CN114761438A - 用于编程细胞外囊泡的重组多肽 - Google Patents

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约翰·卡梅伦·贝尔
杰克·蒂莫西·惠兰
马蒂厄·弗朗索瓦·约瑟夫·克鲁皮
杰西·年·董
布赖恩·丹尼斯·利克蒂
马修·约翰·阿瑟顿
王福安
约安娜·普图·波米耶
斯蒂芬·唐纳德·博尔顿
穆罕默德塔哈·穆罕默德迪亚扎德
拉古纳特·兴格拉维鲁
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Abstract

本文提供了一种重组肿瘤选择性病毒颗粒，其包含编码用于将细胞外囊泡(EV)导向至少一种靶细胞的重组多肽的核酸，所述重组多肽包含：用于将所述EV导向由所述至少一种靶细胞表达的所述至少一种靶分子的至少一个靶向部分；至少一种EV锚定多肽；以及至少一种囊泡内多肽。该病毒颗粒可来自溶瘤病毒。还提供了用于将EV编程为靶向特定分子的重组多肽。还描述了用于例如在疫苗或无细胞“CAR‑T”样应用中将有效载荷多肽(和/或货物分子)递送至靶细胞的治疗性EV，以及用于在EV介导的BiTE样应用中将免疫细胞募集至靶细胞的EV。溶瘤病毒也可被工程化以感染肿瘤细胞并脱落程序性EV，从而产生附加的治疗效果。

Description

用于编程细胞外囊泡的重组多肽
相关申请的交叉引用
本申请要求于2019年11月28日提交的标题为“RECOMBINANT POLYPEPTIDES FORPROGRAMMING EXTRACELLULAR VESICLES”[用于编程细胞外囊泡的重组多肽]的美国临时专利申请号62/941,768的优先权，该临时专利申请特此通过援引并入。本说明书中所提及的所有出版物、专利和专利申请以及展出物通过援引并入本文，如同每个单独的出版物、专利或专利申请具体且单独地通过援引并入。
技术领域
本披露总体上涉及将分子递送至细胞。更具体地，本披露涉及将分子靶向递送至细胞。
背景技术
治疗性分子在生物系统内的靶向递送是疾病治疗的重要组成部分。然而，由于不稳定性、在到达靶细胞之前的脱靶效应、分子在其他环境中的毒性以及其他问题，将分子靶向递送至特定细胞类型仍然是一项挑战。
因此，期望提供仅治疗靶细胞的稳定的靶向治疗性分子。
发明内容
本披露的目的是消除或减轻先前方法的至少一个缺点。
在第一方面，本披露提供了一种重组肿瘤选择性病毒颗粒，其包含编码用于将细胞外囊泡(EV)导向至少一种靶细胞的重组多肽的核酸，所述重组多肽包含：用于将所述EV导向由所述至少一种靶细胞表达的所述至少一种靶分子的至少一个靶向部分，至少一种EV锚定多肽，和至少一种囊泡内多肽。
在另一方面，提供了一种用于将细胞外囊泡(EV)导向至少一种靶细胞的重组多肽，其包含：用于将所述EV导向由所述至少一种靶细胞表达的所述至少一种靶分子的至少一个靶向部分，至少一种EV锚定多肽，和至少一种囊泡内多肽。
在一个方面，提供了一种编码本文的重组多肽的核酸分子。
在一个方面，提供了一种包含如本文所定义的核酸的载体。
在一个方面，提供了一种包含如本文所定义的核酸的重组病毒基因组。
在一个方面，提供了一种包含如本文所定义的核酸的病毒颗粒。
在一个方面，提供了一种包含如本文所定义的核酸、载体、重组病毒基因组或病毒颗粒的宿主细胞。
在一个方面，提供了一种包含如本文所定义的重组多肽的靶向细胞外囊泡(EV)。
在一个方面，提供了一种组合物，其包含如本文所定义的核酸、如本文所定义的载体、如本文所定义的重组病毒基因组、如本文所定义的病毒颗粒或如本文所定义的靶向EV；以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。
在一个方面，提供了一种将靶向部分结合到靶细胞的靶分子的方法，所述方法包括使所述靶细胞与如本文所定义的靶向EV接触。
在一个方面，提供了一种将有效载荷分子递送至靶细胞的方法，所述方法包括使所述靶细胞与如本文所定义的靶向EV接触。
在一个方面，提供了一种将货物分子递送至靶细胞的方法，所述方法包括使所述靶细胞与如本文所定义的靶向EV接触。
在一个方面，提供了一种刺激针对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所定义的核酸、如本文所定义的载体、如本文所定义的重组病毒基因组、如本文所定义的病毒颗粒或如本文所定义的靶向EV，其中所述靶细胞包括免疫细胞，并且其中所述至少一种EV治疗性有效载荷多肽包括抗原。
在一个方面，提供了一种杀伤靶细胞的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所定义的核酸、如本文所定义的载体、如本文所定义的重组病毒基因组、如本文所定义的病毒颗粒或如本文所定义的靶向EV，其中所述至少一种EV治疗性有效载荷多肽包括细胞毒性分子。
在一个方面，提供了一种重编程免疫细胞的方法，所述方法包括使这些免疫细胞与如本文所定义的核酸、如本文所定义的载体、如本文所定义的重组病毒基因组、如本文所定义的病毒颗粒或如本文所定义的靶向EV接触，其中该至少一种EV治疗性有效载荷分子包括免疫调节分子。
在一个方面，提供了一种将免疫应答导向靶病变细胞的方法，该方法包括向受试者施用如本文所定义的核酸、如本文所定义的载体、如本文所定义的重组病毒基因组、如本文所定义的病毒颗粒或如本文所定义的靶向EV，其中所述重组多肽包含分别特异性结合至少两种不同的靶分子的至少两个靶向部分，其中所述至少两种不同的靶分子分别由免疫细胞和病变细胞表达。
在一个方面，提供了一种制备用于受试者的治疗性靶向EV的方法，所述方法包括：使获自受试者的细胞与如本文所定义的核酸、如本文所定义的载体、如本文所定义的重组病毒基因组或如本文所定义的病毒颗粒接触，以及收集这些靶向EV。
在一个实施例中，提供了一种产生靶向EV的方法，其中所述方法包括在细胞中表达如本文所定义的核酸，或培养如本文所定义的宿主细胞以产生EV；以及收集这些EV。
在结合附图阅读以下对具体实施例的描述后，本披露的其他方面和特征对于本领域普通技术人员将变得显而易见。
附图说明
现在将参考附图仅以实例的方式描述本披露的实施例。
图1描绘了本披露所设想的不同构建体的示意图。
图2描绘了嵌入在根据本发明的细胞外囊泡中的具有PD1靶向部分、LAMP2B跨膜结构域和HA-标签囊泡内多肽的多肽的示意图(小图A)以及示出小图A中描绘的多肽从痘苗病毒平台在全细胞裂解物以及分离的细胞外囊泡中成功表达的免疫印迹(小图B)。
图3描绘了免疫印迹，其示出在图2中示出的多肽中PD1靶向部分的拓扑是正确的(外部取向的)。
图4在小图A中描绘了为获得小图B中的数据而进行的竞争性结合ELISA实验设计的示意图，其示出如图2中描绘的多肽中的PD1部分成功地与其PDL-1受体结合。
图5在小图A中描绘了小图B中表示的数据的时间线，其示出图2的构建体在病毒表达时成功地激活T细胞。
图6在小图A中描绘了示出嵌入在靶向两种不同细胞类型(一种癌细胞和一种免疫杀伤细胞)的EV中的基于双特异性四次跨膜蛋白的构建体的示意图，并且在小图B中描绘了示出当肿瘤细胞用小图A的构建体转染然后与免疫细胞组合时细胞死亡增强的明视野显微镜图像。
图7描绘了示出在细胞转染后根据本发明的六种不同构建体的表达的蛋白质印迹。
图8描绘了示出在细胞转染后根据本发明的五种不同构建体的表达的蛋白质印迹。
图9描绘了示出在细胞转染后根据本发明的六种不同构建体的适当表达的蛋白质印迹。
图10描绘了示出在细胞转染后根据本发明的四种不同构建体的适当表达的蛋白质印迹。
图11描绘了靶向树突细胞上的DEC205的四种不同构建体的蛋白质免疫印迹，其示出小EV或含有CdaA有效载荷的靶向EV激活具有DEC205表面分子的树突细胞中的STING途径。
图12描绘了蛋白质免疫印迹，其显示当用小EV或含有靶向DEC205的具有CdaA有效载荷的图11的构建体的靶向EV处理时，在细胞表面上不具有DEC205的小鼠成纤维细胞不具有激活的STING途径。
图13描绘了示出靶向树突细胞上的DEC205的根据本发明的三种构建体的蛋白质免疫印迹，其显示外泌体(exosome)或含有CdaA有效载荷的靶向EV激活树突细胞中的STING途径。
图14在小图A中描绘了示出根据本发明的两种构建体的适当表达的蛋白质印迹，并且在小图B中描绘了示出靶向树突细胞的根据本发明的构建体的表达的免疫荧光图像。
图15描绘了示出靶向具有轮状病毒抗原有效载荷的树突细胞的根据本发明的构建体的细胞表达的免疫荧光图像。
图16描绘了展示对于其中构建体由肿瘤选择性病毒表达的情况携带用于免疫毒素介导的细胞死亡(凋亡)以及溶瘤作用(病毒介导的细胞死亡)的细胞毒性有效载荷的根据本发明的单靶向程序性细胞外囊泡的作用机制的示意图。
图17描绘了具有靶向癌胚抗原(CEA)或碳酸酐酶IX(CA9)的单链可变片段(scFv)靶向部分与VSVG跨膜结构域和mGZMB有效载荷的嵌合融合构建体的示意图。
图18描绘了示出在三种不同细胞类型中由质粒或病毒表达并在分离的细胞外囊泡中富集或由靶向EV表达的本发明的两种构建体的适当表达的蛋白质印迹。
图19A描绘了示出相对于阴性对照由根据本发明的痘苗病毒表达的具有细胞毒性有效载荷的两种构建体的细胞活力降低的柱状图。
图19B描绘了示出用根据本发明的靶向靶表面分子并携带细胞毒性有效载荷的构建体转染的在细胞表面上展示这些细胞表面分子的细胞中细胞死亡增加的明视野显微镜图像。
图19C描绘了示出与未转染细胞、缺乏靶向部分的构建体和缺乏细胞毒性有效载荷的构建体相比根据本发明的携带细胞毒性有效载荷的两种构建体相对于阴性对照细胞活力降低的柱状图。
图20描绘了示出在两种不同细胞类型中根据本发明的携带细胞毒性有效载荷的两种构建体相对于阴性对照细胞活力降低的柱状图。
图21描绘了示出用于上清液转移的方法的示意图。
图22描绘了上清液转移实验中细胞的明视野显微镜图像，其显示仅在接受含有靶向MC38-细胞的构建体的上清液(细胞外囊泡级分)的MC38-细胞中的细胞死亡。
图23描绘了上清液转移实验中细胞的明视野显微镜图像，其显示当用来自由表达根据本发明的构建体的病毒感染的细胞的上清液处理时仅在展示靶细胞表面分子的细胞中的细胞死亡。
图24描绘了在上清液转移实验中细胞的免疫荧光显微镜图像，其示出了靶向hCEA的具有mCherry有效载荷的根据本发明的构建体的表达，其在上面小图中示出用表达该构建体的病毒感染的CEA阴性细胞表达该构建体，并且在下面两个小图中，仅具有CEA靶表面标志物并且经历上清液转移的细胞摄取靶向这种细胞表面分子的构建体。
图25描绘了提供本发明的一个方面的用于在体内、原位或体外从生产细胞系产生根据本发明的程序性细胞外囊泡的概述的示意图。
图26描绘了展示根据本发明的具有基于四次跨膜蛋白的跨膜结构域并携带细胞毒性有效载荷的五种不同构建体的示意图。
图27描绘了示出图26中展示的五种构建体的成功表达的蛋白质印迹。
图28描绘了展示根据本发明的七种不同构建体的示意图，其中所展示的构建体的六种构建体具有靶向CD19和CD20的基于CD63四次跨膜蛋白的跨膜结构域与一个有效载荷，并且七种所展示的构建体中的一种构建体具有两个有效载荷和弗林蛋白酶切割位点。
图29A描绘了示出具有CTX靶向部分、VSVG跨膜结构域和NanolucTM有效载荷的根据本发明的构建体成功地由在HEK293T细胞中转染的质粒表达的蛋白质印迹。
图29B描绘了示出上清液转移实验中的发光的柱状图，其中荧光仅见于表达如图29A中所示的构建体的细胞的上清液中。
图29C描绘了示出转移到六种不同的人成胶质细胞瘤细胞系的图29B的上清液的柱状图，其中细胞中的发光与在处理的细胞外部展示的并且仅在包括适当的靶向部分的构建体中的靶细胞表面标志物的比例相关。
图30描绘了示出用痘苗病毒(VacV)感染的786-0癌细胞比未感染的细胞产生更多EV的图。
图31描绘了示出用痘苗病毒感染的几种癌细胞类型比未感染的细胞产生更多的EV的蛋白质印迹。
图32描绘了示出根据本发明的四种不同构建体在细胞转染后和在分离的EV级分中表达的蛋白质印迹。
图33描绘了示出根据本发明的构建体在细胞转染后和在分离的EV级分中的表达的蛋白质印迹。
图34描绘了示出根据本发明的四种不同构建体在细胞转染后和在分离的EV级分中表达的蛋白质印迹。
图35A示出了荧光显微镜图像，其显示含有与RNA结合基序融合的LDLRT(LDLR-靶向)-VSV的质粒可包装与NanolucTM(Nluc)融合的编码蓝色荧光蛋白(BFP)的mRNA并将其递送至LDLR靶标阳性的受体细胞。
图35B与35A相同的实验在受体细胞中测量NanolucTM活性的定量读出。
图36描绘了用aFAP-VSVG-mGZMB EV处理的成纤维细胞激活蛋白(FAP)阳性胰腺成纤维细胞(PanFib)、胰腺癌细胞(BxPC3)和患者样品(P025、P032)的细胞活力的图示。
图37描绘了蛋白质免疫印迹，其显示表达靶向树突细胞上的DEC205并含有CdaA有效载荷的aDEC205-mCD63-CdaA的PEV能够激活树突细胞中的STING途径。
图38描绘了靶向巨噬细胞上的MARCO的三种不同构建体的蛋白质免疫印迹，其示出小EV或含有CdaA有效载荷的靶向EV在骨髓衍生的巨噬细胞中激活STING途径，该巨噬细胞在其细胞表面上表达MACRO。
图39描绘了表明抗Marco-连接的CdaA PEV构建体在刺激干扰素(IFN)信号传导途径中的效力的测定。
图40描绘了表明与模拟对照相比在具有αCD3构建体的EV存在下鼠脾细胞(10:1脾细胞:MC38)对MC38细胞的细胞杀伤增加的直方图。
图41描绘了用原初EV或用aDEC205-VSVGTM-OVA或aDEC205-CD63D-CdaA-Flag和aDEC205-VSVGTM-OVA两者修饰的EV进行疫苗接种实验的结果的柱状图，其表明树突细胞靶向抗原[例如卵清蛋白(OVA)]和免疫佐剂(例如CdaA酶)两者的组合在体内诱导免疫应答。
图42描绘了示出通过刺激干扰素应答而充当免疫佐剂的树突细胞导向的PEV构建体的测定
具体实施方式
通常，本披露提供了一种重组肿瘤选择性病毒颗粒，其包含编码用于将细胞外囊泡(EV)导向至少一种靶细胞的重组多肽的核酸，所述重组多肽包含：用于将所述EV导向由所述至少一种靶细胞表达的所述至少一种靶分子的至少一个靶向部分；至少一种EV锚定多肽；以及至少一种囊泡内多肽。该病毒颗粒可来自溶瘤病毒。还提供了用于将细胞外囊泡(EV)导向至少一种靶细胞的重组多肽，该重组多肽包含：用于将所述EV导向由所述至少一种靶细胞表达的所述至少一种靶分子的至少一个靶向部分，至少一种EV锚定多肽，和至少一种囊泡内多肽。
包含EV编程重组多肽的病毒颗粒
在一个方面，提供了一种重组肿瘤选择性病毒颗粒，其包含编码用于将细胞外囊泡(EV)导向至少一种靶细胞的重组多肽的核酸，所述重组多肽包含：
-用于将所述EV导向由所述至少一种靶细胞表达的所述至少一种靶分子的至少一个靶向部分，
-至少一种EV锚定多肽，和
-至少一种囊泡内多肽。
在一个实施例中，重组肿瘤选择性病毒颗粒是溶瘤病毒的颗粒。
重组多肽
在一个方面，提供了一种用于将细胞外囊泡(EV)导向至少一种靶细胞的重组多肽，其包含：
-用于将所述EV导向由所述至少一种靶细胞表达的所述至少一种靶分子的至少一个靶向部分，
-至少一种EV锚定多肽，和
-至少一种囊泡内多肽。
“单特异性”单跨膜(TM)结构域构建体
在一个实施例中，所述至少一种EV锚定多肽包括连接到所述至少一个靶向部分的EV导向跨膜多肽。
在一个实施例中，所述EV导向跨膜多肽包含来自LAMP2b、VSVG、CD81、CD82或LAMP1的跨膜结构域。
在一个实施例中，所述EV导向跨膜多肽包含来自胡宁(Junin)病毒糖蛋白、拉沙热(Lassa fever)病毒糖蛋白、LCMV(淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)糖蛋白、SARS-CoV-2糖蛋白、太米阿米(Tamiami)病毒糖蛋白、瓜纳瑞托(Guanarito)病毒糖蛋白、巴拉那(Paraná)病毒糖蛋白、马丘波(Machupo)病毒糖蛋白、萨比亚(Sabia)病毒糖蛋白或CdaA的跨膜结构域。
在一个实施例中，EV导向跨膜多肽包含来自弹状病毒糖蛋白的跨膜结构域。
在一个实施例中，EV导向跨膜多肽包含来自沙粒病毒糖蛋白的跨膜结构域。
在一个实施例中，所述至少一种靶细胞包括哺乳动物细胞。
在一个实施例中，所述哺乳动物细胞是人细胞。
在一个实施例中，所述至少一种靶细胞是肿瘤细胞、肿瘤基质细胞或免疫细胞。
在一个实施例中，所述肿瘤基质细胞包括癌症相关的成纤维细胞。
在一个实施例中，所述免疫细胞是T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞。
在一个实施例中，所述免疫细胞是巨噬细胞。在一个实施例中，所述至少一种靶分子是巨噬细胞受体(MARCO)。
在一个实施例中，所述T细胞是调节性T细胞或细胞毒性T细胞。
在一个实施例中，所述至少一种靶分子是细胞表面标志物或细胞表面受体。
在一个实施例中，所述至少一种靶分子是TNF-α家族受体、整联蛋白、C型凝集素受体、瘦蛋白、癌胚抗原、CD抗原、碳酸酐酶、FAP、MMP2、DEC205、DC40、CLEC9、CD3、糖胺聚糖、多糖或脂质。
在一个实施例中，所述至少一种靶分子包括疾病特异性细胞表面分子，其是：
-由病变细胞表达而不是由健康对照细胞表达的，或
-与所述健康对照细胞相比，由所述病变细胞以更大的量表达的。
在一个实施例中，所述疾病特异性细胞表面分子包括肿瘤相关抗原。
在一个实施例中，所述至少一种靶分子包括DEC205、CLEC9A、CEACAM5、CTLA4、CD3、CD7、CD11c、CD19、CD20、CD22、CD40、CD44、CD206、EGFR、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、CA9、MMP-2、PD-L1、SIRPa、硫酸软骨素、αv-整联蛋白或叶酸受体。
在一个实施例中，所述至少一个靶向部分包括受体配体、抗体或其功能性片段、scFv、单结构域抗体或DARPin。
在一个实施例中，所述抗体是单结构域抗体。
在一个实施例中，所述抗体是人源化抗体。
在一个实施例中，所述功能性片段是Fab'或F(ab')2。
在一个实施例中，所述至少一个靶向部分包括抗DEC205、抗Clec9A、抗FAP、抗CEA、抗CA9、抗CTL4、抗CD3、抗CD206、抗CD19、抗CD20、抗CD22、抗CD44、抗CD7、SIRPα胞外域、GE11肽、CTX、VAR2Δ、CD40配体、CD40靶向肽、iRGD或PD1。
在一个实施例中，所述囊泡内多肽可包含用于突出到囊泡内空间中的短氨基酸尾部。所述囊泡内多肽可包含至少9个氨基酸。所述囊泡内多肽可包含至少10个氨基酸。所述囊泡内多肽可包含至少11个氨基酸。所述囊泡内多肽可包含至少12个氨基酸。所述囊泡内多肽可包含至少13个氨基酸。所述囊泡内多肽可包含至少14个氨基酸。所述囊泡内多肽可包含至少15个氨基酸。所述囊泡内多肽可包含至少9个氨基酸。所述囊泡内多肽可包含9至15个氨基酸。
在一个实施例中，所述囊泡内多肽包括经由所述EV锚定多肽连接到所述至少一个靶向部分的至少一种EV有效载荷多肽。EV有效载荷多肽可包括例如治疗性多肽、用于成像的多肽、用于诊断的多肽、自杀蛋白、或生物标志物的受体。
在一个实施例中，该至少一种EV有效载荷多肽包括至少一种EV治疗性有效载荷多肽。
“单特异性”四次跨膜蛋白构建体
在一个实施例中，所述EV锚定多肽和所述囊泡内多肽一起包含EV导向重组四次跨膜蛋白，该EV导向重组四次跨膜蛋白包含插入其两个跨膜结构域之间的所述至少一个靶向部分。
在一个实施例中，所述重组四次跨膜蛋白包括或衍生自人CD63或CD9。
在一个实施例中，所述至少一种靶细胞包括哺乳动物细胞。
在一个实施例中，所述哺乳动物细胞是人细胞。
在一个实施例中，所述至少一种靶细胞是肿瘤细胞、肿瘤基质细胞或免疫细胞。
在一个实施例中，所述肿瘤基质细胞包括癌症相关的成纤维细胞。
在一个实施例中，所述免疫细胞是T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞。
在一个实施例中，所述免疫细胞是巨噬细胞。在一个实施例中，所述至少一种靶分子是巨噬细胞受体(MARCO)。
在一个实施例中，所述T细胞是调节性T细胞或细胞毒性T细胞。
在一个实施例中，所述至少一种靶分子是细胞表面标志物或细胞表面受体。
在一个实施例中，所述至少一种靶分子是TNF-α家族受体、整联蛋白、C型凝集素受体、瘦蛋白、癌胚抗原、CD抗原、碳酸酐酶、FAP、MMP2、DEC205、DC40、CLEC9、CD3、糖胺聚糖、多糖或脂质。
在一个实施例中，所述至少一种靶分子包括疾病特异性细胞表面分子，其是：
-由病变细胞表达而不是由健康对照细胞表达的，或
-与所述健康对照细胞相比，由所述病变细胞以更大的量表达的。
在一个实施例中，所述疾病特异性细胞表面分子包括肿瘤相关抗原。
在一个实施例中，所述至少一种靶分子包括DEC205、CLEC9A、CEACAM5、CTLA4、CD3、CD7、CD11c、CD19、CD20、CD22、CD40、CD44、CD206、EGFR、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、CA9、MMP-2、PD-L1、SIRPa、硫酸软骨素、αv-整联蛋白或叶酸受体。
在一个实施例中，所述至少一个靶向部分包括受体配体、抗体或其功能性片段、scFv、单结构域抗体或DARPin。
在一个实施例中，所述抗体是单结构域抗体。
在一个实施例中，所述抗体是人源化抗体。
在一个实施例中，所述功能性片段是Fab'或F(ab')2。
在一个实施例中，所述至少一个靶向部分包括抗DEC205、抗Clec9A、抗FAP、抗CEA、抗CA9、抗CTL4、抗CD3、抗CD206、抗-抗CD19、抗CD20、抗CD22、抗CD44、抗CD7、SIRPα胞外域、GE11肽、CTX、VAR2Δ、CD40配体、CD40靶向肽、iRGD或PD1。
在一个实施例中，该重组多肽进一步包含连接到所述重组四次跨膜蛋白的N-末端和/或C-末端的至少一种EV有效载荷多肽。EV有效载荷多肽可包括例如治疗性多肽、用于成像的多肽、用于诊断的多肽、自杀蛋白、或生物标志物的受体。
在一个实施例中，该至少一种EV有效载荷多肽包括至少一种EV治疗性多肽。
“双特异性”四次跨膜蛋白构建体
在一个实施例中，所述至少一个靶向部分包含至少两个靶向部分，其中所述EV锚定多肽和所述囊泡内多肽一起包含EV导向重组四次跨膜蛋白，该EV导向重组四次跨膜蛋白从N-末端至C-末端包含编号为1、2、3和4的四个跨膜结构域，其中所述两个靶向部分中的第一靶向部分插入跨膜结构域1与2之间，并且所述两个靶向部分中的第二靶向部分插入跨膜结构域3与4之间。
在一个实施例中，所述EV导向重组四次跨膜蛋白衍生自人CD63或CD9。
在一个实施例中，所述至少两个靶向部分特异性结合至少两种不同的靶分子。
靶向相同的靶细胞
在一个实施例中，所述至少两种不同的靶分子由相同的靶细胞表达。
在一个实施例中，所述靶细胞包括哺乳动物细胞。
在一个实施例中，所述哺乳动物细胞包括人细胞。
在一个实施例中，所述靶细胞包括肿瘤细胞、肿瘤基质细胞或免疫细胞。
在一个实施例中，所述肿瘤基质细胞包括癌症相关的成纤维细胞。
在一个实施例中，所述免疫细胞是T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞。
在一个实施例中，所述免疫细胞是巨噬细胞。在一个实施例中，所述至少一种靶分子是巨噬细胞受体(MARCO)。
在一个实施例中，所述T细胞是调节性T细胞或细胞毒性T细胞。
在一个实施例中，所述至少两种靶分子中的每一种靶分子是细胞表面分子。
在一个实施例中，所述至少两种靶分子中的每一种靶分子是TNF-α家族受体、整联蛋白、C型凝集素受体、瘦蛋白、癌胚抗原、CD抗原、碳酸酐酶、FAP、MMP2、DEC205、DC40、CLEC9、CD3、糖胺聚糖、多糖或脂质。
在一个实施例中，所述至少两种靶分子中的每一种靶分子包括疾病特异性细胞表面分子，其是：
-由病变细胞表达而不是由健康对照细胞表达的，或
-与所述健康对照细胞相比，由所述病变细胞以更大的量表达的。
在一个实施例中，所述疾病特异性细胞表面分子包括肿瘤相关抗原。
在一个实施例中，所述至少两种靶分子中的每一种靶分子独立地包括DEC205、CLEC9A、CEACAM5、CTLA4、CD3、CD7、CD11c、CD19、CD20、CD22、CD40、CD44、CD206、EGFR、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、CA9、MMP-2、PD-L1、SIRPa、硫酸软骨素、αv-整联蛋白或叶酸受体。
在一个实施例中，所述至少两个靶向部分各自独立地包括受体配体、抗体或其功能性片段、scFv、单结构域抗体或DARPin。
在一个实施例中，所述抗体是单结构域抗体。
在一个实施例中，所述抗体是人源化抗体。
在一个实施例中，所述功能性片段是Fab'或F(ab')2。
在一个实施例中，所述至少一个靶向部分包括抗DEC205、抗Clec9A、抗FAP、抗CEA、抗CA9、抗CTL4、抗CD3、抗CD206、抗CD19、抗CD20、抗CD22、抗CD44、抗CD7、SIRPα胞外域、GE11肽、CTX、VAR2Δ、CD40配体、CD40靶向肽、iRGD或PD1。
靶向不同的靶细胞
在一个实施例中，所述至少两种不同的靶分子由不同的靶细胞表达。
在一个实施例中，所述不同的靶细胞包括病变细胞和免疫细胞，并且其中所述至少两个靶向部分分别导向病变细胞表面分子和免疫细胞表面分子。
在一个实施例中，所述不同的靶细胞包括肿瘤细胞和免疫细胞，并且其中所述至少两个靶向部分分别导向肿瘤细胞表面分子和免疫细胞表面分子。
在一个实施例中，所述免疫细胞是T细胞，并且所述免疫细胞表面标志物是T细胞表面分子。
在一个实施例中，所述T细胞是调节性T细胞或细胞毒性T细胞。
在一个实施例中，所述免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞，并且所述免疫细胞表面标志物是NK细胞表面分子。
在一个实施例中，所述免疫细胞是B细胞，并且所述免疫细胞表面标志物是B细胞表面分子。
在一个实施例中，所述免疫细胞是巨噬细胞，并且所述免疫细胞表面标志物是巨噬细胞表面分子。在一个实施例中，所述至少一种靶分子是巨噬细胞受体(MARCO)。
在一个实施例中，所述免疫细胞是树突细胞，并且所述免疫细胞表面标志物是树突细胞表面分子。
在一个实施例中，所述免疫细胞是嗜中性粒细胞，并且所述免疫细胞表面标志物是嗜中性粒细胞表面分子。
在一个实施例中，所述肿瘤细胞表面分子包括肿瘤相关抗原。
在一个实施例中，所述肿瘤细胞表面分子包括CEACAM5、CD19、CD20、CD22、EGFR、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、CA9、MMP-2、PD-L1、SIRPα、硫酸软骨素、αv-整联蛋白或叶酸受体中的一者。
在一个实施例中，所述至少一个靶向部分包括抗体或其功能性片段、scFv、单结构域抗体或DARPin。
在一个实施例中，所述抗体是单结构域抗体。
在一个实施例中，所述抗体是人源化抗体。
在一个实施例中，所述功能性片段是Fab'或F(ab')2。
在一个实施例中，重组多肽进一步包含至少一种EV有效载荷多肽。EV有效载荷多肽可包括例如治疗性多肽、用于成像的多肽、用于诊断的多肽、自杀蛋白、或生物标志物的受体。
在一个实施例中，该至少一种EV有效载荷多肽包括至少一种EV治疗性有效载荷多肽。
在一个实施例中，所述EV治疗性有效载荷多肽连接到所述重组四次跨膜蛋白的所述N-末端和/或C-末端。
有效载荷
适当地，这些有效载荷旨在用于本文所述的实施例。
在一个实施例中，所述至少一种EV有效载荷多肽经由用于释放所述至少一种EV有效载荷多肽的切割位点连接。
在一个实施例中，所述至少一种EV治疗性有效载荷多肽经由用于释放所述至少一种EV治疗性有效载荷多肽的切割位点连接。
在一个实施例中，所述切割位点包括自切割肽、pH依赖性切割位点或酶切割位点。
在一个实施例中，所述EV治疗性有效载荷多肽包括活性药物成分(API)。
在一个实施例中，所述EV治疗性有效载荷多肽包括细胞毒性分子。
在一个实施例中，所述细胞毒性分子包括人GZMB R201K、鼠GZMB、白喉毒素、来自假单胞菌外毒素A的PE38结构域、或人TRAIL。
在一个实施例中，所述有效载荷多肽包括免疫调节分子。
在一个实施例中，免疫调节分子包括产生免疫原性分子的酶。
在一个实施例中，所述免疫调节分子包括STING或ERAdP途径激活剂。
在一个实施例中，所述STING或ERAdP途径激活剂包括细菌二核苷酸环化酶。
在一个实施例中，所述细菌二核苷酸环化酶包括CdaA。
在一个实施例中，所述有效载荷多肽包括酶。
在一个实施例中，所述有效载荷多肽包含核酸结合结构域。
在一个实施例中，所述核酸结合结构域包含RNA结合基序。
在一个实施例中，核酸结合结构域包括来自Cas13家族成员蛋白的RNA结合基序。在一个实施例中，RNA结合基序包括来自Cas13a的RNA结合基序。在一个实施例中，RNA结合基序包括来自Cas13b的RNA结合基序。在一个实施例中，RNA结合基序包括来自Cas13d的RNA结合基序。
在一个实施例中，RNA结合基序包括来自Pum(Pumilio-同源结构域-1)的RNA结合基序。
在一个实施例中，RNA结合基序包括来自Stu1(Staufen-1)的RNA结合基序。
在一个实施例中，RNA结合基序包括来自甲病毒衣壳蛋白L72AE的RNA结合基序。
在一个实施例中，核酸结合包括来自MS2外壳蛋白(本文中“MS2”)的RNA结合基序。
在一个实施例中，RNA结合基序包括来自VEEV衣壳蛋白的RNA结合基序。
在一个实施例中，所述RNA结合基序包含核酸配体系统。
在一个实施例中，所述有效载荷多肽包括抗原。
在一个实施例中，所述抗原是肿瘤相关抗原。
在一个实施例中，所述抗原来自病原体。
在一个实施例中，所述EV治疗性有效载荷多肽进一步包括佐剂。
在一个实施例中，所述佐剂包括STING或ERAdP途径激活剂。
在一个实施例中，所述STING或ERAdP途径激活剂包括细菌二核苷酸环化酶。
在一个实施例中，所述细菌二核苷酸环化酶包括CdaA。
在一个实施例中，所述至少一种EV治疗性有效载荷多肽连接到至少一种另外的EV有效载荷多肽。
在一个实施例中，所述至少一种EV治疗性有效载荷多肽通过切割位点连接到所述至少一种另外的EV有效载荷多肽。
在一个实施例中，所述至少一种EV治疗性有效载荷多肽通过至少两个EV跨膜结构域与所述至少一种另外的EV有效载荷多肽分离。
核酸分子
在一个方面，提供了一种编码本文的重组多肽的核酸分子。
在一个实施例中，所述核酸进一步编码单独的EV货物分子。
在一个实施例中，所述EV货物分子包括核酸。
在一个实施例中，所述核酸包括RNA。
在一个实施例中，RNA包括来自表12中的序列的靶序列。在一个实施例中，重组多肽包括来自表12中对应于货物靶序列的序列的RNA结合基序。
在一个实施例中，所述RNA包括mRNA、miRNA或shRNA。
在一个实施例中，所述EV货物分子包括多肽。
在一个方面，提供了编码如本文所定义的重组多肽并且包含如本文所定义的EV有效载荷的核酸分子。
在一个方面，提供了编码如本文所定义的重组多肽并且包含如本文所定义的EV治疗性有效载荷的核酸分子。
在一个实施例中，所述核酸进一步编码单独的EV货物分子。
在一个实施例中，所述EV货物分子包括核酸。
在一个实施例中，所述核酸包括RNA。
在一个实施例中，所述RNA包括mRNA、miRNA或shRNA。
在一个实施例中，所述EV货物分子包括多肽。
载体
在一个方面，提供了一种包含如本文所定义的核酸的载体。
在一个方面，提供了一种包含如本文所定义的核酸的载体，其中所述重组多肽包含EV治疗性有效载荷。
重组病毒基因组
在一个方面，提供了一种包含如本文所定义的核酸的重组病毒基因组。
在一个实施例中，病毒基因组来自慢病毒、痘苗病毒的天坛株、或腺相关病毒(AAV)。
在一个实施例中，病毒基因组来自肿瘤选择性病毒。
在一个实施例中，所述病毒基因组来自溶瘤病毒。
在一个实施例中，所述溶瘤病毒是水疱性口炎病毒(VSV)、痘苗病毒、单纯疱疹病毒1(HSV-1)、疱疹病毒2(HSV-2)、腺病毒。
在一个方面，提供了一种包含如本文所定义的核酸的重组病毒基因组，其中所述重组多肽包含EV治疗性有效载荷。
在一个实施例中，病毒基因组来自肿瘤选择性病毒。
在一个实施例中，所述病毒基因组来自溶瘤病毒。
在一个实施例中，所述溶瘤病毒是水疱性口炎病毒(VSV)、痘苗病毒、单纯疱疹病毒1(HSV-1)、疱疹病毒2(HSV-2)、腺病毒。
病毒颗粒
在一个方面，提供了一种包含如本文所定义的核酸的病毒颗粒。
在一个实施例中，所述病毒颗粒是慢病毒、痘苗病毒的天坛株、或腺相关病毒(AAV)的颗粒。
在一个实施例中，所述病毒颗粒是肿瘤选择性病毒的颗粒。
在一个实施例中，所述病毒颗粒是溶瘤病毒的颗粒。
在一个实施例中，所述溶瘤病毒是水疱性口炎病毒(VSV)、痘苗病毒、单纯疱疹病毒1(HSV-1)、疱疹病毒2(HSV-2)、腺病毒。
在一个方面，提供了一种包含如本文所定义的核酸的病毒颗粒，其中所述重组多肽包含EV治疗性有效载荷。
在一个实施例中，所述病毒颗粒是肿瘤选择性病毒的颗粒。
在一个实施例中，所述病毒颗粒是溶瘤病毒的颗粒。
在一个实施例中，所述溶瘤病毒是水疱性口炎病毒(VSV)、痘苗病毒、单纯疱疹病毒1(HSV-1)、疱疹病毒2(HSV-2)、腺病毒。
宿主细胞
在一个方面，提供了一种包含如本文所定义的核酸、载体、重组病毒基因组或病毒颗粒的宿主细胞。
在一个实施例中，宿主细胞是原核细胞。
在一个实施例中，宿主细胞是真核细胞。
在一个实施例中，宿主细胞是酵母细胞或昆虫细胞。
在一个实施例中，宿主细胞是哺乳动物细胞。
在一个实施例中，宿主细胞是人细胞。
在一个实施例中，宿主细胞是免疫细胞。
在一个实施例中，宿主细胞是B细胞、T细胞、树突细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞。
在一个实施例中，宿主细胞是调节性T细胞或细胞毒性T细胞。
在一个实施例中，所述宿主细胞进一步编码单独的EV货物分子。
在一个实施例中，所述EV货物分子包括核酸。
在一个实施例中，所述核酸包括RNA。
在一个实施例中，核酸结合结构域包括来自Cas13家族成员蛋白的RNA结合基序。在一个实施例中，RNA结合基序包括来自Cas13a的RNA结合基序。在一个实施例中，RNA结合基序包括来自Cas13b的RNA结合基序。在一个实施例中，RNA结合基序包括来自Cas13d的RNA结合基序。
在一个实施例中，RNA结合基序包括来自Pum(Pumilio-同源结构域-1)的RNA结合基序。
在一个实施例中，RNA结合基序包括来自Stu1(Staufen-1)的RNA结合基序。
在一个实施例中，RNA结合基序包括来自甲病毒衣壳蛋白L72AE的RNA结合基序。
在一个实施例中，核酸结合包括来自MS2外壳蛋白(本文中“MS2”)的RNA结合基序。
在一个实施例中，RNA结合基序包括来自VEEV衣壳蛋白的RNA结合基序。
在一个实施例中，重组多肽包含上述RNA结合基序中的一者，并且EV货物包含RNA结合基序的同源RNA靶序列。RNA结合基序和同源靶序列的实例提供于表12的序列中。
在一个实施例中，所述RNA包括mRNA、miRNA或shRNA。
在一个实施例中，所述EV货物分子包括多肽。
在一个方面，提供了一种包含如本文所定义的核酸、载体、重组病毒基因组或病毒颗粒的宿主细胞，其中该重组多肽包含EV治疗性有效载荷。
在一个实施例中，宿主细胞是原核细胞。
在一个实施例中，宿主细胞是真核细胞。
在一个实施例中，宿主细胞是酵母细胞或昆虫细胞。
在一个实施例中，宿主细胞是哺乳动物细胞。
在一个实施例中，宿主细胞是人细胞。
在一个实施例中，宿主细胞是免疫细胞。
在一个实施例中，宿主细胞是B细胞、T细胞、树突细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞。
在一个实施例中，宿主细胞是调节性T细胞或细胞毒性T细胞。
在一个实施例中，所述宿主细胞进一步编码单独的EV货物分子。
在一个实施例中，所述EV货物分子包括核酸。
在一个实施例中，所述核酸包括RNA。
在一个实施例中，所述RNA包括mRNA、miRNA或shRNA。
在一个实施例中，所述EV货物分子包括多肽。
靶向细胞外囊泡(EV)
在一个方面，提供了一种包含如本文所定义的重组多肽的靶向细胞外囊泡(EV)。
在一个实施例中，靶向EV进一步包含单独的EV货物分子。
在一个实施例中，所述EV货物分子包括核酸。
在一个实施例中，所述核酸包括RNA。
在一个实施例中，RNA包括来自表12中的序列的靶序列。在一个实施例中，重组多肽包括来自表12中对应于货物靶序列的序列的RNA结合基序。
在一个实施例中，所述RNA包括mRNA、miRNA或shRNA。
在一个实施例中，所述EV货物分子包括多肽。
在一个实施例中，所述EV货物分子包括API。
在一个实施例中，靶向EVS是外泌体。
在一个实施例中，靶向EVS是微囊泡。
在一个实施例中，靶向EVS是核外颗粒体(ectosome)。
在一个实施例中，靶向EVS是凋亡小体。
在一个实施例中，靶向EVS是病毒样颗粒。
在一个实施例中，靶向EVS是大囊泡。
在一个实施例中，靶向EVS是癌小体。
在一个实施例中，靶向EVS是纳米囊泡(gesicle)。
在一个方面，提供了一种包含如本文所定义的重组多肽的靶向细胞外囊泡(EV)，其中该重组多肽包含EV治疗性有效载荷。
在一个实施例中，靶向EV进一步包含单独的EV货物分子。
在一个实施例中，所述EV货物分子包括核酸。
在一个实施例中，所述核酸包括RNA。
在一个实施例中，所述RNA包括mRNA、miRNA或shRNA。
在一个实施例中，所述EV货物分子包括多肽。
在一个实施例中，所述EV货物分子包括API。
在一个实施例中，靶向EVS是外泌体。
在一个实施例中，靶向EVS是微囊泡。
在一个实施例中，靶向EVS是核外颗粒体。
在一个实施例中，靶向EVS是凋亡小体。
药物组合物
在一个方面，提供了一种组合物，其包含如本文所定义的核酸、如本文所定义的载体、如本文所定义的重组病毒基因组、如本文所定义的病毒颗粒或如本文所定义的靶向EV；以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。
在一个方面，提供了一种组合物，其包含如本文所定义的核酸、如本文所定义的载体、如本文所定义的重组病毒基因组、如本文所定义的病毒颗粒或如本文所定义的靶向EV；以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂，其中该重组多肽包含EV治疗性有效载荷。
方法和用途
结合靶标
在一个方面，提供了一种将靶向部分结合到靶细胞的靶分子的方法，所述方法包括使所述靶细胞与如本文所定义的靶向EV接触。
在一个方面，提供了如本文所定义的靶向EV用于将靶向部分结合到靶细胞的靶分子的用途。
在一个方面，提供了如本文所定义的靶向EV，其用于将靶向部分结合到靶细胞的靶分子。
递送有效载荷
在一个方面，提供了一种将有效载荷分子递送至靶细胞的方法，所述方法包括使所述靶细胞与如本文所定义的靶向EV接触。
在一个方面，提供了如本文所定义的靶向EV用于将有效载荷分子递送至靶细胞的用途。
在一个方面，提供了如本文所定义的EV，其用于将有效载荷分子递送至靶细胞。
递送货物
在一个方面，提供了一种将货物分子递送至靶细胞的方法，所述方法包括使所述靶细胞与如本文所定义的靶向EV接触。
在一个方面，提供了如本文所定义的靶向EV用于将货物分子递送至靶细胞的用途。
在一个方面，提供了如本文所定义的靶向EV，其用于将货物分子递送至靶细胞。
刺激免疫应答
在一个方面，提供了一种刺激针对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所定义的核酸、如本文所定义的载体、如本文所定义的重组病毒基因组、如本文所定义的病毒颗粒或如本文所定义的靶向EV，其中所述靶细胞包括免疫细胞，并且其中所述至少一种EV治疗性有效载荷多肽包括抗原。
在一个实施例中，所述抗原包括病变细胞特异性抗原。
在一个实施例中，所述抗原包括肿瘤特异性抗原
在一个实施例中，所述抗原来自病原体。
在一个实施例中，所述至少一种EV治疗性有效载荷多肽进一步包括佐剂。
在一个方面，提供了如本文所定义的核酸、如本文所定义的载体、如本文所定义的重组病毒基因组、如本文所定义的病毒颗粒或如本文所定义的靶向EV用于刺激针对抗原的免疫应答的用途，其中所述靶细胞包括免疫细胞，并且其中所述至少一种EV治疗性有效载荷多肽包括抗原。
在一个实施例中，所述抗原包括病变细胞特异性抗原。
在一个实施例中，所述抗原包括肿瘤特异性抗原
在一个实施例中，所述抗原来自病原体。
在一个实施例中，所述至少一种EV治疗性有效载荷多肽进一步包括佐剂。
在一个方面中，提供了如本文所定义的核酸、如本文所定义的载体、如本文所定义的重组病毒基因组、如本文所定义的病毒颗粒或如本文所定义的靶向EV，其用于刺激针对抗原的免疫应答，其中所述靶细胞包括免疫细胞，并且其中所述至少一种EV治疗性有效载荷多肽包括抗原。
在一个实施例中，所述抗原包括病变细胞特异性抗原。
在一个实施例中，所述抗原包括肿瘤特异性抗原
在一个实施例中，所述抗原来自病原体。
在一个实施例中，所述至少一种EV治疗性有效载荷多肽进一步包括佐剂。
杀伤靶细胞
在一个方面，提供了一种杀伤靶细胞的方法，所述方法包括向受试者施用如本文所定义的核酸、如本文所定义的载体、如本文所定义的重组病毒基因组、如本文所定义的病毒颗粒或如本文所定义的靶向EV，其中所述至少一种EV治疗性有效载荷多肽包括细胞毒性分子。
在一个实施例中，所述细胞毒性分子包括人GZMB R201K、鼠GZMB、白喉毒素、来自假单胞菌外毒素A的PE38结构域、或人TRAIL。
在一个实施例中，所述靶细胞包括病变细胞。
在一个实施例中，所述病变细胞是肿瘤细胞。
在一个方面中，提供了如本文所定义的核酸、如本文所定义的载体、如本文所定义的重组病毒基因组、如本文所定义的病毒颗粒或如本文所定义的靶向EV用于杀伤靶细胞的用途，其中所述至少一种EV治疗性有效载荷多肽包括细胞毒性分子。
在一个实施例中，所述细胞毒性分子包括人GZMB R201K、鼠GZMB、白喉毒素、来自假单胞菌外毒素A的PE38结构域、或人TRAIL。
在一个实施例中，所述靶细胞包括病变细胞。
在一个实施例中，所述病变细胞是肿瘤细胞。
在一个方面，如本文所定义的核酸、如本文所定义的载体、如本文所定义的重组病毒基因组、如本文所定义的病毒颗粒或如本文所定义的靶向EV用于杀伤靶细胞，其中所述至少一种EV治疗性有效载荷多肽包括细胞毒性分子。
在一个实施例中，所述细胞毒性分子包括人GZMB R201K、鼠GZMB、白喉毒素、来自假单胞菌外毒素A的PE38结构域、或人TRAIL。
在一个实施例中，所述靶细胞包括病变细胞。
在一个实施例中，所述病变细胞是肿瘤细胞。
重编程免疫细胞
在一个方面，提供了一种重编程免疫细胞的方法，所述方法包括使这些免疫细胞与如本文所定义的核酸、如本文所定义的载体、如本文所定义的重组病毒基因组、如本文所定义的病毒颗粒或如本文所定义的靶向EV接触，其中该至少一种EV治疗性有效载荷分子包括免疫调节分子。
在一个实施例中，所述免疫调节分子包括STING或ERAdP途径激活剂。
在一个实施例中，所述STING或ERAdP途径激活剂包括细菌二核苷酸环化酶。
在一个实施例中，所述细菌二核苷酸环化酶包括CdaA。
在一个实施例中，所述免疫细胞包括B细胞、T细胞、NK细胞、树突细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞。在一个实施例中，所述免疫细胞包括巨噬细胞。
在一个实施例中，所述免疫调节分子包括STING途径激活剂，所述免疫细胞包括巨噬细胞，并且所述至少一种靶分子是巨噬细胞受体(MARCO)。
在一个方面，提供了如本文所定义的核酸、如本文所定义的载体、如本文所定义的重组病毒基因组、如本文所定义的病毒颗粒或如本文所定义的靶向EV用于重编程免疫细胞的用途，其中该至少一种EV治疗性有效载荷分子包括免疫调节分子。
在一个实施例中，所述免疫调节分子包括STING或ERAdP途径激活剂。
在一个实施例中，所述STING或ERAdP途径激活剂包括细菌二核苷酸环化酶。
在一个实施例中，所述细菌二核苷酸环化酶包括CdaA。
在一个实施例中，所述免疫细胞包括B细胞、T细胞、NK细胞、树突细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞。在一个实施例中，所述免疫细胞包括巨噬细胞。
在一个实施例中，所述免疫调节分子包括STING途径激活剂，所述免疫细胞包括巨噬细胞，并且所述至少一种靶分子是巨噬细胞受体(MARCO)。
在一个方面，提供了具有如本文所定义的核酸、如本文所定义的载体、如本文所定义的重组病毒基因组、如本文所定义的病毒颗粒或如本文所定义的靶向EV的免疫细胞，其用于重编程免疫细胞，其中所述至少一种EV治疗性有效载荷分子包括免疫调节分子。
在一个实施例中，所述免疫调节分子包括STING或ERAdP途径激活剂。
在一个实施例中，所述STING或ERAdP途径激活剂包括细菌二核苷酸环化酶。
在一个实施例中，所述细菌二核苷酸环化酶包括CdaA。
在一个实施例中，所述免疫细胞包括B细胞、T细胞、NK细胞、树突细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞。在一个实施例中，所述免疫细胞包括巨噬细胞。
在一个实施例中，所述免疫调节分子包括STING途径激活剂，所述免疫细胞包括巨噬细胞，并且所述至少一种靶分子是巨噬细胞受体(MARCO)。
将免疫应答导向靶标
在一个方面，提供了一种将免疫应答导向靶病变细胞的方法，该方法包括向受试者施用如本文所定义的核酸、如本文所定义的载体、如本文所定义的重组病毒基因组、如本文所定义的病毒颗粒或如本文所定义的靶向EV，其中所述重组多肽包含分别特异性结合至少两种不同的靶分子的至少两个靶向部分，其中所述至少两种不同的靶分子分别由免疫细胞和病变细胞表达。
在一个实施例中，所述病变细胞包括肿瘤细胞。
在一个实施例中，所述至少两种不同的靶分子中的一种靶分子包括肿瘤相关抗原。
在一个实施例中，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞。
在一个实施例中，所述免疫细胞是T细胞。
在一个实施例中，所述免疫细胞是调节性T细胞或细胞毒性T细胞。
在一个实施例中，所述免疫细胞是NK细胞。
在一个方面，提供了如本文所定义的载体、如本文所定义的重组病毒基因组、如本文所定义的病毒颗粒或如本文所定义的靶向EV用于指导针对靶病变细胞的免疫应答的用途，其中所述重组多肽包含分别特异性结合至少两种不同的靶分子的至少两个靶向部分，其中所述至少两种不同的靶分子分别由免疫细胞和病变细胞表达。
在一个实施例中，所述病变细胞包括肿瘤细胞。
在一个实施例中，所述至少两种不同的靶分子中的一种靶分子包括肿瘤相关抗原。
在一个实施例中，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞。
在一个实施例中，所述免疫细胞是T细胞。
在一个实施例中，所述免疫细胞是调节性T细胞或细胞毒性T细胞。
在一个实施例中，所述免疫细胞是NK细胞。
在一个方面，提供了如本文所定义的载体、如本文所定义的重组病毒基因组、如本文所定义的病毒颗粒或如本文所定义的靶向EV，其用于将免疫应答导向靶病变细胞，其中所述重组多肽包含分别特异性结合至少两种不同的靶分子的至少两个靶向部分，其中所述至少两种不同的靶分子分别由免疫细胞和病变细胞表达。
在一个实施例中，所述病变细胞包括肿瘤细胞。
在一个实施例中，所述至少两种不同的靶分子中的一种靶分子包括肿瘤相关抗原。
在一个实施例中，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞。
在一个实施例中，所述免疫细胞是T细胞。
在一个实施例中，所述免疫细胞是调节性T细胞或细胞毒性T细胞。
在一个实施例中，所述免疫细胞是NK细胞。
治疗性靶向EV的制备
在一个方面，提供了一种制备用于受试者的治疗性靶向EV的方法，所述方法包括：
使获自受试者的细胞与如本文所定义的核酸、如本文所定义的载体、如本文所定义的重组病毒基因组或如本文所定义的病毒颗粒接触，以及
-收集这些靶向EV。
在一个实施例中，所述细胞是肿瘤细胞。
在一个实施例中，所述细胞是免疫细胞。
在一个实施例中，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞。
在一个方面，提供了如本文所定义的核酸、如本文所定义的载体、如本文所定义的重组病毒基因组或如本文所定义的病毒颗粒用于制备用于受试者的治疗性靶向EV的用途。
在一个实施例中，所述细胞是肿瘤细胞。
在一个实施例中，所述细胞是免疫细胞。
在一个实施例中，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞。
在一个方面，提供了如本文所定义的核酸、如本文所定义的载体、如本文所定义的重组病毒基因组或如本文所定义的病毒颗粒，其用于制备用于受试者的治疗性靶向EV。
在一个实施例中，所述细胞是肿瘤细胞。
在一个实施例中，所述细胞是免疫细胞。
在一个实施例中，所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞
生产方法
在一个实施例中，提供了一种产生靶向EV的方法，其中所述方法包括在细胞中表达如本文所定义的核酸，或培养如本文所定义的宿主细胞以产生EV；以及收集这些EV。
定义和实施例
提供以下定义以便于理解本文使用的术语。
所谓“肿瘤选择性”病毒是指优先在肿瘤细胞中生长或复制的病毒。
所谓“溶瘤病毒”是指当具有活性时在体外或体内复制并杀伤肿瘤细胞的许多病毒中的任何一种。这些病毒可以是天然的溶瘤病毒，或已被修饰以产生或提高溶瘤活性的病毒。溶瘤病毒包括弹状病毒。弹状病毒包括：卡拉加斯(Carajas)病毒、金迪普拉(Chandipura)病毒、科卡(Cocal)病毒、伊斯法罕(Isfahan)病毒、皮理(Piry)病毒、水疱性口炎阿拉戈斯(Vesicular stomatitis Alagoas)病毒、BeAn 157575病毒、博特克(Boteke)病毒、卡尔查基(Calchaqui)病毒、美洲鳗病毒(Eel virus American)、格雷洛奇(GrayLodge)病毒、朱罗纳(Jurona)病毒、克拉马斯(Klamath)病毒、克瓦塔(Kwatta)病毒、拉霍亚(La Joya)病毒、马尔佩斯泉(Malpais Spring)病毒、埃尔贡山蝙蝠病毒(Mount Elgonbat)病毒、佩里内特(Perinet)病毒、图帕伊阿(Tupaia)病毒、法明顿(Farmington)病毒、大巴伊亚(Bahia Grande)病毒、Muir Springs病毒、Reed Ranch病毒、哈特公园(Hart Park)病毒、费兰杜(Flanders)病毒、凯米斯(Kamese)病毒、Mosqueiro病毒、莫苏里(Mossuril)病毒、巴鲁(Barur)病毒、福冈(Fukuoka)病毒、克恩峡谷(Kern Canyon)病毒、恩科比逊(Nkolbisson)病毒、利丹特(Le Dantec)病毒、Keuraliba病毒、Connecticut病毒、新明托(New Minto)病毒、莎草(Sawgrass)病毒、查可(Chaco)病毒、SenaMadureira病毒、蒂姆博(Timbo)病毒、阿尔姆皮瓦(Almpiwar)病毒、阿鲁卡(Aruac)病毒、班戈兰(Bangoran)病毒、卞博(Bimbo)病毒、Bivens Arm病毒、蓝蟹(Blue crab)病毒、查里维勒河(Charleville)病毒、卡森平原(Coastal Plains)病毒、DakArK 7292病毒、Entamoeba病毒、加巴(Garba)病毒、戈萨斯(Gossas)病毒、Humpty Doo病毒、约英杰卡卡(Joinjakaka)病毒、肯纳曼格拉姆(Kannamangalam)病毒、科隆各(Kolongo)病毒、库尔平耶(Koolpinyah)病毒、科通考讷(Kotonkon)病毒、兰德几亚(Landjia)病毒、马尼托巴(Manitoba)病毒、马可(Marco)病毒、Nasoule病毒、纳瓦鲁(Navarro)病毒、Ngaingan病毒、奥克韦尔(Oak-Vale)病毒、奥博第安(Obodhiang)病毒、奥衣塔(Oita)病毒、奥安戈(Ouango)病毒、帕里河(Parry Creek)病毒、里奥格兰德鲷(Rio Grande cichlid)病毒、圣德吉姆巴(Sandjimba)病毒、西格马(Sigma)病毒、斯里布尔(Sripur)病毒、斯威特沃特科(Sweetwater Branch)病毒、蒂布鲁加尔冈(Tibrogargan)病毒、西布尔玛(Xiburema)病毒、雅塔(Yata)病毒、罗得岛(Rhode Island)病毒、阿德莱德河(Adelaide River)病毒、贝里马(Berrimah)病毒、金伯利(Kimberley)病毒、马拉巴(Maraba)病毒、牛短暂热病毒、或它们的工程化变体。
“细胞外囊泡”(EV)是细胞衍生的膜结构，包括外泌体、微囊泡、病毒样颗粒、大囊泡、癌小体、纳米囊泡和凋亡小体。这些细胞外囊泡通常基于它们的大小、特异性标志物、细胞来源和生物发生过程进行分类。外泌体是在多泡体(MVB)膜与质膜融合时从细胞释放的内体来源的30-160nm囊泡。外泌体由每种细胞类型产生，并且它们的释放可由多种刺激诱导，包括应激、缺氧、细胞死亡和病毒感染。经典微泡(也称为微粒)是通过质膜脱落从细胞释放的100nm-1μm囊泡。癌细胞也可分泌称为癌小体的较大微囊泡(>1μm)，其仅在大小方面不同于经典微泡。与外泌体一样，微囊泡释放可由应激和病毒感染诱导，并且它们的内容物是异质的。凋亡小体是大的EV，其通过起泡从凋亡细胞中释放并且大小范围为200nm至5μm。这些磷脂酰丝氨酸和膜联蛋白V包被的EV含有来自垂死细胞的细胞质内容物。传统上，在100,000g下沉淀的EV被称为外泌体，但事实上，这种沉淀含有微囊泡和外泌体的组合。尽管它们的生物发生途径是不同的，但外泌体和微囊泡具有许多相似性，并且一旦从细胞释放就难以彼此区分。最近，国际细胞外囊泡学会(International Society forExtracellular Vesicles)建议术语小EV(sEV)应当用于大小小于200nm的颗粒，而术语大EV(lEV)应当用于大小大于200nm的颗粒。
术语“程序性EV”(PEV)和“靶向EV”在本文中同义地使用，是指包含如本文所定义的重组多肽并且因此具有工程化获得的对靶分子的亲和力(由靶向部分提供)的EV。
所谓“重组”意指含有不同来源的片段的核酸或多肽分子，例如(但不限于)通过重组DNA技术进行遗传工程化的产物。
所谓“EV锚定多肽”意指将重组多肽束缚于EV膜的多肽。
所谓“EV导向跨膜多肽”意指跨膜蛋白的跨越EV的整个磷脂双层膜并且天然靶向(运输至)EV膜的部分。
含有此类EV导向跨膜结构域的蛋白质可源自病毒(例如VSVG)，或源自细胞(例如CD63和lamp2b)。跨膜结构域可以是单程的或可多次通过膜，诸如四次(四程，或四次跨膜)。
单程和四次跨膜蛋白结构域可经由接头序列工程化以携带单个或多个有效载荷，并且单程结构域可类似地工程化以串联方式以携带单个或多个靶向部分。
同样，所谓“EV导向四次跨膜蛋白”意指被运输至EV膜的四次跨膜蛋白的子集。四次跨膜蛋白是在所有多细胞真核生物中发现的膜蛋白家族，也称为跨膜4超家族(TM4SF)蛋白。它们具有四个跨膜α螺旋和两个细胞外结构域、一个短的细胞外结构域或环和一个较长的细胞外结构域/环。尽管几个蛋白质家族具有四个跨膜α螺旋，但四次跨膜蛋白由保守氨基酸序列定义，该保守氨基酸序列在EC2结构域中包括四个或更多个半胱氨酸残基，其中两个半胱氨酸残基在高度保守的'CCG'基序中。
四次跨膜蛋白可被工程化以携带至多2个靶向部分，以及直接携带至多2个有效载荷，或如果连接在一起则携带更多个有效载荷。
表1提供了特异性导向EV膜并在EV膜中富集的蛋白质的一些实例。这些实例包括单程和四次跨膜蛋白结构域。
表1：包含EV导向跨膜结构域的蛋白质的实例
Figure BDA0003664152420000311
Figure BDA0003664152420000321
在重组四次跨膜蛋白的上下文中，所谓“衍生自”应理解为天然四次跨膜蛋白被修饰以包括外源序列，诸如插入一个或两个细胞外环的靶向部分和/或连接到四次跨膜蛋白的有效载荷。
所谓“靶向部分”意指能够以足够的亲和力和特异性结合靶分子以便能够将EV靶向表达靶分子的靶细胞的分子。靶向部分的非限制性实例包括抗体、其功能性片段、其工程化片段、配体(其靶向受体)、设计的锚蛋白重复蛋白(DARPin)(其结合靶蛋白)和介导特异性蛋白质-蛋白质相互作用的结构域。应当理解，在EV的上下文中，重组多肽的靶向部分旨在是外部取向的。
表2列出了一些示例性靶向部分。
表2：示例性靶向部分
Figure BDA0003664152420000331
Figure BDA0003664152420000341
Figure BDA0003664152420000351
Figure BDA0003664152420000361
Figure BDA0003664152420000371
“单结构域抗体”(sdAb)，也称为纳米抗体，是由单个单体可变抗体结构域组成的抗体片段。与完整抗体一样，它能够选择性地结合特定抗原。分子量仅为12-15kDa，单结构域抗体比由两条重链和两条轻链组成的普通抗体小得多。sdAB通过免疫单峰骆驼、美洲驼、羊驼或鲨鱼产生，或者可由具有四条链的普通IgG工程化。
所谓“功能性片段”意指保持互补位(包含互补决定区或CDR)并能够与其所衍生自的亲本抗体结合相同靶分子的抗体部分。实例包括Fab和F(ab’)2片段。
所谓“工程化片段”是指衍生自亲本抗体并保留互补位的重组多肽，因此能够结合与亲本抗体相同的靶分子。一个实例是单链可变片段(scFv)，它是免疫球蛋白的重链(VH)和轻链(VL)的可变区的融合蛋白，用通常10至约25个氨基酸的短接头肽连接。
“DARPin”是包含几个通常为33个氨基酸的重复结构域(通常4至6个重复)的重复蛋白质。可选择DARPin并将其用作特异性靶向的替代性支架，因为它们可以高亲和力和特异性结合它们的靶抗原。与单克隆抗体相比，使用DARPin的关键优点是DARPin通常具有低分子量，含有40至100个氨基酸残基。例如，HER2在乳腺癌细胞中频繁过表达。可选择与HER2的细胞外结构域结合的DARPin并将其用于将治疗性EV导向表达HER2的恶性细胞。
所谓“靶分子”意指靶向部分所结合的分子。此类分子可以是细胞表面分子，诸如例如，可被靶向部分特异性结合的多肽、脂质或多糖。
所谓“靶细胞”意指表达被靶向部分结合的靶分子，并且有效载荷(如果适用的话)和/或货物(如果适用的话)所导向的细胞。
所谓“囊泡内多肽”意指重组多肽的向EV内部延伸的多肽部分。应当理解，囊泡内多肽可包含突出到囊泡内空间中的短多肽(例如具有至少9个氨基酸)。然而，在本文所述的其他构型中，应理解囊泡内多肽可包含EV有效载荷多肽。在其他构型中，EV导向跨膜结构域和囊泡内多肽可一起包含EV导向重组四次跨膜蛋白，其可包含或可不包含可连接到N-末端和/或C-末端的至少一种EV有效载荷多肽。
“单靶向”指示EV群体靶向一个靶分子。然而，在指定“至少一个”靶的情况下，应理解这也旨在涵盖导向多于一个靶分子的EV，使得EV被最低限度地单靶化。
同样，“双特异性”意指EV靶向两个靶分子。在指定“至少两个”的情况下，应理解这也旨在涵盖靶向多于两个靶分子的EV，使得EV具有最低限度的双特异性。
所谓“细胞表面分子”意指锚定或以其他方式与细胞表面结合以允许重组多肽通过靶向部分靶向细胞的任何分子。此类分子可包括例如多肽、多糖或脂质(包括多糖和对多肽的脂质修饰)。实例包括整合膜蛋白、外周膜蛋白及其修饰。
所谓“细胞表面标志物”是特定细胞类型所特有(或富含)的细胞表面分子。细胞表面标志物或细胞表面标志物的组合对于给定的细胞类型或细胞状态(诸如疾病状态)可以是独特的。
所谓“肿瘤基质”意指肿瘤环境中除癌细胞本身以外的细胞，诸如例如癌症相关的成纤维细胞。
所谓“肿瘤相关抗原”(TAA)意指与肿瘤细胞相关的任何免疫原，并且其在健康细胞或对应的健康细胞中不存在或较不丰富(取决于应用和要求)。例如，在生物体的上下文中，肿瘤相关抗原对肿瘤细胞可以是独特的。TAA可以是例如肿瘤特异性突变、异常剪接蛋白、癌胚抗原或内源性逆转录病毒蛋白。TAA可以是包含新表位的新抗原。新抗原是先前未被免疫系统识别的新形成的(非自体)抗原，并且可由例如肿瘤突变产生。
术语“有效载荷”和“货物”在这里有差别地使用。前者是重组多肽的一部分，而后者旨在是EV中携带的单独分子。
所谓“EV有效载荷多肽”意指作为重组多肽本身的一部分并因此将由相同核酸分子共同编码的任何多肽。EV有效载荷多肽包括将期望EV负载或EV介导的靶向或递送的任何多肽。
所谓“EV治疗性有效载荷多肽”意指作为重组多肽本身的一部分并因此将由相同的核酸分子共同编码的治疗性多肽。有效载荷的类别包括(但不限于)细胞毒性分子(例如GZMB变体、白喉毒素、pe38(来自假单胞菌外毒素A的结构域)或TRAIL)、免疫重编程分子(例如STING或ERAdP途径激活剂，诸如细菌环化酶)、酶、核苷酸结合结构域和抗原(诸如肿瘤抗原或来自感染性病原体的抗原，诸如登革病毒、疟疾或轮状病毒)。非限制性实例呈现于表3中。
表3：示例性有效载荷
Figure BDA0003664152420000391
Figure BDA0003664152420000401
Figure BDA0003664152420000411
相反，所谓“EV货物”是指在EV中携带的分子，但该分子与将EV导向靶标的重组多肽分开。因此，货物可由编码重组多肽的相同或不同的核酸编码(在后者的情况下，它们将被理解为表达为单独的多肽)。设想，例如，被操纵以表达重组多肽的宿主细胞可单独编码(或被修饰以表达)货物(或反之亦然)。作为与重组多肽分开的分子，货物分子不需要是多肽。例如，货物分子可以是小分子，例如小分子药物或成像剂。货物可以是核酸，诸如mRNA、miRNA、shRNA或siRNA。例如，在有效载荷包含核酸结合结构域的实施例中，核酸可被优先负载到囊泡中。此类结合结构域可以是序列特异性的，与核酸分子内的序列基序结合。货物分子还可包括多肽，诸如细胞毒性分子、免疫重编程分子、酶或抗原。
术语“连接”指示两个部分共价连接，但此类连接不需要是直接的。例如，如果“A”和“B”是“连接的”，则应理解该连接可包含附加的氨基酸残基或多肽。同样地，“经由”特征诸如接头多肽或有效载荷连接，指示在重组多肽的上下文中该特征位于“A”与“B”之间(并分开)。然而，“A”和“B”都不需要直接附接到介入特征。
所谓“佐剂”应理解为增强对抗原的免疫应答和/或调节其朝向期望免疫应答的分子。
当本文提及核酸和氨基酸分子时，应理解也明确设想涵盖它们的序列变体的实施例。例如，此类序列变体可以是保留与它们所衍生自的亲本分子基本上相同的功能或相同的功能的多肽(或编码多肽的核酸分子)。此类序列变体可与亲本分子至少70％相同。它们可与亲本分子至少80％相同。它们可与亲本分子至少90％相同。它们可与亲本分子至少95％相同。它们可与亲本分子至少96％相同。它们可与亲本分子至少97％相同。它们可与亲本分子至少98％相同。它们可与亲本分子至少99％相同。本文设想的序列变体可包含保守氨基酸取代(或编码它们的核酸序列改变)。本文设想的序列变体可包含沉默突变。
实例
以下实施例概述了本发明的实施例和/或关于本发明进行的研究。虽然实施例是说明性的，但本发明决不限于以下例举的实施例。
实例介绍
已经尝试使用多种分子、机制和手段来对EV进行编程以携带或递送治疗剂，该多种分子、机制和手段可能是昂贵的、需要离体的和耗时的(诸如经由电穿孔)，并且其不是贮存稳定的并且缺乏验证。
因此，需要一种以简单、廉价、稳定的方式将分子递送至细胞，包括但不限于治疗剂和毒素，递送至体内的靶细胞，或者在体内、体外或离体简单且连续地制备的手段。
重组肽已被设计用于将分子靶向递送至细胞。
图1提供了本文设想的示例性构建体构型的概述：
图1，小图(a)-单个靶标-无有效载荷
图1，小图(b)-两个靶标-无有效载荷
图1，小图(c)-两个靶标-具有有效载荷
图1，小图(d)-单个靶标-具有有效载荷
图1，小图(e)-对照-无靶标、单个有效载荷
图1，小图(f)-对照-无跨膜结构域
实例1
单靶向-无有效载荷(两部分构建体)
应用：阻断或激活细胞表面受体的功能。
这些平台如何工作：它们可充当竞争性结合或阻断药物。
优点：稳定性和缺乏免疫原性。在PEV由病毒平台产生的情况下，这具有原位递送的潜力。顺便提及地，由于这些解决方案，该方法也更具成本效益。
递送/制造模式：基于病毒的平台(例如痘苗病毒、慢病毒、腺相关病毒[AAV]、VSV、HSV-1等)。质粒(例如pcDNA 3.1)和游离PEV。
实例1(a)：程序性细胞死亡蛋白1(PD1)是优先在免疫细胞诸如T、B、NK细胞和骨髓衍生的树突细胞中表达的表面蛋白。在与其配体PD-L1接合时，PD1传递免疫抑制信号。拮抗PD1的分子(单克隆抗体)：通过结合PD1和PD-L1的PD-L1相互作用已显示促进T细胞介导的肿瘤细胞杀伤。虽然这些策略在一些临床适应症中显示出积极的结果，但这些方法往往产生大量浪费的抗原，这使其未到达它们的最终目的地/用途(例如表达PD-L1的外泌体)。这些因素降低了抗PD1和抗PD-L1单克隆抗体的生物利用度并增加了毒性风险。
因此，目前设想的是以PD-L1作为靶向部分从而阻断功能的靶向PD1的PEV。靶向部 分：PD-L1(ICI的阻断应用/佐剂)。
有效载荷：无或可选。
跨膜结构域(TD结构域)：可使用表1中列出的所有实例。
实例1(b)：类似地，可使用CD3靶向部分诸如抗CD3抗体经由CD3表面蛋白来激活T细胞(T细胞激活/衔接子应用)。
有效载荷：无或可选。
跨膜结构域(TD结构域)：可使用表1中列出的所有实例。
表4：示例性构建体
Figure BDA0003664152420000441
结果：PD1靶向的数据可见于图2至图5中。
图2：溶瘤痘苗病毒(VV或VacV)可用编码PD1胞外域的“嵌合阻断构建体”编程EV。产生VV骨架以表达PEV构建体，其允许编程EV以在EV表面上展示鼠PD-1胞外域(mPD-1)。这些展示PD-1的EV可在小鼠中特异性结合在表面表达PD-L1的肿瘤细胞。
图2A：“嵌合阻断构建体”的示意图，其中mPD-1展示在PEV的细胞外表面上并充当靶向部分。mPD-1与跨膜LAMP2B结构域融合，这有助于将构建体穿梭到PEV中。值得注意的是，LAMP2b通常富含EV。这种完整的PEV构建体在嵌合转基因构建体的细胞内部分是HA标记的，这允许PEV的追踪和可视化。
图2B：将人肾细胞癌786-0细胞模拟感染或用VV-Exo-对照(该对照构建体表达LAMP2B跨膜结构域和构建体的C-末端上的HA标签，但EV靶向部分被FLAG标签替代)或用VV-Exo-PD1(小图2A中示出的PEV构建体，MOI(感染复数)为1，持续48小时)感染。感染48小时后，收获细胞并裂解用于免疫印迹分析。类似地，通过连续离心方法从培养基中分离细胞外囊泡。然后，使用针对mPD-1和HA标签的抗体进行EV级分和全细胞裂解物(WCL)的蛋白质印迹分析(以证实适当的嵌合转基因表达)。还测试了EV标志物Alix和VV抗原A27L以分别适当显示EV分离和VV感染。
图3：显示表达图2A所示构建体的PEV可使用抗PD1抗体进行分离，其中免疫印迹显示嵌合蛋白构建体整合到EV中以形成在外部具有靶向部分的PEV。与抗PD1抗体结合的分子表达Alix和浮舰蛋白(Flotillin)(EV标志物)，指示它们与EV整合。溶瘤痘苗病毒(VV)可用在其表面上展示PD1的“嵌合阻断构建体”对感染细胞衍生的EV进行编程。使用在上图2中描述的表达嵌合PEV构建体的VV平台及其对照，以1的MOI感染786个癌细胞48小时，然后分离细胞裂解物和EV。该图中的图像示出了使用抗PD1抗体对完整EV进行免疫沉淀(IP)下拉后收集的EV级分的免疫印迹。还示出了起始WCL。从模拟或感染细胞中收集EV和WCL(MOI为1，48小时)。也探测膜的EV标志物，即Alix和浮舰蛋白-1。由于交叉反应性的抗体重链的检测用作每种条件的负载对照。
注意到，用抗PD1抗体仅下拉衍生自用表达mPD-1-LAMP2B-HA标签构建体的VV感染的细胞的EV。该数据显示，该构建体不仅被表达和整合到EV中，而且EV中的PEV构建体的“拓扑或取向”也是如所预期的。
图4显示VV可用“PEV阻断构建体”编程EV以展示特异性结合其结合配偶体PD-L1的PD1。
图4A：进行竞争性结合ELISA设置以获得小图B中所示数据的示意图：SA-链霉亲和素；HRP-辣根过氧化物酶。在该实验设置中，与生物素缀合的mPD-L1蛋白结合来自Exo-PD1构建体的mPD-1，其中B14R作为对照，从而产生可定量的荧光信号；因此，缺乏mPD-1表达的样品(由于不存在Exo-PD1)不应结合mPD-L1，从而产生很少或没有荧光信号。这示出了用于获得图4B中所示数据的竞争性结合酶联免疫吸附测定(ELISA)实验的示意图。这里，将细胞裂解物在覆盖有抗mPD1抗体的孔板上洗涤。因此，展示mPD1的构建体将结合到板上。洗涤板，以便仅保留结合的构建体，然后用与生物素融合的mPD-L1(PD1的天然结合配体)温育。在该温育后，然后用2-SA-HRP(2表示这是第二抗体洗涤，第一抗体是PD1)在板上洗涤，其与生物素相互作用并产生可定量的荧光信号。因此，在细胞裂解物EV的外部展示功能性PD-1的孔板应显示出荧光，如图4b所示。
图4B：为了表明Exo-PD1嵌合体是否可结合mPD-L1，使用本文在图2中所述的表达嵌合PEV构建体的VV平台及其对照。将小鼠结直肠CT26癌细胞以10的MOI感染48小时，然后制备细胞裂解物。细胞裂解物用于如小图A所展示的适应性竞争性结合ELISA。对于这种结合ELISA，首先对每种条件下的样品进行二辛可宁酸蛋白质测定(BCA)分析以确定蛋白质浓度。基于该分析，将已知的总输入蛋白质浓度用于每种条件。对于每种病毒处理，包括附加的实验条件(阴性对照)，其中在添加到ELISA设置之前将裂解物与抗mPD-1抗体预温育2小时；这样做是为了阻断(Exo-PD1嵌合体的)mPD-1与mPD-L1之间的相互作用，以确保观察到的任何荧光都是由于这种相互作用。将每种条件相对于阴性对照的吸光度读数绘制为所示CT26细胞裂解物样品中总输入蛋白质的函数。包括附加的条件，其中细胞裂解物样品与抗mPD-1抗体预温育2小时。小图B中所示的结果表明，观察到的最大荧光信号是VV-Exo-PD1条件下的。还重要的是注意到当裂解物与抗mPD-1抗体(阴性对照)预温育时，VV-Exo-PD1条件下的荧光信号丢失；因此，证实观察到的信号是由于mPD-1结合到mPD-L1。这进一步通过观察到对于模拟感染和VV对照病毒条件(有和没有抗PD-1抗体)吸光度几乎没有或没有差异来证实。***P<0.001。该图示出了输入蛋白质浓度的荧光，表明表达PD1(不同时表达抗PD1)的痘苗病毒显示随着蛋白质浓度的增加荧光增加。
图5提供了实验时程的示意性时间线，并且数据显示表达PD-1的PEV成功地结合T细胞上的PD-L1，从而激活这些T细胞中的各种mRNA免疫标志物。
图5，小图a)：小图B示出了PEV处理后T细胞激活的qPCR分析的实验时程设置的示意图。简而言之，从小鼠脾脏中分离T细胞；然后通过抗CD3e和抗CD28抗体对细胞进行过夜激活。平行地，从模拟感染的、用VV-Exo-对照病毒感染的或用VV-Exo-PD1病毒感染的以10的MOI持续48小时的CT26细胞(在图2中描述)收集EV。每种条件下通过差速离心纯化EV，然后将其转移至激活的T细胞48小时。然后，从T细胞中提取RNA并进行qPCR分析。还包括其中没有将EV转移至激活的T细胞的附加实验条件(单独的T细胞)，以及TGF-βmRNA水平的分析-该标志物作为非靶向对照起作用，因为它不是已知被PD1:PD-L1抑制轴改变的细胞因子之一。重要的是提及在EV转移之前，将每种条件的EV归一化，使得对于每种条件使用相等的浓度。
图5，小图B：数据显示Exo-PD1 EV能够在鼠T细胞中在mRNA水平上激活各种免疫标志物。从用相同浓度的EV处理后的鼠T细胞收集的mRNA的qPCR分析。从如图中所示处理的CT26-WT细胞(模拟感染的细胞或用对照VV病毒或VV-exo-PD1感染的细胞)收集EV。本研究中使用的免疫T细胞激活标志物是：IL-2、IFN-γ、TNF-α和IL-12。包括TGF-β作为非靶标对照。*p<0.05，**p<0.01，***p<0.001。
实例2
多靶向两部分构建体-(EV-BiKe和EV-BiTe)(无有效载荷)
背景：在自然界中，主要组织相容性复合体(MHC)是T细胞识别和杀伤肿瘤细胞所需的。然而，大多数肿瘤下调(MHC)的表达以逃避免疫攻击。本领域中规避肿瘤的逃逸机制的一种现有策略是通过工程化的双特异性抗体，其将T细胞和肿瘤细胞吸引到紧密接近的位置。这些双特异性抗体也称为双特异性T细胞衔接子或BiTE。
这些BiTE能够介导T细胞以MHC非依赖性方式识别和杀伤肿瘤细胞的能力。BiTE由针对T细胞抗原CD3和特异性肿瘤相关抗原(TAA)的连接的可变链抗体片段组成。类似地，双特异性NK细胞衔接子或BiKE可介导与NK细胞上的激活受体和表面肿瘤抗原的同时结合，从而促进NK细胞依赖性的肿瘤细胞杀伤。尽管现有的BiKE和BiTE技术是有前途的，但许多目前处于临床开发中的技术具有与全身施用期间的毒性相关的问题、药物稳定性问题(短半衰期)和达到足够高的局部浓度以在大多数实体癌中有效的挑战
应用：具有两个靶向部分的PEV构建体：一个靶向部分识别T(或NK)细胞，而另一个靶向部分靶向肿瘤细胞(癌细胞或CAF)。
这些平台如何工作：这些PEV将促进T细胞与肿瘤细胞之间或NK细胞与肿瘤细胞之间的突触，从而促进这些免疫细胞类型对肿瘤细胞的定向杀伤。
优点：以PEV形式展示BiTE和BiKE比双特异性抗体构建体更稳定。
特殊特征：通常，无有效载荷的PEV构建体本身是使T细胞或NK细胞更接近癌细胞的稳定的双特异性细胞衔接子。这些PEV可在体内或离体产生。
递送模式：在患者中使用OV作为递送媒介物以在感染的癌细胞中分泌BiTE和BiKE。因此，PEV被递送到需要的确切部位，因此在皮摩尔浓度下可能是有效的，即比目前的双特异性抗体方法更低剂量的治疗。基于病毒的平台，例如：可使用痘苗病毒(缩写为VacV或VV)、慢病毒、腺相关病毒[AAV]、VSV、HSV-1等。
还设想了用于制备病毒和感染细胞以及用于制造分离的PEV的质粒(例如pcDNA3.1)。
靶向部分：如上所述的单链可变片段或纳米抗体。这些部分结合到：
-肿瘤细胞：表面肿瘤抗原靶标(例如抗CEA、抗CA9、抗FAP等)；以及以下中的任一者
-T细胞：与T细胞结合的分子(例如CD3靶标，经由抗CD3 scFV靶向部分)，或
-NK细胞：与NK细胞受体靶标结合的分子(例如抗CD16或抗NKG2D)
有效载荷：无
跨膜结构域：可使用表1中列出的所有实例。此处包括的实例是关于四次跨膜蛋白，然而单程TM蛋白可用于“多聚化技术”(详见特殊特征)。
表5：双特异性EV靶向构建体
Figure BDA0003664152420000481
结果：
图6：靶向癌细胞表面的CEA和T细胞表面的CD3的EXO-bite PEV构建体导致癌细胞死亡的增强。将HT-29细胞用ExoBiTE构建体(即，抗CEA+抗CD3-CD63构建体，其分别在癌细胞和T细胞的表面上展示识别CEACAM5和CD3的抗体，在左图中示出了显示Exo-Bite构建体及其在EV中的拓扑结构的图)转染或保持未转染。然后将细胞与或不与小鼠脾细胞(1:3比例)共温育48小时。注意，将HT-29细胞用Exo-Bite构建体转染，然后与脾细胞共培养导致增强的(～50％)细胞死亡。参见以粗体框出的小图。
图6，左小图示出了具有靶向T细胞和癌细胞的基于四次跨膜蛋白的嵌合构建体的PEV的实例的示意图。图6，右小图显示当细胞用将T细胞吸引至癌细胞的双特异性PEV转染时细胞死亡增强。
实例3
单靶向-免疫佐剂有效载荷
背景/上下文：先天免疫过程的药理学刺激代表了实现多种治疗性结果诸如抑制病毒复制、加强抗肿瘤免疫和增强疫苗免疫原性的有吸引力的策略。本文所述的平台可代表增加和延长分别由感染性疾病和癌症疫苗引起的细胞和肿瘤免疫应答的有效手段。
应用：免疫佐剂(例如STING或ERAdP激活剂，其生成刺激免疫系统的免疫原性分子)有效载荷可通过靶向特异性DC表面分子而特异性地递送至抗原呈递细胞(APC)诸如树突细胞(DC)。
这些平台如何工作：抗原呈递细胞(APC)诸如DC表现出很大程度上的不成熟或免疫耐受性表型(尚未在功能上准备接受呈递的抗原，或用于抑制免疫应答)。经由PEV向DC递送免疫佐剂(即STING或ERAdP途径激活剂，例如细菌二核苷酸环化酶诸如为c-di-AMP环化酶CdaA和MtbDisa，和为c-di-GMP环化酶VCA0848，或小鼠/人cGAS)可导致STING和/或ERAdP的激活，这增强DC抗原呈递能力，并增加T细胞共刺激分子的表达，从而加强APC活性。在一些情况下，这些平台可与疫苗方法组合使用。
优点：稳定性、更少的脱靶毒性、定制递送。
靶向部分：靶标是抗原呈递细胞表面分子，包括但不限于CD40、TNF-α家族受体、DEC-205、C型凝集素受体和CD11c、整联蛋白受体，作为靶向部分包括特异性单克隆抗体、scFv、单结构域抗体、纳米抗体(即抗DEC205、抗Clec9A、抗CD11c、抗凝集素受体)。肽和配体代表作为活性靶向剂的抗体的合适替代物(例如CD40配体或CD40靶向肽)。
有效载荷：细菌二核苷酸环化酶(即CdaA等)(注：这些有效载荷是酶，因此这些实例指示具有功能活性的酶也可通过PEV递送)。
跨膜结构域：可使用表1中列出的所有实例。到目前为止，我们的所有实例都是用VSV-G和CD63构建的。
递送/制造模式：可使用基于病毒的平台，诸如痘苗病毒、慢病毒、腺相关病毒[AAV]、VSV、HSV-1等。还设想了用于制备重组病毒和转染细胞的质粒(例如pcDNA 3.1)，以及制备和分离的PEV。
表6：激活STING或ERAdP的具有有效载荷的PEV靶向树突细胞
全称 靶向分子 有效载荷 TM结构域 活性
鼠CLEC9a靶向的VSVG-CdaA α-mCLEC9a CdaA VSVG 激活APC
鼠DEC205靶向的VSVG-CdaA α-mDEC205 CdaA VSVG 激活APC
鼠DEC205靶向的VSVG-XX α-mDEC205 XX VSVG
鼠DEC205靶向的VSVG-XX α-mDEC205 XX VSVG
鼠DEC205靶向的mCD63-CdaA α-mDEC205 CdaA CD63 激活APC
结果：
图7至图10提供了示出来自pcDNA3.1质粒和来自VV的构建体在细胞和EV中表达的蛋白质印迹。注意，HEK293T(人胚肾)细胞仅由于易于转染而被选择作为实例，并且代表任何数量的细胞类型。注意，这些图也代表充当癌症疫苗的构建体，如下所述。
图7：各种嵌合PEV构建体在细胞转染后适当表达。HEK293T细胞保持未被转染或用含有抗DEC205靶向部分和不同有效载荷[插入CD63的第二环中]的指定CD63质粒(所有构建体在其C-末端是Flag标记的)转染。在24小时收集细胞裂解物，进行免疫印迹，并探测指定抗体(抗Flag，或抗β-肌动蛋白作为负载对照)。红色椭圆示出了期望的条带。
图8：各种嵌合PEV构建体在细胞转染后适当表达。HEK293T细胞未被转染或用含有抗DEC205靶向部分和不同有效载荷[插入CD63的第一环中]的指定CD63质粒(所有构建体在其C-末端是Flag标记的)转染。在24小时收集细胞裂解物，并对指定抗体(抗Flag，或抗β-肌动蛋白作为负载对照)进行免疫印迹。红色椭圆示出了期望的条带。
图9：各种嵌合PEV构建体在细胞转染后适当表达。HEK293T细胞保持未被转染或用含有抗DEC205靶向部分VSV-G TM结构域和不同有效载荷的指定pcDNA3.1质粒(所有构建体在其C-末端是Flag标记的)转染。在24小时收集细胞裂解物，进行免疫印迹，并探测指定抗体(抗Flag，或抗β-肌动蛋白作为负载对照)。红色椭圆示出了期望的条带。
图10：各种嵌合PEV构建体在细胞转染后适当表达。HEK293T细胞保持未被转染或用含有抗DEC205或抗CLEC9A靶向部分(VSV-G)和不同有效载荷(CdaA或mCherry)的指定pcDNA3.1质粒(胞外域-阴性和Flag标记)转染。在24小时收集细胞裂解物，进行免疫印迹，并探测指定抗体(抗Flag，或抗β-肌动蛋白作为负载对照)。红色椭圆示出了期望的条带。
图11至图13示出了蛋白质免疫印迹的3个小图，其显示含有具有VSVG跨膜结构域和CdaA有效载荷(STING和/或ERAdP途径激活剂)的靶向Dec205的嵌合构建体的分离的PEV，以剂量依赖性方式成功地激活树突细胞中的STING或ERAdP(图11)，但不激活非靶标鼠成纤维细胞中的STING(图12，具有c-di-AMP和B-DNA阳性对照的L929细胞)。这种递送至DC的二核苷酸环化酶导致STING信号传导轴的激活，如TBK1的磷酸化所指示的(图13)。这些图显示STING磷酸化在DC中发生(激活)。
含有抗DEC205-VSVG-CdaA嵌合构建体的分离的PEV以剂量依赖性方式导致STING激活。STING(干扰素基因刺激物)途径有助于抗原呈递细胞(包括DC)的激活。STING激活由其磷酸化介导。在DC中，STING的激活对于IFN-β表达和IL-12产生以及对于激活标志物CD40和CD86的表面表达是重要的。cGAS-STING途径的作用在病原体检测和癌症免疫中是重要的。STING激活以及ERAdP激活似乎是将免疫细胞募集到肿瘤微环境中的必要组成组分，这对于肿瘤的免疫清除是极为重要的。STING激活也在疫苗接种期间提供佐剂功能。
此处显示的数据证明，在用指定量的从用编码指定PEV构建体的pcDNA3.1质粒转染的HEK293T细胞和对照分离的EV处理24小时后，仅用抗DEC205-VSVG-CdaA构建体修饰的EV可激活原代鼠树突细胞(图11)中的STING-TBK1-IRF3信号轴，但不激活小鼠成纤维细胞(图12)，该小鼠成纤维细胞在细胞表面不表达DEC205但能够响应经典STING激动剂c-di-AMP和B-DNA。注意，本文中STING的激活是使用识别丝氨酸365处的磷酸化STING的抗体来证明的。加载对照包括总STING和b-肌动蛋白。图13：在通过从用所示VSVG质粒转染的HEK293T细胞分离的EV处理24小时后原代小鼠DC中STING-TBK1-IRF3信号传导轴的激活。通过磷酸化的STING和TBK1激活通过使用磷酸特异性抗体的蛋白质印迹来证明。STING和TBK1的总水平也显示为负载对照。STING已被鉴定为用于检测胞质核酸，特别是衍生自病原体和病毒的dsDNA以及内源第二信使(例如环状-di-GMP和-AMP)所需的关键信号传导分子。这些事件导致通过细胞激酶(包括TBK1)激活(磷酸化)IRF3和NF-κB途径产生先天免疫应答基因。TBK1活性通过其Ser172的自磷酸化来调节。注意，在小图C中，仅携带抗DEC205-VSVG-CdaA构建体的PEV在小鼠树突细胞中不仅导致STING激活(磷酸化)，而且导致下游分子(TBK1)的磷酸化(＝激活)。
实例4
单靶向-癌症疫苗有效载荷
背景/上下文：肿瘤相关抗原和/或免疫重编程部分(例如STING或ERAdP途径激活剂)可经由PEV特异性递送至APC(诸如树突细胞)上的表面分子。该构建体将表达靶向部分以将PEV靶向DC(树突细胞)并且其可伴随地携带一个或多个有效载荷。
应用：这些平台将代表引发稳健的肿瘤抗原特异性免疫的有效手段。
这些平台如何工作：DC表现出很大程度上的不成熟或耐受表型。经由PEV(作为有效载荷或货物)的肿瘤抗原递送，连同佐剂(DC成熟刺激物诸如激动性抗CD40 mAb、聚(I:C)、胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)、脂多糖(LPS)或toll样受体7/8(TLR7/8)激动剂)的共施用或如上所述的含有STING或ERAdP途径激活剂(例如细菌二核苷酸环化酶诸如为c-di-AMP环化酶的CdaA和MtbDisa，以及为c-di-GMP环化酶的VCA0848)的PEV的靶向共递送导致增强的肿瘤相关抗原呈递能力和增加的T细胞共刺激分子表达
肿瘤相关抗原单独或与佐剂组合或与免疫重编程部分(例如STING或ERAdP途径激活剂)组合可经由PEV特异性递送至树突细胞上的表面分子
靶向部分：靶标：抗原呈递细胞表面分子，包括CD40、TNF-α家族受体、DEC205、C型凝集素受体(CLEC9)和CD11c、整联蛋白受体，通过靶向部分包括特异性单克隆抗体、scFv、单结构域抗体、纳米抗体(即抗DEC205、抗Clec9A、抗CD11c)、配体或靶向肽(例如CD40配体或CD40靶向肽)靶向。
有效载荷：特异性肿瘤相关抗原(用于小鼠肿瘤模型中的概念验证：正在研究DCT和OVA)。可使用与临床试验相关的人肿瘤相关抗原(例如HPV-E6和E7、NY-ESO-1等)。也可使用癌症特异性新抗原。
设想了特异性病变细胞抗原的伴随表达，诸如肿瘤相关/特异性抗原(例如OVA、DCT、mERKm9等)。此外，佐剂分子诸如STING或ERAdP激活剂可与疾病特异性抗原或肿瘤相关/特异性抗原伴随递送
跨膜结构域：可使用表1中列出的所有实例。到目前为止，我们的所有实例都是用VSV-G构建的。
递送/制造模式：可使用基于病毒的平台，诸如痘苗病毒、慢病毒、腺相关病毒[AAV]、VSV、HSV-1等。还设想了用于转染细胞的质粒(例如pcDNA 3.1)，以及制备的分离的PEV。
表7：具有抗原有效载荷的树突细胞靶向(癌症疫苗应用)
全称 靶向分子 有效载荷 TD结构域 活性
鼠CLEC9a靶向的VSVG-OVA α-mCLEC9a OVA VSVG 直接抗原递送
鼠DEC205靶向的VSVG-OVA α-mDEC205 OVA VSVG 直接抗原递送
鼠DEC205靶向的VSVG-DCT α-mDEC205 DCT VSVG 直接抗原递送
鼠DEC205靶向的VSVG-mERKm9 α-mDEC205 mERKm9 VSVG 直接抗原递送
结果：
图7至图9提供了示出转染后来自pcDNA3.1载体质粒的构建体在细胞和EV中的表达的蛋白质印迹。
图14：图14，小图A是示出具有基于VSVG的跨膜结构域和mCherry(对照)或OVA(癌症靶标)的靶向树突细胞的PEV(靶向部分-抗Dec205)的表达的蛋白质印迹。图14，小图B是示出转染编码该构建体的质粒后抗DEC205-VSVG-OVA的细胞表达的免疫荧光图像。这些图显示靶向DEC205并携带卵清蛋白(OVA)抗原的嵌合PEV构建体在细胞转染后适当表达。
图14，小图A：用编码抗DEC205-VSVG-OVA或抗DEC205-VSVG-mCherry对照构建体的指定pcDNA 3.1质粒转染HEK293T细胞。注意，两个构建体在N-末端都是HIS标记的。在转染后24小时收集细胞裂解物，并用针对HIS标签和负载对照GAPDH的特异性抗体进行免疫印迹。
图14，小图B：用编码抗DEC205-VSVG-OVA构建体的指定pcDNA 3.1质粒转染HEK293T细胞。注意，两个构建体在N-末端都是HIS标记的。转染后24小时将细胞固定并准备用抗HIS抗体(绿色)进行免疫荧光染色。将细胞核用DAPI(蓝色)染色。
实例5
单靶向-感染性疾病疫苗有效载荷
背景/上下文：病原体特异性抗原和/或免疫重编程部分(例如STING或ERAdP途径激活剂)可经由PEV特异性递送至树突细胞上的表面分子。该构建体将表达靶向部分以使PEV适应DC，并且其可伴随地携带多个有效载荷。
应用：这些平台将代表引发稳健的病原体特异性抗原驱动的免疫的有效手段。
这些平台如何工作：与上述相似，DC表现出很大程度上不成熟的表型。经由PEV的病原体特异性抗原递送，连同佐剂(DC成熟刺激物诸如激动性抗CD40mAb、聚(I:C)、胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)、脂多糖(LPS)或toll样受体7/8(TLR7/8)激动剂)的共施用或含有STING或ERAdP途径激活剂(例如细菌二核苷酸环化酶诸如为c-di-AMP环化酶的CdaA和MtbDisa，以及为c-di-GMP环化酶的VCA0848)的PEV的靶向共递送导致增强的病原体特异性抗原呈递能力和增加的T细胞共刺激分子表达
靶向部分：靶标包括抗原呈递细胞表面分子，包括CD40、TNF-α家族受体、DEC-205、C-型凝集素受体和CD11c、整联蛋白受体，其通过靶向部分诸如特异性单克隆抗体、scFv、单结构域抗体、纳米抗体(即抗DEC205、抗Clec9A、抗CD11c)、配体或靶向肽(例如CD40配体或CD40靶向肽)靶向。
有效载荷：病原体特异性抗原[例如登革PM和E抗原、疟疾CS30、轮状病毒VP6等)。特异性感染性疾病相关抗原与佐剂分子诸如STING或ERAdP激活剂的伴随表达可用于加强疫苗接种活性。
跨膜结构域：可使用表1中列出的所有实例。到目前为止，我们的所有实例都是用VSV-G构建的。
递送/制造模式：基于病毒的平台(例如痘苗病毒、慢病毒、腺相关病毒[AAV]、VSV等)。质粒(例如pcDNA 3.1)和游离PEV。
表8：具有抗原有效载荷的树突细胞靶向(疫苗应用)
Figure BDA0003664152420000551
结果：
图15是示出在转染编码该构建体的质粒后抗DEC205-VSVG-VP6(一种轮状病毒抗原)的细胞表达的免疫荧光图像。靶向DEC205并携带轮状病毒抗原(VP6)的嵌合PEV构建体在细胞转染后适当表达。用编码抗DEC205-VSVG-VP6构建体的指定pcDNA 3.1质粒转染HEK293T细胞。24小时后，将细胞固定并准备用抗HIS抗体(绿色)进行免疫荧光染色。将细胞核用DAPI(蓝色)染色。注意，抗DEC205-VSVG-VP6构建体在N-末端都是HIS标记的。
实例6
单靶向-免疫重编程有效载荷
背景/上下文：免疫重编程分子(例如细胞因子、miRNA)可作为有效载荷或货物经由PEV特异性递送至特定免疫细胞群体上的表面分子靶标。该构建体将表达靶向部分以使PEV适应特异性免疫细胞群体，并且其可伴随地携带多个有效载荷。
应用：这些平台代表重编程或训练(例如激活、表型改变等)免疫细胞以发挥特定功能并因此对抗炎性疾病和癌症的有效手段。此外，这些PEV可用于增加癌细胞对免疫细胞的可见性(免疫原性)(例如促进免疫原性细胞死亡)。
实例6(a)：M1/M2失衡
这些平台如何工作：免疫抑制性M2巨噬细胞将变成准备吞噬肿瘤细胞的免疫加强性M1巨噬细胞。此外，巨噬细胞的某些亚群在引起炎性疾病诸如哮喘、动脉粥样硬化、类风湿性关节炎、骨关节炎、子宫内膜异位、1型和2型糖尿病和肥胖方面是重要的。可用PEV进行巨噬细胞重编程。
靶向部分：CD206(甘露糖受体)的单链可变片段或结合肽可用于特异性靶向M2巨噬细胞(也称为促肿瘤巨噬细胞)。
有效载荷：不含货物的有效载荷，或者为特异性捕获货物的RNA结合基序的有效载荷，通过RNAi改变巨噬细胞极化以减少炎性基因表达，因为多个基因可同时下调。货物靶标可包括炎性介质，诸如细胞因子(例如，TNF-α、IL-6、IL-1β)、趋化因子(例如，CCL2、CCL3、CCL5)和参与促进炎症的转导靶标，诸如NF-κB信号级联的成员。将IκBα、siRNA靶向丝裂原激活蛋白激酶4 4(Map4k4)的miRNA盒通过减少巨噬细胞中的Tnf-αmRNA来减少全身性炎症。
实例6(b)：Treg重编程：
这些平台如何工作：已知调节性T细胞(Treg)限制效应T细胞的功能。在癌症的上下文中，Treg是抗肿瘤免疫的强效抑制剂，并且这些细胞在肿瘤微环境中的存在导致肿瘤生长。用PEV定向靶向Treg中的调节分子将导致这些细胞转化为分泌IFNg的效应细胞(抗癌细胞)。
靶向部分：导向免疫抑制性T细胞表面上的CTL4(细胞毒性T淋巴细胞相关抗原4)的单链可变片段。
有效载荷：不含货物的有效载荷，或者为特异性捕获货物的RNA结合基序的有效载荷，通过下调CARMA1和/或MALT1将免疫抑制性调节性T细胞(Treg)转化为抗癌T细胞。例如，含有针对CARMA 1和/或MALT1的shRNA的miRNA盒。T细胞激活。这些miRNA盒可以是具有或不具有对应于有效载荷RNA结合基序识别位点的RNA序列的EV导向miRNA盒。替代性地，这些miRNA盒可以是常规的非EV导向盒，其包括对应于有效载荷的RNA结合基序识别位点的RNA序列。
跨膜结构域：可使用表1中列出的所有实例。
递送/制造模式：基于病毒的平台(例如痘苗病毒、慢病毒、腺相关病毒[AAV]、VSV等)。质粒(例如pcDNA 3.1)和游离PEV。
实例6(c)：T细胞激活
这些平台如何工作：已在慢性病毒、细菌和寄生虫感染以及癌症中描述了降低的T细胞功能。靶向CD3的PEV可用于刺激免疫系统中对抗疾病的T细胞的活性。
靶向部分：T细胞激活：靶向T细胞上的CD3的单链可变片段或单结构域抗体。
有效载荷：CD3靶向构建体是无偿的-在T细胞中接合CD3可能足以激活它们并动员它们以杀伤癌细胞。抗CD3单克隆抗体(mAb)引发导致T淋巴细胞通过T细胞受体(TCR)激活的信号，该激活涉及磷脂酰肌醇途径、PKC的激活和增加细胞内钙(Cai2+)。
实例7
具有细胞毒性有效载荷的单靶向和多靶向EV-CAR样
背景/上下文：这些提供了一种功能类似靶向细胞毒性T细胞的EV(类似于CAR-T疗法，但从等式中去除了T细胞)。这使得我们的PEV能够杀伤高度免疫抑制性的免疫学上“冷”的肿瘤和MHC-I缺陷的癌症。
应用：具有细胞毒性功能的PEV，用作靶向特定肿瘤细胞类型的药物，如以下实例中所述。可设想其他细胞类型。
这些平台如何工作：图16描绘了携带细胞毒性有效载荷的单靶向EV通过基于病毒的平台所提出的作用机制。虽然这里描绘的痘苗病毒具有单靶向部分，但这可通过质粒表达(即pcDNA3.1)和游离PEV扩展到其他递送/制造模式，诸如其他病毒(慢病毒、腺相关病毒、水疱性口炎病毒等)。简而言之，工程化痘苗病毒将感染癌细胞。在受感染的细胞中，病毒基因组被转录和翻译以产生更多的病毒后代，其将被释放以感染邻近的肿瘤细胞，导致溶瘤或病毒介导的细胞死亡。同时，已被编码到病毒基因组中的转基因也将被受感染的细胞翻译。该转基因将由与跨膜接头结构域(灰色)融合的靶向部分(紫色)组成，所述跨膜接头结构域将携带细胞毒性有效载荷(绿色)。跨膜结构域，即VSVG，优先将构建体穿梭到PEV中，使得靶向结构域在PEV的细胞外表面上，而有效载荷被隔离在细胞内。然后这些PEV由受感染的细胞分泌。然后，PEV通过细胞外靶向部分与邻近癌细胞上的靶抗原结合，导致这些PEV的摄取，并将它们的细胞毒性有效载荷释放到受体细胞中，从而导致抗原阳性靶细胞的死亡。
优点：非自体的、稳定的、特异性靶向的，可通过病毒递送或储存稳定地产生。
靶向部分：单链可变片段或单结构域抗体(即，抗CD19、抗CD20、抗CD22、抗EGFR、抗FAP、抗CEA、抗CA9)或通过靶向肽[即，MMP2靶向氯毒素(CTX)、蛋白聚糖靶向VAR2Δ(VAR2Δ，也称为VAR2CSA，结合仅在胎盘中表达并且也在癌细胞上以高比例发现的不同类型的硫酸软骨素(CS))、以高亲和力靶向EGFR的GE11肽]。
有效载荷：细胞毒性有效载荷诸如鼠粒酶B(mGZMB)、人粒酶B(hGZMB R201K)(注意R201K突变赋予对内源性人粒酶B抑制剂的抗性)、白喉毒素(DT)、TRAIL(主要在肿瘤细胞中引起细胞死亡的细胞因子)和截短的假单胞菌外毒素38(PE38)。
跨膜结构域：可使用表1中列出的所有实例。
递送/制造模式：基于病毒的平台(例如痘苗病毒、慢病毒、腺相关病毒[AAV]、VSV等)。质粒(例如pcDNA 3.1)和游离PEV。
表9：示例性构建体
Figure BDA0003664152420000591
Figure BDA0003664152420000601
Figure BDA0003664152420000611
Figure BDA0003664152420000621
结果：
图17示出了具有靶向癌胚抗原(CEA)或碳酸酐酶IX(CA9)的单链可变片段(scFv)靶向部分与VSVG跨膜结构域和mGZMB有效载荷的嵌合融合构建体的示意图。紫色，通过由重链和轻链组成的单链可变片段(scFv)的构建体的靶向结构域，或单结构域抗体或纳米抗体或其他靶向形式；灰色，单程跨膜接头结构域(VSV-G)；绿色，粒酶B有效载荷。注意，靶向部分还可包含除scFv、单结构域抗体或纳米抗体之外的肽，诸如MMP2靶向的氯毒素或蛋白聚糖靶向的VAR2Δ。His和Flag起到标签的作用，用于可视化和追踪嵌合构建体的表达。
图18示出了免疫印迹，其显示在HEK 293T细胞转染、人骨肉瘤U2OS细胞的病毒感染后，以及进一步在从病毒感染的786-0人肾细胞腺癌细胞分离的小EV中，图17中描绘的构建体由pcDNA3.1质粒成功表达。用于这些实验的阴性对照是在取代嵌合构建体序列表达的eGFP。这表明在被转染和感染的细胞中，质粒和病毒分别成功表达PEV，并且它们成功地嵌入在衍生自被转染和感染的细胞的EV中。所有印迹都用抗粒酶B抗体探测。印迹显示抗CEA-VSVG-mGZMB和抗CA9-VSVG-mGZMB在以下中的表达：
最左边的印迹-用编码构建体的pcDNA3.1质粒转染的293T细胞。
中间印迹-用编码这些构建体的痘苗病毒(VACV)感染的U2OS人骨肉瘤细胞
最右边的印迹-分离自用病毒感染的786-0人肾细胞腺癌细胞的小细胞外囊泡(sEV)。
如所预期的，在被不表达任何粒酶B蛋白的VACV-eGFP感染的细胞中没有获得信号。
这些印迹显示，嵌合粒酶B融合构建体不仅由质粒表达，而且它们也成功地通过跨膜VSVG接头分选和包装在sEV中。
图19A、图19B和图19C显示被表达图17和图18的PEV的痘苗病毒进行病毒性感染的展示CEA或CA9的癌细胞具有增强的细胞死亡，这分别由靶向受体细胞上的CEA或CA9的PEV所携带的细胞毒性有效载荷介导。
图19A：编码携带细胞毒性粒酶B有效载荷的人CEA或CA9单靶向衍生PEV的痘苗病毒在已知在其表面上表达高水平CEA和CA9的人结肠癌细胞系(HT-29)中的细胞毒性。简而言之，用相应的病毒以0.1的MOI感染HT-29细胞。在感染后48小时通过Alamar BlueTM活力测定评估细胞活力(n＝4个生物学重复)。虽然eGFP对照病毒确实诱导了细胞死亡，但在该细胞系中被CEA靶向病毒和CA9靶向病毒感染后，细胞死亡的程度相当大。鉴于HT-29表达细胞表面水平的CEA和CA9抗原的事实，这是可以预期的。
图19B：hCEA-VSVG-mGZMB转染的HCT116细胞在转染后在上清液中产生PEV，但不死亡，因为它们不表达EV摄取所需的CEACAM5。相反，表达CEACAM5的转染的HT-29细胞在转染后在上清液中产生EV，但大部分(～60％)细胞死于摄取含有GZMB的EV。
图19C：MDA-MB-231和MDA-MB-231-CA9过表达细胞的细胞活力的定量，这些细胞死于摄取它们在质粒转染指定细胞系后产生的含有hCEA-VSVG-mGZMB和CA9-VSVG-mGZMB的PEV。细胞在暴露于缺乏mGZMB或用于靶向的抗体的PEV对照后不死亡。
图20显示当暴露于展示VAR2Δ并携带mGZMB的PEV时，两种癌细胞系显示出增强的细胞死亡。用表达VAR2-VSVG-mGZMB嵌合构建体的质粒转染细胞。HT-29(人结直肠癌细胞系)和BxPC3细胞(人胰腺癌细胞系)的细胞活力的定量，这些细胞死于摄取它们在质粒转染后产生的含有VAR2-VSVG-mGZMB的PEV。
图21是示出上清液转移方法的示意图(数据和结果见图6)。简而言之，在第0天接种786-0细胞，使得它们在第二天达到汇合。然后用(1)VACV-eGFP、(2)VACVαCEA-VSVG-mGZMB、或(3)VACVαCA9-VSVG-mGZMB以MOI＝0.1感染细胞。这些细胞被认为是EV的生产细胞系。然后在感染后2小时用DMEM+10％外泌体耗尽的FBS替换细胞上的培养基。然后将板在37℃+5％CO2条件下温育48小时，此时允许病毒复制并产生嵌合粒酶B构建体，随后将它们包装并分泌到EV中。48小时后，收集上清液，并在4℃下以2000×g离心20分钟以去除细胞碎片和死细胞。然后将上清液通过0.2μm过滤器以通过尺寸排阻去除痘苗病毒，使得过滤后的上清液不含病毒且仅含有EV。然后将上清液转移到受体细胞系中。
图22示出了2个PEV构建体(表达具有VSVG跨膜结构域的抗CEA-mGZMB的痘苗病毒和表达具有VSVG跨膜结构域的抗CA9-mGZMB的痘苗病毒)的如上所述的上清液转移实验的结果。对照是未感染的细胞和表达eGFP的痘苗病毒。遵循图21中描述的方法。所有PEV构建体都表达eGFP。存在三种对照(未感染、仅eGFP和抗CA9构建体)。与最左边的两组接受模拟物(未感染且仅eGFP)和CA9靶向的PEV(从左数第4组-注意MC38-CEA不表达人CA9)的对照MC38细胞相比，具有可观察到的细胞死亡的仅MC38-CEA细胞(经基因工程化以表达人CEA的小鼠结直肠癌细胞系)是接受含有hCEA-VSVG-mGZMB PEV的上清液的那些(第3组)。显示绿色通道以表明在过滤步骤期间没有感染性病毒颗粒通过(eGFP由所有载体表达)并且可观察到的结果是仅上清液转移的结果。第四组进一步表明靶向CA9的PEV没有作用，因为靶细胞(MC38-CEA)不具有在表面上表达的CA9。
图23示出了利用来自用抗CEA-VSVG-mGZMB质粒转染的786-0细胞的上清液或来自未转染的786-0细胞的上清液作为阴性对照的另一个上清液转移实验。将上清液转移到野生型(CEA阴性)或表达CEA的MC38细胞以及表达CEA的HT-29细胞上。786-0细胞用作PEV生产细胞系并用hCEA-VSVG-mGZMB质粒转染。二十四小时后，将上清液(即含有PEV)转移到表达或不表达靶抗原(在这种情况下为hCEA)的细胞系上。MC38 WT细胞是CEA阴性的，并且在接受来自未转染的786-0细胞的模拟上清液后与来自用hCEA-VSVG-mGZMB质粒转染的786-0细胞的上清液后没有显示出显著差异。作为CEA阳性细胞系的MC38-hCEA和HT-29细胞两者在接受来自用hCEA-VSVG-mGZMB转染的786-0的上清液后，与接受模拟上清液相比表现出显著的细胞死亡，表明PEV中(上清液中)的靶向部分对靶细胞的特异性。
图24示出了在靶向CEA阴性或CEA阳性细胞上的CEA的PEV中用mCherry作为有效载荷的上清液转移实验。用编码hCEA-VSVG-mCherry的质粒转染CEA阴性的293T细胞以产生hCEA-VSVG-mCherry PEV(上图)。收集这些细胞的上清液并用于处理新鲜的293T(CEA阴性，中间小图)细胞和HT-29(CEA阳性，底部小图)细胞二十四小时。CEA阳性细胞显示出显著的mCherry信号，表明PEV仅被靶细胞掺入(CEA阳性)。
图25示出了提供EV-CAR(嵌合抗原受体)平台概况的示意图，其中PEV由供体细胞产生。已制备以稳定表达EV-CAR构建体(例如通过逆转录病毒转导)的生产细胞系将产生携带期望构建体的EV。在该实例中，构建体由CD63跨膜结构域支架(四次跨膜蛋白)与对肿瘤相关抗原(TAA)(例如CD19、CD20)特异性的至少一个单链可变片段(scFv)靶向部分和细胞毒性有效载荷(例如粒酶B)组成。可分离由生产细胞系产生的PEV并施用于患者。当PEV(EV-CAR)到达肿瘤细胞时，TAA的识别产生受体介导的内吞以吞噬PEV。摄取后，PEV释放嵌合构建体/EV内容物并因此释放细胞毒性有效载荷，从而导致诱导肿瘤细胞凋亡。附图描述提供了靶向癌细胞的具体实例。
图26示出了具有四次跨膜蛋白CD63跨膜结构域的不同构建体的示意图，其中：一个构建体具有两个靶向部分和单个有效载荷，两个构建体具有一个靶向部分和单个有效载荷，其中靶向部分位于构建体中的不同位置，一个构建体具有两个靶向部分且没有有效载荷，并且对照构建体没有靶向部分单但有单个有效载荷。
图27示出了探测粒酶B的蛋白质印迹，以表明图26中描绘的由质粒表达的全长构建体的成功蛋白质表达。
图28示出了已制备并正在实验中验证的多种双特异性基于四次跨膜蛋白的嵌合构建体的示意图。这些包括6种不同的有效载荷，以及一种在构建体的另一侧具有用于第二有效载荷的弗林蛋白酶可切割位点的构建体。
实例8
单靶向和多靶向-肿瘤细胞编程有效载荷
背景/上下文：重编程部分可作为游离货物(治疗性miRNA、mRNA)或通过与RNA结合蛋白/结构域有效载荷(例如RNA结合蛋白/结构域MS2、CAS13或其他)结合，经由PEV连接到特定肿瘤(例如免疫细胞群、CAF或癌细胞)上的表面分子靶标而特异性递送。该构建体将表达靶向部分以使PEV适应期望的细胞类型，并且其可伴随地携带单个或多个有效载荷，以及/或者这些构建体可与具有对应序列的特定货物组合。
应用：这些平台代表重编程或训练(例如激活、表型改变等)肿瘤驻留细胞以发挥特定功能并因此对抗癌症的有效手段。
这些平台如何工作：例如，这些PEV可用于增加癌细胞对免疫细胞的可见性(免疫原性)(例如促进免疫原性细胞死亡)或可用于在肿瘤微环境中将T细胞原位重编程为CAR-T细胞。
特殊特征：“RNA结合有效载荷(例如MS2、CAS13)和治疗性RNA分子货物(即mRNA、lncRNA、微RNA)之间的”核酸配体系统含有由RNA结合有效载荷结合的“匹配”RNA结合基序(RNA配体结构域)。
靶向部分：以上列出的所有实例。
有效载荷：RNA结合蛋白或它们的RNA结合基序(例如Cas13、MS2外壳蛋白、Staufen-1、人Pumilio-同源结构域-1)。
跨膜结构域：可使用表1中列出的所有实例。
递送/制造模式：基于病毒的平台(例如痘苗病毒、慢病毒、腺相关病毒[AAV]、VSV等)。质粒(例如pcDNA 3.1)和游离PEV。
结果：
图29C显示含有CTX-VSVG-NanolucTM的PEV能够特异性地重编程接受细胞，使其在与荧光素(底物)的酶促反应(NanolucTM是一种酶)期间“发光”。注意，NanolucTM是一种酶，并且该数据不仅示出了NanolucTM经由PEV的靶向递送，而且示出了功能性酶的递送。
图13显示CdaA酶可经由PEV特异性地递送至DC，并且一旦在受体细胞中，该酶就具有功能活性。
实例9
货物共表达(可与各种PEV构建体组合)
背景/上下文：术语“货物”在本文中被定义为与嵌合蛋白构建体共表达但不是其一部分的分子。因此，无论构建体中是否存在有效载荷，都可包括/共表达货物。货物可以是优先针对EV的核酸或蛋白质，和/或可包括由PEV构建体中包含的特异性RNA识别有效载荷识别的特定序列的RNA。
应用：可用于可能适于将分子靶向靶细胞的任何应用，特别是如果它们不能在PEV构建体中维持活性/功能。在其他情况下，可促进EV货物分子的特异性递送。
特殊特征：RNA可具有RNA结合基序识别位点以结合RNA结合基序有效载荷，或者具有EV导向基序。蛋白质可通过本领域已知的靶向它们的特异性序列优先导向EV。
靶向部分：多种，视情况而定
有效载荷：RNA结合基序，例如其中货物具有RNA结合基序识别序列。
为了产生定制的且伴随地携带特定感兴趣的核酸分子(货物；例如微RNA和mRNA)的EV，PEV可被设计成携带含有1个或更多个RNA结合结构域(RBD)的有效载荷。RNA货物可展示由RBD识别的结合基序(也称为RNA配体结构域)，并因此特异性地相互作用并由含有RBD的PEV(“RNA核酸配体系统”系统)携带。例如，可使用在细胞RNA结合蛋白中发现的充分表征的RNA结合结构域，诸如RRM、KH、冷休克结构域(CSD)和锌指CCHC结构域。类似地，在病毒外壳或衣壳蛋白(例如MS2噬菌体外壳蛋白)或细菌RNA结合Cas蛋白(例如Cas13)中发现的RNA结合结构域可被设计为PEV构建体中的部分有效载荷，其作为携带RNA的系统或核酸配体系统发挥作用。同源RNA结合配体将包括在RNA货物分子中。
跨膜结构域：PEV可以含有根据本文件中概述的其他类别的任何跨膜结构域-货物不是目前描述的嵌合构建体的一部分
表10：示例性构建体
Figure BDA0003664152420000671
Figure BDA0003664152420000681
实例10
对照构建体
这些构建体用作多个类别的各种实验的对照。这些中的一些是独立的概念构建体验证，例如功能性有效载荷递送(mCherry或NanolucTM)或在用于单个靶标的四次跨膜蛋白跨膜结构域内放置靶向分子。
表11：概念验证PEV构建体-对照
Figure BDA0003664152420000682
Figure BDA0003664152420000691
Figure BDA0003664152420000701
结果：
图29A、图29B和图29C是概念验证，其显示靶向癌细胞表面上的MMP-2的PEV(PEV靶向部分：CTX)可递送功能性有效载荷，在这种情况下是酶NanolucTM。
图29A：HEK293T细胞未被转染或用具有或不具有氯毒素(CTX)靶向部分和报告有效载荷(NanolucTM)的指定PEV质粒(Flag标记)转染。所有构建体均含有VSVG跨膜结构域和C-末端的FLAG标签。转染后24小时收集细胞裂解物，并对指定抗体(Flag或β-肌动蛋白作为负载对照)进行免疫印迹。数据示出了期望的实验构建体(CTX-VSVG-NanolucTM)及其相应阴性对照[VSVG-NanolucTM(无靶向部分)或CTX-VSVG(无有效载荷)]的表达。
图29B：如(A)所示转染HEK293T细胞并在EV耗尽的培养基中培养。24小时和48小时后，收集上清液，并使用光度计和标准荧光素酶检测测定法测量发光水平。缩写：UT：未转染；VC：CTX-VSVG构建体；VN：VSVG-NanolucTM构建体；CVN：CTX-VSVG-NanolucTM构建体。注意，NanolucTM信号仅在衍生自用VSVG-NanolucTM和CTX-VSVG-NanolucTM构建体转染的细胞的上清液(含有EV)中检测到。
图29C：在转染后48小时从转染的HEK293T细胞收集的上清液用于处理各种人成胶质细胞瘤细胞系。在条件培养基转移8小时后，使用NanolucTM底物(荧光素酶测定)和发光计测量细胞裂解物中的发光。注意，展示CTX-VSVG-NanolucTM的EV的摄取在U87MG细胞中特别增强。该细胞系表达高水平的MMP-2(CTX结合的蛋白质)。
实例10
病毒感染增加EV分泌
已表明病毒感染(例如痘苗病毒感染)增加小EV分泌。
图30描绘了示出使用纳米颗粒追踪分析系统(
Figure BDA0003664152420000711
软件)分析由未感染(模拟)或用痘苗病毒(VacV)感染的786-0癌细胞系产生的总小EV的图。*p<0.05，**p<0.01。
图31描绘了在以1的MOI模拟感染(M)或CopWT感染(VACV)(V)后来自Vero、786-0和HT-29细胞的EV和全细胞裂解物(WCL)的感染后48小时的蛋白质印迹分析。探测膜的EV标志物(Alix、TSG101和浮舰蛋白-1)、细胞/非EV标志物(GM130、钙网蛋白、Tom20)和VacV的A27L蛋白。
实例11
作为EV导向跨膜多肽的替代性病毒糖蛋白
结果：
图32描绘了示出四种不同构建体在细胞转染后和在分离的EV级分中的表达的蛋白质印迹，其显示衍生自VSV、LCMV(淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)、拉沙(拉沙热病毒)和胡宁病毒(也称为阿根廷哺乳动物沙粒病毒)的病毒糖蛋白(G)可用作跨膜结构域以将有效载荷(Flag标签)穿梭到EV中。简而言之，用表达VSV-G、LCMV-G、拉沙病毒-G、胡宁病毒-G的pCDNA 3.1质粒或作为对照(模拟)的空载体转染HEK293 T细胞。48小时后，使用RIPA缓冲液收集细胞裂解物，并按照制造商的方案使用EXO-quick-TC试剂(系统生物科学公司(SystemBiosciences))从转染细胞的上清液中收集EV。然后，将细胞裂解物和纯化的EV进行SDS-PAGE并用抗Flag抗体进行蛋白质印迹。值得注意的是，所有糖蛋白构建体在它们的C-末端都展示Flag标签以便于检测。
图33描绘了示出构建体在细胞转染后和在分离的EV级分中的表达的蛋白质印迹，其显示衍生自SARS-CoV-2的病毒糖蛋白可用作跨膜结构域以将有效载荷穿梭到EV中。简而言之，用表达SARS-CoV-2刺突蛋白的pcDNA 3.1质粒或作为对照(模拟)的空载体转染HEK293 T细胞。48小时后，使用RIPA缓冲液收集细胞裂解物，并按照制造商的方案使用EXO-quick-TC试剂(系统生物科学公司(System Biosciences))从转染细胞的上清液中收集EV。然后，将细胞裂解物和纯化的EV进行SDS-PAGE并用抗刺突抗体进行蛋白质印迹。
图34描绘了示出四种不同构建体在细胞转染后和在分离的EV级分中的表达的蛋白质印迹，其显示衍生自太米阿米、瓜纳瑞托、巴拉那、马丘波和萨比亚病毒的病毒糖蛋白可用作跨膜结构域以将有效载荷(Flag标签)穿梭到EV中。简而言之，用表达太米阿米病毒-G、瓜纳瑞托病毒-G、巴拉那病毒-G、马丘波病毒-G、萨比亚病毒G的pcDNA 3.1质粒或作为对照(模拟)的空载体转染HEK293 T细胞。48小时后，使用RIPA缓冲液收集细胞裂解物，并按照制造商的方案使用EXO-quick-TC试剂(系统生物科学公司)从转染细胞的上清液中收集EV。然后，将细胞裂解物和纯化的EV进行SDS-PAGE并用抗HA抗体进行蛋白质印迹。值得注意的是，所有糖蛋白构建体在它们的C-末端都展示HA标签以便于检测。
实例12
货物共表达
如先前实例9中所述。
背景/上下文：无论构建体中是否存在有效载荷，都可包括/共表达货物。
应用：可用于可能适于将分子靶向靶细胞的任何应用，特别是如果它们不能在PEV构建体中维持活性/功能。在其他情况下，可促进EV货物分子向靶细胞的特异性递送。
特殊特征：货物RNA分子可具有RNA结合基序识别位点以结合RNA结合基序有效载荷，或者具有EV导向基序。蛋白质可通过本领域已知的靶向它们的特异性序列优先导向EV。
靶向部分：多种，取决于应用。
有效载荷：RNA结合基序，例如其中货物具有RNA结合基序识别序列。
为了产生定制的且伴随地携带特定感兴趣的核酸分子(货物，例如微RNA和mRNA)的EV，PEV可被设计成携带含有1个或更多个RNA结合结构域(RBD)的有效载荷。RNA货物可展示由RBD识别的结合基序(也称为RNA配体结构域)，并因此特异性地相互作用并由含有RBD的PEV(“RNA核酸配体系统”系统)携带。例如，可使用在细胞RNA结合蛋白中发现的充分表征的RNA结合结构域，诸如RRM结构域、K同源(KH)结构域、冷休克结构域(CSD)和锌指CCHC结构域。类似地，在病毒外壳或衣壳蛋白(例如MS2噬菌体外壳蛋白)或细菌RNA结合Cas蛋白(例如Cas13)中发现的RNA结合结构域可被设计为PEV构建体中的部分有效载荷，其作为携带RNA或核酸配体系统发挥作用。同源RNA结合配体将包括在RNA货物分子中。
跨膜结构域：PEV可以含有根据本文件中概述的其他类别的任何跨膜结构域-货物不是目前描述的嵌合构建体的一部分。
结果：
表12提供了图35中实验显示的与特定靶RNA序列特异性结合的氨基酸基序(RNA结合基序)。RNA序列被它们相应的RNA结合基序选择性识别并且不存在于人基因组中，如通过生物信息学分析所确定的。这些RNA结合基序可用作本发明所述的有效载荷，并如下图所示。
表12：含有RNA结合结构域的构建体和靶RNA序列
Figure BDA0003664152420000731
Figure BDA0003664152420000741
Figure BDA0003664152420000751
Figure BDA0003664152420000761
Figure BDA0003664152420000771
Figure BDA0003664152420000781
Figure BDA0003664152420000791
Figure BDA0003664152420000801
Figure BDA0003664152420000811
图35A.在用负载不同PEV构建体的EV训练的受体细胞中NanolucTM活性的定量读出。然后定量NanolucTM活性以表明含有与RNA结合基序融合的LDLRT(LDLR-靶向)-VSVG跨膜结构域(VSVGTM)的质粒可包装与NanolucTM(Nluc)融合的编码蓝色荧光蛋白(BFP)的mRNA并将其递送至细胞表面上LDLR阳性的受体细胞。简而言之，在这些实验中使用TranswellTM系统，其中用表达LDLR-VSVGTM-dCas13a+gRNA基序-BFP_NLuc或LDLR-VSVGTM-dCas13a+BFP_NLuc-3X CBD或LDLR-VSVGTM-dCas13d+gRNA基序-BFP_NLuc或LDLR-VSVGTM-dCas13d+BFP_NLuc-3X CBD或LDLR-VSVGTM-Pum+BFP_NLuc-3XPBD或LDLR-VSVGTM-Stuf+BFP_NLuc-3XSBD或LDLR-VSVGTM-SD-VEEV+BFP_NLuc-3XPS或LDLR-VSVGTM-L72AE+BFP_NLuc-3X C/D Box或LDLR-VSVGTM-MS2+BFP_NLuc-3X HAM的质粒共转染接种在TranswellTM插入物(图中描绘为供体细胞)中的HEK293 T细胞。转染后，将TranswellTM与受体细胞(铺板在TranswellTM系统的底部)一起温育24小时，然后收集TranswellTM系统的底部区室中的细胞(受体细胞)，并按照制造商建议的方案(Promega)测量受体细胞中的NanolucTM活性。
图35B.图35A中描绘的相同实验的代表性荧光显微图像。如图35A所示转染后，将TranswellTM与受体细胞(铺板在TranswellTM系统的底部)一起温育24小时，然后使用EVOS荧光显微镜对TranswellTM系统的底部和上部区室中的细胞成像，以检测BFP在转染细胞(供体)中但也在受体细胞中的表达(在图中示出为浅灰色信号，而不是实际的蓝色荧光)。值得注意的是，图35B描绘了受体细胞的明视野图像，以表明在模拟对照条件下存在细胞，但不存在BFP表达的表达。
实例13
具有细胞毒性有效载荷的单靶向
如先前实例7中所述。
应用：可用于可能适于将细胞毒性分子[例如，粒酶B(GZMB)]靶向靶细胞的任何应用，在该实例中，被靶向的细胞是表达成纤维细胞激活蛋白(FAP)的癌症相关成纤维细胞或激活的成纤维细胞、癌细胞和胰腺癌患者肿瘤样品。
结果
图36.在该图中示出了用负载抗FAP-VSVG-mGZMB的EV处理的成纤维细胞激活蛋白(FAP)阳性胰腺成纤维细胞(PanFib)、胰腺癌细胞(BxPC3)和胰腺癌患者来源的样品(P025、P032)的细胞活力。简而言之，HEK293T细胞用表达抗FAP-VSVG-mGZMB的质粒转染，或保持未转染作为模拟阴性对照。24小时后，收集来自转染细胞的上清液并通过以1000×g离心10分钟预清除细胞碎片。然后，将上清液转移到已知表达FAP的各种细胞类型中，并按照制造商的说明书使用AlamarBlue测量细胞活力。将暴露于衍生自用抗FAP-VSVG-mGZMB转染的供体细胞的上清液的细胞的活力计算为与暴露于阴性对照上清液的细胞相比活力的变化(％)。
实例14
单靶向-免疫佐剂有效载荷
如先前实例3中所述。
图37描绘了负载有抗DEC205靶向部分和CdaA有效载荷[插入CD63的第一环中]的EV(其表达示于图8中)在原代分离的树突细胞中有效激活STING途径。HEK293 T细胞用pcDNA3.1载体中的PEV构建体aDEC205-CD63D-CdaA-Flag(在图中标记为CD63 EV)转染或保持未转染，然后48小时后通过连续超速离心纯化EV并保存在-80℃直至进一步使用。将来自C57BL/6小鼠股骨和胫骨的骨髓祖细胞在含有鼠GM-CSF(派普泰克公司(PeproTech)#315-03，最终浓度为40ng/ml)的RPMI中培养6天。在第7天，将分化的DC铺板，并如所示用未转染的外泌体或CD63 EV处理24小时。此后，用STING磷酸化状态特异性抗体(细胞信号传导技术公司(Cell Signaling Technology)#72971)通过蛋白质印迹评价经处理的DC中的STING磷酸化(S365)。通过STING抗体(细胞信号传导技术公司#13647)评估总STING蛋白水平。β-肌动蛋白用作负载对照。
实例15
单靶向-免疫重编程有效载荷
如先前在实例3、4和实例6a中所述。
应用：可用于可能适于将“免疫重编程”分子靶向靶免疫细胞的任何应用。在该实例中，靶细胞是原代巨噬细胞。在该具体实例中，用负载PEV构建体的EV处理巨噬细胞，所述PEV构建体将这些EV特异性地靶向巨噬细胞(经由抗Marco靶向部分)并同时递送STING途径激活剂细菌酶CdaA。值得注意的是，在文献中已知通过在其表面上表达高水平MARCO的巨噬细胞(尤其是肿瘤相关巨噬细胞或TAM)在STING激活后被重编程(或极化)为促炎表型。
结果
图38.在该图中描绘了示出用负载如下所述的三种不同PEV构建体的EV处理的激活的原代巨噬细胞中STING的激活的蛋白质印迹。简而言之，抗MARCO-VSVGTM-CdaA或抗MARCO-SARS2TM-CdaA或抗MARCO-CdaATM-CdaA载体在HEK293 T细胞中表达。48小时后，收集上清液并通过连续超速离心分离EV。将沉淀的EV重悬于PBS中并保存在-80℃直至进一步使用。将来自C57BL/6小鼠股骨和胫骨的骨髓祖细胞在含有鼠M-CSF(派普泰克公司#315-02-最终浓度为25ng/ml)的DMEM中培养6天。在第7天，将分化的巨噬细胞铺板，并保持未不处理或用脂多糖(LPS)以5EU单位/ml预处理24小时，以诱导MARCO在这些细胞表面上的表达。此后，将预处理的巨噬细胞保持模拟处理或用各种EV制剂处理24小时。随后，用STING磷酸化状态特异性抗体(细胞信号传导技术公司#72971)通过蛋白质印迹评价经处理的巨噬细胞中的STING磷酸化(S365)。作为对照，通过STING抗体(细胞信号传导技术公司#13647)评估总STING蛋白水平。β-肌动蛋白用作负载对照。
图39.描绘了表明各种抗Marco连接的CdaA PEV构建体(即抗MARCO-VSVGTM-CdaA或抗MARCO-SARS2TM-CdaA或抗MARCO-CdaATM-CdaA载体)在刺激干扰素(IFN)信号传导途径中的效力的实验。评估在各种MARCO-CdaA融合蛋白中的细菌环化酶CdaA生成c-di-AMP-STING信号传导应答的功能效力。为此，将HEK293T细胞模拟或用如所示的各种MARCO质粒转染24小时。随后，制备含c-di-AMP的裂解物，并将其应用于THP1-Blue-ISG IRF(IFN调节因子)报告细胞(体内基因公司(InvivoGen))以刺激STING-IRF信号传导轴24小时，从而允许按照制造商的方案进行Quanti-Blue测定。
实例16
多靶向两部分构建体(EV-BiTE)
如先前实例2中所述。
背景：主要组织相容性复合体(MHC)是T细胞识别和杀伤肿瘤细胞所需的。然而，大多数肿瘤下调(MHC)的表达以逃避免疫攻击。本领域中规避肿瘤的逃逸机制的一种现有策略是通过工程化的双特异性抗体，其将T细胞和肿瘤细胞吸引到紧密接近的位置。这些双特异性抗体也称为双特异性T细胞衔接子或BiTE。
BiTE能够以MHC非依赖性方式介导T细胞识别和杀伤肿瘤细胞的能力。BiTE由针对T细胞抗原CD3和特异性肿瘤相关抗原(TAA)的连接的可变链抗体片段组成。类似地，双特异性NK细胞衔接子或BiKE可介导与NK细胞上的激活受体和表面肿瘤抗原的同时结合，从而促进NK细胞依赖性的肿瘤细胞杀伤。尽管现有的BiKE和BiTE技术是有前途的，但许多目前处于临床开发中的技术具有与全身施用期间的毒性相关的问题、药物稳定性问题(短半衰期)和达到足够高的局部浓度以在大多数实体癌中有效的挑战
应用：具有两个靶向部分的PEV构建体：一个靶向部分识别T细胞，而另一个靶向部分靶向肿瘤细胞(癌细胞或CAF)。
这些平台如何工作：这些PEV促进T细胞与肿瘤细胞之间的突触，从而促进这些免疫细胞类型对肿瘤细胞的定向杀伤。
优点：以PEV形式展示BiTE和BiKE比双特异性抗体构建体更稳定。
特殊特征：通常，无有效载荷的PEV构建体本身是使T细胞或NK细胞更接近癌细胞的稳定的双特异性细胞衔接子。这些PEV可在体内或离体产生。
递送模式：在患者中使用肿瘤选择性病毒作为递送媒介物以在感染的癌细胞中分泌BiTE和BiKE。因此，PEV被递送到需要的确切部位，因此在皮摩尔浓度下可能是有效的，即比目前的双特异性抗体方法更低剂量的治疗。基于病毒的平台，例如：可使用痘苗病毒、慢病毒、腺相关病毒[AAV]、VSV、HSV-1等。
还设想了用于制备病毒和感染细胞以及用于制造分离的PEV的质粒(例如pcDNA3.1)。
靶向部分：如上所述的单链可变片段或纳米抗体。这些部分结合到：通过表面肿瘤抗原靶标(例如抗CEA，抗CA9，抗FAP等)的肿瘤细胞和通过经由抗CD3 scFV靶向部分结合到T细胞的分子(例如CD3靶标)的T细胞。
有效载荷：无
跨膜结构域：可使用表1中列出的所有实例。此处包括的实例是关于四次跨膜蛋白，然而单程TM蛋白可用于“多聚化技术”(详见特殊特征)。
结果
图40示出了在原初EV或用αCD3-VSVG、αCD3-αFAP-CD63或αCD3-αCEA-CD63修饰的EV的存在下与鼠脾细胞共培养的MC38(WT和CEA表达)细胞(脾细胞:MC38的比例为10:1)中的细胞活力。与原初EV相比，EV上的Exo-BiTE构建体增加脾细胞的细胞杀伤。简而言之，编码αCD3-VSVG、αCD3-αFAP-CD63或αCD3-αCEA-CD63的载体在HEK293 T细胞中表达。48小时后，收集上清液并通过连续超速离心分离EV。将沉淀的EV重悬于PBS中并保存在-80℃直至进一步使用。从匀浆的小鼠脾脏收集脾细胞并新鲜使用。
实例17
单靶向-癌症疫苗有效载荷
如先前在实例3和4中所述。
背景/上下文：肿瘤相关抗原和/或免疫重编程部分(例如STING或ERAdP途径激活剂)可经由PEV特异性递送至APC(诸如树突细胞)上的表面分子。该构建体将表达靶向部分以将PEV靶向DC(树突细胞)并且其可伴随地携带一个或多个有效载荷。
应用：这些平台将代表引发稳健的肿瘤抗原特异性免疫的有效手段。
这些平台如何工作：DC表现出很大程度上的不成熟或耐受表型。经由PEV(作为有效载荷或货物)的肿瘤抗原递送，连同佐剂(DC成熟刺激物诸如激动性抗CD40 mAb、聚(I:C)、胞嘧啶-磷酸-鸟嘌呤(CpG)、脂多糖(LPS)或toll样受体7/8(TLR7/8)激动剂)的共施用或如上所述的含有STING或ERAdP途径激活剂(例如细菌二核苷酸环化酶诸如为c-di-AMP环化酶的CdaA和MtbDisa，以及为c-di-GMP环化酶的VCA0848)的PEV的靶向共递送导致增强的肿瘤相关抗原呈递能力和增加的T细胞共刺激分子表达
肿瘤相关抗原单独或与佐剂组合或与免疫重编程部分(例如STING或ERAdP途径激活剂)组合可经由PEV特异性递送至树突细胞上的表面分子。
靶向部分：靶标：抗原呈递细胞表面分子，包括CD40、TNF-α家族受体、DEC205、C型凝集素受体(CLEC9)和CD11c、整联蛋白受体，通过靶向部分包括特异性单克隆抗体、scFv、单结构域抗体、纳米抗体(即抗DEC205、抗Clec9A、抗CD11c)、配体或靶向肽(例如CD40配体或CD40靶向肽)靶向。
有效载荷：特异性肿瘤相关抗原(用于小鼠肿瘤模型中的概念验证：正在研究DCT和OVA)。可使用与临床试验相关的人肿瘤相关抗原(例如HPV-E6和E7、NY-ESO-1等)。也可使用癌症特异性新抗原。
设想了特异性病变细胞抗原的伴随表达，诸如肿瘤相关/特异性抗原(例如OVA、DCT、mERKm9等)。此外，佐剂分子诸如STING或ERAdP激活剂可与疾病特异性抗原或肿瘤相关/特异性抗原伴随递送
跨膜结构域：可使用表1中列出的所有实例。
递送/制造模式：可使用基于病毒的平台，诸如痘苗病毒、慢病毒、腺相关病毒[AAV]、VSV、HSV-1等。还设想了用于转染细胞的质粒(例如pcDNA3.1)，以及制备的分离的PEV。
结果
图41.用原初EV或用aDEC205-VSVGTM-OVA(在图中命名为“OVA”)或aDEC205-CD63D-CdaA-Flag和aDEC205-VSVGTM-OVA两者(在图中称为OVA+环化酶)(还注意到先前在图8、图14和图38中示出了这些构建体)修饰的EV进行疫苗接种实验显示，树突细胞靶向抗原[例如卵清蛋白(OVA)]和免疫佐剂(例如CdaA酶)两者的组合在体内诱导免疫应答。简而言之，编码aDEC205-CD63D-CdaA-Flag和/或抗DEC205-VSVGTM-OVA的载体在HEK293 T细胞中表达。包括空载体转染作为阴性模拟EV对照。48小时后，收集上清液并通过连续超速离心分离EV，重悬于750ul PBS中并保存在-80℃直至进一步使用。然后用200ul每种EV制剂/小鼠IV(原初n＝5，仅OVA n＝3，OVA+环化酶n＝3)疫苗接种小鼠。十四天后，收获脾细胞，并用SIINFEKL四聚体染色。数据显示为四聚体+CD8+T细胞相对于在原初小鼠中观察到的背景染色占总CD8+T细胞的百分比。
实例18
单靶向-免疫佐剂有效载荷
如先前实例3中所述。
在这种常见的土壤细菌中，硫还原地杆菌(Geobactersulfurreducens)[GsPCA]的“响应受体调节的二鸟苷酸环化酶”产生环状AMP-GMP(3’,3’-cGAMP)。缺失REC(信号接收/二聚化)调节结构域并且表达二鸟苷酸环化酶(DGC)或GGDEF结构域，从而产生独特的组成型活性形式。当这种活性形式在通过抗DEC205 scFV靶向树突细胞的PEV构建体中表达并通过VSVG跨膜结构域负载到EV中时，观察到干扰素应答的功能性激活。
图42.该图示出了可通过刺激报告细胞系中的干扰素应答而充当免疫佐剂的树突细胞导向的PEV构建体。使用Quanti-Blue比色测定对哺乳动物细胞THP1-Blue-ISG系统中野生型和各种突变的c-di-GMP和c-di-AMP细菌环化酶进行功能表征。将如下详述的各种密码子优化的转基因构建体在HEK 293T细胞中转染48小时。收集细胞裂解物并转移至IFN-β启动子-SEAP报告细胞[THP1-Blue-ISG IRF(IFN调节因子)报告细胞(体内基因公司)]以刺激STING-IRF信号传导轴24小时，以允许按照制造商的方案进行Quanti-Blue测定。在图42中，GsPCA：抗DEC205-VSVGTM-GsPCA-FLAG-pcDNA3.1(+)质粒。阳性对照包括(1)CdaA：CD63_抗DEC205_CD63_CdaA_FLAG-pcDNA3.1(+)质粒和(2)c-di-AMP：10μg/ml。阴性对照包括模拟转染的细胞。
当在本文中命名特征时，应当理解，特征的对应示例性序列(或包含的序列)可在表13中找到。
表13：主序列表
Figure BDA0003664152420000881
Figure BDA0003664152420000891
Figure BDA0003664152420000901
Figure BDA0003664152420000911
Figure BDA0003664152420000921
Figure BDA0003664152420000931
Figure BDA0003664152420000941
Figure BDA0003664152420000951
Figure BDA0003664152420000961
Figure BDA0003664152420000971
Figure BDA0003664152420000981
Figure BDA0003664152420000991
Figure BDA0003664152420001001
Figure BDA0003664152420001011
Figure BDA0003664152420001021
Figure BDA0003664152420001031
Figure BDA0003664152420001041
Figure BDA0003664152420001051
Figure BDA0003664152420001061
Figure BDA0003664152420001071
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Figure BDA0003664152420001091
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Figure BDA0003664152420001111
Figure BDA0003664152420001121
Figure BDA0003664152420001131
Figure BDA0003664152420001141
Figure BDA0003664152420001151
Figure BDA0003664152420001161
Figure BDA0003664152420001171
Figure BDA0003664152420001181
Figure BDA0003664152420001191
Figure BDA0003664152420001201
Figure BDA0003664152420001211
Figure BDA0003664152420001221
Figure BDA0003664152420001231
应当理解，在一些实施例中涵盖功能性变体。功能性变体可包含与表13中列出的示例性序列至少80％相同的序列，其中所述变体保留与它们所衍生自的亲本分子基本上相同的功能。功能性变体可与相应的亲本分子至少90％相同。功能性变体可与相应的亲本分子至少95％相同。功能性变体可与相应的亲本分子至少96％相同。功能性变体可与相应的亲本分子至少97％相同。功能性变体可与相应的亲本分子至少98％相同。功能性变体可与相应的亲本分子至少99％相同。同样，某些实施例涵盖保留与它们所衍生自的全长亲本分子基本上相同的功能的功能性片段。
在前述说明中，为了解释的目的，阐述了许多细节以便提供对实施例的透彻理解。然而，对于本领域技术人员将显而易见的是，这些具体细节不是必需的。
上述实施例仅旨在为示例性的。本领域技术人员可对特定实施例进行改变、修改和变化。权利要求书的范围不应受本文阐述的特定实施例限制，而应以与说明书整体一致的方式来解释。
本文提及的所有参考文献通过援引以其全文并入。
参考文献
Stickney,Z.,Losacco,J.,McDevitt,S.,Zhang,Z.,and Lu,B.(2016)Development of exosome surface display technology in living humancells.BiochemBiophys Res Commun.472(1):53-9.
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U.S.Patent No.10,617,768.
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U.S.Patent Application No.16/900,383.
序列表
<110> 麦克马斯特大学（MCMASTER UNIVERSITY）
渥太华医院研究所（OTTAWA HOSPITAL RESEARCH INSTITUTE）
<120> 用于编程细胞外囊泡的重组多肽
<130> PAT 106151W-90
<150> US 62/941,768
<151> 2019-11-28
<160> 108
<170> PatentIn 3.5版
<210> 1
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LAMP2B TM结构域
<400> 1
Leu Val Pro Ile Ala Val Gly Ala Ala Leu Ala Gly Val Leu Ile Leu
1 5 10 15
Val Leu Leu Ala Tyr Phe Ile Gly
20
<210> 2
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VSV-G TM结构域
<400> 2
Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu Val Leu Arg
1 5 10 15
Val Gly Ile His Leu
20
<210> 3
<211> 70
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 含VSV-G TM结构域的截短
<400> 3
Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys Asn Pro Ile Glu Leu Val Glu Gly Trp
1 5 10 15
Phe Ser Ser Trp Lys Ser Ser Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly
20 25 30
Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu Val Leu Arg Val Gly Ile His Leu Cys
35 40 45
Ile Lys Leu Lys His Thr Lys Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp Ile Glu
50 55 60
Met Asn Arg Leu Gly Lys
65 70
<210> 4
<211> 23
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LAMP1 TM结构域
<400> 4
Leu Ile Pro Ile Ala Val Gly Gly Ala Leu Ala Gly Leu Val Leu Ile
1 5 10 15
Val Leu Ile Ala Tyr Leu Val
20
<210> 5
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 胡宁病毒糖蛋白TM结构域
<400> 5
Ile Cys Phe Trp Ser Thr Val Phe Phe Thr Ala Ser Leu Phe Leu His
1 5 10 15
Leu Val Gly Ile Pro
20
<210> 6
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 拉沙热病毒糖蛋白
<400> 6
Leu Leu Met Phe Ser Thr Ser Ala Tyr Leu Val Ser Ile Phe Leu His
1 5 10 15
Leu Val Lys Ile Pro
20
<210> 7
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> LCMV糖蛋白TM结构域
<400> 7
Leu Leu Met Phe Ser Thr Ser Ala Tyr Leu Val Ser Ile Phe Leu His
1 5 10 15
Leu Val Lys Ile Pro
20
<210> 8
<211> 1273
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2糖蛋白
<400> 8
Met Phe Val Phe Leu Val Leu Leu Pro Leu Val Ser Ser Gln Cys Val
1 5 10 15
Asn Leu Thr Thr Arg Thr Gln Leu Pro Pro Ala Tyr Thr Asn Ser Phe
20 25 30
Thr Arg Gly Val Tyr Tyr Pro Asp Lys Val Phe Arg Ser Ser Val Leu
35 40 45
His Ser Thr Gln Asp Leu Phe Leu Pro Phe Phe Ser Asn Val Thr Trp
50 55 60
Phe His Ala Ile His Val Ser Gly Thr Asn Gly Thr Lys Arg Phe Asp
65 70 75 80
Asn Pro Val Leu Pro Phe Asn Asp Gly Val Tyr Phe Ala Ser Thr Glu
85 90 95
Lys Ser Asn Ile Ile Arg Gly Trp Ile Phe Gly Thr Thr Leu Asp Ser
100 105 110
Lys Thr Gln Ser Leu Leu Ile Val Asn Asn Ala Thr Asn Val Val Ile
115 120 125
Lys Val Cys Glu Phe Gln Phe Cys Asn Asp Pro Phe Leu Gly Val Tyr
130 135 140
Tyr His Lys Asn Asn Lys Ser Trp Met Glu Ser Glu Phe Arg Val Tyr
145 150 155 160
Ser Ser Ala Asn Asn Cys Thr Phe Glu Tyr Val Ser Gln Pro Phe Leu
165 170 175
Met Asp Leu Glu Gly Lys Gln Gly Asn Phe Lys Asn Leu Arg Glu Phe
180 185 190
Val Phe Lys Asn Ile Asp Gly Tyr Phe Lys Ile Tyr Ser Lys His Thr
195 200 205
Pro Ile Asn Leu Val Arg Asp Leu Pro Gln Gly Phe Ser Ala Leu Glu
210 215 220
Pro Leu Val Asp Leu Pro Ile Gly Ile Asn Ile Thr Arg Phe Gln Thr
225 230 235 240
Leu Leu Ala Leu His Arg Ser Tyr Leu Thr Pro Gly Asp Ser Ser Ser
245 250 255
Gly Trp Thr Ala Gly Ala Ala Ala Tyr Tyr Val Gly Tyr Leu Gln Pro
260 265 270
Arg Thr Phe Leu Leu Lys Tyr Asn Glu Asn Gly Thr Ile Thr Asp Ala
275 280 285
Val Asp Cys Ala Leu Asp Pro Leu Ser Glu Thr Lys Cys Thr Leu Lys
290 295 300
Ser Phe Thr Val Glu Lys Gly Ile Tyr Gln Thr Ser Asn Phe Arg Val
305 310 315 320
Gln Pro Thr Glu Ser Ile Val Arg Phe Pro Asn Ile Thr Asn Leu Cys
325 330 335
Pro Phe Gly Glu Val Phe Asn Ala Thr Arg Phe Ala Ser Val Tyr Ala
340 345 350
Trp Asn Arg Lys Arg Ile Ser Asn Cys Val Ala Asp Tyr Ser Val Leu
355 360 365
Tyr Asn Ser Ala Ser Phe Ser Thr Phe Lys Cys Tyr Gly Val Ser Pro
370 375 380
Thr Lys Leu Asn Asp Leu Cys Phe Thr Asn Val Tyr Ala Asp Ser Phe
385 390 395 400
Val Ile Arg Gly Asp Glu Val Arg Gln Ile Ala Pro Gly Gln Thr Gly
405 410 415
Lys Ile Ala Asp Tyr Asn Tyr Lys Leu Pro Asp Asp Phe Thr Gly Cys
420 425 430
Val Ile Ala Trp Asn Ser Asn Asn Leu Asp Ser Lys Val Gly Gly Asn
435 440 445
Tyr Asn Tyr Leu Tyr Arg Leu Phe Arg Lys Ser Asn Leu Lys Pro Phe
450 455 460
Glu Arg Asp Ile Ser Thr Glu Ile Tyr Gln Ala Gly Ser Thr Pro Cys
465 470 475 480
Asn Gly Val Glu Gly Phe Asn Cys Tyr Phe Pro Leu Gln Ser Tyr Gly
485 490 495
Phe Gln Pro Thr Asn Gly Val Gly Tyr Gln Pro Tyr Arg Val Val Val
500 505 510
Leu Ser Phe Glu Leu Leu His Ala Pro Ala Thr Val Cys Gly Pro Lys
515 520 525
Lys Ser Thr Asn Leu Val Lys Asn Lys Cys Val Asn Phe Asn Phe Asn
530 535 540
Gly Leu Thr Gly Thr Gly Val Leu Thr Glu Ser Asn Lys Lys Phe Leu
545 550 555 560
Pro Phe Gln Gln Phe Gly Arg Asp Ile Ala Asp Thr Thr Asp Ala Val
565 570 575
Arg Asp Pro Gln Thr Leu Glu Ile Leu Asp Ile Thr Pro Cys Ser Phe
580 585 590
Gly Gly Val Ser Val Ile Thr Pro Gly Thr Asn Thr Ser Asn Gln Val
595 600 605
Ala Val Leu Tyr Gln Asp Val Asn Cys Thr Glu Val Pro Val Ala Ile
610 615 620
His Ala Asp Gln Leu Thr Pro Thr Trp Arg Val Tyr Ser Thr Gly Ser
625 630 635 640
Asn Val Phe Gln Thr Arg Ala Gly Cys Leu Ile Gly Ala Glu His Val
645 650 655
Asn Asn Ser Tyr Glu Cys Asp Ile Pro Ile Gly Ala Gly Ile Cys Ala
660 665 670
Ser Tyr Gln Thr Gln Thr Asn Ser Pro Arg Arg Ala Arg Ser Val Ala
675 680 685
Ser Gln Ser Ile Ile Ala Tyr Thr Met Ser Leu Gly Ala Glu Asn Ser
690 695 700
Val Ala Tyr Ser Asn Asn Ser Ile Ala Ile Pro Thr Asn Phe Thr Ile
705 710 715 720
Ser Val Thr Thr Glu Ile Leu Pro Val Ser Met Thr Lys Thr Ser Val
725 730 735
Asp Cys Thr Met Tyr Ile Cys Gly Asp Ser Thr Glu Cys Ser Asn Leu
740 745 750
Leu Leu Gln Tyr Gly Ser Phe Cys Thr Gln Leu Asn Arg Ala Leu Thr
755 760 765
Gly Ile Ala Val Glu Gln Asp Lys Asn Thr Gln Glu Val Phe Ala Gln
770 775 780
Val Lys Gln Ile Tyr Lys Thr Pro Pro Ile Lys Asp Phe Gly Gly Phe
785 790 795 800
Asn Phe Ser Gln Ile Leu Pro Asp Pro Ser Lys Pro Ser Lys Arg Ser
805 810 815
Phe Ile Glu Asp Leu Leu Phe Asn Lys Val Thr Leu Ala Asp Ala Gly
820 825 830
Phe Ile Lys Gln Tyr Gly Asp Cys Leu Gly Asp Ile Ala Ala Arg Asp
835 840 845
Leu Ile Cys Ala Gln Lys Phe Asn Gly Leu Thr Val Leu Pro Pro Leu
850 855 860
Leu Thr Asp Glu Met Ile Ala Gln Tyr Thr Ser Ala Leu Leu Ala Gly
865 870 875 880
Thr Ile Thr Ser Gly Trp Thr Phe Gly Ala Gly Ala Ala Leu Gln Ile
885 890 895
Pro Phe Ala Met Gln Met Ala Tyr Arg Phe Asn Gly Ile Gly Val Thr
900 905 910
Gln Asn Val Leu Tyr Glu Asn Gln Lys Leu Ile Ala Asn Gln Phe Asn
915 920 925
Ser Ala Ile Gly Lys Ile Gln Asp Ser Leu Ser Ser Thr Ala Ser Ala
930 935 940
Leu Gly Lys Leu Gln Asp Val Val Asn Gln Asn Ala Gln Ala Leu Asn
945 950 955 960
Thr Leu Val Lys Gln Leu Ser Ser Asn Phe Gly Ala Ile Ser Ser Val
965 970 975
Leu Asn Asp Ile Leu Ser Arg Leu Asp Lys Val Glu Ala Glu Val Gln
980 985 990
Ile Asp Arg Leu Ile Thr Gly Arg Leu Gln Ser Leu Gln Thr Tyr Val
995 1000 1005
Thr Gln Gln Leu Ile Arg Ala Ala Glu Ile Arg Ala Ser Ala Asn
1010 1015 1020
Leu Ala Ala Thr Lys Met Ser Glu Cys Val Leu Gly Gln Ser Lys
1025 1030 1035
Arg Val Asp Phe Cys Gly Lys Gly Tyr His Leu Met Ser Phe Pro
1040 1045 1050
Gln Ser Ala Pro His Gly Val Val Phe Leu His Val Thr Tyr Val
1055 1060 1065
Pro Ala Gln Glu Lys Asn Phe Thr Thr Ala Pro Ala Ile Cys His
1070 1075 1080
Asp Gly Lys Ala His Phe Pro Arg Glu Gly Val Phe Val Ser Asn
1085 1090 1095
Gly Thr His Trp Phe Val Thr Gln Arg Asn Phe Tyr Glu Pro Gln
1100 1105 1110
Ile Ile Thr Thr Asp Asn Thr Phe Val Ser Gly Asn Cys Asp Val
1115 1120 1125
Val Ile Gly Ile Val Asn Asn Thr Val Tyr Asp Pro Leu Gln Pro
1130 1135 1140
Glu Leu Asp Ser Phe Lys Glu Glu Leu Asp Lys Tyr Phe Lys Asn
1145 1150 1155
His Thr Ser Pro Asp Val Asp Leu Gly Asp Ile Ser Gly Ile Asn
1160 1165 1170
Ala Ser Val Val Asn Ile Gln Lys Glu Ile Asp Arg Leu Asn Glu
1175 1180 1185
Val Ala Lys Asn Leu Asn Glu Ser Leu Ile Asp Leu Gln Glu Leu
1190 1195 1200
Gly Lys Tyr Glu Gln Tyr Ile Lys Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu
1205 1210 1215
Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met Val Thr Ile Met
1220 1225 1230
Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys Leu Lys Gly Cys Cys
1235 1240 1245
Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp Asp Ser Glu Pro
1250 1255 1260
Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr
1265 1270
<210> 9
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2糖蛋白TM结构域
<400> 9
Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile Val Met
1 5 10 15
Val Thr Ile Met Leu
20
<210> 10
<211> 71
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SARS-CoV-2糖蛋白TM结构域+囊泡内尾部
<400> 10
Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile
1 5 10 15
Val Met Val Thr Ile Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys
20 25 30
Leu Lys Gly Cys Cys Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp
35 40 45
Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr Tyr Pro
50 55 60
Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
65 70
<210> 11
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 太米阿米病毒糖蛋白TM结构域
<400> 11
Val Cys Phe Trp Ser Thr Leu Phe Tyr Thr Ala Ser Ile Phe Leu His
1 5 10 15
Leu Ile Arg Ile Pro
20
<210> 12
<211> 31
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 瓜纳瑞托病毒糖蛋白TM结构域
<400> 12
Lys Thr Pro Leu Thr Leu Val Asp Leu Cys Phe Trp Ser Ala Ile Phe
1 5 10 15
Phe Thr Thr Ser Leu Phe Leu His Leu Val Gly Phe Pro Thr His
20 25 30
<210> 13
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 马丘波病毒糖蛋白TM结构域
<400> 13
Ile Cys Phe Trp Ser Thr Ile Phe Phe Thr Ala Ser Leu Phe Leu His
1 5 10 15
Leu Val Gly Ile Pro
20
<210> 14
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 萨比亚病毒糖蛋白TM结构域
<400> 14
Ile Cys Phe Trp Ser Thr Leu Phe Phe Thr Thr Thr Leu Phe Leu His
1 5 10 15
Leu Val Gly Phe Pro
20
<210> 15
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 巴拉那病毒糖蛋白TM结构域
<400> 15
Ile Cys Phe Trp Ser Leu Val Tyr Phe Thr Val Ser Val Phe Leu Gln
1 5 10 15
Leu Val Gly Ile Pro
20
<210> 16
<211> 44
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CdaA TM结构域
<400> 16
Met Asp Phe Ser Asn Met Ser Ile Leu His Tyr Leu Ala Asn Ile Val
1 5 10 15
Asp Ile Leu Val Val Trp Phe Val Ile Tyr Lys Val Ile Met Leu Ile
20 25 30
Arg Gly Thr Lys Ala Val Gln Leu Leu Lys Gly Ile
35 40
<210> 17
<211> 250
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗mDEC205 scFv
<400> 17
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser
20 25 30
Tyr Asp Ile Asp Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp
35 40 45
Ile Gly Trp Ile Phe Pro Gly Glu Gly Ser Thr Glu Tyr Asn Glu Lys
50 55 60
Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala
65 70 75 80
Tyr Met Glu Leu Thr Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
130 135 140
Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Thr Ser Leu Gly Asn Ser Ile Thr
145 150 155 160
Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Lys Gly Trp Leu Ala Trp Tyr
165 170 175
Gln Gln Lys Ser Gly Asn Ala Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser
180 185 190
Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
195 200 205
Thr Asp Tyr Ile Phe Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala
210 215 220
Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gln Ser Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly
225 230 235 240
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala
245 250
<210> 18
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗mCLEC9A scFv
<400> 18
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Gln Ala Val Ser Ala Gly
1 5 10 15
Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Asp
20 25 30
Glu Asn Lys Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln
35 40 45
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Gly Glu Ser Gly Val
50 55 60
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
65 70 75 80
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
85 90 95
Tyr Tyr Asp Phe Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Gly Gly Ser
100 105 110
Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln
115 120 125
Ile Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Glu Ser Leu Lys
130 135 140
Ile Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala Ala Ile Tyr
145 150 155 160
Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile
165 170 175
Arg Thr Arg Pro Ser Lys Tyr Ala Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Arg
180 185 190
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Met Val Tyr Leu
195 200 205
Gln Met Asp Asn Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr
210 215 220
Pro Arg Ala Thr Glu Asp Val Pro Phe Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser
245
<210> 19
<211> 242
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CEACAM5 scFv
<400> 19
Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Ser Gly Thr
1 5 10 15
Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile Lys Asp Ser
20 25 30
Tyr Met His Trp Leu Arg Gln Gly Pro Glu Gln Cys Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala Pro Lys Phe
50 55 60
Gln Gly Lys Ala Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Asn Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala
130 135 140
Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr Cys Ser Ala
145 150 155 160
Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys Pro Gly Thr
165 170 175
Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val
180 185 190
Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr
195 200 205
Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln
210 215 220
Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys Leu Glu Leu
225 230 235 240
Lys Arg
<210> 20
<211> 284
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CTLA4 scFv（9D9克隆）
<400> 20
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
1 5 10 15
Gly Ser Thr Gly Ile Arg Arg Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr
20 25 30
Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg
35 40 45
Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp
50 55 60
Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val
65 70 75 80
Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
85 90 95
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu
100 105 110
Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly
115 120 125
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ala Lys Leu Gln Glu Ser Gly
145 150 155 160
Pro Val Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala
165 170 175
Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser
180 185 190
His Gly Lys Ser Leu Glu Trp Ile Gly Val Ile Asn Pro Tyr Asn Gly
195 200 205
Asp Thr Ser Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val
210 215 220
Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser
225 230 235 240
Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Tyr Gly Ser Trp Phe
245 250 255
Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Ile Thr Val Ser Thr Ala Lys Thr
260 265 270
Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Arg Ser
275 280
<210> 21
<211> 246
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD19 scFv
<400> 21
Asp Ile Gln Met Thr Gln Thr Thr Ser Ser Leu Ser Ala Ser Leu Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Ser Cys Arg Ala Ser Gln Asp Ile Ser Lys Tyr
20 25 30
Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Asp Gly Thr Val Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Tyr His Thr Ser Arg Leu His Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Asn Leu Glu Gln
65 70 75 80
Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Phe Cys Gln Gln Gly Asn Thr Leu Pro Tyr
85 90 95
Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Thr Gly Ser Thr Ser Gly
100 105 110
Ser Gly Lys Pro Gly Ser Gly Glu Gly Ser Thr Lys Gly Glu Val Lys
115 120 125
Leu Gln Glu Ser Gly Pro Gly Leu Val Ala Pro Ser Gln Ser Leu Ser
130 135 140
Val Thr Cys Thr Val Ser Gly Val Ser Leu Pro Asp Tyr Gly Val Ser
145 150 155 160
Trp Ile Arg Gln Pro Pro Arg Lys Gly Leu Glu Trp Leu Gly Val Ile
165 170 175
Trp Gly Ser Glu Thr Thr Tyr Tyr Asn Ser Ala Leu Lys Ser Arg Leu
180 185 190
Thr Ile Ile Lys Asp Asn Ser Lys Ser Gln Val Phe Leu Lys Met Asn
195 200 205
Ser Leu Gln Thr Asp Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys Ala Lys His Tyr
210 215 220
Tyr Tyr Gly Gly Ser Tyr Ala Met Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Ser
225 230 235 240
Val Thr Val Ser Ser Thr
245
<210> 22
<211> 248
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD20 scFv
<400> 22
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Leu Ser Leu Pro Val Thr Pro Gly
1 5 10 15
Glu Pro Ala Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Lys Ser Leu Leu His Ser
20 25 30
Asn Gly Ile Thr Tyr Leu Tyr Trp Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser
35 40 45
Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Gln Met Ser Asn Leu Val Ser Gly Val Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
65 70 75 80
Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Val Gly Val Tyr Tyr Cys Ala Gln Asn
85 90 95
Leu Glu Leu Pro Tyr Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ser
130 135 140
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ala Phe Ser Tyr Ser
145 150 155 160
Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
165 170 175
Gly Arg Ile Phe Pro Gly Asp Gly Asp Thr Asp Tyr Asn Gly Lys Phe
180 185 190
Lys Gly Arg Val Thr Ile Thr Ala Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr
195 200 205
Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
210 215 220
Ala Arg Asn Val Phe Asp Gly Tyr Trp Leu Val Tyr Trp Gly Gln Gly
225 230 235 240
Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Ala
245
<210> 23
<211> 254
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP scFv
<400> 23
Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Asp Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu
1 5 10 15
Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn
20 25 30
Asn Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu
35 40 45
Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser
50 55 60
Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe
65 70 75 80
Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr
85 90 95
Cys Ala Arg Gly Ala Arg Trp Gln Ala Arg Pro Ala Thr Arg Ile Asp
100 105 110
Gly Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser
115 120 125
Ser Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Gly Gly Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu
145 150 155 160
Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val
165 170 175
Thr Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala Pro
180 185 190
Arg Leu Leu Met Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Ala Gly Val Pro Asp
195 200 205
Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser
210 215 220
Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly
225 230 235 240
Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
245 250
<210> 24
<211> 113
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CTLA4 scFv
<400> 24
Ile Arg Arg Ala Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser
1 5 10 15
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
20 25 30
Val Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
35 40 45
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro
50 55 60
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
65 70 75 80
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
85 90 95
Gly Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
100 105 110
Arg
<210> 25
<211> 36
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 氯毒素
<400> 25
Met Cys Met Pro Cys Phe Thr Thr Asp His Gln Met Ala Arg Lys Cys
1 5 10 15
Asp Asp Cys Cys Gly Gly Lys Gly Arg Gly Lys Cys Tyr Gly Pro Gln
20 25 30
Cys Leu Cys Arg
35
<210> 26
<211> 169
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> PD1胞外域
<400> 26
Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln
1 5 10 15
Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp
20 25 30
Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala
35 40 45
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met
50 55 60
Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala
65 70 75 80
Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln
85 90 95
Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp
100 105 110
Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
115 120 125
His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val
130 135 140
Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro
145 150 155 160
Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met
165
<210> 27
<211> 635
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 恶性疟原虫蛋白质的VAR2结构域，VAR2CSA
<400> 27
Arg Gly Ser Asp Leu Lys Ser Ser Asn Ser Arg Val Thr Thr Pro Lys
1 5 10 15
Val Asp Val Gly Asn Tyr Lys Cys Leu Glu Tyr Asn Asp Asn Lys Tyr
20 25 30
Gly Arg Lys Met Thr Arg Ala Ser Gly Cys Ser Trp Gln Asn Met Tyr
35 40 45
Glu Lys Arg Asp Asp Cys Thr Glu Glu Asn Thr Pro Ile Lys Cys Gln
50 55 60
Cys Ala Tyr Lys Tyr Gly His Pro Thr Asn Gly Leu Pro Ser Pro Val
65 70 75 80
Asn Val Val Val Ala Thr Asn Cys Gln Gln Leu Lys Ser Lys Asp Thr
85 90 95
Glu Lys Asn Cys Lys Glu Thr Thr Thr Tyr Thr Thr Tyr Thr Thr Trp
100 105 110
Pro Ala Lys Asp Ala Gly Cys Ile Asn Asp Asp Leu Val Ile Ser Leu
115 120 125
Tyr Ser Ser Pro Thr Thr Leu Gly Ile Asp Ile Leu His Lys Phe Phe
130 135 140
Ser Asp Ile Asp Ser Gln Val Cys Lys Asn Glu Ala Ala Asn Thr Thr
145 150 155 160
Ser Ser Pro Gly Cys Asn Lys Thr Gly Ala Lys Arg Asn Arg Lys Ala
165 170 175
Asp Glu Ile Tyr Lys Ser Tyr Arg Lys Tyr Ile Gln Asp Trp Arg Lys
180 185 190
Val Trp Ser Ser Gly Ala Thr Gly Asp Gly Gly Lys Cys Asp Glu Ile
195 200 205
Phe Lys Lys Tyr Val Glu Cys Lys Asn Lys Cys Glu Thr Lys Cys Glu
210 215 220
Gly Asn Cys Thr Gly Gly Ser Glu Lys Cys Ser Lys Cys Asn Glu Ile
225 230 235 240
Val Pro Lys Val Lys Glu Gln Arg Gln Lys Cys Phe His Glu Val Trp
245 250 255
Glu Gln Leu Phe Arg Leu Tyr Gln Pro Ile Leu Asp Ile Thr Pro Ile
260 265 270
Asp Asp Cys Ser Ser Gly Ser Gly Thr Val Ser Gly Asp Gly Cys Cys
275 280 285
Thr Thr Ser Asn Met Gly Ala Gly His Lys Met Ala Leu Trp Ile Tyr
290 295 300
Lys Lys Asn Thr Asn Trp Trp Ser Glu Arg Leu Glu Asp Leu Ser Ser
305 310 315 320
Tyr Ser Thr Asp Gln Glu Ala Thr Asn Asn Lys Lys Ile Tyr Lys Arg
325 330 335
Phe Leu Lys Gly Phe Ile Lys Gln Leu Asn Leu Glu Leu Asp Lys Thr
340 345 350
Tyr Glu Asn Asp Trp Ile Ser Thr Gly Lys Ile Leu Asp Gly Tyr Asp
355 360 365
Ala Phe Ser Tyr Glu Leu Ala Lys Cys Leu Lys Lys Gly Asn Asp Asp
370 375 380
Asn Lys Lys Glu His Ser Pro Lys Leu Asn Lys Gly Glu His Phe Ala
385 390 395 400
Ala Ile Ile Trp Glu Lys Leu Leu Glu Ser Asn Thr Arg Ile Asn Lys
405 410 415
Leu Glu Gln Thr Lys Lys Gly Lys Glu Asp Leu Cys Val Val Leu Cys
420 425 430
Leu Ser Gln Thr Arg Pro Pro Leu Gly Ile Thr Asn Ala Tyr Glu Lys
435 440 445
Gln Leu Gly Gly Glu Lys Gly Ser Ser Lys Lys Trp Ile Trp Asn Lys
450 455 460
Asn Asn Lys Lys Ser Gln Glu Ser Lys Cys Lys Asp Cys Lys Tyr Cys
465 470 475 480
Asn Thr Leu Ser Ala Leu Val Lys Glu Leu Asn Lys Glu Cys Ala Glu
485 490 495
Gln Asn Lys Asn Asn Cys Ser Gly Asn Ser Ser Ser Gly Ser Lys Asn
500 505 510
Asp Ser Cys Asn Glu Gln Leu Ile Arg Leu Phe Asp Gln Cys Cys Cys
515 520 525
Asn Glu Val Gly Ser Leu Ser Thr His Glu Ile Val Cys Val Arg Leu
530 535 540
Asp Lys Asp Asn Glu Arg Val Gly Leu Lys Val His Lys Cys Val Lys
545 550 555 560
Lys Lys Asn Ala Lys Ile Ser Ser His Thr Ile Cys Thr Lys Asn Ser
565 570 575
Ser Pro Asp Ser Ile Gln Glu Gln Glu Val Ser Ala Ile Gly Ser Glu
580 585 590
Asn Cys Asn Cys Val Glu Asp Asn Asn Lys Gln Ile Lys Glu Ser Pro
595 600 605
Asn Asn Ala Asp Ser Ser Asn Leu Ile Phe Ser Leu Lys Thr Ala Tyr
610 615 620
Glu Ala Phe Tyr Pro Asp Gly Lys Ile Tyr Asn
625 630 635
<210> 28
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3
<400> 28
Gln Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Ala Arg Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Arg Tyr
20 25 30
Thr Met His Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile
35 40 45
Gly Tyr Ile Asn Pro Ser Arg Gly Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Lys Phe
50 55 60
Lys Asp Lys Ala Thr Leu Thr Thr Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Tyr Asp Asp His Tyr Cys Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly
100 105 110
Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Ala Ile
130 135 140
Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Ser Ala Ser
145 150 155 160
Ser Ser Val Ser Tyr Met Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Thr Ser
165 170 175
Pro Lys Arg Trp Ile Tyr Asp Thr Ser Lys Leu Ala Ser Gly Val Pro
180 185 190
Ala His Phe Arg Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile
195 200 205
Ser Gly Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp
210 215 220
Asn Ser Asn Pro Phe Thr Phe Gly Ser Gly Thr Lys Leu Glu Ile Asn
225 230 235 240
<210> 29
<211> 530
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗MARCO
<400> 29
Ile Arg Ser Leu Ser Ser Leu Gln Ser Leu Ser Thr Lys Asp Leu Thr
1 5 10 15
Met Gly Trp Ile Cys Ile Ile Phe Leu Val Ala Thr Ala Thr Gly Val
20 25 30
Leu Pro Gln Val Lys Leu Leu Gln Ser Gly Ala Ala Leu Val Lys Pro
35 40 45
Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr
50 55 60
Asp Tyr Trp Val Ser Trp Val Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu
65 70 75 80
Cys Ile Gly Glu Ile Ser Pro Asn Ser Gly Thr Thr Asn Phe Asn Glu
85 90 95
Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr
100 105 110
Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr
115 120 125
Tyr Cys Thr Arg Cys Arg Tyr Thr Thr Gly Val His Tyr Phe Asp Tyr
130 135 140
Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr Val Ser Ser Ala Glu Thr Thr Ala
145 150 155 160
Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro Gly Thr Ala Leu Lys Ser Asn Ser
165 170 175
Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val
180 185 190
Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe
195 200 205
Pro Ala Val Leu Gln Ser Gly Leu Tyr Thr Leu Thr Ser Ser Val Thr
210 215 220
Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala
225 230 235 240
His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val Asp Lys Lys Ile Glu Lys Gly Glu
245 250 255
Phe Ala Thr Tyr Met Ala Ala Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
260 265 270
Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Val Ile Pro Leu Leu Ile
275 280 285
Ser Ser Pro Gln Asn Asp Glu Ser Cys Gln Ser Leu Phe Leu Leu Leu
290 295 300
Leu Trp Ile Leu Gly Thr Lys Gly Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro
305 310 315 320
Ser Ile Leu Ser Val Thr Ile Gly Gln Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg
325 330 335
Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser Asp Gly Asn Ser Tyr Leu Tyr Trp
340 345 350
Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val
355 360 365
Ser Asn Leu Gly Ser Gly Val Pro Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
370 375 380
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Gly Val Glu Ala Glu Asp Leu
385 390 395 400
Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala Thr His Ala Pro Trp Thr Phe Gly
405 410 415
Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val
420 425 430
Ser Ile Phe Pro Pro Ser Thr Glu Gln Leu Ala Thr Gly Gly Ala Ser
435 440 445
Val Val Cys Leu Met Asn Asn Phe Tyr Pro Arg Asp Ile Ser Val Lys
450 455 460
Trp Lys Ile Asp Gly Thr Glu Arg Arg Asp Gly Val Leu Asp Ser Val
465 470 475 480
Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu
485 490 495
Ser Leu Thr Lys Ala Asp Tyr Glu Ser His Asn Leu Tyr Thr Cys Glu
500 505 510
Val Val His Lys His His Pro His Pro Gly Arg Ile Pro Ala Thr Gly
515 520 525
Ala Tyr
530
<210> 30
<211> 260
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人抗DEC205
<400> 30
Gln Ala Val Val Thr Gln Glu Ser Ala Leu Thr Thr Ser Pro Gly Glu
1 5 10 15
Thr Val Thr Leu Thr Cys Arg Ser Ser Thr Gly Ala Val Thr Ile Ser
20 25 30
Asn Tyr Ala Asn Trp Val Gln Glu Lys Pro Asp His Leu Phe Thr Gly
35 40 45
Leu Ile Gly Gly Thr Asn Asn Arg Ala Pro Gly Val Pro Ala Arg Phe
50 55 60
Ser Gly Ser Leu Ile Gly Asp Lys Ala Ala Leu Thr Ile Thr Gly Ala
65 70 75 80
Gln Thr Glu Asp Glu Ala Ile Tyr Phe Cys Ala Leu Trp Tyr Asn Asn
85 90 95
Gln Phe Ile Phe Gly Ser Gly Thr Lys Val Thr Val Leu Gly Gly Gly
100 105 110
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Glu Val Gln Leu Gln Gln Ser Gly Pro Val Leu Val Lys Pro
130 135 140
Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala Ser Gly Asn Thr Phe Thr
145 150 155 160
Asp Ser Phe Met His Trp Met Lys Gln Ser His Gly Lys Ser Leu Glu
165 170 175
Trp Ile Gly Ile Ile Asn Pro Tyr Asn Gly Gly Thr Ser Tyr Asn Gln
180 185 190
Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu Thr Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr
195 200 205
Ala Tyr Met Glu Leu Asn Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr
210 215 220
Tyr Cys Ala Arg Asn Gly Val Arg Tyr Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln
225 230 235 240
Gly Thr Thr Leu Thr Val Ser Ser Ala Ser Gly Ala Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Ser Ala Ala Ala
260
<210> 31
<211> 231
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人/小鼠抗langerin（aka抗CD207）
<400> 31
Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Thr Leu Ser Cys Lys Ala
1 5 10 15
Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp His Asp Met His Trp Val Gln Gln Thr
20 25 30
Pro Val Tyr Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Asp Pro Glu Thr Gly
35 40 45
Asp Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala Ile Leu Thr Ala
50 55 60
Asp Lys Ser Ser Arg Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg Ser Leu Thr Ser
65 70 75 80
Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Pro Phe Tyr Tyr Ser Asn
85 90 95
Tyr Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser
100 105 110
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ile
115 120 125
Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys
130 135 140
Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp
145 150 155 160
Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp Ile Tyr Ala Thr
165 170 175
Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
180 185 190
Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Ala
195 200 205
Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro Leu Thr Phe Gly
210 215 220
Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu
225 230
<210> 32
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> SIRPa（残基1-118）的N-末端V-set Ig结构域
<400> 32
Glu Glu Glu Val Gln Val Ile Gln Pro Asp Lys Ser Val Ser Val Ala
1 5 10 15
Ala Gly Glu Ser Ala Ile Leu His Cys Thr Ile Thr Ser Leu Ile Pro
20 25 30
Val Gly Pro Ile Gln Trp Phe Arg Gly Ala Gly Pro Ala Arg Glu Leu
35 40 45
Ile Tyr Asn Gln Arg Glu Gly His Phe Pro Arg Val Thr Thr Val Ser
50 55 60
Glu Thr Thr Arg Arg Glu Asn Met Asp Phe Ser Ile Ser Ile Ser Asn
65 70 75 80
Ile Thr Pro Ala Asp Ala Gly Thr Tyr Tyr Cys Val Lys Phe Arg Lys
85 90 95
Gly Ser Pro Asp Thr Glu Val Lys Ser Gly Ala Gly Thr Glu Leu Ser
100 105 110
Val Arg Ala Lys Pro Ser
115
<210> 33
<211> 12
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> GE11肽
<400> 33
Tyr His Trp Tyr Gly Tyr Thr Pro Gln Asn Val Ile
1 5 10
<210> 34
<211> 60
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> iRGD肽
<400> 34
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
20 25 30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
35 40 45
Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His
50 55 60
<210> 35
<211> 261
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40配体
<400> 35
Met Ile Glu Thr Tyr Asn Gln Thr Ser Pro Arg Ser Ala Ala Thr Gly
1 5 10 15
Leu Pro Ile Ser Met Lys Ile Phe Met Tyr Leu Leu Thr Val Phe Leu
20 25 30
Ile Thr Gln Met Ile Gly Ser Ala Leu Phe Ala Val Tyr Leu His Arg
35 40 45
Arg Leu Asp Lys Ile Glu Asp Glu Arg Asn Leu His Glu Asp Phe Val
50 55 60
Phe Met Lys Thr Ile Gln Arg Cys Asn Thr Gly Glu Arg Ser Leu Ser
65 70 75 80
Leu Leu Asn Cys Glu Glu Ile Lys Ser Gln Phe Glu Gly Phe Val Lys
85 90 95
Asp Ile Met Leu Asn Lys Glu Glu Thr Lys Lys Glu Asn Ser Phe Glu
100 105 110
Met Gln Lys Gly Asp Gln Asn Pro Gln Ile Ala Ala His Val Ile Ser
115 120 125
Glu Ala Ser Ser Lys Thr Thr Ser Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly
130 135 140
Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn Leu Val Thr Leu Glu Asn Gly Lys Gln
145 150 155 160
Leu Thr Val Lys Arg Gln Gly Leu Tyr Tyr Ile Tyr Ala Gln Val Thr
165 170 175
Phe Cys Ser Asn Arg Glu Ala Ser Ser Gln Ala Pro Phe Ile Ala Ser
180 185 190
Leu Cys Leu Lys Ser Pro Gly Arg Phe Glu Arg Ile Leu Leu Arg Ala
195 200 205
Ala Asn Thr His Ser Ser Ala Lys Pro Cys Gly Gln Gln Ser Ile His
210 215 220
Leu Gly Gly Val Phe Glu Leu Gln Pro Gly Ala Ser Val Phe Val Asn
225 230 235 240
Val Thr Asp Pro Ser Gln Val Ser His Gly Thr Gly Phe Thr Ser Phe
245 250 255
Gly Leu Leu Lys Leu
260
<210> 36
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CD40结合肽
<400> 36
Val Leu Gln Trp Ala Glu Lys Gly Tyr Tyr Thr Met Ser Asn Asn
1 5 10 15
<210> 37
<211> 170
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Nanoluc
<400> 37
Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Arg Gln Thr Ala Gly
1 5 10 15
Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu Phe
20 25 30
Gln Asn Leu Gly Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val Leu Ser
35 40 45
Gly Glu Asn Gly Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu
50 55 60
Gly Leu Ser Gly Asp Gln Met Gly Gln Ile Glu Lys Ile Phe Lys Val
65 70 75 80
Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu His Tyr Gly
85 90 95
Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Ile Asp Tyr Phe Gly
100 105 110
Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr Val
115 120 125
Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu Ile
130 135 140
Asn Pro Asp Gly Ser Leu Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Gly Val Thr
145 150 155 160
Gly Trp Arg Leu Cys Glu Arg Ile Leu Ala
165 170
<210> 38
<211> 236
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mCherry
<400> 38
Leu Val Gln Leu Val His Ala Ala Gly Gly Val Ala Ala Leu Gly Ala
1 5 10 15
Phe Val Leu Phe His Asp Gly Val Val Leu Val Val Gly Gly Asp Val
20 25 30
Gln Leu Asp Val Asp Val Val Gly Ala Gly Gln Leu His Gly Leu Leu
35 40 45
Gly Leu Val Gly Gly Leu Asp Leu Ser Val Val Val Ala Ala Val Leu
50 55 60
Gln Leu Gln Pro Leu Leu Asp Leu Ala Leu Gln Gly Ala Val Leu Gly
65 70 75 80
Val His Pro Leu Gly Gly Gly Leu Pro Ala His Gly Leu Leu Leu His
85 90 95
Tyr Gly Ala Val Gly Gly Glu Val Gly Ala Ala Gln Leu His Leu Val
100 105 110
Asp Glu Leu Ala Val Leu Gln Gly Gly Val Leu Gly His Gly His His
115 120 125
Ala Ala Val Leu Glu Val His His Ala Leu Pro Leu Glu Ala Leu Gly
130 135 140
Glu Gly Gln Leu Gln Val Val Gly Asp Val Gly Gly Val Leu His Val
145 150 155 160
Gly Leu Gly Ala Val His Glu Leu Arg Gly Gln Asp Val Pro Gly Glu
165 170 175
Gly Gln Gly Ala Thr Leu Gly His Leu Gln Leu Gly Gly Leu Gly Ala
180 185 190
Leu Val Gly Ala Ala Leu Ala Leu Ala Leu Asp Leu Glu Leu Val Ala
195 200 205
Val His Gly Ala Leu His Val His Leu Glu Ala His Glu Leu Leu Asp
210 215 220
Asp Gly His Val Ile Leu Leu Ala Leu Ala His His
225 230 235
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<211> 280
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 人TRAIL
<400> 39
Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys Val
1 5 10 15
Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala Val
20 25 30
Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys Tyr
35 40 45
Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr Trp
50 55 60
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65 70 75 80
Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser Glu
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100 105 110
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His
165 170 175
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180 185 190
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195 200 205
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210 215 220
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225 230 235 240
Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe
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Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser
260 265 270
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275 280
<210> 40
<211> 386
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 卵清蛋白
<400> 40
Met Gly Ser Ile Gly Ala Ala Ser Met Glu Phe Cys Phe Asp Val Phe
1 5 10 15
Lys Glu Leu Lys Val His His Ala Asn Glu Asn Ile Phe Tyr Cys Pro
20 25 30
Ile Ala Ile Met Ser Ala Leu Ala Met Val Tyr Leu Gly Ala Lys Asp
35 40 45
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50 55 60
Gly Phe Gly Asp Ser Ile Glu Ala Gln Cys Gly Thr Ser Val Asn Val
65 70 75 80
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85 90 95
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115 120 125
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130 135 140
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145 150 155 160
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Asn Ala Ile Val Phe Lys Gly Leu Trp Glu Lys Ala Phe Lys Asp Glu
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195 200 205
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225 230 235 240
Ser Met Leu Val Leu Leu Pro Asp Glu Val Ser Gly Leu Glu Gln Leu
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Glu Ala Gly Arg Glu Val Val Gly Ser Ala Glu Ala Gly Val Asp Ala
340 345 350
Ala Ser Val Ser Glu Glu Phe Arg Ala Asp His Pro Phe Leu Phe Cys
355 360 365
Ile Lys His Ile Ala Thr Asn Ala Val Leu Phe Phe Gly Arg Cys Val
370 375 380
Ser Pro
385
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> CdaA
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Asn Ile Phe Ile Pro Asn Thr Pro Leu His Asp Gly Ala Val Ile Ile
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Ser Pro Phe Leu Ser Lys Glu Leu Gly Thr Arg His Arg Ala Ala Leu
195 200 205
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225 230 235 240
Ser Glu Glu Glu Leu His Lys Ile Leu Leu Lys Glu Leu Val Thr Val
245 250 255
Thr Ala Lys Lys Pro Ser Ile Phe Ser Lys Trp Lys Gly Gly Lys Ser
260 265 270
Glu
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> mtbDISA
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His Ala Val Thr Arg Pro Thr Leu Arg Glu Ala Val Ala Arg Leu Ala
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Thr Gly Ala Leu Ile Val Leu Gly His Asp Glu Asn Val Glu Ala Ile
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50 55 60
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65 70 75 80
Ser Arg Ile Val Arg Ala Asn Val Gln Leu Val Pro Asp Pro Ser Ile
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115 120 125
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Leu Ala Ala Ser Ala Gly Asp Leu Gln Ser Val Asp Gly Ile Gly Ala
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Thr Ile Ser Asp Gln
355
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> dCas13a RBM
<400> 43
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35 40 45
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100 105 110
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245 250 255
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260 265 270
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305 310 315 320
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325 330 335
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340 345 350
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Asn Ile Ile Lys His Arg Ala Phe Tyr Asn Ile Lys Lys Tyr Gly Met
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Leu Asn Leu Leu Glu Lys Ile Ala Asp Lys Ala Lys Tyr Lys Ile Ser
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<211> 1148
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> dCas13b RBM
<400> 44
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1 5 10 15
Asn Ile Pro Ala Leu Val Glu Asn Gln Lys Lys Tyr Phe Gly Thr Tyr
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85 90 95
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Asn Gly Lys Tyr Lys Gln Asn Arg Val Glu Val Asn Ser Asn Asp Ile
115 120 125
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130 135 140
Leu Thr Asn Ala Tyr Lys Thr Tyr Glu Glu Lys Leu Asn Asp Gly Cys
145 150 155 160
Glu Phe Leu Thr Ser Thr Glu Gln Pro Leu Ser Gly Met Ile Asn Asn
165 170 175
Tyr Tyr Thr Val Ala Leu Arg Asn Met Asn Glu Arg Tyr Gly Tyr Lys
180 185 190
Thr Glu Asp Leu Ala Phe Ile Gln Asp Lys Arg Phe Lys Phe Val Lys
195 200 205
Asp Ala Tyr Gly Lys Lys Lys Ser Gln Val Asn Thr Gly Phe Phe Leu
210 215 220
Ser Leu Gln Asp Tyr Asn Gly Asp Thr Gln Lys Lys Leu His Leu Ser
225 230 235 240
Gly Val Gly Ile Ala Leu Leu Ile Cys Leu Phe Leu Asp Lys Gln Tyr
245 250 255
Ile Asn Ile Phe Leu Ser Arg Leu Pro Ile Phe Ser Ser Tyr Asn Ala
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Gln Ser Glu Glu Arg Arg Ile Ile Ile Arg Ser Phe Gly Ile Asn Ser
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Phe Thr Thr Leu Ser Ala Glu Lys Gln Ser Arg Phe Arg Ile Ile Ser
325 330 335
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Pro Leu Leu Leu Gln Tyr Ile Asp Tyr Gly Lys Leu Phe Asp His Ile
355 360 365
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370 375 380
Lys Thr Cys Ile Asp Gly Gln Thr Arg Val Arg Val Ile Glu Gln Pro
385 390 395 400
Leu Asn Gly Phe Gly Arg Leu Glu Glu Ala Glu Thr Met Arg Lys Gln
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580 585 590
Asp Arg Lys Ser Ile Arg Ser Ala Asp Asn Lys Met Gly Lys Arg Gly
595 600 605
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Asn Ala Asn Val Thr Tyr Leu Ile Ala Glu Tyr Met Lys Arg Val Leu
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965 970 975
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980 985 990
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Tyr Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Tyr Pro Tyr Asp
1130 1135 1140
Val Pro Asp Tyr Ala
1145
<210> 45
<211> 992
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> dCas13d RBM
<400> 45
Ala Ile Ala Ala Leu Thr Ala Thr Arg Ser Ser Gly Ser Gly Ser Glu
1 5 10 15
Ala Ser Ile Glu Lys Lys Lys Ser Phe Ala Lys Gly Met Gly Val Lys
20 25 30
Ser Thr Leu Val Ser Gly Ser Lys Val Tyr Met Thr Thr Phe Ala Glu
35 40 45
Gly Ser Asp Ala Arg Leu Glu Lys Ile Val Glu Gly Asp Ser Ile Arg
50 55 60
Ser Val Asn Glu Gly Glu Ala Phe Ser Ala Glu Met Ala Asp Lys Asn
65 70 75 80
Ala Gly Tyr Lys Ile Gly Asn Ala Lys Phe Ser His Pro Lys Gly Tyr
85 90 95
Ala Val Val Ala Asn Asn Pro Leu Tyr Thr Gly Pro Val Gln Gln Asp
100 105 110
Met Leu Gly Leu Lys Glu Thr Leu Glu Lys Arg Tyr Phe Gly Glu Ser
115 120 125
Ala Asp Gly Asn Asp Asn Ile Cys Ile Gln Val Ile His Asn Ile Leu
130 135 140
Asp Ile Glu Lys Ile Leu Ala Glu Tyr Ile Thr Asn Ala Ala Tyr Ala
145 150 155 160
Val Asn Asn Ile Ser Gly Leu Asp Lys Asp Ile Ile Gly Phe Gly Lys
165 170 175
Phe Ser Thr Val Tyr Thr Tyr Asp Glu Phe Lys Asp Pro Glu His His
180 185 190
Arg Ala Ala Phe Asn Asn Asn Asp Lys Leu Ile Asn Ala Ile Lys Ala
195 200 205
Gln Tyr Asp Glu Phe Asp Asn Phe Leu Asp Asn Pro Arg Leu Gly Tyr
210 215 220
Phe Gly Gln Ala Phe Phe Ser Lys Glu Gly Arg Asn Tyr Ile Ile Asn
225 230 235 240
Tyr Gly Asn Glu Cys Tyr Asp Ile Leu Ala Leu Leu Ser Gly Leu Ala
245 250 255
His Trp Val Val Ala Asn Asn Glu Glu Glu Ser Arg Ile Ser Arg Thr
260 265 270
Trp Leu Tyr Asn Leu Asp Lys Asn Leu Asp Asn Glu Tyr Ile Ser Thr
275 280 285
Leu Asn Tyr Leu Tyr Asp Arg Ile Thr Asn Glu Leu Thr Asn Ser Phe
290 295 300
Ser Lys Asn Ser Ala Ala Asn Val Asn Tyr Ile Ala Glu Thr Leu Gly
305 310 315 320
Ile Asn Pro Ala Glu Phe Ala Glu Gln Tyr Phe Arg Phe Ser Ile Met
325 330 335
Lys Glu Gln Lys Asn Leu Gly Phe Asn Ile Thr Lys Leu Arg Glu Val
340 345 350
Met Leu Asp Arg Lys Asp Met Ser Glu Ile Arg Lys Asn His Lys Val
355 360 365
Phe Asp Ser Ile Arg Thr Lys Val Tyr Thr Met Met Asp Phe Val Ile
370 375 380
Tyr Arg Tyr Tyr Ile Glu Glu Asp Ala Lys Val Ala Ala Ala Asn Lys
385 390 395 400
Ser Leu Pro Asp Asn Glu Lys Ser Leu Ser Glu Lys Asp Ile Phe Val
405 410 415
Ile Asn Leu Arg Gly Ser Phe Asn Asp Asp Gln Lys Asp Ala Leu Tyr
420 425 430
Tyr Asp Glu Ala Asn Arg Ile Trp Arg Lys Leu Glu Asn Ile Met His
435 440 445
Asn Ile Lys Glu Phe Arg Gly Asn Lys Thr Arg Glu Tyr Lys Lys Lys
450 455 460
Asp Ala Pro Arg Leu Pro Arg Ile Leu Pro Ala Gly Arg Asp Val Ser
465 470 475 480
Ala Phe Ser Lys Leu Met Tyr Ala Leu Thr Met Phe Leu Asp Gly Lys
485 490 495
Glu Ile Asn Asp Leu Leu Thr Thr Leu Ile Asn Lys Phe Asp Asn Ile
500 505 510
Gln Ser Phe Leu Lys Val Met Pro Leu Ile Gly Val Asn Ala Lys Phe
515 520 525
Val Glu Glu Tyr Ala Phe Phe Lys Asp Ser Ala Lys Ile Ala Asp Glu
530 535 540
Leu Arg Leu Ile Lys Ser Phe Ala Arg Met Gly Glu Pro Ile Ala Asp
545 550 555 560
Ala Arg Arg Ala Met Tyr Ile Asp Ala Ile Arg Ile Leu Gly Thr Asn
565 570 575
Leu Ser Tyr Asp Glu Leu Lys Ala Leu Ala Asp Thr Phe Ser Leu Asp
580 585 590
Glu Asn Gly Asn Lys Leu Lys Lys Gly Lys His Gly Met Arg Asn Phe
595 600 605
Ile Ile Asn Asn Val Ile Ser Asn Lys Arg Phe His Tyr Leu Ile Arg
610 615 620
Tyr Gly Asp Pro Ala His Leu His Glu Ile Ala Lys Asn Glu Ala Val
625 630 635 640
Val Lys Phe Val Leu Gly Arg Ile Ala Asp Ile Gln Lys Lys Gln Gly
645 650 655
Gln Asn Gly Lys Asn Gln Ile Asp Arg Tyr Tyr Glu Thr Cys Ile Gly
660 665 670
Lys Asp Lys Gly Lys Ser Val Ser Glu Lys Val Asp Ala Leu Thr Lys
675 680 685
Ile Ile Thr Gly Met Asn Tyr Asp Gln Phe Asp Lys Lys Arg Ser Val
690 695 700
Ile Glu Asp Thr Gly Arg Glu Asn Ala Glu Arg Glu Lys Phe Lys Lys
705 710 715 720
Ile Ile Ser Leu Tyr Leu Thr Val Ile Tyr His Ile Leu Lys Asn Ile
725 730 735
Val Asn Ile Asn Ala Arg Tyr Val Ile Gly Phe His Cys Val Glu Arg
740 745 750
Asp Ala Gln Leu Tyr Lys Glu Lys Gly Tyr Asp Ile Asn Leu Lys Lys
755 760 765
Leu Glu Glu Lys Gly Phe Ser Ser Val Thr Lys Leu Cys Ala Gly Ile
770 775 780
Asp Glu Thr Ala Pro Asp Lys Arg Lys Asp Val Glu Lys Glu Met Ala
785 790 795 800
Glu Arg Ala Lys Glu Ser Ile Asp Ser Leu Glu Ser Ala Asn Pro Lys
805 810 815
Leu Tyr Ala Asn Tyr Ile Lys Tyr Ser Asp Glu Lys Lys Ala Glu Glu
820 825 830
Phe Thr Arg Gln Ile Asn Arg Glu Lys Ala Lys Thr Ala Leu Asn Ala
835 840 845
Tyr Leu Arg Asn Thr Lys Trp Asn Val Ile Ile Arg Glu Asp Leu Leu
850 855 860
Arg Ile Asp Asn Lys Thr Cys Thr Leu Phe Ala Asn Lys Ala Val Ala
865 870 875 880
Leu Glu Val Ala Arg Tyr Val His Ala Tyr Ile Asn Asp Ile Ala Glu
885 890 895
Val Asn Ser Tyr Phe Gln Leu Tyr His Tyr Ile Met Gln Arg Ile Ile
900 905 910
Met Asn Glu Arg Tyr Glu Lys Ser Ser Gly Lys Val Ser Glu Tyr Phe
915 920 925
Asp Ala Val Asn Asp Glu Lys Lys Tyr Asn Asp Arg Leu Leu Lys Leu
930 935 940
Leu Cys Val Pro Phe Gly Tyr Cys Ile Pro Arg Phe Lys Asn Leu Ser
945 950 955 960
Ile Glu Ala Leu Phe Asp Arg Asn Glu Ala Ala Lys Phe Asp Lys Glu
965 970 975
Lys Lys Lys Val Ser Gly Asn Ser Gly Ser Gly Ala Ala Ala Arg Val
980 985 990
<210> 46
<211> 377
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Pum RBM
<400> 46
Ala Ile Ala Ala Leu Thr Ala Thr Arg Ser Ser Gly Ser Gly Ser Met
1 5 10 15
Gly Arg Ser Arg Leu Leu Glu Asp Phe Arg Asn Asn Arg Tyr Pro Asn
20 25 30
Leu Gln Leu Arg Glu Ile Ala Gly His Ile Met Glu Phe Ser Gln Asp
35 40 45
Gln His Gly Ser Arg Phe Ile Gln Leu Lys Leu Glu Arg Ala Thr Pro
50 55 60
Ala Glu Arg Gln Leu Val Phe Asn Glu Ile Leu Gln Ala Ala Tyr Gln
65 70 75 80
Leu Met Val Asp Val Phe Gly Asn Tyr Val Ile Gln Lys Phe Phe Glu
85 90 95
Phe Gly Ser Leu Glu Gln Lys Leu Ala Leu Ala Glu Arg Ile Arg Gly
100 105 110
His Val Leu Ser Leu Ala Leu Gln Met Tyr Gly Cys Arg Val Ile Gln
115 120 125
Lys Ala Leu Glu Phe Ile Pro Ser Asp Gln Gln Asn Glu Met Val Arg
130 135 140
Glu Leu Asp Gly His Val Leu Lys Cys Val Lys Asp Gln Asn Gly Asn
145 150 155 160
His Val Val Gln Lys Cys Ile Glu Cys Val Gln Pro Gln Ser Leu Gln
165 170 175
Phe Ile Ile Asp Ala Phe Lys Gly Gln Val Phe Ala Leu Ser Thr His
180 185 190
Pro Tyr Gly Cys Arg Val Ile Gln Arg Ile Leu Glu His Cys Leu Pro
195 200 205
Asp Gln Thr Leu Pro Ile Leu Glu Glu Leu His Gln His Thr Glu Gln
210 215 220
Leu Val Gln Asp Gln Tyr Gly Asn Tyr Val Ile Gln His Val Leu Glu
225 230 235 240
His Gly Arg Pro Glu Asp Lys Ser Lys Ile Val Ala Glu Ile Arg Gly
245 250 255
Asn Val Leu Val Leu Ser Gln His Lys Phe Ala Ser Asn Val Val Glu
260 265 270
Lys Cys Val Thr His Ala Ser Arg Thr Glu Arg Ala Val Leu Ile Asp
275 280 285
Glu Val Cys Thr Met Asn Asp Gly Pro His Ser Ala Leu Tyr Thr Met
290 295 300
Met Lys Asp Gln Tyr Ala Asn Tyr Val Val Gln Lys Met Ile Asp Val
305 310 315 320
Ala Glu Pro Gly Gln Arg Lys Ile Val Met His Lys Ile Arg Pro His
325 330 335
Ile Ala Thr Leu Arg Lys Tyr Thr Tyr Gly Lys His Ile Leu Ala Lys
340 345 350
Leu Glu Lys Tyr Tyr Met Lys Asn Gly Val Asp Leu Gly Gly Ser Gly
355 360 365
Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
370 375
<210> 47
<211> 208
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> Stu1 RBM
<400> 47
Ala Ile Ala Ala Leu Thr Ala Thr Arg Ser Ser Gly Ser Gly Ser Asn
1 5 10 15
Leu Asn Lys Ser Glu Ile Ser Gln Val Phe Glu Ile Ala Leu Lys Arg
20 25 30
Asn Leu Pro Val Asn Phe Glu Val Ala Arg Glu Ser Gly Pro Pro His
35 40 45
Met Lys Asn Phe Val Thr Lys Val Ser Val Gly Glu Phe Val Gly Glu
50 55 60
Gly Glu Gly Lys Ser Lys Lys Ile Ser Lys Lys Asn Ala Ala Ile Ala
65 70 75 80
Val Leu Glu Glu Leu Lys Lys Leu Pro Pro Leu Pro Ala Val Glu Arg
85 90 95
Val Lys Pro Arg Ile Lys Lys Lys Thr Lys Pro Ile Val Lys Pro Gln
100 105 110
Thr Ser Pro Glu Tyr Gly Gln Gly Ile Asn Pro Ile Ser Arg Leu Ala
115 120 125
Gln Ile Gln Gln Ala Lys Lys Glu Lys Glu Pro Glu Tyr Thr Leu Leu
130 135 140
Thr Glu Arg Gly Leu Pro Arg Arg Arg Glu Phe Val Met Gln Val Lys
145 150 155 160
Val Gly Asn His Thr Ala Glu Gly Thr Gly Thr Asn Lys Lys Val Ala
165 170 175
Lys Arg Asn Ala Ala Glu Asn Met Leu Glu Ile Leu Gly Phe Lys Val
180 185 190
Pro Gln Arg Gln Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
195 200 205
<210> 48
<211> 174
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> VEEV RBM
<400> 48
Ala Ile Ala Ala Leu Thr Ala Thr Arg Ser Ser Gly Ser Gly Ser Met
1 5 10 15
Phe Pro Phe Gln Pro Met Tyr Pro Met Gln Pro Met Pro Tyr Arg Asn
20 25 30
Pro Phe Ala Ala Pro Arg Arg Pro Trp Phe Pro Arg Thr Asp Pro Phe
35 40 45
Leu Ala Met Gln Val Gln Glu Leu Thr Arg Ser Met Ala Asn Leu Thr
50 55 60
Phe Lys Gln Arg Arg Asp Ala Pro Pro Glu Gly Pro Pro Ala Lys Lys
65 70 75 80
Pro Lys Arg Glu Ala Pro Gln Lys Gln Lys Gly Gly Gly Gln Gly Lys
85 90 95
Lys Lys Lys Asn Gln Gly Lys Lys Lys Ala Lys Thr Gly Pro Pro Asn
100 105 110
Pro Lys Ala Gln Ser Gly Asn Lys Lys Lys Pro Asn Lys Lys Pro Gly
115 120 125
Lys Arg Gln Arg Met Val Met Lys Leu Glu Ser Asp Lys Gly Ser Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Tyr Pro Tyr Asp
145 150 155 160
Val Pro Asp Tyr Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
165 170
<210> 49
<211> 167
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> L72AE RBM
<400> 49
Ala Ile Ala Ala Leu Thr Ala Thr Arg Ser Ser Gly Ser Gly Ser Met
1 5 10 15
Tyr Val Arg Phe Glu Val Pro Glu Asp Met Gln Asn Glu Ala Leu Ser
20 25 30
Leu Leu Glu Lys Val Arg Glu Ser Gly Lys Val Lys Lys Gly Thr Asn
35 40 45
Glu Thr Thr Lys Ala Val Glu Arg Gly Leu Ala Lys Leu Val Tyr Ile
50 55 60
Ala Glu Asp Val Asp Pro Pro Glu Ile Val Ala His Leu Pro Leu Leu
65 70 75 80
Cys Glu Glu Lys Asn Val Pro Tyr Ile Tyr Val Lys Ser Lys Asn Asp
85 90 95
Leu Gly Arg Ala Val Gly Ile Glu Val Pro Cys Ala Ser Ala Ala Ile
100 105 110
Ile Asn Glu Gly Glu Leu Arg Lys Glu Leu Gly Ser Leu Val Glu Lys
115 120 125
Ile Lys Gly Leu Gln Lys Gly Ser Gly Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr Asp
130 135 140
Val Pro Asp Tyr Ala Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Tyr Pro
145 150 155 160
Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala
165
<210> 50
<211> 262
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> MS2 RBM
<400> 50
Ala Ile Ala Ala Leu Thr Ala Thr Arg Ser Ser Gly Ser Gly Ser Met
1 5 10 15
Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val Asp Asn Gly Gly Thr Gly
20 25 30
Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala Asn Gly Ile Ala Glu Trp
35 40 45
Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr Lys Val Thr Cys Ser Val
50 55 60
Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr Thr Ile Lys Val Glu Val
65 70 75 80
Pro Lys Gly Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn Met Glu Leu Thr Ile Pro
85 90 95
Ile Phe Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu Ile Val Lys Ala Met Gln
100 105 110
Gly Leu Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro Ser Ala Ile Ala Ala Asn
115 120 125
Ser Gly Ile Tyr Ala Met Ala Ser Asn Phe Thr Gln Phe Val Leu Val
130 135 140
Asp Asn Gly Gly Thr Gly Asp Val Thr Val Ala Pro Ser Asn Phe Ala
145 150 155 160
Asn Gly Ile Ala Glu Trp Ile Ser Ser Asn Ser Arg Ser Gln Ala Tyr
165 170 175
Lys Val Thr Cys Ser Val Arg Gln Ser Ser Ala Gln Asn Arg Lys Tyr
180 185 190
Thr Ile Lys Val Glu Val Pro Lys Gly Ala Trp Arg Ser Tyr Leu Asn
195 200 205
Met Glu Leu Thr Ile Pro Ile Phe Ala Thr Asn Ser Asp Cys Glu Leu
210 215 220
Ile Val Lys Ala Met Gln Gly Leu Leu Lys Asp Gly Asn Pro Ile Pro
225 230 235 240
Ser Ala Ile Ala Ala Asn Ser Gly Ile Tyr Gly Ser Gly Tyr Pro Tyr
245 250 255
Asp Val Pro Asp Tyr Ala
260
<210> 51
<211> 166
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dCas13a RBM靶序列
<400> 51
gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaacggaa ttcgagctcg gtaccttccc 60
gggttcatta gagatttaga ctaccccaaa aacgaagggg actaaaacgt ctgcaggtcg 120
actctagaaa gatttagact accccaaaaa cgaaggggac taaaac 166
<210> 52
<211> 166
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dCas13b RBM靶序列
<400> 52
gttgtggaag gtccagtttt gaggggctat tacaacggaa ttcgagctcg gtaccttccc 60
gggttcatta gagttgtgga aggtccagtt ttgaggggct attacaacgt ctgcaggtcg 120
actctagaaa gttgtggaag gtccagtttt gaggggctat tacaac 166
<210> 53
<211> 151
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> dCas13d RBM靶序列
<400> 53
gaacccctac caactggtcg gggtttgaaa cggaattcga gctcggtacc ttcccgggtt 60
cattagagaa cccctaccaa ctggtcgggg tttgaaacgt ctgcaggtcg actctagaaa 120
gaacccctac caactggtcg gggtttgaaa c 151
<210> 54
<211> 181
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Pum RBM靶序列
<400> 54
tggaattcga gctcggtacc ttcccgggtt cattagatcc taaggttcat ataatcgttg 60
tccagaattg tatatattcg tgcaggtcga ctctagatca tataatcgtt gtccagaatt 120
gtatatattc gttggcactg gcgtcgttca tataatcgtt gtccagaatt gtatatattc 180
g 181
<210> 55
<211> 187
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> Stu1 RBM靶序列
<400> 55
cattagatcc taaggtgagt gccagaagct gcctcgattc aacgaggcag tttctggtac 60
tctgcaggtc gactctagag agtgccagaa gctgcctcga ttcaacgagg cagtttctgg 120
tactcttggc actggcgtcg tgagtgccag aagctgcctc gattcaacga ggcagtttct 180
ggtactc 187
<210> 56
<211> 316
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> VEEV RBM靶序列
<400> 56
agtggcggct taattaaatt acacatgtcg gtgtgagact atagttagtt gcgacgggta 60
cgtcgttaaa agaatagcta tcagtccagg cctgtatggg aagccttcag gctatgctgc 120
tacgatgcac cgcgagggat tcttgtgctg caaagtgaca gacacattga acggggagag 180
ggtctctttt cccgtgtgca cgtatgtgcc agctacattg tgtgaccaaa tgactggcat 240
actggcaaca gatgtcagtg cggacgacgc gcaaaaactg ctggttgggc tcaaccagcg 300
catagtcgtc aaagcg 316
<210> 57
<211> 161
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> L72AE RBM靶序列
<400> 57
cccgggttca ttagatccta aggtgctctg accgaaaggc gtgatgagct gcaggtcgac 60
tctagagctc tgaccgaaag gcgtgatgag cttggcactg gcgtcgtgct ctgaccgaaa 120
ggcgtgatga gctgcggtac ctttaagacc aatgacttac a 161
<210> 58
<211> 120
<212> DNA
<213> 人工序列
<220>
<223> MS2 RBM靶序列
<400> 58
aaggtaaaca tgaggatcac ccatgtctgc aggtcgactc tagaaaacat gaggatcacc 60
catgtcttgg cactggcgtc gtaaacatga ggatcaccca tgtctgcggt acctttaaga 120
<210> 59
<211> 525
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向PD-L1的PD1-胞外域+接头VSVG-Nanoluc
<400> 59
Thr Met Ser Val Phe Ala Cys Phe Pro Cys Leu Gly Leu Gly Ser Cys
1 5 10 15
Trp Cys Ala Trp Cys Ser Val Leu Cys Gly Leu Met Leu Gly Glu Phe
20 25 30
Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln
35 40 45
Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp
50 55 60
Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala
65 70 75 80
Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met
85 90 95
Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala
100 105 110
Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln
115 120 125
Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp
130 135 140
Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu
145 150 155 160
His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val
165 170 175
Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro
180 185 190
Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly Met His His His His His His Gly
195 200 205
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
210 215 220
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
225 230 235 240
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
245 250 255
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Leu Gly Gly
260 265 270
Gly Gly Ser Asp Ile Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys Asn Pro Ile Glu
275 280 285
Leu Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser Ser Ile Ala Ser Phe
290 295 300
Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu Val Leu Arg Val
305 310 315 320
Gly Ile His Leu Cys Ile Lys Leu Lys His Thr Lys Lys Arg Gln Ile
325 330 335
Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys Val Phe Thr Leu Glu
340 345 350
Asp Phe Val Gly Asp Trp Arg Gln Thr Ala Gly Tyr Asn Leu Asp Gln
355 360 365
Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu Phe Gln Asn Leu Gly Val
370 375 380
Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val Leu Ser Gly Glu Asn Gly Leu
385 390 395 400
Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu Gly Leu Ser Gly Asp
405 410 415
Gln Met Gly Gln Ile Glu Lys Ile Phe Lys Val Val Tyr Pro Val Asp
420 425 430
Asp His His Phe Lys Val Ile Leu His Tyr Gly Thr Leu Val Ile Asp
435 440 445
Gly Val Thr Pro Asn Met Ile Asp Tyr Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly
450 455 460
Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr Val Thr Gly Thr Leu Trp
465 470 475 480
Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu Ile Asn Pro Asp Gly Ser
485 490 495
Leu Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Gly Val Thr Gly Trp Arg Leu Cys
500 505 510
Glu Arg Ile Leu Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
515 520 525
<210> 60
<211> 482
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向PD-L1的PD1-胞外域VSVG-Nanoluc
<400> 60
Thr Met Phe Met Pro Ser Ser Leu Ser Tyr Ser Ser Trp Ala Thr Cys
1 5 10 15
Trp Leu Leu Cys Cys Leu Ile Ile Leu Ala Lys Asn Ser Ser Thr Asp
20 25 30
Pro Ser Arg Asn Ser Asp Thr Met Lys Cys Leu Leu Tyr Leu Ala Phe
35 40 45
Leu Phe Ile Gly Val Asn Cys Glu Phe Met Trp Val Arg Gln Val Pro
50 55 60
Trp Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp
65 70 75 80
Leu Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro
85 90 95
Ala Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser
100 105 110
Leu Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser
115 120 125
Pro Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser
130 135 140
Gln Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg
145 150 155 160
His Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly
165 170 175
Ile Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu His Pro Lys Ala Lys Ile Glu
180 185 190
Glu Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr
195 200 205
Ser Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln
210 215 220
Gly Met His His His His His His Asp Ile Gly Asp Thr Gly Leu Ser
225 230 235 240
Lys Asn Pro Ile Glu Leu Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser
245 250 255
Ser Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe
260 265 270
Leu Val Leu Arg Val Gly Ile His Leu Cys Ile Lys Leu Lys His Thr
275 280 285
Lys Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys
290 295 300
Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val Gly Asp Trp Arg Gln Thr Ala Gly
305 310 315 320
Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu Phe
325 330 335
Gln Asn Leu Gly Val Ser Val Thr Pro Ile Gln Arg Ile Val Leu Ser
340 345 350
Gly Glu Asn Gly Leu Lys Ile Asp Ile His Val Ile Ile Pro Tyr Glu
355 360 365
Gly Leu Ser Gly Asp Gln Met Gly Gln Ile Glu Lys Ile Phe Lys Val
370 375 380
Val Tyr Pro Val Asp Asp His His Phe Lys Val Ile Leu His Tyr Gly
385 390 395 400
Thr Leu Val Ile Asp Gly Val Thr Pro Asn Met Ile Asp Tyr Phe Gly
405 410 415
Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val Phe Asp Gly Lys Lys Ile Thr Val
420 425 430
Thr Gly Thr Leu Trp Asn Gly Asn Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu Ile
435 440 445
Asn Pro Asp Gly Ser Leu Leu Phe Arg Val Thr Ile Asn Gly Val Thr
450 455 460
Gly Trp Arg Leu Cys Glu Arg Ile Leu Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp
465 470 475 480
Asp Lys
<210> 61
<211> 874
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向PD-L1的PD1-胞外域+大接头VSVG-Nanoluc
<400> 61
Thr Met Glu Phe Gly Leu Ser Trp Val Phe Leu Val Ala Leu Phe Arg
1 5 10 15
Gly Val Gln Cys Thr Gly Glu Phe Met Trp Val Arg Gln Val Pro Trp
20 25 30
Ser Phe Thr Trp Ala Val Leu Gln Leu Ser Trp Gln Ser Gly Trp Leu
35 40 45
Leu Glu Val Pro Asn Gly Pro Trp Arg Ser Leu Thr Phe Tyr Pro Ala
50 55 60
Trp Leu Thr Val Ser Glu Gly Ala Asn Ala Thr Phe Thr Cys Ser Leu
65 70 75 80
Ser Asn Trp Ser Glu Asp Leu Met Leu Asn Trp Asn Arg Leu Ser Pro
85 90 95
Ser Asn Gln Thr Glu Lys Gln Ala Ala Phe Cys Asn Gly Leu Ser Gln
100 105 110
Pro Val Gln Asp Ala Arg Phe Gln Ile Ile Gln Leu Pro Asn Arg His
115 120 125
Asp Phe His Met Asn Ile Leu Asp Thr Arg Arg Asn Asp Ser Gly Ile
130 135 140
Tyr Leu Cys Gly Ala Ile Ser Leu His Pro Lys Ala Lys Ile Glu Glu
145 150 155 160
Ser Pro Gly Ala Glu Leu Val Val Thr Glu Arg Ile Leu Glu Thr Ser
165 170 175
Thr Arg Tyr Pro Ser Pro Ser Pro Lys Pro Glu Gly Arg Phe Gln Gly
180 185 190
Met His His His His His His Lys Phe Thr Ile Val Phe Pro His Asn
195 200 205
Gln Lys Gly Asn Trp Lys Asn Val Pro Ser Asn Tyr His Tyr Cys Pro
210 215 220
Ser Ser Ser Asp Leu Asn Trp His Asn Asp Leu Ile Gly Thr Ala Leu
225 230 235 240
Gln Val Lys Met Pro Lys Ser His Lys Ala Ile Gln Ala Asp Gly Trp
245 250 255
Met Cys His Ala Ser Lys Trp Val Thr Thr Cys Asp Phe Arg Trp Tyr
260 265 270
Gly Pro Lys Tyr Ile Thr His Ser Ile Arg Ser Phe Thr Pro Ser Val
275 280 285
Glu Gln Cys Lys Glu Ser Ile Glu Gln Thr Lys Gln Gly Thr Trp Leu
290 295 300
Asn Pro Gly Phe Pro Pro Gln Ser Cys Gly Tyr Ala Thr Val Thr Asp
305 310 315 320
Ala Glu Ala Val Ile Val Gln Val Thr Pro His His Val Leu Val Asp
325 330 335
Glu Tyr Thr Gly Glu Trp Val Asp Ser Gln Phe Ile Asn Gly Lys Cys
340 345 350
Ser Asn Tyr Ile Cys Pro Thr Val His Asn Ser Thr Thr Trp His Ser
355 360 365
Asp Tyr Lys Val Lys Gly Leu Cys Asp Ser Asn Leu Ile Ser Met Asp
370 375 380
Ile Thr Phe Phe Ser Glu Asp Gly Glu Leu Ser Ser Leu Gly Lys Glu
385 390 395 400
Gly Thr Gly Phe Arg Ser Asn Tyr Phe Ala Tyr Glu Thr Gly Gly Lys
405 410 415
Ala Cys Lys Met Gln Tyr Cys Lys His Trp Gly Val Arg Leu Pro Ser
420 425 430
Gly Val Trp Phe Glu Met Ala Asp Lys Asp Leu Phe Ala Ala Ala Arg
435 440 445
Phe Pro Glu Cys Pro Glu Gly Ser Ser Ile Ser Ala Pro Ser Gln Thr
450 455 460
Ser Val Asp Val Ser Leu Ile Gln Asp Val Glu Arg Ile Leu Asp Tyr
465 470 475 480
Ser Leu Cys Gln Glu Thr Trp Ser Lys Ile Arg Ala Gly Leu Pro Ile
485 490 495
Ser Pro Val Asp Leu Ser Tyr Leu Ala Pro Lys Asn Pro Gly Thr Gly
500 505 510
Pro Ala Phe Thr Ile Ile Asn Gly Thr Leu Lys Tyr Phe Glu Thr Arg
515 520 525
Tyr Ile Arg Val Asp Ile Ala Ala Pro Ile Leu Ser Arg Met Val Gly
530 535 540
Met Ile Ser Gly Thr Thr Thr Glu Arg Glu Leu Trp Asp Asp Trp Ala
545 550 555 560
Pro Tyr Glu Asp Val Glu Ile Gly Pro Asn Gly Val Leu Arg Thr Ser
565 570 575
Ser Gly Tyr Lys Phe Pro Leu Tyr Met Ile Gly His Gly Met Leu Asp
580 585 590
Ser Asp Leu His Leu Ser Ser Lys Ala Gln Val Phe Glu His Pro His
595 600 605
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610 615 620
Asp Ile Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys Asn Pro Ile Glu Leu Val Glu
625 630 635 640
Gly Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser Ser Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile
645 650 655
Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu Val Leu Arg Val Gly Ile His
660 665 670
Leu Cys Ile Lys Leu Lys His Thr Lys Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp
675 680 685
Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys Val Phe Thr Leu Glu Asp Phe Val
690 695 700
Gly Asp Trp Arg Gln Thr Ala Gly Tyr Asn Leu Asp Gln Val Leu Glu
705 710 715 720
Gln Gly Gly Val Ser Ser Leu Phe Gln Asn Leu Gly Val Ser Val Thr
725 730 735
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740 745 750
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Gln Ile Glu Lys Ile Phe Lys Val Val Tyr Pro Val Asp Asp His His
770 775 780
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785 790 795 800
Pro Asn Met Ile Asp Tyr Phe Gly Arg Pro Tyr Glu Gly Ile Ala Val
805 810 815
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820 825 830
Lys Ile Ile Asp Glu Arg Leu Ile Asn Pro Asp Gly Ser Leu Leu Phe
835 840 845
Arg Val Thr Ile Asn Gly Val Thr Gly Trp Arg Leu Cys Glu Arg Ile
850 855 860
Leu Ala Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
865 870
<210> 62
<211> 358
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗CD3构建体
<400> 62
Thr Met Ser Val Phe Ala Cys Phe Pro Cys Leu Gly Leu Gly Ser Cys
1 5 10 15
Trp Cys Ala Trp Cys Ser Val Leu Cys Gly Leu Met Leu Gly Asp Ile
20 25 30
Glu Val Gln Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Lys
35 40 45
Ser Leu Lys Leu Ser Cys Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr
50 55 60
Gly Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Ser Val
65 70 75 80
Ala Tyr Ile Thr Ser Ser Ser Ile Asn Ile Lys Tyr Ala Asp Ala Val
85 90 95
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100 105 110
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Ala Arg Phe Asp Trp Asp Lys Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
130 135 140
Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
145 150 155 160
Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Ala
165 170 175
Ser Leu Gly Asp Arg Val Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile
180 185 190
Ser Asn Tyr Leu Asn Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys
195 200 205
Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr Asn Lys Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg
210 215 220
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Arg Asp Ser Ser Phe Thr Ile Ser Ser
225 230 235 240
Leu Glu Ser Glu Asp Ile Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn
245 250 255
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260 265 270
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275 280 285
Glu Leu Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser Ser Ile Ala Ser
290 295 300
Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu Val Leu Arg
305 310 315 320
Val Gly Ile His Leu Cys Ile Lys Leu Lys His Thr Lys Lys Arg Gln
325 330 335
Ile Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys Glu Phe Asp Tyr
340 345 350
Lys Asp Asp Asp Asp Lys
355
<210> 63
<211> 752
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向人CEA并接合人T细胞（通过CD3）的双特异性EV
<400> 63
Thr Met Ala Val Glu Gly Gly Met Lys Cys Val Lys Phe Leu Leu Tyr
1 5 10 15
Val Leu Leu Leu Ala Phe Cys Ala Cys Ala Val Gly Leu Ile Ala Ile
20 25 30
Gly Val Ala Val Gln Val Val Leu Lys Gln Ala Ile Thr His Glu Thr
35 40 45
Thr Ala Gly Ser Leu Leu Pro Val Val Ile Ile Ala Val Gly Ala Phe
50 55 60
Leu Phe Leu Val Ala Phe Val Gly Cys Cys Gly Ala Cys Lys Glu Asn
65 70 75 80
Tyr Cys Leu Met Ile Thr Phe Ala Ile Phe Leu Ser Leu Ile Met Leu
85 90 95
Val Glu Val Ala Val Ala Ile Ala Gly Tyr Val Phe Arg Asp Gln Leu
100 105 110
Lys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Glu Val Gln Leu Val Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Lys Ser Leu Lys Leu Ser Cys
130 135 140
Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Gly Met His Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Ser Val Ala Tyr Ile Thr Ser Ser
165 170 175
Ser Ile Asn Ile Lys Tyr Ala Asp Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Val
180 185 190
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Leu Leu Phe Leu Gln Met Asn Ile Leu
195 200 205
Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Asp Trp Asp
210 215 220
Lys Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
245 250 255
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val
260 265 270
Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp
275 280 285
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr
290 295 300
Asn Lys Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
305 310 315 320
Gly Arg Asp Ser Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Ile
325 330 335
Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly
340 345 350
Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Val Lys Ser Glu Phe Asn
355 360 365
Lys Ser Phe Gln Gln Gln Met Gln Asn Tyr Leu Lys Asp Asn Lys Thr
370 375 380
Ala Glu Phe Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg
385 390 395 400
Ser Gly Thr Ser Val Lys Leu Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Asn Ile
405 410 415
Lys Asp Ser Tyr Met His Trp Leu Arg Gln Gly Pro Glu Gln Cys Leu
420 425 430
Glu Trp Ile Gly Trp Ile Asp Pro Glu Asn Gly Asp Thr Glu Tyr Ala
435 440 445
Pro Lys Phe Gln Gly Lys Ala Thr Phe Thr Thr Asp Thr Ser Ser Asn
450 455 460
Thr Ala Tyr Leu Gln Leu Ser Ser Leu Thr Ser Glu Asp Thr Ala Val
465 470 475 480
Tyr Tyr Cys Asn Glu Gly Thr Pro Thr Gly Pro Tyr Tyr Phe Asp Tyr
485 490 495
Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
500 505 510
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Asn Val Leu Thr Gln
515 520 525
Ser Pro Ala Ile Met Ser Ala Ser Pro Gly Glu Lys Val Thr Ile Thr
530 535 540
Cys Ser Ala Ser Ser Ser Val Ser Tyr Met His Trp Phe Gln Gln Lys
545 550 555 560
Pro Gly Thr Ser Pro Lys Leu Trp Ile Tyr Ser Thr Ser Asn Leu Ala
565 570 575
Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr
580 585 590
Ser Leu Thr Ile Ser Arg Met Glu Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr
595 600 605
Cys Gln Gln Arg Ser Ser Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Cys Gly Thr Lys
610 615 620
Leu Glu Leu Lys Arg His His His His His His Asp Ile Thr Ile Leu
625 630 635 640
Asp Lys Leu Gln Lys Glu Asn Asn Cys Cys Gly Ala Ser Asn Tyr Thr
645 650 655
Asp Trp Glu Asn Ile Pro Gly Met Ala Lys Asp Arg Val Pro Asp Ser
660 665 670
Cys Cys Ile Asn Ile Thr Val Gly Cys Gly Asn Asp Phe Lys Glu Ser
675 680 685
Thr Ile His Thr Gln Gly Cys Val Glu Thr Ile Ala Ile Trp Leu Arg
690 695 700
Lys Asn Ile Leu Leu Val Ala Ala Ala Ala Leu Gly Ile Ala Phe Val
705 710 715 720
Glu Val Leu Gly Ile Ile Phe Ser Cys Cys Leu Val Lys Ser Ile Arg
725 730 735
Ser Gly Tyr Glu Val Met Ser Arg Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
740 745 750
<210> 64
<211> 764
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向鼠和人FAP并接合鼠T细胞（通过CD3）的双特异性EV
<400> 64
Thr Met Ala Val Glu Gly Gly Met Lys Cys Val Lys Phe Leu Leu Tyr
1 5 10 15
Val Leu Leu Leu Ala Phe Cys Ala Cys Ala Val Gly Leu Ile Ala Ile
20 25 30
Gly Val Ala Val Gln Val Val Leu Lys Gln Ala Ile Thr His Glu Thr
35 40 45
Thr Ala Gly Ser Leu Leu Pro Val Val Ile Ile Ala Val Gly Ala Phe
50 55 60
Leu Phe Leu Val Ala Phe Val Gly Cys Cys Gly Ala Cys Lys Glu Asn
65 70 75 80
Tyr Cys Leu Met Ile Thr Phe Ala Ile Phe Leu Ser Leu Ile Met Leu
85 90 95
Val Glu Val Ala Val Ala Ile Ala Gly Tyr Val Phe Arg Asp Gln Leu
100 105 110
Lys Tyr Pro Tyr Asp Val Pro Asp Tyr Ala Glu Val Gln Leu Val Glu
115 120 125
Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Gly Lys Ser Leu Lys Leu Ser Cys
130 135 140
Glu Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Gly Tyr Gly Met His Trp Val Arg
145 150 155 160
Gln Ala Pro Gly Arg Gly Leu Glu Ser Val Ala Tyr Ile Thr Ser Ser
165 170 175
Ser Ile Asn Ile Lys Tyr Ala Asp Ala Val Lys Gly Arg Phe Thr Val
180 185 190
Ser Arg Asp Asn Ala Lys Asn Leu Leu Phe Leu Gln Met Asn Ile Leu
195 200 205
Lys Ser Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Ala Arg Phe Asp Trp Asp
210 215 220
Lys Asn Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser Gly Gly
225 230 235 240
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln
245 250 255
Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Pro Ala Ser Leu Gly Asp Arg Val
260 265 270
Thr Ile Asn Cys Gln Ala Ser Gln Asp Ile Ser Asn Tyr Leu Asn Trp
275 280 285
Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Tyr Thr
290 295 300
Asn Lys Leu Ala Asp Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
305 310 315 320
Gly Arg Asp Ser Ser Phe Thr Ile Ser Ser Leu Glu Ser Glu Asp Ile
325 330 335
Gly Ser Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr Tyr Asn Tyr Pro Trp Thr Phe Gly
340 345 350
Pro Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Gly Ser Val Lys Ser Glu Phe Asn
355 360 365
Lys Ser Phe Gln Gln Gln Met Gln Asn Tyr Leu Lys Asp Asn Lys Thr
370 375 380
Ala Glu Phe Gln Val Gln Leu Gln Glu Ser Asp Pro Gly Leu Val Lys
385 390 395 400
Pro Ser Glu Thr Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile
405 410 415
Ser Ser Asn Asn Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys
420 425 430
Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr
435 440 445
Asn Pro Ser Leu Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys
450 455 460
Asn Gln Phe Ser Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala
465 470 475 480
Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Gly Ala Arg Trp Gln Ala Arg Pro Ala Thr
485 490 495
Arg Ile Asp Gly Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val
500 505 510
Thr Val Ser Ser Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly
515 520 525
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr
530 535 540
Leu Ser Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser
545 550 555 560
Gln Ser Val Thr Arg Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly
565 570 575
Gln Ala Pro Arg Leu Leu Met Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Ala Gly
580 585 590
Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu
595 600 605
Thr Ile Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln
610 615 620
Gln Phe Gly Ser Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile
625 630 635 640
Lys His His His His His His Asp Ile Thr Ile Leu Asp Lys Leu Gln
645 650 655
Lys Glu Asn Asn Cys Cys Gly Ala Ser Asn Tyr Thr Asp Trp Glu Asn
660 665 670
Ile Pro Gly Met Ala Lys Asp Arg Val Pro Asp Ser Cys Cys Ile Asn
675 680 685
Ile Thr Val Gly Cys Gly Asn Asp Phe Lys Glu Ser Thr Ile His Thr
690 695 700
Gln Gly Cys Val Glu Thr Ile Ala Ile Trp Leu Arg Lys Asn Ile Leu
705 710 715 720
Leu Val Ala Ala Ala Ala Leu Gly Ile Ala Phe Val Glu Val Leu Gly
725 730 735
Ile Ile Phe Ser Cys Cys Leu Val Lys Ser Ile Arg Ser Gly Tyr Glu
740 745 750
Val Met Ser Arg Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
755 760
<210> 65
<211> 644
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向鼠CLEC9a的VSVG-CdaA
<400> 65
Thr Met Ser Val Phe Ala Cys Phe Pro Cys Leu Gly Leu Gly Ser Cys
1 5 10 15
Trp Cys Ala Trp Cys Ser Val Leu Cys Gly Leu Met Leu Gly Asp Ile
20 25 30
Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Val Val Lys Pro Gly Ala
35 40 45
Ser Val Lys Leu Ser Cys Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Ile Phe Thr Ser
50 55 60
Tyr Asp Ile Asp Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu Gln Gly Leu Glu Trp
65 70 75 80
Ile Gly Trp Ile Phe Pro Gly Glu Gly Ser Thr Glu Tyr Asn Glu Lys
85 90 95
Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Ser Val Asp Lys Ser Ser Ser Thr Ala
100 105 110
Tyr Met Glu Leu Thr Arg Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Phe
115 120 125
Cys Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Arg Arg Tyr Phe Asp Leu Trp Gly Gln
130 135 140
Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
145 150 155 160
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met
165 170 175
Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Thr Ser Leu Gly Asn Ser Ile Thr
180 185 190
Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Lys Gly Trp Leu Ala Trp Tyr
195 200 205
Gln Gln Lys Ser Gly Asn Ala Pro Gln Leu Leu Ile Tyr Lys Ala Ser
210 215 220
Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly
225 230 235 240
Thr Asp Tyr Ile Phe Thr Ile Ser Asn Leu Gln Pro Glu Asp Ile Ala
245 250 255
Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gln Ser Phe Pro Trp Thr Phe Gly Gly
260 265 270
Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala His His His His His His
275 280 285
Asp Ile Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys Asn Pro Ile Glu Leu Val Glu
290 295 300
Gly Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser Ser Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile
305 310 315 320
Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu Val Leu Arg Val Gly Ile His
325 330 335
Leu Cys Ile Lys Leu Lys His Thr Lys Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp
340 345 350
Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys Glu Phe Asp Phe Ser Asn Met Ser
355 360 365
Ile Leu His Tyr Leu Ala Asn Ile Val Asp Ile Leu Val Val Trp Phe
370 375 380
Val Ile Tyr Lys Val Ile Met Leu Ile Arg Gly Thr Lys Ala Val Gln
385 390 395 400
Leu Leu Lys Gly Ile Phe Ile Ile Ile Ala Val Lys Leu Leu Ser Gly
405 410 415
Phe Phe Gly Leu Gln Thr Val Glu Trp Ile Thr Asp Gln Met Leu Thr
420 425 430
Trp Gly Phe Leu Ala Ile Ile Ile Ile Phe Gln Pro Glu Leu Arg Arg
435 440 445
Ala Leu Glu Thr Leu Gly Arg Gly Asn Ile Phe Thr Arg Tyr Gly Ser
450 455 460
Arg Ile Glu Arg Glu Gln His His Leu Ile Glu Ser Ile Glu Lys Ser
465 470 475 480
Thr Gln Tyr Met Ala Lys Arg Arg Ile Gly Ala Leu Ile Ser Val Ala
485 490 495
Arg Asp Thr Gly Met Asp Asp Tyr Ile Glu Thr Gly Ile Pro Leu Asn
500 505 510
Ala Lys Ile Ser Ser Gln Leu Leu Ile Asn Ile Phe Ile Pro Asn Thr
515 520 525
Pro Leu His Asp Gly Ala Val Ile Ile Lys Gly Asn Glu Ile Ala Ser
530 535 540
Ala Ala Ser Tyr Leu Pro Leu Ser Asp Ser Pro Phe Leu Ser Lys Glu
545 550 555 560
Leu Gly Thr Arg His Arg Ala Ala Leu Gly Ile Ser Glu Val Thr Asp
565 570 575
Ser Ile Thr Ile Val Val Ser Glu Glu Thr Gly Gly Ile Ser Leu Thr
580 585 590
Lys Gly Gly Glu Leu Phe Arg Asp Val Ser Glu Glu Glu Leu His Lys
595 600 605
Ile Leu Leu Lys Glu Leu Val Thr Val Thr Ala Lys Lys Pro Ser Ile
610 615 620
Phe Ser Lys Trp Lys Gly Gly Lys Ser Glu Glu Phe Asp Tyr Lys Asp
625 630 635 640
Asp Asp Asp Lys
<210> 66
<211> 603
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向鼠CLEC9a的VSVG-mCherry
<400> 66
Thr Met Ser Val Phe Ala Cys Phe Pro Cys Leu Gly Leu Gly Ser Cys
1 5 10 15
Trp Cys Ala Trp Cys Ser Val Leu Cys Gly Leu Met Leu Gly Asp Ile
20 25 30
Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Pro Ser Ser Gln Ala Val Ser Ala Gly
35 40 45
Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Val Leu Tyr Asp
50 55 60
Glu Asn Lys Lys Asn Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Gln
65 70 75 80
Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Gly Glu Ser Gly Val
85 90 95
Pro Asp Arg Phe Ile Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr
100 105 110
Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln
115 120 125
Tyr Tyr Asp Phe Pro Pro Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Gly Gly Ser
130 135 140
Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Gln
145 150 155 160
Ile Val Glu Ser Gly Gly Gly Leu Val Gln Pro Lys Glu Ser Leu Lys
165 170 175
Ile Ser Cys Thr Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Asn Ala Ala Ile Tyr
180 185 190
Trp Val Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val Gly Arg Ile
195 200 205
Arg Thr Arg Pro Ser Lys Tyr Ala Thr Asp Tyr Ala Asp Ser Val Arg
210 215 220
Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asp Ser Lys Ser Met Val Tyr Leu
225 230 235 240
Gln Met Asp Asn Leu Arg Thr Glu Asp Thr Ala Met Tyr Tyr Cys Thr
245 250 255
Pro Arg Ala Thr Glu Asp Val Pro Phe Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met
260 265 270
Val Thr Val Ser Ser His His His His His His Asp Ile Gly Asp Thr
275 280 285
Gly Leu Ser Lys Asn Pro Ile Glu Leu Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser
290 295 300
Trp Lys Ser Ser Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile
305 310 315 320
Gly Leu Phe Leu Val Leu Arg Val Gly Ile His Leu Cys Ile Lys Leu
325 330 335
Lys His Thr Lys Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg
340 345 350
Leu Gly Lys Glu Phe Met Val Ser Lys Gly Glu Glu Asp Asn Met Ala
355 360 365
Ile Ile Lys Glu Phe Met Arg Phe Lys Val His Met Glu Gly Ser Val
370 375 380
Asn Gly His Glu Phe Glu Ile Glu Gly Glu Gly Glu Gly Arg Pro Tyr
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<220>
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<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向鼠DEC205的mCD63-CdaA
<400> 72
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Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
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Ala Ala Ala Leu Gly Ile Ala Phe Val Glu Val Leu Gly Ile Ile Phe
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Leu Ile Arg Gly Thr Lys Ala Val Gln Leu Leu Lys Gly Ile Phe Ile
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Thr Ile Glu Leu Cys Val Gly Asp Pro Glu Ile Lys Lys Thr Ser Phe
530 535 540
Lys Gly Asp Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Asn Lys Val Ala Gln Gly
545 550 555 560
Ile Val Ser Tyr Gly Lys Asn Asn Gly Met Pro Pro Arg Ala Cys Thr
565 570 575
Lys Val Ser Ser Phe Val His Trp Ile Lys Lys Thr Met Lys Arg Tyr
580 585 590
Glu Phe Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
595 600
<210> 84
<211> 768
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗FAP-VSVG-白喉毒素
<400> 84
Met Ser Val Phe Ala Cys Phe Pro Cys Leu Gly Leu Gly Ser Cys Trp
1 5 10 15
Cys Ala Trp Cys Ser Val Leu Cys Gly Leu Met Leu Gly Asp Ile Gln
20 25 30
Val Gln Leu Gln Glu Ser Asp Pro Gly Leu Val Lys Pro Ser Glu Thr
35 40 45
Leu Ser Leu Thr Cys Thr Val Ser Gly Gly Ser Ile Ser Ser Asn Asn
50 55 60
Tyr Tyr Trp Gly Trp Ile Arg Gln Thr Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp
65 70 75 80
Ile Gly Ser Ile Tyr Tyr Ser Gly Ser Thr Asn Tyr Asn Pro Ser Leu
85 90 95
Lys Ser Arg Val Thr Ile Ser Val Asp Thr Ser Lys Asn Gln Phe Ser
100 105 110
Leu Lys Leu Ser Ser Val Thr Ala Ala Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
115 120 125
Ala Arg Gly Ala Arg Trp Gln Ala Arg Pro Ala Thr Arg Ile Asp Gly
130 135 140
Val Ala Phe Asp Ile Trp Gly Gln Gly Thr Met Val Thr Val Ser Ser
145 150 155 160
Gly Gly Ser Ser Arg Ser Ser Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
165 170 175
Gly Gly Glu Thr Thr Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser Leu Ser
180 185 190
Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser Val Thr
195 200 205
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210 215 220
Leu Leu Met Tyr Gly Ala Ser Asn Arg Ala Ala Gly Val Pro Asp Arg
225 230 235 240
Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Arg
245 250 255
Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Phe Gly Ser
260 265 270
Pro Tyr Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys His His His
275 280 285
His His His Asp Ile Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys Asn Pro Ile Glu
290 295 300
Leu Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser Ser Ile Ala Ser Phe
305 310 315 320
Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu Val Leu Arg Val
325 330 335
Gly Ile His Leu Cys Ile Lys Leu Lys His Thr Lys Lys Arg Gln Ile
340 345 350
Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys Glu Phe Met Gly Ala
355 360 365
Asp Asp Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser
370 375 380
Ser Tyr His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly
385 390 395 400
Ile Gln Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp
405 410 415
Lys Gly Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser
420 425 430
Val Asp Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys
435 440 445
Val Thr Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn
450 455 460
Ala Glu Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu
465 470 475 480
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485 490 495
Ala Ser Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser
500 505 510
Val Glu Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu
515 520 525
Leu Glu Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met
530 535 540
Tyr Glu Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser
545 550 555 560
Val Gly Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg
565 570 575
Asp Lys Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile
580 585 590
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595 600 605
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610 615 620
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625 630 635 640
Gly Ala Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp
645 650 655
Ser Glu Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile
660 665 670
Leu Pro Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His
675 680 685
His Asn Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu
690 695 700
Met Val Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly
705 710 715 720
Phe Ala Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val
725 730 735
Val His Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr
740 745 750
Gln Pro Met His Glu Phe Glu Phe Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
755 760 765
<210> 85
<211> 631
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAIL-VSVG-白喉毒素
<400> 85
Thr Met Ser Val Phe Ala Cys Phe Pro Cys Leu Gly Leu Gly Ser Cys
1 5 10 15
Trp Cys Ala Trp Cys Ser Val Leu Cys Gly Leu Met Leu Gly Asp Ile
20 25 30
Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys Val
35 40 45
Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala Val
50 55 60
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65 70 75 80
Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr Trp
85 90 95
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100 105 110
Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser Glu
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Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys
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180 185 190
Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His
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260 265 270
Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe
275 280 285
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Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly His His His His His His Asp Ile
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Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys Asn Pro Ile Glu Leu Val Glu Gly Trp
325 330 335
Phe Ser Ser Trp Lys Ser Ser Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly
340 345 350
Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu Val Leu Arg Val Gly Ile His Leu Cys
355 360 365
Ile Lys Leu Lys His Thr Lys Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp Ile Glu
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435 440 445
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Gly Asp Val Cys Tyr Val Ala Gly Trp Gly Arg Met Ala Pro Met Gly
515 520 525
Lys Tyr Ser Asn Thr Leu Gln Glu Val Glu Leu Thr Val Gln Lys Asp
530 535 540
Arg Glu Cys Glu Ser Tyr Phe Lys Asn Arg Tyr Asn Lys Thr Asn Gln
545 550 555 560
Ile Cys Ala Gly Asp Pro Lys Thr Lys Arg Ala Ser Phe Arg Gly Asp
565 570 575
Ser Gly Gly Pro Leu Val Cys Lys Lys Val Ala Ala Gly Ile Val Ser
580 585 590
Tyr Gly Tyr Lys Asp Gly Ser Pro Pro Arg Ala Phe Thr Lys Val Asn
595 600 605
Ser Phe Leu Ser Trp Ile Lys Lys Thr Met Lys Ser Ser Glu Phe Asp
610 615 620
Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
625 630
<210> 86
<211> 629
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAIL-VSVG-白喉毒素2
<400> 86
Thr Met Ser Val Phe Ala Cys Phe Pro Cys Leu Gly Leu Gly Ser Cys
1 5 10 15
Trp Cys Ala Trp Cys Ser Val Leu Cys Gly Leu Met Leu Gly Asp Ile
20 25 30
Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys Val
35 40 45
Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala Val
50 55 60
Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys Tyr
65 70 75 80
Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr Trp
85 90 95
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100 105 110
Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser Glu
115 120 125
Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro Leu
130 135 140
Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr
145 150 155 160
Arg Gly Arg Ser Asn Thr Leu Ser Ser Pro Asn Ser Lys Asn Glu Lys
165 170 175
Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His
180 185 190
Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His
195 200 205
Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln
210 215 220
Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr
225 230 235 240
Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser
245 250 255
Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser
260 265 270
Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe
275 280 285
Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser
290 295 300
Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly His His His His His His Asp Ile
305 310 315 320
Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys Asn Pro Ile Glu Leu Val Glu Gly Trp
325 330 335
Phe Ser Ser Trp Lys Ser Ser Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly
340 345 350
Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu Val Leu Arg Val Gly Ile His Leu Cys
355 360 365
Ile Lys Leu Lys His Thr Lys Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp Ile Glu
370 375 380
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405 410 415
Ser Leu Lys Arg Cys Gly Gly Phe Leu Ile Arg Asp Asp Phe Val Leu
420 425 430
Thr Ala Ala His Cys Trp Gly Ser Ser Ile Asn Val Thr Leu Gly Ala
435 440 445
His Asn Ile Lys Glu Gln Glu Pro Thr Gln Gln Phe Ile Pro Val Lys
450 455 460
Arg Pro Ile Pro His Pro Ala Tyr Asn Pro Lys Asn Phe Ser Asn Asp
465 470 475 480
Ile Met Leu Leu Gln Leu Glu Arg Lys Ala Lys Arg Thr Arg Ala Val
485 490 495
Gln Pro Leu Arg Leu Pro Ser Asn Lys Ala Gln Val Lys Pro Gly Gln
500 505 510
Thr Cys Ser Val Ala Gly Trp Gly Gln Thr Ala Pro Leu Gly Lys His
515 520 525
Ser His Thr Leu Gln Glu Val Lys Met Thr Val Gln Glu Asp Arg Lys
530 535 540
Cys Glu Ser Asp Leu Arg His Tyr Tyr Asp Ser Thr Ile Glu Leu Cys
545 550 555 560
Val Gly Asp Pro Glu Ile Lys Lys Thr Ser Phe Lys Gly Asp Ser Gly
565 570 575
Gly Pro Leu Val Cys Asn Lys Val Ala Gln Gly Ile Val Ser Tyr Gly
580 585 590
Lys Asn Asn Gly Met Pro Pro Arg Ala Cys Thr Lys Val Ser Ser Phe
595 600 605
Val His Trp Ile Lys Lys Thr Met Lys Arg Tyr Glu Phe Asp Tyr Lys
610 615 620
Asp Asp Asp Asp Lys
625
<210> 87
<211> 795
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> TRAIL-VSVG-白喉毒素3
<400> 87
Thr Met Ser Val Phe Ala Cys Phe Pro Cys Leu Gly Leu Gly Ser Cys
1 5 10 15
Trp Cys Ala Trp Cys Ser Val Leu Cys Gly Leu Met Leu Gly Asp Ile
20 25 30
Ala Met Met Glu Val Gln Gly Gly Pro Ser Leu Gly Gln Thr Cys Val
35 40 45
Leu Ile Val Ile Phe Thr Val Leu Leu Gln Ser Leu Cys Val Ala Val
50 55 60
Thr Tyr Val Tyr Phe Thr Asn Glu Leu Lys Gln Met Gln Asp Lys Tyr
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Ser Lys Ser Gly Ile Ala Cys Phe Leu Lys Glu Asp Asp Ser Tyr Trp
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Asp Pro Asn Asp Glu Glu Ser Met Asn Ser Pro Cys Trp Gln Val Lys
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Trp Gln Leu Arg Gln Leu Val Arg Lys Met Ile Leu Arg Thr Ser Glu
115 120 125
Glu Thr Ile Ser Thr Val Gln Glu Lys Gln Gln Asn Ile Ser Pro Leu
130 135 140
Val Arg Glu Arg Gly Pro Gln Arg Val Ala Ala His Ile Thr Gly Thr
145 150 155 160
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165 170 175
Ala Leu Gly Arg Lys Ile Asn Ser Trp Glu Ser Ser Arg Ser Gly His
180 185 190
Ser Phe Leu Ser Asn Leu His Leu Arg Asn Gly Glu Leu Val Ile His
195 200 205
Glu Lys Gly Phe Tyr Tyr Ile Tyr Ser Gln Thr Tyr Phe Arg Phe Gln
210 215 220
Glu Glu Ile Lys Glu Asn Thr Lys Asn Asp Lys Gln Met Val Gln Tyr
225 230 235 240
Ile Tyr Lys Tyr Thr Ser Tyr Pro Asp Pro Ile Leu Leu Met Lys Ser
245 250 255
Ala Arg Asn Ser Cys Trp Ser Lys Asp Ala Glu Tyr Gly Leu Tyr Ser
260 265 270
Ile Tyr Gln Gly Gly Ile Phe Glu Leu Lys Glu Asn Asp Arg Ile Phe
275 280 285
Val Ser Val Thr Asn Glu His Leu Ile Asp Met Asp His Glu Ala Ser
290 295 300
Phe Phe Gly Ala Phe Leu Val Gly His His His His His His Asp Ile
305 310 315 320
Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys Asn Pro Ile Glu Leu Val Glu Gly Trp
325 330 335
Phe Ser Ser Trp Lys Ser Ser Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly
340 345 350
Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu Val Leu Arg Val Gly Ile His Leu Cys
355 360 365
Ile Lys Leu Lys His Thr Lys Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp Ile Glu
370 375 380
Met Asn Arg Leu Gly Lys Glu Phe Met Gly Ala Asp Asp Val Val Asp
385 390 395 400
Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr His Gly Thr
405 410 415
Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln Lys Pro Lys
420 425 430
Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly Phe Tyr Ser
435 440 445
Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp Asn Glu Asn
450 455 460
Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr Tyr Pro Gly
465 470 475 480
Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu Thr Ile Lys
485 490 495
Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu Gln Val Gly
500 505 510
Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser Arg Val Val
515 520 525
Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu Tyr Ile Asn
530 535 540
Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu Ile Asn Phe
545 550 555 560
Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu Tyr Met Ala
565 570 575
Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly Ser Ser Leu
580 585 590
Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys Thr Lys Thr
595 600 605
Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn Lys Met Ser
610 615 620
Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys Gln Tyr Leu
625 630 635 640
Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu Ser Glu Leu
645 650 655
Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala Asn Tyr Ala
660 665 670
Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu Thr Ala Asp
675 680 685
Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro Gly Ile Gly
690 695 700
Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn Thr Glu Glu
705 710 715 720
Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val Ala Gln Ala
725 730 735
Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala Ala Tyr Asn
740 745 750
Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His Asn Ser Tyr
755 760 765
Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Gln Pro Met His Glu
770 775 780
Phe Glu Phe Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
785 790 795
<210> 88
<211> 776
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向人CTLA4的VSVG-白喉毒素
<400> 88
Thr Met Ser Val Phe Ala Cys Phe Pro Cys Leu Gly Leu Gly Ser Cys
1 5 10 15
Trp Cys Ala Trp Cys Ser Val Leu Cys Gly Leu Met Leu Gly Asp Ile
20 25 30
Ile Arg Arg Ala Asp Ile Val Leu Thr Gln Ser Pro Gly Thr Leu Ser
35 40 45
Leu Ser Pro Gly Glu Arg Ala Thr Leu Ser Cys Arg Ala Ser Gln Ser
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Val Gly Ser Ser Tyr Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln Ala
65 70 75 80
Pro Arg Leu Leu Ile Tyr Gly Ala Phe Ser Arg Ala Thr Gly Ile Pro
85 90 95
Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile
100 105 110
Ser Arg Leu Glu Pro Glu Asp Phe Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Gln Tyr
115 120 125
Gly Ser Ser Pro Trp Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Val Glu Ile Lys
130 135 140
Arg Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
145 150 155 160
Glu Ala Lys Leu Val Glu Ser Gly Gly Gly Val Val Gln Pro Gly Arg
165 170 175
Ser Leu Arg Leu Ser Cys Ala Ala Ser Gly Phe Thr Phe Ser Ser Tyr
180 185 190
Thr Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Lys Gly Leu Glu Trp Val
195 200 205
Thr Phe Ile Ser Tyr Asp Gly Asn Asn Lys Tyr Tyr Ala Asp Ser Val
210 215 220
Lys Gly Arg Phe Thr Ile Ser Arg Asp Asn Ser Lys Asn Thr Leu Tyr
225 230 235 240
Leu Gln Met Asn Ser Leu Arg Ala Glu Asp Thr Ala Ile Tyr Tyr Cys
245 250 255
Ala Arg Thr Gly Trp Leu Gly Pro Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr
260 265 270
Leu Val Thr Val Ser Thr Ala Lys Thr Thr Pro Pro Ser Val Tyr Pro
275 280 285
Leu Ala Pro Arg Ser His His His His His His Asp Ile Gly Asp Thr
290 295 300
Gly Leu Ser Lys Asn Pro Ile Glu Leu Val Glu Gly Trp Phe Ser Ser
305 310 315 320
Trp Lys Ser Ser Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu Ile Ile
325 330 335
Gly Leu Phe Leu Val Leu Arg Val Gly Ile His Leu Cys Ile Lys Leu
340 345 350
Lys His Thr Lys Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp Ile Glu Met Asn Arg
355 360 365
Leu Gly Lys Glu Phe Arg Ala Arg Tyr Lys Arg Met Gly Ala Asp Asp
370 375 380
Val Val Asp Ser Ser Lys Ser Phe Val Met Glu Asn Phe Ser Ser Tyr
385 390 395 400
His Gly Thr Lys Pro Gly Tyr Val Asp Ser Ile Gln Lys Gly Ile Gln
405 410 415
Lys Pro Lys Ser Gly Thr Gln Gly Asn Tyr Asp Asp Asp Trp Lys Gly
420 425 430
Phe Tyr Ser Thr Asp Asn Lys Tyr Asp Ala Ala Gly Tyr Ser Val Asp
435 440 445
Asn Glu Asn Pro Leu Ser Gly Lys Ala Gly Gly Val Val Lys Val Thr
450 455 460
Tyr Pro Gly Leu Thr Lys Val Leu Ala Leu Lys Val Asp Asn Ala Glu
465 470 475 480
Thr Ile Lys Lys Glu Leu Gly Leu Ser Leu Thr Glu Pro Leu Met Glu
485 490 495
Gln Val Gly Thr Glu Glu Phe Ile Lys Arg Phe Gly Asp Gly Ala Ser
500 505 510
Arg Val Val Leu Ser Leu Pro Phe Ala Glu Gly Ser Ser Ser Val Glu
515 520 525
Tyr Ile Asn Asn Trp Glu Gln Ala Lys Ala Leu Ser Val Glu Leu Glu
530 535 540
Ile Asn Phe Glu Thr Arg Gly Lys Arg Gly Gln Asp Ala Met Tyr Glu
545 550 555 560
Tyr Met Ala Gln Ala Cys Ala Gly Asn Arg Val Arg Arg Ser Val Gly
565 570 575
Ser Ser Leu Ser Cys Ile Asn Leu Asp Trp Asp Val Ile Arg Asp Lys
580 585 590
Thr Lys Thr Lys Ile Glu Ser Leu Lys Glu His Gly Pro Ile Lys Asn
595 600 605
Lys Met Ser Glu Ser Pro Asn Lys Thr Val Ser Glu Glu Lys Ala Lys
610 615 620
Gln Tyr Leu Glu Glu Phe His Gln Thr Ala Leu Glu His Pro Glu Leu
625 630 635 640
Ser Glu Leu Lys Thr Val Thr Gly Thr Asn Pro Val Phe Ala Gly Ala
645 650 655
Asn Tyr Ala Ala Trp Ala Val Asn Val Ala Gln Val Ile Asp Ser Glu
660 665 670
Thr Ala Asp Asn Leu Glu Lys Thr Thr Ala Ala Leu Ser Ile Leu Pro
675 680 685
Gly Ile Gly Ser Val Met Gly Ile Ala Asp Gly Ala Val His His Asn
690 695 700
Thr Glu Glu Ile Val Ala Gln Ser Ile Ala Leu Ser Ser Leu Met Val
705 710 715 720
Ala Gln Ala Ile Pro Leu Val Gly Glu Leu Val Asp Ile Gly Phe Ala
725 730 735
Ala Tyr Asn Phe Val Glu Ser Ile Ile Asn Leu Phe Gln Val Val His
740 745 750
Asn Ser Tyr Asn Arg Pro Ala Tyr Ser Pro Gly His Lys Thr Glu Phe
755 760 765
Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
770 775
<210> 89
<211> 799
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 靶向鼠CTLA4的VSVG-白喉毒素
<400> 89
Thr Met Ser Val Phe Ala Cys Phe Pro Cys Leu Gly Leu Gly Ser Cys
1 5 10 15
Trp Cys Ala Trp Cys Ser Val Leu Cys Gly Leu Met Leu Gly Asp Ile
20 25 30
Met Glu Thr Asp Thr Leu Leu Leu Trp Val Leu Leu Leu Trp Val Pro
35 40 45
Gly Ser Thr Gly Ile Arg Arg Ala Asp Ile Val Met Thr Gln Thr Thr
50 55 60
Leu Ser Leu Pro Val Ser Leu Gly Asp Gln Ala Ser Ile Ser Cys Arg
65 70 75 80
Ser Ser Gln Ser Ile Val His Ser Asn Gly Asn Thr Tyr Leu Glu Trp
85 90 95
Tyr Leu Gln Lys Pro Gly Gln Ser Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Lys Val
100 105 110
Ser Asn Arg Phe Ser Gly Val Pro Asp Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser
115 120 125
Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile Ser Arg Val Glu Ala Glu Asp Leu
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Gly Val Tyr Tyr Cys Phe Gln Gly Ser His Val Pro Tyr Thr Phe Gly
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Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Glu Ala Lys Leu Gln Glu Ser Gly
180 185 190
Pro Val Leu Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Met Ser Cys Lys Ala
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Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asp Tyr Tyr Met Asn Trp Val Lys Gln Ser
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<223> 抗CD19+抗CD20-CD63- Nanoluc
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820 825 830
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<223> 抗mCTLA4- VSVG-mCherry
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Lys Asn Ala Lys Ile Ser Ser His Thr Ile Cys Thr Lys Asn Ser Ser
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<220>
<223> 抗MARCO-SARS-2刺突TMD-CdaA
<400> 106
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100 105 110
Ser Gly Thr Thr Asn Phe Asn Glu Lys Phe Lys Gly Lys Ala Thr Leu
115 120 125
Thr Val Asp Lys Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu
130 135 140
Thr Ser Glu Asp Ser Ala Ile Tyr Tyr Cys Thr Arg Cys Arg Tyr Thr
145 150 155 160
Thr Gly Val His Tyr Phe Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Val Met Val Thr
165 170 175
Val Ser Ser Ala Glu Thr Thr Ala Pro Ser Val Tyr Pro Leu Ala Pro
180 185 190
Gly Thr Ala Leu Lys Ser Asn Ser Met Val Thr Leu Gly Cys Leu Val
195 200 205
Lys Gly Tyr Phe Pro Glu Pro Val Thr Val Thr Trp Asn Ser Gly Ala
210 215 220
Leu Ser Ser Gly Val His Thr Phe Pro Ala Val Leu Gln Ser Gly Leu
225 230 235 240
Tyr Thr Leu Thr Ser Ser Val Thr Val Pro Ser Ser Thr Trp Pro Ser
245 250 255
Gln Thr Val Thr Cys Asn Val Ala His Pro Ala Ser Ser Thr Lys Val
260 265 270
Asp Lys Lys Ile Glu Lys Gly Glu Phe Ala Thr Tyr Met Ala Ala Gly
275 280 285
Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
290 295 300
Gly Gly Val Ile Pro Leu Leu Ile Ser Ser Pro Gln Asn Asp Glu Ser
305 310 315 320
Cys Gln Ser Leu Phe Leu Leu Leu Leu Trp Ile Leu Gly Thr Lys Gly
325 330 335
Asp Val Val Leu Thr Gln Thr Pro Ser Ile Leu Ser Val Thr Ile Gly
340 345 350
Gln Ser Val Ser Ile Ser Cys Arg Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asp Ser
355 360 365
Asp Gly Asn Ser Tyr Leu Tyr Trp Phe Leu Gln Arg Pro Gly Gln Ser
370 375 380
Pro Gln Arg Leu Ile Tyr Leu Val Ser Asn Leu Gly Ser Gly Val Pro
385 390 395 400
Asn Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Lys Ile
405 410 415
Ser Gly Val Glu Ala Glu Asp Leu Gly Val Tyr Tyr Cys Met Gln Ala
420 425 430
Thr His Ala Pro Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Leu Lys
435 440 445
Arg Ala Asp Ala Ala Pro Thr Val Ser Ile Phe Pro Pro Ser Thr Glu
450 455 460
Gln Leu Ala Thr Gly Gly Ala Ser Val Val Cys Leu Met Asn Asn Phe
465 470 475 480
Tyr Pro Arg Asp Ile Ser Val Lys Trp Lys Ile Asp Gly Thr Glu Arg
485 490 495
Arg Asp Gly Val Leu Asp Ser Val Thr Asp Gln Asp Ser Lys Asp Ser
500 505 510
Thr Tyr Ser Met Ser Ser Thr Leu Ser Leu Thr Lys Ala Asp Tyr Glu
515 520 525
Ser His Asn Leu Tyr Thr Cys Glu Val Val His Lys His His Pro His
530 535 540
Pro Gly Arg Ile Pro Ala Thr Gly Ala Tyr Gly Gly Gly Gly Gly Gly
545 550 555 560
Trp Pro Trp Tyr Ile Trp Leu Gly Phe Ile Ala Gly Leu Ile Ala Ile
565 570 575
Val Met Val Thr Ile Met Leu Cys Cys Met Thr Ser Cys Cys Ser Cys
580 585 590
Leu Lys Gly Cys Cys Ser Cys Gly Ser Cys Cys Lys Phe Asp Glu Asp
595 600 605
Asp Ser Glu Pro Val Leu Lys Gly Val Lys Leu His Tyr Thr Gly Gly
610 615 620
Gly Gly Met Asp Phe Ser Asn Met Ser Ile Leu His Tyr Leu Ala Asn
625 630 635 640
Ile Val Asp Ile Leu Val Val Trp Phe Val Ile Tyr Lys Val Ile Met
645 650 655
Leu Ile Arg Gly Thr Lys Ala Val Gln Leu Leu Lys Gly Ile Phe Ile
660 665 670
Ile Ile Ala Val Lys Leu Leu Ser Gly Phe Phe Gly Leu Gln Thr Val
675 680 685
Glu Trp Ile Thr Asp Gln Met Leu Thr Trp Gly Phe Leu Ala Ile Ile
690 695 700
Ile Ile Phe Gln Pro Glu Leu Arg Arg Ala Leu Glu Thr Leu Gly Arg
705 710 715 720
Gly Asn Ile Phe Thr Arg Tyr Gly Ser Arg Ile Glu Arg Glu Gln His
725 730 735
His Leu Ile Glu Ser Ile Glu Lys Ser Thr Gln Tyr Met Ala Lys Arg
740 745 750
Arg Ile Gly Ala Leu Ile Ser Val Ala Arg Asp Thr Gly Met Asp Asp
755 760 765
Tyr Ile Glu Thr Gly Ile Pro Leu Asn Ala Lys Ile Ser Ser Gln Leu
770 775 780
Leu Ile Asn Ile Phe Ile Pro Asn Thr Pro Leu His Asp Gly Ala Val
785 790 795 800
Ile Ile Lys Gly Asn Glu Ile Ala Ser Ala Ala Ser Tyr Leu Pro Leu
805 810 815
Ser Asp Ser Pro Phe Leu Ser Lys Glu Leu Gly Thr Arg His Arg Ala
820 825 830
Ala Leu Gly Ile Ser Glu Val Thr Asp Ser Ile Thr Ile Val Val Ser
835 840 845
Glu Glu Thr Gly Gly Ile Ser Leu Thr Lys Gly Gly Glu Leu Phe Arg
850 855 860
Asp Val Ser Glu Glu Glu Leu His Lys Ile Leu Leu Lys Glu Leu Val
865 870 875 880
Thr Val Thr Ala Lys Lys Pro Ser Ile Phe Ser Lys Trp Lys Gly Gly
885 890 895
Lys Ser Glu Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
900 905
<210> 107
<211> 611
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗Langerin-VSVG-CdaA
<400> 107
Met Arg Arg Met Gln Leu Leu Leu Leu Ile Ala Leu Ser Leu Ala Leu
1 5 10 15
Val Thr Asn Ser Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala Ser Val Thr Leu
20 25 30
Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Ile Asp His Asp Met His Trp
35 40 45
Val Gln Gln Thr Pro Val Tyr Gly Leu Glu Trp Ile Gly Ala Ile Asp
50 55 60
Pro Glu Thr Gly Asp Thr Gly Tyr Asn Gln Lys Phe Lys Gly Lys Ala
65 70 75 80
Ile Leu Thr Ala Asp Lys Ser Ser Arg Thr Ala Tyr Met Glu Leu Arg
85 90 95
Ser Leu Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Ile Pro Phe
100 105 110
Tyr Tyr Ser Asn Tyr Ser Pro Phe Ala Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Leu
115 120 125
Val Thr Val Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
130 135 140
Gly Gly Ser Ile Val Leu Ser Gln Ser Pro Ala Ile Leu Ser Ala Ser
145 150 155 160
Pro Gly Glu Lys Val Thr Met Thr Cys Arg Ala Ser Ser Ser Val Ser
165 170 175
Tyr Met His Trp Tyr Gln Arg Lys Pro Gly Ser Ser Pro Lys Pro Trp
180 185 190
Ile Tyr Ala Thr Ser Asn Leu Ala Ser Gly Val Pro Ala Arg Phe Ser
195 200 205
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Ser Tyr Ser Leu Thr Ile Ser Arg Val Glu
210 215 220
Ala Glu Asp Ala Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Gln Trp Ser Ser Asn Pro
225 230 235 240
Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Leu Gly Gly Gly Gly Gly
245 250 255
Asp Thr Gly Leu Ser Lys Asn Pro Ile Glu Leu Val Glu Gly Trp Phe
260 265 270
Ser Ser Trp Lys Ser Ser Ile Ala Ser Phe Phe Phe Ile Ile Gly Leu
275 280 285
Ile Ile Gly Leu Phe Leu Val Leu Arg Val Gly Ile His Leu Cys Ile
290 295 300
Lys Leu Lys His Thr Lys Lys Arg Gln Ile Tyr Thr Asp Ile Glu Met
305 310 315 320
Asn Arg Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Met Asp Phe Ser Asn Met
325 330 335
Ser Ile Leu His Tyr Leu Ala Asn Ile Val Asp Ile Leu Val Val Trp
340 345 350
Phe Val Ile Tyr Lys Val Ile Met Leu Ile Arg Gly Thr Lys Ala Val
355 360 365
Gln Leu Leu Lys Gly Ile Phe Ile Ile Ile Ala Val Lys Leu Leu Ser
370 375 380
Gly Phe Phe Gly Leu Gln Thr Val Glu Trp Ile Thr Asp Gln Met Leu
385 390 395 400
Thr Trp Gly Phe Leu Ala Ile Ile Ile Ile Phe Gln Pro Glu Leu Arg
405 410 415
Arg Ala Leu Glu Thr Leu Gly Arg Gly Asn Ile Phe Thr Arg Tyr Gly
420 425 430
Ser Arg Ile Glu Arg Glu Gln His His Leu Ile Glu Ser Ile Glu Lys
435 440 445
Ser Thr Gln Tyr Met Ala Lys Arg Arg Ile Gly Ala Leu Ile Ser Val
450 455 460
Ala Arg Asp Thr Gly Met Asp Asp Tyr Ile Glu Thr Gly Ile Pro Leu
465 470 475 480
Asn Ala Lys Ile Ser Ser Gln Leu Leu Ile Asn Ile Phe Ile Pro Asn
485 490 495
Thr Pro Leu His Asp Gly Ala Val Ile Ile Lys Gly Asn Glu Ile Ala
500 505 510
Ser Ala Ala Ser Tyr Leu Pro Leu Ser Asp Ser Pro Phe Leu Ser Lys
515 520 525
Glu Leu Gly Thr Arg His Arg Ala Ala Leu Gly Ile Ser Glu Val Thr
530 535 540
Asp Ser Ile Thr Ile Val Val Ser Glu Glu Thr Gly Gly Ile Ser Leu
545 550 555 560
Thr Lys Gly Gly Glu Leu Phe Arg Asp Val Ser Glu Glu Glu Leu His
565 570 575
Lys Ile Leu Leu Lys Glu Leu Val Thr Val Thr Ala Lys Lys Pro Ser
580 585 590
Ile Phe Ser Lys Trp Lys Gly Gly Lys Ser Glu Asp Tyr Lys Asp Asp
595 600 605
Asp Asp Lys
610
<210> 108
<211> 525
<212> PRT
<213> 人工序列
<220>
<223> 抗mDEC205-VSVG-GsPCA催化结构域
<400> 108
Met Ala Gln Val Lys Leu Gln Glu Ser Gly Thr Glu Leu Ala Lys Pro
1 5 10 15
Gly Ala Ala Val Lys Glu Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Thr Glu Val
20 25 30
Val Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Leu Ser Cys Cys Lys Ala Ser Gly
35 40 45
Tyr Ile Phe Thr Ser Tyr Asp Ile Asp Trp Val Arg Gln Thr Pro Glu
50 55 60
Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Trp Ile Phe Pro Gly Glu Gly Ser Thr
65 70 75 80
Glu Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Ala Thr Leu Ser Val Asp Lys
85 90 95
Ser Ser Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Thr Arg Leu Thr Ser Glu Asp
100 105 110
Ser Ala Val Tyr Phe Cys Ala Arg Gly Asp Tyr Tyr Arg Arg Tyr Phe
115 120 125
Asp Leu Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
145 150 155 160
Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Phe Leu Ser Thr Ser Leu
165 170 175
Gly Asn Ser Ile Thr Ile Thr Cys His Ala Ser Gln Asn Ile Lys Gly
180 185 190
Trp Leu Ala Trp Tyr Gln Gln Lys Ser Gly Asn Ala Pro Gln Leu Leu
195 200 205
Ile Tyr Lys Ala Ser Ser Leu Gln Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser
210 215 220
Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Tyr Ile Phe Thr Ile Ser Asn Leu Gln
225 230 235 240
Pro Glu Asp Ile Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln His Tyr Gln Ser Phe Pro
245 250 255
Trp Thr Phe Gly Gly Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Arg Ala Ala Gly
260 265 270
Gly Gly Gly Gly Asp Thr Gly Leu Ser Lys Asn Pro Ile Glu Leu Val
275 280 285
Glu Gly Trp Phe Ser Ser Trp Lys Ser Ser Ile Ala Ser Phe Phe Phe
290 295 300
Ile Ile Gly Leu Ile Ile Gly Leu Phe Leu Val Leu Arg Val Gly Ile
305 310 315 320
His Leu Cys Ile Lys Leu Lys His Thr Lys Lys Arg Gln Ile Tyr Thr
325 330 335
Asp Ile Glu Met Asn Arg Leu Gly Lys Gly Gly Gly Gly Gly Leu Tyr
340 345 350
Val Asp Glu Leu Thr Gly Leu Phe Asn Tyr Arg Tyr Leu Asp Ile Ser
355 360 365
Leu Asp Arg Glu Leu Lys Arg Ala Asp Arg Phe Gly Ser Val Val Ser
370 375 380
Met Ile Phe Ile Asp Met Asp His Phe Lys Gly Val Asn Asp Thr His
385 390 395 400
Gly His Leu Phe Gly Ser Gln Val Leu His Glu Val Gly Gln Leu Leu
405 410 415
Lys Lys Ser Val Arg Glu Val Asp Val Ile Ile Arg Tyr Gly Gly Asp
420 425 430
Glu Phe Thr Ile Ile Leu Val Glu Thr Gly Glu Lys Gly Ala Ala Thr
435 440 445
Val Ala Glu Arg Ile Arg Arg Ser Ile Glu Asp His His Phe Leu Ala
450 455 460
Ser Glu Gly Leu Asp Val Arg Leu Thr Ala Ser Leu Gly Tyr Ala Cys
465 470 475 480
Tyr Pro Leu Asp Thr Gln Ser Lys Met Glu Leu Leu Glu Leu Ala Asp
485 490 495
Lys Ala Met Tyr Arg Gly Lys Glu Glu Gly Lys Asn Arg Val Phe Arg
500 505 510
Ala Thr Ala Ile Arg Asp Tyr Lys Asp Asp Asp Asp Lys
515 520 525

Claims (220)

1.一种重组肿瘤选择性病毒颗粒，其包含编码用于将细胞外囊泡(EV)导向至少一种靶细胞的重组多肽的核酸，所述重组多肽包含：
-用于将所述EV导向由所述至少一种靶细胞表达的所述至少一种靶分子的至少一个靶向部分，
-至少一种EV锚定多肽，和
-至少一种囊泡内多肽。
2.如权利要求1所述的重组肿瘤选择性病毒颗粒，其是溶瘤病毒颗粒。
3.一种用于将细胞外囊泡(EV)导向至少一种靶细胞的重组多肽，该重组多肽包含：
-用于将所述EV导向由所述至少一种靶细胞表达的所述至少一种靶分子的至少一个靶向部分，
-至少一种EV锚定多肽，和
-至少一种囊泡内多肽。
4.如权利要求3所述的重组多肽，其中所述至少一种EV锚定多肽包括连接到所述至少一个靶向部分的EV导向跨膜多肽。
5.如权利要求4所述的重组多肽，其中所述EV导向跨膜多肽包含来自LAMP2b、VSVG、CD81、CD82或LAMP1的跨膜结构域。
6.如权利要求4所述的重组多肽，其中所述EV导向跨膜多肽包含来自胡宁病毒糖蛋白、拉沙热病毒糖蛋白、LCMV(淋巴细胞性脉络丛脑膜炎病毒)糖蛋白、SARS-CoV-2糖蛋白、太米阿米病毒糖蛋白、瓜纳瑞托病毒糖蛋白、巴拉那病毒糖蛋白、马丘波病毒糖蛋白、萨比亚病毒糖蛋白或CdaA的跨膜结构域。
7.如权利要求3至6中任一项所述的重组多肽，其中所述至少一种靶细胞包括哺乳动物细胞。
8.如权利要求7所述的重组多肽，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
9.如权利要求3至8中任一项所述的重组多肽，其中所述至少一种靶细胞是肿瘤细胞、肿瘤基质细胞或免疫细胞。
10.如权利要求9所述的重组多肽，其中所述肿瘤基质细胞包括癌症相关的成纤维细胞。
11.如权利要求9所述的重组多肽，其中所述免疫细胞是T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞。
12.如权利要求11所述的重组多肽，其中所述T细胞是调节性T细胞或细胞毒性T细胞。
13.如权利要求3至12中任一项所述的重组多肽，其中所述至少一种靶分子是细胞表面标志物或细胞表面受体。
14.如权利要求3至13中任一项所述的重组多肽，其中所述至少一种靶分子是TNF-α家族受体、整联蛋白、C型凝集素受体、瘦蛋白、癌胚抗原、CD抗原、碳酸酐酶、FAP、MMP2、DEC205、DC40、CLEC9、CD3、糖胺聚糖、多糖或脂质。
15.如权利要求3至14中任一项所述的重组多肽，其中所述至少一种靶分子包括疾病特异性细胞表面分子，其是：
-由病变细胞表达而不是由健康对照细胞表达的，或
-与所述健康对照细胞相比，由所述病变细胞以更大的量表达的。
16.如权利要求15所述的重组多肽，其中所述疾病特异性细胞表面分子包括肿瘤相关抗原。
17.如权利要求3至16中任一项所述的重组多肽，其中所述至少一种靶分子包括DEC205、CLEC9A、CEACAM5、CTLA4、CD3、CD7、CD11c、CD19、CD20、CD22、CD40、CD44、CD206、EGFR、EGFRvIII、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、CA9、MMP-2、PD-L1、SIRPa、硫酸软骨素、αv-整联蛋白或叶酸受体。
18.如权利要求3至17中任一项所述的重组多肽，其中所述至少一个靶向部分包括受体配体、抗体或其功能性片段、scFv、单结构域抗体或DARPin。
19.如权利要求18所述的重组多肽，其中所述抗体是单结构域抗体。
20.如权利要求18或19所述的重组多肽，其中所述抗体是人源化抗体。
21.如权利要求18所述的重组多肽，其中所述功能性片段是Fab'或F(ab')2。
22.如权利要求18所述的重组多肽，其中所述至少一个靶向部分包括抗DEC205、抗Clec9A、抗FAP、抗CEA、抗CA9、抗CTL4、抗CD3、抗CD206、抗EGFRViii、抗CD19、抗CD20、抗CD22、抗CD44、抗CD7、SIRPα胞外域、GE11肽、CTX、VAR2Δ、CD40配体、CD40靶向肽、iRGD或PD1。
23.如权利要求3至22中任一项所述的重组多肽，其中所述囊泡内多肽包括经由所述EV锚定多肽连接到所述至少一个靶向部分的至少一种EV有效载荷多肽。
24.如权利要求23所述的重组多肽，其中该至少一种EV有效载荷多肽包括至少一种EV治疗性有效载荷多肽。
25.如权利要求3所述的重组多肽，其中所述EV锚定多肽和所述囊泡内多肽一起包含EV导向重组四次跨膜蛋白，该EV导向重组四次跨膜蛋白包含插入其两个跨膜结构域之间的所述至少一个靶向部分。
26.如权利要求25所述的重组多肽，其中所述重组四次跨膜蛋白包括或衍生自人CD63或CD9。
27.如权利要求25或26所述的重组多肽，其中所述至少一种靶细胞包括哺乳动物细胞。
28.如权利要求27所述的重组多肽，其中所述哺乳动物细胞是人细胞。
29.如权利要求27至28中任一项所述的重组多肽，其中所述至少一种靶细胞是肿瘤细胞、肿瘤基质细胞或免疫细胞。
30.如权利要求29所述的重组多肽，其中所述肿瘤基质细胞包括癌症相关的成纤维细胞。
31.如权利要求29所述的重组多肽，其中所述免疫细胞是T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞。
32.如权利要求31所述的重组多肽，其中所述T细胞是调节性T细胞或细胞毒性T细胞。
33.如权利要求25至32中任一项所述的重组多肽，其中所述至少一种靶分子是细胞表面标志物或细胞表面受体。
34.如权利要求25至33中任一项所述的重组多肽，其中所述至少一种靶分子是TNF-α家族受体、整联蛋白、C型凝集素受体、瘦蛋白、癌胚抗原、CD抗原、碳酸酐酶、FAP、MMP2、DEC205、DC40、CLEC9、CD3、糖胺聚糖、多糖或脂质。
35.如权利要求25至34中任一项所述的重组多肽，其中所述至少一种靶分子包括疾病特异性抗原，其是：
-由病变细胞表达而不是由健康对照细胞表达的，或
-与所述健康对照细胞相比，由所述病变细胞以更大的量表达的。
36.如权利要求35所述的重组多肽，其中所述疾病特异性抗原包括肿瘤相关抗原。
37.如权利要求25至36中任一项所述的重组多肽，其中所述至少一种靶分子包括DEC205、CLEC9A、CEACAM5、CTLA4、CD3、CD7、CD11c、CD19、CD20、CD22、CD40、CD44、CD206、EGFR、EGFRvIII、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、CA9、MMP-2、PD-L1、SIRPa、硫酸软骨素、αv-整联蛋白或叶酸受体。
38.如权利要求25至37中任一项所述的重组多肽，其中所述至少一个靶向部分包括受体配体、抗体或其功能性片段、scFv、单结构域抗体或DARPin。
39.如权利要求38所述的重组多肽，其中所述抗体是单结构域抗体。
40.如权利要求38或39所述的重组多肽，其中所述抗体是人源化抗体。
41.如权利要求38所述的重组多肽，其中所述功能性片段是Fab'或F(ab')2。
42.如权利要求38所述的重组多肽，其中所述至少一个靶向部分包括抗DEC205、抗Clec9A、抗FAP、抗CEA、抗CA9、抗CTL4、抗CD3、抗CD206、抗EGFRViii、抗CD19、抗CD20、抗CD22、抗CD44、抗CD7、SIRPα胞外域、GE11肽、CTX、VAR2Δ、CD40配体、CD40靶向肽、iRGD或PD1。
43.如权利要求25至42中任一项所述的重组多肽，其进一步包含连接到所述重组四次跨膜蛋白的N-末端和/或C-末端的至少一种EV有效载荷多肽。
44.如权利要求43所述的重组多肽，其中该至少一种EV有效载荷多肽包括至少一种EV治疗性多肽。
45.如权利要求3所述的重组多肽，
其中所述至少一个靶向部分包含至少两个靶向部分，
其中所述EV锚定多肽和所述囊泡内多肽一起包含EV导向重组四次跨膜蛋白，该EV导向重组四次跨膜蛋白从N-末端至C-末端包含编号为1、2、3和4的四个跨膜结构域，其中所述两个靶向部分中的第一靶向部分插入跨膜结构域1与2之间，并且所述两个靶向部分中的第二靶向部分插入跨膜结构域3与4之间。
46.如权利要求45所述的重组多肽，其中所述EV导向重组四次跨膜蛋白衍生自人CD63或CD9。
47.如权利要求45或46所述的重组多肽，其中所述至少两个靶向部分特异性结合至少两种不同的靶分子。
48.如权利要求47所述的重组多肽，其中所述至少两种不同的靶分子由相同的靶细胞表达。
49.如权利要求48所述的重组多肽，其中所述靶细胞包括哺乳动物细胞。
50.如权利要求49所述的重组多肽，其中所述哺乳动物细胞包括人细胞。
51.如权利要求48至50中任一项所述的重组多肽，其中所述靶细胞包括肿瘤细胞、肿瘤基质细胞或免疫细胞。
52.如权利要求51所述的重组多肽，其中所述肿瘤基质细胞包括癌症相关的成纤维细胞。
53.如权利要求51所述的重组多肽，其中所述免疫细胞是T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞。
54.如权利要求53所述的重组多肽，其中所述T细胞是调节性T细胞或细胞毒性T细胞。
55.如权利要求48至54中任一项所述的重组多肽，其中所述至少两种靶分子中的每一种靶分子是细胞表面分子。
56.如权利要求48至55中任一项所述的重组多肽，其中所述至少两种靶分子中的每一种靶分子是TNF-α家族受体、整联蛋白、C型凝集素受体、瘦蛋白、癌胚抗原、CD抗原、碳酸酐酶、FAP、MMP2、DEC205、DC40、CLEC9、CD3、糖胺聚糖、多糖或脂质。
57.如权利要求48至56中任一项所述的重组多肽，其中所述至少两种靶分子中的每一种靶分子包括疾病特异性细胞表面分子，其是：
-由病变细胞表达而不是由健康对照细胞表达的，或
-与所述健康对照细胞相比，由所述病变细胞以更大的量表达的。
58.如权利要求57所述的重组多肽，其中所述疾病特异性细胞表面分子包括肿瘤相关抗原。
59.如权利要求48至58中任一项所述的重组多肽，其中所述至少两种靶分子中的每一种靶分子独立地包括DEC205、CLEC9A、CEACAM5、CTLA4、CD3、CD7、CD11c、CD19、CD20、CD22、CD40、CD44、CD206、EGFR、EGFRvIII、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、CA9、MMP-2、PD-L1、SIRPa、硫酸软骨素、αv-整联蛋白或叶酸受体。
60.如权利要求48至59中任一项所述的重组多肽，其中所述至少两个靶向部分各自独立地包括受体配体、抗体或其功能性片段、scFv、单结构域抗体或DARPin。
61.如权利要求60所述的重组多肽，其中所述抗体是单结构域抗体。
62.如权利要求60或61所述的重组多肽，其中所述抗体是人源化抗体。
63.如权利要求60所述的重组多肽，其中所述功能性片段是Fab'或F(ab')2。
64.如权利要求60所述的重组多肽，其中所述至少一个靶向部分包括抗DEC205、抗Clec9A、抗FAP、抗CEA、抗CA9、抗CTL4、抗CD3、抗CD206、抗EGFRViii、抗CD19、抗CD20、抗CD22、抗CD44、抗CD7、SIRPα胞外域、GE11肽、CTX、VAR2Δ、CD40配体、CD40靶向肽、iRGD或PD1。
65.如权利要求47所述的重组多肽，其中所述至少两种不同的靶分子由不同的靶细胞表达。
66.如权利要求65所述的重组多肽，其中所述不同的靶细胞包括病变细胞和免疫细胞，并且其中所述至少两个靶向部分分别导向病变细胞表面分子和免疫细胞表面分子。
67.如权利要求65所述的重组多肽，其中所述不同的靶细胞包括肿瘤细胞和免疫细胞，并且其中所述至少两个靶向部分分别导向肿瘤细胞表面分子和免疫细胞表面分子。
68.如权利要求67所述的重组多肽，其中所述免疫细胞是T细胞，并且所述免疫细胞表面分子是T细胞表面分子。
69.如权利要求68所述的重组多肽，其中所述T细胞是调节性T细胞或细胞毒性T细胞。
70.如权利要求67所述的重组多肽，其中所述免疫细胞是自然杀伤(NK)细胞，并且所述免疫细胞表面分子是NK细胞表面分子。
71.如权利要求67所述的重组多肽，其中所述免疫细胞是B细胞，并且所述免疫细胞表面分子是B细胞表面分子。
72.如权利要求67所述的重组多肽，其中所述免疫细胞是巨噬细胞，并且所述免疫细胞表面分子是巨噬细胞表面分子。
73.如权利要求67所述的重组多肽，其中所述免疫细胞是树突细胞，并且所述免疫细胞表面分子是树突细胞表面分子。
74.如权利要求67所述的重组多肽，其中所述免疫细胞是嗜中性粒细胞，并且所述免疫细胞表面分子是嗜中性粒细胞表面分子。
75.如权利要求67至74中任一项所述的重组多肽，其中所述肿瘤细胞表面分子包括肿瘤相关抗原。
76.如权利要求67至74中任一项所述的重组多肽，其中所述肿瘤细胞表面分子包括CEACAM5、CD19、CD20、CD22、EGFR、EGFRvIII、成纤维细胞激活蛋白(FAP)、CA9、MMP-2、PD-L1、SIRPα、硫酸软骨素、αv-整联蛋白或叶酸受体中的一者。
77.如权利要求65至76中任一项所述的重组多肽，其中所述至少一个靶向部分包括抗体或其功能性片段、scFv、单结构域抗体或DARPin。
78.如权利要求77所述的重组多肽，其中所述抗体是单结构域抗体。
79.如权利要求77或78所述的重组多肽，其中所述抗体是人源化抗体。
80.如权利要求77所述的重组多肽，其中所述功能性片段是Fab'或F(ab')2。
81.如权利要求45至80中任一项所述的重组多肽，其进一步包含至少一种EV有效载荷多肽。
82.如权利要求81所述的重组多肽，其中包括该至少一种EV有效载荷多肽包括至少一种EV治疗性有效载荷多肽。
83.如权利要求82所述的重组多肽，其中所述至少一种EV治疗性有效载荷多肽连接到所述重组四次跨膜蛋白的所述N-末端和/或C-末端。
84.如权利要求23、43和81中任一项所述的重组多肽，其中所述至少一种EV有效载荷多肽经由用于释放所述至少一种EV治疗性有效载荷多肽的切割位点连接。
85.如权利要求24、44和82中任一项所述的重组多肽，其中所述至少一种EV治疗性有效载荷多肽经由用于释放所述至少一种EV治疗性有效载荷多肽的切割位点连接。
86.如权利要求84或85所述的重组多肽，其中所述切割位点包括自切割肽、pH依赖性切割位点或酶切割位点。
87.如权利要求24、44和82中任一项所述的重组多肽，其中所述EV治疗性有效载荷多肽包括活性药物成分(API)。
88.如权利要求24、44和82中任一项所述的重组多肽，其中所述EV治疗性有效载荷多肽包括细胞毒性分子。
89.如权利要求88所述的重组多肽，其中所述细胞毒性分子包括人GZMB R201K、鼠GZMB、白喉毒素、来自假单胞菌外毒素A的PE38结构域、或人TRAIL。
90.如权利要求24、44和82中任一项所述的重组多肽，其中所述有效载荷多肽包括免疫调节分子。
91.如权利要求90所述的重组多肽，其中所述免疫调节分子包括STING或ERAdP途径激活剂。
92.如权利要求91所述的重组多肽，其中所述STING途径激活剂包括细菌二核苷酸环化酶。
93.如权利要求92所述的重组多肽，其中所述细菌二核苷酸环化酶包括CdaA。
94.如权利要求24、44和82中任一项所述的重组多肽，其中所述有效载荷多肽包括酶。
95.如权利要求24、44和82中任一项所述的重组多肽，其中所述有效载荷多肽包含核酸结合结构域。
96.如权利要求95所述的重组多肽，其中所述核酸结合结构域包含RNA结合基序。
97.如权利要求96所述的重组多肽，其中所述RNA结合基序包含核酸配体系统。
98.如权利要求24、44和82中任一项所述的重组多肽，其中所述有效载荷多肽包括抗原。
99.如权利要求98所述的重组多肽，其中所述抗原是肿瘤相关抗原。
100.如权利要求98所述的重组多肽，其中所述抗原来自病原体。
101.如权利要求98至100中任一项所述的重组多肽，其中所述EV治疗性有效载荷多肽进一步包括佐剂。
102.如权利要求101所述的重组多肽，其中所述佐剂包括STING或ERAdP途径激活剂。
103.如权利要求102所述的重组多肽，其中所述STING途径激活剂包括细菌二核苷酸环化酶。
104.如权利要求103所述的重组多肽，其中所述细菌二核苷酸环化酶包括CdaA。
105.如权利要求24、44和82中任一项所述的重组多肽，其中所述至少一种EV治疗性有效载荷多肽连接到至少一种另外的EV有效载荷多肽。
106.如权利要求105所述的重组多肽，其中所述至少一种EV治疗性有效载荷多肽通过切割位点与所述至少一种另外的EV有效载荷多肽连接。
107.如权利要求105所述的重组多肽，其中所述至少一种EV治疗性有效载荷多肽通过至少两个EV跨膜结构域与所述至少一种另外的EV有效载荷多肽分离。
108.一种核酸分子，其编码如权利要求1至22、25至42和45至80中任一项所定义的重组多肽。
109.如权利要求108所述的核酸，其中所述核酸进一步编码单独的EV货物分子。
110.如权利要求109所述的核酸，其中所述EV货物分子包括核酸。
111.如权利要求109所述的核酸，其中所述核酸包括RNA。
112.如权利要求111所述的核酸，其中所述RNA包括mRNA、miRNA或shRNA。
113.如权利要求109所述的核酸，其中所述EV货物分子包括多肽。
114.一种核酸分子，其编码如权利要求24、44和82至107中任一项所定义的重组多肽。
115.如权利要求114所述的核酸，其中所述核酸进一步编码单独的EV货物分子。
116.如权利要求115所述的核酸，其中所述EV货物分子包括核酸。
117.如权利要求116所述的核酸，其中所述核酸包括RNA。
118.如权利要求117所述的核酸，其中所述RNA包括mRNA、miRNA或shRNA。
119.如权利要求114所述的核酸，其中所述EV货物分子包括多肽。
120.一种载体，其包含如权利要求108至109中任一项所定义的核酸。
121.一种载体，其包含如权利要求114至119中任一项所定义的核酸。
122.一种重组病毒基因组，其包含如权利要求108至113中任一项所定义的核酸或与其互补的核酸。
123.如权利要求122所述的重组病毒基因组，其中该病毒基因组来自肿瘤选择性病毒。
124.如权利要求122或123所述的重组病毒基因组，其中所述病毒基因组来自溶瘤病毒。
125.如权利要求124所述的重组病毒基因组，其中所述溶瘤病毒是水疱性口炎病毒(VSV)、痘苗病毒、单纯疱疹病毒1(HSV-1)、疱疹病毒2(HSV-2)、腺病毒。
126.一种重组病毒基因组，其包含如权利要求114至119中任一项所定义的核酸或与其互补的核酸。
127.如权利要求126所述的重组病毒基因组，其中所述病毒基因组来自肿瘤选择性病毒。
128.如权利要求126或127所述的重组病毒基因组，其中所述病毒基因组来自溶瘤病毒。
129.如权利要求127所述的重组病毒基因组，其中所述溶瘤病毒是水疱性口炎病毒(VSV)、痘苗病毒、单纯疱疹病毒1(HSV-1)、疱疹病毒2(HSV-2)、腺病毒。
130.一种病毒颗粒，其包含如权利要求108至113中任一项所定义的核酸或与其互补的核酸。
131.如权利要求130所述的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是肿瘤选择性病毒的颗粒。
132.如权利要求130或131所述的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是溶瘤病毒的颗粒。
133.如权利要求132所述的病毒颗粒，其中所述溶瘤病毒是水疱性口炎病毒(VSV)、痘苗病毒、单纯疱疹病毒1(HSV-1)、疱疹病毒2(HSV-2)、腺病毒。
134.一种病毒颗粒，其包含如权利要求114至119中任一项所定义的核酸或与其互补的核酸。
135.如权利要求134所述的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是肿瘤选择性病毒的颗粒。
136.如权利要求134或135所述的病毒颗粒，其中所述病毒颗粒是溶瘤病毒的颗粒。
137.如权利要求136所述的病毒颗粒，其中所述溶瘤病毒是水疱性口炎病毒(VSV)、痘苗病毒、单纯疱疹病毒1(HSV-1)、疱疹病毒2(HSV-2)、腺病毒。
138.一种宿主细胞，其包含如权利要求108至105中任一项所定义的核酸、如权利要求120所定义的载体、如权利要求122至125中任一项所述的重组病毒基因组或如权利要求130至133中任一项所定义的病毒颗粒。
139.如权利要求138所述的宿主细胞，其是原核细胞。
140.如权利要求138所述的宿主细胞，其是真核细胞。
141.如权利要求140所述的宿主细胞，其是酵母细胞或昆虫细胞。
142.如权利要求140所述的宿主细胞，其是哺乳动物细胞。
143.如权利要求142所述的宿主细胞，其是人细胞。
144.如权利要求138所述的宿主细胞，其是免疫细胞。
145.如权利要求144所述的宿主细胞，其中所述免疫细胞是B细胞、T细胞、树突细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞。
146.如权利要求145所述的宿主细胞，其是调节性T细胞或细胞毒性T细胞。
147.如权利要求138至146中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞进一步编码单独的EV货物分子。
148.如权利要求147所述的宿主细胞，其中所述EV货物分子包括核酸。
149.如权利要求148所述的宿主细胞，其中所述核酸包括RNA。
150.如权利要求149所述的宿主细胞，其中所述RNA包括mRNA、miRNA或shRNA。
151.如权利要求147所述的宿主细胞，其中所述EV货物分子包括多肽。
152.一种宿主细胞，其包含如权利要求114至119中任一项所定义的核酸、如权利要求121所定义的载体、如权利要求126至129中任一项所述的重组病毒基因组或如权利要求131至137中任一项所定义的病毒颗粒。
153.如权利要求152所述的宿主细胞，其是原核细胞。
154.如权利要求152所述的宿主细胞，其是真核细胞。
155.如权利要求154所述的宿主细胞，其是酵母细胞或昆虫细胞。
156.如权利要求154所述的宿主细胞，其是哺乳动物细胞。
157.如权利要求156所述的宿主细胞，其是人细胞。
158.如权利要求152所述的宿主细胞，其是免疫细胞。
159.如权利要求158所述的宿主细胞，其中所述免疫细胞是B细胞、T细胞、树突细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞。
160.如权利要求159所述的宿主细胞，其是调节性T细胞或细胞毒性T细胞。
161.如权利要求152至160中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞进一步编码单独的EV货物分子。
162.如权利要求161所述的宿主细胞，其中所述EV货物分子包括核酸。
163.如权利要求162所述的宿主细胞，其中所述核酸包括RNA。
164.如权利要求163所述的宿主细胞，其中所述RNA包括mRNA、miRNA或shRNA。
165.如权利要求161所述的宿主细胞，其中所述EV货物分子包括多肽。
166.一种靶向细胞外囊泡(EV)，其包含如权利要求1至22、25至42和45至80中任一项所定义的重组多肽。
167.如权利要求166所述的靶向EV，其进一步包含单独的EV货物分子。
168.如权利要求167所述的靶向EV，其中所述EV货物分子包括核酸。
169.如权利要求168所述的靶向EV，其中所述核酸包括RNA。
170.如权利要求169所述的靶向EV，其中所述RNA包括mRNA、miRNA或shRNA。
171.如权利要求168所述的靶向EV，其中所述EV货物分子包括多肽。
172.如权利要求167所述的靶向EV，其中所述EV货物分子包括API。
173.一种靶向细胞外囊泡(EV)，其包含如权利要求23、24、43、44和81至107中任一项所定义的重组多肽。
174.如权利要求173所述的靶向EV，其进一步包含单独的EV货物分子。
175.如权利要求174所述的靶向EV，其中所述EV货物分子包括核酸。
176.如权利要求175所述的靶向EV，其中所述核酸包括RNA。
177.如权利要求176所述的靶向EV，其中所述RNA包括mRNA、miRNA或shRNA。
178.如权利要求174所述的靶向EV，其中所述EV货物分子包括多肽。
179.如权利要求174所述的靶向EV，其中所述EV货物分子包括API。
180.如权利要求166至179中任一项所述的靶向EV，其是外泌体。
181.如权利要求166至179中任一项所述的靶向EV，其是微囊泡。
182.如权利要求166至179中任一项所述的靶向EV，其是核外颗粒体。
183.如权利要求166至179中任一项所述的靶向EV，其是凋亡小体。
184.一种组合物，其包含如权利要求108至113中任一项所定义的核酸、如权利要求120所定义的载体、如权利要求122至125中任一项所述的重组病毒基因组、如权利要求130至133中任一项所定义的病毒颗粒或如权利要求166至172中任一项所述的靶向EV；以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。
185.一种组合物，其包含如权利要求114至118中任一项所定义的核酸、如权利要求121所定义的载体、如权利要求126至130中任一项所述的重组病毒基因组、如权利要求134至137中任一项所定义的病毒颗粒或如权利要求173至177中任一项所述的靶向EV；以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载剂。
186.一种将靶向部分结合到靶细胞的靶分子的方法，所述方法包括使所述靶细胞与如权利要求166至179中任一项所定义的靶向EV接触。
187.如权利要求166至179中任一项所定义的靶向EV用于将靶向部分结合到靶细胞的靶分子的用途。
188.如权利要求166至179中任一项所定义的靶向EV，其用于将靶向部分结合到靶细胞的靶分子。
189.一种将有效载荷分子递送至靶细胞的方法，所述方法包括使所述靶细胞与如权利要求173至179中任一项所定义的靶向EV接触。
190.如权利要求173至179中任一项所定义的靶向EV用于将有效载荷分子递送至靶细胞的用途。
191.如权利要求173至179中任一项所定义的EV，其用于将有效载荷分子递送至靶细胞。
192.一种将货物分子递送至靶细胞的方法，所述方法包括使所述靶细胞与如权利要求167至172和174至179中任一项所定义的靶向EV接触。
193.如权利要求167至172和174至179中任一项所定义的靶向EV用于将货物分子递送至靶细胞的用途。
194.如权利要求167至172和174至179中任一项所定义的靶向EV，其用于将货物分子递送至靶细胞。
195.一种刺激针对抗原的免疫应答的方法，所述方法包括向受试者施用如权利要求114至116中任一项所定义的核酸、如权利要求121所定义的载体、如权利要求126至129中任一项所述的重组病毒基因组、如权利要求133至136中任一项所定义的病毒颗粒或如权利要求173至177中任一项所述的靶向EV，其中所述靶细胞包括免疫细胞，并且其中所述至少一种EV治疗性有效载荷多肽包括抗原。
196.如权利要求195所述的方法，其中所述抗原包括病变细胞特异性抗原。
197.如权利要求195所述的方法，其中所述抗原包括肿瘤特异性抗原
198.如权利要求195所述的方法，其中所述抗原来自病原体。
199.如权利要求195至198中任一项所述的方法，其中所述至少一种EV治疗性有效载荷多肽进一步包括佐剂。
200.一种杀伤靶细胞的方法，所述方法包括向受试者施用如权利要求114至119中任一项所定义的核酸、如权利要求121所定义的载体、如权利要求126至130中任一项所述的重组病毒基因组、如权利要求133至137中任一项所定义的病毒颗粒或如权利要求173至185中任一项所述的靶向EV，其中所述至少一种EV治疗性有效载荷多肽包括细胞毒性分子。
201.如权利要求200所述的方法，其中所述细胞毒性分子包括人GZMB R201K、鼠GZMB、白喉毒素、来自假单胞菌外毒素A的PE38结构域、或人TRAIL。
202.如权利要求200或201所述的方法，其中所述靶细胞包括病变细胞。
203.如权利要求202所述的方法，其中所述病变细胞是肿瘤细胞。
204.一种重编程免疫细胞的方法，所述方法包括使这些免疫细胞与如权利要求114至119中任一项所定义的核酸、如权利要求121所定义的载体、如权利要求126至130中任一项所述的重组病毒基因组、如权利要求133至137中任一项所定义的病毒颗粒或如权利要求173至185中任一项所述的靶向EV接触，其中所述至少一种EV治疗性有效载荷分子包括免疫调节分子。
205.如权利要求204所述的方法，其中所述免疫调节分子包括STING或ERAdP途径激活剂。
206.如权利要求205所述的方法，其中所述STING或ERAdP途径激活剂包括细菌二核苷酸环化酶。
207.如权利要求206所述的方法，其中所述细菌二核苷酸环化酶包括CdaA。
208.如权利要求204至207中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞包括B细胞、T细胞、NK细胞、树突细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞。
209.一种将免疫应答导向靶病变细胞的方法，所述方法包括向受试者施用如权利要求108至119中任一项所定义的核酸、如权利要求120或121所定义的载体、如权利要求122至129中任一项所述的重组病毒基因组、如权利要求130至137中任一项所定义的病毒颗粒或如权利要求166至179中任一项所述的靶向EV，其中所述重组多肽包含分别与至少两种不同的靶分子特异性结合的至少两个靶向部分，其中所述至少两种不同的靶分子分别由免疫细胞和病变细胞表达。
210.如权利要求209所述的方法，其中所述病变细胞包括肿瘤细胞。
211.如权利要求210所述的方法，其中所述至少两种不同的靶分子中的一种靶分子包括肿瘤相关抗原。
212.如权利要求209至211中任一项所述的方法，其中所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞。
213.如权利要求212所述的方法，其中所述免疫细胞是T细胞。
214.如权利要求213所述的方法，其中所述免疫细胞是调节性T细胞或细胞毒性T细胞。
215.如权利要求212所述的方法，其中所述免疫细胞是NK细胞。
216.一种制备用于受试者的治疗性靶向EV的方法，所述方法包括：
-使获自受试者的细胞与如权利要求108至119中任一项所定义的核酸、如权利要求120或121所定义的载体、如权利要求122至129中任一项所述的重组病毒基因组或如权利要求130至137中任一项所定义的病毒颗粒接触，以及
-收集这些靶向EV。
217.如权利要求216所述的方法，其中所述细胞是肿瘤细胞。
218.如权利要求216所述的方法，其中所述细胞是免疫细胞。
219.如权利要求218所述的方法，其中所述免疫细胞包括T细胞、B细胞、自然杀伤(NK)细胞、树突细胞、巨噬细胞或嗜中性粒细胞
220.一种产生靶向EV的方法，其中所述方法包括：
-在细胞中表达如权利要求108至119中任一项所定义的核酸，或培养如权利要求138至165中任一项所定义的宿主细胞以产生EV，以及
-收集EV。
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