상이 되는 암조직에 대해 보다 선택적으로 작용할 수 있다면 치료 효과를 극대화할 수 있다.
현재까지 약물 전달 시스템으로 개발된 리포좀 또는 마이셀 등은 생체 내에서 약물의 유지시간을 증가시키고 약물동력학 관점에서 개선이 있었으나, 특정 세포, 예를 들어, 면역 세포나 암세포에 대한 선택적 타겟팅 능력은 결여되어 있다. 뿐만 아니라 합성물질을 사용한 리포좀은 생체 적합성 문제가 발생할 수 있다.
한편, 최근 세포 분비물(secretome)에 세포의 행동(behavior)을 조절하는 다양한 생체활성인자가 포함되어 있다는 연구가 보고되고 있으며, 특히 세포 분비물 내에는 세포 간 신호전달 기능을 갖는 '엑소좀(exosome)' 또는 '세포외 소포체(extracellular vesicle)'가 포함되어 있어 그 성분과 기능에 대한 연구가 활발히 진행 중에 있다.
세포는 세포외 환경에 다양한 막(membrane) 유형의 소포체를 방출하는데, 통상 이러한 방출 소포체들을 세포외 소포체(Extracellular vesicles, EVs)라고 부르고 있다. 세포외 소포체는 세포막 유래 소포체, 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 엑소좀 등으로 불려지기도 하며, 경우에 따라서는 엑소좀과는 구별되어 사용되기도 한다.
엑소좀은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막을 갖는 수십 내지 수백 나노미터 크기의 소포체로서 내부에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다. 엑소좀은 유래된 세포의 성질 및 상태에 따라 특이적인 유전물질과 생체활성 인자들이 포함되어 있다. 증식하는 줄기세포 유래 엑소좀의 경우 세포의 이동, 증식 및 분화와 같은 세포 행동을 조절하고, 조직 재생과 관련된 줄기세포의 특성이 반영되어 있다(Nature Review Immunology 2002 (2) 569-579).
즉, 세포의 아바타라고 불리는 엑소좀은 세포와 유사하게 성장인자와 같은 생체활성 인자들이 포함되어 있는데, 생체활성 인자들을 세포와 세포 간에 실어 나르는 전달체 역할, 즉, 세포와 세포 간의 교신 역할을 한다. 엑소좀은 줄기세포, 면역세포, 섬유아세포 및 암세포 등의 동물세포로부터 방출될 뿐만 아니라 식물, 세균(bacteria), 균류(fungi), 조류(algae) 등 다양한 생물의 세포로부터도 방출되는 것으로 알려져 있다.
이와 같은 엑소좀을 약물 전달체로 사용할 경우 생체적합적이고 생체 내에서 약물의 안정성을 높여주면서도 잘 흡수된다는 장점이 있다. 그러나 자연적으로 생성되는 엑소좀에 약물 카고를 소수성 특성 등을 이용하여 수동적으로 흡수시켜 로딩하는 방식은 제조 효율이 떨어지고 엑소좀에 충분한 약물 카고가 로딩되지 못하는 한계가 있다.
최근에는 유전자 구조체 제작 단계에서 엑소좀의 막관통 단백질에 목적 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 후 세포 내에서 발현시키고 세포 배양액에 분비 내지는 방출된 엑소좀을 분리하여 목적 단백질 또는 펩타이드가 로딩된 엑소좀(엑소좀의 막관통 단백질에 목적 단백질 또는 펩타이드가 융합된 엑소좀)을 수득하는 방법이 제안되고 있다(WO 2013/084000 A2; WO 2014/168548 A2 참조).
그러나 다른 기술 분야와 마찬가지로 본 발명이 속하는 기술분야 역시 목적 단백질 또는 펩타이드를 엑소좀에 효과적으로 로딩하고 치료 대상이 되는 표적 부위에 효과적으로 전달하기 위한 새로운 기술에 대한 끊임없는 개발을 요구하고 있다.
한편, 상기한 배경기술로서 설명된 사항들은 본 발명의 배경에 대한 이해 증진을 위한 것일 뿐, 본 발명의 "선행 기술"로서 이용될 수 있다는 승인으로서 인용한 것은 아님을 이해하여야 한다.
대한민국 공개특허공보 제10-2020-0098512호 (2020.08.20) 국제공개공보 WO 2013/084000 A2 (2013.06.13) 국제공개공보 WO 2014/168548 A2 (2014.10.16)
본 발명의 목적은 엑소좀의 막단백질 변이체를 포함하는 엑소좀 및 이의 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은 엑소좀의 막단백질 변이체와 목적 단백질 또는 펩타이드의 융합 폴리펩타이드를 이용하여 종래의 엑소좀의 막단백질을 이용하는 방법 보다 목적 단백질 또는 펩타이드를 증가된 양으로 엑소좀에 로딩할 수 있는 기술을 제공하는데 있다.
본 발명의 또 다른 목적은 엑소좀의 막단백질 변이체와 목적 단백질 또는 펩타이드의 융합 폴리펩타이드를 포함하는 엑소좀을 면역 관련 질환, 암, 염증 질환, 바이러스 질환, 기타 다양한 질환의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료에 응용하는 것을 제공하는데 있다.
그러나, 전술한 바와 같은 본 발명의 과제는 예시적인 것으로, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다. 또한, 본 발명의 다른 목적 및 이점은 하기의 발명의 상세한 설명, 청구범위 및 도면에 의해 보다 명확하게 된다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위하여, 본 발명자는 예의연구를 거듭한 결과, 본 발명 고유의 엑소좀 막단백질 변이체에 목적 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 작제물을 세포에 형질도입하고 상기 유전자 작제물을 세포 내에서 발현시킨 후 세포 배양액에 분비 내지는 방출된 엑소좀을 분리하면 엑소좀 당 목적 단백질 또는 펩타이드의 함량이 높은 것(즉, 엑소좀에 대한 목적 단백질 또는 펩타이드의 로딩 효율이 현저히 우수한 것)을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 명세서에서 용어, "세포외 소포체(Extracellular vesicles, EVs)"는 통상 세포막 유래 소포체(membrane vesicles), 엑토좀(ectosomes), 쉐딩 소포체(shedding vesicles), 마이크로파티클(microparticles), 또는 이의 등가물을 포괄하는 의미로 사용된다. 분리 환경, 조건 및 방법 등에 따라 세포외 소포체는 엑소좀과 동일한 의미를 가질 수도 있고 엑소좀과 크기는 동일 내지는 유사하지만 엑소좀의 조성을 갖지 않는 나노베지클까지 포함하는 의미를 가질 수도 있다. 한편, 본 명세서에서 목적 단백질 또는 펩타이드의 로딩과 관련하여 사용되는 엑소좀이라는 용어는 상기 세포외 소포체를 포괄하는 의미로 사용된다.
본 명세서에서 용어, "엑소좀(exosomes)"은 세포막의 구조와 동일한 이중인지질막으로 이루어진 수십 내지 수백 나노미터(바람직하게는 대략 30~200 nm) 크기의 소포체를 의미한다(단, 분리 대상이 되는 세포 종류, 분리방법 및 측정방법에 따라 엑소좀의 입자 크기는 가변될 수 있음)(Vasiliy S. Chernyshev et al., "Size and shape characterization of hydrated and desiccated exosomes", Anal Bioanal Chem, (2015) DOI 10.1007/s00216-015-8535-3). 엑소좀에는 엑소좀 카고(cargo)라고 불리는 단백질, 핵산(mRNA, miRNA 등) 등이 포함되어 있다. 엑소좀 카고에는 광범위한 신호전달 요소들(signaling factors)이 포함되며, 이들 신호전달 요소들은 세포 타입에 특이적이고 분비세포의 환경에 따라 상이하게 조절되는 것으로 알려져 있다. 엑소좀은 세포가 분비하는 세포 간 신호전달 매개체로서 이를 통해 전달된 다양한 세포 신호는 표적 세포의 활성화, 성장, 이동, 분화, 탈분화, 사멸(apoptosis), 괴사(necrosis)를 포함한 세포 행동을 조절한다고 알려져 있다.
한편, 본 명세서에서 사용된 "엑소좀"이란 용어는 동물 유래 세포에서 분비되어 세포외 공간으로 방출된 나노 크기의 베지클 구조를 갖고 있고 엑소좀과 유사한 조성을 갖는 베지클(예를 들어, 엑소좀-유사 베지클)을 모두 포함하는 것을 의미한다. 상기 세포의 종류는 제한되지 않으나, 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, HEK293 세포, HEK293T 세포, CHO 세포, 줄기세포, 면역세포, 또는 암세포 등일 수 있고, 바람직하게는 HEK293 세포나 HEK293T 세포일 수 있다.
또한, 본 발명을 한정하지 않는 하나의 예시로서, 동물 유래 세포는 줄기세포 또는 면역세포일 수 있다. 상기 줄기세포는 배아줄기세포, 유도만능 줄기세포(induced pluripotent stem cell; iPSC), 성체줄기세포, 배아줄기세포 유래 중간엽 줄기세포, 또는 유도만능 줄기세포 유래 중간엽 줄기세포일 수 있다. 상기 면역세포는 T 세포, B 세포, NK 세포, 세포독성 T 세포(cytotoxic T cell), 수지상 세포 또는 대식 세포일 수 있다. 상기 성체줄기세포는 중간엽 줄기세포, 인간 조직 유래 중간엽 기질세포, 인간 조직 유래 중간엽 줄기세포, 및 다분화능 줄기세포로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 성체 줄기세포일 수 있다. 상기 중간엽 줄기세포는 제대, 제대혈, 골수, 지방, 근육, 신경, 피부, 양막, 와튼젤리 및 태반으로 구성된 군에서 선택되는 1종 이상의 조직으로부터 유래된 중간엽 줄기세포일 수 있다.
그러나 인체에 불리한 작용을 일으키지 않는 것이라면 당업계에서 사용되고 있거나 향후 사용될 수 있는 다양한 동물세포를 사용할 수 있음은 물론이다. 따라서, 후술하는 실시예들에서 사용된 HEK293T 세포는 본 발명에서 사용될 수 있는 동물세포의 일례로서 이해되어야 하며, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아님을 명백히 밝혀 둔다.
본 명세서에서 사용된 용어, "목적 단백질 또는 펩타이드"는 엑소좀 상 및/또는 엑소좀 내에 로딩하고자 하는 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 또는 이들의 단편을 의미한다. 목적 단백질 또는 펩타이드는 엑소좀 상 및/또는 엑소좀 내에 존재하지 않는 외인성(exogenous)일 수 있고, 엑소좀 상 및/또는 엑소좀 내에 존재하는 내인성(endogenous)일 수 있다. 본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 목적 단백질 또는 펩타이드는 면역 조절, 항암 작용, 항염 작용, 항바이러스 작용, 및/또는 기타 생리적으로 유용한 기능을 갖는 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 또는 이들의 단편일 수 있다.
예를 들어, 목적 단백질 또는 펩타이드는 항체, 항체의 가변영역 단편, 항체의 Fc 도메인, 항체의 Fc 도메인 결합 단백질, 단일 체인 항체, 단일 체인 가변영역 단편(scFv), 미니바디(minibody), 다이아바디(diabody), 트리아바디(triabody), 펩타이드 앱타머, 나노바디(nanobody), CRISPR-결합 단백질, 세포사멸 유도 단백질, 세포사멸 억제 단백질, 효소, 리간드, 리간드 수용체, 성장인자, 성장인자 수용체, 사이토카인(예를 들어, IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 등), 사이토카인 수용체, 성장인자 결합 수용체, 사이토카인 결합 수용체, 사이토카인 저해 단백질, 독소 단백질, 유전자 손상 유도 단백질, 유전자 손상 저해 단백질, 바이러스 억제 단백질, 또는 항균 단백질이거나 이들의 단편일 수 있다.
본 명세서에서 사용된 용어, "유전적으로 조작된(genetically engineered)"이란 용어는 세포에 대하여 하나 이상의 유전적 변형(genetic modification)을 도입하는 행위 또는 이러한 행위에 의해 만들어진 세포 및/또는 이로부터 유래한 엑소좀을 의미한다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀은, 서열번호 1의 엑소좀 막단백질 변이체에 목적 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 융합 폴리펩타이드를 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀에 있어서, 상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 상기 엑소좀 막단백질 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있으며, 바람직하게는 상기 엑소좀 막단백질 변이체의 N-말단에 융합될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀에 있어서, 신호 펩타이드가 상기 목적 단백질 또는 펩타이드의 N-말단에 융합될 수 있다. 상기 신호 펩타이드는 상기 목적 단백질 또는 펩타이드로부터 유래된 것이거나 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자의 신호 펩타이드일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드는 상기 엑소좀의 막을 통과하여 위치하고, 상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 상기 엑소좀의 표면 상에 위치한다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀에 있어서, 상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, 또는 IL-21 중 적어도 1종일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀은, 상기 목적 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 외인성 서열을 포함하도록 유전적으로 조작 또는 변형된 엑소좀 생산 세포로부터 생산될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀에 있어서, 상기 엑소좀 생산 세포는 HEK293 세포 및/또는 HEK293T 세포일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 제조방법은, 서열번호 1의 엑소좀 막단백질 변이체에 목적 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 작제물을 준비하는 단계와, 상기 유전자 작제물을 엑소좀 생산 세포에 형질도입하는 단계와, 상기 융합 폴리펩타이드를 상기 엑소좀 생산 세포 내에서 발현시키는 단계와, 상기 융합 폴리펩타이드를 포함하는 엑소좀을 분리하는 단계를 포함한다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 제조방법에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드를 포함하는 엑소좀은 상기 엑소좀 생산 세포로부터 분비 또는 방출되어 상기 엑소좀 생산 세포의 배양액 내에 함유된다. 상기 배양액으로부터 상기 융합 폴리펩타이드를 포함하는 엑소좀을 분리할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 제조방법에 있어서, 상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 상기 엑소좀 막단백질 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 융합될 수 있으며, 바람직하게는 상기 엑소좀 막단백질 변이체의 N-말단에 융합될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 제조방법에 있어서, 신호 펩타이드가 상기 목적 단백질 또는 펩타이드의 N-말단에 융합될 수 있다. 상기 신호 펩타이드는 상기 목적 단백질 또는 펩타이드로부터 유래된 것이거나 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자의 신호 펩타이드일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 제조방법에 있어서, 상기 융합 폴리펩타이드는 상기 엑소좀의 막을 통과하여 위치하고, 상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 상기 엑소좀의 표면 상에 위치한다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 제조방법에 있어서, 상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, 또는 IL-21 중 적어도 1종일 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 엑소좀의 제조방법에 있어서, 상기 엑소좀 생산 세포는 HEK293 세포 및/또는 HEK293T 세포일 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 엑소좀 막단백질 변이체는 종래의 다른 엑소좀 단백질(천연 엑소좀 단백질) 보다 상기 엑소좀의 표면에 높은 함량(높은 밀도)으로 존재한다. 상기 엑소좀 막단백질 변이체가 상기 엑소좀의 표면에 높은 함량으로 존재하면 상기 엑소좀 막단백질 변이체에 융합된 상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 엑소좀 당 함량이 높게 된다. 따라서, 본 발명의 엑소좀에 로딩된 목적 단백질 또는 펩타이드의 함량은 천연 엑소좀에 로딩된 목적 단백질 또는 펩타이드의 함량 보다 높다. 또한, 본 발명의 엑소좀 막단백질 변이체를 이용하면 종래의 다른 엑소좀 단백질(천연 엑소좀 단백질)을 이용하는 것 보다 엑소좀에 대한 목적 단백질 또는 펩타이드의 로딩 효율을 현저히 증가시킬 수 있다.
예를 들어, 종래의 다른 엑소좀 단백질(천연 엑소좀 단백질)로는 CD9, CD63, CD81, LAMP-1, LAMP-2, 신택신-3(Syntaxin-3), 신테닌-1(Syntenin-1), 신테닌-2, 신데칸-1(Syndecan-1), 신데칸-4, 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자(Prostaglandin F2 Receptor Negative Regulator) 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것이 아님은 물론이다.
또한, 본 발명은 상기 엑소좀을 유효성분으로 포함하는 조성물을 제공한다. 상기 조성물은 약학 조성물 또는 화장료 조성물일 수 있다. 예를 들어, 상기 약학 조성물은 주사제로 제조될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 상기 엑소좀과, 약리학적으로 허용가능한 담체를 포함한다. 예를 들어, 상기 약학 조성물은 항종양 효과 증진용 또는 항암효과 증진용으로 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물은 암세포 사멸물질을 포함할 수 있다. 상기 암세포 사멸물질은 상기 엑소좀 표면 또는 내부에 위치할 수 있고, 상기 목적 단백질 또는 펩타이드 및/또는 상기 엑소좀 막단백질 변이체에 융합되어 위치할 수도 있다.
예를 들어, 상기 암세포 사멸물질은 IL-2, IL-7, IL-12, IL-15, IL-18, IL-21 등의 사이토카인, 독소 단백질, 유전자 손상 유도 단백질, CRISPR-결합 단백질, 세포사멸 유도 단백질, 그랜자임 A, 그랜자임 B, 퍼포린, FAS 단백질, TRAIL(TNF-related apoptosis-inducing ligand) 단백질, PD-1, PD-L1, CTLA-4 등의 면역 체크포인트 단백질, CD47, 항-EGFR 항체 등 암 특이적 항체들, T 세포 수용체(T Cell Receptor), NKG2D 등 면역세포 표면 단백질, 인터페론 유전자 자극인자(Stimulator of Interferon Genes; STING), 알부민 결합 파클리탁셀, 악티노마이신, 알리트레티노인, 아자시티딘, 아자티오프린, 베바시주맙, 벡사토텐, 블레오마이신, 보테조밉, 카보플라틴, 카페시타빈, 세툭시맙, 시스플라틴, 클로람부실, 사이클로포스파미드, 시타라빈, 다우노루비신, 도세탁셀, 독시플루리딘, 독소루비신, 에피루비신, 에포틸론, 에를로티닙, 에토포시드, 플루오로우라실, 게피티닙, 겜시타빈, 하이드록시우레아, 이다루비신, 이마티닙, 이필리무맙, 이리노테칸, 라파티닙, 메클로레타민, 멜팔란, 메르캅토퓨린, 메토트렉세이트, 미톡산트론, 오크렐리주맙, 오파투무맙, 옥살리플라틴, 파클리탁셀, 파니투무맙, 페메트렉세드, 리툭시맙, 타후르포시드, 테니포사이드, 티오구아닌, 토포테칸, 트레티노인, 발루비신, 베무라페닙, 빈블라스틴, 빈크리스틴, 빈데신, 비노렐빈, 보리노스타트, 로미뎁신, 5-플루오로우라실(5-FU), 6-메르캅토퓨린(6-MP), 클라드리빈, 클로파라빈, 플록스유리딘, 플루다라빈, 펜토스타틴, 미토마이신, 익사베필론, 에스트라무스틴 등으로 구성된 군으로부터 선택된 적어도 1종일 수 있다. 그러나 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 다양한 항종양 또는 항암 물질이 사용될 수 있음은 물론이다.
또한, 본 발명은 전술한 바와 같은 엑소좀을 포함하는 약물 전달 시스템을 제공한다. 예를 들어, 상기 약물 전달 시스템은 단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 또는 이들의 단편의 전달 시스템이다.
본 발명을 한정하지 않는 예시로서, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템은 경구 또는 비경구의 여러 가지 제형일 수 있다.
본 발명의 일 구체예에 따른 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템은 면역 관련 질환, 암, 염증 질환, 바이러스 질환, 및/또는 기타 다양한 질환의 예방, 억제, 완화, 개선 또는 치료하는데 사용될 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템은 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제 등을 포함할 수 있다. 상기 담체, 부형제 및 희석제로는 락토오스, 덱스트로오스, 트레할로오스, 수크로오스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 카보네이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스(microcrystalline cellulose), 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 미네랄 오일 등을 들 수 있으며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템은 통상의 방법에 따라 산제, 환제, 정제, 캡슐제, 현탁제, 에멀젼, 시럽, 과립제, 엘릭시르제(elixirs), 에어로졸 등의 경구투여용 제제, 외용제, 좌제, 또는 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템의 투여는 어떠한 적절한 방법으로 환자에게 소정의 물질을 도입하는 것을 의미하며, 상기 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템의 투여경로는 약물이 목적 조직에 도달할 수 있는 한 어떠한 일반적인 경로를 통하여 투여될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템은 경구 또는 비경구 투여할 수 있으며, 비경구 투여로는 종양 내 투여, 관절 내 투여, 관절강 내 투여, 활액낭 내(intrasynovial) 투여, 흉골 내 투여, 수강 내(intrathecal) 투여, 병변 내 및 두개 내(intracranial) 투여, 경피 투여, 복강 내 투여, 정맥 내 투여, 동맥 내 투여, 림프 내 투여, 근육 내 투여, 피하 투여, 피내 투여, 국소 투여, 직장 내 투여 등을 거론할 수 있다. 그러나, 이에 제한되는 것이 아니며 당업계에 알려진 다양한 투여 방법을 배제하지 않는다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템은 활성 물질이 표적 조직 또는 세포로 이동할 수 있는 임의의 장치에 의해 투여될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템의 치료상 유효량은 질환 치료 효과를 기대하기 위하여 투여에 요구되는 양을 의미한다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템의 경구투여용 고형제제는 적어도 1종의 부형제, 예를 들면, 전분, 칼슘 카보네이트, 수크로오스, 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 제조될 수 있다. 또한, 상기 경구투여용 고형제제는 상기 부형제 이외에 실리카, 스테아르산, 마그네슘 스테아레이트, 칼슘 스테아레이트, 탈크, 폴리에틸렌 글리콜과 같은 윤활제(활택제)를 포함할 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템의 경구투여용 액상제제는 단순 희석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등을 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템의 비경구 투여용 제제는 멸균된 수용액, 비수성 용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 또는 좌제일 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템의 비경구 투여용 제제는 주사제로도 제조될 수 있다. 본 발명의 일 구체예의 주사제는 수성 주사제, 비수성 주사제, 수성 현탁 주사제, 비수성 현탁 주사제, 또는 용해 또는 현탁하여 사용하는 고형 주사제 등일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 일 구체예의 주사제는 그 종류에 따라 주사용 증류수, 식물유(예를 들어, 낙화생유, 참기름, 동백기름 등), 모노글리세리드, 디글리세리드, 프로필렌글리콜, 캄퍼, 벤조산에스트라디올, 차살리실산비스무트, 아르세노벤졸나트륨, 또는 황산스트렙토마이신 중 적어도 1종을 포함할 수 있고, 선택적으로 안정제나 방부제를 포함할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템의 배합비율은 전술한 바와 같은 추가 성분들의 종류나 양, 형태 등에 따라서 적당하게 선택할 수 있다. 예를 들어, 주사제 전량에 대해, 본 발명의 약물 전달용 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템은 약 0.1 내지 99 중량%, 바람직하게는 약 10 내지 90 중량% 정도 포함될 수 있다. 또한, 본 발명의 일 구체예의 약물 전달용 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템의 적합한 투여량은 환자의 질환 종류, 질환의 경중, 제형의 종류, 제제화 방법, 환자의 연령, 성별, 체중, 건강 상태, 식이, 배설률, 투여 시간 및 투여 방법에 따라 조절될 수 있다. 예를 들어, 성인에게 본 발명의 일 구체예의 약물 전달용 약학 조성물 또는 약물 전달 시스템을 투여하는 경우, 하루에 0.001 mg/kg ~ 100 mg/kg의 용량으로 1 내지 수회에 나누어 투여할 수 있다.
한편, 본 발명의 일 구체예의 조성물이 화장료 조성물로 제조되는 경우, 본 발명의 효과를 손상하지 않는 범위내에서 통상 화장료 조성물에 이용되는 성분, 예를 들면 보습제, 산화방지제, 유성성분, 자외선 흡수제, 유화제, 계면활성제, 증점제, 알콜류, 분말성분, 색재, 수성성분, 물, 각종 피부영양제 등을 필요에 따라 적절히 배합할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 예를 들면, 패취, 마스크팩, 마스크시트, 크림, 토닉, 연고, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 로션, 젤, 오일, 팩, 스프레이, 에어졸, 미스트, 파운데이션, 파우더, 기름 종이 등의 다양한 형태에 적용할 수 있다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 당업계에서 통상적으로 제조되는 어떠한 화장품 제형으로도 제조될 수 있다. 예를 들어 패취, 마스크팩, 마스크시트, 유연화장수, 영양화장수, 수렴화장수, 영양크림, 마사지크림, 아이크림, 클렌징크림, 에센스, 아이에센스, 클렌징로션, 클렌징폼, 클렌징워터, 선스크린, 립스틱, 비누, 샴푸, 계면활성제-함유 클렌징, 입욕제, 바디로션, 바디크림, 바디오일, 바디에센스, 바디세정제, 염모제, 헤어토닉 등으로 제형화할 수 있으나 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명의 일 구체예의 화장료 조성물은 화장료 조성물에 통상적으로 이용되는 성분들을 포함하며, 예컨대 항산화제, 안정화제, 용해화제, 비타민, 안료 및 향료와 같은 통상적인 보조제 그리고 담체를 포함할 수 있다. 또한, 화장료 조성물에 대한 각각의 제형에 있어서, 다른 성분들은 화장료 조성물의 종류 또는 사용목적 등에 따라 당업자가 어려움 없이 적의 선정하여 배합할 수 있다.
본 발명은 고유의 엑소좀 막단백질 변이체에 목적 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 융합 폴리펩타이드 및 이를 코딩하는 유전자 작제물을 이용하여 종래의 다른 엑소좀 단백질(천연 엑소좀 단백질)을 이용하는 것 보다 엑소좀에 대한 목적 단백질 또는 펩타이드의 로딩 효율을 현저히 증가시킬 수 있다. 즉, 본 발명의 엑소좀 막단백질 변이체는 천연 엑소좀 단백질 보다 엑소좀 표면 상에 높은 함량으로 존재하고, 이에 따라 본 발명의 엑소좀 막단백질 변이체에 융합된 목적 단백질 또는 펩타이드 역시 엑소좀 표면 상에 높은 함량으로 존재하여 목적 단백질 또는 펩타이드를 엑소좀에 고효율로 로딩할 수 있는 장점이 있다.
한편, 전술한 바와 같은 효과들에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것은 아니다.
도 1은 본 발명의 엑소좀 막단백질 변이체(서열번호 1)의 N-말단 및 C-말단에 각각 IL-12 및 mGFP를 융합시킨 서열번호 2의 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 작제물이 삽입된 벡터(이하, "pEF6_IL-12_EXO variant_mGFP 벡터"라 함) 지도를 나타낸다.
도 2는 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자(서열번호 7)의 N-말단 및 C-말단에 각각 IL-12 및 mGFP를 융합시킨 서열번호 3의 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 작제물이 삽입된 벡터(이하, "pEF6_IL-12_PTGFRN_mGFP 벡터"라 함) 지도를 나타낸다.
도 3은 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자의 C-말단에 mGFP를 융합시킨 서열번호 4의 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 작제물이 삽입된 벡터(이하, "pEF6_PTGFRN_mGFP 벡터"라 함) 지도를 나타낸다.
도 4는 트랜스펙션되지 않은 HEK293T 세포("Control"로 표시됨)에서 형광이 관찰되지 않고, C-말단에 형광단백질인 mGFP가 융합된 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자가 삽입된 벡터(pEF6_IL-12_EXO variant_mGFP 벡터, pEF6_IL-12_PTGFRN_mGFP 벡터, 및 pEF6_PTGFRN_mGFP 벡터)에 의해 트랜스펙션된 HEK293T 세포에서는 형광이 관찰되는 것을 나타내는 형광현미경 사진이다.
도 5는 본 발명의 엑소좀 막단백질 변이체에 IL-12가 융합된 폴리펩타이드를 발현하는 HEK293T 세포의 경우, 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자에 IL-12가 융합된 폴리펩타이드를 발현하는 HEK293T 세포 보다 세포 밖 IL-12 단백질 분비량이 현저히 높은 것을 나타내는 IL-12 ELISA 결과 그래프이다.
도 6은 본 발명의 엑소좀 막단백질 변이체에 IL-12가 융합된 폴리펩타이드를 발현하는 HEK293T 세포를 배양하여 얻은 엑소좀을 NK-92 세포에 처리한 경우, 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자에 IL-12가 융합된 폴리펩타이드를 발현하는 HEK293T 세포를 배양하여 얻은 엑소좀을 NK-92 세포에 처리한 경우에 비해 NK-92 세포에서의 인터페론-γ 감마 유도 효과가 현저한 것을 나타내는 인터페론-γ 감마 ELISA 결과 그래프이다.
도 7은 본 발명의 엑소좀 막단백질 변이체에 IL-12가 융합된 폴리펩타이드를 안정적으로 발현하는 HEK293T 안정화 세포주를 배양하여 얻은 엑소좀에서 검출된 V5 단백질 양(엑소좀에 대한 IL-12 로딩 양 반영)이 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자에 IL-12가 융합된 폴리펩타이드를 안정적으로 발현하는 HEK293T 안정화 세포주를 배양하여 얻은 엑소좀에서 검출된 V5 단백질 양 보다 훨씬 많은 것을 나타내는 웨스턴 블랏 결과이다.
도 8은 본 발명의 엑소좀 막단백질 변이체에 IL-12가 융합된 폴리펩타이드를 안정적으로 발현하는 HEK293T 안정화 세포주를 배양하여 얻은 엑소좀을 NK-92 세포에 처리한 경우, 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자에 IL-12가 융합된 폴리펩타이드를 안정적으로 발현하는 HEK293T 안정화 세포주를 배양하여 얻은 엑소좀을 NK-92 세포에 처리한 경우에 비해 NK-92 세포에서의 인터페론-γ 감마 유도 효과가 현저한 것을 나타내는 인터페론-γ 감마 ELISA 결과 그래프이다.
이하 본 발명을 하기 실시예에서 보다 상세하게 기술한다. 다만, 하기 실시예는 본 발명의 내용을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 권리범위를 제한하거나 한정하는 것이 아니다. 본 발명의 상세한 설명 및 실시예로부터 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 기술자가 용이하게 유추할 수 있는 것은 본 발명의 권리범위에 속하는 것으로 해석된다. 본 발명에 인용된 참고문헌들은 본 발명에 참고로서 통합된다.
명세서 전체에서, 어떤 부분이 어떤 구성 요소를 "포함"한다고 할 때, 이는 특별히 반대되는 기재가 없는 한 다른 구성 요소를 제외하는 것이 아니라 다른 구성 요소를 더 포함할 수 있는 것을 의미한다.
실시예
실시예 1: 세포의 배양
형질도입에 사용할 HEK293T 세포(Horizon Discovery에서 구입)는 공급사의 권고에 따라 10% 우태아혈청(fetal bovine serum, FBS; ThermoFisher Scientific, USA에서 구입) 및 1% 항생제-항진균제(antibiotics-antimycotics; ThermoFisher Scientific, USA에서 구입)가 함유된 DMEM 배지(ThermoFisher Scientific, USA에서 구입)에서 5% CO2, 37℃ 조건 하에 계대 배양하였다.
NK-92 세포(ATCC, USA에서 구입)는 5% 인간 AB 혈청(human AB serum; Sigma-Aldrich, USA에서 구입) 및 200 IU/mL 재조합 IL-2 (recombinant interleukin-2; Peprotech, USA에서 구입)가 함유된 TexMACS 배지(Miltenyi, Germany에서 구입)에서 5% CO2, 37℃ 조건 하에 계대 배양하였다.
실시예 2: 목적 융합 폴리펩타이드를 발현하는 벡터의 제조
pEF6/V5-His A 벡터(#V96120, Invitrogen, USA에서 구입)의 멀티클로닝 부위 중 KpnI과 XbaI 부분을 각각 KpnI 제한효소 및 XbaI 제한효소를 이용하여 절단해 DNA를 선형화하였다. 이후, PCR을 통해 서열번호 2의 융합 폴리펩타이드, 서열번호 3의 융합 폴리펩타이드, 및 서열번호 4의 융합 폴리펩타이드 각각을 코딩하는 유전자 작제물을 증폭한 뒤 증폭된 유전자 작제물 각각을 pEF6/V5-His A 벡터에 서브클로닝하였다(도 1 내지 도 3 참조).
IL-12와 본 발명의 서열번호 1의 엑소좀 막단백질 변이체의 사이, 그리고 IL-12와 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자(서열번호 7)의 사이에는 링커(GGGGS)를 3번 반복하여 삽입하였다. 또한, 본 발명의 서열번호 1의 엑소좀 막단백질 변이체와 mGFP의 사이, 그리고 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자(서열번호 7)와 mGFP의 사이에는 링커(GGGGS)를 3번 반복하여 삽입하였다. 한편, 서열번호 2 또는 서열번호 3의 융합 폴리펩타이드의 N-말단에 위치하는 단일사슬 IL-12를 구성하는 IL-12B(서열번호 5)와 신호 펩타이드가 제거된 IL-12A(서열번호 6) 사이에는 링커(GGGGS)를 3번 반복하여 삽입하였다.
도 1에는 본 발명의 서열번호 1의 엑소좀 막단백질 변이체의 N-말단 및 C-말단에 각각 IL-12 및 mGFP를 융합시킨 융합 폴리펩타이드(서열번호 2의 융합 폴리펩타이드)를 코딩하는 유전자 작제물이 삽입된 벡터(pEF6_IL-12_EXO variant_mGFP 벡터)가 도시되어 있다. 또한, 도 2에는 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자(서열번호 7)의 N-말단 및 C-말단에 각각 IL-12 및 mGFP를 융합시킨 융합 폴리펩타이드(서열번호 3의 융합 폴리펩타이드)를 코딩하는 유전자 작제물이 삽입된 벡터(pEF6_IL-12_PTGFRN_mGFP 벡터)가 도시되어 있다. 추가로, 도 3에는 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자(서열번호 7)의 C-말단에 mGFP를 융합시킨 융합 폴리펩타이드(서열번호 4의 융합 폴리펩타이드)를 코딩하는 유전자 작제물이 삽입된 벡터(pEF6_PTGFRN_mGFP 벡터)가 도시되어 있다.
실시예 3: 목적 융합 폴리펩타이드의 발현 확인과 안정화 세포주 제작
실시예 3-1: 목적 융합 폴리펩타이드의 발현 확인
HEK293T 세포를 형질전환 하루 전에 24-웰 플레이트의 각 웰에 6×104 세포/500 μL로 각각 분주하고 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다. 다음 날 5% 엑소좀-제거 우태아혈청(exosome-depleted FBS; System Biosciences, USA에서 구입)이 함유된 DMEM으로 배양액을 교체하고, 실시예 2에서 제작된 벡터 각각을 이펙텐 트랜스펙션 시약(Effectene Transfection Reagent; Qiagen, Germany에서 구입)을 이용하여 HEK293T 세포에 형질도입하였다. 형질도입 후 72시간 동안 배양하고 인큐사이트 S3(Incucyte S3; Sartorius, Germany에서 구입)를 이용하여 HEK293T 세포 내 형광 단백질 발현 여부를 확인하였다. 실시예 2에서 제작된 3가지 벡터 모두 mGFP 유전자를 포함하고 있으므로 이들 벡터 각각이 HEK293T 세포에 정상적으로 형질도입되어 세포 내에서 발현된 경우 HEK293T 세포 내에서 형광이 관찰되어야 한다.
72시간 배양한 후 형광현미경으로 이미지를 촬영한 결과, 벡터에 의해 트랜스펙션되지 않은 HEK293T 세포("Control"로 표시됨)에서는 형광이 관찰되지 않았으나, pEF6_IL-12_EXO variant_mGFP 벡터, pEF6_IL-12_PTGFRN_mGFP 벡터 및 pEF6_PTGFRN_mGFP 벡터 각각이 형질도입된 HEK293T 세포에서는 형광이 관찰되었다(도 4 참조). 따라서, 상기 벡터들은 HEK293T 세포에서 정상적으로 발현되는 것으로 확인되었다.
도 4에 도시된 바와 같이, 본 발명의 엑소좀 막단백질 변이체(서열번호 1)의 N-말단에 IL-12가 융합되고 C-말단에 mGFP가 융합된 폴리펩타이드(서열번호 2)를 코딩하는 유전자 작제물이 삽입된 pEF6_IL-12_EXO variant_mGFP 벡터에 의해 트랜스펙션된 HEK293T 세포에서 형광이 관찰되었다. 이로부터 본 발명의 서열번호 1의 엑소좀 막단백질 변이체에 목적 단백질 또는 펩타이드(IL-12)를 융합시킨 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 작제물이 삽입된 pEF6_IL-12_EXO variant_mGFP 벡터는 HEK293T 세포에 형질도입되어 상기 융합 폴리펩타이드가 정상적으로 발현된 것을 알 수 있다.
실시예 3-2: 안정화 세포주 제작
또한, 실시예 3-1에서 pEF6_IL-12_EXO variant_mGFP 벡터 및 pEF6_IL-12_PTGFRN_mGFP 벡터로 각각 형질전환된 HEK293T 세포를 회수한 후, 10 μg/mL 블라스티시딘(Blasticidin)(Invivogen, USA에서 구입)이 첨가된 DMEM 배지에서 6주 동안 배양하여 각 목적 융합 폴리펩타이드를 안정적으로 발현하는 세포들만 선별하여 안정화 세포주를 제작하였다.
실시예 4: 목적 단백질 또는 펩타이드의 세포 밖 분비 확인
실시예 3-1에 따라 pEF6_IL-12_EXO variant_mGFP 벡터, pEF6_IL-12_PTGFRN_mGFP 벡터 및 pEF6_PTGFRN_mGFP 벡터 각각에 의해 HEK293T 세포를 트랜스펙션하고 72시간 배양한 후, 각 웰에서 세포배양 상층액을 300 μL를 취했다. 그리고 나서 IL-12 ELISA 키트(R&D Systems, USA에서 구입)를 이용해 세포배양 상층액으로 분비된 목적 단백질 또는 펩타이드(IL-12)를 정량하였다.
벡터에 의해 트랜스펙션되지 않은 HEK293T 세포("Control"로 표시됨)의 배양액 및 pEF6_PTGFRN_mGFP 벡터에 의해 트랜스펙션된 HEK293T 세포의 배양액에서는 IL-2가 검출되지 않았으나, pEF6_IL-12_EXO variant_mGFP 벡터 및 pEF6_IL-12_PTGFRN_mGFP 벡터 각각에 의해 트랜스펙션된 HEK293T 세포의 배양액에서는 IL-2가 상당량 검출되어 IL-12가 세포 밖으로 분비된 것이 확인되었다(도 5).
도 5에 도시된 바와 같이, 본 발명의 엑소좀 막단백질 변이체(서열번호 1)의 N-말단에 IL-12가 융합된 폴리펩타이드(서열번호 2)를 코딩하는 유전자가 삽입된 벡터(pEF6_IL-12_EXO variant_mGFP)에 의해 트랜스펙션된 HEK293T 세포의 IL-12 분비량이 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자(서열번호 7)의 N-말단에 IL-12가 융합된 폴리펩타이드(서열번호 3)를 코딩하는 유전자가 삽입된 벡터(pEF6_IL-12_PTGFRN_mGFP)에 의해 트랜스펙션된 HEK293T 세포의 IL-12 분비량 보다 약 18배 많았다.
이러한 결과는 트랜스펙션된 HEK293T 세포로부터 분비 또는 방출되는 엑소좀에 본 발명의 엑소좀 막단백질 변이체가 높은 함량으로 존재하고, 이에 따라 본 발명의 엑소좀 막단백질 변이체에 융합된 목적 단백질 또는 펩타이드(IL-12) 역시 엑소좀에 높은 함량으로 존재함으로써, 트랜스펙션된 HEK293T 세포로부터 분비 또는 방출된 엑소좀을 함유하는 세포배양액에서 IL-12의 분비량이 현저하게 많은 것을 의미한다. 한편, 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자는 대표적인 엑소좀 막단백질인 CD9 보다 대략 3배 높게 엑소좀 상에 발현되고, 또 다른 대표적인 엑소좀 막단백질인 CD81 보다 대략 2배 높게 엑소좀 상에 발현되는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 엑소좀 막단백질 변이체를 사용하여 IL-12를 엑소좀에 로딩한 경우 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자를 사용하여 IL-12를 엑소좀에 로딩한 경우에 비해 목적 단백질 또는 펩타이드(IL-12)의 분비량이 현저하게 많고, 이로부터 본 발명의 엑소좀 막단백질 변이체는 CD9, CD81 및 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자 보다 목적 단백질 또는 펩타이드(IL-12)를 엑소좀에 더 많이 로딩시키는 것을 알 수 있다.
따라서, 본 발명의 엑소좀의 막단백질 변이체에 목적 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 융합 폴리펩타이드를 이용할 경우 목적 단백질 또는 펩타이드를 엑소좀에 고효율로 로딩할 수 있다.
실시예 5: 목적 단백질 또는 펩타이드가 로딩된 엑소좀 분리 및 NK 세포에서 IFN-γ 분비 유도 효과 비교
실시예 4의 결과를 재차 검증하기 위해, 본 발명의 엑소좀 막단백질 변이체에 IL-12를 융합시킨 융합 폴리펩타이드가 로딩된 엑소좀이 인터페론-γ 감마를 유도하는 효과를 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자에 IL-12를 융합시킨 융합 폴리펩타이드가 로딩된 엑소좀이 인터페론-γ 감마를 유도하는 효과와 비교하였다.
IL-12(Interleukin 12)는 IL-12A 유전자로부터 발현되는 p35 소단위체와 IL-12B 유전자로부터 발현되는 p40 소단위체로 이루어진 사이토카인으로 대식세포, 수지상세포 등 다양한 선천면역(innate immunity)에 관여하는 세포에서 분비된다. IL-12는 NK 세포와 세포독성 T 림프구(cytotoxic T lymphocyte)로부터 인터페론-γ 감마 분비를 유도하여 무감작 CD4+ 세포(naive CD4+ T 세포)의 Th1 세포로의 분화를 촉진시키고, 이에 따라 후천적 면역(adaptive immunity)에 관여하는 세포들의 항암효과를 증진시키는 기능을 갖는다. 따라서 IL-12의 양이 많으면 NK 세포에서의 인터페론-γ 감마 분비가 증가하게 된다.
본 발명의 엑소좀의 막단백질 변이체에 IL-12를 융합시킨 융합 폴리펩타이드가 로딩된 엑소좀이 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자에 IL-12를 융합시킨 융합 폴리펩타이드가 로딩된 엑소좀 보다 인터페론-γ 감마 분비 유도 효과가 크다면 본 발명의 엑소좀 막단백질 변이체에 IL-12를 융합시킨 융합 폴리펩타이드가 로딩된 엑소좀 표면 상에 IL-12가 높은 함량(높은 밀도)로 존재하는 것을 의미한다. 따라서, 엑소좀에 의한 NK 세포에서의 인터페론-γ 감마 유도 증가는 엑소좀에 대한 목적 단백질 또는 펩타이드(IL-12)의 로딩 효율 증가를 의미한다.
우선, HEK293T 세포는 형질전환 하루 전에 2.5×105 세포 함유 배양액 5 mL 를 T25 세포 배양 플라스크(T25 cell culture flask)에 넣어주고, 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다. 다음 날 5% 엑소좀-제거 우태아혈청이 함유된 DMEM으로 배양액을 교체한 후, 실시예 2에서 제작된 벡터 각각을 이펙텐 트랜스펙션 시약(Effectene Transfection Reagent)을 이용하여 HEK293T 세포에 형질도입하였다. HEK293T 세포를 72시간 동안 배양한 후 세포배양 상층액을 모두 취하고, 이를 0.22 μm 시린지 필터(제품명: SLGVR33RB; Merck, Germany에서 구입)로 여과하였다. 이후, 아미콘 울트라-15 원심분리용 100kDa 필터유닛(Amicon Ultra-15 Centrifugal 100 kDa Filter Unit; Merck, Germany에서 구입)을 이용해 상층액 5 mL를 4℃에서 1시간 동안 농축하고 농축액을 DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline; Gibco, USA에서 구입)에 현탁한 후, 총 부피의 20% 만큼 PEG8000 (500 mg/mL) 용액을 넣고 섞어서 4℃에서 보관하였다. 24시간 뒤, PEG8000과 섞은 농축액을 4℃에서 10,000×g로 원심분리를 한 후 상층액을 모두 제거하고 엑소좀 펠렛을 200 μL DPBS에 현탁하여 4℃ 또는 -20℃에서 보관하였다.
다음으로, 배양 중인 NK-92 세포를 48-웰 플레이트의 각 웰에 2×105 세포/250 μL로 각각 분주하고, 각각의 엑소좀 5 μg 또는 10 μg을 250 μL 배양액에 희석한 후 NK-92 세포에 처리하고 5% CO2, 37℃ 조건에서 24시간 배양하였다. 이때, 대조군으로서 벡터에 의해 트랜스펙션되지 않은 HEK293T 세포로부터 수득한 엑소좀(도 6에서 "Control"로 표시됨)을 사용하였다. 24시간 뒤 각각의 엑소좀이 처리된 NK-92 세포배양 상층액 100 μL를 수득하고, IFN-γ ELISA 키트(R&D Systems, USA에서 구입)를 이용하여 수득된 상층액 내의 인터페론-γ(IFN-γ)의 양을 측정하였고, 이로부터 각각의 엑소좀 처리에 의한 NK-92 세포에서의 인터페론-γ 분비량을 정량하였다.
벡터에 의해 트랜스펙션되지 않은 HEK293T 세포로부터 수득된 엑소좀 및 pEF6_PTGFRN_mGFP 벡터에 의해 트랜스펙션된 HEK293T 세포로부터 수득된 엑소좀 처리에 의해서는 NK-92 세포에서 인터페론-γ가 거의 분비되지 않았으나, pEF6_IL-12_EXO variant_mGFP 벡터 및 pEF6_IL-12_PTGFRN_mGFP 벡터 각각에 의해 트랜스펙션된 HEK293T 세포로부터 수득된 엑소좀을 처리한 NK-92 세포에서는 인터페론-γ 분비 유도가 확인되었다(도 6).
도 6에 도시된 바와 같이, 본 발명의 엑소좀 막단백질 변이체(서열번호 1)에 IL-12가 융합된 폴리펩타이드(서열번호 2)를 코딩하는 유전자 작제물이 삽입된 벡터(pEF6_IL-12_EXO variant_mGFP)에 의해 트랜스펙션된 HEK293T 세포를 배양하여 얻은 엑소좀(이하, "본 발명의 엑소좀"이라 함)을 NK-92 세포에 처리한 경우, 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자(서열번호 7)에 IL-12가 융합된 폴리펩타이드(서열번호 3)를 코딩하는 유전자 작제물이 삽입된 벡터(pEF6_IL-12_PTGFRN_mGFP)에 의해 트랜스펙션된 HEK293T 세포를 배양하여 얻은 엑소좀(이하, "종래의 엑소좀"이라 함)을 NK-92 세포에 처리한 경우에 비해 인터페론-γ 분비 유도를 약 1.6배 증가시켰다.
이러한 결과는 본 발명의 엑소좀은 종래의 엑소좀에 비해 인터페론-γ 분비를 유도하는 IL-12의 양이 상대적으로 많다는 것을 의미한다. 즉, 본 발명의 엑소좀에는 서열번호 1의 엑소좀 막단백질 변이체가 높은 함량으로 존재하고, 이에 따라 상기 엑소좀 막단백질 변이체에 융합된 IL-12 역시 본 발명의 엑소좀에 높은 함량으로 존재하는 것을 의미한다.
상기 실험결과로부터, 본 발명의 엑소좀 막단백질 변이체는 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자, CD9 및 CD81 보다 목적 단백질 또는 펩타이드(IL-12)의 엑소좀 로딩 효율이 우수하다는 것을 알 수 있다. 그리고, 본 발명의 엑소좀은 종래의 엑소좀 보다 많은 양의 IL-12가 로딩되어 있어 NK-92 세포에 처리 시 인터페론-γ 분비 유도 역시 현저히 증가시키는 것을 알 수 있다.
실시예 6: 목적 융합 폴리펩타이드를 안정적으로 발현하는 엑소좀 분리
실시예 3-2에서 제작한 서열번호 2 및 서열번호 3의 목적 융합 폴리펩타이드를 각각 발현하는 HEK293T 안정화 세포주를 각각 75T 세포배양 플라스크에 3.75×106 개 분주하고 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다. 다음 날 1% 엑소좀-제거 우태아혈청(exosome-depleted FBS; System Biosciences, USA에서 구입), 1% 항생제-항진균제 및 10 μg/mL 블라스티시딘(Blasticidin)(Invivogen, USA에서 구입)이 함유된 Opti-MEM(ThermoFisher Scientific, USA에서 구입)으로 배양액을 교체하고 48 시간 동안 5% CO2, 37℃ 조건에서 배양하였다.
이후 세포배양 상층액을 모두 취하고, 이를 500×g에서 5분 동안 원심분리하여 세포파쇄물을 제거한 상층액을 0.22 μm 시린지 필터(제품명: SLGVR33RB; Merck, Germany에서 구입)로 여과하였다. 그리고 나서, 아미콘 울트라-15 원심분리용 100 kDa 필터유닛(Amicon　Ultra-15 Centrifugal 100 kDa Filter Unit; Merck, Germany에서 구입)을 이용해 상층액 15 mL를 4℃에서 30분 동안 농축하였다. 농축액을 DPBS(Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline; Gibco, USA에서 구입)에 현탁한 후, 총 부피의 20% 만큼 PEG8000 (500 mg/mL) 용액을 넣고 섞어서 4℃에서 보관하였다. 24시간 뒤, PEG8000과 섞은 농축액을 4℃에서 10,000×g로 원심분리를 한 후 상층액을 모두 제거하고 엑소좀 펠렛을 회수하였다.
엑소좀 펠렛은 목적에 따라 200 μL DPBS 또는 1X 프로테아제 저해제 칵테일(protease inhibitor cocktail)(Merck, Germany에서 구입)이 첨가된 1X RIPA (Cell Signaling, USA) 용액에 현탁한 후 마이크로 BCA 어세이(microBCA assay)(ThermoFisher Scientific, USA에서 구입)를 이용하여 단백질 농도를 정량하였고 사용 전까지 -80℃에서 보관하였다.
실시예 7: 엑소좀에서 목적 단백질 또는 펩타이드의 로딩 여부 확인
1X RIPA 용액으로 용해한 엑소좀 펠렛은 4X 피어스 LDS 샘플 버퍼(비환원성)(Pierce™ LDS Sample Buffer, Non-Reducing; ThermoFisher Scientific, USA에서 구입)와 섞은 후 웨스턴 블로팅 기법을 이용해 분석하였다. TGX 스테인-프리 겔(Stain-Free Gel)(Bio-Rad, USA에서 구입)의 각 웰에 20 μg의 엑소좀 시료를 로딩한 후, mini-PROTEAN 전기영동 시스템(Bio-Rad, USA에서 구입)을 이용하여 SDS-PAGE를 수행하였다. 이후 항-V5 항체(Abcam, UK에서 구입), 항-CD81 항체(Abcam, UK에서 구입), 항-신테닌-1 항체(Abcam, UK에서 구입) 및 항-CD63 항체(Santa Cruz Biotechnology, USA에서 구입)와 반응시킨 뒤 애머샴 이미저 680(Amersham Imager 680)(Cytiva, USA에서 구입)을 이용하여 감지 및 분석을 하였다.
상기와 같은 웨스턴 블로팅 기법을 이용해 실시예 6에서 분리된 각 엑소좀에 로딩된 IL-12 단백질의 양을 측정하였다. 서열번호 1의 엑소좀 막단백질 변이체의 N-말단 및 C-말단에 각각 IL-12 및 mGFP를 융합시킨 융합 폴리펩타이드(서열번호 2의 융합 폴리펩타이드)와, 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자(서열번호 7)의 N-말단 및 C-말단에 각각 IL-12 및 mGFP를 융합시킨 융합 폴리펩타이드(서열번호 3의 융합 폴리펩타이드) 모두 C-말단에 V5 태그가 연결되어 있기 때문에, α-V5 항체를 이용하면 서열번호 2의 융합 폴리펩타이드 및 서열번호 3의 융합 폴리펩타이드를 정성적 및 정량적으로 검출할 수 있다.
서열번호 2 및 서열번호 3의 목적 융합 폴리펩타이드를 각각 발현하는 HEK293T 안정화 세포주 배양액으로부터 분리한 엑소좀(실시예 6에 따라 분리된 엑소좀) 모두에서 V5 단백질이 검출되었고, 이로부터 각 엑소좀에 목적 융합 폴리펩타이드가 정상적으로 로딩된 것을 확인하였다.
또한, 도 7에 도시된 바와 같이, 서열번호 2의 융합 폴리펩타이드를 안정적으로 발현하는 HEK293T 세포를 배양하여 얻은 엑소좀에서 검출된 V5 단백질 양이 서열번호 3의 융합 폴리펩타이드를 안정적으로 발현하는 HEK293T 세포를 배양하여 얻은 엑소좀에서 검출된 V5 단백질 양 보다 많은 것이 확인되었다. 융합 폴리펩타이드의 C-말단에는 V5 단백질 태그가 연결되어 있으므로, 엑소좀에서 검출된 V5 단백질 양이 많은 결과는 엑소좀에 로딩된 융합 플리펩타이드의 양이 많다는 것을 나타낸다.
추가적으로, 이미지 J 소프트웨어(Image J Software)(NIH, USA)를 이용해 단백질 밴드를 정량한 결과, 엑소좀에 로딩된 서열번호 2의 융합 폴리펩타이드(서열번호 1의 엑소좀 막단백질 변이체의 N-말단 및 C-말단에 각각 IL-12 및 mGFP를 융합시킨 융합 폴리펩타이드)의 양은, 엑소좀에 로딩된 서열번호 3의 융합 폴리펩타이드(서열번호 7의 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자의 N-말단 및 C-말단에 각각 IL-12 및 mGFP를 융합시킨 융합 폴리펩타이드)의 양 보다 약 11.7배 많은 것으로 확인되었다. 또한, 엑소좀에는 널리 공지된 엑소좀 마커 단백질 CD63, CD81 및 신테닌-1이 풍부하게 존재하는 것으로 확인되었다(도 7).
상기와 같은 실험결과로부터, 서열번호 2의 융합 폴리펩타이드를 구성하는 IL-12 및 엑소좀 막단백질 변이체 역시 서열번호 3의 융합 폴리펩타이드를 구성하는 IL-12 및 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자 보다 엑소좀에 훨씬 많은 양이 로딩되는 것을 알 수 있으며, 이로부터 본 발명의 엑소좀 막단백질 변이체는 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자 보다 엑소좀에 높은 밀도로 엑소좀 표면 상에 발현되어 목적 단백질 또는 펩타이드(IL-12)의 엑소좀 로딩 효율이 우수하다는 것을 알 수 있다.
실시예 8: NK 세포에서의 IFN-γ 분비 유도 효과 비교
서열번호 2의 목적 융합 폴리펩타이드를 발현하는 HEK293T 안정화 세포주(실시예 3-2에 따라 제작)를 배양하여 실시예 6에 따라 엑소좀(이하, "본 발명의 엑소좀"이라 함)을 준비하였고(도 8에서 "IL-12_EXO variant_mGFP"로 표시), 서열번호 3의 목적 융합 폴리펩타이드를 발현하는 HEK293T 안정화 세포주(실시예 3-2에 따라 제작)를 배양하여 실시예 6에 따라 엑소좀(이하, "종래의 엑소좀"이라 함)을 준비하였다(도 8에서 "IL-12_PTGFRN_mGFP"로 표시).
배양 중인 NK-92 세포를 48-웰 플레이트의 각 웰에 2×105 세포/250 μL로 각각 분주하고, 목적 단백질 또는 펩타이드(IL-12)가 포함된 각각의 엑소좀 0.25 μg 또는 0.5 μg을 250 μL 배양액에 희석하여 NK-92 세포에 처리하였다. 또한, 음성대조군(Negative Control)인 배양액을 NK-92 세포에 처리하였고, 양성대조군(Positive Control)인 6.25 ng의 재조합 IL-12(R&D Systems, USA에서 구입)를 NK-92 세포에 처리하였으며, 형질전환을 하지 않은 HEK293T 세포로부터 수득한 대조군 엑소좀(도 8에서 "Control EXO"로 표시) 1 μg을 NK-92 세포에 처리하였다.
각각의 물질 처리 후 24 시간 뒤 각각의 물질이 처리된 NK-92 세포의 배양 상층액 100 μL를 수득하고, IFN-γ ELISA 키트(R&D Systems, USA에서 구입)를 이용하여, 수득된 상층액 내의 인터페론-γ(IFN-γ)의 양을 측정하였고, 이로부터 각각의 물질 처리에 의한 NK-92 세포에서의 인터페론-γ 분비량을 정량하였다.
도 8에 나타낸 바와 같이, 본 발명의 엑소좀 막단백질 변이체(서열번호 1)에 IL-12가 융합된 폴리펩타이드(서열번호 2)를 발현하는 HEK293T 안정화 세포주를 배양하여 얻은 엑소좀(이하, "본 발명의 엑소좀"이라 함)을 NK-92 세포에 처리한 경우, 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자(서열번호 7)에 IL-12가 융합된 폴리펩타이드(서열번호 3)를 발현하는 HEK293T 안정화 세포주를 배양하여 얻은 엑소좀(이하, "종래의 엑소좀"이라 함)을 NK-92 세포에 처리한 경우에 비해 인터페론-γ 분비 유도를 약 1.6배 증가시켰다.
이러한 결과는 본 발명의 엑소좀은 종래의 엑소좀에 비해 인터페론-γ 분비를 유도하는 IL-12의 양이 상대적으로 많다는 것을 의미한다. 즉, 본 발명의 엑소좀에는 서열번호 1의 엑소좀 막단백질 변이체가 높은 함량으로 존재하고, 이에 따라 상기 엑소좀 막단백질 변이체에 융합된 IL-12 역시 본 발명의 엑소좀에 높은 함량으로 존재하는 것을 의미한다.
상기 실험결과로부터, 본 발명의 엑소좀 막단백질 변이체는 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자, CD9 및 CD81 보다 목적 단백질 또는 펩타이드(IL-12)의 엑소좀 로딩 효율이 우수하다는 것을 알 수 있다. 그리고, 본 발명의 엑소좀은 종래의 엑소좀 보다 많은 양의 IL-12가 로딩되어 있어 NK-92 세포에 처리 시 인터페론-γ 분비 유도 역시 현저히 증가시키는 것을 알 수 있다.
이상, 본 발명을 상기 실시예를 들어 설명하였으나, 본 발명은 이에 제한되는 것이 아니다. 당업자라면 본 발명의 취지 및 범위를 벗어나지 않고 수정, 변경을 할 수 있으며 이러한 수정과 변경 또한 본 발명에 속하는 것임을 알 수 있을 것이다.
<110> ExoCoBio Inc. <120> Exosomes comprising exosomal membrane protein variant and manufacturing method thereof <130> P20-0100KR <150> KR 10-2020-0065564 <151> 2020-05-31 <160> 7 <170> KoPatentIn 3.0 <210> 1 <211> 854 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> EXO variant <400> 1 Val Pro Thr Ala Thr Leu Val Arg Val Val Gly Thr Glu Leu Val Ile 1 5 10 15 Pro Cys Asn Val Ser Asp Tyr Asp Gly Pro Ser Glu Gln Asn Phe Asp 20 25 30 Trp Ser Phe Ser Ser Leu Gly Ser Ser Phe Val Glu Leu Ala Ser Thr 35 40 45 Trp Glu Val Gly Phe Pro Ala Gln Leu Tyr Gln Glu Arg Leu Gln Arg 50 55 60 Gly Glu Ile Leu Leu Arg Arg Thr Ala Asn Asp Ala Val Glu Leu His 65 70 75 80 Ile Lys Asn Val Gln Pro Ser Asp Gln Gly His Tyr Lys Cys Ser Thr 85 90 95 Pro Ser Thr Asp Ala Thr Val Gln Gly Asn Tyr Glu Asp Thr Val Gln 100 105 110 Val Lys Val Leu Ala Asp Ser Leu His Val Gly Pro Ser Ala Arg Pro 115 120 125 Pro Pro Ser Leu Ser Leu Arg Glu Gly Glu Pro Phe Glu Leu Arg Cys 130 135 140 Thr Ala Ala Ser Ala Ser Pro Leu His Thr His 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Gln Cys Phe 1505 1510 1515 1520 Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp Phe Phe Lys Ser Ala 1525 1530 1535 Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile Phe Phe Lys Asp Asp 1540 1545 1550 Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe Glu Gly Asp Thr Leu 1555 1560 1565 Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe Lys Glu Asp Gly Asn 1570 1575 1580 Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn Ser His Asn Val Tyr 1585 1590 1595 1600 Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys Val Asn Phe Lys Ile 1605 1610 1615 Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu Ala Asp His Tyr Gln 1620 1625 1630 Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu Leu Pro Asp Asn His 1635 1640 1645 Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu Ser Lys Asp Pro Asn Glu Lys Arg 1650 1655 1660 Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala Ala Gly Ile Thr His 1665 1670 1675 1680 Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 1685 <210> 4 <211> 1132 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTGFRN_mGFP <400> 4 Met Gly Arg Leu Ala Ser Arg Pro Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Ala Leu Cys Arg Gly Arg Val Val Arg Val Pro Thr Ala Thr Leu Val 20 25 30 Arg Val Val Gly Thr Glu Leu Val Ile Pro Cys Asn Val Ser Asp Tyr 35 40 45 Asp Gly Pro Ser Glu Gln Asn Phe Asp Trp Ser Phe Ser Ser Leu Gly 50 55 60 Ser Ser Phe Val Glu Leu Ala Ser Thr Trp Glu Val Gly Phe Pro Ala 65 70 75 80 Gln Leu Tyr Gln Glu Arg Leu Gln Arg Gly Glu Ile Leu Leu Arg Arg 85 90 95 Thr Ala Asn Asp Ala Val Glu Leu His Ile Lys Asn Val Gln Pro Ser 100 105 110 Asp Gln Gly His Tyr Lys Cys Ser Thr Pro Ser Thr Asp Ala Thr Val 115 120 125 Gln Gly Asn Tyr Glu Asp Thr Val Gln Val Lys Val Leu Ala Asp Ser 130 135 140 Leu His Val Gly Pro Ser Ala Arg Pro Pro Pro Ser Leu Ser Leu Arg 145 150 155 160 Glu Gly Glu Pro Phe Glu Leu Arg Cys Thr Ala Ala Ser Ala Ser Pro 165 170 175 Leu His Thr His Leu Ala Leu Leu Trp Glu Val His Arg Gly Pro Ala 180 185 190 Arg Arg Ser Val Leu Ala Leu Thr His Glu Gly Arg Phe His Pro Gly 195 200 205 Leu Gly Tyr Glu Gln Arg Tyr His Ser Gly Asp Val Arg Leu Asp Thr 210 215 220 Val Gly Ser Asp Ala Tyr Arg Leu Ser Val Ser Arg Ala Leu Ser Ala 225 230 235 240 Asp Gln Gly Ser Tyr Arg Cys Ile Val Ser Glu Trp Ile Ala Glu Gln 245 250 255 Gly Asn Trp Gln Glu Ile Gln Glu Lys Ala Val Glu Val Ala Thr Val 260 265 270 Val Ile Gln Pro Ser Val Leu Arg Ala Ala Val Pro Lys Asn Val Ser 275 280 285 Val Ala Glu Gly Lys Glu Leu Asp Leu Thr Cys Asn Ile Thr Thr Asp 290 295 300 Arg Ala Asp Asp Val Arg Pro Glu Val Thr Trp Ser Phe Ser Arg Met 305 310 315 320 Pro Asp Ser Thr Leu Pro Gly Ser Arg Val Leu Ala Arg Leu Asp Arg 325 330 335 Asp Ser Leu Val His Ser Ser Pro His Val Ala Leu Ser His Val Asp 340 345 350 Ala Arg Ser Tyr His Leu Leu Val Arg Asp Val Ser Lys Glu Asn Ser 355 360 365 Gly Tyr Tyr Tyr Cys His Val Ser Leu Trp Ala Pro Gly His Asn Arg 370 375 380 Ser Trp His Lys Val Ala Glu Ala Val Ser Ser Pro Ala Gly Val Gly 385 390 395 400 Val Thr Trp Leu Glu Pro Asp Tyr Gln Val Tyr Leu Asn Ala Ser Lys 405 410 415 Val Pro Gly Phe Ala Asp Asp Pro Thr Glu Leu Ala Cys Arg Val Val 420 425 430 Asp Thr Lys Ser Gly Glu Ala Asn Val Arg Phe Thr Val Ser Trp Tyr 435 440 445 Tyr Arg Met Asn Arg Arg Ser Asp Asn Val Val Thr Ser Glu Leu Leu 450 455 460 Ala Val Met Asp Gly Asp Trp Thr Leu Lys Tyr Gly Glu Arg Ser Lys 465 470 475 480 Gln Arg Ala Gln Asp Gly Asp Phe Ile Phe Ser Lys Glu His Thr Asp 485 490 495 Thr Phe Asn Phe Arg Ile Gln Arg Thr Thr Glu Glu Asp Arg Gly Asn 500 505 510 Tyr Tyr Cys Val Val Ser Ala Trp Thr Lys Gln Arg Asn Asn Ser Trp 515 520 525 Val Lys Ser Lys Asp Val Phe Ser Lys Pro Val Asn Ile Phe Trp Ala 530 535 540 Leu Glu Asp Ser Val Leu Val Val Lys Ala Arg Gln Pro Lys Pro Phe 545 550 555 560 Phe Ala Ala Gly Asn Thr Phe Glu Met Thr Cys Lys Val Ser Ser Lys 565 570 575 Asn Ile Lys Ser Pro Arg Tyr Ser Val Leu Ile Met Ala Glu Lys Pro 580 585 590 Val Gly Asp Leu Ser Ser Pro Asn Glu Thr Lys Tyr Ile Ile Ser Leu 595 600 605 Asp Gln Asp Ser Val Val Lys Leu Glu Asn Trp Thr Asp Ala Ser Arg 610 615 620 Val Asp Gly Val Val Leu Glu Lys Val Gln Glu Asp Glu Phe Arg Tyr 625 630 635 640 Arg Met Tyr Gln Thr Gln Val Ser Asp Ala Gly Leu Tyr Arg Cys Met 645 650 655 Val Thr Ala Trp Ser Pro Val Arg Gly Ser Leu Trp Arg Glu Ala Ala 660 665 670 Thr Ser Leu Ser Asn Pro Ile Glu Ile Asp Phe Gln Thr Ser Gly Pro 675 680 685 Ile Phe Asn Ala Ser Val His Ser Asp Thr Pro Ser Val Ile Arg Gly 690 695 700 Asp Leu Ile Lys Leu Phe Cys Ile Ile Thr Val Glu Gly Ala Ala Leu 705 710 715 720 Asp Pro Asp Asp Met Ala Phe Asp Val Ser Trp Phe Ala Val His Ser 725 730 735 Phe Gly Leu Asp Lys Ala Pro Val Leu Leu Ser Ser Leu Asp Arg Lys 740 745 750 Gly Ile Val Thr Thr Ser Arg Arg Asp Trp Lys Ser Asp Leu Ser Leu 755 760 765 Glu Arg Val Ser Val Leu Glu Phe Leu Leu Gln Val His Gly Ser Glu 770 775 780 Asp Gln Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Ser Val Thr Pro Trp Val Lys 785 790 795 800 Ser Pro Thr Gly Ser Trp Gln Lys Glu Ala Glu Ile His Ser Lys Pro 805 810 815 Val Phe Ile Thr Val Lys Met Asp Val Leu Asn Ala Phe Lys Tyr Pro 820 825 830 Leu Leu Ile Gly Val Gly Leu Ser Thr Val Ile Gly Leu Leu Ser Cys 835 840 845 Leu Ile Gly Tyr Cys Ser Ser His Trp Cys Cys Lys Lys Glu Val Gln 850 855 860 Glu Thr Arg Arg Glu Arg Arg Arg Leu Met Ser Met Glu Met Asp Gly 865 870 875 880 Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Met Ser 885 890 895 Lys Gly Glu Glu Leu Phe Thr Gly Val Val Pro Ile Leu Val Glu Leu 900 905 910 Asp Gly Asp Val Asn Gly His Lys Phe Ser Val Ser Gly Glu Gly Glu 915 920 925 Gly Asp Ala Thr Tyr Gly Lys Leu Thr Leu Lys Phe Ile Cys Thr Thr 930 935 940 Gly Lys Leu Pro Val Pro Trp Pro Thr Leu Val Thr Thr Leu Thr Tyr 945 950 955 960 Gly Val Gln Cys Phe Ser Arg Tyr Pro Asp His Met Lys Gln His Asp 965 970 975 Phe Phe Lys Ser Ala Met Pro Glu Gly Tyr Val Gln Glu Arg Thr Ile 980 985 990 Phe Phe Lys Asp Asp Gly Asn Tyr Lys Thr Arg Ala Glu Val Lys Phe 995 1000 1005 Glu Gly Asp Thr Leu Val Asn Arg Ile Glu Leu Lys Gly Ile Asp Phe 1010 1015 1020 Lys Glu Asp Gly Asn Ile Leu Gly His Lys Leu Glu Tyr Asn Tyr Asn 1025 1030 1035 1040 Ser His Asn Val Tyr Ile Met Ala Asp Lys Gln Lys Asn Gly Ile Lys 1045 1050 1055 Val Asn Phe Lys Ile Arg His Asn Ile Glu Asp Gly Ser Val Gln Leu 1060 1065 1070 Ala Asp His Tyr Gln Gln Asn Thr Pro Ile Gly Asp Gly Pro Val Leu 1075 1080 1085 Leu Pro Asp Asn His Tyr Leu Ser Thr Gln Ser Lys Leu Ser Lys Asp 1090 1095 1100 Pro Asn Glu Lys Arg Asp His Met Val Leu Leu Glu Phe Val Thr Ala 1105 1110 1115 1120 Ala Gly Ile Thr His Gly Met Asp Glu Leu Tyr Lys 1125 1130 <210> 5 <211> 328 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-12B <400> 5 Met Cys His Gln Gln Leu Val Ile Ser Trp Phe Ser Leu Val Phe Leu 1 5 10 15 Ala Ser Pro Leu Val Ala Ile Trp Glu Leu Lys Lys Asp Val Tyr Val 20 25 30 Val Glu Leu Asp Trp Tyr Pro Asp Ala Pro Gly Glu Met Val Val Leu 35 40 45 Thr Cys Asp Thr Pro Glu Glu Asp Gly Ile Thr Trp Thr Leu Asp Gln 50 55 60 Ser Ser Glu Val Leu Gly Ser Gly Lys Thr Leu Thr Ile Gln Val Lys 65 70 75 80 Glu Phe Gly Asp Ala Gly Gln Tyr Thr Cys His Lys Gly Gly Glu Val 85 90 95 Leu Ser His Ser Leu Leu Leu Leu His Lys Lys Glu Asp Gly Ile Trp 100 105 110 Ser Thr Asp Ile Leu Lys Asp Gln Lys Glu Pro Lys Asn Lys Thr Phe 115 120 125 Leu Arg Cys Glu Ala Lys Asn Tyr Ser Gly Arg Phe Thr Cys Trp Trp 130 135 140 Leu Thr Thr Ile Ser Thr Asp Leu Thr Phe Ser Val Lys Ser Ser Arg 145 150 155 160 Gly Ser Ser Asp Pro Gln Gly Val Thr Cys Gly Ala Ala Thr Leu Ser 165 170 175 Ala Glu Arg Val Arg Gly Asp Asn Lys Glu Tyr Glu Tyr Ser Val Glu 180 185 190 Cys Gln Glu Asp Ser Ala Cys Pro Ala Ala Glu Glu Ser Leu Pro Ile 195 200 205 Glu Val Met Val Asp Ala Val His Lys Leu Lys Tyr Glu Asn Tyr Thr 210 215 220 Ser Ser Phe Phe Ile Arg Asp Ile Ile Lys Pro Asp Pro Pro Lys Asn 225 230 235 240 Leu Gln Leu Lys Pro Leu Lys Asn Ser Arg Gln Val Glu Val Ser Trp 245 250 255 Glu Tyr Pro Asp Thr Trp Ser Thr Pro His Ser Tyr Phe Ser Leu Thr 260 265 270 Phe Cys Val Gln Val Gln Gly Lys Ser Lys Arg Glu Lys Lys Asp Arg 275 280 285 Val Phe Thr Asp Lys Thr Ser Ala Thr Val Ile Cys Arg Lys Asn Ala 290 295 300 Ser Ile Ser Val Arg Ala Gln Asp Arg Tyr Tyr Ser Ser Ser Trp Ser 305 310 315 320 Glu Trp Ala Ser Val Pro Cys Ser 325 <210> 6 <211> 197 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> IL-12A without signal peptide <400> 6 Arg Asn Leu Pro Val Ala Thr Pro Asp Pro Gly Met Phe Pro Cys Leu 1 5 10 15 His His Ser Gln Asn Leu Leu Arg Ala Val Ser Asn Met Leu Gln Lys 20 25 30 Ala Arg Gln Thr Leu Glu Phe Tyr Pro Cys Thr Ser Glu Glu Ile Asp 35 40 45 His Glu Asp Ile Thr Lys Asp Lys Thr Ser Thr Val Glu Ala Cys Leu 50 55 60 Pro Leu Glu Leu Thr Lys Asn Glu Ser Cys Leu Asn Ser Arg Glu Thr 65 70 75 80 Ser Phe Ile Thr Asn Gly Ser Cys Leu Ala Ser Arg Lys Thr Ser Phe 85 90 95 Met Met Ala Leu Cys Leu Ser Ser Ile Tyr Glu Asp Leu Lys Met Tyr 100 105 110 Gln Val Glu Phe Lys Thr Met Asn Ala Lys Leu Leu Met Asp Pro Lys 115 120 125 Arg Gln Ile Phe Leu Asp Gln Asn Met Leu Ala Val Ile Asp Glu Leu 130 135 140 Met Gln Ala Leu Asn Phe Asn Ser Glu Thr Val Pro Gln Lys Ser Ser 145 150 155 160 Leu Glu Glu Pro Asp Phe Tyr Lys Thr Lys Ile Lys Leu Cys Ile Leu 165 170 175 Leu His Ala Phe Arg Ile Arg Ala Val Thr Ile Asp Arg Val Met Ser 180 185 190 Tyr Leu Asn Ala Ser 195 <210> 7 <211> 879 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> PTGFRN <400> 7 Met Gly Arg Leu Ala Ser Arg Pro Leu Leu Leu Ala Leu Leu Ser Leu 1 5 10 15 Ala Leu Cys Arg Gly Arg Val Val Arg Val Pro Thr Ala Thr Leu Val 20 25 30 Arg Val Val Gly Thr Glu Leu Val Ile Pro Cys Asn Val Ser Asp Tyr 35 40 45 Asp Gly Pro Ser Glu Gln Asn Phe Asp Trp Ser Phe Ser Ser Leu Gly 50 55 60 Ser Ser Phe Val Glu Leu Ala Ser Thr Trp Glu Val Gly Phe Pro Ala 65 70 75 80 Gln Leu Tyr Gln Glu Arg Leu Gln Arg Gly Glu Ile Leu Leu Arg Arg 85 90 95 Thr Ala Asn Asp Ala Val Glu Leu His Ile Lys Asn Val Gln Pro Ser 100 105 110 Asp Gln Gly His Tyr Lys Cys Ser Thr Pro Ser Thr Asp Ala Thr Val 115 120 125 Gln Gly Asn Tyr Glu Asp Thr Val Gln Val Lys Val Leu Ala Asp Ser 130 135 140 Leu His Val Gly Pro Ser Ala Arg Pro Pro Pro Ser Leu Ser Leu Arg 145 150 155 160 Glu Gly Glu Pro Phe Glu Leu Arg Cys Thr Ala Ala Ser Ala Ser Pro 165 170 175 Leu His Thr His Leu Ala Leu Leu Trp Glu Val His Arg Gly Pro Ala 180 185 190 Arg Arg Ser Val Leu Ala Leu Thr His Glu Gly Arg Phe His Pro Gly 195 200 205 Leu Gly Tyr Glu Gln Arg Tyr His Ser Gly Asp Val Arg Leu Asp Thr 210 215 220 Val Gly Ser Asp Ala Tyr Arg Leu Ser Val Ser Arg Ala Leu Ser Ala 225 230 235 240 Asp Gln Gly Ser Tyr Arg Cys Ile Val Ser Glu Trp Ile Ala Glu Gln 245 250 255 Gly Asn Trp Gln Glu Ile Gln Glu Lys Ala Val Glu Val Ala Thr Val 260 265 270 Val Ile Gln Pro Ser Val Leu Arg Ala Ala Val Pro Lys Asn Val Ser 275 280 285 Val Ala Glu Gly Lys Glu Leu Asp Leu Thr Cys Asn Ile Thr Thr Asp 290 295 300 Arg Ala Asp Asp Val Arg Pro Glu Val Thr Trp Ser Phe Ser Arg Met 305 310 315 320 Pro Asp Ser Thr Leu Pro Gly Ser Arg Val Leu Ala Arg Leu Asp Arg 325 330 335 Asp Ser Leu Val His Ser Ser Pro His Val Ala Leu Ser His Val Asp 340 345 350 Ala Arg Ser Tyr His Leu Leu Val Arg Asp Val Ser Lys Glu Asn Ser 355 360 365 Gly Tyr Tyr Tyr Cys His Val Ser Leu Trp Ala Pro Gly His Asn Arg 370 375 380 Ser Trp His Lys Val Ala Glu Ala Val Ser Ser Pro Ala Gly Val Gly 385 390 395 400 Val Thr Trp Leu Glu Pro Asp Tyr Gln Val Tyr Leu Asn Ala Ser Lys 405 410 415 Val Pro Gly Phe Ala Asp Asp Pro Thr Glu Leu Ala Cys Arg Val Val 420 425 430 Asp Thr Lys Ser Gly Glu Ala Asn Val Arg Phe Thr Val Ser Trp Tyr 435 440 445 Tyr Arg Met Asn Arg Arg Ser Asp Asn Val Val Thr Ser Glu Leu Leu 450 455 460 Ala Val Met Asp Gly Asp Trp Thr Leu Lys Tyr Gly Glu Arg Ser Lys 465 470 475 480 Gln Arg Ala Gln Asp Gly Asp Phe Ile Phe Ser Lys Glu His Thr Asp 485 490 495 Thr Phe Asn Phe Arg Ile Gln Arg Thr Thr Glu Glu Asp Arg Gly Asn 500 505 510 Tyr Tyr Cys Val Val Ser Ala Trp Thr Lys Gln Arg Asn Asn Ser Trp 515 520 525 Val Lys Ser Lys Asp Val Phe Ser Lys Pro Val Asn Ile Phe Trp Ala 530 535 540 Leu Glu Asp Ser Val Leu Val Val Lys Ala Arg Gln Pro Lys Pro Phe 545 550 555 560 Phe Ala Ala Gly Asn Thr Phe Glu Met Thr Cys Lys Val Ser Ser Lys 565 570 575 Asn Ile Lys Ser Pro Arg Tyr Ser Val Leu Ile Met Ala Glu Lys Pro 580 585 590 Val Gly Asp Leu Ser Ser Pro Asn Glu Thr Lys Tyr Ile Ile Ser Leu 595 600 605 Asp Gln Asp Ser Val Val Lys Leu Glu Asn Trp Thr Asp Ala Ser Arg 610 615 620 Val Asp Gly Val Val Leu Glu Lys Val Gln Glu Asp Glu Phe Arg Tyr 625 630 635 640 Arg Met Tyr Gln Thr Gln Val Ser Asp Ala Gly Leu Tyr Arg Cys Met 645 650 655 Val Thr Ala Trp Ser Pro Val Arg Gly Ser Leu Trp Arg Glu Ala Ala 660 665 670 Thr Ser Leu Ser Asn Pro Ile Glu Ile Asp Phe Gln Thr Ser Gly Pro 675 680 685 Ile Phe Asn Ala Ser Val His Ser Asp Thr Pro Ser Val Ile Arg Gly 690 695 700 Asp Leu Ile Lys Leu Phe Cys Ile Ile Thr Val Glu Gly Ala Ala Leu 705 710 715 720 Asp Pro Asp Asp Met Ala Phe Asp Val Ser Trp Phe Ala Val His Ser 725 730 735 Phe Gly Leu Asp Lys Ala Pro Val Leu Leu Ser Ser Leu Asp Arg Lys 740 745 750 Gly Ile Val Thr Thr Ser Arg Arg Asp Trp Lys Ser Asp Leu Ser Leu 755 760 765 Glu Arg Val Ser Val Leu Glu Phe Leu Leu Gln Val His Gly Ser Glu 770 775 780 Asp Gln Asp Phe Gly Asn Tyr Tyr Cys Ser Val Thr Pro Trp Val Lys 785 790 795 800 Ser Pro Thr Gly Ser Trp Gln Lys Glu Ala Glu Ile His Ser Lys Pro 805 810 815 Val Phe Ile Thr Val Lys Met Asp Val Leu Asn Ala Phe Lys Tyr Pro 820 825 830 Leu Leu Ile Gly Val Gly Leu Ser Thr Val Ile Gly Leu Leu Ser Cys 835 840 845 Leu Ile Gly Tyr Cys Ser Ser His Trp Cys Cys Lys Lys Glu Val Gln 850 855 860 Glu Thr Arg Arg Glu Arg Arg Arg Leu Met Ser Met Glu Met Asp 865 870 875

Claims (29)

  1. 서열번호 1의 엑소좀 막단백질 변이체에 목적 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 융합 폴리펩타이드를 포함하는, 엑소좀.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 상기 엑소좀 막단백질 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 융합된, 엑소좀.
  3. 제2항에 있어서,
    상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 상기 엑소좀 막단백질 변이체의 N-말단에 융합된, 엑소좀.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    신호 펩타이드가 상기 목적 단백질 또는 펩타이드의 N-말단에 융합되는, 엑소좀.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 신호 펩타이드는 상기 목적 단백질 또는 펩타이드로부터 유래된 것이거나 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자의 신호 펩타이드인, 엑소좀.
  6. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 융합 폴리펩타이드는 엑소좀의 막을 통과하여 위치하고, 상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 엑소좀의 표면 상에 위치하는 것을 특징으로 하는, 엑소좀.
  7. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 IL-12인, 엑소좀.
  8. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 목적 단백질 또는 펩타이드를 코딩하는 외인성 서열을 포함하도록 유전적으로 조작 또는 변형된 엑소좀 생산 세포로부터 생산되는, 엑소좀.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 유전적으로 조작 또는 변형된 엑소좀 생산 세포는 HEK293 세포 또는 HEK293T 세포인, 엑소좀.
  10. 제1항의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 항암용 약학 조성물.
  11. 제10항에 있어서,
    약리학적으로 허용가능한 담체를 더 포함하는, 항암용 약학 조성물.
  12. 제10항에 있어서,
    항종양 효과 증진용 또는 항암효과 증진용인, 항암용 약학 조성물.
  13. 제12항에 있어서,
    암세포 사멸물질을 포함하는, 항암용 약학 조성물.
  14. 제13항에 있어서,
    상기 암세포 사멸물질은 상기 엑소좀 표면 또는 내부에 위치하는 것을 특징으로 하는, 항암용 약학 조성물.
  15. 제14항에 있어서,
    상기 암세포 사멸물질은 상기 목적 단백질 또는 펩타이드, 상기 엑소좀 막단백질 변이체, 또는 이들 모두에 융합되어 위치하는 것을 특징으로 하는, 항암용 약학 조성물.
  16. 제10항 내지 제15항 중 어느 한 항에 기재된 항암용 약학 조성물을 포함하는 약물 전달 시스템.
  17. 제16항에 있어서,
    단백질, 폴리펩타이드, 올리고펩타이드 또는 이들의 단편의 전달 시스템인 것을 특징으로 하는, 약물 전달 시스템.
  18. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항의 엑소좀을 유효성분으로 포함하는, 화장료 조성물.
  19. 제18항에 있어서,
    샴푸, 비누, 린스, 계면활성제-함유 클렌징, 크림, 로션, 연고, 토닉, 트리트먼트, 컨디셔너, 현탁액, 유탁액, 페이스트, 젤, 오일, 왁스, 스프레이, 에어졸, 미스트, 또는 파우더인, 화장료 조성물.
  20. 서열번호 1의 엑소좀 막단백질 변이체에 목적 단백질 또는 펩타이드를 융합시킨 융합 폴리펩타이드를 코딩하는 유전자 작제물을 준비하는 단계와,
    상기 유전자 작제물을 엑소좀 생산 세포에 형질도입하는 단계와,
    상기 융합 폴리펩타이드를 상기 엑소좀 생산 세포 내에서 발현시키는 단계와,
    상기 융합 폴리펩타이드를 포함하는 엑소좀을 분리하는 단계를 포함하는, 엑소좀의 제조방법.
  21. 제20항에 있어서,
    상기 융합 폴리펩타이드를 포함하는 엑소좀은 상기 엑소좀 생산 세포로부터 분비 또는 방출되어 상기 엑소좀 생산 세포의 배양액 내에 함유되는 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 제조방법.
  22. 제21항에 있어서,
    상기 배양액으로부터 상기 융합 폴리펩타이드를 포함하는 엑소좀을 분리하는 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 제조방법.
  23. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 상기 엑소좀 막단백질 변이체의 N-말단 또는 C-말단에 융합된 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 제조방법.
  24. 제23항에 있어서,
    상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 상기 엑소좀 막단백질 변이체의 N-말단에 융합된, 엑소좀의 제조방법.
  25. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    신호 펩타이드가 상기 목적 단백질 또는 펩타이드의 N-말단에 융합되는, 엑소좀의 제조방법.
  26. 제25항에 있어서,
    상기 신호 펩타이드는 상기 목적 단백질 또는 펩타이드로부터 유래된 것이거나 프로스타글란딘 F2 수용체 음성 조절자의 신호 펩타이드인, 엑소좀의 제조방법.
  27. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 융합 폴리펩타이드는 엑소좀의 막을 통과하여 위치하고, 상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 엑소좀의 표면 상에 위치하는 것을 특징으로 하는, 엑소좀의 제조방법.
  28. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 목적 단백질 또는 펩타이드는 IL-12인, 엑소좀의 제조방법.
  29. 제20항 내지 제22항 중 어느 한 항에 있어서,
    상기 엑소좀 생산 세포는 HEK293 세포 또는 HEK293T 세포인, 엑소좀의 제조방법.
KR1020210060594A 2020-05-31 2021-05-11 엑소좀의 막단백질 변이체를 포함하는 엑소좀 및 이의 제조방법 KR102341138B1 (ko)

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