KR102479118B1 - 보편적인 살해 t-세포 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 변형된 자연 살해 세포 (NK) 세포 및 개인화된 의약에서 그것의 용도에 관한 것이다. 본 발명의 변형된 NK 세포는 비-면역원성이이고, 이는 이들이 숙주 면역계에 의해 거부됨이 없이 임의의 수령 대상체에 투여될 수 있다는 것을 의미한다 (이들은 "보편적"이다). 제1 구현예에서, 비-면역원성 NK 세포는 CD3을 발현하도록 변형되어 T-세포 수용체(TcR)가 발현되도록 한다. 추가의 구현예에서, 비-면역원성 NK 세포는 CD3 보조-수용체와 함께 TcR을 발현하도록 추가로 변형된다. 특정 TcR과 함께 CD3의 공동-발현은 표적 세포에 대한 항원-특이적 세포독성을 나타내는 변형된 NK 세포를 초래한다. 보편적인 NK 세포는 따라서 특이적-항원에 대해 표적화될 수 있고, 그리고 따라서 개인화된 의약, 특히 종양학의 분야에 사용될 수 있다.
Description
본 발명은 자연 살해 세포 및 치료법, 특히 암의 치료에서의 이들의 용도에 관한 것이다. 특이적으로 CD3을 발현하도록 변형되고 더욱이 암 항원 또는 다른 표적 항원에 특이적인 T-세포 수용체에 기반한 항원 수용체를 공동-발현하도록 변형 될 수 있는 변형된 자연 살해 세포가 개발되었다. 변형된 자연 살해 세포는 비-면역원성으로, 예를 들면 낮은 수준의 MHC를 발현하거나 MHC-음성으로, 이것은 대상체의 MHC-유형에 무관하게, 세포가 보편적인 사용에 적합하다는 것을 의미한다. 본 발명은 따라서 유익하게는 보편성 및 개인화의 특징을 결합한다; T-세포 수용체는 질환 상태 (예를 들면 암 유형) 및 치료되는 대상체의 MHC 유형 양자에 매칭될 수 있어, "보편적인 세포"가 치료되는 대상체에 개인화된 치료에 사용될 수 있도록 한다.
면역계의 특정 세포는 특정한 표적 세포에 대해 세포독성을 나타낸다. 세포독성 T-림프구는 MHC 부류 I 분자에 결합된 항원-유도 펩티드를 특이적으로 인식할 수 있는 T-세포 수용체(TcR)를 발현한다. 반대로, 자연 살해 (NK) 세포는 MHC-제한되지 않고 MHC 분자에 의한 항원 전달을 필요로 하지 않아 그것의 살상 효과를 발휘한다. 이들은 펩티드-장입된 MHC의 부재하에 스트레스 받은 세포를 인식할 수 있고, MHC를 결한 세포를 사멸시킬 수 있다. 따라서 NK 세포는, 이들 "비-MHC" 세포는 그렇지 않으면 다른 면역 세포에 의해 검출되고 교란되지 않기 때문에, 타고난 면역력에 중요한 역할을 한다.
세포독성 T-세포 (세포독성 T 림프구 또는 살해 T-세포로도 알려짐)는 MHC 부류-I 분자에 의해 세포 표면에 제시된 항원 (펩티드)에 결합함에 의해 TcR을 통해 항원-특이적 방식으로 감염되거나 손상된 세포를 인식할 수 있다. 펩티드-MHC 부류-I에 대한 결합은 결합 상호작용의 친화도를 향상시키고 TcR에 의한 신호 형질도입을 증가시키는, CD8 보조-수용체에 의해 매개된다. 다른 T-세포 유형, 현저히 헬퍼 T-세포의 TcR은 CD4 보조-수용체에 의해 매개된 MHC-부류-II 분자에 의해 제시된 항원성 펩티드를 인식한다. CD3은 세포 표면에 TcR의 국부화를 위해 T-세포에서 요구되며 (문헌 [Ahmadi et al., 2011. Blood 118, 3528-3537]), 적합한 항원 펩티드로 장입된 MHC 단백질과 접촉에 의해 T-세포의 활성화를 위해 요구된다. CD3은 TcR과 함께 TcR 복합체를 형성하는, 4개의 상이한 쇄들: CD3γ 쇄, CD3δ 쇄, 두 개의 CD3ε 쇄 및 ζ 쇄로 구성된 단백질 복합체이다.
NK 세포 (또한 '큰 과립 림프구'로 정의됨)는 (B 림프구 및 T 림프구를 또한 유발하는) 일반적인 림프양 조상세포로부터 분화된 세포 계통을 나타낸다. T-세포와 달리, NK 세포는 원형질막에 자연적으로 CD3를 포함하지 않는다. 중요하게는, NK 세포는 TCR을 발현하지 않으며 전형적으로 또한 다른 항원-특이적 세포 표면 수용체 (뿐만 아니라 TCR 및 CD3, 이들은 또한 면역글로불린 B-세포 수용체를 발현하지 않고, 대신에 전형적으로 CD16 및 CD56을 발현함)를 결여한다. 따라서 NK 세포는 그것의 CD3-, CD56+ 표현형에 의해 분화된다. NK 세포 세포독성 활성은 감작을 필요로 하지 않지만 IL-2를 포함한 다양한 사이토카인으로 활성화에 의해 향상된다. NK 세포는 일반적으로 항원-수용체-매개된 신호전달에 필요한 적절한 또는 완벽한 신호전달 경로를 결여하는 것으로 생각되고 따라서 항원 수용체-의존성 신호전달, 활성화 및 증식이 가능하다고 생각되지 않는다.
NK 세포는 세포독성이고, 그것의 세포독성 활성을 조절하기 위해 활성화 및 저해 수용체 신호전달을 균형을 이룬다. 예를 들면, CD16을 발현하는 NK 세포 (FcγRIII 수용체)는 감염된 세포에 결합된 항체의 Fc 도메인에 결합할 수 있어, NK 세포 활성화를 초래할 수 있다. 반대로, 활성은 MHC 부류 I 단백질의 높은 수준을 발현하는 세포에 비해 감소된다. 표적 세포와의 접촉에서 NK 세포는 단백질 예컨대 페르포린, 및 효소 예컨대 프로테아제 (그란자임)를 방출한다. 페르포린은 표적 세포의 세포막에 기공을 형성할 수 있어, 세포자멸사 또는 세포 용해를 유도할 수 있다.
암을 치료하기 위한 수많은 T-세포 기반 요법이 개발되어 왔으며, 최근에는 입양 세포 전달 (ACT)로 공지된 이들 치료가 점점 더 매력적으로 되었다. 세 가지 주요 ACT 전략이 지금까지 개발되었다. 이들 중 최초이고 가장 개발된 것은 (종양 침윤 림프구 (TILs)로 공지된) 주변 또는 종양 부위로부터 환자 자신의 종양-반응성 T-세포의 단리를 포함한다. 이들 세포는 생체 외에서 증식되어 환자에게 재-주입된다. 그러나, 이 방법은 세포가 증식되는 동안 몇 주일의 지연을 포함할 수 있으며 전문의 세포 생산 설비를 필요로 한다.
종양을 인식할 수 있는 수용체로 환자의 자신의 T-세포의 변형을 포함하는 두 가지 대안적인 요법이 이용가능하다. 하나의 선택으로, 암 항원에 대한 활성을 갖는 TcR이 단리되고 특성화될 수 있으며, 그리고 TcR을 암호화하는 유전자가 T-세포에 삽입될 수 있어 환자에게 재-주입될 수 있다. 이 요법은 일부 환자에서 고형 종양을 감소시키는 것으로 나타났지만 유의미한 단점과 관련된다: 사용된 TcR은 환자의 면역 유형과 매칭되어야 한다. 따라서, TcR의 사용에 대한 대안으로서, T-세포에서의 키메라성 항원 수용체 (CAR)의 발현을 포함하는 요법이 또한 시사되었다. CAR은 TcR 복합체의 신호전달 도메인에 연결된 항체를 포함하는 융합 단백질이며, 그리고 적합한 항체가 선택되면 종양에 대해 T 세포를 향하도록 사용될 수 있다. TCR과 달리, CAR은 수령체에 MHC-매칭될 필요가 없다. 그러나, CAR에 대한 적합한 표적으로 사용될 수 있는 아주 적은 암-특이성 표면 항원은 지금까지는 식별되지 않았고, 따라서 암 치료법에서 CAR의 사용은 현재는 제한된다.
TcR 또는 CAR을 갖는 T-세포의 변형을 포함하는 모든 ACT 접근법은 환자 또는 조직-유형 매칭된 공여체로부터의 T-세포의 단리 및 변형을 필요로 한다. 자가조직 T-세포의 사용은 비-자가조직 세포가 사용되는 경우 거부의 위험을 피하기 위해 필요하다. 이것은 ACT와 관련된 비용을 증가시키며, 그리고 또한 ACT에서 T-세포를 준비하기 위해 요구된 시간 규모를 증가시킬 수 있다.
ACT의 상기 제한을 극복하고자 하는 대안적인 방법은 예를 들어 WO 98/49268에 기재된 바와 같이 세포독성 NK 세포를 이용한다. NK 세포는 강력한 살상 세포이며 수많은 상이한 악성 세포에 대해 고도로 세포독성이다. NK 세포는 비-자기 HLA 분자를 발현하지만 자가 HLA 항원을 발현하지 않는 표적 세포를 인식할 것이기 때문에 자가조직 NK 세포는 일반적으로 효과적이지 않으며, (GvHD를 피하기 위해 T-세포의 주의 깊은 제거를 필요로 하는) 동종이계 NK 세포 또는 세포주가 사용될 필요가 있다. NK 세포주 NK-92의 조사된 세포에 기반한 요법은 백혈병 및 다른 혈액학적 악성종양의 치료에서 임상시험으로 진행되었다. 방사선조사는 세포가 증식할 수 없으며 따라서 사멸 효과는 제한적이고 지속시간이 한정된다는 것을 의미한다. NK 세포는 또한 건강한 조직을 공격하지 않는다. 그러나, NK 세포의 본래 "범위"는 제한되며 그리고 비록 NK-92 세포가 1차 NK 세포보다 더 넓은 범위를 가지지만, NK 세포는 표적 세포 상의 항원을 특이적으로 표적화하는데 적합한 수용체를 자연적으로 포함하지 않으므로, 치료될 수 있는 암의 범위를 확장하고 그리고 세포가 특정한 또는 선택된 암에 대해 표적화하거나 또는 다시 향하도록 하기 위해 이들 세포의 추가 변형이 요구된다. 그와 같은 재-방향화는 물론 동종이계 NK 세포에 대한 요건이 제거되지만 NK-세포주는 그럼에도 불구하고 여전히 이점, 예를 들면 1차 또는 자가조직 NK 세포에 비교하여 개선된 세포독성을 가질 수 있다는 것을 의미한다.
이를 위해, CAR을 발현하는 NK 세포가 암의 치료에 사용하기 위해 개발되었다. 암세포의 표면에서 항원을 인식하는 CAR은 지속적으로 성장하는 NK-92 세포주에 도입되었으며, 이들 CAR을 포함하는 NK-92 세포는 친계 NK-92 세포에 비하여 종양 세포에 대한 향상된 세포독성을 가지는 것으로 나타났다 (문헌 [Uherek et al., 2002. Blood 200, 1265-1273]). 조기 임상시험이 진행 중이다. 그러나, 전술한 바와 같이, CAR에 대한 표적으로 이용가능한 항원의 결여는 현재 CAR-기반 요법의 사용을 제한한다.
본 발명은 암-특이적 사멸 세포를 제공하기 위한 대안적인 접근법에 기반한다. 더 상세하게는, 본 발명은 NK 세포에 기반한 암-특이적 살해 세포를 보편적인 용도로 제공하는 것이 목적이며, 이는 T-세포 기반 요법에 대해 현재 요구되는 바와 같은, 세포가 치료되는 대상체의 면역 유형과 매칭될 것을 요구하지는 않지만, 그러나 이들은 그럼에도 불구하고 필요에 따라 대상체의 특정한 면역- 및 암-유형에 맞추어 질 수 있다는 것을 의미한다. 따라서, 보편적인 살해 세포는 개인화된 의학에 사용될 수 있다.
따라서 본 발명은 NK 세포를 T-세포로 변화시키고, 따라서 T-세포와 같이 특정한 및 지향된 방식으로 TcR을 발현시키고 세포를 사멸시킬 수 있게 하는 것을 제안한다. 본 발명은 NK 세포의 효력 및 고유한 천연 사멸 능력을 TcR에 의해 부여된 세포 활성화 및 특이적 표적화와 결합시킨다. 비록 CAR은 이전에 NK 세포에서 발현되었지만, NK 세포가 NK 세포에 의한 성공적인 활성화 및 표적화된 사멸을 초래하는 방식으로 TcR이 성공적으로 발현될 수 있게 하는 모든 필요한 신호전달 경로 및 조직을 보유한다는 것이 지금까지는 가능성있는 것으로 생각되지 않았다. 보편성은, 세포가 수령체의 면역계에 의해 외래성으로 인식되지 않도록, 비-면역원성인, 예를 들면 자연적으로 낮은 수준의 MHC를 발현하거나, 감소된 증식성 능력을 가지는 NK 세포를 사용함으로써, 또는 NK 세포 MHC- (예를 들면 HLA-)를 음성으로 함에 의해 제공된다. 따라서 NK 세포는 치료될 대상체의 면역- (예를 들면 HLA-) 유형에 매칭될 필요가 없으며 대상체의 면역 유형에 무관하게, (즉, 임의의 면역 유형, 예를 들면 임의의 HLA 프로파일/유형을 갖는 대상체에) 보편적으로 투여될 수 있다.
본 발명은 따라서 작용성의 활성 TcR이 비-면역원성 NK 세포에서 발현되도록 하는 수단을 제공한다. 이런 방식으로, 세포의 MHC-매칭에 의존하지 않지만 세포 내로 도입되는 TcR의 특이성에 의해 지시된 특이성을 제어하는 보편적인 살해 T-세포가 제공될 수 있다. NK 세포에서 CD3 및 TcR의 공동-발현은 TcR이 NK 세포의 표면에 국부화되기에 충분한 것으로 밝혀졌고, 그리고 놀랍게도 TcR을 발현하는 NK 세포는 표적 세포에 대한 항원-특이적 세포독성을 나타냈다. 또 다른 방식으로 검토하면, 본 발명은 NK 세포를, 단순히 비-면역원성 NK 세포에서 CD3 및 TcR의 공동-발현을 통해, 보편성의 부가된 이점을 갖는 세포독성 T-세포로 전환시키는 수단을 제공한다. 본 발명은 따라서 개인화된 의약에 사용될 수 있는 '보편적인' 살해 T-세포를 제공한다.
따라서, 제1 측면에서, 본 발명은 변형된 NK 세포를 제공하고, 여기서 상기 세포는 비-면역원성이고 CD3를 발현하도록 변형된다.
특히, 세포는, 예를 들면 증식성 능력을 감소하도록 조사함에 의해, 또는 본 세포가 대상체에 도입될 때 면역 반응을 일으키기에 충분히 오랫동안 지속되지 않도록 증식을 감소하는 일부 다른 수단에 의해, 또는 세포를 MHC-음성으로 변경함에 의해 비-면역원성이 되도록 변형된다.
본 발명의 세포는 더욱이 표적 세포 (즉, 표적 항원) 상의 항원에 대한 특이성을 갖는 TcR을 발현하도록 변형될 수 있다. 아래에서 더욱 정의된 바와 같이, 용어 "TcR"은 TcR 항원 인식 영역을 포함하거나 그에 기반되거나 또는 TcR로부터 유도된 임의의 항원 수용체를 포함하도록 본 명세서에서 광범위하게 사용된다. 따라서, 천연 및 합성 TcR 양자, 예를 들면 TcR 변이체 또는 유도체가 포함된다.
특정 구현예에서, 본 발명은 CD3 및 TcR을 발현하는 비-면역원성 NK 세포를 제공하고, 여기서 상기 TcR은 암 세포 상의 항원에 특이적이다. 환언하면, 본 발명은 암-특이적 NK 세포를 제공하고, 여기서 상기 세포는 비-면역원성이고 그리고 요기서 상기 암 특이성은 암-특이적 TcR 및 CD3의 공동-발현에 의해 제공된다. 아래에서 더 상세히 설명되는 바와 같이, 바람직한 구현예에서 TcR은 보조-수용체 독립적, 특히 CD4 및/또는 CD8 독립적이다.
추가 측면에서 본 발명은 요법에 사용하기 위한, 더 상세하게는 암 치료법에, 또는 보다 일반적으로 입양 세포 전달 요법에 (예를 들면 T-세포 요법에 반응할 수 있는 임의의 병태의 치료에) 사용하기 위해 위에서 정의된 바와 같은 이러한 세포를 제공한다.
또 추가의 측면은 암 치료법에서 사용하거나 또는 입양 세포 전달 요법을 위한 약제의 제조에 위에서 정의된 바와 같은 변형된 NK 세포의 용도를 제공한다.
적어도 1종의 약제학적으로 허용가능한 담체 또는 부형제와 함께, 위에서 정의된 바와 같은 변형된 NK 세포를 포함하는 치료 조성물이 또한 제공되고, 그와 같은 치료 조성물은 암 치료법에서 사용하거나 또는 입양 세포 전달 요법을 위한 것이다.
또 추가의 측면은 치료 방법, 더 상세하게는 그것을 필요로 하는 대상체 (예를 들면 암으로부터 고통받고 있는 또는 진단된 대상체)에 유효량의 위에서 정의된 바와 같은 변형된 NK 세포를 투여하는 것을 포함하는 암 치료의 방법 또는 입양 세포 전달 요법의 방법을 제공한다.
치료법에 사용하기 위해, 본 발명의 변형된 NK 세포는 TcR을 CD3와 함께 공동-발현하도록 변형될 것이다. 따라서 치료법에 사용하기 위한 약제 또는 조성물의 제조는 TcR을 발현하도록 NK 세포를 변경하는 것을 포함할 것이다. TcR은 먼저 치료되는 대상체 (즉 변형된 NK 세포의 수령체)의 면역 (즉 MHC) 유형을 매칭하고 그리고 두 번째로 NK 세포에 의해 표적화된 대상체 내 세포를 매칭하거나 인식하도록 설계되거나 선택될 것이다. 즉 TcR은 대상체에서 원하는 표적 항원을 인식하도록 설계 또는 선택된다. 이것은 대상체 내 암 세포에 의해 또는 입양 세포 전달 요법으로 폐기되도록 되는 임의의 세포, 즉 감염된 세포, 예를 들면 바이러스 또는 다른 병원체 항원을 발현하는 (또는 제시하는) 세포에 의해 발현된 (또는 제시된) 표적 항원일 수 있다.
따라서 본 발명에 따라 암 치료법 또는 입양 세포 전달 요법을 수행하기 위해, 또는 치료적 사용을 위한 변형된 NK 세포를 제조하기 위해, 하기 단계가 수행될 수 있다:
(a) CD3를 발현하도록 변형된 비-면역원성 NK 세포를 제공하는 단계;
(b) 치료되는 대상체의 MHC 유형을 결정하는 단계;
(c) 대상체 내 표적 항원을 식별하는 단계로, 항원은, 예를 들면 대상체의 암 유형 및/또는 특정한 암 마커 (예를 들면 항원)의 발현 또는 특정한 돌연변이의 존재 등을 식별하거나 결정함에 의해, 대상체 내 세포에 의해 발현되거나 제시되는 단계;
(e) 상기 표적 항원에 대한 특이성을 갖고 대상체의 MHC 유형에 매칭하는 TcR을 발현하도록 단계 (a)의 세포를 변형하는 단계.
아래에 추가로 논의되어 질 바와 같이, 단계는 개별적으로 또는 순차적으로, 또는 동시에 수행될 수 있다. 따라서, 예를 들면, 단계 (a) 및 (d)는 동시에 수행될 수 있고, 더 상세하게는 세포는 하나 이상의 동시 단계에서 CD3 및 TcR을 발현하도록 변형될 수 있다. 그러나, 또 다른 구현예에서 세포는 TcR을 발현하도록 변형 전에 별개의 단계에서 CD3를 발현하도록 변형될 수 있다.
마지막으로, 치료 방법 또는 치료 용도에서, 단계 (d)의 변형된 세포는 (예를 들면 추가의 단계 (e)에서) 대상체에 투여될 수 있다.
본 발명의 또 다른 측면에서, (세포가 치료 용도에 적합한 (또는 치료 용도로 가능할 수 있는)) 보편적인 NK 세포, 또는 더 상세하게는 개인화된 치료 용도용, 즉 입양 세포 전달 요법용 세포를 제조하는데 사용하기 위한 보편적인 NK 세포의 생산 방법이 제공되며, 상기 방법은:
(a) 비-면역원성인 NK 세포를 제공하는 것, 더 특이적으로 NK 세포를 이것이 비-면역원성으로 되도록 변형하는 것; 및
(b) 상기 세포를 CD3를 발현하도록 변형하는 것을 포함한다.
입양 세포 전달 요법에 사용하기 위한 변형된 NK 세포를 추가로 제공하기 위해, 세포는 TcR를 발현하도록, 그리고 특히 개인화된 치료법에 대해서는 치료되는 대상체의 MHC-유형에 매칭되고 변형된 NK 세포에 의해 표적화된 표적 세포에 의해 발현되거나 제시된 표적 항원을 인식하는 TcR을 발현하도록 단계 (c)에서 추가로 변형된다.
바람직한 구현예에서, 암-특이성 NK 세포의 생산 방법이 제공되며, 상기 방법은:
(a) 비-면역원성인 NK 세포를 제공하는 것, 예를 들면 NK 세포를 이것이 비-면역원성으로 되도록 변형하는 것;
(b) 상기 세포를 CD3를 발현하도록 변형하는 것;
(c) 상기 세포를 암-특이성 TcR을 발현하도록 변형하는 것을 포함한다.
단계 (b) 및 (c)는 함께 (동시에) 또는 개별적으로, 예를 들면 순차적으로 수행될 수 있다. 그러나, 유리한 구현예에서, 아래에 추가로 기재되는 바와 같이, CD3를 발현하는 보편적인 NK 세포가 제조될 수 있어, 세포는 대상체의 MHC-유형 및 진단에 기반하여 선택된 TcR을 발현하도록 세포를 추가로 변형시킴으로써, 입양 전달 요법을 위한 개인화된 세포를 제조하기 위해 개별의 단계에서 연속적으로 사용될 수 있다. 따라서 (예를 들면 상이한 공지된 또는 이전에 식별된 표적 항원 예를 들면 암 항원의 범위에 대해) MHC- 특이성 (즉 유형) 및 표적 항원 특이성에 따른 상이한 TcR (더 특이적으로 TcR을 암호화하는 핵산 분자 또는 벡터)을 함유하는 TcR 수용체의 은행 또는 라이브러리가 제조될 수 있다. 대상체의 진단 (예를 들면 특정한 암 유형, 또는 특정한 항원을 발현하는 것으로 알려지거나 또는 대상체의 암의 특정한 분석에 의해 식별된 암)에 의존하여, 특정한 TcR이 본 발명에 따른 NK 세포를 변형하기 위해 선택 및 사용될 수 있다. 대안적으로, 적절한 NK 세포가 대상체 진단 및 MHC-유형에 의존하여 선택될 수 있는, 다변하는 특이성의 CD3 및 TcR 양자를 발현하는 변형된 NK 세포의 은행 또는 패널이 제조될 수 있다.
따라서, 본 발명의 또 추가의 측면은 조합된 생성물, 또는 키트, 특히 입양 세포 전달 요법, 또는 암 치료법에서 사용하기 위한 그와 같은 생성물 또는 키트를 제공하고, 상기 생성물 또는 키트는:
(a) 비-면역원성이고 CD3를 발현하는 변형된 보편적인 NK 세포, 더 상세하게는 비-면역원성이 되도록 변형되고 CD3를 발현하는NK 세포; 및
(b) TcR을 각각 암호화하는 핵산 분자의 패널을 포함하고, 여기서 상기 TcR은 상이한 항원 특이성 및/또는 상이한 MHC 특이성을 가진다.
편리하게 암호화 핵산 분자는 벡터, 예를 들면 변형된 NK 세포 내로 도입 (즉, 형질감염 또는 형질도입 등)할 준비가 되어있는 벡터로 제공될 수 있다. 바람직한 구현예에서, TcR은 암 항원, 또는 (예를 들면 우선적으로 또는 특이적으로) 암세포에 발현된 항원에 대한 특이성을 갖는다.
본 발명의 다른 추가의 측면은 변형된 NK 세포의 패널 또는 라이브러리를 제공하며, 각 NK 세포는 비-면역원성이며 CD3을 발현하고, 예를 들면 비-면역원성이 되고 CD3를 발현하도록 변형되고 그리고 TcR를 발현하고 (즉 발현하도록 변형되고), 여기서 상이한 NK 세포의 TcR은 상이한 항원 특이성 및/또는 상이한 MHC 특이성을 가진다.
이러한 측면에서 동일한 항원을 인식하는 다중 TcR이 있을 수 있지만 그러나 이들은 그것의 MHC 특이성에서 다를 수 있고 그 반대일 수 있다고 이해될 것이다.
본 발명은 암의 치료에 면역계의 세포독성 세포를 이용한다. 특이적으로 본 발명은 그렇지 않으면 TcR을 발현하지 않는 면역계의 세포독성 세포에서 TcR의 발현, 및 이러한 세포에서 활성인, 작용성 TcR의 발현을 허용하는 방법에 관한 것이다.
용어들 '세포용해' 및 '세포독성'은 표적 세포에서 용해 또는 세포자멸사에 의해 세포사를 유도할 수 있는 세포를 지칭하기 위해 본 명세서에서 상호교환적으로 사용된다.
용어 '표적 세포'는 본 발명의 세포독성 세포에 의해 사멸되는 임의의 세포를 지칭한다. 더 상세하게는, 표적 세포는 NK 세포에 의해 표적화된 세포이며, 따라서 TcR (표적 항원)에 의해 인식되는 항원을 발현 또는 제시하는 세포이다. 이들은 임의의 세포 유형을 포함할 수 있으며, 표적 세포의 표면에 표시된 항원을 통해 본 발명의 세포에 의해 표적화된다.
따라서 표적 세포는 그것이 소거, 예를 들면 제거, 사멸, 불활성 부여 등이 되는 것이 바람직하게 되는 대상체의 신체에서 임의의 세포일 수 있다. 바람직한 표적 세포는 암 세포이지만, 이것은 질환 또는 임상 병태로부터의 임의의 세포일 수 있다. 따라서 질환 또는 병태는 입양 세포 전달 요법으로부터, 또는 더 상세하게는 사멸 또는 제거 등을 위한 세포를 표적화하는 T-세포 요법으로부터 이점일 수 있는 임의의 병태일 수 있다. 암세포뿐만 아니라, 제거되는 것이 임상적으로 바람직할 수 있는 다른 세포는 감염된 세포, 즉 임의의 병원체로 감염된 세포를 포함한다. 전형적으로, 이러한 세포는 바이러스-감염된 세포일 것이지만, 이들은 또한 임의의 다른 병원성 유기체, 예를 들면 임의의 미생물, 예를 들면, 박테리아, 진균, 마이코플라스마, 원생동물, 프리온으로 감염될 수 있다. 대안적으로, 표적 세포는 세포자멸적 또는 사전-세포자멸적일 수 있거나, 또는 스트레스 받은 상태일 수 있거나 (즉 그것의 세포 표면에 스트레스-관련된 마커를 발현할 수 있거나), 또는 예를 들면 특정한 돌연변이를 발현하는 돌연변이체 세포일 수 있다.
"표적 항원"은 표적 세포에 제시될 때 TcR에 의해 인식되는 분자이거나 (또는 더 특이적으로 제공하거나 포함한다). 따라서, 표적 항원, 또는 더 상세하게는 표적 항원으로부터 유도된 펩티드는 TcR에 의해 인식될 필요가 있는 것과 같은 MHC-I 또는 MHC II 제한된 방식으로 표적 세포 상에 제시된다. 따라서, 상기에 논의된 바와 같이, 표적 항원은 암 항원, 즉 암 세포에 의해 특이적으로, 선택적으로 또는 우선적으로 발현되거나 또는 암 세포의 특징이거나 암 세포 마커로서 공지된 또는 사용되는 항원일 수 있다. 암 항원은 보편적인 암 항원, 즉 넓은 범위의 상이한 암에서 통상적으로 발견되는 항원일 수 있거나, 특정한 유형의 암에 특이적일 수 있다. 대안적으로, 이것은 표적 세포에 의해 제시되는 감염 병원체로부터의 항원 또는 소거하고자 하는 임의의 다른 세포에 의해 발현되거나 제시되는 임의의 다른 항원일 수 있다.
'MHC'는 주요 조직적합성 복합체의 단백질을 지칭하며, MHCI 및 MHCII 단백질을 양자를 포함한다. MHCII 단백질은 일반적으로 수지상 세포, 단핵 식균세포, 일부 내피 세포, 및 흉선 상피 세포와 같은 항원-제시 세포의 표면에서만 발견된다. MHCII 단백질은 또한 B 세포에 의해 발현되며, 따라서 B-세포 악성종양에 의해 발현될 수 있다. MHCII 단백질은 또한 흑색종 세포에 의해 빈번하게 발현된다. 용어 MHC는 인간 백혈구 항원 (HLA)을 포함하며, 따라서 대상체가 인간인 경우, 이들 용어는 상호교환적으로 사용될 수 있다.
임의의 NK 세포가 본 발명에 따라 사용될 수 있다. 용어 "NK 세포"는 항원-특이적 수용체 (예를 들면 T-세포 수용체 또는 B-세포 수용체)를 자연적으로 포함하지 않는 공통의 림프양 조상세포로부터 유도된 세포독성 림프구인 큰 과립 림프구를 지칭한다. NK 세포는 그것의 CD3-, CD56+ 표현형에 의해 분화될 수 있다. 본 명세서에서 사용된 바와 같은 용어는 따라서 임의의 공지된 NK 세포 또는 임의의 NK-유사 세포 또는 NK 세포의 특징을 갖는 임의의 세포를 포함한다.
일 구현예에서, NK 세포는 본 발명에서 사용하기 위한 NK 세포의 집단을 제공하기 위해 대상체로부터 유도될 수 있고 시험관내에서 성장될 수 있다. NK 세포는 자가일 수 있거나 (즉, 본 발명의 세포 및 방법을 사용하여 치료되는 대상체로부터 유도될 수 있거나) 또는 이종성일 수 있다 (즉, 세포는 공여 대상체로부터 유도될 수 있고 제2 대상체의 치료를 위해 의도될 수 있다 (즉, 이들은 동종이계, 동계의 또는 이종발생성일 수 있다). 따라서, 1차 NK 세포가 사용될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 이전에 단리되고 배양된 당해 기술에서 공지된 NK 세포가 본 발명에서 사용될 수 있다. 따라서, NK 세포주가 사용될 수 있다. 수많은 상이한 NK 세포가 공지되고 문헌에 보고되어 있고 이들 중 임의의 것이 사용할 수 있거나 또는 세포주는 1차 NK 세포로부터, 예를 들어 바이러스 형질 전환에 의해 제조될 수 있다 (문헌 [Vogel B et al., 2014 Leukemia 28 : 192-195]). 세포주는 1차 NK 세포에 비해 수많은 이점을 가질 수 있는데, 예를 들면, 이들은 배양에서 성장 및 유지가 보다 쉬울 수 있고, 입양 세포 전달 요법에 대해 표준화된 품질로 요구에 보다 쉽게 확장되고 쉽게 이용가능하다. 특정 세포주, 예를 들면 NK-92 세포주는 또한 보다 높은 세포독성 활성을 나타낼 수 있고, (본 발명에 따라 변형되지 않은) 그것의 비변형된 상태에서 이들은 더 넓은 범위의 세포 표적, 예를 들면 암 세포 표적을 가질 수 있다(이는 저해 수용체의 수의 부재 또는 감소로 인한 것일 수 있음). 적합한 NK 세포는 (결코 이에 제한되는 것은 아니지만), NK-92에 부가하여 NK-YS, NK-YT, MOTN-1, NKL, KHYG-1, HANK-1 또는 NKG 세포주를 포함한다.
바람직한 구현예에서, 세포는 NK-92 세포 (문헌 [Gong et al., 1994, Leukemia 8, 652-658]) 또는 그것의 변이체이다. 비-면역원성인 NK-92 변이체를 포함하여 최초 NK-92 세포의 수많은 상이한 변이체가 제조되고 기술되거나 또는 이용 가능하다. 임의의 이러한 변이체가 사용될 수 있고 용어 "NK-92"에 포함된다. 다른 세포주의 변이체가 또한 사용될 수 있다. 그러나, 본 발명에 따라 사용하기 위한 임의의 NK-92 또는 사실상 임의의 NK 세포는 본 발명에 따라 변형된 NK 세포 내로 도입되거나 또는 도입되는 TcR 이외의 임의의 항원-특이적 수용체를 발현하도록 변형되어서는 안된다. 예를 들면, 세포는 CAR (TcR 복합체로부터 세포내 신호전달 도메인에 연결된 단클론성 항체)를 발현해서는 안된다. 보다 일반적으로, 본 발명에 따른 변형된 NK 세포는 항체 인식 영역에 기반하거나 이를 포함하는 항원-특이적 수용체를 발현하지 않는다. NK 세포는 본질적으로 항원-특이적 수용체를 포함하지 않으며, 따라서 본 발명의 세포에 존재하는 유일한 항원-특이적 수용체는 NK 세포로 도입되거나 또는 도입되는 TcR인 것이다.
본 발명에 따르면, 변형된 NK 세포는 비-면역원성이다. 기능적으로 말하자면 이것은 세포가 이것이 도입되는 임의의 대상체의 면역계에 의해 인식되지 않는다는 것을 의미한다 - 그것은 면역학적 레이더 하에서 통과하고 수령 대상체에 의해 거부되거나 외래의 것으로 인정되지 않는다. 즉, NK 세포가 투여되는 대상체의 면역계에 의해 변형된 NK 세포에 대하여 임상적으로 유의미한 면역학적 반응이 일어나지 않는다. 따라서, 대상체에게 투여될 때, 세포가 치료법에서 세포의 사용에 영향을 미치거나, 방해하거나, 예방하는 면역 반응을 생성하지 않으면, 세포는 비-면역원성일 수 있다.
용어 "비-면역원성"은 따라서 세포가 주입되거나 또는 달리는 대상체에 투여될 때 세포에 실질적인 또는 임상적으로 유의미한 면역 반응이 없는 것을 의미하는 것으로 본 명세서에서 광범위하게 사용된다. 더 상세하게는, 세포는 세포의 거부를 유도하고 및/또는 세포의 기능에 영향을 미치기에 충분한 면역 반응을 일으키지 않으며 (또는 일으킬 능력이 없으며), 예를 들면 면역 반응은 세포의 기능 또는 효과 (즉 유용성)를 폐지하거나 실질적으로 또는 유의미하게 감소시키기에 충분하지 않다. 따라서, 세포는 대상에서 세포독성 활성, 더 상세하게는 표적 세포에 대해 유의미한 또는 실질적인 또는 측정가능한 세포독성 활성을 보유한다. 특정 구현예에서, 세포는 외래의 것으로 거부되지 않는다. 임의의 생물학적 시스템과 같이, 면역 반응의 부재는 절대적 (또는 100%)이지 않을 수 있고, NK 세포에 대한 작은 (또는 온화한 또는 중요하지 않은) 면역 반응 (예를 들면 최소한 면역 반응)은 세포의 기능 또는 유용성이 실질적으로 영향을 받지 않는 한 (즉 세포가 여전히 그것의 기능을 수행할 수 있는 한) 오래 지속될 수 있다.
따라서, (이것이 수득된 동일한 대상체에 투여하기 위한, 또는 투여된 세포인) 자가조직 세포는 (이것이 "셀프"이기 때문에) 비-면역원성일 것이다는 것을 알 수 있을 것이다. 유사하게, 비-자가조직 MHC-매칭된 NK 세포는 비-면역원성이거나 실질적으로 비-면역원성일 것이다. 따라서 용어 "비-면역원성"은 작용성 비-면역원성을 포함한다. 그러나, 특정 구현예에서, 그리고 전술한 바와 같이, 본 발명의 비-면역원성 NK 세포는 세포의 수령체에 관계없이, 즉 그것이 도입되거나 되입되는 대상체에 무관하게 비-면역원성이다 (즉, 이것은 비-자가조직 대상체에 투여되는 경우 임상적으로 유의미한 면역 반응을 유도하지 않을 것이다). 특정 구현예에서, NK 세포는 이것을 비-면역원성으로 하는 처리를 받을 수 있다 (즉 이것은 비-면역원성으로 변형될 수있다). 예를 들어, 상기 처리는, 예를 들면 세포에 의한 MHC 발현을 감소시키거나 제거하기 위해, 물리적, 화학적 또는 생물학적 처리, 또는 세포의 구조적 또는 물리-화학적 변형 (예를 들어, 세포의 구조적 또는 물리적 변화 또는 변경을 야기하는 처리), 예를 들면 조사, 또는 유전자 변형일 수 있다. 따라서, 일부 구현예에서, NK 세포는 단순히 기능적으로 면역원성이 아니지만, 이것을 비-면역원성으로 만드는 변형을 지니거나 포함한다.
따라서, NK 세포는 천연적으로 비-면역원성일 수 있거나, 또는 비-면역원성으로 변형될 수 있다. 천연적으로 비-면역원성 NK 세포는 MHC 분자를 발현하지 않을 것이거나 또는 단지 약하게 MHC 분자를 발현하거나, 또는 면역학적 반응을 자극하지 않는 비-작용성 MHC 분자를 발현할 것이다. 면역원성인 NK 세포는 MHC 분자의 발현을 제거하거나 또는 그것의 표면에 단지 약하게 MHC 분자를 발현하도록 변형될 수 있다. 대안적으로, 이러한 세포는 비-작용성 MHC 분자를 발현하도록 변형될 수 있다.
임의의 이러한 세포 (천연적으로 비-면역원성이든 또는 어떤 점에서 변형되었든 간에)는 대상체의 면역 반응에 의해 임상적으로 유의미한 면역학적 반응을 촉발하기에 충분한 수준으로 그것의 표면에 MHC를 포함하지 않고 MHC-음성인 것으로 고려될 수 있다. 환언하면, MHC-음성 세포는 면역학적으로 작용성인 임의의 MHC 분자를 그것의 표면에 MHC 분자를 발현하지 않거나, 이것이 또 다른 면역 세포, 특히 비-자가 면역 세포 또는 의도된 수령 대상체로부터의 면역 세포에 의해 인식될 수 있는 충분히 높은 수준으로 그것의 표면에 MHC 분자를 발현하지 않는다. 세포는 MHC 분자를 결할 수 있거나, 또는 이것은 그것의 세포 표면에 MHC를 발현하지 않거나, 또는 그것의 세포 표면에 단지 약하게 MHC를 발현하거나, 또는 발현된 임의의 MHC 분자는 비-작용성, 예를 들면 이것은 이것이 비-작용성이 되도록 돌연변이되거나 또는 달리는 변형될 수 있다. 작용성 MHC 분자의 발현을 교란하는 임의의 수단이 포함된다. 그러므로, 이것은 MHC 복합체의 분자를 녹아웃 또는 녹다운하는 것을 포함할 수 있으며, 및/또는 그것은 세포 표면에서 MHC 분자 또는 전체 복합체의 적절한 이송을 방지하고 및/또는 발현을 교정하는 변형을 포함할 수 있다.
특히, 본 발명의 세포의 표면에서 하나 이상의 작용성 MHC 부류-I 단백질의 발현이 교란될 수 있다. 일 구현예에서 세포는 HLA-음성인 인간 세포, 및 따라서 하나 이상의 HLA 분자의 발현이 교란 (예를 들면 녹아웃)된 세포, 예를 들면, HLA MHC 부류 I 복합체의 분자일 수 있다.
바람직한 구현예에서, MHC 부류-I의 교란은 성숙한 MHC 부류-I 복합체의 성분인 β2-마이크로글로불린을 암호화하는 유전자를 녹아웃함에 의해 수행될 수 있다. β2m의 발현은, 예를 들면 (프로모터를 비활성화하기 위해) β2m 프로모터의 부위 지향적 돌연변이유발에 의해, 또는 유전자 내에 β2m 단백질, 예를 들면 프레임-전이 돌연변이 또는 미성숙한 '정지' 코돈의 발현을 방지하는 비활성화 돌연변이를 도입하기 위해 β2m 단백질을 암호화하는 유전자 내에 β2-마이크로글로불린 유전자 (β2m)의 표적 붕괴를 통해 제거될 수 있다. 대안적으로, 부위 지향적 돌연변이유발은 세포 표면에 활성 MHC 단백질을 형성할 수 없는 비-작용성 β2m 단백질을 생성하기 위해 사용될 수 있다. 이런 식으로 β2m 단백질 또는 MHC가 세포내로 유지될 수 있거나, 또는 존재할 수 있지만 세포 표면에서 비-작용성이다.
NK 세포는 대상체에 투여되기 전에 대안적으로 조사될 수 있다. 조사된 NK-92 세포는 임상시험에서 비-면역원성인 것으로 밝혀졌고 면역요법에서의 사용이 허용되었다 (문헌 [Ton T. et al. 2013 Cytotherapy 15 1563-70]). 이론에 의한 구속됨 없이, 세포의 조사는 세포가 대상체에 단지 일시적으로 존재하고, 따라서 변형된 NK 세포에 대한 면역학적 반응을 증가하기 위한 대상체의 면역계에 이용가능한 시간 감소를 초래하는 것으로 여겨진다. 비록 이러한 세포가 그것의 세포 표면에 작용성 MHC 분자를 발현할 수 있지만, 이들은 또한 비-면역원성인 것으로 고려될 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 NK 세포는 증식하는 그것의 능력, 또는 수용력을 감소함에 의해, 즉 그것의 증식성 수용력을 감소함에 의해 비-면역원성으로 변형될 수 있다.
본 발명의 NK 세포는 CD3를 발현하도록 변형된다. 상기에서 언급된 바와 같이, 본 발명의 NK 세포는 TcR 이외의 CAR, 또는 사실상 임의의 항원-특이적 수용체를 발현하지 않는다. 따라서, 특히, TcR-CD3 융합의 경우을 제외하고, CD3는 키메라성 수용체의 일부로서 발현되지 않는다. 더 상세하게는, CD3는 키메라성 항원 수용체 (CAR), 또는 TcR이 아닌 임의의 결합 분자 또는 모이어티로부터, 예를 들면 임의의 다른 친화도 결합 파트너, 예를 들면 TcR 이외의 리간드 또는 수용체로부터 유도된 항체-유도된 항원 결합 영역(들), 또는 결합 도메인에 기반된 (또는 포함하는) 임의의 키메라성 수용체의 일부로서 발현되지 않는다. 따라서, CD3는 TcR이 아닌 또는 TcR로부터 유도되지 않은 항원 결합 도메인 (즉 결합 파트, 또는 모이어티) 또는 임의의 결합 도메인 또는 리간드를 포함하는 키메라성 수용체의 일부로서 발현되지 않는다. 환언하면, CD3는 독립적으로 (즉 별도의 분자 또는 쇄로, 또는 CD3 쇄 또는 이들의 일부, 또는 스페이서 또는 링커 분자가 아닌 모이어티와 융합의 일부로서가 아님) 발현되고, 및/또는 이것은 TcR-CD3 융합의 일부로 (또는 그 안에) 발현된다. 따라서, 특히, 본 발명의 NK 세포는 CD3-TcR 융합 이외의 CD3 쇄 또는 분자를 포함하는 CAR 또는 다른 키메라성 수용체를 발현하지 않는다. CD3가 융합 (즉 융합 단백질)로서 또는 그 일부로서 제공되는 일 구현예에서, 이것은 아래에 추가로 기재되는 바와 같이, CD3 융합 또는 CD3-TcR 융합이다.
NK 세포는 정상적으로 (또는 천연적으로) CD3를 발현하지 않고 따라서 세포가 CD3를 발현할 수 있도록 CD3를 암호화하는 핵산 분자가 세포 안으로 도입된다. 따라서 세포는 CD3를 재조합으로 발현하도록 변형된다. 환언하면 세포는 CD3를 암호화하는 이종성 핵산 분자의 발현을 허용하도록 변형된다. CD3는 세포의 종 (즉 본 세포와 동일한 종의 것)에 매칭될 수 있으나, 상이한 종으로부터의 CD3 또한 사용될 수 있다. 따라서, 인간 NK 세포 인간 CD3, 또는 또 다른 포유동물 종, 예컨대 마우스, 랫트, 토끼 등으로부터의 CD3가 발현될 수 있다. 바람직한 구현예에서 CD3의 모든 쇄 (즉 CD3γ 쇄, CD3δ 쇄, 두 CD3ε 쇄 및 ζ 쇄)이 NK 세포에서 발현된다. 그러나, 단지 단일 CD3 쇄 (예를 들면 단지 CD3γ 쇄, 또는 단지 CD3δ 쇄, 또는 단지 CD3ζ 쇄, 또는 단지 CD3ε 쇄, 또는 이들의 임의의 조합이 존재할 수 있다는 것이 또한 고려된다. 따라서 NK 세포는 임의의 CD3 쇄을 단독으로, 또는 최대로 그리고 완벽한 CD3 분자를 포함한 다른 CD3 쇄과 조합하여 발현하도록 변형될 수 있다. 이론에 의한 구속됨 없이, TcR이 세포 표면으로 향하거나 및/또는 CD3 쇄 중 하나 이상이 NK 세포에서 발현되지 않는 신호전달을 시작하는 것이 가능할 수 있다는 것이 가설된다. 또한 CD3 쇄 중 하나 이상이 융합 단백질로서 제공될 수 있으며, 여기서 CD3의 위치화 및 신호전달 기능이 유지된다면 적어도 두 개의 쇄이 단일 폴리펩티드로 발현되는 것으로 기대된다.
1종 이상의 CD3 쇄은 또한 일 핵산 분자 또는 1 초과 핵산 분자, 예를 들면 별도의 분자에 의해 암호화될 수 있다. 편리하게 모든 세 가지 CD3 쇄을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 작제물이, 예를 들면 동일한 프로모터의 조절하에서 또는 어떤 점에서 서로 연결되어 제작될 것이다.
본 발명의 NK 세포는 더욱이 TcR을 발현하도록 변형될 수 있다. TcR은 표적 세포의 표면상의 항원에 선택적으로 결합하는 TcR 항원-인식 도메인, 항원-인식 서열 또는 그것의 단편을 포함하는 임의의 수용체로 볼 수 있다. 따라서, 본 발명의 문맥에서, TcR은 그것의 천연 (또는 천연) 맥락에서 TcR 항원-인식 도메인을 포함하는 표준적 TcR일 수 있거나, 이것은 TcR에서 함께 천연적으로 발견되지 않는 (즉 비-천연 맥락) 아미노산 서열 및/또는 단백질 도메인 (즉, 키메라성 분자 또는 융합 단백질의 일부로서)에 연결된 TcR 항원-인식 도메인, 항원-인식 서열 또는 그것의 단편을 포함할 수 있다. 용어 "TcR"은 따라서 임의의 항원 수용체를 포함하는 것으로 본 명세서에서 광범위하게 사용되고 여기서 항원 인식 영역은 TcR 항원-인식 도메인 또는 서열, 예를 들면 천연 TcR로부터, 또는 천연 TcR로부터 유도된 항원 인식 영역에 의해 제공된다. 용어 "TcR"은 따라서 천연 및 합성 또는 인공 TcR 분자 또는 작제물, TcR 변이체 또는 유도체, 또는 천연 TcR로부터 유도된 또는 그에 기반한 TcR 분자인 비-천연 TcR을 포함한다.
TcR을 발현하는 NK 세포는 따라서 표적 세포를 향한 항원-특이적 (즉 표적화된) 세포독성 활성을 갖는다. TcR은 흥미 있는 표적 세포 상의 항원 (표적 항원)에 대한 특이성을 갖는 임의의 TcR일 수 있다. NK 세포의 특이성, (즉 세포가 결합하는 항원)은 TcR의 특이성에 의해 결정될 것이다. 환언하면, 적합한 TcR의 선택은 원하는 특이성 (즉 표적 세포 상의 특정한 항원에 대한 특이성)을 갖는 NK 세포를 제공하기 위해 필요하다. 따라서 일 구현예에서 본 발명은 CD3를 발현하도록 변형되고 추가로 표적 세포 상의 항원에 대한 특이성을 갖는 TcR을 발현하도록 변형된 NK 세포를 제공한다.
바람직한 구현예에서, TcR은 고친화도로 표적 세포의 표면상 항원에 결합한다 (즉 TcR은 고친화도 TcR이다). 그와 같은 유리한 구현예에서, TcR은 TcR을 발현하는 세포가 각각 세포독성 또는 헬퍼 T 세포에서 TcR의 활성화를 위해 전형적으로 요구된 CD8/CD4 공동수용체의 부재에서 활성화를 당할 수 있는 충분히 고친화도로 표적 세포의 표면상의 MHC-항원 복합체에 결합할 수 있다. 따라서 본 발명은 CD3를 발현하도록 변형되고 추가로 표적 세포 상의 항원에 대한 특이성을 갖는 TcR을 발현하도록 변형된 NK 세포를 제공하고, 여기서 상기 TcR은 고친화도로 상기 표적 세포에 결합하고 그리고 CD8 및/또는 CD4 공동수용체의 부재에서 활성화한다. 대안적으로 표현하면, 본 발명에 따라 NK 세포안으로 도입된 TcR은 독립적인 보조-수용체 (또는 보조인자)이다; 즉 이것은 활성화되는 세포에 대한 (즉 일어나는 TcR 결합에 의해 유도된 세포에 대한) 추가의 수용체 또는 보조인자를 요하지 않는다. 따라서 TcR은 정상 생리적 범위내에서 koff로 항원 (MHC-항원 복합체)에 결합할 수 있다. 특히 이것은 CD8- 및/또는 CD4-독립적, 예를 들면 CD8-독립적, 그리고 더 상세하게는 CD4 및 CD8-독립적이다. 그러나, 대안적인 구현예에서 NK 세포는 CD4 및/또는 CD8를 발현하도록 추가로 변형될 수 있다.
TcR은 MHC 부류-I 또는 -II 계열의 단백질에 의해 세포 표면에 제시된 항원 (펩티드)을 인식하고 결합한다. 항원의 인식은 따라서 세포 및 펩티드의 MHC-유형 (더 특이적으로 펩티드의 서열)(항원) 양자에 좌우된다. 일반적으로 말하면, 표적 항원은 공지되고 TcR은 그것의 항원 특이성에 따라 선택된다. 바람직한 구현예에서, 표적 세포에 의해 제시된 펩티드 항원의 서열은 공지될 수 있다. 추가로, 표적 세포의 MHC-유형 또한 공지될 수 있다. 따라서 바람직한 구현예에서, 특이적으로 표적 세포의 표면 상의 항원-MHC 복합체에 결합할 수 있는 TcR이 선택될 수 있다. 따라서 바람직한 구현예에서 본 발명은 CD3를 발현하도록 변형되고 추가로 표적 세포 상의 항원에 대한 특이성을 갖는 TcR을 발현하도록 변형된 NK 세포를 제공하고, 여기서 상기 TcR은 특이적으로 표적 세포의 표면 상의 항원-MHC 복합체에 결합할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구현예에서, TcR은 표적 세포 또는 헬퍼 T-세포에 대한 세포독성을 나타내는 것으로 특이적으로 식별된 세포독성 T-세포로부터 선택될 수 있다. 대안적으로, 그와 같은 TcR, 또는 그것의 단편의 항원-인식 도메인 또는 서열이 선택될 수 있다. 상기 T-세포는 치료의 대상체가 될 환자로부터 수득될 수 있거나, 제2 대상체 (즉 TcR 공여체)로부터 수득될 수 있다. 따라서, TcR은 표적 세포에 대해 "입증된" 활성을 갖는 것으로 식별된 T-세포로부터 선택될 수 있다. 환언하면, 표적 세포에 대해 유효한 것으로 나타난 TcR이 선택될 수 있다. 예로써, T-세포, 예를 들면 종양-침윤 림프구는 암 환자로부터 단리될 수 있다. 그것의 특성에 의해 이들은 환자의 암에 대해 활성인 T-세포이거나 이를 포함할 것이다. 이러한 세포의 TcR을 암호화하는 유전자가 식별 및 클로닝될 수 있고, 그리고 본 발명에 따른 NK 세포에 TcR, 또는 그와 같은 TcR, 또는 그것의 단편의 항원-인식 도메인 또는 서열을 발현하도록 사용될 수 있다. T-세포는 백신접종에 의해 예를 들면 암 항원을 포함하는 백신의 투여에 의해 환자 또는 대상체에서 생산될 수 있다. 대상체에서 암에 대해 또는 암 세포에 대해 대부분 활성인 백신접종에 의해 유도된 이들 T-세포가 그런 다음 선택될 수 있다. 그와 같은 방식으로 가장 강력한 또는 유효한 TcR, 예를 들면 최고 친화도를 갖거나 또는 보조-수용체 독립적인 TcR이 선택될 수 있다. 최적의 TcR을 얻기 위해 친화도 성숙이 착수되어 질 수 있다.
유익하게는, TcR is 유도된 대상체 (TcR 공여체)의 HLA 프로파일 또는 MHC 프로파일은 치료되는 대상체의 HLA 프로파일 또는 MHC와 동일할 것이다. 전술한 바와 같이, 표적 세포에 대한 특이성을 갖는 T-세포 내 TcR이 확일될 수 있고 특징되어 질 수 있으며, 그리고 TcR의 아미노산 서열 및 TcR을 암호화하는 유전자의 핵산 서열이 얻어질 수 있다. 또 다른 방식으로, 표적 세포 상의 특정한 항원에 대한 특이성을 갖는 TcR을 포함하는 세포독성 T-세포 또는 헬퍼 T-세포가 대상체에서 식별될 수 있고, 수용체의 아미노산 서열 및 수용체를 암호화하는 유전자의 DNA 서열이 수득될 수 있다. DNA 서열 또는 유전자는 그 TcR이 숙주 (즉 수령체) NK 세포에서 발현되도록 NK 세포 안으로 도입을 위한 핵산 분자 또는 작제물을 제조하기 위해 사용될 수 있다.
본 발명의 대안적인 구현예에서, 인공 TcR (즉 세포독성 또는 헬퍼 T-세포로부터 식별되지 않은 TcR)이 사용될 수 있다. TcR은 인공적으로-생성된 동종-반응성 TcR일 수 있다. TcR의 결합 도메인은 파아지 디스플레이 또는 리보솜 디스플레이와 같은 조합-기반 방법에 의해 생성될 수 있고, 특정한 항원 및 MHC (예를 들면 HLA) 조합에 특이적인 인공 결합 도메인을 포함하는 키메라성 단백질이 수득될 수 있다.
TcR은 작제물, 또는 다른 단백질 도메인을 포함하는 융합체로서 제공될 수 있다.
CD3 쇄 중 하나 이상 (또는 전체 CD3 작제물)은 TcR을 갖는 융합 단백질로 발현될 수 있다. 환언하면, CD3 쇄 중 하나 이상은 TcR과 같은 폴리펩티드 쇄에 존재할 수 있다. 바람직한 구현예에서, CD3 분자, 또는 CD3 쇄 중 하나 이상 (예를 들면 CD3γ 쇄, CD3δ 쇄, CD3ζ 쇄, 또는 CD3ε 쇄, 또는 이들의 임의의 조합)은, 즉 (융합 작제물이 예를 들면 CD3 쇄에 의해 제공된 막투과성 도메인을 보유하는 한 추가의 CD3 분자가 또한 세포에 존재되어 질 필요없이 원형질막에 직접적으로 표적화될 TcR-CD3 융합 작제물로 존재할 수 있다 (문헌 [Willemsen RM 2000 Gene Therapy 7:1369-1377]). 따라서 그와 같은 구현예에서 세포는 동일한 작제물 또는 융합체의 일부로서 동시에 CD3 및 TcR을 발현하도록 변형될 수 있다. 비록 CD3가 개별적으로 발현되는 것이 필요하지 않을 수 있지만, 이것은 그럼에도 불구하고, 예를 들면 신호전달을 개선하고 따라서 세포 활성을 개선하기 위해 제공될 수 있다.
전술한 바와 같이, 패널 내 각 TcR이 특정한 항원-MHC 복합체에 대한 (예를 들면 특정한 친화도에 대해) 특이성을 갖는, 상이한 TcR의 패널이 개발될 수 있다. 따라서, 상이한 표적 항원이 인식될 수 있고, 및/또는 표적 항원 상 상이한 에피토프, 및/또는 TcR이 항원에 대한 상이한 친화도 및/또는 선택성을 가질 수 있다. 추가로, 주어진 표적 항원에 대해, 패널은 상이한 MHC 특이성 (또는 MHC 유형)을 포함할 수 있다. 이런 식으로, 특정 항원-HLA 복합체에 결합할 수 있는 특정한 TcR은 본 발명의 방법에 사용하기 위한 패널, 즉 대상체의 표적 항원 및 MHC-유형 양자에 매칭하는 TcR로부터 선택될 수 있다. 따라서, 특히 바람직한 구현예에서, 특정 TcR은 특정한 표적 세포에 의해 제시된 항원, 및 그것의 MHC (예를 들면 HLA) 유형의 특성에 기반하여 선택될 수 있다. 그와 같은 패널은 표적 세포에 대한 특이적 세포독성 활성을 갖는 NK 세포의 빠른 생성을 가능하도록하기 위해 사용될 수 있다고 기대된다. 따라서, 표적 세포에 대한 특이성을 갖는 NK 세포를 생산하기 위한 본 발명의 방법은 하기를 포함할 수 있다:
a) CD3를 발현하도록 NK 세포를 변형하는 것;
b) 상기 표적 세포의 MHC 프로파일 및 상기 표적 세포에 의해 표시된 항원의 동일성을 결정하는 것; 및
c) 상기 NK 세포가 TcR을 발현하도록 변형하는 것, 여기서 상기 TcR은 상이한 항원 및/또는 MHC-유형에 대한 특이성을 갖는 각 TcR의 패널로부터 선택되고 그리고 여기서 상기 TcR은 상기 표적 세포 상에 표시된 MHC 및 항원에 대해 특이성을 가진다.
TcR은 TcR을 암호화하는 뉴클레오티드 서열을 포함하는 핵산 분자의 형태로 패널에 제공될 수 있다. 편리하게, 핵산 분자는 벡터 또는 작제물, 특히 NK 세포 안으로 직접적으로 도입에 대해 적합한 벡터 또는 작제물 내에 포함되어 질 수 있다. 핵산 분자는 DNA 또는 RNA일 수 있다. 예를 들어 TcR은 mRNA 또는 바이러스 벡터, 예를 들면 레트로바이러스 벡터로 제공될 수 있다.
일 구현예에서, NK 세포는 본 세포가 CD3를 발현하도록 변형된 후 TcR을 발현하도록 변형된다. 따라서, 전술한 바와 같이, 보편적인 NK 세포는 비-면역원성 NK 세포를 CD3를 발현하도록 변형함에 의해 제조될 수 있다. 이러한 변형된 NK 세포는 배양물에서 성장 및 유지될 수 있거나 또는 미래의 사용을 위해 보관될 수 있다. 따라서, 일 구현예에서 세포는 TcR을 발현하도록 세포를 변형하기 전에 CD3를 발현하는 NK 세포의 집단을 생산하도록 복제될 수 있다. NK 세포는 배양물에서 성장될 수 있거나 증식될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 세포는 CD3 및 TcR을 동시에 또는 실질적으로 동시에 발현하도록 변형될 수 있다고 고려된다. 일 구현예에서, CD3 및 TcR 양자에 대한 유전자를 포함하는 단일 벡터 또는 작제물은 세포가 CD3 및 TcR 모두를 발현하도록 변형시켜기 위해 사용될 수 있으며, 다른 구현예에서 별도의 벡터가 또한 사용될 수 있다. 상기에 논의된 바와 같이, 단일 폴리펩티드 분자에 TcR 및 CD3 작용기 양자를 포함하는 융합 단백질이 또한 NK 세포에서 발현될 수 있으며, 따라서 그와 같은 융합 단백질을 암호화하는 벡터 또는 작제물이 세포를 변형시기 위해 사용될 수 있다. CD3 및 TcR 양자를 발현하도록 변형된 NK 세포는 대상체에 세포를 도입하기 전에 복제될 수 있고, 예를 들면 배양물에 성장될 수 있거나 또는 증식될 수 있다. 따라서 본 발명의 일 구현예에서, CD3를 발현하는 NK 세포의 집단이 생성될 수 있고, 및 NK:CD3 세포의 하위-집단이 표적 세포의 표면 상 항원에 특이성을 갖는 TcR을 발현하도록 변형될 수 있다.
본 발명의 변형된 NK 세포는 또한, 예를 들면 세포 기능 또는 거동의 다른 측면을 변경 또는 변형시키기 위해 및/또는 다른 단백질을 발현시키기 위해, 다른 방식으로 변형될 수 있다. 예를 들면, 세포는 신체의 특정한 조직 또는 위치에 대해 세포의 위치화를 표적하거나 개선하기 위해 작용하는, 귀소 수용체 또는 위치화 수용체를 발현하도록 변형될 수 있다. 세포는 또한 NK 세포에 의해 나타난 세포독성 반응을 향상시키기 위해 T-세포 신호전달 경로의 성분 중 하나 이상을 발현하도록 변형될 수 있다. 임의의 이러한 변형은 본 발명에 따른 변형 이전, 이후 또는 동시에 일어날 수 있다.
본 발명의 세포는 생체내 및/또는 시험관내에서 복제하는 그것의 능력을 변경하도록 변형될 수 있다. 일 구현예에서, 세포의 복제 능력 (세포가 복제 즉, 증식하는 능력)이 향상될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 이것은 사이토카인, 예컨대 IL-2의 향상된 발현을 가지도록 세포를 변형함으로써 달성될 수 있다. IL-2는 NK 세포가 세포용해 기능을 신장하고 유지하기 위해서 일반적으로 요구되고, 따라서 IL-2를 발현하는 세포는 성장 배지에서 보강되고 대상체에 도입시 세포독성 활성을 유지하는 추가의 IL-2를 요하지 않는다. 사이토카인의 발현은 세포 내로 사이토카인을 암호화하는 핵산 분자를 포함하는 이종성 (비-천연) 벡터 또는 작제물을 도입함에 의해 향상될 수 있거나, 또는 대안적으로 사이토카인을 암호화하는 내인성 유전자의 발현이 향상될 수 있다. 사이토카인의 발현은 구성적일 수 있거나 (즉, 사이토카인을 암호화하는 유전자의 발현을 조절하는 프로모터는 구성적으로 활성이거나 '온'일 수 있음), 또는 외부 자극에 의해 유도성일 수 있다.
일 구현예에서 세포는 세포가 CD3 및/또는 TcR을 발현하도록 변형되기 전에 향상된 복제 능력을 가지도록 변형될 수 있다. 또 다른 구현예에서, 세포는 세포가 CD3 및/또는 TcR을 발현하도록 변형된 후에 향상된 복제 능력을 가지도록 변형될 수 있다. 대안적인 구현예에서, 세포는 세포가 CD3를 발현하도록 변형된 후이지만 세포가 TcR을 발현하도록 변형되기 전에 향상된 복제 능력을 가지도록 변형될 수 있다 (즉, 세포가 TcR을 발현하도록 변형하기 전에 CD3를 발현하는 NK 세포의 큰 집단을 생성하는 것이 따라서 가능할 수 있다). 대안적으로, 상기 변형 중 임의의 들 이상이 실질적으로 동일한 시간에 수행될 수 있다. 일 구현예에서, 세 가지 변형 모두가 실질적으로 동일한 시간에 수행될 수 있다.
본 발명의 NK 세포의 증식성 수용력 및 생존력 (생존)은 또한 세포가 환자에 도입되기 전에 감소될 수 있다. 전술한 바와 같이, 이것은 세포 비-면역원성을 부여하도록 수행될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 세포의 복제 능력 및/또는 생존력은 조사에 의해 감소될 수 있다. 복제하는 세포의 능력 및/또는 그것의 생존력은 세포에 공급된 조사의 용량 및 특성에 의존하여 줄어들거나 (즉 복제는 보다 서서히 발생할 수 있음) 또는 제거될 수 있다. 방사선은 α, β 또는 γ 방사선 중 임의의 공급원으로부터 될 수 있거나, 또는 X-선 방사선 또는 자외선 광일 수 있다. 5-10 Gy의 방사선량이 증식을 무력화하는데 충분할 수 있으나, 다른 적합한 방사선량은 1-10, 2-10, 3-10, 4-10, 6-10, 7-10, 8-10 또는 9-10 Gy, 또는 보다 높은 용량 예컨대 11, 12, 13, 14, 15 또는 20 Gy일 수 있다. 대안적으로, NK 세포는 세포가 유도적으로 사멸되거나 외부 자극에 반응하여 복제되는 것을 방지할 수 있는 '자살 유전자'를 발현하도록 변형될 수 있다.
세포는 A) 향상된 복제 능력을 가지도록 그리고 B) 감소된 복제 능력 및/또는 생존력을 가지도록 변형될 수 있다. 두 가지 변형이 임의의 순서 (즉, A 그런 다음 B 또는 B 그런 다음 A)로 순차적으로 수행될 수 있거나, 본질적으로 동일한 시간 (A 및 B 함께)에 수행될 수 있다. 그와 같은 구현예에서, 세포는 CD3 및/또는 TcR을 발현하도록 세포를 변형하기 전, 동시에 또는 후에 시험관내에서 세포의 성장을 강화시키기 위해 사이토카인 (예컨대 IL-2)을 발현하도록 변형될 수 있고, 그리고 그 뒤에 대상체에 세포를 도입하기 전에 그것의 복제 능력 및/또는 생존력을 감소시키도록 변형될 수 있다.
상기로부터 본 발명의 세포는 하나 이상의 유전자의 발현 수준을 변경시키거나 특히 세포에 의해 정상적으로 발현되지 않는 하나 이상의 유전자의 발현을 가능하게 하도록 변형될 수 있음이 명백할 것이다. 이러한 이종성 유전자 발현을 가능하게 하기 위해, 문제의 유전자에 상응하거나 또는 이를 포함하는 핵산 분자가 세포 내로 도입된다. 편리하게 핵산 분자는 벡터 또는 재조합 작제물로 세포 내로 도입될 수 있다. 이종성 유전자 발현 방법은 작제물/벡터 제조의 관점에서 그리고 세포 내로 핵산 분자 (벡터 또는 작제물)를 도입하는 관점 양자에서 당해 기술에 공지되어 있다. 따라서, 포유동물 세포, 특히 림프양 세포 또는 NK 세포, 및 적절한 벡터 등 (예를 들면, 바이러스 벡터)과 함께 사용하기에 적합한 프로모터 및/또는 다른 발현 조절 서열은 당해 기술에 잘 알려져 있다.
벡터 또는 작제물 (핵산 분자)은 화학 형질감염 제제 (예컨대 인산칼슘, 분지형 유기 화합물, 리포좀 또는 양이온성 폴리머), 전기천공, 세포 스퀴징, 초음파천공, 광학적 형질감염, 유체역학적 전달, 또는 바이러스 형질도입을 포함하는 다양한 수단에 의해 본 발명의 세포에 도입될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 벡터 또는 작제물은 바이러스 형질도입에 의해 도입된다. 세포 안으로 도입된 이종성 핵산 분자는 에피솜 상태로 발현될 수 있거나, 또는 적합한 유전자좌에서 세포의 게놈 안으로 통합될 수 있다.
NK 세포에 적합한 세포 배양 방법 및 시약은 또한 당해 기술에서 잘 알려져 있다. 선택 및 편리성 등에 따라 임의의 원하는 세포 배양의 방법이 사용될 수 있다. 예를 들면, 테플론 백이 대규모 배양 또는 자동화된 세포 배양 시스템에 사용될 수 있다.
본 발명의 표적 세포는 암 세포일 수 있다. 암은 악성, 예비-악성 또는 비-악성 여부를 불문하고 임의의 신생물성 병태를 포함하도록 본 명세서에서 광범위하게 정의된다. 그러나 일반적으로 이것은 악성 병태일 수 있다. 고형 및 비-고형 종양 양자가 포함되고, 용어 "암 세포"는 "종양 세포"와 동의어로 간주될 수 있다.
고형 및 조혈 암을 포함하는 임의의 유형의 암이 포함된다. 대표적인 암은 급성 림프아구성 백혈병 (ALL), 급성 골수 백혈병 (AML), 부신피질 암종, 에이즈-관련된 암 (예를 들면 카포시 육종 및 림프종), 항문암, 맹장암, 별아교세포종, 비정형 기형/횡문근양 종양, 기저 세포 암종, 담도암, 간외 방광암, 골 암 (예를 들면 유잉 육종, 골육종 및 악성 섬유질 조직구종), 뇌간 신경아교종, 뇌암, 유방암, 기관지 종양, 버킷 림프종, 카르시노이드 종양, 심장 (심장) 종양, 중추신경계의 암 (비정형 기형/횡문근양 종양, 배아 종양, 생식세포 종양, 림프종을 포함함), 자궁경부암, 척색종, 만성적 림프구성 백혈병 (CLL), 만성 골수성 백혈병 (CML), 만성 골수증식성 장애, 결장암, 결장직장암, 두개인두종, 피부 T-세포 림프종, 담도암, 관상피내암종 (DCIS), 배아 종양, 자궁내막 암, 뇌실막세포종, 식도암, 비강신경교세포종, 유잉 육종, 두개외 생식세포 종양, 고환외 생식세포 종양, 간외 담도암, 안암 (안구내 흑색종 및 망막모세포종을 포함함), 골의 섬유질 조직구종, 담낭암, 위 (위장) 암, 위장 카르시노이드 종양, 위장 기질 종양 (GIST), 생식세포 종양, 임신성 융모성 질환, 신경아교종, 모발 세포 백혈병, 두경부 암, 심장 암, 간세포 (간) 암, 조직구증, 랑게르한스 세포, 호지킨 림프종, 하인두 암, 안구내 흑색종, 소도세포 종양, 췌장 신경내분비 종양, 카포시 육종, 신장암 (신장 세포 및 윌름스 종양을 포함함), 랑게르한스 세포 조직구증, 후두 암, 백혈병 (급성 림프아구성 (ALL), 급성 골수 (AML), 만성적 림프구성 (CLL), 만성 골수성 (CML)을 포함함, 입술 및 구강 암, 간암 (1차), 소엽 동일계내 암종 (LCIS), 폐암, 림프종, 거대글로불린혈증, 왈덴스트롬, 흑색종, 머켈 세포 암종, 중피종, 잠복 원발이 있는 전이성 편평상피 목 암, 정중선 관 암종 함유 NUT 유전자, 입 암, 다중 내분비 신조직형성 증후군, 소아기, 다발성 골수종/형질 세포 신생물, 균상식육종, 골수이형성 증후군, 골수이형성/골수증식성 신생물, 다발성 골수종, 골수증식성 장애, 비강 및 부비동 암, 비인두 암, 신경교세포종, 비-호지킨 림프종, 비-소세포 폐암, 구강암, 구강 암, 구강인두 암, 골육종, 난소암, 췌장암, 췌장 신경내분비 종양 (소도세포 종양), 유두종증, 부신경절종, 부비동 및 비강 암, 부신경절종, 음경암, 인두 암, 크롬친화세포종, 뇌하수체 종양, 형질 세포 신생물/다발성 골수종, 흉막폐 모세포종, 임신 및 유방암, 1차 중추신경계 (CNS) 림프종, 전립선암, 결장직장암, 신장 세포 (신장) 암, 신장 골반 및 요관, 이행 세포 암, 망막모세포종, 횡문근육종, 타액샘 암, 육종, 세자리 증후군, 피부암, 소세포 폐암, 작은 창자 암, 연조직 육종, 편평상피 세포 암종, 잠복 원발이 있는 편평상피 목 암, 전이성, 위 (위장) 암, T-세포 림프종, 고환암, 인후두암, 흉선종 및 흉선 암종, 갑상선암, 신장 골반 및 요관의 이행 세포 암, 요도 암, 자궁 암, 자궁내막, 자궁 육종, 질암, 외음부암, 발덴스트롬 거대글로불린혈증, 및 윌름스 종양을 포함한다
전술한 바와 같이, 수많은 암이 특정한 또는 특이적 암 항원을 발현하거나 특정한 또는 특이적 암 항원의 발현에 의해 특징되는 것으로 식별되었다. 따라서, 공지되거나 인식된 암 항원이 사용될 수 있다. 당해 기술에 공지된 바와 같이, 특정 항원은 수많은 상이한 암 유형에서 발생할 수 있고, 다른 것은 특정한 암 유형에 대해 특이적일 수 있다. 그러나, 다른 사례에서 대상체에서 암을 특정화하고 사용에 적합한 암 항원을 식별하는 것이 적절하거나 필요할 수 있다. 따라서 임의의 암은 보편적인 암 항원에 대해 지향된 TcR을 사용하여 치료될 수 있으며 그러한 TcR이 식별되었다. 대안적으로, 암은 현재 입양 T-세포 요법에 의해 치료되거나 치료를 위해 제안된 임의의 암, 예를 들면 일반 암 예컨대 흑색종, 혈액학적 암, 폐암, 결장직장암일 수 있다. 더욱 대안적으로, 암은 (예를 들면 고아 약물 상태가 있는) 현재 이용가능한 치료 선택이 거의 없는 희귀 암, 예컨대 예를 들면 췌장암 또는 육종일 수 있다.
다른 구현예에서 표적 세포는 감염된 세포, 및 특히 바이러스로 감염된 세포일 수 있다. 바이러스는 임의의 바이러스일 수 있으나, 일반적으로 병원성 바이러스일 것이다. 예로써, 바이러스는 HIV, 간염 바이러스 (예를 들면 HBV 또는 HCV), HPV, CMV 또는 EBV, HHV-8, HTLV-1, SV40, 엔테로바이러스일 수 있다. 다른 가능한 감염제 또는 병원체는 또한 박테리아, 예를 들면 헬리코박터 파일로리, 클라미디아 뉴모니애, 및 기생충 예를 들면 주혈흡충 및 간 흡충, 타이 간흡충, 클로노르키스 시넨시스 및 말라리아를 포함한다.
본 발명의 일 구현예에서 세포는 정맥내로 직접적으로 대상체에 투여될 수 있다. 대안적인 구현예에서 세포는 종양내로 주입을 통해 종양 안으로 직접적으로 투여될 수 있다.
대상체에 투여된 세포의 용량은 표적 세포의 특성에 따라 달라질 것이다. 표적 세포가 암 세포인 본 발명의 바람직한 구현예에서, 용량은 표적화되는 암의 유형에 기초하여 산출될 수 있다. 바람직한 구현예에서, 대략 109 세포의 용량이 대상체에게 투여될 수 있지만, 그러나 이것은 암의 유형 및 정도에 따라 변할 수 있다. 대략 106, 107, 또는 108 세포의 용량이 투여될 수 있는 것이 가능하다. 대안적으로, 대략 1010, 1011 또는 1012 세포의 보다 높은 용량이 투여될 수 있다. 투여된 세포의 용량은 또한 환자의 신체 사이즈에 의존하여 변할 수 있고 따라서 105, 106, 107, 108, 109, 1010, 1011 또는 1012 세포의 용량이 환자의 체표면적의 ㎡ 당 또는 환자의 체중의 kg 당 투여될 수 있다.
효과적으로 대상체를 치료하기 위해 다중 주입이 요구될 수 있다는 것이 또한 기대된다. 예를 들면, 2, 3, 4, 5, 6 또는 그 이상의 별도의 주입이 24 또는 48시간, 또는 매 3, 4, 5, 6 또는 7일의 간격으로 환자에게 투여될 수 있다. 주입은 또한 매주, 격주로 또는 매달 간격, 또는 6주 또는 2, 3, 4, 5, 또는 6개월의 간격으로 이격될 수 있다. 매년 주입이 투여될 수 있다는 것이 또한 가능하다.
본 발명의 방법 및 세포를 사용하여 치료되는 대상체는 포유동물의 임의의 종일 수 있다. 예를 들면, 대상체는 가정용 애완동물, 예컨대 마우스, 랫트, 게르빌, 토끼, 기니아 피그, 햄스터, 고양이 또는 개, 또는 가축, 예컨대 염소, 양, 돼지, 소 또는 말의 임의의 종일 수 있다. 본 발명의 추가의 바람직한 구현예에서 대상체는 영장류, 예컨대 원숭이, 긴팔 원숭이, 고릴라, 오랑우탄, 침팬지 또는 보노보일 수 있다. 그러나, 본 발명의 바람직한 구현예에서 대상체는 인간이다.
본 발명에서 사용하기 위한 NK 세포는 임의의 포유동물의 종으로부터 수득될 수 있다는 것이 고려되지만, 그러나, 바람직한 구현예에서 NK 세포는 치료되는 대상체와 동일한 포유동물의 종으로부터의 것일 것이다. 더욱이, 그리고 전술한 바와 같이, 바람직한 구현예에서, 세포는 포유동물의 동일한 종으로부터 단백질을 발현하는 유전자를 사용하여 변형될 것이다 (예를 들면 인간 CD3 및 TcR이 인간 대상체에 대해 사용될 것이다). 그러나 상이한 종으로부터의 CD3 및 TcR이 또한 사용될 수 있으며, 예를 들면 세포는 마우스 CD3 및 인간 TcR을 발현하는 유전자를 사용하여 변형될 수 있다는 것이 가능하다.
본 발명은 하기 실시예로부터 그리고 도면을 참조로 보다 완전하게 이해될 수 있고, 여기서:
도 1은 CD3가 NK-92 세포에서 발현될 수 있다는 것을 도시한다. CD3-IRES-GFP 레트로바이러스 작제물은 NK-92 세포 안으로 형질도입되었다. 형광은 FITC 채널에서 모니터링되었다. GFP+ 세포는 표지된 영역에 제시된다. 흑색: 비 형질감염된 세포, 회색: 형질감염된 세포.
도 2는 CD3가 TcR의 존재에서 CD3-IRES-GFP를 발현하는 NK-92 세포의 표면에서 검출될 수 있다는 것을 도시한다. GFP+ 분류된 NK-92 (NK-92-CD3)는 네 개의 상이한 TcR, 즉 라듐-1 (TGFbRII 프레임 이동 특이성, MHC-I) 및 시스테인 변이체, 라듐-1cys, DMF-5(MART-1 특이성, MHC-I), 라듐-3 (hTERT 특이성, MHC-II)으로 중복감염되고 그리고 중복감염되지 않은 세포가 대조군으로서 수행되었다. 세포는 세포 표면에서 CD3를 검출하기 위해 항-CD3로 염색되고, 형광은 FITC (GFP) 및 APC (항-CD3) 채널에서 측정되었다. 최상부 우측 사분면에서의 세포가 세포 표면에서 CD3를 발현한다.
도 3은 라듐-1 및 DMF-5 TcR이 CD3-GFP를 발현하는 NK-92 세포의 표면에서 특이적으로 검출될 수 있다는 것을 도시한다. 세포는 CD3 및 2개의 상이한 TcR: 라듐-1 (TGFbRII 프레임 이동), DMF-5 (MART-1), 및 CD3 단독 (NoTcR)을 발현하도록 형질감염되었다. 세포는 라듐-1의 V-베타 쇄 (DMF5가 아님, 상부 열)을 검출할 수 있는 V-베타 특이성 항체 또는 세포 표면에서 DMF-5 TcR (하부 열)을 검출하는 MART-1 다량체로 염색되었다. 형광은 FITC (GFP) 및 APC (항-Vb 및 M1-다량체) 채널에서 측정되었다.
도 4는 CD3 및 라듐-1 TcR을 발현하도록 변형된 NK-92 세포가 항원-특이적 세포독성 활성을 나타내는 것을 도시한다. CD3-IRES-GFP로 형질감염된 NK-92 세포 (GFP+-상부 박스-CD3_IRES_GFP) 및 형질감염되지 않은 세포 (GFP- -하부 박스-NTr)가 2개의 별개의 집단으로 게이팅되었다. NK 세포는 TGFbRII 표적 펩티드, 및 무관한 펩티드 또는 단독으로 단일 쇄 삼량체를 발현하는 SupT1 세포로 배양되었다. SupT1 세포는 NK 세포 마커 CD56의 발현을 검출함에 의해 NK 세포로부터 분리되었다. 탈과립화는 GFP+ 및 GFP- 집단에서 SupT1 세포로 항온처리 후 NK 세포 내 CD107 마커의 검출로 모니터링하고 그리고 함께 그래프로 그렸다 (히스토그램, 회색: GFP-, 점선: GFP+).
도 5는 DMF5 또는 라듐-1 TcR으로 중복감염되고 분류된 NK-92 세포 CD3의 순수한 집단이 관련된 펩티드로 장입된 T2 세포에 의해 특이적으로 활성화되었다는 것을 도시한다. 상부: 게이팅 전략: CD3 신호 및 GFP는 두 세포주를 분리하기 위해 사용되었다. 그런 다음 CD3+ 집단은 CD107a 발현 (탈과립화)에 대해 시험되었다. 히스토그램: 제시된 NK-92-CD3-TcR은 1 μM의 펩티드로 O/N 장입된 T2 세포로 항온처리되었다 (회색 음영: 펩티드 무, 어두운 회색 윤곽: MART-1, 밝은 회색 윤곽: TGFbRII).
도 6은 라듐-1 및 DMF-5 TcR에 대한 EC50 값의 산출을 도시한다.
도 7은 α-CD3 및 α-CD28 항체와 접촉에 의한 NK-92(CD3/라듐-1) 세포의 활성화의 포스포-유세포측정 분석의 결과를 도시한다. 유세포측정 스펙트럼의 우측-전환은, 이어서 TCR 복합체의 활성화를 나타내는 관련 단백질의 인산화의 증가된 수준을 나타낸다.
도 8은 NK-92(CD3/라듐-1) 및 NK92(CD3/DMF-5) 세포의 자극의 특이성을 도시한다. NK-92 세포는 각 수용체에 대한 특이적 동족 펩티드 (라듐-1을 발현하는 세포에 대해 TGFbRII, DMF-5를 발현하는 세포에 대해 MART-1) 또는 랜덤 펩티드 중 하나를 제시하는 항원-제시 세포로 항온처리되었다. TCR 복합체를 통한 신호전달의 자극은 다양한 TcR/CD3-관련된 단백질의 인산화의 수준에 따라 다양한 시점에서 측정되었다. 이들 인산화 수준은 포스포-유세포측정에 의해 측정되었다. 각 그래프에서, 연속선은 특이적인 동족 펩티드에 의한 세포의 활성화를 정의한다; 점선은 랜덤 펩티드에 의한 세포의 활성화를 정의한다.
도 9는 라듐-5 또는 라듐-6 TcR 중 어느 하나로 형질도입된 NK-92(CD3) 세포의 자극의 동력학을 도시한다. 이들 수용체 양자는 CD4+ T 세포로부터 유도되고 특이적으로 TGFbRII 프레임 이동 펩티드를 결합한다; 라듐-5는 특이적으로 이것을 HLA-DR7과 관하여, 라듐-6은 HLA-DR4와 관하여 결합한다. 라듐-5 및 라듐-6에 대한 EC50 값은 공여체 환자 (환자 H, S 및 B)로부터의 조직을 사용하여 산출된다. 환자 H는 HLA-DR7 일배체형을 가지고; 환자 S 및 B는 HLA-DR4 일배체형을 가진다.
도 1은 CD3가 NK-92 세포에서 발현될 수 있다는 것을 도시한다. CD3-IRES-GFP 레트로바이러스 작제물은 NK-92 세포 안으로 형질도입되었다. 형광은 FITC 채널에서 모니터링되었다. GFP+ 세포는 표지된 영역에 제시된다. 흑색: 비 형질감염된 세포, 회색: 형질감염된 세포.
도 2는 CD3가 TcR의 존재에서 CD3-IRES-GFP를 발현하는 NK-92 세포의 표면에서 검출될 수 있다는 것을 도시한다. GFP+ 분류된 NK-92 (NK-92-CD3)는 네 개의 상이한 TcR, 즉 라듐-1 (TGFbRII 프레임 이동 특이성, MHC-I) 및 시스테인 변이체, 라듐-1cys, DMF-5(MART-1 특이성, MHC-I), 라듐-3 (hTERT 특이성, MHC-II)으로 중복감염되고 그리고 중복감염되지 않은 세포가 대조군으로서 수행되었다. 세포는 세포 표면에서 CD3를 검출하기 위해 항-CD3로 염색되고, 형광은 FITC (GFP) 및 APC (항-CD3) 채널에서 측정되었다. 최상부 우측 사분면에서의 세포가 세포 표면에서 CD3를 발현한다.
도 3은 라듐-1 및 DMF-5 TcR이 CD3-GFP를 발현하는 NK-92 세포의 표면에서 특이적으로 검출될 수 있다는 것을 도시한다. 세포는 CD3 및 2개의 상이한 TcR: 라듐-1 (TGFbRII 프레임 이동), DMF-5 (MART-1), 및 CD3 단독 (NoTcR)을 발현하도록 형질감염되었다. 세포는 라듐-1의 V-베타 쇄 (DMF5가 아님, 상부 열)을 검출할 수 있는 V-베타 특이성 항체 또는 세포 표면에서 DMF-5 TcR (하부 열)을 검출하는 MART-1 다량체로 염색되었다. 형광은 FITC (GFP) 및 APC (항-Vb 및 M1-다량체) 채널에서 측정되었다.
도 4는 CD3 및 라듐-1 TcR을 발현하도록 변형된 NK-92 세포가 항원-특이적 세포독성 활성을 나타내는 것을 도시한다. CD3-IRES-GFP로 형질감염된 NK-92 세포 (GFP+-상부 박스-CD3_IRES_GFP) 및 형질감염되지 않은 세포 (GFP- -하부 박스-NTr)가 2개의 별개의 집단으로 게이팅되었다. NK 세포는 TGFbRII 표적 펩티드, 및 무관한 펩티드 또는 단독으로 단일 쇄 삼량체를 발현하는 SupT1 세포로 배양되었다. SupT1 세포는 NK 세포 마커 CD56의 발현을 검출함에 의해 NK 세포로부터 분리되었다. 탈과립화는 GFP+ 및 GFP- 집단에서 SupT1 세포로 항온처리 후 NK 세포 내 CD107 마커의 검출로 모니터링하고 그리고 함께 그래프로 그렸다 (히스토그램, 회색: GFP-, 점선: GFP+).
도 5는 DMF5 또는 라듐-1 TcR으로 중복감염되고 분류된 NK-92 세포 CD3의 순수한 집단이 관련된 펩티드로 장입된 T2 세포에 의해 특이적으로 활성화되었다는 것을 도시한다. 상부: 게이팅 전략: CD3 신호 및 GFP는 두 세포주를 분리하기 위해 사용되었다. 그런 다음 CD3+ 집단은 CD107a 발현 (탈과립화)에 대해 시험되었다. 히스토그램: 제시된 NK-92-CD3-TcR은 1 μM의 펩티드로 O/N 장입된 T2 세포로 항온처리되었다 (회색 음영: 펩티드 무, 어두운 회색 윤곽: MART-1, 밝은 회색 윤곽: TGFbRII).
도 6은 라듐-1 및 DMF-5 TcR에 대한 EC50 값의 산출을 도시한다.
도 7은 α-CD3 및 α-CD28 항체와 접촉에 의한 NK-92(CD3/라듐-1) 세포의 활성화의 포스포-유세포측정 분석의 결과를 도시한다. 유세포측정 스펙트럼의 우측-전환은, 이어서 TCR 복합체의 활성화를 나타내는 관련 단백질의 인산화의 증가된 수준을 나타낸다.
도 8은 NK-92(CD3/라듐-1) 및 NK92(CD3/DMF-5) 세포의 자극의 특이성을 도시한다. NK-92 세포는 각 수용체에 대한 특이적 동족 펩티드 (라듐-1을 발현하는 세포에 대해 TGFbRII, DMF-5를 발현하는 세포에 대해 MART-1) 또는 랜덤 펩티드 중 하나를 제시하는 항원-제시 세포로 항온처리되었다. TCR 복합체를 통한 신호전달의 자극은 다양한 TcR/CD3-관련된 단백질의 인산화의 수준에 따라 다양한 시점에서 측정되었다. 이들 인산화 수준은 포스포-유세포측정에 의해 측정되었다. 각 그래프에서, 연속선은 특이적인 동족 펩티드에 의한 세포의 활성화를 정의한다; 점선은 랜덤 펩티드에 의한 세포의 활성화를 정의한다.
도 9는 라듐-5 또는 라듐-6 TcR 중 어느 하나로 형질도입된 NK-92(CD3) 세포의 자극의 동력학을 도시한다. 이들 수용체 양자는 CD4+ T 세포로부터 유도되고 특이적으로 TGFbRII 프레임 이동 펩티드를 결합한다; 라듐-5는 특이적으로 이것을 HLA-DR7과 관하여, 라듐-6은 HLA-DR4와 관하여 결합한다. 라듐-5 및 라듐-6에 대한 EC50 값은 공여체 환자 (환자 H, S 및 B)로부터의 조직을 사용하여 산출된다. 환자 H는 HLA-DR7 일배체형을 가지고; 환자 S 및 B는 HLA-DR4 일배체형을 가진다.
실시예 1.
NK92 세포에서 CD3의 발현.
코돈-최적화된 pMP71-CD3ζ-CD3ε-CD3γ-CD3δ-IRES-GFP (CD3-GFP) 벡터 (문헌 [Ahmadi et al. 2011. Blood 118, 3528-3573])를 사용하여 CD3로 NK92 세포를 형질전환하고 세포를 레트로바이러스 형질도입을 사용하여 형질감염하였다. CD3-GFP 작제물을 함유하는 레트로바이러스가 포장 세포주 (헥-피닉그)에 생산되고 NK 세포가 연속원심분리되었다 (바이러스 상청액으로 항온처리된 0.3M 세포 및 레트로넥틴 (타나카 바이오텍) 코팅된 플레이트 상에서 32C에서 1시간 동안 900xg에서 스핀 다운됨). GFP는 성공적인 형질도입에 대한 마커로 사용되었다.
CD3로 NK-92 세포의 성공적인 형질도입 (NK-92(CD3))은 FACS 칸토 흐름 세포측정기 (BD 바이오사이언스스)를 사용하여 유세포측정에 의해 식별하였다. 형광은 SSC 및 FITC 채널에서 모니터링하고, 성공적인 형질감염은 GFP 채널에서 형광을 모니터링함으로 관측되었다 (도 1 참고). 대략 50%의 형질감염 효율이 수득되었다. 대안적으로 GFP+ 세포는 순수한 집단을 얻기 위해 분류되었다.
실시예 2.
NK-92(CD3) 세포에서 TcR의 발현
CD3 및 TcR을 공동 발현하는 NK-92(CD3) 세포의 능력을 시험하였다. CD3 및 TcR 각각은 세포 표면에 표적화되도록 TcR 복합체의 다른 구성원의 공동-발현을 요한다. 따라서 CD3 및 TcR 양자로 세포의 성공적인 공동-형질감염에 대한 마커로서 NK 세포의 표면에 CD3의 발현을 사용하는 것이 가능하였다.
NK-92(CD3) 세포는 레트로바이러스 상청액 (라듐-1cys 시스테인 변이체, 라듐-1-특이적 (TGFbRII 프레임 이동), DMF-5, MART-1 특이적 (DMF-5 (문헌 [Johnson, L. A. et al. 2006 J Immunol 177:6548-6559]) 및 라듐-3 (hTERT, MHC-II))을 사용하여 네 가지 상이한 TcR로 중복 감염되었고 세포 표면에서 CD3의 발현은 APC로 표지된 항-CD3 항체 다량체를 사용하여 각 TcR에 대해 모니터링되었다. CD3의 발현은 GFP 발현에 대해 세포를 모니터링함에 의해 검출되었다. 형광은 FITC 및 APC 채널에서 검출되었다. GFP를 발현하는 세포는 도트 플롯의 우측 영역에 나타나고, 그것의 세포 표면에서 CD3을 발현하는 세포는 도트 플롯의 상부 영역에 나타난다. CD3 및 TcR을 공동-발현하는 세포 (즉, 세포 표면에 국재화된 CD3-TcR 복합체를 갖는 세포)는 도트 플롯의 우상측 영역에 나타난다.
세포 표면에서 CD3의 발현은 각각의 TcR을 발현하도록 변형된 세포에서 검출되었다 (도 2A-D) (각 도트 플롯에서 상부-오른쪽 사분면에서의 세포). 특히, 라듐-1 TcR을 발현하도록 변형된 세포는 세포 표면에서 CD3의 발현을 보였다 도 2B. 도 2D는 또한 GFP+ 세포에 대한 APC 채널에서 형광에서의 작은 증가를 나타내어, 라듐-3 TcR의 낮은 발현 수준을 나타낸다. CD3 발현은 TcR이 없는 세포에 대해 세포 표면에서 검출되지 않았다 (도 2E).
세포 표면에서 TcR의 발현이 또한 라듐1 및 DMF-5 TcR을 발현하도록 변형된 NK-92(CD3) 세포에서도 검출되었다. 세포 표면에서 TcR의 존재는 라듐-1의 V-베타 쇄을 검출할 수 있는 V-베타 특이적 항체 또는 APC로 표지된, 세포 표면에서 DMF-5 TcR을 검출하기 위한 MART-1 다량체 (하부 열) 중 어느 하나를 사용하여 모니터링되었다. 형광은 FITC (GFP) 및 APC (항-Vb 및 M1-다량체) 채널에서 측정되었다. TcR을 발현하도록 변형되지 않은 NK-92(CD3) 세포에 대한 APC 채널에서 신호의 증가는 관찰되지 않았다 (도 3A). 라듐-1 TcR을 발현하도록 변형된 세포는 MART-1 다량체가 아닌 항-Vβ 항체로 염색될 때 APC 채널에서 신호의 증가를 나타냈다. (도 3B). DMF-5 TcR을 발현하도록 변형된 세포는 MART-1 다량체로 염색될 때 APC 채널에서 신호 증가를 나타냈다 (도 3C).
실시예 3.
TcR을 발현하는 NK-92(CD3)는 작용성임
NK 세포에서 발현될 때 본 TcR의 작용성을 검증하기 위해 NK 세포에서 발현된 TcR이 표적 세포를 특이적으로 인식할 수 있는지 여부를 시험하였다.
TcR을 발현하는 NK-92(CD3) 세포는 바른 표적 펩티드 (TGFbRII) 또는 비-특이적 펩티드 (irr)를 포함하는 단일 쇄 삼량체 (SCT) 분자를 발현하는 표적 세포와 함께 5시간 동안, 또는 표적 세포의 부재 (APC 없음)에서 항온처리되었고, 탈과립화 마커 CD107의 발현을 표적 세포에 의해 자극되는 NK 세포의 능력에 대한 마커로서 모니터링되었다. (SCT는 항원을 보여주는 MHC 부류-I 단백질을 나타내며, 단일 폴리펩티드 쇄로서 발현되는 항원 펩티드, β2-마이크로글로불린 및 h-쇄로 구성된다. US 2010/015954 및 문헌 [Yu, Y. Y.et al.(2002) J Immunol 168: 3145-3149] 참고.
NK-92(CD3) 세포는 초기에 항-CD56 Tx Red (CD56은 NK 세포에 대한 마커임) 및 TxRed로 염색되고 GFP 형광이 모니터링되었다 (도 4A). NK-92 세포의 별도의 집단은 GFP의 발현에 기반하여 관측되었다. GFP+ 세포 (상부 영역) 및 GFP- NK 세포 (하부 영역) 양자가 검출되었다. CD107a의 발현은 세포의 각 집단에 대해 모니터링되었고, GFP- 세포는 음성 대조군 (즉 비-TcR 발현 세포)으로 사용되었다.
라듐1-특이적 TcR을 발현하는 NK-92(CD3) 세포는 비-특이적 펩티드 (도 4C) 또는 라듐-1 표적 펩티드 TGFbRII (도 4D)로 단일 쇄 삼량체 (SCT) 분자를 발현하는 SupT1과 함께 항온처리되었다. 항원-제시 세포의 부재에서 항온처리된 세포가 또한 모니터링되었다 (도 4B) CD3 발현은 NK-92 세포주에 대해 모니터링되었고 그리고 세포는 상기에 개괄된 바와 같이 게이팅되었다. GFP+(점선) 및 GFP-(실선) 집단을 각 히스토그램에서 볼 수 있다.
라듐-1-특이적 TcR을 발현하는 NK-92(CD3) 세포만이 라듐-1 SCT를 발현하는 SupT1 세포와 함께 항온처리될 때 (도 4D), 실선 (GFP- 음성 대조군)과 비교될 때 점선의 오른쪽으로의 이동에 의해 제시된 바와 같이, CD107 발현에서의 증가를 보였다. 비-특이적 펩티드를 발현하는 SupT1 세포와 함께 항온처리될 때 이들 세포 (도 4C) 또는 항원 제시 세포의 부재하에 항온처리된 세포에 대한 CD107 발현의 증가는 관찰되지 않았다.
함께, 이들 데이터는 라듐-1-특이적 TcR을 발현하는 NK-92(CD3)는 라듐-1 표적 펩티드를 발현하는 표적 세포에 의해 활성화되어 질 수 있음을 나타낸다. 이것은 NK-92(CD3) 세포에서 발현된 TcR이 활성이고 작용성임을 입증한다. 따라서, TcR을 발현하는 NK-92(CD3) 세포는 표적-세포 특이적 세포독성을 갖는 것으로 나타났다.
실시예 4.
관련된 펩티드로 장입된 T2 세포에 의해 TcR을 발현하는 NK-92(CD3) 세포의 활성화
NK-92(CD3) 세포는 라듐-1 또는 DMF-5 TcR 중 어느 하나를 발현하도록 변형되었고 그리고 세포 표면에서 CD3의 발현은 APC-표지된 항-CD3를 사용하여 검출되었다. CD3+ 세포가 탈과립화 분석 (도 5, 최상부 패널)을 위해 선택되고 분류되었다.
라듐-1 또는 DMF-5 TcR을 발현하도록 변형된 NK-92(CD3) 세포는 각각 라듐-1 및 DMF-5 TcR에 대한 표적 항원인, TGFbRII (밝은 회색 윤곽) 또는 MART1 (어두운 회색 윤곽) 펩티드 중 어느 하나로 장입된 T2 세포 (도 5, 바닥면 패널)와 함께 항온처리되었다. 어느 하나의 펩티드의 존재에서 T2 세포와 함께 항온처리된 라듐-1 (도 5, 바닥면 좌측 패널) 및 DMF-5 (도 5, 바닥면 우측 패널) TcR을 발현하는 NK-92(CD3) 세포에 의해 CD107a 발현이 측정되었다. 라듐-1 TcR을 발현하도록 변형된 NK-92(CD3) 세포는 TGFbRII 펩티드의 존재에서 활성화를 나타냈고 DMF-5 TcR을 발현하는 세포는 MART-1의 존재에서 활성화를 나타냈다. 비-특이적 활성화는 관찰되지 않았다.
유사한 실험이 각 TcR에 대한 EC50을 결정하기 위해 또한 수행되었다. 라듐-1 (원) 및 DMF-5 (정사각형) TcR을 발현하도록 변형된 NK-92(CD3) 세포가 각각 상이한 펩티드 농도의 범위로 TGFbRII 또는 MART-1 펩티드의 존재에서 T2 세포와 함께 항온처리되었다. 활성화는 상기에 개괄된 바와 같이 CD107a 발현을 검출함으로써 측정되었다. 각 농도에서 CD107a의 발현이 측정되었고, 그리고 상대적 활성화 (최대 CD107a 발현의 백분율로서의 CD107a)가 산출되었다. 2nM (라듐-1) 및 7nM (DMF-5)의 EC50 값이 산출되었다 (도 6).
실시예 5.
NK-92(CD3) 세포에서 TcR/CD3-매개된 신호전달
라듐-1 TcR로 형질감염된 NK-92(CD3) 세포가 그것의 신호전달 능력을 조사하기 위해 포스포-유세포측정을 사용하여 시험되었다. 초기에, TCR 복합체의 일반적인 신호전달 능력이 TCR을 통한 활성화를 자극하는, 항-CD3 및 항-CD28 항체로 세포를 자극함에 의해 분석되었다. 도 7에 나타낸 바와 같이, TcR 및 CD3의 클러스터링은 T 세포에서 관찰되는 것과 유사한 신호전달 캐스케이드의 활성화를 유도한다. 이것은 ZAP-70, SLP-76 및 CD3ζ를 비롯한 몇 개의 TcR/CD3-관련된 단백질의 인산화의 증가된 수준에 의해 나타났다.
세포는 그런 다음 항원-제시 세포를 사용하고 포스포-유세포측정에 의한 상이한 시점에서 TCR 복합체의 신호전달 활성을 모니터링하여, 특이적 항원에 의한 자극에 대해 시험되었다. NK-92(CD3)-라듐-1 및 NK-92(CD3)-DMF-5 양자는 그것의 동족 펩티드로 자극되었다. 도 8에 나타낸 바와 같이, 단지 특이적 자극만 신호전달 분자 인산화를 유도했다. 조기 및 후기 신호는 구별될 수 있었고, 그리고 패턴은 T 세포에서 관찰된 것과 유사했다. 종합하면, 이들 데이터는 NK-92(CD3-TCR)가 그것의 기질과 접촉할 때 T 세포 같이 반응한다는 것을 입증한다.
실시예 6.
CD4+ T 세포-유도된 TcR에 의한 NK-92(CD3) 세포의 자극
CD4+ T 세포-유도된 TcR 라듐 5 및 라듐 6가 NK92(CD3) 세포 안으로 형질도입되었다. 이들 TcR은 MHC 부류 II 펩티드 표적에 대해 특이적으로 세포를 재배향할 수 있었다. 라듐-5 및 라듐-6 양자는 TGFbRII 프레임 이동 돌연변이체 펩티드 (KSLVRLSSCVPVALMSAMT)를 특이적으로 표적으로 한다; 라듐-5는 HLA-DR7에 관하여 특이적으로 이 펩티드를, HLA-DR4에 관하여 라듐-6을 표적으로 한다. NK-92(CD3)-라듐5/6 세포의 자극의 동력학은 도 9에 도시되었다. NK-92(CD3) 세포 자극은 상기 실시예 4에서와 같이 측정되었다. 양 TcR의 EC50 값은 도 9에 나타낸 바와 같이 산출되었다. HLA-DR7 일배체형 환자 샘플에서의 라듐-5 EC50은 19μM로 산출되었다; 라듐6 EC50은 일 환자 샘플에서 4μM로 그리고 제2 환자에서는 0.4μM로 산출되었다. 양 환자 샘플은 HLA-DR4 일배체형이었다.
실시예 7.
CD3/CD3-TcR 발현을 갖는 및 갖지 않는 NK-92 단백질 발현의 분석
NK-92 세포의 단백질 발현 프로파일이 NK92(CD3/CD3-TcR) 세포의 것과 비교되었다. (NK-92(CD3/CD3-TcR) 세포에서 CD3의 존재를 당연히 제외하고 두 그룹의 세포 간에는 변화가 관찰되지 않았다. 비교는 아래 표에서 보여진다 (PBMC = 말초 혈액 단핵 세포).
Claims (22)
- 변형된 NK 세포로서,
상기 세포는 CD3 쇄인 CD3γ, CD3δ, CD3ε 및 CD3ζ; 및 TcR을 발현하고,
상기 CD3 쇄 및 상기 TcR은 상기 NK 세포의 표면에 위치한 작용성 CD3-TcR 복합체를 형성하는, 변형된 NK 세포. - 제1항에 있어서, 상기 세포는 변형된 1차 NK 세포인 것인, 변형된 NK 세포.
- 제1항에 있어서, 상기 세포는 변형된 NK-92 세포인 것인, 변형된 NK 세포.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는 비-면역원성으로 변형된 것인, 변형된 NK 세포.
- 제4항에 있어서, 상기 세포는 보편적인 비-면역원성으로 변형된 것인, 변형된 NK 세포.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 세포는:
i) 인간 세포이고, HLA-음성인 것;
ⅱ) β2 마이크로글로불린의 발현을 방해하거나 금지하도록 변형된 것; 또는
ⅲ) 조사된(irradiated) 것인, 변형된 NK 세포. - 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TcR은 독립적인 보조 수용체(co-receptor)인, 변형된 NK 세포.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TcR은 암 항원에 대해 특이적인 것인, 변형된 NK 세포.
- 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 TcR은 감염된 세포에 의해 발현되거나 제시되는 항원을 인식하는 것인, 변형된 NK 세포.
- 제8항에서 정의된 바와 같은 변형된 NK 세포, 및 약제학적으로 허용가능한 1종 이상의 담체 또는 부형제를 포함하는, 암 치료용 치료 조성물.
- 제10항에 있어서, 상기 TcR은 치료되는 대상체 내 표적 세포에 의해 발현된 항원, 및 상기 대상체의 MHC 유형에 대해 특이적인 것인, 암 치료용 치료 조성물.
- 제9항에서 정의된 바와 같은 변형된 NK 세포, 및 약제학적으로 허용가능한 1종 이상의 담체 또는 부형제를 포함하는, 감염 치료용 치료 조성물.
- 제12항에 있어서, 상기 TcR은 치료되는 대상체 내 표적 세포에 의해 발현된 항원, 및 상기 대상체의 MHC 유형에 대해 특이적인 것인, 감염 치료용 치료 조성물.
- 하기 단계를 포함하는 치료용 변형 NK 세포를 제조하는 방법:
(a) CD3 쇄인 CD3γ, CD3δ, CD3ε 및 CD3ζ를 발현하는 NK 세포를 제공하는 단계;
(b) 치료되는 대상체의 MHC 유형을 결정하는 단계;
(c) 상기 대상체 내 표적 항원을 식별하는 단계로서, 상기 항원은 상기 대상체 내 세포에 의해 발현되거나 제시되는 것인 단계; 및
(d) 상기 표적 항원에 대한 특이성을 갖고 상기 대상체의 상기 MHC 유형에 매칭되는 TcR을 발현하여, 작용성 CD3-TcR 복합체가 상기 세포의 표면에 위치하도록 상기 단계 (a)의 세포를 변형하는 단계. - 제14항에 있어서, 상기 TcR은 암 항원에 대해 특이적인 것인, 방법.
- 제14항 또는 제15항에 있어서, 상기 NK 세포는 1차 NK 세포인 것인, 방법.
- 입양 세포 전달 요법에서 사용하기 위한 키트로서,
(a) CD3 쇄인 CD3γ, CD3δ, CD3ε 및 CD3ζ를 발현하는 NK 세포; 및
(b) TcR을 각각 암호화하는 핵산 분자의 패널을 포함하고, 상기 TcR은 상이한 항원 특이성 및/또는 상이한 MHC 특이성을 가지는, 키트. - 제17항에 있어서, 상기 핵산 분자는 벡터에 함유되는 것인, 키트.
- 제18항에 있어서, 상기 벡터는 바이러스 벡터인 것인, 키트.
- 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NK 세포는 1차 NK 세포인 것인, 키트.
- 제17항 내지 제19항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 NK 세포는 보편적인 비-면역원성인 것인, 키트.
- 제21항에 있어서, 상기 NK 세포는:
i) 인간 세포이고, HLA-음성인 것;
ⅱ) β2 마이크로글로불린의 발현을 방해하거나 금지하도록 변형된 것; 또는
ⅲ) 조사된(irradiated) 것인, 키트.
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