CN112437668A - 通过ptp1b抑制活化细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明一般涉及活化用于治疗的细胞的方法。例如，本发明涉及制备用于免疫治疗，特别是用于癌症免疫治疗的离体细胞。更具体地，本发明涉及制备用于过继细胞转移的表现出细胞毒性特性的白细胞(特别是通过PTP1B抑制的T细胞)的方法。本发明还涉及用于癌症免疫治疗的细胞和包括它们的组合物。本发明还涉及免疫治疗的方法，特别是癌症免疫治疗的方法。

Description

通过PTP1B抑制活化细胞的方法
技术领域
本发明一般涉及活化用于治疗的细胞的方法。例如，本发明涉及制备用于免疫治疗，特别是用于癌症免疫治疗的离体细胞。更具体地，本发明涉及制备用于过继细胞转移的表现出细胞毒性特性的白细胞(特别是T细胞)的方法。本发明还涉及用于癌症免疫治疗的细胞和包括它们的组合物。本发明还涉及免疫治疗的方法，特别是癌症免疫治疗的方法。
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本申请要求澳大利亚临时申请AU 2018901979的优先权，通过引用将其内容和公开整体并入本文。
背景技术
免疫治疗是利用患者的免疫系统来抵抗疾病(例如癌症或病毒感染)，通过刺激患者的免疫系统来攻击恶性肿瘤或病毒感染的细胞(并且不伤害患者的正常细胞)。免疫治疗的一种模式采用患者的免疫(例如，通过施用癌症疫苗)来训练患者的免疫系统以识别和破坏肿瘤细胞。另一种方法是利用治疗性抗体的施用，从而招募患者的免疫系统来破坏肿瘤细胞。基于细胞的免疫治疗是另一种方法，其涉及诸如自然杀伤细胞(NK细胞)、淋巴因子活化的杀伤细胞(LAK)、细胞毒性T淋巴细胞(CTL)、树突状细胞(DC)等的免疫细胞。
患者自身的免疫系统可以耐受许多种肿瘤细胞或病毒感染的细胞，由于它们是患者自身的细胞(例如，它们是自体的)并且不会被患者的免疫系统有效识别，从而使肿瘤或病毒感染的细胞在没有适当的监管控制下生长并分裂。另外，肿瘤特异性T细胞通常是耐受的，因此它们不响应肿瘤活性。因此，患者自身的免疫系统需要刺激才会攻击患病细胞。
过继细胞转移(ACT)是一种有效的免疫治疗形式，涉及将具有抗肿瘤或抗病毒活性的免疫细胞转移到患者中。ACT是一种治疗方法，其通常涉及识别具有抗肿瘤或抗病毒活性的淋巴细胞，将这些细胞大量体外扩增并将其输注到患病宿主中。
过继T细胞治疗取决于以下能力：最佳选择或基因工程具有靶标抗原特异性的细胞，然后诱导T细胞增殖同时保留其效应子功能以及移植和归巢能力。然而，已经对过继转移的细胞进行了临床试验，这些细胞是在目前被认为会损害T细胞的基本功能(例如抗原特异性细胞毒活性)的次优条件下培养的。
当前用于制备用于过继细胞治疗的细胞的方法受限于它们所提供的细胞对靶细胞(例如肿瘤细胞)的细胞杀伤小于预期。因此，需要用于过继细胞治疗或用于制备用于过继细胞治疗的细胞的新的或改进的方法和/或组合物。
还另外需要用于刺激免疫系统以治疗癌症的新的或改进的方法和/或组合物。
在说明书中对任何现有技术的引用不是承认或暗示：该现有技术在任何管辖范围内构成公知常识的一部分，或者该现有技术可以被合理地预期能被本领域技术人员理解、视为相关，和/或可以与现有技术的其他片段结合。
发明内容
本发明涉及一种用于生产具有增强的杀伤靶细胞能力的白细胞的方法，该方法包括：
-在能使PTP1B抑制剂失活白细胞中的PTP1B的条件下，使白细胞与PTP1B抑制剂接触，
从而产生具有增强的杀伤靶细胞能力的白细胞。
本发明涉及用于生产具有增强的杀伤靶细胞能力的白细胞的方法，该方法包括：
-在能使白细胞中的PTP1B失活的条件下，使白细胞与PTP1B抑制剂离体接触足够的时间，
从而产生具有增强的杀伤靶细胞能力的白细胞。
本发明涉及一种用于制备表现出细胞毒性T细胞的至少一种特性的离体T细胞群的方法，其包括在PTP1B抑制剂的存在下培养T细胞。
本发明涉及一种用于制备表现出细胞毒性T细胞的至少一种特性的离体T细胞群的方法，其包括以下步骤：
-在PTP1B抑制剂的存在下，从生物样品中培养T细胞群；
-扩增培养的细胞；
从而制备表现出细胞毒性特性的离体T细胞群。优选地，所述生物样品源自患有癌症的主体，或者已经被调节或改造成对癌症具有特异性。
本发明涉及一种用于制备包含抗原特异性细胞毒性T细胞的组合物的离体方法，该方法包括：
-提供含有T细胞群的生物样品；
-在PTP1B抑制剂的存在下，将抗原物质与T细胞群共培养；以及
-扩增培养的细胞；
从而离体制备包含抗原特异性细胞毒性T细胞的组合物。
本发明涉及一种用于扩增白细胞群的方法，该方法包括：
-在能使PTP1B抑制剂失活白细胞中的PTP1B的条件下，使白细胞群与PTP1B抑制剂接触，
从而扩增白细胞群。所述白细胞可以包含T细胞或B细胞。优选地，所述白细胞包含T细胞，所述T细胞包括CD4+和CD8+ T细胞。所述T细胞还可以包括效应子和效应子记忆T细胞和/或中央记忆T细胞。所述T细胞也可以进行基因改造以表达抗肿瘤T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)，或者可以是γδT细胞。所述白细胞还可以包含肿瘤浸润淋巴细胞、外周血淋巴细胞，或者用混合淋巴细胞肿瘤细胞培养物(mixed lymphocyte tumour cell culture，MLTC)富集，或者使用自体抗原呈递细胞和肿瘤衍生肽进行克隆。淋巴细胞可以从组织相容性供体或患癌主体中分离。
本发明涉及一种增加主体中表现出效应子记忆表型的T细胞水平的方法，其包括以下步骤：
-在PTP1B抑制剂的存在下，从生物样品中离体培养T细胞群；
-扩增培养的细胞；
-将培养的细胞施用于主体；
从而增加主体中表现出效应子记忆表型的T细胞水平。
本发明还提供了一种用于在主体中形成适于治疗癌症的免疫应答的方法，包括以下步骤：
-从所述主体或组织相容性供体主体获得T细胞；
-在能产生表现出至少一种细胞毒性T细胞特性的T细胞群的条件下，在PTP1B抑制剂的存在下离体培养T细胞足够的时间，从而形成细胞毒性T细胞群，
-将细胞毒性T细胞群施用于所述主体；
从而在主体中产生适于治疗癌症的免疫应答。
本发明还涉及一种增强具有疾病状态的主体中CD8+ T细胞介导的免疫的方法，包括：
-在能产生表现出细胞毒性T细胞的至少一种特性的CD8+ T细胞群的条件下，使CD8+T细胞与PTP1B抑制剂离体接触足够的时间；
-将CD8+ T细胞群施用于主体；
从而增强主体中CD8+ T细胞介导的免疫。
本发明还涉及一种增强具有疾病状态的主体中CD8+ T细胞介导的免疫的方法，包括：
-分离所述主体的CD8+ T细胞群；
-将编码针对PTP1B的siRNA、shRNA或gRNA的核酸分子引入分离的CD8+ T细胞中，从而降低CD8+ T细胞中PTP1B的水平；以及
-将CD8+ T细胞重新引入所述主体中，
从而增强主体中CD8+ T细胞介导的免疫。
本发明涉及一种促进主体中癌症消退的方法，其包括以下步骤：
-在PTP1B抑制剂的存在下，培养从主体获得的T细胞，
-将培养的T细胞施用于所述主体；
从而促进癌症的消退。
本发明涉及一种促进患有癌症的主体中癌症消退的方法，其包括以下步骤：
-在PTP1B抑制剂的存在下，培养对所述癌症所表达的肿瘤抗原具有特异性的CAR-T细胞，
-将培养的CAR-T细胞施用于所述主体；
从而促进癌症的消退。
本发明涉及一种延长患有癌症的主体的存活的方法，其包括以下步骤：
-在PTP1B抑制剂的存在下，培养对所述癌症所表达的肿瘤抗原具有特异性的CAR-T细胞，
-将培养的CAR-T细胞施用于所述主体；
从而延长所述主体的存活。
在上述实施方案的一些实例中，所述癌症是Her-2阳性癌症，并且所述CAR-T细胞对Her-2具有特异性，但是应当理解，该方法不限于所述癌症表达的肿瘤抗原的类型。(在其他实例中，所述癌症对肿瘤抗原CD171、EGFR、MSLN、CD19、CD123、Lewis Y、FAP、CD22、GD2或CD131呈阳性，并且CAR-T细胞对这些抗原中的任何一种或多种具有特异性。)
在本发明的任何方法中，所述T细胞在被施用于主体之前不需要暴露于细胞因子(例如IL-2、IL-15或IL-17)。或者，被施用T细胞的个体不需要同时施用用于增强T细胞增殖的细胞因子(例如IL-2、IL-15或IL-17)。
本发明还涉及用于过继免疫治疗的肿瘤抗原特异性细胞毒性T细胞，其包含编码干扰RNA的外源核酸，所述干扰RNA例如为能够降低细胞中PTP1B水平的微小RNA、shRNA、siRNA或gRNA分子。
本发明涉及一种分离的、纯化的或重组的细胞，其包含抗原特异性T细胞受体和编码干扰RNA的外源核酸，所述干扰RNA例如为能够降低细胞中PTP1B水平的微小RNA、shRNA、siRNA或gRNA分子。优选地，TCR对癌症抗原具有特异性，并且该细胞是CD8+ T细胞。所述CD8+ T细胞可以是从患有癌症的宿主分离的肿瘤浸润淋巴细胞或外周血淋巴细胞。
本发明涉及一种治疗主体中癌症的方法，其包括施用对治疗所述癌症有效的分离的或纯化的CD8+ T细胞群，所述CD8+ T细胞包含抗原特异性T细胞受体和编码干扰RNA的外源核酸，所述干扰RNA例如为针对PTP1B的微小RNA、shRNA、siRNA或gRNA分子。
本发明还提供了一种用于增殖、富集或扩增包含CD8+ T细胞的细胞组合物的方法，该方法包括在培养基中培养细胞组合物，所述培养基包含PTP1B抑制剂，其中所述PTP1B抑制剂被提供在培养基中以允许在培养期间与CD8+ T细胞接触。优选地，所述增殖、富集或扩增将导致表现出至少一种细胞毒性T细胞特性的CD8+ T细胞的数量加倍。更优选地，所述细胞扩增将导致3×或4×数量的表现出至少一种细胞毒性T细胞特性的CD8+ T细胞。CD8+T细胞的扩增可以是5×、6×、7×、8×、9×或超过10×。该方法还可以增加组合物中表现出至少一种细胞毒性T细胞特性的CD8+ T细胞的相对数量。
本发明还涉及一种细胞毒性细胞的组合物，其中大于20％的细胞具有完全或部分的PTP1B抑制。优选地，所述组合物包括大于30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的具有完全或部分的PTP1B抑制的细胞。在一个实施方案中，所有细胞均具有完全或部分的PTP1B抑制。
本发明还涉及一种包含如本文所述的白细胞和PTP1B抑制剂的组合物。优选地，所述PTP1B抑制剂是如本文所述的干扰RNA，或者是小分子抑制剂、claramine、trodusquemine、其衍生物(包括DPM-1001)或本文所述的任何其他小分子抑制剂。所述组合物可以进一步包含用于增强细胞杀伤的细胞因子，例如IL-2或IFNγ。优选地，所述白细胞是CAR T细胞，更优选地，所述CAR T细胞对细胞表面肿瘤抗原具有特异性。在一个实例中，所述CAR-T细胞对Her-2具有特异性，但是应当理解，该方法不限于癌症所表达的肿瘤抗原的类型。在其他实例中，所述CAR-T细胞对一种或多种肿瘤抗原具有特异性，所述肿瘤抗原包括但不限于CD171、EGFR、MSLN、CD19、CD123、Lewis Y、FAP或CD131或任何其他肿瘤抗原。
所述T细胞可以选自由以下组成的组：肿瘤浸润淋巴细胞、外周血淋巴细胞、经过基因改造以表达抗肿瘤T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)、γδT细胞、用混合淋巴细胞肿瘤细胞培养物(MLTC)富集或使用自体抗原呈递细胞和肿瘤衍生肽进行克隆。淋巴细胞可以从组织相容性供体或患癌主体中分离。
在本发明的任何方法中，在PTP1B抑制剂的存在下进行培养之前，将白细胞或T细胞纯化或基本纯化。该步骤通过从生物样品中去除其他细胞类型来富集白细胞或T细胞。
在一个实施方案中，所述CAR-T细胞是Her-2特异性CAR CD8+ T细胞。在替代性实施方案中，所述CAR-T细胞是CD19特异性CAR CD8+ T细胞，或是CD171特异性CAR CD8+ T细胞，或EGFR特异性CAR CD8+ T细胞，或CD22特异性CAR CD8+ T细胞，或CD123特异性CAR CD8+ T细胞，或Lewis Y特异性CAR CD8+ T细胞，或MSLN特异性CAR CD8+ T细胞，或FAP特异性CAR CD8+ T细胞，或CD131特异性CAR CD8+ T细胞等。所述T细胞可以是包括一种以上的T细胞类型的群体，包括本文所述的任意一种或多种类型。例如，T细胞群可以包括幼稚T细胞、活化T细胞和/或记忆T细胞。
本发明涉及一种用于增加主体中表现出效应子记忆表型的T细胞水平的方法，该方法包括以下步骤：
-将PTP1B抑制剂施用于所述主体；
从而增加主体中表现出效应子记忆表型的T细胞水平。
本发明还提供了一种用于在主体中形成适于治疗癌症的免疫应答的方法，包括以下步骤：
-将PTP1B抑制剂施用于所述主体；
从而在主体中产生适于治疗癌症的免疫应答。
本发明还涉及一种增强具有疾病状态的主体中CD8+ T细胞介导的免疫的方法，包括：
-将PTP1B抑制剂施用于所述主体；
从而增强主体中CD8+ T细胞介导的免疫。
本发明还涉及一种治疗主体中癌症的方法，其包括：
-将PTP1B抑制剂施用于所述主体；
从而治疗所述主体中的癌症。
本发明还涉及一种在经受癌症的主体中活化耗尽的肿瘤浸润淋巴细胞的方法，其包括：
-将PTP1B抑制剂施用于所述主体；
从而活化所述主体中的肿瘤浸润淋巴细胞。
本发明涉及一种促进患有癌症的主体中的癌症消退的方法，其包括以下步骤：
-将PTP1B抑制剂施用于所述主体；
从而促进癌症的消退。
在一些实施方案中，所述癌症是Her-2阳性癌症。或者，所述癌症可以是CD19阳性癌症、CD171阳性癌症、EGFR阳性癌症、CD22阳性癌症、CD123阳性癌症、Lewis Y阳性癌细胞、或MSLN阳性癌症、FAP阳性癌症或CD131阳性癌症。然而，应当理解，本发明不受需要治疗的癌症类型的限制。
本发明涉及一种延长患有癌症的主体的存活的方法，其包括以下步骤：
-将PTP1B抑制剂施用于所述主体；
从而延长所述主体的存活。优选地，所述癌症是Her-2阳性癌症。
在以上任何方法中，所述方法可以进一步包括向个体施用CAR T细胞。所述CAR-T细胞可以是Her-2特异性CAR CD8+ T细胞。在其他实例中，所述CAR-T细胞对一种或多种肿瘤抗原具有特异性，所述肿瘤抗原包括但不限于CD171、EGFR、MSLN、CD19、CD123、Lewis Y、FAP或CD131或任何其他肿瘤抗原。
因此，本发明还涉及一种治疗主体中癌症的方法，其包括：
-提供已接受CAR-T细胞来治疗癌症的主体，
-将PTP1B抑制剂施用于所述主体；
从而治疗所述主体中的癌症。
进一步地，本发明涉及一种增强针对主体中癌症的CAR-T治疗的方法，该方法包括：
-提供已接受CAR-T细胞来治疗癌症的主体，
-将PTP1B抑制剂施用于所述主体；
从而增强针对所述主体中癌症的CAR-T治疗。
本发明还提供了PTP1B抑制剂在药物制备中的用途，所述药物用于：
-增加主体中表现出效应子记忆表型的T细胞水平；
-在主体中形成适于治疗癌症的免疫应答；
-增强具有疾病状态的主体中CD8+ T细胞介导的免疫；
-治疗主体中的癌症；
-促进患有癌症的主体中癌症的消退；或
-延长患有癌症的主体的存活。
所述药物可以进一步包括CAR-T细胞。优选地，所述CAR-T细胞是Her-2特异性CARCD8+ T细胞。在其他实例中，所述CAR-T细胞对一种或多种肿瘤抗原具有特异性，所述肿瘤抗原包括但不限于CD171、EGFR、MSLN、CD19、CD123、Lewis Y、FAP或CD131或任何其他肿瘤抗原。
本发明还提供了用于以下用途的PTP1B抑制剂或包含PTP1B抑制剂的药物组合物：
-增加主体中表现出效应子记忆表型的T细胞水平；
-在主体中形成适于治疗癌症的免疫应答；
-增强具有疾病状态的主体中CD8+ T细胞介导的免疫；
-治疗主体中的癌症；
-促进患有癌症的主体中癌症的消退；或
-延长患有癌症的主体的存活。
上述用途可以与对需要治疗的个体施用CAR-T细胞相结合。所述CAR-T细胞可以是，但不限于Her-2特异性CAR CD8+ T细胞。
在本发明的任何方面，所述PTP1B抑制剂可以直接施用于个体。施用途径可以是系统性的或如本文所述的允许PTP1B抑制剂进入循环的任何途径。将理解，对个体直接施用PTP1B抑制剂能够用于活化不然会被耗尽的肿瘤浸润淋巴细胞。
如本文所用，PTP1B抑制剂可以是抑制PTP1B的磷酸酶活性的任何分子。该抑制剂可以是磷酸酶活性位点的直接抑制剂，可以变构地起作用以抑制磷酸酶活性、抑制PTP1B与其底物的相互作用，或者可以通过降低PTP1B基因的转录活性或减少细胞中存在的PTP1BmRNA或蛋白质的量来降低PTP1B的水平。
所述PTP1B抑制剂可以特异性结合并直接抑制PTP1B，使得PTP1B的脱靶作用最小化。优选地，PTP1B抑制剂将另一靶标的活性或表达抑制或降低不超过约5％，不超过约10％，不超过约15％或不超过约20％。优选地，所述PTP1B抑制剂抑制或降低PTP1B的活性至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或更高。在某些实施方案中，所述抑制剂完全抑制或阻止PTP1B的活性。
通常，该抑制剂是小分子，例如claramine、trodusquemine(或衍生物DPM-1001)或如本文所述的任何其他小分子抑制剂、或肽或拟肽。所述抑制剂也可以是抑制性RNA或干扰RNA，例如反义RNA、siRNA、微小RNA或shRNA。
在进一步的实施方案中，所述抑制剂是用于基于CRISPR的基因组编辑的gRNA(包括sgRNA)，其导致ptp1b表达部分或完全降低或PTP1B活性部分或完全降低。尽管gRNA通常与基因组编辑系统(例如CRISPR-Cas9)一起使用，但将理解也可以使用利用gRNA的其他基因组编辑方法(例如Cpf1或CRISPR-Cas12a)。
在本发明的任何方面，唯一的抑制是针对PTP1B的。换句话说，除PTP1B外，没有其他基因或基因产物被抑制。例如，唯一使用的小分子抑制剂是PTP1B抑制剂，或者唯一使用的miRNA、shRNA、siRNA或gRNA靶向PTP1B，或者唯一的基因组编辑发生在PTP1B基因上。
在本发明的任何方面，唯一被抑制的磷酸酶是PTP1B。换句话说，没有其他磷酸酶被抑制。例如，PTP1B抑制剂不抑制另一种磷酸酶。
如本文所用，除非上下文另有要求，否则术语“包括”和该术语的变体，例如“含有”、“包含”和“所包括的”，并不旨在排除进一步的添加剂、组分、整体或步骤。
通过以实施例的方式并参考附图给出的以下描述，本发明的进一步的方面以及在前述段落中描述的方面的进一步实施方案将变得清楚。
附图说明
图1.C57BL/6.Ptpn1-/-小鼠的胸腺细胞发育。用针对A)CD4和CD8，B)谱系标志物(CD4、CD8、CD3、Gr-1、B220、CD19、CD11b、CD11c、NK1.1、TER119)、CD25、CD44和c-KIT，以及C)TCRβ、CD69和CD5的荧光染料偶联抗体对来自7周龄小鼠的C57BL/6.Ptpn1+/+和C57BL/6.Ptpn1-/-胸腺细胞进行染色，并通过流式细胞术进行分析。A)针对CD4+、CD8+、CD4+/CD8+(DP)和CD4-/CD8-(DN)胸腺细胞亚群对细胞设门，并确定绝对数。B)针对谱系-CD25loCD44hiKIThi(DN1)、谱系-CD25hiCD44hiKIThi(DN2)、谱系-CD25hiCD44loKITlo(DN3)、谱系-CD25loCD44loKITlo(DN4)对细胞设门，并确定绝对数。C)根据阳性选择标志物CD69、CD5和TCRβ的表达，针对不同发育阶段(标记为1-4)对细胞设门，并确定百分数。(A-C)中的结果是来自指定数量的小鼠的平均值±标准误。
图2.T细胞特异性PTP1B缺失增加胸腺细胞数，而对CD4/CD8谱系提交(lineagecommitment)没有发育影响。从胸腺、淋巴结(LN)、脾脏和肝脏制备来自8周龄C57BL/6.Lck-Cre；Ptpn1fl/fl小鼠(n＝8)和C57BL/6.Ptpn1fl/fl(n＝8)小鼠的单细胞悬液。在室温下，将细胞用荧光染料偶联抗体的FACS缓冲液(含2％胎牛血清的D-PBS)染色30分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞两次，并通过流式细胞术进行分析。A)C57BL/6.Lck-Cre；Ptpn1fl/fl小鼠的胸腺(p＝0.0499)、淋巴结(p＝0.0003)和脾脏(p＝0.0207)的总细胞数增加。B)C57BL/6.Lck-Cre；Ptpn1fl/fl双阳性(DP)胸腺细胞(p＝0.008)、双阴性(DN)胸腺细胞(p＝0.008)、CD4+胸腺细胞(p＝0.0013)和CD8+胸腺细胞(p＝0.0293)中的细胞数增加。C)在C57BL/6.Lck-Cre；Ptpn1fl/fl小鼠中，在胸腺细胞发育的各个阶段(p＝0.002、p＝0.001、p＝0.053、p＝0.001)的细胞数增多。D)在C57BL/6.Lck-Cre；Ptpn1fl/fl小鼠中，CD8+/CD4+胸腺细胞比例没有变化(p＝0.7984)。所示结果为平均值±标准误，代表两个独立的实验；使用双尾Mann-WhitneyU检验确定显著性。
图3.C57BL/6.Ptpn1-/-小鼠中的T细胞亚群。从7周龄小鼠的脾脏、淋巴结和肝脏分离的C57BL/6.Ptpn1+/+和C57BL/6.Ptpn1-/-淋巴细胞用针对CD4、CD8、CD44和CD62L的荧光染料偶联抗体进行染色，并通过流式细胞术进行分析。确定了总的CD4+或CD8+ T细胞以及CD4+与CD8+幼稚(CD44loCD62Lhi)和效应子/记忆样(CD44hiCD62Llo；EM)和中央/记忆样(CD44hiCD62Lhi；CM)T细胞的绝对数量。所示结果为平均值±标准误；使用双尾Mann-Whitney U检验确定显著性；*p＜0.05，**p＜0.01。
图4.T细胞特异性PTP1B缺陷增加外周中记忆T细胞群的细胞数。从胸腺、淋巴结、脾脏和肝脏制备来自8周龄C57BL/6.Lck-Cre；Ptpn1fl/fl小鼠(n＝8)和C57BL/6.Ptpn1fl/fl(n＝8)小鼠的单细胞悬液。在室温下，将细胞用荧光染料偶联抗体FACS缓冲液染色30分钟。用FACS缓冲液洗涤细胞两次，并通过流式细胞术进行分析。A-B)在来自C57BL/6.Lck-Cre；Ptpn1fl/fl小鼠的淋巴结和脾脏中，包括幼稚、效应子/记忆和中央/记忆T细胞的总的CD4+和CD8+ T细胞显著增加。C)C57BL/6.Lck-Cre；Ptpn1fl/fl小鼠的淋巴结(p＝0.0047)和脾脏(p＝0.0379)中，CD4+CD185+GL-7+生发中心滤泡辅助T细胞(germinal center follicularhelper T cell)显著增加。来自C57BL/6.Lck-Cre；Ptpn1fl/fl小鼠的淋巴结(p＝0.0011)和脾脏(p＝0.0006)中，B细胞数显著增加。D)来自C57BL/6.Lck-Cre；Ptpn1fl/fl小鼠的淋巴结(p＝0.0002)、脾脏(p＝0.0019)和胸腺(p＝0.0281)中，CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞显著增加。所示结果为平均值±标准误，并代表两个独立的实验；使用双尾Mann-Whitney U检验确定显著性。
图5.PTP1B缺陷增强TCR介导的活化。A)将FACS纯化的来自7周龄C57BL/6.Ptpn1+/+和C57BL/6.Ptpn1-/-小鼠的CD8+幼稚(CD44loCD62Lhi)和CD4+幼稚(CD25loCD44loCD62Lhi)脾脏T细胞(2×105)用板结合的α-CD3ε和α-CD28(1.25μg/ml)刺激48小时。收获细胞并用针对CD44、CD25、CD62L和CD69的荧光染料偶联抗体染色。通过流式细胞术分析细胞，并确定指示的平均荧光强度(MFI)。所示单位是任意的(AU)。B)将FACS纯化的来自7周龄C57BL/6.Lck-Cre；Ptpn1fl/fl小鼠(n＝5)和C57BL/6.Ptpn1fl/fl小鼠(n＝5)的CD8+幼稚((CD44loCD62Lhi)和CD4+幼稚(CD25loCD44loCD62Lhi)脾脏T细胞(2×105)分离，并用α-CD3(1.25μg/ml)和α-CD28(1.25μg/ml)抗体刺激48小时。在C57BL/6.Lck-Cre；Ptpn1fl/fl CD4+(p<0.0001；p<0.0001；p<0.0001)和CD8+ T细胞(p<0.0001；p<0.0001；p<0.0001)上的活化标志物CD25、CD44和CD69显著增高。所示结果为平均值±标准误并代表两个独立的实验；使用双尾Mann-Whitney U检验确定显著性；*p<0.05。
图6.PTP1B缺陷增强TCR介导的CD4+幼稚T细胞体外增殖。将FACS纯化的来自来自7周龄C57BL/6.Ptpn1+/+和C57BL/6.Ptpn1-/-小鼠的CD4+幼稚(CD25loCD44loCD62Lhi)淋巴结T细胞用2μM Cell Tracker Violet(CTV)染色并用指定浓度的板结合的α-CD3ε刺激72h，并通过流式细胞术进行分析。显示了来自两个独立实验的指定数目的小鼠的代表性直方图叠加图和定量结果。所示结果为平均值±标准误；使用未配对的学生t检验(Student’s t-test)确定显著性；*p＜0.05，**p＜0.01，***p＜0.001。
图7.PTP1B缺陷增强TCR介导的CD8+幼稚T细胞体外增殖。将FACS纯化的来自7周龄C57BL/6.Ptpn1+/+和C57BL/6.Ptpn1-/-小鼠的CD8+幼稚(CD44loCD62Lhi)淋巴结T细胞(2×105)用2μM Cell Tracker Violet(CTV)染色并用指定浓度的板结合的α-CD3ε刺激72h，并通过流式细胞术进行分析。显示了来自两个独立实验的指定数目的小鼠的代表性直方图叠加图和定量结果。所示结果为平均值±标准误；使用未配对的Student’s t检验确定显著性；*p＜0.05，**p＜0.01。
图8.T细胞特异性PTP1B缺陷增强TCR介导的增殖。将FACS纯化的来自C57BL/6.Lck-Cre；Ptpn1fl/fl(n＝5)和C57BL/6.Ptpn1fl/fl小鼠(n＝5)的CD8+幼稚(CD44loCD62Lhi)淋巴结T细胞用2μM CTV染色。在1.25μg/ml可溶性α-CD28存在下，用从5μg/ml连续2倍稀释至0.3μg/ml的板结合的α-CD3ε刺激细胞72小时，并通过流式细胞术进行分析。在各种α-CD3浓度下，增殖的C57BL/6.Lck-Cre；Ptpn1fl/fl CD4+(从1.25μg/ml到5μg/ml；p＝0.369，p<0.0001，p<0.0001)或C57BL/6.Lck-Cre；Ptpn1fl/fl CD8+(从1.25μg/ml到5μg/ml；p＝0.0005，p<0.0001，p<0.0001)T细胞的数量均显著增加。所示结果为平均值±标准误，并代表两个独立的实验；使用双尾Mann-Whitney U检验确定显著性。
图9.PTP1B缺陷增强淋巴细胞减少症引起的体内增殖。将从C57BL/6.Ptpn1+/+和C57BL/6.Ptpn1-/-小鼠分离的幼稚CD4+CD45.2+或CD8+CD45.2+淋巴结T细胞用CTV染色并转移至亚致死剂量辐照的(650Gy)C57BL/6.Ly5.1/CD45.1+宿主。在过继转移后第8天，用针对CD45.2、CD4和CD8的荧光染料偶联抗体对脾脏T细胞染色，并通过流式细胞术进行分析。显示了来自两次独立实验的指定数量小鼠的CD45.2+CD8+供体T细胞的代表性CTV直方图叠加图和定量结果(平均值±标准误)。使用双尾Mann-Whitney U检验确定显著性；*P＜0.05，**P＜0.01。
图10.在体外幼稚CD4+和CD8+ T细胞中，CD3诱导的ERK磷酸化不需要PTP1B。将来自7周龄的C57BL/6.Ptpn1+/+(n＝4)和C57BL/6.Ptpn1-/-(n＝4)小鼠的CD4+A-B)和CD8+C-D)幼稚(CD44lo)和记忆(CD44hi)淋巴结T细胞(2×105)在冰上用1μg/ml可溶性α-CD3ε染色30分钟，然后在37℃下孵育指定的时间点。通过流式细胞术确定ERK磷酸化，并表示为平均荧光强度(MFI)。所示结果为平均值±标准误，并代表两个独立的实验。
图11.在体外CD4+和CD8+PTP1B-无T细胞中，增强的IL-15诱导的Stat5磷酸化。将来自7周龄的C57BL/6.Ptpn1+/+(n＝4)和C57BL/6.Ptpn1-/-(n＝4)小鼠的CD4+和CD8+幼稚(CD44lo)和记忆(CD44hi)淋巴结T细胞(2×105)与5ng/ml IL-15在37℃下孵育指定的时间点。通过流式细胞术确定Stat5磷酸化，并表示为平均荧光强度(MFI)。所示结果为平均值±标准误，并代表两个独立的实验。使用双因素方差分析检验确定显著性。
图12.PTP1B缺陷增强T细胞中的细胞因子信号传导。将来自7周龄的C57BL/6.Lck-Cre；Ptpn1fl/fl(n＝5)和C57BL/6.Ptpn1fl/fl(n＝5)小鼠的CD4+和CD8+幼稚(CD44loCD62Lhi)或中央记忆(CD44hiCD44hi)淋巴结T细胞(2×105)与A)5ng/ml IL-7和B)5ng/ml IL-15在37℃下孵育指定的时间点。A)在PTP1B缺陷的CD4+和CD8+ T细胞以及CD4+或CD8+幼稚和中央记忆T细胞(CD4亚群：总计：p＝0.0219，幼稚：p＝0.0007，中央/记忆：p＝0.0005)；(CD8亚群：总计：p＝0.0022，幼稚：p<0.0001，中央/记忆：p<0.0001)中，IL-7介导的Stat5磷酸化增强。B)在PTP1B缺陷的CD4+和CD8+ T细胞以及CD4+或CD8+幼稚和中央记忆T细胞(CD4亚群：总计：p<0.0001，幼稚：p<0.0001，中央/记忆：p<0.0001)；(CD8亚群：总计：p<0.0001，幼稚：p<0.0001，中央/记忆：p<0.0001)中，IL-15介导的Stat5磷酸化增强。所示结果为平均值±标准误，并代表两个独立的实验。使用双因素方差分析检验确定显著性。
图13.PTP1B缺陷增强体外CAR T细胞活化和细胞毒性。分离来自C57BL/6.Lck-Cre；Ptpn1fl/fl小鼠(n＝5)和C57BL/6.Ptpn1fl/fl小鼠(n＝5)的脾脏细胞，并将其加工成单细胞。在第0天，用5μg/mlα-CD3和5μg/mlα-CD28抗体(补充5ng/ml IL-2和0.2ng/ml IL-7)刺激2.5×107个细胞。然后在第1天和第2天用携带嵌合抗原受体(CAR)表达载体的逆转录病毒转导细胞两次。然后将转导的细胞在完全T细胞培养基中与5ng/ml IL-2和0.2ng/mlIL-7培养7天，以评估CAR T细胞的表型和CAR T细胞的细胞毒性。A)将CD8+CD44+CD62Lhi中央记忆和CD8+CD44+CD62Llo效应子/效应子记忆CAR-T细胞分选，然后以不同的CAR T:靶标比例与靶细胞共培养4小时。靶细胞(HER-2阳性)用500nM CTV染色，对照细胞(LML；HER-2阴性)用5nM CTV染色。将HER-2阳性靶细胞和HER-2阴性对照细胞以50:50混合，并与CAR T细胞共培养。基于通过流式细胞术确定的细胞数和以下函数计算靶标生存力指数(TargetViability Index)：
Figure BDA0002890224110000101
PTP1B缺陷的CD8+中央/记忆或效应子/记忆CAR T细胞与其野生型对应体相比显著降低了靶细胞的生存力指数(p<0.0001，p<0.0001)。B)PTP1B缺陷导致效应子/记忆(p＝0.0079)CAR T细胞数量增加以及中央/记忆(p＝0.0079)CAR T细胞数量减少。C)在PTP1B缺陷的CAR T细胞中，活化标志物CD25、Lag3和PD-1显著增加(p＝0.0159，p＝0.0079，p＝0.0079)。细胞毒性标志物颗粒酶B和干扰素γ的表达增加(p＝0.0159，p＝0.0159)。所示结果为平均值±标准误，并代表两个独立的实验。使用双因素方差分析检验评估CAR T细胞的细胞毒性，并用双尾Mann-Whitney U试验确定CAR T细胞表型，从而确定显著性。
图14.PTP1B缺陷增强了体内CAR T细胞介导的肿瘤抑制。A)将2×105个表达HER2的E0771细胞(E0771:HER2)接种到HER-2转基因小鼠的第四腹股沟乳腺脂肪垫中。肿瘤注射的7天后，HER-2转基因小鼠接受全身辐照(4Gy)，然后过继转移1×107个CAR T细胞(静脉注射)并共同施用2.5×105IU人IL-2(腹腔注射)。监测肿瘤生长，并在肿瘤接种的28天后，在肿瘤生长的终点从引流淋巴结和脾脏中分离出CAR T细胞。B)PTP1B缺陷的CAR T细胞显著增强了肿瘤生长的抑制(p<0.0001，p<0.0001，p<0.0001)。C)在HER-2转基因小鼠的引流淋巴结(p＝0.0079，p＝0.0079，p＝0.0079)和脾脏(p＝0.0079，p＝0.0079，p＝0.0079，p＝0.0079)中，PTP1B缺陷的总CAR T细胞、CD8+CAR T细胞、CD8+CAR T中央/记忆和效应子/记忆细胞显著增加。D)循环的PTP1B缺陷的中央/记忆CD8+CAR T细胞增加(p＝0.0317)，而效应子/记忆CD8+CAR T细胞没有差异(p＝0.3095)。所示结果为平均值±标准误。使用双因素方差分析评估肿瘤生长和双尾Mann-Whitney U检验确定CAR T细胞表型，从而确定显著性。
图15.PTP1B缺陷导致CAR T细胞耗尽减少。在过继转移到荷瘤小鼠中28天后，从引流淋巴结和脾脏中分离出CAR T细胞。通过流式细胞术分析耗尽标志物PD-1和Lag-3的表达水平。在引流淋巴结(Lag-3：p＝0.0079，p＝0.0079；PD-1：p＝0.0079)和脾脏(Lag-3：p＝0.0079，p＝0.0079)中，PTP1B缺陷的CD8+总CAR T细胞、CD8+中央/记忆CAR T细胞和CD8+效应子/记忆CAR T细胞中Lag-3 A)和PD-1B)的表达水平显著降低。所示结果为平均值±标准误；使用双尾Mann-Whitney U检验确定显著性。
图16.在C57BL/6.Ly5.1小鼠中，PTP1B缺陷增强CD8+中央记忆CAR T细胞的应答以根除肿瘤(除了内源性免疫监测介导的以外)。将HER-2过表达的E0771乳腺癌细胞(2.5×105)注射到雌性C57BL/6.Ly5.1小鼠的第四腹股沟乳腺脂肪垫中。肿瘤注射的7天后，C57BL/6.Ly5.1小鼠接受了全身辐照(4Gy)，然后过继转移1×107个由C57BL/6.Ly5.2Ptpn1fl/fl和Lck-Cre；Ptpn1fl/fl脾细胞产生的CAR T细胞。过继CAR T细胞转移后第0-4天，给小鼠注射IL-2(50,000IU/天)。A)过继转移的42天后，有2/5的Ptpn1fl/fl CAR T细胞接受者出现肿瘤，而有0/5的Lck-Cre；Ptpn1fl/fl CAR T细胞接受者保持无肿瘤。从B)淋巴结或C)脾脏中分离出Ptpn1fl/fl与Lck-Cre；Ptpn1fl/fl CAR T细胞，并通过流式细胞术进行分析。确定了总的CD4+或CD8+ T细胞以及CD4+与CD8+幼稚(CD44loCD62Lhi)T细胞和效应子/记忆(CD44hiCD62Llo；EM)T细胞和中央/记忆(CD44hiCD62Lhi；CM)T细胞的绝对数量。所示结果为平均值±标准误；使用双尾Mann-Whitney U检验确定显著性；*p<0.05。
图17.PTP1B缺陷抑制C57BL/6.Ly5.1小鼠中的中央/记忆CAR T细胞耗尽。将HER-2过表达的E0771乳腺癌细胞(2.5×105)注射到雌性C57BL/6.Ly5.1小鼠的第四腹股沟乳腺脂肪垫中。肿瘤注射的7天后，C57BL/6.Ly5.1小鼠接受了全身辐照(4Gy)，然后过继转移1×107个由Ptpn1fl/fl和Lck-Cre；Ptpn1fl/fl脾细胞产生的CAR T细胞。过继CAR T细胞转移后第0-4天，给小鼠注射IL-2(50,000IU/天)。在过继转移42天后，从C57BL/6.Ly5.1小鼠的A-B)肿瘤引流淋巴结和c-d)脾脏中分离出HER-2-特异性CAR T细胞，并对CD4、CD8、CD44、CD62L和PD-1染色，并通过流式细胞术确定CD4+(A，C)或CD8+(B，E)中央/记忆(CD44hiCD62Lhi)与效应子/记忆(CD44hiCD62Llo)HER-2-特异性CAR T细胞的PD-1平均荧光强度(MFI)。显示了指定数目的小鼠和实验的代表性结果(平均值±标准误)。使用双尾Mann-Whitney U检验确定显著性；*p＜0.05。
图18.在整体PTP1B缺陷的小鼠中同源肿瘤生长受到抑制。将悬浮在20μl 1×DPBS中的1×106AT-3OVA乳腺癌细胞移植到PTP1B缺陷(Ptpn1-/-；n＝8)、ptp1b-杂合(Ptpn1+/-；n＝10)和具有活性PTP1B的野生型(Ptpn1+/+；n＝8)雌性小鼠的乳腺脂肪垫中。A)在移植后监测肿瘤生长28天。与PTP1B杂合小鼠(p<0.0001；双因素方差分析)和野生型小鼠(p<0.0001；双因素方差分析)相比，PTP1B缺陷小鼠表现出显著的肿瘤生长抑制。与PTPB1B杂合小鼠(p<0.0001；双因素方差分析)相比，PTP1B缺陷小鼠还表现出增强的肿瘤抑制。B)在移植后第28天测定肿瘤重量。与野生型小鼠的肿瘤负荷相比，PTP1B缺陷小鼠和PTP1B杂合小鼠的肿瘤负荷均显著降低(p＝0.0041和p＝0.0431)。C)PTP1B缺陷小鼠和PTP1B杂合小鼠与其野生型对应体相比均表现出明显的体重减轻(p<0.0001和p<0.0001；双因素方差分析)。D)与其野生型对应体相比，PTP1B缺陷小鼠中的常驻记忆T细胞(Trm)、效应子/效应子记忆T细胞(Teff/em)和中央记忆T细胞(Tcm)显著增加(p＝0.0012，p＝0.0012，和p＝0.0012)。E)在引流淋巴结中，Teff/em细胞没有显著增加(p＝0.4418)，而Tcm数量(p＝0.003)显著增加。显示了指定数目的小鼠和实验的代表性结果(平均值±标准误)。使用双尾Mann-Whitney U检验确定显著性。
图19.在T细胞特异性PTP1B缺陷的小鼠中同源肿瘤生长受到抑制。将悬浮在20μl1×DPBS中的1×106个AT-3OVA乳腺癌细胞移植到T细胞特异性ptp1b缺陷(Lck-Cre；Ptpn1fl/fl；n＝8)和野生型(Ptpn1fl/fl；n＝8)雌性小鼠的乳腺脂肪垫中。A)在T细胞特异性PTP1B缺陷的小鼠中，肿瘤的生长显著延迟(p<0.0001；双因素方差分析)。B)在Lck-Cre；Ptpn1fl/fl小鼠中，荷瘤小鼠的总体存活率显著提高(p<0.0001；双因素方差分析)。C)在Lck-Cre；Ptpn1fl/fl小鼠中，肿瘤浸润的总CD8+ T细胞、CD8+ Teff/em细胞、CD8+ Tcm细胞、总CD4+ T细胞、CD4+ Teff/em细胞和CD4+ Tcm细胞显著增加(p＝0.0087、p＝0.0152、p＝0.0022、p＝0.0087、p＝0.0043和p＝0.0411)。显示了指定数目的小鼠和实验的代表性结果(平均值±标准误)。使用双尾Mann-Whitney U检验确定显著性。
图20.PTP1B特异性抑制剂MSI-1436(Trodusquemine)抑制肿瘤生长。将悬浮在20μl1×DPBS中的1×106个AT-3OVA乳腺癌细胞移植到T细胞特异性PTP1B缺陷(Lck-Cre；Ptpn1fl/fl；n＝16)和PTP1B野生型(Ptpn1fl/fl；n＝16)雌性小鼠的乳腺脂肪垫中。肿瘤细胞移植17天后，将MSI-1436通过腹膜内注射以浓度为10mg/kg体重的100μl 0.9％(v/v)生理盐水应用于受体小鼠。在暗周期开始之前，每三天用MSI-1436处理来自Ptpn1fl/fl和Lck-Cre；Ptpn1fl/fl受体的16只小鼠中的8只。A)与Ptpn1fl/fl受体相比，在Lck-Cre；Ptpn1fl/fl小鼠以及用MSI-1436处理的Ptpn1fl/fl和Lck-Cre；Ptpn1fl/fl小鼠中，肿瘤生长被显著抑制(p<0.0001，p<0.0001和p<0.0001；双因素方差分析)。B)与Ptpn1fl/fl受体相比，T细胞特异性PTP1B缺陷显著降低了Lck-Cre；Ptpn1fl/fl小鼠中的肿瘤负荷(p＝0.0007)；当与未处理的对应体相比，MSI-1436处理的Ptpn1fl/fl小鼠表现出肿瘤负荷显著降低(p<0.0001)。C)与之前研究一致，MSI-1436处理在Lck-Cre；Ptpn1fl/fl或Ptpn1fl/fl小鼠中引起了显著的体重减轻(p<0.0001和p<0.0001)。这伴随着食物摄入和肥胖的减少，但瘦体重没有变化(数据未显示)。显示了指定数目的小鼠和实验的代表性结果(平均值±标准误)。使用双尾Mann-Whitney U检验确定显著性。
具体实施方式
将理解的是，在本说明书中公开和定义的本发明扩展到在文本或附图中所提到的或明显的两个或更多个单独特征的所有可替代组合。所有这些不同的组合构成了本发明的各种可替代方面。
现在将详细参考本发明的某些实施方案。虽然本发明将结合实施方案进行描述，但应理解其意图不在于将本发明局限于这些实施方案。相反，本发明旨在覆盖所有替代、变型和等同形式，其可以包括在如由权利要求所限定的本发明的范围内。
本领域技术人员将意识到许多与本文描述的方法和材料相似或等同的方法和材料，其可用于实施本发明。本发明绝不限于所述的方法和材料。将理解的是，在本说明书中公开和定义的发明扩展到在文本或附图中所提到的或明显的两个或更多个单独特征的所有可替代组合。所有这些不同的组合构成了本发明的各种可替代方面。
本文引用的所有专利和出版物均通过引用以其整体并入本文。
为了解释本说明书，以单数形式使用的术语也将包括复数形式，反之亦然。
发明人已经开发了一种用于有效制备用于过继细胞转移，特别是用于癌症免疫治疗的细胞的方法。发明人惊奇地发现，抑制T细胞中PTP1B的活性会增强此类细胞的活化及其杀伤靶细胞的能力。此外，本发明的优点在于使被耐受否则将可用于过继细胞转移(ADC)的T细胞(例如，在肿瘤浸润淋巴细胞的情况下，它们对肿瘤抗原具有特异性)能被恢复活力并降低耐受性。
更进一步地，发明人已经发现抑制T细胞中的PTP1B大幅减少了用细胞因子进行伴随刺激的需求(例如，以增强用于ADC的细胞的扩增)。不希望受理论的束缚，发明人认为用于ADC的细胞(其还经过处理以抑制PTP1B活性)对细胞因子(例如IL-17、IL-15和IL-2)更加敏感，使得用该细胞处理过的患者可以不需要细胞因子的伴随治疗。或者，考虑到当抑制PTP1B时T细胞对细胞因子的响应性增强，可以将较少的细胞用于ADC。
不受任何理论或作用方式的束缚，认为抑制PTP1B活性引起T细胞受体(TCR)信号传导的改变，从而逆转或避免耐受性，反而会促进T细胞向细胞毒性T细胞谱系的分化。例如，分离的CD8+ T细胞经处理以降低PTP1B活性，导致以下任意一种或多种功能：对带有需要对其增强免疫应答的抗原的细胞产生细胞毒活性，对抗原呈递的维持能力和/或抗原回忆应答增强，或具有效应T细胞的功能和/或表型特征。
尽管已经证明离体培养的CD8+ T细胞的癌症免疫治疗表现出显著的功效，但这种治疗并非对每位患者都有效，因为难以获得有效数量的具有靶向肿瘤细胞以及一旦识别肿瘤细胞就杀死肿瘤细胞的能力的CD8+ T细胞。本发明提供了一种用于产生具有增强的杀伤靶细胞(诸如肿瘤细胞)能力的细胞的手段。
发明人发现的进一步的优势在于，抑制T细胞中的PTP1B增加中央记忆和效应子记忆T细胞的持久性。这意味着，除了在PTP1B抑制后立即增加细胞毒性杀伤作用之外，本发明的方法还提供了更好的免疫系统适应性和准备，以应对长期或随后暴露于相关抗原中(例如，在相关疾病或病症复发时)。
来自主体的白细胞(优选T细胞)的解剖学来源包括外周血、肿瘤、恶性积液和引流淋巴结。用于过继转移的淋巴细胞既可以源自切除肿瘤的基质(肿瘤浸润淋巴细胞)，也可以源自血液，以及：经过基因改造以表达抗肿瘤T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)、用混合淋巴细胞肿瘤细胞培养物(MLTC)富集或使用自体抗原呈递细胞和肿瘤衍生肽进行克隆。用于输注的淋巴细胞可从同种异体供体(优选HLA匹配的)中分离，或从患癌主体中分离。在一个实施方案中，来自主体的白细胞，优选T细胞，不是从骨髓中获得或不是源自骨髓。
在本发明的任何方法中，可以将已在PTP1B抑制剂的存在下培养的白细胞(优选T细胞)转移到获得细胞的同一哺乳动物中。换句话说，用于本发明方法的细胞可以是自体细胞，即该细胞可以从治疗或预防了医学病症的哺乳动物中获得。或者，可以将细胞同种异体地转移到另一个主体中。优选地，在治疗或预防主体的医学病症的方法中，细胞对于主体是自体的。
靶向癌症免疫治疗的T细胞的一种来源可以是使用人工嵌合受体(例如，源自单克隆抗体的抗原结合域)。当与适当的细胞内信号传导域偶联时，表达这些嵌合抗原受体(CAR)的T细胞能够杀死肿瘤细胞靶标。CAR T细胞具有以下优势：以MHC不受限的方式起作用，允许它们能够靶向抗原加工或呈递途径被破坏的肿瘤细胞。此外，它们可以针对细胞表面的非肽抗原，从而扩大了恶性细胞上能够被识别的靶结构的范围。因此，表达CAR的T细胞能够补充MHC受限的细胞毒性T细胞，并提高这种细胞免疫治疗的整体有效性。
当幼稚CD8+和CD4+ T细胞与由主要组织相容性复合物(majorhistocompatibility complex，MHC)分子呈递的肽抗原结合时，T细胞受体信号强度决定T细胞进展是否超过G1限制点并发生细胞分裂，产生白介素2(IL-2)并进行克隆扩增/增殖以及分化并获得各种效应子功能。TCR信号传导依赖于由Src家族蛋白酪氨酸激酶(Lck和Fyn)以及Syk家族PTK ZAP-70介导的酪氨酸磷酸化。TCR的结合使Lck磷酸化TCR的基于免疫受体酪氨酸的活化基序，从而导致ZAP-70募集以及衔接蛋白(例如LAT)的活化和磷酸化。这转而允许信号传导复合物的成核以及多种效应子通路的磷酸化和活化。在TCR结合后，Lck的活化和/或功能受Lck及其底物的定位以及免疫突触内调节分子的丰度、活性和分离的调节。这样的调节分子包括调节Lck Y505抑制位点以及Lck Y394活化位点的磷酸化的蛋白质酪氨酸磷酸酶(PTP)。
PTP1B(也称为PTPN1、PTP1B、蛋白酪氨酸磷酸酶、非受体1型、酪氨酸蛋白磷酸酶非受体1型或蛋白酪氨酸磷酸酶1B)是一种普遍存在的磷酸酶，该磷酸酶通过其C末端锚定在内质网中并且其催化区域暴露于胞质溶胶。已知PTP1B使多种磷蛋白去磷酸化，例如生长因子胰岛素和表皮生长因子(EGF)、c-Src和β-连环蛋白的受体。PTP1B还使Janus活化蛋白激酶9JAK)家族成员(包括Tyk-2和JAK-2)去磷酸化。据报道，PTP1B是胰岛素受体的主要负调节剂，还是瘦素信号传导的负调节剂。编码PTP1B的PTPN1基因位于20q13，这是一个与来自不同地理来源的人群的胰岛素抗性和糖尿病相关的基因组区域。在PTPN1基因中已鉴定出超过20种与2型糖尿病风险增加相关的单核苷酸多态性(SNP)。小鼠体内PTP1B的整体缺失导致胰岛素敏感性增加和葡萄糖耐量提高。此外，PTP1B已经被证明可以调节细胞因子受体信号传导，包括IFN-γ信号传导。PTP1B在癌症中的作用尚不清楚，在不同类型的癌症中观察到表达升高或降低。
为了确定PTP1B抑制剂的存在是否抑制PTP1B，可以进行如下实验：如前所述，使用p-NPP(对硝基苯基磷酸酯)和p-tyr-RCML(p-tyr还原的、羧酰胺甲基化的和马来酰化的溶菌酶)作为底物，测量PTP1B免疫沉淀物中的PTP1B活性(Bukczynska P等.Biochem.J.2004年6月15日；380(Pt 3):939-49；Tiganis T等.J.Biol.Chem.1997年8月22日；272(34):21548-57)。或者，可以通过流式细胞术和免疫印迹分析已知的PTP1B底物，例如c-Src、胰岛素受体、EGF受体、Tyk-2、JAK-2和酪氨酸磷酸化的转录因子STAT5。
可用于本发明的PTP1B抑制剂是完全或部分降低如本文所述的PTP1B的一种或多种功能的抑制剂。优选地，PTP1B抑制剂降低PTP1B的磷酸酶活性(例如小分子、肽或拟肽)，降低PTP1B基因的转录活性，或降低细胞中存在的PTP1B mRNA或蛋白质的量。
在本发明的任何实施方案中，PTP1B的抑制可以是至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％或100％的抑制。在进一步的实施方案中，所述抑制仅针对PTP1B，使得导致抑制其他靶标的脱靶效应极小至无。因此，在优选的实施方案中，对除PTP1B以外的靶标的抑制不超过20％，不超过10％，不超过5％。
如本文所用，PTP1B抑制剂可以是抑制PTP1B的磷酸酶活性或降低细胞中PTP1B水平的任何分子。该抑制剂可以是磷酸酶活性位点的直接抑制剂，可以变构地作用以抑制磷酸酶活性、抑制PTP1B与其底物的相互作用，或者可以通过降低PTP1B基因的转录活性或减少细胞中存在的PTP1B mRNA或蛋白质的量来降低PTP1B的水平。
磷酸酶活性位点的直接抑制剂，变构地作用以抑制磷酸酶活性的抑制剂或抑制PTP1B与其底物相互作用的抑制剂的例子是小分子，例如：
Claramine(Sigma，1545；也称为(3β,6β)-6-[[3-[[4-[(3-氨丙基)氨基]丁基]氨基]丙基]氨基]-胆甾烷-3-醇)及其衍生物；
Trodusquemine(MSI-1436，produlestan，Trodulamine，troduscemine，CAS号：186139-09-3，一种天然存在的胆甾烷以及PTP1B的非竞争性变构抑制剂，trodusquemine选择性地靶向并抑制PTP1B，从而阻止PTP1B介导的信号传导)及其衍生物，包括DPM-1001(Krishnan等2018，JBC，293：1517-1525)；
3-(3,5-二溴-4-羟基-苯甲酰基)-2-乙基-苯并呋喃-6-磺酸-(4-(噻唑-2-基胺磺酰基)-苯基)-酰胺(也称为PTP抑制剂XXII，CAS号：765317-72-4，ThermofisherScientific或Calbiochem)及其衍生物；
3-十六酰基-5-羟甲基-特窗酸钙盐(RK-682，CAS号：332131-32-5，Santa CruzBiotechnology)及其衍生物；
2-[(羧羰基)氨基]-4,5,6,7-四氢噻吩并[2,3-c]吡啶-3-羧酸盐酸(TCS-401，CAS号：243966-09-8，Santa Cruz Biotechnology)及其衍生物；
6-甲基-2-(草酰氨基)-4,5,6,7-四氢噻吩并[2,3-c]吡啶-3-羧酸三氟乙酸盐(BML-267，Santa Cruz Biotechnology)及其衍生物；
或肽，或拟肽。
可以减少细胞中存在的PTP1B mRNA或蛋白质的量的抑制剂的例子是抑制性RNA或干扰RNA，例如反义RNA、siRNA、微小RNA或shRNA。
可以减少PTP1B mRNA的量的shRNA序列的例子包括：
AATTGCACC-AGGAAGATAATGACTATATC(SEQ ID NO：1)
示例性siRNA序列包括：
正义：5’-UAGGUACAGAGACGUCAGUdTdT-3’；(SEQ ID NO：2)反义：5’-ACUGACGUCUCUGUACCUAdTdT-3(SEQ ID NO:3)
正义，5’-UAGGUACAGAGACGUCAGUdTdT-3’；(SEQ ID NO：4)反义，5’-ACUGACGUCUCUGUACCUAdTdT-3′(SEQ ID NO：5)
正义，5-’AAATCAACGGAAGAAGGGTCT-3’(SEQ ID NO：6)
正义：5’-NNUGACCAUAGUCGGAUUAAA-3’(SEQ ID NO：7)
正义：5’-UUGAUGUAGUUUAAUCCGACUAUGG-3’(SEQ ID NO：8)
反义：5’-CCAUAGUCGGAUUAAACUACAUCAA-3’(SEQ ID NO：9)
技术人员还将理解，可以从许多商业来源(包括Dharmacon(西班牙，马德里)和Thermofisher(美国))获得可用于减少PTP1B mRNA的shRNA或siRNA。可以例如从OpenBiosystems(Dharmacon)购买可商购获得的靶向ptp1b的shRNA，目录号为RHS3979-9571385。
优选地，siRNA、shRNA靶标是(参考GenBank NCBI参考序列)：
外显子2，优选从NM_001278618.1的第291位开始；
外显子3，优选从NM_002827.3的第382位开始；
外显子3和4，优选从NM_001278618.1的第466位开始；
外显子4和5，优选从NM_002827.3的第557位开始；
外显子2和3，优选从NM_002827.3的第360位开始；
优选地，shRNA与本文所述的任何序列具有至少50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性，只要shRNA仍保留降低细胞中PTP1B水平的能力即可。
进一步地，PTP1B抑制还可以包括基因组编辑以删除或修饰全部或部分的PTP1B编码序列。一种示例性的基因组编辑技术是CRISPR/Cas9系统(Jinek,M.等，(2012)Science，337，816–821；Cong L.等，(2013)Science，339，819–823；和Qi,L.S.等，(2013)Cell，152，1173–1183)。这样，根据本发明，PTP1B抑制剂可以包括用于CRISPR-Cas9基因组编辑以抑制或删除PTP1B活性的gRNA(包括sgRNA)。更具体地，本发明考虑了使用CRISPR-Cas9删除人CAR T细胞中的Ptp1b。此外，使用CRISPR-Cas9能够使抑制作用仅限于PTP1B(即，其中仅PTP1B被抑制)。在某些实施方案中，仅对PTP1B的抑制可以是完全抑制(即，敲除)PTP1B功能，或降低PTP1B活性/表达(即，敲低或部分敲除)。
技术人员将能够购买或设计靶向多种PTP1B序列的gRNA或crRNA。此类gRNA靶序列的例子包括：
TTCGAGCAGATCGACAAGTC(SEQ ID NO：10)
GATGTAGTTTAATCCGACTA(SEQ ID NO：11)
GAGCTGGGCGGCCATTTACC(SEQ ID NO：12)
TGACGTCTCTGTACCTATTT(SEQ ID NO：13)
CAAAAGTGACCGCATGTGTT(SEQ ID NO：14)
GTCTTTCAGTTGACCATAGT(SEQ ID NO：15)
可以通过使用病毒载体将miRNA、siRNA或shRNA递送至相关的T细胞。存在大量适用于本发明的可用病毒载体，包括那些确定用于人类基因治疗的病毒载体。合适的病毒载体包括基于RNA病毒的载体，例如逆转录病毒来源的载体，例如莫洛尼鼠白血病病毒(Moloney murine leukemia virus，MLV)来源的载体，并且包括更复杂的逆转录病毒来源的载体，例如慢病毒来源的载体。人类免疫缺陷病毒(HIN-1)来源的载体属于这一类。其他例子包括源自HIN-2的慢病毒载体、猫免疫缺陷病毒(feline immunodeficiency virus，FIN)、马传染性贫血病毒、猿猴免疫缺陷病毒(simian immunodeficiency virus，SIV)和Maedi-Visna病毒。
优选地，修饰的逆转录病毒，甚至更优选地，修饰的慢病毒，被用于递送特异性miRNA、siRNA或shRNA。该病毒还可以包括编码嵌合抗原T细胞受体的序列，用于靶向待杀伤的特定细胞。因此，多核苷酸和任何相关的遗传元件作为原病毒被整合到宿主细胞的基因组中。修饰的逆转录病毒优选在包装细胞中由病毒载体产生，所述病毒载体包括产生病毒所必需的序列以及miRNA、siRNA或shRNA和/或CAR。病毒载体还可以包括促进miRNA、siRNA或shRNA表达的遗传元件，例如启动子和增强子序列。为了防止在靶细胞中复制，可以去除复制所需的内源病毒基因。
技术人员将熟悉用于将Cas9和向导RNA(gRNA)病毒引入细胞中以靶向PTP1B的方法(例如，利用慢病毒方法)。另外，本发明考虑了使用Cas9核糖核蛋白(RNP)介导的基因编辑来删除PTP1B(例如，利用Neon转染系统，使用预载了靶向人PTP1B的合成crRNA:tracrRNA(Dharmacon)的GeneArtTMPlatinumTMCas9核酸酶)。
技术人员将能够利用标准定量PCR方法来确定PTP1B mRNA水平是否已降低。例如，可以使用Taqman基因表达检测来确定Ptpn1表达(Mm00448427_m1，ThermofisherScientific)。技术人员将理解，此类检测能够用于确认由siRNA或shRNA靶向所导致的，或作为gRNA衍生的CRISPR-Cas9基因组编辑以降低PTP1B活性的结果而出现的PTP1B mRNA降低。
包含CD8+ T细胞和PTP1B抑制剂的组合物可以进一步包括癌症特异性抗原和/或一种或多种细胞因子以增强细胞杀伤(例如IL-2或IFNγ)。当抗原存在于包含分离的、富集的或纯化的CD8+ T细胞的组合物中时，抗原可以作为独立实体存在，或抗原可以以抗原能够与CD8+ T细胞上存在的T细胞受体或CAR相互作用的任何情况存在。当抗原能够与CD8+T细胞的TCR相互作用时，CD8+ T细胞可以被活化。抗原能够提供在组合物中以使其能够被CD8+ TCR识别的各种实施方案的实例包括但不限于抗原与在抗原呈递细胞(例如树突细胞、巨噬细胞或某些活化的上皮细胞)表面的MHC-1缔合(或在动物模型中的等效呈递)的形式存在。或者，抗原能够与任何其他天然的或合成的分子或其他化合物、复合物、实体、底物等物理缔合，这将有助于CD8+ T细胞上的TCR对抗原的识别。例如，将抗原可以与MHC-1或其他适合的分子复合以将抗原呈递给CD8+ TCR，并且MHC-1或其他合适的分子能够与基质(例如乳胶珠、任何板的塑料表面，或任何其他合适基质)物理缔合，以促进抗原适当接触CD8+T细胞TCR，从而使抗原被CD8+ T细胞识别。
可以使用常规的细胞分选技术获得CD8+ T细胞，所述常规的细胞分选技术基于T细胞表面标志物区分并分离T细胞，可用于获得用于本发明的组合物和方法的分离的群体CD8+T细胞。例如，可以从个体获得包括血液和/或外周血淋巴细胞的生物样品，并使用可商购获得的设备和试剂从样品中分离出CD8+ T细胞，从而获得分离的CD8+ T细胞群。可以通过使用其他细胞表面标记物，例如CD44、L-选择素(CD62L)、CD25、CD49d、CD122、CD27、CD43、CD69、KLRG-1、CXCR3、CCR7、IL-7Rα和KLRG-1，在表型的基础上进一步表征和/或分离鼠CD8+T细胞。可以通过负性选择CD4+、NK1.1+、B220+、CD11b+、TER119+、Gr-1+、CD11c+和CD19+细胞，来初步富集CD8+ T细胞。幼稚CD8+ T细胞的特征是CD44低、CD62L高、CCR7高、CD25低、CD43低、CD49d低、CD69低、IL-7Rα高和CD122低，然而经历过抗原的记忆T细胞则是CD44高、CD49d高、CD122高、CD27高、CD43高和CXCR3高。记忆CD8+CD44高的T细胞能够进一步被细分为位于淋巴组织的中央记忆T细胞(CD62L高，CCR7高)和位于非淋巴组织的效应子记忆T细胞(CD62L低，CCR7低)(Klonowski等，Immunity 2004，20：551-562)。分离的CD8+ T细胞群能够在任何合适的容器、设备、细胞培养基、系统等中与PTP1B和/或抗原混合，并且能够在体外培养和/或暴露于一种或多种抗原和任何其他试剂中或细胞培养基中，以扩增和/或成熟和/或分化T细胞，从而具有各种所需的细胞毒性T细胞特征。
可以使用表型细胞表面标志物CD62L、CCR7、CD27、CD28和CD45RA或CD45RO来鉴定人CD8+ T细胞类型和/或群(Sallusto F等，Nature 1999，401：708-712)。如本文所用，CD8+T细胞类型和/或群具有以下特征或细胞表面标志物的表达模式：幼稚T细胞的特征是CD45RA+、CD27+、CD28+、CD62L+和CCR7+；CD45RO+中央记忆T细胞是CD45RA-、CD27+、CD28+、CD62L+和CCR7+；CD45RO+效应子记忆T细胞被定义为缺乏这五种标志物(CD45RA-、CD27-、CD28-、CD62L-和CCR7-)的表达；并且终末分化的效应子记忆CD45RA+ T细胞的特征是CD45RO+、CCR7-、CD27-、CD28-、CD62L-。终末分化的效应子记忆细胞进一步正调节标志物(例如CD57、KLRG1、CX3CR1)，并表现出强大的细胞毒性，其特征在于它们能够产生高水平的颗粒酶A和B、穿孔素和IFNγ。因此，各种T细胞群能够基于它们的表达或这些标至物的缺乏表达来与其他细胞和/或彼此分离。以这种方式，本发明提供了分离不同的CD8+ T细胞群的方法以及分开的或分离的CD8+ T细胞群。本文所述的CD8+ T细胞类型也可以通过本领域已知的任何其他合适的方法分离；例如，如果一个或多个特定抗原被用来产生抗原特异性CD8+ T细胞，则这些细胞能够利用所述一个或多个抗原通过亲和纯化从其他细胞中分开或分离出来；合适的方案是本领域已知的。
不同的CD8+ T细胞类型还能够表现出特定功能，包括，例如：分泌IFN-γ，分泌IL-2，产生颗粒酶B，表达FasL和表达CD 107。但是，尽管如本文所述，细胞表面标志物的表达模式被认为能够诊断每种特定的CD8+ T细胞类型和/或群，但每种细胞类型和/或群的功能属性可能会根据一种或多种细胞受到的刺激量而变化。
T细胞的效应子功能或特性能够通过效应分子来确定，该效应分子是T细胞响应于其T细胞受体与靶细胞上的抗原:MHC复合物的特异性结合而释放的，或者CAR T细胞中在嵌合抗原受体(例如scFv)与在靶细胞上表达的抗原相互作用的情况下释放的。能够由细胞毒性CD8+ T细胞释放的细胞毒性效应分子包括穿孔素、颗粒酶A和B、颗粒溶素和Fas配体。通常，脱粒后，穿孔素会将其自身插入靶细胞的质膜中形成一个孔，颗粒酶是能够触发细胞凋亡(一种细胞死亡形式)的丝氨酸蛋白酶，颗粒溶素诱导靶细胞的细胞凋亡，而Fas配体也能够诱导细胞凋亡。通常，这些细胞毒性效应分子在释放前被储存在细胞中的溶解颗粒中。能够由细胞毒性T细胞释放的其他效应分子包括IFN-γ、TNF-β和TNF-α。IFN-γ能够抑制病毒复制并活化巨噬细胞，而TNF-β和TNF-α能够参与巨噬细胞活化和靶细胞杀伤。在本发明的任何方法中，在施用或重新引入与PTP1B抑制剂接触的细胞之前，将使用针对表面标志物和细胞内标志物的荧光染料偶联抗体，通过流式细胞术评估那些细胞的细胞毒活性，所述表面标志物和细胞内标志物确定了细胞毒性效应T细胞，其包括颗粒酶A和B、穿孔素和IFNγ。
活化的T细胞是一种细胞，其不再处于GO期，并且开始产生一种或多种细胞毒素、细胞因子和/或本文所述细胞类型特有的其他膜相关的标志物(例如CD8+)，并且能够识别并结合在表面上展示特定肽:MHC复合物或仅抗原的任何靶细胞并释放其效应分子。
促进T细胞分化为细胞毒性T细胞群的本发明方法导致细胞毒性T细胞群在统计学上显著增加。当与适当的对照(例如，用本发明的方法处理之前的群大小)相比，细胞以至少高出10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％的量存在时，群增加。当细胞的功能比适当的对照(例如，在没有特定事件或条件的情况下在特定试验中的细胞样品的性能)高出至少10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％或100％时，细胞毒性CD8+ T细胞效应子功能增强。在适当的情况下，体内功能或体内细胞群的存在可以使用从主体分离的细胞在体外试验中来测量。
“富集”或“纯化”的细胞群是特定细胞与其他细胞之比的增加，例如，与主体体内发现的细胞相比，或与暴露于PTP1B抑制剂之前的比例相比。在一些实施方案中，在富集或纯化的细胞群中，特定的细胞至少包括总细胞群的20％、30％、40％、50％、60％、70％、75％、80％、90％、95％或99％。细胞群可以通过一种或多种细胞表面标志物和/或性质来定义。
如本文所述，暴露于PTP1B抑制剂或与PTP1B抑制剂接触的CD8+ T细胞表现出细胞毒性T细胞的至少一种特性，在施用于主体后，引发对肿瘤细胞的细胞毒性T细胞应答。优选地，对肿瘤细胞的CTL应答有效地引起具有靶抗原的肿瘤细胞的细胞死亡，例如裂解。
暴露于PTP1B抑制剂或与PTP1B抑制剂接触的CD8+ T细胞能够通过任何方法施用于主体，所述方式包括：例如，注射、输注、沉积、植入、口服或局部施用或其任何组合。注射可以是例如静脉注射、肌内注射、皮内注射、皮下注射或腹膜内注射。取决于癌症、其严重程度和主体的整体健康，可以在给定的时间段内施用单剂量或多剂量，这可以由本领域技术人员在不进行过度实验的情况下确定。注射可以在多个部位进行。CD8+ T细胞可以单独施用或与其他治疗剂组合施用。每剂量可以包括约10×103个CD8+ T细胞、20×103个细胞、50×103个细胞、100×103个细胞、200×103个细胞、500×103个细胞、1×106个细胞、2×106个细胞、20×106个细胞、50×106个细胞、100×106个细胞、200×106个、500×106个、1×109个细胞、2×109个细胞、5×109个细胞、10×109个细胞等。施用频率可以是，例如，每周一次、每周两次、每两周一次、每三周一次、每四周一次、每月一次、每两个月一次、每三个月一次、每四个月一次、每五个月一次、每六个月一次等等。施用发生的总天数可以是1天、2天或3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天等等。应当理解，任何给定的施用可能涉及在同一天进行两次或多次注射。对于施用，至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少95％、至少99％的被施用的CD8+ T细胞表现出细胞毒性T细胞的至少一种特性。
在一个说明性的实施方案中，当细胞已经用PTP1B抑制剂(例如抑制PTP1B的小分子抑制剂、抑制剂RNA或包括CRISPR/Cas9系统形式的抑制剂)处理时，可以制备包含CD8+T细胞的组合物并施用于患者。在一个实施方案中，缺乏任何动物产品(例如牛血清)的培养基可以用于培养CD8+ T细胞。在另一个实施方案中，可以使用技术人员通常用于避免被细菌、真菌和支原体污染的组织培养条件。在一个示例性的实施方案中，在施用于患者之前，将CD8+ T(例如CAR-T细胞)沉淀、洗涤并重悬在药学上可接受的载体或稀释剂中。包含表达CAR的T淋巴细胞(例如，细胞毒性T淋巴细胞)的示例性组合物包括包含在无菌的290mOsm盐水中、在不溶性cryomedia(含有Plasma-Lyte A、葡萄糖、氯化钠注射液、人血清白蛋白和DMSO)中、在含2％人血清白蛋白的0.9％NaCl、或在任何其他无菌的290mOsm不溶性物质中的细胞的组合物。或者，在另一个实施方案中，取决于培养基的特性，可以将CAR-T细胞作为组合物在培养基中施用，或者在施用前浓缩并重悬在培养基中。在各种实施方案中，可以通过任何合适的手段将CAR-T细胞组合物施用于患者，例如肠胃外施用，例如，皮内、皮下、肌内、腹膜内、静脉内或鞘内施用。
在进一步的实施方案中，本申请包括将PTP1B抑制剂直接施用于正在接受或已经接受CD8+ T细胞治疗的个体。根据本文所述的任何方法，在施用于需要治疗的主体之前，CD8+T细胞可以已经与PTP1B抑制剂接触。或者，将CD8+ T细胞施用于主体，而未经受事先暴露于PTP1B抑制剂或与PTP1B抑制剂接触，而是将PTP1B抑制剂直接施用于主体。
可以在主体接受CD8+ T细胞治疗之前、同时或之后施用PTP1B抑制剂。在PTP1B抑制剂和CD8+ T细胞是同时施用于主体的情况下，它们可以通过相同的施用途径(包括在单一的组合物中)或通过不同的施用途径来施用。例如，CD8+ T细胞可以通过注射到主体的血流中来施用，而PTP1B抑制剂可以口服施用或通过另一种施用途径施用，例如肌内、皮内、皮下或腹膜内施用。
在一个特别优选的实施方案中，为了增强CAR-T治疗的功效的目的，在向主体施用CAR-T细胞之后将PTP1B抑制剂直接施用于主体。随后可以每两周一次、或每周一次或两次、或更多次施用抑制剂，以促进CAR-T细胞扩增并形成记忆CAR-T细胞。
在特别优选的实施方案中，在静脉内施用CAR-T细胞之前、期间或之后，PTP1B抑制剂是trodusquemine(通过注射施用)，或衍生物(例如DPM-1001)(口服施用)。
应当清楚地理解，尽管该说明书特别涉及人类应用，但本发明也可用于兽医目的。因此，本发明在所有方面都可用于家畜，例如牛、绵羊、马和家禽，用于猫和狗等伴侣动物，以及用于动物园的动物。因此，通用术语“主体”或“待治疗/正在被治疗的主体”应理解为包括所有需要增强免疫应答的动物(例如人、猿、狗、猫、马和牛)，例如患有癌症的主体。
如本文所用，术语“离体”或“离体治疗”是指一种治疗，其中细胞获自患者或合适的替代来源，例如合适的同种异体供体，并被修饰，使得被修饰的细胞能够用于治疗将通过被修饰的细胞产生的治疗益处而改善的疾病。治疗包括将被修饰的细胞施用或重新引入患者中。离体治疗的益处在于，能够在不使患者暴露于治疗带来的不希望的附带影响的情况下，为患者提供治疗的益处。
术语“施用”是指将治疗有效剂量的前述组合物(包括各种细胞)施用于个体。“治疗有效量”是指产生施用的效果的剂量。确切的剂量将取决于治疗的目的，并且可以由本领域技术人员使用已知技术来确定。如本领域已知并且如上所述，由于系统递送与局部递送、年龄、体重、总体健康、性别、饮食、施用时间、药物相互作用和病症的严重程度，可能需要进行调整，并且可以由本领域技术人员用常规实验来确定。
需要治疗的主体包括那些已经患有良性、癌前或非转移性肿瘤的主体，以及要预防癌症发生或复发的主体。主体可能具有转移细胞，包括存在于腹水和/或淋巴结中的转移细胞。
治疗的目的或结果可能是减少癌细胞的数量；缩小原发性肿瘤的大小；抑制(即减缓至某种程度，优选停止)癌细胞浸润到外周器官中；抑制(即减缓至某种程度，优选停止)肿瘤转移；在某种程度上抑制肿瘤生长；和/或在某种程度上减轻一种或多种与疾病相关的症状。
可以通过评估存活时间、疾病进展时间、应答率(RR)、应答时间和/或生命质量来测定治疗效果。
该方法对于延长疾病进展时间特别有用。
该方法对于延长人的存活特别有用，包括整体存活和无进展存活。
该方法对于提供对治疗的完全应答特别有用，由此对治疗应答的癌症的全部迹象已经消失。这并不总是意味着癌症已经被治愈。
该方法对于提供对治疗的部分应答特别有用，由此应答于治疗，一种或多种肿瘤或病变的大小或体内癌症的程度已经减小。
治疗的目的或结果可以是以下任意一种或多种：
-减少癌细胞的数目；
-减小原发肿瘤的大小；
-阻止(即减缓至某种程度，优选停止)癌细胞浸润到外周器官中；
-抑制(即减缓至某种程度，优选停止)肿瘤转移；
-在某种程度上抑制肿瘤生长；
-在某种程度上减轻一种或多种与疾病相关的症状。
在一个实施方案中，需要治疗的动物包括那些患有良性、癌前、非转移性肿瘤的动物。
在一个实施方案中，癌症是癌前的或肿瘤前的。
在一个实施方案中，所述癌症是继发性癌症或转移。继发性癌症可以位于任何器官或组织中，特别是具有相对较高的血液动力学压力的那些器官或组织中，例如肺、肝、肾、胰腺、肠和脑。可以在腹水和/或淋巴结中检测到继发性癌症。
在一个实施方案中，癌症可能是基本上不可检测的。
“癌前”或“肿瘤前”通常是指通常在癌症发生之前或发展为癌症的状况或生长。“癌前”生长可能具有以异常的细胞周期调节、增殖或分化为特征的细胞，该细胞可以通过细胞周期的标志物来确定。
在一个实施方案中，癌症是癌前的或肿瘤前的。
在一个实施方案中，所述癌症是继发性癌症或转移。继发性癌症可以位于任何器官或组织中，特别是具有相对较高的血液动力学压力的那些器官或组织，例如肺、肝、肾、胰腺、肠和脑。
在一个实施方案中，癌症表达细胞表面肿瘤抗原Her-2。表达细胞表面肿瘤抗原Her-2的癌症的一个实例是肉瘤。
癌症的其他实例包括：母细胞瘤(包括髓母细胞瘤和视网膜母细胞瘤)、肉瘤(包括脂肉瘤和滑膜细胞肉瘤)、神经内分泌肿瘤(包括类癌肿瘤、胃泌素瘤和胰岛细胞癌)、间皮瘤、神经鞘瘤(包括听神经瘤)、脑膜瘤、腺癌、黑色素瘤、白血病或淋巴样恶性肿瘤、肺癌(包括小细胞肺癌(SCLC)、非小细胞肺癌(NSCLC)、肺腺癌和肺鳞癌、表皮样肺癌)、腹膜癌、肝细胞癌、胃癌(gastric cancer或stomach cancer)(包括胃肠癌)、胰腺癌、胶质母细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌(liver cancer)、膀胱癌、肝细胞瘤(hepatoma)、乳腺癌(包括转移性乳腺癌)、结肠癌、直肠癌、结直肠癌、子宫内膜癌或子宫癌、唾液腺癌、肾癌(kidney cancer或renal cancer)、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌、肛门癌、阴茎癌、睾丸癌、食道癌、胆道肿瘤以及头颈癌。
肿瘤前、肿瘤和转移性疾病是可以应用本发明方法的特定实例。广泛的实例包括：乳腺肿瘤、结直肠肿瘤、腺癌、间皮瘤、膀胱肿瘤、前列腺肿瘤、生殖细胞肿瘤、肝细胞瘤/胆管、恶性上皮肿瘤、神经内分泌肿瘤、垂体瘤、小圆形细胞瘤、鳞状细胞癌、黑色素瘤、非典型纤维黄色瘤、精原细胞瘤、非精原细胞瘤、基质莱迪希细胞瘤(stromal leydig celltumour)、支持细胞瘤(Sertoli cell tumour)、皮肤肿瘤、肾脏肿瘤、睾丸肿瘤、脑瘤、卵巢肿瘤、胃肿瘤、口腔肿瘤、膀胱肿瘤、骨肿瘤、宫颈肿瘤、食道肿瘤、喉肿瘤、肝肿瘤、肺肿瘤、阴道肿瘤和威尔姆斯肿瘤(Wilms’tumour)。
特定癌症的实例包括但不限于：腺癌、腺瘤、腺纤维瘤、腺淋巴瘤、adontoma、AIDS相关癌症、听神经瘤、急性淋巴细胞性白血病、急性骨髓性白血病、腺样囊性癌、肾上腺皮质癌、特发性髓样化生、脱发、肺泡软组织肉瘤(alveolar soft-part sarcoma)、釉母细胞瘤、血管角质瘤、血管淋巴增生伴嗜酸性粒细胞增多、硬化性血管瘤、血管瘤病、Apud肿瘤、肛门癌、血管肉瘤、再生障碍性贫血、星形细胞瘤、共济失调-毛细血管扩张、基底细胞癌(皮肤)、膀胱癌、骨癌、肠癌、脑干神经胶质瘤、脑和中枢神经系统肿瘤、乳腺癌、鳃原性瘤、中枢神经系统肿瘤、类癌肿瘤、宫颈癌、儿童期脑肿瘤、儿童期癌症、儿童期白血病、儿童期软组织肉瘤、软骨肉瘤、绒毛膜癌、慢性淋巴细胞性白血病、慢性骨髓性白血病、结直肠癌、皮肤T细胞淋巴瘤、恶性上皮肿瘤(例如Walker、基底细胞、基底鳞状(basosquamous)、Brown-Pearce、导管、Ehrlich肿瘤、Krebs 2、Merkel细胞、粘液性、非小细胞肺、燕麦细胞，乳头癌、硬性癌、细支气管、支气管原的、鳞状细胞和过渡细胞)、癌肉瘤、宫颈非典型增生、乳腺叶状囊肉瘤、牙骨质瘤、脊索瘤、迷芽瘤、软骨肉瘤、软骨母细胞瘤、颅咽管瘤、胆管瘤、胆脂瘤、圆柱瘤、囊腺癌、囊腺瘤、隆突性皮肤纤维肉瘤、促结缔组织增生性小圆细胞瘤(desmoplastic-small-round-cell-tumour)、导管癌、无性细胞瘤、内分泌癌症、子宫内膜癌、室管膜细胞瘤、食道癌、尤因氏肉瘤、肝外胆管癌、眼癌、眼：黑素瘤、视网膜母细胞瘤、输卵管癌、范可尼贫血症、纤维瘤、纤维肉瘤、胆囊癌、胃癌、胃肠癌、胃肠道类癌、泌尿生殖系统癌症、生殖细胞肿瘤、妊娠滋养细胞疾病(gestationaltrophoblastic-disease)、神经胶质瘤、妇科癌症、巨细胞瘤、神经节瘤、神经胶质瘤、血管球瘤、颗粒细胞瘤、男性细胞瘤(gynandroblastoma)、血液学恶性肿瘤、毛细胞白血病、头颈癌、肝细胞癌、遗传性乳腺癌、组织细胞增生症、霍奇金病(Hodgkin’s disease)、人乳头瘤病毒、葡萄胎、高钙血症、下咽癌、错构瘤、血管内皮瘤、血管瘤、血管外皮细胞瘤、血管肉瘤、血管肉瘤、组织细胞疾病、恶性组织细胞增多症、组织细胞瘤、肝癌、汗腺腺瘤、hondrosarcoma、免疫增生小、opoma、眼内黑色素瘤(ontraocularmelanoma)、胰岛细胞癌、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcoma)、肾癌、朗格汉斯细胞组织细胞增生症(Langerhan’s Cell Histiocytosis)、喉癌、平滑肌肉瘤、白血病、李-佛美尼综合征(li-fraumeni syndrome)、唇癌、脂肪肉瘤、肝癌、肺癌、淋巴水肿、淋巴瘤、霍奇金氏淋巴瘤、非霍奇金淋巴瘤、平滑肌肉瘤、白血病(例如B细胞、混合细胞、裸细胞、T细胞、T细胞慢性、HTLV-II相关的、淋巴管肉瘤、淋巴细胞性急性、淋巴细胞性慢性、肥大细胞和髓样)、白血病肉瘤、莱迪希细胞瘤(leydig cell tumour)、平滑肌瘤、淋巴管瘤、淋巴管细胞瘤(lymphangiocytoma)、淋巴管瘤、淋巴管肌瘤、淋巴管肉瘤、男性乳腺癌、肾脏恶性横纹肌样肿瘤(malignant-rhabdoid-tumour-of-kidney)、髓母细胞瘤、黑色素瘤、默克尔细胞癌(Merkel cell cancer)、间皮瘤、转移癌、口腔癌、多发性内分泌肿瘤、蕈样霉菌病(mycosisfungoides)、骨髓增生异常综合征、骨髓瘤、骨髓增殖性疾病、恶性类癌综合征类癌性心脏病(malignant carcinoid syndrome carcinoid heart disease)、脑膜瘤、黑色素瘤、间质瘤、中肾瘤、成肌细胞瘤、肌瘤、肌肉瘤、粘液瘤、粘液肉瘤、鼻癌、鼻咽癌、肾母细胞瘤、神经母细胞瘤、神经纤维瘤病、nijmegen断裂综合征、非黑瘤皮肤癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、神经鞘膜瘤、神经母细胞瘤、神经上皮瘤、神经纤维瘤病、神经纤维瘤、神经瘤、肿瘤(neoplasms)(例如骨、乳腺、消化系统、结直肠癌、肝脏)、眼癌、食道癌、口腔癌、口咽癌、骨肉瘤，造口卵巢癌、胰腺癌、副鼻癌(paranasal cancer)、甲状旁腺癌、腮腺癌、阴茎癌、外周神经外胚层肿瘤、垂体癌、真性红细胞增多症、前列腺癌、骨瘤、骨肉瘤、卵巢癌、乳头状瘤、副神经节瘤、非嗜铬性副神经节瘤(paraganglioma nonchromaffin)、松果体瘤、浆细胞瘤、原癌基因、罕见癌症及相关疾病、肾细胞癌、视网膜母细胞瘤、横纹肌肉瘤、Rothmund-Thomson综合症、网状内皮组织增殖、横纹肌瘤、唾液腺癌、肉瘤、神经鞘瘤、塞泽里综合症(Sezary syndrome)、皮肤癌、小细胞肺癌(SCLC)、小肠癌、软组织肉瘤、脊髓肿瘤、鳞状细胞癌-(皮肤)、胃癌、滑膜肉瘤、肉瘤(例如尤因氏实验(Ewing’s experimental)、卡波西氏肉瘤(Kaposi’s sarcomas)和肥大细胞肉瘤)、支持细胞瘤(Sertoli cell tumour)、滑膜瘤、睾丸癌、胸腺癌、甲状腺癌、过渡细胞癌(膀胱)、过渡细胞癌(肾-盆骨-/-输尿管)、滋养细胞癌、畸胎瘤、卵泡膜细胞瘤、胸腺瘤、滋养细胞肿瘤、尿道癌、泌尿系统癌、尿空斑蛋白(uroplakins)、子宫肉瘤、子宫癌、阴道癌、外阴癌、华氏巨球蛋白血症(Waldenstrom’smacroglobulinemia)和威尔姆斯肿瘤(Wilms’tumour)。
将理解的是，在本说明书中公开和定义的发明扩展到在文本或附图中所提到的或显而易见的两个或更多个单独特征的所有可替代组合。所有这些不同的组合构成了本发明的各种可替代方面。
实施例
实施例1：Ptp1b缺失增加整体的T细胞细胞数，而不影响胸腺中CD4/CD8 T细胞的 发育。
Ptpn1fl/fl小鼠先前已有描述(Bence等，2006Nature Medicine 12，917-24)。为了删除T细胞中的PTP1B，我们将Ptp1bfl/fl小鼠Lck-Cre转基因杂交，以产生Lck-Cre；Ptpn1fl /fl小鼠。
在8周龄时处死Lck-Cre；Ptpn1fl/fl小鼠(n＝8)和野生型对应体(n＝8)。将从胸腺和各种淋巴器官中分离出单细胞以用于FACS分析。
图2(A)显示，胸腺(p＝0.0499)、淋巴结(p＝0.0003)和脾脏(p＝0.0207)的总细胞数增多。双阳性(DP)胸腺细胞(p＝0.008)、双阴性(DN)胸腺细胞(p＝0.008)、CD4+胸腺细胞(p＝0.0013)和CD8+胸腺细胞(p＝0.0293)的细胞数增加(图2B)。
同时，还发现在各个发育阶段之间细胞数增多(p＝0.002，p＝0.001，p＝0.053，p＝0.001)(图2C)。但是，CD4+和CD8+ T细胞之间的比例仍然相似(p＝0.7984)。(图2D)。
用Mann-Whitney检验进行统计。图表代表来自两个独立实验。
实施例2：Ptp1b缺失增加外周中各种T细胞亚群的细胞数。
在8周龄时处死Lck-Cre；Ptpn1fl/fl小鼠(n＝8)和野生型对应体(n＝8)。将从胸腺和各种淋巴器官中分离出单细胞，如实施例1。
图4(A-B)显示，在淋巴结和脾脏中，总的CD4+和CD8+ T细胞以及其中的效应子\效应子记忆或中央记忆亚群的细胞数都增加了。图4C显示在淋巴结(p＝0.0047)和脾脏(p＝0.0379)中，生发中心滤泡辅助T细胞的细胞数量增加。同时，在淋巴结(p＝0.0011)和脾脏(p＝0.0006)中的B细胞的数量也增加了。
另外，脾脏中的γδT细胞增加(p＝0.003)。在淋巴结(p＝0.0002)、脾脏(p＝0.0019)和胸腺(p＝0.0281)的CD4+CD25+FoxP3+调节性T细胞的数目增加(图4D)。
用Mann-Whitney检验进行统计。图表代表来自两个独立实验。
实施例3：Ptp1b缺失增强T细胞的TCR信号传导和活化。
分离来自Lck-Cre；Ptpn1fl/fl小鼠(n＝5)和野生型对应体(n＝5)的淋巴细胞，并用抗CD3(1.25μg/ml)和抗CD28(1.25μg/ml)抗体刺激48小时。
Lck-Cre；Ptpn1fl/fl CD4+或CD8+ T细胞中的活化标志物CD25、CD44和CD69均显著上调。CD62L则相反，显著降低。
当用抗CD3(1μg/ml)抗体刺激时，在CD4+ T细胞中ERK的磷酸化显著增强，而在CD8+T细胞中则没有显著增强。
使用Mann-Whitney检验对活化标志物进行统计，并使用双因素方差分析对磷酸化进行统计。图表代表来自两个独立实验。
实施例4：PTP1B缺失增强T细胞中的细胞因子信号传导。
分离来自Lck-Cre；Ptpn1fl/fl小鼠(n＝5)和野生型对应体(n＝5)的淋巴细胞，并用IL-7(图12A)或IL-15(图12B)刺激。
在总体CD4+和CD8+ T细胞或幼稚和中央记忆亚群中STAT5的磷酸化增强。用双因素方差分析进行统计。图表代表来自两个独立实验。
实施例5：PTP1B缺失增强T细胞的增殖。
从Lck-Cre；Ptpn1fl/fl小鼠(n＝5)和野生型对应体(n＝5)分离淋巴细胞，并用各种浓度的抗CD3抗体和1.25μg/ml的抗CD28抗体刺激72小时。在各种强度的抗CD3刺激下，CD4+T细胞和CD8+ T细胞中的增殖细胞数量均显著增加(参见图6-8)。
用Mann-Whitney检验进行统计。图表代表来自两个独立实验。
实施例6：Ptp1b缺失增强嵌合抗原受体(CAR)T细胞的杀伤能力。
从Lck-Cre；Ptpn1fl/fl小鼠(n＝5)和野生型对应体(n＝5)分离脾细胞，并用5μg/ml的抗CD3抗体和5μg/ml的抗CD28抗体刺激，在D0供应5ng/ml IL-2和0.2ng/ml IL-7。然后在D1和D2用CAR表达载体通过逆转录病毒转导细胞两次。然后在完全培养基中用5ng/ml IL-2和0.2ng/ml IL-7培养转导的细胞，直到D7用于表型分析，D10用于杀伤试验。
在分析前，将CAR-T细胞与靶细胞以不同的比例共培养4小时。与野生型对应体相比，Lck ptp1b CAR-T细胞显示出明显更好的杀伤能力(图13A)。当在杀伤试验之前分选出中央记忆或效应子/效应子记忆亚群时，在任一亚群中，Lck-Cre；Ptpn1fl/fl细胞都胜过野生型对应体。在这两种基因型中，效应子/效应子记忆亚群在杀伤方面的表现均优于中央记忆群。
ptp1b缺失导致效应子/效应子记忆亚群增加(图13)。
Lck-Cre；Ptpn1fl/fl CAR-T细胞中活化标志物CD25、Lag3和PD-1显著增加。同时，功能性标志物颗粒酶B和干扰素γ也增加。(图13C)。
在杀伤试验中使用双因素方差分析进行统计，对表型进行Mann-Whitney检验。图表代表来自两个独立实验。
实施例7：Ptp1b缺失增强CAR-T介导的肿瘤抑制作用和CAR-T寿命。
如上文实施例6中所述，制备CAR-T细胞。
将2×105个表达Her-2的E0771细胞接种到Her-2转基因小鼠的乳腺脂肪垫中。CAR-T制备同时开始。1×107个CAR-T细胞通过静脉注射过继转移，随后伴随500IU IL-2三次(图14A)。
监测肿瘤生长(图14B)，并在肿瘤生长的终点从引流淋巴结和脾脏中分离出CAR-T细胞。Lck-Cre；Ptpn1fl/fl CAR-T细胞表现出明显更好的肿瘤生长抑制作用，并且在小鼠中的持久性更好(图14C和D)。
用双因素方差分析对肿瘤生长进行统计，并用Mann-Whitney t检验对CAR-T细胞的细胞数量进行统计。
实施例8：Ptp1b缺失使CAR-T细胞维持较少的耗尽表型。
如在实施例7中所述，在被过继转移到荷瘤小鼠中20天后，从淋巴结和脾脏中分离出CAR-T细胞。
用流式细胞术分析耗尽标志物PD-1和Lag-3的表达水平。
在引流淋巴结中的Lck-Cre；Ptpn1fl/fl效应子/效应子记忆CAR-T细胞中，PD-1表达水平明显较低(图15A)。在引流淋巴结和脾脏中的Lck-Cre；Ptpn1fl/fl中央记忆CAR-T细胞中，Lag-3表达水平明显较低(图15A)。
用Mann-Whitneyt-检验进行统计。
实施例8：PTP1B抑制通过对T细胞的作用抑制肿瘤生长。
将乳腺癌细胞移植到小鼠的乳腺脂肪垫中，该小鼠“整体”ptp1b缺陷(Ptpn1-/-)或T细胞特异性ptp1b缺陷(Lck-Cre；Ptpn1fl/fl)。在移植后监测肿瘤生长28天。与对照(ptp1b+/+)相比，整体缺陷ptp1b或ptp1b杂合的小鼠表现出显著的肿瘤生长抑制。(图18A)。与对照组相比，在T细胞特异性ptp1b缺陷的小鼠中，肿瘤的生长明显延迟，并且荷瘤小鼠的总体存活率显著提高。(图19A)。这些结果表明，T细胞中的PTP1B缺陷增强了T细胞介导的免疫监视，从而抑制了肿瘤的发展。
图18-20中显示的结果表明，如果小鼠没有PTP1B(图18中的结果)或仅在T细胞中缺乏PTP1B(参见图19中的结果)，则小鼠中的同基因肿瘤的生长受到抑制。每隔3天用变构PTP1B抑制剂MSI1436(trudosquemine)处理小鼠也会抑制同基因乳腺肿瘤的生长(图20)。至关重要的是，在T细胞中缺乏PTP1B的小鼠中，PTP1B抑制剂并未导致肿瘤负荷的进一步减小，这表明PTP1B抑制剂通过直接抑制T细胞中的PTP1B来引发其抗肿瘤作用。
这些结果表明，可以通过在向个体施用T细胞之前直接抑制T细胞中的PTP1B，或者可选地通过直接向个体施用抑制剂来直接靶向T细胞中的PTP1B，来实现对PTP1B的抑制，以引发抗肿瘤作用。

Claims (55)

1.一种用于生产具有增强的杀伤靶细胞能力的白细胞的方法，所述方法包括：
-在能使PTP1B抑制剂失活白细胞中的PTP1B的条件下，使白细胞与PTP1B抑制剂接触，
从而产生具有增强的杀伤靶细胞能力的白细胞。
2.根据权利要求1所述的方法，其中在不存在T辅助细胞的情况下使所述白细胞与所述PTP1B抑制剂接触。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中使所述白细胞与所述PTP1B抑制剂离体接触。
4.一种用于制备表现出细胞毒性T细胞的至少一种特性的离体T细胞群的方法，其包括在PTP1B抑制剂的存在下培养T细胞。
5.一种用于制备表现出细胞毒性T细胞的至少一种特性的离体T细胞群的方法，其包括以下步骤：
-在PTP1B抑制剂的存在下，从生物样品中培养T细胞群；
-扩增培养的细胞；
从而制备表现出细胞毒性特性的离体T细胞群。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述生物样品源自患有癌症的主体或者已经被调节或改造成对癌症具有特异性。
7.一种用于制备包含抗原特异性细胞毒性T细胞的组合物的离体方法，所述方法包括：
-提供含有T细胞群的生物样品；
-在PTP1B抑制剂的存在下，将抗原物质与所述T细胞群共培养；以及
-扩增培养的细胞；
从而离体制备包含抗原特异性细胞毒性T细胞的组合物。
8.一种用于增加主体中表现出效应子记忆表型的T细胞水平的方法，其包括以下步骤：
-在PTP1B抑制剂的存在下，从生物样品中离体培养T细胞群；
-扩增培养的细胞；
-将培养的细胞施用于所述主体；
从而增加主体中表现出效应子记忆表型的T细胞水平。
9.一种用于在主体中形成适于治疗癌症的免疫应答的方法，其包括以下步骤：
-从所述主体或组织相容性供体主体获得T细胞；
-在能产生表现出至少一种细胞毒性T细胞特性的T细胞群的条件下，在PTP1B抑制剂的存在下离体培养所述T细胞足够的时间，从而形成细胞毒性T细胞群，
-将所述细胞毒性T细胞群施用于所述主体；
从而在主体中产生适于治疗癌症的免疫应答。
10.一种增强具有疾病状态的主体中CD8+T细胞介导的免疫的方法，包括：
-在能产生表现出细胞毒性T细胞的至少一种特性的CD8+T细胞群的条件下，使CD8+T细胞与PTP1B抑制剂离体接触足够的时间；
-将所述CD8+T细胞群施用于所述主体；
从而增强主体中CD8+T细胞介导的免疫。
11.一种增强具有疾病状态的主体中CD8+T细胞介导的免疫的方法，包括：
-分离所述主体的CD8+T细胞群；
-将编码针对PTP1B的siRNA、shRNA或gRNA的核酸分子引入分离的CD8+T细胞中，从而降低CD8+T细胞中PTP1B的水平；以及
-将所述CD8+T细胞重新引入所述主体中，
从而增强主体中CD8+T细胞介导的免疫。
12.一种促进主体中癌症消退的方法，其包括以下步骤：
-在PTP1B抑制剂的存在下，培养从主体获得的T细胞，
-将培养的T细胞施用于所述主体；
从而促进癌症的消退。
13.一种促进患癌主体中癌症消退的方法，其包括以下步骤：
-在PTP1B抑制剂的存在下，培养对所述癌症所表达的肿瘤抗原具有特异性的CAR-T细胞，
-将培养的CAR-T细胞施用于所述主体；
从而促进癌症的消退。
14.一种延长患癌主体的存活的方法，其包括以下步骤：
-在PTP1B抑制剂的存在下，培养对所述癌症所表达的肿瘤抗原具有特异性的CAR-T细胞，
-将培养的CAR-T细胞施用于所述主体；
从而延长所述主体的存活。
15.根据权利要求12至14所述的方法，其中所述癌症选自：Her-2阳性癌症、CD19阳性癌症、CD171阳性癌症、EGFR阳性癌症、CD22阳性癌症、CD123阳性癌症、Lewis Y阳性癌细胞、或MSLN阳性癌症、FAP阳性癌症或CD131阳性癌症。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述PTP1B抑制剂是干扰RNA或小分子抑制剂。
17.根据权利要求16所述的方法，其中所述小分子抑制剂是claramine或trodusquemine或其衍生物。
18.根据权利要求1至15中任一项所述的方法，其中所述PTP1B抑制剂是用于直接抑制PTP1B的CRISPR/Cas9系统。
19.一种用于过继免疫治疗的肿瘤抗原特异性细胞毒性T细胞群，其包含编码干扰RNA的外源核酸。
20.一种分离的、纯化的或重组的细胞，其包含抗原特异性T细胞受体和编码干扰RNA的外源核酸。
21.根据权利要求19所述的细胞群或权利要求20所述的分离的、纯化的或重组的细胞，其中所述干扰RNA是能够降低细胞中PTP1B水平的微小RNA、shRNA、siRNA或gRNA分子。
22.根据权利要求20或21所述的分离的、纯化的或重组的细胞，其中所述T细胞受体(TCR)对癌症抗原具有特异性，并且所述细胞是CD8+T细胞。
23.根据权利要求22所述的细胞，其中所述CD8+T细胞是从患有癌症的宿主分离的肿瘤浸润淋巴细胞或外周血淋巴细胞。
24.一种用于增殖、富集或扩增包含CD8+T细胞的细胞组合物的方法，所述方法包括在培养基中培养细胞组合物，所述培养基包含PTP1B抑制剂，其中所述PTP1B抑制剂被提供在所述培养基中以允许在培养期间与CD8+T细胞接触。
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述增殖、富集或扩增将导致表现出至少一种细胞毒性T细胞特性的CD8+T细胞的数量加倍。
26.根据权利要求25所述的方法，其中所述扩增导致3×或4×数量的表现出至少一种细胞毒性T细胞特性的CD8+T细胞，优选至少5×、6×、7×、8×、9×或超过10×。
27.根据权利要求22至26中任一项所述的方法，其中所述组合物中表现出至少一种细胞毒性T细胞特性的CD8+T细胞的相对数量增加。
28.一种细胞毒性细胞的组合物，其中大于20％的细胞具有完全或部分的PTP1B抑制。
29.根据权利要求28所述的组合物，其中，所述组合物包括大于30％、40％、50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的具有完全或部分的PTP1B抑制的细胞，或其中优选地，所述组合物中的全部细胞具有完全或部分的PTP1B抑制。
30.一种包含白细胞和PTP1B抑制剂的组合物。
31.根据权利要求30所述的组合物，其中所述PTP1B抑制剂是干扰RNA或小分子抑制剂。
32.根据权利要求31所述的组合物，其中所述小分子抑制剂是claramine或trodusquemine或其衍生物。
33.根据权利要求28至32中任一项所述的组合物，其中所述组合物进一步包含用于增强细胞杀伤的细胞因子，例如IL-2或IFNγ。
34.根据权利要求30至33中任一项所述的组合物，其中所述白细胞是CAR T细胞，优选为对细胞表面肿瘤抗原具有特异性的CAR T细胞，更优选地，其中所述CAR T细胞对选自以下的肿瘤抗原具有特异性：Her-2、CD19、CD171、EGFR、CD22、CD123、Lewis Y、MSLN、FAP或CD131。
35.根据权利要求30至34中任一项所述的组合物，其中所述白细胞选自由以下组成的组：肿瘤浸润淋巴细胞、外周血淋巴细胞、经过基因改造以表达抗肿瘤T细胞受体或嵌合抗原受体(CAR)、γδT细胞、用混合淋巴细胞肿瘤细胞培养物(MLTC)富集或使用自体抗原呈递细胞和肿瘤衍生肽进行克隆。
36.根据权利要求35所述的组合物，其中所述淋巴细胞从组织相容性供体或从患有癌症的主体中分离。
37.根据权利要求1至17或24至27中任一项所述的方法，其中在PTP1B抑制剂的存在下进行培养之前，将所述细胞纯化或基本纯化。
38.一种治疗主体中癌症的方法，其包括施用有效治疗癌症的分离的或纯化的CD8+T细胞群，所述CD8+T细胞包含抗原特异性T细胞受体和编码抑制PTP1B的干扰RNA的外源核酸。
39.根据权利要求28所述的方法，其中所述干扰RNA是针对PTP1B的微小RNA、shRNA、siRNA或gRNA分子。
40.一种用于增加主体中表现出效应子记忆表型的T细胞水平的方法，其包括以下步骤：
-将PTP1B抑制剂施用于所述主体；
从而增加主体中表现出效应子记忆表型的T细胞水平。
41.一种用于在主体中形成适于治疗癌症的免疫应答的方法，包括向所述主体施用PTP1B抑制剂，从而在主体中产生适于治疗癌症的免疫应答。
42.一种增强具有疾病状态的主体中CD8+T细胞介导的免疫的方法，其包括对所述主体施用PTP1B抑制剂，从而增强主体中CD8+T细胞介导的免疫。
43.一种治疗主体中癌症的方法，包括向所述主体施用PTP1B抑制剂，从而治疗所述主体中的癌症。
44.一种促进患有癌症的主体中的癌症消退的方法，其包括向所述主体施用PTP1B抑制剂，从而促进所述癌症消退。
45.一种延长患有癌症的主体的存活的方法，其包括向所述主体施用PTP1B抑制剂，从而延长所述主体的存活。
46.根据权利要求38至45中任一项所述的方法，其中所述癌症为Her-2阳性癌症、CD19阳性癌症、CD171阳性癌症、EGFR阳性癌症、CD22阳性癌症、CD123阳性癌症、Lewis Y阳性癌细胞、或MSLN阳性癌症、FAP阳性癌症或CD131阳性癌症。
47.根据权利要求40至46中任一项所述的方法，其中所述方法进一步包括向个体施用CAR-T细胞。
48.根据权利要求47所述的方法，其中所述CAR-T细胞是Her-2特异性CAR CD8+T细胞。
49.根据权利要求38至48中任一项所述的方法，其中所述PTP1B抑制剂直接施用于个体。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述抑制剂是系统性地或通过允许所述PTP1B抑制剂进入循环的任何手段施用的。
51.根据权利要求49或50所述的方法，其中所述PTP1B抑制剂是干扰RNA或小分子抑制剂。
52.根据权利要求51所述的方法，其中所述小分子抑制剂是claramine或trodusquemine或其衍生物。
53.根据权利要求51所述的方法，其中所述PTP1B抑制剂是干扰RNA，所述扰RNA选自能够降低细胞中PTP1B水平的微小RNA、shRNA、siRNA或gRNA分子。
54.PTP1B抑制剂在药物制备中的用途，所述药物用于：
-增加主体中表现出效应子记忆表型的T细胞水平；
-在主体中形成适于治疗癌症的免疫应答；
-增强具有疾病状态的主体中CD8+T细胞介导的免疫；
-治疗主体中的癌症；
-促进患有癌症的主体中癌症的消退；或
-延长患有癌症的主体的存活。
55.以下用途的PTP1B抑制剂或包含PTP1B抑制剂的药物组合物：
-增加主体中表现出效应子记忆表型的T细胞水平；
-在主体中形成适于治疗癌症的免疫应答；
-增强具有疾病状态的主体中CD8+T细胞介导的免疫；
-治疗主体中的癌症；
-促进患有癌症的主体中癌症的消退；或
-延长患有癌症的主体的存活。
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