CN107250351A - 通用杀伤t细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种经过修饰的自然杀伤(NK)细胞和其在个体化医疗中的用途。本发明的经过修饰的NK细胞是非免疫原性的，意指它们能够投予给任何接受者受试者而不被宿主免疫系统排斥(它们是“通用”的)。在第一实施例中，所述非免疫原性NK细胞经过修饰以表达CD3，从而使T细胞受体(TcR)得以表达。在另一个实施例中，所述非免疫原性NK细胞经过进一步修饰以表达TcR以及CD3共受体。CD3与特异性TcR的共表达导致所述经过修饰的NK细胞显现针对靶细胞的抗原特异性细胞毒性。通用NK细胞因此能够被靶向特异性抗原，并且因此可用于个体化医疗中，尤其是肿瘤学领域中。

Description

通用杀伤T细胞
本发明涉及自然杀伤细胞和其在疗法中、尤其是癌症治疗中的用途。具体来说，已经研发出一种经过修饰的自然杀伤细胞，它已经过修饰以表达CD3并且它可以经过进一步修饰以共表达基于对癌症抗原或其它靶抗原具有特异性的T细胞受体的抗原受体。经过修饰的自然杀伤细胞是非免疫原性的，例如表达低水平的MHC或是MHC阴性的，这意味着所述细胞适合于普遍使用，与受试者的MHC类型无关。本发明因此有利地组合了通用性和个体化的特征；T细胞受体可以与待治疗受试者的疾病状况(例如，癌症类型)和MHC类型相匹配，以使“通用细胞”可用于针对待治疗受试者个体化设计的治疗中。
免疫系统的某些细胞展现出针对特定靶细胞的细胞毒性活性。细胞毒性T淋巴细胞表达能够特异性识别与MHC I类分子结合的抗原衍生肽的T细胞受体(TcR)。相比之下，自然杀伤(NK)细胞不受MHC限制，并且不需要由MHC分子进行抗原呈递来发挥其杀伤作用。它们能够在不存在加载肽的MHC的情况下识别应激细胞，并且能够杀伤缺乏MHC的细胞。NK细胞因此在先天免疫中起重要作用，因为这些“非MHC”细胞原本不会被其它免疫细胞检测到和破坏。
细胞毒性T细胞(也被称作细胞毒性T淋巴细胞或杀伤T细胞)能够经由TcR通过与在细胞表面上由MHC I类分子呈递的抗原(肽)结合而以抗原特异性方式识别受到感染或破坏的细胞。与肽-MHC I类的结合通过CD8共受体来介导，CD8共受体增强了结合相互作用的亲和力并且增加了TcR的信号转导。其它T细胞类型、特别是辅助性T细胞的TcR通过CD4共受体介导来识别由MHC II类分子呈递的抗原肽。在T细胞中需要CD3来将TcR定位到细胞表面(Ahmadi等人2011.《血液(Blood)》118,3528-3537)，并且在与加载有合适的抗原肽的MHC蛋白质接触后，需要CD3来活化T细胞。CD3是由四种独特的链组成的蛋白质复合体：CD3γ链、CD3δ链、两条CD3ε链以及ζ链，它们与TcR一起形成TcR复合体。
NK细胞(也被定义为‘大颗粒淋巴细胞’)代表由常见淋巴祖细胞(它还产生B淋巴细胞和T淋巴细胞)分化的细胞谱系。不同于T细胞，NK细胞天然地不包含质膜处的CD3。重要的是，NK细胞不表达TCR并且通常也缺乏其它抗原特异性细胞表面受体(如同TCR和CD3一样，它们也不表达免疫球蛋白B细胞受体，并且相反地通常表达CD16和CD56)。因此NK细胞通过其CD3-、CD56+表现型来区分。NK细胞的细胞毒性活性不需要致敏，但可通过用包括IL-2在内的各种细胞因子活化而增强。通常认为NK细胞缺乏抗原-受体介导的信号传导所必需的恰当的或完整的信号传导途径，并且因此认为不能够进行抗原受体依赖性信号传导、活化和扩增。
NK细胞具有细胞毒性，并且平衡活化与抑制性受体信号传导来调整其细胞毒性活性。举例来说，表达CD16(FcγRIII受体)的NK细胞可以结合到与感染细胞结合的抗体的Fc结构域，引起NK细胞活化。相比之下，针对表达高水平的MHC I类蛋白质的细胞的活性降低。在与靶细胞接触时，NK细胞释放出蛋白质，如穿孔素(perforin)；和酶，如蛋白酶(颗粒酶)。穿孔素能够在靶细胞的细胞膜中形成孔，诱导细胞凋亡或细胞裂解。
已经研发出许多基于T细胞的疗法来治疗癌症，并且这些称为过继性细胞转移(ACT)的治疗近来年已经变得越来越具有吸引力。迄今为止已经采用了三种主要的ACT策略。这三种中的第一种也是研发最成熟的一种涉及从外周或肿瘤部位分离患者自身的肿瘤反应性T细胞(称为肿瘤浸润性淋巴细胞(TIL))。将这些细胞离体扩增并重新注射到患者体内。然而，这种方法在细胞扩增的时候会涉及若干周的延迟，并且要求专门的细胞生产设施。
有两种替代疗法可用，它们涉及用能够识别肿瘤的受体修饰患者自身的T细胞。在一个选择中，能够分离并表征对癌症抗原具有活性的TcR，并且能够将编码TcR的基因插入到T细胞中并且重新注射到患者体内。这种疗法在一些患者中显示可缩小实体肿瘤，但是伴随有显著的缺点：所用的TcR必须与患者的免疫类型相匹配。因此，作为使用TcR的替代方案，还提出了涉及在T细胞中表达嵌合抗原受体(CAR)的疗法。CAR是包含抗体与TcR复合体的信号传导结构域连接的融合蛋白，并且如果选择了合适的抗体，那么CAR就能够被用来使T细胞定向于肿瘤。不同于TCR，CAR不需要MHC匹配接受者。然而，迄今为止已鉴别到的能够用作合适的CAR靶标的癌症特异性表面抗原非常少，因此在癌症疗法中使用CAR目前受到限制。
所有涉及到用TcR或CAR修饰T细胞的ACT途径都需要从患者或从组织类型匹配的供体分离并修饰T细胞。如果使用非自体细胞，那么为了避免排斥反应的风险，必需使用自体T细胞。这提高了与ACT相关的成本，并且也会增加为了制备用于ACT中的T细胞所需的时间比例。
致力于解决ACT的以上限制的替代性方法利用细胞毒性NK细胞，如例如WO 98/49268中所述。NK细胞是强效杀伤细胞并且对许多不同的恶性细胞都有很高的细胞毒性。因为NK细胞能识别表达非自身HLA分子而不是自身HLA抗原的靶细胞，所以自体NK细胞通常不是很有效并且不需要使用同种异基因的NK细胞(它们必须要小心地去除T细胞来避免GvHD)或细胞系。基于NK细胞系NK-92的照射过的细胞的疗法已经进展到了临床试验阶段来治疗白血病和其它血液学恶性肿瘤。照射意味着细胞不能够增殖并且因此杀伤作用具有有限的和规定的持续时间。NK细胞也不攻击健康组织。然而，NK细胞的天然“范围”有限并且虽然NK-92细胞所具有的范围比原代NK细胞宽，因为NK细胞天然不包含适合于特异性靶向靶细胞上的抗原的受体，但是为了扩大可以被治疗的癌症的范围并且为了使细胞靶向或重定向于特定的或选定的癌症，需要进一步修饰这些细胞。这样重定向当然意味着去除了对同种异基因NK细胞的需求，但是尽管如此，相比于原代或自体NK细胞来说，NK细胞系依然具有优点，例如改良的细胞毒性。
为此目的，已经研发了表达CAR的NK细胞用来治疗癌症。已将识别癌细胞表面上的抗原的CAR引入到连续生长的NK-92细胞系中，并且包含这些CAR的NK 92细胞已经相对于亲本NK-92细胞显示出对肿瘤细胞具有增强的细胞毒性(Uherek等人2002.《血液》200,1265-1273)。早期临床试验仍在进行之中。然而，如上文所指出，缺乏可用的抗原作为CAR的靶标目前限制了基于CAR的疗法的使用。
本发明是基于一种用于提供癌症特异性杀伤细胞的替代方法。更具体来说，本发明旨在提供基于NK细胞、用于普遍使用的癌症特异性杀伤细胞，这意味着细胞不用像目前针对基于T细胞的疗法所要求的那样必须匹配待治疗受试者的免疫类型，但即便如此它们仍可以根据需要调整成适合于特定的免疫类型和癌症类型的受试者。因此，可以使用通用杀伤细胞进行个体化医疗。
本发明因此建议将NK细胞改为T细胞，并且因此使其能够像T细胞一样，表达TcR并且以特异性和定向方式杀伤细胞。本发明组合了NK细胞的效能和固有的天然杀伤能力与通过TcR得到的特异性靶向和细胞活化。虽然CAR先前已在NK细胞中表达，但是迄今为止一直不认为NK细胞有可能具有所有必需的信号传导途径和机制以允许TcR能够以引起成功活化并且通过NK细胞靶向杀伤的方式成功地表达。通用性由以下提供：通过使用非免疫原性的NK细胞，例如它天然地表达低水平的MHC或具有降低的增殖能力；或者通过使得NK细胞变成MHC(例如，HLA)阴性，以使得细胞不会被接受者的免疫系统识别为外源物。因此，NK细胞不需要匹配待治疗受试者的免疫(例如，HLA)类型并且可以普遍地投予，与受试者的免疫类型无关(即具有任何免疫类型、例如任何HLA分布/类型的受试者)。
本发明因此提供允许功能性、活性TcR在非免疫原性NK细胞中表达的方法。以此方式，可以提供通用杀伤T细胞，它不取决于细胞的MHC匹配，但它具有由引入细胞中的TcR的特异性决定的受控制的特异性。发现NK细胞中CD3和TcR的共表达足以将TcR定位到NK细胞的表面，并且出人意料地，表达TcR的NK细胞展现出针对靶细胞的抗原特异性细胞毒性。从另一种方式来看，本发明简单地通过CD3和TcR在非免疫原性NK细胞中的共表达，提供了用于将NK细胞转换成细胞毒性T细胞的方法，并增加了通用性益处。本发明因此提供一种能够用于个体化医疗中的‘通用’杀伤T细胞。
因此，在第一方面，本发明提供一种经过修饰的NK细胞，其中所述细胞是非免疫原性的并且经过修饰以表达CD3。
具体来说，将细胞修饰成非免疫原性，例如通过照射来降低增殖能力；或者通过一些其它的减少增殖的手段，使得细胞在被引入到受试者体内时不会存留太久以产生免疫反应；或者通过将细胞修饰成MHC阴性。
本发明的细胞可以经过进一步修饰以表达对靶细胞上的抗原(即靶抗原)具有特异性的TcR。如下文进一步定义的，术语“TcR”在本文中在广义上使用，包括包含TcR抗原识别区或是基于TcR抗原识别区、或衍生自TcR的任何抗原受体。因此，天然的和合成的TcR均包括在内，例如TcR变异体或衍生物。
在一个特定实施例中，本发明提供一种表达CD3和TcR的非免疫原性NK细胞，其中所述TcR对癌细胞上的抗原具有特异性。换句话说，本发明提供一种癌症特异性NK细胞，其中细胞是非免疫原性的并且其中癌症特异性通过癌症特异性TcR和CD3的共表达来提供。如将在下文更详细地描述，在一个优选实施例中，TcR是独立的共受体，尤其是独立的CD4和/或CD8。
另一方面，本发明提供如上文所定义的这类细胞用于疗法中，更具体来说用于癌症疗法中，或更通常是用于过继性细胞转移疗法中(例如，用于治疗可对T细胞疗法起反应的任何病况)。
再另一方面提供如上文所定义的经过修饰的NK细胞在制造用于癌症疗法或用于过继性细胞转移疗法的药物中的用途。
还提供了一种治疗性组合物，它包含如上文所定义的经过修饰的NK细胞以及至少一种药学上可接受的载体或赋形剂，并且将这类治疗性组合物用于癌症疗法中或过继性细胞转移疗法中。
又另一方面提供一种治疗方法，更具体来说是一种癌症治疗方法，或一种过继性细胞转移疗法方法，所述方法包含向有需要的受试者(例如患有或被诊断为癌症的受试者)投予有效量的如上文所定义的经过修饰的NK细胞。
关于在疗法中使用，本发明的经过修饰的NK细胞将被修饰成共表达TcR与CD3。因此，用于在疗法中使用的药物或组合物的制备将包含修饰NK细胞以表达TcR。TcR将经过设计或选择以首先匹配待治疗受试者(即经过修饰的NK细胞的接受者)的免疫(即MHC)类型，并且其次匹配或识别受试者体内将被NK细胞靶向的细胞。那就是TcR经过设计或选择以识别受试者体内的所期望的靶抗原。这可以是受试者体内由癌细胞或任何将通过过继性细胞转移疗法消除的细胞(例如感染细胞，例如表达(或呈递)病毒或其它病原体的抗原的细胞)表达(或呈递)的靶抗原。
因此，为了进行根据本发明的癌症疗法或过继性细胞转移疗法，或为了制备用于治疗用途的经过修饰的NK细胞，可以进行以下步骤：
(a)提供已经过修饰以表达CD3的非免疫原性NK细胞；
(b)确定待治疗受试者的MHC类型；
(c)鉴别受试者体内的靶抗原，所述抗原由受试者体内的细胞表达或呈递，例如通过鉴别或确定受试者的癌症类型、和/或特定癌症标志物(例如，抗原)的表达或特定突变的存在情况等；
(d)修饰步骤(a)的细胞以表达对靶抗原具有特异性并且匹配受试者的MHC类型的TcR。
如下文将进一步论述的，所述步骤可以分开或依次或同时进行。因此，举例来说，步骤(a)和(d)可以同时进行，更具体来说，细胞可以在一个或多个同时进行的步骤中修饰以表达CD3和TcR。然而，在另一个实施例中，细胞可以在修饰以表达TcR之前，在另一个步骤中修饰以表达CD3。
最后，在治疗方法或治疗性使用中，可以向受试者投予步骤(d)的经过修饰的细胞(例如，在另一个步骤(e)中)。
在本发明的另一方面中，提供一种用于制造通用NK细胞(所述细胞适合于(或能够用于)治疗用途)的方法，或更具体来说是用于制备用于个体化治疗用途、即用于过继性细胞转移疗法的细胞的通用NK细胞，所述方法包含：
a)提供非免疫原性的NK细胞，更具体来说修饰NK细胞以使其呈非免疫原性；和
b)修饰所述细胞以表达CD3。
为了进一步提供一种用于过继性细胞转移疗法中的经过修饰的NK细胞，在步骤(c)中进一步修饰细胞以表达TcR，并且尤其针对个体化疗法来说，是这样的TcR，它匹配待治疗受试者的MHC类型并且识别由将被经过修饰的NK细胞靶向的靶细胞表达或呈递的靶抗原。
在一个优选实施例中，提供一种用于制造癌症特异性NK细胞的方法，所述方法包含：
a)提供非免疫原性的NK细胞，例如修饰NK细胞以使其呈非免疫原性；
b)修饰所述细胞以表达CD3；
c)修饰所述细胞以表达癌症特异性TcR。
步骤(b)和(c)可以一起(同时)或分开(例如依次)进行。然而，在有利的实施例中，如下文将进一步描述，可以制备表达CD3的通用NK细胞，所述细胞随后可以在单独的步骤中使用，通过进一步修饰细胞以表达基于受试者的诊断和MHC类型选择的TcR来制备用于过继转移疗法的个体化细胞。因此，可以根据MHC特异性(即类型)和靶抗原特异性(例如，针对一系列不同的已知或先前已鉴别的靶抗原，例如癌症抗原)，制备含有不同TcR(尤其是，编码TcR的核酸分子或载体)的TcR受体库或文库。取决于受试者的诊断(例如，特定的癌症类型、或已知表达特定抗原的癌症、或通过受试者的癌症的具体分析鉴别)，可以选择并使用特定TcR来修饰根据本发明的NK细胞。或者，可以制备表达具有不同特异性的CD3和TcR的经过修饰的NK细胞库或组，可以取决于受试者诊断和MHC类型从中选择恰当的NK细胞。
因此，本发明的再另一方面提供一种组合产品或试剂盒，尤其是用于过继性细胞转移疗法中或癌症疗法中的产品或试剂盒，所述产品或试剂盒包含：
(a)非免疫原性的并且表达CD3的经过修饰的通用NK细胞，尤其是经过修饰而为非免疫原性并且表达CD3的NK细胞；和
(b)一组核酸分子，所述核酸分子各自编码TcR，其中所述TcR具有不同的抗原特异性和/或不同的MHC特异性。
方便的是，编码核酸分子可以在载体中提供，例如准备引入(即转染或转导等)到经过修饰的NK细胞中的载体。在一个优选实施例中，TcR对癌症抗原或对在癌细胞上(例如，优先地或特异性)表达的抗原具有特异性。
本发明的又另一方面提供经过修饰的NK细胞组或文库，每个NK细胞都是非免疫原性的并且表达CD3，例如经过修饰而为非免疫原性的并且表达CD3，并且表达(即经过修饰以表达)TcR，其中不同NK细胞的TcR具有不同的抗原特异性和/或不同的MHC特异性。
应了解，在这些方面，可以存在识别同一个抗原的多个TcR，但它们的MHC特异性可以不同，反之亦然。
本发明采用免疫系统的细胞毒性细胞来治疗癌症。具体来说，本发明涉及TcR在免疫系统中原本不表达TcR的细胞毒性细胞中的表达，和使活性功能性TcR在这样的细胞中表达的方法。
术语‘溶细胞’和‘细胞毒性’在本文中可互换地使用，是指细胞能够在靶细胞中通过裂解或细胞凋亡来诱导细胞死亡。
术语‘靶细胞’是指任何被本发明的细胞毒性细胞杀伤的细胞。更具体来说，靶细胞是NK细胞所靶向的细胞，并且因此是表达或呈递由TcR(靶抗原)识别的抗原的细胞。这些细胞可以包括任何细胞类型，并且由本发明细胞经由在靶细胞表面上展示的抗原进行靶向。
因此，靶细胞可以是受试者体内任何希望消除的细胞，例如希望去除、杀伤、使其失活等。优选的靶细胞是癌细胞，但是它可以是任何由疾病或临床病况产生的细胞。所述疾病或病况因此可以是可受益于过继性细胞转移疗法，或更尤其受益于靶向要杀伤或去除等的细胞的T细胞疗法的任何病况。与癌细胞一样，临床上可能希望去除的其它细胞包括感染细胞，即被任何病原体感染的细胞。这类细胞通常是病毒感染细胞，但它们也可以被任何其它致病性生物体感染，例如任何微生物，例如细菌、真菌、支原体、原生动物、朊病毒。或者，靶细胞可以细胞凋亡的或前细胞凋亡的，或者处于应激状态(即表达其细胞表面的应激相关的标志物)，或者可以是突变细胞，例如表达特定突变。
“靶抗原”是(或更具体来说提供或包含)当在靶细胞上呈递时由TcR识别的分子。因此，靶抗原、或更尤其衍生自靶抗原的肽，以MHC I或MHC II限制性方式，如被TcR识别所要求般在靶细胞上呈递。因此，如上文所讨论，靶抗原可以是癌症抗原，即由癌细胞特异性、选择性或优先表达的抗原，或者具有癌细胞特征的抗原或已知或被用作癌细胞标志物的抗原。癌症抗原可以是通用癌症抗原，即通常在广泛范围的不同癌症上发现的抗原，或可以对特定类型的癌症具有特异性。或者，它可以是来自感染性病原体的由靶细胞呈递的抗原，或任何其它由任何其它希望消除的细胞表达或呈递的抗原。
‘MHC’是指主要组织相容性复合体的蛋白质，并且包括MHCI和MHCII蛋白质。MHCII蛋白质通常仅在抗原呈递细胞的表面上发现，抗原呈递细胞例如树突状细胞、单核吞噬细胞、一些内皮细胞以及胸腺上皮细胞。MHCII蛋白质也由B细胞表达，并且因此可以由B细胞恶性肿瘤表达。MHCII蛋白质也常常由黑素瘤细胞表达。术语MHC涵盖人类白细胞抗原(HLA)，并且因此在受试者是人类的情况下，这些术语可以互换使用。
根据本发明，可以使用任何NK细胞。术语“NK细胞”是指大颗粒淋巴细胞，是一种衍生自天然地不包含抗原特异性受体(例如，T细胞受体或B细胞受体)的常见淋巴祖细胞的细胞毒性淋巴细胞。NK细胞可以通过其CD3-、CD56+表现型来区分。如本文所用的术语因此包括任何已知的NK细胞或任何NK样细胞或任何具有NK细胞特征的细胞。
在一个实施例中，NK细胞可以从受试者获得并且在体外生长，得到NK细胞群体以用于本发明中。NK细胞可以是自体的(即使用本发明的细胞和方法从待治疗受试者获得)，或者可以是异源的(即细胞可以从供体受试者获得并且可以打算用于治疗第二受试者(即它们可以是同种异基因的、同基因的或异种的))。因此可以使用原代NK细胞。在一个替代实施例中，可以在本发明中使用本领域中已知的事先经过分离和培养的NK细胞。因此可以使用NK细胞系。多种不同的NK细胞是已知的并在文献中有报道，并且可以使用这些细胞中的任何细胞，或者可以例如通过病毒转化由原代NK细胞制备细胞系(Vogel B等人2014《白血病(Leukemia)》28:192-195)。细胞系可以具有许多优于原代NK细胞的优点，例如细胞系可以更容易地在培养物中生长和维持，更容易扩增并且随时可根据需要以标准化质量用于过继性细胞转移疗法。某些细胞系，例如NK-92细胞系，还可展现更高的细胞毒性活性，并且在其未经修饰的状态下(没有根据本发明修饰)，它们可具有更宽的细胞靶标范围，例如癌细胞靶标(这可能是因为不存在抑制性受体或抑制性受体的数量减少)。除了NK-92之外，合适的NK细胞还包括(但是决不限于)NK-YS、NK-YT、MOTN-1、NKL、KHYG-1、HANK-1或NKG细胞系。
在一个优选实施例中，细胞是NK-92细胞(Gong等人,1994,《白血病》8,652-658)或其变异体。已经制备并且描述了原始NK-92细胞的许多不同的变异体，或者这些变异体是可获得的，包括非免疫原性的NK-92变异体。任何这样的变异体都可以使用并且包括在术语“NK-92”中。还可以使用其它细胞系的变异体。然而，任何NK-92或实际上任何根据本发明使用的NK细胞都不应该修饰成表达除了TcR以外的任何抗原特异性受体，所述TcR被引入到或将被引入到根据本发明修饰的NK细胞中。举例来说，细胞不应该表达CAR(一种与来自TcR复合体的细胞内信号传导结构域有关的单克隆抗体)。更一般来说，根据本发明的经过修饰的NK细胞不表达基于或包含抗体识别区的抗原特异性受体。NK细胞天然地不包含抗原特异性受体，并且因此本发明细胞中所存在的唯一的抗原特异性受体是被引入到或将被引入到NK细胞中的TcR。
根据本发明，经过修饰的NK细胞是非免疫原性的。从功能上来说，这意味着细胞不会被引入了该细胞的任何受试者的免疫系统识别，它在免疫雷达下通过并且未被接受者受试者排斥或识别为外源物。也就是说，投予了NK细胞的受试者的免疫系统未对经过修饰的NK细胞产生临床上显著的免疫反应。因此，细胞可以是非免疫原性的，如果它不是，那么在投予给受试者时，会产生免疫反应，免疫反应会影响、干扰或阻止细胞在疗法中的使用。
术语“非免疫原性”因此在本文中在广义上使用，意指当将细胞注射到受试者体内或以其它方式投予给受试者时，对所述细胞没有实质性的或临床上显著的免疫反应。更确切地说，细胞没有引起(或不能够引起)足以导致细胞的排斥反应和/或影响细胞功能的免疫反应，例如免疫反应不足以消除或大体上或显著地降低细胞的功能或作用(即效用)。因此，细胞在受试者体内保持细胞毒性活性，尤其是针对靶细胞的显著的或实质性的或可测量的细胞毒性活性。在一个特定实施例中，细胞未被排斥为外源物。如同任何生物系统一样，免疫反应的缺少可能不是绝对的(或100％)，可以耐受针对NK细胞的小的(或温和的或轻微的)免疫反应(例如，最低免疫反应(de minimis immune response))，只要细胞的功能或效用基本上不受影响即可(即只要细胞仍然能够发挥其功能即可)。
因此，将会看到，自体细胞(即投予给或用于投予给获得该自体细胞的同一个受试者的细胞)将是非免疫原性的(因为它是“自身的”)。类似地，非自体MHC匹配的NK细胞也将是非免疫原性的或基本上非免疫原性的。术语“非免疫原性”因此包括功能性非免疫原性。然而，在某些实施例中并且如上文所指出，本发明的非免疫原性NK细胞是非免疫原性的，这与细胞的接受者无关，即与引入了所述细胞或将要引入所述细胞的受试者无关(即它如果被投予到非自体受试者体内，将不会诱导临床上显著的免疫反应)。在特定实施例中，NK细胞可经过一种处理，这种处理使得它变成非免疫原性(即它可经过修饰而为非免疫原性)。举例来说，所述处理可以是物理或化学或生物处理，或细胞的结构性或物理化学修饰(例如，引起细胞的结构或物理改变或更改的处理)，例如照射，或基因修饰，例如用于减少或消除细胞的MHC表达。因此，在一些实施例中，NK细胞不是简单地在功能上免疫原性，而是具有或包含使其变成非免疫原性的修饰。
因此，NK细胞可以是天然地非免疫原性的，或可以经过修饰而为非免疫原性。天然地非免疫原性的NK细胞不表达MHC分子或仅微弱地表达MHC分子，或可以表达不刺激免疫反应的非功能性MHC分子。可以对可能是免疫原性的NK细胞进行修饰，以消除MHC分子的表达，或仅在其表面微弱地表达MHC分子。或者，可以将这类细胞修饰成表达非功能性MHC分子。
任何这样的细胞(不论是天然地非免疫原性的或在一定程度上经过修饰的)在其表面都不包含足以通过受试者的免疫反应触发临床上显著的免疫反应的水平的MHC，并且可被认为是MHC阴性的。换句话说，MHC阴性细胞不在其表面上表达任何免疫功能性MHC分子，或不在其表面上表达可被另一个免疫细胞、尤其是非自身免疫细胞或来自目标接受者受试者的免疫细胞识别的足够高含量的MHC分子。细胞可以缺乏MHC分子，或它可以不在其细胞表面表达MHC，或仅在其细胞表面微弱地表达MHC，或被表达的任何MHC分子可以是非功能性的，例如它可以突变或以其它方式经过修饰以使得它是非功能性的。任何借以破坏功能性MHC分子的表达的手段都有涵盖。因此，这可以包括基因敲除或敲低MHC复合体的分子，和/或它可以包括阻止MHC分子或整个复合体在细胞表面的恰当转运和/或正确表达的修饰。
具体来说，可破坏一个或多个功能性MHC I类蛋白质在本发明细胞表面的表达。在一个实施例中，细胞可以是HLA阴性人类细胞并且因此是一个或多个HLA分子的表达被破坏(例如，基因敲除)的细胞，例如HLA MHC I类复合体的分子。
在一个优选实施例中，MHC I类的破坏可通过敲除编码β2微球蛋白的基因来进行，β2微球蛋白是成熟的MHC I类复合体的组分。β2m的表达可以通过β2微球蛋白基因(β2m)的靶向破坏来消除，例如通过β2m启动子的定点突变诱发(以使启动子失活)，或在编码β2m蛋白质的基因内定点突变诱发以引入阻止β2m蛋白质表达的失活性突变，例如基因内的移码突变或提前‘终止’密码子。或者，可以使用定点突变诱发来产生不能够在细胞表面形成活性MHC蛋白质的非功能性β2m蛋白质。以此方式，β2m蛋白质或MHC可以保留在细胞内，或可以存在于细胞表面，但是是非功能性的。
或者可以在投予给受试者之前对NK细胞进行照射。发现照射过的NK-92细胞在临床试验中是非免疫原性的并且已被许可用于免疫疗法中(Ton T.等人2013《细胞疗法(Cytotherapy)》15 1563-70)。不希望受理论所束缚，认为照射细胞引起细胞仅短暂地存在于受试者体内，从而减少受试者的免疫系统建立针对经过修饰的NK细胞的免疫反应可用的时间。虽然这类细胞可在其细胞表面表达功能性MHC分子，但是它们也可以被认为是非免疫原性的。
因此，根据本发明的NK细胞可以通过降低其增殖的能耐或能力，即通过降低其增殖能力而修饰成非免疫原性。
本发明的NK细胞经过修饰以表达CD3。如上文所提到的，本发明的NK细胞不表达CAR或除TcR以外的实际上任何抗原特异性受体。因此，具体来说，除了在TcR-CD3融合物的情况下之外，CD3不表达为嵌合受体的一部分。更具体来说，CD3不表达为嵌合抗原受体(CAR)或基于(或包含)以下的任何嵌合受体的一部分：抗体衍生的抗原结合区，或衍生自任何不是TcR的结合分子或部分的结合域，例如来自任何其它亲和力结合伴侣，例如来自除TcR以外的配体或受体。因此，CD3不表达为包含抗原结合域(即结合部分，或部分(moiety))或任何不是TcR或不是衍生自TcR的结合域或配体的嵌合受体的一部分。换句话说，CD3独立地表达(即作为单独的分子或链，或不作为与不是CD3链或其一部分的部分、或间隔子或连接子分子的融合物的一部分)，和/或它被表达为TcR-CD3融合物的一部分(或在其内部)。因此，具体来说，本发明的NK细胞不表达CAR或其它包含除CD3-TcR融合物以外的CD3链或分子的嵌合受体。在CD3作为融合物(即融合蛋白)或作为融合物(即融合蛋白)的一部分提供的实施例中，它是CD3融合物或CD3-TcR融合物，如下文进一步所描述。
NK细胞正常(或天然地)不表达CD3，因此将编码CD3的核酸分子引入细胞中使得细胞能够表达CD3。因此，细胞被修饰成以重组方式表达CD3。换句话说，细胞被修饰成允许表达编码CD3的异源核酸分子。CD3可以匹配细胞的物种(即与细胞是同一个物种)，然而，也可以使用来自不同物种的CD3。因此，就人类NK细胞来说，可以表达人类CD3或来自另一个哺乳动物物种的CD3，如小鼠、大鼠、兔等。在一个优选实施例中，CD3的所有链(即CD3γ链、CD3δ链、两条CD3ε链以及ζ链)都在NK细胞中表达了。然而，预期也仅存在单一的CD3链(例如，仅CD3γ链、或仅CD3δ链、或仅CD3ζ链、或仅CD3ε链)或其任何组合。因此，NK细胞可以修饰成表达单一的CD3链中的任一种或与其它CD3链的组合，直到并包括完整的CD3分子。不希望受理论所束缚，假设也许可能使TcR定向于细胞表面和/或引发这样的信号传导，其中CD3链中的一个或多个不在NK细胞中表达。预期CD3的链中的一个或多个还可以作为融合蛋白提供，其中链中的至少两个被表达为单一多肽，只要保留CD3的定位和信号传导功能即可。
一个或多个CD3链还可以由一种核酸分子或例如分开的分子上的超过一种核酸分子编码。有利地，制造包含编码所有三种CD3链的核酸分子的构筑体，例如在相同的启动子的控制下或在一定程度上彼此相关的。
本发明的NK细胞可以进一步修饰成表达TcR。TcR可以视为包含选择性结合靶细胞表面上的抗原的TcR抗原识别结构域、抗原识别序列或其片段的任何受体。因此在本发明的上下文中，TcR可以是在其天然(或自然)环境中的包含TcR抗原识别结构域的典型TcR，或者它可以包含与天然地不是一起在TcR中发现(即非天然环境)的氨基酸序列和/或蛋白质结构域有关的TcR抗原识别结构域、抗原识别序列或其片段(即作为嵌合分子或融合蛋白的一部分)。术语“TcR”因此在本文中在广义上使用，包括任何这样的抗原受体，其中抗原识别区由TcR抗原识别结构域或序列提供，例如来自天然TcR或衍生自天然TcR的抗原识别区。术语“TcR”因此包括天然的和非天然的TcR，即合成的或人工TcR分子或构筑体、TcR变异体或衍生物、或衍生自或基于天然TcR的TcR分子。
表达TcR的NK细胞因此具有针对靶细胞的抗原特异性(即靶向)细胞毒性活性。TcR可以是任何对相关靶细胞上的抗原(靶抗原)具有特异性的TcR。NK细胞的特异性(即细胞所结合的抗原)将由TcR的特异性决定。换句话说，必需选择合适的TcR来提供具有所期望的特异性(即对靶细胞上的特异性抗原的特异性)的NK细胞。因此在一个实施例中，本发明提供一种经过修饰以表达CD3并且经过进一步修饰表达对靶细胞上的抗原具有特异性的TcR的NK细胞。
在一个优选实施例中，TcR以高亲和力结合到靶细胞表面上的抗原上(即TcR是高亲和力TcR)。在这样的有利实施例中，TcR能够以足以使得表达TcR的细胞能够在不存在CD8/CD4共受体的情况下经历活化的高亲和力结合到靶细胞表面上的MHC-抗原复合体上，CD8/CD4共受体分别是在细胞毒性或辅助性T细胞中活化TcR通常所需的。因此本发明提供一种经过修饰以表达CD3并且经过进一步修饰以表达对靶细胞上的抗原具有特异性的TcR的NK细胞，其中所述TcR以高亲和力结合到所述靶细胞上并且在不存在CD8和/或CD4共受体的情况下经历活化。换种表达来说，引入到根据本发明的NK细胞中的TcR是独立的共受体(或辅助因子)；即它不需要另外的受体或辅助因子来活化细胞(即通过TcR结合诱导在细胞中发生信号传导)。因此TcR可以按正常生理范围内的koff结合于抗原(MHC-抗原复合体)。具体来说，它是CD8和/或CD4独立的，例如CD8独立的，并且尤其是CD4和CD8独立的。然而，在一个替代实施例中，NK细胞可以经过进一步修饰以表达CD4和/或CD8。
TcR识别并结合在细胞表面由MHC I类或II类家族的蛋白质呈递的抗原(肽)。因此抗原的识别取决于细胞的MHC类型和肽(尤其是肽的序列)(抗原)。一般来说，靶抗原是已知的并且TcR根据其抗原特异性来选择。在一个优选实施例中，由靶细胞呈递的肽抗原的序列可以是已知的。另外，靶细胞的MHC类型也可以是已知的。因此在一个优选实施例中，可以选择能够特异性结合靶细胞表面上的抗原-MHC复合体的TcR。因此在一个优选实施例中，本发明提供一种经过修饰以表达CD3并且经过进一步修饰以表达对靶细胞上的抗原具有特异性的TcR的NK细胞，其中所述TcR能够特异性结合靶细胞表面上的抗原-MHC复合体。
在本发明的一个优选实施例中，TcR可以选自已被鉴别为特异性展示针对靶细胞或辅助性T细胞的细胞毒性的细胞毒性T细胞。或者，可以选择这类TcR的抗原识别结构域或序列或其片段。所述T细胞可以从将是治疗受试者的患者获得，或可以从第二受试者(即TcR供体)获得。因此，TcR可以选自被鉴别为针对靶细胞具有“已证实的”活性的T细胞。换句话说，可选择显示对靶细胞有效的TcR。举例来说，可以从癌症患者中分离出T细胞，例如肿瘤浸润性淋巴细胞。根据其性质，这些细胞将是或将包括对患者的癌症有效的T细胞。编码这类细胞的TcR的基因能够被鉴别和克隆，并且用于在根据本发明的NK细胞中表达TcR、或这类TcR的抗原识别结构域或序列、或其片段。T细胞可以在患者中或在受试者中通过疫苗接种产生，例如通过投予包含癌症抗原的疫苗。随后可以选择那些通过疫苗接种诱导的、对受试者的癌症或对癌细胞最有效的T细胞。用这样一种方式，可以选出最强效的或最有效的TcR，例如具有最高亲和力或是独立的共受体的TcR。可以进行亲和力成熟以获得最佳TcR。
有利的是，获得TcR的受试者(TcR供体)的HLA分布或MHC分布将与待治疗受试者的HLA分布或MHC相同。如上文所指出，可以鉴别和表征对靶细胞具有特异性的T细胞中的TcR，并且可以获得TcR的氨基酸序列和编码TcR的基因的核酸序列。换句话说，可以鉴别受试者体内包含对靶细胞上的特定抗原具有特异性的TcR的细胞毒性T细胞或辅助性T细胞，并且可以获得受体的氨基酸序列和编码受体的基因的DNA序列。所述DNA序列或所述基因可以用于制备用于引入到NK细胞中以使TcR在宿主(即接受者)NK细胞中得以表达的核酸分子或构筑体。
在本发明的一个替代实施例中，可以使用人工TcR(即不是从细胞毒性或辅助性T细胞鉴别的TcR)。TcR可以是人工产生的同种异体反应性TcR。TcR的结合结构域可以通过基于组合的方法产生，如噬菌体展示或核糖体展示，并且可以获得包含人工结合结构域、对特定抗原和MHC(例如，HLA)组合具有特异性的嵌合蛋白。
TcR可以作为包含其它蛋白质结构域的构筑体或融合物提供。
CD3链中的一个或多个(或整个CD3构筑体)可以与TcR一起表达为融合蛋白。换句话说，CD3链中的一个或多个可与TcR存在于同一条多肽链中。在一个优选实施例中，CD3分子或CD3链中的一个或多个(例如，CD3γ链、CD3δ链、CD3ζ链或CD3ε链或其任何组合)可作为将直接靶向质膜的TcR-CD3融合构筑体存在，即不要求在细胞中还存在另外的CD3分子(只要融合构筑体保留例如由CD3链提供的跨膜结构域即可)(Willemsen RM 2000《基因疗法(Gene Therapy)》7:1369-1377)。因此在这类实施例中，细胞可以被修饰成同时表达CD3和TcR，作为同一个构筑体或融合物的一部分。虽然单独地表达的CD3可能不是必需的，但尽管如此还是可以提供它来例如改良信号传导并且因此改良细胞活性。
如上文所指出，可以产生一组不同的TcR，这组中的每个TcR都对特定抗原-MHC复合体具有特异性(例如，特异性亲和力)。因此，可以识别不同的靶抗原和/或靶抗原上的不同的表位，和/或TcR可以对抗原具有不同的亲和力和/或选择性。另外，就指定靶抗原来说，该组可以包含具有不同MHC特异性(或MHC类型)的TcR。以此方式，可以从该组中选出能够与特异性抗原-HLA复合体结合的特定TcR以用于本发明方法中，即匹配靶抗原和受试者的MHC类型的TcR。因此，在一个特别优选的实施例中，可以基于由特定靶细胞呈递的抗原的性质和其MHC(例如，HLA)类型来选择特异性TcR。预期可以使用这一组快速产生对靶细胞具有特异性细胞毒性活性的NK细胞。因此，用于产生对靶细胞具有特异性的NK细胞的本发明方法可以包含：
a)修饰NK细胞以表达CD3；
b)确定所述靶细胞的MHC分布和由所述靶细胞展示的抗原的同一性；以及
c)修饰所述NK细胞以表达TcR，其中所述TcR选自一组各自具有针对不同抗原和/或MHC类型的特异性的TcR，并且其中所述TcR具有针对在所述靶细胞上展示的MHC和抗原的特异性。
TcR可以按包含编码TcR的核苷酸序列的核酸分子形式提供一组。适宜地，核酸分子可以包含在载体或构筑体内，尤其是适合直接引入到NK细胞中的载体或构筑体。核酸分子可以是DNA或RNA。举例来说，TcR可以作为mRNA或作为病毒载体(例如逆转录病毒载体)提供。
在一个实施例中，NK细胞被修饰成在细胞经过修饰以表达CD3之后表达TcR。因此，如上文所指出，可以通过将非免疫原性NK细胞修饰成表达CD3来制备通用NK细胞。经过这样修饰的NK细胞可以在培养物中生长和维持，或储存以供将来使用。因此，在一个实施例中，可以在修饰细胞以表达TcR之前使细胞复制产生表达CD3的NK细胞群体。NK细胞可以在培养物中生长或扩增。在一个替代实施例中，设想可以将细胞修饰成同时或基本上同时表达CD3和TcR。在一个实施例中，可以使用包含用于CD3和TcR的基因的单一载体或构筑体修饰细胞以表达CD3和TcR，并且在其它实施例中还可以使用分开的载体。如上文所讨论的，单一多肽分子中包含TcR和CD3功能性的融合蛋白也可以在NK细胞中表达，并且因此可以使用编码这类融合蛋白的载体或构筑体来修饰细胞。可以使经过修饰以表达CD3和TcR的NK细胞复制，例如可以在培养物中生长或扩增，然后再将细胞引入到受试者体内。因此在本发明的一个实施例中，可以产生表达CD3的NK细胞群体，并且可以将NK:CD3细胞的子群体修饰成表达对靶细胞表面上的抗原具有特异性的TcR。
本发明的经过修饰的NK细胞还可以按其它方式进行修饰，例如以改变或修改细胞功能或特性的其它方面，和/或表达其它蛋白质。举例来说，细胞可以经过修饰以表达归巢受体或定位受体，它用以将细胞靶向体内特定组织或位置或改良细胞于体内特定组织或位置的定位。为了增强NK细胞展现的细胞毒性反应，细胞还可以修饰成表达T细胞信号传导途径的组分中的一个或多个。任何这类修饰都可以在根据本发明的修饰之前、之后或同时进行。
本发明细胞可以经过修饰以改变其在体内和/或体外复制的能力。在一个实施例中，可以增强细胞的复制能力(细胞复制(即增殖)的能力)。在一个优选实施例中，这可以通过将细胞修饰成具有增强的细胞因子(如IL-2)表达来实现。IL-2是NK细胞生长和维持溶细胞功能通常所需的，并且因此表达IL-2的细胞不需要在生长培养基中补充额外的IL-2，并且在引入受试者体内时保留细胞毒性活性。细胞因子的表达可以通过将包含编码细胞因子的核酸分子的异源(非天然)载体或构筑体引入细胞中来增强，或可替代地，可以增强编码细胞因子的内源性基因的表达。细胞因子的表达可以是组成型表达(即控制编码细胞因子的基因的表达的启动子可以是组成性活性的或‘起作用(on)’)，或可以通过外部刺激诱导。
在一个实施例中，可以在将细胞修饰成表达CD3和/或TcR之前将细胞修饰成具有增强的复制能力。在另一个实施例中，可以在将细胞修饰成表达CD3和/或TcR之后将细胞修饰成具有增强的复制能力。在一个替代实施例中，可以在将细胞修饰成表达CD3之后，但是在将细胞修饰成表达TcR之前，将细胞修饰成具有增强的复制能力(即，这也许因此可能在将细胞修饰成表达TcR之前产生表达CD3的大NK细胞群体)。或者，可以基本上同时进行以上修饰中的任何两种或更多种。在一个实施例中，可以基本上同时进行所有三种修饰。
还可以在将细胞引入患者体内之前降低本发明的NK细胞的增殖能力和活力(存活率)。如上文所指出，这么做可以使细胞变成非免疫原性。在一个优选实施例中，可以通过照射降低细胞的复制能力和/或活力。细胞复制的能力和/或其活力可以根据提供给细胞的照射的剂量和性质而被削弱(即可以更缓慢地进行复制)或消除。辐射可以来自任何的α、β或γ辐射源，或可以是X射线辐射或紫外光。5-10Gy的辐射剂量可足以消除增殖，然而其它合适的辐射剂量可以是1-10、2-10、3-10、4-10、6-10、7-10、8-10或9-10Gy，或更高剂量，如11、12、13、14、15或20Gy。或者，NK细胞可以经过修饰以表达‘自杀基因’，这个基因允许细胞响应于外部刺激发生诱导性杀伤或阻止复制。
可以将细胞修饰成A)具有增强的复制能力和B)具有减弱的复制能力和/或活力。两个修饰可以按任何次序依次进行(即先A后B或先B后A)，或可以基本上同时进行(A和B一起)。在这类实施例中，可以在将细胞修饰成表达CD3和/或TcR之前、同时或之后将细胞修饰成表达用于增强细胞体外生长的细胞因子(如IL-2)，并且随后可以将细胞修饰成使其复制能力和/或活力减弱，然后再将细胞引入到受试者中。
从以上内容可以清楚知道，本发明细胞可以经过修饰以改变一个或多个基因的表达水平，或尤其是允许一个或多个正常不被细胞表达的基因得以表达。为了允许这类异源基因表达，将对应于或包含所讨论的基因的核酸分子引入细胞中。可以将核酸分子方便地在载体或重组性构筑体中引入细胞中。就构筑体/载体制备来说和就将核酸分子(载体或构筑体)引入到细胞中来说，异源基因表达方法是本领域中已知的。因此，适用于哺乳动物细胞、尤其是淋巴细胞或NK细胞的启动子和/或其它表达控制序列以及合适的载体等(例如，病毒载体)是本领域中众所周知的。
载体或构筑体(核酸分子)可以通过各种手段引入本发明细胞中，包括化学转染剂(如磷酸钙、分支链有机化合物、脂质体或阳离子聚合物)、电穿孔、细胞挤压(cellsqueezing)、声致穿孔(sonoporation)、光学转染、流体动力学导入或病毒转导。在一个优选实施例中，通过病毒转导引入载体或构筑体。引入细胞中的异源核酸分子可以游离表达，或可以整合到合适基因座处的细胞基因组中。
适合NK细胞的细胞培养方法和试剂在本领域中也是众所周知的。可以根据选择和便利性等使用任何所期望的细胞培养方法。举例来说，可以使用特氟龙袋(Teflon bag)进行大规模培养，或可以使用自动化细胞培养系统。
本发明的靶细胞可以是癌细胞。癌症在本文中被广泛地定义为包括任何致瘤性病况，无论是恶性的、恶化前的或非恶性的。然而，一般来说，它可能是恶性病况。实体肿瘤和非实体肿瘤均包括在内并且术语“癌细胞”可以视为与“肿瘤细胞”同义。
涵盖了任何类型的癌症，包括实体癌症和造血癌症。代表性癌症包括急性成淋巴细胞白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、肾上腺皮质癌、爱滋病相关癌症(例如，卡波西肉瘤(Kaposi Sarcoma)和淋巴瘤)、肛门癌、阑尾癌、星形细胞瘤、非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤、基底细胞癌、胆管癌、肝外膀胱癌、骨癌(例如，尤文氏肉瘤(Ewing Sarcoma)、骨肉瘤和恶性纤维组织细胞瘤)、脑干神经胶质瘤、脑癌、乳腺癌、支气管肿瘤、伯基特淋巴瘤(Burkitt Lymphoma)、类癌瘤、心脏肿瘤(Cardiac/Heart Tumour)、中枢神经系统癌症(包括非典型畸胎样/横纹肌样肿瘤、胚胎肿瘤、生殖细胞肿瘤、淋巴瘤)、子宫颈癌、脊索瘤、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML)、慢性骨髓增生性病症、结肠癌、结肠直肠癌、颅咽管瘤、皮肤T细胞淋巴瘤、胆管癌、肝外乳腺管原位癌(DCIS)、胚胎肿瘤、子宫内膜癌、室管膜瘤、食道癌、鼻腔神经胶质瘤、尤文氏肉瘤、颅外生殖细胞肿瘤、性腺外生殖细胞肿瘤、肝外胆管癌、眼癌(包括眼内黑素瘤和成视网膜细胞瘤)、骨纤维组织细胞瘤、胆囊癌、胃癌(Gastric/Stomach Cancer)、胃肠类癌肿瘤、胃肠基质肿瘤(GIST)、生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞疾病、神经胶质瘤、毛细胞白血病、头颈癌、心脏癌、肝细胞(肝)癌、组织细胞增多病、朗格汉斯细胞(Langerhans Cell)、霍奇金淋巴瘤(Hodgkin Lymphoma)、下咽癌、眼内黑素瘤、胰岛细胞肿瘤、胰腺神经内分泌肿瘤、卡波西肉瘤、肾癌(包括肾细胞和韦尔姆斯氏瘤(Wilms Tumour))、朗格汉斯细胞组织细胞增多病、喉癌、白血病(包括急性成淋巴细胞性白血病(ALL)、急性骨髓性白血病(AML)、慢性淋巴细胞性白血病(CLL)、慢性骨髓性白血病(CML))、唇癌和口腔癌、肝癌(原发性)、小叶原位癌(LCIS)、肺癌、淋巴瘤、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症(Macroglobulinemia)、黑素瘤、梅克尔细胞癌(Merkel CellCarcinoma)、间皮瘤、隐匿性原发性转移性鳞状颈部癌症、涉及NUT基因的中线癌、口癌、儿童多发性内分泌瘤形成综合征、多发性骨髓瘤/浆细胞赘瘤、蕈样真菌病、骨髓发育不良综合征、骨髓发育不良/骨髓增生性赘瘤、多发性骨髓瘤、骨髓增生性病症、鼻腔和副鼻窦癌、鼻咽癌、成神经细胞瘤、非霍奇金淋巴瘤、非小细胞肺癌、口腔癌(Oral Cancer/OralCavity Cancer)、口咽癌、骨肉瘤、卵巢癌、胰腺癌、胰腺神经内分泌肿瘤(胰岛细胞肿瘤)、乳头状瘤病、副神经节瘤、副鼻窦和鼻腔癌、副甲状腺癌、阴茎癌、咽癌、嗜铬细胞瘤、垂体肿瘤、浆细胞赘瘤/多发性骨髓瘤、胸膜肺胚细胞瘤、妊娠和乳腺癌、原发性中枢神经系统(CNS)淋巴瘤、前列腺癌、直肠癌、肾细胞(肾)癌、肾盂和输尿管移行细胞癌、成视网膜细胞瘤、横纹肌肉瘤、唾液腺癌、肉瘤、塞扎里综合征(Sézary Syndrome)、皮肤癌、小细胞肺癌、小肠癌、软组织肉瘤、鳞状细胞癌、隐匿性原发性转移性鳞状颈部癌症、胃癌(Stomach/Gastric Cancer)、T细胞淋巴瘤、睾丸癌、喉癌、胸腺瘤和胸腺癌、甲状腺癌、肾盂和输尿管的移行细胞癌、尿道癌、子宫癌、子宫内膜、子宫肉瘤、阴道癌、外阴癌、瓦尔登斯特伦巨球蛋白血症以及韦尔姆斯氏瘤。
如上文所指出，已经鉴别到有许多癌症表达特定的或特异性癌症抗原，或其特征在于特定的或特异性癌症抗原的表达。因此可以使用已知的或所识别的癌症抗原。如本领域中已知的，某些抗原可以按许多不同的癌症类型存在，其它抗原可以对特定癌症类型具有特异性。然而，在其它情况下，表征受试者的癌症并且鉴别适用的癌症抗原可能是恰当的或必需的。因此可以使用针对通用癌症抗原的TcR治疗任何癌症并且已经鉴别了这类TcR。或者，癌症可以是目前用过继性T细胞疗法治疗的或建议这么治疗的任何癌症，例如常见癌症，如黑素瘤、血液癌症、肺癌、结肠直肠癌。另外可替代地，癌症可以是目前几乎没有治疗选择的罕见癌症(例如，处于孤儿药地位(orphan drug status))，例如胰腺癌或肉瘤。
在其它实施例中，靶细胞可以是感染细胞，并且尤其是被病毒感染的细胞。病毒可以是任何病毒，但一般是致病病毒。举例来说，病毒可以是HIV、肝炎病毒(例如，HBV或HCV)、HPV、CMV或EBV、HHV-8、HTLV-1、SV40、肠道病毒。其它可能的传染媒介物或病原体还包括细菌，例如幽门螺旋杆菌(Helicobacter pylori)、肺炎衣原体(Chlamydia pneumoniae)；和寄生虫，例如埃及血吸虫(Schistosoma haematobium)和肝吸虫、麝猫后睾吸虫(Opisthorchis viverrini)、华枝睾吸虫(Clonorchis sinensis)以及疟疾。
在本发明的一个实施例中，细胞可以直接静脉内投予给受试者。在一个替代实施例中，细胞可以经由肿瘤内注射直接投予到肿瘤中。
投予给受试者的细胞的剂量将根据靶细胞的性质而变化。在本发明的一个优选实施例中，其中靶细胞是癌细胞，剂量可以基于有待靶向的癌症的类型来计算。在一个优选实施例中，可以向受试者投予约109个细胞的剂量，然而这可以根据癌症的类型和程度而变化。可能投予约106、107或108个细胞的剂量。或者，可以投予约1010、1011或1012个细胞的更高剂量。所投予的细胞的剂量还可以根据患者的体型而变化，并且因此可以每平方米患者体表面积或每千克患者体重投予105、106、107、108、109、1010、1011或1012个细胞的剂量。
预期为了有效地治疗受试者还可以要求多个输注。举例来说，可以按24或48小时的时间间隔或每3、4、5、6或7天，向患者投予2、3、4、5、6个或更多个单独的输注。输注还可以按每周一次、每两星期一次或每月一次的时间间隔，或6周或2、3、4、5或6个月的时间间隔隔开。一年一次投予输注也是可能的。
待使用本发明的方法和细胞治疗的受试者可以是任何哺乳动物物种。举例来说，受试者可以是以下任何物种：家养宠物，如小鼠、大鼠、沙鼠、兔子、天竺鼠、仓鼠、猫或狗；或家畜，如山羊、绵羊、猪、牛或马。在本发明的另外一个优选实施例中，受试者可以是灵长类动物，如猴、长臂猿、大猩猩、猩猩(orang-utang)、黑猩猩或倭黑猩猩(bonobo)。然而，在本发明的一个优选实施例中，受试者是人类。
设想可以从任何哺乳动物物种获得用于本发明的NK细胞，然而，在一个优选实施例中，NK细胞将来自与待治疗受试者相同的哺乳动物物种。此外，并且如上文所指出，在一个优选实施例中，将使用表达来自相同的哺乳动物物种的蛋白质的基因来修饰细胞(例如，针对人类受试者，将使用人类CD3和TcR)。然而，也可能使用来自不同物种的CD3和TcR，例如可以使用表达小鼠CD3和人类TcR的基因来修饰细胞。
可以根据以下实例并且参考附图更充分地了解本发明，在附图中：
图1显示CD3能够在NK-92细胞中表达。将CD3-IRES-GFP逆转录病毒构筑体转导到NK-92细胞中。监测FITC通道中的荧光。在标记区中指示GFP+细胞。黑色：未经转染的细胞；灰色：经过转染的细胞。
图2显示在TcR存在下，能够在表达CD3-IRES-GFP的NK-92细胞的表面检测到CD3。用四个不同的TcR重复感染经过GFP+分拣的NK-92(NK-92-CD3)，即镭-1(TGFbRII移码特异性，MHC-I)和半胱氨酸变异型镭-1cys、DMF-5(MART-1特异性，MHC-I)、镭-3(hTERT特异性，MHC-II)，并且作为对照，不对细胞进行重复感染。用抗CD3给细胞染色以检测细胞表面的CD3，并且测量FITC(GFP)和APC(抗CD3)通道中的荧光。在右上象限中的细胞表达细胞表面的CD3。
图3显示能够在表达CD3-GFP的NK-92细胞的表面特异性检测到镭-1和DMF-5 TcR。将细胞转染成表达CD3和两个不同的TcR以及单独的CD3(无TcR)，两个不同的TcR是镭-1(TGFbRII移码)、DMF-5(MART-1)。用能够检测镭-1的V-β链的V-β特异性抗体(不是DMF5，上排)或用于检测细胞表面处的DMF-5 TcR的MART-1多聚体(下排)对细胞进行染色。测量FITC(GFP)和APC(抗Vb和M1-多聚体)通道中的荧光。
图4显示经过修饰以表达CD3和镭-1 TcR的NK-92细胞展现抗原特异性细胞毒性活性。将经过CD3-IRES-GFP转染的NK-92细胞(GFP+-上面的方框-CD3_IRES_GFP)和未经转染的细胞(GFP--下面的方框-NTr)选通到两个单独的群体中。将NK细胞与含有TGFbRII靶肽和不相关肽的表达单链三聚体的SupT1细胞一起培育或单独培育。通过检测NK细胞标志物CD56的表达将SupT1细胞与NK细胞分离。在与SupT1细胞一起培育之后通过检测GFP+和GFP-群体中在NK细胞中的CD107标志物来监测脱粒，并且一起绘成图(直方图，灰色：GFP-，虚线：GFP+)。
图5显示经过DMF-5或镭-1 TcR的CD3重复感染并且经过分拣的纯NK-92细胞群体被加载了相关肽的T2细胞特异性活化。上图：选通策略：使用CD3信号和GFP来分离两个细胞系。接着测试CD3+群体的CD107a表达(脱粒)。直方图：将所指示的NK-92-CD3-TcR与加载/未加载1μM肽的T2细胞一起培育(灰色阴影：无肽；深灰色轮廓：MART-1；浅灰色轮廓：TGFbRII)。
图6显示镭-1和DMF-5 TcR的EC50值的计算。
图7显示NK-92(CD3/镭-1)细胞在与α-CD3和α-CD28抗体接触后的活化的磷酸化流式细胞仪分析结果。流式细胞仪光谱右移指示相关蛋白质的磷酸化水平增加，这又指示TCR复合体的活化。
图8显示NK-92(CD3/镭-1)和NK-92(CD3/DMF-5)细胞的刺激的特异性。将NK-92细胞与呈递每个受体的特异性同源肽(用于表达镭-1的细胞的TGFbRII、用于表达DMF-5的细胞的MART-1)或随机肽的抗原呈递细胞一起培育。根据各种TcR/CD3相关蛋白的磷酸化水准，在不同的时间点测量通过TCR复合体的信号传导的刺激。这些磷酸化水平通过磷酸化流式细胞仪来测量。在每张图中，实线界定特异性同源肽对细胞的活化；虚线界定随机肽对细胞的活化。
图9显示经过镭-5或镭-6 TcR转导的NK-92(CD3)细胞的刺激的动力学。这些受体均源自CD4+T细胞并且特异性结合TGFbRII移码肽；镭-5在HLA-DR7的情况下特异性结合所述肽，镭-6在HLA-DR4的情况下特异性结合所述肽。使用来自供体患者(患者H、S和B)的组织计算镭-5和镭-6的EC50值。患者H具有HLA-DR7单倍型；患者S和B具有HLA-DR4单倍型。
实例1.
CD3在NK92细胞中的表达.
使用经过密码子优化的pMP71-CD3ζ-CD3ε-CD3γ-CD3δ-IRES-GFP(CD3-GFP)载体(Ahmadi等人2011.《血液》118,3528-3573)，用CD3转染NK92细胞，并且使用逆转录病毒转导转染细胞。在包装细胞系(Hek-Phoenix)中产生含有CD3-GFP构筑体的逆转录病毒并且对NK细胞进行离心培育(spinoculate)(将0.3M细胞与病毒上清液一起培育并且在900×g下在32C下在涂有重组人纤维蛋白片段(retronectin)(Tanaka Biotech)的培养盘上离心1小时)。GFP用作成功转导的标志物。
通过流式细胞术使用FACS Canto流式细胞仪(BD Biosciences)确认CD3对NK-92细胞的成功转导(NK-92(CD3))。监测SSC和FITC通道中的荧光，并且通过监测GFP通道中的荧光来观察成功转染(参见图1)。获得约50％的转染效率。或者，为了获得纯群体，分拣GFP+细胞。
实例2.
TcR在NK-92(CD3)细胞中的表达
测试NK-92(CD3)细胞共表达CD3和TcR的能力。为了靶向细胞表面，CD3和TcR各自需要共表达TcR复合体的另一个成员。因此可能使用NK细胞表面上的CD3的表达作为CD3和TcR对细胞成功共转染的标志。
使用逆转录病毒上清液，用四个不同的TcR(镭-1cys半胱氨酸变异型镭-1特异性(TGFbRII移码)、DMF-5、MART-1特异性(DMF-5(Johnson,L.A.等人2006《免疫学杂志(JImmunol)》177:6548-6559))以及镭-3(hTERT，MHC-II))重复感染NK-92(CD3)细胞，并且使用经过APC标记的抗CD3抗体多聚体监测每个TcR在细胞表面的CD3表达。通过监测细胞的GFP表达来检测CD3表达。检测FITC和APC通道中的荧光。表达GFP的细胞出现在点图的右侧区域中，并且在其细胞表面表达CD3的细胞出现在点图的上部区域中。共表达CD3和TcR的细胞(即在细胞表面定位有CD3-TcR复合体的细胞)出现在点图的右上方区域中。
检测经过修饰以各自表达一种TcR的细胞在细胞表面的CD3表达(图2A到图2D)(每个点图右上象限中的细胞)。具体来说，图2B显示经过修饰以表达镭-1 TcR的细胞在细胞表面的CD3表达。图2D也显示APC通道中关于GFP+细胞的小幅荧光增加，指示镭-3 TcR的低表现水平。至于缺乏TcR的细胞，未在细胞表面检测到CD3表达(图2E)。
还检测了经过修饰以表达镭1和DMF-5 TcR的NK-92(CD3)细胞中在细胞表面的TcR表达。使用经过APC标记的能够检测镭-1的V-β链的V-β特异性抗体或用于检测细胞表面的DMF-5 TcR的MART-1多聚体(下排)监测细胞表面的TcR存在情况。测量FITC(GFP)和APC(抗Vb和M1-多聚体)通道中的荧光。关于未修饰成表达TcR的NK-92(CD3)细胞，未看到APC通道中的信号增加(图3A)。经过修饰以表达镭-1 TcR的细胞当用抗Vβ抗体而不是MART-1多聚体染色时显示APC通道中的信号增加。(图3B)。经过修饰以表达DMF-5 TcR的细胞当用MART-1多聚体染色时显示APC通道中的信号增加(图3C)。
实例3.
表达TcR的NK-92(CD3)是功能性的
为了验证我们的TcR在NK细胞中表达时的功能，我们测试了在NK细胞中表达的TcR是否能够特异性识别靶细胞。
将表达TcR的NK-92(CD3)细胞与包含正确靶肽(TGFbRII)或非特异性肽(irr)的表达单链三聚体(SCT)分子的靶细胞一起培育5小时，或在不存在靶细胞(无APC)的情况下培育，并且监测脱粒标志物CD107的表达作为NK细胞被靶细胞刺激的能力的标志。SCT表示展示抗原的MHC I类蛋白质，并且由抗原肽、β2微球蛋白和h链组成，表达为单一多肽链，参见US 2010/015954和Yu,Y.Y.等人(2002)《免疫学杂志》168:3145-3149。
首先用抗CD56Tx Red(CD56是NK细胞的标志物)和TxRed对NK-92(CD3)细胞进行染色并且监测GFP荧光(图4A)。基于GFP表达观察单独的NK-92细胞群体。检测到GFP+细胞(上部区域)和GFP-NK细胞(下部区域)。监测每个细胞群体的CD107a表达，并且使用GFP-细胞作为阴性对照(即不表达TcR的细胞)。
将表达镭1-特异性TcR的NK-92(CD3)细胞与含有非特异性肽(图4C)或镭-1靶肽TGFbRII(图4D)的表达单链三聚体(SCT)分子的SupT1一起培育。还监测了在不存在抗原呈递细胞的情况下培育的细胞(图4B)。监测NK-92细胞系的CD3表达并且如上文所概述般对细胞进行选通。每个直方图中都能看到GFP+(虚线)和GFP-(实线)群体。
当与表达镭-1 SCT的SupT1细胞一起培育时，只有表达镭-1特异性TcR的NK-92(CD3)细胞显示CD107表达增加(图4D)，如通过虚线相比于实线(GFP-阴性对照)向右偏移所指示。当与表达非特异性肽的SupT1细胞一起培育时(图4C)或在不存在抗原呈递细胞的情况下培育细胞时，未看到这些细胞的CD107表达增加。
这些数据共同指示，表达镭-1特异性TcR的NK-92(CD3)能够被表达镭-1靶肽的靶细胞活化。这说明在NK-92(CD3)细胞中表达的TcR具有活性和功能性。因此表达TcR的NK-92(CD3)细胞显示具有靶细胞特异性细胞毒性。
实例4.
用加载了相关肽的T2细胞来活化表达TcR的NK-92(CD3)细胞
将NK-92(CD3)细胞修饰成表达镭-1或DMF-5 TcR并且使用经过APC标记的抗CD3检测细胞表面的CD3表达。选择CD3+细胞进行脱粒分析(图5，上图)并分拣。
将经过修饰以表达镭-1或DMF-5 TcR的NK-92(CD3)细胞与加载了TGFbRII(浅灰色轮廓)或MART1(深灰色轮廓)肽的T2细胞(图5，下图)一起培育，TGFbRII肽和MART1肽分别是镭-1和DMF-5 TcR的靶抗原。测量在任一种肽存在下与T2细胞一起培育的表达镭-1(图5，左下图)和DMF-5(图5，右下图)TcR的NK-92(CD3)细胞的CD107a表达。经过修饰以表达镭-1TcR的NK-92(CD3)细胞在TGFbRII肽存在下展现活化，并且表达DMF-5 TcR的细胞在MART-1存在下展现活化。未见到非特异性活化。
还进行了类似实验来测定每个TcR的EC50。将经过修饰以表达镭-1(圆形)和DMF-5(正方形)TcR的NK-92(CD3)细胞与T2细胞一起分别在TGFbRII或MART-1肽存在下在一系列不同的肽浓度下进行培育。通过如上文所概述般检测CD107a表达来测量活化。测量每个浓度下的CD107a表达，并且计算相对活化(CD107a作为CD107a表达的最大百分比)。计算2nM(镭-1)和7nM(DMF-5)的EC50值(图6)。
实例5.
NK-92(CD3)细胞中TcR/CD3介导的信号传导
使用磷酸化流式细胞仪测试用镭-1 TcR转染的NK-92(CD3)细胞来研究其信号传导能力。首先，通过用抗CD3和抗CD28抗体刺激细胞来分析TCR复合体的总体信号传导能力，这是模拟通过TCR的活化。如图7中所示，TcR和CD3的簇集(clustering)导致信号级联的活化，类似于在T细胞中所观察到的。这通过若干TcR/CD3相关的蛋白质的磷酸化水平增加来显示，所述蛋白质包括ZAP-70、SLP-76和CD3ζ。
接着使用抗原呈递细胞测试细胞被特异性抗原刺激的情况，并且通过磷酸化流式细胞仪监测TCR复合体在不同时间点的信号传导活性。NK-92(CD3)-镭-1和NK-92(CD3)-DMF-5均用其同源肽进行刺激。如图8中所示，仅特异性刺激引起信号传导分子磷酸化。可以区分早期信号和晚期信号，并且模式类似于T细胞中所看到的。这些数据共同说明，NK-92(CD3-TCR)在与其底物接触时像T细胞一样反应。
实例6.
用CD4+ T细胞衍生的TcR刺激NK-92(CD3)细胞
将CD4+ T细胞衍生的TcR镭5和镭6转导到NK-92(CD3)细胞中。这些TcR能够使细胞特异性地重定向于MHC II类肽靶标。镭-5和镭-6均特异性靶向TGFbRII移码突变肽(KSLVRLSSCVPVALMSAMT)；镭-5在HLA-DR7的情况下特异性靶向这种肽，镭-6在HLA-DR4的情况下特异性靶向这种肽。NK-92(CD3)-镭-5/6细胞的刺激的动力学显示于图9中。如上文在实例4中般测量NK-92(CD3)细胞刺激。计算两种TcR的EC50值，如图9中所示。镭-5EC50在HLA-DR7单倍型患者样品中经过计算为19μM；镭-6EC50在一个患者样品中经过计算为4μM并且在第二患者样品中经过计算为0.4μM。两个患者样品均属于HLA-DR4单倍型。
实例7.
分析在存在和不存在CD3/CD3-TcR表达的情况下的NK-92蛋白质表达
比较NK-92细胞的蛋白质表达谱与NK-92(CD3/CD3-TcR)细胞的蛋白质表达谱。两组细胞之间未看到变化(当然在NK-92(CD3/CD3-TcR)细胞上存在CD3这点除外)。所述比较显示在下表中(PBMC＝外周血单核细胞)。

Claims (22)

1.一种经过修饰的NK细胞，其中所述细胞是非免疫原性的并且经过修饰以表达CD3，其中所述CD3不表达为除TcR-CD3融合物以外的嵌合受体的一部分。
2.根据权利要求1所述的细胞，其中所述细胞经过修饰而为非免疫原性。
3.根据权利要求1或2所述的细胞，其中所述细胞是经过修饰的NK-92细胞。
4.根据权利要求1到3中任一项所述的细胞，其中所述细胞经过照射，或其中以其它方式降低所述细胞的增殖能力。
5.根据权利要求1到4中任一项所述的细胞，其中所述细胞经过修饰以破坏或阻止β2微球蛋白的表达。
6.根据权利要求1到5中任一项所述的细胞，其中所述细胞经过进一步修饰以表达对靶细胞上的抗原具有特异性的TcR。
7.根据权利要求6所述的细胞，其中所述TcR是独立的共受体。
8.根据权利要求4到6中任一项所述的细胞，其中所述靶细胞是癌细胞。
9.根据权利要求4到6中任一项所述的细胞，其中所述靶细胞是感染细胞。
10.根据权利要求4到8中任一项所述的细胞，其用于疗法中。
11.根据权利要求4到8中任一项所述的细胞，其用于过继性细胞转移疗法中。
12.根据权利要求10所述的细胞，其用于癌症疗法中。
13.根据权利要求9到11中任一项所述的细胞，其中所述TcR对由待治疗受试者的靶细胞表达的抗原和所述受试者的MHC类型均具有特异性。
14.根据权利要求4到12中任一项所述的经过修饰的NK细胞在制造用于过继性细胞转移疗法中的药物方面的用途，优选地其中所述疗法是癌症疗法。
15.一种治疗性组合物，包含根据权利要求4到12中任一项所述的经过修饰的NK细胞以及至少一种药学上可接受的载体或赋形剂。
16.一种治疗方法，所述方法包含向有需要的受试者投予有效量的根据权利要求4到12中任一项所述的经过修饰的NK细胞。
17.一种制造用于制备用于过继性细胞转移疗法的细胞的通用NK细胞的方法，所述方法包含：
(a)提供非免疫原性NK细胞；和
(b)修饰所述细胞以表达CD3。
18.一种用于制备用于治疗用途的经过修饰的NK细胞的方法，所述方法包含：
(a)提供已经过修饰以表达CD3的非免疫原性NK细胞；
(b)确定待治疗受试者的MHC类型；
(c)鉴别所述受试者中的靶抗原，所述抗原由所述受试者中的细胞表达或呈递；
(d)修饰步骤(a)的所述细胞以表达对所述靶抗原具有特异性并且匹配所述受试者的所述MHC类型的TcR。
19.根据权利要求17所述的方法，其中所述TcR对癌症抗原具有特异性。
20.一种用于过继性细胞转移疗法中的试剂盒，所述试剂盒包含：
(a)根据权利要求1到5中任一项所述的经过修饰的通用NK细胞；和
(b)一组各自编码TcR的核酸分子，其中所述TcR具有不同的抗原特异性和/或不同的MHC特异性。
21.根据权利要求19所述的试剂盒，其中所述核酸分子被包含在载体中，优选是病毒载体。
22.一组经过修饰的NK细胞，每个NK细胞都是非免疫原性的并且经过修饰以表达CD3和TcR，其中不同的NK细胞的TcR具有不同的抗原特异性和/或不同的MHC特异性。
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112912727A (zh) * 2018-08-31 2021-06-04 因维克蒂斯股份有限公司 评估car功能性的方法
CN113728231A (zh) * 2019-03-22 2021-11-30 盖亚生物制药有限公司 提供免疫细胞的方法

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* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP3466967A1 (en) 2015-05-18 2019-04-10 TCR2 Therapeutics Inc. Compositions and methods for tcr reprogramming using fusion proteins
WO2017192440A1 (en) * 2016-05-02 2017-11-09 Cerus Corporation Compositions and methods for improved nk cell therapies
CN109715668A (zh) 2016-08-02 2019-05-03 T细胞受体治疗公司 用于使用融合蛋白进行tcr重编程的组合物和方法
PT3445787T (pt) 2016-10-07 2021-03-15 Tcr2 Therapeutics Inc Composições e métodos para reprogramação de recetores de célula t com o uso de proteínas de fusão
CN110177803A (zh) 2016-11-22 2019-08-27 T细胞受体治疗公司 用于使用融合蛋白进行tcr重新编程的组合物和方法
US20190358263A1 (en) 2016-12-07 2019-11-28 Oslo Universitetssykehus Hf Compositions and Methods for Cell Therapy
EP3565565A4 (en) * 2017-01-04 2020-12-09 Nova Southeastern University NATURAL KILLER CELLS (NK) FOR THE EXPRESSION OF AN ANTIGENS-SPECIFIC FUNCTIONAL T-CELL RECEPTOR (TCR) COMPLEX, METHOD FOR MANUFACTURING THEREOF AND METHOD FOR THERAPEUTIC USE THEREOF
EP3750547A1 (en) 2019-06-13 2020-12-16 Universitätsmedizin der Johannes Gutenberg-Universität Mainz Modified nk-92 cells, and therapeutic and diagnostic uses thereof
CN111662871A (zh) * 2020-06-11 2020-09-15 福建医科大学孟超肝胆医院(福州市传染病医院) 一种核酸适体功能化nk细胞及其制备与应用
AU2021348239A1 (en) 2020-09-24 2023-05-04 Medigene Immunotherapies Gmbh Prame specific t-cell receptors and uses thereof
TW202233831A (zh) * 2020-11-03 2022-09-01 中國大陸商杭州啟函生物科技有限公司 增強免疫療法的系統和方法
GB202017873D0 (en) 2020-11-12 2020-12-30 Olso Unversitetssykehus Hf Method of determining DLBCL prognosis
KR20220160479A (ko) * 2021-05-27 2022-12-06 (주)에스엠티바이오 신경내분비종양의 치료용 자연살해세포
WO2023047089A1 (en) 2021-09-21 2023-03-30 Oslo Universitetssykehus Hf Binding proteins for terminal deoxynucleotidyl transferase (tdt)
WO2023078287A1 (en) * 2021-11-03 2023-05-11 Hangzhou Qihan Biotechnology Co., Ltd. Systems and methods for enhanced immunotherapies
WO2024020537A2 (en) * 2022-07-22 2024-01-25 Board Of Regents, The University Of Texas System Cd3-expressing natural killer cells with enhanced function for adoptive immunotherapy

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060292156A1 (en) * 2004-07-10 2006-12-28 Campbell Kerry S Genetically modified human natural killer cell lines
US20130273083A1 (en) * 2012-02-22 2013-10-17 Ingenium Biotherapy Corporation System for Immunotherapy Targeting Tumor Propagation and Progression

Family Cites Families (14)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5124251A (en) 1990-01-31 1992-06-23 Becton, Dickinson And Company CD3 ζ co-associated complex on CD16- NK cells
EP1690927A1 (en) 1997-04-30 2006-08-16 Hans Klingemann Natural killer cell lines and methods of use
IL127142A0 (en) 1998-11-19 1999-09-22 Yeda Res & Dev Immune cells having predefined biological specificity
JP4716350B2 (ja) 2001-12-04 2011-07-06 ダナ−ファーバー キャンサー インスティテュート インク． 潜伏期膜タンパク質に対する抗体およびそれらの使用
JP5525689B2 (ja) * 2004-11-02 2014-06-18 ザ ガバメント オブ ザ ユナイテッド ステイツ オブ アメリカ アズ リプレゼンティッド バイ ザ セクレタリー デパートメント オブ ヘルス アンド ヒューマン サービシーズ 過剰増殖性障害を処置するための組成物および方法
US8518697B2 (en) 2006-04-04 2013-08-27 Washington University Single chain trimers and uses therefor
CN101631138A (zh) 2008-07-18 2010-01-20 深圳富泰宏精密工业有限公司 个人信息代理系统及方法
US8785601B2 (en) * 2009-01-28 2014-07-22 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services T cell receptors and related materials and methods of use
US11471486B2 (en) 2012-09-04 2022-10-18 Inven2 As Selective and controlled expansion of educated NK cells
US9511092B2 (en) 2013-01-28 2016-12-06 St. Jude Children's Research Hospital, Inc. Chimeric receptor with NKG2D specificity for use in cell therapy against cancer and infectious disease
AU2014212009B2 (en) 2013-02-04 2020-01-30 Roger Williams Medical Center Methods and compositions for treating gastrointestinal stromal tumor (GIST)
JP6425301B2 (ja) * 2014-05-29 2018-11-21 国立大学法人富山大学 Ｔｃｒの細胞傷害活性誘導能を評価するためのｎｋ細胞株、およびその作製方法
AU2015276136A1 (en) 2014-06-18 2016-12-22 Chemotherapeutisches Forschungsinstitut Georg-Speyer-Haus Car-expressing NK-92 cells as cell therapeutic agents
US20170274014A1 (en) * 2014-07-21 2017-09-28 Jennifer Brogdon Combinations of low, immune enhancing, doses of mtor inhibitors and cars

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US20060292156A1 (en) * 2004-07-10 2006-12-28 Campbell Kerry S Genetically modified human natural killer cell lines
US20130273083A1 (en) * 2012-02-22 2013-10-17 Ingenium Biotherapy Corporation System for Immunotherapy Targeting Tumor Propagation and Progression

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAVID A. KNORR ET AL.: "Pluripotent stem cell-derived natural killer cells for cancer therapy", 《TRANSLATIONAL RESEARCH》 *
HALL C. ET AL.: "Requirements for cell surface expression of the human TCR/CD3 complex in non-T cells", 《INT IMMUNOL.》 *
LANIER, L.L. ET AL.: "Expression of cytoplasmic CD3 epsilon proteins in activated human adult natural killer(NK) cells and CD3 gamma, delta, epsilon complexes in fetal NK cells: Implications for the relationship of NK and T lymphocytes", 《J IMMUNOL.》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112912727A (zh) * 2018-08-31 2021-06-04 因维克蒂斯股份有限公司 评估car功能性的方法
CN113728231A (zh) * 2019-03-22 2021-11-30 盖亚生物制药有限公司 提供免疫细胞的方法

Also Published As

Publication number Publication date
GB201501175D0 (en) 2015-03-11
ES2922231T3 (es) 2022-09-12
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